BRPI1013895B1

BRPI1013895B1 - Composições de partícula semelhante a virus (vlp) de virus do papiloma e de capsómero, método de preparação das mesmas, vacina compreendendo a referida composição vlp, polipeptídeo quimérico, kit compreendendo a reverida composição de vlp, bem com usos da referida vlp

Info

Publication number: BRPI1013895B1
Application number: BRPI1013895-1A
Authority: BR
Inventors: Richard B.S. Roden; Reinhard Kirnbauer; Christina Schellenbacher
Original assignee: The Johns Hopkins University
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2021-08-03
Also published as: US9149503B2; EP2416798A4; US10046026B2; HK1242997A1; US20160200774A1; US20120093821A1; WO2010118424A2; WO2010118424A3; EP2416798A2; ES2653251T3; CN107080833A; EP2416798B1; BRPI1013895A2; CN102458440A; DK2416798T3

Abstract

composições de partícula semelhante a vírus (vlp) de papilomavírus e de capsômero, método de preparação das mesmas, vacina compreendendo a referida composição de vlp, polipeptídeo quimérico, ácido nucleico codificando-o, vetor de expressão, célula hospedeira, soro imune ou anticorpo, kits compreendendo a referida composição de vlp ou anticorpos, bem como usos da referida vlp, soro e anticorpo. a presente invenção refere-se, por exemplo, a uma composição de partículas semelhantes a vírus (vlp) formada a partir de um polipeptídeo quimérico compreendendo uma proteína l1 principal do capsídeo de papiloma vírus (por exemplo, papilomavírus humano, ou hpv), na qual é inserida um peptídeo exibido na superfície compreendendo epítopo neutralizante de uma proteína l2 de papilomavírus. composições de vacinas compreendendo o vlp são descritas, bem como métodos para induzir uma resposta imune (por exemplo, vacinação) em um indivíduo contra o papiloma vírus, utilizando o vlp, e kits compreendendo o vlp, para a realização de um método da invenção.

Description

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício da data dedepósito do Pedido Provisório de Patente Americana 61/168.445, depositado em 10 de abril de 2009, que é incorporado por referência em sua totalidade neste pedido.

[0002] Esta invenção foi feita com o suporte do governo sobnúmero de concessão P50 CA098252 concedido pelo National Cancer Institute. O governo tem certos direitos na invenção.

INFORMAÇÃO ANTECEDENTE

[0003] Os mais de cem tipos de papilomavírus humano (HPV)identificados até agora (de Villiers et al. (2004) Virology 22, 670-80) são os agentes etiológicos de papilomas ou verrugas de pele e mucosa. A infecção persistente com tipos de alto risco presentes em mucosas, muitas vezes HPV16 e HPV18, causam o câncer cervical, que constitui o segundo câncer mais fatal em mulheres no mundo inteiro, causando 274.000 mortes por ano. A morbidade substancial resulta de outras condições não cervicais relacionadas ao HPV, tais como verrugas anogenitais, vulvais, vaginais, penianas, anais ou câncer de orofaringe.

[0004] O desenvolvimento de vacinas profiláticas atuais para opapilomavírus foi lançado através de observações de que a principal proteína L1 recombinantemente expressa do capsídeo se autoencaixa nas partículas similares a papilomavírus (VLP). Estes capsídeos virais vazios são compostos por 360 moléculas L1 e se assemelham com vírions nativos tanto em estrutura como em imunogenicidade, no entanto não são oncogênicos e infecciosos. Além disso, VLP não podem replicar porque as células nas quais VLP são feitos contêm somente L1 e nenhum outro gene do papilomavírus. As vacinas com subunidades de VLP induzem respostas de anticorpos com alta titulação e restritas ao tipo de conformação dos epítopos de L1 (Christensen et al. (1990) J Virol 64* 3151-3156); Kirnbauer et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 12180-12184; Rose et al. (1994) Gen J Virol 75, 2445-9; Suzich et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 11553-11557). Quando aplicado a mulheres antes da infecção, as vacinas disponíveis que visam os tipos de alto risco mais prevalentes, HPV16 e HPV18, demonstraram uma eficácia de até 100% contra a infecção persistente e doença associada causada pelos tipos incluídos, e dessa forma são potencialmente capazes de prevenir aproximadamente 70% das displasias cervicais de alto grau e provavelmente cânceres. Por isso, o uso de vacinas L1 atualmente autorizadas exige a continuação do rastreamento citológico cervical das mulheres. A prevenção de 96% do câncer cervical requereria a imunidade a 7 tipos de HPV de alto risco (16/18/31/33/45/52/58) (Munoz et al. (2004) Int J Cancer 111, 278-85) e o desenvolvimento de vacinas de VLP L1 mais altamente multivalentes (e presumivelmente mais caras).

[0005] A pesquisa de imunógenos alternativos de espectro maisamplo atraiu a atenção a menor proteína L2 do capsídeo, que é imunogenicamente subdominante no contexto de capsídeos coexpressos L1 mais L2 (Roden et al. (2000) Virology TJQ., 254-257). A imunização de animais com peptídeo amino (N)-terminal de L2 demonstrou sua capacidade de extrair anticorpos de neutralização de baixa titulação que protegem contra o desafio com os tipos cognatos de papilomavírus (PV) in vivo (Embers et al. (2002) J Virol 76, 9798- 805; Gaukroger et al. (1996) J Gen Virol 77 (Pt 7), 1577-83),neutralizam cruzadamente tipos heterólogos de PV in vitro (Kawana et al. (1999) J Virol 73, 6188-90; Pastrana et al. (2005a) Virology 337, 365-72; Roden et al. (2000) (supra)), e conferem proteção cruzada in vivo (Gambhira et al. (2007a) J Virol 81, 11585-92).

[0006] Há uma necessidade de desenvolver imunógenos ouvacinógenos que exibem anticorpos de neutralização com alta titulação contra um amplo espectro de tipos de HPV.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0007] A figura 1 mostra um sumário de proteínas quiméricas L1-L2 fusionadas A-J. Os peptídeos L2 de HPV16 com resíduos de aminoácido indicados foram inseridos na alça DE da proteína BPV1 L1 (entre os resíduos 133/134), ou da proteína L1 do HPV16 (entre os resíduos 136/137). As linhas preenchidas indicam as proteínas L1. As barras abertas indicam os peptídeos L2. * Indica 2 aminoácidos (Pro e Arg) adicionados nas regiões N- e C-terminais do respectivo peptídeo resultante de sítios de restrição por enzima usados para a clonagem. Os esquemas não estão demonstrados em escala.

[0008] A figura 2a mostra uma análise das proteínas quiméricasfusionadas (por Western Blot de lisados celulares de Sf-9 infectados por baculovírus recombinante. Os anticorpos monoclonais AUl ou Camvir-1 detectaram VLP quimérico de BPV1 L1 ou de HPV16 L1 como grandes colunas dentro de uma faixa de 45-60 KD. A reatividade para colunas de PM menor é provável devido a produtos de degradação proteolítica. Ambos anticorpos monoclonais não foram reativos com lisados de células Sf-9 não infectadas ou células deinseto infectadas com baculovírus selvagem (AcMNPV). Proteínas selvagens de BPV1 L1 ou de HPV 16 L1 foram usadas comocontroles. A figura 2b mostra que a antigenicidade dos peptídeos L2 incorporados foi verificada com anticorpo monoclonal RG-1 (A, B, J) ou soros de coelho policlonais para aa 1-88 L2 de HPV16 (C) e aa 11-200 L2 de HPV16 (D, E, F, G, H, I) respectivamente. D, E, e F foram usados como gradiente para proteínas fusionadas purificadas.

[0009] A figura 3 mostra uma microscopia eletrônica detransmissão (MET) de preparações de partícula purificadas, 30.000x: as proteínas quiméricas BL1-16L2 18-31 (A), 17-36 (B), 2-22 (C), 75112 (E), 115 - 154 (F), 149-175 (G) e 172-200 (H) e 16L1-16L2 17-36 (J) se encaixam em VLP, com um tamanho de aproximadamente 5060 nm. BL1-16L2 35-75 (D) e BL1-16L2 13-107 (I) não formaminequivocamente capsômeros ou VLP.

[00010] A figura 4 mostra imunizações BPV L1-HPV16 L2 (BL1- 16L2) 17-36 de coelhos e camundongos, usando adjuvante de Freund ou Alúmen-MPL e imunizações HPV16 L1-HPV16 L2 (16L1-16L2) 1736 de coelhos, usando adjuvante Alúmen-MPL: Avaliação por ELISA para peptídeo L2. ELISAs foram realizados em triplicatas para 5 diluições seriadas de soro de 100 até 7.812.500. O ELISA foi realizado usando peptídeo sintético aa 18-31 L2 HPV16 como antígeno. Os dados dos antissoros de BL1-16L2 17-36 indicam títulos de anticorpo específicos de L2 de 62.500-312.500 em NZW usando Freund como adjuvante ( figura 4a), títulos de 12.500 em NZW utilizando Alúmen- MPL (figura 4b), e títulos de 2.500-12.500 em Balb/c utilizando Alúmen-MPL como adjuvante ( figura 4c). Os dados dos antissoros de 16L1-16L2 17-36 indicam títulos de anticorpo específicos de L2 de 12.500 em NZW utilizando Alúmen-MPL ( figura 4d). O anticorpo monoclonal RG-1 é dirigido contra aa 17-36 L2 de HPV16 (18). Os dados são mostrados como OD média +/- DP.

[00011] A figura 5 mostra a neutralização de vírions nativos de HPV2a por antissoros para RG1-VLP (HPV 16 L1/L2 (17-36)) (Ensaio de Neutralização por RT-PCR). Os vírions de HPV2a foram isolados de uma verruga plantar humana, incubados na presença ou na ausência de soros indicados na diluição final 1:400, e adicionados a células HaCaT (colunas 2-6). RNA foi transcrito reversamente em DNAc e o RNA viral ligado foi detectado por dois ciclos de dupla amplificação por PCR, e o RNA de beta-actina foi detectado por um ciclo de PCR como um controle. coluna 1, somente células HaCaT; coluna 2, somente HPV2, sem adição de soro; coluna 3, anti-HPV2 L1- VLP; coluna 4, anti-RG1-VLP pré-imune; coluna 5, anti-RG1-VLP imune; coluna 6, anti-HPV16 selvagem L1/L2-VLP selvagem. Os soros foram testados na diluição final de 1:400.

[00012] A figura 6 mostra um alinhamento das sequências dos peptídeos L2 de múltiplos tipos (não todos) de papilomavírus humano e animal correspondentes aos aminoácidos 17-36 do HPV 16 L2. As sequências na Tabela, correndo de cima para baixo, são representadas pelas SEQ ID NOs: 3 até 23.

DESCRIÇÃO

[00013] Os presentes inventores demonstram neste pedido que vários peptídeos (epítopos) L2 da região N-terminal da proteína L2, por exemplo, o peptídeo de resíduos de aminoácidos de aproximadamente 17-36 de L2 do HPV16, ou sequências comparáveis (equivalentes) de outros tipos de papilomavírus (PV), quando incorporado na alça da superfície DE da proteína L1 do papilomavírus (PV), formam proteínas recombinantes fusionadas (quiméricas) que se unem à VLP; e que estes quiméricos de L1-L2 VLP, quando introduzidos em animais, induzem respostas neutralizantes por anticorpo de amplo espectro a uma ampla faixa de papilomavírus de mucosa de alto risco, baixo risco, cutâneo e do tipo beta. As respostas imunes fortes e duráveis são consideravelmente mais altas do que a proteína fusionada linear. Sem desejar estar ligado a qualquer mecanismo particular, é sugerido que estas fortes respostas imunes resultam da exposição do epítopo no denso arranjo repetitivo de VLP.

[00014] Os inventores também sugerem que os resíduos de aminoácido do peptídeo 17-36 de L2 do HPV16, ou sequências comparáveis (equivalentes) de outras cepas de papilomavírus (PV), quando introduzidos em outros sítios de L1, de tal forma que o peptídeo L2 é exposto na superfície da VLP que é formado, também se montam em VLP L1-L2 quimérico que, quando introduzidos em animais, induzem respostas neutralizantes por anticorpo de amplo espectro a uma ampla faixa de papilomavírus de mucosa de alto risco, baixo risco, cutâneo e do tipo beta.

[00015] Dessa forma, uma sequência particular do peptídeo L2, e/ou o sítio L1 no qual o peptídeo L2 é introduzido, são fatores que contribuem para a indução da reatividade cruzada/neutralização forte, de amplo espectro das VLPs da invenção.

[00016] Em aspectos da invenção, uma ou mais das composições de VLP da invenção são usadas como uma composição imunogênica ou vacina. Nas modalidades da invenção, uma composição de VLP pode ser usada para profilaxia (por exemplo, prevenção) ou tratamento de infecção por papilomavírus e doença associada, e/ou pode ser combinada com um veículo farmacêutico. Em certos aspectos, uma composição é administrada a um indivíduo antes, depois, e/ou durante a exposição do vírus para minimizar ou prevenir a infecção do vírus ou para reduzir a severidade da infecção e retardar ou parar a progressão da doença, ou para prevenir a transmissão de um vírus do hospedeiro infectado de outro indivíduo que não tem tal infecção de vírus através da vacinação do hospedeiro infectado ou do indivíduo não infectado.

[00017] As vantagens das composições da VLP da invenção, e os métodos de utilização deles para imunizar indivíduos, incluem a porção L2 que provoca respostas de neutralização por anticorpo contra um amplo espectro de HPV, sem interferir na capacidade de VLP de induzir níveis de alta titulação de anticorpo anti-L1. O veículo da vacina de VLP L1 é bem tolerado e fornece imunogenicidade a longo prazo (pelo menos 6 anos até agora). Dessa forma, as vacinas baseadas em VLP de L1 HPV 16 como veículo de epítopos de L2 oferecem a vantagem de induzir, com um construto único, ambos os anticorpos restritos a tipo HPV16 L1, bem como anticorpos anti-L2 de neutralização de reatividade cruzada. A ampla reatividade cruzada reduz a necessidade de testes de rastreamento para determinar uma infecção por HPV e/ou uma neoplasia intraepitelial, e reduz a necessidade de produzir formulações altamente multivalentes de vacinas de VLP L1 para cobrir toda a doença causada pelos tipos de HPV, por meio disso reduzindo os custos. As composições da invenção fornecem uma vacina de baixo custo, largamente protetora que é estável, pode ser produzida em larga escala, e pode ser administrada sem agulhas. O baixo custo permite o uso em países em desenvolvimento, onde ocorre 80% da carga de câncer cervical global.

[00018] Esta invenção relaciona-se, por exemplo, a uma composição de partículas similares a papilomavírus (VLP) montadas (compreendendo, consistindo de) a partir de um polipeptídeo quimérico compreendendo uma proteína L1 do papilomavírus (PV), na qual está inserido um peptídeo exposto na superfície consistindo da seguinte sequência de uma proteína L2 do papilomavírus:a)(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)C PPD(I/V)(W/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L) (SEQ ID NO: 1), oub) abYcdCKefghCPPDijklm (SEQ ID NO:2), onde a = (D/Q/H/E); b = (L/I); c = (K/P/R/Q/S); d = (T/S/A/G); e = (Q/I/V/L/A); f = (A/S/T); g = (G/N); h = (T/N); i = (FV); j = (I/V/Q); k = (P/N/D); l = (K/R); m = (V/I/L), ouc) uma sequência que é pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% idêntica a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO: 2.

[00019] Como usado neste pedido, as formas singulares "um", "uma", "a" e "o" incluem os referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa forma, por exemplo, o termo "montado a partir de um polipeptídeo quimérico", como usado acima, engloba mais de um polipeptídeo quimérico.

[00020] Uma sequência consenso desta porção de L2 foi primeiro estabelecida por um dos presentes inventores e colaboradores em Gambhira et al. (2007b) J Virol 81, 13927-31, alinhando as sequências altamente conservadas nesta porção da proteína L2 de uma variedade de espécies de PV. Este alinhamento original é mostrado na Figura 6 deste pedido, e é publicado em cores como figura 1A no artigo Gambhira (2007b), o qual está incorporado por referência neste pedido, especificamente com referência àquela figura e à sequência consenso derivada disto. Posteriormente, os presentes inventores estenderam o alinhamento para incluir variedades adicionais de espécies de PV, como são mostrados na Tabela 1 abaixo, e modificaram as sequências de consenso de acordo. As sequências consenso modificadas estão representadas por SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2.Tabela 1

[00021] O epítopo RG1 L2 de HPV16 (L2 17 - 36) é altamente conservado entre os tipos de HPV de mucosa (tipos de alto risco sublinhados) e pele e induz neutralização cruzada (^)SEQ ID(NO:9) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV(NO:24) QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV(NO:25) QLYKTCKQSGTCPPDIIPKV(NO:26) QLYKTCKQAGTCPPDVIPKIpolar) PV (90%)(NO:22) DLYRTCKQAGTCPPDVIPKV (NO:27) DLYRTCKQAGTCPPDVIPKV (NO:28) DLYRTCKQAGTCPPDIIPRV (NO:29) DLYRTCKQAGTCPPDIIPRL (NO:30) DLYRTCKQAGTCPPDIIPRV (NO: 16) QLYRTCKA AGTCPPDVIPKV (NO:31) ELYKTCKAAGTCPPDVIPKV (NO:32) QLYQTCKAAGTCPPDVIPKV (NO:33) QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV (NO:34) QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV (NO:35) ELYKTCKVAGTCPPDVIPKV (NO:36) QLYSTCKAAGTCPPDVIPKV (NO:37) QLYQTCKAAGTCPSDIIPKV (NO:38) QLYQTCKAAGTCPSDIIPKV (NO:39) QLYQTCKAAGTCPPDVVNKV (NO: 10) DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV (NO:40) QLYRTCKASGTCPPDVIPKV (NO:41) QLYRTCKASGTCPPDVIPKV (NO:42) QLYRTCKASGTCPPDVIPKV (NO:43) ELYKTCKQSGTCPPDVINKV (NO:44) DLYRTCKAAGTCPPDVIPKV (NO: 14) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (NO: 15) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (NO:45) DLYKTCKAAGTCPPDVIPKI (NO:46) DLYKTCKAAGTCPPDVIPKI (NO:47) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (NO:48) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (NO:7) QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV (NO:8) QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(NO: 13) QLYQTCKA FGTCPPD VIPKV (NO:49) DLYRTCKQSGTCPPD VVPKV (NO:5) HIYQTCKQAGTCPPDVINKV(NO:6) HIYQTCKQAGTCPPDVINKV(NO: 12) QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI(NO:11) DLYRTCKQSGTCPPDVINKV(NO:50) QLYQTCKASGTCPPDVIPKI(NO:51) HIYQSCKAAGTCPPDVLNKV(NO:52) DIYRGCKAS N TCPPDVINKV(NO:3) DIYPSCKISNTCPPDIQNKI HPV1 (50%)(NO:53) NLYAKCQI SGNCLPDVKNKV(NO:21) DIYPTCKIAGNCPADIQNKF

[00022] A sequência L2 pode virvariedade de espécies de PV. Os peptídeos L2 típicos que são adequados incluem, por exemplo, aqueles listados na figura 6 e na tabela 1. Em uma modalidade da invenção, os peptídeos L2 são selecionados a partir de peptídeos que são mostrados neste pedido como sendo reativo-cruzados (neutralizante cruzado). Em outras modalidades da invenção, os peptídeos L2 são selecionados a partir de tipos de mucosa de alto risco (por exemplo, tipos mais comuns que causam o câncer cervical: HPV 16, 18, 31, 33, 45, 52 ou 58), ou de tipo de HPV de pele. Por exemplo, os peptídeos L2 adequados incluem:o peptídeo de aminoácidos 17-36 da proteína L2 de HPV16, tendo a sequência de aminoácidos QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO: 9);o peptídeo de aminoácidos correspondentes da proteína L2 de HPV 18, tendo a sequência de aminoácidos DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV (SEQ ID NO: 10);o peptídeo de aminoácidos correspondentes da proteína L2 de BPV1, tendo a sequência de aminoácidosDLYRTCKQAGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO:22); o peptídeo de aminoácidos correspondentes da proteína L2 de HPV38, tendo a sequência de aminoácidos DIYRGCKASNTCPPDVINKV (SEQ ID NO:52);o peptídeo de aminoácidos correspondentes da proteína L2 de HPV1, tendo a sequência de aminoácidos DIYPSCKISNTCPPDIQNKI (SEQ ID NO:3); ouo peptídeo de aminoácidos correspondentes da proteína L2 de HPV4, tendo a sequência de aminoácidosNLYAKCQLSGNCLPDVKNKV (SEQ ID NO:53).

[00023] Em modalidades deste aspecto da invenção, o peptídeo L2 é inserido em uma alça da proteína L1 tal qual o peptídeo L2 seja exposto na superfície da VLP que se forma. Por exemplo, o peptídeo L2 pode ser inserido na alça DE ou na alça da hélice b4 da proteína L1.

[00024] Nas modalidades da invenção,a proteína L1 é do HPV16 (incluindo uma variante de HPV16 diferente da variante de 114 K, que é exemplificada neste pedido), e o peptídeo L2 é inserido entre os aminoácidos 136 e 137 na alça DE da proteína L1 (a sequência da proteína L1 do HPV16 é SEQ ID NO:85); oua proteína L1 é do BPV1, e o peptídeo L2 é inserido entre os aminoácidos 133 e 134 na alça DE da proteína L1 (a sequência da proteína L1 do BPV16 é SEQ ID NO:83).

[00025] Outro aspecto da invenção é uma composição de partículas similares a papilomavírus (VLP) montadas (compreendendo, consistindo de) a partir de um polipeptídeo quimérico compreendendo uma proteína L1 do HPV16, no qual é inserido, na alça DE, um peptídeo consistindo dea)(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N) CPPD(I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)EG (SEQ ID NO:54), oub) abYcdCKefghCPPDijklmEG (SEQ ID NO:55), onde a = (D/Q/H/E); b = (L/I); c = (K/P/R/Q/S); d = (T/S/A/G); e = (Q/I/V/L/A); f = (A/S/T); g = (G/N); h = (T/N); i = (I/V); j = (I/V/Q); k = (P/N/D); l = (K/R); m = (V/I/L), ouc) uma variante da SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO:55 onde falta um aminoácido da região N-terminal e/ou um ou dois aminoácidos da região C-terminal, oud) uma sequência que é pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% idêntica a SEQ ID NO:54 ou SEQ ID NO:55, oue) um peptídeo que reage com um antissoro (por exemplo, um antissoro de coelho) a L2 do HPV16 (17-36) (SEQ ID NO:9), ou com um anticorpo monoclonal do peptídeo L2 do HPV16 (17-36) (SEQ ID NO:9).

[00026] Nas modalidades da invenção, o peptídeo inserido na alça DE consiste na seguinte sequência da proteína L2 do HPV16 (aminoácido 17-38): QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO:56); ou uma variante da SEQ ID NO:56 onde falta um aminoácido na região N-terminal e/ou um ou dois aminoácidos na região C-terminal. Exemplos de tais peptídeos variantes incluem o peptídeo L2 do HPV16 (17-36) tendo a sequência QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO:9), e o peptídeo L2 do HPV16 (18-38) tendo a sequência LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO:57).

[00027] Em modalidades deste aspecto da invenção, na qual o peptídeo L2 é inserido na alça DE de L1,a proteína L1 é do HPV16, e o peptídeo L2 é inserido entre os aminoácidos 136 e 137 na alça DE da proteína L1. Para fins de referência, a sequência de aminoácidos completa de L1 do HPV16 é fornecida em outro lugar neste pedido, como SEQ ID NO:85; oua proteína L1 é do BPV1, e o peptídeo L2 é inserido entre os aminoácidos 133 e 134 na alça DE da proteína L1. Para fins de referência, a sequência de aminoácidos completa de L1 do BPV1 é fornecida em outro lugar neste pedido, como SEQ ID NO:83.

[00028] Para qualquer uma das composições de VLP da invenção, uma variedade de combinações das proteínas/peptídeos de L1 e L2 pode ser usada. Por exemplo,

[00029] As proteínas L1 e L2 podem ser de um vírus de papiloma humano (HPV);a proteína L1 pode ser de um BPV, tal como BPV1, o muito estreitamente relacionado a BPV2, ou qualquer outro dos pelo menos 10 tipos de BPV que já foram identificados (por exemplo, BPV4); oua proteína L1 e/ou a proteína L2 podem ser de um PV que não um HPV.

[00030] Em aspectos da invenção, a proteína L1 é uma variante da L1 exemplificada neste pedido. Algumas dessas tais variantes são discutidas em outro lugar neste pedido. Estes incluem, por exemplo, quimeras de genes L1 derivados de diferentes tipos de HPV como estrutura, bem como as versões truncadas de L1 que se encaixam em VLP ou capsômeros.

[00031] Em aspectos da invenção, uma VLP da invenção é uma composição imunogênica, que, por exemplo, induz uma resposta imune humoral ou celular, específica para o antígeno ou inata. Uma VLP da invenção pode ser imunogênica contra 1, 2, 3, 4, 5, ou mais de tipos de mucosa de alto risco (por exemplo, HPV16, 18, 31, 33, 45, 52, 58, 68, ou 76), tipos de mucosa de baixo risco (por exemplo, HPV6 e 11), HPV13, 32 que causam doença de Heck (hiperplasia epitelial focal de mucosa oral), tipos cutâneos de baixo risco (tipos de pele do trópico) causando verrugas de pele (por exemplo, HPV1, 2, 3, 4, 7, 10, 27, 57, etc.) e/ou tipos beta cutâneos (por exemplo, tipos beta HPV5, 8, 9, 12, 14, 15, 38, etc.) de papilomavírus, ou tipos de papilomavírus animal. Quanto à nomenclatura de PV, todos os PV beta são tipos cutâneos. Entretanto, os tipos cutâneos são normalmente referidos como aqueles que induzem a verruga comum de pele palmar, plantar ou plana (estes são encontrados nos gêneros alfa, gama, mu, nu). Os tipos beta geralmente induzem somente verrugas de pele (ou câncer de pele) em pacientes EV ou pacientes imunossuprimidos.

[00032] Outro aspecto da invenção é uma composição de VLP ou capsomérica da invenção que ainda compreende um adjuvante, ou uma vacina compreendendo uma composição de VLP da invenção e um adjuvante. Uma vacina da invenção pode ser eficaz contra papilomavírus humano (por exemplo, contra papilomavírus de mucosa de alto risco, baixo risco, cutâneo e beta (por exemplo, tipo beta HPV 5)). Uma vacina da invenção pode ser formulada em uma variedade de maneiras, incluindo uma forma liofilizada ou em pó, uma formulação para administração por inalação, ingestão (por exemplo, como uma pílula), em um vetor viral ou bacteriano, ou como um componente de um lubrificante sexual. Um modo da administração é similar àquele das vacinas para HPV atualmente existentes, para a inoculação i.m. com o adjuvante (por exemplo, alumén ou alúmen-MPL). Para a administração em países em desenvolvimento, que podem necessitar da refrigeração adequada, as formulações para liofilizado, inalação, ingestão, ou vetores virais ou bacterianos podem ser mais adequadas.

[00033] Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo quimérico, compreendendo uma proteína L1 do papilomavírus (PV) (por exemplo, uma proteína L1 do HPV16), no qual é inserido um peptídeo exposto na superfície consistindo de uma das seguintes sequências de uma proteína L2 do papilomavírus:a)(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)C PPD(I/V) (I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L) (SEQ ID NO: 1), ou b) abYcdCKefghCPPDijklm (SEQ ID NO:2), onde a = (D/Q/H/E); b = (L/I); c = (K/P/R/Q/S); d = (T/S/A/G); e = (Q/I/V/L/A); f = (A/S/T); g = (G/N); h = (T/N); i = (I/V); j = (I/V/Q); k = (P/N/D); l = (K/R); m = (V/I/L), ouc) uma sequência que é pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% idêntica a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO: 2, ouum polipeptídeo quimérico montado (compreendido, consistindo de) a partir de uma proteína L1 do papilomavírus (PV), na qual é inserido, na alça DE, um peptídeo consistindo de d)(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)C PPD(I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L) EG (SEQ ID NO:54), oue) abYcdCKefghCPPDijklmEG (SEQ ID NO:55), onde a = (D/Q/H/E); b = (L/I); c = (K/P/R/Q/S); d = (T/S/A/G); e = (Q/I/V/L/A); f = (A/S/T); g = (G/N); h = (T/N); i = (I/V); J=QJVtQ); k = (P/N/D); l = (K/R); m = (V/I/L), ouf) uma variante da SEQ ID NO:54 ou SEQ ID NO:55 onde falta um aminoácido na região N-terminal e/ou um ou dois aminoácidos na região C-terminal, oug) uma sequência que é pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% idêntica a SEQ ID NO:54 ou SEQ ID NO:55, ouh) um peptídeo que reage com um antissoro (por exemplo, um antissoro de coelho) para L2 do HPV16 (17-36) (SEQ ID NO:9), ou com um anticorpo monoclonal para o peptídeo L2 do HPV16 (17-36) (SEQ ID NO:9).

[00034] Outros aspectos da invenção são um ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA, ou outras formas de ácido nucleico) que codifica um polipeptídeo da invenção; um vetor de expressão (por exemplo, derivado de sequências regulatórias virais ou bacterianas) compreendendo tal ácido nucleico, que está operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; e uma célula hospedeira compreendendo tal polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor de expressão.

[00035] Outro aspecto da invenção é um método para produção de uma composição de VLP ou capsômero, compreendendo incubação de um polipeptídeo quimérico como acima sob condições adequadas para automontagem.

[00036] Outro aspecto da invenção é um método para imunização ou vacinação de um indivíduo contra um PV (por exemplo, HPV), compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de VLP ou capsômero da invenção.

[00037] Outro aspecto da invenção é um método para indução de uma resposta imune contra HPV em um indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de VLP ou capsômero (por exemplo, uma composição imunogênica ou uma vacina) da invenção. A resposta imune pode ser humoral ou celular, específica para o antígeno ou inata.

[00038] Outro aspecto da invenção é um método para tratar uma infecção por PV em um indivíduo tendo uma infecção por PV ou em risco de estar exposto ao PV, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de VLP ou capsômero (por exemplo, uma composição imunogênica ou uma vacina).

[00039] Outro aspecto da invenção é um método para prevenção de câncer cervical, anogenital, orofaringeal, ou um pré-câncer, em um indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de VLP. "Pré-câncer", como usado neste pedido, refere-se aos precursores de cânceres cervicais e outros anogenitais, tais como lesão intraepitelial de alto grau e de baixo grau, HSIL, LSIL (ou CIN, VIN, AIN etc., de acordo com as regiões anatômicas, cérvix, vulva e ânus, respectivamente). Estas condições já são conhecidas por serem prevenidas pelas vacinas atuais de VLP L1, e seriam esperadas como sendo prevenidas pelas composições de VLP da presente invenção.

[00040] Outro aspecto da invenção é um conjunto compreendendo uma composição de VLP ou capsômero da invenção, ou compreende anticorpos que se ligam a uma composição de VLP da invenção.

[00041] Outro aspecto da invenção é um anticorpo profilático ou terapêutico ou soro imune gerado pela vacinação com uma composição de VLP da invenção, que pode ser administrada a um indivíduo saudável ou doente, respectivamente, para prevenir ou tratar uma infecção por PV.

[00042] Outro aspecto da invenção é uma composiçãocapsomérica, compreendendo um polipeptídeo quimérico L1/L2 da invenção que se automontou em um capsômero (capsômero,subunidade estrutural pentamérica de L1) em vez de em uma VLP. Métodos para geração de tais capsômeros são convencionais na técnica. vide, por exemplo, J Virol 1998 Jan; 72(1):32-41; J Virol 1998 Mar; 72(3):2160-7; Thones et al. (2007) Virology 369, 375-388; ou Bishop et al. (2007), The Journal of Biological Chemistry 282, 3180331811, todos os quais estão incorporados por referência, particularmente por suas descrições de métodos para gerar capsômeros. Um modo de geração de capsômeros é truncar uma proteína L1, ou usar um gene L1 mutado (por exemplo, carregando as mutações C175A e C428A), que inibem sua capacidade de formar uma VLP. vide, por exemplo, J MoI Bio 2001 Mar 16; 307(l):173-82; J Virol 1997 Apr; 71 (4):2988-95, ambos as quais estão incorporadas por referência, particularmente quanto a tais métodos.

[00043] Outro aspecto da invenção é um método para indução de uma reação imunológica (proteção contra infecção) para HPVs de pele tipo alfa (por exemplo, HPV2, 3) em um indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de VLP da invenção. HPV2 está estreitamente relacionado aos tipos HPV27 e 57, que em conjunto com HPV1 são os tipos mais comumente encontrados em verrugas de pele. HPV3, e o tipo estreitamente relacionado HPV10, são tipos cutâneos alfa de baixo risco que são comumente encontrados em verrugas de pele planas, ambas em pacientes imunocompetentes, ou em imunocomprometidos (por exemplo, transplante renal) ou em pacientes EV.

[00044] Uma "partícula similar a papilomavírus (VLP)" quimérica da invenção, como usada neste pedido, refere-se a um capsídeo viral vazio que é composto por moléculas proteicas L1 do papilomavírus, nas quais são inseridos peptídeos do menor capsídeo viral, L2. Os peptídeos inseridos estão inseridos em uma região adequada da proteína L1 para que sejam expostos na superfície da VLP. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo L2 é inserido na alça DE de L1, por exemplo entre os aminoácidos 133 e 134 do BPV1, entre os aminoácidos 136 e 137 da L1 do HPV16, ou entre os sítios equivalentes das moléculas de L1 de outros papilomavírus. O peptídeo inserido compreende um ou mais epítopos (por exemplo, epítopos neutralizantes) que são reativo-cruzados com um amplo espectro de tipos de PV. Em uma modalidade, o peptídeo L2 compreende os aminoácidos 17-36 da proteína L2 do HPV16, ou uma sequência de aminoácidos equivalente de outro papilomavírus. As proteínas quiméricas L1 montam-se espontaneamente em VLP e se assemelham a vírions nativos tanto em estrutura como em imunogenicidade, contudo necessitam do ácido nucleico e dessa forma não são oncogênicas e infecciosas.

[00045] A proteína L1 na qual um peptídeo L2 é inserido pode ser de qualquer uma de uma variedade de tipos (cepas) do papilomavírus (PV). Por exemplo, VLPs podem ser usadas para proteger qualquer um de uma variedade de animais contra a infecção por PV, incluindo, por exemplo, gado e caninos; para tais VLPs, a L1 pode ser de cepas de PV que são conhecidas por infectar aqueles animais, por exemplo, BPV1, BPV2, BPV4, BPV6, ou PV oral canino (COPV). Em uma modalidade, as VLPs são usadas para proteger humanos contra a infecção por HPV; para tais VLPs, a L1 pode ser de qualquer tipo de HPV (por exemplo, HPV 16, 18, 45, 6, 11, 1, 2, 4, 5 ou 8). Alternativamente, BPV pode ser um veículo de vacina adequado para o uso em humanos, particularmente em pacientes que tiveram uma exposição prévia à cepa de HPV tipicamente usada para formar a composição de VLP. VLP nas quais a proteína L1 é derivada de BPV e HPV 16 são exemplificadas neste pedido; os construtos compreendendo outras fontes da proteína L1 serão evidentes para um especialista.

[00046] Nos exemplos neste pedido, a proteína L1 é essencialmente a versão selvagem, exceto pela inserção do peptídeo L2. Entretanto, um especialista reconhecerá que as variantes da proteína L1 também podem ser usadas, contanto que a proteína possa tolerar a inserção de um peptídeo L2 adequado, sem perder sua antigenicidade, e que ele possa montar-se em uma VLP, ou pelo menos em um pentâmero (capsômero). Vários exemplos de tais variantes foram descritos. Por exemplo, pode usar uma L1 truncada, sem até 10 aminoácidos da sua região N-terminal ou sem até 30 aminoácidos da sua região C-terminal. (Vide, por exemplo, J MoI Bio 2001 Mar 16; 307 (l):173-82, ou Bishoop et al. (2007) The Journal of Biological Chemistry 282, 31803-31811, ambos os quais sãoincorporados por referência por sua revelação de criação e utilização de tais proteínas L1 truncadas). Em outra modalidade, uma pequena fusão a um peptídeo de aproximados 60 aminoácidos pode ser usada. (Vide, por exemplo Virology 1997 JuI 21; 234 (1):93-111, que éincorporado por referência da sua revelação de tais peptídeos de fusão.) Em outra modalidade, moléculas de L1 híbridas podem ser usadas, nas quais uma porção da molécula de uma primeira cepa de PV é trocada em uma molécula L1 de uma segunda cepa de PV. Por exemplo, certas porções funcionais da molécula L1, tais como "alças" externamente expostas da proteína, podem ser trocadas entre moléculas de cepas diferentes de PV. Para exemplos de tais proteínas de L1 híbridas, ver, por exemplo, 2001 Dec, Virology 20:291 (2):324-34 ou Oroczo et al. (2005) J Virol 79, 9503-9514, ambos os quais são incorporados por referência por suas revelações de tais proteínas de L1 híbridas. Outros tipos de variantes serão evidentes para um especialista. Vide, por exemplo, J Virol 2006 May; 80 (10):4664-72; White et al. (1999) Virology J 73, 4882-4889; ou Roden et al. (1997) J Virol 71, 6247-52, todos os quais são incorporados por referência neste pedido por suas revelações de outros tipos de variantes adequadas de L1.

[00047] Um peptídeo L2 pode ser engendrado em uma proteína L1 em qualquer um de uma variedade de sítios da proteína L1, contanto que o inserto seja exposto na superfície da VLP e que a inserção não interfira na antigenicidade da proteína L1 ou na capacidade da proteína de montar-se em uma VLP. A cristalização da VLP L1 de HPV16 descreveu a estrutura atômica do capsídeo viral, em particular as alças de superfície hipervariáveis que contêm os epítopos imunodominantes e dependentes da conformação que são reconhecidos na neutralização por anticorpos e que determinam o sorotipo viral (Chen et al. (2000) Molecular Cell 5, 557-567).Consequentemente, os sítios adequados para inserção de um peptídeo L2 na proteína L1 serão evidentes para um especialista. Estes incluem, por exemplo, a alça em hélice b4 (por exemplo, entre os aminoácidos 430 e 433 da L1 do HPV16). Em uma modalidade da invenção, o peptídeo L2 é inserido na alça DE (por exemplo, entre os aminoácidos 133/134 do BPV, ou os aminoácidos equivalentes 136/137 do HPV, que é exemplificado neste pedido. Os sítios de inserção equivalentes de outros PVs também podem ser usados.

[00048] Qualquer um da variedade de peptídeos L2 pode ser inserido em uma proteína L1 para formar uma VLP da invenção. Em uma modalidade, o peptídeo estende-se do aminoácido 17-36 de L2 do HPV16, e tem a sequência QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO:9). Um especialista reconhecerá que esta sequência é altamente conservada entre a variedade das cepas do PV, e que peptídeos comparáveis podem ser selecionados a partir da região equivalente de qualquer uma da variedade de proteínas L2 a serem inseridas em uma proteína L1.

[00049] Por exemplo, o epítopo L2 de HPV pode compreender sequências equivalentes de um papilomavírus dentro do gênero α, ou gêneros β, Y, δ, ε, Z, n, θ, i, K, A, μ, v, %, o, π (vide, por exemplo, de Villiers et al. (2004) Virology 324, 17-27); e/ou dos papilomavírushumanos: HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24,HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32,HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40,HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48,HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56,HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64,HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72,HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80,HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100 até HPV 127; e/ou papilomavírus animal: papilomavírus bovino tipo 1 (BPV1), papilomavírus bovino tipo 2 (BPV2), papilomavírus bovino tipo 4 (BPV4), papilomavírus decoelho do mato (CRPV), papilomavírus de cervo (DPV), papilomavírus de alce europeu (EEPV), papilomavírus oral canino (COPV), papilomavírus de macaco Rhesus (RhPV) e papilomavírus oral de coelho (ROPV).

[00050] Um antígeno de HPV ou epítopo ou peptídeo da invenção podem compreender uma sequência de aminoácidos consecutiva do aminoácido x ao aminoácido y do polipeptídeo L2 do HPV16 SEQ ID NO:81, em que em x é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, e y é o aminoácido 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, ou 43. Um antígeno de HPV ou epítopo ou peptídeo da invenção podem compreender cerca de 20 aminoácidos, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos consecutivos. Em certas modalidades, o peptídeo L2 é um epítopo de HPV16 (SEQ ID NO:9), um epítopo de HPV18 (SEQ ID NO: 10), ou epítopo de HPV45 (SEQ ID NO: 11). Em aspectos adicionais, o peptídeo L2 compreende os aminoácidos 17-36 de SEQ ID NO:81 (L2 de HPV16 17-36 (SEQ ID NO:9)). Enquanto este fragmento é designado 17-36 baseado em HPV16 a posição de aminoácido real de outros tipos de HPV pode diferenciar-se, mas são facilmente identificadas pelo alinhamento com as sequências de HPV16 reveladas neste pedido (sequências "equivalentes" ou "comparáveis"). Em certos aspectos, o peptídeo L2 é pelo menos ou mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à SEQ ID NO:9. Em certas modalidades o peptídeo L2 compreende a sequência de aminoácidos consenso(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)C PPD(I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L) (SEQ ID NO:1), ouabYcdCKefghCPPDijklm (SEQ ID NO:2), onde a = (D/Q/H/E); b = (L/I); c = (K/P/R/Q/S); d = (T/S/A/G); e = (Q/I/V/L/A); f = (A/S/T); g = (G/N); h = (T/N); i = (I/V); j = (I/V/Q); k = (P/N/D); 1 = (K/R); m = (V/I/L).

[00051] Como usado neste pedido, o termo "antígeno" é uma molécula capaz de ser ligada a um anticorpo ou ao receptor de célula T. Um antígeno é adicionalmente capaz de induzir uma resposta imune humoral e/ou resposta imune celular que leva à estimulação de linfócitos B e/ou T. O aspecto estrutural de um antígeno que dá origem a uma resposta biológica é referido neste pedido como um "determinante antigênico" ou "epítopo" e são sinônimos. Os linfócitos B respondem a determinantes antigênicos estranhos via produção de anticorpo, ao passo que os linfócitos T são os mediadores da imunidade celular. Dessa forma, os determinantes antigênicos ou epítopos são aquelas partes de um antígeno que são reconhecidas pelos anticorpos, ou no contexto de um MHC, pelos receptores de célula T. Um determinante antigênico ou epítopo não têm que ser uma sequência contígua/consecutiva ou o segmento da proteína e devem incluir várias sequências que não são imediatamente adjacentes entre si.

[00052] Quanto a uma sequência de aminoácidos particular, um "epítopo" é um conjunto de resíduos de aminoácido que está envolvido no reconhecimento por uma imunoglobulina particular, ou no contexto de células T, aqueles resíduos necessários para o reconhecimento por proteínas do receptor da célula T e/ou receptores do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC). Os resíduos de aminoácido de um epítopo não têm que ser contíguos/consecutivos. Em uma colocação no sistema imune, in vivo ou in vitro, um epítopo são as características coletivas de uma molécula, tais como estrutura primária, secundária e terciária do peptídeo, e carga, que em conjunto forma um sítio reconhecido por uma imunoglobulina, receptor de célula T ou molécula de HLA. Em todas as partes desta revelação, "epítopo" e "peptídeo" muitas vezes são usados intercambiavelmente.

[00053] Como usado neste pedido, "epítopo de célula B" ou "epítopo alvo" (por exemplo, L2 de HPV), se refere a uma característica de um peptídeo ou proteína que é reconhecido por um receptor de célula B na resposta imunogênica ao peptídeo compreendendo aquele antígeno (por exemplo, um epítopo L2 de HPV (imunógeno ou epítopo alvo)).

[00054] Como usado neste pedido ""epítopo de célula T auxiliar" ou "epítopo Th" significa uma característica de um peptídeo ou proteína que é reconhecido por um receptor de célula T na iniciação de uma resposta imunológica ao peptídeo compreendendo aquele antígeno. Acredita-se geralmente que o reconhecimento de um epítopo de célula T por uma célula T é via um mecanismo em que as células T reconhecem fragmentos de peptídeo de antígenos que estão ligados às moléculas do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) de classe I ou classe II expressas nas células apresentadoras de antígeno. Em algumas modalidades da presente invenção, os epítopos ou fragmentos epitópicos identificados como descrito neste pedido encontram uso na detecção das células apresentadoras de antígeno tendo moléculas de MHC capazes de ligação e exposição dos epítopos ou fragmentos.

[00055] Como usado neste pedido, "HPV" e "papilomavírus humano" referem-se aos membros da família Papilomavírus que são capazes de infectar humanos. Há dois grupos principais de HPVs definido pelo seu tropismo (genital/mucosa e grupos cutâneos), cada um dos quais contém múltiplos "tipos" ou "cepas" virais (por exemplo, HPV16, HPV18, HPV31, HPV32, etc.). De interesse particular na presente invenção são tipos de HPV que estão associados com infecção genital e malignidade, bem como aqueles que produzem papilomas benignos, tanto na mucosa como na pele, resultando em morbidade para o paciente.

[00056] O termo "vacina" refere-se à formulação que contém 1, 2, 3, 4, 5, ou mais composições de VLP da presente invenção. Ascomposições de VLP estarão tipicamente em uma forma que é capaz de ser administrada a um indivíduo e induz uma resposta imune protetora ou terapêutica suficiente para induzir a imunidade para prevenir e/ou melhorar uma infecção e/ou reduzir pelo menos um sintoma de uma infecção e/ou aumentar a eficácia de outra terapia anti-HPV ou profilática. Tipicamente, uma vacina compreende uma salina convencional ou um meio de solução aquosa tamponada no qual a composição da presente invenção é suspensa ou dissolvida, embora a administração de pó seco, por exemplo, por inalação, e até formulação com um adjuvante adicional, tal como alúmen, também seja contemplada. A composição da presente invenção pode ser usada convenientemente para prevenir, melhorar, ou de outra maneira tratar uma infecção. Na introdução em um hospedeiro, uma composição imunogênica da invenção (por exemplo, uma vacina) é capaz de provocar uma resposta imune incluindo, mas não limitada a, a produção de anticorpos e/ou citocinas e/ou ativação de células T citotóxicas, células apresentadoras de antígeno, células T auxiliares, células dendríticas e/ou outras respostas celulares. Tipicamente, tal resposta será reativo-cruzada entre vários tipos de papilomavírus, incluindo, mas não limitados a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais tipos de HPV descritos neste pedido. Tipos reativo-cruzados particulares de HPV são discutidos em outro lugar neste pedido.

[00057] Como usado neste pedido, vacinas "profiláticas" e "preventivas", anticorpos ou soros imunes são vacinas, anticorpos ou soros imunes que são projetados e administrados para prevenir a infecção, a doença, e/ou alguma sequela(s) relacionada causada ou associada a um organismo patogênico, particularmente HPV.

[00058] Como usado neste pedido, vacinas "terapêuticas" são vacinas que são projetadas e administradas a pacientes já infectados com um organismo patogênico, tais como aqueles com pelo menos uma cepa de HPV. As vacinas terapêuticas (por exemplo, as vacinas terapêuticas para HPV) são usadas para prevenir e/ou tratar o desenvolvimento de tumores benignos ou malignos nestes indivíduos infectados.

[00059] Os termos "inibição", "redução" ou "prevenção", ou qualquer variação destes termos, quando usados nas reivindicações e/ou relatório descritivo incluem qualquer redução mensurável ou inibição completa para alcançar um resultado desejado, tal como inibição, redução, ou prevenção de infecção viral, extensão viral, crescimento viral ou transmissão viral.

[00060] Em todas as partes deste pedido de patente, o termo "aproximadamente" é usado para indicar que no valor inclui o desvio padrão de erro do dispositivo ou método que é empregado para determinar o valor.

[00061] É contemplado que um ou mais membros de uma lista fornecida neste pedido podem ser especificamente excluídos ou incluídos em uma invenção reivindicada.

[00062] Um "indivíduo", como usado neste pedido, inclui qualquer animal que foi infectado, ou está em risco de ser infectado com um papilomavírus. Indivíduos adequados (pacientes) incluem animais de laboratório (tais como camundongo, rato, coelho, porquinho da Índia ou porco), animais de fazenda (tais como gado), animais de esporte (tais como cães ou cavalos) e animais domésticos (tais como um cavalo, cão ou gato). Primatas não humanos e pacientes humanos estão incluídos.

[00063] Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo", como usados neste pedido, não estão restritos a nenhum número particular de aminoácidos; estes termos são algumas vezes usados intercambiavelmente neste pedido. As propriedades e sequências de aminoácido das proteínas da invenção, e dos ácidos nucleicos que as codificam, são bem conhecidas e podem ser determinadas rotineiramente, bem como descarregadas de vários bancos de dados conhecidos. Vide, por exemplo, bancos de dados NCBI GenBank. Algumas sequências são fornecidas neste pedido. Esta informação é exata desde a data do arquivamento deste pedido de patente. Entretanto, alguma informação sobre a sequência é rotineiramente atualizada (por exemplo, para corrigir erros das entradas anteriores), portanto a informação atualizada (corrigida) sobre as proteínas e ácidos nucleicos que as codificam está incluída neste pedido de patente. A informação fornecida pelos bancos de dados de sequência discutidos neste pedido está incorporada por referência no presente pedido de patente.

[00064] As proteínas quiméricas discutidas neste pedido sãoalgumas vezes referidas neste pedido como "proteínas da invenção".

[00065] Um aspecto da invenção é um método para produção deuma VLP (ou o componente de polipeptídeo da mesma) da invenção. Em uma modalidade da invenção, os epítopos de HPV são sintetizados usando métodos convencionais modificados para as sequências de aminoácido particulares. Tais técnicas incluem, por exemplo, métodos bem conhecidos pelos versados na técnica da síntese de peptídeo, por exemplo, síntese em fase de solução (ver Finn et al. em Proteins, 3rdEd., Neurath and Hill (Eds), Academic Press, NY, 2, 105-253, 1976), ou síntese em fase sólida [ver Barany et al. Em: The Peptides, Gross and Meienhofer (Eds) Academic Press, NY, 3-284, 1979), ou síntese em fase sólida gradual como relatado por Merrifield et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154), osconteúdos de cada um dos quais estão incorporados neste pedido por referência. Outras referências para técnicas de síntese de peptídeo incluem peptídeos sintetizados pelo modo Fmoc-poliamida de síntese de peptídeo em fase sólida como revelado por Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433, peptídeos sintetizados utilizando um procedimento Fmoc/tBu (Atherton et al. Em: Solid Phase Peptide Synthesis: A Pratical Approach, IRL Press, Oxford, 1989). Os aminoácidos de Fmoc podem ser obtidos de vários fornecedores, por exemplo, Chem-Impex International (Wood Dale, Ill., EUA), Merck Biosciences (Nottingham, UK), e Bachem UK Ltd. (St. Helens, UK).

[00066] Alternativamente, um polipeptídeo da invenção pode ser preparado recombinantemente. A presente invenção fornece clonagem recombinante e vetores de expressão contendo DNA, bem como a célula hospedeira contendo os vetores recombinantes. Os vetores de expressão contendo DNA podem ser usados para preparar os polipeptídeos ou fragmentos de polipeptídeo da invenção codificados por um DNA. Um método para produzir polipeptídeos compreende a cultura das células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão recombinante que codifica o polipeptídeo, sob condições que promovem a expressão do polipeptídeo, em seguida recuperando os polipeptídeos expressos da cultura. O versado reconhecerá que o procedimento para purificar os polipeptídeos expressos irá variar de acordo com fatores como tipo de células hospedeiras empregadas, e se o polipeptídeo é ligado à membrana ou tem uma forma solúvel que é secretada da célula hospedeira. Os polipeptídeos da invenção podem incluir várias sequências líder de tráfico direto ou auxiliar na purificação.

[00067] Qualquer sistema de expressão adequado pode ser empregado. Os vetores incluem DNA que codifica um polipeptídeo ou fragmento da invenção, operacionalmente ligados às sequências nucleotídicas adequadas regulatórias transcricionais ou traducionais, tais como aquelas derivadas de um gene de mamífero, microbiano, viral, ou de inseto. Exemplos de sequências regulatórias incluem promotores transcricionais, operadores ou potencializadores, um sítio de ligação ribossomal do mRNA, e sequências apropriadas que controlam a transcrição e a iniciação da tradução e a terminação. As sequências nucleotídicas são operacionalmente ligadas quando a sequência regulatória se relaciona funcionalmente com a sequência de DNA. Dessa forma, uma sequência nucleotídica promotora é operacionalmente ligada a uma sequência de DNA se a sequência nucleotídica promotora controlar a transcrição da sequência de DNA. Uma origem de replicação que confere a capacidade de replicar nas células hospedeiras desejadas, e uma seleção gênica pelo qual as transformadas são identificadas, estão geralmente incorporadas no vetor de expressão.

[00068] Células hospedeiras adequadas para expressão de polipeptídeos incluem procariotos, leveduras ou células eucarióticas superiores. Células de mamífero ou de inseto são geralmente preferenciais para uso como células hospedeiras. Clonagem apropriada e vetores de expressão para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura, e mamíferos são descritos, por exemplo, em Pouwels et al em: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, 1985. Os sistemas de tradução livre de célula também podem ser empregados para produzir polipeptídeos usando RNAs derivados de construtos de DNA revelados neste pedido. Em geral, métodos de biologia molecular referidos neste pedido são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, edição atual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & filhos, New York, NY.

[00069] Métodos para permitir que os polipeptídeos se montem em VLPs são bem conhecidos e convencionais, assim como são os métodos para purificá-los para uso em indivíduos. Para "condições adequadas para automontagem", ver, por exemplo, os métodos descritos nos Exemplos neste pedido, ou em Kirnbauer et al. (1993) J Virol 67, 6929-6936; Volpers et al. (1994) Virology 200, 504-512; ou J MoI Biol 2001 Mar 16; 307(1): 173-82, todos os quais estãoincorporados por referência nas descrições de tais métodos.

[00070] Os métodos da presente invenção incluem prevenção e/ou tratamento de uma doença ou condição causada ou relacionada à infecção por papilomavírus (por exemplo, infecção por HPV). Um peptídeo imunogênico do HPV e/ou um anticorpo que se liga ao mesmo, podem ser dados para induzir ou fornecer uma resposta protetora e/ou terapêutica em um indivíduo infectado ou suspeito de ter sido exposto ou em risco de ficar infectado com HPV. Os métodos podem ser empregados no que diz respeito a indivíduos que testaram positivo para a exposição ao HPV ou que são considerados estar em risco para a infecção baseada na possível exposição.

[00071] Em algumas modalidades, o tratamento é administrado napresença de adjuvantes ou veículos ou outros antígenos, tanto antígenos de HPV ou antígenos de outros patógenos. Além disso, em alguns exemplos, o tratamento compreende administração de outros agentes comumente usados contra a infecção viral, tais como um ou mais antivirais.

[00072] A imunogenicidade das composições VLP pode ser aumentada pelo uso de estimulantes não específicos adicionais da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes adequados incluem todos os compostos imunoestimulatórios aceitáveis, tais como citocinas, toxinas ou composições sintéticas, tais como alúmen.

[00073] Diversos adjuvantes podem ser usados para aumentar uma resposta por anticorpo contra uma VLP descrito neste pedido. Adjuvantes podem ser usados para (1) aprisionar o antígeno no corpo para causar uma liberação lenta; (2) atrair as células envolvidas na resposta imune ao local da administração; (3) induzir a proliferação ou ativação de células do sistema imune; ou (4) melhorar a distribuição do antígeno em todas as partes do corpo do indivíduo.

[00074] Adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, sais minerais, polinucleotídeos, e substâncias naturais. Adjuvantes específicos que podem ser usados incluem IL-I, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, interferon- , GM-CSF, BCG, sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio ou outro composto de alumínio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídio A, e lipídio monofosforil (MPL), ou agentes microbianos inativados. RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, dimicolato de trehalose (TDM), eesqueleto de parede celular (CWS) em uma emulsão deesqualeno/Tween 80 a 2%. Antígenos de MHC podem até ser usados. Outros adjuvantes ou métodos estão exemplificados nas Patentes Americanas 6.814.971, 5.084.269, 6.656.462, cada uma das quais está incorporada neste pedido por referência.

[00075] Vários métodos para alcançar o efeito do adjuvante para a vacina incluem o uso de agentes, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato (alúmen), comumente usado em solução de 0,05 a 0,1% de salina tamponada com fosfato, misturada com polímeros sintéticos de açúcares (CARBOPOL®) usados em uma solução de cerca de 0,25%, agregação de uma proteína na vacina por tratamento de calor com temperaturas entre aproximadamente 70° a aproximadamente 101°C por um período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. Agregação pela reativação de anticorpos tratados com pepsina (Fab) em albumina; mistura com células bacterianas (por exemplo, C. parvum), endotoxinas ou componentes lipopolissacarídicos de bactérias gram-negativas; emulsão em transportes de óleo fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, mono-oleato de manida (Aracel A)); ou emulsão com uma solução de perfluorcarbono (FLUOSOL-DA®) a 20% usado como um substituto de bloqueio também pode ser empregada para produzir um efeito de adjuvante. Um adjuvante típico é o adjuvante de Freund completo (contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes de Freund incompletos, e hidróxido de alumínio.

[00076] Para a administração em humanos, uma variedade de adjuvantes adequados será evidente para um especialista. Estes incluem, por exemplo, Alúmen-MPL como adjuvante, ou formulação comparável, ASO4, que é usada na vacina aprovada Cervarix® para HPV L1, AS03, AS02, MF59, montanida, adjuvantes baseados em saponina, tais como GPI-0100, adjuvantes baseados em CpG, ou imiquimod. Em modalidades da invenção, um adjuvante é fisicamente acoplado à VLP, ou encapsulado pela VLP, em vez de simplesmente misturado com eles.

[00077] Além de adjuvantes, pode ser desejável coadministrar modificadores de resposta biológica (BRM) para aumentar as respostas imunes. BRMs demonstraram regular positivamente a imunidade da célula T ou inibir a atividade supressora celular. Tais BRMs incluem, mas não são limitados a, Cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); ou dose baixa de Ciclofosfamida (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ) e citocinas, tais como interferon- , IL-2, ou IL-12 ou genes que codificam proteínas envolvidas em funções imunes auxiliares, tais como B-7. Em modalidades da invenção, estes genes são encapsulados pela VLP para facilitar sua entrega em um indivíduo.

[00078] A maneira da aplicação pode ser amplamente variada.Qualquer um dos métodos convencionais de administração de uma vacina é aplicável. Acredita-se que estes incluam aplicação oral em uma base sólida fisiologicamente aceitável ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, parenteralmente por injeção, inalação de um pó, via fragmento transcutâneo, via instilação vaginal e similares. A dosagem da vacina dependerá da via de administração e irá variar de acordo com o tamanho e a saúde do indivíduo.

[00079] A preparação de vacinas que contêm o polipeptídeo ou sequência(s) de peptídeos como ingredientes ativos é bem entendida em geral na técnica, como exemplificado pelas Patentes Americanas 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; e 4.578.770, todas as quais são incorporadas neste pedido por referência. Tipicamente, tais vacinas são preparadas como injetáveis ou como soluções líquidas ou suspensões: formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também deve ser emulsionada. O ingrediente imunogênico ativo muitas vezes é misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, salina, dextrose, glicerol, etanol, ou similares e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, a vacina pode conter quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH, ou adjuvantes que aumentam a eficácia das vacinas. Em modalidades específicas, as vacinas são formuladas com uma combinação de substâncias, como descrito nas Patentes Americanas 6.793.923 e 6.733.754, que são incorporadas neste pedido por referência.

[00080] As vacinas podem ser administradas por inalação. Em certas modalidades uma vacina pode ser administrada como um aerossol. Como usado neste pedido, o termo "aerossol" ou "composição de aerossol" refere-se a uma suspensão de partículas sólidas ou líquidas em um gás. Os termos podem ser usados geralmente para se referirem a uma composição que foi vaporizada, nebulizada, ou de outra maneira convertida de uma forma sólida ou líquida para uma forma inalável incluindo partículas de fármaco sólidas ou líquidas suspensas. Tais aerossóis podem ser usados para entregar uma vacina através do sistema respiratório. Como usado neste pedido, "o sistema respiratório" se refere ao sistema de órgãos no corpo responsável pela entrada de oxigênio e a expiração de dióxido de carbono. O sistema geralmente inclui todas as passagens aéreas desde o nariz até os alvéolos pulmonares. Nos mamíferos, considera-se em geral que nele inclui os pulmões, brônquios, bronquíolos, traqueia, passagens nasais e diafragma. Para fins da presente revelação, a entrega de uma vacina ao sistema respiratório indica que um fármaco é entregue a uma ou mais das passagens aéreas do sistema respiratório, em particular aos pulmões.

[00081] Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios (para aplicação anal ou vaginal) e, em alguns casos, formulações orais. Para supositórios, ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialcalenoglicóis ou triglicerídeos: tais supositórios podem ser formados de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%, preferencialmente aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Formulações orais incluem tais excipientes normalmente empregados como, por exemplo, classes farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós e contêm aproximadamente 10% a aproximadamente 95% do ingrediente ativo, preferencialmente aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.

[00082] As composições de VLP podem ser formuladas em uma vacina como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formado com os grupos amina livres do peptídeo) e aqueles que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido hidroclórico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, etanol 2-etilamina, histidina, procaína e similares.

[00083] Em muitos exemplos, será desejável ter múltiplas administrações da vacina, normalmente no máximo, pelo menos, ou não excedendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais vacinações incluindo todas as faixas existentes entre. As vacinações serão normalmente em 1, 2, 3, 4, 5, 6, a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas/meses/anos de intervalo, incluindo todos os valores e faixas existentes entre, mais normalmente intervalos de três a cinco semanas. Tipicamente, os reforços periódicos auxiliares em intervalos de 1 a 15 anos, normalmente dez anos, serão desejáveis para manter os níveis protetores dos anticorpos. O curso da imunização deve ser seguido por ensaios para anticorpos contra os antígenos, como descrito supra, Patentes Americanas 3.791.932; 4.174.384 e3.949.064, que são ilustrativos destes tipos de ensaios.

[00084] As composições e os métodos relacionados da presente invenção, particularmente a administração de uma VLP compreendendo um epítopo de L2 de HPV a um paciente/indivíduo, também podem ser usados em combinação com a administração do rastreamento tradicional de HPV e/ou outras vacinas, incluindo, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, esfregaço de Papanicolau, PCR, Southern blotting, administrando CERVARIX™, GARDASIL™, vacinas para HPV ou outros agentes infecciosos, terapia ablativa de lesões de HPV, terapias imunomodulatórias para lesões de HPV (por exemplo, Aldara™), ou similares.

[00085] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são administradas a um indivíduo. Diferentes aspectos da presente invenção envolvem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo. Em algumas modalidades da presente invenção, uma VLP compreendendo um epítopo de L2 de HPV é administrada ao paciente para proteger contra ou tratar uma infecção por um ou mais patógenos de HPV. Tais composições serão geralmente dissolvidas ou dispersadas em um veículo farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso.

[00086] Como usado neste pedido, o termo "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável " referem-se àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro dos limites do juízo médico sólido, adequados para o contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outros problemas de complicações comensuráveis a uma proporção razoável de benefício/risco. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um preenchedor líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante, envolvido no carreamento ou transporte de um agente químico. O veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer e todo solvente, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de absorção retardada, e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto à medida que quaisquer meios convencionais ou agentes são incompatíveis com os ingredientes ativos, seu uso em composições imunogênicas e terapêuticas é contemplado.

[00087] Os compostos ativos da presente invenção podem ser formulados para administração parenteral, por exemplo, formulados para injeção através das vias intravenosas, intramusculares, subcutâneas, ou até intraperitoniais. Além dos compostos formulados para aerossol ou administração parenteral, como aqueles para injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; cápsulas de liberação por tempo.

[00088] As soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água apropriada pela mistura com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenamento e uso, estes preparados contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.

[00089] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões; formulações incluindo óleo de sésamo, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida até a extensão que pode ser facilmente injetada. Também deve ser estável sob condições de produção e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.

[00090] As composições de VLP podem ser formuladas em uma forma neutra ou em forma de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formados com os grupos amina livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido hidroclórico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, etanol 2-etilamina, histidina, procaína, e similares.

[00091] O veículo também pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), misturas adequadas dos mesmos, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário em caso da dispersão, e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e similares. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida pelo uso de agentes que retardam a absorção nas composições, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00092] Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários ingredientes enumerados acima, como requisitado, seguido pela esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso dos pós estéreis para preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são técnicas de secagem a vácuo e congelamento a vácuo, que produzem um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução estéril dos mesmos anteriormente filtrada.

[00093] Administração das composições de acordo com a presente invenção será tipicamente através de qualquer via comum. Isto inclui, mas não é limitado à administração oral, nasal ou bucal.

[00094] Alternativamente, administração pode ser por administração ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitonial, respiratória ou intravenosa. Em certas modalidades, uma composição de vacina pode ser inalada (por exemplo, Patente Americana 6.651.655, que é especificamente incorporada por referência). Tais composições seriam normalmente administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis que incluem veículos, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis.

[00095] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve estar apropriadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com salina suficiente ou glicose. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitonial. Nesta conexão, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos por aqueles com habilidade na técnica à luz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em uma solução isotônica de NaCl e adicionada ao fluido hipodermóclise ou injetada no sítio proposto para infusão (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do indivíduo. A pessoa responsável pela administração determinará, em todo caso, a dose apropriada individual para o indivíduo.

[00096] Uma quantidade eficaz da composição terapêutica ou profilática é determinada baseada na meta desejada. Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade que é eficaz para ocasionar um resultado desejado (por exemplo, a indução de uma quantidade mensurável de uma resposta imune, a imunização de um indivíduo, etc.). O termo "unidade de dose" ou "dosagem" refere-se as unidades fisicamente discretas adequadas para uso em um indivíduo, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas desejadas discutidas acima em associação com sua administração, isto é, a via apropriada e o regime. A quantidade a ser administrada, tanto de acordo com o número de tratamentos como de acordo com a unidade de dose, depende da proteção desejada.

[00097] Quantidades exatas da composição também dependem do julgamento do especialista e são peculiares para cada indivíduo. Fatores que afetam a dose incluem o estado físico e clínico do indivíduo, a via de administração, a meta desejada do tratamento (alívio de sintomas versus cura), e a potência, estabilidade e toxicidade da composição em particular.

[00098] Na formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade como é terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como os tipos de soluções injetáveis descritas acima.

[00099] Em uma modalidade da invenção, VLPs são administradas a indivíduos pela administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria recombinante atenuada (tais como uma bactéria salmonela) que codifica um polipeptídeo quimérico da invenção. As VLPs são então produzidas pelo intestino in vivo, onde as bactérias replicam. Para orientação, para realizar os métodos usando tais vetores bacterianos, ver, por exemplo, Nardelli-Haefliger (2007) Clin Vaccin Immunol 14, 1285-1295, que é incorporado por referênciaespecificamente para tal revelação. Métodos para geração de construtos recombinantes que podem ser expressos em bactérias (vetores bacterianos) são convencionais; alguns métodos típicos são descritos em outro lugar neste pedido. Bactérias liofilizadas podem ser facilmente embarcadas para países em desenvolvimento, onde podem então ser ressuspensas e administradas a indivíduos. Tal modo de administração é vantajoso em um país onde falta capacidade de refrigeração que poderia ser necessária para outras formulações de VLPs. Em outra modalidade, VLPs são administradas em um vírus atenuado, tal como um Adenovírus atenuado, ou outros vetores virais que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Métodos para produzir ácidos nucleicos recombinantes adequados que podem ser expressos em um hospedeiro viral são convencionais, e alguns de tais métodos são discutidos em outro lugar neste pedido.

[000100] A presente invenção inclui composições para prevenção ou melhora de infecções por HPV. Como tal, a invenção contempla vacinas para uso tanto em modalidades de imunização ativa como em passiva.

[000101] Uma modalidade da invenção é um método de preparo de uma imunoglobulina para uso na prevenção ou tratamento da infecção por HPV compreendendo as etapas de imunização de um receptor com uma vacina da invenção e isolamento da imunoglobulina ou anticorpos do receptor, e/ou produzir recombinantemente tais imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas. Uma imunoglobulina preparada por este método é um aspecto adicional da invenção. Uma composição farmacêutica compreendendo a imunoglobulina da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável é um aspecto adicional da invenção que pode ser usado na produção de um medicamento para tratamento ou prevenção da infecção por HPV. Um método de tratamento ou prevenção da infecção por HPV compreendendo uma etapa de administração a um paciente de uma quantidade eficaz da preparação farmacêutica da invenção é um aspecto adicional da invenção.

[000102] Os inóculos para produção de anticorpo policlonal são tipicamente preparados pela dispersão da composição antigênica em um diluente fisiologicamente tolerável, tal como salina ou outros adjuvantes adequados para o uso humano para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunoestimulatória do inóculo é administrada a um mamífero, por exemplo, um humano, e o indivíduo inoculado é então mantido durante tempo suficiente para a composição antigênica induzir anticorpos protetores. Os anticorpos podem ser isolados até a extensão desejada por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual 1988).

[000103] Os anticorpos podem incluir preparados de antissoro de uma variedade de animais comumente usados, por exemplo, cabras, primatas, burros, porco, cavalos, porquinhos da Índia, ratos ou homem. Os animais são sangrados e o soro recuperado.

[000104] Uma imunoglobulina produzida conforme a presente invenção pode incluir anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpo ou subfragmentos. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas inteiras de qualquer classe, por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade dual a dois ou mais antígenos da invenção. Também podem ser fragmentos, por exemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv e incluindo fragmentos híbridos similares. Uma imunoglobulina também pode incluir proteínas naturais, sintéticas, ou geneticamente engendradas que agem como um anticorpo ligando-se aos antígenos específicos para formar um complexo.

[000105] Uma composição de HPV ou vacina da presente invenção podem ser administradas a um receptor que então atua como uma fonte de imunoglobulina, produzida em resposta ao desafio da composição de HPV. Um indivíduo tratado dessa forma doaria o plasma do qual a globulina hiperimune seria obtida através da metodologia de fracionamento plasmático convencional. A globulina hiperimune seria administrada a outro indivíduo a fim de transmitir resistência contra ou tratar a infecção por HPV. As globulinas hiperimunes da invenção são particularmente úteis para tratamento ou prevenção da infecção por HPV em crianças, indivíduos imunocomprometidos ou onde o tratamento é necessário e não há tempo para o indivíduo produzir anticorpos em resposta à vacinação.

[000106] Um aspecto adicional da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais anticorpos monoclonais (ou fragmentos dos mesmos; preferencialmente humanos ou humanizados) reativos contra constituintes da composição imunogênica da invenção, que pode ser usada para tratar ou prevenir a infecção por múltiplos tipos de HPV.

[000107] Métodos para produção de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988). Alternativamente, os fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos pelo rastreamento de uma biblioteca de exposição de fago adequada (Vaughan et al. (1998) Nat Biotech 16, 535-539). Os anticorpos monoclonais podem ser humanos, humanizados, ou em parte humanizados por métodos conhecidos.

[000108] Outro aspecto da invenção é um conjunto de vacinação ou tratamento de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o conjunto compreende um frasco e opcionalmente um pacote suplementar com instruções de administração, o frasco compreende uma composição de VLP ou vacina para administração de acordo com os métodos da presente invenção.

[000109] Qualquer uma das composições descritas neste pedido pode ser incluída em um conjunto. Em um exemplo não limitante, os reagentes para preparação de uma VLP e/ou administração de uma VLP, ou anticorpos gerados pela vacinação com VLP podem estar incluídos em um conjunto. O conjunto pode incluir ainda reagentes para avaliar a atividade de VLP tanto in vitro como in vivo. Os conjuntos compreenderão dessa forma, no recipiente adequado, uma composição de VLP. Em certos aspectos, o conjunto pode incluir reagentes e/ou dispositivos de administração, por exemplo, inalador ou nebulizador. Também pode incluir um ou mais tampões, compostos, ou dispositivos para preparação da composição para a administração.

[000110] Os componentes dos conjuntos podem ser empacotados tanto em meios aquosos ou em forma liofilizada. Os recipientes dos conjuntos incluirão geralmente pelo menos um frasco, tubo para teste, frasco, garrafa, seringa ou outros meios de recipiente, nos quais um componente pode ser colocado, e preferencialmente, apropriadamente aliquotado. Onde há mais de um componente no conjunto, o conjunto também conterá geralmente um segundo, terceiro ou outro recipiente adicional no qual os componentes adicionais podem ser separadamente colocados. Entretanto, várias combinações de componentes podem ser compreendidas em um frasco. Os conjuntos da presente invenção também incluirão tipicamente um meio para conter os recipientes em confinamento para venda comercial. Tais recipientes podem incluir injeção ou recipientes plásticos nos quais os frascos desejados são conservados.

[000111] Quando os componentes do conjunto são fornecidos em uma e/ou mais soluções líquidas, a solução líquida é uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril que é particularmente preferencial. Entretanto, os componentes do conjunto podem ser fornecidos como pó(s) seco. Quando os reagentes e/ou os componentes são fornecidos como um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. É idealizado que o solvente também possa ser fornecido em outro recipiente.

[000112] Um conjunto também pode incluir instruções para empregar os componentes do conjunto assim como o uso de qualquer outro reagente não incluído no conjunto. As instruções podem incluir variações que podem ser implementadas.

[000113] É contemplado que tais reagentes são as modalidades dos conjuntos da invenção. Tais conjuntos, entretanto, não são limitados aos itens particulares identificados acima e podem incluir qualquer reagente usado para preparação e/ou administração de uma vacina de VLP da invenção.

[000114] Entre outros usos, os conjuntos da invenção podem ser usados em aplicações experimentais. Um técnico versado reconhecerá componentes de conjuntos adequados para realizar um método da invenção.

[000115] No precedente e nos seguintes exemplos, todas as temperaturas são apresentadas em graus centígrados não corrigidos; e, a menos que esteja indicado, todas as partes e porcentagens são por peso.EXEMPLOSExemplo I. Materiais e MétodosA. Expressão das proteínas quiméricas L1-L2 em Baculovírus

[000116] Os peptídeos de L2 de HPV16 foram geneticamente engendrados nas alças de superfície DE de BPV1 L1 (pela inserção entre os aa 133/134) ou HPV16 L1 (entre os aa 136/137). Os pares de iniciador usados nas construções foram como se segue:(1.) 5'-ctg ttt gca tgt ttt ata aag ggt gac ttt tct att cac attttc tgc-3' (SEQ ID NO:58) (codificando HPV16 L2 aa 18-24/BPV1 L1 aa 125-133)5 '-gca ggt aca tgt cca cct gac ace caa aca aca gat gac agg-3' (SEQ ID NO:59) (codificando HPV16 L2 aa 25-31/BPV L1 aa 134 - 140)(2.) 5'-ccg ctg aat tca ata tgg cgt tgt ggc aac aag-3'(SEQ ID NO:60) (codificando EcoR1-BPV L1 aa 1-6)5 '-gca tga ggt acc gct ttt att tct ttt tct ttt ttg cag gc-3' (SEQ ID NO: 61) (codificando Kpn1-stop-BPV L1 aa 489-495, timidinas [nt] 1416 e 1482 [nt] sequência selvagem de ORF de BPV1 L1 substituída por citosinas)(3.) 5'-gta taa tgt cag gtg gac atg tac ctg cct gtt tgc atgttt tat aaa gtt ggg tga ctt ttc tat tca c-3' (SEQ ID NO:62) (codificando HPV16 L2 aa 17-33/BPV L1 aa 128-133)5'- cta agg tta ccc aaa caa cag atg aca gga aac aaa cag gcc-3' (SEQ ID NO: 63) (codificando HPV16 L2 aa 34-36/BPV L1 aa 134-145)(4.) 5'- cgg ccg cgg ggt gac ttt tct att c-3' (SEQ IDNO:64) (codificando SstII - BPV L1 aa 129-133)5'- cgg ccg cgg acc caa aca aca gat g-3' (SEQ ID NO:65) (codificando SstII - BPV L1 aa 134 - 138)(5.) 5 '-ggc gac aca aac gtt ctg caa aac gca caa aac gtgcat cgg cta ccc aac ttt ata aaa cat gcc cgc-3' (SEQ ID NO: 66) (codificando HPV 16 L2 aa 2-22 - SstII)5 '-ggg cat gtt tta taa agt tgg gta gcc gat gca cgt ttt gtg cgt ttt gca gaa cgt ttg tgt cgc cgc-3' (SEQ ID NO: 67) (codificando HPV 16 L2 aa 2-22 - SstII)(6.) 5'-gga agg ttg aag gca aaa cta ttg ctg atc aaa tat tacaat atg gaa gta tgg gtg tat ttt ttg gtg ggt tag gaa ttg gaa cag ggt cgg gta cag gcg gac gca ctg ggt ata ttc cat tgc cgc-3' (SEQ ID NO:68) (codificando HPV16 L2 aa 35-75 - SstII)5'-ggc aat gga ata tac cca gtg cgt ccg cct gta ccc gac cct gtt cca att cct aac cca cca aaa aat aca ccc ata ctt cca tat tgt aat att tga tca gca ata gtt ttg cct tca acc ttcc gc-3' (SEQ ID NO:69) (codificando HPV16 L2 aa 35-75 - SstII)(7.) 5'-gca tga ccg cgg ttg gga aca agg cct ccc aca gctac-3' (SEQ ID NO:70) (codificando Sstll-HPV16 L2 aa 75-83)5'-gca tga ccg cgg agt ttc ttc cac taa aga aac-3' (SEQ ID N0:71) (codificando SstII-HPV16 L2 aa 106 - 112)(8.) 5'-gca tga ccg cgg att gat gct ggt gca cca ac-3'(SEQ ID NO:72) (codificando SstII-HPV16 L2 aa115-121)5'-gca tga ccg cgg agt agt aac agt att att aat atc-3' (SEQ ID NO:73) (codificando SstII-HPV16 L2 aa 147-154)(9.) 5'-gca tga ccg cgg aat aat act gtt act act gtt act ac-3'(SEQ ID NO: 74) (codificando SstII-HPV 16L2 aa 149-156)5'-gca tga ccg cgg ttc tgc agg tgt tgg agg ctg caa tac-3' (SEQ ID NO:75) (codificando Sstll-HPV16 L2 aa 167-175)(10.) 5'-gca tga ccg cgg cca aca cct gca gaa act gga g-3'(SEQ ID NO:76) (codificando SstII-HPV16L2 aa 172-178)5'-gca tga ccg cgg tgt atc cat agg aat ttc ttc ata att atg-3' (SEQ ID NO:77) (codificando Sstll-HPV16 L2 aa 191-200)(11.) 5'-gca tga ccg cgg gca tcg gct acc caa ctt tat aaa ac-3' (SEQ ID NO:78) (codificando SstII-HPV16O L2 aa 13-21)5'-gca tga ccg cgg aga aac tat aga agg atc aga agg gc-3' (SEQ ID NO:79) (codificando Sstll-HPV16 L2 aa 99-107)

[000117] As sequências que codificam HPV16 L2 e BPV L1, os quais estes iniciadores foram gerados, e as sequências das proteínas codificadas são:Ácido nucleico de L2 do HPV16 (114) (SEQ ID NO:80)ATGCGACACAAACGTTCTGCAAAACGCACAAAACGTGCATCGGCT ACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCT GACATTATACCTAAGGTTGAAGGCAAAACTATTGCTGATCAAATAT TACAATATGGAAGTATGGGTGTATTTTTTGGTGGGTTAGGAATTGG AACAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGG GAACAAGGCCTCCCACAGCTACAGATACACTTGCTCCTGTAAGAC CCCCTTTAACAGTAGATCCTGTGGGCCCTTCTGATCCTTCTATAGT TTCTTTAGTGGAAGAAACTAGTTTTATTGATGCTGGTGCACCAACA TCTGTACCTTCCATTCCCCCAGATGTATCAGGATTTAGTATTACTA CTTCAACTGATACCACACCTGCTATATTAGATATTAATAATACTGTT ACTACTGTTACTACACATAATAATCCCACTTTCACTGACCCATCTG TATTGCAGCCTCCAACACCTGCAGAAACTGGAGGGCATTTTACAC TTTCATCATCCACTATTAGTACACATAATTATGAAGAAATTCCTATG GATACATTTATTGTTAGCACAAACCCTAACACAGTAACTAGTAGCA CACCCATACCAGGGTCTCGCCCAGTGGCACGCCTAGGATTATATA GTCGCACAACACAACAAGTTAAAGTTGTAGACCCTGCTTTTGTAAC CACTCCCACTAAACTTATTACATATGATAATCCTGCATATGAAGGT ATAGATGTGGATAATACATTATATTTTTCTAGTAATGATAATAGTAT TAATATAGCTCCAGATCCTGACTTTTTGGATATAGTTGCTTTACATA GGCCAGCATTAACCTCTAGGCGTACTGGCATAAGGTACAGTAGAA TTGGTAATAAACAAACACTACGTACTCGTAGTGGAAAATCTATAGG TGCTAAGGTACATTATTATTATGATTTTAGTACCATTGATCCTGCAG AAGAAATAGAATTACAAACTATAACACCTTCTACATATACTACCACT TCACATGCAGCCTCACCTACTTCTATTAATAATGGATTATATGATAT TTATGCAGATGACTTTATTACAGATACTTCTACAACCCCGGTACCA TCTGTACCCTCTACATCTTTATCAGGTTATATTCCTGCAAATACAAC AATTCCTTTTGGTGGTGCATACAATATTCCTTTAGTATCAGGTCCT GATATACCCATTAATATAACTGACCAAGCTCCTTCATTAATTCCTAT AGTTCCAGGGTCTCCACAATATACAATTATTGCTGATGCAGGTGAC TTTTATTTACATCCTAGTTATTACATGTTACGAAAACGACGTAAACG TTTACCATATTTTTTTTCAGATGTCTCTTTGGCTProteína L2 do HPV16 (114) (SEQ ID NO:81): (NC 001522)MRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQY GSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTV DPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTSVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAI LDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNY EEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKVVDPA FVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDNSINIAPDPDFLDIVALHR PALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDFSTIDPAEEIE LQTITPSTYTTTSHAASPTSINNGLYDIYADDFTTDTSTTPVPSVPSTS LSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIPIVPGSPQYTIIA DAGDFYLHPSYYMLRKRRKRLPYFFSDVSLAAÁcido nucleico de L1 de BPV1 (SEQ ID NO: 82):atggcgttgtggcaacaaggccagaagctgtatctccctccaacccctgtaagcaaggtgctttgc agtgaaacctatgtgcaaagaaaaagcattttttatcatgcagaaacggagcgcctgctaactata ggacatccatattacccagtgtctatcggggccaaaactgttcctaaggtctctgcaaatcagtata gggtatttaaaatacaactacctgatcccaatcaatttgcactacctgacaggactgttcacaaccc aagtaaagagcggctggtgtgggcagtcataggtgtgcaggtgtccagagggcagcctcttgga ggtactgtaactgggcaccccacttttaatgctttgcttgatgcagaaaatgtgaatagaaaagtca ccacccaaacaacagatgacaggaaacaaacaggcctagatgctaagcaacaacagattctg ttgctaggctgtacccctgctgaaggggaatattggacaacagcccgtccatgtgttactgatcgtct agaaaatggcgcctgccctcctcttgaattaaaaaacaagcacatagaagatggggatatgatg gaaattgggtttggtgcagccaacttcaaagaaattaatgcaagtaaatcagatctacctcttgaca ttcaaaatgagatctgcttgtacccagactacctcaaaatggctgaggacgctgctggtaatagca tgttcttttttgcaaggaaagaacaggtgtatgttagacacatctggaccagagggggctcggaga aagaagcccctaccacagatttttatttaaagaataataaaggggatgccacccttaaaataccc agtgtgcattttggtagtcccagtggctcactagtctcaactgataatcaaatttttaatcggccctact ggctattccgtgcccagggcatgaacaatggaattgcatggaataatttattgtttttaacagtgggg gacaatacacgtggtactaatcttaccataagtgtagcctcagatggaaccccactaacagagta tgatagctcaaaattcaatgtataccatagacatatggaagaatataagctagcctttatattagag ctatgctctgtggaaatcacagctcaaactgtgtcacatctgcaaggacttatgccctctgtgcttga aaattgggaaataggtgtgcagcctcctacctcatcgatattagaggacacctatcgctatataga gtctcctgcaactaaatgtgcaagcaatgtaattcctgcaaaagaagacccttatgcagggtttaa gttttggaacatagatcttaaagaaaagctttctttggacttagatcaatttcccttgggaagaagattt ttagcacagcaaggggcaggatgttcaactgtgagaaaacgaagaattagccaaaaaacttcc agtaagcctgcaaaaaaaaaaaaaaaataaProteína L1 de BPV1 (SEQ ID NO:83):MALWQQGQKLYLPPTPVSKVLCSETYVQRKSIFYHAETE RLLTIGHPYYPVSIGAKTVPKVSANQYRVFKIQLPDPNQ FALPDRTVHNPSKERLVWAVIGVQVSRGQPLGGTVTGHP TFNALLDAENVNRKVTTQTTDDRKQTGLDAKQQQILLLG CTPAEGEYWTTARPCVTDRLENGACPPLELKNKHIEDGD MMEIGFGAANFKEINASKSDLPLDIQNEICLYPDYLKMA EDAAGNSMFFFARKEQVYVRHIWTRGGSEKEAPTTDFYLKNNKGDATLKIPSVHFGSPSGSLVSTD NQIFNRPYWLFRAQGMNNGIAWNNLLFLTVGDNTRGTNL TISVASDGTPLTEYDSSKFNVYHRHMEEYKLAFILELCS VEITAQTVSHLQGLMPSVLENWEIGVQPPTSSILEDTYR YIESPATKCASNVIPAKEDPYAGFKFWNIDLKEKLSLDL DQFPLGRRFLAQQGA GCSTVRKRRISQKTSSKPAKKKKK

[000118] A sequência que codifica L1 do HPV16, que é usado na construção do construto J mostrado na figura 1, e a sequência daproteína codificada, é:Ácido nucleico de L1 do HPV16 (114 KB) (SEQ ID NO: 84)ATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCCACTGTCTACTTG CCTCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCACGGATGAA TATGTTGCACGCACAAACATATATTATCATGCAGGAACATCCAGACTACTTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCCTATTAAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGTATCAGGATTACAATACAGGGTATTTAGAATACATTTACCTGACCCCAATAAGTTTGGTTTTCCTGACACCTCATTTTATAATCCAGATACACAGCGGCTGGTTTGGGCCTGTGTAGGTGTTGAGG TAGGTCGTGGTCAGCCATTAGGTGTGGGCATTAGTGGCCATCCTTTATTAAATAAATTGGATGACACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCCCATGTACCAATGTTGCAGTAAATCCAGGTGATTGTCCACCATTAGAGTTAATAAACACAGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTGATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTTACTACATTACAGGCTAACAAAAGTGAAGTTCCACTGGATATTTGTACATCTATTTGCAAATATCCAGATTATATTAAAATGGTGTCAGAACCATATGGCGACAGCTTATTTTTTTATTTACGAAGGGAACAAATGTTTGTTAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTACTGTTGGTGAAAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCTTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAA CCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTT GTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCT CCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTT TGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTA GATCAGTTTCCTTTAGGACGCAAATTTTTACTACAAGCA GGATTGAAGGCCAAACCAAAATTTACATTAGGAAAACGA AAAGCTACACCCACCACCTCATCTACCTCTACAACTGCT AAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAAProteína L1 do HPV16 (114 KB) (SEQ ID NO:85):MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGT SRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPD PNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISG HPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLI GCKPPIGEHWGKGSPCTNVUMVNPGDCPPLELINTVIQDG DMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMV SEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGTVGENVPDDLYIK GSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQG HNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNT NFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNST ILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKE DPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKP KFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL

[000119] Oligonucleotídeos sintéticos orientados de maneira reversa (costa a costa) (1., ver pares de iniciadores acima) codificando HPV16 L2 aa 18-31 foram usados para a inserção no ORF BPV1 L1 por um PCR touchdown reversa, usando o vetor de transferência de baculovírus BPV1 L1-pEVmod (Kirnbauer et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 12180-12184). Para evitar produtos não específicos a temperatura de anelamento foi reduzida em 1,5°C por sete ciclos, seguidos por 30 ciclos adicionais na temperatura de chegada final. Posteriormente, as sequências L2 inseridas foram unidas pela ligação de terminação brusca. Mutações silenciosas foram introduzidas na região C-terminal da ORF L1 (poli-A tratado) por (2.) para evitar mutações dos amplicons. A sequência L1-L2 mutada foi reclonada no vetor pEVmod e epítopos de L2 inseridos foram ainda alongados pela reaplicação de PCR (3).

[000120] As seguintes séries de peptídeos que abrangem a região N- terminal de L2 do HPV 16 foram incorporadas em BPV1 L1 pEVmod empregando um recém estabelecido sítio de enzima de restrição SstII (ccgcgg) inserido entre os aa 133/134 pela PCR touchdown reversa utilizando pares de iniciadores (4.). Oligonucleotídeos de fita dupla (com sítios flanqueadores de SstII) codificando peptídeos L2 de HPV16 aa 2-22 (5.), aa 35-75 (6.) foram gerados pelo anelamento de oligonucleotídeo sintético, ou gerando amplicons de PCR que codificam L2 de HPV16 aa 75-112 (7)., aa 115-154 (8)., aa 149-175 (9)., aa 172-200 (10)., aa 13-107 (11)., respectivamente e clonado no sítio SstII de BPV L1 (aa 133/134). O SstII (ccgcgg) codifica para a prolina (P) - arginina (R), adicionada a ambas as extremidades de L2 nas proteínas de fusão traduzidas.

[000121] Um plasmídeo que codifica L1 de HPV16 (derivado do clone genômico 114 KB (27)) - L2 de HPV16 aa 17-36 (ainda referido como 16L1-16L2 17-36) foi gerado a partir da subclonagem de oligossintéticos com códon otimizado (Geneart, Alemanha) nos sítios Bg1II a Kpnl do vetor de transferência de baculovírus pSynwtVI- (Kirnbauer et al. (1993) J Virol 67, 6929-36). Vetores recombinantes de expressão foram verificados por sequenciamento bidirecional (VBC- Biotech; Viena, Áustria).

[000122] Baculovírus recombinantes foram gerados pela cotransfecção das células de inseto Sf-9 com DNA de vetores de transferência e baculovírus linearizado (BaculoGold, BD Biosciences). Expressão e purificação da VLP foram realizadas como descrito anteriormente em Kirnbauer et al. (1992) {supra). Em poucas palavras, as proteínas quiméricas foram expressas através da infecção de células de inseto com estoques de baculovírus amplificados por 3 dias. Posteriormente, as células coletadas foram lisadas por sonicação em PBS/NaCl 0,8 M/CaCl2 2 mM/PMSF 1 mM. Após a adição de Brij58 0,5%, as proteínas foram incubadas durante a noite a 4°C. As estruturas de alta massa molecular foram purificadas por ultracentrifugação em sacarose/almofadas de PBS (35% p/vol) e CsCl/PBS 29% (peso/peso) em gradientes de densidade durante pelo menos 24 horas cada um.

[000123] A separação de VLP em capsômeros pentaméricos foi alcançada sob condições de redução por diálise extensiva em TrisHCl 10 mM pH 7,9/DTT 10 mM/2-mercaptoetanol 7,5% (2-ME) (adaptado por McCarthy et al. (1998) J Virol 72, 32-41). As imunizações foram realizadas com pentâmeros redialisados em uma tampão equivalente sem 2-ME. Para imunizações com o antígeno desnaturado, VLP foi dialisada contra PBS (NaCl 0,5 M/ CaCl2 1 mM/Tween-80 0,02%) e fervida em SDS 4%.

B. Western Blot

[000124] Células Sf-9 foram infectadas por 3 dias, coletadas, desnaturadas em tampão de lise (2-ME 2%) e analisadas por SDS- Page e Western Blot. A expressão das proteínas L1 foi verificada através de um anticorpo monoclonal (mAb) AU1 que reconhece o epítopo linear de L1 de BPV DTYRYI (BAbCO) (SEQ ID NO:93), ou Camvir-1 produzido contra L1 de HPV16 (BD Pharmingen). Para verificar a antigenicidade de peptídeos L2, amostras foram testadas com anticorpo monoclonal RG-1 diretamente para L2 de HPV16 aa 1736 (Gambhira et al. (2007b) J Virol 81, 13927-31), ou soros policlonais de coelho produzido contra His marcado com L2 de HPV16 aa 1-88 ou His marcado com L2 de HPV16 aa 11-200 (Pastrana et al. (2005a) Virology 337, 365-72).

C. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

[000125] Partículas purificadas foram carregadas em grades de descarga incandescente de cobre recobertas com carbono, fixada em Glutaraldeído 2,5%, negativamente marcadas com uranilacetato 1%, e visualisadas pelo microscópio eletrônico JEOL 1010 em 80 kV e 30.000x de aumento.

D. Imunização

[000126] As proteínas foram extensivamente dialisadas contra PBS contendo NaCl 0,5 M/CaCl2 1 mM/Tween-80 0,02%. Dois coelhos brancos da Nova Zelândia (BNZ) foram imunizados com 50 Dg partículas nativas ou partículas SDS-desnaturadas no adjuvante de Freund completo (AFC), seguido por três pulsos quatro, seis e oito semanas depois em Freund incompleto (AFI) (Charles River; Kisslegg, Alemanha). Alternativamente, os imunógenos foram administrados em uma mistura 10:1 de gel de hidróxido de alumínio (A8222, Sigma- Aldrich) e lipídio monofosforil A (S6322, Sigma-Aldrich) (referido como Alúmen-MPL) preparado de acordo com protocolos do fabricante. Em camundongos Balb/c foram dados 10 αg do antígeno e pulsos quatro, oito e dez semanas após a primeira injeção. Os soros foram coletados 14 dias após o último pulso e armazenados a -20°C.

E. ELISA

[000127] A titulação dos anticorpo específicos em antissoros produzidos contra BPV1 L1 - HPV16 L2 (ainda referido como BL1- 16L2) aa 2-22, 75-112, 115-154, 149-175, 172-200 foram determinados por ELISA, usando HPV16 L2 His-marcado aa 1-88 ou polipeptídeos HPV16 L2 aa 11-200 para recobrir as placas de microtitulação.

[000128] Estes antígenos foram gerados usando o vetor pET28A (Pastrana et al. (2005a) {supra)) transformados em E. coli Rosetta DE3 (Novagen), induzidos por IPTG e purificados por afinidade em colunas Ni-NTA (Qiagen). As proteínas eluídas foram agrupadas, verificadas por Western Blotting, quantificadas através do Conjunto de Ensaio Proteico BCA (Pierce) e armazenadas a -20°C.

[000129] O ELISA foi realizado como descrito anteriormente (Gambhira et al. (2007b) J Virol 81, 13927-31). As placas de Maxisorb (Nunc) foram recobertas durante a noite com 0,1 Dg do peptídeo L2/ poço em tampão carbonato (pH 9,6) e bloqueadas com PBS-BSA 1%. As diluições seriais décuplas dos antissoros foram incubadas em triplicata de poços em BSA/PBS/Tween-20 0,05% (Tw-20). Seguido por 3 lavagens com PBS/Tween-20 0,05%, anticorpo conjugado a peroxidase em BSA/PBS/Tween-20 0,05% (1:5000) foi adicionado e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as placas foram lavadas e desenvolvidas adicionando o substrato ABTS (Boehringer Mannheim). A densidade ótica (OD) em 405 nm foi determinada usando um leitor ELISA (Dynatech).

F. ELISA utilizando um peptídeo sintético biotinilado L2 de HPV16 aa 18-31

[000130] Os antissoros produzidos contra BL1-16L2 aa 18-31, BL1- 16L2 aa 17-36, 16L1-16L2 aa 17-36 foram examinados por ELISA utilizando um peptídeo L2 biotinilado de HPV16 aa 18-31 (LYKTCKQAGTCPPD (SEQ ID NO:94); JPT Peptide Technologies; Berlim, Alemanha) como antígeno (Slupetzky et al. (2007) Vaccine 25, 2001-10). Um ng peptídeo/poço foi adicionado a placas de estreptavidina Nunc durante a noite (como especificado pelo protocolo de revestimento geral de Estreptavidina Nunc). As placas foram lavadas com PBS, bloqueadas durante a noite com leite em pó desnatado 0,5%/PBS a 4°C, e incubadas com antissoros diluídos seriadamente por 1 hora à temperatura ambiente. Seguido por três lavagens com PBS, uma diluição 1:10,000 do conjugado foi adicionada, as placas foram lavadas, desenvolvidas com ABTS e OD determinada em 405nm.G. Ensaio de Neutralização de Pseudovírion

[000131] Os pseudovírions foram produzidos em células 293TT e purificados em gradientes Optiprep (Sigma) como descrito por Buck et al. (ver sítio na rede de alcance mudial:ccr.cancer.gov/lco/protocols.asp) com pequenas modificações. Os seguintes plasmídeos para expressão das proteínas de capsídeo L1 e L2 ou da fosfatase alcalina secretada (FAS) foram usados:

[000132] Plasmídeos de empacotamento: HPV5: p5sheLL; HPV6: p6sheLL; HPV16: p16L1h, p16L2h; HPV18: peL1fB, peL2bhb; HPV45: p45shell, CRPV: pCRPVL1, pCRPVL2 (fornecido por J. Schiller, NIH, mapas dos plasmídeos e referências: ver o portal da rede de alcance mundial em home.ccr.cancer.gov/Lco/plasmids.asp),HPV31: p31L1h, p31L2h (Konda et al. (2007) Virology 358, 266-72); HPV52: p52L1h, p52L2h (não publicado) HPV58: p58L1h, p58L2h (Konda et al. (2007) {supra)) (fornecido por Kanda, Tóquio)HPV11: HPV11 L1, HPV11L2, HPV11 L1/L2, não publicado (fornecido por M. Muller, Heidelberg)Plasmídeo alvo: pYSEAP (fornecido por J. Schiller, NIH)

[000133] Vetores de expressão para empacotar proteínas de capsídeo foram cotransfectados com o plasmídeo repórter pYSEAP e o rendimento de capsídeo foi detectado colorimetricamente. Ensaios de neutralização foram realizados de acordo com um protocolo adaptado (ver o sítio da rede de alcance mundial: ccr.cancer.gov/lco/neutralizationassay.htm). Os pseudovírions foram pré-incubados com diluições seriais 1:2 dos soros que começavam em 1:100 em duplicata de poços em gelo pór 1 hora. Seguido por infecção com soluções de pseudovírion, as células 293TT foram incubadas por 72 horas a 37°C e a atividade da FAS foi determinada em sobrenadantes celulares clarificados colorimetricamente em 405nm (Alphs et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 5850-5). Os títulos de neutralização foram relatados como recíprocos da diluição mais alta que causa redução de 50% da atividade de FAS em cada ensaio, em comparação com soros pré-imunes da mesma diluição. Quando a redução de FAS esteve perto de 50% na diluição 1:100, os soros foram reavaliados em 1:50.Exemplo II. Resultados

[000134] Estudos prévios relataram que a imunização com o peptídeo L2 de HPV16 aa 1-88 induziu baixa titulação de respostas imunes humorais a HPV16 homólogo e neutralização cruzada de tipos heterólogos in vitro (Pastrana et al. (2005a) {supra)) e aquela vacinação com peptídeos L2 de HPV16 aa 11-200 confere proteção cruzada in vivo contra o desafio por CRPV e ROPV (Gambhira et al. (2007a) J Virol 81, 11585-92). A fim de aumentar a titulação deanticorpos gerados pela imunização, peptídeos de L2 foram incorporados no sítio de L1 exposto na superfície, presumivelmente resultando em um arranjo de L2 de 360 vezes na superfície do capsídeo.

[000135] Anteriormente, peptídeos de até 9 aminoácidos de comprimento foram expressos com sucesso pela de alça DE na VLP de superfície de BPV1 sem comprometer a capacidade de montar-se em uma VLP imunogênica (Handisurya et al. (2007) FEBS J 274, 1747-1758; Slupetzky et al. (2007) (supra)). Por isso, a alça DE de L1 foi escolhida para a inserção para expor o peptídeo L2 na superfície da VLP quimérica unida de BPV1 (figura .1). O uso de capsídeos de BPV1 como veículo evita a indução de antissoros anti-HPV L1 neutralizantes que poderiam obscurecer a detecção de baixos títulos de anticorpos neutralizantes (cruzados) anti-L2 de HPV16. As sequências codificantes de nove peptídeos parcialmente sobrepostos de L2 de HPV16 aa 18-31 (A), aa 17-36 (B, correspondente ao epítopo do anticorpo monoclonal RG-1); os aa 2-22 (C), aa 35-75 (D), aa 75112 (E), aa 115-154 (F), aa 149-175 (G), aa 172-200 (H), aa 13-107 (I) foram inseridos entre os códons 133 e 134 de L1 BPV1. Um vetor de expressão para uma proteína de fusão L1-L2 quimérica adicional com a inserção de L2 de HPV16 aa 17-36 em L1 de HPV16 (16L1-16L2 1736) (J) também foi gerado. Como HPV16 é o tipo de alto risco mais importante que causa 50% dos cânceres cervicais no mundo inteiro, raciocinamos que o uso de VLP de L1 de HPV16 como veículo de L2 de HPV 16 permitiria a indução de uma combinada resposta imune de alta titulação anti L1 de HPV 16 e uma ampla neutralização cruzada anti L2. Aqui, a inserção na alça DE de L1 de HPV16 entre os códons 136 e 137 foi escolhida por alinhamento de sequência.

[000136] Baculovírus recombinantes foram gerados e usados para a infecção de células de inseto Sf-9. Três dias depois, as células foram lisadas e analisadas por SDS-PAGE. Western blotting das proteínas recombinantes com anticorpo monoclonal AU1 (anti-BPV L1) e Camvir-1 (anti- L1 HPV16) mostrou a migração dentro de uma faixa de 45-60 KD (figura figura 2a, A-J). Como esperado, a migração da maioria das proteínas de fusão L1-L2 foi levemente mais lenta em comparação com as proteínas L1 selvagens.

[000137] A antigenicidade dos peptídeos L2 de HPV16 inseridos foi verificada pelo anticorpo monoclonal RG-1 (anti-L2 de HPV16 aa 1736) ou soros de coelho policlonais produzidos contra L2 de HPV16 aa 1-88 ou L2 de HPV16 aa 11-200 como apropriado (figura figura 2b). Várias colunas migratórias mais rápidas são provavelmente causadas pela degradação proteica.

[000138] A L1 de VLP nativa provoca titulação de anticorpos de neutralização mais altas do que a subunidade de pentâmero, e os pentâmeros são dramaticamente mais imunogênicos do que a proteína L1 monomérica, desnaturada. Dessa forma o status de montagem da proteínas L1-L2 quiméricas foi determinado por MET. Em caso de formações morfológicas equivocadas, a montagem nos capsômeros foi ainda distinguida por ELISA realizado com anticorpo monoclonal 5B6 dependente de conformação, cuja ligação é dependente da montagem de L1 de BPV1 em pentâmeros (Slupetzky et al. (2001) J Gen Virol 82, 2799-804).

[000139] Como mostrado na figura 3, MET demonstrou a montagem em VLP de tamanho integral (aproximadamente 50-60 nm de diâmetro) de BL1-16L2 18-31 (A), 17-36 (B), 2-22 (C), 75-112 (E), 115154 (F), 149-175 (G) e 172-200 (H), e 16L1-16L2 17-36 (J). Asproteínas quiméricas BL1-16L2 35-75 (D) e BL1-16L2 13-107 (I)existiram em conformações menos ordenadas, sugerindo a presença de pentâmeros de L1 ou agregados proteicos. Para distinguir ainda estas possibilidades, ELISAs usando anticorpos monoclonais 5B6 (38) e anticorpos monoclonais AU1 foram realizados. Nenhuma das preparações proteicas em que faltavam VLP (D e I) reagiu com 5B6, sugerindo que proteínas quiméricas D e I foram incapazes de se montarem em pentâmeros. Além disso, os resultados demonstraram aumento da ligação do anticorpo monoclonal AU1 com BL1-16L2 desnaturado 13-107 (I), em comparação com as preparações nativas, mas não para BL1-16L2 35-75 (D), sugerindo uma formaçãoparcialmente dependente da conformação do antigo (I) mas não da última proteína (D) (dados não mostrados). Consequentemente, abstivemo-nos da imunização com BL1-16L2 35-75.

[000140] Tomadas em conjunto oito de dez proteínas quiméricas foram capazes de montar-se em VLP, apresentando até 44 aa de 16L2 (BL1-16L2 115-154 (F), mais quatro aa codificados flanqueando sítios de enzima de restrição SstII) dentro da alça DE de superfície de L1 BPV1, e 20 aa dentro de L1 HPV16 (J), respectivamente ( figura 1, 3). L2 - anticorpos séricos específicos

[000141] Imunogenicidade de VLP L1-L2 quimérica e de respostas imunes humorais a peptídeos L2 expostos foram determinados pela imunização de coelhos BNZ. Cada antígeno foi administrado tanto em partículas nativas ou em antígeno desnaturado por SDS, a fim de determinar o impacto da estrutura da partícula na imunogenicidade. As imunizações foram realizadas usando o potente adjuvante de Freund (CFA/IFA). Os antígenos que induziram amplas respostas de anticorpo de neutralização cruzada foram ainda administrados usando Alúmen- MPL aplicável a humano como adjuvante. Além disso, camundongos Balb/c procriados cosanguineamente foram inoculados com formulações antigênicas de Alúmen-MPL a fim de englobar um sistema para mamífero alternativo.

[000142] Dois coelhos BNZ foram imunizados em CFA/IFA com BL1- 16L2 18-31 (A), 17-36 (B), 2-22 (C), 75-112 (E), 115-154 (F), 149-175 (G), 172-200 (H), com preparações nativas ou desnaturadas por SDS. Devido à sua montagem incompleta, BL1-16L2 13-107 (I) - a proteína foi inoculada como preparação nativa somente.

[000143] Por ELISA, as respostas imunes específicas de L2 foram detectadas usando peptídeo sintético L2 HPV16 aa 18-31, ou proteínas L2 HPV16 expressas bacterianamente aa 1-88 ou aa 11200, respectivamente como antígenos (Tabela 2). Com exceção de BL1-16L2 2-22 (C), todas as preparações de VLP induziram respostas de anticorpo significantes (títulos nos limites de 2.500-312.500), enquanto que as proteínas desnaturadas correspondentes provocaram níveis de anticorpo que foram tipicamente cinco vezes mais baixos (títulos de 500-12.500). Os soros pré-imunes foram não reativos em todos os casos.

[000144] Estes resultados demonstram uma imunogenicidade melhorada dos epítopos presentes na VLP nativa, em comparação com as proteínas desnaturadas análogas. A ausência completa de uma resposta humoral detectável a L2 pela imunização por BL1-16L2 2-22 (C) sugere que o aa 20 N-terminal de L2 de HPV16 nãorepresenta um epítopo de célula B em coelhos. Além disso, a incapacidade de BL1-16L2 13-107 (I) para reunir-se em VLP pode ser responsável pela indução de apenas uma modesta resposta imune anti-L2 (títulos de 500) (Tabela 2).A tabela 2

[000145] Avaliação de antissoros de coelho por ELISA peptídeo L2 de HPV 16. Dois coelhos NZW foram vacinados cada um com proteínas BL1-16L2 quiméricas indicadas, como preparações de VLP nativa ou interrompidas por SDS, usando Freund (CFA/IFA) como adjuvante. ELISA foi realizado usando L2 de HPV16 1-88 (para soros produzidos contra BL1-16L2 2-22), L2 HPV16 aa 18-31 (BL1-16L2 1831, BL1-16L2 17-36), L2 HPV16 aa 11-200 (BL1-16L2 75-112, BL1- 16L2 115-154, BL1-16L2 149-175, BL1-16L2 172-200, BL1-16L2 13107) como antígenos de ELISA. Os soros foram diluídos serialmente e testado em triplicatas. A proteína interrompida por SDS BL1-16L2 13107 não foi usada como imunógeno (X).

Neutralização in vitro

[000146] Os ensaios de neutralização de pseudovírion tiram proveito dos vetores de transferência gênica baseados em papilomavírus (pseudovírions) para mimetizar a infecção por papilomavírus e sua inibição in vitro (Buck et al. (2005) Methods MoI Med 119, 445-62). A infecção de culturas celulares com capsídeos L1/L2, encapsulando o plasmídeo repórter pYSEAP, leva à expressão da fosfatase alcalina secretada (FAS), que pode ser medida no sobrenadante, ao passo que a pré-incubação de pseudovírions com anticorpos de neutralização previne a infecção e reduz a quantidade de FAS. Tem sido demonstrado que anticorpos de neutralização se correlacionam com a proteção de animais no desafio viral in vivo (Alphs et al. (2008) {supra); Gambhira et al. (2007b) {supra)).

[000147] Os ensaios de neutralização foram realizados com pseudovírions de L2 tipo homólogo a HPV16 e L2 divergente de HPV18 de alto risco (Tabela 3a). Os soros incapazes de neutralizar a infecção com qualquer tipo não foram mais avaliados. Todos os soros foram testados em diluições seriais de 10 vezes de 1:100 - 1:100.000, evidência de níveis de anticorpo mais baixos foi reavaliada com diluições de soro de 1:50, ao passo que os títulos <50 foram considerados insignificantes.Tabela 3a

[000148] Ensaios de neutralização de pseudovírion de soros de coelho produzida contra o nativo ou desnaturado (desnat) indicado. Proteínas de BL1-16L2 usando Freund (CFA/IFA) como adjuvante. Os títulos de dois animais são mostrados. Os soros que não neutralizaram nem HPV16 nem HPV18 não foram testados (X) para tipos de pseudovírions restantes. Os ensaios foram realizados com diluições de soro nos limites de 1:100 a 1:100.000. Quando uma titulação neutralização mais baixa, soros suspeitos foram reavaliados na diluição de 1:50.

[000149] Da esquerda para a direita, de cima para baixo: antissoros para BL1-16L2 (títulos de neutralização); pseudovírions; 18-31 (A) nativa; 18-31 (A) desnaturada; 17-36 (B) nativa; 17-36 (B) desnaturada; 75-112 (E) nativa; 75-112 (E) desnaturada; 115-154 (F) nativa; 115-154 (F) desnaturada; 13-107 (I) nativa; pseudovírions; 2-22 (C) nativa; 2-22 (C) desnaturada; 18-31 (A) pentâmero; 149-175 (G) nativa; 149-175 (G) desnaturada; 175-200 (H) nativa; 175-200 (H) desnaturadaTabela 3b

[000150] Neutralização dos pseudovírions BPV1 por soros produzida contra VLP quimérico BL1-16L2 nativo. Os ensaios foram realizados com diluições de soro de 1:100 a 1: 100.000. O soro de coelho VLP BPV L1/L2 foi produzido contra L1 de BPV selvagem coexpresso mais L2 de VLP.

[000151] Como esperado nos resultados de ELISA negativos, o antissoro BL1-16L2 2-22 (C) não continha nenhum anticorpo deneutralização detectável. Um dos dois coelhos imunizados com VLP nativas BL1-16L2 18-31 (A) desenvolveu antissoros neutralizantespara HPV16 (título 1: 100) e beta-HPV5 (1:100) não relacionado. Ao contrário, o antígeno desnaturado por SDS induziu anticorpos neutralizantes àqueles e 4 tipos adicionais de HPV (títulos de ambos os animais dados em parêntesis) HPV16 (100/100), HPV18 (100/100), HPV45 (100/0), HPV52 (0/100), HPV58 (0/100), HPV5 (1.000/100) bem como CRPV (0/50). Por isso, concluiu-se que a apresentação do peptídeo L2 de HPV16 18-31 em VLP quimérica foi desvantajosa à indução de anticorpos de neutralização. Além disso, animais imunizados com BL1-16L2 aa 18-31 (A) desestruturado emcapsômeros pentavalentes foram incapazes de induzir anticorpos de neutralização (não mostrado).

[000152] A imunização de coelhos com VLP BL1-16L2 17-36 (B) (compreendendo o epítopo RG-1) induziu anticorpos de neutralização contra cinco tipos de HPV de alto risco, HPV 16 (1.000/10.000), HPV18 (100-1.000/1.000), HPV45 (100/100-1.000), HPV52 (0/100), HPV58 (100/1.000), tipo de baixo risco HPV11 (0/50-100) e tipo beta- HPV 5 (100/10.000). Os soros imunes à VLP interrompida causaram títulos menos distintos a HPV16 (100/100), HPV18 (100/0), HPV58 (100/0) e HPV5 (100/0), e a neutralização foi não detectável para HPV45, HPV52 e HPV11.

[000153] Vacinação com partículas quiméricas BL1-16L2 75-112 (E) e BL1-16L2 115-154 (F) neutralizou pseudovírions de HPV16 comtítulos de (100/0) (E) e (1.000/100) (F) respectivamente, mas não neutralizou cruzadamente nenhum outro pseudovírion testado. Os antígenos desnaturados correspondentes provocaram titulações modestas (de 50/0) (E) e (100/50) (F) respectivamente.

[000154] Embora tanto BL1-16L2 149-175 (G), BL1-16L2 172-200 (H) nativo como desnaturado induziram marcantes respostas imunes específicas a 16L2 por ELISA, os antissoros não foram neutralizantes para HPV16 e HPV18. Um de dois animais, inoculado com a proteína BL1-16L2 13-107 (I), produziu anticorpos de neutralização contraHPV16 (100/0) e HPV58 (50/0) (Tabela 3a).

[000155] Por isso, os epítopos de neutralização podem ser mapeados na região N-terminal de L2 HPV16 aa 17-148. Entretanto, a indução da neutralização cruzada estreitamente relacionada ao tipo genital de alto risco (HPV52, HPV58), bem como aos tipos de alto risco filogeneticamente divergentes (HPV18, HPV45), genital de baixo risco (HPV11), beta-HPV (HPV5), e PV animal (CRPV) foi restrita aos resíduos L2 HPV16 aa 17-36 anteriormente relatados (o epítopo RG- 1). A importância de flanquear o aminoácido 17 e 32-36 é acentuada pela neutralização insuficiente dos soros produzidos contra o construto 18-31. Além disso, a apresentação de VLP de superfícies pode melhorar a imunogenicidade dos epítopos expostos comparando com proteínas de fusão lineares. Para determinar se a VLP quimérica manteve a capacidade de induzir anticorpos de neutralização a epítopos dependentes de conformação da proteína de veículo L1, ensaios de neutralização de pseudovírion de BPV1 foram realizados (Tabela 3b). Os antissoros induzidos pela VLP quimérica (BL1-16L2 18-31 (A), 17-36 (B), 75-112 (E), 115-154 (F), 149-175 (G))neutralizaram pseudovírions de BPV1 com títulos entre 100.000 a 1.000.000, ao passo que duas quimeras (BL1-16L2 2-22 (C) e 172-200 (H)) produziram títulos mais baixos de anticorpos de neutralização (1.000 a 10.000). Por isso, a inserção de quatro dos seis peptídeos não interferiu na indução de altos títulos de anticorpos de neutralização contra L1, independente do tamanho de peptídeos incorporados.

[000156] Como Freund não é aprovado para o uso humano, dois coelhos adicionais foram imunizados com BL1-16L2 17-36 (B)utilizando Alúmen-MPL como adjuvante. Uma formulação comparável (ASO4) é usada na vacina aprovada para HPV L1 Cervarix®. Além disso, quatro camundongos Balb/c foram vacinados com a mesma formulação de antígeno-adjuvante para apoiar as nossas observações da neutralização cruzada em um sistema mamífero diferente. O ELISA-peptídeo detectou respostas de anticorpo específico para L2 com títulos de 2.500-12.500 tanto em coelhos como em camundongos ( figura 4 b, c). VLP quimérica formulada no adjuvante de Freund ( figura 4a) induziu títulos de anticorpo pelo menos cinco vezes mais altos comparando com o Alúmen-MPL.

[000157] Ambos os coelhos imunizados com a formulação de Alúmen-MPL provocaram antissoros capazes de neutralizar HPV16 de alto risco (100/100), HPV18 (100/100) e HPV58 (100/100) e tipo beta HPV5 (50/50) (Tabela 4a). Além disso, um dos soros dos coelhos neutralizou o tipo de alto risco HPV45 (100) e o de baixo risco HPV6 (títulos de 50 a 100) e HPV11 (100). Dessa forma com esquemas de imunização similares àqueles com o adjuvante de Freund, a imunização com VLP usando Alúmen-MPL induziu títulos que foram uma ou duas ordens de magnitude mais baixas. Dentre quatro camundongos imunizados com BL1-16L217-36, um camundongo desenvolveu anticorpos de neutralização contra HPV16 somente (título de 100), dois camundongos provocaram anticorpos contra HPV16 (1.000/50-100) e 18 (1.000/100) e um animal desenvolveu anticorpos contra HPV18 (100), 31 (100), 45 (100), 52 (100) e 58 (100) (Tabela 4a).Tabela 4

[000158] 4a. Ensaio de neutralização de pseudovírion para antissoros de dois coelhos BNZ e quatro camundongos Balb/c imunizados com BL1-16L217-36 utilizando Alúmen-MPL como adjuvante. 3b. Os ensaios de neutralização de pseudovírion de antissoros de dois coelhos BNZ produzidos contra 16L1-16L2 17-36 utilizando Alúmen-MPL como adjuvante. Todos os ensaios foram realizados em duplicados para diluições de soro seriais de 10 vezes de 1:100-1:100.000. Quando um título de neutralização mais baixo era suspeito, os soros foram reavaliados na diluição de 1:50.

[000159] Para desenvolver capsídeos de HPV como veículo de vacina potencial, foi incorporado o epítopo de proteção cruzada L2 HPV16 aa 17-36 (RG-1) em L1 HPV16 (derivado da variante alemã 114K do HPV16 (Kirnbauer et al. (1993) {supra)). Análogo ao sítio de inserção de BPV1 L1 entre aa 133/134, para a inserção de HPV16 entre aa 136/137 foi usado. Estes aminoácidos estão localizados dentro da alça DE de superfície, adjacente a um segmento de L1 hipervariável e imunodominante. A reunião em VLP foi observada por MTE (figura 3J). Dois coelhos BNZ foram vacinados com VLP nativa com Alúmen-MPL como adjuvante. Como examinado pelo ELISA peptídeo, a imunização induziu anticorpos específicos para L2 em ambos os animais com títulos de 1:12.500 (figura 4d).

[000160] Quando analisados por ensaios de neutralização de pseudovírion, ambos os soros de coelho neutralizaram HPV16 com títulos de 100.000, que amplamente reflete a resposta de anticorpo ao veículo VLP L1 HPV16. Além disso, uma robusta neutralização dos tipos de alto risco heterotípicos HPV18 (1.000/1.000), HPV31 (10.000/1.000), HPV45 (1.000/100), HPV52 (100/50), e HPV58 (1.000/1.000) foi observada. Além disso, a neutralização de tipos de baixo risco HPV6 (100/50), HPV11 (100) por um dos soros dos coelhos, e tipo beta HPV5 (100/50) foi detectada (Tabela 4b). Como esperado, o antissoro de coelho #4835 (J.Schiller), produzido contra VLP L1 HPV16, usando Freund como adjuvante neutralizou HPV16 (1.000.000) e o estreitamente relacionado HPV31 (1.000) somente (dados não mostrados). Estes resultados eliminam o impacto do veículo L1 na larga faixa da neutralização cruzada e indicam que a inserção de peptídeos L2 não interfere com as respostas de anticorpo de alto título a L1.

Discussão

[000161] O impacto das recentemente introduzidas vacinas VLP HPV L1 na carga das neoplasias anogenitais associadas a HPV e sua rentabilidade econômica é o assunto de estudos contínuos. As vacinas atuais visam tipos de HPV que causam 90% das verrugas anogenitais (HPV6, HPV11) e/ou 70% dos cânceres cervicais (HPV16, HPV18). A proteção pela vacinação com VLP L1 é primariamente restringida a tipo com proteção cruzada parcial contra algumas mucosas filogeneticamente relacionadas. Dessa forma, os programas de rastreamento citológico em mulheres vacinadas não podem ser abandonados, e os custos consideráveis para a introdução de programas de imunização profilática na população devem ser suportados além dos custos do rastreamento. Além disso, as vacinas atualmente disponíveis são demasiado caras no momento atual para o uso em países em desenvolvimento, onde 80% da carga de câncer cervical global ocorre.

[000162] Estudos prévios demonstraram que a vacinação com o N- terminal ou peptídeos com extensão total de L2 ou proteínas pode induzir uma baixa titulação, com resposta de anticorpo ainda protetora a uma ampla faixa de divergentes tipos e espécies de papilomavírus. A estratégia de vacinação com VLP HPV16 L1-HPV16 L2 descrita neste pedido dispara com um construto único alto título de anticorpos de neutralização dependente da conformação similares a vacinação monovalente com VLP HPV 16 L1, e níveis significantes de anticorpos para uma região altamente conservada de L2 que neutralizam cruzadamente um amplo espectro de tipos de HPV patogênicos.

[000163] A cristalização da pequena VLP L1 HPV16 (T=I) descreveu a estrutura atômica do capsídeo viral, em particular as alças de superfície hipervariáveis que contêm os epítopos imunodominantes e dependentes da conformação que são reconhecidos pelos anticorpos de neutralização e determinam o sorotipo viral (Chen et al. (2000) Molecular Cell 5, 557-567). Para aumentar a imunogenicidade de L2, os peptídeos que cobrem a região N-terminal de L2 HPV16 foram inseridos em sítios correspondentes da alça DE de L1 BPVl e L1 HPV16. O comprimento tolerado do peptídeo L2 inserido que ainda permite à reunião VLP foi de 44 e 20 resíduos, respectivamente. A sequência de aminoácidos do inserto aparece como limitação adicional da reunião VLP. É notável que a análise da sequência fortemente prediz a presença de uma região de transmembrana em 45-67 que pode conferir a falência dos construtos de L2 35-75 e 13-107 de montar-se, e sua ausência de todos os construtos que realmente se montam. Esta observação estende estudos prévios e confirma que a alça DE imunogênica é um sítio adequado para apresentação de antígeno em dois gêneros diferentes de PV.

[000164] Vacinações para papilomavírus baseadas em VLP induzem fortes respostas imunes humorais (Carter et al. (1994) Virology 199, 284-91; Christensen et al. (1994) J Gen Virol 75, 2271-6; Kirnbauer et al. (1992) {supra); Rose et al. (1994) J Gen Virol 75, 2445-9), e mediadas por célula a L1 e antígenos incorporados (Handisurya et al. (2007) Feb J 274, 1747-1758; Lenz et al. (2001) J Immunol 166, 534655; Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188, 327-38; Rudolf et al. (2001) J Immunol 166, 5917-24; Slupetzky et al. (2001) J Gen Virol 82, 2799804; Yang et al. (2004) J Immunol 173, 2624-31; Zamora et al. (2006) Immunol YJ2, 2662-70). A resposta de anticorpo a VLP é fortemente dependente da densidade de epítopos presentes na superfície (Bachman et al. (1997) Ann Rev Immunol 15 _, 235-70; Chackerian et al. (2002) Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950) 169, 6120-6). Foram encontrados que os coelhos imunizados com VLP quimérica nativa demonstram robustas respostas imunes a L2 por ELISA, com, em média, títulos 5 vezes maiores comparando com vacinações com proteínas interrompidas por SDS (tabela 2). Supondo que esta diferença fosse provavelmente maior na ausência do adjuvante, a exposição do peptídeo nas superfícies VLP L1 parece representar uma estratégia útil para superar a sub-dominância imune de L2 no seu contexto natural.

[000165] Um exame abrangente de epítopos de célula B dentro da região N-terminal de L2 HPV16 foi conduzido usando sobreposição de peptídeos. Como os quiméricos BL1-16L2 69-81 e 108-120 foram publicados anteriormente (Slupetzky et al. (2007) (supra)), os peptídeos adjacentes foram projetados sem sobreposição. A neutralização de pseudovírions homólogos a HPV16 foi alcançada pela imunização com proteínas quiméricas que compreendem HPV16 L2 aa 13-154 (Tabela 3a). Esta observação apoia achados prévios em que a resposta protetora de anticorpo de neutralização a L2 de tipos divergentes de PV é mediada pela região N-terminal 150 aa de BPV4 L2 (Campo et al. (1997) Virology 234, 261-6; Chandrachud et al. (1995) Virology 211, 204-8); BPV1 L2 (Pastrana et al. (20005b)Virology 337, 365-72); CRPV-ROPV L2 (Embers et al. (2002) (supra)), HPV 16 L2 (Embers et al. (2004) Vaccine 22, 670-80; Kawana et al. (1998) Virology 245, 353-9; Pastrana et al.. (2005b) (supra)).

[000166] A neutralização cruzada eficiente de um amplo painel de tipos de HPV de mucosa foi restrita a soros produzidos contra HPV16 incorporado a resíduos L2 aa 17-36, o epítopo RG-1 anteriormente descrito (Gambhira et al. (2007b) (supra)). Resíduos dentro desta região altamente conservada entre os diferentes gêneros e tipos de PV foram anteriormente determinados a interagir com um receptor celular de superfície secundário, enquanto seu envolvimento crítico na infectividade do vírus é alocado para um estágio posterior da infecção.

[000167] O uso do Alúmen-MPL como o adjuvante estreitou a lacuna entre as condições de imunização dos estudos dos animais dados neste pedido e estabeleceu vacinas de subunidade L1. A formulação aproxima a propriedade adjuvante de ASO4 do Cervarix ®, cujas características adjuvantes foram atribuídas à ativação da imunidade inata por vias de citocinas pró-inflamatórias bem como indução de células B de memória. Os modelos de anticorpo de neutralização entre coelhos individuais vacinados com BL1-16L2 17-36 em Freund ou Alúmen-MPL diferenciam-se consideravelmente, mostrando 1-2 log de diferenças no título, ou até negatividade a alguns tipos, que poderiam ser devido a anticorpos abaixo do nível de detecção, em vez de processamento e apresentação diferente do epítopo em indivíduos. De maneira geral, a neutralização cruzada foi induzida em dois mamíferos diferentes e utilizando Alúmen-MPL como adjuvante, que é aplicável para o uso humano.

[000168] Mais importante, os níveis de anticorpos de neutralização induzidos neste pedido presumivelmente são protetores in vivo (Embers et al. (2002) (supra); Gambhira et al. (2007a) (supra); Gaukroger et al. (1996) (supra)). A sensibilidade dos papilomavírus à neutralização por antisoros de baixo título pode ser em parte devido à cinética de entrada excepcionalmente lenta nas células permitindo acesso prolongado aos anticorpos de neutralização (CuIp et al. (2004) Virology 319, 152-61). Além disso, um modelo de desafio vaginal de camundongos aponta para o fato que o vírus inicialmente se liga à membrana basal do epitélio mecanicamente rompido e consequentemente se adsorve nas células epiteliais, enquanto elas recuperam o contato à membrana basal (Roberts et al. (2007) Nat Med 13, 857-61).

[000169] Apesar da modificação de L1 da VLP de superfície pela inserção de L2, imunização com VLP BL1-16L2 quimérica induziu um alto título de anticorpos anti-BPVl L1, independente do comprimento de peptídeo inserido. Similarmente VLP 16L1-16L2 17-36 induziu altos títulos de anticorpos de neutralização de HPV16, similares a vacinação com VLP HPV16 L1 selvagem, indicando que os epítopos imunogênicos principais de L1 são mantidos. É notável, que a imunização de coelhos com VLP 16L1-16L2 17-36 quimérica nativa, com Alúmen-MPL como adjuvante induziu uma robusta neutralização dos tipos de HPV de alto risco 16/18/31/45/52/58, tipos de baixo risco 6 e 11 e tipo beta HPV 5, com títulos de neutralização aproximadamente de 10 a 100 vezes mais altos quando em comparação com soros produzidos contra VLP BL1-16L2 17-36comparável sob condições idênticas de vacinação (tabela 4). Estes resultados indicam uma apresentação favorável do epítopo RG-1 dentro da composição de aminoácidos de L1 de HPV16 como veículo. Por isso, espera-se que os epítopos de neutralização cruzada dentro da região altamente conservada 17-36 de L2 dos divergentes tipos de HPV podem ser expostos em uma maneira análoga.

[000170] VLP L1-L2 quimérica permite vacinas de HPV de amplo espectro. Seu uso potencial é baseado em L1 de VLP como veículo da vacina, que são bem tolerados e fornecem proteção de longo prazo de 8 anos até agora. Como o rendimento obtido é similar àquele da VLP L1 HPV16 selvagem (dados não mostrados), espera-se que a vacina VLP HPV16 L1-HPV16-L2 17-36 descrita neste pedido forneça uma ampla proteção cruzada a tipos heterotípicos de HPV, sem aumento de custos, além da proteção de alto nível e restrita a tipo contra HPV16 homólogo.Exemplo III. Caracterização adicional do espectro de neutralização cruzada baseada em L2

[000171] Dois coelhos BNZ foram imunizados 4 vezes nas semanas 0, 4, 6, 8 com VLP-RG1 (HPV16L1-16L2 (17-36)) mais adjuvante de Alúmen-MPL (Charles River, Alemanha). Os antissoros foram tirados 2 semanas após a 4a imunização e testados utilizando ensaios de neutralização de pseudovírion recentemente estabelecidos para os tipos de HPV 3, 32, 33, 38, 68, 76 (Helena Faust, Joakim Dillner, não publicado). Os soros pré-imunes dos mesmos coelhos foram usados como controles. O antissoro de um coelho BNZ que tinha sido imunizado com VLP HPV16L1 selvagem mais adjuvante de Freund (primeira imunização com adjuvante de Freund completo (CFA), pulsos com o adjuvante de Freund incompleto (IFA)) foi usado como controle adicional. Os soros foram diluídos 1:100, 1:1000 e 1:10.000 e testados duas vezes. Os soros que não neutralizavam na diluição 1:100 foram ainda testados uma vez na diluição 1:50.

[000172] Os antissoros a VLP-RG1 neutralizaram cruzadamente os tipos de HPV de mucosa de alto risco 33, 68, 76, tipo de mucosa HPV32 (causador da doença de Heck), e tipo de pele alfa HPV3, com títulos de 50 a 1.000 (Tabela 5, colunas 2, 4). Ao contrário os soros pré-imunes dos mesmos coelhos foram não neutralizantes em todos os ensaios (colunas 1, 3).

[000173] Além disso, a neutralização de baixo título do HPV 32, 33, e 68 foi detectada para o antissoro #4835 para VLP L1 HPV16 selvagem (coluna 5). Além, o último soro tinha sido produzido usando o forte adjuvante de Freund.

[000174] Tabela 5. Ensaios de neutralização de pseudovírion. Os títulos mostrados correspondem a mais alta diluição recíproca dos soros de coelho indicados (pré) imunes a VLP-RG1, ou VLP L1 HPV16 selvagem, que neutralizou os tipos de pseudovírion de HPV indicados.

1, Pré-imunização BNZ#12, VLP-RG1 + Alum-MPLBZN#1 após a 4a imunização3, Pré-imunização BNZ#24, VLP-RG1 + Alum-MPLBZN#2 após a 4a imunização5, VLP L1 HPV16 + CFA/IFA BNZ#4835 após a 4a imunização Ensaio de Neutralização de Vírion de HPV2a (RT-PCR)

[000175] Foi determinado então a capacidade dos antissoros de VLP-RG1 em neutralizar o tipo de pele alfa HPV2a, que está estreitamente relacionado a HPV27 e 57. HPVl, 2, 27 e 57 são os tipos de HPV mais prevalentes detectados em 96% de verrugas comuns cutâneas HPV-positivas (de Koning et al., J Clin Microbiol). Além disso, uma duração longa de verrugas relacionadas a HPV2 foi descrita (Rubben et al. (1997) Arch Dermatol Res 289, 337-340), e HPV2 e HPV57 também foram isolados de lesões de mucosas. Para desenvolver um ensaio de neutralização baseado no vírion infeccioso in vitro, HPV2a nativo foi isolado de uma grande verruga plantar de um paciente que sofre de múltiplas verrugas extensas de pele. Para determinar tipo de HPV, DNA genômico foi isolado do tecido da verruga e amplificação por PCR por 40 ciclos usando iniciadores gerais CP4/CP5, ou PPF1/CP5, visando a região E1: PPFl 5'-(nt2082) - AAC-AAT-GTG-TAG-ACA-TTA-TAA-ACG-AGC-(nt 2108)-3' (SEQ ID NO:86)

[000176] CP4 5'-(nt1942)-ATG-GTA-CAR-TGG-GCA-TWT-GA- (nt1961)-3' (SEQ ID NO:87) CP5 5'-(nt2400)-GAG-GYT-GCA-ACC- AAA-AMT-GRC-T-(nt2378)-3' (SEQ ID NO:88) Os amplicons foram sequenciados e um BLAST do nucleotídeo (ncbi.nlm.nih.gov) descreveu pareamento de 100% com o HPV2a (Número de acesso X55964, desde a data de depósito da presente aplicação).

[000177] O tecido de verruga foi removido usando uma lâmina de navalha e, após adição de um volume igual de PBS, congelado no nitrogênio líquido. O tecido foi descongelado e mecanicamente homogeneizado com contas de aço usando Instrumento Fast Prep-24 em 4,0 M/S, 2 vezes por 20 segundos (MP Biomedicals, LLC). Após uma centrifugação por 5 min a 14.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf, o sobrenadante contendo o vírion foi coletado e armazenado em alíquotas a -80°C.

[000178] O ensaio de neutralização foi desenvolvido em analogia a um método descrito (Smith et al. (1995)/. J Invest. Dermatol. 105, 438444; Shafti-Keramat et al. (2003) J Virol 77, 13125-13135).Resumidamente, os queratinócitos (3x 105 células) foram semeados em placas de cultura de tecido com 60 mm de diâmetro. No dia seguinte meio de cultura foi aspirado e as células foram infectadas com 2μl da solução de vírion de HPV2 em 1 ml de DMEM (Invitrogen) pré-incubado com a diluição indicada dos soros pré-imunes ou imunes a VLP-RG1, ou somente meio como controle, antes de serem adicionados às células, incubados por 1 hora à temperatura ambiente com um leve balanço a cada 15 min, e então adicionado 4 ml de DMEM fresco + SFB 10% + antibiótico/antifúngico 1% (Invitrogen). Como controle de especificidade, os vírions foram incubados com o antissoro produzido contra VLP-L1 HPV2 (um gentil presente de TiIo Senger, German Cancer Research Center, Heidelberg), ou VLP HPV16 selvagem-L1/selvagem-L2. Após 24 horas da incubação, RNA celular total foi coletado usando Tri Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio). Para a síntese da primeira fita de cDNA, iniciadores oligop(dT) 15 foram usados (Roche). MRNA agrupado de HPV2 E1AE4 foi detectado por dois ciclos de 30 ciclos de PCR aninhada utilizando os seguintes iniciadores: 1o círculo: HPV2 UO: 5'- GGGTGGTAACTACCTGCTG-3' (SEQ ID NO:89), HPV2 DO: 5 '-CTCTTGTCAGGAACTCTGTACG-3' (SEQ ID NO:90); 2o círculo: HPV2 UI: 5 '-CAGAACCGTCCGGCTGGTGG-3' (SEQ ID NO:91) HPV2 DI: 5 '-CCCACCCGCCCAGTGCCAC-3' (SEQ ID NO:92). Os tamanhos finais esperados dos amplicons do PCR foram 556 bp para mRNA do HPV2 e 429 bp para mRNA da beta-actina.

[000179] Como mostrado na figura 5, o antissoro anti-RG1 neutralizou vírions de HPV2a como indicado pela ausência de RNA viral detectável (coluna 5), ao passo que o controle sem soro (coluna 2), o soro pré-imune (coluna 4), e o soro produzido contra VLP HPV16 selvagem-L1/selvagem-L2 (coluna 6) não neutralizaram. Como controles apropriados, nenhum RNA viral foi detectado quando nenhum vírus foi adicionado a células (coluna 1), ou quando um soro de neutralização anti- VLP HPV2 L1 foi usado (coluna 3).

[000180] Para determinar títulos de neutralização ao longo do tempo, dois coelhos foram imunizados com VLP-RG1 mais o Alúmen-MPL em 0, 4, 6, 8 semanas e os soros analisados 10 meses após o terceiro pulso. Os títulos de antissoros de neutralização (cruzada) foram detectáveis com redução de 10 a 100 vezes ou tinham ficado indetectáveis, quando em comparação com títulos de soros tirados duas semanas após o terceiro pulso (Tabela 6, comparar a coluna '10 meses' com a coluna '3° pulso'). Importantemente, um VLP-RG1 adicional mais o pulso de Alúmen-MPL de coelhos no mês 10 aumentou os títulos de soros tirados duas semanas depois dos antigos níveis no mínimo (vide tabela 6, coluna '4o pulso'). Estes dados indicam uma resposta funcional de célula B de memória aos epítopos de neutralização (cruzada) de VLP-RG1.

[000181] Tabela 6: Imunização em pulsos de dois coelhos BNZ com VLP-RG1 (HPV16L1 - 16L2 (17-36)) 10 meses após imunizaçãoprimária

[000182] Tabela 6: Dois coelhos BNZ foram imunizados com VLP- RG1 mais Alúmen-MPL como descrito acima, e soros retirados 2 semanas após a quarta imunização (3o pulso). 10 meses depois, os soros foram retirados (10 meses de segmento) e ambos os coelhos receberam um pulso adicional de VLP-RG1 mais adjuvante Alúmen- MPL e os soros foram retirados novamente duas semanas depois (4o pulso). Os soros foram analisados por diluições seriais de 10 vezes em ensaios de neutralização de pseudovírion indicados. Os títulos de neutralização são mostrados. O ponto de interrogação (?) indica que o respectivo título de neutralização não foi determinado.

[000183] Conclusão: a Imunização com VLP HPV16L1-RG1quimérico no adjuvante aplicável para o uso humano pode induzir respostas de anticorpo de amplo espectro de longa duração para papilomavírus de mucosa de alto risco, de baixo risco e divergente alfa e beta cutâneo.

[000184] Da descrição precedente, um versado na técnica pode apurar facilmente as características essenciais desta invenção, e sem se afastar do espírito e escopo da mesma, pode fazer trocas e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições e utilizar a presente invenção até sua extensão mais completa. As modalidades específicas precedentes preferenciais são para ser interpretadas como simplesmente ilustrativas, e não limitadas ao escopo da invenção de qualquer modo em absoluto. A revelação inteira de todas os pedidos de patente, patentes e publicações (incluindo o pedido de patente provisório 61/168.445, depositado em 10 de abril de 2009) citados acima e nas figuras são por meio deste incorporados em sua totalidade por referência.

Claims

1. Composição de partícula semelhante a vírus (VLP), caracterizada pelo fato de que é formada a partir de um polipeptídeo quimérico compreendendo uma proteína L1 do vírus do papiloma (PV) na qual é inserido um peptídeo exibido na superfície consistindo na seguinte sequência de uma proteína L2 do vírus do papiloma:a) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO: 9) oub) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO: 56) ouc) LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO: 57),em que o peptídeo L2 é inserido na alça DE da proteína L1.

2. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de quea proteína L1 é do HPV16, e o peptídeo L2 é inserido entre os aminoácidos 136 e 137 na alça DE da proteína L1 (SEQ ID NO: 85), oua proteína L1 é do BPV1, e o peptídeo L2 é inserido entre os aminoácidos 133 e 134 na alça DE da proteína L1 (SEQ ID NO: 83).

3. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as proteínas L1 e L2 são de um vírus do papiloma humano (HPV).

4. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 é de um BPV.

5. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 é uma variante, tal que a proteína L1 pode tolerar a inserção de um peptídeo L2 apropriado, sem perder sua antigenicidade, e pode se conformar em um VLP, ou pelo menos um capsômero.

6. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma composição imunogênica, preferencialmente em que é imunogênica contra vírus do papiloma de mucosa de alto risco ou baixo risco, cutâneo de baixo risco, e/ou cutâneo tipo beta.

7. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é imunogênica contra três ou mais dos seguintes vírus do papiloma: HPV de mucosa de alto risco tipos 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58, 68, ou 76; HPV de mucosa de baixo risco tipos 6, 11; HPV tipos 13, 32; HPV cutâneo de baixo risco tipos 1, 2, 3, 4, 7, 10, 27, 57; e/ou HPV tipo beta 5, 8, 9, 12, 14, 15, 38.

8. Composição de VLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

9. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de VLP, como definida na reivindicação 1, e um adjuvante.

10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9 caracterizada pelo fato de que é eficaz contra vírus do papiloma humano, preferencialmente em que é eficaz contra vírus do papiloma de mucosa de alto risco, baixo risco, tipos cutâneos e/ou tipo beta.

11. Vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição:(i) é formulada para a administração por inalação, ingestão, em um vetor viral ou bacteriano, ou como um componente de um lubrificante sexual;(ii) está em uma formulação para injeção intramuscular (i.m.); e/ou(iii) está em uma forma liofilizada ou em pó.

12. Polipeptídeo quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína L1 do vírus do papiloma (PV), na qual é inserido um peptídeo exibido na superfície consistindo de uma das seguintes sequências de uma proteína L2 do vírus do papiloma: a) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO: 9) oub) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO: 56) ouc) LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO: 57),em que o peptídeo L2 é inserido na alça DE da proteína L1.

13. Polipeptídeo quimérico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que está inserido em uma célula hospedeira.

14. Método para preparar uma composição de VLP ou de capsômero, caracterizado pelo fato de que compreende incubar um polipeptídeo quimérico, como definido na reivindicação 12, sob condições adequadas para a auto-montagem.

15. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de VLP, como definida na reivindicação 1.

16. Composição de capsômero, caracterizada pelo fato de que é formada a partir de um polipeptídeo quimérico compreendendo uma proteína L1 do vírus do papiloma (PV), na qual é inserido um peptídeo exibido na superfície consistindo de uma das seguintes sequências a partir de uma proteína L2 do vírus do papiloma:a) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO: 9) oub) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO: 56) ouc) LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO: 57),em que o peptídeo L2 é inserido na alça DE da proteína L1.

17. Uso de uma VLP, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição, vacina e/ou kit para imunização contra o HPV.

18. Uso de uma VLP, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para vacinação contra o HPV.

19. Uso de uma VLP, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para induzir uma resposta imune em um indivíduo contra o HPV.

20. Uso de uma VLP, como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar uma infecção por PV em um indivíduo com infecção por PV ou em risco de exposição ao PV.

21. Uso de uma VLP, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para prevenção de câncer cervical, anogenital, orofaríngeo ou pré-câncer.

22. Uso de uma VLP, como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para a preparação de uma composição para induzir uma reação imunológica a um HPV do tipo cutâneo.