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BRPI0913875B1 - polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno e método para verificar se o isopreno em um polímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo sustentável e renovável - Google Patents

polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno e método para verificar se o isopreno em um polímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo sustentável e renovável Download PDF

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BRPI0913875B1
BRPI0913875B1 BRPI0913875-7A BRPI0913875A BRPI0913875B1 BR PI0913875 B1 BRPI0913875 B1 BR PI0913875B1 BR PI0913875 A BRPI0913875 A BR PI0913875A BR PI0913875 B1 BRPI0913875 B1 BR PI0913875B1
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BR
Brazil
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isoprene
polyisoprene
polymer
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varies
Prior art date
Application number
BRPI0913875-7A
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English (en)
Inventor
Frank J. Feher
Gregory M. Whited
Gopal K. Chotani
Fernando Valle
Karl J. Sanford
Joseph C. Mcauliffe
Marguerite A. Cervin
Aaron S. Puhala
Andrei Miasnikov
Richard La Duca
Caroline Peres
Original Assignee
The Goodyear Tire & Rubber Company
Danisco Us Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by The Goodyear Tire & Rubber Company, Danisco Us Inc filed Critical The Goodyear Tire & Rubber Company
Publication of BRPI0913875A2 publication Critical patent/BRPI0913875A2/pt
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Abstract

POLÍMEROS DE POLI-ISOPRENO PROVENIENTE DE FONTES RENOVÁVEIS E MÉTODO PARA VERIFICAR SE O ISOPRENO EM UM POLÍMERO DE POLI-ISOPRENO É PROVENIENTE DE UMA FONTE NÃO DERIVADA DE PETRÓLEO SUSTENTÁVEL E RENOVÁVEL. Foi descoberto que certas células em cultura podem converter o carbono disponível no meio de cultura de células em isopreno. Essas células possuem um ácido nucleico heterólogo que é operacionalmente ligado a um promotor e codificado um isopreno sintase polipeptídio. O isopreno produzido em tal meio de cultura pode ser então recuperado e polimerizado em borrachas sintéticas e outros materiais poliméricos úteis. Os polímeros contendo isopreno sintético desta invenção oferecem a vantagem de serem verificáveis quanto ao fato de serem derivados de fontes não petroquímicas. Eles também podem ser analiticamente distinguidos das borrachas que são provenientes de fontes naturais. A presente invenção apresenta mais especificamente um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de delta 13C superior a -22%. Este tipo de poli-isopreno pode ser uma borracha de homopolímero de (Alfa)s-l A-poliisopreno.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória US N° de Série 61/133.521, depositado em 30 de junho de 2008. Os ensinamentos do Pedido de Patente Provisória US N° de Série 61/133.521 estão aqui incorporados em sua integridade a título de referência.
Antecedentes da Invenção
[002] Isopreno (2-metil-buta-1,3-dieno) é um composto orgânico extremamente importante que é usado em uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, o isopreno é empregado como um intermediário ou como um material de partida na síntese de numerosas composições químicas e polímeros. O isopreno também é um material biológico importante que é sintetizado naturalmente por muitas plantas e animais, inclusive pelos seres humanos. O isopreno é um líquido incolor à tem-peratura ambiente e é altamente inflamável. A fórmula estrutural do isopreno é:
Figure img0001
[003] O isopreno tornou-se um monõmero importante para utilização na síntese de cis-1,4- polibutadieno quando sua polimerização es- tereorregulada passou a ser comercialmente possível no início dos anos 1960. O cis-1,4-poli-isopreno feito portais polimerizações estere- orreguladas tem a estrutura e as propriedades semelhantes àquelas da borracha natural. Embora ele não seja idêntico à borracha natural ele pode ser usado como um substituto para a borracha natural em muitas aplicações. Por exemplo, a borracha sintética de cis-1,4-poli-isopreno é bastante usada na produção de pneus e outros produtos de borracha. Esta demanda por borracha sintética de cis-1,4-poli-isopreno consome a maior parte do isopreno disponível no mercado mundial. O isopreno restante é usado na produção de outras borrachas sintéticas, copolí- meros em blocos, e outros produtos químicos. Por exemplo, o isopreno é usado na produção de borrachas de butadieno-isopreno, borrachas de copolímero de estireno-isopreno, borrachas de estireno-isopreno- butadieno, copolímeros em blocos de estireno-isopreno-estireno, e co- polímeros em blocos de estireno-isopreno.
[004] Com o passar dos anos muitas rotas de síntese para produzir isopreno foram investigadas. Por exemplo, a síntese de isopreno por reação de isobutileno com formaldeído na presença de um catalisador está descrita na Patente U.S.3.146.278, Patente U.S. 3.437.711, Patente U.S.3.621.072, Patente U.S.3.662.016, Patente U.S.3.972.955, Patente U.S.4.000.209, Patente U.S.4.014.952, Patente U.S.4.067.923, e Patente U.S.4.511.751. A Patente U.S. 3.574.780 descreve um outro processo para a produção de isopreno passando uma mistura de metil- ter-butil éter e ar sobre catalisadores à base de óxido misto. O metil-ter-butil éter é então craqueado em isobutileno e metanol sobre o catalisador. O metanol produzido é oxidado para formaldeído que então reage com o isobutileno sobre o mesmo catalisador para produzir o isopreno. A Patente U.S.5.177.290 descreve um processo para produzir dienos, inclusive isopreno, que envolve reagir uma mistura reacional de um ter-alquil éter e uma fonte de oxigênio sobre dois catalisadores funcionalmente distintos em condições de reação suficientes para produzir altos rendimentos dos dienos com reciclo mínimo do éter.
[005] O isopreno usado em aplicações industriais é tipicamente produzido como um subproduto do craqueamento térmico do petróleo ou nafta ou é de alguma forma extraído de correntes petroquímicas. Este é um processo relativamente caro e de alto consumo de energia. Com a demanda mundial por produtos petroquímicos em constante crescimento, espera-se que o preço do isopreno aumente até níveis muito mais altos a longo prazo e que de qualquer jeito sua disponibilidade fique limitada. Em outras palavras, existe a preocupação de que os futuros abastecimentos de isopreno proveniente de fontes petroquímicas será inadequado para atender às necessidades previstas e que os preços vão disparar, atingindo níveis sem precedentes. Por conseguinte, existe uma necessidade atual de buscar uma fonte de isopreno proveniente de uma fonte renovável e de baixo custo, e que seja inofensiva ao meio ambiente.
Sumário da Invenção
[006] Foi descoberto que certas células em cultura podem converter mais de cerca de 0,002 porcento do carbono disponível no meio de cultura de células em isopreno. Essas células possuem um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio de isopreno sintase e (ii) é operacionalmente ligado a um promotor. Em alguns casos, essas células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tal como, porém sem limitação, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerí- deo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídio microbiano ou vegetal), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens acima. O isopreno produzido em tal meio de cultura pode ser então recuperado e polimerizado formando borrachas sintéticas e outros materiais poliméricos úteis.
[007] Será previsto que haverá uma significativa demanda por borracha sintética e outros polímeros contendo isopreno que são sintetizados usando isopreno deste tipo que é feito a partir de fontes não petroquímicas renováveis. Na verdade, acredita-se que os clientes in- dustriais e os consumidores vão preferir adquirir polímeros contendo isopreno que são derivados dessas fontes inofensivas ao meio ambiente àqueles que são feitos com isopreno derivado de um processo pe-troquímico. Acredita-se ainda que os clientes vão até preferir pagar preços mais altos por aqueles produtos inofensivos ao meio ambiente que são feitos com recursos renováveis. No entanto, é importante que seja possível verificar que tais polímeros contendo isopreno são realmente feitos a partir de recursos não petroquímicos. Os polímeros sintéticos contendo isopreno desta invenção oferecem a vantagem de se-rem verificáveis quanto ao fato de serem derivados de recursos não petroquímicos. Eles também podem ser analiticamente distinguidos de borrachas que são provenientes de fontes naturais.
[008] A presente invenção apresenta mais especificamente um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C superior a -22%o. Este tipo de poli- isopreno pode ser um homopolímero de poli-isopreno.
[009] A presente invenção apresenta ainda um polímero de poli- isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -30%o a -28,5%o. Este tipo de poli-isopreno também pode ser um homopolímero de poli- isopreno.
[0010] A presente invenção também apresenta um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o poli-isopreno é livre de proteína, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de - 34%o a -24%o.
[0011] Esta invenção revela ainda um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um teor de cis-1,4-microestruturas inferior a 99,9%, onde o polímero de poli- isopreno tem um teor de trans-1,4-microestruturas inferior a 99,9%, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o.
[0012] A presente invenção também apresenta um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli- isopreno tem um teor de 3,4-microestruturas superior a 2%, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o.
[0013] A presente invenção revela ainda um polímero de poli- isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um teor de 1,2-microestruturas superior a 2%, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de - 34%o a -24%o.
[0014] A presente invenção também apresenta um polímero que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno e pelo menos um monômero adicional, onde o polímero inclui blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, e onde os blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno têm um valor de δ13C superior a -22%o.
[0015] A presente invenção revela ainda um polímero que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno e pelo menos um monômero adicional, onde o polímero inclui blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, e onde os blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno têm um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o.
[0016] A presente invenção também apresenta um polímero de poli-isopreno líquido que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli- isopreno tem um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e onde o polímero de poli-isopreno líquido tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de - 34%o a -24%o.
[0017] A presente invenção revela ainda um polímero de poli- isopreno líquido que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli- isopreno líquido tem um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e onde o polímero de poli-isopreno líquido tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a - 24%o.
[0018] A presente invenção também apresenta um método para verificar se um homopolímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo, renovável e sustentável que compreende: (I) determinar o valor de δ13C do homopolímero de poli-isopreno; (II) se o homopolímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C dentro da faixa de -34%c a -30%o ou dentro da faixa de -28,5%o a -24%o adicionalmente analisando o homopolímero de poli-isopreno para determinar (1) seu teor de cis-microestruturas, (2) seu teor de 3,4-microestruturas, (3) seu teor de 1,2- microestruturas, (4) seu peso molecular médio ponderai, ou (5) a presença ou ausência de proteínas residuais, sabões, lipídios, resinas, ou açúcares indicativos de borracha natural; e (III) verificar se o homopolímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo renovável e sustentável se ele tem (i) um valor de δ13C superior a -22%o, (ii) um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -30%o a -28,5%o, ou (iii) um valor de δ13C dentro da faixa de -34%o a -30%o ou dentro da faixa de -28,5%o a -24%o e se ele (a) tem um teor de cis-microestruturas inferior a 100%, (b) contém 3,4- microestrutura, (c) contém 1,2-microestrutura, (d) tem um peso mole- cular médio ponderai inferior a 100.000, ou (e) é livre de proteínas re-siduais, sabões, lipídios, resinas, ou açúcares indicativos de borracha natural.
[0019] A presente invenção revela ainda um método para verificar se um copolímero tendo unidades repetitivas que são derivadas de isopreno contém isopreno que é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo renovável e sustentável, o referido método compreendendo: (I) determinar o valor de δ13C de pelo menos um bloco de poli- isopreno no copolímero; e (II) verificar se o isopreno no copolímero é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo renovável e sustentável se o bloco de poli-isopreno tem (i) um valor de δ13C superior a - 22%o, ou (ii) um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a - 28,5%o.
Breve Descrição dos Desenhos
[0020] A figura 1 mostra a sequência nucleotídica de um gene de kudzu isopreno sintase de códon otimizado para expressão em E. coli (SEQ ID N°: 1). O códon inicial atg está em itálico, o códon de terminação está em negrito e o sítio Pstl acrescentado está sublinhado.
[0021] A figura 2 mostra um mapa de pTrcKudzu.
[0022] A figura 3 mostra a sequência nucleotídica de pTrcKudzu (SEQ ID N°: 2). O RBS está sublinhado, o códon inicial de kudzu isopreno sintase está em letras maiúsculas e em negrito e o códon de interrupção está em letras maiúsculas e em negrito e em itálico. O esqueleto do vetor é pTrcHis2B.
[0023] A figura 4 mostra um mapa de pETNHisKudzu.
[0024] A figura 5 mostra a sequência nucleotídica de pETNHisKudzu (SEQ ID N°: 5).
[0025] A figura 6 mostra um mapa de pCL-lac -Kudzu.
[0026] A figura 7 mostra a sequência nucleotídica de pCL-lac- Kudzu (SEQ ID N°: 7).
[0027] A figura 8A mostra um gráfico representando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli sem vetor.
[0028] A figura 8B mostra um gráfico representando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli com pCL-lac-Kudzu.
[0029] A figura 8C mostra um gráfico representando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli com pTrcKudzu.
[0030] A figura 8D mostra um gráfico representando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli com pETN-HisKudzu.
[0031] A figura 9A mostra um gráfico representando a OD durante o tempo de fermentação de BL21/pTrcKudzu de E. coli em uma fermentação com alimentação intermitente com capacidade para 14 litros.
[0032] A figura 9B mostra um gráfico representando a produção de isopreno durante o tempo de fermentação de BL21/pTrcKudzu de E. coli em uma fermentação com alimentação intermitente com capacidade para 14 litros.
[0033] A figura 10A mostra um gráfico representando a produção de isopreno em Panteoa citrea. Células de controle sem kudzu isopreno sintase recombinante. Os losangos cinzas representam a síntese de isopreno, os quadrados pretos representam a OD600.
[0034] A figura 10B mostra um gráfico representando a produção de isopreno em Panteoa citrea expressando pCL-lac Kudzu. Os losangos cinzas representam a síntese de isopreno, os quadrados pretos representam a OD600.
[0035] A figura 10C mostra um gráfico representando a produção de isopreno em Panteoa citrea expressando pTrcKudzu. Os losangos cinzas representam a síntese de isopreno, os quadrados pretos representam a OD600.
[0036] A figura 11 mostra um gráfico representando a produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase recombinante. BG3594comK é uma cepa de B. subtilis sem plasmídeo (produção de isopreno nativo). CF443-BG3594comK é uma cepa de B. subti- lis com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante). IS no eixo dos y indica isopreno.
[0037] A figura 12 mostra a sequência nucleotidica de pBS Kudzu #2 (SEQ ID N°: 57).
[0038] A figura 13 mostra a sequência nucleotidica de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado para expressão em Yarrowia (SEQ ID N°: 8).
[0039] A figura 14 mostra um mapa de pTrex3g compreendendo um gene de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado para expressão em Yarrowia.
[0040] A figura 15 mostra a sequência nucleotidica do vetor pSPZI(MAP29Spb) (SEQ ID N°: 11).
[0041] A figura 16 mostra a sequência nucleotidica do gene de isopreno sintético de kudzu (Pueraria montana) de códon otimizado para expressão em Yarrowia (SEQ ID N°: 12).
[0042] A figura 17 mostra a sequência nucleotidica do gene de isopreno sintase sintética de alámo híbrido (Populus alba x Populus tremula) (SEQ ID N°: 13). O códon inicial ATG está em negrito e o códon de terminação está sublinhado.
[0043] A figura 18A mostra uma construção esquemática em linhas gerais dos vetores pYLA 1, pYLI e pYL2.
[0044] A figura 18B mostra uma construção esquemática em linhas gerais do vetor pYLA(POPI).
[0045] A figura 18C mostra uma construção esquemática em linhas gerais do vetor pYLA(KZI).
[0046] A figura 18D mostra uma construção esquemática em linhas gerais do vetor pYLI(KZI).
[0047] A figura 18E mostra uma construção esquemática em linhas gerais do vetor pYLI(MAP29).
[0048] A figura 18F mostra uma construção esquemática em linhas gerais do vetor pYLA(MAP29).
[0049] A figura 19 mostra as vias metabólicas de MVA e DXP para isopreno (de acordo com F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). A descrição a seguir inclui nomes alternativos para cada polipeptídio nas vias e uma referência que descreve um ensaio para medir a atividade do polipeptídio indicado (cada uma dessas referências estando aqui incorporadas em sua integridade a título de refe-rência, particularmente no que diz respeito a ensaios para verificar a atividade polipeptídica para os polipeptídios nas vias de MVA e DXP). Via do mevalonate: AACT; Acetil-CoA acetiltransferase, MvaE, EC 2.3.1.9. Ensaio: J. Bacterid., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; Hidroxime- tilglutaril-CoA sintase, MvaS, EC 2.3.3.10. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-Hidroxi-3- metilglutarol-CoA redutase, MvaE, EC 1.1.1.34. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; Mevalonate quinase, ERG12, EC 2.7.1.36. Ensaio: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomevalonato quinase, ERG8, EC 2.7.4.2, Ensaio: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato descarboxi- lase, MVDI, EC 4.1.1.33. Ensaio: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; Isopentenil-difosfato delta-isomerase, IDII, EC 5.3.3.2. Ensaio: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Via do DXP: DXS; 1- Desoxixilulose-5-fosfato sintase, dxs, EC 2.2.1.7. Ensaio: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Desoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisome- rase, dxr, EC 2.2.1.7. Ensaio: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-Difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase, IspD, EC 2.7.7.60. Ensaio: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4- Difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol quinase, IspE, EC 2.7.1.148. Ensaio: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-Metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase, IspF, EC 4.6.1.12. Ensaio: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-hidroxi-2- metil-2-(E)- butenil 4-difosfato sintase, ispG, EC 1.17.4.3. Ensaio: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; HDR; 1-hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato redutase, IspH, EC 1.17.1.2. Ensaio: JACS, 126:12847- 12855, 2004.
[0050] A figura 20 mostra gráficos representando os resultados da análise por GC-MS da produção de isopreno por cepas recombinantes de Y. lipolytica sem (à esquerda) ou com (à direita) um gene de isopreno sintase de kudzu. As setas indicam o tempo de eluição do padrão de isopreno autêntico.
[0051] A figura 21 mostra um mapa de pTrcKudzu ylDI DXS Kan.
[0052] A figura 22 mostra a sequência nucleotídica de pTrcKudzu ylDI DXS Kan (SEQ ID N°: 20).
[0053] A figura 23A mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzukan. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0054] A figura 23B mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzu ylDI kan. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0055] A figura 23C mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzu DXS kan. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspa- ce ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0056] A figura 23D mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzu ylDI DXS kan. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0057] A figura 23E mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0058] A figura 23F mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu ylDI. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0059] A figura 23G mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu DXS. O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam a OD600, os círculos representam a produtividade de total isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0060] A figura 23H mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzulDIDXSkan. A seta indica o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo dos x representa o tempo depois da indução; o eixo dos y representa a OD600 e o eixo dos y2 representa a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os lo-sangos pretos representam a OD600, os triângulos pretos representam a produtividade de isopreno (pg/L) e os quadrados brancos representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0061] A figura 24 mostra um mapa de pTrcKKDylklS kan.
[0062] A figura 25 mostra uma sequência nucleotídica de pTrcKK DylklS kan (SEQ ID N°: 33).
[0063] A figura 26 mostra um mapa de pCL PtrcUpperPathway.
[0064] A figura 27 mostra uma sequência nucleotídica de pCL Ptr cUpperPathway (SEQ ID N°: 46).
[0065] A figura 28 mostra um mapa do cassete contendo a via inferior de MVA e idi de levedura para integração no cromossoma de B. subtilis no locus nprE. nprE a montante/a jusante indica 1 kb cada de sequência do locus nprE locus para integração. Promotor de aprE (promotor de serina protease alcalina) indica o promotor (-35, -10, +1 sítio inicial da transcrição, RBS) no gene de aprE. MVKI indica o gene de mevalonato quinase de levedura. RBS-PMK indica o gene de fos- fomevalonato quinase de levedura com um RBS de Bacillus a montante do sítio inicial. RBS-MPD indica o gene de difosfomevalonato des- carboxilase quinase de levedura com um RBS de Bacillus a montante do sítio inicial. RBS-IDI indica o gene idi de levedura com um RBS de Bacillus a montante do sítio inicial. Terminador indica o terminador de transcrição serina protease alcalina terminadora de B. amyliquefaciens. SpecR indica o marcador de resistência à espectinomicina. "nprE upstream repeat for amp."indica uma repetição direta da região a montante usada para amplificação.
[0066] A figura 29 mostra uma sequência nucleotídica do cassete contendo a via inferior de MVA e idi de levedura para integração no cromossoma de B. subtilis no locus nprE (SEQ ID N°: 47).
[0067] A figura 30 mostra um mapa de p9796-poplar.
[0068] A figura 31 mostra uma sequência nucleotídica de p9796- poplar (SEQ ID N°: 48).
[0069] A figura 32 mostra um mapa de pTrcPoplar.
[0070] A figura 33 mostra uma sequência nucleotídica de pTrcPoplar (SEQ ID N°: 49).
[0071] A figura 34 mostra um mapa de pTrcKudzu ylDI Kan.
[0072] A figura 35 mostra uma sequência nucleotídica de pTrcKudzu ylDI Kan (SEQ ID N°: 50).
[0073] A figura 36 mostra um mapa de pTrcKudzuDXS Kan.
[0074] A figura 37 mostra uma sequência nucleotídica de pTrcKudzuDXS Kan (SEQ ID N°: 51).
[0075] A figura 38 mostra um mapa de pCL PtrcKudzu.
[0076] A figura 39 mostra uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu (SEQ ID N°: 52).
[0077] A figura 40 mostra um mapa de pCL PtrcKudzu A3.
[0078] A figura 41 mostra uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu A3 (SEQ ID N°: 53).
[0079] A figura 42 mostra um mapa de pCL PtrcKudzu ylDI.
[0080] A figura 43 mostra uma sequência nucleotidica de pCL PtrcKudzu ylDI (SEQ ID N°: 54).
[0081] A figura 44 mostra um mapa de pCL PtrcKudzu DXS.
[0082] A figura 45 mostra uma sequência nucleotidica de pCL PtrcKudzu DXS (SEQ ID N°: 55).
[0083] A figura 46 mostra gráficos representando a produção de isopreno a partir de estoque de abastecimento de biomassa. O quadro A mostra a produção de isopreno a partir de palha de milho, o quadro B mostra a produção de isopreno a partir de bagaço, o quadro C mostra a produção de isopreno a partir de polpa de madeira mole, o quadro D mostra a produção de isopreno a partir de glicose, e o quadro E mostra a produção de isopreno a partir de células sem estoque de abastecimento adicional. Os quadrados cinzas representam medidas de QD600 das culturas nos tempos indicados pós-inoculação e os triângulos pretos representa a produção de isopreno nos tempos indicados pós-inoculação.
[0084] A figura 47A mostra um gráfico representando a produção de isopreno por BL21 (WE3) pTrcKudzu yEDI DXS (kan) em uma cultura sem glicose adicionada. Os quadrados representam a QD600, e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/ml).
[0085] A figura 47B mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de açúcar invertido com um estoque de abastecimento de glicose a 1% por BL21 (ÀDE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan). Os quadrados representam a OD600, e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/ml).
[0086] A figura 47C mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de um estoque de abastecimento de açúcar invertido a 1% por BL21 (ÀDE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan). Os quadrados representam a OD600, e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/ml).
[0087] A figura 47D mostra um gráfico representando a produção de isopreno a partir de um estoque de abastecimento de palha de milho a 1% AFEX por BL21 (ÀDE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan). Os quadrados representam a OD600, e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/ml).
[0088] A figura 48 mostra gráficos demonstrando o efeito de extrato de levedura na produção de isopreno. O quadro A mostra o correr do tempo da densidade ótica nos fermentadores alimentados com quantidades variáveis de extrato de levedura. O quadro B mostra o correr do tempo do título de isopreno nos fermentadores alimentados com quantidades variáveis de extrato de levedura. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação. O quadro C mostra o efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli cultivado em cultura com alimentação intermitente.
[0089] A figura 49 mostra gráficos demonstrando a produção de isopreno a partir de um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu + ylDI + DXS. O quadro A mostra o correr do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 500 I alimentado com glicose e extrato de levedura. O quadro B mostra o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 500 I alimentado com glicose e extrato de levedura. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação. O quadro C mostra o correr do tempo do isopreno total produzido a partir do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura.
[0090] A figura 50 mostra um mapa de pJMupperpathway2.
[0091] A figura 51 mostra a sequência nucleotídica de pJMupper- pathway2 (SEQ ID N°: 56).
[0092] A figura 52 mostra um mapa de pBS Kudzu #2.
[0093] A figura 53A mostra um gráfico representando o crescimento durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase recombinante de kudzu em uma fermentação com alimentação intermitente com capacidade para 14 litros. Os losangos pretos representam uma cepa de controle (BG3594comK) sem produção de isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativo) e os triângulos cinzas representam Bacillus com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante).
[0094] A figura 53B mostra um gráfico representando a produção de isopreno durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase recombinante de kudzu em uma fermentação com alimentação intermitente com capacidade para 14 litros. Os losangos pretos representam uma cepa de controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativo) e os triângulos cinzas representam Bacillus com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante).
[0095] A figura 54 mostra um mapa do plasmídeo pET24 P.alba HGS.
[0096] As figuras 55A e 55B mostram a sequência nucleotidica do plasmídeo pET24 P. alba HGS (SEQ ID N°: 87).
[0097] A figura 56 mostra um diagrama esquemática mostrando os sítios de restrição usados para digestão da endonuclease para construir o plasmídeo EWL230 e extremidades coesas compatíveis entre os sítios BspHI e Ncol.
[0098] A figura 57 mostra um mapa do plasmídeo EWL230.
[0099] As figuras 58A e 58B mostram a sequência nucleotidica do plasmídeo EWL230 (SEQ ID N°: 88).
[00100] A figura 59 mostra um diagrama esquemático mostrando os sítios de restrição usados para digestão da endonuclease para construir o plasmídeo EWL244 e extremidades coesas compatíveis entre os sítios Nsil e Pstl.
[00101] A figura 60 mostra um mapa de EWL244.
[00102] As figuras 61A e 61B mostram a sequência nucleotidica do plasmídeo EWL244 (SEQ ID N°: 89).
[00103] A figura 62 mostra um mapa de plasmídeos MCM484-487.
[00104] As figuras 63A-63C mostram a sequência nucleotídica do plasmídeo MCM484 (SEQ ID N°: 90).
[00105] As figuras 64A-64C mostram a sequência nucleotídica do plasmídeo MCM485 (SEQ ID N°: 91).
[00106] As figuras 65A-65C mostram a sequência nucleotídica do plasmídeo MCM486 (SEQ ID N°: 92).
[00107] As figuras 66A-66C mostram a sequência nucleotídica do plasmídeo MCM487 (SEQ ID N°: 93).
[00108] As figuras 67A-67D mostram gráficos da produção de isopreno pela cepa de E. coli (EWL256) expressando genes da via de MVA e cultivada em uma cultura com alimentação intermitente com capacidade para 15 litros sem alimentação com extrato de levedura.
[00109] A figura 67A mostra o correr do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00110] A figura 67B mostra o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00111] A figura 67C mostra o correr do tempo do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00112] A figura 67D mostra a taxa de desprendimento total de dióxido de carbono (TCER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00113] As figuras 68A-68E mostram gráficos da produção de isopreno pela cepa de E. coli (EWL256) expressando genes da via de MVA e cultivada em uma cultura com alimentação intermitente com capacidade para 15 litros sem alimentação com extrato de levedura.
[00114] A figura 68A mostra o correr do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00115] A figura 68B mostra o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00116] A figura 68C mostra o correr do tempo do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00117] A figura 68D mostra a produtividade volumétrica dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. Um valor médio de 1,1 g/L/hora foi mantido por um período de 40 horas (23-63 horas) com alimentação com extrato de levedura.
[00118] A figura 68E a taxa de desprendimento de dióxido de carbono (CER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00119] As figuras 69A-69D mostram a produção de isopreno a partir de diferentes fontes de carbono via a MVA (via).
[00120] A figura 69A mostra o crescimento de E. coli EWL256, que contém tanto a via de MVA quanto isopreno sintase, seja em glicose, hidrolisado de biomassa, glicerol, ou acetato como a única fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionada foi incluído. O crescimento foi medido como a densi-dade ótica a 600 nM.
[00121] A figura 69B mostra a produtividade específica de isopreno a partir de E. coli EWL256 contendo tanto a via de MVA quanto isopreno sintase quando cultivada seja em glicose, hidrolisado de biomassa, glicerol, ou acetato como a única fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionada foi incluído. Amostras foram coletadas 190 minutos, 255 minutos e 317 minutos depois da inoculação e o isopreno produzido pela bactéria foi medido usando GC-MS.
[00122] A figura 69C mostra o crescimento de E. coli EWL256 seja em glicose ou xilose como a única fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionada foi incluído. O crescimento foi medido como a densidade ótica a 600 nM.
[00123] A figura 69D mostra a produtividade específica de isopreno a partir de E. coli EWL256 quando cultivada seja em glicose ou xilose como a única fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionada foi incluído. Amostras foram coletadas 260 minutos, 322 minutos e 383 minutos depois da inoculação e isopreno produzido pela bactéria foi medido usando GC-MS.
[00124] As figuras 70A e 70B mostram a produção de isopreno por cepas de E. coli a partir de glicose e a partir de ácido graxo, respectivamente. Para a figura 70A, onze colônias resultantes da transformação de WW4 com pMCM118, o plasmídeo contendo a via inferior do ácido mevalônico, foram coletadas para verificar a presença da via inferior. Células das colônias foram cultivadas em meio TM3 contendo 0,1% de extrato de levedura e 2% de glicose. Alíquotas da cultura induzida foram analisadas quanto à produção de isopreno depois de 4 horas de indução. Todas as colônias apresentaram produção de isopreno. O indutor IPTG teve um forte efeito inibitório do crescimento, como ficou evidente a partir da densidade celular reduzida de 3 a 4,6 vezes a uma concentração de 50 a 900 uM do indutor (dados não mostrados). O gráfico mostra que uma indução mais alta resulta em um título específico mais alto de isopreno. Para a figura 70B, a cultura de produção foi inoculada a partir de uma cultura lavada por uma noite a uma diluição de 1 para 10. A cultura foi cultivada por várias horas e induzida com 50 uM de IPTG. A barra da esquerda mostra os resultados do ensaio de isopreno quatro horas após a indução seguida de um ensaio de acúmulo de isopreno em uma hora. A barra do meio mostra o valor normalizado para uma hora para a mesma cultura com o mesmo período de indução porém analisada por um ensaio de acúmulo de isopreno em 12 horas. A barra da direita mostra o valor para um ensaio de acúmulo de isopreno em uma hora da cultura que foi induzida por 13 horas.
[00125] A figura 71 mostra um mapa do vetor de transporte de E. coli-Streptomyces pUWL201PW (6400 bp) usado para clonar isopreno sintase a partir de Kudzu. Tsr, gene de resistência à tioestreptona. A fotografia foi emprestada de Doumith et al., Mol. Gen. Genet. 264: 477- 485, 2000.
[00126] A figura 72 mostra a formação de isopreno pela cepa do tipo selvagem de Streptomyces albus ("wt") e por cepas ancorando o plasmídeo pUWL201PW (controle negativo) ou pUWL201_iso (codificando isopreno sintase de Kudzu).
[00127] A figura 73A mostra um mapa do opéron da via inferior de M. mazei archaeal.
[00128] As figuras 73B e 73C mostram a sequência nucleotídica do opéron da via inferior de M. mazei archaeal (SEQ ID N°: 113).
[00129] A figura 74A mostra um mapa de MCM376 - MVK de Lowe- rin pET200D de M. mazei archaeal.
[00130] As figuras 74B e 74C mostram a sequência nucleotídica de MCM376 - MVK de Lowerin pET200D de M. mazei archaeal (SEQ ID N°: 114).
[00131] As figuras 75A-75D mostram o crescimento e a produtividade específica da produção de isopreno para EWL256 comparado ao RMI 1608-2. O crescimento (OD550) está representado pelos losangos brancos; a produtividade específica de isopreno está representada por barras cheias. O eixo dos x representa o tempo (horas) pós-indução seja com 200 (figuras 75A e 75B) seja com 400 (figuras 75C e 75D) uM de IPTG. O eixo dos Y-1 representa a produtividade de isopreno (ug/L/OD/hora) e o eixo dos Y-2 representa unidades arbitrárias da densidade ótica a um comprimento de onde igual a 550. Esses valores para a OD550 devem ser multiplicados por 6,66 para obter a OD real da cultura.
[00132] A figura 76 mostra um mapa do plasmídeo pBBRCMPG11,5- pgi
[00133] As figuras 77A e 77B mostram a sequência nucleotídica do plasmídeo pBBRCMPGI1,5-pgl (SEQ ID N°: 122).
[00134] As figuras 78A-78F mostram gráficos da produção de isopreno pela cepa de E. coli expressando mevalonate quinase de M. ma- zei, isopreno sintase de P. alba, e pg1 (RHM111608-2), e cultivada em uma cultura com alimentação intermitente com capacidade de 15 litros. A figura 78A mostra o correr do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. A figura 78B mostra o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação. Método para cálculo do isopreno: isopreno cumulativo produzido em 59 horas, g/volume do fermen- tador em 59 horas, L [=] g/L de caldo. A figura 78C também mostra o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. Método para cálculo do isopreno: ,í(taxa de produção instantânea de isopreno, g/L/hora)dt a partir de t = 0 a 59 horas [=] g/L de caldo. A figura 78D mostra o correr do tempo do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 I alimentado com glicose. A figura 78E mostra a produtividade volumétrica dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. A figura 78F mostra a taxa de desprendimento de dióxido de carbono (CER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00135] A figura 79A mostra um mapa do plasmídeo pJ201: 19813.
[00136] As figuras 79B e 79C mostram a sequência nucleotídica de pJ201:19813 (SEQ ID N°: 123).
[00137] A figura 80 mostra o correr do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00138] A figura 81 mostra o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 I alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00139] A figura 82 mostra o correr do tempo do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 I alimentado com glicose.
[00140] A figura 83 mostra um gráfico ilustrando o correr do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 500 I alimentado com glicose e extrato de levedura.
[00141] A figura 84 mostra um gráfico ilustrando o correr do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 500 I alimentado com glicose e extrato de levedura. O título é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00142] A figura 85 mostra um gráfico ilustrando o correr do tempo do isopreno total produzido a partir do biorreator de 500 I alimentado com glicose e extrato de levedura.
Descrição Detalhada da Invenção
[00143] Uma técnica para produzir isopreno em uma cultura de células que produzem isopreno está descrita no Pedido de Patente U.S. Provisória N° de Série 61/013.574, depositado em 13 de dezembro de 2007, e no Pedido de Patente U.S.Provisória N° de Série 61/013.386, depositado em 13 de dezembro de 2007, e no Pedido de Patente U.S. N° de Série 12/335.071. Os ensinamentos do Pedido de Patente U.S. Provisória N° de Série 61/013.574, Pedido de Patente U.S.Provisória N° de Série 61/013.386, e Pedido de Patente U.S.N° de Série 12/335.071 estão aqui incorporados a título de referência com a finalidade de ensinar técnicas para produzir e recuperar isopreno por tal processo. Em todos os casos, o Pedido de Patente U.S.Provisória N° de Série 61/013.574, Pedido de Patente U.S.Provisória N° de Série 61/013.386, e Pedido de Patente U.S.N° de Série 12/335.071 ensinam composições e métodos para a produção de quantidades aumentadas de isopreno em culturas de células. Em particular, essas composições e métodos aumentam a taxa de produção de isopreno e aumentam a quantidade total do isopreno que é produzido. Por exemplo, foram produzidos sistemas de cultura de células que geram 4,8 x 104 nmo- les/gwcm/hora de isopreno (Tabela 1). A eficiência desses sistemas é demonstrada pela conversão de um rendimento de ~ 23,6 % molar (rendimento de 10,7 % em peso) do carbono que as células consomem de um meio de cultura de células em isopreno (rendimento % de carbono). Como mostrado nos exemplos e na Tabela 2, aproximadamente 60,5 g de isopreno por litro de caldo foram gerados. O isopreno foi produzido a uma taxa específica máxima de 1,88 x 105 nmo- les/OD/hora (1,88 x 105 nrnoles/gWcm/hora). Se desejado, podem ser obtidas quantidades ainda maiores de isopreno usando outras condições, tais como aquelas descritas neste relatório. Em algumas modalidades, uma fonte de carbono renovável é usada para a produção de isopreno. As composições e métodos da presente invenção são desejáveis porque eles possibilitam alto rendimento de isopreno por célula, alto rendimento de carbono, alta pureza de isopreno, alta produtividade, baixo consumo de energia, baixo custo de produção e investimento, e reações secundárias mínimas. Este eficiente processo biossintéti- co de grande escala para a produção de isopreno proporciona uma fonte de isopreno para borracha sintética à base de isopreno e oferece uma alternativa de baixo custo desejável ao uso de borracha natural.
[00144] Como discutido mais adiante, a quantidade de isopreno produzido por células pode ser bastante aumentada pela introdução de ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase (por exemplo, um polipeptídio de isopreno sintase vegetal) nas células. Polipeptídios de isopreno sintase covertem dimetilalil difosfato (DMAPP) em isopreno. Como mostrado nos exemplos, um polipeptídio de isopreno sintase heterólogo de Pueraria Montana (kudzu) ou de Po- pulus alba (choupo) foi expresso em uma variedade de células hospedeiras, tais como Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis, Yar- rowia lipolytica, e Trichoderma reesei. Como também mostrado nos exemplos, uma mevalonate quinase heteróloga de Metanosarcina ma- zei (M. mazei) (MVK) foi expressa em células hospedeiras tais como Escherichia coli para aumentar a produção de isopreno. Todas essas células produziram mais isopreno do que as células correspondentes sem o polipeptídio de isopreno sintase heterólogo. Como ilustrado nas Tabelas 1 e 2, grandes quantidades de isopreno são produzidas usando os métodos descritos nesta invenção. Por exemplo, células de B. subtilis com um ácido nucleico de isopreno sintase heterólogo produziram aproximadamente 10 vezes mais isopreno em um fermentador de 14 litros do que as células de B. subtilis de controle correspondentes sem o ácido nucleico heterólogo (Tabela 2). A produção de 60,5 g de isopreno por litro de caldo (mg/L, onde o volume de caldo inclui o vo-lume do meio para as células e o volume das células) por E. coli e 30 mg/L por B. subtilis em fermentadores indica que quantidades significativas de isopreno podem ser geradas (Tabela 2). Se desejado, o isopreno pode ser produzido em uma escala ainda maior ou outras condições descritas neste relatório podem ser usadas para aumentar ainda mais a quantidade de isopreno. Os vetores listados nas Tabelas 1 e 2 e as condições experimentais estão descritos em maiores detalhes abaixo e na seção de Exemplos. Tabela 1: Rendimentos exemplificativos de isopreno em um balão oscilante usando as culturas de células e os métodos da invenção. O ensaio para medir a produção de isopreno está descrito no Exemplo I, parte II. Para esse ensaio, uma amostra foi removida em um ou mais momentos diferentes do balão oscilante e cultivada por 30 minutos. A quantidade de isopreno produzido nessa amostra foi então medida. A concentração no headspace e a taxa específica de produção de isopreno estão listadas na Tabela 1 e descritas mais adiante.
Figure img0002
*Normalizado para 1 ml_ de 1 ODΘOO,cultivada por hora em um balão de headspace vedado com uma proporção de líquido para volume de headspace de 1:19. Tabela 2: Rendimentos exemplificativos de isopreno em um fer- mentador usando as culturas de células e os métodos da invenção. O ensaio para medir a produção de isopreno está descrito no Exemplo I, parte II. Para este ensaio, uma amostra dos gases desprendidos do fermentador foi coletada e analisada quanto à quantidade de isopreno. A concentração máxima no headspace (que é a concen-tração mais alta no headspace durante a fermentação), o título (que é a quantidade total cumulativa de isopreno produzido por litro de caldo), e a taxa específica máxima de produção de isopreno (que é a taxa es pecífica mais alta durante a fermentação) estão listados na Tabela 2 e descritos mais adiante.
Figure img0003
**Normalizado para uma axa de fluxo de gases desprendidos de 1 vvm (1 volume de gás desprendido por 1 Lcaido por minuto).
[00145] Adicionalmente, a produção de isopreno por células que contêm um ácido nucleico de isopreno sintase heterólogo pode ser melhorada aumentando-se a quantidade de um polipeptídio de 1-desoxi- D-xilulose-5- fosfato sintase (DXS) e/ou de um polipeptídio de isopen- tenil difosfato isomerase (IDI) expresso pelas células. Por exemplo, um ácido nucleico de DXS e/ou um ácido nucleico de IDI pode ser introduzido nas células. O ácido nucleico de DXS pode ser um ácido nucleico heterólogo ou uma cópia duplicata de um ácido nucleico endógeno. Da mesma forma, o ácido nucleico de IDI pode ser um ácido nucleico heterólogo ou uma cópia duplicata de um ácido nucleico endógeno. Em algumas modalidades, a quantidade de polipeptídio de DXS e/ou de IDI é aumentada substituindo-se os promotores ou regiões reguladoras endógenos de DXS e/ou IDI por outros promotores e/ou regiões reguladoras que resultam em uma maior transcrição de ácidos nucleicos de DXS e/ou IDI. Em algumas modalidades, as células contêm um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase (por exemplo, um ácido nucleico de isopreno sintase vegetal) e uma cópia duplicata de um ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídio de isopreno sintase.
[00146] Os polipeptídios de DXS e IDI codificados fazem parte da via de DXP para a biossíntese de isopreno (figura 19A). Os polipeptídios de DXS convertem piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1- desoxi-D-xilulose-5-fosfato. Embora sem se pretender se ater a qualquer teoria particular, acredita-se que o aumento da quantidade do polipeptídio de DXS aumenta o fluxo de carbono através de de DXP, levando a uma maior produção de isopreno. Os polipeptídios de IDI catalisam a interconversão de isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP). Embora sem pretendermos nos ater a qualquer teoria particular, acredita-se que o aumento da quantidade do polipeptídio de IDI nas células aumenta a quantidade de IPP que é convertido em DMAPP, que por sua vez é convertido em isopreno.
[00147] Por exemplo, a fermentação de células de E. coli com um isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia, e ácidos nucleicos de DXS de E. coli foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 50 a 300 pg/L durante um período de tempo de 15 horas (Exemplo 7, parte VII). Como um outro exemplo, a fermentação de E. coli com mevalonato quinase de M. mazei (MVK), isopreno sintase de P. alba, a via superior de MVA, e a via inferior integrada de MVA foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 32 a 35,6 g/L durante um período de tempo de 67 horas (Exemplo 10, parte III).
[00148] Em ainda um outro exemplo, a fermentação de E. coli com mevalonato quinase de M. mazei (MVK), isopreno sintase de P. alba, superexpressão de pg 1 (RHM111608-2), a via superior de MVA, e a via inferior integrada de MVA foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 33,2 g/L a 40,0 g/L durante um período de tempo de 40 horas ou de 48,6 g/L a 60,5 g/L durante um período de tempo de 59 horas (Exemplo 13, parte (ii)).
[00149] Em algumas modalidades, a presença de ácidos nucleicos de isopreno sintase, IDI, e DXS heterólogos ou endógenos extras faz com que as células cresçam de forma mais reproduzível ou permaneçam viáveis por mais tempo em relação à célula correspondente com apenas um ou dois desses ácidos nucleicos heterólogos ou endógenos extras. Por exemplo, células contendo ácidos nucleicos de isopreno sintase, IDI, e DXS heterólogos se desenvolveram melhor que as célu-las com apenas ácidos nucleicos de isopreno sintase e DXS heterólogos ou com apenas um ácido nucleico de isopreno sintase heterólogo. Também, ácidos nucleicos de isopreno sintase, IDI, e DXS heterólogos foram operacionalmente ligados com sucesso a um promotor forte em um plasmídeo de muitas cópias que foi mantido por células de E. coli, sugerindo que grandes quantidades desses polipeptídios poderiam ser expressas nas células sem causar uma toxicidade excessiva às célu- las. Embora sem se desejar se ater a uma teoria particular, acredita-se que a presença de ácidos nucleicos de isopreno sintase e IDI heterólo- gos ou endógenos extras pode reduzir a quantidade de um ou mais intermediários potencialmente tóxicos que do contrário se acumulariam se somente um ácido nucleico de DXS heterólogo ou endógeno extra estivesse presente nas células.
[00150] Em algumas modalidades, a produção de isopreno por células que contêm um ácido nucleico de isopreno sintase heterólogo é aumentada aumentando-se a quantidade de um polipeptídio de MVA expresso pelas células (figuras 19A e 19B). Polipeptídios de vias de MVA exemplificativos incluem qualquer um dos polipeptídios a seguir: polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase), polipeptídios de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídios de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA reductase), polipeptídios de mevalonato quinase (MVK), polipeptídios de fos- fomevalonato quinase (PMK), polipeptídios de difosfomevalonato des- carboxilase (MVD), polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC), polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK), polipeptídios de IDI, e polipeptídios (por exemplo, polipeptídios de fusão) tendo uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via de MVA. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA podem ser introduzi-dos nas células. Em algumas modalidades, as células contêm a via superior de MVA, que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG- CoA sintase, e HMG-CoA redutase. Em algumas modalidades, as células contêm a via inferior de MVA, que inclui ácidos nucleicos de MVK, PMK, MVD, e IDI. Em algumas modalidades, as células contêm a via inteira de MVA, que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG- CoA sintase, HMG-CoA redutase, MVK, PMK, MVD, e IDI. Em algumas modalidades, as células contêm uma via inteira de MVA que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, MVK, PMDC, IPK, e IDI. Os ácidos nucleicos das vias de MVA podem ser ácidos nucleicos heterólogos ou cópias duplicatas de ácidos nucleicos endógenos. Em algumas modalidades, a quantidade de um ou mais polipeptídios das vias de MVA é aumentada por substituição dos promotores ou regiões reguladoras endógenos para os ácidos nucleicos das vias de MVA por outros promotores e/ou regiões reguladoras que resultam em uma maior transcrição dos ácidos nucleicos das vias de MVA. Em algumas modalidades, as células contêm um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase (por exemplo, um ácido nucleico de isopreno sintase vegetal) e uma cópia duplicata de um ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídio de isopreno sintase.Por exemplo, células de E. coli con-tendo um ácido nucleico codificando polipeptídio de isopreno sintase de kudzu e ácidos nucleicos codificando polipeptídios de MVK, PMK, MVD, e BDI de Saccharomyces cerevisia geraram isopreno a uma taxa de 6,67 x 104 nmol/Lcaido/ODeoo/hora (vide Exemplo 8). Adicionalmente, uma fermentação com capacidade para 14 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos codificando polipeptídios de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, e HMG-CoA redutase de Enterococcus faecalis produziu 22 gramas de ácido mevalônico (um intermediário da via de MVA). Um balão oscilante dessas células produz 2-4 gramas de ácido mevalônico por litro. Esses resultados indicam que os ácidos nucleicos heterólogos das vias de MVA são ativados em E. coli. Células de E. coli que contêm ácidos nucleicos para a via superior de MVA e para a via inferior de MVA assim como uma isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 127) produziram significativamente mais isopreno (874 pg/Lcaido/hora/OD) que as células de E. coli com ácidos nucleicos apenas para a via inferior de MVA e a isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 131) (vide Tabela 3 polipeptídio de ni isopreno sintase e um ácido nucleico codificando o polipeptídio de MVK de M. mazei geraram 320,6 g (a uma taxa específica máxima de 9,54 x 104 nmol/Lcaido/ODeoo/hora (isto é, 9,5 x 10’5 mol/Lcaido/ODeoo/hora)) de iso- preno durante 67 horas de fermentação na ausência de alimentação com extrato de levedura ou 395,5 g (a uma taxa específica máxima de 8,66 x 104 nmol/Lcaido/ODeoo/hora) durante 68 horas de fermentação na presença de alimentação com extrato de levedura (vide Exemplo 10).
[00151] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção das células mantém o ácido nucleico heterólogo de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA por pelo menos cerca de 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura contínua sem diluição). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, o ácido nucleico compreende a cópia heteróloga ou duplicata de um ácido nucleico endógeno de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA também compreende um marcador seletivo, tal como um ácido nucleico de resistência aos antibióticos canamicina, ampiclina, carbenicilina, gentamicina, higromi- cina, fleomicina, bleomicina, neomicina, ou cloranfenicol.
[00152] Como indicado no Exemplo 7, parte VI, a quantidade de isopreno produzido pode ser ainda aumentada pela adição de extrato de levedura ao meio de cultura de células usando células de E. coli com ácidos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, JDI de S. cerevi- sia, e DXS de E. coli para produzir isopreno. Em particular, a quantidade de isopreno produzido foi linearmente proporcional à quantidade de extrato de levedura no meio de cultura de células para as concentrações testadas (figura 48C). Adicionalmente, aproximadamente 0,11 gramas de isopreno por litro de caldo foi produzido a partir de um meio de cultura de células com extrato de levedura e glicose (Exemplo 7, parte VIII). O aumento da quantidade de extrato de levedura na presença de glicose resultou na produção de mais isopreno do que aquele que foi produzido com o aumento da quantidade de glicose na presença de extrato de levedura. Também, o aumento da quantidade de extrato de levedura permitiu que as células produzissem um alto nível de isopreno por um período de tempo mais longo e melhorou a saúde das células.
[00153] A produção de isopreno também foi demonstrada com o uso de três tipos de biomassa hidrolisada (bagaço, palha de milho, e polpa de madeira mole) como a fonte de carbono (figuras 46A-C e figuras 69A e 69B). células de E. coli com ácidos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, JDI de S. cerevisia, e DXS de E. coli produziram tanto isopreno a partir dessas fontes de carbono de biomassa hidrolisada quanto aquele produzido a partir da quantidade equivalente de (por exemplo, 1% de glicose, p/v). Células de E. coli expressando isopreno sintase e a via de MVA de P. alba produziram isopreno a uma taxa de crescimento inicial mais alta a partir de palha de milho tratada com expansão de fibras de amónia (AFEX) do aquele produzir a partir da quantidade equivalente de glicose. (Figuras 69A e 69B). Se desejado, qualquer outra fonte de carbono de biomassa pode ser usada nas composições e métodos da invenção. Fontes de carbono de biomassa são desejáveis porque são mais baratas que muitos meios de cultura de células convencionais, facilitando assim a produção econômica de isopreno.
[00154] Adicionalmente, foi demonstrado que o açúcar invertido funciona como uma fonte de carbono para a geração de isopreno (figura 47D).
[00155] Adicionalmente, foi demonstrado que xilose, acetato, e gli- cerol também funcionam como uma fonte de carbono para a geração de isopreno (figuras 69A-69D). Por exemplo, células de E. coli com isopreno sintase e a via de MVA de P. alba desenvolvidas em acetato como a única fonte de carbono apresentaram uma produtividade específica de isopreno cerca de duas vezes maior durante crescimento em glicose (Exemplo 10, parte IV; figuras 69A e 69B).
[00156] Em algumas modalidades, um óleo é incluído no meio de cultura de células. Por exemplo, células de B. subtilis contendo um ácido nucleico de isopreno sintase de kudzu produziram isopreno quando cultivadas em um meio de cultura de células contendo um óleo e uma fonte de glicose (Exemplo 4, parte III). Como um outro exemplo, células mutantes fadR atoC de E. coli contendo as vias superior e inferior de MVA mais isopreno sintase de kudzu produziram isopreno quando cultivadas em um meio de cultura de células contendo óleo de palma e uma fonte de glicose (Exemplo 12, parte II). Em algumas modalidades, mais de um óleo (tal como 2, 3, 4, 5, ou mais óleos) é incluído no meio de cultura de células. Embora sem desejarmos nos ater a uma teoria particular, acreditamos que (i) o óleo pode aumentar a quantidade de carbono nas células que se encontra disponível para conversão em isopreno, (ii) o óleo pode aumentar a quantidade de acetil-CoA nas células, aumentando assim o fluxo de carbono através da via de MVA, e/ou (ii) o óleo pode fornecer nutrientes extras para as células, o que é desejável uma vez que parte do carbono nas células é convertido em isopreno e não em outros produtos. Em algumas modalidades, células que são cultivadas em um meio de cultura de células contendo óleo naturalmente usam a via de MVA para produzir isopreno ou são geneticamente modificadas para conter ácidos nucleicos para a via de MVA inteira. Em algumas modalidades, o óleo é parcialmente ou completamente hidrolisado antes de ser adicionado ao meio de cultura de células para facilitar o uso do óleo pelas células hospedeiras.
[00157] Polipeptídios e ácidos nucleicos exemplificativos
[00158] Vários polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, DDI, e/ou da via de MVA podem ser usados nas composições e métodos da invenção.
[00159] Conforme usado neste relatório, "polipeptídios" inclui polipeptídios, proteínas, peptídios, fragmentos de polipeptídios, e polipeptídios de fusão que incluem parte de um primeiro polipeptídio ou todo ele (por exemplo, um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, BDI, ou da via de MVA) e parte de um segundo polipeptídio ou todo ele (por exemplo, um peptídio que facilita a purificação ou detecção do polipep- tídio de fusão, tal como um His-tag). Em algumas modalidades, o polipeptídio de fusão tem uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via de MVA (tal como os polipeptídios de AA-CoA tiolase e HMG- CoA redutase). Em algumas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio natural (tal como o polipeptídio codificado por um ácido nucleico de mvaE de Enterococcus faecalis) que tem uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via de MVA.
[00160] Em várias modalidades, um polipeptídio tem pelo menos ou cerca de 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, ou mais aminoá- cidos. Em algumas modalidades, o fragmento de polipeptídio contém pelo menos ou cerca de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, ou mais ami- noácidos contíguos de um polipeptídio de comprimento integral e tem pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% de uma atividade de um polipeptídio de comprimento integral correspondente. Em modalidades particulares, o polipeptídio inclui um fragmento da sequência de aminoácidos integral de qualquer polipeptídio natural de isopreno sintase, DXS, EDI, ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o polipeptídio tem uma ou mais mutações em relação à sequência do tipo selvagem (isto é, uma sequência que ocorre na natureza) de um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, EDI, ou da via de MVA.
[00161] Em algumas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio isolado. Conforme usado neste relatório, um "polipeptídio isolado" não faz parte de uma biblioteca de polipeptídios, tal como uma biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 ou mais polipeptídios diferentes e é separado de pelo menos um componente com o qual ele ocorre na natureza. Um polipeptídio isolado pode ser obtido, por exemplo, por expressão de um ácido nucleico recombinante codificando o polipeptídio.
[00162] Em algumas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio heterólogo. Por "polipeptídio heterólogo" entende-se um polipeptídio cuja sequência de aminoácidos não é idêntica àquela de um outro po- lipeptídio naturalmente expresso na mesma célula hospedeira.
[00163] Conforme usado neste relatório, um "ácido nucleico" refere- se a dois ou mais desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos na forma de cordão simples ou de cordão duplo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante. Por "ácido nucleico recombinante" entende-se um ácido nucleico de interesse que é livre de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, genes) que, no genoma que ocorre na natureza do organismo do qual deriva o ácido nucleico de interesse, flanqueiam o ácido nucleico de interesse. O termo, por conseguinte, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA, um fragmento de DNA genômico, ou um fragmento de cDNA produzido por PCR ou por digestão de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Em algumas modalidades, um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA é operacionalmente ligado a um outro ácido nucleico codificando todo ou uma porção de um outro polipeptídio de modo que o ácido nucleico recombinante codifica um polipeptídio de fusão que incui um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA e todo ou parte de um outro polipeptídio (por exemplo, um peptídio que facilita a purificação ou detecção do polipeptídio de fusão, tal como um His-tag). Em algumas modalidades, parte ou todo ou um ácido nucleico recombinante é quimicamente sintetizado.
[00164] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico heterólogo. Por "ácido nucleico heterólogo" entende-se um ácido nucleico cuja sequência de ácidos nucleicos não é idêntica àquela de um outro ácido nucleico encontrado naturalmente na mesma célula hospedeira. Em modalidades particulares, o ácido nucleico inclui um segmento da sequência de ácidos nucleicos ou a sequência de ácidos nucleicos inteira de qualquer ácido nucleico natural de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui pelo menos ou cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico natural de isopreno, DXS, IDI, ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma ou mais mutações em relação à sequência do tipo selvagem (isto é, uma sequência que ocorre na natureza) de um um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, EDI, ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma ou mais mutações (por exemplo, uma mutação silenciosa) que aumenta a transcrição ou translação do ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma variante degenerada de qualquer ácido nucleico codificando um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, EDI, ou da via de MVA.
[00165] "Degeneração do códon"refere-se à divergência no código genético permitindo variação da sequência nucleotidica sem afetar a sequência de aminoácidos de um polipeptídio codificado. O versado na técnica conhece o "códon-bias" exibido por uma célula hospedeira específica no uso de códons de nucleotídeos para especificar um amino- ácido dado. Por conseguinte, quando um ácido nucleico é sintetizado para melhorar sua expressão em uma célula hospedeira, é desejável em algumas modalidades desenhar o ácido nucleico de modo que sua frequência de uso do códon se aproxima da frequência de uso do có-don preferida da célula hospedeira.
[00166] Os números de acesso dos polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA exemplificativos estão listados no Apêndice 1 (os números de acesso do Apêndice 1 e suas sequências correspondentes estão aqui incorporados em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito às sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos dos polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, EDI, e/ou da via de MVA). O banco de dados Kegg também contém as sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos de numerosos polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou dia via de MVA exemplificati- vos (vide, por exemplo, o site em "geno- me.jp/kegg/pathway/map/map00100.html"e as sequências ali contidas, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito às sequências de aminoácidos e de aminoácidos de polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA). Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídios e/ou ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA têm uma sequência idêntica à sequência disponibilizada ao público em 12 de dezembro de 2007 ou em 11 de dezembro de 2008, tal como qualquer uma das sequências que correspondem a qualquer um dos números de acesso no Apêndice 1 ou qualquer uma das sequências presentes no banco de dados Kegg. Polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA exemplificativos adicionais estão descritos mais adiante.
[00167] Polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase exemplificativos
[00168] Como observado acima, polipeptídios de isopreno sintase convertem dimetilalil difosfato (DMAPP) em isopreno. Polipeptídios de isopreno sintase exemplificativos incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídios, e polipeptídios de fusão que têm pelo menos uma atividade de um polipeptídio de isopreno sintase. Métodos tradicionais podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de isopreno sintase medindo-se a capacidade do polipeptídio para converter DMAPP em isopreno in vitro, em um extrato de células, ou in vivo. Em um ensaio exemplificative, extratos de células são preparados cultivando-se uma cepa (por exemplo, a cepa E. coli/pTrcKudzu aqui descrita) no método do balão oscilante como des- crito no Exemplo 1. Depois de completada a indução, aproximadamente 10 ml de células são pelotizadas por centrifugação a 7000 x g por 10 minutos e ressuspendidas em 5 ml de PEB sem glicerol. As células são lisadas usando uma célula "French Pressure"usando procedimentos tradicionais. Alternativamente as células são tratadas com lisozima (solução de lisozima Ready-Lyse; Epicentre) depois de uma etapa de congelamento/descongelamento a -80°C.
[00169] A atividade de polipeptídio de isopreno sintase no extrato de células pode ser medida, por exemplo, da maneira descrita em Silver et al., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 e referências ali citadas, cada uma delss estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente em relação a ensaios para determinar a atividade do polipeptídio de isopreno sintase. DMAPP (Sigma) é evaporado até a secura em uma corrente de nitrogênio e reidratado até uma concentração de 100 mM em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 8,2 e armazenado a -20°C. Para realizar o ensaio, uma solução de 5 pl de MgCh 1 M, DMAPP 1 mM (250 pg/ml), 65 pl de tampão de extrato de plantas (PEB) (50 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 20 mM de MgCh, 5% de glicerol, e 2 mM de DTT) é adicionada a 25 pl de um extrato de células em um frasco de headspace de 20 ml com uma tampa de rosca metálica e um septo de silicone revestido com teflon (Agilent Technologies) e cultivada a 37°C por 15 minutos com agitação. A reação é resfriada bruscamente pela adição de 200 pl de EDTA 250 mM e quantificada por GC/MS da maneira descrita no Exemplo 1, parte II.
[00170] Ácidos nucleicos de isopreno sintase exemplificativos incluem que codificam um polipeptídio, fragmento de um polipeptídio, pep- tídio, ou polipeptídio de fusão que tem pelo menos uma atividade de um polipeptídio de isopreno sintase. Polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase exemplificativos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos naturais de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção.
[00171] Em algumas modalidades, o polipeptídio ou ácido nucleico de isopreno sintase faz parte da família Fabaceae, tal como a subfamí- lia Faboideae. Em algumas modalidades, o polipeptídio ou ácido nucleico de isopreno sintase é um polipeptídio ou ácido nucleico de Pue- raria montana (kudzu) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraria lobata, choupo (tal como Populus alba, Populus nigra, Populus trichocarpa, Populus alba x tremula (CAC35696), ou Populus alba) (Sasaki et al., FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005; Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001), choupo tremedor (tal como Populus tremuloides) (Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), ou carvalho inglês (Quercus robuf) (Zimmer et al., WO 98/02550), cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito aos ácidos nucleicos de isopreno sintase e à expressão de polipeptídios de isopreno sintase. Isopreno sintases adequadas incluem, porém sem limitação, aquelas identifca- das pelos Nos de acesso Genbank AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, and AY182241, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a sequências e ácidos nucleicos e polipeptídios de isopreno sintase. Em algumas modalidades, o polipeptídio ou ácido nucleico de isopreno sintase não é um polipeptídio ou ácido nucleico natural de Quercus robur (isto é, o polipeptídio ou ácido nucleico de isopreno sintase é um polipeptídio ou ácido nucleico de isopreno sintase que não um polipeptídio ou ácido nucleico natural de Quercus robur). Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polipeptídio de isopreno sintase é um polipeptídio ou ácido nucleico natural de choupo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polipeptídio de isopreno sintase não é um polipeptídio ou ácido nucleico natural de choupo.
Polipeptídios e ácidos nucleicos de DXS exemplificativos
[00172] Como observado acima, polipeptídios de 1-desoxi-D- xilulose-5-fosfato sintase (DXS) convertem piruvato e D-gliceraldeído- 3-fosfato em 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato. Polipeptídios de DXS exemplificativos incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídios, e polipeptídios de fusão que têm pelo menos uma atividade de um polipeptídio de DXS exemplificative. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de DXS medindo a capacidade do polipeptídio para converter piruvato e D- gliceraldeído-3-fosfato em 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato in vitro, em um extrato de células, ou in vivo. Ácidos nucleicos de DXS exemplificativos incluem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídio, fragmento de um polipeptídio, peptide, ou polipeptídio de fusão que tem pelo menos uma atividade de um polipeptídio de DXS. Polipeptídios e ácidos nu-cleicos de DXS exemplificativos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos naturais de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção.
IDI Polipeptídios e ácidos nucleicos de IDI exemplificativos
[00173] Polipeptídios de isopentenil difosfato isomerase (isopente- nil-difosfato delta- isomerase ou IDI) catalisam a interconversão de isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP) (por exemplo, convertem IPP em DMAPP e/ou convertem DMAPP em IPP). Polipeptídios de IDI exemplificativos incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídios, e polipeptídios de fusão que têm pelo menos uma atividade de um polipeptídio de IDI. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de IDI medindo a capacidade do polipeptídio para interconverter IPP e DMAPP in vitro, em um extrato de células, ou in vivo. Ácidos nucleicos de IDI exemplificativos incluem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídio, fragmento de um polipeptídio, peptídio, ou polipeptídio de fusão que tem pelo menos uma atividade de um polipeptídio de IDI. Polipeptídios e ácidos nucleicos de IDI exemplificativos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos naturais de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção.
Polipeptídios e ácidos nucleicos da via de MVA exemplificativos
[00174] Polipeptídios da via de MVA exemplificativos incluem polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA- CoA tiolase), polipeptídios de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídios de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase), polipeptídios de mevalonato quinase (MVK), polipeptídios de fos- fomevalonato quinase (PMK), polipeptídios de difosfomevalonte des- carboxilase (MVD), polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC), polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK), polipeptídios de IDI, e polipeptídios (por exemplo, polipeptídios de fusão) tendo uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via de MVA. Em parti-cular, polipeptídios da via de MVA incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídios, e polipeptídios de fusão que têm pelo menos uma atividade de um polipeptídio da via de MVA. Ácidos nucleicos da via de MVA exemplificativos incluem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídio, fragmento de um polipeptídio, peptídio, ou polipeptídio de fusão que tem pelo menos uma atividade de um polipeptídio da via de MVA. Polipeptídios e ácidos nucleicos da via de MVA exemplificativos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos naturais de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos de origem descritos nesta invenção.
[00175] Em particular, polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase ou AACT) convertem duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de AA- CoA tiolase medindo a capacidade do polipeptídio para converter duas moléculas de acetil- CoA em acetoacetil-CoA in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.Polipeptídio de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase ou HMGS) converte acetoacetil-CoA em S-hidroxi-S-metilglutaril- CoA. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de HMG-CoA sintase medindo a capacidade do polipeptídio para converter acetoacetil-CoA em 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.
[00176] Polipeptídios de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase ou HMGR) convertem 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA em mevalonate. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de HMG- CoA redutase medindo a capacidade do polipeptídio para converter 3- hidroxi-3- metilglutaril-CoA em mevalonate in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.Polipeptídios de mevalonato quinase (MVK) fosforilam o mevalonate para formar mevalonate-5- fosfato. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de MVK medindo a capacidade do polipeptídio para converter mevalonato em mevalonato-5-fosfato in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.
[00177] Polipeptídios de fosfomevalonato quinase (PMK) fosforilam mevalonato-5- fosfato para formar mevalonato-5-difosfato. Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de poli- peptídio de PMK medindo a capacidade do polipeptídio para converter mevalonato-5-fosfato em mevalonato-5-difosfato in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.
[00178] Polipeptídios de difosfomevalonte descarboxilase (MVD ou DPMDC) polipeptídios convert mevalonato-5-difosfato em isopentenil difosfato (IPP). Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem MVD polypeptide activity medindo a capacidade do polipeptídio para converter mevalonato-5- difosfato em IPP in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.Polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC) convertem mevalonato-5-fosfato em isopentenil fosfato (IP). Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de PMDC medindo a capacidade do polipeptídio para converter mevalonato-5-fosfato em IP in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.
[00179] Polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK) fosforilam isopentil fosfato (IP) para formar isopentenil difosfato (IPP). Métodos tradicionais (tais como como aqueles descritos neste relatório) podem ser usados para determinar se um polipeptídio tem atividade de polipeptídio de IPK medindo a capacidade do polipeptídio para converter IP em IPP in vitro, em um extrato de células, ou in vivo.
[00180] Polipeptídios e ácidos nucleicos de IDI exemplificativos estão descritos acima.
Métodos exemplificativos para isolar ácidos nucleicos
[00181] Ácidos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA podem ser isolados usando-se métodos tradicionais. Métodos para obter ácidos nucleicos desejados de um organismo de origem de interesse (tal como um genoma bacteriano) são comuns e bastante conhecidos na literatura de biologia molecular (vide, por exemplo, o documento WO 2004/033646 e referências ali citadas, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito ao isolamento dos ácidos nucleicos de interesse). Por exemplo, se a sequência do ácido nucleico for conhecida (tal como qualquer um dos ácidos nucleicos conhecidos descritos nesta invenção), bibliotecas genômicas adequadas podem ser criadas por digestão de endonuclease de restrição e podem ser rastreadas com sondas complementares à sequência de ácidos nucleicos desejada. Depois de a sequência ser isolada, o DNA pode ser amplificado usando-se métodos tradicionais de amplificação direcionada por iniciadores tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) (Patente US N° 4.683.202, que está aqui incorporada em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de PCR) para obter quantidades de DNA adequadas para transformação usando vetores apropriados.
[00182] Alternativamente, ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA (tais como qualquer um dos ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, EDI, e/ou da via de MVA com uma sequência de ácidos nucleicos conhecida) podem ser quimicamente sintetizados usando métodos tradicionais.
[00183] Polipeptídios e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA adicionais que podem ser adequados para uso nas composições e métodos descritos nesta invenção podem ser identificados usando métodos tradicionais. Por exemplo, bibliotecas de cosmídeos do DNA cromossômica de organismos que sabidamente produzem isopreno naturalmente podem ser construídas em organis-mos tais como E. coli, e em seguida analisadas quanto à produção de isopreno. Em particular, bibliotecas de cosmídeos podem ser ciradas onde segmentos grandes de DNA genômico (35-45 kb) são acondio- nados em vetores e usados para transformar hospedeiros apropriados. Vetores de cosmídeo são incomparáveis em termos de sua capacidade para acomodar grandes quantidades de DNA. Geralmente os vetores de cosmídeo têm pelo menos uma cópia da sequência de cos DNA que é necessária para o acondicionamento e subsequente circulariza- ção do DNA heterólogo. Além da sequência de cos, esses vetores também contêm uma origem de replicação tal como ColEI e marcadores de resistência a drogas tal como um ácido nucleico resistente à ampicilina ou neomicina. Métodos de uso de vetores de cosmídeo para a transformação de hospedeiros bacterianos adequados estão descritos por Sambrook et al., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor, 1989, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação. Tipicamente, para clonar cosmídeos, DNA heterólogo é isolado usando as endonucleases de restrição apropriadas e ligado adjacente à região cos do vetor de cosmídeo usando as ligases apropriadas. Vetores de cosmídeo contendo o DNA heterólogo linearizado são então reagidos com um veículo de acondicionamento de DNA tal como bateriófago. Durante o processo de acondicionamento, os sítios cos são clivados e o DNA heterólogo é acondicionado na porção de cabeça da partícula virai bacteriana. Essas partículas são então usadas para transfectar células hospedeiras adequadas tais como E. coli. Depois de injetado na célula, o DNA heterólogo circulariza sob a influência das extremidades cos pegajosas. Desta maneira, segmentos grandes de DNA heterólogo podem ser introduzidos e ex-pressos em células hospedeiras.
[00184] Métodos adicionais para obter ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, BDI, e/ou da via de MVA incluem rastreamento de uma biblioteca metagenômica por ensaio (tal como o ensaio headspace descrito nesta invenção) ou por PCR usando iniciadores direcionados contra nucleotídeos codificando um comprimento de aminoácidos conservados (por exemplo, pelo menos 3 aminoácidos conservados). Aminoácidos conservados podem ser identificados por alinhamento de sequências de aminoácidos de polipeptídios conhecidos de isopreno sin- tase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA. Aminoácidos conservados para polipeptídios de isopreno sintase podem ser identificados com base nas sequências alinhadas de polipeptídios de isopreno sintase conhecidos. Um organismo que sabidamente produz isopreno naturalmente pode ser submetido a métodos tradicionais de purificação de proteínas (que são bastante conhecidos na literatura) e o polipeptídio purificado resultante pode ser sequenciado usando-se métodos tradicionais. Outros métodos são encontrados na literatura (vide, por exemplo, Julsing et al., Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al., Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito à identificação dos ácidos nucleicos envolvidos na síntese de isopreno).
[00185] Adicionalmente, programas tradicionais de previsão de alinhamento de sequência e/ou estrutura podem ser usados para identificar polipeptídios e ácidos nucleicos adicionais de DXS, IDI, ou da via de MVA com base na semelhança da estrutura primária e/ou secundária prevista do polipeptídio com aquela de polipeptídios e ácidos nucleicos conhecidos de DXS, IDI, ou da via de MVA. Bancos de dados tradicionais tais como o banco de dados swissprot-trembl (site em "ex-pasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Suíça) também podem ser usados para identificar isopreno sintase, Polipeptídios e ácidos nucleicos de DXS, IDI, ou da via de MVA. A estrutura secundária e/ou terciária de um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA pode ser prevista usando-se os ajustes de default de programas tradicionais de previsão de estruturas, tais como o PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, EUA). Alternativamente, a estrutura secundária e/ou terciária verdadeira de um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA pode ser determinada usando-se métodos tradicionais. Ácidos nucleicos adicionais de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA também podem ser identificados por hibridização para sondas geradas a partir de ácidos nucleicos conhecidos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA.
Promotores e vetores exemplificativos
[00186] Qualquer um dos ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA descritos nesta invenção pode ser incluído em um ou mais vetores. Por conseguinte, a invenção também se refere a vetores com um ou mais ácidos nucleicos codificando qualquer um dos polipeptídios de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA que estão descritos nesta invenção. Conforme usado neste relatório, um "vetor" significa uma construção que é capaz de distribuir, e deseja-velmente expressar um ou mais ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, porém sem limitação, plasmídeos, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA, cosmídeos, e vetores de fago. Em algumas modalidades, o vetor conté um ácido nucleico sob o controle de uma sequência de controle de expressão.
[00187] Conforme usado neste relatório, uma "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico de interesse. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou um promotor induzível, ou um intensificador. Um "promotor induzível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou evolucionária. A sequência de controle de expressão é operacional-mente ligada ao segmento de ácido nucleico a ser transcrito.
[00188] Em algumas modalidades, o vetor contém um marcador seletivo. O termo "marcador seletivo" refere-se a um ácido nucleico capaz de expressão em uma célula hospedeira que permite a fácil seleção das células hospedeiras contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, porém sem limitação, ácidos nucleicos de resistência a antibióticos (por exemplo, ca- namicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomici- na, bleomicina, neomicina, ou cloranfenicol) e/ou ácidos nucleicos que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional à célula hospedeira. Marcadores seletivos nutricionais exemplifica- tivos incluem os marcadores conhecidos na literatura tais como amdS, argB, e pyr4. Marcadores úteis em sistemas vetores para a transformação de Trichoderma são conhecidos na literatura (vide, por exemplo, Finkelstein, Capítulo 6 em Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Cap. 6., 1992; e Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres, 1992, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, o marcador seletivo é o ácido nucleico amdS, que codifica a enzima acetamidase, permitindo que células transformadas cresçam em acetamida como uma fonte de nitrogênio. O uso de um ácido nucleico de A. nidulans amdS como marcador seletivo está descrito por Kelley et al., EMBO J. 4:475 - 479, 1985 e Penttila et al., Gene 61:155-164, 1987 (cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA se integra em um cromossoma das células sem um marcador seletivo.
[00189] Vetores adequados são aqueles que são compatíveis com a célula hospedeira empregada.Vetores adequados podem ser derivados, por exemplo, de uma bactéria, um vírus (tal como bacteriofato T7 ou um fago derivado de M-13), um cosmídeo, uma levedura, ou uma planta. Protocolos para obtenção e uso de tais vetores são conhecidos pelos versados na técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor, 1989, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito ao uso de vetores).
[00190] Promotores são bastante conhecidos na literatura. Qualquer promotor que funcione na célula hospedeira pode ser usado para expressão de um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA na célula hospedeira. Regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para induzir a expressão de ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA em várias células hospedeiras são numerosas e conhecidas pelos versados na técnica (vide, por exemplo, o documento WO 2004/033646 e referências ali citadas, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a vetores para expressão dos ácidos nucleicos de interesse). Virtualmente qualquer promotor capaz de induzir esses ácidos nucleicos é adequado para a presente invenção incluindo, porém sem limitação, CYCI, fflS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, e TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOXI (útil para expressão em Pichia); e lac, trp, 0PL, 0PR,T7, tac, e trc (útil para expressão em E. coli).
[00191] Em algumas modalidades, um promotor de glicose isomerase é usado (vide, por exemplo, a Patente US N° 7.132.527 e referências ali citadas, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a promotores e sistemas de plasmídeo para expressar os polipeptídios de interesse). Mutantes de promotores de glicose isomerase já descri-tos podem ser usados para variar o nível de expressão do polipeptídio codificado por um ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor de glicose isomerase (Patente US N° 7.132.527). Em várias modalidades, o promotor de glicose isomerase está contido em um plasmídeo de baixo, médio, ou alto número de cópias (Patente US N° 7.132.527).
[00192] Em várias modalidades, um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, DDI, e/ou da via de MVA está contido em um plasmídeo de baixo número de cópias (por exemplo, um plasmídeo que é mantido a cerca de 1 a cerca de 4 cópias por célula), um plasmídeo de número médio de cópias (por exemplo, um plasmídeo que é mantido a cerca de 10 a cerca de 15 cópias por célula), ou um plasmídeo de alto número de cópias (por exemplo, um plasmídeo que é mantido a cerca de 50 ou mais cópias por célula). Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA é operacionalmente ligado a um promotor T7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA operacionalmente ligado a um promotor T7 está contido em um plasmídeo de número médio ou alto de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA é operacionalmente ligado a um promotor Trc. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA operacionalmente ligado a um promotor Trc está contido em um plasmídeo de número médio ou alto de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA é operacionalmente ligado a um promotor Lac. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, EDI, ou da via de MVA operacionalmente ligado a um promotor Lac está contido em um plasmídeo de baixo número de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA é operacionalmente ligado a um promotor endógeno, tal como um promotor endógeno de Escherichia, Panteoa, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces, ou Trichoder- ma ou um promotor endógeno de serine protease alcalina, isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o áci- do nucleico heterólogo ou endógeno extra de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA operacionalmente ligado a um promotor endógeno está contido em um plasmídeo de alto número de cópias. Em al-gumas modalidades, o vetor é um plasmídeo replicante que não se integra em um cromossoma nas células. Em algumas modalidades, parte do vetor ou todo ele se integra em em um cromossoma nas células.
[00193] Em algumas modalidades, o vetor é qualquer vetor que quando introduzido em uma célula hospedeira fúngica é integrado no genoma da célula hospedeira e é replicado. Indicamos o Fungal Gene-tics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, o site em "fgsc.net" e as referências ali citadas, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito to vectors) para consulta a uma lista de vetores. Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou de integração estão dados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Au- subel et al. (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18); van den Hon- del et al. em Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press págs. 396-428, 1991; e Patente US N° 5.874.276, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a vetores. Vetores particularmente úteis incluem pFB6, pBR322, PUC18, pUCWO, e pENTR/D.
[00194] Em algumas modalidades, um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, EDI, ou da via de MVA é operacionalmente ligado a um promotor adequado que mostra atividade transcricional em uma célula hospedeira fúngica. O promotor pode ser derivado de um ou mais ácidos nucleicos codificando um polipeptídio que ou é endógeno ou é heterólogo para a célula hospedeira. Em algumas modalidades, o promotor é útil em um hospedeiro da espécie Trichoderma. Exemplos não limitativos adequados de promotores incluem cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xynl, e amy. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor que é nativo para a célula hospedeira. Por exemplo, em algumas modalidades quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor nativo de T. reesei. Em algumas modalidades, o promotor é cbhlde T. reesei, que é um promotor induzível e fora depositado no GenBank sob o Acesso N° D86235, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a promotores. Em algumas modalidades, o promotor é um promoter que é heterólogo à célula hospedeira fúngica. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores dos genes de glicoamilase de A. awa- mori e A. niger (glaA) (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1581- 1585, 1984, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a promotores); alfa amilases de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, xln1 de T. reesei, e a celo- bio-hidrolase 1 de T. reesei (EP 137280, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a promotores).
[00195] Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui uma sequência de terminação. Regiões de controle de terminação também podem ser derivados de vários genes nativos para a célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência de terminação e a sequência do promotor são derivadas da mesma fonte. Em uma outra modalidade, a sequência de terminação é endógena à célula hospedeira. Uma sequência de terminação particularmente adequada é a cbh1 derivada de uma cepa Trichoderma (tal como T. reesei). Outros terminadores fúngicos úteis incluem o terminador de um ácido nucleico de glicoamilase de A. niger ou A. awamori (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a terminadores fúngi- cos). Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser incluído. Para expressão eficaz dos polipeptídios, DNA codificando o polipeptídio são operacionalmente ligados através dos códons iniciais a regiões de controle de expressão selecionadas de modo que a expressão resulte na formação do RNA mensageiro apropriado.
[00196] Em algumas modalidades, o promotor, a região codificadora, e o terminador originam-se do ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA a ser expresso. Em algumas modalidades, a região codificadora para um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA é inserido em um vetor de expressão múltiplo uso de forma que ele fica sob o controle transcricional do promotor da construção de expressão e sequências de terminador. Em algumas modalidades, genes ou parte dos mesmos são inseridos a jusante do promotor cbh1 forte.
[00197] Um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA pode ser incorporado em um vetor, tal como um vetor de expressão, usando-se técnicas tradicionais (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito ao rastreamento de sequências de DNA apropriadas e à construção de vetores). Métodos usados para ligar a construção de DNA compreendendo um ácido nucleico de interesse (tal como um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA), um promotor, a terminator, e outras sequências e para inseri-los em um vetor adequado são bastante conhecidos na literatura. Por exemplo, enzimas de restrição podem ser usadas para clivar o ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA e o vetor. Em seguida, as extremidades compatíveis do ácido nucleico clivado de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA e o vetor clivado podem ser ligados. A ligação geralmente é efetuada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os ligadores oligonu- cleotídicos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional (vide, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, e Bennett & Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, págs. 70-76, 1991, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a ligadores oligonucleo- tídicos). Adicionalmente, vetores podem ser construídos usando-se técnicas de recombinação (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
[00198] Em algumas modalidades, pode ser desejável superexpres- sar ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA em níveis muito mais altos que os atualmente encontrados em células naturais. Este resultado pode ser obtido pela clonagem seletiva dos ácidos nucleicos codificando esses polipeptídios em plasmídeos de múltiplas cópias ou colocando esses ácidos nucleicos sob um promotor induzível ou constitutivo forte. Métodos para superexpressar polipeptídios desejados são comuns e bastante conhecidos na literatura de biologia molecular e exemplos podem ser encontrados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor, 1989, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a técnicas de clonagem.
[00199] As referências a seguir incluem descrições de metodologia geral adicional útil de acordo com a invenção: Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 e Ausubel et al., Eds. Current Protocols em Molecular Biology, 1994, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito à biologia molecular e técnicas de clonagem.
[00200] Organismos de origem exemplificativos
[00201] Ácidos nucleicos (e seus polipeptídios codificados) de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA podem ser obtidos de qualquer organismo que contém naturalmente de isopreno sintase, DXS, DDI, e/ou da via de MVA. Como observado acima, o isopreno é formado naturalmente por uma variedade de organismos, tais como bactérias, levedura, plantas, e animais. Os organismos contêm a via de MVA, a via de DXP, ou ambas as vias de MVA e de DXP para produzir isopreno (figura 19). Portanto, ácidos nucleicos de DXS podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contém a via de DXP ou que contém ambas as vias de MVA e de DXP. Ácidos nucleicos de DDI e de isopreno sintase podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contém a via de MVA, a via de DXP, ou ambas as vias de MVA e de DXP. Ácidos nucleicos da via de MVA podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contém a via de MVA ou que contém ambas as vias de MVA e de DXP.
[00202] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA é idêntica à sequência de um ácido nucleico que é produzido por qualquer um dos seguintes organismos na natureza. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídio de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA é idêntica à sequência de um polipeptídio que é produzido por qualquer um dos seguintes organismos na natureza.Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polipeptídio de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA é um ácido nucleico ou polipeptídio mutante derivado de qualquer um dos organismos descritos nesta invenção. Conforme usado neste relatório, "derivado de"refere-se à fonte do ácido nucleico ou polipeptídio na qual uma ou mais mutações são introduzidas. Por exemplo, um polipeptídio que é "derivado de um polipeptídio vegetal"refere-se ao polipeptídio de interesse que resulta da in-trodução de uma ou mais mutações na sequência de polipeptídio vegetal do tipo selvagem (isto é, uma sequência que ocorre na natureza).
[00203] Em algumas modalidades, o organismo de origem é um fungo, e exemplos do mesmo são espécies de Aspergillus tais como A. oryzae e A. niger, espécies de Saccharomyces tais como S. cerevisiae, espécies de Schizosaccharomyces tais como S. pombe, e espécies de Trichoderma tais como T. reesei. Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma célula fúngica filamentosa. O termo "fungos filamentosos"refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (vide, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York). Esses fungos caracterizam-se por um micélio vegetative com uma parede celular composta de quitina, celulose, e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos são morfologicamente, fisiologicamente, e geneticamente distintos das leveduras. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos se dá por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. A célula parental do fungo filamentoso pode ser uma célula de, porém sem limitação, Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei, a forma assexuada de Hypocrea jecorina, antigamente classificada como T. lon- gibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC N° 56765 e ATCC N° 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, H. insolens, H. lanuginose, ou H. grisea); Chrysospo- rium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidu- lans, ou A. awamori) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 e Goedegebuur et al., Genet 41: 89-98, 2002), Fusarium sp., (por exemplo, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxyspo- ruim, ou F. venenatum), Neurospora sp., (por exemplo, N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp., (por exemplo, M. miehei), Rhizopus sp. e Emericella sp. (vide também, Innis et al., Sei 228: 21-26, 1985). O termo "Trichoderma" ou "Trichoderma sp." ou "Trichoderma spp." refere- se a qualquer gênero de fungo antigamente ou atualmente classificado como Trichoderma.
[00204] Em algumas modalidades, o fungo é A. nidulans, A. awamo- ri, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, ou F. solani. Cepas de Aspergillus foram descritas por Ward et al., em Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993 e Goe- degebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a fungos. Em modalidades particulares, o fungo é uma cepa de Trichoderma, tal como uma cepa de T. reesei. Cepas de T. reesei são conhecidas e exemplos não limitativos incluem ATCC N° 13631, ATCC N° 26921, ATCC N° 56764, ATCC N° 56765, ATCC N° 56767, e NRRL 15709, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a cepas de T. reesei. Em algumas modalidades, a cepa hospedeira é um derivado de RL-P37. RL- P37 foi descrito por Sheir- Neiss et al., em Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a cepas de T. reesei.
[00205] Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma levedura, tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pi- chia sp., ou Candida sp. Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma bactéria, tal como cepas de Bacillus tais como B. lichen- formis ou B. subtilis, cepas de Pantoea tais como P. citrea, cepas de Pseudomonas tais como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces tais como S. albus, S. lividans, ou S. rubiginosus, ou cepas de Escherichia tais como E. coli.
[00206] Conforme usado neste relatório, "o gênero Bacillus"inclui todas as espécies do gênero "Bacillus", conhecidas pelos versados na técnica, e que incluem, porém sem limitação, B. subtilis, B. lichenifor- mis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagu- lans, B. circulans, B. lautus, e B. thuringiensis. Já foi reconhecido que o gênero Bacillus continua a sofrer reorganização taxonômica. Portanto, este gênero destina-se a incluir espécies que foram reclassificadas, incluindo, porém sem limitação, organismos tais como B. stearother- mophilus, que hoje é chamado de "Geobacillus stearothermophilus". A produção de endosporos resistentes na presença de oxigênio é considerada o aspecto que define o gênero Bacillus, embora esta característica também se aplique aos recentemente denominados Aliciclobaci- llus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filo- bacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Ther- mobacillus, Ureibacillus, e Virgibacillus.
[00207] Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma bactéria gram-positiva. Exemplos não limitativos incluem cepas de Streptomyces (por exemplo, S. albus, S. lividans, S. coelicolor, ou S. griseus) e Bacillus. Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma bactéria gram-negativa, tal como E. coli ou Pseudomonas sp.
[00208] Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma planta, tal como uma planta da família das Fabaceae, tal como a sub- família Faboideae. Em algumas modalidades, o organismo de origem é kudzu, choupo (tal como Populus alba x tremula CAC35696 ou Popu- lus alba) (Sasaki et al., FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005), choupo tremedor (tal como Populus tremuloides), ou Quercus robur.
[00209] Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma alga, tal como uma alga verde, alga vermelha, glaucófitas, cloraracnió- fitas, euglenidas, cromista, ou dinoflagelatos.
[00210] Em algumas modalidades, o organismo de origem é uma cianobactéria, tal como uma cianobactéria classificada em qualquer dos seguintes grupos com base em sua morfologia:
[00211] Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales, ou Stigonematales.
Células hospedeiras exemplificativas
[00212] Uma variedade de células hospedeiras pode ser usada para expressar polipeptídios de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA e para produzir isopreno pelos métodos da invenção reivindicada.Células hospedeiras exemplificativas incluem células de qualquer um dos organismos listados na seção anterior sob o título "Organismos de Origem Exemplificativos". A célula hospedeira pode ser uma célula que produz naturalmente isopreno ou uma célula que não produz naturalmente isopreno. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pro-duz naturalmente isopreno usando a via de DXP, e um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, e/ou IDI é adicionado para aumentar a produção de isopreno usando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno usando a via de MVA, e uma isopreno sintase e/ou um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA são adicionados para aumentar a produção de isopreno usando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno usando a via de DXP e um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA são adicionados para produzir isopreno usando parte ou toda a via de MVA assim como a via de DXP. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno ambas as vias de DXP e de MVA e um ou mais ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA são adicionados para aumentar a produção de isopreno por uma dessas vias ou por ambas.
Métodos de transformação exemplificativos
[00213] Ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA ou vetores contendo os mesmos podem ser inseridos em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula vegetal, uma célula fúngica, uma célula de levedura, ou uma célula bacteriana descrita nesta invenção) usando técnicas tradicionais para expressão do polipeptídio codificado de isopreno sintase, DXS, EDI, e/ou da via de MVA. A introdução de uma construção de DNA ou de um vetor em uma célula hospedeira pode ser efetuada usando técnicas tais como transformação, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo transfecção mediada por lipofecção ou transfecção mediada por DEAE-dextrina ou transfecção usando um vírus de fago recombinante), incubação com precipitado de fosfato de cálcio DNA, bombardeamento de alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA, e fusão de protoplastos. Técnicas gerais de transformação são conhecidas na literatura (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor, 1989; e Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação). A expressão de polipeptídio heterólogo em Trichoderma está descrita na Patente U.S.6.022.725; Patente U.S.6.268.328; Patente U.S. 7.262.041; no documento WO 2005/001036; Harkki et al.; Enzyme Mi- crob. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio Technol. 7:596-603, 1989; no documento EP 244.234; no documento EP 215.594; e Neva- lainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", em Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong & Berka, Marcel Dekker Inc., NY págs. 129 - 148, 1992, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação e expressão). Também indicamos Cao et al., (ScL 9:991-1001, 2000; EP 238023; e Yelton et al., Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 (cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação) para informações sobre a transformação de cepas de Aspergillus. Os ácidos nucleicos introduzidos podem ser integrados em DNA cromossômico ou mantidos como sequências de replicação extracromossômicas.
[00214] Qualquer método conhecido na literatura pode ser usado para selecionar transformantes. Em um exemplo não limitativo, os transformantes estáveis incluindo um marcador amdS distinguem-se dos transformantes instáveis por sua taxa de crescimento mais rápido e pela formação de colônias circulares com um contorno liso em vez de rugoso em um meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicional-mente, em alguns casos um outro teste de estabilidade é conduzido cultivando-se os transformantes em um meio não seletivo sólido (por exemplo, um meio sem a presença de acetamida), coletando-se os esporos desse meio de cultura, e determinando-se a percentagem desses esporos que subsequentemente germinam e se desenvolvem em meio seletivo contendo acetamida.
[00215] Em algumas modalidades, células fúngicas são transformadas por um processo que envolve a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos seguida de regeneração da parede celular de maneira conhecida. Em uma modalidade específica, a preparação de Trichoderma sp. para transformação envolve a preparação de protoplastos de micélios fúngicos (vide, Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação). Em algumas modalidades, os micélios são obtidos de esporos vegetativos germinativos. Os micélios são tratados com uma enzima que digere a parede celular resultando em protoplastos. Os protoplastos são então protegidos pela presença de um estabilizador osmótico no meio de suspensão. Esses estabilizadores incluem sorbitol, manitol, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, e similares. Normalmente a concentração desses estabilizadores varia entre 0,8 M e 1,2 M. É desejável usar uma solução cerca de 1,2 M de sorbitol no meio de suspensão.
[00216] A absorção de DNA na cepa de Trichoderma sp. hospedeira é dependente da concentração de íons de cálcio. Geralmente, são usados entre cerca de 10 mM de CaCh e 50 mM de CaCb em uma solução de absorção. Além dos íons de cálcio na solução de absorção, outros compostos geralmente incluídos são um sistema tamponante tal como tampão TE (10 Mm de Tris, pH 7,4; 1 mM de EDTA) ou tampão de 10 mM de MOPS, pH 6,0 (ácido morfolinopropanossulfônico) e poli- etileno glicol (PEG). Embora sem desejarmos nos ater a uma teoria particular, acreditamos que o polietileno glicol age para fundir as membranas celulares, dessa forma permitindo que o conteúdo do meio a ser distribuído no citoplasma da cepa de Trichoderma sp. e o DNA de plasmídeo sejam transferidos para o núcleo. Esta fusão frequentemente deixa múltiplas cópias do DNA de plasmídeo integrado no cromossoma do hospedeiro.
[00217] Normalmente uma suspensão contendo os protoplastos ou células de Trichoderma sp. que foram submetidos a um tratamento de permeabilidade a uma densidade de 105 a 107/mL (tal como 2 x 106/mL) são usados na transformação. Um volume de 100 pL desses protoplastos ou células em uma solução apropriada (por exemplo, 1,2 M de sorbitol e 50 mM de CaCh) são misturados com o DNA desejado. Geralmente, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplastos. Em algumas modalidades, cerca de 0,25 volumes são adicionados à suspensão de protoplastos. Aditivos tais como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio, e similares também podem ser adicionados à solução de absorção e auxiliar na transformação. Procedimentos similares encontram-se disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas (vide, por exemplo, Patente U.S.6.022.725 e Patente U.S.6.268.328, cada uma delas estando aqui incorporada em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação).
[00218] Geralmente, a mistura é então cultivada a aproximadamente 0°C por um período entre 10 e 30 minutos. Mais PEG é então adicionado à mistura para aumentar ainda mais a absorção da sequência de ácidos nucleicos desejada. O PEG 4000 a 25% geralmente é adicionado em volumes de 5 a 15 vezes o volume da mistura de transfor- mação; no entanto, volumes maiores ou menores podem ser adequados. O volume do PEG 4000 a 25% é desejavelmente cerca de 10 vezes o volume da mistura de transformação. Depois de o PEG ser adicionado, a mistura de transformação é então cultivada à temperatura ambiente ou em gelo antes da adição de uma solução de sorbitol e de CaCh. A suspensão de protoplastos é então adicionada a alíquotas derretidas de um meio de crescimento. Quando o meio de crescimento inclui ums seleção de crescimento (por exemplo, acetamida ou um antibiótico) ele permite o crescimento de transformantes apenas.
[00219] A transformação de células bacterianas pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, como descrito por Sambrook et al., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de transformação.
Meios de cultura de células exemplificativos
[00220] A invenção também inclui uma célula ou uma população de células em cultura que produzem isopreno. Por "células em cultura"entende-se duas ou mais células em uma solução (por exemplo, um meio de cultura de células) que permite que as células sofram uma ou mais divisões celulares. "Células em cultura" não incluem células vegetais que fazem parte de uma planta multicelular viva contendo células que se diferenciaram em tecidos vegetais. Em várias modalidades, a cultura de células inclui pelo menos ou cerca de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais células.
[00221] Qualquer fonte de carbono pode ser usada para cultivar as células hospedeiras. O termo "fonte de carbono"refere-se a um ou mais compostos contendo carbono capazes de serem metabolizados por uma célula hospedeira ou um orgasismo. Por exemplo, o meio de cultura de células usado para cultivar as células hospedeiras pode incluir qualquer fonte de carbono adequada para manter a viabilidade ou o crescimento das células hospedeiras.
[00222] Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um carboidrato (tal como monossacarídeo, dissacarídeo, oligossacarídeo, ou po- lissacarídeo), açúcar invertido (por exemplo, xarope de sacarose enzi- maticamente tratado), glicerol, glicerina (por exemplo, um subproduto de glicerina de um processo de produção de biodiesel ou sabão), di- hidroxiacetona, fonte de um único carbono, óleo (por exemplo, um óleo de planta ou vegetal tal como óleo de milho, de palma, ou de seoja), acetato, gordura animal, óleo animal, ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo saturado, um ácido graxo insaturado, ou um ácido graxo poli-insaturado), lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, di- glicerídeo, triglicerídeo, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídio microbiano ou vegetal), fonte de carbono renovável (por exemplo, uma fonte de carbono de biomassa tal como uma fonte de carbono de biomassa hidrolisada), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, polímero, ácido, álcool, aldeído, cetona, ami- noácido, succinato, lactato, acetato, etanol, ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens acima. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um produto da fotossíntese, incluindo, porém sem limitação, glicose. Em algumas modalidades, o carboidrato é xilose ou glicose.
[00223] Monossacarídeos exemplificativos incluem glicose e frutose; oligossacarídeos exemplificativos incluem lactose e sacarose, polissa- carídeos exemplificativos incluem amido e celulose, carboidratos exemplificativos incluem açúcares C-6 (por exemplo, frutose, manose, galactose, ou glicose) e açúcares C-5 (por exemplo, xilose ou arabinose). Em algumas modalidades, o meio de cultura de células inclui um carboidrato assim como uma fonte de carbono diferente de carboidrato (por exemplo, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um único carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, ou um componente de um extrato de levedura). Em algumas modalidades, o meio de cultura de células inclui um carboidrato assim como um polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou pep- tídio microbiano ou vegetal). Em algumas modalidades, o polipeptídio microbiano é um polipeptídio de levedura ou de bactéria. Em algumas modalidades, o polipeptídio vegetal é um polipeptídio de soja, milho, canola, jatropha, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, semente de colza, semente de algodão, semente de palma, azeitona, açafrão, germelim, ou semente de linhaça.
[00224] Em algumas modalidades, a concentração do carboidrato é pelo menos ou cerca de 5 gramas por litro de caldo (g/L, onde o volume do caldo inclui tanto o volume do meio de cultura de células como o volume das células), tal como pelo menos ou cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração do carboidrato varia entre cerca de 50 e cerca de 400 g/L, tal como entre cerca de 100 e cerca de 360 g/L, entre cerca de 120 e cerca de 360 g/L, ou entre cerca de 200 e cerca de 300 g/L. Em algumas modalidades, esta concentração de carboidrato inclui a quantidade total de carboidrato que é adicionado antes e/ou durante a cultura das células hospedeiras.
[00225] Lipídios exemplificativos são qualquer substância contendo um ou mais ácidos que são ácidos graxos C-4 ou superiores que são saturados, insaturados, ou ramificados.
[00226] Óleos exemplificativos são lipídios que são líquidos à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o lipídio contém um ou mais ácidos graxos C-4 ou superiores (por exemplo, contém um ou mais ácidos graxos saturados, insaturados, ou ramificados com quatro ou mais carbonos). Em algumas modalidades, o óleo é obtido de soja, milho, canola, jatropha, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, semente de colza, semente de algodão, semente de palma, azeitona, açafrão, gergelim, semente de linhaça, células microbianas oleaginosas, árvore do sebo chinesa ("Chinese tallow"), ou qualquer combina- ção de dois ou mais dos itens acima.
[00227] Ácidos graxos exemplificativos incluem compostos da fórmula RCOOH, onde "R" é um hidrocarboneto. Ácidos graxos insatura- dos exemplificativos incluem compostos onde "R" inclui pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Ácidos graxos insaturados exemplificativos incluem, porém sem limitação, ácido oleico, ácido vaccêni- co, ácido linoleico, ácido palmitolaídico, e ácido araquidônico. Ácidos graxos poli-insaturados exemplificativos incluem compostos onde "R" inclui uma pluralidade de ligações duplas carbono-carbono. Ácidos graxos saturados exemplificativos incluem compostos onde "R" é um grupo alifático saturado. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui um ou mais C12-C22 ácidos graxos, tal como um C12 ácido graxo saturado, um C14 ácido graxo saturado, um Cw ácido graxo saturado, um C18 ácido graxo saturado, um C20 ácido graxo saturado, um C22 ácido graxo saturado. Em uma modalidade exemplificativa, 0 ácido graxo é ácido palmítico. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um sal de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado), um derivado de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado), ou um sal de um derivado de ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado). Sais adequados incluem, porém sem limitação, sais de lítio, sais de potássio, sais de sódio, e similares. Digliceróis e trigliceróis são ésteres de ácido graxo de glicerol.
[00228] Em algumas modalidades, a concentração do lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo é pelo menos ou cerca de 1 grama por litro de caldo (g/L, onde 0 volume do caldo inclui tanto 0 volume do meio de cultura de células como 0 volume das células), tal como pelo menos ou cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração do lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo varia entre cerca de 10 e cerca de 400 g/L, tal como entre cerca de 25 e cerca de 300 g/L, entre cerca de 60 e cerca de 180 g/L, ou entre cerca de 75 e cerca de 150 g/L. Em algumas modalidades, a concentração inclui a quantidade total do lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo que é adicionada antes e/ou durante a cultura das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui (i) um lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, or triglicerídeo e (ii) um carboidrato, tal como glicose. Em algumas modalidades, a proporção do lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo para o carboidrato é de cerca de 1: 1 com base nos carbonos (isto é, um carbono no lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo por carbono do carboidrato). Em modalidades particulares, a quantidade do lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo varia entre cerca de 60 e 180 g/L, e a quantidade dos carboidratos varia entre cerca de 120 e 360 g/L.
[00229] Fontes de carbono de polipeptídios microbianos exemplifi- cativas incluem um ou mais polipeptídios de levedura ou de bactéria. Fontes de carbono de polipeptídios vegetais exemplificativas incluem um ou mais polipeptídios de soja, milho, canola, jatropha, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, semente de colza, semente de algodão, semente de palma, azeitona, açafrão, gergelim, ou semente de linhaça.
[00230] Fontes de carbono renováveis exemplificativas incluem permeato de soro de queijo, licor de infusão de milho, melaços de beterraba, malte de cevada, e componentes de qualquer um dos itens acima. Fontes de carbão renováveis exemplifiativas também incluem acetato, glicose, hexose, pentose e xilose presente na biomassa, tal como, milho, Panicum virgatum ("switchgrass"), cana-de-açúcar, despejos celulares de processos de fermentação, e subprodutos proteicos da moagem de soja, milho, ou trigo. Em algumas modalidades, a fonte de carbono de biomassa é um material lignocelulósico, hemicelulósico, ou celulósico tal como, porém sem limitação, grama, trigo, pala de trigo, bagaço, bagaço de cana-de-açúcar, polpa de madeira mole, milho, sabugo ou palha de milho, semente de milho, fibra de sementes de milho, palha de milho, Panicum virgatum ("switchgrass"), produto da casca de arroz, ou um subproduto da moagem por via úmida ou seca de grãos (por exemplo, milho, sorgo, centeio, triticale, cevada trigo, e/ou grãos de destilados). Materiais celulósicos exemplificativos incluem madeira, papel e refugo de polpa, plantas herbáceas, e polpa de frutas. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui qualquer parte de planta, tal como caules, grãos, raízes, ou tubérculos. Em algumas modalidades, todas ou parte de qualquer uma das plantas a seguir são usadas como uma fonte de carbono: milho, trigo, centeio, sorgo, triticale, arroz, milhete, cevada, mandioca, legumes, tais como feijões e ervilhas, batatas, batatas-doce, bananas, cana-de-açúcar, e/ou tapioca. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um hidrolisado de biomassa, tal como um hidrolisado de biomassa que inclui xilose e glicose ou que inclui sacarose e glicose.
[00231] Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável (tais como biomassa) é pré-tratada antes de ser adicionada ao meio de cultura de células. Em algumas modalidades, o pré-tratamento inclui pré-tratamento enzimático, pré-tratamento químico, ou uma combinação de pré-tratamento enzimático e químico (vide, por exemplo, Far- zaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; Patente US N° 6.176.176; Patente US N° 6.106.888; cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito ao pré-tratamento de fontes de carbono re-nováveis). Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável é parcialmente ou completamente hidrolisada antes de ser adicionada ao meio de cultura de células.
[00232] Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável (tal como palha de milho) sofre pré-tratamento com expansão de fibras de amónia (AFEX) antes de ser adicionada ao meio de cultura de células (vide, por exemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014- 2018, 2005). Durante o pré-tratamento AFEX, uma fonte de carbono renovável é tratada com amónia anidra líquida a temperaturas moderadas (tal como cerca de 60 a cerca de 100°C) e alta pressão (tal como cerca de 1,72 a cerca de 2,07 MPa (250 a cerca de 300 psi)) por cerca de 5 minutos. Em seguida, a pressão é rapidamente liberada. Neste processo, os efeitos químicos e físicos combinados da solubili- zação de lignina, hidrólise de hemicelulose, descristalização de celulose, e área superficial aumentada permite a conversão enzimática quase completa da celulose e da hemicelulose em açúcares fermenatá- veis. O pré-tratamento AFEX apresenta a vantagem de que quase toda a amónia pode ser recuperada e reutilizada, ao passo que o restante serve como fontes de nitrogênio para micróbios em processos descendentes. Também, uma corrente de lavagem para o pré-tratamento AFEX não é necessária. Assim, a recuperação da matéria seca subsequente ao tratamento com AFEX é de essencialmente 100%. AFEX é basicamente um processo seco a seco. A fonte de carbono renovável tratada é estável por longos períodos e pode ser introduzida a cargas com teor de sólidos muito alto em processos de hidrólise enzimática ou processos de fermentação. A celulose a hemicelulose são bem preservadas com o processo AFEX, com pouca ou nenhuma degradação. Não é necessária a neutralização antes da hidrólise enzimática de uma fonte de carbono renovável que sofrera pré-tratamento AFEX. A hidrólise enzimática de fontes de carbono tratadas com AFEX produz correntes de açúcar limpas para uso subsequente em fermentação.
[00233] Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a pelo menos ou cerca de 0,1, 0,5, 1, 1,5 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, ou 50% de glicose (p/v). A quantidade equivalente de glicose pode ser determinada usando-se métodos tradicionais de HPLC com glicose como uma referência para medir a quantidade de glicose gerada a partir da fonte de carbono. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a entre cerca de 0,1 e cerca de 20% de glicose, tal como entre cerca de 0,1 e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 0,5 e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 1 e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 1 e cerca de 5% de glicose, ou entre cerca de 1 e cerca de 2% de glicose.
[00234] Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui extrato de levedura ou um ou mais componentes de extrato de levedura. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura é de pelo menos 1 grama of extrato de levedura por litro de caldo (g/L, onde o volume do caldo inclui tanto o volume do meio de cultura de células como o volume das células), tal como pelo menos ou cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura varia entre cerca de 1 e cerca de 300 g/L, tal como entre cerca de 1 e cerca de 200 g/L, entre cerca de 5 e cerca de 200 g/L, entre cerca de 5 e cerca de 100 g/L, ou entre cerca de 5 e cerca de 60 g/L. Em algumas modalidades, a concentração inclui a quantidade total de extrato de levedura que é adicionada antes e/ou durante a cultura das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui extrato de levedura (ou um ou mais componentes do mesmo) e uma outra fonte de carbono, tal como glicose. Em algumas modalidades, a proporção de extrato de levedura para a outra fonte de carbono é de cerca de 1:5, cerca de 1:10, ou cerca de 1:20 (p/p).
[00235] Adicionalmente a fonte de carbono também ser substratos de um só carbono tais como dióxido de carbono, ou metanol. A produção de glicerol a partir de fontes de um só carbono (por exemplo, metanol, formaldeído, ou formiato) foi relatada em leveduras metilotróficas (Yamada et al., Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a fontes de carbono) e em bactérias (Hunter et al., Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a fontes de carbono). Esses organismos podem assimilar compostos de um só carbono, variando em termos do estado de oxidação de metano a formiato, e produzem glicerol. A via de assimilação de carbono pode ser através do ribulose monofosfato, através da serina, ou através do xilulose-momofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer- Verlag: New York, 1986, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a fontes de carbono). A via de ribulose monofosfato envolve a condensação de formiato com ribulose-5-fosfato para formar um açúcar de seis carbonos que se transforma em frutose e eventualmente no produto de três carbonos gliceraldeído-3-fosfato. Da mesma forma, a via de serina assimila o composto de um só carbono na via glicolítica por meio do metilenotetra-hidrofolato.
[00236] Além dos substratos de um e de dois carbonos, também se sabe que organismos metilotróficos utilizam inúmeros outros compostos contendo carbono tais como metilamina, glucosamina e uma variedade de aminoácidos para atividade metabólica. Por exemplo, sabemos que a levedura metilotrófica utiliza o carbono da metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7thed., 415-32. Editors: Murrell et al., Publisher: Intercept, Andover, UK, 1993, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a fontes de carbono). Similarmente, várias espécies de Candida metabolizam ala- nina ou ácido oleico (Suiter et al., Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a fontes de carbono).
[00237] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio tradicional contendo sais fisiológicos e nutrientes (vide, por exemplo, Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al., Academic Press, págs. 71-86, 1988 e Ilmen et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997, cada urn deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a meios de cultura de células). Meios de crescimento exemplificativos são meios comercialmente preparados comuns tais como caldo de Luria Bertani (LB), caldo de Sa- bouraud Dextrose (SD), ou caldo de meio de levedura (YM). Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser usados, e o meio apropriado para o crescimento de células hospedeiras particulares é conhecido pelo versado na técnica de microbiologia ou ciência da fermentação.
[00238] Além de uma fonte de carbono apropriada, o meio de cultura de células desejavelmente contém minerais adequados, sais, cofato- res, tampões, e outros componentes conhecidos pelos versados na técnica adequados para o crescimento das culturas ou para o aumento da produção de isopreno (vide, por exemplo, o documento WO 2004/033646 e referências ali citadas e o documento WO 96/35796 e referências ali citadas, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a meios de cultura de células e a condições de cultura de células). Em algumas modalidades em que um ácido nucleico de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA está sob o controle de um promotor induzível, o agente indutor (por exemplo, um açúcar, um sal metálico ou um antimicrobiano) é desejavelmente adicionado ao meio a uma concentração eficaz para induzir a expressão de um polipeptídio de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou da via de MVA. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células tem um antibiótico (tal como ca- namicina) que corresponde ao ácido nucleico de resistência a antibióticos (tais como um ácido nucleico de resistência à canamicina) em um vetor que tem um ou mais ácidos nucleicos de DXS, IDI, ou da via de MVA.
Condições exemplificativas de cultura de células
[00239] Materiais e métodos adequados para a manutenção e o crescimento de culturas bacterianas são bastante conhecidos na literatura. Técnicas exemplificativas podem ser encontradas em Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) ou Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Si- nauer Associates, Inc., Sunderland, MA, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito à técnicas de cultura de células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meios de cultura em condições que permitem a expressão de um ou mais polipeptídios de isopreno sintase, DXS, IDI, ou da via de MVA codificados por um ácido nucleico inserido nas células hospedeiras.
[00240] Condições padrão de cultura de células podem ser usadas para a cultura das células (vide, por exemplo, WO 2004/033646 e referências ali citadas, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a condições de cultura de células e de fermentação). As células são cultivadas e mantidas a uma temperatura, em uma mistura gasosa, e a um pH (tal como cerca de 20 a cerca de 37°C, em cerca de 6% a cerca de 84% de CO2, e a um pH entre cerca de 5 e cerca de 9) apropriados. Em algumas modalidades, as células são cultivadas a 35°C em um meio de cultura de células apropriado. Em algumas modalidades, por exemplo, as culturas são cultivadas a aproximadamente 28°C em um meio apropriado em culturas ou fermentadores oscilantes até que seja atingida a quantidade desejada de produção de isopreno. Em algumas modalidades, as faixas de pH para fermentação variam entre cerca de pH 5,0 a cerca de pH 9,0 (tai como cerca de pH 6,0 a cerca de pH 8,0 ou cerca de 6,5 a cerca de 7,0). As reações podem ser realizadas em condições aeróbicas, anóxicas, ou anaeróbicas com nas necessidades das células hospedeiras. Condições de cultura exemplificativas para um dado fungo filamentoso são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou a partir da fonte dos fungos tal como o American Type Culture Collection e o Fungal Genetics Stock Center.
[00241] Em várias modalidades, as células são cultivadas usando qualquer modo de fermentação conhecido, tal como processos intermitentes, processos com alimentação intermitente, processos ou contínuos Em algumas modalidades, um método de fermentação intermitente é usado. A fermentação intermitente clássica é um sistema fechado onde a composição do meio é fixada no início da fermentação e não é submetida a alterações artificiais durante a fermentação. Assim sendo, no início da fermentação o meio de cultura de células é inoculada com as células hospedeiras desejadas e deixa-se a fermentação ocorrer sem qualquer tipo de adição ao sistema. Tipicamente, no entanto, a fermentação "intermitente" é intermitente em relação à adição da fonte de carbono e frequentemente são feitas tentativas de controlar fatores tais como o pH e a concentração de oxigênio. Nos sistemas intermitentes, as composições de metabólito e de biomassa do sistema são constantemente trocadas até que seja interrompido o período de fermentação.Em culturas intermitentes, as células moderam a partir de uma fase lag estática até uma fase log de grande crescimento e finalmente até uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Em algumas modalidades, as células na fase log são responsáveis pelo volume de produção de isopreno. Em algumas modalidades, as células na fase estacionária produzem isopreno.
[00242] Em algumas modalidades, é usada uma variação do sistema intermitente tradicional, tal como o sistema com alimentação inter- mitente. Os processos de fermentação com alimentação intermitente compreendem um sistema intermitente típico com exceção de que a fonte de carbono é adicionada em incrementos à medida que a fermentação avança. Sistemas com alimentação intermitente são úteis quando a repressão de catabólito está apta a inibir o metabolismo das células e onde são desejáveis quantidades limitadas da fonte de carbono no meio de cultura de células. As fermentações com alimentação intermitente podem ser realizadas com a fonte de carbono (por exemplo, glicose) em uma quantidade limitada ou excessiva. A medição da concentração real da fonte de carbono em sistemas com alimentação intermitente é difícil e portanto ela é estimada com base nas alterações de fatores mensuráveis tais como o pH, o oxigênio dissolvido, e a pressão parcial de gases perdidos tais como CO2. As fermentações intermitentes e com alimentação intermitente são comuns e bastante conhecidas na literatura e exemplos podem ser encontrados em Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a condições de cultura de células e de fermentação.
[00243] Em algumas modalidades, métodos de fermentação contínua são usados. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é continuamente adicionado a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. A fermentação contínua geralmente as culturas a uma densidade alta e constante onde as células estão principalmente na fase log de crescimento.
[00244] A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam 0 crescimento das células ou a produção de isopreno. Por exemplo, um método mantém um determinado nutriente tal como a fonte de carbono ou 0 nível de nitrogénio a uma taxa fixa e permite que todos os parâmetros moderem. Em outros sistemas, inúmeros fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto que a concentração celular (por exemplo, a concentração medida pela turvação do meio) é mantida constante. Os sistemas contínuos esforçam-se para manter condições de crescimento em estado estacionário. Assim, a perda de células devido à remoção do meio é equilibrada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos para modular os nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bastante co-nhecidos na literatura de microbiologia industrial e uma variedade de métodos estão detalhados por Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a condições de cultura de células e de fermentação.
[00245] Em algumas modalidades, as células são imobilizadas em um substrato como catalisadores de células integrais e submetidas a condições de fermentação para produção de isopreno.
[00246] Em algumas modalidades, frascos de cultura líquida são colocados em agitadores para introduzir oxigênio no líquido e manter a uniformidade da cultura. Em algumas modalidades, uma incubadora é usada controlar a temperatura, a umidade, a velocidade de oscilação, e/ou outras condições nas quais uma cultura é desenvolvida. As incubadoras mais simples são caixas isoladas com um aquecedor ajustá- vel, tipicamente chegando a -65°C. Incubadoras mais elaboradas também podem incluir a capacidade para abaixar a temperatura (via refrigeração), ou a capacidade para controlar a umidade ou os níveis de CO2. A maioria das incubadoras incluem um timer; algumas também podem ser programadas em ciclos através de diferentes temperaturas, níveis de umidade etc. As incubadoras podem variar em tamanho desde aquelas para uso em bancada a unidades do tamanho de pequenas salas.
[00247] Se desejado, uma porção ou todo o meio de cultura de células pode ser trocado para reposição de nutrientes e/ou para evitar o acúmulo de subprodutos metabólicos potencialmente nocivos e células mortas. No caso de culturas em suspensão, as células podem ser separadas do meio por centrifugação ou filtração da cultura em suspensão e em seguida ressuspensão das células em meio fresco. No caso de culturas aderentes, o meio pode ser removido diretamente por aspiração e substituído. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células permite que pelo menos uma porção das células se dividam por pelo menos ou cerca de 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura contínua sem diluição).
[00248] Em algumas modalidades, um promotor constitutivo ou permeável (tal como um promotor Trc) é usado e um composto (tal como IPTG) não é adicionado para induzir a expressão dos ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA operacionalmente ligados ao promotor. Em algumas modalidades, um composto (tal como IPTG) é adicionado para induzir a expressão dos ácidos nu-cleicos de isopreno sintase, DXS, DDI, ou da via de MVA operacionalmente ligados ao promotor.
Produção de isopreno exemplificativa
[00249] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura em condições que permitem a produção de isopreno pelas células. Por "produtividade absoluta máxima"entende-se a quantidade absoluta máxima de isopreno nos gases desprendidos durante a cultura de culturas por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada particular de fermentação). Por "momento de produtividade absoluta máxima"entende-se o momento durante uma rodada de fermentação em que a quantidade absoluta de isopreno no gás desprendido está em um máximo durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no momento de produtividade absoluta máxima. Em algumas modalidades, a produtividade absoluta máxima para as células é de cerca de qualquer uma das quantidades de isopreno descritas nesta invenção.
[00250] Por "produtividade específica máxima"entende-se a quantidade máxima de isopreno produzido por célula durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular). Por "momento de produtividade específica máxima"entende-se o momento durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular) em que a quantidade de isopreno produzido por célula está em um máximo. A produtividade específica máxima é determinada dividindo-se a produtividade total pela quantidade de células, determinada pela densidade ótica a 600nm (ODeoo). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no momento de produtividade específica máxima. Em algumas modalidades, a produtividade específica máxima para as células é de cerca de qualquer uma das quantidades de isopreno descritas nesta invenção.
[00251] Por "produtividade volumétrica máxima" entende a quantidade máxima de isopreno produzido por volume de caldo (incluindo o volume das células e do meio de cultura de células) durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular). Por "momento de produtividade volumétrica específica máxima"entende-se o momento durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fer-mentação particular) em que a quantidade de isopreno produzido por volume de caldo está em um máximo. A produtividade volumétrica es- pecífica máxima é determinada dividindo-se a produtividade total pelo volume de caldo e a quantidade de tempo.Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no momento de produtividade volumétrica específica máxima. Em algumas modalidades, a produtividade volumétrica específica máxima para as células é de cerca de qualquer uma das quantidades de isopreno por volume por tempo descritas nesta invenção.
[00252] Por "concentração máxima" entende-se a quantidade máxima de isopreno produzido durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular). Por "momento de concentração máxima" entende-se o momento durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular) em que a quantidade de isopreno produzido por célula está em um máximo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no momento de concentração máxima. Em algumas modalidades, a concentração máxima para as células é de cerca de qualquer uma das quantidades de isopreno descritas nesta invenção.
[00253] Por "produtividade volumétrica média" entende-se a quantidade média de isopreno produzido por volume de caldo (incluindo o volume das células e do meio de cultura de células) durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular). A produtividade volumétrica média é determinada dividindo-se a produtividade total pelo volume de caldo e quantidade de tempo. Em algumas moda-lidades, a produtividade volumétrica específica média para as células é de cerca de qualquer uma das quantidades de isopreno por volume por tempo descritas nesta invenção.
[00254] Por "produtividade total cumulativa" entende-se a quantidade total cumulativa de isopreno produzido durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma rodada de fermentação particular). Em algumas modalidades, a quantidade total cumulativa de isopreno é medida. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa para as células é de cerca de qualquer uma das quantidades de isopreno descritas nesta invenção.
[00255] Em algumas modalidades, as células em cultura produzem isopreno de mais de ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 12.500, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 75.000, 100.000, 125.000, 150.000, 188.000, ou mais nmoles de isopreno/grama de células para o peso molhado das células/hora (nrnoles/gwcm/hora). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno varia entre cerca de 2 a cerca de 200.000 nrnoles/gWcm/hora, tal como entre cerca de 2 e cerca de 100 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 100 e cerca de 500 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 150 e cerca de 500 nmo- les/gwcm /hora, cerca de 500 e cerca de 1.000 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 1.000 e cerca de 2.000 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 2.000 e cerca de 5.000 nrnoles/gwcm/hora, cerca de 5.000 e cerca de 10.000 nmo- les/gWcm/hora, cerca de 10.000 e cerca de 50.000 nrnoles/gwcm/hora, cerca de 50.000 e cerca de 100.000 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 100.000 e cerca de 150.000 nrnoles/gWcm/hora, ou cerca de 150.000 e cerca de 200.000 nrnoles/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno varia entre cerca de 20 e cerca de 200.000 nrnoles/gwcm/hora, cerca de 100 e cerca de 5.000 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 200 e cerca de 2.000 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 200 e cerca de 1.000 nmoles/gwcp/hora, cerca de 300 e cerca de 1.000 nmo- les/gwcm/hora, cerca de 400 e cerca de 1.000 nrnoles/gwcm/hora, cerca de 1.000 e cerca de 5.000 nmoles/gWCm/hora, cerca de 2.000 e cerca de 20.000 nrnoles/gwcm/hora, cerca de 5.000 e cerca de 50.000 nmo- les/gWcm/hora, cerca de 10.000 e cerca de 100.000 nrnoles/gWcm/hora, cerca de 20.000 e cerca de 150.000 nmoles/gWcm/hora, ou cerca de 20.000 e cerca de 200.000 nmoles/gWCm/hora.
[00256] A quantidade de isopreno em unidades de nmoles/gWcm/hora pode ser medida da maneira descrita na Patente U.S.5.849.970, que está aqui incorporada em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito à medição da produção de isopreno. Por exemplo, dois ml_ de headspace (por exemplo, o headspace de uma cultura tal como 2 ml_ de cultura cultivada em frascos vedados a 32°C com agitação a aproximadamente 200 rpm por aproximadamente 3 horas) são analisados quanto à quantidade de isopreno usando um sistema de cromatografia gasosa tradicional, tal como um sistema operado isotermicamente (85°C) com uma coluna de n-octano/porasil C (All- tech Associates, Inc., Deerfield, III.) e acoplado a um detector de gás de redução de óxido mercúrico RGD2 (Trace Analytical, Menlo Park, CA) (vide, por exemplo, Greenberg et al., Atmos. Environ. 21 A: 2689- 2692, 1993; Silver et al., Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito à medição da produção de isopreno). As unidades de área de cromatografia gasosa são convertidas em nmol de isopreno via uma curva de calibração da concentração de isopreno padrão. Em algumas modalidades, o valor para os gramas de células para o peso molhado das células é calculado obtendo-se o valor de Aeoo para uma amostra da cultura de células, e em seguida con- vertendo-se o valor de Aeoo em gramas de células com base em uma curva de calibração de pesos molhados para culturas de células com um valor de Aeoo conhecido. Em algumas modalidades, os gramas das células são estimados assumindo-se que um litro de caldo (incluindo meio de cultura de células e células) com um valor de Aeoo igual a 1 tem um peso molhado das células de 1 grama. O valor também é dividido pelo número de horas que a cultura fora incubada, tal como três horas.
[00257] Em algumas modalidades, as células na cultura produzem isopreno de mais de ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, ou mais ng de isopre- no/grama de células para o peso molhado das células/hora (ng/gWCm/h). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno varia entre cerca de 2 e cerca de 5.000 ng/gWCm/h, tal como entre cerca de 2 e cerca de 100 ng/gwcm/h, cerca de 100 e cerca de 500 ng/gWCm/h, cerca de 500 e cerca de 1.000 ng/gWCm/h, cerca de 1.000 e cerca de 2.000 ng/gWCm/h, ou cerca de 2.000 e cerca de 5.000 ng/gWCm/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno varia entre cerca de 20 e cerca de 5.000 ng/gwcm/h, cerca de 100 e cerca de 5.000 ng/gWCm/h, cerca de 200 e cerca de 2.000 ng/gWCm/h, cerca de 200 e cerca de 1.000 ng/gWCm/h, cerca de 300 e cerca de 1.000 ng/gWCm/h, ou cerca de 400 e cerca de 1.000 ng/gwcm/h. A quantidade de isopreno em ng/gWCm/h pode ser calculada multiplicando-se o valor para a produção de isopreno nas unidades de nrnoles/gwcm/hora discutidas acima por 68,1 (como descrito na Equação 5 abaixo).
[00258] Em algumas modalidades, as células na cultura produzem um título cumulativo (quantidade total) de isopreno de mais de ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaido, onde o volume do caldo inclui o volume das células e do meio de cultura de células). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno varia entre cerca de 2 e cerca de 5.000 mg/Lcaido, tal como entre cerca de 2 e cerca de 100 mg/Lbroth, cerca de 100 e cerca de 500 mg/Lbroth, cerca de 500 e cerca de 1.000 mg/Lcaido, cerca de 1.000 e cerca de 2.000 mg/ Lcaido, ou cerca de 2.000 e cerca de 5.000 mg/ Lcaido. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno varia entre cerca de 20 e cerca de 5.000 mg/ Lcaido, cerca de 100 e cerca de 5.000 mg/ Lcaido, cerca de 200 e cerca de 2.000 mg/ Lcaido, cerca de 200 e cerca de 1.000 mg/ Lcaido, cerca de 300 e cerca de 1.000 mg/ Lcaido, ou cerca de 400 e cerca de 1.000 mg/ Lcaido.
[00259] A produtividade específica de isopreno em mg de isopre- no/L de headspace do balão oscilante ou culturas similares pode ser medida coletando um 1 ml de amostra da cultura de células a um valor de ODeoo de aproximadamente 1,0, colocando-se a mesma em um frasco de 20 mL, incubando-se por 30 minutos, e em seguida medindo- se a quantidade de isopreno no headspace (da maneira descrita, por exemplo, no Exemplo I, parte II). Se o valor de ODeoo não for 1,0, então a medida pode ser normalizada para um valor de ODeoo igual 1,0 dividindo-se o valor de ODeoo. O valor de mg de isopreno/L de headspace pode ser convertido em mg/Lcaido/hora/ODeoo de caldo de cultura multi- plicando-se por um fator de 38. O valor em unidades de mg/Lcaido/hora/ODeoo pode ser multiplicado pelo número de horas e o valor de ODeoo para obter o título cumulativo em unidades de mg de isopreno/L de caldo.
[00260] Em algumas modalidades, as células em cultura têm uma produtividade volumétrica média de isopreno de mais de ou cerca de 0,1, 1,0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1100, 1200, 1300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, ou mais mg de isopreno/L de caldo/hora (mg/Lcaido/hora, onde o volume do caldo inclui o volume das células e do meio de cultura de células). Em algumas modalidades, a produtividade volumétrica média de isopreno varia entre cerca de 0,1 e cerca de 3.500 mg/LcaidO/hora, tal como entre cerca de 0,1 e cerca de 100 mg/Lcaido/hora, cerca de 100 e cerca de 500 mg/Lcaido/hora, cerca de 500 e cerca de 1.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 1.000 e cerca de 1.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 1.500 e cerca de 2.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 2.000 e cerca de 2.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 2.500 e cerca de 3.000 mg/Lcaido/hora, ou cerca de 3.000 e cerca de 3.500 mg/Lcaido/hora. Em algumas modalidades, a produtividade volumétrica média de isopreno varia entre cerca de 10 e cerca de 3.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 100 e cerca de 3.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 200 e cerca de 1.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 200 e cerca de 1.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 1.000 e cerca de 3.000 mg/Uaido/hora, ou cerca de 1.500 e cerca de 3.000 mg/Lcaido/hora.
[00261] Em algumas modalidades, as células em cultura have uma produtividade volumétrica máxima de isopreno de mais de ou cerca de 0,5, 1,0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1100, 1200, 1300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.750, 4.000, 4.250, 4.500, 4.750, 5.000, 5.250, 5.500, 5.750, 6.000, 6.250, 6.500, 6.750, 7.000, 7.250, 7.500, 7.750, 8.000, 8.250, 8.500, 8.750, 9.000, 9.250, 9.500, 9.750, 10.000, 12.500, 15.000, ou mais mg de isopreno/L de cal- do/hora onde o volume do caldo inclui o volume das células e do meio de cultura de células). Em algumas modalidades, a produtividade volumétrica máxima de isopreno varia entre cerca de 0,5 e cerca de 15.000 mg/Lcaido/hora, tal como entre cerca de 0,5 e cerca de 10 mg/Lcaido/hora, cerca de 1,0 e cerca de 100 mg/Lcaido/hora, cerca de 100 e cerca de 500 mg/Lcaido/hora, cerca de 500 e cerca de 1.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 1.000 e cerca de 1.500 mg/Uaido/hora, cerca de 1.500 e cerca de 2.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 2.000 e cerca de 2.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 2.500 e cerca de 3.000 mg/Uaido/hora, cerca de 3.000 e cerca de 3.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 3.500 e cerca de 5.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 5.000 e cerca de 7.500 mg/Uaido/hora, cerca de 7.500 e cerca de 10.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 10.000 e cerca de 12.500 mg/Lcaido/hora, ou cerca de 12.500 e cerca de 15.000 mg/Lcaido/hora. Em algumas modalidades, a produtividade volumétrica máxima de isopreno varia entre cerca de 10 e cerca de 15.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 100 e cerca de 2.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 1.000 e cerca de 5.000 mg/Lcaido/hora, cerca de 2.500 e cerca de 7.500 mg/Lcaido/hora, cerca de 5.000 e cerca de 10.000 mg/LcaidO/hora, cerca de 7.500 e cerca de 12.500 mg/Lcaido/hora, ou cerca de 10.000 e cerca de 15.000 mg/Lcaido/hora.
[00262] A taxa de produção instantânea de isopreno em mg/Lcaido/hora em um fermentador pode ser medida coletando-se uma amostra do gás desprendido do fermentador, analisando-se o mesmo quanto à quantidade de isopreno (em unidades tais como mg de isopreno per Lgas) da maneira descrita, por exemplo, no Exemplo I, parte II e multiplicando-se este valor pela taxa à qual o gás desprendido é passado através de cada litro de caldo (por exemplo, a 1 vvm (volume de ar/volume de caldo/minuto) esta taxa é de 60 Lgas por hora). Assim, um nível de gás desprendido igual a 1 mg/Lgas corresponde a uma taxa de produção instantânea de 60 mg/LcaidO/hora a um fluxo de ar de 1 vvm. Se desejado, o valor nas unidades mg/LcaidO/hora pode ser dividido pelo valor de ODeoo para obter a taxa específica em unidades de mg/Lcaido/hora/OD. O valor médio de mg isopreno/Lgas pode ser convertido na produtividade total de produto (gramas de isopreno por litro de caldo de fermentação, mg/Lcaido) multiplicando-se esta concentração média de isopreno no gás desprendido pela quantidade total de gás desprendido borrifado por litro de caldo de fermentação durante a fermentação. Assim, uma concentração média de isopreno no gás desprendido de 0,5 mg/Lcaido/hora durante 10 horas a 1 vvm corresponde a uma concentração total de produto de 300 mg isopreno/LcaidO.
[00263] Em algumas modalidades, as células em cultura convertem mais de ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 23,2, 23,4, 23,6, 23,8, 24,0, 25,0, 30,0, 31,0, 32,0, 33,0, 35,0, 37,5, 40,0, 45,0, 47,5, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, ou 90,0 % molar do carbono no meio de cultura de células em isopreno. Em algumas modalidades, a percentagem de conversãao de carbono em isopreno varia entre cerca de 0,002 e cerca de 90,0 molar %, tal como cerca de 0,002 e cerca de 0,005%, cerca de 0,005 e cerca de 0,01%, cerca de 0,01 e cerca de 0,05%, cerca de 0,05 e cerca de 0,15%, 0,15 e cerca de 0,2%, cerca de 0,2 e cerca de 0,3%, cerca de 0,3 e cerca de 0,5%, cerca de 0,5 e cerca de 0,8%, cerca de 0,8 e cerca de 1,0%, cerca de 1,0 e cerca de 1,6%, cerca de 1,6 e cerca de 3,0%, cerca de 3,0 e cerca de 5,0%, cerca de 5,0 e cerca de 8,0%, cerca de 8,0 e cerca de 10,0%, cerca de 10,0 e cerca de 15,0%, cerca de 15,0 e cerca de 20,0%, cerca de 20,0 e cerca de 25,0%, cerca de 25,0% a 30,0%, cerca de 30,0% a 35,0%, cerca de 35,0% a 40,0%, cerca de 45,0% a 50,0%, cerca de 50,0% a 55,0%, cerca de 55,0% a 60,0%, cerca de 60,0% a 65,0%, cerca de 65,0% a 70,0%, cerca de 75,0% a 80,0%, cerca de 80,0% a 85,0%, ou cerca de 85,0% a 90,0%. Em algumas modalidades, a percentagem de conversão de carbono em isopreno varia entre cerca de 0,002 e cerca de 0,4 % molar, 0,002 e cerca de 0,16 % molar, 0,04 e cerca de 0,16 % molar, cerca de 0,005 e cerca de 0,3 % molar, cerca de 0,01 e cerca de 0,3 % molar, cerca de 0,05 e cerca de 0,3 % molar, cerca de 0,1 to 0,3 % molar, cerca de 0,3 e cerca de 1,0 % molar, cerca de 1,0 e cerca de 5,0 % molar, cerca de 2 e cerca de 5,0 % molar, cerca de 5,0 e cerca de 10,0 % molar, cerca de 7 e cerca de 10,0 % molar, cerca de 10,0 e cerca de 20,0 % molar, cerca de 12 e cerca de 20,0 % molar, cerca de 16 e cerca de 20,0 % molar, cerca de 18 e cerca de 20,0 % molar, cerca de 18 e 23,2 % mo-lar, cerca de 18 e 23,6 % molar, cerca de 18 e cerca de 23,8 % molar, cerca de 18 e cerca de 24,0 % molar, cerca de 18 e cerca de 25,0 % molar, cerca de 20 e cerca de 30,0 % molar, cerca de 30 e cerca de 40,0 % molar, cerca de 30 e cerca de 50,0 % molar, cerca de 30 e cerca de 60,0 % molar, cerca de 30 e cerca de 70,0 % molar, cerca de 30 e cerca de 80,0 % molar, ou cerca de 30 e cerca de 90,0 % molar.
[00264] A percentagem de conversão de carbono em isopreno (também denominada "% de rendimento de carbono") pode ser medida dividindo-se os moles de carbono no isopreno produzido pelos moles de carbono na fonte de carbono (tal como os moles de carbono na glicose e extrato de levedura produzida e alimentada). Este número é multiplicado por 100% para dar o valor percentual (como indicado na Equação 1). Equação 1
Figure img0004
[00265] Para este cálculo, pode-se presumir que o extrato de levedura contém 50% p/p de carbono. Como um exemplo, para as fermentações de 500 litros descritos no Exemplo 7, parte VHI, a percentagem de conversão de carbono em isopreno pode ser calculada como mostrado na Equação 2. Equação 2
Figure img0005
[00266] Para as fermentações de 500 litros descritas nesta invenção (Exemplo 7, partes VII e VIII), a percentagem de conversão de carbono em isopreno variou entre 0,04-0,06%. Um rendimento de carbono de 0,11- 0,16% foi obtido usando-se sistemas de 14 litros descritos nesta invenção.
[00267] O versado na técnica pode facilmente converter as taxas de produção de isopreno ou a quantidade de isopreno produzido em quaisquer outras unidades. Equações exemplificativas estão apresentadas abaixo para interconversão entre unidades. Unidades para a taxa de produção de isopreno (total e específica) Equação 3 1 g isopreno/Lcaido/hora = 14,7 mmol isopreno/Lcaido/hora (taxa volumétrica total) Equação 4 1 nmol isopreno /gWCm/hora = 1 nmol isopreno ZLcaido/hora/ODeoo (Esta conversão assume que um litro de caldo com um valor de ODeoo de 1 tem um peso molhado de células de 1 grama.) Equação 5 1 nmol isopreno/gwcm/hora = 68,1 ng isopreno/gWCm/hora (dado o peso molecular de isopreno) Equação 6 1 nmol isopreno/Lgas 02/hora = 90 nmol isopreno/LcaidO/hora (a uma taxa de fluxo de O2 de 90 L/hora por L de caldo de cultura) Equação 7 1 ug isopreno/Lgas isopreno no gás desprendido = 60 ug isopre- no/Lcaido/hora a uma taxa de fluxo de 60 Lgas por Lcaid0 (1 vvm) Unidades para 0 título (total e específico) Equação 8 1 nmol isopreno/mg proteína celular = 150 nmol isopreno/Lcaido/ODdθo (Esta conversão assume que um litro de caldo com um valor de ODeoo de 1 tem uma quantidade de proteína celular total de aproximadamente 150 mg) (produtividade específica) Equação 9 1 g isopreno/Lcéddo = 14,7 mmol isopreno/LcaidO (título total)
[00268] Se desejado, a Equação 10 pode ser usada para converter qualquer uma das unidades que incluem 0 peso molhado das células nas unidades correspondentes que incluem 0 peso seco das células.
Equação 10 Peso seco das células = (peso molhado das células)/3,3
[00269] Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase produz uma quantidade de isopreno que é pelo menos ou cerca de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes, ou maior que a quantidade de isopreno produzido a partir de uma célula correspondente cultivada essencialmente nas mesmas condições sem o ácido nucleico heterólogo codificando o polipeptídio de isopreno sintase.
[00270] Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase e um ou mais ácidos nucleicos heteró- logos codificando um polipeptídio de DXS, EDI, e/ou da via de MVA produz uma quantidade de isopreno que é pelo menos ou cerca de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes, ou maior que a quantidade de isopreno produzido a partir de uma célula correspondente cultivada essencialmente nas mesmas condições sem os ácidos nucleicos heterólogos.
Métodos de purificação de isopreno exemplificativos
[00271] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos neste relatório inclui ainda a recuperação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzido usando as composições e os métodos da invenção podem ser recuperados usando técnicas tradicionais, tais como extração gasosa, fracionamento, adsorção/dessorção, pervapo- ração, dessorção térmica ou a vácuo de isopreno a partir de uma fase sólida, ou extração de isopreno imobilizado ou absorvido em uma fase sólica com um solvente (vide, por exemplo, Patente U.S.4.703.007 e Patente U.S.4.570.029, cada uma delas estando aqui incorporada em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a métodos de recuperação e purificação de isopreno). Em algumas modalidades, a recuperação de isopreno involve o isolamento de isopreno em uma forma líquida (tal como uma solução pura de isopreno ou uma solução de isopreno em um solvente). A extração gasosa envolve a remoção de vapor de isopreno da corrente de gases desprendidos da fermentação de maneira contínua. Tal remoção pode ser feita de diversas maneiras diferentes incluindo, porém sem limitação, adsorção a uma fase sólida, distribuição em uma fase líquida, ou condensação direta. Em algumas modalidades, enriquecimento com membrana de uma corrente de vapor de isopreno diluído acima do ponto de orvalho do vapor resultante na condensação de isopreno líquido.
[00272] A recuperação de isopreno pode envolver uma etapa ou múltiplas etapas. Em algumas modalidades, a remoção de vapor de isopreno da corrente de gases desprendidos da fermentação e a conversão de isopreno em uma fase líquida são realizadas simultaneamente. Por exemplo, o isopreno pode ser diretamente condensado da corrente de gases desprendidos para formar um líquido. Em algumas modalidades, a remoção de vapor de isopreno da corrente de gases desprendidos da fermentação e a conversão de isopreno em uma fase líquida são realizadas sequencialmente. Por exemplo, o isopreno pode ser adsorvido a uma fase sólida e em seguida extraído da fase sólida com um solvente.
[00273] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos nesta invenção pode incluir ainda a purificação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzido usando as composições e os métodos da invenção pode ser purificado usando técnicas tradicionais. Purificação refere-se a um processo através do qual o isopreno é separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é obtido como um líquido substancialmente puro. Exemplos de métodos de purificação incluem (i) destilação a partir de uma solução em um extraente líquido e (ii) cromatografia. Conforme usado neste relatório, "isopreno purificado" significa isopreno que fora separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas mo- dalidades, o isopreno é pelo menos cerca de 20%, em peso, livre de outros componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em várias modalidades, o isopreno é pelo menos ou cerca de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, ou 99%, em peso, puro. A pureza pode ser avaliada por qualquer método apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, análise por HPLC, ou análise por GC-MS.
[00274] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos nesta invenção inclui ainda a polimerização do do isopreno. Por exemplo, métodos tradicionais podem ser usados para polimerizar o isopreno purificado para formar cis-poli-isopreno ou outros produtos a jusante usando-se métodos tradicionais.
[00275] Métodos e composições adicionados estão descritos no pedido de patente provisória U.S.N° 61/097.186, depositado em 15 de setembro de 2008, Pedido de patente provisória U.S.N° 61/097.189, depositado em 15 de setembro de 2008, Pedido de patente provisória U.S.N° 61/097.163, depositado em 15 de setembro de 2008, e Pedido de Patente U.S.Série N° 12/335.071, todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito a composições e métodos para produção de isopreno.
[00276] O isopreno desta invenção pode ser polimerizado formando polímeros úteis, inclusive borracha sintética, utilizando-se as mesmas técnicas que são aplicáveis ao isopreno que é derivado de fontes petroquímicas. A polimerização e recuperação de tal isopreno contendo polímeros são adequadamente realizadas de acordo com vários métodos adequados para processos de polimerização de monômero do tipo dieno. Esta polimerização inclui operações intermitentes, semicontí- nuas, ou contínuas em condições que excluem o ar e outras impurezas atmosféricas, em particular oxigênio e umidade. A polimerização do monômero isopreno também pode ser realizada em inúmeros sistemas de reatores de polimerização diferentes, incluindo, porém sem limitação, polimerização em massa, polimerização em fase vapor, polimeri- zação em solução, polimerização em suspensão, polimerização em emulsão, e sistemas de polimerização por precipitação. Os métodos de polimerização comercialmente preferidos são tipicamente polimerização em solução e polimerização em emulsão.
[00277] A reação de polimerização também pode ser iniciada usando um vasto conjunto de iniciadores de polimerização ou sistemas catalíticos diferentes. O iniciador ou sistema catalítico usado vai depender das características desejadas do polímero contendo isopreno sendo sintetizado. Por exemplo, nos casos em que está sendo feita borracha de cis-1,4-poli-isopreno, um sistema catalítico de Ziegler Natta que é compreendido de tetracloreto de titânio e trietil alumínio pode ser utilizado. Na síntese de outros tipos de polímero contendo isopreno outros tipos de sistemas iniciadores podem ser necessários. Por exemplo, polímeros contendo isopreno podem ser feitos usando um iniciador de radicais livres, um iniciador tipo redox, um iniciador aniônico, ou um iniciador catiônico. O iniciador ou sistema catalítico preferido vão depender da microestrutura do polímero, do peso molecular, da distribuição de peso molecular, e da ramificação de cadeia desejada. Os iniciadores preferidos também vão depender do fato de o isopreno estar sendo homopolimerizado ou copolimerizado com monômeros adicionais. No caso de copolímeros o iniciador usado também vai depender do fato de ser desejável que o polímero sendo feito tenha uma distribuição aleatória, não aleatória, ou afunilada de unidades repetitivas que são derivadas dos monômeros particulares. Por exemplo, iniciadores aniônicos ou iniciadores de radicais livres controlados são tipicamente usados na síntese de copolímeros em blocos tendo blocos de isopreno.
[00278] É importante que o iniciador ou sistema catalítico empregado seja compatível com o tipo de sistema de polimerização usado. Por exemplo, em polimerizações em emulsão são tipicamente utilizados iniciadores de radicais livres. Em polimerizações em solução, iniciadores tais como compostos de alquil lítio são tipicamente empregados para iniciar a polimerização. Uma vantagem da polimerização de radicais livres é que as reações podem ser tipicamente realizadas em condições menos rigorosas que as polimerizações iônicas. Os iniciadores de radicais livres também apresentam maior tolerância de traços de impurezas.
[00279] Receitas de emulsão convencionais também também podem ser empregadas na polimerização de isopreno de acordo com a presente invenção; no entanto, algumas restrições e modificações podem ser surgir da inclusão de comonômeros adicionais, ou das restrições referentes aos parâmetros de polimerização. Tensoativos iônicos, conhecidos na técnica, incluindo detergentes do tipo sulfonato e sabões à base de carboxilato, sulfato e fosfato são úteis nesta invenção. O nível de tensoativo iônico é computado com base no peso total dos componentes orgânicos e pode variar de cerca de 2 a 30 partes em peso de tensoativo iônico por 100 partes em peso de componentes orgânicos.
[00280] Exemplos de iniciadores de radicais livres que são úteis na prática da presente invenção são aqueles conhecidos como iniciadores tipo "redox", tais como combinações de sais de ferro quelatados, sul- foxilato de formaldeído de sódio, e hidroperóxidos orgânicos. Representativos de hidroperóxidos orgânicos são hidroperóxido de cumeno, hidroperóxido de paramentano, e hidroperóxido de ter-butil. Hidroperóxido de ter-butil (t-BHP), peracetato de ter-butil (t-BPA) e iniciadores tipo "azo", tais como azobisiobutironitrila (AIBN), são preferidos.
[00281] A temperatura de reação utilizada nas polimerizações de radicais livres é tipicamente mantida na faixa de 0°C a 150°C. Temperaturas entre cerca de 20°C e 120°C são geralmente preferidas e temperaturas dentro da faixa de 60°C a 100°C normalmente são mais preferidas. A pressão reacional não é crítica. Tipicamente ela é suficientemente alta apenas para manter as condições de reação em fase líquida; ela pode ser uma pressão atuogênica, que vai variar dependendo dos componentes da mistura reacional e da temperatura, ou ela pode ser mais alta, por exemplo, até 68,9 bar ("1000 psi").
[00282] Em operações intermitentes, o tempo de polimerização pode ser variado conforme desejado desde alguns poucos minutos até diversos dias. A polimerização em processos intermitentes pode ser interrompida quando o monômero não for mais absorvido, ou antes disso, se desejado, por exemplo, se a mistura reacional ficar viscosa demais. Em operações contínuas, a mistura de polimerização pode ser passada através de um reator ou de uma série de reatores de qualquer desenho adequado. As reações de polimerização em tais casos são adequadamente amustadas variando-se o tempo de residência no sistema de reator. Os tempos de residência variam com o tipo do sistema de reator e variam de 10 a 15 minutos a 24 ou mais horas. A concentração de monômero na mistura reacional pode variar até 5 porcento em peso da mistura reacional, dependendo das condições empregadas; a faixa de 20 a 80 porcento em peso é preferida.
[00283] A polimerização de isopreno também pode ser realizada em um solvente orgânico adequado que é líquido nas condições de reação e que é relativamente inerte. O solvente pode ter o mesmo número de átomos de carbono por molécula que o reagente dieno ou pode estar em uma faixa de ebulição diferente. Solventes orgânicos preferidos normalmente são alcanos e cicloalcanos. Os solventes podem ser constituídos de um ou mais compostos aromáticos, parafínicos ou ci- cloparafínicos. Esses solventes normalmente vão conter de cerca de 4 átomos de carbono por mol a cerca de 10 átomos de carbono por molécula e serão líquidos nas condições de polimerização. Alguns exemplos representativos de solventes orgânicos adequados incluem penta- no, iso-octano, ciclohexano, metilciclohexano, isohexano, n-heptano, n- octano, n-hexano, benzeno, tolueno, xileno, etilbenzeno, dietilbenzeno, isobutilbenzeno, éter de petróleo, querose, espíritos de petróleo, nafta de petróleo, e similares, isolados ou em mistura. Hidrocarbonetos aromáticos, tais como benzeno, tolueno, isopropilbenzeno, xileno, ou compostos aromáticos halogenados, tais como clorobenzeno, bromo- benzeno, ou ortodiclorobenzeno, também podem ser empregados, mas na maioria dos casos não são preferidos. Outros solventes úteis incluem tetra-hidrofurano e dioxano.
[00284] Na polimerização em solução, normalmente haverá de 5 a 30 porcento em peso de monômeros no meio de polimerização. Tais meios de polimerização são, naturalmente, constituídos do solvente orgânico e monômeros. Na maioria dos casos, será preferido que o meio de polimerização contenha de 10 a 25 porcento em peso de monômeros. Geralmente será mais preferido que o meio de polimerização contenha de 15 a 20 porcento em peso de monômeros.
[00285] A polimerização é tipicamente realizada para atingir uma conversão essencialmente completa dos monômeros em polímero. A adição Incrementai de monômero, ou de um agente de transferência de cadeia, pode ser usada para evitar a formação excessiva de gel. Essas pequenas modificações são de conhecimento do versado na técnica. Depois que a polimerização está completa, o polímero é recu-perado a partir de uma lama ou solução do polímero. Uma simples filtração pode ser adequada para separar o polímero do diluente. Outros meios para separar o polímero do diluente podem ser empregados. O polímero pode ser tratado, separadamente ou enquanto ainda misturado na mistura reacional, para separar resíduos. Tal tratamento pode ser feito com alcoóis tais como metanol, etanol, ou isopropanol, com alcoóis acidificados, ou com outros líquidos polares similares. Em muitos casos os polímeros são obtidos em soluções de hidrocarboneto e o polímero pode ser recuperado por coagulação com álcool acidificado, por exemplo, metanol ou isopropanol contendo 2% de ácido clorídrico, rapidamente agitado. Subsequente a esta coagulação inicial, os polímeros podem ser lavados com um líquido apropriado, tal como metanol.
[00286] Como anteriormente observado, o isopreno também pode ser copolimerizado com um ou mais comonômeros adicionais para fazer copolímeros úteis. Alguns ajustes na receita de polimerização ou nas condições de reação podem ser necessários para obter uma taxa satisfatória de formação de polímero, dependendo da quantidade relativa de isopreno incluído e dos outros monômeros envolvidos. Exemplos de comonômeros que são úteis na prática desta invenção incluem outros monômeros do tipo dieno, tais como 1,3-butadieno e hexadie- nos. Monômeros vinil aromáticos também podem ser copolimerizáveis com isopreno para fazer polímeros úteis. Tais monômeros vinil aromáticos incluem estireno, a-metilestireno, divinil benzeno, cloreto de vinil, acetato de vinil, cloreto de vinilideno, metil metacrilato, etil acrilato, vi- nilpiridina, acrilonitrila, metacrilonitrila, ácido metacrílico, ácido itacôni- co e ácido acrílico. Misturas de diferentes comonômeros também podem ser empregados em diferentes níveis.
[00287] O monômero isopreno também pode ser copolimerizado com um ou mais monômeros do tipo diolefina conjugada adicionais. Aqueles contendo de 4 a 8 átomos de carbono geralmente são preferidos para fins comerciais. Alguns exemplos representativos específicos de monômeros do tipo diolefina conjugada que podem ser copolimeri- zados com isopreno incluem 1,3-butadieno, 2,3-dimetil-1,3-butadieno, piperileno, 3-butil-1,3-octadieno, 2-fenil-1,3-butadieno, e similares, isolados ou em mistura.
[00288] Alguns exemplos representativos de monômeros etilenica- mente insaturados que podem ser copolimerizados com isopreno incluem alquil acrilatos, tais como metil acrilato, etil acrilato, butil acrilato, metil metacrilato e similares; monômeros do tipo vinilideno tendo um ou mais grupos terminais CH2=CH-; vinil aromáticos tais como estireno, alfa-metilestireno, bromoestireno, cloroestireno, fluorestireno e similares; α-olefinas tais como etileno, propileno, 1-buteno e similares; halo- genetos de vinil, tais como brometo de vinil, cloroeteno (cloreto de vi-nil), fluoreto de vinil, iodeto de vinil, 1,2-dibromoeteno, 1,1-dicloroeteno (cloreto de vinilideno), 1,2-dicloroeteno e similares; ésteres vinílicos, tais como vinil acetato; nitrilas α,β-olefinicamente insaturadas, tais como acrilonitrila e metacrilonitrila; amidas α,β-olefinicamente insaturadas, tais como acrilamida, N-metil acrilamida, N,N-dimetilacrilamida, metacrilamida e similares. Monômeros funcionalizados também podem ser opcionalmente copolimerizados com isopreno para fazer polímeros de borracha úteis. Monômeros funcionalizados deste tipo e métodos pelos quais eles podem ser incorporados em polímeros de borracha estão descritos na Patente U.S.6.627.721 e na Patente U.S. 6.936.669. Os ensinamentos da Patente U.S.6.627.721 e da Patente U.S.6.936.669 estão aqui incorporados a título de referência com a finalidade de descrever tais monômeros funcionalizados e sua incorporação em polímeros contendo isopreno.
[00289] Polímeros de borracha que são copolímeros de um ou mais monômeros do tipo dieno com um ou mais outros monômeros etileni- camente insaturados normalmente vão conter de cerca de 50 porcento em peso a cerca de 99 porcento em peso de monômeros do tipo diole- fina conjugada (incluindo isopreno) e de cerca de 1 porcento em peso a cerca de 50 porcento em peso dos outros monômeros etilenicamente insaturados além dos monômeros do tipo diolefina conjugada. Por exemplo, copolímeros de borracha de monômero isopreno com monômeros vinil aromáticos, tais como borrachas de estireno-isopreno normalmente vão conter de 50 a 95 porcento em peso de isopreno e de 5 a 50 porcento em peso de monômeros vinil aromáticos.
[00290] Os monômeros vinil aromáticos são provavelmente o grupo mais importante de monômeros etilenicamente insaturados que são comumente incorporados em borrachas contendo isopreno. Tais monômeros vinil aromáticos tipicamente contêm de 8 a 20 átomos de carbono. Geralmente, o monômero vinil aromático vai conter de 8 a 14 átomos de carbono. O monômero vinil aromático mais amplamente usado é o estireno.Alguns exemplos de monômeros vinil aromáticos que podem ser utilizados incluem estireno, 1-vinilnaftaleno, 2- vinilnaftaleno, a-metilestireno, 4-fenilestireno, 3-metilestireno e similares.
[00291] Alguns exemplos representativos de polímeros de borracha contendo isopreno incluem borracha de homopolímero de cis-1,3-poli- isopreno, borracha de 3,4-poli-isopreno, borracha de estireno-isopreno (SIR), borracha de β-metilestireno-isopreno, borracha de estireno- isopreno-butadieno (SIBR), borracha de estireno-isopreno (SIR), borracha de isopreno-butadieno (IBR), borracha de cc-metilestireno- isopreno- butadieno e borracha de a-metilestireno-estireno-isopreno- butadieno. Nos casos em que o polímero de borracha é constituído de unidades repetitivas que são derivadas de dois ou mais monômeros, as unidades repetitivas que são derivadas dos diferentes monômeros, inclusive o isopreno, normalmente serão distribuídas de maneira essencialmente aleatória. As unidades repetivas que são derivadas dos monômeros diferem do monômero pelo fato de que uma ligação dupla normalmente é consumida pela reação de polimerização.
[00292] O polímero de borracha pode ser feito por polimerização em solução em um processo intermitente ou em um processo contínuo carregando continuamente o monômero isopreno e opcionalmente monômeros adicionais em uma zona de polimerização. A zona de polimerização será tipicamente um reator de polimerização ou uma série de reatores de polimerização. A zona de polimerização normalmente fornecerá agitação para manter os monômeros, o polímero, o iniciador, e o modificador bem dispersados no solvente orgânico na zona de po- limerização. Essas polimerizações contínuas são tipicamente conduzidas em um sistema de múltiplos reatores. O polímero de borracha sintetizado é continuamente removido da zona de polimerização. A conversão de monômero atingida na zona de polimerização geralmente será de pelo menos cerca de 85 porcento. É preferível que a conversão de monômero seja de pelo menos cerca de 90 porcento.
[00293] A polimerização pode ser iniciada com um iniciador aniôni- co, tal como um composto de alquil lítio. O composto de alquil lítio que pode ser usada tipicamente conterá de 1 a cerca de 8 átomos de carbono, tal como n-butil lítio. A quantidade do iniciador à base de lítio utilizado vai variar com os monômeros sendo polimerizados e com o peso molecular que é desejado para o polímero sendo sintetizado. No en-tanto, via de regra, de 0,01 a 1 phm (partes por partes em peso do monômero) do iniciador à base de lítio será utilizada. Na maioria dos casos, de 0,01 a 0,1 phm do iniciador à base de lítio será utilizada, sendo preferível utilizar de 0,025 a 0,07 phm do iniciador à base de lítio.
[00294] Essas polimerizações aniônicas são opcionalmente conduzidas na presença de modificadores polares, tais como alquiltetra- hidrofurfuril éteres. Alguns exemplos representativos de modificadores polares polares específicos que podem ser usados incluem metiltetra- hidrofurfuril éter, etiltetra-hidrofurfuril éter, propiltetra-hidrofurfuril éter, butiltetra-hidrofurfuril éter, hexiltetra-hidrofurfuril éter, octiltetra- hidrofurfuril éter, dodeciltetra-hidrofurfuril éter, dietil éter, di-n-propil éter, di-isopropil éter, di-n-butil éter, tetra-hidrofurano, dioxano, dimetil éter de etileno glicol, dietil éter de etileno glicol, dimetil éter de dietileno glicol, dietil éter de dietileno glicol, dimetil éter de trietileno glicol, trime- tilamina, trietilamina, N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina, N-metil morfo- lina, N-etil morfolina, ou N-fenil morfolina.
[00295] O modificador polar será tipicamente empregado em um nível no qual a proporção molar do modificador polar para o iniciador à base de lítio varia dentro da faixa de cerca de 0,01 : 1 a cerca de 5:1. A proporção molar do modificador polar para o iniciador à base de lítio mais tipicamente vai variar dentro da faixa de cerca de 0,1 : 1 a cerca de 4:1. Geralmente é preferível que a proporção molar do modificador polar para o iniciador à base de lítio varie dentro da faixa de cerca de 0,25: 1 a cerca de 3:1. Geralmente é ainda mais preferível que a a proporção molar do modificador polar para o iniciador à base de lítio varie dentro da faixa de cerca de 0,5:1 a cerca de 3:2.
[00296] A temperatura de polimerização utilizada nessas polimeri- zações aniônicos pode variar dentro de uma ampla faixa de cerca de - 20°C a 180°C. Na maioria dos casos, será utilizada uma temperatura de polimerização dentro da faixa de cerca de 30°C a cerca de 125°C. É tipicamente preferível que a temperatura de polimerização varie dentro da faixa de cerca de 45°C a cerca de 100°C. É tipicamente ainda mais preferível que a temperatura de polimerização varie dentro da faixa de cerca de 60°C a cerca de 90°C. A pressão usada normalmente será suficiente para manter uma fase substancialmente líquida nas condições da reação de polimerização.
[00297] Essas polimerizações aniônicas de isopreno normalmente são conduzidas por um período de tempo suficiente para permitir a polimerização substancialmente completa do isopreno e de quaisquer monômeros adicionais que estejam presentes. Em outras palavras, a polimerização normalmente é realizada até que um alto grau de conversão de pelo menos cerca de 85 porcento seia atingido. A polimerização normalmente é então interrompida pela adição de um agente, tal como um álcool, um agente de terminação, ou um agente de acoplamento. Por exemplo, um halogeneto de estanho e/ou um halogeneto de silício podem ser usados como agente de acoplamento. O halogeneto de estanho e/ou o halogeneto de silício são continuamente adicionados nos casos em que o acoplamento assimétrico é desejado. Esta adição contínua de agente de acoplamento à base de estanho e/ou de agente de acoplamento à base de silício normalmente é feita em uma zona de reação separada da zona de reação em que a massa de polimerização está ocorrendo. Os agentes de acoplamento normalmente serão adicionados em um vaso de reação separado depois de que for atingido o grau de conversão desejado. Os agentes de acoplamento podem ser adicionados em uma solução de hidrocarboneto, por exemplo, em ciclo-hexano, à mistura de polimerização com misturação adequada para distribuição e reação. Em outras palavras, o acoplamento será tipicamente adicionado somente depois que for atingido um alto grau de conversão. Por exemplo, o agente de acoplamento normalmente será somente depois de realizada uma conversão de monômero superior a cerca de 85 porcento. Será tipicamente preferido que a conversão de monômero a ser atingida seja de pelo menos cerca de 90 porcento antes de ser adicionado o agente de acoplamento.
[00298] Os halogenetos de estanho usados como agentes de acoplamento normalmente serão tetra-halogenetos de estanho, tais como tetracloreto de estanho, tetrabrometo de estanho, tetrafluoreto de estanho ou tetraiodeto de estanho. No entanto, tri-halogenetos de estanho também podem ser opcionalmente usados. Polímeros acoplados com tri-halogenetos de estanho têm um máximo de três braços. Isto, naturalmente, contrasta com polímeros acoplados com tetra-halogenetos de estanho que têm um máximo de quatro braços. Para induzir um nível mais alto de ramificação, os tetra-halogenetos de estanho são normalmente preferidos. Via de regra, o tetracloreto de estanho é o mais preferido.
[00299] Os agentes de acoplamento à base de silício que podem ser usados normalmente serão tetra-halogenetos de silício, tais como tetracloreto de silício, tetrabrometo de silício, tetrafluoreto de silício ou tetraiodeto de silício. No entanto tri-halogenetos de silício também podem podem ser opcionalmente usados. Polímeros acoplados com tri- halogenetos de silício têm um máximo de três braços. Isto, naturalmen- te, contrasta com polímeros acoplados com tetra-halogenetos de silício que têm um máximo de quatro braços. Para induzir um nível mais alto de ramificação, os tetra-halogenetos de silício são normalmente preferidos. Via de regra, o tetracloreto de silício é o mais preferido dos agentes de acoplamento à base de silício.
[00300] Uma combinação de um halogeneto de estanho e um halogeneto de silício pode ser opcionalmente usada para acoplar o polímero de borracha. Com o uso de tal combinação de agentes de acoplamento à base de estanho e de silício, é possível obter propriedades aperfeiçoadas para borrachas para pneus, tal como menor histerese. É particularmente desejável utilizar uma combinação de agentes de aco-plamento à base de estanho e de silício em compostos para banda de rodagem de pneus que contêm sílica e negro de carvão. Nestes casos, a proporção molar de halogeneto de estanho para halogeneto de silício empregada no acoplamento ao polímero de borracha normalmente vai variar dentro da faixa de 20:80 a 95:5. A proporção molar de halogeneto de estanho para halogeneto de silício empregada no acoplamento ao polímero de borracha mais tipicamente vai variar dentro da faixa de 40:60 a 90:10. A proporção molar de halogeneto de estanho para halogeneto de silício empregada no acoplamento ao polímero de borracha de preferência vai variar dentro da faixa de 60:40 a 85: 15. A proporção molar de halogeneto de estanho para halogeneto de silício empregada no acoplamento ao polímero de borracha mais preferivelmente vai variar dentro da faixa de 65:35 a 80:20.
[00301] Amplamente, e exemplificativamente, é empregada uma faixa de cerca de 0,01 a 4,5 miliequivalentes de agente de acoplamento à base de estanho (halogeneto de estanho e halogeneto de silício) por 100 gramas do polímero de borracha. Normalmente é preferível utilizar cerca de 0,01 a cerca de 1,5 miliequivalentes do agente de acoplamento por 100 gramas de polímero para obter a viscosidade Mooney desejada. Quantidades mais altas tendem a resultar na produção de polímeros contendo grupos terminalmente reativos ou em acoplamento insuficiente. Um equivalente de agente de acoplamento à base de estanho por equivalente de lítio é considerado uma quantidade ótima para ramificação máxima. Por exemplo, se uma mistura de tetra- halogeneto de estanho e tetra-halogeneto de silício for usada como o agente de acoplamento, será utilizado um mol do agente de acoplamento para quatro moles de extremidades de lítio vivas. Nos casos em que uma mistura de tri-halogeneto de estanho e tri-halogeneto de silício é usada como o agente de acoplamento, será otimamente utilizado um mol do agente de acoplamento para cada três moles de extremidades de lítio vivas. O agente de acoplamento pode ser adicionado em uma solução de hidrocarboneto, por exemplo, em ciclo-hexano, à mistura de polimerização no reator com misturação adequada para distribuição e reação.
[00302] Depois que o acoplamento tiver sido completado, uma alquil 1,2-etileno diamina terciária quelante ou um sal metálico de um álcool cíclico pode ser opcionalmente adicionado ao cimento de polímero para estabilizar o polímero de borracha acoplado. Na maioria dos casos, de cerca de 0,01 phr (partes em peso por 100 partes em peso de borracha seca) a cerca de 2 phr da alquil 1,2-etileno diamina quelante ou do sal metálico do álcool cíclico serão adicionados ao cimento de polí-mero para estabilizar o polímero de borracha. Tipicamente, de cerca de 0,05 phr a cerca de 1 phr da alquil 1,2-etileno diamina quelante ou do sal metálico do álcool cíclico serão adicionados. Mais tipicamente, de cerca de 0,1 phr a cerca de 0,6 phr da alquil 1,2-etileno diamina quelante ou do sal metálico do álcool cíclico serão adicionados ao cimento de polímero para estabilizar o polímero de borracha.
[00303] Os agentes de terminação que podem ser usados para interromper a polimerização e "terminar" o polímero de borracha vivo incluem mono-halogenetos de estanho, mono-halogenetos de silício, N,N,N',N'- tetradialquil diamino-benzofenonas (tais como tetrametildia- minobenzofenona e similares), N,N-dialquilamino-benzaldeídos (tais como dimetilaminobenzaldeido e similares), 1,3-dialquil-2- imidazolidinonas (tais como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona e similares), pirrolidinonas 1-alquil-substituidas; pirrolidinonas 1-aril-substituidas, dialquil-dicicloalquil-carbodi-imidas contendo de cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono, e dicicloalquil-carbodi-imidas contendo de cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono.
[00304] Depois que a etapa de terminação, e opcionalmente a etapa de estabilização, tiver sido completada, o polímero de borracha pode ser recuperado a partir do solvente orgânico. O polímero de borracha acoplado pode ser recuperado a partir do solvente orgânico e do resíduo por meios tais como coagulação química (álcool), dessoventização térmica, ou outro método adequado. Por exemplo, geralmente é desejável precipitar o polímero de borracha do solvente orgânico pela adição de alcoóis inferiores contendo de cerca de 1 a cerca de 4 átomos de carbono à solução de polímero. Alcoóis inferiores adequados para precipitação da borracha a partir do cimento de polímero incluem incluem metanol, etanol, álcool isopropílico, álcool normal-propílico e álcool t-butílico. A utilização de alcoóis inferiores para precipitar o polímero de borracha a partir do cimento de polímero também "termina" qualquer polímero vivo remanescente inativando os grupos terminais de lítio. Depois que o polímero de borracha acoplado é recuperado da solução, extração com vapor pode ser empregada para reduzir o nível de compostos orgânicos voláteis no polímero de borracha acoplado. Adicionalmente, o solvente orgânico pode ser removido do polímero de borracha por secagem em tambor, secagem em extrusor, secagem a vácuo, e similares.
[00305] Como anteriormente explicado, a borracha sintética cis-1,3- poli-isopreno que é bastante semelhante à borracha natural para permitir sua livre substituição pode ser produzido pela polimerização em solução de isopreno com um sistema catalítico de Ziegler Natta que é compreendido de tetracloreto de titânio (TiCk) e um composto de or- ganoalumínio, temperatura ambiente trietilalumínio, AI-(CH2-CH3)3. A borracha de poli-isopreno que é feita com este sistema catalítico de Ziegler Natta tem um alto teor de cis-microestrutura de até 98 porcento que se assemelha bastante àquele da borracha natural de Hevea Bra- siliensis (a seringueira comum) que tem um teor de cic-microestrutura de virtualmente 100 porcento. No entanto, esta ligeira diferença na mi- croestrutura do polímero resulta de propriedades físicas que são inferiores àquelas da borracha natural em certos aspectos. Por exemplo, a borracha natural tipicamente apresenta uma resistência verde que é superior àquela da borracha sintética cis-1,4-poli-isopreno. Por outro lado, em determinados outros aspectos a borracha sintética cis-1,4- poli-isopreno é superior à borracha natural da Hevea Brasiliensis, guayule, e Taraxacum kok-Saghyz (dente-de-leão russo). Por exemplo, a borracha natural contém proteínas residuais, sabões, resinas, e açúcares uma vez que ela é proveniente de plantas. A presença dessas impurezas residuais pode ser extremamente nociva em algumas aplicações. Por exemplo, a presença de proteínas residuais em produtos de borracha pode causar reações alérgicas graves em algumas pessoas e representam uma grande preocupação para os fabricantes de alguns produtos contendo borracha, tais como luvas de borracha, cami- sas-de-vênus, êmbolos de seringa, e similares. De qualquer forma, as borrachas sintéticas de homopolímero de poli-isopreno desta invenção que são livres das proteínas, sabões, resinas, e açúcares presentes na borracha natural, incluindo a borracha natural da Hevea Brasiliensis.
[00306] A Patente U.S.3.931.136 descreve um processo para a produção de cis-1,4-poli-isopreno de alto peso molecular. O catalisador usado nesse processo é uma mistura de três componentes de (A) um tetracloreto de titânio, (B) um composto de organoalumínio da fórmula AIR3, onde cada R representa um grupo alquil, de preferência um grupo alquil contendo de 1 a 8 átomos de carbono, um grupo aril, de preferência um grupo fenil, ou um grupo cicloalquil, de preferência um grupo ciclohexil, e (C) uma beta-dicetona da fórmula:
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onde R' e R" podem ser iguais ou diferentes e representam um grupo alquil ou um grupo aril. R' e R" de preferência representam um grupo alquil contendo de 1 a 5 átomos de carbono ou um grupo fenil. Os ensinamentos da Patente U.S.3.931.136 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de cis-1,4-poli- isopreno.
[00307] Uma técnica de polimerização em solução para a síntese de cis-1,4-poli-isopreno com um sistema catalítico que é compreendido de uma mistura de tetracloreto de titânio e um composto de trialquilalumí- nio está descrita pela Patente U.S.4.430.487. Neste processo a polimerização e rapidamente interrompida com 4,7-diaza-decano-1,10- diamina. Os ensinamentos da Patente U.S.4.430.487 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de cis-1,4-poli-isopreno.
[00308] A síntese de cis-1,4-poli-isopreno por polimerização de isopreno com um sistema catalítico que é compreendido de um tetra- halogeneto de titânio, um composto de trialquilalumínio e difenil éter pode resultar na formação de um gel indesejado. A Patente U.S. 5.919.876 descreve que a formação de gel pode ser reduzida com a condução de tais polimerizações na presença de uma diarilamina, tal como difenilamina para-estirenada. A Patente U.S.5.919.876 descreve mais especificamente um processo para a síntese de cis-1,4-poli- isopreno tendo um baixo teor de gel que compreende a polimerização de isopreno em um solvente orgânico inerte com um sistema catalítico pré-formado que é feito pela reação de um composto de organoalumí- nio com tetra-halogeneto de titânio, tal como tetracloreto de titânio, na presença de pelo menos um éter, onde a referida polimerização é con-duzida a uma temperatura que varia dentro da faixa de cerca de 0°C a cerca de 100°C, e onde a referida polimerização é conduzida na presença de uma diarilamina. Os ensinamentos da Patente U.S. 5.919.867 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização em solução que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4-poli- isopreno.
[00309] O cis-1,4-poli-isopreno pode ser feito por polimerização em fase vapor utilizando um catalisador pré-formado que é feito pela reação de um composto de organoalumínio com tetracloreto de titânio. A Patente U.S.6.066.705 descreve um método para a polimerização em fase vapor de isopreno formando cis-1,4-poli-isopreno em um processo compreendendo as etapas de: (1) carregar em uma zona de reação o referido isopreno e sistema catalítico pré-formado que é feito pela reação de um composto de organoalumínio com tetracloreto de titânio, de preferência na presença de pelo menos um éter; onde o isopreno é mantido na fase vapor na referida zona de reação por uma combinação adequada de temperatura e pressão; (2) deixar o referido isopreno po- limerizar formando cis-1,4-poli-isopreno a uma temperatura dentro da faixa de cerca de 35°C a cerca de 7O°C; e (3) remover o referido cis- 1,4-poli-isopreno da referida zona de reação. Já foi determinado que a formação de gel pode ser reduzida nessas polimerizações em fase vapor conduzindo-se a polimerização do monômero isopreno na presença de uma diarilamina, tal como difenilamina para-estirenada. Os ensinamentos da Patente U.S.6.066.705 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização em fase vapor que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4- poli-isopreno.
[00310] Borracha de poli-isopreno que é límpida (transparente) e de alta pureza pode ser sintetizada utilizando-se um sistema catalítico à base de neodímio. A Patente U.S.6.780.948 refere-se a um processo deste tipo para a síntese de borracha de poli-isopreno que compreende a polimerização do monômero isopreno na presença de um sistema catalítico à base de neodímio, onde o sistema catalítico à base de neodímio é preparado por (1) reagir um carboxilato de neodímio com um composto de organoalumínio na presença de isopreno por um período de cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos para produzir o componente catalítico neodímio-alumínio, e (2) e subsequentemente reagir o componente catalítico neodímio-alumínio com um cloreto de dialquil alumínio por um período de pelo menos 30 minutos para produzir o sistema catalítico à base de neodímio. Os ensinamentos da Patente U.S.5,919,867 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4- poli-isopreno de alta pureza.
[00311] A Patente U.S.7.091.150 e a Patente U.S.7.199.201 descrevem o uso de um sistema catalítico à base de neodímio para poli- merizar o monômero isopreno formando borracha sintética de poli- isopreno tendo um teor de cis-microestrutura extremamente alto e alta estereorregulatidade. Esta borracha de poli-isopreno vai cristalizar sob tensão e pode ser combinado para formar formulações de borracha de maneira similar à borracha natural. Esta técnica mais especificamente apresenta um processo para a síntese de borracha de poli-isopreno que compreende a polimerização do monômero isopreno na presença de um sistema catalítico à base de neodímio, onde o sistema catalítico à base de neodímio é preparado por um processo que compreende (1) reagir um carboxilato de neodímio com um composto de organoalumínio em um solvente orgânico para produzir o componente catalítico ne- odímio-alumínio, e (2) subsequentemente reagir o componente catalítico neodímio-alumínio com um halogênio elemental para produzir o sistema catalítico à base de neodímio. Na prática deste processo, o sistema catalítico à base de neodímio é tipicamente livre de compostos contendo níquel.
[00312] A borracha sintética de poli-isopreno feita por este processo é constituída de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, onde a borracha sintética de poli-isopreno tem um teor de cis- microestrutura que varia dentro da faixa de 98,0% a 99,5%, um teor de 3,4-microestrutura que varia dentro da faixa de 0,5% a 2,0%, e um teor de trans-microestrutura que varia dentro da faixa de 0,0% a 0,5%. Os ensinamentos da Patente U.S.7.091.150 e da Patente U.S.7.199.201 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos à base de neodímio e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4-poli- isopreno com teor de cis-microestrutura extremamente alto e alta este- reorregularidade.
[00313] Catalisadores com lantanídeo como único componente, tal como di-iodetos de lantanídeo, também podem ser usados na síntese de poli-isopreno com teor de cis-microestrutura extremamente alto. Por exemplo, di-iodeto de túlio, di-iodeto de disprósio, e di-iodeto de neodímio podem iniciar a polimerização de isopreno formando uma borracha com alto teor de cis-1,4-poli-isopreno sem a necessidade de componentes catalíticos adicionais. Di-iodetos de lantanídeo podem por conseguinte ser usados para iniciar a polimerização do monômero isopreno formando uma grande quantidade de cis-1,4-poli-isopreno condições de polimerização em solução.
[00314] A Patente U.S.4.894.425 revela um processo para a síntese de poli-isopreno que pode possuir grupos funcionais e que contém mais de 70 porcento de unidades 1,2- e 3,4-estruturais. Este processo envolve a polimerização aniônica de isopreno em um solvente hidro- carboneto inerte na presença de um composto de organolítio como o catalisador e de um éter como o cocatalisador, onde cocatalisador usado é um dialquil éter de etileno glicol da fórmula R1-O-CH2-CH2-O- R2 onde R1 e R2 são grupos alquil com diferentes números de átomos de carbono, selecionados do grupo que consiste em metil, etil, n-propil, iso-propil, n- butil, iso-butil, sec-butil, e ter-butil, e onde a soma dos átomos de carbono nos dois grupos alquil R1 e R2 varia dentro da faixa de 5 a 7. Os ensinamentos da Patente U.S.4.894.425 estão aqui in-corporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de poli-isopreno com um alto teor de 1,2- e 3,4-microestruturas.
[00315] O 3,4-poli-isopreno cristalizável pode ser sintetizado em solventes orgânicos resultando em rendimentos quantitativos depois de curtos períodos de polimerização utilizando os sistemas catalíticos descritos pela Patente U.S.5.082.906. O 3,4-poli-isopreno feito utilizando este sistema catalítico é cristalizável sob tensão e pode ser empregado em bandas de rodagem para pneus que oferecem tração aperfeiçoada e resistência ao aumento de corte aperfeiçoada. A Patente U.S.5.082.906 descreve especificamente um processo para a síntese de 3,4-poli-isopreno que compreende polimerizar o monômero isopreno em um solvente orgânico a uma temperatura que varia dentro da faixa de cerca de -10°C a cerca de 100°C na presença de um sistema catalítico que é compreendido de (a) um composto de organoferro, (b) um composto de organoalumínio, (c) uma amina aromática quelante, e (d) um composto protônico; onde a proporção molar da amina quelante para o composto de organoferro varia dentro da faixa de cerca de 0,1 : 1 a cerca de 1: 1, onde a proporção molar do composto de organoalumínio para o composto de organoferro varia dentro da faixa de cerca de 5: 1 a cerca de 200:1, e onde a proporção molar do composto protônico para o composto de organoalumínio varia dentro da faixa de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,2:1. Os ensinamentos da Patente U.S. 5.082.906 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de poli-isopreno tendo um alto teor de 3,4- microestruturas e que é cristalizável sob tensão.
[00316] A Patente U.S.5.356.997 também apresenta um processo para a síntese de 3,4-poli-isopreno cristalizável sob tensão. Este 3,4- poli-isopreno tem um teor de 3,4-microestruturas que varia dentro da faixa de cerca de 65% a cerca de 85%, um teor de cis-1,4- microestruturas que varia dentro da faixa de cerca de 15% a cerca de 35%, e essencialmente nenhuma trans-1,4-microestrutura ou 1,2- microestrutura. Ele pode ser sintetizado em solventes orgânicos resultando em rendimentos quantitativos depois de curtos períodos de polimerização. A Patente U.S.5.356.997 descreve especificamente um processo para a síntese de 3,4-poli-isopreno que compreende polime- rizar o monômero isopreno em um solvente orgânico a uma temperatura que varia dentro da faixa de cerca de -10°C a cerca de 100°C na presença de um sistema catalítico que é compreendido de (a) um composto de organoferro que é solúvel no solvente orgânico, onde o ferro no composto de organoferro está no estado de oxidação +3, (b) um composto de organoalumínio parcialmente hidrolisado que foi preparado por adição de um composto protônico selecionado do grupo que consiste em água, alcoóis e ácidos carboxílicos ao composto de organoalumínio, e (c) uma amina aromática quelante; onde a propor-ção molar da amina quelante para o composto de organoferro varia dentro da faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 1:1, onde a proporção molar do composto de organoalumínio para o composto de organoferro varia dentro da faixa de cerca de 5: 1 a cerca de 200: 1, e onde a proporção molar do composto protônico para o composto de organoalumínio varia dentro da faixa de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,2: 1. Os ensinamentos da Patente U.S.5.356.997 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de poli- isopreno tendo um alto teor de 3,4-microestruturas e que é cristalizável sob tensão.
[00317] A Patente U.S.5.677.402 revela um processo para preparar borracha de 3,4-poli-isopreno que compreende polimerizar o monômero isopreno com um iniciador à base de organolítio a uma temperatura que varia dentro da faixa de cerca de 30°C a cerca de 100°C na presença de um alcóxido de sódio e um modificador polar, onde a proporção molar do alcóxido de sódio para o iniciador à base de organolítio varia dentro da faixa de cerca de 0,05:1 a cerca de 3: 1; e onde a pro-porção molar do modificador polar para o iniciador à base de organolítio varia dentro da faixa de cerca de 0,25: 1 a cerca de 5: 1. Os ensinamentos da Patente U.S.5.677.402 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar sistemas catalíticos e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de 3,4-poli- isopreno.
[00318] A Patente U.S.7.351.768 descreve a síntese de poli- isopreno líquido tendo um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 5.000 a 100.000 e de preferência na faixa de 20.000 a 80.000. Os ensinamentos da Patente U.S.5.677.402 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ilustrar a síntese de poli-isopreno líquido.
[00319] A Patente U.S.6.576.728 descreve um processo para a co- polimerização de estireno e isopreno para produzir borracha de estireno-isopreno com baixo teor de vinil tendo uma distribuição aleatória de unidades repetitivas que são derivadas de estireno. Os sistemas iniciadores empregados nessas polimerizações são constituídos de (a) um iniciador à base de lítio e (b) um membro selecionado do grupo que consiste em (1) um alcóxido de sódio, (2) um sal sódico de um ácido sulfônico, e (3) um sal sódico de um glicol éter. É importante que o sistema iniciador usado nessas polimerizações seja livre de modificadores polares, tais como bases de Lewis. Os ensinamentos da Patente U.S. 6.576.728 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ilustrar a síntese de borracha de estireno-isopreno.
[00320] A Patente U.S.6.313.216 descreve um processo para sintetizar borracha de estireno-isopreno aleatória compreendendo: (1) carregar continuamente isopreno, estireno, um iniciador, e um solvente em uma primeira zona de polimerização, (2) deixar o isopreno e o estireno copolimerizarem na primeira zona de polimerização até atingir uma conversão total de 60 a 95 porcento para produzir um cimento de polímero contendo cadeias de estireno-isopreno vivas, (3) carregar continuamente o cimento de polímero contendo cadeias de estireno- isopreno vivas e monômero isopreno adicional em uma segunda zona de polimerização, onde de 5 a 40 porcento da quantidade total de isopreno alterada é carregada na segunda zona de polimerização, (4) deixar a copolimerização continuar na segunda zona de polimerização até atingir uma conversão do monômero isopreno de pelo menos 90 porcento onde a conversão total de estireno e isopreno na segunda zona de polimerização é limitada a um máximo de 98 porcento, (5) remover um cimento de polímero de borracha de estireno-isopreno aleatória tendo extremidades de cadeia vivas provenientes da segunda zona de reação, (6) eliminar as extremidades de cadeia vivas na borracha de estireno-isopreno aleatória, e (7) recuperar a borracha de estireno- isopreno aleatória a partir do cimento de polímero, onde as copolimeri- zações na primeira zona de polimerização e na segunda zona de polimerização são realizadas a uma temperatura que varia dentro da faixa de 70°C a 100°C, e onde a quantidade de estireno carregada na primeira zona de polimerização é pelo menos 2 porcento maior que a quantidade total de estireno ligado na borracha. Os ensinamentos da Patente U.S.6.313.216 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ilustrar a síntese de borracha de estireno-isopreno.
[00321] Copolímeros de isopreno-butadieno com altos teores de vi- nil podem ser sintetizados em solventes orgânicos resultando em altos rendimentos depois de curtos períodos de polimerização utilizando o processo descrito na Patente U.S.5.061.765. Os copolímeros de iso- preno-butadieno feitos utilizando este processo têm uma temperatura de transição de vidro que varia dentro da faixa de cerca de 0°C a cerca de -60°C e podem ser empregados em bandas de rodagem para pneus que oferecem tração aperfeiçoada e resistência ao aumento de corte aperfeiçoada. A Patente U.S.5.061.765 descreve mais especificamente um processo para a síntese de copolímeros de isopreno- butadien tendo um alto teor de vinil que compreende copolimerizar o monômero isopreno e o monômero butadieno em um solvente orgânico a uma temperatura que varia dentro da faixa de cerca de -10°C a cerca de 100°C na presença de um sistema catalítico que é compreendido de (a) um composto de organoferro, (b) um composto de organoalumínio, (c) uma amina aromática quelante, e (d) um composto protônico; onde a proporção molar da amina quelante para o composto de organoferro varia dentro da faixa de cerca de 0,1 : 1 a cerca de 1: 1, onde a proporção molar do composto de organoalumínio para o composto de organoferro varia dentro da faixa de cerca de 5: 1 a cerca de 200: 1 , e onde a proporção molar do composto protônico para o composto de organoalumínio varia dentro da faixa de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,2:1. Os ensinamentos da Patente U.S.5.061.765 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ilustrar a síntese de borracha de isopreno-butadieno.
[00322] Uma técnica para sintetizar terpolímeros de borracha de estireno, isopreno e butadieno está descrita na Patente U.S. 5.137.998. Esses terpolímeros de borracha apresentam uma excelente combinação de propriedades para utilização em compostos de borracha para bandas de rodagem para pneus. Com a utilização de tais terpolímeros em bandas de rodagem para pneus, é possível construir pneus tendo resistência aperfeiçoada à derrapagem em asfalto molhado sem sacrificar a resistência ao rolamento ou as características de desgaste da banda de rodagem. A Patente U.S.5.137.998 descreve mais especificamente um processo para a preparação de um terpolí- mero de borracha de estireno, isopreno, e butadieno tendo múltiplas temperaturas de transição de vidro e tendo uma excelente combinação de propriedades para uso na produção de para bandas de rodagem para pneus que compreende: terpolimerizar estireno, isopreno e 1,3- butadieno em um solvente orgânico a uma temperatura de no máximo cerca de 40°C na presença de (a) pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em óxido de tripiperidino fosfina e alcóxidos de metal alcalino e (b) um composto de organolítio. Os ensinamentos da Patente U.S.5,137,998 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ilustrar a síntese de borracha de estireno-isopreno- butadieno.
[00323] Uma borracha de isopreno-butadieno (IBR) líquida que é particularmente valiosa para uso na produção de bandas de rodagem para pneus de automóveis de alto desempenho, inclusive pneus para carros de corrida, que exibem características superiores de tração a seco e durabilidade, pode ser feita pelo processo apresentado na Patente U.S.6.562.895. Esta borracha de isopreno-butadieno é um líquido à temperatura ambiente e é constituída de unidades repetitivas que são derivadas de cerca de 5 porcento em peso a cerca de 95 porcento em peso de isopreno e de cerca de 5 porcento em peso a cerca de 95 porcento em peso de 1,3-butadieno, onde as unidades repetitivas derivadas de isopreno e de 1,3-butadieno estão em uma ordem essencialmente aleatória. Esta IBR também tem um peso molecular médio numérico baixo que varia dentro da faixa de cerca de 3.000 a cerca de 50.000 e tem uma temperatura de transição de vidro que varia dentro da faixa de cerca de -50°C a cerca de 20°C.
[00324] Esses copolímeros de isopreno-butadieno são sintetizados utilizando um iniciador à base de organolítio e um modificador polar. O nível de iniciador à base de organolítio empregado vai depender do peso molecular que é desejado para o polímero de isopreno-butadieno líquido sendo sintetizado. Via de regra, em todas as polimerizações aniônicas o peso molecular do polímero produzido é inversamente proporcional à quantidade de iniciador sendo utilizada. Como um polímero de isopreno-butadieno líquido tendo um peso molecular relativamente baixo está sendo sintetizado, a quantidade de iniciador empregada será relativamente grande. Via de regra, de cerca de 0,1 a cerca de 2 phm (partes por cem partes de monômero em peso) do composto de organolítio serão empregadas. Na maioria dos casos, será preferível utilizar de cerca de about 0,2 a cerca de 1 phm do composto de organolítio, sendo ainda mais preferível utilizar de cerca de 0,4 phm a 0,6 phm do composto de organolítio. De qualquer forma, a quantidade de iniciador à base de organolítio será selecionada de forma a resultar na produção de polímero de isopreno-butadieno líquido tendo um peso molecular médio numérico que varia dentro da faixa de cerca de 3.000 a cerca de 50.000.
[00325] A quantidade de iniciador à base de organolítio será de preferência selecionada de forma a resultar na produção de polímero de isopreno-butadieno líquido tendo um peso molecular médio numérico que varia dentro da faixa de cerca de 5.000 a cerca de 30.000. A quantidade de iniciador à base de organolítio será ainda mais preferivelmente selecionada de forma a resultar na produção de polímero de isopreno-butadieno líquido tendo um peso molecular médio numérico que varia dentro da faixa de cerca de 8.000 a cerca de 18.000. De qualquer forma, é crítico realizar a copolimerização do 1,3-butadieno e do estireno na presença de um modificador polar, tal como N,N,N',N'- tetra- metiletilenodiamina (TMEDA), para atingir uma temperatura de transição de vidro elevada que varia dentro da faixa de cerca de -50°C a 20°C. Os ensinamentos da Patente U.S. 6.562.895 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ilustrar a síntese de polímeros de isopreno-butadieno líquidos.
[00326] Copolímeros em blocos contendo um bloco de poli-isopreno podem ser feitos pelo processo descrito na Patente U.S.5.242.984. Por exemplo, polímeros diblocos lineares de estireno e isopreno (copolímeros em blocos de S-l) e polímeros triblocos lineares de estireno e isopreno (copolímeros triblocos de S-l-S) podem ser feitos por este processo. Nesta técnica, os monômeros são polimerizados em se-quência por polimerização aniônica em um solvente orgânico inerte. Normalmente um composto organometálico alcalino, tal como um composto de alquil lítio, é usado para iniciar a polimerização que pode ser conduzida em uma ampla faixa de temperaturas.
[00327] Métodos para controlar os pesos moleculares dos blocos e do polímero como um todo estão descritos na Patente U.S.3.149.182 e na Patente U.S.3.231.635 que estabelecem que a quantidade de monômero pode ser mantida constante e pesos moleculares diferentes podem ser obtidos alterando-se a quantidade de catalisador ou que a quantidade de catalisador pode ser mantida constante e pesos moleculares diferentes podem ser obtidos alterando-se a quantidade de monômero. Subsequente à polimerização sequencial, o produto é terminado tal como pela adição de um agente de terminação prótico, por exemplo água, álcool ou outros reagentes ou com hidrogênio, com a finalidade de remover o radical de lítio formando o núcleo para o polímero condensado produzido. O polímero em blocos produzido é então recuperado tal como por coagulação utilizando água quente ou vapor d'água ou ambos. Os ensinamentos da Patente U.S.5.242.984, da Patente U.S.3.149.182, e da Patente U.S.3.231.635 estão aqui incorporados a título de referência com o propósito de ensinar métodos para a síntese de copolímeros em blocos de S-l e de polímeros triblocos de S- l-S.
[00328] É possível verificar que todos os tipos de polímeros feitos com o isopreno desta invenção foram produzidos com isopreno que não se originam de uma fonte petroquímica. Adicionalmente, os polímeros contendo ispreno desta invenção também podem ser distinguidos dos polímeros contendo isopreno que são provenientes de fontes naturais, tais como borracha natural. Por conseguinte, é possível verificar analiticamente que os polímeros contendo isopreno desta invenção são provenientes das fontes biorrenováveis e inofensivas ao meio am-biente descritas nesta invenção.
[00329] A proporção de isótopos de carbono 13C e 12C pode ser usada para identificar ou estabelecer possíveis origens para muitas amostras contendo carbono. Este método funciona bem porque: (1) ambos os isótopos são estáveis em intervalos de tempo geológicos; (2) a proporção de 13C para 12C pode ser medida com grande precisão usando combinações de análise de combustão, cromatografia gasosa, e espectrometria de massas de razão isotópica; (3) as proporções de 13C/12C para muitos materiais naturais ocorrem dentro de faixas estreitas características desses materiais; e (4) as proporções de 13C/12C para muitos materiais variam de formas previsíveis à medida em que esses materiais sofrem reações químicas.
[00330] Estudos envolvendo proporções de 13C/12C em ou próximo a níveis de abundância natural geralmente apresentam os dados isotó- picos como "valores delta", que são representados pelo símbolo δ13C e dados em partes por mil (%o) em relação a uma amostra de referência padrão. Para o carbono, a amostra de referência é tipicamente Pee Dee Belemite, que tem uma abundância natural de 13C de 1,112328% e à qual foi atribuído um δ13C igual a 0,00%o. A fórmula que relaciona as proporções de 13C/12C aos valores delta é a seguinte: δ13C (em %o) versus padrão = [(Ramostra - Rpadrão)/Rpadrão](1000), onde Ramostra é a proporção de 13C/12C para a amostra Rpadrão é a proporção de Pee Dee Belemite.
[00331] Embora isótopos de carbono (isto é, 13C e 12C) participem dos mesmos processos físicos e das mesmas reações químicas, a ligeira diferença de massa entre 13C e 12C pode se manifestar em diferenças muito pequenas nas velocidades de muitas reações e processos. Isto leva a pequenas diferenças entre as proporções de 13C/12C para amostras submetidas a reações químicas ou a processos físicos. Por exemplo, processos físicos tais como evaporação ou difusão fazem distinção entre isótopos mais pesados e tipicamente levam a um leve enriquecimento do isótopo mais pesado na amostra original à medida que o isótopo mais leve evapora ou se dissipa mais rapidamente. A proporção de 13C/12C portanto aumenta levemente à medida em que a evaporação ou dissipação ocorre. Para reações químicas, incluindo reações enzimáticas, a situação é mais complexa, mas geralmente há uma leve discriminação de um isótopo sobre um outro, que pode ser detectada medindo-se as proporções de 13C/12C ou os valores de δ13C. Por exemplo, o CO2 atmosférico pode ser convertido em substância vegetal via dois mecanismos muito diferentes para fotossíntese: a via de Calvin-Benson, que ocorre em plantas de C3, e a via de Hatch- Slack, que ocorre em plantas de C4. Estes dois mecanismos são sufi-cientemente diferentes para produzir uma diferença mensurável dem δ13C do mesmo CO2. Para plantas de C4, 0 δ13C tipicamente varia de - 9%o a -17%e com uma média próxima a -13%o. Para plantas de C3, 0 δ13C tipicamente varia de -20%o a -32%o com uma média próxima a - 27%o. Como estas faixas são tão diferentes e os valores de δ13C podem ser rotineiramente medidos dentro de 0,02%o, fica relativamente fácil distinguir entre resíduos vegetais derivados de plantas de C3 versus plantas de C4. Isto tem uma infinidade de aplicações em arqueologia e outros campos nos quais a análise de resíduos contendo carbono provenientes de restos de comida ou de esqueletos pode ser usada para investigar a evolução, as atividades e a alimentação de seres humanos e outros animais.
[00332] Mais recentemente, os valores de δ13C têm sido utilizados para detectar fraudes econômicas, especialmente na adulteração de gêneros alimentícios por outros materiais - incluindo produtos sintéticos potencialmente nocivos derivados de petroquímicos. Por exemplo, o óleo de milho é considerado um óleo vegetal premium e produtores inescrupulosos ficam tentados a diluir o óleo de milho com óleos mais baratos. Felizmente, o óleo de milho é derivado de uma planta de C4 ao passo que a maioria das alternativas mais baratas são derivadas de plantas de C3 ou de animais. O δ13C para 0 óleo de milho autêntico varia portanto entre -13,7%o e -16,4%o em comparação com -25%o a -32%o para as alternativas. Qualquer diluição significativa do óleo de milho por uma alternativa mais barata pode ser detectada medindo-se seu δ13C. Da mesma forma, a adição de cana-de-açúcar (um produto da fotossíntese de C4) a sucos de fruta, vinhos, espíritos, e mel (todos os produtos da fotossíntes de C3) pode ser detectada medindo-se os valores de δ13C. É até mesmo possível detectar a adulteração de sabores naturais por análogos sintéticos e 0 uso de suplementos hormonais sintéticos ilegais via valores de δ13C.
[00333] A presente invenção se utiliza da possibilidade de se medir com precisão os valores de δ13C para produzir novos polímeros isoprê- nicos isotopicamente únicos que podem ser facilmente distinguidos de polímeros derivados de estoques de alimentação à base de petróleo. A presente invenção também se utiliza da possibilidade de se medir com precisão os valores de δ13C para produzir novos polímeros isoprênicos isotopicamente únicos que podem ser facilmente distinguidos de borracha natural. Um aspecto notável da presente invenção é que ela oferece novos polímeros uma ampla faixa de valores de δ13C que podem ser ajustados e subsequentemente verificados quanto à autenticidade. Como descrito acima, estes novos polímeros atendem a uma crescente necessidade dos clientes de poder verificar produtos que não contêm possíveis alérgenos proteináceos nem estoques de alimentação derivados de petróleo.
[00334] Os polímeros representados pela presente invenção contêm unidades de isopreno que são isotopicamente únicas em comparação com a borracha natural e com polímeros sintéticos contendo isopreno derivado de petróleo. No caso da borracha natural derivada da Hevea brasiliensis (isto é, a seringueira natural comum), os valores de δ13C tipicamente variam de cerca de -27%o a cerca de -28%o. A borracha de guayule, que é derivada de um arbusto de deserto, tem um δ13C de cerca de -31 %o. Ambas as borrachas apresentam valores de δ13C esperados para produtos da fotossínte de C3, e sabe-se que ambas as borrachas contêm proteínas ligadas a polímero.
[00335] O poli-isopreno sintético tradicional pode ter valores de δ13C diferentes dependendo da fonte de isopreno. Para isopreno derivado da destilação extrativa de correntes de C5 das refinarias de petróleo, o δ13C varia de cerca de -22%o a cerca de -24%o. Esta faixa é típica para hidrocarbonetos insaturados leves derivados de petróleo, e polímeros contendo isopreno derivado de petróleo tipicamente contêm unidades isoprênicas com 0 mesmo δ13C. Para polímeros contendo isopreno de-rivado da reação de isobutileno com formaldeído, os valores de δ13C podem ser iguais a cerca de -34,4%o porque 0 formaldeído geralmente é derivado de estoques de alimentação com valores de δ13C muito mais negativos.
[00336] A presente invenção oferece polímeros contendo isopreno com valores de δ13C muito diferentes. Por exemplo, a fermentação de glicose derivado de milho (δ13C -10,73%o) com quantidades mínimas de outros nutrientes contendo carbono (por exemplo, extrato de levedura) produz isopreno que pode ser polimerizado formando poli-isopreno com δ13C -14,66%o a -14,85%o. O δ13C para este polímero está nitidamente em uma nova faixa que está bastante fora dos limites normais para a borracha natural e todos os poli-isoprenos sintéticos já conhecidos, e se encontra dentro da faixa normalmente associada a produtos derivados de plantas de C4. O valor de δ13C singular para este polímero é uma consequência direta do fato de que o isopreno é derivado de glicose proveniente de milho, que na verdade é um produto derivado de plantas de C4.
[00337] Os versados na técnica reconhecem que resultados semelhantes podem ser obtidos com o uso de outros açúcares ou fermentáveis derivados de plantas de C4. Por exemplo, a sacarose da cana-de- açúcar (δ13C -10,4°/oo), o açúcar invertido da cana-de-açúcar (δ13C - 15,3%o), a glicose de amido de milho (δ13C -11,1%o), e a glicose da degradação hidrolítica da palha de milho (δ13C -11,3%o) ou do bagaço da cana-de-açúcar (δ13C -13,0%o) devem produzir isopreno que pode ser usado para produzir polímeros de isopreno com valores de δ13C que são menos negativos que os da borracha natural ou de polímeros sintéticos contendo isopreno derivado de petróleo. Os versados na técnica também vão reconhecer que deve ser possível produzir isopreno e polímeros de isopreno com δ13C menos negativos que cerca de -22%o a partir de estoques de alimentação fermentáveis com δ13C aproxima-damente maior (isto é, menos negativo) que cerca de -18%o, incluindo misturas de estoques de alimentação fermentáveis com um δ13C médio aproximadamente maior que cerca de -18%o.
[00338] Além de produzir polímeros contendo isopreno com valores de δ13C característicos de produtos derivados de plantas de C4, os versados na técnica vão reconhecer que polímeros contendo isopreno com marcação isotópica única podem ser produzidos a partir de estoques de alimentação não C4fermentáveis. Por exemplo, a glicose proveniente de polpa de madeira mole hidrolisada (δ13C -23%o) deve dar isopreno e poli-isopreno com δ13C próximo a -27%o, que está dentro de uma faixa única entre as faixas normais observadas para o isopreno derivado da destilação extrativa de frações de C5 e para o isopreno derivado da reação de isobutileno com formaldeído. Os versados na técnica também vão reconhecer que a fermentação de outros açúcares com faixas de δ13C entre aproximadamente -20%o e cerca de -28%o devem produzir isopreno e polímeros isoprênicos com δ13C variando de cerca de -24%o a cerca de -32%o. Esses outros açúcares podem incluir (porém sem limitação) glicose derivada de celulose hidrolisada (δ13C - 25 ± 2%o), açúcar invertido derivado de beterraba (δ13C -26 %o a -27 %o), e lactose (δ13C -27 %o a -28%o). A fermentação de óleos vegetais (δ13C -26 %o a -32%o), incluindo óleo de palma (δ13C -30%o) pode dar acesso a polímeros de isopreno com δ13C mais negativo que -30%o.
[00339] Os versados na técnica vão reconhecer que a cofermenta- ção de de dois ou mais estoques de alimentação podem ser usada para produzir isopreno e por conseguinte polímeros contendo isopreno com valores intermediários de δ13C. Por exemplo, uma mistura 1:1 de sacarose derivada de cana-de-açúcar (δ13C - 10,4%o) e sacarose derivada de beterraba (δ13C -26 %o a -27 %o) deve produzir isopreno e por conseguinte polímeros contendo isopreno com aproximadamente o mesmo valor de δ13C que o polímero o polímero produzido a partir de sacarose derivada de uma única fonte com o valor médio de δ13C (isto é, aproximadamente -18,5%o). O mesmo deve ocorrer para açúcares invertidos derivados de açúcar e beterraba. Nos dois casos, é óbvio que os mesmos polímeros poderiam ser sintetizados por misturação e em seguida (co)polimerização de quantidades iguais de isopreno preparado separadamente a partir de sacarose ou de açúcar invertido derivado de cana-de-açúcar e beterraba. Também é óbvio que a cofer- mentação de açúcares com outros estoques de alimentação fermentáveis - tais como extrato de levedura e óleos vegetais - podem ser usa- dos para produzir isopreno e por conseguinte polímeros contendo isopreno com valores intermediários de δ13C. Por exemplo, a cofermenta- ção de glicose (δ13C -1O,73%o) e extrato de levedura (δ13C -26 %o a - 27%o) em uma proporção de 181,2 : 17,6 produz isopreno que pode ser polimerizado produzindo poli-isopreno com valores de δ13C de -18 %o a -20 %o. Ao contrário, a fermentação de glicose com uma quantidade mínima de extrato de levedura e subsequente polimerização do isopreno produz poli-isopreno com valores de δ13C de -14%o a -15%o.
[00340] Para copolimeros de isopreno com outros monômeros, os versados na técnica reconhecem que existe uma quantidade limitada de isopreno que é incoporado no esqueleto do polímero como "blocos" de poli-isopreno. A tendência do isopreno a formar blocos de duas ou mais unidades isoprênicas - mesmo em "copolimeros aleatórios" - depende de muitos fatores, incluindo a quantidade de isopreno em relação aos outros monômeros, o tipo de catalisador usado para polimerização, e as condições de reação específicas para a polimerização. A presença desses blocos junto com o esqueleto do polímero geralmente pode ser detectada por espectroscopia com RMN. Com o uso de uma combinação de degradação química (por exemplo, ozonólise) e croma- tografia, é possível isolar fragmentos desses blocos para análise química, incluindo a medida dos valores de δ13C para os blocos derivados de isopreno. Isto oferece uma maneira para determinar se os copolimeros de isopreno com outros monômeros contêm isopreno derivado de estoques de alimentação renováveis/sustentáveis, especialmente estoques de alimentação derivados de plantas de C4.
[00341] Os polímeros de poli-isopreno desta invenção que são feitos com monômero isopreno proveniente de culturas de células que utilizam fontes de carbono biorrenováveis podem ser identificados como tais por seu valor de δ13C e outras características do polímero. Por exemplo, é possível verificar que os seguintes polímeros contendo iso- preno contêm monômero isopreno que foi produzido utilizando o método desta invenção: (1) Polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C superior a - 22%o. Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor de δ13C que é superior a -21 %o, e também podem ter um valor de δ13C que é superior a -20%o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -22%o a -10%o, e em outros casos terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -21%o a -12%o. Em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -20%o a -14%o. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno será borracha de homopolímero de poli- isopreno. (2) Um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -3O%o a -28,5%o. Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -30%o a -29%o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -30%o a -29%o, e em outros casos o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de - 30%o a -29,5%o. Em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno pode ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -29,5%o a -28,5%o e em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno pode ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -29,0%o a -28,5%o. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno será borracha de homopolímero de poli-isopreno. (3) Um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o poli-isopreno é livre de proteína, e onde o polímero de poli- isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a - 24%o. Em alguns casos este polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em outros casos o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o, e em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno será borracha de homopolí- mero de poli-isopreno. (4) Um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um teor de cis-1,4- microestruturas inferior a 99,9%, onde o polímero de poli-isopreno tem um teor de trans-1,4-microestruturas inferior a 99,9%, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de - 34%o a -24%o. Tal poli-isopreno pode ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em alguns casos o polímero de poli- isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a - 25°/oo. Em outros casos o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. O polímero de poli- isopreno pode ter um teor de cis-1,4-microestruturas inferior a 99,8%. Em outros casos o polímero de poli-isopreno terá um teor de cis-1,4- microestruturas inferior a 99,7%. Em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno terá um teor de cis-1,4-microestruturas inferior a 99,5% ou ainda inferior a 99%. Em muitos casos o polímero de poli-isopreno terá um teor de cis-1,4-microestruturas inferior a 98,5% ou ainda inferior a 98%. Este polímero de poli-isopreno também pode ter uma poli- dispersidade inferior a 2,0 ou ainda inferior a 1,8. Em alguns casos o polímero de poli-isopreno tem uma polidispersidade inferior a 1,6 ou ainda inferior a 1,5. Em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno pode ter uma polidispersidade inferior a 1,4 ou ainda inferior a 1,2. Em muitos casos o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,1. (5) Um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um teor de 3,4-microestruturas superior a 2%, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o. Tais polímeros de poli- isopreno podem ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em alguns casos o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o. Em outros casos polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. O polímero de poli-isopreno pode ter um teor de 3,4- microestruturas superior a 5%. Em alguns casos o polímero de poli- isopreno terá um teor de 3,4-microestruturas superior a 10%. Em outros casos o polímero de poli-isopreno terá um teor de 3,4- microestruturas superior a 15%.Em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno terá um teor de 3,4-microestruturas superior a 20%. Em muitos casos o polímero de poli-isopreno terá um teor de 3,4- microestruturas superior a 25%. Este polímero de poli-isopreno pode ter uma polidispersidade inferior a 2,0. Em alguns casos o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,8. Em outros casos o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,6. Em ainda outros casos o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,5 ou ainda inferior a 1,4. Em muitos casos o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,2 ou ainda inferior a 1,1. (6) Um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um teor de 1,2-microestruturas superior a 2%, e onde o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o. Os polímeros de poli- isopreno deste tipo podem ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. O polímero de poli-isopreno pode ter um teor de 1,2-microestruturas superior a 5%. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de 1,2-microestruturas superior a 10%. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de 1,2- microestruturas superior a 15%. Em ainda outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de 1,2- microestruturas superior a 20%. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de 1,2- microestruturas superior a 25%. O polímero de poli-isopreno pode ter uma polidispersidade inferior a 2,0. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,8. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,6. Em ainda outros casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,5. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 1,4 ou ainda inferior a 1,2. É possível que o polímero de poli-isopreno tenha uma polidispersidade inferior a 1,1. (7) Um polímero que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno e pelo menos um monômero adicional, onde o polímero inclui blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, e onde os blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno têm um valor de δ13C superior a -22%o. Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor de δ13C que é superior a -21 %o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terão um valor de δ13C que é superior a -20%o. Em outros casos, o po- límero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -22%o a -10%o. Em ainda outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -21 %o a -12%o. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -20%o a -14%o. (8) Um polímero que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno e pelo menos um monômero adicional, onde o polímero inclui blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, e onde os blocos de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno têm um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o. Tais copolimeros podem ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em alguns casos, o copolímero deste tipo terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o. Em outros casos, os copolimeros deste tipo terão um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. Os copolimeros deste tipo podem ser copolimeros de borracha de isopreno e 1,3 - butadiene, copolimeros de borracha de isopreno e estireno, copolimeros de borracha de isopreno e a-metil estireno, e similares. (9) Um polímero de poli-isopreno líquido que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno tem um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e onde o polímero de poli-isopreno líquido tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o. Tais polímeros de poli-isopreno líquido podem ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. Tais polímeros de poli-isopreno líquido podem ter um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 20.000 a 80.000. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um peso molecular médio ponderla que varia dentro da faixa de 30.000 a 50.000. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersidade inferior a 2,0 ou ainda inferior a 1,8. Em ainda outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersidade inferior a 1,6 ou ainda inferior a 1,5. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersidade inferior a 1,4 ou ainda inferior a 1,2. É possível que o polímero de poli-isopreno líquido tenha uma polidispersidade inferior a 1,1. (10) Um polímero de poli-isopreno líquido que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de um monômero de isopreno, onde o polímero de poli-isopreno líquido tem um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e onde o polímero de poli-isopreno líquido tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o. Tais polímeros de poli-isopreno líquido podem ter um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -25%o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o. Em ainda outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -32%o a -25%o. Tal poli-isopreno líquido pode ter um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 20.000 a 80.000. O poli-isopreno líquido tipicamente terá um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 30.000 a 50.000. Tal poli-isopreno líquido pode ter uma polidispersidade inferior a 2,0. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersidade inferior a 1,8. Em outros casos, o polímero de poli- isopreno líquido tem uma polidispersidade inferior a 1,6. Em ainda outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersidade inferior a 1,5 ou ainda inferior a 1,4. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersidade inferior a 1,2 ou ain- da inferior a 1,1.
[00342] Esta invenção é ilustrada pelos exemplos a seguir que são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como limitativos do escopo da invenção ou da maneira em que ela pode ser praticada. A menos que especificamente indicado em contrário, as partes e percentagens estão dadas em peso.
EXEMPLOS
[00343] Os exemplos, que são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como limitativos do escopo da invenção de forma alguma, também descrevem e apresentam detalhes dos aspectos e modalidades da invenção descritos acima. A menos que de outra forma indicado, a temperatura está em graus centígrados e a pressão é a pressão atmosférica ou próxima à pressão atmosférica. Os exemplos precedentes e a descrição detalhada são oferecidos a título ilustrativo e não a título limitativo. Todas as publicações, pedidos de patente, e patentes citados neste relatório estão aqui incorporados a título de referência como se cada publicação, pedido de patente ou patente individual tivesse sido especificamente e individualmente mencionado ter sido incorporado a título de referência. Em particular, todas as publicações citadas nesta invenção são expressamente incorporadas a título de referência com o propósito de descrever e apresentar composições e metodologias que poderiam ser usadas junto com a invenção. Embo-ra a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes a título ilustrativo e exemplificativo com fins de clareza de compreensão, ficará evidente para os versados na técnica que à luz dos ensinamentos desta invenção certas variações e modificações podem ser feitas sem contudo se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexas.
[00344] Na prática desta invenção a análise de 13C pode ser feita carregando-se amostras de 0,5 a 1,0 mg em vasilhas de estanho para análise isotópica de carbono usando um analisador elemental Costech ECS4010 como uma entrada para um espectrômetro de massas de razão isotópica ThermoFinnigan Delta Plus XP. As amostras são vertidas em um reator de combusão de óxido cobaltoso/cobáltico a 1020°C com gases de combustão sendo passados em um corrente de hélio a 85mL/min através de reator de cobre (650°C) para converter NOX em N2. CO2 e N2 são separados usando uma coluna de peneira molecular 5A 3-m. Em seguida, as proporções de 13C/12C são calibradas na escala VPDB usando dois padões de laboratório (Acetanilida B, -29,52 ± 0,02%om e amido de milho A, -11,01 ±0,02%o) que foram cuidadosamente calibrados na escala VPDB por combustão fora de linha e análise de entrada dupla usando a abordagem de 2 padrões de T. B. Co- plen et al., New Guidelines for δ13C Measurements, Anal. Chem., 78, 2439-2441 (2006). Os ensinamentos da Coplen estão aqui incorporados a título de referência com 0 propósito de ensinar a técnica para determinar valores de δ13C.
Exemplo 1: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu recombinante I. Construção de vetores para expressão do isopreno sintase de kudzu em E. coli
[00345] A sequência proteica para 0 gene de isopreno sintase de kudzu (Pueraria montana) (IspS) foi obtida no GenBank (AAQ84170). Um gene de isopreno sintase de kudzu, otimizado para uso em códon de E. coli, foi adquirido no DNA2.0 (SEQ ID N°: 1). O gene de isopreno sintase foi removido do plasmídeo fornecido por digestão com endonuclease de restrição com BspLUHI ZPstl, purificado com gel, e ligado em pTrcHis2B (Invitrogen) que fora digerido com NcoVPstl. A construção foi desenhada de modo que 0 códon de terminação no gene de isopreno sintase 5' para 0 sítio Pstl. Como resultado, quando a construção foi expressa, 0 His-Tag não está ligado à proteína isopreno sintase. O plasmídeo resultante, pTrcKudzu, foi verificado por sequenci- amento (figuras 2 e 3).
[00346] O gene de isopreno sintase também foi clonado em pET 16b (Novagen). Neste caso, o gene de isopreno sintase foi inserido em pET16b de modo que a proteína isopreno sintase recombinante contivesse o His tag N-terminal. O gene de isopreno sintase foi amplificado a partir de pTrcKudzu por PCR usando o conjunto de iniciadores pET- His-Kudzu-2F: 5'- CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAA- TTTAC (SEQ ID N°: 3) e pET-His- Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID N°: 4). Esses iniciadores acrescentaram um sítio Ndel à extremidade 5' e um sítio BamHI à extremidade 4' do gene, respectivamente. O plasmídeo pTrcKudzu, descrito acima, foi usado como DNA gabarito, Her- culase polimerase (Stratagene) foi usada de acordo com as instruções do fabricante, e iniciadores foram adicionados a uma concentração de 10 pmoles. A PCR foi realizada em um volume total de 25 pl. O produto de PCR foi digerido com Ndel/BamHI e clonado em pET16b digerido com as mesmas enzimas. A mistura de ligação foi transformada em Top10 de E. coli (Invitrogen) e o clone correto selecionado por sequen- ciamento. O plasmídeo resultante, no qual o gene de isopreno sintase de kudzu foi expresso a partir do promotor T7, foi designado pETNHis- Kudzu (figuras 4 e 5).
[00347] O gene de isopreno sintase de kudzu também foi clonado no plasmídeo de baixo número de cópias pCL1920. Iniciadores foram usados para amplificar o gene de isopreno sintase de kudzu a partir do pTrcKudzu descrito acima. O iniciador de sentido normal acrescentou um sítio HindiII site e um RBS de consenso de E. coli à extremidade 5'. O sítio de clonagem Pstl já estava presente no pTrcKudzu em 3' do códon de terminação e assim o iniciador invertido foi construído de modo que o produto final de PCR incluísse o sítio Pstl. As sequências dos iniciadores eram: Hindlll-rbs-Kudzu F: 5'- CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAA- TAAACC (SEQ ID N°: 6) e BamHI-Kudzu R: 5'- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAG- CTG (SEQ ID N°: 4). O produto de PCR foi amplificado usando Hercu- lase polimerase com iniciadores a uma concentração de 10 pmoles e com 1 ng de DNA gabarito (pTrcKudzu). O protocolo de amplificação incluía 30 ciclos de (95° C por 1 minuto, 60° C por 1 minuto, 72° C por 2 minutos). O produto foi digerido com Hindlll e Pstl e ligado em pCL1920 que também havia sido digerido com Hindlll e Pstl. A mistura de ligação foi transformada em Top 10 de E. coli. Vários transforman- tes foram examinados por sequenciamento. O plasmídeo resultante foi designado pCL-lac- Kudzu (figuras 6 e 7).
II. Determinação da produção de isopreno
[00348] Para as culturas em balão oscilante, um ml de uma cultura foi transferido dos balões oscilantes para frascos de headspace CTC de 20 ml (Agilent cat de frascos # 5188 2753; cat de tampas # 5188 2759). A tampa foi bem rosqueada e os frascos foram incubados à temperatura ambiente equivalente com agitação a 250 rpm. Depois de 30 minutos os frascos foram removidos da incubadora e analisados da maneira descrita abaixo (vide Tabela 1 para alguns valores experimentais deste ensaio).
[00349] Nos casos em que a produção de isopreno nos fermentado- res foi determinada, amostras foram coletadas do gás desprendido do fermentador e analisadas diretamente da maneira descrita abaixo (vide Tabela 2 para alguns valores experimentais deste ensaio).
[00350] A análise foi realizada usando um sistema de GC/MS Agilent 6890 fazendo interface com um classificador automático CTC Analytics (Suíça) CombiPAL operando no modo de headspace. Uma coluna de GC/MS Agilent HP-5MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 pm de espessura do filme) foi usada para separação dos analitos. O classificador foi ajustado para injetar 500 pL de gás de headspace. O método de GC/MS utilizou hélio como o gás carreador a um fluxo de 1 ml/minutos. O canal de injeção foi mantido a 250° C com uma relação de separa- ção de 50:1. A temperatura do forno foi mantida a 37°C por 2 minutos, o período de duração da análise. O detector seletivo de massas Agilent 5793N foi operado no modo de monitoramento de íons simples (SIM) em m/z 67. O detector ficava desligado de 1,4 a1,7 minutos para permitir a eluição dos gases permanentes. Nessas condições foi observado que o isopreno (2- metil- 1,3-butadieno) eluiu em 1,78 minutos. Uma tabela de calibração foi usada para quantificar a quantidade absoluta de isopreno e foi verificado que era linear de 1 pg/L a 200 pg/L. O limite de detecção foi estimado em 50 a 100 ng/L usando este método.
III. Produção de isopreno em balões oscilantes contendo células de E. coli expressando isopreno sintase recombinante
[00351] Os vetores descritos acima foram introduzidos na cepa BL21 de E. coli (Novagen) para produzir as cepas BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu e BL21/pETHisKudzu. As cepas foram espalhadas para isolamento sobre LA (ágar de Luria) e carbenicilina (50 pg/ml) e incubadas durante uma noite a 37° C. Colônias simples foram inoculadas em balões oscilantes defletidos de 250 ml contendo 20 ml de caldo de Luria Bertani (LB) e carbenicilina (100 pg/ml). As culturas foram cultivadas por uma noite a 20°C com agitação a 200 rpm. A ODeoo das culturas de uma noite foram medidas e as culturas foram diluídas em um balão oscilante defletido de 250 ml contendo de 30 ml de Ma- gicMedia (Invitrogen) e carbenicilina (100 pg/ml) até uma ODeoo ~ 0,05. A cultura foi incubada a 30° C com agitação a 200 rpm. Quando a ODeoo ~ 0,5 - 0,8, 400 pM de IPTG foram adicionados e as células foram incubadas por mais 6 horas a 30° C com agitação a 200 rpm. 0, 2, 4 e 6 horas depois de indução com IPTG, alíquotas de 1 ml das culturas foram coletadas, a ODeoo foi determinada e a quantidade de isopreno produzido foi medida da maneira descrita acima. Os resultados estão mostrados na figura 8.
IV. Produção de isopreno a partir de BL21/ptrcKudzu em fermentação com capacidade para 14 litros
[00352] A produção em grande escala de isopreno a partir de E. coli contendo o gene de isopreno sintase recombinante de kudzu foi determinada a partir de uma cultura com alimentação intermitente. A receita do meio de fermentação (TM2) por filtro de meio de fermentação foi a seguinte: K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono-hidratado 2 g, citrato de amónio férrico 0,3 g, (NH4)2SO4 3,2 g, extrato de levedura 5 g, solução de metais de traço modificados 1000X 1 ml. Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo e dissolvidos em dil-hO. O pH foi ajustado em 6,8 com hidróxido de potássio (KOH) e q.s. para completar 0 volume. O produto final foi esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 p (apenas, não em autoclave). A receita da solução de metais de traço modificados 1000X foi a seguinte: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoθ4 * 2H2O 100 mg. Cada componente foi dissolvido um por vez em diH2O, 0 pH foi ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida q.s. para completar 0 volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 p.
[00353] Esta experiência foi realizada em um biorreator de 14 L para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose ao pH de fermentação desejado pH 6,7 e a uma temperatura de 34° C. Um inoculo da cepa BL21 ZptrcKudzu de E. coli retirado de um frasco congelado foi preparado em um meio de soytone-extrato de levedura-glicose. Depois que 0 inoculo cresceu até ODsso = 0,6, dois balões de 600 ml foram centrifugados e os conteúdos foram ressuspendidos em 70 ml de so- brenadante para transferir a pelota de células (70 ml de material de OD 3,1) para 0 biorreator. Em vários tempos depois da inoculação, amostras foram removidas e a quantidade de isopreno produzido foi determinada da maneira descrita acima. Os resultados estão mostrados na figura 9.
Exemplo 2: Produção de isopreno em E. coli expres- sando isopreno sintase de choupo recombinante
[00354] A sequência proteica para o isopreno sintase de choupo (Populus alba x Populus tremula) (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786) foi obtida no GenBank (CAC35696). Um gene, códon otimizado para E. coli, foi adquirido no DNA2.0 (p9796-choupo, figuras 30 e 31). O gene de isopreno sintase foi removido do plasmídeo fornecido por digestão com endonuclease de restrição com BspLU111/Pstl, purificado com gel, e ligado em pTrcHis2B que fora digerido com Ncol/Pstl. A construção é clonada de modo que o códon de terminação no enxerto fique antes do sítio Pstl, o que resulta em uma construção na qual o His tag não é ligado à proteína isopreno sintase. O plasmídeo resultante pTrcPoplar (figuras 32 e 33), foi analisado por sequen- ciamento.
Exemplo 3: Produção de isopreno em Panteoa citrea expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
[00355] Os plasmídeos pTrcKudzu e pCL-lac Kudzu descritos no Exemplo 1 foram eletroporados em P. citrea (Patente US N° 7.241.587). Transformantes foram selecionados sobre LA contendo carbenicilina (200 pg/ml) ou espectinomicina (50 pg/ml), respectivamente. A produção de isopreno nos balões oscilantes e a determinação da quantidade de isopreno produzido foram efetuadas da maneira descrita no Exemplo 1 para cepas de E. coli expressando isopreno sintase de kudzu recombinante . Os resultados estão mostrados na figura 10.
Exemplo 4: Produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase de kudzu recombinante I. Construção de um plasmídeo replicante de B. subtilis para a expressão de isopreno sintase de kudzu
[00356] O gene de isopreno sintase de kudzu foi expresso na cepa aprEnprE Pxyl- comK de Bacillus subtilis (BG3594comK) usando um plasmídeo replicante (pBS19 com um cassete de resistência ao cloran- fenicol) sob controle do promotor aprE. O gene de isopreno sintase, o promotor aprE e o terminador de transcrição foram amplificados separadamente e fundidos usando PCR. A construção foi então clonada em pBS19 e transformada em B. subtilis.
a) Amplificação do promotor aprE
[00357] O promotor aprE foi amplificado a partir de DNA cromossô- mica de Bacillus subtilis usando os seguintes iniciadores: CF 797 (+) Mfel inicial do promotor aprE 5'- GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID N°: 58) CF 07-43 (-) Fusão do promotor aprE ao Kudzu ispS 5'- ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTAC- CCTCTCCTTTTA (SEQ ID N°: 59)
b) Amplificação do gene de isopreno sintase
[00358] O gene de isopreno sintase de kudzu foi amplificado a partir do plasmídeo pTrcKudzu (SEQ ID N°: 2). O gene teve o códon otimizado para E. coli e foi sintetizado por DNA 2.0. Os seguintes iniciadores foram usados: CF 07-42 (+) Fusão do promotor aprE ao gene de isopreno sintase de kudzu (GTG códon inicial) 5'- TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTT- CTCAAT (SEQ ID N°: 60) CF 07-45 (-) Fusão da extremidade 3' do gene de isopreno sintase de kudzu ao terminador 5'- CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGT- TAATC (SEQ ID N°: 61)
c) Amplificação do terminador de transcrição
[00359] O terminador da serina protease alcalina de Bacillus amyli- quefaciens foi amplificado a partir de um plasmídeo pJHPms382 previamente sequenciado usando os seguintes iniciadores: CF 07-44 (+) Fusão da extremidade 3' de isopreno sintase de kudzu ao terminador 5'- GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGG- CCTTGG (SEQ ID N°: 62) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador de B. amyliquefaci- ens (BamHI) 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63)
[00360] O fragmento de kudzu foi fundido ao fragmento do terminador usando PCR com os seguintes iniciadores: CF 07-42 (+) Fusão do promotor aprE ao gene de isopreno sintase de kudzu (GTG códon inicial) 5'- TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTT- CTCAAT (SEQ ID N°: 61) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador de B. amyliquefaci- ens (BamHI) 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63)
[00361] O fragmento do terminador de kudzu foi fundido ao fragmento do promotor usando PCR com os seguintes iniciadores: CF 797 (+) Mfel inicial do promotor aprE 5'- GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID N°: 64) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador de B. amyliquefaci- ens (BamHI) 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63)
[00362] O fragmento de PCR de fusão foi purificado usando um kit Qiagen e digerido com as enzimas de restrição Mfel e BamHI. Este fragmento de DNA digerido foi purificado em gel usando um kit Qiagen e ligado a um vetor conhecido como pBS19, que fora digerido com EcoRI e BamHI e purificado em gel.
[00363] A mistura de ligação foi transformada em células Top 10 de E. coli e colônias foram selecionadas sobre placas de LA e 50 carbeni- cilina. Um total de seis colônias foi escolhido e cultivado por uma noite em LB e 50 carbenicilina e em seguida plasmídeos foram isolados usando um kit Qiagen. Os plasmídeos foram digeridos com EcoRI e BamHI para verificar os enxertos e três dos plasmídeos corretos foram enviados para sequenciamentos com os seguintes iniciadores: CF 149 (+) EcoRI inicial do promotor aprE 5'- GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 65) CF 847 (+) Sequência em pXX 049 (extremidade do promotor aprE) 5'- AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID N°: 66) CF 07-45 (-) Fusão da extremidade 3' de isopreno sintase de kudzu ao terminador 5'- CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGT- TAATC (SEQ ID N°: 61) CF 07-48 (+) Sequenciamento do iniciador para isopreno sintase de kudzu 5'- CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID N°: 67) CF 07-49 (+) Sequenciamento em kudzu isopreno sintase 5'- GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID N°: 68)
[00364] O plasmídeo designado pBS Kudzu #2 (figuras 52 e 12) estava correto por sequenciamento e foi transformado em BG 3594 comK, uma cepa hospedeira de Bacillus subtilis. A seleção foi feita sobre placas de LA e 5 cloranfenicol. Um transformante foi escolhido e deixado desenvolver colônias simples em LA e 5 cloranfenicol, e em seguida cultivados em LB e 5 cloranfenicol até atingir uma ODeoo de 1,5. Ele foi armazenado congelado em um frasco a -80° C na presence de glicerol. A cepa resultante foi designada CF 443.
II. Produção de isopreno em balões oscilantes contendo células de B. subtilis expressando isopreno sintase recombinante.
[00365] Culturas de uma noite foram inoculadas com uma única colônia de CF 443 de um meio de LA e Cloranfenicol (Cm, 25 pg/ml). As culturas foram cultivadas em LB e Cm a 37° C com agitação a 200 rpm. Essas culturas de uma noite (1 ml) foram usadas para inocular balões oscilantes defletidos de 250 ml contendo 25 ml de meio Grants II e cloranfenicol a uma concentração final de 25 pg/ml. A receita do meio Grants II Media foi a seguinte: 10 g de soytone, 3 ml de K2HPO4 1M, 75 g de glicose, 3,6 g de ureia, 100 ml de MOPS 10X, q.s. para 1 L com H2O, pH 7,2; a receita de MOPS 10X foi a seguinte: 83,72 g de MOPS, 7,17 g de tricina, 12 g de pelotas de KOH, 10 ml de solução 0,276M de K2SO4, 10 ml de solução 0,528M de MgCh, 29,22 g de NaCI, 100 ml de micronutrientes 100X, q.s. para 1 L com H2O; e a receita de micronutrientes foi a seguinte: 1,47 g de CaCl2*2H2O, 0,4 g de FeSO4*7H20, 0,1 g de MnSO4*H20, 0,1 g de ZnSO4*H2O, 0,05 g de CUCI2*2H2O, 0,1 g de CoCl2*6H2O, 0,1 g de Na2MoO4*2H2O, q.s. para 1 L com H2O. Os balões oscilantes oscilantes foram incubados a 37°C e amostras foram coletadas em 18, 24, e 44 horas. 18 horas depois os headspaces de CF443 e da cepa de controle tiveram amostras coletadas. Isto representava 18 horas de acúmulo de isopreno. A quantidade de isopreno foi determinada por cromatografia gasosa da maneira descrita no Exemplo 1. A produção de isopreno foi significativamente aumentada por expressão do isopreno sintase recombinante (figura 11).
III. Produção de isopreno por CF443 em fermentação com capacidade para 14 L
[00366] A produção em grande escala de isopreno proveniente de B. subtilis contendo 0 gene de isopreno sintase recombinante de kudzu em um plasmídeo replicante foi determinada a partir de uma cultura com alimentação intermitente. A cepa CF 443de Bacillus, expressando um gene de isopreno sintase de kudzu, ou uma cepa de controle que não expressa um gene de isopreno sintase de kudzu foi cultivada por fermentação com alimentação intermitente convencional em um meio nutriente contendo farinha de soja (Cargill), fosfato de sódio e potássio, sulfato de magnésio e uma solução de ácido cítrico, cloreto férrico e cloreto de manganês. Antes da fermentação o meio é macerado por 90 minutos usando uma mistura de enzimas incluindo celulases, hemice- lulases e pectinases (vide o documento WO95/04134). Fermentações com capacidade para 14 L são alimentados com 60% p/p de glicose (dextrose DE99 Cargill, verduras ("greens") ADM Versadex ou açúcar invertido Danisco) e 99% p/p de óleo (óleo de soja Western Family, onde 99% p/p é a concentração de óleo antes de ele ter sido adicionado ao meio de cultura de células). A alimentação foi iniciada quando a glicose na batelada não era detectável. A taxa de alimentação foi aumentada por várias horas e foi ajustada para adicionar o óleo na mesma base que o carbono. O pH foi controlado em 6,8 - 7,4 usando hidróxido de amónio a 28% p/v. No caso espumação, um agente anties- pumante foi adicionado ao meio. A temperatura de fermentação foi controlada em 37°C e a cultura de fermentação foi agitada a 750 rpm. Vários outros parâmetros tais como pH, DO%, fluxo de ar, e pressão foram monitorados durante todo o processo. A DO% foi mantida acima de 20. Amostras foram coletadas durante um período de 36 horas e analisadas quanto ao crescimento celular (OD550) e a produção de iso-preno. Os resultados destas experiências estão apresentados nas figuras 53A e 53B.
IV. Integração da isopreno sintase de kudzu (ispS) em B. subtilis.
[00367] O gene de isopreno sintase de kudzu foi clonado em um plasmídeo de integração (pJH101- cmpR) sob 0 controle do promotor aprE. Nas condições testadas, não foi detectado isopreno.
Exemplo 5: Produção de isopreno em Trichoderma I. Construção de vetores para expressão da isopreno sintase de kudzu em Trichoderma reesei
[00368] O gene de IS de kudzu de códon otimizado de Yarrowia li- polytica foi sintetizado por DNA 2.0 (SEQ ID N°: 8) (figura 13). Este plasmídeo serviu de gabarito para a seguinte reação de amplificação por PCR: 1 pl de plasmídeo gabarito (20 ng/ul), 1 pl do iniciador EL- 945 (10 uM) 5'- GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCA- ATTGG (SEQ ID N°: 9), 1 pl do iniciador EL-965 (10 uM) 5'- CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID N°: 10), 1 pl de dNTP (10 mM), 5 pl de tampão 10x Pfullltra II Fusion HS DNA Polime- rase, 1 pl de Pfullltra II Fusion HS DNA Polimerase, 40 pl de água em um volume reacional total de 50 pl. O iniciador de sentido normal continha mais 4 nucleotídeos na extremidade 5' que não correspondiam ao gene de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado de Y. lipolytica, mas eram necessários para clonagem no vetor pENTR/D-TOPO. O iniciador invertido continha mais 21 nucleotídeos na extremidade 5' que não correspondiam ao gene de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado de Y. lipolytica, mas foram inseridos para clonagem em outros esqueletos de vetor. Usando o termociclizador MJ Research PTC- 200, a reação de PCR foi realizada da seguinte maneira: 95° C por 2 minutos (apenas o primeiro ciclo), 95° C por 30 segundos, 55° C por 30 segundos, 72° C por 30 segundos (repetido por 27 ciclos), 72° C por 1 minuto depois do último ciclo. O produto de PCR foi analisado em um E-gel a 1,2% para confirmar o sucesso da amplificação do gene de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado de Y. lipolytica.
[00369] O produto de PCR foi então clonado usando o kit de clonagem TOPO pENTR/D-TOPO seguindo o protocolo do fabricante: 1 pl de reação de PCR, 1 pl de solução salina, 1 pl de vetor TOPO pENTR/D-TOPO e 3 pl de água em um volume reacional total de 6 pl. A reação foi incubada à temperatura ambiente por 5 minutos. Um mi- crolitro de reação TOPO foi transformado em células TOP10 quimicamente competentes de E. coli. Os transformantes foram selecionados sobre placas de LA e 50 pg/ml de canamicina. Várias colônias foram recolhidas e cada uma delas foi inoculada em um tubo de 5 ml contendo LB e 50 pg/ml de canamicina e as culturas foram deixadas crescer por uma noite a 37° C com agitação a 200 rpm. Plasmídeos foram isolados dos tubos de cultura de uma noite usando o kit QIAprep Spin Mi- niprep, seguindo o protocolo do fabricante. Vários plasmídeos foram sequenciados para verificar se a sequência de DNA estava correta.
[00370] Um único plasmídeo pENTR/D-TOPO, codificando um gene de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado de Y. lipolytica, foi usado para clonagem Gateway em um vetor pTrex3g customizado. A construção do pTrex3g está descrita no documento WO 2005/001036 A2. A reação foi realizada seguindo o protocolo do fabricante para o kit Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Kit (Invitrogen): 1 pl do vetor doador pENTR/D- TOPO de gene de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado de Y. lipolytica, 1 pl do vetor de destinação pTrex3g, 6 pl de tampão TE, pH 8,0 em um volume reacional total de 8 pl. A reação foi incubada à temperatura ambiente por 1 hora e em seguida 1 pl de solução de proteinase K foi adicionado e a incubação continuou a 37° C por 10 minutos. Em seguida 1 pl de reação foi transformado em células TOP10 quimicamente competentes de E. coli. Os transformantes foram selecionados sobre placas de LA e 50 pg/ml de carbenicilina. Várias colônias foram recolhidas e cada uma delas foi inoculada em um tubo de 5 ml contendo LB e 50 pg/ml de carbenicilina e as culturas foram deixadas crescer por uma noite a 37° C com agitação a 200 rpm. Plasmídeos foram isolados dos tubos de cultura de uma noite usando o kit QIAprep Spin Miniprep, seguindo o protocolo do fabricante. Vários plasmídeos foram sequenciados para verificar se a sequência de DNA estava correta.
[00371] Transformação biolística do plasmídeo pTrex3g de isopreno sintase de kudzu de códon otimizado de Y. lipolytica (figura 14) em uma cepa de Trichoderma reesei "quad delete"foi realizada usando o sistema de distribuição de partículas Biolistic PDS-1000/HE (vide documento WO 2005/001036 A2). Isolamento dos transformantes estáveis e avaliação do balão oscilante foram feitos usando o protocolo apresentado no Exemplo 11 da publicação de patente WO 2005/001036 A2.
II. Produção de isopreno em cepas recombinantes de T. reesei
[00372] Um ml de culturas de 15 e 36 horas de transformantes de isopreno sintase descritos acima foram transferidos para frascos de headspace. Os frascos foram vedados e incubados por 5 horas a 30°C. O gás de headspace foi medido e o isopreno foi identificado pelo método descrito no Exemplo 1. Dois dos transformantes apresentaram traços de isopreno. A quantidade de isopreno pôde ser aumentada por uma incubação de 14 horas. As duas amostras positivas mostraram isopreno em níveis de cerca de 0,5 pg/L para a incubação de 14 horas. O controle não transformado não apresentou níveis detectáveis de isopreno. Esta experiência mostra que o T. reesei é capaz de produzir isopreno a partir de precursor endógeno quando abastecido com isopreno sintase exógeno.
Exemplo 6: Produção de isopreno em Yarrowia I. Construção de vetores para expressão do isopreno sintase de kudzu em Yarrowia lipolytica.
[00373] O ponto de partida para a construção de vetores para a expressão do gene de isopreno sintase de kudzu em Yarrowia lipolytica foi o vetor pSPZI(MAP29Spb). A sequência completa deste vetor (SEQ ID N°: 11) está mostrada na figura 15.
[00374] Os seguintes fragmentos foram amplificados por PCR usando DNA cromossômico de uma cepa GICC 120285 de Y. lipolytica como o gabarito: uma forma sem promotor do gene URA3, um fragmento de RNA ribossômico 18S, um terminador de transcrição do gene XPR2 de Y. lipolytica e dois fragmentos de DNA contendo os promotores dos genes XPR2 e ICL1. Os seguintes iniciadores de PCR foram usados: ICL1 3 5 ' - GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATAC- TGCAGGTGAC (SEQ ID N°: 69) ICL1 5 5'- GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID N°: 70) XPR3 5'- CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID N°: 71) XPR5 5'- GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID N°: 72) XPRT3 5'- GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID N°: 73) XPRT5 5'- GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID N°: 74) Y18S3 5'- GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID N°: 75) Y18S 5 5'- GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID N°: 76) YURA3 5'- GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID N°: 77) YURA 50 5'- GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID N°: 78) YURA 51 5'- GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID N°: 79)
[00375] Para amplificação por PCR a PfuUltrall polimerase (Strata- gene), tampão fornecido pelo fabricante e dNTPs, 2,5 pM de iniciadores e o DNA gabarito indicado foram usados de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação foi efetuada usando o seguinte ciclo: 95° C por 1 min; 34x (95° C por 30 seg; 55° C por 30 seg; 72° C por 3 min) e 10 min a 72°C seguida de uma incubação a 4o C.
[00376] Moléculas de DNA sintético codificando o gene de isopreno sintase de kudzu, de códon otimizado para expressão em Yarrowia, foram obtidas no DNA 2.0 (figura 16; SEQ ID N°: 12). Detalhes completos do esquema de construção dos plasmídeos pYLA(KZI) e pYLI(KZI) contendo o gene sintético de isopreno sintase de kudzu sob controle dos promotores XPR2 e ICLI, respectivamente, estão apresentados na figura 18. Plasmídeos de controle nos quais um gene de fator de cruzamento (MAP29) é inserido no lugar de um gene de isopreno sintase também foram construídos (figuras 18E e 18F).
[00377] Um procedimento de clonagem semelhante pode ser usado para expressar um gene de isopreno sintase de choupo (Populus alba x Populus tremula). A sequência do isopreno de choupo está descrita por Miller B. et al. (2001) em Planta 213, 483-487 e mostrada na figura 17 (SEQ ID N°: 13). Um esquema de construção para a geração dos plasmídeos pYLA(POPI) e pYLI(POPI) contendo gene de isopreno sintase sintético de choupo sob controle dos promotores XPR2 e ICL1, respectivamente, está apresentado nas figuras 18A e B.
II. Produção de isopreno por cepas recombinantes de Y. lipolytica.
[00378] Os vetores pYLA(KZI), pYLI(KZI), pYLA(MAP29) e pYLI(MAP29) foram digeridos com Sacll e usados para transformar a cepa Y. lipolytica CLIB 122 por um procedimento em acetato de lí- tio/polietileno glicol para prototrofia de uridina. Em suma, as células de levedura cultivadas em YEPD (1% de extrato de levedura, 2% de pep- tona, 2% de glicose) por uma noite foram recolhidas por centrifugação (4000 rpm, 10 min), lavadas uma vez com água estéril e suspendidas em acetato de lítio 0,1 M, pH 6,0. Alíquotas de duzentos pl da suspensão de células foram misturadas com solução de DNA de plasmídeo linearizado (10-20 pg), incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente e mistura com 1 ml de PEG 4000 a 50% no mesmo tampão. As suspensões foram ainda incubadas por 1 hora à temperatura ambiente seguidas de 2 minutos de choque térmico a 42°C. As células foram então plaqueadas em placas de SC his leu (0,67% de base de nitrogênio de levedura, 2% de glicose, 100 mg/L de cada um de leucina e histidi- na). Os transformantes surgiram depois de 3-4 dias de incubação a 30°C.
[00379] Três isolados da transformação de pYLA(KZI), três isolados da transformação de pYLI(KZI), dois isolados da transformação de pYLA(MAP29) e dois isolados da transformação de pYLI(MAP29) foram cultivados por 24 horas no meio YEP7 (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, pH 7,0) a 30° C com agitação. Células de 10 ml de cultura foram recolhidas por centrifugação, ressuspendidas em 3 ml de YEP7 fresco e colocadas em frascos de 15 ml com tampa de rosca. Os frascos foram incubados por uma noite à temperatura ambiente com agitação suave (60 rpm). O teor de isopreno no headspace desses frascos foi analisado por cromatografia gasosa usando detector espec- trométrico de massas da maneira descrita no Exemplo 1. Todos os transformantes obtidos com pYLA(KZI) e pYLI(KZI) produziram quantidades facilmente detectáveis de isopreno (0,5 pg/L a 1 pg/L, figura 20). Não foi detectado isopreno no headspace das cepas de controle contendo gene de fitase no lugar de um gene de isopreno sintase.
Exemplo 7: Produção de isopreno em E. coli expres- sando isopreno sintase e idi, ou dxs, ou idi e dxs de kudzu I. Construção de vetores codificando isopreno sintase e idi, ou dxs, ou idi e dxs de kudzu para a produção de isopreno em E. coli i) Construção de pTrcKudzuKan
[00380] O gene bla de pTrcKudzu (descrito no Exemplo 1) foi substituído pelo gene que confere resistência à canamicina. Para remover o gene bla, pTrcKudzu foi digerido com BspHI, tratado com fosfatase alcalina de camarão (SAP), eliminado com calor a 65°C, e em seguida teve a extremidade preenchida com fragmento Klenow e dNTPs. O fragmento grande 5 kbp foi purificado em gel de agarose e ligado ao gene kanr que fora amplificado por PCR a partir de pCR-Blunt-ll-TOPO usando os iniciadores MCM22 5'- GATCAAGCTTAACCGGAATTG- CCAGCTG (SEQ ID N°: 14) e MCM23 5'- GATCCGATCGTCA- GAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID N°: 15), digerido com Hmdlll e Pvwl, e teve a extremidade preenchida. Um transformante contendo um plasmídeo que confere resistência à canamicina (pTrcKudzuKan) foi selecionado sobre LA contendo canamicina 50 pg/ml.
ii) Construção de pTrcKudzu ylDI Kan
[00381] pTrcKudzuKan foi digerido com Pstl, tratado com SAP, eliminado com calor e purificado em gel. Ele foi ligado a um produto de PCR codificando idi de S. cerevisiae com um RBS sintético. Os iniciadores de PCR foram Nsil-YIDI 1 F 5'- CATCAATGCATCGCCCTTAG- GAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID N°: 16) e Pstl- YlDI 1 R 5'- CTT- CTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID N°: 17); e o gabarito foi dena genômico de S. cerevisiae. O produto de PCR foi digerido com Nsil e Pstl e purificado em gel antes da ligação. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 quimicamente competentes e selecionadas sobre LA contendo 50 pg/ml de canamicina. Vários transformantes foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi denominado pTrcKudzu- ylDI(kan) (figuras 34 e 35).
iii) Construção de pTrcKudzu DXS Kan
[00382] O plasmídeo pTrcKudzuKan foi digerido com Pstl, tratado com SAP, eliminado com calor e purificado em gel. Ele foi ligado a um produto de PCR codificando dxs de E. coli com um RBS sintético.
Os iniciadores para PCR foram MCM 13 5'-
[00383] GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACA- TGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID N°: 18) e MCM14 5'- CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID N°: 19); e o gabarito foi DNA genômico de E. coli. O produto de PCR foi digerido com Nsil e Pstl e purificado em gel antes da ligação. A reação de transformação resultante foi transformada em células TOP10 e selecionada sobre LAa com canamicina 50 pg/ml. Vários transformantes foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi denominado pTrc- Kudzu-DXS(kan) (figuras 36 e 37).
iv) Construção de pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan)
[00384] pTrcKudzu-ylDI(kan) foi digerido com Pstl, tratado com SAP, eliminado com calor e purificado em gel. Ele foi ligado a um produto de PCR codificando dxs de E. coli com um RBS sintético (iniciadores MCM 13 5'- GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACA- TGAGTTTTGATATTGCCAAA TACCCG (SEQ ID N°: 18) e MCM 145'- CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID N°: 19); gabarito células TOP10) que fora digerido com Nsil e Pstl e purificado em gel. O plasmídeo final foi denominado pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan) (figuras 21 e 22).
v) Construção de pCL PtrcKudzu
[00385] Um fragmento de DNA contendo o promotor, o gene estrutural e o terminador do Exemplo 1 acima foi digerido a partir de pTrcKudzu usando Sspl e purificado em gel. Ele foi ligado ao pCL1920 que fora digerido com Pvwll, tratado com SAP e eliminado com calor. A mistura de ligação resultante foi transformada em células TQP10 e selecionada em LA contendo espectinomicina 50 pg/ml. Vários clones foram isolados e sequenciados e dois foram selecionados. pCL Ptrc- Kudzu e pCL PtrcKudzu (A3) têm o enxerto em sentidos opostos (figuras 38-41).
vi) Construção de pCL PtrcKudzu ylDI
[00386] O amplicon IDI de PCR digerido com Nsil-Pstl e purificado em gel do item (ii) acima foi ligado em pCL PtrcKudzu que fora digerido com Pstl, tratado com SAP, e eliminado com calor. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA contendo espectinomicina 50 pg/ml. Vários clones foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi denominado pCL PtrcKudzu ylDI (figuras 42 e 43).
vii) Construção de pCL PtrcKudzu DXS
[00387] O amplicon DXS de PCR digerido com Nsil-Pstl e purificado em gel do item (iii) acima foi ligado em pCL PtrcKudzu (A3) que fora digerido com Pstl, tratado com SAP, e eliminado com calor. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA contendo espectinomicina 50 pg/ml. Vários clones foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi denominado pCL PtrcKudzu DXS (figuras 44 e 45).
II. Medição de isopreno no headspace de culturas expressando isopreno sintase, idi, e/ou dxs de kudzu em diferentes números de cópias.
[00388] Culturas de E. coli BL21(WE3) previamente transformadas com os plasmídeos pTrcKudzu(kan) (A), pTrcKudzu-yDDI kan (B), pTrcKudzu-DXS kan (C), pTrcKudzu-ylDI- DXS kan (D) foram cultivadas em LB canamicina 50 pg/mL. Culturas de pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-ylDI (F) e pCL PtrcKudzu-DXS (G) foram cultivadas em LB espectinomicina 50 pg/mL. As culturas foram induzidas com 400 pM IPTG no tempo 0 (ODeoo aproximadamente 0,5) e amostras foram coletadas para medir o headspace de isopreno (vide Exemplo 1). Os resultados estão mostrados nas figuras 23A-23G.
[00389] O plasmídeo pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan) foi introduzida na cepa BL21 de E. coli por transformação. A cepa resultante BL21/pTrc Kudzu IDI DXS foi cultivada por uma noite em LB contendo canamicina (50 pg/ml) a 20°C e usada para inocular balões oscilantes de TM3 (13,6 g de K2PO4, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de MgSO4*7H2O), 2,0 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato férrico de amónio, 3,2 g de (NH4)2SO4, 0,2 g de extrato de levedura, 1,0 ml de solução de metais de traço modificados 1000x, ajustado em pH 6,8 e q.s para H2O, e esterilizado em filtro) contendo 1% de glicose. Os balões foram incubados a 30°C até ser atingida uma ODeoo de 0,8, e em seguida induzidos com 400 pM IPTG. Amostras foram coletadas em tempos diferentes depois da indução e a quantidade de isopreno no headspace foi medida da maneira descrita no Exemplo 1. Os resultados estão mostrados na figura 23H.
III. Produção de isopreno a partir de biomassa em E. co- H/pTrcKudzu ylDI DXS
[00390] A cepa BL21 pTrcKudzuIDIDXS foi testada quanto à capacidade de gerar isopreno a partir de três tipos de biomassa; bagaço, palha de milho e polpa de madeira mole com glicose como controle. Hidrolisados da biomassa foram preparados por hidrólise enzimática (Brown, L & Torget, R., 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass") e usados a uma diluição baseada em equivalentes de glicose. Neste exemplo, os equivalentes de glicose eram iguais a 1% de glicose. Uma única colônia de uma placa de células recém-transformadas de BL21 (DE3) pTrcKudzu yEDI DXS (kan) foi usada para inocular 5 ml de LB mais canamicina (50 pg/ml). A cultura foi incubada por uma noite a 25° C com agitação. No dia seguinte a cultura de uma noite foi diluída até atingir uma ODeoo de 0,05 em 25 ml de TM3 e 0,2% de YE e 1% de es-toque de alimentação. O estoque de alimentação era palha de milho, bagaço, ou polpa de madeira mole. Glicose foi usada como um controle positivo e ausência de glicose foi usada como um controle negativo. As culturas foram incubadas a 30° C com agitação a 180 rpm. A cultura teve a ODeoo monitorada e quando ela atingiu uma ODeoo de -0,8, as culturas foram analisadas depois de 1 e 3 horas quanto à produção de isopreno da maneira descrita no Exemplo 1. As culturas não são induzidas. Todas as culturas contendo estoque de alimentação adicionado produziram isopreno equivalente ao das culturas do controle positivo com glicose. As experiências foram feitas em duplicata e estão mostradas na figura 46.
IV. Produção de isopreno a partir de açúcar invertido em E. coli/pT rcKudzu IDI DXS
[00391] Uma única colônia de uma placa de células recém- transformadas de BL21 (WE3)/pTrcKudzu ylDI DXS (kan) foi usada para inocular 5 ml_ de LB e canamicina (50 pg/ml). A cultura foi incubada por uma noite a 25° C com agitação. No dia seguinte a cultura de uma noite foi diluída até atingir uma ODeoo de 0,05 em 25 ml de TM3 e 0,2% de YE e 1% de estoque de alimentação. O estoque de alimentação era glicose, glicose invertida ou palha de milho. O estoque de ali-mentação de açúcar invertido (açúcar invertido Danisco) foi preparado por tratamento enzimático de xarope de sacarose. Palha de milho AFEX foi preparada da maneira descrita abaixo (Parte V). As células foram cultivadas a 30°C e a primeira amostra foi medida quando as culturas atingiram uma ODeoo -0,8-1,0 (0 hora). As culturas foram analisadas quanto ao crescimento conforme a medida da ODeoo e quanto à produção de isopreno da maneira descrita no Exemplo 1 em 0, 1 e 3 horas. Os resultados estão mostrados na figura 47.
V. Preparação de hidrolisado a partir de palha de milho pré- tratada com AFEX
[00392] Palha de milho pré-tratada com AFEX foi adquirida no Michigan Biotechnology Institute. As condições de pré-tratamento foram 60% de umidade, carga de amónia 1:1, e 90°C por 30 minutos, e em seguida secada ao ar. O teor de umidade na palha de milho pré- tratada com AFEX foi de 21,27%. O teor de glicano e xilano na palha de milho pré-tratada com AFEX foi de 31,7% e 19,1% (base seca), respectivamente. O processo de sacarificação foi o seguinte: 20 g de palha de milho pré-tratada com AFEX foram adicionados a um balão de 500 ml com 5 ml de tampão citrato de sódio 1 M pH 4,8, 2,25 ml de Accellerase 1000, 0,1 ml de Grindamyl H121 (produto de xilanase Da- nisco proveniente de Aspergillus niger para a indústria panificadora), e 72,65 ml de água desionizada. O balão foi colocado em um agitador orbital e incubado a 50° C por 96 horas. Uma amostra foi retirada do agitador e analisada usando HPLC. O hidrolisado continha 38,5 g/1 de glicose, 21,8 g/1 de xilose, e 10,3 g/1 de oligômeros de glicose e/ou xilose.
VI. Efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli cultivada em cultura com alimentação intermitente
[00393] A fermentação foi efetuada na escala com capacidade para 14 L como anteriormente descrito com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu ylDI DXS descrito acima. Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) foi introduzido a uma taxa exponencial. A quantidade total de extrato de levedura alimentado no fermentador variou entre 70-830 g durante as 40 horas de fermentação. A densidade ótica do caldo de fermentação foi medida a um comprimento de onda de 550 nm. A densidade ótica final dentro dos fermentadores era proporcional à quantidade de extrato de levedura adicionada (figura 48A). O nível de isopreno no gás desprendido do fermentador foi determinado da maneira anteriormente descrita. O título de isopreno aumentou durante o curso da fermentação (figura 48B). A quantidade de isopreno produzido foi linearmente proporcional à quantidade de extrato de levedura alimentado (figura 48C).
VII. Produção de isopreno em fermentação com capacidade para 500 L de pTrcKudzu DXS yEDI
[00394] Uma fermentação com capacidade para 500 litros de células de E. coli com isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisiae, e ácidos nucleicos de DXS de E. coli (E. coli BL21 (ÁDE3) pTrc Kudzu dxs yidi) foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 50 de 300 pg/L durante um periodo de tempo de 15 horas. Com base nas concentrações médias de isopreno, no fluxo médio através do dispositivo e no grau de rompimento de isopreno, a quantidade de isopreno coletado foi calculada como sendo aproximadamente igual a 17 g.
VIII. Produção de isopreno em fermentação com capacidade para 500 L de E. coli cultivada em cultura com alimentação intermitente
[00395] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00396] K2HPO4 7,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono- hidratado 2 g, citrato férrico de amónio 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, solução de metais de traço modificados 1000X 1 ml. Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo e dissolvidos em dibW. Esta solução foi tratada em uma autoclave. O pH foi ajustado em 7,0 com amónio gasoso (NH3) e q.s. para completar 0 volume. Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibiótico foram adicionados depois de esterilização e ajuste do pH.
Solução de metais de traço modificados 1000X:
[00397] Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoθ4 * 2H2O 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em H2O desionizada, 0 pH é ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida q.s. para completar 0 volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron.
[00398] A fermentação foi realizada em um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo 0 plasmídeo pTrcKudzu ylDI DXS. Esta experiência foi realizada para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose e extrato de levedura ao pH de fermentação desejado pH 7,0 e a uma temperatura de 30°C. Um inóculo da cepa de E. coli retirado de um frasco congelado foi preparado em meio de soytone- extrato de levedura-glicose. Depois que o inóculo cresceu até OD 0,15, medida a 550 nm, 20 ml foram usados para inocular um biorreator contendo 2,5 L de meio de soytone-extrato de levedura-glicose. O biorreator de 2,5 L foi cultivado a 30°C até uma OD 1,0 e 2,0 L foram transferidos para o biorreator de 500 L.
[00399] Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) e glicose foram alimentados a taxas exponenciais. A quantidade total de glicose e extrato de levedura alimentados no biorreator durante as 50 horas de fermentação foi de 181,2 kg e 17,6 kg, respectivamente. A densidade ótica no biorreator ao longo do tempo está mostrada na figura 49A. O nível isopreno no gás desprendido do biorreator foi determinado da maneira anteriormente descrita. O título de isopreno aumentou durante o curso da fermentação (figura 49B). A quantidade total de isopreno produzido durante as 50 horas de fermentação foi de 55,1 g e o tempo de produção está mostrado na figura 49C.
Exemplo 8: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu e genes da via de ácido mevalô- nico recombinante I. Clonagem da via inferior de MVA
[00400] A estratégia para clonagem da via inferior de ácido mevalô- nico foi a seguinte. Quatro genes da via de biossíntese do ácido meva- lônico; os genes mevalonato quinase (MVK), fosfomevalonato quinase (PMK), difosfomevalonte descarboxilase (MVD) e isopentenil difosfato isomerase foram amplificados por PCR a partir de DNA cromossômico de S. cerevisiae e clonados individualmente no plasmídeo pCR Bluntll TOPO (Invitrogen). Em alguns casos, o gene idi foi amplificado a partir de DNA cromossômico de E. coli. Os iniciadores foram desenhados de modo um RBS de consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID N°: 80) ou AAGGAGG (SEQ ID N°: 81)) foi inserido na extremidade 5', 8 bp a montante do códon inicial e um sítio Pstl foi adicionado na extremidade 3'. Os genes foram então clonados um por um no vetor pTrcHis2B até que toda a via estivesse montada.
[00401] O DNA cromossônico de S. cerevisiae S288C foi adquirido no ATCC (ATCC 204508D). O gene MVK foi amplificado a partir do cromossoma de S. cerevisiae usandos os iniciadores MVKF (5'- AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID N°: 21) e MVK-Pstl-R (5'- ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAG- CTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID N°: 22) usando Pfu- Turbo de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR de tamanho correto (1370 bp) foi identificado por eletroforese através de um E-gel a 1,2% E-gel (Invitrogen) e clonado em pZeroBLUNT TOPO. O plasmídeo resultante foi designado pMVK1. O plasmídeo pMVK1 foi digerido com as endonucleases de restrição Sad e Taql e o fragmento foi purificado em gel e ligado em pTrcHis2B digerido com Sad e BstBI. O plasmídeo resultante foi denominado pTrcMVKI .
[00402] O segundo gene na via da biossíntese do ácido mevalônico, PMK, foi amplificado por PCR usando os iniciadores: Pstl-PMKI R (5'- GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID N°: 23) e BsiHKA I-PMK1 F (5'- CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID N°: 24). A reação de PCR foi realizada usando Pfu Turbo poli- merase (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de tamanho correto (1387 bp) foi digerido com Pstl e BsiHKI e ligado em pTrcMVKI digerido com Pstl. O plasmídeo resultante foi denominado pTrcKK. O MVD e os genes idi foram clonados da mesma maneira. A PCR foi realizada usando os pares de iniciadores Pstl-MVD 1 R (5'-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID N°: 25) e Nsil- MVD 1 F (5'-
[00403] GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID N°: 26) para amplificar o gene MVD e Pstl- YIDI 1 R (5'- CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, SEQ ID N°: 27) e Nsil-YIDI 1 F (5'- CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID N°: 28) para amplificar o gene ylDI. Em alguns casos o gene de IPP isomerase, idi de E. coli foi usado. Para amplificar idi de DNA cromos- sômico de E. coli, o seguinte conjunto de iniciadores foi usado: Pstl- CIDI 1 R (5'-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, SEQ ID N°: 29) e Nsil-CIDI 1 F (5'- CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAA- CATG, SEQ ID N°: 30). O DNA gabarito foi DNA cromossômico isolado de E. coli FM5 por métodos tradicionais (WO 96/35796 e WO 2004/033646, cada um deles estando aqui incorporado em sua integridade a título de referência, particularmente no que diz respeito ao isolamento de ácidos nucleicos). Os plasmídeos finais foram denominados pKKDIy para a construção codificando o gene idi de levedura ou pKKDIc para a construção codificando o gene idi de E. coli. Os plasmídeos foram transformados em E. coli hospedeiros BL21 para subsequente análise. Em alguns casos a isopreno sintase de kudzu foi clo- nada em pKKDIy produzindo o plasmídeo pKKDIylS.
[00404] A via inferior de MVA também foi clonada em pTrc contendo um marcador de resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pTrcKKDIy foi digerido com as endonucleases de restrição Apal e Pstl, o fragmento de 5930 bp fi separado em um agarose E-gel a 1,2% e purificado usando o kit Qiagen Gel Purification de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKudzuKan, descrito no Exemplo 7, foi digerido com as endonucleases de restrição Apal e Pstl, e o fragmento de 3338 bp contendo o vetor foi purificado em um E-gel a 1,2% usando o kit Qiagen Gel Purification. O fragmento de 3338 bp do vetor e o fragmento de 5930 bp da via inferior de MVA foram ligados usando o kit Roche Quick Ligation. A mistura de ligação foi transfor- mada em células TOP10 de E. coli e os tranformantes foram cultivadas a 37°C por uma noite com seleção sobre LA contendo canamicina (50 pg/ml). Os transformantes foram verificados por digestão com enzimas de restrição e um transformante foi congelado como estoque. O plasmídeo foi designado pTrcKanKKDIy.
II. Clonagem de um gene de isopreno sintase de kudzu em pTrcKanKKDIy
[00405] O gene de isopreno sintase de kudzu foi amplificado por PCR a partir de pTrcKudzu, descrito no Exemplo 1, usando os iniciadores MCM50 5'- GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG- TGTGCGACCTCTTCTCAA TTTACT (SEQ ID N°: 31) e MCM53 5'- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID N°: 32). O fragmento de PCR resultante foi clonado em pCR2,1 e transformado em células TOP10 de E. coli. Este fragmento contém a sequência codificadora para isopreno sintase de kudzu e uma região a montante contendo um RBS de E. coli. Os transformantes foram incubados por uma noite a 37°C com seleção sobre LA contendo carbenicilina (50 pg/ml). A inserção correta do fragmento foi verificada por se- quenciamento e esta cepa foi designada MCM93.
[00406] O plasmídeo da cepa MCM93 foi digerido com as endonucleases de restrição Nsil e Pstl para liberar um enxerto de 1724 bp contendo o RBS e isopreno sintase de kudzu. O fragmento de 1724 bp foi separado em um agarose E-gel a 1,2% e purificado usando o kit Qiagen Gel Purification de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKanKKDIy foi digerido com a endonuclease de restrição Pstl, tratado com SAP por 30 minutos a 37°C e purificado usando o kit Qiagen PCR cleanup. O plasmídeo e o isopreno sintase de kudzu codificando fragmento de DNA foram ligados usando o kit Roche Quick Ligation. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 de E. coli e os transformantes foram cultivados por uma noite a 37°C com seleção sobre LA contendo canamicina a 50 pg/ml. O transformante correto foi verificado por digestão de restrição e o plasmídeo foi designado pTrcKKDylkISKan (figuras 24 e 25). Este plasmídeo foi transformado em células BL21(ÀDE3) cells (Invitrogen).
III. Produção de isopreno a partir de mevalonato em E. coli expressando a via inferior de mevalonato recombinante e isopreno sintase de kudzu.
[00407] A cepa BL21/pTrcKKDylklSKan foi cultivada em meio MOPS (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736-747) teve o pH ajustado em pH 7,1 e foi suplementada com 0,5% de glicose e 0,5% de ácido mevalônico. Uma cultura de controle também foi montada usando condições idênticas porém sem a adição de 0,5% de ácido mevalônico. A cultura foi iniciada a partir de uma cultura de semente de uma noite com 1% de inóculo e induzida com 500 pM de IPTG quando a cultura atingiu uma ODeoo de 0,3 a 0,5. As culturas foram cultivadas a 30°C com agitação a 250 rpm. A produção de isopreno foi analisada 3 horas depois da indução usando o ensaio de headspace descrito no Exemplo 1. A produção máxima de isopreno foi de 6,67 x 104 nmol/Lcaido/ODeoo/hora onde Lcaido é o volume de caldo e inclui tanto o volume do meio de cultura de células como o volume das células. A cultura de controle não suplementada com ácido mevalônico não produziu isopreno mensurável.
IV. Clonagem da via superior de MVA
[00408] A via biossintética superior de mevalonato, compreeenden- do dois genes codificando três atividades enzimáticas diferentes, foi clonada a partir de Enterococcus faecalis. O gene mvaE codifica uma proteína com as atividades enzimáticas de acetil-CoA acetiltransferase e de 3-hidroxi-3- metil glutaril-CoA (HMG-CoA) redutase, as primeira e terceira proteínas na via, e o gene mvaS codifica a segunda enzima na via, HMG-CoA sintase. O gene mvaE foi amplificado a partir de DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um sítio fixador de ribossoma de E. coli e um espaçador na frente usando os seguintes iniciadores: CF 07-60 (+) Início de mvaE w/ RBS + ATG códon inicial Sad 5' - GA- GACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTA- TTG (SEQ ID N°: 34) CF 07-62 (-) Fusão de mvaE a mvaS com RBS entre os dois 5' - TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTG- TTTTCTTAAATC (SEQ ID N°: 35)
[00409] O gene mvaS foi amplificado a partir de DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um RBS e um espaçador de E. coli na frente usando os seguintes iniciadores: CF 07-61 (+) Fusão de mvaE a mvaS com RBS entre os dois 5'- GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGG- GATTGATAA A (SEQ ID N°: 36) CF 07-102 (-) Extremidade do gene mvaS BglU 5' -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 37)
[00410] Os fragmentos de PCR foram fundidos entre si por PCR usando os seguintes iniciadores: CF 07-60 (+) Início de mvaE w/ RBS + ATG códon inicial Sad 5'- GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTA- TTATTG (SEQ ID N°: 34) CF 07-102 (-) Extremidade do gene mvaS Bglll 5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 37)
[00411] O fragmento de PCR de fusão foi purificado usando um kit Qiagen e digerido com as enzimas de restrição Sad e BgHI. Este fragmento de DNA digerido foi purificado em gel usando um kit Qiagen e ligado no vetor comercialmente disponíveis pTrcHis2A, que fora digeri- do com Sad e Bglll e purificado em gel.
[00412] A mistura de ligação foi transformada em células Top 10 de E. coli e colônias foram selecionadas sobre placas de LA e 50 pg/ml de carbenicilina. Um total de seis colônias foi escolhido e cultivado por uma noite em LB e 50 pg/ml de carbenicilina e plasmídeos foram isolados usando um kit Qiagen. Os plasmídeos foram digeridos com Sad e BgHI para examinar os enxertos e um plasmídeo correto foi sequenci- ado com os seguintes iniciadores: CF 07-58 (+) Início do gene mvaE 5' - ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID N°: 38) CF 07-59 (-) Extremidade do gene mvaE 5' - ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID N°: 39) CF 07-82 (+) Início do gene mvaE 5' - ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO-,40) CF 07-83 (-)Extremidade do gene mvaS 5' - TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 41) CF 07-86 (+) Sequência em mvaE 5' - GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID N°: 42) CF 07-87 (+) Sequência em mvaE 5' - TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID N°: 43) CF 07-88 (+) Sequência em mvaE 5' - GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID N°: 44) CF 07-89 (+) Sequência mvaS 5' - GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID N°: 45)
[00413] O plasmídeo denominado pTrcHis2AUpperPathway#1 era correto por sequenciamento e foi transformado na cepa BL21 de E. coli comercialmente disponível. A seleção foi feita sobre LA e 50 pg/ml de carbenicilina. Dois transformantes foram escolhidos e cultivadas em LB e 50 pg/ml de carbenicilina até atingirem uma ODeoo de 1,5. As duas cepas foram congeladas em um frasco a -80° C na presença de glice- rol. As cepas foram designadas CF 449 para pTrcHis2AUpperPathway#1 em BL21, isolado #1 e CF 450 para pTrcHis2AUpperPathway#1 em BL21, isolado #2. Foi verificado que os dois clones se comportavam de maneira idêntica quando analisados.
V. Clonagem da via superior de MVA em pCL1920
[00414] O plasmídeo pTrcHis2AUpperPathway foi digerido com a endonuclease de restrição Sspl para liberar um fragmento contendo pTrc-mvaE-mvaS-(His tag)-terminador. Neste fragmento, o his-tag não foi transladado. Este fragmento de 4,5 kbp de extremidade cega foi purificado a partir de um E-gel a 1,2% usando o kit Qiagen Gel Purification. Um fragmento de 4,2 kbp de extremidade cega e desfosforilado de pCL1920 foi preparado por digestão do vetor com a endonuclease de restrição Pvull, tratamento com SAP e purificação em gel a partir de um E-gel a 1,2% usando o kit Qiagen Gel Purification. Os dois fragmentos foram ligados usando o kit Roche Quick Ligation e transformados em células TOP10 quimicamente competentes. Os transformantes foram selecionados sobre LA contendo espectinomicina (50 pg/ml). Uma colônia correta foi identificada por rastreamento quanto à presença do enxerto por PCR. O plasmídeo foi designado pCL PtrcUpper- Pathway (figuras 26 e 27).
VI. Cepas expressando as vias superior e inferior combinadas do ácido mevalônico
[00415] Para obter uma cepa com uma via completa do ácido mevalônico mais isopreno sintase de kudzu, os plasmídeos pTrcKKDylklS- kan e pCLpTrcUpperPathway foram ambos transformados em células competentes BL21(WE3) (Invitrogen) e os transformantes foram selecionados sobre LA contendo canamicina (50 pg/ml) e espectinomicina (50 pg/ml). Os transformantes foram examinados por plasmídeo prep para confirmar que ambos os plasmídeos ficaram retidos no hospedeiro. A cepa foi designada MCM127.
VII. Produção de ácido mevalônico a partir de glicose em E. coli/pUpperpathway
[00416] Colônias simples do BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS ou FM5/p pTrcHis2A- mvaE/mvaS são inoculadas em LB e carbenicilina (100 pg/ml) e são cultivadas por uma noite a 37° C com agitação a 200 rpm. Estas culturas foram diluídas em 50 ml de meio em balões defletidos de 250 ml até atingirem uma ODeoo de 0,1. O meio foi TM3, 1 ou 2% de glicose, carbenicilina (100 ug/ml) ou TM3, 1% de glicose, óleo de soja hidrolisada, e carbenicilina (100 ug/ml) ou TM3 e biomassa (preparada a partir de bagaço, palha de milho ou Panicum virgatum ("switchgrass")). As culturas foram cultivadas a 30°C com agitação a 200 rpm por aproximadamente 2-3 horas até atingirem uma ODeoo de 0,4. Neste ponto a expressão da construção mvaE mvaS foi induzida pela adição de IPTG (400 pM). As culturas foram incubadas por mais 20 ou 40 hotas com amostras sendo retiradas em intervalos de 2 horas a 6 horas após a indução e em seguida em 24, 36 e 48 horas, conforme necessário. A coleta de amostra foi feita por remoção de 1 ml de cultura, medição da ODeoo, pelotização das células em uma microcen- trífuga, e remoção do sobrenadante e análise do mesmo quanto à presença de ácido mevalônico.
[00417] Uma fermentação com capacidade para 14 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos codificando polipeptídios de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, e HMG-CoA redutase de Enterococcus fae- calis produziu 22 gramas de ácido mevalônico com meio TM3 e 2% de glicose como o meio de cultura de células. Um balão oscilante dessas células produziu 2-4 gramas de ácido mevalônico por litro com meio LB e 1% de glicose como o meio de cultura de células. A produção de áci-do mevalônico nessas cepas indicou que a via de MVA era funcional em E. coli. VIII. Produção de isopreno a partir de E. coli BL21 contendo a via superior e a via inferior de MVA mais isopreno sintase de kudzu. As cepas a seguir foram criadas por transformação em várias combinações de plasmídeos contendo a via superior e a via inferior de MVA e o gene de isopreno sintase de kudzu como descrito acima e os plasmideos contendo os genes de idi, dxs, e dxr e isopreno sintases descritos no Exemplo 7. As células hospedeiras usadas eram BL21(ÀDE3)quimicamente competentes e as transformações foram feitas por métodos tradicionais. Os transformantes foram selecionados sobre ágar L contendo canamicina (50 pg/ml) ou canamicina mais espectinomicina (ambos a uma concentração de 50 pg/ml). As placas foram cultivadas a 37° C. As cepas resultantes foram designadas da seguinte maneira:
[00418] Cultivadas em canamicina mais espectinomicina (50 pg/ml cada) MCM127 - pCL Upper MVA e pTrcKKDylklS (kan) em BL21(ÀDE3) MCM131 - pCL1920 e pTrcKKDylklS (kan) em BL21(ÀDE3) MCM125 - pCL Upper MVA e pTrcHis2B (kan) em BL21(ÀDE3) Cultivadas em canamicina (50 pg/ml) MCM64 - pTrcKudzu ylDI DXS (kan) em BL21(ÀDE3) MCM50 - pTrcKudzu (kan) em BL21(ÀDE3) MCM123 - pTrcKudzu ylDI DXS DXR (kan) em BL21(ÀDE3)
[00419] As cepas acima foram rapidamente transferidas de estoque congelados para LA e um antibiótico apropriado e cultivadas por uma noite a 37°C. Uma única colônia de cada placa foi usada para inocular balões oscilantes (25 ml de LB e do antibiótico apropriado). Os balões foram incubados a 22° C por uma noite com agitação a 200 rpm. Na manhã seguinte os balões foram transferidos para uma incubadora a 37° C e cultivados por mais 4,5 horas com agitação a 200 rpm. As culturas de 25 ml foram centrifugadas para pelotizar as células e as células foram ressuspendidas em 5 ml de LB e do antibiótico apropriado. As culturas foram então diluídas em 25 ml de LB, % de glicose, e o antibiótico apropriado até atingir uma ODeoo de 0,1. Foram montados dois balões para cada cepa, um conjunto para indução com IPTG (800 pM) e o segundo conjunto não foi induzido. As culturas foram incubadas a 37°C com agitação a 250 rpm. Um conjunto das culturas foi induzido depois de 1,50 horas (imediatamente após o tempo de amostragem 1). Em cada tempo de amostragem, a ODeoo foi medida e a quantidade de isopreno foi determinada da maneira descrito no Exemplo 1. Os resultados estão apresentados na Tbela 3. A quantidade de isopreno produzido está apresentada como a quantidade na produção máxima para a cepa particular. Tabela 3. Produção de isopreno em cepas de E. coli
Figure img0007
Traço: pico presente porém não integrável.
IX. Análise de ácido mevalônico
[00420] Mevalonolactona (1,0 g, 7,7 mmol) (CAS# 503-48-0) foi adquirido na Sigma-Aldrich (Wl, EUA) como um xarope que foi dissolvido em água (7,7 ml_) e foi tratado com hidróxido de potássio (7,7 mmol) para gerar o sal potássico de ácido mevalônico. A conversão em ácido mevalônico foi confirmada por análise de 1H RMN. Amostras para análise por HPLC foram preparadas por centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos para remover as células, seguida da adição de uma alíquota de 300 pl de sobrenadante a 900 pl de H2O. Ácido perclórico (36 pl de uma solução a 70%) foi então adicionado seguido de misturação e resfriamento em gelo por 5 minutos. As amostras foram então centrifugadas mais uma vez (14.000 rpm por 5 min) e 0 sobrenadante foi transferido para HPLC. Padrões de ácido mevalônico (20, 10, 5, 1 e 0,5 g/L) foram preparados da mesma maneira. A análise do ácido mevalônico (20 uL volume de injeção) foi feita por HPLC usando uma coluna Bio- Rad Aminax 87-H+ (300 mm por 7,0 mm) eluída com 5 mM de ácido sulfúrico a 0,6 mL/min com detecção do índice de refração (RI). Nessas condições o ácido mevalônico eluiu na forma de lactona em 18,5 minutos.
Exemplo 9. Construção da via superior e da via inferior de MVA para integração em Bacillus subtilis I. Construção da via superior de MVA em Bacillus subtilis
[00421] A via superior de Enterococcus faecalis é integrada em B. subtilis sob controle do promotor aprE. A via superior consiste em dois genes; mvaE, que codifica para AACT e HMGR, e mvaS, que codifica para HMGS. Os dois genes são fundidos com um códon de interrupção entre eles, um sítio RBS site na frente de mvaS, e estão sob o controle do promotor aprE. Um terminador está situado depois do gene mvaE. O marcador de resistência ao cloranfenicol é clonado depois do gene mvaE e a construção é integrada no locus aprE por cruzamento duplamente retrógrado usando regiões flanqueadas de homologia.
[00422] Quatro fragmentos de DNA são amplificados por PCR de modo que contenham projeções que vão permitir que eles se fundam por uma reação de PCR. As amplificações por PCR são efetuadas usando Herculase polimerase de acordo com as instruções do fabricante. 1. PaprE CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82) CF 07-94 (-) Fusão de PaprE a mvaE 5'- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID N°: 83) Gabarito: DNA cromossômico de Bacillus subtilis 2. mvaE CF 07-93 (+) fusão de mvaE ao promotor aprE (GTG códon inicial) 5'- TTAAAAGGAGAGGGTA AAGAGTGAAA ACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID N°: 84) CF 07-62 (-) Fusão de mvaE ao mvaS com RBS entre os dois 5'- TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTG- TTTTCTTAAATC (SEQ ID N°: 35) Gabarito: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis (do ATCC) 3. mvaS CF 07-61 (+) Fusão de mvaE ao mvaS com RBS entre os dois 5'- GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGG- GATTGATAA A(SEQ ID N°: 36) CF 07-124 (-) Fusão da extremidade de mvaS ao terminador 5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTrTTTTAGTTTCGA- TAAGAACGAACGGT (SEQ JD NO:85) Gabarito: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis 4. Terminador de serina protease alcalina de B. amyliquefa- ciens CF 07-123 (+) Fusão da extremidade de mvaS ao terminador 5'- ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGG- CCCCG (SEQ ID N°: 86) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador de B. amyliquefaciens BamHI 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63) Gabarito: DNA cromossômico de Bacillus amyliquefaciens Reações de fusão por PCR 5. Fusão de mvaE ao mvaS CF 07-93 (+) fusão de mvaE ao promotor aprE (GTG códon inicial) 5 ' – TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID N°: 84) CF 07-124 (-) Fusão da extremidade de mvaS ao terminador 5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGA- TAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 85) Gabarito: #2 e 3 acima 6. Fusão de mvaE-mvaS ao promotor aprE CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82) CF 07-124 (-) Fusão da extremidade de mvaS ao terminador 5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 85) Gabarito #1 e #4 acima 7. Fusão de PsfrE-mvaE-mvaS ao terminador CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador BamHI de B. amyliquefaciens 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63) Gabarito: #4 e #6
[00423] O produto é digerido com as endonucleases de restrição Pstl/BamHI e ligado ao pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, págs. 615-624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, & R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D. C.) que é digerido com Pstl/BamHI. A ligação é transformada em células TOP 10 quimicamente competentes de E.coli e os transformantes são selecionados sobre LA contendo carbenicilina (50 pg/ml). O plasmídeo correto é identificado por sequenciamento e é designado pJMUpperpathway2 (figuras 50 e 51). O DNA de plasmídeo purificado é transformado em Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK e os transformantes são selecionados sobre ágar L contendo cloranfenicol (5 pg/ml). Uma colônia cor- reta é selecionada e é plaqueada sequencialmente sobre ágar L contendo cloranfenicol 10, 15 e 25 pg/ml para amplificar o número de cópias do cassete contendo a via superior.
[00424] A cepa resultante é testada quanto à produção de ácido mevalônico sendo cultivada em LB contendo 1% de glicose e 1%. As culturas são analisadas por GC quanto à produção de ácido mevalônico. Esta cepa é subsequentemente usada como um hospedeiro para a integração da via inferior de ácido mevalônico.
[00425] Os seguintes iniciadores são usados para sequenciar as várias construções acima.
[00426] Iniciadores de sequenciamento: CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82) CF 07-58 (+) Início do gene mvaE 5'- ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID N°: 38) CF 07-59 (-) Extremidade do gene mvaE 5'- ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID N°: 39) CF 07-82 (+) Início do gene mvaE 5'- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID N°: 40) CF 07-83 (-) Extremidade do gene mvaS 5'- TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 41) CF 07-86 (+) Sequência em mvaE 5'- GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID N°: 42) CF 07-87 (+) Sequência em mvaE 5'- TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID N°: 43) CF 07-88 (+) Sequência em mvaE 5'- GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID N°: 44) CF 07-89 (+) Sequência mvaS 5'- GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID N°: 45)
[00427] Os transformantes são selecionados sobre LA contendo cloranfenicol a uma concentração de 5 pg/ml. Foi confirmado por sequen- ciamento que uma colônia tem a integração correta e esta é plaqueada sobre LA contendo concentrações crescentes de cloranfenicol durante vários dias, até um nível final de 25 pg/ml. Isto resulta na amplificação do cassete contendo os genes de interesse. A cepa resultante é designada CF 455: pJMupperpathway#l X Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl comK (amplificada para crescer em LA contendo cloranfenicol 25 pg/ml).
II. Construção da via inferior de MVA em Bacillus subtilis
[00428] A via inferior de MVA, consistindo nos genes mvkl, pmk, mpd e idi são combinadas em um cassete consistindo nas regiões de DNA flanqueadas da região nprE region do cromossoma de B. subtilis (sítio de integração), o promotor aprE, e o marcador de resistência à espectinomicina (vide figuras 28 e 29). Este cassete é sintetizado por DNA2.0 e é integrado no cromossoma de B. subtilis contendo a via superior de MVA integrada ao locus aprE. O gene de isopreno sintase de kudzu é expresso a partir do plasmídeo replicante descrito no Exemplo 4 e é transformado na cepa com ambas as vias superior e inferior integradas.
Exemplo 10: Produção de isopreno em E. coli expressando mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de P. alba I. Construção de vetores e cepas codificando mevalonato quinase (MVK) de M. mazei e isopreno sintase de P. alba (i) Construção da cepa EWL201 (BL21, Cm-GI1,2-KKDyl)
[00429] E. coli BL21 (marca Novagen, EMD Biosciences, Inc.) foi uma cepa receptora, transduzida com lisado de MCM331 P1 (lisado preparado de acordo com o método descrito por Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.). Os transdutores foram selecionados espalhando-se as células sobre ágar L e 20 pg/pl de cloranfenicol. As placas foram incubadas por uma noite a 30°C. Análise dos transdutores não mostrou colônias nas placas de controle (placa de controle com água + células para reversão e placa de controle com água e lisado de P1 para contaminação do lisado.
[00430] Quatro transdutores foram coletados e usados para inocular 5 ml_ de caldo L e 20 pg/pl de cloranfenicol. As culturas foram cultivadas por uma noite a 30°C com agitação a 200 rpm. Para fazer preparações de DNA genômico de cada transdutante para análise por PCR, 1,5mL da cultura de células de uma noite foram centrifugados. A pelota de células foi ressuspendida com 400pl de tampão de ressuspensão (20 mM de Tris, 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCI, pH 7,5) e 4pl de RNase, DNase-free (Roche) foram adicionados. Os tubos foram incubados a 37°C por 30 minutos seguido da adição de 4pl de SDS a 10% e 4pl de solução de estoque de proteinase K a 10 mg/ml (Sigma- Aldrich). Os tubos foram incubados a 37°C por 1 hora. O lisado de células foi transferido para tubos Phase Lock Light Gel de 2 ml (Eppen- dorf) e 200pl de cada urn de fenol saturado pH 7,9 (Ambion Inc.) e clo-rofórmio foram adicionados. Os tubos foram bem misturados e micro- centrifugados por 5 minutos. Uma segunda extração foi feita com 400pl de clorofórmio e a camada aquosa foi transferida para outro tubo ep- pendorf. O DNA genômico foi precipitado pela adição de 1 ml de etanol a 100% e centrifugação por 5 minutos. A pelota de DNA genômico foi lavada com 1 ml de etanol a 70%. O etanol foi removido e a pelota de DNA genômico foi deixada secar ao ar por um curto período. A pelota de DNA genômico foi ressupendida com 200 pl de TE.
[00431] Usando Pfu Ultra II DNA polimerase (Stratagene) e 200 ng/pl de DNA genômico como gabarito, 2 conjuntos diferentes de tubos de reação de PCR foram preparados de acordo com o protocolo do fabricante. Para o conjunto 1, os iniciadores MCM 130 e GB Cm-Rev (Tabela 4) foram usados para garantir que os transdutores fossem integrados com sucesso no locus attTn7. Os parâmetros de PCR para o conjunto 1 foram 95°C por 2 minutos (somente para o primeiro ciclo), 95°C por 25 segundos, 55°C por 25 segundos, 72°C por 25 segundos (repetir as etapas 2-4 por 28 ciclos), 72°C por 1 minuto. Para o conjunto 2, os iniciadores MVD For e MVD Rev (Tabela 4) foram usados para garantir que o opéron gil.2-KKDyI fosse integrado de forma apropriada. Os parâmetros de PCR para o conjunto 2 foram 95°C por 2 minutos (somente para o primeiro ciclo), 95°C por 25 segundos, 55°C por 25 segundos, 72°C por 10 segundos (repetir as etapas 2-4 por 28 ciclos), 72°C por 1 minuto. Análise dos amplicons por PCR sobre um E-gel a 1,2% (Invitrogen Corp.) mostrou que os 4 clones de transdutor estavam corretos (um foi escolhido e designado cepa EWL201).
ii) Construção da cepa EWL204 (BL21, loopout-GII.2- KKDyl)
[00432] O marcador de cloranfenicol foi removido ("looped out") da cepa EWL201 usando o plasmídeo pCP20 da maneira descrita por Da- tsenko &Wanner (2000) (Datsenko et al., Proc Natl. Acad. Sei USA 97:6640-6645, 2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. (Datsenko et al., PNAS, 97: 6640-6645, 2000). Células EWL201 foram cultivadas em caldo L até a fase de midlog e em seguida lavadas três vezes com água estéril gelada. Uma alíquota de 50 pl de suspensão de células foi misturada com 1 pl de pCP20 e a mistura de suspensão de células foi eletroporada em uma cubeta de 2 mm (Invitrogen Corp.) a 2,5 Volts e 25 uFd usando urn Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.). 1 ml de LB foi imedi- atamente adicionado às células, e em seguida e estas foram transferidas para um tubo de polipropileno de 14 ml (Sarstedt) com uma tampa de metal.
[00433] As células foram deixadas se recuperar crescendo por 1 hora a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre ágar L e 20 pg/pl de cloranfenicol e 50 pg/pl de carbenicilina e incubadas a 30°C por uma noite. No dia seguinte, um único clone foi cultivado em 10 ml de caldo L e 50 pg/pl de carbenicilina a 30°C até o início da fase log. A temperatura da cultura em desenvolvimento foi então levada aumentada para 42°C por 2 horas. Diluições seriadas foram feitas, e as células foram espalhadas sobre placas de LA (sem seleção de antibiótico), e incubadas por uma noite a 30°C. No dia seguinte, 20 colônias foram recolhidas e espalhadas sobre placas de ágar L (sem antibióticos) e de LA e 20 pg/pl de cloranfenicol. As placas foram então incubadas por uma noite a 30°C. As células capazes de crescer sobre as placas de LA, porém não nas placas de LA e 20 pg/pl de cloranfenicol, foram consideradas células com o marcador de removido (uma foi escolhida e designada cepa EWL204).
iii) Construção do plasmídeo pEWL230 (pTrc P. alba)
[00434] A geração de um gene sintético codificando isopreno sintase de Populus alba (P. alba HGS) foi feita pela DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA) com base no método de otimização de códon para expressão em E. coli. O gene sintético foi clonado no plasmídeo pET24a (marca Novagen, EMD Biosciences, Inc.) e distribuído liofilizado (figuras 54, 55A e 55B).
[00435] Uma reação de PCR foi realizada para amplificar o gene de isopreno sintase de P. alba (P. alba HGS) usando pET24 P.alba HGS como o gabarito, os iniciadores MCM182 e MCM192, e Herculase II Fusion DNA polimerase (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. As condições de PCR foram as seguintes: 95°C por 2 minutos (somente para o primeiro ciclo), 95°C por 25 segundos, 55°C por 20 segundos, 72°C por 1 minuto, repetir por 25 ciclos, com uma extensão final a 72°C por 3 minutos. O produto de PCR de isopreno sintase de P. alba foi purificado usando o kit QIAquick PCR Purification (Qiagen Inc.).
[00436] O produto de PCR de isopreno sintase de P. alba foi então digerido em uma reação de 20 pl contendo 1 pl da endonuclease BspHI (New England Biolabs) com 2pl de tampão 4 NEB 10X. A reação foi incubada por 2 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado usando o kit QIAquick PCR Purification. Uma digestão de restrição secundária foi realizada em uma reação de 20 pl contendo 1 pl da endonuclease Pstl (Roche) com 2 pl de tampão H 10X. A reação foi incubada por 2 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado usando o kit QIAquick PCR Purification. O plasmídeo pTrcHis2B (Invitrogen Corp.) foi digerido em uma reação de 20 pj contendo 1 pl da endonuclease Ncol (Roche), 1 pl da endonuclease Pstl, e 2 pl do tampão H 10X. A reação foi incubada por 2 horas a 37°C. O vetor pTrcHis2B digerido foi purificado em gel usando um E-gel a 1,2% (Invitrogen Corp.) e extraído usando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) (figura 56). Usando as extremidades coesas compatíveis dos sítios BspHI e Ncol sites, foi preparada uma reação de ligação de 20 pl foram preparados contendo 5 pl do enxerto de isopreno sintase de P. alba, 2 pl do vetor pTrc, e 1 pl de T4 DNA ligase (New England Bio- labs), 2 pl de tampão ligase 10X, e 10 pl de ddbW. A mistura de ligação foi incubada à temperatura ambiente por 40 minutos. A mistura de ligação foi dessalinizada colocando-se um filtro de membrana de nitro- celulose de 0,025 pm (Millipore) em uma placa de petri de ddbW e aplicando-se a mistura de ligação suavemente sobre o filtro de membrana de nitrocelulose por 30 minutos à temperatura ambiente. Células MCM446 (vide seção II) foram cultivadas em LB até a fase de midlog e em seguida lavadas três vezes com água estéril gelada. Uma alíquota de 50 pl da suspensão de células foi misturada com 5 pl da mistura de ligação de pTrc P.alba HGS dessalinizada. A mistura de suspensão de células foi eletroporada em uma cubeta de 2 mm a 2,5 Volts e 25 uFd usando um Gene Pulser Electroporator. 1 ml de LB foi imediatamente adicionado às células, e em seguida estas foram transferidas para um tubo de polipropileno de 14 ml (Sarstedt) com uma tampa de metal.
[00437] As células foram deixadas se recuperar crescendo por 2 horas a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre ágar L e 50 pg/pl de carbenicilina e 10 mM de ácido mevalônico e incubadas a 30°C. No dia seguinte, 6 transformantes foram recolhidos e cultivados em tubos com 5 ml de caldo L e 50 pg/pl de carbenicilina por uma noite a 30°C. Preparações de plasmídeo foram feitas nas culturas de uma noite usando o kit QIAquick Spin Miniprep (Qiagen). Devido ao uso de células BL21 para propagação de plasmídeo, uma modificação de lavagem das colunas de centrifugação com tampão PB 5X e tampão PE 3X foi incorporada de acordo com o protocolo padrão do fabricante para obter DNA de plasmídeo de alta qualidade. Os plasmídeos foram digeridos com Pstl em uma reação de 20 pl para garantir o fragmento linear de tamanho correto. Todos os 6 plasmídeos tinham o tamanho correto e foram enviados para Quintara Biosciences (Berkeley, CA) para sequenciamento com os iniciadores MCM65, MCM66, EL1000 (Tabela 4). Os resultados do sequenciamento de DNA mostraram que todos os 6 plasmídeos estavam corretos. Um foi escolhido e designado plasmídeo EWL230 (figuras 57, 58A e 58B).
iv) Construção do plasmídeo pEWL244 (pTrc P.alba- mMVK)
[00438] Uma reação de PCR foi realizada para amplificar o gene MVK de Metanosarcina mazei (M. mazei) usando MCM376 como o gabarito (vide seção v), os iniciadores MCM165 e MCM177 (vide Tabela 4), e Pfu Ultra II Fusion DNA polimerase (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. As condições de PCR foram as seguintes: 95°C por 2 minutos (somente para o primeiro ciclo), 95°C por 25 segundos, 55°C por 25 segundos, 72°C por 18 segundos, repetir por 28 ciclos, com extensão final a 72°C por 1 minuto. O produto de PCR de MVK de M. mazei foi purificado usando o kit QIAquick PCR Purification (Qiagen Inc.).
[00439] O produto de PCR de MVK de M. mazei foi então digerido em uma reação de 40 pl contendo 8 pl de produto de PCR, 2 pl da endonuclease Pmel (New England Biolabs), 4 pl de tampão 4 NEB 10X, 4 pl de NEB BSA 10X, e 22 pl de ddH2O. A reação foi incubada pfor 3 horas a 37°C. O produto de PCR digerido foi então purificado usando o kit QIAquick PCR Purification Kit. Uma digestão de restrição secundária foi realizada em uma reação de 47 pl contendo 2 pl da endonuclease Nsil (Roche), 4,7pl de tampão H 10X, e 40 pl do fragmento de MVK de M. mazei digerido com Pmel. A reação foi incubada por 3 horas a 37°C. O produto de PCR digerido foi então purificado em gel usando um E-gel a 1,2% e extraído usando o kit QIAquick Gel Extraction. O plasmídeo EWL230 foi digerido em uma reação de 40 pl contendo 10 pl de plasmídeo, 2 pl da endonuclease Pmel, 4 pl de tampão 4 NEB 10X, 4 pl de NEB BSA 10X, e 20 pl de ddH2O. A reação foi incubada por 3 horas a 37°C. O produto de PCR digerido foi então purificado usando o kit QIAquick PCR Purification. Uma digestão de restrição secundária foi realizada em uma reação de 47 pl contendo 2 pl da endonuclease Pstl, 4,7 pl de tampão H 10X, e 40 pl do fragmento linear EWL230 digerido com Pmel. A reação foi incubada por 3 horas a 37°C. O produto de PCR digerido foi então purificado em gel usando um E- gel a 1,2% e extraído usando o kit QIAquick Gel Extraction (figura 59). Usando as extremidades coesas compatíveis dos sítios Nsil e Pstl, foi preparada uma reação de ligação de 20 pd contendo 8 pl de enxerto de MVK de M. mazei, 3 pl do plasmídio EWL230, 1 pl de T4 DNA ligase, 2 pl de tampão ligase 10X, e 6 pl de ddH2O. A mistura de ligação foi incubada por uma noite a 16°C. No dia seguinte, a mistura de ligação foi dessalinizada colocando-se um filtro de membrana de nitrocelulose de 0,025 pm em uma placa de petri de ddH2O e aplicando-se a mistura de ligação suavemente sobre o filtro de membrana de nitrocelulose por 30 minutos à temperatura ambiente. Células MCM446 foram cultivadas em LB até a fase de midlog e em seguida lavadas três vezes com água estéril gelada. Uma alíquota de 50 pl da suspensão de células foi misturada com 5 pl da mistura de ligação de pTrc P.alba-mMVK dessalinizada. A mistura de suspensão de células foi eletroporada em uma cu- beta de 2 mm a 2,5 Volts e 25 uFd usando um Gene Pulser Electropo- rator. 1 ml de LB foi imediatamente adicionado às células, e em seguida as células foram transferidas para um tubo de polipropileno de 14 ml com uma tampa de metal. As células foram deixadas se recuperar crescendo por 2 horas a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre placas de ágar LA e 50 pg/pl de carbenicilina e 5 mM de ácido mevalônico e incubados a 30°C. No dia seguinte, 6 transformantes foram recolhidos e cultivados em tubos com 5 ml de LB e 50 pg/pl de carbenicilina por uma noite a 30°C. Preparações de plasmídeo foram feitas nas culturas de uma noite usando o kit QIAquick Spin Miniprep. Devido ao uso de células BL21 para propagação de plasmídeo, uma modificação de lavagem das colunas de centrifugação com tampão PB 5X e tampão PE 3X foi incorporada de acordo com o protocolo padrão do fabricante para obter DNA de plasmídeo de alta qualidade. Os plasmídeos foram digeridos com Pstl em uma reação de 20 pl para ga-rantir o fragmento linear de tamanho correto. Todos os 6 plasmídeos tinham o tamanho correto e foram enviados para Quintara Biosciences para sequenciamento com os iniciadores MCM65, MCM66, EL1000, EL1003, e EL1006 (Tabela 4). Os resultados do sequenciamento de DNA mostraram que todos os 3 plasmídeos estavam corretos. Um foi escolhido e designado plasmídeo EWL244 (figuras 60 e 61A-B).
v) Construção do plasmídeo MCM376 - MVK a partir de "M. mazei archaeal Lower"em pET200D.
[00440] A MVK ORF do opéron da via inferior de M. mazei archaeal (figuras 73A- C) foi amplificada por PCR usando os iniciadores MCM161 e MCM162 (Tabela 4) usando a mistura de PCR Invitrogen Platinum HiFi. 45 uL de mistura de PCR foram combinados com 1 uL de gabarito, 1 uL de cada iniciador a 10 uM, e 2 uL de água. A reação foi realizada em ciclos da seguinte maneira: 94°C por 2:00 minutos; 30 ciclos de 94°C por 0:30 minutos, 55°C por 0:30 minutos e 68°C por 1:15 minutos; e em seguida 72°C por 7:00 minutos, e 4°C até esfriar. 3 uL desta reação de PCR foram ligados ao plasmídeo pET200D Invitrogen de acordo com o protocolo do fabricante. 3 uL desta ligação foram introduzidos em células TOP10 Invitrogen, e os transformantes foram selecionados sobre LA/kan50. Um plasmídeo de um transformante foi isolado e o enxerto foi sequenciado, resultando em MCM376 (figuras 74A-C).
vi) Construção da cepa EWL251 (BL21(DE3), Cm-GI1.2- KKDyl, pTrc P.alba-mMVK)
[00441] Células MCM331 (que contêm a construção cromossômica gi1.2KKDyl codificando mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase, e IPP isomerase de S. cerevisiae) foram cultivadas em LB até a fase de midlog e em seguida lavadas três vezes com água estéril gelada. 50 pl de suspensão de células foram misturados com 1 pil do plasmídeo EWL244. A mistura de suspensão de células foi eletroporada em uma cubeta de 2 mm a 2,5 Volts e 25 uFd usando um Gene Pulser Electroporator. 1 ml de LB foi imediatamente adicionado às células, e em seguida as células foram transferidas para um tubo de polipropileno de 14 ml com uma tampa de metal. As células foram deixadas se recuperar crescendo por 2 horas a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre placas de ágar LA e 50 pg/pl de carbenicilina e 5 mM de ácido mevalônico e incubados a 37°C. Uma colônia foi selecionada e designada cepa EWL251.
vii) Construção da cepa EWL256 (BL21(DE3), Cm-GI1.2- KKDyl, pTrc P.alba-mMVK, pCL Upper MVA)
[00442] Células EWL251 foram cultivadas em LB até a fase de mi- dlog e em seguida lavadas três vezes com água estéril gelada. 50 pl da suspensão de células foram misturados com 1 pl do plasmídeo MCM82 (que é pCL PtrcUpperPathway codificando de mvaE e mvaS E. faecalis). A mistura de suspensão de células foi eletroporada em uma cubeta de 2 mm a 2,5 Volts e 25 uFd usando um Gene Pulser Electroporator. 1 ml de LB foi imediatamente adicionado às células, e em seguida as células foram transferidas para um tubo de polipropile- no de 14 ml com uma tampa de metal. As células foram deixadas se recuperar crescendo por 2 horas a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre placas de LA e 50 pg/pl de carbenicilina e 50 pg/pl de espectinomicina e incubados a 37°C. Uma colônia foi escolhida e de-signada cepa EWL256. Tabela 4: Sequências de iniciadores
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II. Construção de MCM442-449: BL21 e BL21(DE3) com FRT-cmR-FRT-gi1.x- mKKDyl i) Construção do gabarito para recombinação
[00443] Cassetes de recombinação à base de FRT, e plasmídeos para integração mediada por Red/ET e loopout do marcador de antibiótico foram adquiridos no Gene Bridges GmbH (Alemanha). Os procedimentos usando esses materiais foram realizados de acordo com os protocolos da Gene Bridges. Os iniciadores MCM 193 e MCM 195 foram usados para amplificar o cassete de resistência a partir do gabarito FRT- gb2-Cm-FRT usando o kit Stratagene Herculase II Fusion de acordo com o protocolo do fabricante. A reação de 50 uL foi efetuada usando o seguinte ciclo: 95°C, 2 minutos; (95°C, 20 segundos, 55°C, 20 segundos, 72°C, 1 minuto) x 5, (95°C, 20 segundos, 60°C, 20 segundos, 72°C, 1 minuto) x 25; 72°C, 3 minutos; 4°C até esfriar. O amplicon foi purificado por uma coluna Qiagen PCR de acordo com o protocolo do fabricante e eluído em 30 uL de EB (tampão de eluição). O DNA foi digerido com Ndel e Pcil em uma reação de 20 pl com tampão H Roche 1x e 0,5 uL de BSA. O plasmídeo MCM376 foi digerido em uma reação de 10 pl contendo 1 uL de cada um de Ndel, Ncol, e tampão H Roche. As reações prosseguiram por uma noite a 37°C, e em seguida o corte de DNA foi purificado em colunas Qiagen PCR e eluí- dos em 30 uL de EB. O produto de PCR foi ligado em MCM376 em uma reação contendo 1 uL de vetor, 3 uL de produto de PCR, 1 uL de tampão 2 Quick Ligase Roche, 5 uL de tampão 1, e 1 uL de Ligase. A reação prosseguiu à temperatura ambiente por 3 horas e em seguida 5 uL foram transformados em células TOP10 Invitrogen de acordo com o protoloco do fabricante. Os transformantes foram selecionados sobre ágar L (LA) e cloranfenicol (10 ug/mLO) a 37°C por uma noite.
[00444] Colônias de transformantes foram colocadas sobre LA contendo cloranfenicol (30 ug/mL) e canamicina (50 ug/ml) para serem armazenadas e enviadas para Quintara (Berkeley, CA) para sequenciamento. Foi verificado que quatro clones, cada um com os quatro nucleotídeos diferentes em "N" no iniciador MCM 195, tinham a sequência correta para o promotor inserido. Os clones foram cultivados em 5 mL de LB contendo cloranfenicol (30 ug/mL) e canamicina (50 ug/mL) e usados para a preparação de DNA de plasmídeo. Este plasmídeo foi retransformado em células TOP10 e cepas foram congeladas da seguinte maneira: Tabela 5: MCM484-487 MCM484 cmR-gi1,6-MVK(mazei) em pET (clone AI-3, variável nt A) MCM485 cmR-gi1,0-MVK(mazei) em pET (clone B4-6, variável nt C) MCM486 cmR-gi1.2-MVK(mazei) em pET (clone CI-5, variável nt G) MCM487 cmR-gi1.5-MVK(mazei) em pET (clone C3-3, variável nt T)
ii) Criação das cepas alvo de recombinação MCM349 e MCM441
[00445] O marcador de resistência ao cloranfenicol resistance (cmR) foi removido ("looped out") da cepa MCM331 usando o plasmídeo pGB706 (GeneBridges) de acordo com as instruções do fabricante. Células MCM331 foram cultivadas até a fase de midlog em LV e lavadas três vezes em água estéril gelada. Uma alíquota de 1 uL de pGB706 DNA foi adicionada a 50 uL de suspensão de células e esta mistura foi eletroporada em uma cubeta de 2 mm a 2,5 volts, 25u Fd seguida de recuperação imediata em 500 uL de LB por uma hora a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre LB contendo tetra- ciclina (5 ug/ml) a 30°C. No dia seguinte, um clone foi cultivado a 30°C em LB contendo tetraciclina (5 ug/ml) até que turvaçâo fosse visível (OD600-0,5-0,8). Esta cultura foi espalhada sobre LB e cultivada por uma noite a 37°C. Um clone que não conseguiu crescer em LB contendo cloranfenicol (10 ug/mL) ou LB contendo tetraciclina (5 ug/mL) foi congelado como MCM348. O plasmídeo MCM356 (pRedET carben- cilina; GeneBridges) foi eletroporado da maneira descrita acima e os transformantes foram selecionados sobre LB contendo carbenicilina (50 ug/mL) a 30°C. Um clone foi cultivado em LB carbenicilina (50 ug/mL) a 30°C e congelado como MCM349.
[00446] A cepa MCM441 foi criada por eletrotransformação do plasmídeo MCM356 em EWL204 como descrito acima.
iii) Recombinação de FRT-cmR-FRT-gil.x-mMVK em MCM349 e MCM441
[00447] Os plasmídeos MCM484-487 foram usados como gabarito para amplificação por PCR com os iniciadores MCM120 e MCM196 e o kit Herculase II Fusion, de acordo com o protocolo do fabricante. Três reações por gabarito foram realizadas com 0, 1, ou 3uL DMSO. As reações de 50 uL foram efetuadas usando o seguinte ciclo: 95°C, 2 minutos; (95°C, 20 segundos; 55°C 20 segundos; 72°C, 1,5 minutos) por cinco ciclos; (95°C, 20 segundos; 60°C 20 segundos; 72°C, 1,5 minutos) por 25 ciclos; 72°C por 3 minutos; 4°C, por uma noite. Três reações de um dado gabarito foram combinadas e purificadas em colunas Qiagen PCR e eluídas com 30 uL de EB a 60°C. 5uL de DNA foram digeridos com 1 uL de Dpnl em tampão A Roche 1x por 3 horas a 37°C. Este DNA foi então microdializado contra um excesso de água por 30 minutos.
[00448] As cepas foram cultivadas em 5 mL de LB contendo carbenicilina (50 ug/mL) de traços frescos ("fresh streaks") a 30°C até atingirem uma OD600 de -0,5. 40 mM de L-arabinose foram adicionados e as culturas foram incubadas a 37°C por 1,5 hora. As células foram recolhidas e eletroporadas com 3uL dos amplicons dialisados acima, e em seguida recuperadas em 500 uL de SOC a 37°C por 1,5-3 horas. Os transformantes foram selecionados sobre placas de LA contendo cloranfenicol (5 ug/mL) a 37°C.
[00449] Os clones sensíveis à canamicina foram analisados por PCR quanto à inserção do amplicon.
[00450] Os produtos de PCR dos clones positivos foram sequencia- dos para verificar a sequência do DNA inserido. Os amplicons eram consistentes com o FRT-gi1.2-yKKDyl em attTn7 em MCM441 e 348 sendo substituídos por FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyl (as designações yK e mKreferem-se à mevalonato quinase de Saccharomyces cerevisiae e Metanosarcina mazei, respectivamente). Tabela 6A: As seguintes cepas foram cultivadas em LB contendo cloranfenicol (5 ug/mL) e congeladas.
Figure img0010
Tabela 6B: Iniciadores MCM120 AAAGTAGCCGAAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGAT GTTTGATTAAAAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG (SEQ ID N°: 109) MCM193 GATATACATATGAATTAACCCTCACTAAAGG (SEQ ID N°: 110) MCM 195 GCATGCATGACATGTTTTTTTACCTCCTTTGTTATCCGCTCACAA- TTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATNGT- CAAGGGCG CGGCCGCGATCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID N°: 111) MCM 196 AGGCTCTCAACTCTGACATGTTTTTTTCCTCCTTAAGGGTGCA- GGCCTATCGCAAATTAGCTTAATCTACTTTCAGACCTTGCTCGG (SEQ ID N°: 112)
III. Efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli expressando genes da via do ácido mevalônico e cultivada em cultura com alimentação intermitente com capacidade para 15 L
[00451] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00452] K2HPO4 7,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono- hidratado 2 g, citrato férrico de amónio 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, solução de metais de traço modificados 1000X 1 ml. Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo e dissolvidos em diHhO. Esta solução foi tratada em uma autoclave. O pH foi ajustado em 7,0 com hidróxido de amónio (30%) e q.s. para completar 0 volume. Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adicionados depois de esterilização e ajuste do pH.
[00453] Solução de metais de traço modificados 1000X:
[00454] Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoθ4 * 2H2O 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em H2O desionizada, 0 pH é ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida q.s. para completar 0 volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron.
[00455] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células BL21 (DE3) células de E. coli contendo a via superior do ácido mevalônico (MVA) (pCL Upper), a via inferior de MVA integrada (gi1.2KKDyl),e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e de isopreno sintase de P. alba (pTrcAlba-mMVK). Esta experiência foi realizada para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose a um pH de fermentação desejado pH 7,0 e à temperatura de fermentação desejada de 30°C. Um frasco congelado da cepa de E. coli foi descongelado e inoculado em meio de triptona-extrato de levedura. Depois que o inoculo cresceu até OD 1,0, medida a 550 nm, 500 ml_ foram usados para inocular um biorreator de 15 L completando o volume inicial até 5-L.
i) Produção de isopreno em células de E.coli (EL256) cultivadas em cultura com alimentação intermitente sem alimentaçãoa com extrato de levedura
[00456] Glicose foi alimentada a uma taxa exponencial até as células atingirem a fase estacionária. Depois disso a alimentação de glicose foi diminuída para atender as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose introduzida no biorreator durante a fermentação de 67 horas foi de 3,9 kg. A indução foi obtida por adição de isopropil-beta-D- 1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG foi levada até 102 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 9. A concentração de IPTG foi aumentada até 192 uM quando a OD550 atingiu 140. O perfil de OD550 no interior do biorreator ao longo do tempo está mostrado na figura 67A. O nível de isopreno no gás desprendido do biorreator foi determinado usando um espectrômetro de massas Hiden. O título de isopreno aumentou durante a fermentação até um valor final de 35,6 g/L (figura 67B). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 67 horas foi de 320,6 g e 0 tempo de produção está mostrado na figura 67C. O perfil de atividade metabólica, medida por TCER, está mostrado na figura 67D. O rendimento molar do carbono utilizado que participou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 17,9%. O rendimento em percentagem em peso de isopreno a partir de glicose foi de 8,1%.
[00457] Produção de isopreno em células E.coli (EL256) cultivadas em cultura com alimentação intermitente com alimentação com extrato de levedura
[00458] Glicose foi alimentada a uma taxa exponencial até as células atingirem a fase estacionária. Depois disso a alimentação de glicose foi diminuída para atender as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose introduzida no biorreator durante a fermentação de 68 horas foi de 7,1 kg. Um total de 1,06 kg de extrato de levedura também foi alimentado durante a fermentação. A indução foi obtida por adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada até 208 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 7. A concentração de IPTG foi aumentada até 193 uM quando a OD550 atingiu 180. O perfil de OD550 no interior do biorreator ao longo do tempo está mostrado na figura 68A. O nível de isopreno no gás desprendido do biorreator foi determinado usando um espectrômetro de massas Hiden. O título de isopreno aumentou durante a fermentação até um valor máximo de 32,2 g/L (figura 68B). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 68 horas foi de 395,5 g e 0 tempo de produção está mostrado na figura 68C. O curso do tempo de produtividade volumétrica está mostrado na figura 68D e mostra que uma taxa média de 1,1 g/L/hora foi mantida entre 23 e 63 horas. O perfil de atividade metabólica, medida por TCER, está mostrado na figura 68E. O rendimento molar do carbono utilizado que participou na produção de isopreno du-rante a fermentação foi de 10,3%. O rendimento em percentagem em peso de isopreno a partir de glicose foi de 5,2%.
IV. Produção de isopreno a partir de diferentes fontes de carbono em E. coli ancorando a via do ácido mevalônico (MVA) e isopreno sintase (EWL256)
[00459] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00460] K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono-hidratado 2 g, citrato férrico de amónio 0,3 g, (NHLt)2SO4 3,2 g, extrato de levedura 0,2 g, solução de metais de traço modificados 1000X 1 ml. Todos os componentes foram sequencialmente dissolvidos em dil-hO. O pH foi ajustado em 6,8 com hidróxido de amónio (30%) e o volume foi completado. O meio foi esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron. A fonte de carbono foi adicionada até uma concentração final de 1%. Os antibióticos necessários foram adicionados depois de esterilização e ajuste do pH.
[00461] Solução de metais de traço 1000X (por litro de meio de fermentação):
[00462] Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Cada componente foi dissolvido um de cada vez em diH2O, 0 pH foi ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida 0 volume foi completado e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron.
i) Preparação de hidrolisado de biomassa AFEX
[00463] Palha de milho pré-tratada com AFEX foi hidrolisada para preparar um hidrolisado de biomassa contendo xilose, glicose e acetato.
[00464] Palha de milho pré-tratada com AFEX, adquirida no Michigan Biotechnology Institute, foi usada. As condições de pré-tratamento foram 60% de umidade, carga de amónia 1:1, e 90°C por 30 minutos, e em seguida secada ao ar. O teor de umidade na palha de milho pré- tratada com AFEX foi de 21,27%. O teor de glicano e xilano na palha de milho pré-tratada com AFEX foi de 31,7% e 19,1% (base seca), respectivamente. A enzima usada foi accellerase 1000, Grindamyl H121 (produto de xilanase Danisco proveniente de Aspergillus niger para a indústria panificadora).
[00465] Para sacarificação, 20 g de palha de milho pré-tratada com AFEX foram adicionados a um balão de 500 ml, junto com 5 ml de tampão citrato de sódio 1 M pH 4,8, 2,25 ml de Accellerase 1000, 0,1 ml de Grindamyl H121, e 72,65 ml de água desionizada. O balão foi colocado em um agitador orbital, e incubado a 50°C por 96 horas.
[00466] Para análise, uma amostra foi retirada do agitador, e analisada usando HPLC. O hidrolisado continua 37,2 g/1 de glicose e 24,3 g/L de xilose, e 7,6 g/L de oligômeros de glicose e/ou xilose. Adicio- nalmente, o hidrolisado também continha 1,17 g/L de acetato.
ii) Procedimento experimental
[00467] Um inóculo da cepa EWL256de E. coli contendo a via de MVA e isopreno sintase foi retirado de um frasco congelado e espalhado sobre uma placa de caldo LB ágar contendo espectinomicina (50 ug/mL) e carbinicilina (50 ug/mL) e incubado a 30°C por uma noite. Uma única colônia foi inoculado em meio TM3 contendo glicose, xilose, glicerol, acetato ou biomassa como a única fonte de carbono e cultivado por uma noite a 30°C. As células que cresceram em acetato atingiram uma densidade ótica significativamente mais baixa. As células que cresceram em glicose, glicerol, hidrolisado de biomassa ou acetato foram diluídas em 20 mL de meio TM3 contendo as respectivas fontes de carbono até atingir uma densidade ótica entre 0,1 medida a 600 nM. Um controle negativo não contendo qualquer fonte de carbono foi preparado a partir da cultura de uma noite com glicose. Uma experiência separada foi realizada com glicose e xilose, onde as culturas foram di-luídas até uma densidade ótica de 0,05. Todas as condições das culturas (exceto em relação ao acetato e glicerol) foram testadas em duplicata e os resultados apresentados são a média entre essas culturas. A produção de isopreno foi induzida com 200pM de IPTG desde o início da experiência. Os balões foram incubados a 30°C em um agitador orbital (200 rpm) e o crescimento foi acompanhado medindo-se a densidade ótica. Depois que as culturas alimentadas com glicose atingiram uma densidade ótica de aproximadamente 0,4, amostras foram analisadas quanto à produção de isopreno a partir de todas as fontes de carbono testadas em intervalos de uma hora durante três horas. Amostras de 100 pL foram transferidas em duplicata para frascos de vidro de 2 mL, vedados e incubados por 30 minutos a 30°C. As bactérias foram então eliminadas com calor por incubação a 80°C por 8 minutos. A quantidade de isopreno produzido foi medida usando GC-MS e a produtividade específica (pg/L*hr) foi calculada.
iii) Resultados
[00468] Uma produção significativa de isopreno pôde ser demonstrada durante crescimento em todas as fontes de carbono testadas. Essas fontes de carbono são exemplos de alcoóis comuns, ácidos orgânicos, açúcares contendo 5 ou 6 unidades de carbono (Cs ou Ce), e hidrolisado de biomassa.
[00469] A taxa de crescimento inicial em hidrolisado de biomassa foi equiparável à taxa de crescimento em glicose (figura 69A). A produtividade específica inicial durante crescimento em hidrolisado de biomassa foi significativamente maior que durante crescimento em glicose. Isto demonstra que hidrolisado de biomassa pode ser usado como fonte de carbono eficiente para a produção de isopreno. A produtividade específica caiu depois 255 minutos de crescimento em hidrolisado de biomassa (figura 69B). As bactérias apresentaram uma taxa de crescimento mais baixa com xilose como a única fonte de carbono quando comparada à glicose (figura 69C), mas uma produtividade específica significativa de isopreno foi medida (figura 69D). Isto mostra que açúcares de Cs e Ce podem ser utilizados para a produção de isopreno via a via de ácido mevalonato.
[00470] Supreendentemente, as bactérias que cresceram em acetato como a única fonte de carbono apresentaram uma produtividade específica de isopreno aproximadamente duas vezes mais alta que durante crescimento em glicose (figura 69A). As bactérias cresceram mais devagar em acetato quando comparadas com o crescimento em glicose (figura 69B), mas a experiência realizada demonstra que acetato também pode ser usado como uma fonte de carbono para a produção de isopreno. Acetato também estava presente no hidrolisado de biomassa segundo medido por HPLC.
[00471] As bactérias cresceram bem com glicerol como a única fonte de carbono (figura 69A) e produção significativa de isopreno foi demonstrada (figura 69B). Isto mostra que alcoóis comuns também podem ser usasdos como fontes de carbono para a produção de isopreno via a via de ácido mevalonato.
Exemplo 11: Expressão de isopreno sintase a partir de planta em Streptomyces sp.
[00472] O gene para isopreno sintase Kudzu foi obtido a partir do plasmídeo pJ201:19813. O plasmídeo pJ201:19813 codifica isopreno sintase de Pueraia lobata (Kudzu plant) teve o códon otimizado para Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Rhodopseudomonas palustris e Corynebacterium (figuras 79A-79C (SEQ ID N°: 123)). Digestão do plasmídeo pJ201 : 19813 com as enzimas de restrição Ndel e BamHI liberou o gene isol9813 que foi ligado no vetor de transporte pUWL201PW de Streptomyces-E.coli (Doumith et ai, Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000; figura 71) para gerar pUWL201_iso. O sucesso da clonagem foi verificado por análise de restrição de pUWL201_iso. A expressão de isopreno sintase isol9813 estava sob o controle do promotor erm que permite a expressão constitutiva na espécie Strep- tomycetes, mas não a expressão em E. coli.
[00473] PUWL201PW (sem enxerto) e pUWL201_iso foram introduzidos em Streptomyces albus J1074 (Sanchez et al. Chem. Biol. 9:519- 531, 2002) por transformação de protoplastos da maneira descrita por Hopwood et al. The John innes foundation, Noruega, 1985.
[00474] Uma alíquota de 200 pl de suspensão de protoplastos foi transformada com 1,9 pg de pUWL201PW ou 2,9 pg de pUWL201_iso. Depois de incubação por uma noite a 28°C em placas de ágar R5 não seletivo, os transformantes positivos foram selecionados por nova incubação por 4 dias em ágar revestido R3 contendo tiostreptona (250 pg/ml). Os transformantes resistentes à tiostreptona fooram examinados quanto à presença dos plasmídeos pUWL por preparação de plasmídeos usando kit Plasmid Mini Kit (Qiagen). O DNA de plasmídeo preparado foi reintroduzido em DH5cc de E. coli para gerar quantidades suficientes de DNA de plasmídeo para serem analisadas por análise de restrição. Os transformantes positivos foram selecionados sobre placas de ágar L contendo ampicilina e a análise dos enxertos foi feita por digestão do DNA de plasmídeo com as endonucleases Ndel e BamHI. O isopreno sintase foi identificado como um fragmento de 1,7 kb em clones de pUWL201 iso positivos ao passo que nas cepas de controle (pUWL201PW) tal fragmento não foi observado.
[00475] A cepa do tipo selvagem e os transformantes de S. albus contendo o plasmídeo de controle pUWL201PW ou isopreno sintase codificando pUWL201_iso foram analisados quanto à formação de isopreno. As cepas foram cultivadas em duplicata em meio sólido (ágar de caldo de soja tríptico, TSB; 2,5 ml) na presença ou ausência de tios- treptona (200 pg/ml) e incubadas por 4 dias a 28°C em fracos de headspace vedados (volume total 20 ml). Amostras de headspace de 500 pl (medições finais) foram analisadas por GC-MS no modo SIM e o isopreno foi identificado de acordo com os tempos de retenção e as massas moleculares de referência (67 m/z). O isopreno presente nas amostras de headspace foi quantificado por curvas de calibração previamente geradas. Enquanto que S. albus do tipo selvagem e cepas de controle ancorando pUWL201PW produziram isopreno em concentrações ligeiramente mais altas que o limite de detecção (0,04 - 0,07 ppm), S. albus ancorando pUWL201 _iso produziu isopreno em um excesso pelo menos dez vezes maior em relação aos controles (0,75 ppm; figura 72). Os resultados demonstram a expressão bem-sucedida de isopreno sintase derivado de planta em um organismo procariótica do grupo Actinomycetes.
Exemplo 12: Produção de isopreno ou mevalonato a partir de ácido graxo ou óleo de palma em E. coli fadR atoC LS5218 contendo a via superior ou as vias superior e inferior de ácido mevalônico mais isopreno sintase de kudzu.
[00476] A cepa LS5218 de Escherichia coli fadR atoC (#6966) foi adquirida no Coli Genetic Stock Center. FadR codifica um repressor de transcrição que regula negativamente a expressão dos genes codificando enzimas de degradação de ácidos graxos enzymes (Campbell et al., J. Bacteriol. 183: 5982-5990, 2001). AtoC é um regulador de resposta em um sistema regulador de dois componentes onde AtoS regula o metabolismo de acetolactato. A cepa fadR atoC permite a expressão constitutiva dos genes de degradação de ácidos graxos e incorpora ácidos graxos de cadeia longa em poli-hidroxialcanoatos de comprimento de cadeia longo. Quando óleo de palma foi usado como uma fonte de carbono para a produção de mevalonato ou de isopreno, o óleo óleo foi convertido em glicerol mais ácido graxo. Métodos para este procedimento são bastante conhecidos na literatura, e podem ser feitos seja enzimaticamente por incubação com uma lipase (por exemplo lipase de pâncreas de porco, lipase de Candida rugosa, ou outras lipases semelhantes) ou quimicamente por saponificação com uma base tal como hidróxido de sódio.
i) Cepa de E. coli fadR atoC expressando a via superior de ácido mevalônico
[00477] A cepa WW4 foi criada por eletroporação de pCLPtrcUp- perPathway em LS5218 usando-se métodos tradicionais (Sambrooke et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor, 1989). A incorporação do plasmídeo foi demonstrada pela produção de ácido mevalônico (MVA) quando células foram cultivadas no meio TM3 suplementado com C12 ácido graxo (FA) ou óleo de palma como a fonte de carbono. Para demonstrar a produção de MVA por WW4 a partir de ácido graxo, células de uma cultura de uma noite foram diluídas 1 para 100 em 5 mL do meio TM3 modificado (TM3 sem extrato de levedura) suplementado com 0,25% de C12 FA (Sigma cat # L9755). O primeiro sinal de produção de MVA (24 mg/L) ficou evidente depois de uma noite de incubação a 30°C da cultura induzida por IPTG. A produção aumentou durante três dias até um nível final de 194 mg/L de MVA produzido. Para demonstrar a produção de MVA por WW4 a partir de óleos, células de uma cultura de uma noite foram diluídas 1 para 100 em meio TM3 modificado suplementado com 200 mg de óleo de palma digerido por 5 mL de meio TM3. O primeiro sinal de produção de MVA (50 mg/L) ficou evidente depois de uma noite de incubação da cultura induzida por IPTG a 30°C. A produção aumentou durante três dias até um nível final de 500 mg/L de MVA produzido.
ii) Cepa E. coli fadR atoC expressando as vias superior e inferior de MVA mais isopreno sintase de kudzu
[00478] A cepa WW4 de Escherichia coli (LS5218 fadR atoC pCL- PtrcUpperPathway) foi transformada com pMCM118 [pTrcKKDylklS] para produzir WW10. A incorporação do plasmídeo foi demonstrada por evidência de produção de isopreno quando a cepa foi cultivada em TM3 e glicose e induzida com IPTG (100, 300, ou 900 uM). A cepa era relativamente sensível ao IPTG e apresentou um defeito de crescimento significativo mesmo a 100 uM de IPTG. Esses resultados estão mos-trados na figura 70A.
[00479] Para testar a produção de isopreno a partir de ácido dode- canoico, WW10 foi cultivada por uma noite em caldo L contendo espectinomicina (50 ug/ml), e canamicina (50 ug/ml) a 37°C com agitação a 200 rpm. As células foram lavadas com meio TM3 modificado por centrifugação e ressuspensão em seu volume de cultura original com este meio. As células lavadas e ressuspendidas desta cultura inicial foram diluídas 1 para 100 e 1 para 10 em 5 mL de meio TM3 modificado contendo 0,125% de C12 ácido graxo (Sigma cat # L9755).
[00480] Para demonstrar a produção de mevalonato a partir de óleo de palma, o óleo foi predigerido com lipase a 37°C e 250 rpm por vários dias para liberar os ácidos graxos (evidência de hidrólise foi avaliada pela espuma formada quando os tubos foram agitados).
[00481] Além disso, uma cultura foi montada por diluição das células lavadas a 1 para 10 em meio TM3 modificado contido nos tuvos de ensaio com óleo de palma. Um segundo tubo foi montado pela adição de 0,125% de C12FA ao resto (2,5 ml_) das células lavadas sem nova diluição (bioconversão). Depois de 3,75 horas de crescimento a 30°C com agitação a 250 rpm todas as culturas foram induzidas pela adição de 50 uM de IPTG. A incubação continuou por 4 horas e depois desse período 200 uL de cada uma das culturas foram avaliados quanto ao acúmulo de isopreno com um ensaio de headspace modificado (1 hora de acumulação a 30°C com agitação a 500 rpm). Um ensaio de isopreno adicional foi conduzido por uma incubação de 12 horas do bloco de vidro de ensaio antes da análise por GCMS. A incubação das culturas induzidas continuou por uma noite e alíquotas de 200 uL foram novamente analisadas quanto à produção de isopreno (1 hora, 30 graus, agitador Shel-Lab a 500 rpm) na manhã seguinte. Análise dessas culturas mostrou níveis significativos de produção de isopreno. Os níveis mais altos de isopreno foram observados na cultura que foi semeada a uma diluição 1/10 a partir da cultura inicial de uma noite depois de ela ter sido incubada e induzida por uma noite. Este resultado sugere que esta cultura continuou a crescer e aumentar em termos de densidade celular. Estes resultados estão mostrados na figura 70B. A densidade celular não pôde ser medida diretamente porque a suspensão de ácido graxo tinha uma aparência turva. A densidade celular desta cultura foi portanto determinada por plaqueamento de uma alíquota da cultura e mostrou 8 x 107 unidades formadoras de colônias. Isto corresponde aproximadamente a uma ODeoo de 0,1. Não obstante, esta cultura apresentou uma produção significativa de isopreno; não foi observada formação de isopreno para cepas semelhantes sem a via descrita neste exemplo.
Exemplo 13: Aperfeiçoamento da produção de isopreno por expressão constitutiva de ybhE em E. coli.
[00482] Este exemplo mostra a produção de isopreno em uma cepa expressando constitutivamente ybhE (pgl) comparada a uma cepa de controle com ybhE do tipo selvagem. O gene ybhE (pgl) codifica uma 6-fosfogliconolactonase que suprime a gliconilação pós-translacional de proteínas expressas de forma heteróloga e melhora a solubilidade e o rendimento do produto ao mesmo tempo em que também melhora o rendimento e o fluxo de biomassa através da via de pentose fosfato (Aon et al. Applied and Environmental Microbiology, 74(4): 950-958, 2008).
[00483] A cepa BL21 de E. coli produtora de isopreno (EWL256) foi construída com expressão constitutiva do gene ybhE em um plasmídeo replicante pBBRIMCS5(Gentamicina) (adquirido do Dr. K. Peterson, Louisiana State University).
[00484] Cassestes de recombinação à base de FRT, e plasmídeos para integração mediada por Red/ET e loopout do marcador de antibiótico foram adquiridos no Gene Bridges GmbH (Alemanha). Os procedimentos usando esses materiais foram realizados de acordo com os protocolos da Gene Bridges. Os iniciadores Pgl-F e PglGI1.5-R foram usados para amplificar o cassete de resistência a partir do gabarito FRT-gb2-Cm-FRT usando o kit Stratagene Herculase II Fusion de acordo com o protocolo do fabricante. A reação de PCR (volume final de 50 uL) continha: 5 uL de tampão, 1 uL de gabarito DNA (FRT-gb2- Cm-F from Gene Bridges), 10 de pmoles de cada iniciador, e 1,5 uL de mistura dedNTP 25mM, o volume completado até 50 uL com dH2θ. A reação foi efetuada usando o seguinte ciclo: 1 x 2 minutos, 95°C e em seguida 30 ciclos de (30 segundos a 95°C; 30 segundos a 63°C; 3 minutos a 72°C).
[00485] O produto de PCR resultante foi purificado usando o kit Qi- aQick PCR purification (Qiagen) e eletroporado em células MG1655 eletrocompetentes ancorando o plasmídeo contendo pRed-ET recombinase da seguinte maneira. As células foram preparadas por cultura em 5 mL de caldo L até atingirem uma OD600 ~0,6 a 30°C. As células foram induzidas para expressão de recombinase pela adição de 4% de arabinose e deixas crescer por 30 minutos a 30°C seguido de 30 minutos de crescimento a 37°C. Uma alíquota de 1,5 mL das células foi lavada 3-4 vezes com dFLO gelada. A pelota de células final foi ressus- pendida em 40 uL de dFLO gelada e 2-5 uL do produto de PCR foram adicionados. A eletroporação foi realizada em cubetas ("gap cuvettes") de 1 mm, a 1,3 kV em um Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.). As células foram recuperadas por 1-2 horas a 30°C e plaqueadas so-bre ágar L contendo cloranfenicol (5 ug/mL). Cinco transformantes foram analisados por PCR e sequenciamento usando iniciadores flanqueando o sítio de integração (2 conjuntos de iniciadores: pgl e 49 rev e 3'FxoRV-pglstop; Bottom Pgb2 e Top GB's CMP (946)). Um trans- formante correto foi selecionado e esta cepa foi designada MG1655 GI1.5-pgl::CMP.
[00486] O DNA cromossômico de MG1655 GI1,5-pgl::CMP foi usado como gabarito para gerar um fragmento de PCR contendo a construção FRT-CMP-FRT-GI1.5 - ybhE. Esta construção foi clonada em pBBRIMCS5(Gentamicina) da seguinte maneira. O fragmento, aqui denominado CMP-GI1,5 -pgl, foi amplificado usando o iniciador 5' Pglcon- firm-F e o iniciador 3' 3' FxoRV-pglstop. O fragmento resultante foi clo- nado usando o kit de clonagem TOPO- Blunt no vetor de plasmídeo pCR-Blunt ll-TOPO conforme sugerido pelo fabricante. O fragmento Nsil ancorando o fragmento CMP-GI1.5-pgl foi clonado no sítio Pstl de pBBRIMCS5(Gentamicina). Foi preparada uma reação de ligação de 20pl contendo 5pl do enxerto CMP-GI1.5-pgl, 2pl do vetor pBBR- IMCS5(Gentamicina), 1 pl de T4 DNA ligase (New England Biolabs), 2 pl de tampão ligase 10X, e 10 pl de ddFLO. A mistura de ligação foi incubada à temperatura ambiente por 40 minutos e em seguida 2-4 uL foram eletroporados em células Top 10 eletrocompetentes (Invitrogen) usando os parâmetros descritos acima. Os transformantes foram selecionados sobre ágar L contendo 10 ug/ml de cloranfenicol e 5 ug/ml de gentamicina. A sequência do clone selecionado foi determinada usando vários dos iniciadores descritos acima assim como o "in-house T3" e os iniciadores invertidos fornecidos pela Sequetech, CA. Este plasmídeo foi designado pBBRCMPGI1.5-pgl (figuras 77A-B and SEQ ID N°: 122).
[00487] O plasmídeo pBBRCMPGU .5-pgl foi eletroporado em EWL256, como descrito acima no Exemplo 10 e os transformantes foram plaqueados sobre ágar L contendo cloranfenicol (10 ug/mL), gentamicina (5 ug/mL), espectinomicina (50 ug/mL), e carbenicilina (50 ug/mL). Um transformante foi selecionado e designado RM11608-2. Iniciadores: Pgl-F 5'- ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAG- TTGAATTAACCCTCACT AAAGGGCGGCCGC-3' (SEQ ID N°: 115) PglGI1.5-R 5'- GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATG- CTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAG- TGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGA- CGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-S' (SEQ ID N°: 116) 3' EcoRV-pglstop: 5'-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC (SEQ ID N°: 117) pgl 449 rev: CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG (SEQ ID N°: 118) Bottom Pgb2: GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC (SEQ ID N°: 119) Top GB's CMP (946): ACTGAAACGTTTTCATCGCTC (SEQ ID N°: 120) Pglconfirm-F 5 '-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-S' (SEQ ID N°: 121)
i) Análise em pequeno escala Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00488] K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono-hidratado 2 g, citrato férrico de amónio 0,3 g, (NH4)2SÜ4 3,2 g, extrato de levedura 1 g, solução de metais de traço 1000X 1 ml. Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo e dissolvidos em diH2O. O pH foi ajustado em 6,8 com hidróxido de amónio (30%) e 0 volume foi completado. O meio foi esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron. Glicose 5,0 g e antibióticos foram adicionados depois de esterilização e ajuste do pH.
[00489] Solução de metais de traço 1000X (por litro de meio de fermentação):
[00490] Ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, Fe- SO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO4* 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoθ4 * 2H2O 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em diFLO. O pH é ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida 0 volume da solução é completado e a solução é esterilizada em filtro com um filtro de 0,22 micron.
a) Procedimento experimental
[00491] A produção de isopreno foi analisada cultivando-se as cepas em um Cellerator™ da MicroReactor Technologies, Inc. O volume funcional em cada um dos 24 compartimentos era de 4,5 mL. A temperatura foi mantida em 30°C, 0 valor do pH era 7,0, 0 valor do fluxo de oxigênio era 20 sccm e a taxa de agitação era de 800 rpm. Um inóculo da cepa de E. coli retirado de um frasco congelado foi espalhado sobre uma placa de caldo LB (com antibóticos e incubado a 30°C. Uma única colônia foi inoculado em um meio com antibióticos e cultivada por uma noite. As bactérias foram diluídas em 4,5 mL de meio com antibióticos até atingir uma densidade ótica de 0,05 medida a 550 nm.
[00492] A análise do gás desprendido de isopreno foi efetuada usando um ensaio de headspace com cromatógrafo a gás- espectrômetro de massa (GC-MS) (Agilent). A preparação da amostra foi a seguinte: 100 pL de caldo integral foram colocados em um frasco de GC vedado e incubados a 30 °C por um tempo fixao de 30 minutos. Depois de uma etapa de eliminação com calor, consistindo em incubação a 70°C por 5 minutos, a amostra foi carregada no GC.
[00493] A densidade ótica (OD) a um comprimento de onda de 550 nm foi obtida usando uma leitora de microplacas (Spectramax) durante o curso da operação. A produtividade específica foi obtida dividindo-se a concentração de isopreno (pg/L) pela leitura de OD e pelo tempo (hora).
[00494] As duas cepas EWL256 e RMI 1608-2 foram avaliadas nos níveis de indução com 200 e 400 uM de IPTG. As amostras foram analisadas quanto à produção de isopreno e crescimento celular (OD550) 1, 2,5, 4,75, e 8 horas após a indução. As amostras foram feitas em duplicata.
b) Resultados
[00495] A experiência demonstrou que em 2 concentrações diferentes de IPTG a cepa expressando o ybhE (pgl) apresentou um drástico aumento de 2-3 vezes na produtividade específica de isopreno em relação à cepa de controle.
ii) Fermentação de isopreno a partir de E. coli expressando mevalonato quinase de M. mazei, P. isopreno sintase de alba, e supe- rexpressão de pgl over-expression (RHMI 11608-2) e cultivada em cultura com alimentação intermitente com capacidade para 15 L
[00496] Receita do meio (por litro de meio de fermentação)
[00497] K2HPO4 7,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono- hidratado 2 g, citrato férrico de amónio 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, solução de metais de traço modificados 1000X 1 ml. Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo e dissolvidos em dibW. Esta solução foi tratada em uma autoclave. O pH foi ajustado em 7,0 com hidróxido de amónio (30%) e q.s. para completar 0 volume. Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adicionados depois de esterilização e ajuste do pH.
[00498] Solução de metais de traço modificados 1000X:
[00499] Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO4* 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoθ4 * 2H2O 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em Di H2O, 0 pH é ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida q.s. para completar 0 volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron.
[00500] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com BL21 (DE3) células de E. coli contendo a via superior de ácido mevalônico (MVA) (pCL Upper), a via inferior de MVA integrada (gi1.2KKDyl), alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de P. alba (pTrcAlba-mMVK), e alta expressão de pgl (pBBR-pgl). Esta experiência foi realizada para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose ao pH de fermentação desejado pH 7,0 e uma temperatura de 34°C. Um frasco congelado da cepa de E. coli foi descongelado e inoculado em meio triptona-extrato de levedura. Depois que 0 inóculo cresceu até OD 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 15 L completando 0 volume inicial até 5 L.
[00501] Glicose foi alimentada a uma taxa exponencial até as células atingirem a fase estacionária. Depois disso a alimentação de glicose foi diminuída para satisfazer as necessidades metabólicas. A quan- tidade total de glicose distribuída para o bioreactor durante a fermentação de 40 horas (59 horas) foi de 3,1 kg (4,2 kg em 59 horas). A indução foi atingida por adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada até 110 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 4. A concentração de IPTG foi aumentada para 192 uM quando a OD550 atingiu 150. O perfil de OD550 no interior do biorreator ao longo do tempo está mostrado na figura 78A. O nível de isopreno no gás desprendido do biorreator foi determinado usando usando um es- pectrômetro de massas Hiden. O título de isopreno aumentou durante a fermentação até um valor máximo de 33,2 g/L em 40 horas (48,6 g/L em 59 horas) (figura 78B). O título de isopreno aumentou durante a fermentação até um valor máximo de 40,0 g/Lem 40 horas (60,5 g/L em 59 horas) (figura 78C). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 40 horas (59 horas) foi de 281,3 g (451,0 g em 59 horas) e 0 correr do tempo de produção está mostrado na figura 78D. 0 correr do tempo de produtividade volumétrica está mostrado na figura 78E e mostra que uma taxa média de 1,0 g/L/hora foi mantida entre 0 e 40 horas (1,4 g/L/hora entre 19 e 59 horas). O perfil de atividade metabólica, medida por CER, está mostrado na figura 78F. O rendimento molar de carbono utilizado que participou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 19,6% em 40 horas (23,6% em 59 horas). O rendimento em percentagem em peso de isopreno a partir de glicose foi de 8,9% em 40 horas (10,7% em 59 horas).
[00502] Preparation de amostras de isopreno para polimerização
(a) Preparação da solução de metais de traço modificados 1000X:
[00503] Cada um dos componentes a seguir é dissolvido um de cada vez em H2O desionizada: ácido cítrico * H2O (40 g), MnSO4 * H2O (30 g), NaCI (10 g), FeSO4 * 7H2O (1 g), C0CI2 * 6H2O (1 g), ZnSO * 7H2O (1 g), CuSO4 * 5H2O (100 mg), H3BO3 (100 mg), NaMoCU * 2H2O (100 mg). O pH foi ajustado em 3,0 com HCI/NaOH, e em seguida q.s. para completar o volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 micron.
(b) Preparação do meio de fermentação:
[00504] Cada litro de meio de fermentação continha K2HPO4 (7,5 g), MgSO4 * 7H2O (2 g), ácido cítrico mono-hidratado (2 g), citrato férrico de amónio (0,3 g), extrato de levedura (0,5 g), solução de metais de traço modificados 1000X (1 ml). Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo e dissolvidos em dibW. Esta solução foi tratada em uma autoclave. O pH foi ajustado em 7,0 com amónio gasoso (NH3) e q.s. para completar 0 volume. Glicose (10 g), tiamina * HCI (0,1 g), e antibiótico foram adicionados depois de esterilização e ajuste do pH.
(c) Coleta de amostras de isopreno para purificação e polimerização:
[00505] Isopreno foi coletado por adsorçâo em carvão vegetal ativo passando-se a descarga de fermentação através de latas de carvão vegetal ativo dispostas em paralelo sobre uma tubulação de exaustão.
(d) Preparação da amostra A de polimerização de isopreno a partir de glicose usando E. coli
[00506] A fermentação foi efetuada a um pH 7,0 e 30°C em um biorreator de 15 L com células BL21 (DE3) de E. coli contendo os plasmídeos pCL PtrclIpperMVA e pTrc KKDylklS. Um inóculo da cepa de E. coli retirado de um frasco congelado foi espalhado sobre uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia foi inoculado em meio de triptona-extrato de levedura. Depois que 0 inóculo cresceu até OD 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
[00507] Glicose foi alimentada a uma taxa exponencial até as células atingirem a fase estacionária. Depois disso a alimentação de glicose foi diminuída para satisfazer as necessidades metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída para 0 bioreactor durante a fermenta- ção de 54 horas foi de 3,7 kg. A indução foi atingida por adição de iso- propil-beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG foi levada até 25 pM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi aumentada para 50 uM quando a OD550 atingiu 190. A concentração de IPTG foi aumentada para 100 uM em 38 horas de fermentação. O perfil de OD550 no interior do biorreator ao longo do tempo está mostrado na Fig. 1. O título de isopreno aumentou durante a fermentação até um valor finaal de 2,2 g/L (Fig. 2). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 54 horas foi de 15,9 g e o correr do tempo de produção está mostrado na Fig. 3. O rendimento molar de carbono utilizado que participou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 1,53%. (vide figuras 80, 81 e 82).
(e) Preparação da amostra B de polimerização de isopreno a partir de glicose e extrato de levedura usando E. coli
[00508] A formação de isopreno a partir de glicose e extrato de levedura foi efetuada a um pH 7,0 e 30°C em um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu + ylDI + DXS. Um inóculo da cepa de E. coli retirado de um frasco congelado foi preparado em meio de soytone-extrato de levedura-glicose. Depois que o inóculo cresceu até OD 0,15, medida a 550 nm, 20 mL foram usados para inocular um biorreator contendo 2,5-L de meio triptona-extrato de levedura. O biorreator de 2,5 L foi cultivado a 30°C até atingir uma OD de 1,0 e 2,0 L foram transferidos para o biorreator de 500 L. Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) e glicose foram alimentados a taxas exponenciais. A quantidade total de glicose e extrato de levedura alimentados no biorreator durante a fermentação 50 horas foi de 181,2 kg e 17,6 kg, respectivamente. A densidade ótica no interior do reator ao longo do tempo está mostrada na Fig. 4. O título de isopreno titer aumentou durante a fermentação (Fig. 5). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 50 horas foi de 55,1 geo correr do tempo de produção está mostrado na Fig. 6.
[00509] Dessorção de isopreno a partir de carvão vegetal ativo (Método A)
[00510] Carvão vegetal ativo (130 g), que fora exposto a uma corrente de gás desprendido do fermentador, foi colocado em um balão de 1000 mL junto com uma barra de agitação. Ciclohexano (563 mL) foi adicionado ao balão e a lama foi agitada por 2 horas. Vácuo foi aplicado (100 mbar) via um sifão criogênico em linha (30 mL de capacidade, imerso em nitrogénio líquido). Quatro frações foram coletadas e combinadas para produzir uma solução de isopreno/ciclohexano (2,1 % em peso de isopreno, volume total = 53,1 g). Esta solução foi destilada a vácuo a 100 mbar e uma solução de isopreno/ciclohexano foi coletada (rendimento = 10,1 g), a qual foi secada peneiras moleculares 3 A. Análise por GC desta solução indicou um teor de isopreno de 7,7 % em peso.
[00511] Dessorção de isopreno a partir de carvão vegetal ativo (Método B)
[00512] Carvão vegetal ativo (65 g), que fora exposto a uma corrente de gás desprendido do fermentador, foi colocado em um balão de 500 mL junto com uma barra de agitação. Jarytherm DBT (250 g) foi adicionado ao carvão e a lama foi agitada por 2 horas. Vácuo foi aplicado (5 mbar) via um sifão criogênico em linha (30 mL de capacidade, imerso em nitrogênio líquido). Depois de 1 hora o sifão foi aquecido até a temperatura ambiente. Duas fases líquidas estavam presentes no sifão (peso total 1,82 g). A fase orgânica foi diluída com ciclohexano (3,26 g), decantada, e secada peneiras moleculares 3 Â. Análise por GC desta solução indicou um teor de isopreno de 27,3 % em peso ou 1,22 g).
Preparação de catalisador à base de neodímio
[00513] Versatato de neodímio (2,68 mL, 0,51 M em hexano), triisobutilalumínio (54 mL, 1,0 M em hexano), e cloreto de dietilalumínio (3,40 mL, 1,0 M em hexano) foram aspirados em seringas plásticas aparelhadas com um cânula de aço. Os dois primeiros componentes foram adicionados a uma solução de 1,3-butadieno em hexano (22,4 mL, 15 % em peso de 1,3-butadieno, colocados em um vaso de vidro de 100 mL com uma tampa de septo, e agitado por 0,5 hora à temperatura ambiente. O último componente foi adicionado à solução e depois disso foi envelhecido com calor por 0,5 hora a 65°C. A solução final era límpida e amarela. A concentração da solução à base de neo- dímio foi de 0,0164 M.
Preparação de catalisador à base de titânio
[00514] Um vaso de reação de vidro de 100 mL com uma entrada de septo e contendo uma barra de agitação magnética foi colocada em um banho de gelo a 0°C, carregado com n-hexane (5,07 mL, anidro), e com TiCL puro (1,5 mL, 13,7 mmol) com agitação vigorosa. Separadamente, foi gerada uma solução consistindo em difenil éter (1,2 mL, 7,6 mmol) e triisobutilalumínio (14,6 mL, 12,6 mmol, solução a 25 % em peso em hexano). A solução foi adicionada ao vaso de reação durante 5 minutos. Um precipitado castanho formou-se durante a adição. A suspensão foi agitada por 10 minutos e foi então armazenada a - 40°C para uso futuro.
Polimerização
[00515] Amostras de poli-isopreno derivdo principalmente de glicose foram produzidas por polimerização da amostra A de polimerização de isopreno com catalisador à base de neodímio e n-BuLi. Amostras de poli-isopreno derivadas da cofermentação de glicose e extrato de levedura foram produzidas por polimerização da amostra B de polimerização de isopreno com catalisador à base de neodímio, catalisador à base de titânio, catalisador à base de n-BuLi, e polimerização de radicais livres em emulsão. Condições de polimerização representativas estão descritas abaixo.
Polimerização em solução de isopreno com catalisador á base de neodímio
[00516] Um frasco de vidro de 4 mL com tampa de rosca e uma barra de agitação revestida com Teflon foi temperado em um forno por 3 horas a 150°C. O frasco foi aparelhado com um septo de silicone revestido com Teflon e uma tampa de topo levantado. Usando uma seringa, ele foi então carregado com uma solução de isopreno (1,5 g, 7,7 % em peso em ciclohexano, anidro). A solução de catalisador à base de neodímio (60 uL) foi injetada no frasco com uma microseringa. O frasco foi colocado sobre um agitador/chapa quente regulada para 65°C, com a barra de agitação girando a 500 rpm. Depois de 15 minutos a solução ficou visivelmente mais viscosa. Depois de um tempo de reação de 1,5 hora a reação foi resfriada bruscamente com uma solução de isopropanol e hidroxitolueno butilado, (BHT), (30 uL, 10 % em peso de BHT). Uma amostra de 100 mg do cimento foi removida para análise por GPC. O cimento de polímero restante foi secado em condições ambientes. O polímero isolado pesou 110 mg, e foi determinado que ele tinha um peso molecular médio ponderai de 935.000 (por GPC) e um teor de cis-microestruturas superior a 90% (por 13C-RMN).
Polimerização em solução de isopreno com catalisador á base de Ti
[00517] Um frasco de vidro de 4 mL com tampa de rosca e uma barra de agitação revestida com Teflon foi temperado em um forno por 3 horas a 150°C. O frasco foi aparelhado com um septo de silicone revestido com Teflonpré-suIçado e uma tampa de topo levantado. Usando uma seringa, ele foi então carregado com uma solução de isopreno (1,5 g, 7,7 % em peso em ciclohexano, anidro). A suspensão de catali-sador à base de titânio foi magneticamente agitada e uma amostra foi removida (70 uL) com uma pipeta de bico descartável, e a amostra foi então adicionada ao frasco de reação através do septo pré-sulcado. O septo do frasco de reação foi substituído por uma tampa sólida, e o frasco foi colocado sobre um agitador/chapa quente regulada para 65°C, com a barra de agitação girando a 500 rpm. Depois de 15 minu-tos a solução ficou visivelmente mais viscosa. Depois de um tempo de reação de 1,5 hora a reação foi resfriada bruscamente com uma solução de isopropanol e hidroxitolueno butilado, (BHT), (30 uL, 10 % em peso de BHT). Uma amostra de 100 mg do cimento foi removida para análise por GPC. O cimento de polímero restante foi secado em condições ambientes. O polímero isolado pesou 108 mg, e foi determinado que ele tinha um peso molecular médio ponderai de 221.000 (por GPC) e tinha um teor de cis-microestruturassuperior a 94% (por 13C- RMN).
Polimerização em emulsão de isopreno
[00518] Um frasco de 20 ml_ foi usado como vaso de polimerização. A tampa metálica foi perfurada duas vezes com uma sovela e o linear de papelão foi substituído por uma gaxeta de borracha e um linear de Teflon. O frasco foi enxaguado com água desionizada e secado em uma atmosfera de nitrogênio.
[00519] Ao frasco foram adicionados 7,05 g de água desionizada, 1,14 g de sabão (sal potássico de ácidos graxos mistos) a 10%, 174 mg de solução de persulfato de amónio a 10%, e 24 mg de n- dodecano tiol. O balão foi purgado por 30 segundos com nitrogênio e tampado. No frasco, através da gaxeta de borracha/Teflon, foram carregados 3 ml_ de bio-HG (2,033 gramas de isopreno). O frasco foi colocado em um banho de polimerização em frasco tradicional (um segundo frasco branco permite que o frasco seja encaixado em um porta- frascos de 113,64 cc (4 oz)). A mistura foi agitada por 25,5 horas a 65°C (+/- 0,2°C).
Tratamento:
[00520] O látex foi transferido para um balão de 50 ml_ em forma de pera e diluído com 10 mL de água. O orgânico volátil não reagido foi removido por evaporação de 2 mL de água a vácuo (54 mmHg, 40 - 50°C). Ao látex foram adicionados uma dispersão antioxidante, 140 mg de polifenóis ativos AO a 50% (Bostex 24). O látex foi coagulado adicionando-se o mesmo a uma solução de ácido diluído (12 mL de ácido sulfúrico a 18% em 150 mL de água RO). O polímero coagulou formando um único bloco grande que foi prensado e lavado com água RO. A amostra era uma massa borrachuda mole e esbranquiçada. O rendimento foi de 1,24 gramas de um bloco ("crumb") molhado.
[00521] O teor de sólidos totais final (TSC = 100*peso seco/peso molhado) foi de 18,9 % em peso ou uma conversão aproximada de 84%.
Polimerização de isopreno com butil-lítio
[00522] Butil-lítio (1,6 M em hexano) foi diluído com n-hexano (anidro) em uma proporção de 1:10. A solução foi titulada contra um padrão de N-pivalolil-o-benzilanilina em THF. Uma solução de isopreno em ciclohexano (4 mL) foi secada passando-se a mesma através de uma pequena coluna contendo sílica gel tratada com calor.
[00523] Um frasco de vidro de 4 mL (secado em um forno a 150°C) foi aparelhado com uma barra de agitação magnética revestida com Teflon pequena e carregado com uma solução de isopreno em ciclohexano (1,35 g, 21,5 % em peso). Butil-lítio (0,14 M, hexano) foi adicionado via seringa e o frasco foi aquecido até 65°C sobre um agita- dor/chapa quente por 3 horas. A reação de polímero foi resfriada brus-camente com uma solução de BHT/iso-propanol solution (10 % em peso de BHT em iso-propanol). Todos os voláteis foram removidos a vácuo. Este procedimento rendeu 290 mg de polímero, o que representa um rendimento teórico de cerca de 100%. Foi determinado por análise por GPC que este polímero tinha um peso molecular médio ponderai (Mw) de 17,880 e por 13C RMN foi determinado que ele tinha um teor de cis-microestruturas de 67 um teor de trans-microestruturas de 25%, e um teor de 3,4-microestruturas de 8%.
Análise dos polímeros por GPC
[00524] Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é um técnica bem estabelecida para medir o peso molecular e a polidispersidade (Mw/Mn) de polímeros. Duas colunas de microgel "Polymer Laboratories C" em série foram utilizadas com tetra-hidrofurano como o solvente carreador a uma taxa de fluxo de 0,7 ml/min e uma temperatura de coluna de 40°C. A SEC foi realizada usando um detector de espalhamento de luz Wyatt Technologies miniDawn acoplado a um detector de índice de refração Hewlett Packard 1047A. padrões de poliestireno foram usados para calibrar o instrumento.
Análise dos polímeros por RMN
[00525] As microestruturas do polímero foram determinadas por análise por 13C-RMN em um espectrômetro Varian Unity-Plus 400 MHz no solvente clorofórmio-d1. Dados das análises dos isótopos 13C/12C
Figure img0011
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[00526] A menos que de outra forma definido, os significados de todos os termos técnicos e científicos usados nesta invenção são aqueles comumente conhecidos pelo versado na técnica à qual esta invenção pertence. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N. Y. (1991) oferecem definições gerais para muitos dos termos usados nesta invenção.
[00527] Os títulos oferecidos nesta invenção não são limitativos dos vários aspectos ou modalidades da invenção que foram usados como referência no relatório como um todo. Para uso nesta inve, a menos que nitidamente indicado em contrário, os termos "um", "uma", e similares referem-se a um ou mais. Referência feita a "cerca de" um valor ou parâmetro nesta invenção inclui (e descreve) modalidades que indicam aquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição indicando "cerca de X" inclui a descrição de "X". As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. Fica entendido que os aspectos e modalidades da invenção descritos neste relatório incluem "compreendendo", "consistindo", e "consistindo essencialmente nos" aspectos e modalidades.
[00528] Embora certas modalidades representativas e detalhes tenham sido mostrados com o propósito de ilustrar a presente invenção, ficará evidente para os versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas na mesma sem contudo se afastar do escopo da presente invenção. Deve ficar entendido que esta invenção não se limita à metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos, uma vez que estes podem variar. O versado na técnica também vai apreciar que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório também podem ser usados para praticar ou testar a invenção. Apêndice 1 Ácidos nucleicos e polipeptídios de 1-desoxi-D-xilulose- 5-fosfato sintase exemplificativos ATH: AT3G21500(DXPSI) AT4G15560(CLAI) AT5G11380(DXPS3) OSA: 4338768 4340090 4342614 CME: CMF089C PFA: MAL13P1.186 TAN: TA20470 TPV: TP01-0516 ECO: b0420(dxs) ECJ: JW0410(dxs) ECE: Z0523(dxs) ECS: ECsO474 ECC: c0531(dxs) ECI: UTI89_C0443(dxs) ECP: ECP_0479 ECV: APECOl_1590(dxs) ECW: EcE24377A_0451(dxs) ECX: EcHS_A0491 STY: STY0461(dxs) STT: t2441(dxs) SPT: SPA2301(dxs) SEC: SC0463(dxs) STM: STM0422(dxs) YPE: YPO3177(dxs) YPK: yl008(dxs) YPM: YP_0754(dxs) YPA: YPA_2671 YPN: YPN 0911 YPP: YPDSF_2812 YPS: YPTB0939(dxs) YPI: YpsIP31758_3112(dxs) SFL: SF0357(dxs) SFX: S0365(dxs) SFV: SFV_0385(dxs) SSN: SSON_0397(dxs) SBO: SBO_0314(dxs) SDY: SDY_0310(dxs) ECA: ECA1131(dxs) PLU: plu3887(dxs) BUC: BU464(dxs) BAS: BUsg448(dxs) WBR: WGLpl44(dxs) SGL: SG0656 KPN: KPN_00372(dxs) BFL: Bfl238(dxs) BPN: BPEN_244(dxs) HIN: HI1439(dxs) HIT: NTHI1691(dxs) HIP: CGSHiEE_04795 HIQ: CGSHiGG_01080 HDU: HD0441(dxs) HSO: HS_0905(dxs) PMU: PM0532(dxs) MSU: MS1059(dxs) APL: APL_0207(dxs) XFA: XF2249 XFT: PD1293(dxs) XCC: XCC2434(dxs) XCB: XC_1678 XCV: XCV2764(dxs) XAC: XAC2565(dxs) XOO: XOO2017(dxs) XOM: XOO_1900(XOO1900) VCH: VC0889 VVU: VV1_O315 VVY: VV0868 VPA: VP0686 VFL VF0711 PPR: PBPRA0805 PAE: PA4044(dxs) PAU: PA14_11550(dxs) PAP: PSPA7_1057(dxs) PPU: PP_0527(dxs) PST: PSPTO_0698(dxs) PSB: Psyr_0604 PSP: PSPPH_0599(dxs) PFL: PFL_551O(dxs) PFO: Pfl_5007 PEN: PSEEN0600(dxs) PMY: Pmen_3844 PAR: Psyc_0221(dxs) PCR: Pcryo_0245 ACI: ACIAD3247(dxs) SON: SO_1525(dxs) SDN: Sden_2571 SFR: Sfri_2790 SAZ: Sama_2436 SBL: Sbal_1357 SLO: Shew_2771 SHE: Shewmr4_2731 SHM: Shewmr7_2804 SHN: Shewana3_2901 SHW: Sputw3181_2831 ILO: IL2138(dxs) CPS: CPS_1088(dxs) PHA: PSHAa2366(dxs) PAT: Patl_1319 SDE: Sde_3381 PIN: Ping_2240 MAQ: Maqu_2438 MCA: MCA0817(dxs) FTU: FTT1018c(dxs) FTF: FTF1018c(dxs) FTW: FTW_0925(dxs) FTL: FTL_1072 FTH: FTH_1047(dxs) FTA: FTA_1131(dxs) FTN: FTN_0896(dxs) NOC: Noc_1743 AEH: Mlg_1381 HCH: HCH_05866(dxs) CSA: Csal_0099 ABO: ABO_2166(dxs) AHA: AHA_3321(dxs) BCI: BCI_0275(dxs) RMA: Rmag_0386 VOK: COSY_0360(dxs) NME: NMB 1867 NMA: NMA0589(dxs) NMC: NMC0352(dxs) NGO: NGO0036 CVI: CV_2692(dxs) RSO: RSc2221(dxs) REU: Reut_A0882 REH: H16_A2732(dxs) RME: Rmet_2615 BMA: BMAA0330(dxs) BMV: BMASAVPl_1512(dxs) BML: BMA10299_1706(dxs) BMN: BMA10247_A0364(dxs) BXE: Bxe_B2827 BUR: Bcepl8194_B2211 BCN: Bcen_4486 BCH: Bcen2424_3879 BAM: Bamb_3250 BPS: BPSS 1762(dxs) BPM: BURPS 1710b_A0842(dxs) BPL: BURPS 1106A_A2392(dxs) BPD: BURPS668_A2534(dxs) BTE: BTH_U0614(dxs) BPE: BP2798(dxs) BPA: BPP2464(dxs) BBR: BB1912(dxs) RFR: Rfer_2875 POL: Bpro_1747 PNA: Pnap_1501 AJS: Ajs_1038 MPT: Mpe_A2631 HAR: HEAR0279(dxs) MMS: mma_O331 NEU: NEl 161 (dxs) NET: Neut_1501 NMU: Nmul_A0236 EBA: ebA4439(dxs) AZO: azol l98(dxs) DAR: Daro_3061 TBD: Tbd_0879 MFA: Mfla_2133 HPY: HP0354(dxs) HPJ: jhpO328(dxs) HPA: HPAG1_0349 HHE: HH0608(dxs) HAC: Hac_0968(dxs) WSU: WS 1996 TDN: Tmden_0475 CJE: CjO321(dxs) CJR: CJE0366(dxs) CJJ: CJJ81176_0343(dxs) CJU: C8J_0298(dxs) CJD: JJD26997_1642(dxs) CFF: CFF8240_0264(dxs) CCV: CCV52592_1671(dxs) CCV52592_1722 CHA: CHAB381_1297(dxs) CCO: CCC13826_1594(dxs) ABU: Abu_2139(dxs) NIS: NIS_0391(dxs) SUN: SUN_2055(dxs) GSU: GSU0686(dxs-l) GSU1764(dxs-2) GME: Gmet_1934 Gmet_2822 PCA: Pcar_1667 PPD: Ppro_1191 Ppro_2403 DVU: DVU1350(dxs) DVL: Dvul_1718 DDE: Dde_2200 LIP: LI0408(dsx) DPS: DP2700 ADE: Adeh_1097 MXA: MXAN_4643(dxs) SAT: SYN_02456 SFU: Sfum_1418 PUB: SARll_0611(dxs) MLO: mlr7474 MES: Meso_0735 SME: SMc00972(dxs) ATU: AtuO745(dxs) ATC: AGR_C_1351 RET: RHE_CH00913(dxs) RLE: RL0973(dxs) BME: BMEI1498 BMF: BABl_0462(dxs) BMS: BR0436(dxs) BMB: BruAbl_0458(dxs) BOV: BOV_0443(dxs) BJA: bll2651(dxs) BRA: BRADO2161(dxs) BBT: BBta_2479(dxs) RPA: RPA0952(dxs) RPB: RPB 4460 RPC: RPC_1149 RPD: RPD_4305 RPE: RPE_1067 NWI: Nwi_0633 NHA: Nham_0778 BHE: BH04350(dxs) BQU: BQ03540(dxs) BBK: BARBAKC583_0400(dxs) CCR: CC_2068 SIL: SPO0247(dxs) SIT: TM1040_2920 RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs) JAN: Jann_0088 Jann_0170 RDE: RDl_0101(dxs) RDl_0548(dxs) MMR: Mmar10_0849 HNE: HNE_1838(dxs) ZMO: ZMO1234(dxs) ZMO1598(dxs) NAR: Saro_0161 SAL: Sala_2354 ELI: ELI_12520 GOX: GOX0252 GBE: GbCGDNIHl_0221 GbCGDNIHl_2404 RRU: Rru_A0054 Rru_A2619 MAG: amb2904 MGM: Mmcl_1048 SUS: Acid_1783 BSU: BG11715(dxs) BHA: BH2779 BAN: BA4400(dxs) BAR: GBAA4400(dxs) BAA: BA_4853 BAT: BAS4081 BCE: BC4176(dxs) BCA: BCE_4249(dxs) BCZ: BCZK3930(dxs) BTK: BT9727_3919(dxs) BTL: BALH_3785(dxs) BLI: BL01523(dxs) BLD: BLiO2598(dxs) BCL: ABC2462(dxs) BAY: RBAM_022600 BPU: BPUM_2159 GKA: GK2392 GTN: GTNG_2322 LMO: lmol365(tktB) LMF: LMOf2365_1382(dxs) LIN: Hnl402(tktB) LWE: lwel380(tktB) LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB) LLC: LACR_1572 LACR_1843 LLM: llmg_0749(dxsB) SAK: SAK_0263 LPL: lp_2610(dxs) UO: U0406 LAC: LBA0356 LSL: LSL_0209(dxs) LGA: LGAS_0350 STH: STHl 842 CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs) CPE: CPEl 819 CPF: CPF_2073(dxs) CPR: CPR_1787(dxs) CTC: CTCO 1575 CNO: NT01CX_1983 CTH: Cthe_0828 CDF: CD1207(dxs) CBO: CBO1881(dxs) CBA: CLB_1818(dxs) CBH: CLC_1825(dxs) CBF: CLI_1945(dxs) CKL: CKL_1231(dxs) CHY: CHY_1985(dxs) DSY: DSY2348 DRM: Dred_1078 PTH: PTH_1196(dxs) SWO: Swol_0582 CSC: Csac_1853 TTE: TTE1298(dxs) MTA: Moth_1511 MPE: MYPE730 MGA: MGA_1268(dxs) MTU: Rv2682c(dxsl) Rv3379c(dxs2) MTC: MT2756(dxs) MBO: Mb2701c(dxsl) Mb3413c(dxs2) MLE: ML1038(dxs) MPA: MAP2803c(dxs) MAV: MAV_3577(dxs) MSM: MSMEG_2776(dxs) MMC: Mmcs_2208 CGL: NCgI 1827(cgl 1902) CGB: cg2083(dxs) CEF: CE1796 CDI: DIP1397(dxs) CJK: jkl078(dxs) NFA: nfa37410(dxs) RHA: RHAl_ro06843 SCO: SCO6013(SClC3.01) SCO6768(SC6A5.17) SMA: SAV1646(dxsl) SAV2244(dxs2) TWH: TWT484 TWS: TW280(Dxs) LXX: Lxxl0450(dxs) CMI: CMM_1660(dxsA) AAU: AAur_1790(dxs) PAC: PPA1062 TFU: Tfu_1917 FRA: Francci3_1326 FAL: FRAAL2088(dxs) ACE: Acel_1393 SEN: SACE_1815(dxs) SACE_4351 BLO: BL1132(dxs) BAD: BAD_0513(dxs) FNU: FN1208 FN1464 RBA: RB2143(dxs) CTR: CT331(dxs) CTA: CTA_0359(dxs) CMU: TC0608 CPN: 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cbdb_A720(dxs) DRA: DR_1475 DGE: Dgeo_0994 TTH: TTC 1614 TTJ: TTHA0006 AAE: aq_881 TMA: TM1770 PMO: Pmob 1001 Ácidos nucleicos e polipeptídios de acetil-CoA-acetiltransferase exemplificativos HSA: 38(ACATI) 39(ACAT2) PTR: 451528(ACATI) MCC: 707653(ACATI) 708750(ACAT2) MMU: 110446(Acatl) 110460(Acat2) RNO: 25014(Acatl) CFA: 484063(AC AT2) 489421 (ACATI) GGA: 418968(ACATI) 421587(RCJMB04_34i5 XLA: 379569(MGC69098) 414622(MGC81403) 414639(MGC81256) 444457(MGC83664) XTR: 394562(acat2) DRE: 30643(acat2) SPU: 759502(LOC759502) DME: Dmel_CG 10932 Dmel_CG9149 CEL: T02G5.4 T02G5.7 T02G5.8(kat-1) ATH: AT5G48230(ACAT2/EMB1276) OSA: 4326136 4346520 CME: CMA042C CME087C SCE: YPLO28W(ERG10) AGO: AGOS_ADR165C PIC: PICST_31707(ERGIO) CAL: CaO19.1591(erg10) CGR: CAGLOLI 2364g SPO: SPBC215.09C MGR: MGG_01755 MGG_13499 ANI: AN1409.2 AFM: AFUA_6G 14200 AFUA_8G04000 AOR: AO090103000012 AO090103000406 CNE: CNC05280 UMA: UM03571.1 DDI: DDB_0231621 PFA: PF 14-0484 TET: TTHERM-00091590 TTHERM_00277470 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NP4836A(mvaB_2) Ácidos nucleicos e polipeptídios de hidroximetilglutaril-CoA redu- tase exemplificativos HSA: 3156(HMGCR) PTR: 471516(HMGCR) MCC: 705479(HMGCR) MMU: 15357(Hmgcr) RNO: 25675(Hmgcr) CFA: 479182(HMGCR) BTA: 407159(HMGCR) GGA: 395145(RCJMB04_14m24) SPU: 373355(LOC373355) DME: Dmel_CG10367(Hmgcr) CEL: F08F8.2 OSA: 4347443 SCE: YLR450W(HMG2) YML075C(HMGl) AGO: AGOS_AER152W CGR: CAGLOLl 1506g SPO: SPCC162.09c(hmgl) ANI: AN3817.2 AFM: AFUA_1G11230 AFUA_2G03700 AOR: AO090103000311 AO090120000217 CNE: CNF04830 UMA: UM03014.1 ECU: ECU10_1720 DDI: DDB_0191125(hmgA) DDB_0215357(hmgB) TBR: Tb927.6.4540 TCR: 506831.40 509167.20 LMA: LmjF30.3190 VCH: VCA0723 VCO: VC0395_0662 VVU: VV2_0117 VVY: VVA0625 VPA: VPA0968 VFI: VFA0841 PAT: Patl_0427 CBU: CBU_0030 CBU_0610 CBD: COXBU7E912_0151 COXBU7E912_0622(hmgA) TCX: Tcr_1717 DNO: DNO_0797 CVI: CV_1806 SUS: Acid_5728 Acid_6132 SAU: SA2333(mvaA) SAV: SAV2545(mvaA) SAM: MW2466(mvaA) SAB: SAB2419c(mvaA) SEP: SE2109 LWE: lwe0819(mvaA) LLA: L10433(mvaA) LLC: LACR_1664 LLM: llmg_0931(mvaA) SPY: SPy_0880(mvaS.l) SPM: spyM18_0941(mvaSl) SPG: SpyM3_0599(mvaS.l) SPS: SPs 1254 SPH: MGAS 10270_Spy0744 SPI: MGAS10750_Spy0778 SPJ: MGAS2096_Spy0758 SPK: MGAS9429_Spy0742 SPA: M6_SpyO7O3 SPN: SP 1726 SAG: SAG1317 SAN: gbsl387 STL: stu0576(mvaA) STE: STER_0620 SSA: SSA_0337(mvaA) LPL: lp_0447(mvaA) LJO: LJ1608 LSL: LSL_0224 LBR: LVIS_0450 LGA: LGAS_1373 EFA: EF 1364 NFA: nfa22110 BGA: BG0708(mvaA) SRU: SRU_2422 FPS: FP2341 MMP: MMP0087(hmgA) MMQ: MmarC5_1589 MAC: MA3073(hmgA) MBA: Mbar_A1972 MMA: MM_0335 MBU: Mbur_1098 MHU: Mhun_3004 MEM: Memar_2365 MBN: Mboo_0137 MTH: MTH562 MST: Msp_0584(hmgA) MSI: Msm_0227 MKA: MK0355(HMGl) AFU: AF1736(mvaA) HAL: VNG1875G(mvaA) HMA: rrnAC3412(mvaA) HWA: HQ3215A(hmgR) NPH: NP0368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_l) TAC: Ta0406m TVO: TVNl 168 PTO: PTOl 143 PAB: PAB2106(mvaAj) PFU: PFl 848 TKO: TK0914 RCI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA) APE: APE_1869 IHO: Igni_0476 HBU: Hbut_1531 SSO: SSO0531 STO: ST1352 SAI: Saci_1359 PAI: PAE2182 PIS: Pisl_0814 PCL: Pcal_1085 PAS: Pars 0796 Ácidos nucleicos e polipeptídios de mevalonato quinase exemplifica- tivos HSA: 4598(MVK) MCC: 707645(MVK) MMU: 17855(Mvk) RNO: 81727(Mvk) CFA: 486309(MVK) BTA: 505792(MVK) GGA: 768555(MVK) DRE: 492477(zgc: 103473) SPU: 585785(LOC585785) DME: Dmel_CG33671 OSA: 4348331 SCE: YMR208W(ERG12) AGO: AGOS_AER335W PIC: PICST_40742(ERG12) CGR: CAGL0F03861g SPO: SPAC13G6.11c MGR: MGG_06946 ANI: AN3869.2 AFM: AFUA_4G07780 AOR: AO090023000793 CNE: CNKO 1740 ECU: ECU09_1780 DDI: DDBDRAFT_0168621 TET: TTHERM_00637680 TBR: Tb927.4.4070 TCR: 436521.9 509237.10 LMA: LmjF31.0560 CBU: CBU 0608 CBU 0609 CBD: COXBU7E912_0620(mvk) LPN: lpg2039 LPF: lpl2017 LPP: lpp2022 BBA: BdlO27(lmbP) Bdl630(mvk) MXA: MXAN_5019(mvk) OIH: OB0225 SAU: SA0547(mvaKl) SAV: SAV0590(mvaKl) SAM: MW0545(mvaKl) SAR: SAR0596(mvaKl) SAS: SAS0549 SAC: SACOL0636(mvk) SAB: SAB0540(mvaKl) SAA: SAUSA300_0572(mvk) SAO: SAOUHSC_00577 SEP: SE0361 SER: SERP0238(mvk) SHA: SH2402(mvaKl) SSP: SSP2122 LMO: lmoOOlO LMF: LMOf2365_0011 LIN: linOOlO LWE: lwe0011(mvk) LLA: L7866(yeaG) LLC: LACR_0454 LLM: llmg_0425(mvk) SPY: SPy_0876(mvaKl) SPZ: M5005_Spy_0682(mvaKl) SPM: spyM18_0937(mvaKl) SPG: SpyM3_0595(mvaKl) SPS: SPsl258 SPH: MGAS10270_Spy0740(mvaKl) SPI: MGAS10750_Spy0774(mvaKl) SPJ: MGAS2096_Spy0753(mvaKl) SPK: MGAS9429_Spy0737(mvaKl) SPF: SpyM51126(mvaKl) SPA: M6_SpyO699 SPB: M28_SpyO662(mvaKl) SPN: SP_0381 SPR: spiO338(mvk) SPD: SPD_0346(mvk) SAG: SAG1326 SAN: gbsl396 SAK: SAK_1357(mvk) SMU: SMU.181 STC: stiO559(mvaKl) STL: stuO559(mvaKl) STE: STER_0598 SSA: SSA_0333(mvaKl) SSU: SSU05_0289 SSV: SSU98_0285 SGO: SGO_0239(mvk) LPL: lp_1735(mvaKl) LJO: U 1205 LAC: LBAl 167(mvaK) LSA: LSA0908(mvaKl) LSL: LSL_0685(eRG) LDB: LdbO999(mvk) LBU: LBUL 0906 LBR: LVIS_0858 LCA: LSEI_1491 LGA: LGAS_1033 LRE: Lreu_0915 PPE: PEPE_0927 EFA: EF0904(mvk) OOE: OEOE_1100 LME: LEUM_1385 NFA: nfa22070 BGA: BG0711 BAF: BAPKO_0732 FPS: FP0313 MMP: MMP1335 MAE: Maeo_0775 MAC: MA0602(mvk) MBA: Mbar_A1421 MMA: MM_1762 MBU: Mbur_2395 MHU: Mhun_2890 MEM: Memar_1812 MBN: Mboo_2213 MST: Msp_0858(mvk) MSI: Msm_1439 MKA: MK0993(ERG12) HAL: VNGl 145G(mvk) HMA: rtnAC0077(mvk) HWA: HQ2925A(mvk) NPH: NP2850A(mvk) PTO: PTO 1352 PHO: PH1625 PAB: PAB0372(mvk) PFU: PF1637(mvk) TKO: TK1474 RCI: LRC399(mvk) APE: APE_2439 HBU: Hbut_0877 SSO: SSO0383 STO: ST2185 SAI: Saci_2365(mvk) MSE: Msed_1602 PAI: PAE3108 PIS: Pisl_0467 PCL: Pcal_1835 Ácidos nucleicos e polipeptídios de fosfomevalonato exemplifica- tivos HSA: 10654(PMVK) PTR: 457350(PMVK) MCC: 717014(PMVK) MMU: 68603(Pmvk) CFA: 612251(PMVK) BTA: 513533(PMVK) DME: Dmel_CG10268 ATH: AT1G31910 OSA: 4332275 SCE: YMR220W(ERG8) AGO: AGOS_AER354W PIC: PICST_52257(ERG8) CGR: CAGL0F03993g SPO: SPAC343.01C MGR: MGG_05812 ANI: AN2311.2 AFM: AFUA_5G10680 AOR: AO090010000471 CNE: CNM00100 UMA: UM00760.1 DDI: DDBDRAFT_0184512 TBR: TbO9.160.3690 TCR: 507913.20 508277.140 LMA: LmjF15.1460 MXA: MXAN_5017 OIH: OB0227 SAU: SA0549(mvaK2) SAV: SAV0592(mvaK2) SAM: MW0547(mvaK2) SAR: SAR0598(mvaK2) SAS: SAS0551 SAC: SACOL0638 SAB: SAB0542(mvaK2) SAA: SAUSA300_0574 SAO: SAOUHSC_00579 SAJ: SaurJH9_0615 SEP: SE0363 SER: SERP0240 SHA: SH2400(mvaK2) SSP: SSP2120 LMO: Imo0012 LMF: LMOf2365_0013 LIN: HnOO 12 LWE: lwe0013 LLA: L10014(yebA) LLC: LACR_0456 LLM: llmg_0427 SPY: SPy_0878(mvaK2) SPZ: M5005_Spy_0684(mvaK2) SPM: spyM18_0939 SPG: SpyM3_0597(mvaK2) SPS: SPs 1256 SPH: MGAS10270_Spy0742(mvaK2) SPI: MGAS10750_Spy0776(mvaK2) SPJ: MGAS2096_Spy0755(mvaK2) SPK: MGAS9429_Spy0739(mvaK2) SPF: SpyM51124(mvaK2) SPA: M6_Spy0701 SPB: M28_Spy0664(mvaK2) SPN: SP_0383 SPD: SPD_0348(mvaK2) SAG: SAG1324 SAN: gbsl394 SAK: SAK_1355 SMU: SMU.938 STC: str0561(mvaK2) STL: stuO561(mvaK2) STE: STER_0600 SSA: SSA_0335(mvaK2) SSU: SSU05_0291 SSV: SSU98_0287 SGO: SGO_0241 LPL: lp_1733(mvaK2) LJO: LJ1207 LAC: LBAl 169 LSA: LSA0906(mvaK2) LSL: LSL_0683 LDB: Ldb0997(mvaK) LBU: LBUL_0904 LBR: LVIS_0860 LCA: LSEI_1092 LGA: LGAS_1035 LRE: Lreu_0913 PPE: PEPE_0925 EFA: EF0902 NFA: nfa22090 BGA: BG0710 BAF: BAPKO_0731 NPH: NP2852A SSO: SSO2988 STO: ST0978 SAI: Saci_1244 Ácidos nucleicos e polipeptídios de difosfomevalonato descarbo- xilase exemplificativos HSA: 4597(MVD) PTR: 468069(MVD) MCC: 696865(MVD) MMU: 192156(Mvd) RNO: 81726(Mvd) CFA: 489663(MVD) GGA: 425359(MVD) DME: Dmel_CG8239 SCE: YNRO43W(MVD1) AGO: AGOS_AGL232C PIC: PICST_90752 CGR: CAGL0C03630g SPO: SPAC24C9.03 MGR: MGG_09750 ANI: AN4414.2 AFM: AFUA_4G07130 AOR: AO090023000862 CNE: CNL04950 UMA: UM05179.1 DDI: DDBDRAFT_0218058 TET: TTHERM_00849200 TBR: Tb10.05.0010 Tb10.61.2745 TCR: 507993.330 511281.40 LMA: LmjF18.0020 CBU: CBU_0607(mvaD) CBD: COXBU7E912_0619(mvaD) LPN: lpg2040 LPF: lpl2018 LPP: lpp2023 TCX: Tcr_1734 DNO: DNO_0504(mvaD) BBA: Bdl629 MXA: MXAN_5018(mvaD) OIH: OB0226 SAU: SA0548(mvaD) SAV: SAV0591(mvaD) SAM: MW0546(mvaD) SAR: SAR0597(mvaD) SAS: SAS0550 SAC: SACOL0637(mvaD) SAB: SAB0541(mvaD) SAA: SAUSA300_0573(mvaD) SAO: SAOUHSC_00578 SAJ: SaurJH9_0614 SAH: SaurJHl_0629 SEP: SE0362 SER: SERP0239(mvaD) SHA: SH2401(mvaD) SSP: SSP2121 LMO: lmo0011 LMF: LMOf2365_0012(mvaD) LIN: lin0011 LWE: lwe0012(mvaD) LLA: L9089(yeaH) LLC: LACR_0455 LLM: llmg_0426(mvaD) SPY: SPy_0877(mvaD) SPZ: M5005_Spy_0683(mvaD) SPM: spyM18_0938(mvd) SPG: SpyM3_0596(mvaD) SPS: SPs 1257 SPH: MGAS10270_Spy0741(mvaD) SPI: MGAS 10750_Spy0775(mvaD) SPJ: MGAS2096_Spy0754(mvaD) SPK: MGAS9429_Spy0738(mvaD) SPF: SpyM51125(mvaD) SPA: M6_Spy0700 SPB: M28_Spy0663(mvaD) SPN: SP_0382 SPR: spiO339(mvdl) SPD: SPD_0347(mvaD) SAG: SAG1325(mvaD) SAN: gbsl395 SAK: SAK_1356(mvaD) SMU: SMU.937 STC: stiO560(mvaD) STL: stu0560(mvaD) STE: STER_0599 SSA: SSA_0334(mvaD) SSU: SSU05_0290 SSV: SSU98_0286 SGO: SGO_0240(mvaD) LPL: lp_1734(mvaD) LJO: LJ1206 LAC: LBAl 168(mvaD) LSA: LSA0907(mvaD) LSL: LSL_0684 LDB: Ldb0998(mvaD) LBU: LBUL_0905 LBR: LVIS_0859 LCA: LSEI.1492 LGA: LGAS_1034 LRE: Lreu_0914 PPE: PEPE_0926 EFA: EF0903(mvaD) LME: LEUM-1386 NFA: nfa22080 BBU: BB0686 BGA: BG0709 BAF: BAPKO_0730 GFO: GFO_3632 FPS: FP0310(mvaD) HAU: Haur_1612 HAL: VNG0593G(dmd) HMA: rrnAC1489(dmd) HWA: HQ1525A(mvaD) NPH: NP1580A(mvaD) PTO: PTO0478 PTO1356 SSO: SSO2989 STO: ST0977 SAI: Saci_1245(mvd) MSE: Msed 1576 Ácidos nucleicos e polipeptídios de isopentenil fosfato quinases (IPK) exemplificativos Metanobacterium thermoautotrophicum gi|2621082 Metanococcus jannaschii DSM 2661 gi| 1590842; Metanocaldococcus jannaschii gi 11590842 Metanothermobacter thermautotrophicus gi|2621082 Picrophilus torridus DSM9790 (IG-57) gi|48477569 Pyrococcus abyssi gi| 14520758 Pyrococcus horikoshii OT3 gi|3258052 Archaeoglobus fulgidus DSM4304 gi|2648231 Ácidos nucleicos e polipeptídios de isopentenil-difosfato Delta- isomerase (IDI) exemplificativos HSA: 3422(IDII) 91734(IDI2) PTR: 450262(IDI2) 450263(IDII) MCC: 710052(LOC710052) 721730(LOC721730) MMU: 319554(ldil) RNO: 89784(ldil) GGA: 420459(IDII) XLA: 494671 (LOC494671) XTR: 496783(idi2) SPU: 586184(LOC586184) CEL: K06H7.9(idi-l) ATH: AT3G02780(IPP2) OSA: 4338791 4343523 CME: CMB062C SCE: YPLI 17C(IDI1) AGO: AGOS_ADL268C PIC: PICST_6899O(IDI1) CGR: CAGL0J06952g SPO: SPBC106.15(idil) ANI: AN0579.2 AFM: AFUA_6G11160 AOR: AO090023000500 CNE: CNA02550 UMA: UM04838.1 ECU: ECU02_0230 DDL DDB_0191342(ipi) TET: TTHERM_00237280 TTHERM_00438860 TBR: Tb0O9.211.0700 TCR: 408799.19 510431.10 LMA: LmjF35.5330 EHI: 46.t00025 ECO: b2889(idi) ECJ: JW2857(idi) ECE: Z4227 ECS: ECs3761 ECC: c3467 ECI: UTI89_C3274 ECP: ECP_2882 ECV: APECO 1_3638 ECW: EcE24377A_3215(idi) ECX: EcHS_A3048 STY: STY3195 STT: t2957 SPT: SPA2907(idi) SEC: SC2979(idi) STM: STM3039(idi) SFL: SF2875(idi) SFX: S3074 SFV: SFV_2937 SSN: SSON_3042 SSON_3489(yhfK) SBO: SBO_3103 SDY: SDY_3193 ECA: ECA2789 PLU: plu3987 ENT: Ent638_3307 SPE: Spro_2201 VPA: VPA0278 VFI: VF0403 PPR: PBPRA0469(mvaD) PEN: PSEEN4850 CBU: CBU_0607(mvaD) CBD: COXBU7E912_0619(mvaD) LPN: lpg2051 LPF: lpl2029 LPP: lpp2034 TCX: Tcr_1718 HHA: Hhal_1623 DNO: DNO_0798 EBA: ebA5678 p2A143 DVU: DVU1679(idi) DDE: Dde_1991 LIP: LIl 134 BBA: Bdl626 AFW: AnaelO9_4O82 MXA: MXAN_5021(fni) RPR: RP452 RTY: RT0439(idi) RCO: RC0744 RFE: RF_0785(fni) RBE: RBE_0731(fni) RAK: A1C_O419O RBO: A1I_O4755 RCM: A1E_O2555 RRI: A1G_O4195 MLO: mlr6371 RET: RHE_PD00245(ypd00046) XAU: Xaut_4134 SIL: SPO0131 SIT: TM1040_3442 RSP: RSP_0276 RSH: Rsphl7029_1919 RSQ: Rsphl7025_1019 JAN: Jann_0168 RDE: RDl_0147(idi) DSH: Dshi_3527 BSU: BG11440(ypgA) BAN: BA1520 BAR: GBAA1520 BAA: BA_2041 BAT: BAS 1409 BCE: BC 1499 BCA: BCE_1626 BCZ: BCZK1380(fni) BCY: Bcer98_1222 BTK: BT9727_1381(fni) BTL: BALH_1354 BLI: BL02217(fni) BLD: BLiO2426 BAY: RBAM_021020(fni) BPU: BPUM_2020(fni) OIH: OB0537 SAU: SA2136(fni) SAV: SAV2346(fni) SAM: MW2267(fni) SAR: SAR2431(fni) SAS: SAS2237 SAC: SACOL2341(fni) SAB: SAB2225c(fni) SAA: SAUSA300_2292(fni) SAO: SAOUHSC_02623 SEP: SE1925 SER: SERP1937(fni-2) SHA: SH0712(fni) SSP: SSP0556 LMO: Imol383 LMF: LMOf2365_1402(fni) LIN: linl420 LWE: Iwel399(fni) LLA: L11083(yebB) LLC: LACR_0457 LLM: llmg_0428(fni) SPY: SPy_0879 SPZ: M5005_Spy_0685 SPM: spyM18_0940 SPG: SpyM3_0598 SPS: SPsl255 SPH: MGAS10270_Spy0743 SPI: MGAS10750_Spy0777 SPJ: MGAS2096_Spy0756 SPK: MGAS9429_Spy0740 SPF: SpyM51123(fni) SPA: M6_Spy0702 SPB: M28_Spy0665 SPN: SP_0384 SPR: spi0341(fhi) SPD: SPD_0349(fni) SAG: SAG1323 SAN: gbsl393 SAK: SAK_1354(fni) SMU: SMU.939 STC: str0562(idi) STL: stuO562(idi) STE: STER_0601 SSA: SSA_0336 SGO: SGO_0242 LPL: lp_1732(idil) LJO: U 1208 LAC: LBAl 171 LSA: LSA0905(idi) LSL: LSL_0682 LDB: LdbO996(fni) LBU: LBUL_0903 LBR: LVIS_0861 LCA: LSEI_1493 LGA: LGAS_1036 LRE: Lreu_0912 EFA: EF0901 OOE: OEOE_1103 STH: STH1674 CBE: Cbei_3081 DRM: Dred_0474 SWO: Swol_1341 MTA: Moth_1328 MTU: Rvl745c(idi) MTC: MT1787(idi) MBO: Mbl774c(idi) MBB: BCG_1784c(idi) MPA: MAP3079c MAV: MAV_3894(fni) MSM: MSMEG_1057(fni) MSMEG_2337(fni) MUL: MUL_0380(idi2) MVA: Mvan_1582 Mvan_2176 MGI: Mflv_1842 Mflv_4187 MMC: Mmcs_1954 MKM: Mkms_2000 MJL: Mjls_1934 CGL: NCgl2223(cgl2305) CGB: cg2531(idi) CEF: CE2207 CDI: DIP1730(idi) NFA: nfal9790 nfa22100 RHA: RHAl_ro00239 SCO: SCO6750(SC5F2A.33c) SMA: SAV1663(idi) LXX: Lxx23810(idi) CMI: CMM_2889(idiA) AAU: AAur_0321(idi) PAC: PPA2115 FRA: Francci3_4188 FRE: Franeanl_5570 FAL: FRAAL6504(idi) KRA: Krad_3991 SEN: SACE_2627(idiB_2) SACE_5210(idi) STP: Strop_4438 SAQ: Sare_4564 Sare_4928 RXY: Rxyl_0400 BBU: BB0684 BGA: BG0707 SYN: sll1556 SYC: syc2161_c SYF: Synpcc7942_1933 CYA: CYA_2395(fni) CYB: CYB_2691(fni) TEL: til 1403 ANA: all4591 AVA: Ava_2461 Ava_B0346 TER: Tery_1589 SRU: SRU_1900(idi) CHU: CHU_0674(idi) GFO: GFO_2363(idi) FJO: Fjoh_0269 FPS: FP1792(idi) CTE: CT0257 CCH: Cag_1445 CPH: Cpha266_0385 PVI: Cvib_1545 PLT: Plut_1764 RRS: RoseRS_2437 RCA: Rcas_2215 HAU: Haur_4687 DRA: DR.1087 DGE: Dgeo_1381 TTH: TT_P0067 TTJ: TTHBI 10 MJA: MJ0862 MMP: MMP0043 MMQ: MmarC5_1637 MMX: MmarC6_0906 MMZ: MmarC7_1040 MAE: Maeo_1184 MVN: Mevan_1058 MAC: MA0604(idi) MBA: Mbar_A1419 MMA: MM-1764 MBU: Mbur_2397 MTP: Mthe_0474 MHU: Mhun_2888 MLA: Mlab_1665 MEM: Memar_1814 MBN: Mboo_2211 MTH: MTH48 MST: Msp_0856(fni) MSI: Msm_1441 MKA: MK0776(lldD) AFU: AF2287 HAL: VNG1818G(idi) VNG6081G(crt_l) VNG6445G(crt_2) VNG7060 VNG7149 HMA: rrnAC3484(idi) HWA: HQ2772A(idiA) HQ2847A(idiB) NPH: NP0360A(idiB_l) NP4826A(idiA) NP5124A(idiB_2) TAC: Ta0102 TVO: TVN0179 PTO: PTO0496 PHO: PHI 202 PAB: PAB 1662 PFU: PF0856 TKO: TK1470 RCI: LRC397(fni) APE: APE 1765.1 SMR: Smar_0822 IHO: Igni_0804 HBU: Hbut_0539 SSO: SSO0063 STO: ST2059 SAI: Saci_0091 MSE: Msed_2136 PAI: PAE0801 PIS: Pisl_1093 PCL: Pcal_0017 PAS: Pars_0051 TPE: Tpen_0272 Ácidos nucleicos e polipeptídios de isopreno sintase exemplifica- tivos Nosde Acesso Genbank AY341431 AY316691 AY279379 AJ457070 AYl 82241

Claims (14)

1. Polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno é caracterizado pelo fato de que: (A) tem um valor de δ13C maior que -22%o ou que varia dentro da faixa de -30%o a -28,5%o; ou (B) tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o, e em que o polímero de poli-isopreno (i) tem um teor de cis- 1,4-microestruturas inferior a 99,9% e um teor de trans-1,4- microestruturas inferior a 99,9%, ou (ii) tem um teor de 3,4- microestruturas superior a 2%, ou (iii) tem um teor de 1,2- microestruturas superior a 2%; ou (C) tem pelo menos um bloco derivado de isopreno e pelo menos um bloco derivado de pelo menos um monômero adicional, em que os blocos que são derivados de isopreno possuem um valor de δ13C superior a -22%o ou que varia dentro da faixa de -34%o a -24%o.
2. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -21%o a -12%o.
3. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C superior a -22%o ou que varia dentro da faixa de -30%o a - 28,5%o em que o polímero de poli-isopreno é um homopolímero.
4. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o e em que o polímero de poli-isopreno (i) tem um teor de cis-1,4-microestruturas inferior a 99,9% e um teor de trans-1,4-microestruturas inferior a 99,9%, ou (ii) tem um teor de 3,4-microestruturas superior a 2%, ou (iii) tem um teor de 1,2-microestruturas superior a 2%.
5. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um teor de 1,2-microestruturas superior a 5%, e em que o polímero de poli-isopreno tem uma polidispersidade inferior a 2,0.
6. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem (i) um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -33%o a -25%o, e (ii) um peso molecular médio ponderai que varia dentro da faixa de 30.000 a 50.000 e/ou uma polidispersidade inferior a 1,8.
7. Polímero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero é compreendido de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, em que o isopreno é produzido por (a) cultura de células compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase em condições de cultura adequadas para a produção do isopreno, (b) produção do isopreno, e (c) recuperação do isopreno a partir da cultura.
8. Polímero de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio de isopreno sintase é derivado de um polipeptídio de isopreno sintase de planta.
9. Método para verificar se o isopreno em um polímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo sustentável e renovável, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que: 1 A) no caso de um homopolímero de poli-isopreno: (I) determinar o valor de δ13C do homopolímero de poli-isopreno; (II) se o homopolímero de poli-isopreno tiver um valor de δ13C dentro da faixa de -34%o a -3O%o ou dentro da faixa de -28,5%o a -24%o, adicionalmente analisar o homopolímero de poli-isopreno para determinar (1) seu teor de cis-microestruturas, (2) seu teor de 3,4-microestruturas, (3) seu teor de 1,2-microestruturas, (4) seu peso molecular médio ponderai, ou (5) a presença ou ausência de proteínas residuais, sabões, lipídios, resinas, e/ou açúcares indicativos de borracha natural; e (III) verificar se o homopolímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo sustentável e renovável se ele tiver (i) um valor de δ13C superior a -22%0; (ii) um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -30%o a -28,5%o; ou (iii) um valor de δ13C dentro da faixa de -34%o a - 30%o ou dentro da faixa de -28,5%o a -24%o e se ele (a) tem um teor de cis-microestruturas inferior a 100%, (b) contém 3,4-microestruturas, (c) contém 1,2-microestruturas, (d) tem um peso molecular médio ponderai inferior a 100.000, ou (e) é livre de proteínas residuais, sabões, lipídios, resinas, e/ou açúcares indicativos de borracha natural; e 8 B) no caso de um copolímero contendo isopreno: (I) determinar o valor de δ13C de pelo menos um bloco de poli-isopreno no copolímero; e (II) verificar se o isopreno no copolímero é proveniente de uma fonte não derivada de petróleo sustentável e renovável se o bloco de poli-isopreno tiver (i) um valor de δ13C superior a -22%o; ou (ii) valor de δ13C que varia dentro da faixa de -34%o a -28,5%o.
10. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -29,5%o a -28,5%o.
11. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de -30%o a -29%o.
12. Polímero de poli-isopreno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C superior a -22%o ou que varia dentro da faixa de -34%o a - 24%o, em que o polímero de poli-isopreno inclui pelo menos um bloco de unidades repetitivas que são derivadas de isopreno, e em que o polímero de poli-isopreno é um copolímero selecionado do grupo que consiste em (i) um copolímero de isopreno e 1,3-butadieno, (ii) um copolímero de isopreno e estireno, (iii) um copolímero de isopreno, 1,3- butadieno, e estireno, e (iv) um copolímero de isopreno e a-metil estireno.
13. Polímero de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polímero é sintetizado por polimerização do isopreno recuperado na etapa (c).
14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a verificação é feita mostrando que o homopolímero de poli-isopreno tem um valor de δ13C que varia dentro da faixa de - 34%o a -30%o e mostrando que o homopolímero de poli-isopreno é livre de proteínas residuais, sabões, lipídios, resinas, e/ou açúcares indicativos de borracha natural.
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