BRPI1007567B1

BRPI1007567B1 - Processo para modificar o sabor de um substrato contendo proteína de soja

Info

Publication number: BRPI1007567B1
Application number: BRPI1007567-4A
Authority: BR
Inventors: Christoph Hendrink Beckmann; Jan Willem Sanders; Marie-Solenne Coic; Michel Mellema
Original assignee: The Coca-Cola Company
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2010-05-07
Publication date: 2022-09-27
Also published as: MX2011012487A; MX347102B; BRPI1007567A2; ZA201108656B; AR076693A1; BRPI1007567A8; WO2010136321A1; CN102458137A

Abstract

PROCESSO PARA MODIFICAR O SABOR DE UM SUBSTRATO CONTENDO PROTEÍNA DE SOJA. A presente invenção se refere a um processo para a fermentação de um substrato que compreende proteína de soja e um carboidrato com o uso de duas cepas específicas de bactéria mesofílica, a fim de melhorar o sabor da proteína de soja e dos gêneros alimentícios contendo a mesma.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao campo de produtos fermentados (ou cultivados) que contêm soja, especialmente bebidas fermentadas à base de soja, e a um processo para o preparo de tais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os consumidores tornaram-se mais bem informados sobre proteína e seu papel em uma dieta saudável. Esta nova compreensão teve um efeito profundo, estimulando a procura e o interesse do consumidor por bebidas mais saudáveis que são enriquecidas com proteína. Devido ao fato de as bebidas serem uma forma conveniente para incorporar proteína à dieta, os fabricantes continuam a formular novos produtos em um esforço para tornar a proteína mais acessível a um grupo mais amplo de consumidores. As duas proteínas de bebida mais populares são proteína do leite e proteína de soja, e seus vários derivados isolados. De acordo com a Agência de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos, o consumo de produtos alimentícios ricos em proteína de soja pode reduzir o colesterol, melhorar o desempenho atlético, e auxiliar ainda na batalha contra diabetes. Além disso, o interesse pela substituição do leite pela proteína de soja aumentou considerando, por um lado, as questões em relação à sensibilidade em excesso e/ou intolerância contra constituintes do leite experimentados por um número crescente de consumidores, um desejo por produtos adequados para (restrito) vegetarianos e, por outro lado, preços elevados da proteína do leite e questões de abastecimento que alguns fabricantes estão enfrentando em relação a esta mercadoria. As proteínas de soja foram propostas para substituir as proteínas do leite, parcial ou totalmente, dependendo do sistema, e os produtos similares a laticínio foram desenvolvidos baseados inteiramente na proteína de soja.

[003] Tendo em vista os benefícios documentados relacionados à saúde da soja, é desejável incorporar quantidade substancial de proteína de soja em bebidas. No entanto, a incorporação de proteína de soja, por exemplo, em bebidas apresenta diversos desafios. A incorporação de proteína de soja em bebidas é conhecida por conferir um gosto posterior notável e um gosto “de grão” distinto. Foram propostos tipos diferentes de processos para isolar a proteína de soja que auxiliam na remoção destas notas-sabores (estranhos) indesejáveis. Infelizmente, contudo, é quase impossível remover completamente as “notas estranhas” de soja típicas das fontes de proteína de soja como concentrados de soja e isolados de soja. Além disso, na maioria das aplicações de produto, a intensidade de notas estranhas de soja aumenta durante processamento e armazenamento, provavelmente como resultado da formação de compostos de sabor estranho de moléculas precursoras.

[004] O documento U.S. 3.364.034 descreve um método para a remoção de sabor característico e/ou odor de materiais de proteína vegetal para fornecer um produto substancialmente insípido, que compreende: inocular os ditos materiais de proteína com bactéria selecionada a partir do grupo que consiste em Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus cerivisiae, Pseudomonas ovalis, Pseudomonae tragi, Aerobacter aerogenes, Streptococcus lactis, incubar por 16 a 144 horas sob condições que levam à proliferação de bactérias; e terminar a dita proliferação de bactérias após o dito material ser produzido substancialmente insípido. O documento U.S. 4.664.919 descreve um processo para a produção de alimento do tipo iogurte, que compreende fermentar leite de soja com Streptococcus sojalactis. É observado na Patente U.S. que o alimento do tipo iogurte obtido desta forma não apresenta odor 'verde' peculiar de leite de soja e que tem um bom gosto. Declarou-se adicionalmente que a cepa de Streptococcus mencionada anteriormente é capaz de remover o odor 'verde' de grãos de soja e que as quantidades de diacetil e acetona formada são maiores que aquelas de outra bactéria de ácido lático. Os dados fornecidos sobre o Streptococcus sojalactis mostram que o micro-organismo é capaz de se proliferar a temperaturas na faixa de 30 a 40°C, mas não a 20°C ou menos ou a temperaturas de 45°C ou mais.

[005] O documento U.S. 6.599.543 refere-se ao processo para a preparação de um leite de soja fermentado que compreende: colocar os grãos de soja inteiros descascados e sem hipocótilo com água quente ou morna; remover o componente solúvel em água quente ou morna dos grãos de soja; pulverizar os grãos de soja para produzir uma pasta aquosa; remover o componente insolúvel da pasta aquosa para produzir um leite de soja, inocular uma bactéria de ácido lático dos gêneros Bifidobacterium, Lactobacillus bulgaricus e uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste em Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei no leite de soja, adicionar um ou mais sacarídeos que podem ser utilizados pela bactéria de ácido lático para o leite de soja, e fermentar o leite de soja para produzir o leite de soja fermentado. A remoção do hipocótilo dos grãos de soja conforme ensinado pelo documento U.S. 6.599.543 é trabalhosa e dispendiosa.

[006] O documento EP-A 0 386 817 descreve um processo de preparação de um leite de soja fermentado, que compreende as etapas de: a) inocular o leite de soja com uma bactéria de ácido lático formadora de polissacarídeo exocelular; b) incubar o leite de soja inoculado; e c) recuperar o produto fermentado.

[007] O Exemplo 1 do pedido de patente europeia descreve como 100 ml de leite de soja contendo 0,5% em peso de uma lactose adicionada foi fermentado com uma cultura de bactéria de ácido lático formadora de polissacarídeo exocelular (Streptococcus cremoris) por 15 horas a 25°C, após isto, o pH caiu para 4,6. Após fermentação, foi obtido um produto com uma consistência altamente viscosa e praticamente sem sabor de grão.

[008] O documento EP-A 1 145 648 descreve um método de preparação de um ingrediente alimentício proteináceo de soja fermentado de ácido lático com níveis reduzidos de oligossacarídeos que induzem flatulência e níveis conservados de isoflavonas, em que o dito método compreende: d) fornecer um material de soja cru aquoso contendo proteína de soja, oligossacarídeos que induzem flatulência, e isoflavonas; e e) tratar simultaneamente o material de soja cru aquoso com (1) uma fonte de atividade glicosidase que é eficaz para hidrolisar os oligossacarídeos que induzem flatulência em sacarídeos fermentáveis e (2) um ácido lático que produz cultura que fermenta os sacarídeos fermentáveis.

[009] O Exemplo 2 descreve como uma pasta aquosa de sólidos a 30% de farinha de soja desnatada em água foi simultaneamente inoculada com cerca de 5 por cento de uma cultura de ácido lático (mistura de Lactococus lactis e Streptococcus cremoris) e cerca de 0,01 por cento de enzima α-galactosidase. A pasta aquosa inoculada foi mantida a 35°C por 4 horas, período durante o qual o pH caiu de 6,6 para 5,3.

[010] O documento JP-A-2004-261003 descreve um método de preparação de leite de soja fermentado através da fermentação de leite de soja e através da adição de palatinose (isomaltulose) antes, durante ou após fermentação. No Pedido Japonês, observou-se que o cheiro de grama inerente ao leite de soja pode ser reduzido até certo ponto através da fermentação de leite de soja com uma combinação de uma bactéria de ácido lático e uma bifidobactéria, mas que os resultados satisfatórios não podem sempre ser estabelecidos, em particular, devido ao sabor e odor de ácido acético, que é um produto metabólico da fermentação. A palatinose é incorporada ao leite de soja fermentado para suprimir o sabor desagradável, o odor da fermentação, aspereza e o odor de ácido acético gerado no curso da fermentação de ácido lático ou fermentação de ácido acético. Os exemplos do Pedido de Patente Japonesa descrevem a preparação de iogurtes para beber fermentados de um leite de soja ao qual isomaltulose e sacarose são adicionadas antes e/ou após fermentação. Nos exemplos, uma cultura de partida é usada e compreende Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus e Streptoccus thermophilus. Os iogurtes para beber revelados no pedido japonês são extremamente doces já que os mesmos contêm mais de 8% em peso de dissacarídeo adicionado (isomaltulose e/ou sacarose).

[011] Murti TW et al., Journal of Food Science (1993), 58(1), páginas 153 a 157 descreve experimentos nos quais o leite de soja e o leite de vaca foram inoculados com Streptococci, Lactobacilli na ausência ou presença de Bifidobacteria e em que a concentração de inúmeros compostos voláteis foi monitorada durante a fermentação. Os resultados mostram que durante a fermentação do leite de soja a 42°C, a concentração de n-hexanal foi diminuída de 2,31 ppm para 0,55 ppm (sem Bifidobacteria) ou 0,45 ppm (com Bifidobacteria) após 4 horas. O teor de ácido lático após 4 horas de fermentação era de pelo menos 0,4% em peso.

[012] Há um desejo por um produto alimentício contendo proteína de soja que é processado de tal modo que tenha uma quantidade reduzida de componentes de sabor indesejado (comparado aos produtos não processados), e, de preferência, tal processo deveria ser capaz de fornecer produtos (dependendo das condições) e que tenha um caráter de sabor na faixa de insípido a levemente laticínio (mas não um caráter de laticínio real). Isto também significa que é desejado que o pH do produto fermentado não caia abaixo de 6. Tal caráter mais insípido permitiria o processamento em vários outros produtos. De preferência, isto deveria ser alcançável com um número limitado de diferentes ingredientes, a fim de permitir processamento conveniente.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[013] Verificou-se, neste instante, que o objetivo acima pode ser alcançado, pelo menos em parte, através de um processo para modificar o sabor de um substrato contendo proteína de soja, em que o método compreende as etapas de:

[014] fornecer um líquido aquoso pasteurizado ou esterilizado que compreende 0,5 a 15% em peso de proteína de soja dissolvida e pelo menos 0,1 % em peso de carboidratos,

[015] inocular o dito líquido contendo proteína de soja com bactéria de um primeiro grupo de culturas mesofílicas selecionadas a partir de Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus pseudomesenteroides e Lactobacillus reuteri, (bactéria removedora de sabor) em uma quantidade entre 105 a 109 CfU/ml de substrato, e

[016] inocular o dito líquido contendo proteína de soja com bactéria de um segundo grupo de culturas mesofílicas selecionadas a partir de Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Propionibacterium, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus casei, (bactéria formadora de sabor) em uma quantidade entre 105 a 109 CfU/ml de substrato,

[017] fermentar o líquido aquoso inoculado através da incubação a uma temperatura de 15 a 37°C por 0,5 a 10 horas,

[018] em que as bactérias selecionadas a partir do dito primeiro grupo e do dito segundo grupo são inoculados em razões Cfu do primeiro grupo para o segundo grupo de entre 10:1 e 1:100, de preferência 1:1 a 1:40.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[019] É conhecido, a partir da literatura, que quando os substratos contendo proteína de soja são fermentados com bactéria de ácido lático termofílicas, tais LABs termofílicas podem ser capazes de fornecer componentes de sabor benéficos para tal substrato. Verificou-se, surpreendentemente, contudo, que a bactéria mesofílica específica também pode fazer o mesmo. Este grupo de bactérias "geradoras de sabor" compreende, no presente documento, bactérias de ácido lático Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus casei, bem como a bactéria Propionibacterium.

[020] Também se verificou que outras bactérias mesofílicas específicas (ácido lático) podem diminuir o nível de certos componentes que são responsáveis pelos típicos sabores estranhos de soja. Este grupo de bactérias de ácido lático "removedoras de sabor" compreende, no presente documento, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus pseudomesenteroides e Lactobacillus reuteri. Adicionalmente, verificou-se que é possível executar as fermentações com bactérias de ambos os grupos mesofílicos ao mesmo tempo, desde que (para alcançar os benefícios conforme desejado) se assegure a inoculação seja executada de tal modo que seja alcançada uma dada razão de bactérias em ambos os grupos.

[021] Também se verificou, surpreendentemente, que, dependendo das condições de reação (por exemplo, tempo de fermentação) pode-se produzir um produto tendo um caráter mais laticínio no sabor, ou um caráter mais insípido, e para ambos dos quais o nível de componentes de sabor estranho seja reduzido. Isto proporciona o benefício de ser capaz de produzir uma variedade de produtos com diferentes perfis de sabor, enquanto apenas duas cepas de bactéria mesofílica diferentes são usadas, o que é definitivamente uma vantagem a partir de um ponto de vista de processamento, já que fornece flexibilidade na fabricação com um número limitado de cepas de bactéria que precisa ser mantido.

[022] No processo de acordo com a invenção, a Propionibacterium do grupo "gerador de sabor" é, de preferência, selecionada a partir de P. freudenreichii, P. acidipropionici, P. jensenii e P. thoenii.

[023] Também, no processo de acordo com a presente invenção, as bactérias de um primeiro grupo ("removedoras de sabor") de culturas mesofílicas compreendem, de preferência, Lactobacillus brevis.

[024] O termo "bactéria de ácido lático" para uso no presente documento se refere à bacilli ou cocci Gram positiva em formato de haste que não respira que não esporula tolerante a ácido que produz ácido lático como um produto final metabólico principal de fermentação de carboidrato. Para uso no presente documento, o termo "bactéria de ácido lático" não abrange Bifidobacterium ou Propionibacterium.

[025] Embora o processo conforme apresentado no presente documento possa ser empregado em um amplo grau de níveis de proteína (por exemplo, 0,5 a 15%) no substrato, é preferencial que o líquido aquoso pasteurizado ou esterilizado que é inoculado compreende proteína de soja em uma quantidade entre 1 e 10% em peso, de preferência, entre 1 e 8% em peso. "Teor de proteína de soja", para uso no presente documento, se refere à quantidade total de proteína de soja e peptídeos derivados de proteína de soja contida no produto fermentado. O produto fermentado pode ser baseado na proteína de soja, no hidrolisado de proteína de soja ou combinações disto. Conforme será compreendido pelo versado na técnica, a hidrólise (enzimática) de ligações de peptídeo pode ocorrer durante a fermentação.

[026] O substrato que é fermentado no presente método, isto é, o líquido aquoso contendo 0,5 a 15% em peso de proteína de soja dissolvida é, de preferência preparado a partir de uma fonte de proteína de soja selecionada a partir do grupo que consiste em isolado de soja, concentrado de soja, farinha de soja e combinações disto. De acordo com uma realização particularmente preferencial, as últimas fontes de proteína de soja foram obtidas a partir de grãos de soja que exibem atividade de lipoxigenase muito baixa, por exemplo, uma atividade de lipoxigenase menor que 15 kU/mg. Ainda preferencialmente, a fonte de proteína de soja deriva de grãos de soja que exibem uma atividade de lipoxigenase menor que 10 kU/mg, mais preferencialmente menor que 8 kU/mg. Da mesma forma, é vantajoso preparar o presente líquido aquoso a partir de uma fonte de proteína de soja que tem uma atividade de lipoxigenase menor que 5 kU por grama de proteína de soja. Mais preferencialmente, a fonte de proteína de soja tem uma atividade de lipoxigenase menor que 1 kU por grama de proteína de soja.

[027] A atividade de lipoxigenase é determinada espectrofotometricamente de forma adequada através do uso de um ensaio de matriz de acoplamento específico para hidroperóxidos gerados a partir de ácido linoléico, conforme completamente descrito por Anthon e Barrett (J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 32 a 37).

[028] O presente método emprega, de preferência, proteína de soja derivada de grãos de soja que não tiveram o hipocótilo removido (como tal, isto evita etapas de processo adicionais). Consequentemente, o isolado de soja, concentrado de soja e/ou farinha de soja mencionados acima são vantajosamente derivados de grãos de soja opcionalmente descascados que compreende, ainda, o hipocótilo. Mais preferencialmente, as últimas fontes de proteína de sojas derivam de grãos de soja descascados que compreendem, ainda, os hipocótilos. O termo “grãos de soja sem hipocótilo” para uso no presente documento se refere a grãos de soja a partir dos quais o hipocótilo foi removido. O hipocótilo é um termo botânico para uma parte de uma muda de germinação de sementes de uma planta. Como o embrião de planta cresce na germinação, isto divide um broto denominado radícula que se torna a raiz primária e penetra para baixo no solo. Após a emergência da radícula, o hipocótilo emerge e levanta a ponta crescente acima do terreno, portando as folhas embriônicas (denominadas cotilédones) e a plúmula que dá origem às primeiras folhas verdadeiras. O hipocótilo é o órgão primário de extensão da planta jovem e desenvolve o caule.

[029] Para uma proliferação satisfatória da bactéria mesofílica, é preferencial que alguns carboidratos estejam presentes no substrato. Os mesmos podem ser adicionados como tal, mas já fazem parte, frequentemente, de uma preparação contendo proteína de soja que é usado como um substrato. Por conseguinte, é preferencial que o líquido aquoso pasteurizado ou esterilizado que é inoculado compreenda carboidratos em uma quantidade de 0,1 a 10% em peso, de preferência, 0,2 a 5% em peso. Tais carboidratos são, de preferência, carboidratos simples como mono- e/ou dissacarídeo. Os carboidratos preferenciais, nesta conexão, são glicose, frutose, galactose, sacarose, rafinose, estaquiose, lactose e combinações disto. No entanto, o presente método possibilita a preparação de uma bebida de sabor agradável sem o uso de grandes quantidades de adoçante para mascarar as notas estranhas de sabor de soja. Deste modo, vantajosamente, menos de 6% em peso de dissacarídeos são adicionados antes, durante ou após a fermentação. De acordo com uma realização particularmente preferencial, o produto fermentado no recipiente vedado contém menos de 5% em peso de dissacarídeos, mais preferencialmente menos de 4% em peso de dissacarídeos. Ainda de acordo com outra realização preferencial, o produto fermentado embalado contém menos de 8% em peso de mono- e/ou dissacarídeos, mais preferencialmente menos de 5% em peso de mono- e/ou dissacarídeos.

[030] A fermentação é, de preferência, executada a uma temperatura na qual as bactérias de duas cepas usadas trabalham de forma ideal. Nesta conexão, é uma vantagem que ambas sejam mesofílicas.

[031] Seguindo isto, é preferencial que a fermentação seja executada a uma temperatura de 15 a 37°C, de preferência, a uma temperatura de entre 25 e 35°C.

[032] A duração da fermentação no presente documento se encontra, tipicamente, na faixa de 1 a 10 horas, mais preferencialmente, de 2 a 10 horas. De acordo com outra realização preferencial, o tempo de fermentação não excede 14 horas, ainda mais preferencialmente, não excede 10 horas e mais preferencialmente, não excede 8 horas.

[033] Para a fabricação de um produto que possa ser vendido comercialmente, é preferencial que o processo compreenda uma etapa adicional que compreende pasteurizar ou esterilizar a composição aquosa fermentada desta forma.

[034] O processo de acordo com a presente invenção também pode compreender as etapas de carregar o produto fermentado nos recipientes e subsequentemente vedar os recipientes carregados, sendo que o ácido comestível é adicionado ao produto fermentado antes do carregamento dos recipientes de modo a ajustar o pH para menos de 4,5 e opcionalmente, o produto fermentado não é submetido à pasteurização ou esterilização antes, durante ou após o carregamento dos recipientes. Nisto, o ácido comestível é adicionado ao produto fermentado antes da fermentação ter alcançado o ponto no qual a inibição do produto evita produção adicional de ácido lático através da bactéria de ácido lático.

[035] Embora o produto resultante possa ser um líquido ou, por exemplo, um produtor similar a iogurte tradicional, o presente método é vantajosamente empregado para produzir um líquido aquoso fermentado que pode ser usado como uma base para a produção de uma bebida. De acordo com esta realização particular da invenção, o produto fermentado obtido no presente método tem uma viscosidade relativamente baixa, por exemplo, uma viscosidade a uma temperatura de 7°C menor que 50 mPa.s a 100 s-1, mais preferencialmente menor que 25 mPa.s a 100 s-1. A viscosidade de 50 mPa.s a 100 s-1 significa que o produto é 50 vezes mais viscoso que a água e cerca de 25 vezes mais viscoso que o leite. A viscosidade pode ser adequadamente medida com a ajuda de um reômetro AR1000 (TA Instruments, Etten-Leur, Países Baixos), com o uso de um sistema de medição de cone de ângulo de 2% com 40mm de diâmetro. Um processo de cisalhamento de estado estacionário deveria ser usado, aumentando a taxa de cisalhamento de 0,01 a 250/s. A temperatura de medição é de 7°C e apenas o ponto de dados a 100 s- 1 é usado.

[036] Conforme anteriormente mencionado, o processo atualmente reivindicado é capaz de reduzir o nível de certos componentes presentes na preparação contendo proteína de soja, em que os componentes são responsáveis por parte do sabor estranho percebido de muitas preparações de soja. Acredita-se que C5-C9 n-alcanais e (E)-2-hexenal sejam moléculas de sabor por serem amplamente responsáveis pelo sabor estranho for ‘de grão’ frequentemente encontrado em produtos à base de soja. Os inventores constataram que é possível remover as típicas notas estranhas relacionadas à soja de forma muito eficaz com o uso do processo conforme apresentado no presente documento. Nesta conexão, é preferencial que, durante a fermentação das seguintes mudanças nas concentrações de compostos de sabor ocorra: uma redução de pelo menos um C5-C9 n-alcanal em pelo menos 30%, de preferência, em pelo menos 50% quando um leite de soja neutro que tem um teor de proteína de 2,5% em peso é inoculado com 107 células viáveis da dita cultura por ml e incubado a 30°C por 4 horas, com a ressalva de que, antes da inoculação, os seguintes aldeídos foram adicionados nas quantidades indicadas: 2 ppm de n-pentanal, 2 ppm de n-hexanal, 2 ppm de n-heptanal e 2 ppm de n-octanal.

[037] Nesta conexão, é preferencial que, durante a fermentação, a concentração de pelo menos um C5-C9 n-alcanal diminui em pelo menos 30%, de preferência em pelo menos 50%. Da mesma forma, é preferencial que, durante a fermentação, a concentração de (E)-2-hexenal diminui em pelo menos 30%, de preferência em pelo menos 50%. E, de forma similar, é preferencial que durante a fermentação, a concentração de 2-metilbutanal e/ou 3-metilbutanal diminua em pelo menos 50%.

[038] A invenção é adicionalmente ilustrada por meio de exemplos não limitadores:

EXEMPLOS MÉTODOS ANALÍTICOS ANÁLISE DE VOLÁTEIS DE SABOR ESTRANHO E DIACETIL POR MICROEXTRAÇÃO POR FASE SÓLIDA (SPME) SEGUIDA POR GC-MS

[039] 2 g de amostra foram colocados em um frasco de 20ml com headspace e vedado com uma tampa hermética.

[040] As amostras foram analisadas por meio de microextração por fase sólida. Fibra usada: Carboxen/PDMS 85 μm ex. Supelco.

[041] As análises foram executadas em um GC/MS Agilent (MS: LECO Pegasus IV TOF; 15 varreduras/s; m/z: 29 a 250 a 1700 V), equipado com o injetor Gerstel CIS-4 e um amostrador automático Gerstel MPS-2 com SPME opcional. Coluna: VF-5; 50m * 0,2 mm * 0,33 μm PROGRAMA GC: - 40°C(2 minutos) -(37minutos)->160°C(0 minuto)-(207minutos)- >250°C (2 minutos) - Gás: Hélio - Fluxo: 1 ml/min, fluxo constante

TEMPO DE AMOSTRAGEM SPME: 35 MINUTOS A 40°C

[042] Dessorção: 40 minutos a 170°C

[043] Tempo sem divisão: 2 minutos

ANÁLISE SENSORIAL

[044] Os produtos fermentados e a base de soja não fermentada foram avaliadas/experimentadas/percebidas por um painel provador profissional (n=15), com um teste de classificação na intensidade do iogurte/laticínio e soja ou um teste descritivo através da classificação em uma escala de 1 a 10 em descritores relacionados a laticínios e soja (por exemplo, leite, manteiga).

ATIVIDADE DE LIPOXIGENASE

[045] A atividade de lipoxigenase foi determinada espectrofotometricamente através do uso de um ensaio de matriz de acoplamento específico para hidroperóxidos gerados de ácido linoléico, conforme completamente descrito por Anthon e Barrett (J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 32 a 37).

[046] Os extratos de enzima foram obtidos através da homogeneização de 100 mg de partículas de soja desnatadas em 20 ml de tampão de Na2HPO4 com pH de 6,0 a 100 mM + 1% em peso/volume de NaCI então centrifugação a 15,000 rpm a 4°C por 30 minutos e filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 μm.

[047] A 500 μl de uma solução de ácido 3- (dimetilamino)benzoico a 10 mM em Na2HPO4 com pH 6,0 a 100 mM foi adicionado 20 μl de ácido linoléico a 27 mM disperso em 1,4% em peso/volume de Tween 20, e 10 μl de extrato de enzima. Após 5 minutos, 500 μl de uma solução contendo 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona a 0,2 mM e 0,1 mg/ml de hemoglobina bovina foi adicionado. Após 5 minutos adicionais, 500 μl de 1% em peso/volume de lauril sulfato de sódio foi adicionado para terminar a reação. A absorvância a 598 nm foi, então, medida. As ações acima podem ser executadas em uma única cuveta com trajetória de 1 cm de 4,5 ml.

[048] Uma curva padrão foi produzida através da reação de diluições de lipoxigenase de soja da Sigma- Aldrich, de atividade certificada. Isto foi usado para calcular as atividades dos extratos dos grãos de soja. As leituras em branco foram subtraídas, obtidas com o uso de extratos de enzima desnaturados aquecidos a 95°C por 30 minutos. Uma unidade de atividade é o aumento de 0,001 unidade de absorvância a 598 nm por minuto da hidroperoxidação de ácido linoléico.

CONTAGEM VIÁVEL

[049] O número de bactérias vivas nas culturas foi determinado através da contagem de placas de diluições apropriadas de amostras contendo Lactobacillus brevis e Lactobacillus fermentum em ágar MRS e incubação anaeróbica por 3 dias a 30°C. Os números são expressos como unidades de formação de Colônia por ml de produto (Cfu/ml).

CEPAS

[050] Lactobacillus brevis Lb20 (CBS122084, depositado sob o tratado de Budapeste na Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos) Lactobacillus fermentum LMG 8154 (livremente disponível junto à BCCM/LMG, para info: http://bccm.belspo.be/about/Img.php)

[051] Lactobacillus casei 431 (cultura comercial disponível sob este nome junto à Chr Hansen, Dinamarca)

EXEMPLO 1

[052] Combinação de Lactobacillus brevis & Lactobacillus fermentum em diferentes razões.

A: MATERIAL BRUTO

[053] Uma base de soja foi preparada ao dissolver 5,5% de Sunopta SSFR em pó (resultando em uma concentração de proteína de 2,5% de proteína) e 3% de sacarose em água. Esta mistura foi preservada através de um tratamento térmico por 36 segundos a 79 a 85°C, embalada assepticamente e resfriada para armazenamento adicional a 5°C.

B: FERMENTAÇÃO

[054] Pré-culturas de Lactobacillus brevis Lb20 (CBS122084, depositado sob o tratado de Budapeste na Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos) e Lactobacillus fermentum LMG 8154 (livremente disponível junto à BCCM/LMG, para info: http://bccm.belspo.be/about/lmg.php) em que cada uma foi preparada através do cultivo de um dia para o outro em caldo de MRS a 30°C. As pré-culturas foram lavadas com água e concentradas 5 a 10 vezes. A densidade de célula da pré-cultura concentrada foi medida por Densidade Óptica (OD) a 600nm. Para Lactobacillus brevis Lb20, OD foi ajustada em 2,5, e para Lactobacillus fermentum LMG 8154, suspensões de OD 2,5, 5 e 12,5 foram preparadas.

[055] A base de soja foi inoculada com 2% de cada uma das culturas únicas ou com 1% de L. brevis OD 2,5 e 1% de L. fermentum com OD diversa, conforme apresentado na tabela 1 abaixo. Os experimentos cobriram a razão de quantidade de inoculação em OD de L. brevis: L. fermentum e 1:1, 1:2 e 1:5. Estes valores em OD correspondem a razões expressas em Cfu (unidades de formação de colônia) em: 3:1, 2:1 e 1:2, respectivamente.

[056] Após inoculação com culturas únicas e com combinações de culturas conforme apresentado na tabela 1 abaixo, as bases de soja foram incubadas a 30°C. As amostras foram tiradas para medição volátil e o pH da base de soja foi verificado em intervalos regulares (Tabela 1). Após 3 horas de incubação, as amostras foram pasteurizadas a 85°C por 30 minutos e resfriadas antes do teste sensorial. A inoculação da base de soja com 2% de uma suspensão de célula com OD 2,5 refletiu em uma contagem de célula de 2,0x107 Cfu/ml por L. brevis e 6,0x106 Cfu/ml por L. fermentum. TABELA 1. COMPOSIÇÃO DE CULTURA E PH DE CURSO DE TEMPO DE FERMENTAÇÃO DE SOJA COM DIFERENTES CULTURAS

[057] As medições de pH mostram que L. fermentum sozinha modificou a base de soja de forma mais eficaz que L brevis. As culturas mistas de L. brevis e L fermentum alcançaram acidificação no pH 6,0 em 6h e aumentaram a razão de L. fermentum levando para produto mais ácido, conforme observado no produto HZ251 108-B1 F5.

C: VOLÁTEIS

[058] Uma alíquota da amostra foi submetida à SPME seguido por análise GC-MS. Verificou-se que durante a fermentação com culturas combinadas, as áreas de pico para diacetil (contribuindo para o sabor positivo) e hexanal (contribuindo para o sabor estranho) mudaram em números absolutos, mas não quantitativamente, conforme mostrado na Tabela 2. TABELA 2. TEOR DE DIACETIL E HEXANAL DE AMOSTRAS DE SOJA FERMENTADAS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE L. BREVIS E L. FERMENTUM COMO UMA % NA ÁREA DE PICO DO MÁXIMO NO EXPERIMENTO

[059] Deste modo, uma combinação de L. brevis:L. fermentum em uma razão de pelo menos 1:5 (OD) é necessária para alcançar a mesma quantidade de produção de diacetil como com L. fermentum apenas enquanto no mesmo tempo é mantido o efeito de remoção do sabor estranho de L. brevis.

D: SENSORIAL

[060] As bases de soja inoculadas com uma combinação de Lactobacillus brevis e Lactobacillus fermentum em razões 1:1 e 1:2 (em OD) não foram significantemente diferentes do produto não fermentado. Foram constatadas diferenças entre os produtos, mas não foram estatisticamente significativas com base no número de participantes.

[061] A base de soja inoculada com Lactobacillus fermentum e a base de soja inoculada com uma combinação de Lactobacillus brevis e Lactobacillus fermentum em razão de 1:5 (em OD) foram significativamente inferiores na percepção de soja que o produto não fermentado e o produto de base de soja inoculado com Lactobacillus brevis e foi bem como o produto que foi apenas avaliado como sendo significativamente superior em sabor de Iogurte/Laticínio que o produto não fermentado e o produto de base de soja inoculado com Lactobacillus brevis apenas.

EXEMPLO 2

[062] Combinação de Lactobacillus brevis & Lactococcus lactis em diferentes razões.

A: MATERIAL BRUTO

[063] A base de soja foi preparada ao dissolver 5,5% de Sunopta SSFR em pó (resultando em uma concentração de proteína de 2,5% de proteína) e 3% de sacarose em água. Esta mistura foi preservada através de um tratamento térmico por 36 segundos a 79-85°C, embalada assepticamente e resfriada para armazenamento adicional a 5°C.

B: FERMENTAÇÃO

[064] Pré-culturas de Lactobacillus brevis Lb20 (CBS122084, depositado sob o tratado de Budapeste na Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos) e Lactococcus lactis ssp lactis var. diacetilactis SD803 (usado em EP 483888-B1) em que cada uma foi preparada através do cultivo de um dia para o outro em caldo de MRS e de M17, respectivamente, a 30°C. As pré-culturas foram lavadas com água e concentradas 5 a 10 vezes. A densidade de célula da pré-cultura concentrada foi medida por Densidade Óptica (OD) a 600nm. Para Lactobacillus brevis Lb20, OD foi ajustada em 2,5, e para Lactococcus lactis ssp lactis var. diacetilactis SD803, suspensões de OD 2,5, 12,5, 25 e 37,5 foram preparadas.

[065] A base de soja foi inoculada com 2% de cada uma das culturas únicas ou com 1% de L. brevis OD 2,5 e 1% de L. lactis com OD diversa, conforme apresentado na tabela 3 abaixo. Os experimentos cobriram a razão de quantidade de inoculação em OD de L. brevis: L. lactis de 1:5, 1:10 e 1:15. Estes valores em OD correspondem a razões expressas em Cfu (unidades de formação de colônia) em 1:4, 1:8, e 1:12, respectivamente.

[066] Após inoculação com culturas únicas e com combinações de culturas conforme apresentado na tabela 3 abaixo, as bases de soja foram incubadas a 30°C. As amostras foram tiradas para medição volátil e o pH da base de soja foi verificado em intervalos regulares (Tabela 3). Após 3 horas de incubação, as amostras foram pasteurizadas a 85°C por 30 minutos e resfriadas antes do teste sensorial. A inoculação da base de soja com 2% de uma suspensão de célula com OD 2,5 refletiu em uma contagem de célula de 2,9x107 Cfu/ml para L. brevis e 2,3x107 Cfu/ml para L. lactis. TABELA 3. COMPOSIÇÃO DE CULTURA E PH DE CURSO DE TEMPO DE FERMENTAÇÃO DE SOJA COM DIFERENTES CULTURAS

[067] As medições de pH mostram que L. lactis sozinha modificou a base de soja de forma mais eficaz que L brevis. As culturas mistas de L. brevis e L. lactis alcançaram acidificação no pH 6,0 em 6 horas e aumentaram a razão de L. lactis levando a produto mais ácido, conforme observado no produto B1 L15.

C: VOLÁTEIS

[068] Uma alíquota da amostra foi submetida à SPME seguido por análise GC-MS. Verificou-se que durante a fermentação com culturas combinadas, as áreas de pico para diacetil (contribuindo para o sabor positivo) e hexanal (contribuindo para o sabor estranho) mudaram em números absolutos, mas não quantitativamente, conforme mostrado na Tabela 4. TABELA 4. TEOR DE DIACETIL E HEXANAL DE AMOSTRAS DE SOJA FERMENTADAS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE L. BREVIS E L. LACTIS COMO UMA % NA ÁREA DE PICO DO MÁXIMO NO EXPERIMENTO

[069] Deste modo, uma combinação de L. brevis:L. lactis em uma razão de pelo menos 1:5 (OD) é necessária para alcançar a quantidade máxima de produção de diacetil enquanto, no mesmo tempo, o efeito de remoção de sabor estranho de L. brevis é mantido.

D: SENSORIAL

[070] A base de soja inoculada com uma combinação de Lactobacillus brevis e Lactobacillus lactis em razões 1:5, 1:10 e 1:15 (em OD) foi inferior na percepção de soja que o produto não fermentado e o produto de base de soja inoculado com Lactobacoccus lactis apenas. Todas as combinações foram bem avaliadas como sendo significativamente superiores em sabor de Leite/Manteiga que o produto não fermentado e o produto de base de soja inoculado com Lactobacillus brevis apenas. Estas conclusões estão bem alinhadas às análises de Voláteis.

EXEMPLO 3

[071] Combinação de Lactobacillus brevis & Lactobacillus casei em diferentes razões.

A: MATERIAL BRUTO

[072] A base de soja foi preparada ao dissolver 5,5% de Sunopta SSFR em pó (resultando em uma concentração de proteína de 2,5% de proteína) e 3% de sacarose em água. Esta mistura foi preservada através de um tratamento térmico por 36 segundos a 79 a 85°C, embalada assepticamente e resfriada para armazenamento adicional a 5°C.

B: FERMENTAÇÃO

[073] Pré-culturas de Lactobacillus brevis Lb20 (CBS122084, depositado sob o tratado de Budapeste na Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos) e Lactobacillus casei 431 (livremente disponível junto à Chr Hansen sob este nome comercial) em que cada uma foi preparada através do cultivo de um dia para o outro em caldo de MRS a 30°C. As pré-culturas foram lavadas com água e concentradas 5-10 vezes. A densidade de célula da pré-cultura concentrada foi medida por Densidade Óptica (OD) a 600nm. Para Lactobacillus brevis Lb20, OD foi ajustada em 2,5, e para Lactobacillus casei 431, suspensões de OD 2,5, 12,5, e 25 foram preparadas. A base de soja foi inoculada com 2% de cada uma das culturas únicas ou com 1% de L. brevis OD 2,5 e 1% de L. casei com OD diversa, conforme apresentado na tabela 5 abaixo. Os experimentos cobriram a razão de quantidade de inoculação em OD de L. brevis: L. casei de 1:1, 1:5 e 1:10. Estes valores em OD correspondem a razões expressas em Cfu (unidades de formação de colônia) em 1:2, 1:8 e 1:15, respectivamente.

[074] Após inoculação com culturas únicas e com combinações de culturas conforme apresentado na tabela 5 abaixo, as bases de soja foram incubadas a 30°C. As amostras foram tiradas para medição volátil e o pH da base de soja foi verificado em intervalos regulares (Tabela 5). Após 3 horas de incubação, as amostras foram pasteurizadas a 85°C por 30 minutos e resfriadas antes do teste sensorial. A inoculação da base de soja com 2% de uma suspensão de célula com OD 2,5 refletiu em uma contagem de célula de 2,9x107 Cfu/ml para L. brevis e 4,4x107 Cfu/ml para L. casei. TABELA 5. COMPOSIÇÃO DE CULTURA E PH DE CURSO DE TEMPO DE FERMENTAÇÃO DE SOJA COM DIFERENTES CULTURAS

[075] As medições de pH mostram que L casei sozinha modificou a base de soja de forma mais eficaz que L brevis. As culturas mistas de L. brevis e L. casei alcançaram acidificação no pH 6,0 em 6 horas e aumentaram a razão de L. casei levando a produto mais ácido, conforme observado no produto FB060609- B1 LC10.

C: VOLÁTEIS

[076] Uma alíquota da amostra foi submetida à SPME seguido por análise GC-MS. Verificou-se que durante a fermentação com culturas combinadas, as áreas de pico para diacetil (contribuindo para o sabor positivo) e hexanal (contribuindo para o sabor estranho) mudaram em números absolutos, mas não quantitativamente, conforme mostrado na Tabela 6. TABELA 6. TEOR DE DIACETIL E HEXANAL DE AMOSTRAS DE SOJA FERMENTADAS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE L BREVIS E L. CASEI COMO UMA % NA ÁREA DE PICO DO MÁXIMO NO EXPERIMENTO

[077] Deste modo, uma combinação de L. brevis:L.casei em uma razão de pelo menos 1:10 (OD) é necessária para alcançar uma produção significativa de diacetil enquanto, ao mesmo tempo, o efeito d remoção de sabor estranho de L. brevis é mantido.

D: SENSORIAL

[078] A base de soja inoculada com uma combinação de Lactobacillus brevis e Lactobacillus casei em razão de 1:10 (em OD) foi avaliada como sendo significativamente superior em sabor de Leite/Manteiga que o produto não fermentado e o produto de base de soja inoculado com Lactobacillus brevis somente. Isto foi mais bem avaliado como e inferior em sabor estranho de soja que a amostra não fermentada. Estas conclusões estão bem alinhadas às análises de Voláteis.

Claims

1. PROCESSO PARA MODIFICAR O SABOR DE UM SUBSTRATO CONTENDO PROTEÍNA DE SOJA, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer um líquido aquoso pasteurizado ou esterilizado que compreende 0,5 a 15% em peso de proteína de soja dissolvida e pelo menos 0,1% em peso de carboidratos, inocular o dito líquido contendo proteína de soja com bactérias de um primeiro grupo de culturas mesofílicas selecionadas a partir de Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus pseudomesenteroides e Lactobacillus reuteri, em uma quantidade entre 105 a 109 Cfu/ml de substrato, e inocular o dito líquido contendo proteína de soja com bactéria de um segundo grupo de culturas mesofílicas selecionadas a partir de Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Propionibacterium, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus casei, em uma quantidade entre 105 a 109 Cfu/ml de substrato, fermentar o líquido aquoso inoculado através da incubação a uma temperatura de 15 a 37°C por 0,5 a 10 horas, em que as bactérias selecionadas a partir do dito primeiro grupo e do dito segundo grupo são inoculadas em razões Cfu do primeiro grupo para o segundo grupo de 1:1 a 1:40, e em que o pH do produto fermentado não cai abaixo de 6, e em que o substrato é um líquido, e o produto resultante é uma bebida.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Propionibacterium do segundo grupo é selecionada a partir de P. freudenreichii, P. acidipropionici, P. jensenii e P. thoenii.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que as bactérias de um primeiro grupo de culturas mesofílicas compreendem Lactobacillus brevis.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o líquido aquoso pasteurizado ou esterilizado que é inoculado compreende proteína de soja em uma quantidade entre 1 e 10% em peso, de preferência entre 1 e 8% em peso.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o líquido aquoso pasteurizado ou esterilizado que é inoculado compreende carboidratos em uma quantidade de 0,1 a 10% em peso, de preferência, 0,2 a 5% em peso.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os carboidratos compreendem mono- e/ou dissacarídeo.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que no total menos de 6% de dissacarídeos em peso do produto fermentado são adicionados antes, durante ou após fermentação.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a fermentação é executada a uma temperatura de 15 a 37°C, de preferência, a uma temperatura de entre 25 e 35°C.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a duração da fermentação está na faixa de 1 a 10 horas, de preferência, de 2 a 10 horas.

10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as bactérias são inoculadas em razões Cfu do primeiro grupo para o segundo grupo de 1:2 a 1:15.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o processo compreende uma etapa adicional que compreende pasteurizar ou esterilizar a dita composição aquosa fermentada.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende carregar o produto fermentado em recipientes e subsequentemente, vedar os recipientes carregados, em que ácido comestível é adicionado ao produto fermentado antes de carregar os recipientes de modo a ajustar o pH para menos de 4,5 e, opcionalmente, o produto fermentado não é submetido à pasteurização ou esterilização antes, durante ou após o carregamento dos recipientes.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o líquido aquoso contendo 0,5 a 15% em peso de proteína de soja dissolvida é preparado a partir de uma fonte de proteína de soja selecionada a partir do grupo que consiste em isolado de soja, concentrado de soja, farinha de soja e combinações dos mesmos, em que a dita fonte de proteína de soja deriva de grãos de soja que exibem uma atividade de lipoxigenase menor do que 15 kU/mg, mais preferencialmente menor do que 10 kU/mg.