BRPI0907359B1

BRPI0907359B1 - Hidroxifenilpiruvato dioxigenase (hppd) mutada, sequência de ácido nucleico, gene quimérico, proteína de fusão de peptídeo de trânsito/hppd mutada, vetor de clonagem e/ou expressão, método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de hpdd e método de controle seletivo de ervas daninhas em uma área ou campo

Info

Publication number: BRPI0907359B1
Application number: BRPI0907359-0A
Authority: BR
Inventors: Marco Busch; Alain Sailland; Bernd Laber; Kerstin Fischer
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2023-07-11

Abstract

HIDROXIFENILPIRUVATO DIOXIGENASE (HPPD) MUTADA, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, GENE QUIMÉRICO, PROTEÍNA DE FUSÃO DE PEPTÍDEO DE TRÂNSITO,/HPPD MUTADA, VETOR DE CLONAGEM E/OU EXPRESSÃO , MÉTODO DE OBTENÇÃP DE UMA PLANTA RESISTENTE A UM INIBIDOR DE HPPD, MÉTODO DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS EM UMA ÁREA OU CAMPO, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE ÓLEO OU FARELO E USO DE UMA HPPD MUTADA. A presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) mutada, gene quimérico que compreende essa sequência como sequência codificadora e seu uso na obtenção de plantas que são resistentes a herbicidas inibidores de HPPD.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) mutada, a um gene quimérico que compreende essa sequência como sequência codificadora, e seu uso na obtenção de plantas que são resistentes a herbicidas inibidores de HPPD.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As hidroxifenilpiruvato dioxigenases (HPPD; EC 1.13.11.27) são enzimas que catalisam a reação na qual para-hidroxifenilpiruvato (HPP), um produto de degradação de tirosina, é transformado em homogentisato (HG), o precursor nas plantas de tocoferol e plastoquinona (Crouch, N. P. et al, 1997; Fritze et al, 2004). O tocoferol age como um antioxidante associado à membrana. A plastoquinona age, em primeiro lugar, como um condutor de elétrons entre PSII e o complexo de citocromo b6/f e, em segundo lugar, é um cofator redox de fitoeno dessaturase, que está envolvida na biossíntese de carotenoides.

A maior parte das plantas sintetiza tirosina por meio de arrogenato (Abou-Zeid et al, 1995; Bonner et al, 1995; Byng et al, 1981; Connely e Conn, 1986; Gaines et al, 1982). Nessas plantas, a HPP é derivada apenas da degradação de tirosina. Por outro lado, em organismos tais como a levedura Saccharomyces cerevisiae ou a bactéria Escherichia coli, HPP é uma precursora de tirosina e é sintetizada por meio da ação de uma enzima, prefenato desidrogenase (denominada a seguir PDH), que converte prefenato em HPP (Lingens et al, 1967; Sampathkumar e Morrison, 1982). Nesses organismos, a produção de HPP está diretamente relacionada, portanto, ao processo biossintético de aminoácidos aromáticos (via do shikimato) e não ao processo de degradação de tirosina.

A inibição de HPPD gera o desacoplamento da fotossíntese, deficiência de pigmentos acessórios de absorção de luz e, o mais importante, destruição da clorofila pela radiação UV e espécies reativas de oxigênio, devido à falta de fotoproteção normalmente fornecida pelos carotenoides (Norris et al, 1995). A fotodegradação de tecidos fotossinteticamente ativos gera a inibição do crescimento e a morte da planta.

Algumas moléculas que inibem HPPD e que se ligam especificamente à enzima a fim de inibir a transformação do HPP em homogentisato provaram ser herbicidas seletivos muito eficazes.

A maior parte dos herbicidas inibidores de HPPD disponíveis comercialmente pertence a uma destas quatro famílias químicas: 1. tricetonas, tais como sulcotriona (ou seja, 2-[2-cloro-4- (metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona), mesotriona (ou seja, 2-[4- (metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona), tembotriona (ou seja, 2-[2- cloro-4-(metilsulfonil)-3-[(2,2,2-trifluoroetóxi)metil]benzoil]-1,3-ciclo- hexanodiona); 2. dicetonitrilas, tais como 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2- metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona e 2-ciano-1-[4- (metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-fiona; 3. isoxazóis, tais como isoxaflutol (ou seja, (5-ciclopropil-4- isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)fenil]metanona); em plantas, o isoxaflutol é rapidamente metabolizado em DKN, um composto de dicetonitrila que exibe a propriedade de inibição de HPPD; e 4. pirazolinatos, tais como topramezona (ou seja, [3-(4,5-di- hidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5-hidróxi-1-metil-1H-pirazol-4- il)metanona) e pirassulfotol ((5-hidróxi-1,3-dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4- trifluorometilfenil)metanona).

Esses herbicidas inibidores de HPPD podem ser utilizados em gramas e/ou ervas daninhas de folhas largas de plantas de cultura que exibam tolerância metabólica, tais como milho (Zea mays), no qual são rapidamente degradados (Schulz et al, 1993; Mitchell et al, 2001; Garcia et al, 2000; Pallett et al, 2001). A fim de estender o escopo desses herbicidas inibidores de HPPD, foram desenvolvidos vários esforços para conferir às plantas, particularmente plantas com ou sem tolerância metabólica abaixo do normal, uma tolerância em nível agrícola.

Além da tentativa de superar a produção mediada por HPPD de homogentisato (patente US 6.812.010), foi realizada a hiperexpressão da enzima sensível para produzir quantidades da enzima alvo na planta que sejam suficientes com relação ao herbicida (publicação WO 96/38567). A hiperexpressão de HPPD resultou em melhor tolerância pré-emergência ao derivado de dicetonitrila (DKN) de isoxaflutol (IFT), mas a tolerância não foi suficiente para o tratamento pós-emergência (Matringe et al, 2005).

Uma terceira estratégia foi a mutação da HPPD, a fim de obter uma enzima alvo que, embora mantendo as suas propriedades de catalisação de transformação de HPP em homogentisato, seja menos sensível a inibidores de HPPD que a HPPD nativa antes da mutação. Esta estratégia vem sendo aplicada com sucesso na produção de plantas tolerantes a 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona e 2-ciano-1- [4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-fiona (patente EP496630), dois herbicidas inibidores de HPPD pertencentes à família das dicetonitrilas (publicação WO 99/24585). As mutações Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile e, mais especificamente, Gly336Trp (as posições do aminoácido mutado são indicadas com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2) foram identificados como mutações que são responsáveis por um aumento da tolerância ao tratamento pré-emergência com esses herbicidas de dicetonitrila sem causar alterações da atividade da enzima. Mais recentemente, demonstrou-se que a introdução de um gene HPPD de Pseudomonas no genoma plastidial de fumo e soja é muito mais eficaz que a transformação nuclear, conferindo ainda tolerância à aplicação pós-emergência de isoxaflutol (Dufourmantel et al, 2007). Na publicação WO 04/024928, os inventores procuraram aumentar a biossíntese de prenilquinona (tal como a síntese de plastoquinonas, tocoferóis) nas células de plantas por meio do aumento do fluxo do precursor de HPP nas células dessas plantas. Isso foi feito conectando-se a síntese do mencionado precursor a via de “shikimato” por meio da hiperexpressão de uma enzima PDH. Eles também observaram que a transformação das plantas com um gene que codifica uma enzima PDH possibilita o aumento da tolerância das mencionadas plantas aos inibidores de HPPD.

Apesar desses sucessos obtidos para o desenvolvimento de plantas que exibem tolerância a herbicidas de dicetonitrila, ainda é necessário desenvolver e/ou aprimorar o sistema de tolerância a inibidores de HPPD, particularmente para inibidores de HPPD pertencentes às classes das tricetonas (tais como sulcotriona, mesotriona e tembotriona) e dos pirazolinatos (tais como topramezona e pirassulfotol).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, portanto, a novas enzimas HPPD mutadas que mantêm as suas propriedades de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato e que são menos sensíveis a inibidores de HPPD que a HPPD original não mutada, caracterizadas pelo fato de que tais enzimas contêm uma mutação na posição 336 (aminoácido glicina na HPPD nativa), com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2, que é selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Asn, Gly336Cys, Gly336Val, Gly336Trp, Gly336Glu e Gly336Asp.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em uma realização específica, a mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 é selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val, desde que a HPPD mutada não seja a mutante duplo Gly334Ala-Gly336Arg (as posições são fornecidas com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2).

Em uma realização mais específica, a mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 é selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336His, Gly336Met, Gly336Cys e Gly336Phe.

Em uma outra realização específica, a enzima HPPD é de uma planta, particularmente de Arabidopsis thaliana, e contém uma mutação sobre glicina na posição 422 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Arabidopsis de SEQ ID N° 4 (ou seja, posição 336 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2) que é selecionado a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Asn, Gly336Cys, Gly336Val, Gly336Trp, Gly336Glu e Gly336Asp.

Em uma realização mais específica, a mutação na posição 422 com referência a HPPD de Arabidopsis de SEQ ID N° 4 (ou seja, na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2) é selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336His, Gly336Asn, Gly3364Cys e Gly336Val e a HPPD mutada é de origem vegetal, particularmente de Arabidopsis. Observa-se que a posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 é a posição 422 com referência a HPPD de Arabidopsis thaliana de SEQ ID N° 4.

Em uma realização específica, a HPPD mutada de acordo com a presente invenção é menos sensível que a HPPD original não mutada a um herbicida inibidor de HPPD da classe dos isoxazóis, dicetonitrilas, tricetonas ou pirazolinatos.

Em uma realização específica, a HPPD mutada de acordo com a presente invenção é menos sensível que a HPPD original não mutada a um herbicida inibidor de HPPD selecionado a partir de isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, sulcotriona, pirassulfotol, topramezona, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2- SO2CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4- 2,3 Cl2 fenil)propano-1,3-diona.

Em uma outra realização específica, a HPPD mutada de acordo com a presente invenção é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas (denominado inibidor de HPPD de tricetona), tal como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, particularmente tembotriona, ou da classe de pirazolinatos (denominado inibidor de HPPD de pirazolinato), tal como pirassulfotol e topramezona, que a HPPD original não mutada.

Em uma realização mais específica, a HPPD mutada de acordo com a presente invenção é menos sensível a um inibidor de HPPD tricetona selecionado a partir de tembotriona, sulcotriona e mesotriona, particularmente tembotriona.

Em uma outra realização específica, a HPPD mutada de acordo com a presente invenção contém uma segunda mutação, além da primeira mutação sobre o aminoácido glicina na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Em uma realização mais específica, o segundo aminoácido mutado é selecionado a partir dos aminoácidos selecionados: Pro215, Gly298, Gly332, Phe333, Gly334 e Asn337, com referência à sequência HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Além disso, a presente invenção fornece enzimas HPPD que sofreram mutação que retêm as suas propriedades de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato e que são menos sensíveis a inibidores de HPPD da classe de tricetonas tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, ou da classe de pirazolinatos tais como pirassulfotol e topramezona, que a HPPD original não mutada, caracterizadas pelo fato de que contêm uma mutação do aminoácido glicina na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2, bem como usos dessas enzimas para tornar as plantas tolerantes a esses inibidores de HPPD, processos em que herbicidas tricetonas ou pirazolinatos são aplicados a plantas que expressam essas enzimas mutantes e plantas tolerantes a esses inibidores de HPPD da classe de tricetonas ou pirazolinatos compreendendo no seu genoma um gene que codifica certas enzimas de HPPD que sofreram mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Em uma realização específica da presente invenção, a enzima HPPD mutada é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas tal como tembotriona, sulcotriona e mesotriona que a HPPD original sem mutação e sofre mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 de acordo com uma mutação selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336Asp, Gly336Glu, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Trp, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val.

Em uma realização específica da presente invenção, a enzima HPPD mutada é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas tal como tembotriona, sulcotriona e mesotriona que a HPPD original sem mutação e sofre mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 de acordo com uma mutação selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe e Gly336Cys.

Diversos HPPDs e suas sequências primárias foram descritos no estado da técnica, particularmente os HPPDs de bactérias tais como Pseudomonas (Rüetschi et al, Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, publicação WO 96/38567), de plantas tais como Arabidopsis (publicação WO 96/38567, Genebank AF047834), cenoura (publicação WO 96/38567, Genebank 87257), Avena sativa (publicação WO 02/046387), trigo (publicação WO 02/046387), Brachiaria platyphylla (publicação WO 02/046387), Cenchrus echinatus (publicação WO 02/046387), Lolium rigidum (publicação WO 02/046387), Festuca arundinacea (publicação WO 02/046387), Setaria faberi (publicação WO 02/046387), Eleusine indica (publicação WO 02/046387) e sorgo (publicação WO 02/046387), de Coccicoides (Genebank COITRP) ou de mamíferos tais como camundongos e porcos. As sequências correspondentes descritas nas referências indicadas são incorporadas ao presente como referência.

Ao alinhar-se essas sequências conhecidas, utilizando os meios costumeiros da técnica, tais como o método descrito por Thompson, J. D. et al (CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment through Sequence Weighting, Positions-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, Nucleic Acids Research, 22; 4673-4680, 1994) e acesso aos programas de computador de alinhamento de sequências que são acessíveis via Internet, por exemplo, os técnicos no assunto são capazes de definir as homologias de sequência com relação a uma sequência de referência e encontrar os aminoácidos chave ou definir regiões comuns.

No caso da presente invenção, a sequência de referência é a sequência de Pseudomonas, com todas as definições e indicações das posições de aminoácidos específicos que são feitas com relação à sequência de HPPD de Pseudomonas primária de SEQ ID N° 2, exceto quando especificamente indicado. A Figura 1 anexa ilustra um alinhamento de diversas sequências de HPPD que são descritas no estado da técnica; essas sequências são alinhadas com relação à sequência de HPPD de Pseudomonas como a sequência de referência e compreendem as sequências de HPPD de Streptomyces avermitilis (Genebank SAV11864), de Daucus carota (Genebank DCU 87257), de Arabidopsis thaliana (Genebank AF047834), de Zea mais, de Hordeum vulgare (Genebank HVAJ693), de Mycosphaerella graminicola (Genebank AF038152), de Coccicoides immitis (Genebank COITRP) e de Mus musculus (Genebank MU54HD). Essa figura fornece a numeração dos aminoácidos da sequência de Pseudomonas e também os aminoácidos que são comuns para essas sequências, em que esses aminoácidos são indicados por um asterisco. Com base nesse alinhamento, é fácil, a partir da definição do aminoácido de Pseudomonas pela sua posição e sua natureza, identificar a posição do aminoácido correspondente em uma outra sequência de HPPD. A Figura 1 demonstra que isso pode ser feito com o alinhamento de sequências com origem em plantas, mamíferos e bactérias diferentes, o que demonstra que esse método de alinhamento, que é bem conhecido dos técnicos no assunto, pode ser generalizado para qualquer outra sequência. Um alinhamento de diferentes sequências de HPPD também é descrito na publicação WO 97/49816.

Na publicação WO 99/24585, a análise da estrutura terciária do monômero HPPD de Pseudomonas exibe a presença de uma parte C-terminal dos HPPDs, que é onde está localizado o sítio ativo da enzima, ligado à sua parte N-terminal por um peptídeo de ligação que garante a estabilidade da enzima e sua oligomerização (a HPPD de Pseudomonas é um tetrâmero enquanto as HPPDs de plantas são dímeros). Esta estrutura foi obtida por meio dos métodos costumeiros de estudo de difração de raio X de cristal. O peptídeo de ligação possibilita a definição da extremidade N-terminal da parte C-terminal da enzima, em que o mencionado peptídeo de ligação está localizado entre os aminoácidos 145 e 157 no caso de Pseudomonas (cf. Figura 1). Dois aminoácidos, que se encontram nas posições 161 e 162 no caso da sequência de Pseudomonas (D = Asp161 e H = His162), serão observados em todas as sequências exibidas no alinhamento de sequências ilustrado na Figura 1 anexa. Com referência a HPPD de Pseudomonas, é possível, portanto, definir o peptídeo de ligação como estando localizado entre cerca de cinco e quinze aminoácidos acima no fluxo do aminoácido Asp161. Segundo a presente invenção, “HPPD mutada” é compreendida como sendo a substituição de pelo menos um aminoácido da sequência primária da HPPD por um outro aminoácido. A expressão “aminoácido mutado” será utilizada abaixo para designar o aminoácido que é substituído por um outro aminoácido, de forma a designar o sítio da mutação na sequência primária da proteína. Segundo a presente invenção, a mutação é efetuada sobre ao aminoácido glicina na posição 336 com referência à sequência de Pseudomonas de SEQ ID N° 2, que é comum para quase todas as sequências de HPPD identificadas. Das 240 sequências de HPPD conhecidas até aqui, 238 contêm uma glicina na posição 336 e apenas as sequências de HPPD de Synechococcus sp JA-3-3Ab (Acc-No Q2JX04) e Synechococcus sp. JA-2-3B’a (2-13) (Acc-No Q2JPN8)) contêm uma alanina nessa posição. Gly336 é parte de uma sequência de consenso “Gly-Phe-Gly-X-Gly-Asn-Phe” encontrada na maior parte das sequências de HPPD, em que X pode ser qualquer um dos vinte aminoácidos, dentre os HPPDs de diversas origens, o que possibilita a identificação do Gly336 sem nenhuma dificuldade em HPPDs de nenhuma fonte por meio do método de alinhamento de sequências. Gly336 com referência à sequência de Pseudomonas é, por exemplo, Gly422 com referência à sequência de Arabidopsis thaliana de SEQ ID N° 4 (vide Figura 1), mas, no presente, far-se-á referência a Gly na posição de referência 336 por meio de referência à sequência de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 (exceto quando indicado especificamente), muito embora a mutação possa ocorrer em qualquer enzima HPPD útil de acordo com a presente invenção, não necessariamente na HPPD de Pseudomonas.

A atividade enzimática de HPPDs pode ser medida por meio de qualquer método que possibilite a medição da redução da quantidade dos substratos de HPP ou O2 ou a medição do acúmulo de quaisquer dos produtos derivados da reação enzimática, ou seja, homogentisato ou CO2. Particularmente, a atividade de HPPD pode ser medida por meio do método descrito em Garcia et al (1997) ou Garcia et al (1999), que são incorporados ao presente como referência.

Segundo a presente invenção, um inibidor de HPPD da classe de tricetonas (ou inibidor de HPPD de tricetona) indica um inibidor de HPPD que possui um esqueleto de tricetona. Como exemplo desse inibidor de HPPD de tricetona, pode-se mencionar as moléculas sulcotriona (ou seja, 2-[2-cloro-4- (metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona), mesotriona (ou seja, 2-[4- (metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona) e tembotriona (ou seja, 2-[2- cloro-4-(metilsulfonil)-3-[(2,2,2-trifluoroetóxi)metil]benzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona).

Segundo a presente invenção, uma HPPD da classe de pirazolinatos (ou inibidor de HPPD de pirazolinato) indica um inibidor de HPPD que contém um radical de pirazol. Como exemplo desse inibidor de HPPD de pirazolinato, pode-se mencionar as moléculas topramezona (ou seja, [3-(4,5-di- hidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5-hidróxi-1-metil-1H-pirazol-4- il)metanona) e pirassulfotol ((5-hidróxi-1,3-dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4- trifluorometilfenil)metanona).

Em uma realização adicional da presente invenção, HPPD sofre mutação em uma segunda posição de aminoácido além da mutação de Gly336. A presença dessa segunda mutação pode aumentar ainda mais a tolerância ao mesmo herbicida inibidor de HPPD que aquele para o qual a primeira mutação confere uma tolerância, ou pode conferir tolerância a um segundo herbicida inibidor de HPPD. Exemplos dessas mutações que conferem tolerância a inibidores de HPPD e, particularmente, a dicetonitrilas e ao isoxaflutol, são descritos na publicação WO 99/24585.

Em uma realização específica da presente invenção, o segundo aminoácido mutado é selecionado a partir dos aminoácidos de referência a seguir, com referência à sequência de Pseudomonas de SEQ ID N° 2: Pro215, Gly332, Phe333, Gly334 e Asn337, bem como Gly298 na sequência de Pseudomonas (este último não possui correspondente em outros HPPDs, vide a Fig. 1).

Em uma realização da presente invenção, o segundo aminoácido mutado é Pro215 com referência à sequência de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 e a mutação é particularmente Pro215Leu.

A presente invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico, particularmente um DNA isolado, que codifica uma HPPD mutada conforme descrito acima.

A presente invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima HPPD mutada e mantém as suas propriedades de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato e que é menos sensível a inibidores de HPPD da classe de tricetonas tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, que a HPPD sem mutações originais, caracterizado pelo fato de que contém uma mutação do aminoácido glicina na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Em uma realização mais específica, a sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção codifica uma enzima HPPD mutada e é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas tal como tembotriona, sulcotriona e mesotriona que a HPPD sem mutação original e em que a HPPD sofre mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 de acordo com uma mutação selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336Asp, Gly336Glu, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Trp, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val.

Em uma realização ainda mais específica, a sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção codifica uma enzima HPPD mutada e é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas, tal como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, que a HPPD sem mutação original e em que a HPPD sofre mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 de acordo com uma mutação selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe e Gly336Cys.

Segundo a presente invenção, compreende-se uma “sequência de ácido nucleico” como sendo uma sequência de nucleotídeos que pode ser do tipo DNA ou RNA, preferencialmente do tipo DNA, particularmente com duas fitas, seja ela de origem natural ou sintética, particularmente uma sequência de DNA na qual os códons que codificam a HPPD mutada de acordo com a presente invenção foram otimizados conforme o organismo hospedeiro no qual deve ser expresso (tal como por meio de substituição de códons pelos códons de maior preferência ou de preferência superior em tabelas de uso de códons desse organismo hospedeiro ou o grupo ao qual pertence esse organismo hospedeiro, em comparação com o hospedeiro original), em que esses métodos de otimização são bem conhecidos dos técnicos no assunto.

Um “DNA isolado”, da forma utilizada no presente, designa um DNA que não é de ocorrência natural ou não se encontra mais no ambiente natural no qual estava originalmente presente, tal como uma sequência codificadora de DNA associada a outros elementos reguladores em um gene quimérico, um DNA transferido para uma outra célula hospedeira, tal como uma célula vegetal, ou um DNA sintético artificial que contém uma sequência de nucleotídeos diferente em comparação com qualquer DNA de ocorrência natural conhecido.

A sequência que codifica uma HPPD original não mutada e sofrerá mutação de acordo com a presente invenção pode ser de qualquer origem. Particularmente, ele pode ser de origem bacteriana. Exemplos vantajosos que podem ser mencionados são bactérias do tipo Pseudomonas sp, tais como Pseudomonas fluorescens, ou outras cianobactérias do gênero Synechocystis. A sequência pode também ser de origem vegetal, particularmente derivada de plantas dicotiledôneas, plantas umbelíferas ou outras plantas monocotiledôneas. Exemplos vantajosos que podem ser mencionados são plantas tais como fumo, Arabidopsis, Daucus carotta, Zea mais (milho), trigo, cevada, Avena sativa, Brachiaria platyphylla, Cenchrus echinatus, Lolium rigidum, Festuca arundinacea, Setaria faberi, Eleusine indica e sorgo. As sequências codificadoras e a forma de seu isolamento e clonagem são descritas nas referências mencionadas anteriormente, cujo teor é incorporado ao presente como referência. Em uma realização específica da presente invenção, a HPPD possui origem bacteriana, particularmente de Pseudomonas sp, mais especificamente de Pseudomonas fluorescens ou de uma origem vegetal, particularmente de Arabidopsis thaliana.

A HPPD para elaborar a(s) mutação(ões) para o propósito da presente invenção pode ser qualquer HPPD de ocorrência natural ou qualquer de seus fragmentos ativos ou qualquer de suas variações em que alguns aminoácidos (um a dez aminoácidos) foram substituídos, adicionados ou excluídos para fins de clonagem, para elaborar uma fusão de peptídeo de trânsito e similares, que mantenha a atividade de HPPD, ou seja, a propriedade de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato em homogentisato.

Segundo a presente invenção, a HPPD pode ser uma HPPD quimérica. A expressão “HPPD quimérica” destina-se a indicar uma HPPD que compreende elementos originários de diversas HPPDs. Essas HPPDs quiméricas são descritos especificamente na publicação WO 99/24586.

A mutação pode ser efetuada na sequência de ácido nucleico que codifica a HPPD não mutada original por qualquer meio que seja apropriado para a substituição, na mencionada sequência, do códon que codifica o aminoácido mutado pelo códon que corresponde ao aminoácido que deve substituir, em que os mencionados códons são amplamente descritos na literatura e bem conhecidos dos técnicos no assunto.

Podem ser utilizados diversos métodos biológicos moleculares para atingir essa mutação.

Um método preferido de preparação de uma sequência de ácido nucleico mutada de acordo com a presente invenção e da proteína correspondente compreende a condução de mutagênese sítio-dirigida sobre códons que codificam um ou mais aminoácidos que são selecionados antecipadamente, incluindo o códon da posição de referência Gly336 com referência à sequência de HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2. Os métodos de obtenção dessas mutações dirigidas a local são bem conhecidos dos técnicos no assunto e amplamente descritos na literatura (particularmente, Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, editado por M. J. McPherson, IRL Press) ou são métodos para os quais é possível empregar kits comerciais (tais como o kit de mutagênese U. S. E. da PHARMACIA). Após a mutagênese sítio-dirigida, é útil selecionar as células que contêm uma HPPD mutada que seja menos sensível a um inibidor de HPPD utilizando um auxiliar de seleção apropriado. Um método de seleção que é de simples implementação é a determinação da dose de inibidor de HPPD que inibe totalmente a HPPD original sem mutação e que é letal para as células que expressam esse HPPD sem mutação, submeter às células que sofreram mutação a essa dose previamente determinada, isolar em seguida as células que sofreram mutação e suportaram essa dose letal e, em seguida, isolar e clonar o gene que codifica a HPPD mutada. Em vista de uma realização específica da presente invenção e da solução buscada, ou seja, uma HPPD que seja menos sensível a um inibidor de HPPD de pirazolinato ou tricetona, a seleção pode ser realizada conforme descrito acima, utilizando uma tricetona ou um inibidor de HPPD de pirazolinato, particularmente um inibidor de HPPD selecionado a partir de tembotriona, mesotriona, pirassulfotol, topramezona e sulcotriona.

Em vista de uma outra realização da presente invenção, ou seja, uma HPPD que sofre adicionalmente mutação sobre um segundo aminoácido, além da primeira mutação sobre o aminoácido de referência na posição 336 com referência à sequência de HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2, a segunda mutação pode ser obtida por meio de mutagênese sítio-dirigida, realizada simultânea ou sucessivamente à primeira.

Como uma alternativa para a mutagênese sítio-dirigida conforme descrito acima, a segunda mutação pode ser obtida utilizando métodos de mutação aleatória (tais como EMS ou tratamento de radiação) associados a um auxiliar de seleção apropriado. Esses métodos de mutação são bem conhecidos dos técnicos no assunto e amplamente descritos na literatura (particularmente, Sambrook et al, 1989). Os métodos de seleção podem ser realizados conforme descrito acima.

A terminologia DNA ou proteína “que compreende” uma certa sequência X, da forma utilizada ao longo de todo o texto, designa um DNA ou proteína que inclui ou contém pelo menos a sequência X, de tal forma que outras sequências de aminoácidos ou nucleotídeos possam ser incluídas na extremidade 5’ (ou N-terminal) e/ou 3’ (ou C-terminal), tal como (a sequência de nucleotídeos de) uma proteína marcadora selecionável, (a sequência de nucleotídeos de) um peptídeo de trânsito e/ou uma sequência líder 5’ ou uma sequência posterior 3’. De forma similar, o uso do termo “compreendem”, “que compreende” ou “compreende” ao longo de todo o texto e das reivindicações do presente pedido deverá ser compreendido como indicando a inclusão de um número inteiro indicado, etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de nenhum outro número inteiro, etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

A presente invenção também se refere, portanto, a um método de preparação de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma HPPD mutada de acordo com a presente invenção, em que o mencionado método é definido acima.

A presente invenção também se refere ao uso, em um método de transformação de plantas, de um ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada de acordo com a presente invenção como um gene marcador ou como uma sequência codificadora que possibilita conferir à planta tolerância a herbicidas que são inibidores de HPPD e ao uso de inibidores de HPPD sobre plantas que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada de acordo com a presente invenção. Em uma realização da presente invenção, nesse uso, os inibidores de HPPD são tricetonas ou pirazolinatos, preferencialmente tembotriona, mesotriona ou sulcotriona. Compreende-se, naturalmente, que essa sequência pode também ser utilizada em combinação com um ou mais outros genes marcadores e/ou sequência(s) que codifica(m) uma ou mais proteína com propriedades agrícolas úteis.

Dentre os genes que codificam proteínas que conferem propriedades agronômicas úteis às plantas transformadas, pode-se mencionar as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a certos herbicidas, as que conferem tolerância a certos insetos, as que conferem tolerância a certas doenças etc. Esses genes são particularmente descritos nas publicações WO 91/02071 e WO 95/06128. Dentre as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a certos herbicidas sobre as células vegetais e plantas transformadas, pode-se fazer menção do gene bar que confere tolerância a herbicidas de glufosinato, em que o gene codifica um EPSPS apropriado que confere tolerância a herbicidas que possuem EPSPS como alvo, tais como glifosato e seus sais (nas patentes US 4.535.060, US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835, US 5.188.642, US 4.971.908, US 5.145.783, US 5.310.667, US 5.312.910, US 5.627.061, US 5.633.435), o gene que codifica glifosato oxidorredutase (patente US 5.463.175).

Dentre as sequências de DNA que codificam um EPSPS apropriado que confere tolerância aos herbicidas que possuem EPSPS como alvo, far-se-á menção mais específica do gene que codifica um EPSPS vegetal, particularmente EPSPS de milho, que contém duas mutações, 102 e 106, e que é descrito no Pedido de Patente FR 2.736.926, denominado a seguir mutante duplo de EPSPS, ou o gene que codifica um EPSPS isolado de Agrobacterium e que é descrito por SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3 da Patente Norte-Americana n° 5.633.435, denominado a seguir CP4.

Nos casos das sequências de DNA que codificam EPSPS e, mais especificamente, que codificam os genes acima, a sequência que codifica essas enzimas é convenientemente precedida por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito, particularmente que codifica o “peptídeo de trânsito otimizado” descrito na Patente US 5.510.471 ou US 5.633.448.

Dentre as sequências de DNA que codificam proteínas de interesse e conferem propriedades inovadoras de tolerância contra insetos, far- se-á mais especificamente menção das proteínas Bt amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos técnicos no assunto. Far-se-á também menção de proteínas extraídas de bactérias tais como Photorhabdus (publicações WO 97/17432 e WO 98/08932).

A presente invenção também se refere a um gene quimérico (ou conjunto de expressão) que compreende uma sequência codificadora, bem como elementos reguladores heterólogos, na posição 5’ e/ou 3’, pelo menos na posição 5’, que são capazes de funcionar em um organismo hospedeiro, particularmente células vegetais ou plantas, com a sequência codificadora que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme definido anteriormente.

A presente invenção refere-se, portanto, a um gene quimérico (ou conjunto de expressão) que compreende uma sequência codificadora bem como elementos reguladores heterólogos, na posição 5’ e/ou 3’, pelo menos na posição 5’, que são capazes de funcionar em um organismo hospedeiro, particularmente células vegetais ou plantas, com a sequência codificadora que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico conforme definido anteriormente.

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se a um gene quimérico conforme descrito anteriormente, em que o organismo hospedeiro é selecionado a partir de bactérias, leveduras, Pichia, fungos, bacilovírus, células vegetais e plantas.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se a um gene quimérico conforme descrito anteriormente, em que o gene quimérico contém, na posição 5’ da sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo em trânsito de planta, em que essa sequência é disposta entre a região promotora e a sequência que codifica a HPPD mutada, de forma a permitir a expressão de uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito/HPPD mutada.

Como sequência reguladora que é um promotor em células vegetais e plantas, pode-se fazer uso de qualquer sequência promotora de um gene que é expresso naturalmente em plantas, particularmente um promotor que é expresso especialmente nas folhas de plantas, tais como promotores “constitutivos” de origem bacteriana, viral ou vegetal, ou promotores “dependentes da luz”, tais como os de um gene de subunidade pequena de ribulose-biscarboxilase/oxigenase (RuBisCo) vegetal ou qualquer promotor conhecido apropriado que pode ser utilizado. Dentre os promotores de origem vegetal, far-se-á menção dos promotores de histona, conforme descrito no Pedido EP 0.507.698, ou o promotor actina de arroz (patente US 5.641.876). Dentre os promotores de um gene de vírus vegetal, far-se-á menção do vírus mosaico da couve-flor (CAMV 19S ou 35S) ou do promotor circovírus (patente AU 689.311).

Pode-se também fazer uso de uma sequência promotora reguladora específica para regiões específicas ou tecidos de plantas, tais como promotores específicos para sementes (Datla, R. et al, 1997), especialmente o promotor napina (EP 255.378), o promotor faseolina, o promotor glutenina, o promotor heliantinina (publicação WO 92/17580), o promotor albumina (publicação WO 98/45460), o promotor oleosina (publicação WO 98/45461), o promotor SAT1 ou o promotor SAT3 (PCT/US98/06978).

Pode-se também fazer uso de um promotor indutível convenientemente selecionado a partir de lipase de amônia fenilalanina (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), quitinase, glucanase, inibidor da proteinase (PI), gene da família PR1, promotores nopalina sintase (nos) e vspB (patente US 5.670.349, Tabela 3), promotor HMG2 (patente US 5.670.349), promotor betagalactosidase de maçã (ABG1) e promotor aminociclopropano carboxilato sintase de maçã (ACC sintase) (publicação WO 98/45445).

Segundo a presente invenção, pode-se também fazer uso, em combinação com o promotor, de outras sequências reguladoras, que estão localizadas entre o promotor e a sequência codificadora, tais como ativadores da transcrição (“aprimoradores”), como o ativador da tradução do vírus mosaico do fumo (TMV) descrito na publicação WO 87/07644, do vírus da ferrugem do fumo (TEV) descrito por Carrington & Freed, 1990, por exemplo, ou introns tais como o intron adh1 de milho ou intron 1 de actina de arroz.

Como terminal regulador ou sequência de poliadenilação, pode-se fazer uso de qualquer sequência correspondente de origem bacteriana, tal como o terminal nos de Agrobacterium tumefaciens, de origem viral, tal como o terminal CaMV 35S, ou de origem vegetal, tal como o terminal de histona descrito no Pedido EP 0.633.317.

“Organismo hospedeiro” é compreendido como sendo qualquer organismo unicelular ou multicelular no qual o gene quimérico de acordo com a presente invenção pode ser introduzido para fins de produção de HPPD mutada. Esses organismos são, particularmente, bactérias, tais como E. coli, leveduras, particularmente o gênero Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pychia, fungos, particularmente Aspergillus, bacilovírus ou, preferencialmente, células vegetais e plantas.

“Célula vegetal” é compreendida, de acordo com a presente invenção, como sendo qualquer célula que seja derivada de uma planta ou nela encontrada e que seja capaz de formar tecidos não diferenciados tais como calos, tecidos diferenciados tais como embriões, partes de plantas, plantas ou sementes, ou deles seja parte.

Compreende-se “planta”, de acordo com a presente invenção, como sendo qualquer organismo multicelular diferenciado que seja capaz de fotossíntese, particularmente um organismo monocotiledôneo ou dicotiledôneo, mais especialmente plantas cultivadas que se destinam ou não à nutrição animal ou humana, tais como milho ou milho branco, trigo, plantas de Brassica spp tais como Brassica napus ou Brassica juncea, soja, arroz, cana de açúcar, beterraba, fumo, algodão, legumes tais como pepino, alho-porró, cenoura, tomate, alface, pimenta, melão, melancia etc.

Em uma realização, a presente invenção refere-se à transformação das plantas. Qualquer sequência promotora de um gene que é expresso naturalmente em plantas ou qualquer híbrido ou combinação de elementos promotores de genes expressos naturalmente em plantas, incluindo Agrobacterium ou promotores de vírus de plantas, ou qualquer promotor que seja apropriado para o controle da transcrição de um gene de tolerância a herbicidas, pode ser utilizado como a sequência reguladora promotora nas plantas de acordo com a presente invenção. Exemplos desses promotores apropriados são descritos acima.

Segundo a presente invenção, também é possível utilizar, em combinação com a sequência reguladora promotora, outras sequências reguladoras que estão localizadas entre a sequência promotora e a codificadora, tais como sequências de introns ou ativadores da transcrição (amplificadores). Exemplos dessas sequências reguladoras apropriadas são descritos acima.

Qualquer sequência correspondente de origem bacteriana, tal como o terminal nos de Agrobacterium tumefaciens, ou de origem vegetal, tal como um terminal de histona conforme descrito no pedido EP 0.633.317, pode ser utilizada como sequência reguladora terminal de transcrição (e de poliadenilação).

Em uma realização específica da presente invenção, é empregada uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito a 5’ da sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada, em que esse peptídeo de trânsito é disposto entre a região promotora e a sequência que codifica a HPPD mutada, de forma a permitir a expressão de uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito/HPPD mutada, em que a HPPD mutada é definida anteriormente. O peptídeo de trânsito possibilita dirigir a HPPD mutada para os plastídeos, mais especialmente os cloroplastos, em que a proteína de fusão é dividida entre o peptídeo de trânsito e a HPPD mutada quando este último entrar no plastídeo. O plastídeo de trânsito pode ser um único peptídeo, tal como um peptídeo de trânsito de EPSPS (descrito na Patente Norte-Americana n° 5.188.642) ou um peptídeo de trânsito da subunidade pequena de ribulose biscarboxilase/oxigenase vegetal (RuBisCO ssu), em que apropriado inclui alguns aminoácidos da parte N-terminal do RuBisCO ssu maduro (EP 189.707) ou pode ser uma fusão de diversos peptídeos de trânsito tais como um peptídeo de trânsito que compreende um primeiro peptídeo de trânsito vegetal que é fundido a uma parte da sequência N-terminal de uma proteína madura que possui um sítio plastidial, em que essa parte, por sua vez, é fundida a um segundo peptídeo de trânsito vegetal conforme descrito na Patente EP 508.909 e, mais especialmente, o peptídeo de trânsito otimizado que compreende um peptídeo de trânsito do RuBisCO ssu de girassol fundido a 22 aminoácidos da extremidade N-terminal do RuBisCO ssu de milho, fundido, por sua vez, ao peptídeo de trânsito do RuBisCO ssu de milho, conforme descrito, com a sua sequência codificadora, na Patente EP 508.909.

A presente invenção também se refere a proteína de fusão de peptídeo de trânsito/ HPPD mutada e um ácido nucleico ou gene quimérico que pode ser expresso em plantas que codifica essa proteína de fusão, em que os dois elementos dessa proteína de fusão são conforme definido acima.

A presente invenção também se refere a um vetor de clonagem e/ou de expressão para transformar um organismo hospedeiro, em que esse vetor contém pelo menos um gene quimérico conforme definido acima. Além do gene quimérico acima, esse vetor contém pelo menos uma origem de reprodução. Esse vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago ou um vírus que tenha sido transformado por meio da introdução do gene quimérico de acordo com a presente invenção. Esses vetores de transformação, que dependem do organismo hospedeiro para serem transformados, são bem conhecidos dos técnicos no assunto e amplamente descritos na literatura. O vetor de transformação que é utilizado, particularmente, para a transformação de células vegetais ou plantas pode ser um vírus, que pode ser empregado para a transformação de plantas desenvolvidas e que contém adicionalmente os seus próprios elementos de reprodução e expressão. Segundo a presente invenção, o vetor de transformação de células vegetais ou plantas é preferencialmente um plasmídeo, tal como um plasmídeo Ti de Agrobacterium sem braços.

A presente invenção também se refere aos organismos hospedeiros, particularmente células vegetais ou plantas, que são transformados e que contêm um gene quimérico que compreende uma sequência que codifica uma HPPD mutada conforme definido acima, e ao uso das plantas de acordo com a presente invenção em um campo de cultivo de uma safra e colheita de um produto vegetal, tal como grãos de soja ou de milho, em que, em uma realização, o mencionado uso envolve a aplicação de herbicidas inibidores de HPPD a essas plantas para controlar as ervas daninhas. Em uma realização da presente invenção, nesse uso, os inibidores de HPPD são tricetonas ou pirazolinatos, preferencialmente tembotriona, mesotriona ou sulcotriona, particularmente tembotriona.

A presente invenção refere-se, portanto, a um organismo hospedeiro, particularmente uma célula vegetal ou planta, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos um gene quimérico conforme descrito anteriormente, ou pelo menos uma sequência de ácido nucleico conforme descrito anteriormente.

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima HPPD mutada e mantém as suas propriedades de catalisação da conversão de para- hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato e que é menos sensível a um inibidor de HPPD que a HPPD original não mutada, caracterizada pelo fato de que contém uma mutação na posição 336 (aminoácido glicina na HPPD nativa) com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 que é selecionado a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val, desde que a HPPD mutada não seja o mutante duplo Gly334Ala-Gly336Arg (as posições são fornecidas com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2).

Em uma outra realização mais específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrito acima, em que a mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 é selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336His, Gly336Met, Gly336Cys e Gly336Phe, particularmente Gly336His.

Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada que mantém as suas propriedades de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato e que é menos sensível a um inibidor de HPPD que a HPPD original não mutada, em que a enzima HPPD é de uma planta, particularmente de Arabidopsis thaliana, e contém uma mutação sobre glicina na posição 422 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Arabidopsis de SEQ ID N° 4 (ou seja, posição 336 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2) selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Asn, Gly336Cys, Gly336Val, Gly336Trp, Gly336Glu e Gly336Asp.

Em uma realização ainda mais específica, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que a mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 é selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336His, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val e a HPPD mutada é de origem vegetal, particularmente de Arabidopsis. Observa-se que a posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 é a posição 422 com referência a HPPD de Arabidopsis thaliana de SEQ ID N° 4.

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal ou planta, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que a HPPD mutada de acordo com a presente invenção é menos sensível que a HPPD original não mutada a um herbicida inibidor de HPPD da classe de isoxazóis, dicetonitrilas, tricetonas ou pirazolinatos.

Em uma realização mais específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que a HPPD mutada é menos sensível que a HPPD original que não mutada é um herbicida inibidor de HPPD selecionado a partir de isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, sulcotriona, pirassulfotol, topramezona, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4,2,3 Cl2 fenil)propano-1,3-diona.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que a HPPD mutada é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, particularmente tembotriona, ou da classe de pirazolinatos tais como pirassulfotol e topramezona, que a HPPD original não mutada.

Em uma realização mais específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que a HPPD mutada é menos sensível a um inibidor de HPPD de tricetona selecionado a partir de tembotriona, sulcotriona e mesotriona, particularmente tembotriona.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que a HPPD mutada de acordo com a presente invenção contém uma segunda mutação, além da primeira mutação sobre o aminoácido glicina na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada conforme descrita acima, em que o segundo aminoácido mutado é selecionado a partir dos aminoácidos selecionados: Pro215, Gly298, Gly332, Phe333, Gly334 e Asn337, com referência à sequência de HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

A presente invenção refere-se ainda a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima HPPD mutada e mantém as suas propriedades de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato e que é menos sensível a inibidores de HPPD da classe de tricetonas tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, ou da classe de pirazolinatos tais como pirassulfotol e topramezona, que a HPPD original não mutada, caracterizado pelo fato de que contém uma mutação do aminoácido glicina na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Em uma realização mais específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima HPPD mutada e é menos sensível a um inibidor de HPPD da classe de tricetonas ou pirazolinatos que a HPPD original não mutada sofre mutação na posição 336 com referência a HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 de acordo com uma mutação selecionada a partir das mutações a seguir: Gly336Arg, Gly336Asp, Gly336Glu, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336Trp, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se a uma célula vegetal ou planta caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico conforme descrito anteriormente e, além disso, um gene que é funcional em plantas, o que permite a hiperexpressão de uma enzima PDH (prefenato desidrogenase).

A presente invenção também se refere às plantas que contêm células transformadas, particularmente as plantas que são regeneradas a partir das células transformadas. A regeneração pode ser obtida por meio de qualquer método apropriado, em que o método depende da natureza da espécie, conforme descrito, por exemplo, nas referências acima. As patentes e os pedidos de patente a seguir podem ser particularmente mencionados com relação aos métodos de transformação de células vegetais e plantas em regeneração: US 4.459.355, US 4.536.475, US 5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073, EP 267.159, EP 604.662, EP 672.752, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346, US 5.484.956, US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520, US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442.174, EP 486.233, EP 486.234, EP 539.563, EP 674.725, WO 91/02071 e WO 95/06128.

A presente invenção também se refere às plantas transformadas ou suas partes, que são derivadas por meio de cultivo e/ou cruzamento das plantas regeneradas acima e às sementes das plantas transformadas.

A presente invenção também se refere aos produtos finais tais como o farelo ou óleo que são obtidos a partir das plantas, sua parte ou sementes de acordo com a presente invenção.

As plantas transformadas que podem ser obtidas de acordo com a presente invenção podem ser do tipo monocotiledôneo, tais como cereais, cana de açúcar, arroz e milho ou milho branco, ou do tipo dicotiledôneo, tais como fumo, soja, Brassica spp, plantas tais como colza oleaginosa, algodão, beterraba, trevo etc.

A presente invenção refere-se a um método de transformação de organismos hospedeiros, particularmente células vegetais ou plantas, por meio da integração a esses organismos de pelo menos uma sequência de ácido nucleico ou um gene quimérico conforme definido anteriormente, em que é possível obter-se a transformação por qualquer meio conhecido apropriado, em que esses meios são amplamente descritos na literatura especializada e, particularmente, as referências mencionadas no presente pedido, mais especialmente utilizando o vetor de acordo com a presente invenção.

Uma série de métodos compreende o bombardeio de células, protoplastas ou tecidos com partículas às quais são ligadas as sequências de DNA. Uma outra série de métodos compreende o uso, como meio de transferência para a planta, de um gene quimérico que é inserido em um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou um plasmídeo Ri de

Agrobacterium rhizogenes. Podem ser utilizados outros métodos, tais como microinjeção, eletroporação ou outro tipo de precipitação direta utilizando PEG. Os técnicos no assunto podem selecionar qualquer método apropriado de transformação do organismo hospedeiro selecionado, particularmente a célula vegetal ou a planta. Como exemplos, a tecnologia de transformação de soja foi amplamente descrita nos Exemplos 1 a 3 de EP 1186666, incorporada ao presente como referência. Para arroz, poder-se-á realizar transformação mediada por agrobactérias (Hiei et al, 1994, e Hiei et al, 1997, incorporados ao presente como referência), eletroporação (Patente US 5.641.664 e Patente US 5.679.558, incorporadas ao presente como referência) ou bombardeio (Christou et al, 1991, incorporado ao presente como referência). Uma tecnologia apropriada de transformação de plantas monocotiledôneas, particularmente arroz, é descrita na publicação WO 92/09696, incorporada ao presente como referência. Para algodão, foi descrita transformação mediada por agrobactérias (Gould, J. H. e Magallanes-Cedeno, M., 1998 e Zapata, C., 1999, incorporados ao presente como referência), polibreno e/ou transformação mediada por tratamento (Sawahel, W. A., 2001, incorporado ao presente como referência).

Em uma realização específica da presente invenção, a HPPD mutada é dirigida para o cloroplasto. Isso pode ser feito por meio da integração de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de HPPD mutada e peptídeo de trânsito conforme descrito acima.

Alternativamente, a HPPD mutada pode ser expressa diretamente nos cloroplastos utilizando transformação do genoma de cloroplasto. Um método apropriado compreende o bombardeio de seções de folhas por partículas revestidas com o DNA e integração do gene introduzido que codifica a proteína de acordo com a presente invenção por meio de recombinação homóloga. Vetores e sistemas de seleção apropriados são conhecidos dos técnicos no assunto. Um exemplo de meios e métodos que podem ser utilizados para essa integração ao genoma de cloroplasto de linhagens de fumo é fornecido na publicação WO 06/108830, cujo teor é incorporado ao presente como referência. Quando os polipeptídeos são dirigidos diretamente ao cloroplasto utilizando transformação do genoma de cloroplasto, geralmente não é necessária uma sequência de peptídeo de trânsito. A presente invenção também se refere a um método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD, caracterizada pelo fato de que a planta é transformada com um gene quimérico conforme descrito anteriormente.

A presente invenção também se refere a um método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD, caracterizado pelo fato de que a planta é transformada com um gene quimérico que compreende uma sequência codificadora, bem como um elemento regulador heterólogo na posição 5’ e, opcionalmente, na posição 3’, que são capazes de funcionar em um organismo hospedeiro, em que a sequência codificadora contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico conforme descrita anteriormente.

Em uma realização específica da presente invenção, neste método, o inibidor de HPPD é um herbicida tricetona ou pirazolinato, preferencialmente tembotriona, mesotriona ou sulcotriona, particularmente tembotriona.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se a um método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD conforme descrito acima, caracterizado pelo fato de que a planta é adicionalmente transformada, simultânea ou sucessivamente, com um gene funcional nessa planta que permite a hiperexpressão de uma enzima PDH (prefenato desidrogenase).

A presente invenção também se refere a um método de retirada seletiva de ervas daninhas de plantas, particularmente safras de plantas, com o auxílio de um inibidor de HPPD, particularmente um herbicida conforme definido anteriormente, em que esse método é caracterizado pelo fato de que esse herbicida é aplicado a plantas que tenham sido transformadas de acordo com a presente invenção, seja antes do plantio da safra, antes da emergência da safra ou após a emergência da safra.

Em uma realização específica da presente invenção, neste método, o inibidor de HPPD é um herbicida de tricetona ou pirazolinato, preferencialmente tembotriona, mesotriona ou sulcotriona, particularmente tembotriona.

A presente invenção também se refere a um método de controle de ervas daninhas em uma área ou campo que contém sementes transformadas conforme descrito anteriormente no presente pedido de patente, em que esse método compreende a aplicação à mencionada área do campo de uma dose de um herbicida inibidor de HPPD que é tóxico para as mencionadas ervas daninhas, sem afetar significativamente as sementes ou plantas que contêm uma sequência de ácido nucleico ou um gene quimérico conforme descrito anteriormente no presente pedido de patente.

A presente invenção também se refere a um método de cultivo das plantas que foram transformadas com um gene quimérico de acordo com a presente invenção, em que esse método compreende o plantio de sementes que compreendem um gene quimérico de acordo com a presente invenção, em uma área de um campo que é apropriado para cultivo das mencionadas plantas e na aplicação, caso as ervas daninhas estejam presentes, de uma dose, que é tóxica para as ervas daninhas, de um herbicida cujo alvo é a HPPD definida acima à mencionada área do mencionado campo, sem afetar significativamente as mencionadas sementes transformadas ou as mencionadas plantas transformadas e, em seguida, colheita das plantas cultivadas ou partes de plantas quando atingirem o estágio desejado de maturidade e, quando apropriado, na separação das sementes das plantas colhidas.

Nos métodos acima, o herbicida cujo alvo é a HPPD pode ser aplicado de acordo com a presente invenção, seja antes do plantio da safra, antes da emergência da safra ou após a emergência da safra.

A presente invenção também se refere a um processo de obtenção de óleo, particularmente óleo de soja ou farelo, que compreende o cultivo de uma safra, particularmente uma safra de soja, que expressa uma HPPD mutada de acordo com a presente invenção em um campo, tratamento opcional dessa safra com um herbicida inibidor de HPPD, colheita dos grãos, moagem dos grãos para a elaboração de farelo e extração do óleo. Além disso, as sementes ou grãos de plantas, sejam eles inteiros, quebrados ou picados, que contêm o gene quimérico de acordo com a presente invenção são parte da presente invenção.

A presente invenção refere-se, portanto, a um método de obtenção de óleo ou farelo que compreende o cultivo de uma planta transformada conforme descrito acima, tratamento opcional dessa planta com um herbicida inibidor de HPPD, colheita dos grãos e moagem dos grãos para fabricar farelo e extrair o óleo.

Em realizações específicas, os métodos acima de acordo com a presente invenção envolvem um herbicida inibidor de HPPD selecionado a partir de isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, pirassulfotol, sulcotriona, topramezona, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3 Cl2 fenil)propano-1,3-diona.

Em outras realizações específicas, os métodos acima de acordo com a presente invenção envolvem um herbicida inibidor de HPPD da classe de tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionado a partir de tembotriona, sulcotriona e mesotriona, mais especificamente tembotriona.

Dentro do significado da presente invenção, compreende-se que “herbicida” é uma substância ativa como herbicida por si própria ou uma substância que é combinada com um aditivo que altere a sua eficácia, tal como um agente que aumente a sua atividade (um agente sinérgico) ou que limite a sua atividade (um agente de segurança). Naturalmente, deve-se compreender que, para a sua aplicação na prática, os herbicidas acima são combinados, de uma forma que seja intrinsicamente conhecida, com os adjuvantes de formulação que são costumeiramente empregados na química agrícola.

Quando a planta que foi transformada de acordo com a presente invenção contiver um ou mais genes diferentes de tolerância contra outros herbicidas (tal como um gene que codifica um EPSPS que sofreu ou não mutação e confere à planta tolerância contra herbicidas de glifosato ou um gene pat ou bar que confere tolerância contra herbicidas de glufosinato) ou quando a planta transformada for naturalmente sensível a um outro herbicida (tal como tolerância contra sulfonilureia), o método de acordo com a presente invenção pode compreender a aplicação simultânea ou coordenada cronologicamente de um inibidor de HPPD em combinação com o mencionado herbicida ou combinação de herbicidas, tais como herbicidas de glifosato e/ou glufosinato e/ou sulfonilureia.

A presente invenção também se refere ao uso do gene quimérico que codifica uma HPPD mutada de acordo com a presente invenção como um gene marcador durante a transformação de uma espécie vegetal, com base na seleção dos herbicidas inibidores de HPPD mencionados acima.

A presente invenção também se refere a um método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD tricetona ou pirazolinato, caracterizado pelo fato de que a planta é transformada com um gene quimérico que expressa na planta uma HPPD mutada no aminoácido glicina na posição 336 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2.

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se ao mencionado método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD tricetona ou pirazolinato, caracterizado pelo fato de que a mutação de HPPD é selecionada a partir de Gly336Arg, Gly336Asp, Gly336Glu, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336trp, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se ao mencionado método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD de tricetona selecionado a partir de tembotriona, mesotriona e sulcotriona.

Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se ao mencionado método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPPD de tricetona ou pirazolinato, caracterizado pelo fato de que a planta é adicionalmente transformada, simultânea ou sucessivamente, com um gene funcional nessa planta que permite a hiperexpressão de uma enzima PDH (prefenato desidrogenase).

A presente invenção também se refere a um método de controle de ervas daninhas em uma área ou campo, em que o método compreende a plantação nessa área ou campo de plantas transformadas resistentes a um inibidor de HPPD de tricetona ou pirazolinato que foi obtido de acordo com o método descrito acima ou sementes transformadas que dele se originam e na aplicação de uma dose que é tóxica para as ervas daninhas do mencionado inibidor de HPPD de tricetona ou pirazolinato sem afetar significativamente as mencionadas sementes transformadas ou as mencionadas plantas transformadas.

A presente invenção também se refere a um método de obtenção de óleo ou farelo que compreende o cultivo ou um inibidor de HPPD pirazolinato ou tricetona que tenha sido obtido de acordo com o método descrito acima ou uma semente transformada que se origina dessa planta, tratamento opcional dessa planta ou semente com um inibidor de HPPD tricetona ou pirazolinato, colheita dos grãos e moagem dos grãos para elaborar farelo e extrair o óleo.

A presente invenção também se refere ao uso de uma HPPD mutada no aminoácido glicina na posição 336 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2 para tornar as plantas tolerantes a um inibidor de HPPD tricetona ou pirazolinato.

A presente invenção também se refere ao uso de uma HPPD mutada conforme descrita acima, caracterizado pelo fato de que a mutação de HPPD é selecionada a partir de Gly336Arg, Gly336Asp, Gly336Glu, Gly336His, Gly336Met, Gly336Phe, Gly336trp, Gly336Asn, Gly336Cys e Gly336Val.

A presente invenção também se refere ao uso de uma HPPD mutada conforme descrita acima, caracterizado pelo fato de que o inibidor de HPPD é um inibidor de HPPD de tricetona selecionado a partir de tembotriona, mesotriona e sulcotriona.

A presente invenção também se refere a um organismo hospedeiro, particularmente células vegetais ou plantas, que contêm um gene quimérico que compreende uma sequência que codifica uma HPPD mutada de acordo com a presente invenção e que também contém um gene funcional nesse organismo hospedeiro que permite a hiperexpressão de uma enzima prefenato desidrogenase (abreviada no presente PDH).

Na expressão “gene que é funcional em plantas, permitindo a hiperexpressão de uma enzima PDH”, o termo “PDH” deverá ser interpretado como indicando qualquer enzima PDH natural ou mutada e exibe a atividade de PDH de conversão de prefenato em HPP. Particularmente, a mencionada enzima de PDH pode originar-se de qualquer tipo de organismo. Uma enzima com atividade de PDH pode ser identificada por meio de qualquer método que possibilite a medição da queda da quantidade de substrato prefenato ou a medição do acúmulo de um produto derivado da reação enzimática, ou seja, HPP ou um dos cofatores NADH ou NADPH. Particularmente, a atividade de PDH pode ser medida por meio do método descrito no Exemplo 4.

Muitos genes que codificam enzimas de PDH são descritos na literatura e suas sequências podem ser identificadas no Website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/. É particularmente conhecido o gene que codifica a enzima PDH da levedura Saccharomyces cerevisiae (Acesso n° S46037) conforme descrito em Mannhaupt et al (1989), de uma bactéria do gênero Bacillus, particularmente da espécie B. subtilis (Acesso n° P20692) conforme descrito em Henner et al (1986), de uma bactéria do gênero Escherichia, particularmente da espécie E. coli (Acesso n° KMECTD) conforme descrito em Hudson et al (1984), ou de uma bactéria do gênero Erwinia, particularmente da espécie E. herbicola (Acesso n° S29934), conforme descrito em Xia et al (1992).

A presente invenção refere-se ainda a um método de obtenção de um organismo hospedeiro, particularmente uma célula vegetal ou uma planta, resistente a um inibidor de HPDD por meio da integração a esse organismo de pelo menos uma sequência de ácido nucleico ou um gene quimérico conforme definido acima e por meio da sua transformação adicional, simultânea ou sucessivamente, com um gene funcional nesse organismo hospedeiro que permite a hiperexpressão de uma enzima PDH (prefenato desidrogenase).

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se a um método de obtenção de um organismo hospedeiro, particularmente uma célula vegetal ou planta, resistente a um inibidor de HPDD tricetona ou pirazolinato, particularmente tembotriona, mesotriona ou sulcotriona.

Meios e métodos que poderão ser utilizados para a obtenção de organismos hospedeiros, particularmente uma célula vegetal ou uma planta, transformadas com um gene que permite a hiperexpressão de uma enzima HPPD, e com um gene que permite a hiperexpressão de uma enzima PDH são extensamente descritos na publicação WO 04/024928, cujo teor é incorporado ao presente como referência.

A referência no presente relatório descritivo a qualquer publicação anterior (ou informações dela derivadas) ou a qualquer objeto que seja conhecido não é e não deverá ser considerada reconhecimento, admissão ou qualquer forma de sugestão de que a publicação (ou informação) anterior ou matéria conhecida faz parte do conhecimento geral comum no campo da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1: alinhamento das sequências de HPPD de Streptomyces avermilitis, Daucus carota, Arabidopsis thaliana, Zea mais, Hordeum vulgare, Mycosphaerella graminicola, Coccicoides immitis, Mus musculus e Pseudomonas fluorescens. A numeração dos aminoácidos é realizada de acordo com a sequência de Pseudomonas e um asterisco designa os aminoácidos que são comuns a essas sequências.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID N° 1: sequência de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Pseudomonas fluorescens.

SEQ ID N° 2: sequência de aminoácidos de HPPD de Pseudomonas fluorescens.

SEQ ID N° 3: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Arabidopsis thaliana.

SEQ ID N° 4: sequência de aminoácidos de HPPD de Arabidopsis thaliana.

SEQ ID N° 5: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Mus musculus.

SEQ ID N° 6: sequência de aminoácidos de HPPD de Mus musculus.

SEQ ID N° 7: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Coccidioides immitis.

SEQ ID N° 8: sequência de aminoácidos de HPPD de Coccidiodides immitis.

SEQ ID N° 9: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Mycosphaerella graminicola.

SEQ ID N° 10: sequência de aminoácidos de HPPD de Mycosphaerella graminicola.

SEQ ID N° 11: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Hordeum vulgare.

SEQ ID N° 12: sequência de aminoácidos de HPPD de Hordeum vulgare.

SEQ ID N° 13: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Zea mais.

SEQ ID N° 14: sequência de aminoácidos de HPPD de Zea mais.

SEQ ID N° 15: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Daucus carota.

SEQ ID N° 16: sequência de aminoácidos de HPPD de Daucus carota.

SEQ ID N° 17: sequência de ácido nucleico que codifica HPPD de Streptomyces avermilitis.

SEQ ID N° 18: sequência de aminoácidos de HPPD de Streptomyces avermilitis.

SEQ ID N° 19: sequência de primer kerfiOOI.

SEQ ID N° 20: sequência de primer kerfi002.

SEQ ID N° 21: sequência de primer kerfi003.

SEQ ID N° 22: sequência de primer kerfi004.

SEQ ID N° 23: sequência de primer kerfi007.

SEQ ID N° 24: sequência de primer kerfi008.

SEQ ID N° 25: sequência de primer kerfiO11.

SEQ ID N° 26: sequência de primer kerfi012.

SEQ ID N° 27: sequência de primer kerfi014.

SEQ ID N° 28: sequência de primer kerfi016.

SEQ ID N° 29: sequência de primer kerfi019.

SEQ ID N° 30: sequência de primer kerfi020.

SEQ ID N° 31: sequência de primer kerfi015.

SEQ ID N° 32: sequência de primer kerfi018.

EXEMPLOS

Os vários aspectos da presente invenção serão mais bem compreendidos com o auxílio dos exemplos experimentais que seguem. Todos os métodos ou operações que são descritos abaixo nesses exemplos são fornecidos como forma de exemplo e correspondem a uma seleção que é elaborada a partir dos diferentes métodos que são disponíveis para chegar ao mesmo resultado ou similar. Esta escolha não possui efeito sobre a qualidade do resultado e, consequentemente, os técnicos no assunto podem utilizar qualquer método apropriado para chegar ao mesmo resultado ou similar. A maior parte dos métodos de manipulação de fragmentos de DNA é descrita em

Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1 e 2, Ausubel, F. M. et al, publicado pela Greene Publishing Associates & Wiley Interscience (1989) ou em Molecular Cloning, T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, 1982, ou em Sambrook, J. e Russell, D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (terceira edição).

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE HPPD MUTADA DESCRIÇÃO GERAL

A sequência codificadora de AtHPPD de Arabidopsis thaliana (1335 pb) (Genebank AF047834; WO 96/38567) foi clonada inicialmente no vetor de expressão pQE-30 (QIAGEN) entre os sítios de restrição de BamHI e HindIII.

A sequência codificadora de PfHPPD de Pseudomonas fluorescens (1174 pb) (Rüetschi et al, Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567) foi clonada inicialmente no sítio NcoI exclusivo do vetor de expressão pKK233-2 (Pharmacia) que fornece um códon de início.

Os vetores pQE-30-AtHPPD e pKK233-2-PfHPPD foram utilizados para conexão mediada por PCR de um sítio de restrição de NcoI e de uma sequência que codifica uma marca His6 N-terminal às extremidades 5’ e um sítio de restrição de XbaI às extremidades 3’ de AtHPPD e PfHPPD.

O produto de PCR do gene AtHPPD foi isolado a partir de um gel de agarose, cortado com as enzimas de restrição NcoI e XbaI, purificado com o Kit de Purificação de PCR MinElute® (Qiagen) e clonado no vetor pSE420(RI)NX cortado com as mesmas enzimas de restrição.

Com referência ao gene PfHPPD, o produto de PCR foi isolado de um gel de agarose e clonado no vetor PCR®2.1-TOPO®. Ele foi extirpado desse vetor com as enzimas de restrição NcoI e XbaI, isoladas de um gel de agarose e clonadas no vetor pSE420(RI)NX cortado com as mesmas enzimas de restrição. Ambos, pSE420(RI)NX-AtHPPD e -PfHPPD, foram submetidos a mutagênese sítio-dirigida mediada por PCR para alterar um códon definido em sítios correspondentes dos dois genes. O códon correspondente codifica Gly336 em WT PfHPPD e Gly422 em WT AtHPPD.

Os códons que sofreram mutação nas sequências codificadoras são analisados utilizando o método de Pirossequenciamento®.

LIGAÇÃO MEDIADA POR PCR DE UMA SEQUÊNCIA QUE CODIFICA UMA MARCAÇÃO HIS6 N-TERMINAL E SÍTIOS DE RESTRIÇÃO NCO I E XBA I

A reação de PCR para cada gene (AtHPPD e PfHPPD) foi conduzida em 24 poços de uma placa de PCR com 96 poços, respectivamente. Como os primers direto e reverso para essa reação diferem de tamanho em 18 (AtHPPD) e 22 pb (PfHPPD), foi realizado um gradiente de temperatura de anelamento de 40,9 °C a 64,5 °C, em que cada poço é submetido a uma outra temperatura de anelamento dentro dessa faixa. Quando os primers anelam no molde de fita única pela primeira vez, foi produzida uma sobreposição 5’ na nova fita, até que a sua fita complementar é sintetizada e essa sobreposição formada pela região 5’ do primeiro primer é parte do molde. As sequências codificadoras foram estendidas desta forma nas duas extremidades, introduzindo uma sequência que codifica uma marcação His6 N-terminal e um sítio de restrição nas duas extremidades. As misturas de reação contêm 500 ng de DNA de pQE-30- At HPPD pQE-30 (1 μl de maxipreparação de plasmídeos) ou 1 μg de DNA de pKK233-2-PfHPPD (0,75 μl de maxipreparação de plasmídeos), 1 μl de kerfi001 e kerfi002, respectivamente, para AtHPPD ou kerfi003 e kerfi004, respectivamente, para AtHPPD ou kerfi003 e kerfi004, respectivamente, para PfHPPD (todas as soluções de primer possuem uma concentração de 10 pmol*μl-1), 25 μl de mistura Master HotStarTaq (Qiagen) e água em grau de biologia molecular HyPure® até um volume final de 50 μl. O programa de PCR é definido conforme segue:

A etapa 2 é repetida vinte vezes.

As reações de PCR foram submetidas a eletroforese em gel de agarose que produziu faixas claras correspondentes a fragmentos de cerca de 1500 pb (AtHPPD) ou 1100 pb (PfhPPD). As faixas foram recortadas do gel e o DNA foi purificado utilizando o Kit de Extração de Gel QIAquick® (Qiagen).

CLONAGEM NO VETOR PCR®2.1-TOPO® (INVITROGEN)

O vetor pCR®2.1-TOPO® (3931 pb) foi utilizado para clonagem em uma etapa de produtos de PCR amplificados por Taq polimerase que exibem sobreposições de 3’-adenosina (A). O vetor, por sua vez, foi linearizado e exibiu sobreposições de 3’-timidina (T) isoladas nas suas extremidades. A topoisomerase I foi ligada covalentemente a essas 3’-timidinas que serviram de ligação covalente do vetor ao produto de PCR. Para seleção de células bacterianas que conduzem o vetor, poder-se-á utilizar ampicilina ou canamicina. O vetor possuiu um sítio de restrição de XbaI nos seus diversos sítios de clonagem e um sítio de restrição de NcoI no gene KanR.

As soluções de DNA obtidas de cada extração de gel foram utilizadas para clonagem de TOPO TA, respectivamente. Após a transformação de células TOP10 de E. coli, cada reação gerou três colônias brancas (A1-A3, P1-P3) que foram utilizadas para inocular 5 ml de meio LB/amp.

Para determinar se os vetores dessas colônias conduziam o fragmento inserido correto, foi preparado DNA de plasmídeo a partir de 4 ml de cultivos A1-A3 de pCR®2.1-TOPO®-AtHPPD e cultivos P1-P3 de PfHPPD utilizando o Kit de Minipreparação de Centrifugação QIAprep® (Qiagen). Soluções de DNA obtidas dessas preparações de plasmídeos foram submetidas a digestão de restrição com HindIII e XhoI que foi analisado em seguida sobre um gel de agarose a 1%. Tanto HindIII quanto XhoI possuem um único sítio de restrição no vetor pCR®2.1-TOPO®-AtHPPD/PfHPPD, respectivamente. A digestão de restrição de DNA do clone A1 produziu as faixas esperadas que representam um fragmento de 1461 pb (sequência codificadora de AtHPPD) e o fragmento de vetor de 3831 pb; a digestão de restrição de P3 produziu as faixas esperadas que representam um fragmento de 1206 pb (sequência codificadora de PfHPPD) e o fragmento de vetor de 3831 pb sobre o gel de agarose.

DNA obtido por meio da maxipreparação de plasmídeos utilizando o Kit Maxi QIAfilter® (Qiagen) e uma precipitação de NaAc e EtOH subsequente a partir de 100 ml de cultivo de LB/amp líquido A1 (AtHPPD) ou P3 (PfHPPD) foi utilizado para determinar a sequência de DNA do gene HPPD inserido correspondente no vetor pCR®2.1-TOPO®. Conduziu-se sequenciamento de DNA com os primers M13 uni (-21) e M13 rev (-29) pela Eurofins MWG GmbH.

O sequenciamento confirmou a sequência de DNA correta de AtHPPD e PfHPPD no vetor pCR®2.1-TOPO®, incluindo os sítios de restrição nas duas extremidades das sequências codificadoras.

CLONAGEM EM PSE420(RI)NX

O vetor de clonagem e expressão pSE420(RI)NX (5261 pb) é baseado no plasmídeo pSE420 da Invitrogen. Modificações desse vetor incluem a adição de um gene de tolerância a canamicina e a remoção da maior parte da região superligante (múltiplos sítios de clonagem).

O plasmídeo possui o promotor trp-lac (trc) e o gene lacIq que fornece o repressor lac em cada linhagem hospedeira de E. coli. O repressor lac liga-se ao operador lac (lacO) e restringe a expressão do gene alvo; esta inibição pode ser aliviada por meio da indução com isopropil β-D-1- tiogalactopiranosida (IPTG).

Os genes AtHPPD e PfHPPD foram clonados no vetor pSE420(RI)NX entre os sítios de restrição de NcoI e XbaI.

MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA COM BASE EM PCR

DNA molde (pSE420(RI)NX-AtHPPD e pSE420(RI)NX- PfHPPD) foi isolado de cultivo líquido de TOP10 de E. coli por meio da realização de uma minipreparação de plasmídeos. As soluções de DNA obtidas por meio dessas minipreparações foram diluídas até uma concentração de 0,05 μg*μl-1. Mutagênese sítio-dirigida com base em PCR necessita de dois primers de DNA quimicamente sintetizados (primer direto e reverso) que são complementares para a mesma região de DNA, cada um dos quais para uma fita molde de DNA de fita dupla. Esses primers contêm a mutação desejada no seu centro e cobrem uma região de cerca de vinte a trinta nucleotídeos do molde, incluindo o sítio de mutação e dez a quinze bases sobre cada um dos seus lados. O sítio de mutação cobre três nucleotídeos que variam 46/60 independentemente nos primers, a fim de obter cada códon possível no sítio selecionado.

Na mutagênese de PCR circular, um molde de plasmídeo é completamente copiado por meio de reprodução de círculos de rolamento a partir da extremidade 3’ OH de um primer que é incorporado à fita em crescimento. Cada nova molécula de DNA conduz em seguida um ou mais nucleotídeos alterados que estavam contidos no primer. Utiliza-se DNA polimerase de alta fidelidade, a fim de reduzir a possibilidade de mutações indesejadas adicionais.

Os pares de primers de oligonucleotídeos kerfi007/kerfi008 (AtHPPD) e kerfi011/kerfi012 (PfHPPD) foram dissolvidos em água até uma concentração de 10 pmol*μl-1. Para a reação de PCR por mutagênese, foram utilizados 50 ng de plasmídeo molde de minipreparações de pSE420(RI)NX- AtHPPD ou pSE420(RI)NX-PfHPPD, diluídas até uma concentração de 0,05 μg*μl-1. A mistura de reação foi composta conforme segue:

O programa de PCR foi o mesmo para mutagênese de AtHPPD e PfHPPD e o tempo de alongamento foi definido em sete minutos, considerando que leva um minuto para reproduzir 1 kb de DNA de plasmídeo.

A etapa 2 é repetida dezoito vezes.

Após a reação de PCR, as reações foram mantidas sobre gelo para resfriamento até a temperatura ambiente.

Em seguida, os plasmídeos mutantes de reação de PCR foram selecionados utilizando a endonuclease de restrição Dpn I. Somente DNA dam-metilado é degradado pela enzima de restrição Dpn I cujo sítio de restrição GMe6ATC é relativamente abundante. Os moldes de plasmídeo que foram produzidos por bactérias foram metilados e são, portanto, degradados. DNA amplificado por PCR, entretanto, mantém-se intacto.

Adicionou-se 1 μl de enzima de restrição Dpn I (10 U*μl-1) às reações de PCR e as soluções foram misturadas por meio de pipeta para cima e para baixo. Após um minuto de centrifugação (13.200 rpm), as reações foram incubadas a 37 °C por uma hora.

Os plasmídeos mutantes continham entalhes coordenados na extremidade 5’ de cada primer e poderiam ser transformados diretamente em células competentes. Para concentrar plasmídeos mutantes, foi conduzida uma precipitação de NaAC e EtOH e o DNA foi novamente suspenso em 10 μl de Água em Grau de Biologia Molecular HyPure®. Foram utilizados posteriormente 3 μl dessas soluções de plasmídeos para transformação de células K-12 MG1655 de E. coli eletrocompetentes e, no caso de AtHPPD, utilizou-se 1 μl para transformação de células TOP10 de E. coli eletrocompetentes.

Para AtHPPD, foi obtido um total de 62 clones K-12 MG1655 de E. coli, que foram cultivados para análise subsequente do códon mutado em placas com 96 poços profundas de 2 ml Costar®. Para obter um número mais alto de clones, utilizou-se E. coli TOP10 como hospedeiro alternativo de clonagem de plasmídeos em mutagênese. A transformação de células TOP10 de E. coli com plasmídeos que sofreram mutagênese gerou diversas centenas de clones.

Com referência a PfHPPD, foi obtido um total de 252 clones K-12 MG1655 de E. coli que foram cultivados para análise conforme descrito para clones transformados com plasmídeos AtHPPD.

EXEMPLO 2 REAÇÕES DE PIROSSEQUENCIAMENTO® PARA VERIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES PONTUAIS

A tecnologia de Pirossequenciamento® foi utilizada para verificar mutações pontuais por meio da determinação da sequência de nucleotídeos de uma seção curta definida de DNA. Foi realizada uma reação de PCR antes da amplificação de um fragmento de DNA curto que contém a seção a ser sequenciada. O molde amplificado por PCR necessita ter fita única e ser ligado covalentemente a uma molécula de biotina na sua extremidade 5’. Biotina serviu para ligar o molde de forma não covalente a estreptavidina que foi ligada a uma fase estacionária de agarose reticulada (sefarose).

AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS DE DNA BIOTINILADOS

A reação de PCR foi conduzida em placas de PCR com 96 poços. A mistura de reação contém 1 μl de solução de primer direto (kerfi016 para AtHPPD, kerfi020 para PfHPPD; 10 pmol*μl-1), 1 μl de solução de primer reverso (contém uma modificação de biotina nas suas extremidades 5’; kerfi019 para AtHPPD, kerfi014 para PfHPPD; 10 pmol*μl-1), 2 μl de cultivo bacteriano líquido de um clone cultivado em uma placa com poços profundos, 25 μl de Mistura Master HotStarTaq® e 21 μl de Água em Grau de Biologia Molecular HyPure®.

Os programas de PCR para AtHPPD e PfHPPD apresentaram diferenças nas temperaturas de anelamento, que foram definidas em 55 °C e 60 °C, respectivamente.

REAÇÃO DE PIROSSEQUENCIAMENTO®

A reação de Pirossequenciamento® (Biotage) foi conduzida em placas com 96 poços. A cada 45 μl de reação de PCR, foram adicionados 40 μl de tampão de ligação (10 mM de Tris-HCl; 2 M de NaCl; 1 mM de EDTA; 0,1% Tween 20), 3 μl de esferas de estreptavidina sefarose (composição patenteada - GE Healthcare BioScience AB) e 12 μl de ddH2O. Essas misturas foram agitadas por dez minutos na placa de PCR com 96 poços.

Com uma “ferramenta de preparação de vácuo”, cada solução foi depositada em seguida por meio de um pequeno filtro fixado a um pequeno tubo metálico, enquanto as esferas de estreptavidina, agora ligadas ao produto de PCR biotinilado, foram retidas sobre os filtros por meio da sucção. Segundo este princípio, os filtros foram imersos em seguida em etanol a 70% por cinco segundos para lavar o DNA e remover os primers, dNTPs e outros componentes da reação de PCR. O procedimento foi repetido com 0,2 M de NaOH para desnaturar dsDNA e deixar apenas a fita de DNA biotinilada ligada às esferas de estreptavidina. Após uma lavagem final do DNA em tampão de lavagem, a “ferramenta de preparação de vácuo” foi mantida sobre uma placa PSQ® 96 que continha 40 μl de tampão de anelamento e 0,1 μl de solução de primer de Pirossequenciamento® (100 pmol*μl*; kerfi018 para At HPPD/kerfi015 para PfHPPD) por poço. O vácuo foi desligado em seguida e cada filtro foi mergulhado na seu poço correspondente para dissolver o DNA que foi retido pelo filtro. A placa foi incubada em seguida a 80 °C por dois minutos para resolver estruturas secundárias eventualmente formadas nos moldes de DNA. Enquanto as soluções eram resfriadas à temperatura ambiente, os primers de Pirossequenciamento® se hibridizavam nos seus sítios de ligação sobre o molde.

Os componentes restantes das reações de Pirossequenciamento® (620 μl de mistura de enzimas, 620 μl de mistura de substratos e 130 μl de cada solução de dNTP) foram colocados em poços separados de um cartucho. O cartucho e a placa PSQ® foram colocados em seguida no interior do ID de PyroMark®.

O instrumento de Pirossequenciamento® adicionou automaticamente enzima e substrato à mistura de reação antes do início da reação de sequenciamento por meio da adição do primeiro dNTP. Para determinar a sequência de DNA abaixo no fluxo do primer, é conduzida uma rodada de SQA. A ordem dos nucleotídeos adicionados à mistura de reação é definida antecipadamente. Pode-se utilizar o software ID PyroMark® para traduzir os traços de Pyrogram® na sequência de DNA.

RESULTADOS

O fragmento amplificado por PCR de AtHPPD possui um tamanho de 239 pb e a biotina é ligada à fita sem codificação; o fragmento de PfHPPD compreende 142 pb e a biotina é ligada à fita codificadora.

O códon mutado em AtHPPD está localizado a três bases abaixo no fluxo da sequência de primer de kerfi018. As primeiras três bases sequenciadas são adeninas, seguidas pelo códon mutado. A fita codificadora do fragmento de AtHPPD é sintetizada pela DNA polimerase, de tal forma que a sequência possa ser traduzida diretamente na sequência de aminoácidos.

A seleção de 438 colônias de AtHPPD emitiu 146 genes mutantes, 181 genes do tipo selvagem (códon GGC na posição 422) e 111 deixaram de ter reações de sequenciamento ou resultados ambíguos.

A produção de clones mutantes por meio da transformação de plasmídeos mutantes em E. coli K-12 MG1655 ou E. coli TOP10 foi bem sucedida, portanto, em 33% dos casos. Puderam ser obtidos códons que codificam todos os aminoácidos, exceto lisina. Os genes que contêm os códons para ácido glutâmico, histidina, isoleucina, treonina, triptofano e tirosina estavam presentes em clones TOP10 de E. coli dos quais DNA foi preparado e transformado em células MG1655 de E. coli K-12. Se possível, foram selecionados códons sinônimos considerando o uso de códons em E. coli K-12. Não foi selecionado nenhum códon utilizado em uma frequência abaixo de 10% e a maior parte dos códons selecionados é utilizada em uma frequência superior a 35% (banco de dados de uso de códons; E. coli K-12: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=83333).

A partir do primer kerfi015, a fita sem codificação do fragmento PfHPPD é sintetizada pela DNA polimerase, de tal forma que a sequência de nucleotídeos necessitasse ser traduzida para o complemento reverso antes que pudesse ser traduzida na sequência de aminoácidos. O códon mutado sucede imediatamente o primer e, portanto, é representado pelas três primeiras bases sequenciadas na reação.

A seleção de 252 colônias de PfHPPD emitiu 119 genes mutantes, 73 genes inalterados, códon TGG na posição 336) e sessenta reações de sequenciamento mal sucedidas ou resultados ambíguos.

A produção de clones mutantes por meio da transformação de plasmídeos mutantes em células MG1655 de E. coli K-12 foi bem sucedida, portanto, em 47% dos casos. Puderam ser utilizados os códons que codificam todos os aminoácidos, exceto alanina. Se possível, sinônimos de códons foram selecionados considerando-se o uso de códons em E. coli K-12 conforme descrito acima para códons de AtHPPD.

EXEMPLO 3 TESTE DA ATIVIDADE DE HPPD

HPPD produz homogentisato e CO2 de 4-HPP e O2. A enzima é incubada com o seu substrato 4-HPP na presença ou ausência de um inibidor. Ácido L-ascórbico está presente na forma de redutor para reter o ferro em sítio ativo na forma ferrosa e catalase está presente para degradar H2O2 tóxico. Após um tempo de incubação de uma hora, a reação é suspensa por meio da adição de 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNP). DNP forma um derivado de hidrazona com as moléculas de 4-HPP restantes na mistura de teste que aparece com coloração âmbar-marrom sob pH alcalino. A quantidade de 4- HPP não consumido é medida fotometricamente a 405 nm.

Para a preparação de soluções padrão inibidoras, Tembotriona (Mw = 440,82) e DKN (Mw = 359,3) são dissolvidos em DMSO até uma concentração de 10 mM. Essa solução padrão é diluída em primeiro lugar por vinte vezes em DMSO a 25% até uma concentração de 0,5 mM. São elaboradas diluições adicionais com ddH2O para a obtenção das soluções inibidoras utilizadas no teste (5 μM, 10 μM e 20 μM). A solução inibidora correspondente representa a metade do volume da mistura de teste, o que significa que a sua concentração ativa é novamente reduzida duas vezes. Isso resulta em concentrações de inibidor de 2,5 μM, 5 μM e 10 μM. Uma solução de DMSO a 2% fornece a metade da mistura de teste em reações não inibidas para normalizar um possível efeito inibidor de DMSO.

O teste é projetado para uma concentração de HPPD de 444 nM em base monomérica e uma concentração de 4-HPP de 500 μM. Isso corresponde a 44,4 pmol de HPPD e 50 nmol de 4-HPP em uma mistura de teste de 100 μl, o que resulta em um excesso de cerca de mil vezes de substrato com relação à enzima. O peso molecular teórico calculado de uma subunidade de AtHPPD é de 49,515 kD, o que resulta em 2,2 μg de HPPD por mistura de teste. O peso molecular teórico calculado de uma subunidade de PfHPPD é de 41,205 kD, o que resulta em 1,8 μg de HPPD por mistura de teste. A solução de enzima fornece um quarto do volume da mistura de teste, de tal forma que sejam produzidas soluções padrão de enzimas por meio da diluição de soluções de AtHPPD até 88 μg*ml-1 com 50 mM de tampão TRIS; as soluções de PfHPPD são diluídas até 72 μg*ml-1.

As concentrações de inibidor (2,5 μM, 5 μM e 10 μM) fornecem o excesso de cinco vezes, dez vezes e vinte vezes de inibidor em comparação com a quantidade de enzima. É preparada uma solução de tampão e substrato que fornece um quarto da mistura de teste. 2,5 ml de solução de tampão e substrato contêm 1 ml de 1 M tampão TRIS, 500 μl de solução de 10 mM de 4- HPP, 500 μl de solução de 200 mM de ácido L-ascórbico, 13 μl de solução de Catalase e 487 μl de ddH2O. O teste é conduzido em microplacas com 96 poços com fundo em F Greiner e todas as reações são conduzidas em três cópias. Os controles são conduzidos seis vezes por placa e contêm 25 μl de 50 mM de TRIS em vez de solução de HPPD (correspondente ao consumo de 0% de 4-HPP) ou uma solução de buffer e substrato que contém 500 μl de 1 M TRIS em vez de 500 μl de 10 mM de 4-HPP (correspondente a consumo de 100% de HPP). A reação é iniciada por meio da adição de 25 μl de solução de HPPD a uma mistura de 50 μl da solução de inibidor correspondente ou 50 μl de DMSO a 2% e 25 μl de solução de tampão e substrato. A reação é mantida em processamento por uma hora à temperatura ambiente. A reação é suspensa e a coloração de 4-HPP é induzida pela adição de 50 μl de solução de 0,04% DNP e 3,8 N HCl. Após quinze minutos, a adição de 100 μl de 5 N KOH gera a alteração de coloração do derivado de hidrazona. A medição fotométrica com um leitor de microplacas BMG FLUOstar Galaxy é conduzida imediatamente a 405 nm e os dados obtidos são utilizados para análise das atividades de HPPD na presença e ausência de um inibidor.

RESULTADOS

Os mutantes de AtHPPD na posição 422 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Arabidopsis de SEQ ID N° 4 (ou seja, Gly422Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, His, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr e Val) foram testados junto com a enzima WT no teste de atividade de HPPD (observa-se que Gly422 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Arabidopsis de SEQ ID N° 4 corresponde a Gly336 com relação à sequência de referência de Pseudomonas de SEQ ID N° 2). Todas as enzimas foram ativas, mas apenas as atividades dos mutantes Gly422Ala, Asn, Asp, Cys, His, Met, Phe, Tyr e Val estavam dentro ou acima da faixa (> 70%) da enzima WT. A enzima WT reteve 35% da sua atividade na presença de 2,5 μM de tembotriona; apenas os mutantes Gly422Asn, Cys, His e Val retiveram atividades mais altas que aria mem 39, 44, 51 e 43%, respectivamente. As atividades foram adicionalmente reduzidas sob concentrações mais altas de Tembotriona. Apenas o Gly422His mutante exibiu uma atividade residual de cerca de 40% na presença de 5 e 10 μM de Tembotriona enquanto todas as outras enzimas exibiram atividades comparáveis à enzima WT nessas concentrações de inibidor, que variam de cerca de 20 a 10%, respectivamente (Tabela 1).

Os mutantes PfHPPD Gly336Arg, Asp, Gln, Glu, His, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp e Pro foram testados junto com a enzima WT. Com exceção do mutante Gly336Pro, cuja atividade não exibida variou abaixo de 70% da atividade de WT, as atividades dos mutantes de Gly336 estavam dentro ou acima da faixa da enzima WT (> 75%). A enzima WT reteve apenas 5% da sua atividade na presença de 2,5 μM de Tembotriona, enquanto os mutantes Gly336Asp, Arg, Gln, Glu, His, Met, Phe e Trp retiveram atividades acima de 14%. As atividades residuais mais altas foram as de Gly336His (26%) e Gly336Phe (33%). De forma interessante, o mutante Gly336His exibiu atividades residuais de 13 e 11,2% na presença de 5 e 10 μM de Tembotriona, respectivamente, enquanto as atividades de Gly336Phe foram reduzidas para 12,4 e 2,5%, respectivamente. O mutante de Gly336Met exibiu atividades residuais de 7 e 10%, respectivamente, nessas concentrações de inibidor, enquanto a atividade da enzima WT foi reduzida a zero (Tabela 1).

TABELA 1 ATIVIDADE RELATIVA (EM PERCENTUAL) DE MUTANTES PF HPPD E THPPD NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE TEMBOTRIONA

As atividades são normalizadas definindo-se a atividade de enzima não inibida em 100%. HPPD de Pseudomonas fluorescens: * Mutação no gly na posição 422 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Arabidopsis de SEQ ID N° 4 (corresponde a Gly336 com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID N° 2).

EXEMPLO 4 TESTE DA ATIVIDADE DE PDH

A atividade de prefenato desidrogenase foi medida a 25 °C por meio de monitoramento espectrofotométrico a 340 nm da formação de NADH ou NADPH em uma solução contendo 50 mM de tris-HCl, pH 8,6, 300 μM de prefenato e 1 mM de NAD ou NADP em um volume total de 200 μl.

EXEMPLO 3 CONSTRUÇÃO DE GENES QUIMÉRICOS PARA AVALIAÇÃO DE PF HDDP COM E SEM MUTAÇÃO EM FUMO A. Construção dos genes quiméricos:

O vetor que é empregado para elaborar as construções cujo HPPD (tipo selvagem ou mutantes) a ser expresso em plantas de fumo do tipo PBD6 é denominado pRP-RD224. Este vetor foi concebido inicialmente para a clonagem de todos os mutantes HPPD de Pseudomonas por meio de simples substituição do gene HPPD truncado desse vetor entre os sítios KpnI e BstEII. A sua construção a partir do vetor binário pBI121 (Clontech) é extensamente descrita em WO 99/24585.

O clone pRP-RD224 possui, portanto, a estrutura a seguir: RB/promotor Nos/NPTII/terminal Nos/promotor de histona dupla/tev/otp/HPPD truncado/terminal Nos/LB em que “HPPD truncado” designa a sequência que codifica o PfHPPD truncado de cerca de quinhentos pares de bases em ordem subsequente para facilitar a seleção das colônias transformadas que integraram os HPPDs mutantes (WO 99/24585).

MUTANTES PRP-RD224

Os DNAs dos vetores que conduzem os HPPDs com e sem mutação foram digeridos com KpnI e BstEII, purificados e ligados em seguida ao vetor pRP- RD224, que havia sido digerido com KpnI e BstEII e purificado. Os transformadores que haviam integrado o gene HPPD mutado foram selecionados pelo tamanho do inserto por meio de digestão com KpnI e BstEII. Os clones resultantes são denominados pRP-RD224, aos quais é adicionado o tipo de mutação que foi conduzido na HPPD; desta forma, foram criados os clones a seguir: pRP RD224 Pf (para a enzima não mutada), pRP RD224 PfH336 (para a enzima que contém uma histidina na posição 336), pRP RD224 PfM336 (para a enzima que contém uma metionina na posição 336) e pRP RD224 PfF336 (para a enzima que contém uma fenilalanina na posição 336).

EXEMPLO 4 CONSTRUÇÃO DE UM GENE QUIMÉRICO QUE HIPEREXPRESSA PDH

A construção de um gene quimérico que sobre-expressa PDH compreende a montagem, na direção da transcrição, de um promotor “histona dupla” (PdH4) conforme descrito no Pedido de Patente n° EP 0.507.698, a sequência amplificadora da tradução do vírus da corrosão de fumo (TEV) descrita em Carrington e Freed (1990), uma sequência codificadora de um peptídeo de trânsito otimizado (OTP) conforme descrito no Pedido de Patente n° EP 0.508.909, a parte codificadora do gene PDH de levedura descrito em Manhaupt et al (1989) e o terminal nos do gene nopalina sintase descrito em Bevan et al (1983). O conjunto foi clonado em seguida no vetor binário pRD 224 que contém um gene de tolerância à canamicina (NPTII), para gerar o vetor pRD 224-PDH.

Este vetor binário foi utilizado em seguida para transformar a linhagem de Agrobacterium EHA 105 e para gerar a linhagem de Agrobacterium EHA 105-pRD 224-PDH. Essa linhagem de Agrobacterium foi utilizada para transformar plantas de fumo transformadas com os genes quiméricos conforme descrito no Exemplo 3.

As plantas transformadas são selecionadas sobre canamicina. REFERÊNCIAS MENCIONADAS Abou-Zeid et al, 1995, Applied Env. Microb. 41: 1298-1302. Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1 e 2, publicado pela Greene Publishing Associates & Wiley Interscience (1989). Bevan et al, 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), 369-385. Bonner et al, 1995, Plant Cells Physiol. 36, 1013-1022. Byng et al, 1981, Phytochemistry 6: 1289-1292. Carrington e Freed, 1990, J. Virol. 64: 1590-1597. Christou et al, 1991, Biotechnology 9: 957. Connely e Conn, 1986, Z. Naturforsch 41c: 69-78. Crouch, N. P. et al, 1997, Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010. Datla, R. et al, 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296. Gaines et al, 1982, Plants 156: 233-240. Henner et al, 1986, Gene 49 (1) 147-152. Hiei et al, 1994, Plant J. 6: 271-282. Hiei et al, 1997, Plant Mol. Biol. 35: 205-21. Hudson et al, 1984, J. Mol. Biol. 180 (4), 1023-1051. Fritze et al, 2004, Plant Physiology 134: 1388-1400. Garcia et al, 1997, Biochem. J. 325, 761-769. Garcia et al, 1999, Plant Physiol. 119, 1507-1516. Gould, J. H. e Magallanes-Cedeno, M., 1998, Plant Molecular Biology Reporter, 16: 1-10. Horsch et al, 1985, Science 227: 1229-1231. Lingens et al, 1967, European J. Biochem. 1: 363-374. Maniatis, T., Fritsch, E. F., em Molecular Cloning, Sambrook, 1982. Mannhaupt et al, 1989, Gene 85, 303-311. Matringe et al, 2005, Pest Management Science 61: 269-276. 5 Mitchell et al, 2001, Pest Management Science 57: 120-128. Pallett et al, 2001, Pest Management Science 57: 133-142. Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. 10 Sambrook, J. e Russell, D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (terceira edição), ISBN 978-087969577-4, CSHL Press. Sampathkumar e Morrisson, 1982, Bioch. Biophys. Acta 701: 204-211. Sawahel, W. A., 2001, Plant Molecular Biology Reporter, 19: 377a-377f. 15 Schulz et al, 1993, FEBS Letters 318: 162-166. Xia et al, 1992, J. Gen. Microbiol. 138 (7), 1309-1316. Zapata, C., 1999, Theoretical Applied Genetics, 98 (2): 1432-2242.

Claims

1. Hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) mutada que mantém as suas propriedades de catalisação da conversão de para-hidroxifenilpiruvato (HPP) em homogentisato, e que é menos sensível a um inibidor de HPPD que a HPPD original não mutada, caracterizada por conter uma mutação no aminoácido glicina na posição 336, com referência à sequência de aminoácidos da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID NO:2, que é Gly336His.

2. Hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) mutada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a HPPD mutada contém uma segunda mutação.

3. Hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) mutada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o segundo aminoácido mutado é selecionado a partir dos aminoácidos selecionados: Pro215, Gly298, Gly332, Phe333, Gly334 e Asn337, com referência à sequência da HPPD de Pseudomonas de SEQ ID NO:2.

4. Sequência de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que a referida sequência é identificada pela SEQ ID NO:1, em que os nucleotídeos 1006-1008 correspondem ao códon His na HPPD mutada codificada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Gene quimérico que compreende uma sequência codificadora bem como um elemento regulador heterólogo na posição 5' e, opcionalmente, na posição 3', que são capazes de funcionar em um organismo hospedeiro, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora contém uma sequência de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4.

6. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por conter, na posição 5' da sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD mutada, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de planta, em que essa sequência é disposta entre a região promotora e a sequência que codifica a HPPD mutada, de forma a permitir a expressão de uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito/HPPD mutada.

7. Proteína de fusão de peptídeo de trânsito/HPPD mutada caracterizada pelo fato de que a HPPD mutada é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

8. Vetor de clonagem e/ou expressão para transformação de um organismo hospedeiro caracterizado por conter um gene quimérico, conforme definido na reivindicação 5 ou 6.

9. Método de obtenção de uma planta resistente a um inibidor de HPDD caracterizado pelo fato de que a planta é transformada com um gene quimérico, conforme definido na reivindicação 5 ou 6.

10. Método para selecionar sementes transformadas ou plantas transformadas, caracterizado por compreender a aplicação às referidas sementes transformadas ou plantas transformadas contendo uma sequência de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4, ou um gene quimérico, conforme definido na reivindicação 5 ou 6, de uma dose de um herbicida inibidor de HPPD que é tóxico para uma semente ou planta que contém um ácido nucleico ou gene HPPD de tipo selvagem, sem afetar significativamente as sementes ou plantas que contêm uma sequência de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4, ou um gene quimérico, conforme definido na reivindicação 5 ou 6.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor de HPPD é tembotriona.