BRPI0910509B1

BRPI0910509B1 - Uso do anticorpo, anticorpo e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0910509B1
Application number: BRPI0910509-3A
Authority: BR
Inventors: Fumiyoshi Okano; Masaki Shimizu; Takanori Saito; Takayoshi Ido
Original assignee: Toray Industries, Inc
Priority date: 2008-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2021-05-04
Also published as: CN102089004B; US20110129478A1; DK2305300T3; JPWO2010005068A1; AU2009270181B2; HUE028589T2; BRPI0910509A2; EP2305300A4; US11993650B2; US10611835B2; US20200247888A1; AU2009270181A1; KR20110039423A; JP5573156B2; EP2305300B1; PT2305300E; RU2011104709A; PL2305300T3; CN102089004A; RU2533460C2

Abstract

composições farmacêutica, anticorpos, uso do anticorpo, polipeptídeos, polipeptídeo de cdr de cadeia pesada, polipeptídeo de cdr de cadeia leve e dna. a presente invenção se refere a um anticorpo ou fragmento deste, possuindo imunorreatividade a um polipeptídeo que compreende pelo menos 7 aminoácidos contínuos da proteína cd179b, que foi identificada como uma proteína antígeno do câncer expressa especificamente na superfície de células cancerosas, pode ser usado como uma composição farmacêutica para a terapia e/ou profilaxia do câncer.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma nova utilização farmacêutica de um anticorpo contra CD179b ou um fragmento deste, como um agente para a terapia e/ou profilaxia do câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os cânceres são a causa mais comum de morte entre todas as causas de morte, e as principais terapias conduzidas atualmente para tratar os cânceres são tratamento cirúrgico em combinação com a radioterapia e quimioterapia. Apesar dos desenvolvimentos de novos métodos cirúrgicos e da descoberta de novos agentes anticâncer nos últimos anos, os resultados para o tratamento dos cânceres não melhoram muito até o momento com exceção de alguns tipos de câncer. Nos últimos anos, em virtude do desenvolvimento da biologia molecular e imunologia do câncer, foram levantados diversos antígenos de células cancerosas reconhecidos por anticorpos e células T citotóxicas que são especificamente reativos ao câncer, assim como, foram identificados genes que codificam os antígenos de células cancerosas, e há expectativas para os métodos terapêuticos, especificamente aqueles que utilizam direcionamento por antígenos do câncer (Literatura não patentária 1).

[003] Em um método terapêutico para o câncer, para reduzir os efeitos colaterais, é desejável que o peptídeo, polipeptídeo ou proteína reconhecida como antígeno quase não exista em células normais e que exista especificamente nas células cancerosas. Em 1991, Boon, et al. no Instituto Ludwig na Bélgica, isolaram um antígeno de melanoma humano MAGE 1 reconhecido pelas células T CD8-positivas por um método de clonagem por expressão de cDNA, utilizando uma linhagem de células de câncer autólogas e células T reativas ao câncer (Literatura não patentária 2). Posteriormente, foi descrito o método SEREX (identificação sorológica de antígenos pela clonagem de recombinantes de expressão), no qual antígenos tumorais reconhecidos pelos anticorpos produzidos no corpo vivo de um paciente com câncer, em resposta ao câncer do próprio paciente, são identificados através da aplicação de um método de clonagem da expressão gênica, (Literatura não patentária 3; Literatura Patentária 1), e vários antígenos de câncer que dificilmente são expressos em células normais e são expressos de maneira específica nas células de câncer foram isolados por este método (Literaturas não patentárias 4 a 9). Além disso, utilizando uma parte destes como alvo foram realizados ensaios clínicos para terapias com células usando imunócitos especificamente reativos aos antígenos de câncer, e imunoterapias específicas para o câncer, tal como o uso de vacinas contendo antígenos de câncer.

[004] Por outro lado, nos últimos anos, vários medicamentos de anticorpos para o tratamento do câncer ficaram evidentes no mundo, nos quais, as drogas são direcionadas para as proteínas antígenos de células cancerosas. Uma vez que certos níveis de efeitos farmacológicos podem ser obtidos com estas drogas de anticorpos, tal como agentes terapêuticos específicos para o câncer, elas estão se tornando cada vez mais evidentes, porém, a maioria das proteínas antigênicas que seriam como alvo destas drogas, também são expressas em células normais, de modo que, como resultado da administração do anticorpo, não apenas as células cancerosas são lesadas, mas também as células normais que expressam tal antígeno, resultando na ocorrência de efeitos colaterais, que tem sido problemática. Assim, espera-se que a identificação de antígenos de câncer expressos especificamente na superfície das células cancerosas e o emprego de anticorpos para direcionamento a estes antígenos como medicamentos, irá possibilitar o tratamento com medicamentos de anticorpos com menos efeitos colaterais.

[005] O CD179b é conhecido por ser uma parte da cadeia leve substituta de imunoglobulina e expressa na superfície das membranas das células precursoras de células B (células pré-B e células pró-B). Este antígeno desaparece na diferenciação de células B e não é expresso em células B maduras. No entanto, o CD179b é conhecido por estar expresso na leucemia (leucemia de células pré-B) produzidos pela cancerização de células pré-B (Literaturas não patentárias 10 e 11). Além disso, o CD179b é conhecido por estar expresso também em células de linfomas (linfoma de células pré-B) produzidos pela cancerização de células pré-B, e pode ser usado como um marcador diagnóstico para o linfoma de células pré-B (Literatura não patentária 12). No entanto, a sua expressão específica não foi relatada em células de leucemia, exceto em células de pré-leucemia de células B, linfomas que não o linfoma de células pré-B, células de câncer de mama e similares. Além disso, não houve nenhuma descrição sugerindo que anticorpos contra CD179b são úteis para a terapia e/ou profilaxia do câncer. LITERATURA DOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO LITERATURA PATENTÁRIA

[006] Literatura Patentária 1: US 5.698.396 B

LITERATURA NÃO PATENTÁRIA

[007] Literatura não Patentária 1: Tsuyoshi Akiyoshi, “Cancer and Chemotherapy”, 1997, Vol. 24, págs.: 551-519.

[008] Literatura Não Patentária 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991).

[009] Literatura Não Patentária 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995).

[010] Literatura Não Patentária 3: Int. J. Cancer, 72:965-971 (1997).

[011] Literatura Não Patentária 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998).

[012] Literatura Não Patentária 6: Int. J. Cancer, 29:652-658 (1998).

[013] Literatura Não Patentária 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999).

[014] Literatura Não Patentária 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996).

[015] Literatura Não Patentária 9: Hum. Mol. Genet 6:33-39 (1997).

[016] Literatura Não Patentária 10: Adv. Immunol., 63:1-41 (1996).

[017] Literatura Não Patentária 11: Blood, 92:4317-4324 (1998).

[018] Literatura Não Patentária 12: Modern Pathology, 17:423-429 (2004).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[019] A invenção tem como objetivo identificar proteínas antígenos do câncer expressas especificamente na superfície das células cancerosas e fornecer o uso de anticorpos direcionados a estas como agentes para a terapia e/ou profilaxia do câncer.

MODOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

[020] Os inventores da presente invenção estudaram intensamente, pelo método SEREX usando soro de um cão doente a partir do qual foi preparada uma biblioteca de cDNA derivada de tecido de câncer de mama canino, a obtenção de um cDNA que codifica uma proteína que se liga aos anticorpos existentes no soro derivado do corpo vivo que carrega o câncer e, com base em um gene humano homólogo ao gene obtido, foi preparado o CD179b humano, possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 3. Além disso, os presentes inventores descobriram que a CD179b é dificilmente expressa em tecidos normais, mas é especificamente expressa em células de câncer de mama, leucemia e linfoma de células. Além disso, os presentes inventores descobriram que anticorpos contra CD179b, lesam as células que expressam CD179b, completando assim a presente invenção.

[021] Desse modo, a presente invenção tem as seguintes características.

[022] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para a terapia e/ou profilaxia do câncer compreendendo como componente eficaz, um anticorpo ou fragmento deste, em que o dito anticorpo possui imunorreatividade à proteína CD179b e possui a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 3 ou uma sequência de aminoácidos possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos, ou fragmento desta, compreendendo pelo menos 7 aminoácidos contínuos.

[023] Neste exemplo de realização, o câncer acima é um câncer que expressa o gene CD179b.

[024] Em outra realização, o câncer acima é câncer de mama, leucemia ou linfoma.

[025] Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.

[026] Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico.

[027] Em outra realização, o anticorpo acima é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102, e uma região variável de cadeia leve com as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108, em que o anticorpo possui uma imunorreatividade à proteína CD179b.

[028] Em outra realização, o anticorpo acima é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 e uma região variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109, em que o anticorpo possui uma imunorreatividade à proteína CD179b.

[029] A presente invenção também fornece os seguintes anticorpos. (i) Um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102; e uma região variável de cadeia leve possuindo as sequências de aminoácidos exibidas na SEQ ID Nos: 106, 107 e 108, possuindo o anticorpo imunorreatividade à proteína CD179b. (ii) Um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 e uma região variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109, possuindo o dito anticorpo imunorreatividade à proteína CD179b. (iii) Os anticorpos de (i) e (ii) acima, possuindo atividade citotóxica. (iv) Os anticorpos de (i) e (ii) acima, sendo que cada um dos quais é um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico.

[030] A presente invenção também fornece os seguintes polipeptídeos ou DNAs. (v) Um DNA que codifica um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105; ou um DNA que codifica o polipeptídeo. (vi) Um DNA que codifica um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109; ou um DNA que codifica o polipeptídeo. (vii) um DNA possuindo a sequência de bases exibida na SEQ ID No: 110. (viii) um DNA possuindo a sequência de bases exibida na SEQ ID No: 111. (ix) Uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102, ou um DNA de codificação do polipeptídeo. (x) Uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDR) selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108, ou um DNA de codificação do polipeptídeo.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[031] O anticorpo contra CD179b, que é usado na presente invenção, danifica as células cancerosas. Portanto, o anticorpo contra CD179b é útil para a terapia e/ou profilaxia do câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[032] Fig. 1 é um diagrama exibindo os padrões de expressão do gene que codifica a proteína CD179b em tecidos normais e linhagem de células tumorais. A referência numeral 1 representa o padrão de expressão do gene que codifica a proteína CD179b; e a referência numeral 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH.

[033] Fig. 2 é um diagrama mostrando um efeito antitumoral de um anticorpo contra CD179b (anticorpo monoclonal anti-CD179b #8) em camundongos nude para o qual uma linhagem de células de câncer humano Namalwa expressando CD179b foi transplantada. A referência numeral 3 representa o tamanho do tumor nos camundongos nos quais o anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 foi administrado, e a referência numeral 4 representa o tamanho do tumor nos camundongos nos quais foi administrado apenas PBS(-).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[034] A sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 3 na Listagem de Sequências divulgada na presente invenção é a sequência de aminoácidos do CD179b, isolado pelo método SEREX utilizando soro de um cão a partir do qual foi elaborada uma biblioteca de cDNA derivada de tecido de câncer da glândula mamária canina, como um fator homólogo ao humano (homólogo) de um polipeptídio que se liga especificamente aos anticorpos existentes no soro proveniente do cão que carrega o câncer (vide Exemplo 1). O anticorpo contra CD179b utilizado na presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo, contanto que o anticorpo possa exercer uma atividade antitumoral, e exemplos deste incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples (scFv), e fragmentos de anticorpos, como Fab e F(ab')2. Estes anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser preparados por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Na presente invenção, o anticorpo pode preferencialmente se ligar de maneira específica a uma proteína CD179b e, nos casos em que o paciente é um ser humano, o anticorpo é preferivelmente um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, a fim de evitar ou suprimir a reação de rejeição.

[035] Na presente invenção, o termo "se liga especificamente a uma proteína CD179b" significa que o anticorpo se liga especificamente a uma proteína CD179b e não se liga substancialmente a outras proteínas.

[036] Na presente invenção, o anticorpo contra CD179b empregado poderá ser um anticorpo comercialmente disponível. Exemplos de anticorpos conhecidos contra CD179b humano incluem clones como GA170, H- 60, HP6054, A-19, C-16, SLC1, SLC2, SLC3, SLC4 e HSL11, que estão disponíveis.

[037] A atividade antitumoral do anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção pode ser testada in vitro, investigando se o anticorpo apresenta citotoxicidade contra as células tumorais que expressam o polipeptídeo por meio de imunócitos ou pelo complemento, conforme mencionado mais adiante.

[038] Além disso, o indivíduo da presente invenção a ser submetido à terapia e/ou profilaxia do câncer é um mamífero, tal como um humano, animal de estimação, animal doméstico ou animal de esporte, e o indivíduo é preferencialmente humano.

[039] Os termos "câncer" e "tumor" utilizados no presente significa uma neoplasia maligna, e são utilizados indistintamente.

[040] Preparação de antígenos, preparação de anticorpos e composições farmacêuticas relacionadas com a presente invenção serão agora descritas. "PREPARAÇÃO DE ANTÍGENOS PARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS"

[041] As espécies de animais a partir da qual a proteína ou um fragmento desta, usada como um antígeno sensibilizante para a obtenção de um anticorpo contra CD179b utilizado na presente invenção é derivada, não está restrita, e exemplos destas incluem humanos, cães, camundongos, bovinos e ratos. Entretanto, a espécie animal é preferencialmente selecionada tendo em conta a compatibilidade com as células parentais usadas para a fusão celular, e, em geral, uma proteína derivada de um mamífero, especialmente humano, é preferida. Por exemplo, nos casos em que o CD179b é CD179b humana, uma proteína CD179b humana ou um peptídeo parcial desta, as células que expressam CD179b humano, ou similares pode ser usada.

[042] As sequências de base e as sequências de aminoácidos do CD179b humano e homólogos deste podem ser obtidas, por exemplo, acessando o GenBank (NCBI, EUA) e utilizando um algoritmo como o BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:5873-5877 1993; Altschul et al, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997). O CD179b também é denominado de À5, IGLL1, Vpreb2, LOC608248 ou formas semelhantes, mas "CD179b" é usado como um representante no presente. Por exemplo, CD179b humana está registrada, por exemplo, sob os números NM_152855 e NM_020070; Vpreb2 murina está registrada, por exemplo, sob os números NM_016983; e LOC608248 canina está registrada, por exemplo, sob o número XM_845215.

[043] Na presente invenção, nos casos em que a sequência de base ou sequência de aminoácidos da CD179b humana é usada como um padrão, um ácido nucleico ou proteína é alvo, desde que o ácido nucleico ou proteína tenha uma sequência que exiba uma identidade de sequência de 50% a 100%, preferencialmente de 60% a 100%, mais preferencialmente de 80% a 100%, ainda mais preferencialmente de 90% a 100%, e mais preferencialmente de 95% a 100%, por exemplo, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100% ou 99,5% a 100% com a sequência exibida na SEQ ID No: 1 ou 3. Na presente invenção, o termo "% de identidade de sequência" significa a porcentagem (%) de aminoácidos (ou bases) idênticos em relação ao número total de aminoácidos (ou bases), quando as duas sequências são alinhadas entre si de modo que a similaridade máxima entre elas é alcançada com ou sem a introdução de gaps.

[044] O comprimento do fragmento da proteína CD179b não é menor que o comprimento de aminoácidos do epítopo (determinante antigênico), que é a menor unidade reconhecida pelo anticorpo, e menor do que o comprimento total da proteína. O comprimento do epítopo está normalmente dentro do intervalo de 7 a 12 aminoácidos contínuos.

[045] A proteína CD179b humana e polipeptídeos descritos acima contendo os peptídeos parciais destes podem ser sintetizados por um método de síntese química, tais como o método Fmoc (método fluorenil-metiloxicarbonil) ou o método tBoc (método t-butiloxicarbonil). Além disso, eles podem ser sintetizados por métodos convencionais, usando vários tipos de sintetizadores de peptídeos disponíveis comercialmente. Além disso, o polipeptídeo de interesse pode ser obtido utilizando técnicas de engenharia genética conhecidas, pela elaboração de um polinucleotídeo de codificação do polipeptídeo acima e incorporando o polinucleotídeo em um vetor de expressão, que é então introduzido em uma célula hospedeira, e em seguida, permitindo que o polipeptídeo seja produzido na célula hospedeira.

[046] O polinucleotídeo codificante do polipeptídeo acima pode ser facilmente preparado por técnicas conhecidas da engenharia genética ou por métodos convencionais, usando um sintetizador de ácido nucleico comercialmente disponível. Por exemplo, o DNA que possui a sequência de base exibida na SEQ ID No: 1 pode ser preparado pela realização da PCR, usando o DNA cromossômico humano ou uma biblioteca de cDNA humano como molde, e um par de iniciadores (primers) desenhados de tal forma que a sequência de bases exibida na SEQ ID No.1 possa ser amplificada com este. As condições da reação por PCR podem ser ajustadas de forma adequada, e exemplos destas incluem, mas não estão limitados a, repetições do processo de reação de 94 °C por 30 segundos (desnaturação), 55 °C por 30 segundos a 1 minuto (anelamento) e 72 °C por 2 minutos (extensão) por, por exemplo, 30 ciclos, seguido pela reação a 72 °C por 7 minutos. Além disso, o DNA desejado pode ser isolado pela preparação de sonda(s) ou primer(s) adequado(s) com base nas informações da sequência de bases e sequência de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 1 e 3, respectivamente, na Listagem de Sequências do presente, e utilizando as ditas sonda(s) ou primer(s) para a seleção de uma biblioteca de cDNA humana ou similar.

[047] A biblioteca de cDNA é preferivelmente preparada a partir de células, órgão ou tecido que expressa a proteína da SEQ ID No: 3. Exemplos de tais células e tecidos incluem a medula óssea, células de leucemia, células de câncer de mama e células de linfoma. As operações acima descritas, tal como a preparação de sonda(s) ou primer(s), construção de uma biblioteca de cDNA, seleção da biblioteca de cDNA e clonagem do gene de interesse são conhecidas pelos técnicos no assunto, e podem ser realizadas de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Sambrook et al. Molecular cloning, Segunda Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989). A partir do DNA obtido, um DNA de codificação da proteína CD179b humana ou peptídeo parcial da mesma pode ser obtido.

[048] As células hospedeiras descritas acima podem ser quaisquer células desde que estas possam expressar o polipeptídeo acima, e exemplos de células procariotas incluem, mas não estão limitadas a, células de E. coli, e exemplos de células eucarióticas incluem, mas não estão limitadas a, culturas de células de mamíferos, tal como células de rim de macaco COS-1, células de ovário de hamster chinês CHO, linhagem de células renais embrionárias humana HEK 293 e linhagem de células embrionárias de pele de camundongos NIH3T3, células de levedura, como leveduras de brotamento e levedura de fissão, as células do bicho da seda e células somáticas de Xenopus.

[049] Nos casos em que as células procariotas são usadas como células hospedeiras, o vetor de expressão empregado nas células procariotas tem uma origem de replicação, promotor, sítio de ligação do ribossomo, sítio de clonagem múltipla, terminador, gene de resistência a drogas, gene complementar de nutrientes e/ou similares. Exemplos do vetor de expressão da E. coli incluem o sistema pUC, pBluescriptII, sistema de expressão pET e sistema de expressão pGEX. Pela incorporação de um DNA de codificação do polipeptídeo acima em um vetor de expressão e transformação das células hospedeiras procarióticas com o vetor, seguido pelo cultivo dos transformantes resultantes, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso nas células hospedeiras procarióticas. Neste processo, o polipeptídeo também pode ser expresso como uma proteína de fusão com outra proteína (por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP) ou glutationa S-transferase (GST)).

[050] Nos casos em que são utilizadas células eucarióticas como células hospedeiras, um vetor de expressão para células eucarióticas possuindo um promotor, sítio de splicing, sítio de adição de poli(A) e/ou similares é utilizado como vetor de expressão. Exemplos de uma tais vetores de expressão incluem pKa1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vetor EBV, pRS, pcDNA3, pMSG e pYES2. Da mesma forma como descrito acima, com a incorporação de um DNA de codificação do polipeptídeo acima em um vetor de expressão e a transformação de células hospedeiras eucarióticas com tal vetor, seguido pelo cultivo dos transformantes resultantes, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso nas células hospedeiras eucarióticas. Nos casos em que o pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 ou similar é utilizado como vetor de expressão, o polipeptídeo acima pode ser expresso como uma proteína de fusão ao qual um marcador como o marcador His (por exemplo, (His)6 a (His)10), marcador FLAG, marcador myc, marcador HA ou GFP foi adicionado.

[051] Para a introdução do vetor de expressão nas células hospedeiras, métodos bem conhecidos podem ser utilizados, tais como a eletroporação, método de fosfato de cálcio, método de lipossomas, método de dextrano DEAE e microinjeção.

[052] O isolamento e purificação do polipeptídeo de interesse a partir das células hospedeiras podem ser realizados por uma combinação de operações de separação conhecidas. Exemplos de operações de separação conhecidas incluem, mas não estão limitadas a, tratamento com um desnaturante, tal como a ureia, ou um tensoativo; tratamento com ultrasonicação; digestão enzimática; precipitação por salificação (salting-out) ou precipitação fracionada com solvente; diálise; centrifugação; ultrafiltração; filtração em gel; SDS-PAGE; focalização isoelétrica; cromatografia de troca iônica; cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa. “A ESTRUTURA DE UM ANTICORPO”

[053] Um anticorpo é normalmente uma glicoproteína heteropolimérica tendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Exceto para IgM, ela é uma glicoproteína heterotetramérica de cerca de 150 kDa constituída por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Normalmente, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação covalente simples de dissulfeto, mas o número de pontes de dissulfeto entre as cadeias pesada varia entre os diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada uma das cadeias pesadas e cadeias leves também possuem pontes dissulfeto intracadeias. Cada cadeia pesada possui um domínio variável (região VH) em sua extremidade, e o domínio variável é seguido por várias regiões constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável (região VL), e tem uma região constante no extremo oposto desta. A região constante da cada cadeia leve está alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada, e cada domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável de cadeia pesada. Cada domínio variável de um anticorpo tem determinadas regiões que exibem variabilidades especiais, denominadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que dão uma especificidade de ligação ao anticorpo. As partes de cada região variável, que são relativamente conservadas são denominadas de regiões do arcabouço (frameworks) (FRs). Cada um dos domínios variáveis completo das cadeias pesadas e cadeias leves possuem quatro FRs ligados através de três CDRs. Em cada cadeia pesada, os três CDRs são denominados de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 em ordem a partir da extremidade N-terminal, e, em cada cadeia leve, eles são denominados de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de forma semelhante. Para a especificidade de ligação de um anticorpo contra um antígeno, a CDRH3 é a mais importante. Além disso, as CDRs em cada vertente são mantidas unidas pelas regiões FR de modo que as CDRs fiquem próximas umas das outras, contribuindo assim para a formação de um sítio de ligação ao antígeno, juntamente com as CDRs de outra vertente. Embora a região constante não contribua de maneira direta para a ligação do anticorpo ao antígeno, ela exibe várias funções efetoras, tais como envolvimento na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), a fagocitose via ligação ao receptor FcY, taxa de meia-vida/depuração através do receptor Fc neonatal (FcRn), e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), através do componente C1q da cascata do sistema complemento. PREPARAÇÃO DO ANTICORPO

[054] O anticorpo anti-CD179b na presente invenção, significa um anticorpo possuindo uma reatividade imunológica com o comprimento total da proteína CD179b ou um fragmento desta. Na presente invenção, a "reatividade imunológica" designa uma propriedade pela qual o anticorpo e um antígeno CD179b são ligados entre si, e a função para danificar (para causar a morte, supressão ou regressão de) tumores é exercida por meio deste tipo de ligação. Ou seja, o tipo do anticorpo utilizado na presente invenção não está restrito, desde que o anticorpo possa se ligar a uma proteína CD179b para causar danos aos tumores, tal como o câncer de mama, leucemia e linfoma.

[055] Exemplos de anticorpos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecífico, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, e fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab e (Fab’)2). Além disso, o anticorpo pertence a uma classe arbitrária de uma molécula de imunoglobulina, tais como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD ou IgY, ou a uma subclasse arbitrária, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2.

[056] O anticorpo pode ser modificado pela glicosilação, acetilação, formilação, amidação, fosforilação, peguilação (PEG) e/ou similares.

[057] Exemplos da preparação de diferentes anticorpos estão descritos abaixo.

[058] Nos casos em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, por exemplo, uma linhagem de células de leucemia Namalwa expressando CD179b é administrada a um camundongo para imunizar o camundongo, e baço é extraído do camundongo. As células são separadas e fundidas com células de mieloma de camundongo, e, a partir das células fundidas obtidas (hibridomas), um clone que produz um anticorpo com ação supressora do crescimento da célula cancerosa é selecionado. O anticorpo pode ser preparado pelo isolamento do hibridoma que produz o anticorpo monoclonal possuindo uma ação supressora do crescimento da célula cancerosa, cultivando o hibridoma, seguido da purificação do anticorpo no sobrenadante da cultura por meio de um método comumente utilizado de purificação por afinidade.

[059] Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal pode também ser preparado, por exemplo, da seguinte forma.

[060] Em primeiro lugar, de acordo com um método conhecido, um animal é imunizado com um antígeno sensibilizante. De um modo geral, o método é realizado por injeção via intraperitoneal ou subcutânea do antígeno sensibilizante em um mamífero. Mais especificamente, o antígeno sensibilizante está diluído em um volume adequado com PBS (salina tamponada com fosfato) ou soro fisiológico e suspensos, seguida pela mistura, conforme desejado, com uma quantidade adequada de um adjuvante normal, tal como adjuvante completo de Freund com a suspensão. Isso é seguido por emulsificação, e depois a administração da emulsão a um mamífero a cada 4 a 21 dias por várias vezes. Adicionalmente, também é possível usar um veículo adequado quando a imunização com o antígeno sensibilizante é realizada.

[061] Após a imunização do mamífero e confirmação do aumento do nível sérico de anticorpo desejado, os imunócitos são recolhidos do mamífero e submetidos a fusão celular. Exemplos de imunócitos preferidos incluem principalmente as células do baço.

[062] São usadas células de mieloma de mamíferos como outras células parentais para serem fundidas com os imunócitos. Exemplos de células do mieloma preferencialmente empregadas incluem várias linhagens de células conhecidas como; P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. e Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313323) e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

[063] A fusão celular entre o imunócito e as células de mieloma pode ser realizada basicamente de acordo com um método conhecido, por exemplo, um método de Kohler e Milstein (G. Kohler. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

[064] Mais especificamente, a fusão celular é realizada, por exemplo, na presença de um agente promotor da fusão celular, em um meio nutriente normal. Exemplos do agente promotor de fusão incluem polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ), e, a fim de aumentar a eficiência da fusão, um agente auxiliar, tal como dimetilsulfóxido também pode ser adicionado como desejado.

[065] A relação entre os imunócitos e as células de mieloma a serem utilizadas pode ser arbitrariamente fixada. Por exemplo, é preferível o uso de 1 a 10 vezes mais de imunócitos do que de células de mieloma. Exemplos de meio que pode ser usado para a fusão celular inclui o meio RPMI1640 que é o preferido para o crescimento da linhagem de células mieloma; meio MEM e outro meio normalmente utilizado para este tipo de cultura celular. Além disso, um substituto do soro tal como o soro fetal bovino (SFB), também pode ser usado em combinação.

[066] Durante a fusão celular, quantidades prescritas de imunócitos e células de mieloma são misturadas no meio, e uma solução de PEG (com um peso molecular médio de cerca de 1000 a 6000, por exemplo) pré- aquecido a cerca de 37 °C é adicionada à uma concentração de normalmente 30 a 60% (p/v), seguido pela mistura da mistura resultante para formar o hibridomas de interesse. Posteriormente, pela repetição da operação de adição sucessiva de um meio adequado e remoção do sobrenadante por centrifugação, os agentes de fusão celular e similares que não são preferenciais para o crescimento do hibridoma são removidos.

[067] O hibridoma assim obtido é selecionado pelo cultivo em meio de seleção normal, tal como o meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura no meio HAT acima é continuada por um período de tempo suficiente para as outras células que não do hibridoma de interesse (células fundidas) morreram (normalmente, por vários dias a várias semanas). Posteriormente, um método de diluição limitante normal é realizado para a seleção e clonagem de um único hibridoma produtor dos anticorpos de interesse.

[068] Além do método em que o hibridoma acima é obtido através da imunização de um animal não humano com o anticorpo, há também um método no qual os linfócitos humanos, tais como linfócitos humanos infectados com o vírus EB, são sensibilizados in vitro com uma proteína, células que expressam a proteína ou um lisado destas, e os linfócitos sensibilizados são fundidos com células de mieloma derivadas de humano que possuem um potencial de divisão permanente, por exemplo, U266 (número de registro TIB196), para a obtenção de um hibridoma que produz um anticorpo humano possuindo uma atividade desejada (atividade de supressão do crescimento celular, por exemplo).

[069] O hibridoma assim preparado produzindo um anticorpo monoclonal pode ser subcultivado em meio normal, e pode ser armazenado em nitrogênio líquido por um longo período.

[070] Ou seja, os hibridomas podem ser preparados por um processo em que o antígeno desejado ou células que expressam o antígeno desejado é/são utilizado(s) como antígeno sensibilizante para realizar a imunização de acordo com um método de imunização convencional, obtendo-se assim imunócitos que são fundidos com células parentais conhecidas através de um método convencional de fusão celular, seguida pela seleção de células produtoras de anticorpos monoclonais (hibridomas) por um método de triagem convencional.

[071] Outro exemplo do anticorpo que pode ser usado na presente invenção é um anticorpo policlonal. O anticorpo policlonal pode ser obtido, por exemplo, da seguinte forma.

[072] Uma proteína CD179b de ocorrência natural, ou uma proteína CD179b recombinante expressa como uma proteína de fusão com GST em um microorganismo, tal como a E. coli, ou um peptídeo parcial da mesma é utilizada para a imunização de um animal pequeno tal como um camundongo, camundongo produtor de anticorpos humanos ou coelho, e o soro é obtido a partir destes animais de pequeno porte. Um anticorpo policlonal é preparado através da purificação do soro, por exemplo, por precipitação em sulfato de amônio, proteína A, e colunas de proteína G, cromatografia de troca iônica DEAE, ou coluna de afinidade acoplada com uma proteína CD179b ou um peptídeo sintético.

[073] Na presente invenção, os exemplos conhecidos de camundongo produtor de anticorpos humanos incluem o camundongo KM (Kirin Pharma/Medarex) e XenoMouse (Amgen). Quando tal camundongo é imunizado com a proteína CD179b ou fragmento dela, um anticorpo policlonal humano completo pode ser obtido a partir do sangue. Além disso, através da remoção de células do baço do camundongo imunizado e submetendo as células a um método de fusão com células de mieloma, um anticorpo monoclonal do tipo humano pode ser preparado.

[074] O antígeno pode ser preparado de acordo com um método que utiliza células de origem animal (Pedido de Patente PTC Japonês Traduzido aberto a inspeção pública 2007-530068), um método que utiliza um baculovírus (por exemplo, documento WO98/46777), ou similares. Nos casos em que a imunogenicidade do antígeno é baixa, a imunização pode ser realizada após a ligação do antígeno a uma macromolécula que possui imunogenicidade, tal como a albumina.

[075] Além disso, um gene de anticorpo recombinante também pode ser usado, no qual o anticorpo foi elaborado pela clonagem do gene do anticorpo a partir do hibridoma e foi incorporado em um vetor adequado, que foi então transfectado para um hospedeiro, em seguida, foi permitindo que o hospedeiro produzisse o anticorpo pela técnica de recombinação genética (vide, por exemplo, Carl, AK Borrebaeck, James W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido pela Macmillan Publishers Ltd, 1990).

[076] Mais especificamente, o cDNA da região variável (região V) do anticorpo é sintetizada a partir do mRNA do hibridoma usando uma transcriptase reversa. Após a obtenção do DNA codificante da região V do anticorpo de interesse, o DNA é ligado ao DNA que codifica a região constante do anticorpo (região C) de interesse, e o resultante é incorporado a um vetor de expressão. Alternativamente, O DNA codificante da região V do anticorpo pode ser incorporado em um vetor de expressão possuindo o DNA da região C do anticorpo. A incorporação é realizada de modo que a expressão é permitida sob o controle das regiões de controle de expressão, tal como um amplificador e/ou promotor. Subsequentemente, células hospedeiras podem ser transformadas com este vetor de expressão para permitir a expressão do anticorpo.

[077] O anticorpo anti-CD179b da presente invenção é preferivelmente um anticorpo monoclonal. No entanto, também pode ser um anticorpo policlonal, anticorpo geneticamente modificado (tal como um anticorpo monoclonal quimérico ou anticorpo humanizado) ou similar.

[078] Exemplos de anticorpo monoclonal incluem anticorpos monoclonais humanos e anticorpos monoclonais não humanos e animal (por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo, anticorpos monoclonais de rato e anticorpos monoclonais de galinha). O anticorpo monoclonal pode ser preparado por uma cultura de hibridoma obtida pela fusão de células do baço de um mamífero não humano (por exemplo, camundongo ou camundongo produtor de anticorpos humanos) imunizado com uma proteína CD179b, com células de mieloma. Nos exemplos abaixo, um anticorpo monoclonal #8 foi elaborado, com o qual um efeito antitumoral foi confirmada. O anticorpo #8 tem uma região variável da cadeia pesada (VH), com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 e uma região variável da cadeia leve (VL), com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109. Na presente invenção, a região VH possui as sequências de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 103 (CDR1), SEQ ID No: 104 (CDR2) e SEQ ID No: 102 (CDR3); e a região VL possui as sequências de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 106 (CDR1), SEQ ID No: 107 (CDR2) e SEQ ID No: 108 (CDR3).

[079] Um anticorpo quimérico é um anticorpo preparado pela combinação de sequências derivadas de diferentes animais. Exemplos destes anticorpos incluem um anticorpo com regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo de camundongo e regiões constante da cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano. A preparação do anticorpo quimérico pode ser realizada usando um método conhecido. Por exemplo, pode ser obtido pela ligação de uma DNA de codificação de uma região V de anticorpo a um DNA de codificação de uma região C de anticorpo humano, seguido pela incorporação do DNA resultante em um vetor de expressão e transfecção do vetor em um hospedeiro, permitindo assim a produção de um anticorpo quimérico.

[080] Exemplos de anticorpo policlonal incluem anticorpos obtidos através da imunização de um animal produtor de anticorpos humanos (por exemplo, camundongo) com uma proteína CD179b.

[081] Um anticorpo humanizado é um anticorpo modificado também denominado de anticorpo humano remodelado. Um anticorpo humanizado pode ser construído por meio do transplante das CDRs de um anticorpo derivado de um animal imunizado para as regiões de determinação de complementaridade de um anticorpo humano. Uma técnica de recombinação genética comum é conhecida para tal.

[082] Mais especificamente, uma sequência de DNA projetada de tal forma que as CDRs de um anticorpo de camundongo estão ligadas com as regiões do arcabouço (framework) (FRs) de um anticorpo humano, é sintetizada pelo método de PCR a partir de vários oligonucleotídeos preparados de tal forma que os oligonucleotídeos possuem regiões de sobreposição em suas extremidades. O DNA obtido é ligado a um DNA de codificação da região constante do anticorpo humano, e o DNA resultante é incorporado em um vetor de expressão, seguido pela introdução do vetor em um hospedeiro, para se obter um anticorpo humanizado (vide Pedido de Patente Europeu EP 239400 e Pedido de Patente Internacional WO96/02576). As FRs do anticorpo humano ligadas através das CDRs são selecionadas de forma que as regiões determinantes de complementaridade formam um bom sítio de ligação do antígeno. Conforme a necessidade, aminoácidos nas regiões do arcabouço (framework) nas regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos de forma que as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo do anticorpo humano remodelado constituam um local adequado de ligação ao antígeno (Sato, K. et al. Cancer Res. (1993) 53, 851-856). Além disso, as regiões do arcabouço (framework) podem ser substituídas por regiões do arcabouço (framework) derivadas de diversos anticorpos humanos (vide Pedido de Patente Internacional WO99/51743).

[083] Após a preparação de um anticorpo monoclonal quimérico ou um anticorpo humanizado, aminoácidos nas regiões variáveis (FRs, por exemplo) e/ou regiões constantes podem ser substituídos por outros aminoácidos.

[084] O número de aminoácidos a serem substituídos, por exemplo, menos de 15, menos de 10, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais do que 3 ou não mais que 2, de preferência de 1 a 5, mais preferencialmente 1 ou 2, e o anticorpo substituído deve ser funcionalmente equivalente ao anticorpo não substituído. As substituições são preferencialmente substituições de aminoácidos conservadoras, que são substituições entre os aminoácidos que têm propriedades similares de cargas, cadeias laterais, polaridade, aromaticidade e/ou similares. Os aminoácidos com propriedades semelhantes podem ser classificados, por exemplo, em aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos polares não carregados (glicina glutamina, asparagina, serina, treonina, cisteína e tirosina), aminoácidos apolares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, triptofano, fenilalanina e metionina), aminoácidos de cadeia ramificada (valina, treonina e isoleucina) e aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).

[085] Exemplos de anticorpos modificados incluem anticorpos ligados a várias moléculas tal como polietilenoglicol (PEG). No anticorpo modificado da presente invenção, a substância à qual o anticorpo está ligado não é restrita. Tal anticorpo modificado pode ser obtido pela modificação química do anticorpo obtido. Estes métodos de modificação já estão bem estabelecidos no estado da técnica.

[086] Na presente invenção, o termo "funcionalmente equivalente" significa, por exemplo, que o anticorpo sujeito tem uma atividade biológica ou bioquímica semelhante, mais especificamente, uma função de dano para tumores, e não causam, essencialmente, uma reação de rejeição quando é aplicado ao ser humano. Exemplos de tais atividades podem incluir uma atividade de supressão do crescimento celular uma atividade de ligação.

[087] Como método bem conhecido pelos técnicos no assunto na técnica da preparação de um polipeptídeo funcionalmente equivalente a um determinado polipeptídeo, a introdução de mutação(ões) em um polipeptídeo é conhecida. Por exemplo, o técnicos no assunto podem usar a mutagênese sítio- dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, e Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, e Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, T.A. (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) ou técnica similar para a introdução de mutação(ões), conforme o caso, ao anticorpo da presente invenção, para preparar anticorpos funcionalmente equivalentes a esse anticorpo.

[088] O anticorpo que reconhece o epítopo da proteína CD179b a ser reconhecido pelo anticorpo anti-CD179b descrito acima podem ser obtido por um método conhecido pelos técnicos no assunto. Exemplos do método pelo qual pode esse anticorpo ser obtido inclui um método em que o epítopo da proteína CD179b reconhecido pelo anticorpo anti-CD179b é determinada por um método normal (por exemplo, mapeamento de epítopos) e um anticorpo é preparado usando como imunógeno um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos incluída no epítopo, e um método no qual o epítopo do anticorpo é determinado por um método normal, seguido pela seleção de um anticorpo possuindo o epítopo idêntico aquele do anticorpo anti-CD179b. Na presente invenção, o termo "epítopo" designa um fragmento polipeptídico que possui antigenicidade e imunogenicidade em um mamífero, de preferência humano, e sua unidade mínima tem cerca de 7 a 12 aminoácidos.

[089] A constante de afinidade Ka (Kon/Koff) do anticorpo da presente invenção é preferivelmente de pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M1, pelo menos 5x108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5x109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5x1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5x1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1.

[090] O anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente antitumoral. A ligação entre o anticorpo e o agente antitumoral pode ser realizada por meio de um espaçador tendo um grupo (por exemplo, o grupo succinimidila, grupo formila, grupo 2-piridilditio, grupo maleimidila, grupo alcoxicarbonila ou um grupo hidroxi) reativo com um grupo amino, grupo carboxila, grupo hidroxila, grupo tiol e/ou similares.

[091] Exemplos de agentes antitumorais incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos na literatura e similares, ou seja, paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracila, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietiilenetiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxihidrocloreto de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostardas de uracila carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; andrógenos como a calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotana, trilostana, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamide glicosida, ácido aminolevulínico, eniluracila, amsacrina, bestrabucila, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucídeo, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rhizoxina, scizofilano, espirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, doxetaxel, clorambucila, gemcitabina, 6- tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico e capecitabina, e sais farmaceuticamente aceitáveis e derivados destes.

[092] Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode estar ligado a um radioisótopo conhecido descrito na literatura ou similar, tal como, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 ou Lu. O radioisótopo é preferivelmente eficaz para a terapia e/ou diagnóstico de um tumor.

[093] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo que possui uma reatividade imunológica com o CD179b, ou um anticorpo que reconhece especificamente o CD179b. O anticorpo deve ser um anticorpo que possui uma estrutura através da qual a reação de rejeição pode ser em grande parte ou totalmente evitada nos animais ao qual o anticorpo foi administrado. Exemplos de tais anticorpos incluem, por exemplo, nos casos em que o paciente animal é humano, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos quiméricos camundongo-humano), anticorpos de cadeia simples e anticorpos biespecíficos. Cada um destes anticorpos é um anticorpo recombinante em que: cada região variável da cadeia pesada e cadeia leve é derivada de um anticorpo humano e cada região variável da cadeia pesada e cadeia leve é constituída pelas regiões determinantes de complementaridade (CDR1 CDR2 e CDR3) de um anticorpo derivado de um animal não humano e as regiões de arcabouço derivadas de um anticorpo humano, ou cada região variável da cadeia pesada e cadeia leve é derivada de um animal não humano, em que o anticorpo recombinante possui regiões constantes derivadas de anticorpo humano na cadeia pesada e a cadeia leve. Os dois primeiros anticorpos são os preferidos.

[094] Estes anticorpos recombinantes podem ser preparados da seguinte forma. Um DNA codificador do anticorpo monoclonal (por exemplo, anticorpo monoclonal humano, anticorpo monoclonal de camundongo, anticorpo monoclonal de rato ou anticorpo monoclonal de frango) contra CD179b humano é clonado a partir de células produtoras de anticorpos, tal como hibridomas, e, usando este DNA como molde, os DNAs de codificação da região variável da cadeia leve e região variável da cadeia pesada do anticorpo são preparados, por exemplo, pelo método de RT-PCR, seguido pela determinação da sequência da região variável ou sequências CDR1 CDR2 e CDR3 de cada uma das cadeias leve e pesada de acordo com o sistema de numeração de EU Kabat (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 a ed. Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Além disso, O DNA de codificação das respectivas regiões variáveis ou DNA de codificação das respectivos CDRs são preparados pelo uso da técnica de recombinação genética (Sambrook et al. Molecular cloning, Segunda Edição, em: Current Protocols in Molecular Biology (1989)) ou por um sintetizador de DNA. Na presente invenção, o hibridoma produtor de anticorpos monoclonais humanos descrito acima pode ser preparado pela imunização de um animal produtor de anticorpos humano (por exemplo, camundongo) com o CD179b humanos, seguido pela fusão das células do baço, retirados do animal previamente imunizados, com as células de mieloma. Além disso, se necessário, DNAs codificando a região variável e região constante da cadeia leve ou cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano são preparados por meio da técnica de recombinação genética ou por meio de um sintetizador de DNA.

[095] No caso de um anticorpo humanizado, um DNA codificador do anticorpo humanizado pode ser preparado por um processo em que as sequências da CDR no DNA de codificação da região variável da cadeia leve ou cadeia pesada derivado de um anticorpo humano são substituídas pelas sequências d CDR correspondente de um anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, ou galinha) para preparar um DNA, e o DNA assim obtido está ligado a um DNA codificador da região constante da cadeia leve ou cadeia pesada, respectivamente, derivada de um anticorpo humano.

[096] No caso de um anticorpo quimérico, um DNA codificador do anticorpo quimérico pode ser preparado por um processo em que o DNA codificador da região variável da cadeia leve ou cadeia pesada derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, ou galinha) está ligado a um DNA codificador da região constante da cadeia leve ou cadeia pesada, respectivamente, provenientes de um anticorpo humano

[097] No caso de um anticorpo de cadeia simples, que é um anticorpo com uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve linearmente ligados entre si através de um ligante, um DNA codificador do anticorpo de cadeia simples pode ser preparado por um processo em que um DNA codificador da região variável da cadeia pesada, um DNA codificador do ligante e um DNA codificador da região variável da cadeia leve são ligados. Na presente invenção, cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve é derivada de um anticorpo humano ou derivada de um anticorpo humano no qual apenas os CDRs foram substituídos pelo CDRs de um anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato ou galinha). Além disso, o ligante possui 12 a 19 aminoácidos, e exemplos deste, incluem (G4S)3 possuindo 15 aminoácidos (Kim, GB. et al. Protein Engineering Design And Selection 2007, 20 (9) :425-432).

[098] No caso de um anticorpo biespecíficos (diacorpo), que é um anticorpo capaz de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes, um DNA codificador do anticorpo biespecífico pode ser preparado, por exemplo, por meio de um processo no qual um DNA codificador de uma região variável da cadeia pesada A, um DNA codificador de uma região variável da cadeia leve B, um DNA codificador de uma região variável da cadeia pesada B e um DNA codificador de uma região variável da cadeia leve A estão ligados entre si nesta ordem (entretanto, o DNA codificador de uma região variável da cadeia leve B e o DNA codificador da região variável da cadeia pesada B estão ligados entre si através do DNA codificador de um ligante, tal como aquele descrito anteriormente). Na presente invenção, cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve é derivada de um anticorpo humano ou derivada de um anticorpo humano no qual apenas os CDRs foram substituídos pelo CDRs de um anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato ou galinha).

[099] Um anticorpo recombinante pode ser preparado através da incorporação do(s) DNA(s) recombinante(s) assim preparado(s) em uma ou mais vetor(es) apropriado(s) e introduzindo o(s) vetor(es) resultante(s) em células hospedeiras (por exemplo, células de mamíferos, leveduras e células de inseto), em seguida, é permitindo que a (co-)expressão do DNA recombinante (PJ Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY; P. Shepherd e C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice, 1993 ACADEMIC PRESS).

[0100] O anticorpo da presente invenção preparado pelo método acima é um anticorpo que compreende, por exemplo, uma região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102 e uma região variável de cadeia leve possuindo as sequências de aminoácidos exibidas na SEQ ID Nos: 106, 107 e 108. Na presente invenção, as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102; são aquelas para as CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de camundongo, e as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108 são aquelas para as CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de uma região variável de cadeia leve de anticorpo de camundongo. Portanto, o anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico da presente invenção é, por exemplo, o anticorpo a seguir. (i) Um anticorpo compreendendo: uma região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102; e as sequências de aminoácidos da região de arcabouço derivada de um anticorpo humano e uma região variável da cadeia leve com o sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108 e as sequências de aminoácidos das regiões de arcabouço derivada de um anticorpo humano. (ii) Um anticorpo compreendendo: uma região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102; e as sequências de aminoácidos das regiões de arcabouço derivadas de um anticorpo humano; uma região constante da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos provenientes de um anticorpo humano; uma região variável da cadeia leve com as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108 e sequências de aminoácidos das regiões de arcabouço derivadas de um anticorpo humano, e uma região constante de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos derivadas de um anticorpo humano. (iii) Um anticorpo compreendendo: uma região variável da cadeia pesada, possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 e uma região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109. (iv) Um anticorpo compreendendo: uma região variável da cadeia pesada com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105; uma região constante da cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano; uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109, e uma região constante de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano.

[0101] As sequências das regiões constantes e regiões variáveis das cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos humanos podem ser obtidas, por exemplo, pelo NCBI (EUA: GenBank, UniGene e similares). Exemplos de sequências que podem ser designadas inclui o número de acesso J00228 para a região constante da cadeia pesada da IgG1 humana, o número de acesso J00230 para a região constante da cadeia pesada da IgG2 humana, o número de acesso X03604 para a região constante da cadeia pesada da IgG3 humana, número de acesso K01316 para a região constante da cadeia pesada da IgG4 humana, números de acesso V00557, X64135, X64133 e similares para a região constante K da cadeia leve humana, e os números de acesso X64132, X64134 e similares para a a região constante À da cadeia leve humana.

[0102] Os anticorpos acima têm preferencialmente atividade citotóxica e, portanto, podem exercer um efeito antitumoral.

[0103] Além disso, as sequências específicas das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve e CDRs nos anticorpos acima são apresentadas para fins meramente ilustrativos, e é evidente que elas não estão restritas às sequências específicas. É preparado um hibridoma que pode produzir um outro anticorpo humano ou anticorpo de animal não humano (por exemplo, anticorpo de camundongo) contra o CD179b humano, e o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma é recuperado, e em seguida, é julgado se este é ou não é um anticorpo de interesse usando os índices de sua afinidade imunológica e citotoxicidade para o CD179b humano. Com isto, um hibridoma produtor de anticorpo monoclonal de interesse é identificado, e o DNA de codificação das regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo de interesse são preparados a partir do hibridoma, conforme descrito acima, seguido pela determinação das sequências dos DNAs, e, em seguida, o DNA é utilizado para a preparação do outro anticorpo.

[0104] Além disso, os anticorpos da presente invenção mencionados acima podem possuir substituição, deleção e/ou adição de um ou vários (de preferência, 1 ou 2) aminoácidos(s), especialmente em uma sequência da região de arcabouço e/ou sequência(s) da(s) região(ões) constante em cada um dos anticorpos de (i) a (iv) acima, contanto que o anticorpo tenha uma especificidade que permita o reconhecimento específico da CD179b. Aqui, o termo "diversas" significa de 2 a 5, e preferencialmente 2 ou 3.

[0105] A presente invenção também fornece um DNA codificador dos anticorpos acima da presente invenção, uma DNA codificador da cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo acima ou um DNA codificador da região variável da cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo acima. Exemplos de tais DNA incluem: DNAs codificadores das regiões variáveis da cadeia pesada possuindo as sequências de base que codificam as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102; DNAs codificadores das regiões variáveis da cadeia leve possuindo as sequências de base que codificam as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108; e similares.

[0106] Uma vez que as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) codificadas pelo DNA possuindo estas sequências são regiões que determinam a especificidade do anticorpo, as sequências que codificam as outras regiões do anticorpo (ou seja, as regiões constantes e regiões de arcabouço), podem ser aquelas derivadas de outro anticorpo. Na presente invenção, embora o outro anticorpo inclua anticorpos derivados de organismos não humanos, ele é preferencialmente derivado de humanos, visando a redução dos efeitos colaterais. Ou seja, no DNA descrito acima, as regiões de codificação das respectivas regiões do arcabouço (framework) e regiões constantes da cadeia pesada e cadeia leve, possuem, preferencialmente, as sequências de base que codificam as sequências de aminoácidos correspondentes provenientes de um anticorpo humano.

[0107] Outros exemplos de DNA de codificação do anticorpo da presente invenção inclui o DNA codificador da região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 e DNAs na qual a codificação de região variável da cadeia leve possui uma sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109. Na presente invenção, os exemplos da sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 inclui a sequência de base exibida na SEQ ID No: 110. Adicionalmente, exemplos da sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109 inclui a sequência de base exibida na SEQ ID No: 111. Dentre estes DNAs, são preferidos os que compreendem a região de codificação da região constante de cada uma das cadeias pesadas e leves, possuindo uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácido correspondente derivada de um anticorpo humano.

[0108] O DNA da presente invenção pode ser obtido, por exemplo, pelo método acima ou pelo seguinte método. Em primeiro lugar, a partir de um hibridoma relacionado ao anticorpo da presente invenção, o RNA total é preparado usando um kit de extração de RNA comercialmente disponível, o DNA e é sintetizado por uma transcriptase reversa com primers aleatórios ou similares. Posteriormente, pelo método de PCR usando como primers de oligonucleotídeos possuindo sequências conservadas da região variável de cada gene da cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo de camundongo conhecido, os cDNAs codificadores dos anticorpos são amplificados. A sequência de codificação de cada região constante pode ser obtida por amplificação de uma sequência conhecida pelo método de PCR. As sequências de bases dos DNAs podem ser determinadas por um método convencional, por exemplo, incorporando as sequências em plasmídeos ou fagos para a determinação da sequência.

[0109] O efeito antitumoral do anticorpo anti-CD179b utilizado na presente invenção contra as células de câncer que expressam CD179b é considerado como sendo causado pelo seguinte mecanismo.

[0110] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) por células efetoras contra células que expressam CD179b, e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra as células que expressam CD179b.

[0111] Desse modo, a avaliação da atividade do anticorpo anti- CD179b utilizado na presente invenção pode ser realizada, conforme especificamente indicado nos exemplos abaixo, mensura a atividade ADCC e atividade de CDC descritas acima contra as células cancerosas que expressam CD179b in vitro.

[0112] Uma vez que o anticorpo anti-CD179b utilizado na presente invenção se liga a uma proteína CD179b nas células de câncer e apresenta uma ação antitumoral, devido às atividades descritas acima, o anticorpo é considerada eficaz para a terapia e/ou profilaxia do câncer. Ou seja, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para a terapia e/ou profilaxia do câncer compreendendo como componente eficaz um anticorpo anti-CD179b. Nos casos em que o anticorpo anti-CD179b é utilizado para os propósitos de administração em um corpo humano (terapia de anticorpos), o anticorpo é preferivelmente preparado como um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, a fim de reduzir sua imunogenicidade.

[0113] A maior afinidade de ligação do anticorpo anti-CD179b com a proteína CD179b na superfície das células cancerosas provoca uma forte atividade antitumoral pelo anticorpo anti-CD179b. Assim, se um anticorpo anti- CD179b possui uma maior afinidade de ligação com a proteína CD179b pode ser obtido, um efeito antitumoral maior pode ser esperado e, portanto, o anticorpo pode ser utilizado como uma composição farmacêutica para a finalidade de tratamento e/ou profilaxia do câncer. Em termos de maior afinidade, a constante de afinidade Ka (Kon/Koff) é de preferência, de pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5x108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5x109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5x1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5x1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1, como mencionado anteriormente. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[0114] O alvo da composição farmacêutica da presente invenção para a terapia e/ou profilaxia do câncer não é restrita, contanto que este seja um câncer (células) que expressam o gene CD179b e, de preferência, um câncer (células) selecionado a partir do grupo que consiste de leucemia, linfoma e câncer de mama, incluindo também o câncer das glândulas mamárias, câncer da glândula mamária combinado, tumor maligno misto de glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal, mastocitoma, leucemia linfocítica crônica, linfoma gastrointestinal, linfoma de órgãos digestivos e linfoma de pequenas/médias células.

[0115] Além disso, o anticorpo ou fragmento do mesmo utilizado na presente invenção pode ser usado para a terapia e/ou profilaxia dos cânceres descritos acima.

[0116] Quando o anticorpo utilizado na presente invenção é utilizado como uma composição farmacêutica, ele pode ser formulado por um método conhecido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, pode ser utilizado por via parenteral, sob a forma de uma solução injetável que contém uma solução ou suspensão estéril preparada com outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição pode ser usada em combinação com veículo(s) farmaceuticamente aceitável(eis) e ou meio, tal como água destilada, soro fisiológico, óleo vegetal, emulsionante, estabilizante de suspensão, agente tensoativo, agente aromatizante, excipiente, veículo, anti-séptico e/ou ligante, ao(s) qual(is) é(são) misturado(s) na forma de uma dose unitária necessária para a realização da formulação, que é geralmente aceita. A quantidade do componente eficaz na formulação é determinada de tal forma que um volume adequado é obtido dentro do intervalo estabelecido.

[0117] A composição estéril para injeção pode ser prescrita utilizando um veículo, tais como água destilada para injeção, de acordo com um método convencional de formulação.

[0118] Exemplos da solução aquosa incluem soluções isotônicas contendo soro fisiológico, glicose e/ou adjunto(s), como o D-sorbitol, D-manose, D-manitol e/ou cloreto de sódio, que pode ser usado em combinação com solubilizante(s) adequado(s), tal como álcool, etanol, e especificamente; poliálcool, como propileno glicol, polietileno glicol; tensoativo não iônico, como polissorbato-80®, e/ou HCO-60.

[0119] Exemplos de líquido oleosos incluem os óleos de gergelim e óleo de soja, que podem ser usados em combinação com benzoato de benzila ou álcool benzílico como solubilizante. Além disso, também podem ser misturados agentes de tamponamento, como tampão fosfato ou tampão de acetato de sódio, agentes suavizantes como o cloridrato de procaína, e/ou estabilizante, como álcool benzílico, fenol, ou antioxidantes. A solução injetável preparadas é geralmente preenchido em uma ampola adequada.

[0120] A administração é realizada por via oral ou parenteral, preferencialmente por via parenteral, e exemplos específicos destas incluem o tipo de solução injetável, administração nasal, administração pulmonar e administração percutânea. Exemplos do tipo de solução injetável incluem injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e subcutânea, através da qual a solução injetável pode ser administrada sistemicamente ou topicamente.

[0121] Além disso, o método de administração pode ser selecionado adequadamente, dependendo da idade, sintomas, sexo e outras características similares do paciente. A dose da composição farmacêutica contendo o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser selecionada dentro de um intervalo de, por exemplo, 0,0001 mg a 1.000 mg por 1 kg de peso corporal por um tempo. Alternativamente, a dose pode ser selecionada dentro da faixa de 0,001 a 100000 mg/corpo por paciente, mas a dose não está restrita a esses valores. A dosagem e o método de administração variam de acordo com o peso corporal, idade, sintomas e outras características do paciente, e os técnicos no assunto podem selecioná-las adequadamente. POLIPEPTÍDEO E DNA

[0122] A presente invenção também fornece os seguintes polipeptídeos ou DNAs relacionados com o anticorpo acima. (i) Um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105; e um DNA que codifica o polipeptídeo. (ii) Um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109; e um DNA que codifica o polipeptídeo. (iii) um DNA possuindo a sequência de bases exibida na SEQ ID No: 110. (iv) um DNA possuindo a sequência de bases exibida na SEQ ID No: 111. (v) Um polipeptídio da CDR de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102, ou um DNA de codificação do polipeptídeo. (vi) Um polipeptídio da CDR de cadeia leve selecionado a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108, ou um DNA de codificação do polipeptídeo.

[0123] Estes polipeptídeos e DNAs podem ser preparados utilizando a técnica de recombinação genética, conforme descrito acima. EXEMPLOS

[0124] A presente invenção será agora concretamente descrita por meio de exemplos, mas o escopo da presente invenção não é limitado por estes exemplos específicos. EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE UM NOVO ANTÍGENO PARA O CÂNCER PELO MÉTODO SEREX (1) Preparação de uma biblioteca de cDNA

[0125] A partir de um tecido canceroso de glândula mamária de cão removido por cirurgia, o RNA total foi extraído pelo método ácido guanídico- Fenol-Clorofórmio, e o RNA poli(A) foi purificado utilizando o kit de purificação “Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit” (fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.) seguindo o protocolo descrito no manual de instruções anexo a este.

[0126] Usando o RNA assim obtido (5 μg), uma biblioteca de fago cDNA derivada do câncer de glândula mamária canina foi sintetizada. Para a preparação da biblioteca de fago cDNA, os kits de síntese “cDNA Synthesis Kit”, “ZAP-cDNA Synthesis Kit” e “ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit” (fabricado pela Stratagene) foram utilizados de acordo com os protocolos descritos no manual de instruções dos fabricantes. O tamanho da biblioteca de fago cDNA preparada foi de 2,99 x 105 pfu/ml. (2) Seleção da Biblioteca de cDNA pelo Soro

[0127] Usando a biblioteca de fago cDNA derivada do câncer de glândula mamária canina preparados conforme descrito acima, uma imunoseleção foi realizada. Mais especificamente, hospedeiros E. coli (XL1-Blue MRF) foram infectados com a biblioteca de forma que 2340 clones foram incluídos em uma placa de agarose Φ90 * 15 mm NZY, seguido pelo cultivo a 42 °C por 3 a 4 horas para permitir a formação de placas. A placa foi coberta com uma membrana de nitrocelulose (Hybond C Extra, fabricada pela GE Healthcare Bio-Science) impregnada com IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosida) a 37 °C por 4 horas, para permitir a indução e expressão de proteínas, e dessa forma transferir as proteínas para a membrana. Posteriormente, a membrana foi recuperada e embebida em TBS (10 mM de Tris-HCl; 150 mM de NaCl pH 7,5) suplementado com 0,5% de leite desnatado liofilizado, seguido pela agitação a 4 °C durante a noite para suprimir reações inespecíficas. Este filtro foi deixado reagir com o soro do cão diluído 500 vezes em temperatura ambiente por 2 a 3 horas.

[0128] Como o soro canino descrito anteriormente, um total de 3 amostras de soro foram utilizadas, que foram coletadas de cada um dos cães a partir dos quais o câncer da glândula mamária acima foi retirado e outro cão com câncer da glândula mamária. Estas amostras foram armazenadas a -80 °C e pré- tratadas imediatamente antes do uso. O pré-tratamento dos soros foi realizado pelo seguinte método. Hospedeiros E. coli (XL1-Blue MRF) foram infectados com o fago de expressão À ZAP, de modo que nenhum gene exógeno foi inserido, e cultivados em uma placa NZY a 37 °C durante a noite. Posteriormente, 0,2 M de tampão NaHCO3 (pH 8,3) contendo 0,5 M de NaCl foi adicionado à placa, e a placa foi deixada em repouso a 4 °C por 15 horas, seguido pela recuperação do sobrenadante como um extrato de E. coli/fago. Posteriormente, o extrato de E. coli/fago recuperado foi passado através de uma coluna NHS (fabricada pela GE Healthcare Bio-Science) para imobilizar as proteínas derivadas da E. coli/fago. O soro do cão foi passado por esta coluna de proteína imobilizada e foi permitida a reação com as proteínas, a fim de eliminar os anticorpos que adsorvem a E. coli e fagos do soro. A fração de soro passada através da coluna que não foi adsorvida foi diluída 500 vezes com TBS, suplementada com 0,5% de leite desnatado liofilizado, e a diluição resultante foi usada como um material para a imunoseleção.

[0129] A membrana, no qual o soro tratado e as proteínas de fusão descritas acima foram submetidas ao blotting, foi lavada com TBS-T (0,05% Tween-20/TBS) 4 vezes, e um anticorpo de cabra anti-IgG de cão (cabra anti- IgG de cão h+I conjugado com HRP; fabricado pela BETHYL Laboratories, Inc.), que foi diluído 5000 vezes com TBS, suplementado com 0,5% de leite desnatado liofilizado foi deixado reagir, como anticorpo secundário, em temperatura ambiente por uma hora. A detecção foi feita por uma reação enzimática de coloração utilizando a solução de reação NBT/BCIP (fabricado pela Roche), e as colônias cujas posições foram idênticas aos sítios positivos da reação de coloração foram coletados a partir da placa de agarose Φ90 * 15mm NZY, e dissolvidas em 500 μl de tampão SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01% de gelatina, pH 7,5). A segunda e terceira sessões de seleção foram realizadas pela repetição do mesmo método descrito acima, até que as colônias positivas na reação de coloração tornaram-se colônias individuais, isolando 45 clones positivos após a triagem de 92.820 clones fagos reativos ao IgG no soro. PESQUISA DE HOMOLOGIA DOS GENES DO ANTÍGENO ISOLADO

[0130] Para submeter os 45 clones positivos isolados pelo método acima a uma análise de sequência, uma operação para converter o vetor fago em um vetor plasmidial foi realizada. Mais precisamente, 200 μL de uma solução preparada de modo que o hospedeiro E. coli (XL1-Blue MRF) foi contido em uma absorbância OD600 de 1,0, 250 μL da solução de fagos purificada e 1 μl de “ExAssist helper phage” (fabricado pela Stratagene) foram misturados, e a mistura resultante foi deixada reagir a 37 °C por 15 minutos, seguido pela adição de 3 ml de caldo LB e cultivando o resultante a 37 °C por 2,5 a 3 horas. Isto foi imediatamente seguido por 20 minutos de incubação em banho-maria a 70 °C e centrifugação a 1000 x g por 15 m inutos, após o qual o sobrenadante foi coletado como uma solução de fagomídeo. Em seguida, 200 μL de uma solução preparada de modo que o fagomídeo em E. coli hospedeiro (SOLR) foi contido a uma absorbância a OD600 de 1,0; e 10 μL de solução de fagomídeo purificada foi misturada, e a mistura resultante foi deixada reagir a 37 °C por 15 minutos, seguido por plaqueamento em uma alíquota de 50 μl da solução resultante em ágar LB suplementado com ampicilina (50 μg/ml de concentração final) e cultivada a 37 °C durante a noite. As colônias únicas das SOLR transformadas foram selecionadas e cultivadas em LB suplementado com ampicilina (50 μg/ml de concentração final), a 37 °C, seguido pela purificação de DNAs plasmidiais possuindo inserções de interesse usando o kit “QIAGEN plasmid Miniprep Kit” (fabricado pela QIAGEN).

[0131] Cada plasmídeo purificado foi submetido à análise do comprimento total da sequência do segmento inserido pelo método de “primer walking” usando o primer T3 exibido na SEQ ID No: 94 e primer T7 exibido na SEQ ID No: 95. Por esta análise da sequência, as sequências gênicas mostradas nos mesmos números de IDs das SEQ ID Nos: 4 a 92 foram obtidas. Usando a sequência de bases e as sequências de aminoácidos (IDs de número ímpar da SEQ ID Nos: 5 a 93) desses genes, pesquisas da homologia contra genes conhecidos foram realizadas usando o programa de busca de homologia BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), e, como resultado, foi revelado que todos os 45 genes obtidos eram codificadores da CD179b. A homologia entre os 45 genes foram de 94 a 99% em termos de sequências de bases e 96 a 99% em termos de sequências de aminoácidos. As homologias entre os ditos genes e o gene que codifica um fator homólogo humano foi de 62 a 82% em termos de sequências de bases e 69 a 80% em termos de sequências de aminoácidos, na região traduzida para uma proteína. A sequência de base do fator homólogo humano é exibida na SEQ ID No: 1, e as sequências de aminoácidos do fator homólogo humano são exibidas nas SEQ ID Nos: 2 e 3. (4) Análise da expressão gênica em cada tecido

[0132] As expressões gênicas obtidas pelo método descrito acima em tecidos de cão e humanos normais e de diferentes linhagens celulares foram investigadas por RT-PCR (PCR-transcrição reversa). A reação de transcrição reversa foi realizada da seguinte forma. A partir de 50 a 100 mg de cada tecido ou 5-10 x 106 células de cada linhagem celular, o RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (fabricado pela Invitrogen) de acordo com o protocolo descrito no manual de instruções anexo. Usando este RNA total, o cDNA foi sintetizado pelo sistema “Superscript First-Strand Synthesis System” para RT-PCR (fabricado pela Invitrogen) de acordo com o protocolo descrito no manual de instruções anexo do produto. Foram utilizados como cDNAs de tecidos humanos normais (cérebro, o hipocampo, testículos, cólon e placenta), Gene Pool cDNA (fabricado pela Invitrogen), Quick-clone de cDNA (fabricado pela CLONETECH) e biblioteca de cDNA de grande inserção “Large-Insert cDNA Library” (fabricado pela CLONETECH). A reação de PCR foi realizada da seguinte forma, utilizando os primers específicos para os genes obtidos do cão (conforme exibido na SEQ ID Nos: 96 e 97) e os seus genes homólogos aos de humanos (conforme exibido na SEQ ID Nos: 98 e 99). Ou seja, os reagentes e um tampão anexo foram misturados de tal forma que as concentrações/quantidades de 0,25 μl de uma amostra preparada pela reação de transcrição reversa, 2 μM de cada um dos primers acima, 0,2 μM de cada um dos dNTPs e 0,65 U de polimerase ExTaq (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) alcançaram um volume total de 25 μL de solução, e a reação foi realizada através da repetição de 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos e 72 °C por 30 segundos, utilizando um termociclador (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.). Os primers descritos acima específicos para genes possuindo a sequência de base exibida na SEQ ID Nos: 96 e 97 foram para a amplificação das posições 32 a 341 na sequência de base mostrada na SEQ ID No: 4, e para a amplificação da região comum de todos os genes da CD179b do cão mostrado o mesmo número de IDs das SEQ ID Nos: 4 a 92. Além disso, os primers específicos para genes com as sequências de base mostrada nas SEQ ID Nos: 98 e 99 foram para a amplificação das posições 216 a 738 da sequência de base mostrada na SEQ ID No: 1. Como controle para comparação, primers específicos para a GAPDH (exibida na SEQ ID Nos: 100 e 101) foram utilizados ao mesmo tempo. Como resultado, conforme mostrado na figura. 1, os genes de cães obtidos não apresentaram expressão em tecidos normais de cães, mas mostraram forte expressão em tecidos de câncer de mama de cão. Em termos de expressão do gene homólogo humano, a medula óssea foi o único tecido humano normal, onde a sua expressão foi confirmada, mas, em células cancerosas humanas, sua expressão foi detectada em linhagens de células de leucemia e linhagens de células de câncer de mama, de modo que a expressão específica da CD179b em linhagens de células de leucemia e linhagens de células de câncer de mama foi confirmado.

[0133] Na fig. 1, referência numeral 1, em ordenada representa o padrão de expressão do gene identificado acima, e a referência numeral 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH como controle para a comparação. (5) Análise da expressão da proteína antigênica em células de câncer

[0134] Em seguida, cada linhagem celular de câncer em que a expressão do gene CD179b foi confirmada, foi investigada para saber se a proteína CD179b é ou não expressa na superfície das células. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, 106 células de cada linhagem de células de câncer humano para o qual a expressão do gene foi observada foram colocadas, e o tubo foi então centrifugado. Para este tubo, 5 μl de anticorpo camundongo anti- CD179b humano (nome do clone: GA170, fabricado pela Santa Cruz Biotechnology) foi adicionado, e a solução resultante foi suspensa em 95 μL de PBS suplementado com soro bovino fetal, 0,1%, em seguida a suspensão resultante foi deixada em gelo por 1 hora. Após a lavagem das células com PBS, as células foram suspensas em 5 μL de anticorpo monoclonal de coelho anti- IgG2a de camundongo marcado com FITC (fabricado pela BD PharMingen) e 95 μL de PBS suplementado com 0,1% de soro fetal bovino, e deixadas em repouso no gelo por 1 hora. Depois da lavagem das células com PBS, a intensidade de fluorescência foi mensurada por FACSCalibur fabricado pela Beckton Dickinson. Por outro lado, a mesma operação, como descrito acima, foi realizada para preparar as células como um controle, usando o controle de isotipo camundongo IgG2a (fabricado pela MBL) em vez do anticorpo camundongo anti-CD179b humano. Como resultado, as células nos quais o anticorpo anti-CD179b humano foi adicionado apresentaram uma intensidade de fluorescência pelo menos 10% maior que a do controle e, portanto, foi confirmado que a proteína CD179b é expressa na superfície da membrana celular da linhagem celular de câncer humano descrita acima. EXEMPLO 2 EFEITO ANTITUMORAL, CONTRA CÉLULAS CANCEROSAS, DO ANTICORPO CONTRA CD179B (1) A atividade ADCC

[0135] Posteriormente, foi estudado se os anticorpos contra CD179b podem ou não danificar as células de tumor que expressam CD179b. A avaliação foi realizada utilizando um anticorpo comercialmente disponíveis de camundongo contra a CD179b humana (nome do clone: GA170). Em tubo de centrífuga de 50 μL, 106 células pertencentes a cada um dos três tipos de células de leucemia humana, Namalwa, BDCM e RPMI1788 (todas foram adquiridas da ATCC), cuja expressão da CD179b foi confirmada no Exemplo 1 (5), foram coletadas, e 100 μCi de cromo 51 foi adicionado ao tubo, seguido pela incubação a 37 °C por 2 horas. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com meio RPMI suplementado com soro bovino fetal a 10%, e colocadas em uma placa de 96 poços com fundo em V, em uma quantidade de 103 células / poço. Para cada poço, 1 μg de GA170 foi adicionado, e 2 x 105 linfócitos separados do baço de camundongos foram acrescentados a este, seguido pelo cultivo nas condições de 37 °C, 5% de CO2 por 4 horas. Posteriormente, a quantidade de cromo 51 no sobrenadante de cultura liberado a partir de células tumorais danificadas foi mensurado, e a atividade ADCC pelo GA170 contra cada tipo de células cancerosas foi calculada. Como resultado, as atividades de ADCC de 32,6%, 32,3% e 28,3% foram confirmadas para Namalwa, BDCM e RPMI1788, respectivamente. Por outro lado, quando um controle isotípico (clone: 6H3) do GA170 foi utilizado para a mesma operação, a atividade acima não foi detectada. Assim, foi revelado que, pela atividade ADCC induzida pelo uso de um anticorpo contra CD179b, as células tumorais que expressam CD179b podem ser danificadas.

[0136] A atividade citotóxica foi obtida como resultado de um processo em que o anticorpo contra CD179b utilizado na presente invenção, linfócitos de camundongo, e 103 células de cada linhagem de células de leucemia foram misturados, seguido pelo cultivo das células por 4 horas, mensurando a quantidade de cromo 51 liberada no meio após o cultivo, e calculando a atividade citotóxica contra linhagem de células de leucemia, seguindo a equação de cálculo*. * Equação: atividade citotóxica (%) = a quantidade de cromo 51 liberado a partir da Namalwa, BDCM ou RPMI1788 com a adição do anticorpo contra CD179b e linfócitos de camundongos / quantidade de cromo 51 liberado a partir das células alvo com a adição de ácido clorídrico 1N x 100. (2) A atividade CDC

[0137] O sangue coletado de um coelho foi colocado em um tubo Eppendorf, e deixado em repouso à temperatura ambiente por 60 minutos, em seguida, foi centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos para preparar soro para a medição da atividade CDC. Em tubo de centrífuga de 50 ml, 106 células pertencentes a cada um dos três tipos de células de leucemia humana, Namalwa, BDCM e RPMI1788 foram coletadas e 100 μCi de cromo 51 foi adicionado ao tubo, seguido pela incubação a 37 °C por 2 horas e as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI suplementado com soro bovino fetal a 10%. Posteriormente, as células foram suspensas em RPMI contendo o soro de coelho conforme preparado anteriormente, em uma quantidade de 50%, e colocado em uma placa de 96 poços com fundo em V, na quantidade de 103 células/poço. Para cada poço, 1 μg de GA170 foi adicionado, seguido pela cultura nas condições de 37 °C, 5% de CO2 por 4 horas. Posteriormente, a quantidade de cromo 51 no sobrenadante de cultura liberado a partir de células tumorais danificadas foi mensurada, e a atividade CDC pelo GA170 contra cada tipo de células cancerosas foi calculada. Como resultado, as atividades de CDC de 30,5%, 21,2% e 30,5% foram confirmadas para Namalwa, BDCM e RPMI1788, respectivamente. Por outro lado, quando um controle isotípico (clone: 6H3) do GA170 foi utilizado para a mesma operação, a atividade acima não foi detectada. Assim, foi revelado que, pela atividade CDC induzida pelo uso de um anticorpo contra CD179b, as células tumorais que expressam CD179b podem ser danificadas.

[0138] A atividade citotóxica foi obtida, como no item (1) acima, como resultado do cálculo da atividade citotóxica contra cada linhagem celular de leucemia, segundo a equação de cálculo*. * Equação: atividade citotóxica (%) = a quantidade de cromo 51 liberado a partir da Namalwa, BDCM ou RPMI1788 com a adição do anticorpo contra CD179b e soro de coelho / quantidade de cromo 51 liberado a partir das células alvo com a adição de ácido clorídrico 1N x 100. EXEMPLO 3 “PREPARAÇÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL” (1) Preparação de uma Proteína Antígeno

[0139] A proteína CD179b humana foi preparado pelo método de lipofecção de células animais. O gene humano CD179b (SEQ ID No: 22) foi introduzido em um vetor que codifica a região IgG1Fc humana, o vetor SRaIgG1Fc, através de sítios de restrição XhoI e BamHI. O vetor é um vetor SRaIgG1Fc elaborado pela introdução do gene para a região IgG1Fc humana em um vetor pcDL-SRa296 (fabricado pela DNAX). Posteriormente, 24 μg do plasmídeo foram misturados com 60 L de Lipofectamine 2000 (fabricado pela Invitrogen); e OPTI-MEM (fabricado pela Invitrogen) foi adicionado à mistura resultante para atingir um volume total de 3 ml, em seguida, a mistura foi deixada repousar em temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. Para as células CHO-K1 preparadas anteriormente para 2 x 106 células/12 ml de OPTI-MEM, 3 ml da mistura da solução mencionada acima de plasmídeo foi adicionada, seguido por 8 horas de cultivo em condições de 37 °C e 5% de CO2. O meio foi substituído com 10 ml de meio de CHO-S-SFM (fabricado pela Invitrogen), e o cultivo foi então conduzido por 4 a 5 dias. A purificação da proteína antígeno produzida no sobrenadante obtido da cultura foi realizada utilizando a ProteínaA Sepharose HP (fabricada pela GE Healthcare). A ProteínaA Sepharose HP foi suficientemente equilibrada com 20 mM de tampão fosfato (pH 7,4)/0,15 M de NaCl (tampão de equilíbrio/tampão de lavagem), e uma solução preparada pela mistura do sobrenadante da cultura com o tampão de equilíbrio na proporção de 1:1 foi introduzida a este. Posteriormente, a coluna foi lavada suficientemente com a solução de lavagem e a eluição foi realizada com tampão glicina 0,2 M (pH 2,5). A solução eluída foi neutralizada pela adição de 1 M de Tris (pH 9), e o tampão foi trocado por ultrafiltração, utilizando 20 mM de tampão fosfato (pH 7,4)/0,15 M de NaCl, para preparar a proteína CD179b humana. (2) Obtenção de Hibridomas

[0140] Com uma quantidade igual do adjuvante MPL+TDM (fabricado pela Sigma), 100 μg de proteína antígeno (proteína CD179b humana), preparada em (1) foi misturada, para preparar uma solução de antígeno para cada camundongo. A solução do antígeno foi administrada por via intraperitoneal a um camundongo Balb/c (Japão SLC, Inc.), de 6 semanas de idade, e mais 3 administrações foram realizadas em intervalos de uma semana, completando assim a imunização. O baço retirado 3 dias após a última imunização foi colocado entre duas lâminas de vidros estéreis e triturado, seguido por 3 repetições de operações no qual as células foram lavadas com PBS(-) (fabricado pela Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos para remover o sobrenadante, obtendo-se desse modo células do baço. As células obtidas do baço e células de mieloma de camundongo SP2/0 (adquiridas da ATCC) foram misturadas em uma proporção de 10:1, e uma solução de PEG aquecida a 37 °C preparada misturando 200 μL de meio RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal e 800 μl de PEG1500 (fabricada pela Boehringer) juntos foram adicionadas à mistura resultante, em seguida, a mistura foi deixada em repouso por 5 minutos, realizando assim a fusão celular. O sobrenadante foi removido por 5 minutos de centrifugação a 1700 rpm, e as células foram suspensas em 150 ml de meio RPMI1640 (meio de seleção HAT), suplementado com soro bovino fetal a 15%, ai qual o equivalente a 2% da solução HAT fabricada pela Gibco foi adicionado. Em cada poço de 15 placas de 96 poços (fabricadas pela Nunc), 100 μL da suspensão celular foi semeada. As células foram cultivadas por 7 dias em ambiente de 37 °C, 5% de CO2, para a obtenção de hibridomas produzidos pela fusão das células do baço com as células de mieloma. (3) Seleção dos Hibridomas

[0141] Os hibridomas foram selecionados utilizando como índices as afinidades de ligação contra a proteína CD179b humana, dos anticorpos produzidos pelos hibridomas preparados. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 100 μL de uma solução de 1 μg/ml de proteína CD179b humana, preparada no item (1) acima, foi colocado, e a solução foi deixada em repouso a 4 °C por 18 horas. Cada poço foi lavado com PBS-T por 3 vezes, e 400 μL de solução BSA 0,5% (albumina de Soro bovino) (fabricada pela Sigma) foi adicionado a cada poço, em seguida, a placa ficou em temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi removida e os poços foram lavados por 3 vezes com 400 μl/poço de PBS-T, seguido pela adição de 100 μL/poço de sobrenadante da cultura de cada um dos hibridomas obtidos no item (2) acima, e deixando a placa em temperatura ambiente por 2 horas. Após três etapas de lavagem com PBS- T, 100 μL de um anticorpo anti-IgG de camundongo marcado com HRP (H+L) (fabricado pela Invitrogen) diluído 5.000 vezes com PBS foi adicionado a cada poço, e a placa foi deixada em repouso em temperatura ambiente por uma hora. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS-T e 100 μL de solução de substrato TMB (fabricado pela Thermo) foram adicionadas a cada poço, em seguida, a placa foi deixada em repouso por 15 a 30 minutos para realizar a reação de coloração. Após a reação de coloração, 100 μL de ácido sulfúrico 1 N foi adicionado a cada poço para parar a reação, e a absorbância de 450 nm a 595 nm foi mensurada usando um espectrômetro de absorção. Como resultado, hibridomas que produzem os anticorpos exibindo absorbâncias maiores foram selecionados.

[0142] Os hibridomas selecionados foram colocados em uma placa de 96 poços de tal forma que cada poço contivesse 0,5 células, e cultivados. Após uma semana, foram observados hibridomas formando colônias únicas nos poços. As células destes poços foram cultivadas para obtenção de 60 linhagens de células clonadas de hibridoma.

[0143] Posteriormente, uma linhagem de células de hibridoma foi selecionada por meio de índices de afinidades de ligação dos anticorpos produzidos pelas 60 linhagens de células de hibridoma acima, contra células de leucemia. Em cada poço de uma placa de 96 poços, foi colocado 100 μl de uma solução de 1 mg/ml de poli-L-lisina (fabricado pela Sigma)-PBS, e a placa foi deixada em repouso em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a remoção da solução de poli-L-lisina-PBS, uma operação de preenchimento de água destilada estéril em cada poço e descarte desta foi repetida por três vezes, seguido de secagem da placa em uma bancada limpa. A Namalwa, uma linhagem de células de leucemia humana para o qual a expressão da CD179b foi confirmada, foi suspensa em PBS(-) de modo que uma densidade de 106 células / ml fosse atingida, e 100 μL da suspensão resultante foi adicionado em cada poço da placa acima, em seguida, a placa foi deixada em temperatura ambiente por 15 minutos. Após centrifugação a 1700 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi removido, e 100 μL de uma solução de glutaraldeído 0,05% (fabricado pela Sigma) - PBS foi adicionada a cada poço, em seguida, a placa foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos. Cada poço foi lavado com PBS-T por 3 vezes, e 300 μL da solução de BSA 0,5% foi adicionada a cada poço, em seguida, a placa foi deixada à 4 °C por 18 horas. Depois a lavagem dos poços por 3 vezes com PBS-T, 100 μL do sobrenadante da cultura de cada uma das 60 linhagens de células de hibridoma obtidas acima foi adicionado ao poço, e a placa foi deixada à temperatura ambiente por 2 horas. O sobrenadante foi removido e as placas foram lavadas por 3 vezes com PBS-T, seguido pela adição de 100 μL de um anticorpo anti-IgG de camundongo marcado com HRP (H+L) diluído 5.000 vezes com PBS cada poço, e a placa foi deixada sobre a bancada em temperatura ambiente por 1 hora. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS-T e 100 μL da solução de substrato TMB (fabricado pela Thermo) foram adicionados a cada poço, em seguida, a placa foi deixada em repouso por 30 minutos para a realização da reação de coloração. Após a reação de coloração, 100 μL de ácido sulfúrico 1 N foi adicionado a cada poço para parar a reação, e a absorbância de 450 nm a 595 nm foi mensurada usando um espectrômetro de absorção. Como resultado, a linhagem de células de hibridoma #8 que produz o anticorpo exibindo a absorbância mais alta foi selecionada.

[0144] O isotipo do anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 produzido pela linhagem de células de hibridoma #8 selecionado conforme descrito acima, foi determinado pelo método ELISA. O sobrenadante do cultivo da linhagem de células de hibridoma #8 foi avaliada com o kit de sub- genotipagem (COSMO BIO Co., Ltd.), de acordo com protocolo descrito no manual de instruções anexo do kit, e, como resultado, o anticorpo monoclonal anti-CD179b revelou ser IgG3. EXEMPLO 4 O EFEITO ANTITUMORAL DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD1 79B #8 (1) Preparação do Anticorpo Monoclonal Anti-CD179b #8

[0145] A linhagem de células de hibridoma #8 foi cultivada em SFM Hibridoma (fabricada pela Invitrogen). O fluido da cultura foi centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos, e passado através de um sistema de filtro de 0,22 μM. Para a purificação do anticorpo, uma coluna de proteína A Sepharose Hitrap FF (fabricados pela GE Healthcare) foi usada. A coluna foi lavada com PBS para atingir o equilíbrio. Posteriormente, o sobrenadante da cultura foi introduzido na coluna, seguido pela lavagem da coluna com PBS. A eluição foi realizada com 0,1 M de Glicina-HCl (pH 2,5) para a obtenção de um anticorpo purificado. O EFEITO ANTITUMORAL IN VITRO (EM CÉLULAS) A ATIVIDADE ADCC

[0146] Foi estudado se o anticorpo monoclonal anti-CD179b # 8 pode danificar as células de tumor que expressam a CD179b humana. Células de leucemia humana Namalwa, nas quais a expressão da CD179b humana foi confirmada, foram coletadas em um tubo de centrífuga de 50 ml, na quantidade de 106 células, e 10 μCi de cromo 51 foi adicionada ao tubo, seguido pela incubação a 37 °C por 2 horas. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com meio RPMI suplementado com soro bovino fetal a 10%, e colocadas em uma placa de 96 poços com fundo em V, em uma quantidade de 103 células / poço. Para cada poço, 1 μg de anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 foi adicionado, e 2 x 105 linfócitos separados do baço de camundongos foram acrescentados a este, seguido pelo cultivo nas condições de 37 °C, 5% de CO2 por 4 horas. Posteriormente, a quantidade de cromo 51 no sobrenadante de cultura liberado a partir de células tumorais danificadas foi mensurada, e a atividade ADCC pelo anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 contra as células Namalwa foi calculada. Como resultado, uma atividade ADCC de 60,6% foi confirmada para as células Namalwa em cada poço. Por outro lado, quando um controle isotípico (clone: ME07) foi utilizado em uma operação similar, a atividade acima não foi detectada. Assim, foi revelado que o anticorpo monoclonal anti- CD179 #8 pode danificar as células tumorais que expressam CD179b, por meio da sua atividade ADCC. A ATIVIDADE CDC

[0147] O sangue coletado de um coelho foi colocado em um tubo Eppendorf, e deixado em repouso à temperatura ambiente por 60 minutos, em seguida, foi centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos para preparar soro para a medição da atividade CDC. Em tubo de centrífuga de 50 ml, 106 células Namalwa, que são células de leucemia humana, foram coletadas e 100 μCi de cromo 51 foi adicionado ao tubo, seguido pela incubação a 37 °C por 2 horas e as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI suplementado com soro bovino fetal a 10%. Posteriormente, as células foram suspensas em RPMI contendo o soro de coelho conforme descrito anteriormente, em uma quantidade de 50%, e colocado em uma placa de 96 poços com fundo em V, na quantidade de 103 células/poço. Para cada poço, 2 μg de anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 foram adicionados, seguido pelo cultivo nas condições de 37 °C, 5% de CO2 por 4 horas. Posteriormente, a quantidade de cromo 51 no sobrenadante de cultura liberado a partir de células tumorais danificadas foi mensurada, e a atividade CDC pelo anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 contra as células Namalwa foi calculada. Como resultado, uma atividade CDC de 30,5% foi confirmada para as células Namalwa. Por outro lado, quando um controle isotípico (clone: ME07) foi utilizado em uma operação similar, a atividade acima não foi detectada. Assim, foi revelado que o anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 pode danificar as células tumorais que expressam CD179b, por meio da sua atividade CDC. (3) O efeito antitumoral no corpo vivo de um camundongo

[0148] A atividade antitumoral do anticorpo monoclonal anti- CD179b #8 no corpo vivo de um camundongo com tumor foi avaliada. O anticorpo utilizado foi preparado pela purificação do sobrenadante da cultura da linhagem de células do hibridoma #8 por uma coluna da mesma maneira conforme descrito acima.

[0149] Usando um camundongo portador de tumor ao qual a linhagem de células derivadas de câncer humano expressando CD179b foi transplantada, a atividade antitumoral do anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 foi avaliada. As células Namalwa foram transplantadas subcutaneamente na parte de trás de cada um dos 20 camundongos nude (BALB/c Slc-nu/nu, derivados do Japan SLC, Inc.), em um total de 106 células, e foi permitido que o tumor crescesse até um tamanho de cerca de 7 mm de diâmetro. Entre estes camundongos, cada um dos 10 camundongos portadores de tumor foi submetido a administração de 107 linfócitos separados do sangue periférico de camundongos BALB/c (BALB/c Cr Slc, derivados do Japan SLC, Inc.) e 300 μg de anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 na veia caudal. Posteriormente, a mesma quantidade dos linfócitos de camundongo e anticorpo foram administradas a cada camundongo portador de tumor pela veia caudal em um total de 3 vezes durante dois dias, e o tamanho do tumor foi mensurado a cada dia, avaliando-se, assim, o efeito antitumoral. Por outro lado, para cada um dos 10 camundongos portadores de tumores remanescentes, foi administrado PBS(- ) ao invés do anticorpo acima, para fornecer um grupo controle. Como resultado deste estudo, no grupo em que o anticorpo anti-CD179b foi administrado, o volume do tumor reduziu em 65% no Dia 8 em relação ao volume do tumor no início da administração do anticorpo, que foi definido como 100%. No Dia 11, Dia 17 e Dia 20, o tumor regrediu para 52%, 45% e 35%, respectivamente (vide Fig. 2.). Por outro lado, no grupo controle, no Dia 8, Dia 11, Dia 17 e Dia 20, o tumor cresceu para cerca de 180%, 220%, 350% e 420% (vide Fig. 2.). A partir desses resultados, foi demonstrado que o anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 obtido exerce um forte efeito antitumoral no corpo vivo contra as células cancerosas que expressam CD179b. Em termos de tamanho do tumor, o volume foi calculado utilizando a equação de cálculo: diâmetro maior x diâmetro menorxdiâmetro menor x 0,5. EXEMPLO 5 CLONAGEM DO GENE PARA A REGIÃO VARIÁVEL DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD179B #8

[0150] A partir da linhagem de células de hibridoma #8, o mRNA foi extraído, e os genes para a região variável de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal anti-CD179b #8 foram obtidos pelo método de RT- PCR utilizando primers específicos para uma sequência líder do camundongo e a região constante do anticorpo IgG3. Para a determinação de suas sequências, estes genes foram clonados no vetor pCR2.1 (fabricado pela Invitrogen). (1) RT-PCR

[0151] A partir de 106 células da linhagem de células de hibridoma #8, o mRNA foi preparado usando o kit de purificação de micro mRNA (fabricado pela GE Healthcare) e o mRNA obtido foi submetido a transcrição reversa para a sintetize do cDNA usando o kit “SuperScript II 1st strand synthesis kit” (fabricado pela Invitrogen). Estas operações foram realizadas de acordo com os protocolos descritos nas instruções anexas dos respectivos kits.

[0152] Utilizando o cDNA obtido, os genes dos anticorpos foram amplificados por PCR. Para obter o gene para a região VH, um primer específico para a sequência líder do camundongo (SEQ ID No: 112) e um primer específico para a região constante da IgG3 de camundongo (SEQ ID No: 113) foram utilizados. Além disso, para se obter o gene para a região VL, um primer específico para a sequência líder do camundongo (SEQ ID No: 114) e um primer específico para a região constante da cadeia K do camundongo (SEQ ID No: 115) foram utilizados Estes primers foram desenhados referindo-se a Jones ST e Bending MM Bio/technology 9, 88-89 (1991). Para a PCR, foi utilizada a polimerase Ex Taq (fabricada pela Takara Bio Inc.). Foram adicionados em 5 μL de tampão para Taq 10 x EX Taq Buffer, 4 μL da Mistura de dNTP (2,5 μM), 2 μL de cada um dos primers (1,0 μM) e 0,25 μl de Ex Taq (5 unidades/μL), e uma amostra de cDNA, e água estéril para um volume total de 50 μL. A reação foi realizada sob as condições de 2 minutos de tratamento a 94 °C, seguida de 30 ciclos da combinação de desnaturação a 94 °C por 1 minuto, anelamento a 58 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto. (2) Clonagem

[0153] Usando cada um dos produtos de PCR obtidos conforme descrito acima, a eletroforese foi realizada com gel de agarose, e a banda de DNA correspondente para cada uma das regiões VH e VL foi excisada. Cada fragmento foi processado utilizando o kit de purificação “QIAquick Gel purification kit” (fabricado pela QIAGEN), de acordo com o protocolo descrito no manual de instruções. Cada DNA purificado foi clonado no vetor pCR2.1 utilizando o kit de clonagem TA (fabricado pela Invitrogen). O vetor ao qual o DNA estava ligado foi utilizado para transformação de células competentes DH5a (fabricadas pela TOYOBO), de acordo com o método convencional. Dez clones de cada um dos transformantes foram cultivados em um meio (100 μg/ml de ampicilina) a 37 °C durante a noite, e cada DNA plasmidial foi purificado utilizando o kit “Qiaspin Miniprep” (fabricado pela QIAGEN). (3) Determinação das sequências

[0154] A análise das sequências do gene da região VH e da região VL foi realizada através da análise dos DNAs plasmidiais em (2) utilizando o primer direto M13 (SEQ ID No: 116) e o primer reverso M13 (SEQ ID No: 117), por um sequenciador de fluorescência (DNA sequencer 3130XL fabricado pela ABI), utilizando o kit de sequenciamento BigDye Terminator Ver. 3.1 de acordo com o protocolo anexo às instruções. Como resultado, as sequências dos respectivos genes foram determinadas (idênticas entre os 10 clones de cada gene). A sequência de aminoácidos da região VH do anticorpo monoclonal anti- CD179b #8 é exibida na SEQ ID No: 105, e a sequência de aminoácidos da região de VL do anticorpo é exibida na SEQ ID No: 109. APLICAÇÃO INDUSTRIAL

[0155] O anticorpo da presente invenção é útil para a terapia e/ou profilaxia do câncer. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM TEXTO LIVRE

[0156] SEQ ID Nos:94, 96 a 99: primers.

[0157] SEQ ID No:95: primer T7.

[0158] SEQ ID Nos:100 e 101: primers GAPDH.

[0159] SEQ ID Nos:116 e 117: primers.

Claims

1. USO DO ANTICORPO, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para terapia e/ou profilaxia do câncer, em dito anticorpo possuir imunorreatividade à proteína CD179b e possui a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 3, em que o anticorpo é capaz mediar a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) por células efetoras e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células que expressam CD179b.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito câncer ser leucemia ou linfoma.

3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico.

5. ANTICORPO, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 103, 104 e 102 para CDR1, CRD2 e CDR3 respectivamente; e uma região variável de cadeia leve possuindo as sequências de aminoácidos exibidas nas SEQ ID Nos: 106, 107 e 108 para CDR1, CDR2 e CDR3 respectivamente, em que o dito anticorpo possui imunorreatividade à proteína CD179b, em que o anticorpo é capaz mediar a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) por células efetoras e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células que expressam CD179b.

6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 105 e uma região variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID No: 109 .

7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado por ser um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico.

8. USO DO ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7.

9. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo dito anticorpo ser o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em um veículo farmaceuticamente aceitável.