BRPI1007483B1 - Método de diagnóstico de nefropatia in vitro, método in vitro para o monitoramento de progresso de nefropatia, método in vitro para o monitoramento da eficácia de um tratamento de nefropatia, método in vitro de avaliação de toxicidade renal de um agente e kit para diagnóstico de nefropatia - Google Patents
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Abstract
biomarcadores associados com nefropatia. udo da biomarcadores de urina para o diagnóstico da nefropatia, o monitoramento do progresso da nefropatia, e avaliação da eficácia de um tratamento de nefropatia. estes biomarcadores de urina incluem receptor-2 tipo ig associado por leocócitos, glicopotreína ácida alfa 1, seus fragmentos, e combinação destes.
Description
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US N°. 61/147,785, depositado em 28 de janeiro de 2009, cujo conteúdo é incorporado ao presente a título de referência em sua totalidade.
[0002] A nefropatia conhecida, comumente, como enfermidade dos rins, é causada por, entre outros, diabetes, pressão sanguínea alta, toxicidade de drogas, e inflamação.
[0003] A nefropatia é, tipicamente, diagnosticada determinando-se o nível de proteinúria (por exemplo, o nível de albumina na urina), ou examinando-se a taxa de filtração glomerular (GFR), um indicador de função renal. Ambas as aproximações não são adequadas para detecção da nefropatia em estágio inicial, a qual, tipicamente, não demonstra sintomas. Apesar de a nefropatia poder também ser detectada por biópsia renal, esse procedimento invasivo não é uma aproximação de diagnóstico ideal.
[0004] É de grande importância desenvolver um método para detectar a nefropatia em estágio inicial. A chave para alcançar essa meta é identificar biomarcadores confiáveis associados com nefropatia incipiente.
[0005] A presente invenção é baseada em descobertasinesperadas que os níveis de urina do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos, da glicoproteína ácida alfa 1, e de fragmentos dessas duas proteínas são significantemente maiores em um paciente com nefropatia que em um paciente livre de nefropatia. Essas moléculas de proteínas são então biomarcadores confiáveis para o diagnóstico da nefropatia em estágio inicial.
[0006] Consequentemente, um aspecto dessa invençãoretrata um método de diagnóstico da nefropatia. Esse métodoinclui pelo menos os seguintes passos: (a) obter umaamostra de urina de um sujeito suspeito de ter nefropatia,(b) determinar na amostra de urina um nível de um biomarcador, e (c) avaliar se o sujeito tem nefropatia baseado no nível dos biomarcadores. O biomarcador usado nométodo recém-descrito é um dos seguintes: (i) receptor-2tipo Ig associado por leucócitos ou um fragmento deste quetem pelo menos dez resíduos de aminoácidos, tal como DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID N°: 1), (ii) um fragmento deglicoproteína ácida alfa 1 que tem pelo menos dez resíduos aminoácidos, tal como GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID N°:2), (iii) uma combinação de (i) e (ii), ou (iv) uma combinação de (i) e glicoproteína ácida alfa 1.
[0007] Um aumento no nível de um dos quatrobiomarcadores, comparado a este nível em um sujeito livre de nefropatia, indica que o sujeito tem nefropatia. Em um exemplo, o nível do biomarcador é determinado por um ensaio espectrométrico de massa (por exemplo, MALDI-MS, LC-MS e LC-MS/MS). Em outro exemplo, é determinado por um ensaio imunológico (por exemplo, ELISA, Westernblot, RIA, FIA e LIA).
[0008] O método de diagnóstico de nefropatiadescrito acima é aplicável tanto para humanos quanto para animais de laboratório, por exemplo, estes livres de proteinúria. O termo usado aqui “um animal de laboratório” se refere a um animal vertebrado usado, comumente, em testes em animais, por exemplo, camundongo, rato, coelho, gato, cachorro, porco, e primata não humano. Outro aspecto desta invenção retrata um método para monitorizar o progresso da nefropatia em um sujeito. Este método inclui: (a) obter uma amostra da primeira urina do sujeito sofrendo de nefropatia (por exemplo, um humano ou um animal de laboratório), (b) determinar na amostra da primeira urina um nível de um dos quatro biomarcadores listados acima, (c) obter uma segunda amostra de urina do sujeito de 2 semanasa 12 meses depois que a primeira amostra de urina é obtida,(d) determinar na segunda amostra de urina um nível do biomarcador, e (c) avaliar o progresso da nefropatia no sujeito. Um aumento no nível do biomarcador na segunda amostra de urina, comparado a este nível na primeira amostra de urina, indica que a nefropatia é exacerbada no sujeito. Quando o sujeito é um humano com nefropatia em estágio inicial, a segunda amostra de urina é obtida 6 a 12meses depois que a primeira amostra de urina é obtida. Paraum sujeito humano com nefropatia em estágio avançado, a segunda amostra de urina pode ser obtida 3 a 6 meses depoisda primeira amostra. Quando este método é aplicado em um animal de laboratório, a segunda amostra de urina pode serobtida 2 a 4 semanas depois que a primeira amostra de urinaé obtida.
[0009] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para monitoramento da eficácia de um tratamento de nefropatia em um paciente com nefropatia, incluindo: (a) determinar um nível de um dos biomarcadores listados acima em uma amostra de urina do paciente com nefropatia antes do tratamento, (b) determinar um nível do biomarcador em uma amostra de urina do paciente depois do tratamento, e (c) avaliar a eficácia do tratamento baseado na mudança no nível do biomarcador depois do tratamento. O tratamento é determinado eficaz quando o nível de biomarcador pós-tratamento continua o mesmo ou diminui comparado ao nível do biomarcador pré-tratamento.
[00010] Esta invenção também fornece um método de avaliação da toxicidade renal de um agente, incluindo: (a) obter uma pluralidade de amostras de urina de um sujeito tratado com um agente em vários pontos do tempo durante o tratamento, (b) determinar em cada uma das amostras de urina um nível de um dos biomarcadores descritos acima, e (c) avaliar a toxicidade renal do agente baseado na mudança no nível do biomarcador durante o tratamento. Um aumento no nível do biomarcador no curso do tratamento indica que o agente é tóxico renal. O agente pode ser um composto (por exemplo, uma droga ou uma a droga candidata), um produto herbático e um produto alimentício.
[00011] A invenção fornece, ademais, um kit funcional em qualquer um dos métodos descrito acima. Este kit contém um primeiro anticorpo ligado, especificamente, ao receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e um segundo anticorpo ligado, especificamente, à glicoproteína ácida alfa 1. Ambos os anticorpos podem ser moléculas de imunoglobulina inteiras. Em um exemplo, esse kit contém somente anticorpos específicos para antígenos para serem detectados (por exemplo, biomarcadores associados com nefropatia) pela prática de um dos métodos revelados aqui. Em outras palavras, consiste essencialmente de tais anticorpos. Também dentro do escopo desta invenção está um anticorpo isolado especificamente ligado a DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID N°: 1), ou GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID N°:2). O termo usado aqui “anticorpo isolado” se refere a um anticorpo substancialmente livre de moléculas associadas naturalmente. Mais especificamente, uma preparação que contém o anticorpo é considerada como “um anticorpo isolado” quando as moléculas associadas naturalmente na preparação constituem no máximo 20% por peso seco. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, e HPLC.
[00012] Qualquer um dos anticorpos descritos acima pode ser usado na manufatura de um kit funcional na prática de qualquer um dos métodos desta invenção.
[00013] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados na descrição abaixo. Outros recursos ou as vantagens da presente invenção vão ser evidentes na seguinte descrição detalhada de vários exemplos, e também nas reivindicações anexadas.
[00014] Os desenhos são descritos primeiro.
[00015] A fig. 1 é um diagrama mostrando o gráfico de caixas para níveis combinados de um fragmento de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e um fragmento de glicoproteína ácida alfa 1 nos grupos-controle saudáveis e pacientes que têm diversos tipos de nefropatia. DN, IgAN, CHN, e MGN referem-se à nefropatia diabética, nefropatia IgA, nefropatia de erva chinesa, e nefropatia de glomerulonefrite membranosa. Os limites mais alto e mais baixo das caixas marcam os valores 25% e 75% e as linhas que atravessam as caixas representam os valores médios. A margem máxima marca o valor superior abaixo do limitador superior, que é o valor 75% mais 1,5 de alcance interquartil e a margem menor marca o menor valor acima do limite inferior, que é o valor 25% menos 1,5 de alcance interquartil.
[00016] A fig. 2 é um diagrama mostrando o gráfico de caixas para níveis combinados de um fragmento de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e um fragmento de glicoproteína ácida alfa 1 com grupos-controle saudáveis e pacientes tendo CHN. Os limites mais alto e mais baixo das caixas marcam os valores 25% e 75% e as linhas que atravessam as caixas representam os valores médios. A margem máxima marca o valor superior abaixo do limitador superior, que é o valor 75% mais 1,5 de alcance interquartil e a margem menor marca o menor valor acima do limite inferior, que é o valor 25% menos 1,5 de alcance interquartil.
[00017] Em um aspecto, a presente invenção relata um método de diagnóstico de nefropatia baseado no nível de um biomarcador de urina, que pode ser receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos (número de acesso GenBank CAQ08962; IO-Jan-2010), glicoproteína ácida alfa 1 (número de acesso GenBank EAW874I6; IO-Jan-2010), um fragmento das duas proteínas, ou uma combinação destas. O fragmento das duas proteínas tem um comprimento mínimo de dez aminoácidos e preferencialmente, um peso máximo de 120 a 200 aminoácidos. Por exemplo, os fragmentos do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1 podem conter mais de 125 e 191 resíduos de aminoácidos, respectivamente. Em um exemplo, o fragmento de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos é DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: 1) e um fragmento de glicoproteína ácida alfa 1 é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2).
[00018] Cada um dos biomarcadores de urina mencionados acima pode ser usado para diagnosticar qualquer tipo de nefropatia, incluindo aquelas relacionadas à diabetes (por exemplo, nefropatia diabética), glomerulonefrite resultada de deposição de IgA em tecidos renais (por exemplo, nefropatia IgA), inflamação (por exemplo, glomerulonefrite membranosa), fibrose renal induzida por erva chinesa (por exemplo, nefropatia herbática chinesa), dano tubulointersticial crônico, que leva a falência renal (por exemplo, nefrite intersticial crônica), e glomerulonefrite segmental focalizada.
[00019] Para praticar o método de diagnóstico desta invenção, uma amostra de urina é obtida de um sujeito suspeito de ter nefropatia e o nível de quaisquer dos biomarcadores mencionados é então determinado por métodos convencionais, por exemplo, ELISA e Westemblot. Quando o biomarcador é um peptídeo ou uma combinação de peptídeo, seu nível pode ser determinado pelo ensaio espectrométrico. O nível do biomarcador de urina pode então ser comparado a um ponto de referência representando o nível do mesmo biomarcador de urina em um sujeito livre de nefropatia. O ponto de referência pode ser determinado através de uma prática de rotina baseada no nível representativo de um biomarcador de urina em um grupo de pacientes com nefropatia versus aquele em um grupo de sujeitos livres de nefropatia. Por exemplo, pode ser o ponto intermediário entre os níveis médios desses dois grupos. Quando o nível do biomarcador de urina no sujeito é maior que o ponto de referência, indica que o sujeito tem nefropatia. Quando necessário, pacientes que tenham nefropatia de mudança mínima (MCN) ou doença de mudança mínima (MCD) podem ser usados como grupos de controle para determinar o ponto de referência mencionado acima. Geralmente, pacientes de MCN e MCD exibem proteinúria óbvia, mas funções renais normais.
[00020] Quando um fragmento de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos ou um fragmento de glicoproteína ácida alfa 1 é usado, o método de diagnóstico desta invenção pode ser aplicado para detectar nefropatia incipiente quando a presença de proteínas (por exemplo, albumina) na urina não é detectável, por exemplo, livre de proteinúria.
[00021] Em outro aspecto, essa invenção refere-se a um método de monitorar o progresso de nefropatia em um sujeito baseado em quaisquer dos biomarcadores de urina. Para praticar esse método, duas amostras de urina de um sujeito podem ser obtidas dentro de uma duração de tempo adequada (por exemplo, 2 semanas a 12 meses) e examinadas para determinar os níveis de um dos biomarcadores de urina descritos acima. Se o nível de biomarcador de urina na amostra de urina obtida depois é maior quer aquele na amostra de urina obtida antes, indica progressos de nefropatia no sujeito.
[00022] O método de monitoramento pode ser aplicado a um sujeito humano sofrendo de, ou com risco de nefropatia. Quando o sujeito humano está em risco de, ou em estágio inicial de nefropatia, o nível do biomarcador de urina pode ser determinado uma vez a cada 6 a 12 meses para monitorar o progresso de nefropatia. Quando um sujeito humano já está em estágio avançado de nefropatia, é preferencial que o nível de biomarcador de urina seja determinado uma vez a cada 3 a 6 meses. Apesar de possuírem danos nos rins, pacientes com nefropatia em estágio inicial são geralmente assintomáticos e mostram funções renais normais. Esses pacientes estão em risco de progresso de nefropatia. A nefropatia de estágio avançado é caracterizada por um decline progressivo no GFR (por exemplo, < 15 mL/minuto/1,73m2).
[00023] O método de monitoramento descrito acima é também aplicável a um animal de laboratório, seguindo procedimentos de rotina, para estudar nefropatia. Preferencialmente, o animal de laboratório é examinado uma vez a cada 2 a 24 semanas para determinar o nível do biomarcador de urina mencionado acima. Um aumento no nível do biomarcador ao longo do tempo indica progresso da doença no animal.
[00024] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método de eficácia de avaliação de tratamento de nefropatia em um sujeito em necessidade (por exemplo, um paciente de nefropatia humano ou um animal de laboratório sofrendo de danos renais). Neste método, os níveis de um dos biomarcadores de urina descritos acima são determinados antes, durante e/ou depois do tratamento. Se o nível de biomarcador de urina continua o mesmo ou declina ao longo do curso do tratamento, indica que o tratamento é eficaz. Qualquer um dos biomarcadores pode também ser usado para monitorar toxicidade renal de um agende alvo, isto é, se um agente induz danos renais. O agente alvo pode ser qualquer composto ou composição para administração humana. Exemplos incluem, mas não são limitados a, compostos químicos, que podem ser drogas (por exemplo, drogas antiinflamatórias não esteróides) ou drogas candidatas, produtos alimentícios ou suplementos, e suplementos herbáticos. A toxicidade renal de um agente alvo é indicada por sua habilidade de aumentar o nível de um biomarcador de urina através do tempo.
[00025] Também revelado aqui é um kit funcional em prática de qualquer um dos métodos descritos acima. Este kit contém pelo menos dois anticorpos, um específico para receptor-2 tipo Ig, por exemplo, capaz de se ligar ao seu fragmento DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: 1) ou qualquer epítopo contido neste, e o outro específico para glicoproteína ácida alfa 1, por exemplo, capaz de se ligar a seu fragmento GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2) ou qualquer epítopo contido neste. Em um exemplo, o kit inclui dois anticorpos diferentes (por exemplo, um anticorpo de revestimento e um anticorpo de detecção) que se ligam ao mesmo biomarcador. O anticorpo de detecção é conjugado, tipicamente, com uma molécula que emite um sinal detectável tanto por ela mesma quanto através da ligação com outro agente. O termo usado aqui “anticorpo” se refere a uma imunoglobulina inteira ou um fragmento desta, tal como Fab ou F(ab')2 que retém atividade de ligação de antígeno. Pode ser de ocorrência natural ou projetado geneticamente (por exemplo, anticorpo de cadeia única, anticorpo quimérico, ou anticorpo humanizado).
[00026] Os anticorpos incluídos no kit desta invenção podem ser obtidos de fornecedores comerciais. Alternativamente, eles podem ser preparados por métodos convencionais. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, (1988) Anticorpos: Um Manual de Laboratório Cold Spring HarborLaboratory, Nova York. Para produzir anticorpos contra um biomarcador particular como listado acima, o marcador, opcionalmente unido a uma proteína de carreira (por exemplo, KLH), pode ser misturado com adjuvante, e injetado em um animal hospedeiro. Anticorpos produzidos no animal podem então ser purificados por cromatografia de afinidade. Os animais hospedeiros empregados, comumente, incluem coelhos, camundongos, porcos da Guiné, e ratos. Vários adjuvantes que podem ser usados para aumentar a resposta imunológica dependem das espécies hospedeiras e inclui-se oadjuvante de Freund (completo e incompleto), géis mineraistais como hidróxido de alumínio, CpG, substâncias de superfície ativa tais como lisolecitina, polióisplurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleos, hemocianina de lapa californiana, e dinitrofenol. Os adjuvantes humanos úteis incluem BCG (bacilo de Calmette- Guerin) e Corynebacterium parvum. Anticorpos policlonais, isto é, populações heterogêneas de moléculas de anticorpos, estão presentes nos vários clones do animal imunizado.
[00027] Anticorpos monoclonais, isto é, populações homogêneas de moléculas de anticorpos, podem ser preparadas usando tecnologia de hibridoma (veja, por exemplo, Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 51 1; Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6, 292; e Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.). Em particular, anticorpos monoclonais podem ser obtidos por qualquer técnica que forneça para a produção de moléculas de anticorpos por linhas de células continuas na cultura tal como descrito em Kohler et al. (1975) Nature 256, 495 e a Patente N° U.S.4,376,1 10; a técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026, e a técnica de hibridoma EBV (Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, e qualquer subclasse destas. A hibridoma produzindo os anticorpos monoclonais da invenção podem ser cultivados in vitro ou in vivo. A habilidade de produzir títulos altos de anticorpos monoclonais in vivo faz disso um particularmente útil método de produção.
[00028] Além disso, os fragmentos de anticorpos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mais não são limitados a, fragmentos de F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão de pepsina de uma molécula de anticorpo, e fragmentos de Fab que podem ser gerados reduzindo-se as pontes de bissulfeto de fragmentos de F(ab')2 .
[00029] Sem mais elaboração, acredita-se que um versado na técnica possa, baseado na descrição acima, utilizar a presente invenção a sua maior extensão. As seguintes modalidades específicas são, então, para serem construídas como meramente ilustrativas, e não limitativas do restante da descoberta de qualquer jeito, seja o que for. Todas as publicações aqui citadas são incorporadas por referência.Exemplo 1: Diagnosticando nefropatia usando receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos ou glicoproteína acida alfa 1 de urina como um biomarcador.Material e Métodos(1) Sujeitos
[00030] Os seguintes grupos de sujeitos humanosparticiparam neste estudo:(a) Doadores saudáveis: livres de diabetes melituscom funções renais normais,(b) Pacientes DM: que têm diabetes melitus tipo 2, maslivres de nefropatia,(c) Pacientes DN: que têm nefropatia diabética,(d) Pacientes DN de uremia: que têm DN associado à uremia,(e) Pacientes IgAN: que têm nefropatia IgA,(f) Pacientes MGN: que têm glomerulonefritemembranosa,(g) Pacientes CHN: que têm nefropatia induzida porerva chinesa, e(h) Pacientes CIN: que têm nefrite crônicaintersticial.
[00031] Características clínicas dos doadores saudáveis são sumarizadas na Tabela 1 abaixo:
(ii) Ensaio MALDI-MS
[00032] As amostras de urina do meio do fluxo são coletadas dos grupos de sujeitos humanos listados acima de manhã cedo. Essas amostras de urina de ambos doadores saudáveis e pacientes, misturadas com inibidores de protease, são analisadas por MALDI-TOF-MS. Candidatos de peptídeo que eram diferentemente presentes no grupo dos doadores saudáveis e nos vários grupos de pacientes foram identificados em comparação aos modelos de polipeptídeo entre cada grupo de pacientes e o grupo de doadores saudáveis, levando em consideração a avaliação estatística de demografia e parâmetros de amostra. Esses peptídeos foram purificados, e suas sequências de aminoácidos determinadas através de tecnologia de rotina.(iii) Ensaio Westernblot
[00033] Análise Western blotting foi executada usando anticorpos específicos para o fragmento receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: I) e o fragmento glicoproteína ácida alfa 1 GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2), seguindo a tecnologia de rotina. Os resultados foram normalizados contra o nível de creatina ou proteína na mesma amostra.(iv) ELISA
[00034] As amostras de urina foram misturadas com inibidores de protease e diluídas em 1: 100 com um divisor de diluição e as amostras de soro foram diluídas em 1: 10. As amostras diluídas foram postas nos pratos ELISA em triplicatas. As concentrações do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1 foram determinadas através do método ELISA sanduíche padrão e normalizadas contra o nível de creatina ou proteína na mesma amostra.
[00035] Através do ensaio MALDI-MS descrito acima, os peptídeos DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: I) e GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO: 2) foram detectados em amostras de urina de pacientes com nefropatia em nível muito maior comparado a amostras de urina de grupos-controle saudáveis. SEQ ID NO: 1 e 2 são fragmentos de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1, respectivamente. As taxas positivas desses dois peptídeos no grupo de doadores saudáveis e nos vários grupos de paciente são demonstradas na Tabela 2 abaixo:
[00036] Os resultados também mostram que os níveis de urina desses dois peptídeos em pacientes com nefropatia não foram correlacionados com proteinúria, indicando que eles podem ser usados para detectar lesões nos rins anteriormente à aparição de proteínas, particularmente albumina, na urina.
[00037] Além disto, os níveis de urina desses dois peptídeos em pacientes com nefropatia foram descobertos por exibir correlações reversas com GFR, indicando que eles podem servir como marcadores para monitoramento de mudanças de função renal e progresso de nefropatia.
[00038] Através dos ensaios ELISA e Westernblot descritos acima, receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1 verificaram-se diferentemente presentes nas amostras de urina de pacientes com nefropatia (por exemplo, pacientes que tem nefropatia induzida por erva chinesa) versus amostras de urina de grupos-controle saudáveis. Veja tabela 3 abaixo. Mais especificamente, a presença de cada proteína em amostras de urina de grupos-controle saudáveis era dificilmente detectado; enquanto um nível maior da proteína foi achado em amostras de urina de pacientes com nefropatia. Esse resultado indica que cada proteína pode ser usada como um marcador para o diagnóstico de nefropatia.
Exemplo 2: Diagnosticar nefropatia usando a combinaçãode receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1 como um biomarcador
[00039] Os níveis do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e da glicoproteína ácida alfa 1 de urina de ambos grupos-controle saudáveis e pacientes com nefropatia (incluindo pacientes que tem nefropatia diabética, de uremia, nefropatia IgA, nefropatia induzida por erva chinesa, e nefropatia glomerulonefrite membranosa) foram determinados como descrito no Exemplo 1 acima.
[00040] Como demonstrado na Fig. 1, o nível combinado dos, acima mencionados, dois marcadores de proteína foram muito maiores em todos os tipos de pacientes com nefropatia em comparação a este em grupos-controle saudáveis (AUROC = 0.93). Isto indica que o receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e a glicoproteína ácida alfa 1, em combinação, podem ser usados como biomarcadores confiáveis para o diagnóstico de nefropatia, com alta sensitividade e especificação.
[00041] A combinação do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1 de urina verificou-se particularmente confiável em detectar a nefropatia induzida por erva chinesa. Veja a Fig. 2. O AUROC obtido deste estudo alcança 1,0, indicando que a precisão do diagnóstico é 100% quando usado esse biomarcador para diagnosticar pacientes que têm nefropatia induzida por erva chinesa.Outras modalidades
[00042] Todos os recursos revelados nesta especificação podem ser combinados em qualquer combinação. Cada recurso revelado nesta especificação pode ser substituído por um recurso alternativo servindo o mesmo, equivalente ou semelhante propósito. Dessa forma, a menos que declarado expressamente de outra forma, cada recurso revelado é apenas um exemplo de uma série genérica de recursos equivalentes ou semelhantes.
[00043] Da descrição acima, um versado na técnica pode facilmente certificar as características essenciais da presente invenção, e sem partir do âmbito e espoco desta, pode fazer várias mudanças e modificações na invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Dessa forma, outras modalidades estão também entre as reivindicações.
Claims (24)
1. Método de diagnóstico de nefropatia in vitro, caracterizado por:obter uma amostra de urina de um sujeito suspeito de ter nefropatia,determinar na amostra de urina um nível de um biomarcador ou combinação de biomarcadores selecionado do grupo consistindo em (i) receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos, e (ii) uma combinação de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1,em que o receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos é DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: 1) e a glicoproteínaácida alfa 1 é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2),determinar se o sujeito tem nefropatia baseado no nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores,em que um aumento no nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores, comparado com um ponto de referência representando o nível do mesmo biomarcador ou combinação de biomarcadores em um sujeito livre de nefropatia, indica que o sujeito tem nefropatia, em que oponto de referência é o ponto médio entre o nível médio do biomarcador ou combinação de biomarcadores em um grupo de pacientes com nefropatia e aquele de um grupo de sujeitos livres de nefropatia.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores ser determinado por um ensaio espectométrico de massa ou um ensaio imune.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o ensaio espectométrico de massa ser selecionado do grupo constituído de espectrometria de massas de ionização por dessorção à laser assistida por matriz (MALDI-MS), espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS), e espectrometria de massa por cromatografia em tandem líquida LC-MS/MS.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o ensaio imune ser selecionado do grupo constituído de ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), Westernblot, radioimunoensaio (RIA), imunoensaio por fluorescência (FIA) e imunoensaio por luminescência (LIA).
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o sujeito ser um humano.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o sujeito ser um animal de laboratório.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o biomarcador é o receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biomarcador é um receptor- 2 tipo Ig associado por leucócitos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de o sujeito ser livre de proteinúria.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a combinação de biomarcadores é uma combinação de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a combinação de biomarcadores ser a combinação de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e da glicoproteína ácida alfa 1.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a combinação de biomarcadores ser a combinação do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a combinação de biomarcadores ser a combinação do receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e da glicoproteína ácida alfa 1.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de o sujeito ser livre de proteinúria.
15. Método in vitro para o monitoramento de progresso de nefropatia, caracterizado pelo fato de:obter uma primeira amostra de urina de um sujeito sofrendo de nefropatia;determinar na primeira amostra de urina um nível de um biomarcador ou combinação de biomarcadores selecionado do grupo consistindo em (i) receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos, e (ii) uma combinação de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1,em que o receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos é DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: 1) e a glicoproteína ácida alfa 1 é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2),obter uma segunda amostra de urina do sujeito, de 2 semanas a 12 meses depois que a primeira amostra de urina é obtida;determinar na segunda amostra de urina um nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores; eavaliar o progresso de nefropatia no sujeito,sendo que um aumento no nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores na segunda amostra de urina, comparando com esta na primeira amostra de urina, indica que nefropatia é exacerbada no sujeito.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o sujeito ser um humano em nefropatia de estágio inicial e a segunda amostra de urina ser obtida 6 a 12 meses depois que a primeira amostra de urina é obtida.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o sujeito ser um humano em nefropatia de estágio avançado e a segunda amostra de urina ser obtida 3 a 6 meses depois que a primeira amostra de urina é obtida.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o sujeito ser animal de laboratório e a segunda amostra de urina ser obtida 2 a 24 semanas depois que a primeira amostra de urina é obtida.
19. Método in vitro para o monitoramento da eficácia de um tratamento de nefropatia, caracterizado pelo fato de:determinar um nível de um biomarcador ou combinação de biomarcadores em uma amostra de urina do sujeito antes do tratamento, o biomarcador ou combinação de biomarcadores sendo selecionado do grupo consistindo em (i) receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos, e (ii) uma combinação de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1,em que o receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos é DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: 1) e a glicoproteína ácida alfa 1 é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2),determinar um nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores em uma amostra de urina do sujeito após o tratamento;avaliar a eficácia do tratamento baseado na mudança no nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores após o tratamento,em que o tratamento é eficaz se o nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores após o tratamento permanecer sem mudanças ou diminuir em comparação a este antes do tratamento.
20. Método in vitro de avaliação de toxicidade renal de um agente, caracterizado pelo fato de:obter uma pluralidade de amostras de urina de um sujeito tratado com um agente em vários pontos de tempo durante o tratamento,determinar em cada uma das amostras de urina um nível de um biomarcador ou combinação de biomarcadores selecionado do grupo consistindo em (i) receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos, e (ii) uma combinação de receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e glicoproteína ácida alfa 1,em que o receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos é DFLELLVKGTVPGTEASGFDAP (SEQ ID NO: 1) e a glicoproteína ácida alfa 1 é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:2), avaliando a toxicidade renal do agente baseado em uma mudança no nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores durante o tratamento,em que o aumento no nível do biomarcador ou combinação de biomarcadores no curso do tratamento indica que o agente é toxico renal.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de o agente ser selecionado do grupo constituindo em um composto, um produto herbático e um produto alimentício.
22. Kit para diagnóstico de nefropatia, caracterizado pelo fato de compreender um primeiro anticorpo especificamente ligante a receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e um segundo anticorpo especificamente ligante a glicoproteína ácida alfa 1.
23. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de o primeiro e segundo anticorpos serem moléculas de imunoglobulina inteiras.
24. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de consistir em um primeiro anticorpo especificamente ligante a receptor-2 tipo Ig associado por leucócitos e um segundo anticorpo especificamente ligante a glicoproteína ácida alfa 1.
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