BRPI0823256B1

BRPI0823256B1 - Uso de sacarose como substrato para produção fermentativa de 1,2-propanodiol

Info

Publication number: BRPI0823256B1
Application number: BRPI0823256-3A
Authority: BR
Inventors: Voelker François; Figge Rainer; Soucaille Philippe
Original assignee: Metabolic Explorer
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2018-08-07
Also published as: KR101395971B1; DK2346999T3; CA2741427A1; CN102272316A; WO2010051849A1; KR20110088546A; BRPI0823256B8; CN102272316B; EP2346999A1; EP2346999B1; MX2011004842A; US20150159181A1; ES2429305T3; JP2012507992A; US20110217744A1; US9617567B2; AR074092A1; BRPI0823256A2

Description

(54) Título: USO DE SACAROSE COMO SUBSTRATO PARA PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE 1,2PROPANODIOL (51) Int.CI.: C12P 7/18 (73) Titular(es): METABOLIC EXPLORER (72) Inventor(es): FRANÇOIS VOELKER; RAINER FIGGE; PHILIPPE SOUCAILLE (85) Data do Início da Fase Nacional: 04/05/2011

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE SACAROSE COMO SUBSTRATO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE

1,2-PROPANODIOL.

A presente invenção refere-se a processos de 5 fermentação, a microorganismos e a substratos úteis para fermentação. Em particular, esta invenção está relacionada à produção de 1,2-propanodiol por fermentação, a partir de um meio contendo sacarose, em particular de biomassa de planta.

1,2-Propanodiol ou propileno glicol, um diálcool C3, é um produto químico amplamente usado. Ele é um componente de resinas de poliéster insaturadas, detergentes líquidos, refrigerantes, fluidos anticongelamento e descongelantes

para aeronave.	0 propileno	glicol	vem	sendo
15 progressivamente	usado desde	1993-1994	como	uma
substituição para	derivados	de etileno,	que	são

reconhecidos como sendo mais tóxicos do que os derivados de propileno.

1,2-Propanodiol é atualmente produzido por meios 20 químicos usando um processo de hidratação de óxido de propileno que consome grandes quantidades de água. O óxido de propileno pode ser produzido por qualquer de dois processos, um usando epicloroidrina, e o outro hidroperóxido. Ambas as vias usam substâncias altamente tóxicas. Além disso, a via de hidroperóxido gera subprodutos tais como terc-butanol e 1-fenil etanol. Para a produção de propileno ser proveitosa, um uso precisa ser encontrado para estes subprodutos. A via química geralmente produz 1,2-propanodiol racêmico, enquanto cada um de dois estereoisómeros (R)1,3-propanodiol e (S)1,2-propanodiol é de interesse para certas aplicações (por exemplo, materiais de partida quirais para produtos químicos característicos e produtos farmacêuticos).

TÉCNICA ANTERIOR

As desvantagens dos processos químicos para a produção de 1,2-propanodiol tornam a síntese biológica uma alternativa atraente. Duas vias são caracterizadas para a produção natural de 1,2-propanodiol a partir de açúcares por microorganismos. Na primeira via, açúcares de 6-deóxi (por exemplo, L-ramnose ou L-fucose) são clivados em fosfato de diidroxiacetona e (S)-lactaldeído, que podem ser ainda reduzidos a (S)-1,2-propanodiol (Badia et al., 1985).

Esta via é funcional em E. coli, mas não pode dar um j í

processo economicamente viável devido ao custo elevado das j i

desoxiexoses. A segunda via é o metabolismo de açúcares ] comuns (por exemplo, glicose ou xilose) através da via de I

I

I metilglioxal. 0 fosfato de diidroxiacetona é convertido em I metilglioxal que pode ser reduzido tanto para lactaldeído &

como para acetol. Estes dois compostos podem então sofrer uma segunda reação de redução dando 1,2-propanodiol. Esta via é usada por produtores naturais de (R)-1,2-propanodiol, tais como Clostridium sphenoides e Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Estes dois organismos têm sido usados para produzir 1,2-propanodiol de diferentes açúcares, a saber monossacarideos (D-giicose, D-manose, Dgalactose para as hexoses e D-xilose ou L-arabinose para as pentoses) ou dissacarideos (lactose ou celobiose) ou misturas (Tran Din e Gottschalk, 1985, Cameron e Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al., 1987, Altaras et al., 2001). O melhor desempenho obtido foi um título de 9 g/1 e um rendimento de glicose de 0,2 g/g (Sanchez-Rivera et al.,

1987). No entanto, a melhora de desempenhos obtida com estes organismos deve provavelmente ser limitada devido à deficiência de ferramentas genéticas disponíveis. A mesma via de síntese é funcional em E. coli ou outros

Enterobacteriaceae e várias investigações são feitas pelo grupo de Cameron et al., 1998, Altaras e Cameron, 1999,

Altaras e Cameron, 2000) e o grupo de Bennett (Huang et al., 1999, Berrios-Rivera et al. , 2003) para a produção de

1,2-propanodiol neste organismo com fontes de carbono limitadas a D-glicose ou D-frutose. O melhor resultado obtido em um fermentador de batelada alimentado anaeróbico frjgRàsg.

foi uma produção de 4,5 g/1 de 1,2-propanodiol com um rendimento de 0,19 g/g de glicose (Altares e Cameron,

2000). Os resultados obtidos com a mesma abordagem, mas com títulos e rendimentos mais baixos também são descritos na patente WO 98/37204, embora usando fontes de carbono diferentes, a saber galactose, lactose, sacarose e xilose, mas também glicose. Os títulos obtidos com dissacarídeos (lactose e sacarose) foram muito baixos (6 mg/1 e 7 mg/1, respectivamente). Os melhores resultados de produção foram descritos com uma cepa racionalmente projetada e então evoluída de E. coli no pedido de patente WO 2005/073364. Um título de 1,2-propanodiol de 1,8 g/1 foi obtido, com um rendimento de 0,35 g/g de glicose consumida. A produção de

1,2-propanodiol e hidroxiacetona também foi descrita usando levedura recombinante na patente WO 99/28481.

As fontes de carbono usadas nos meios de fermentação consistiram geralmente de carboidratos, a maior parte derivada de plantas. A sacarose é obtida a partir de plantas de açúcar tais como beterraba, cana-de-açúcar, sorgo doce, bordo sacarina, palmeiras doces e agaves azuis.

Amido é o carboidrato de armazenamento mais abundante em plantas. As fontes de amido mais importantes são cereais (milho, trigo, arroz), mandioca, batatas doces e batatas. O !

amido não é metabolizado pela maioria dos microorganismos, mas pode ser processado para cargas de alimentação fermentáveis pela indústria de amido. Polímeros de inulina ou semelhantes a inulina (consistindo principalmente de unidades de frutose) são o segundo carboidrato de armazenamento mais abundante em plantas e são encontrados na chicória, girassol batateiro ou dália. A biomassa lignocelulósica composta de celulose, de hemicelulose e de lignina também é uma fonte promissora de carboidrato, mas ainda em desenvolvimento (Peters, 2006). Como o custo dos produtos químicos de mercadorias biotecnologicamente produzidas está principalmente relacionado ao custo da matéria-prima (isto é, o custo do substrato de fermentação), o uso de açúcares refinados tal como glicose ou sacarose não é uma escolha economicamente sustentável para a produção em escala industrial. Substratos menos caros são necessários, que retenham um alto teor de açúcar fermentável. A este respeito, fontes de carbono contendo sacarose, provenientes da indústria de açúcar, representam uma boa opção.

A sacarose é produzida a partir de beterraba contendo a 24% de sacarose pelo processamento da beterraba em várias etapas. As beterrabas limpas e lavadas são cortadas j em fatias em tiras longas denominadas cossettes que são extraídas com água quente por difusão para dar um suco de i

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SSâSsã sacarose denominado suco bruto e contendo 10 a 15% de sacarose. A segunda etapa é a purificação do suco bruto por alcalinização e carbonatação usando cal e então dióxido de carbono para remover as impurezas e dar o suco fino. O 5 processo de evaporação aumenta a concentração de sacarose no suco fino removendo água para dar o suco fino com um teor de sacarose de 50 a 65%. Este suco de sacarose concentrado é então cristalizado e os cristais são separados por centrifugação e então lavados e secados para dar o açúcar puro. Uma ou mais etapas de cristalização pode ser aplicada para dar sacarose de vários graus de pureza.

Os subprodutos do processamento de beterraba incluem pastas (os cossettes exauridos) e melados (o licor-mãe remanescente da cristalização tendo ainda um teor de sacarose de 40 a 60%).

A sacarose é então produzida a partir de cana-deaçúcar (7 a 20% de sacarose) pela indústria de açúcar. A cana-de-açúcar colhida é limpa antes do processo de moagem para extração do suco. A estrutura da cana é quebrada e então triturada e ao mesmo tempo a sacarose é extraída com água para dar o suco bruto. A cana esmagada exaurida de açúcar é denominada bagaço. Este resíduo é primeiramente j usado como fonte de combustível para gerar o fluxo do ' processo. O suco bruto é então clarificado adicionando cal ;

I e aquecendo e o suco clarificado é separado do precipitado. As últimas etapas do processo, evaporação para dar um xarope concentrado e cristalização, são essencialmente as mesmas para o processamento de beterraba. Os subprodutos do 5 processamento de cana-de-açúcar incluem bagaço, bolo de filtro da clarificação do suco bruto e tipos diferentes de melados, contendo ainda quantidade significativa de sacarose.

Os diferentes intermediários, produtos ou subprodutos 10 contendo sacarose a partir dos processos de açúcar (suco bruto, suco fino ou clarificado, suco espesso, xarope de sacarose, sacarose pura, melados) podem servir como carga de alimentação de fermentação. Por exemplo, a indústria de açúcar no Brasil está usando suco de cana-de-açúcar clarificado para a produção de etanol a fim de usar um substituto para a gasolina. Exemplos recentes na literatura que usam produtos contendo sacarose bruta incluem a produção de etanol a partir do suco por difusão de beterraba por Zymomonas mobilis (Beckers et al., 1999), a produção de L-lactato a partir de melados por E. coli (Shukla et a., 2004) e a produção de D-lactato a partir de melados de cana-de-açúcar ou suco de beterraba por

Lactobacillus delbrueckii (Calabia et al., 2007).

Dois sistemas diferentes são caracterizados para a captação e utilização de sacarose em bactérias positivas em sacarose (isto é, bactérias capazes de utilizar sacarose).

primeiro é baseado em um sistema de sacarose fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato (PEP) (sacarose PTS) onde a sacarose é absorvida e fosforilada usando fosfoenoipiruvato (PEP) como um doador para dar sacarose-6-fosfato intracelular. A sacarose-6-fosfato é então hidrolisada para D-glicose-6-fosfato e D-frutose por uma invertase. A D-frutose é ainda fosforilada para D10 frutose-6-fosfato por uma frutocinase dependente de ATP e pode então penetrar no metabolismo central. Tal sistema foi descrito em várias espécies bacterianas, gram-positivas bem como gram-negativas. Dentre as cepas de Enterobacteriaceae, mais do que 90% de Klebsiella do tipo selvagem, mas menos do que 50% de Escherichia e menos do que 10% de Salmonella são positivas para sacarose.

Um plasmídeo de conjugação pUR400, carregando os genes scrKYANR codificando a sacarose PTS é isolado de

Salmonella (Schmid	et al.	, 1982;	Schmid et	al.	, 1988).	6
Um segundo	sistema não	PTS foi	descoberto mais
recentemente em	E.	coli	EC3132	(Backmann	et	al. , 1992) . 0
sistema envolve	os	genes	cscBKAR	codificando	um sistema de	1
transporte de	simporte	de sacarose:próton	(CscB), um	í
frutocinase (CscK)	, uma	invertase (CscA)	e	um repressor	SÜ

<r específico de sacarose (CscR).

Escheríchia coli K12 e seus derivados (incluindo MG1655) não podem utilizar sacarose. No entanto, esta capacidade pode ser conferida pela transferência dos genes codificando os dois primeiros sistemas descritos. Isto é demonstrado transferindo o plasmídeo pUR400 em E. coli K12 (Schmid et al., 1982) ou plasmídeos diferentes (incluindo pKJL101-l) carregando os genes cscBKAR em uma cepa de E. coli negativa para sacarose (Jahreis et al., 2002). Como para a aplicação industrial, a produção de triptofano a partir de sacarose é documentada em E. coli K12 (Tsunekawa et al., 1992), a produção de hidrogênio foi mostrada em E. coli transportando o plasmídeo pUR400 (Penfold e Macaskie,

2004) e a produção de diferentes aminoácidos transferindo ambos os sistemas, PTS e não PTS, foi relatada no pedido de patente EP1149911.

A produção de 1,2-propanodiol a partir de sacarose é mencionada em Clostridium thermosaccharolyticum (depois renomeado para T. thermosaccharolyticum) por Cameron e

Cooney (1986), mas somente traços foram registrados enquanto a quantidade mais alta do que 3 g/1 com rendimentos mais altos do que 0,1 g/g de substrato foram obtidos com outras fontes de carbono.

A produção de 1,2-propanodiol a partir de sacarose também é mencionada no pedido de patente WO98/37204. No entanto, a cepa AA200 de E. coli transformada com o plasmídeo pSEARX produz somente 7 mg/1 de 1,2-propanodiol a partir de 10 g/1 de sacarose, enquanto o mesmo microorganismo produz de 49 a 71 mg/1 de 1,2-propanodiol a partir de monossacarídeos. Estes dois valores muito baixos de produção lançam dúvida sobre a capacidade real destes organismos para produzir 1,2-propanodiol a partir de sacarose. Na opinião dos requerentes, a cepa AA200, que é derivada de E. coli K12, não deveria ter a capacidade de importar e então metabolizar a sacarose.

Os relatos anteriores indicaram claramente ao perito na técnica que o uso de sacarose para produzir 1,2propanodiol não foi uma boa opção.

Surpreendentemente, introduzindo sistemas diferentes para utilização de sacarose em cepas de E. coli incapazes de utilizar sacarose, os inventores da presente invenção foram capazes de obter rendimento melhorado para a produção de 1,2-propanodiol a partir de sacarose.

Além disso, os inventores demonstraram que qualquer meio contendo sacarose, tal como um suco ou melados a partir de uma carga de alimentação de planta, pode ser usado como um substrato para a produção fermentativa de

1,2-propanodiol.

β

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para produzir 1,2-propanodiol por fermentação compreendendo:

• cultivar um microorganismo produzindo 1,25 propanodiol em um meio apropriado compreendendo uma fonte de sacarose, e • recuperar o 1,2-propanodiol sendo produzido, sendo que o microorganismo é capaz de utilizar sacarose como a única fonte de carbono para a produção de 1,210 propanodiol.

Em particular, a invenção descreve o uso de um microorganismo modificado capaz de usar sacarose como uma única fonte de carbono, dita sacarose sendo obtida a partir de biomassa, em particular de biomassa de planta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como usado no presente, os seguintes termos podem ser usados para interpretação das reivindicações e relatório.

De acordo com a invenção, os termos cultivar, cultura, crescimento e fermentação são usados intercambiavelmente para significar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples. A fermentação é um processo clássico que pode ser efetuado sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

termo meio apropriado, de acordo com a invenção, significa um meio de composição molecular conhecido adaptado para o crescimento de microorganismo. Em particular, dito meio contém pelo menos uma fonte de fósforo e uma fonte de nitrogênio. Dito meio apropriado é, por exemplo, um meio de cultura de minerais de composição definida conhecida adaptada à bactéria usada, contendo pelo menos uma fonte de carbono. Dito meio apropriado também pode designar qualquer líquido compreendendo uma fonte de nitrogênio e/ou uma fonte de fósforo, dito líquido sendo adicionado e/ou misturado à fonte de sacarose. Em particular, o meio de crescimento de minerais para Enterobacteriaceae pode, assim, ser de composição idêntica ou similar ao meio M9 (Anderson, 1946), meio M63 (Miller,

1992) ou um meio tal como definido por Schaefer et al.

(1999), e, em particular, o meio de cultura mínimo denominado MML11PG1_1OO descrito abaixo:

Tabela 1: Composição do meio mínimo MML11PG1 100 com glicose como fonte de carbono.

Constituinte	Concentração (g/1)
EDTA	0,0084
CoCl₂ 6H₂O	0,0025
MnCl₂ 4H₂O	0,0150
CuC1₂ 2H₂O	0,0015
H3BO3	0,0030

I

Constituinte	Concentração (g/l)
Na₂Mo0₄ 2H₂O	0,0025
Zn(CH₃COO)₂ 2H₂O	0,0130
Citrato de Fe(III) H₂O	0,1064
Ácido cítrico	1, 70
KH₂PO₄	1, 65
K₂HPO₄ 3H₂O	0,92
(NH₄) ₂hpo₄	0,40
(NH₄)₂SO₄	4, 88
MgSO₄ 7H₂O	1, 00
CaCl₂ 2H₂O	0,08
Tiamina	0,01
Glicose	20, 00
Tampão MOPS	40,00

Ο ρΗ do meio é ajustado em 6,8 com hidróxido de sódio.

A fonte de carbono glicose pode ser substituída neste meio por qualquer outra fonte de carbono, em particular por sacarose ou qualquer fonte de carbono contendo sacarose tal como suco de cana-de-açúcar ou suco de beterraba.

meio de crescimento para Clostridiaceae pode ser de composição idêntica ou similar a Clostridial Growth Médium (CGM, Wiesenborn et al., 1987) ou um meio de crescimento de minerais como dado por Monot et al (1982) ou Vasconcelos et al. (1994).

O termo sacarose designa um dissacarídeo de glicose e frutose ligado por uma ligação a(l,2) glicosídica, com a fórmula molecular C12H22O11. Seu nome sistemático é a-Dglicopiranosil-(1θ2)-β-D-frutofuranosídeo.

termo fonte de sacarose ou fonte de sacarose designa um meio, líquido ou sólido, contendo sacarose em concentrações diferentes, em particular de 1 a 100% de sacarose.

termo produzindo 1,2-propanodiol significa que a produção do microorganismo no caldo de cultura pode ser registrada inambiguamente por meio analítico padrão conhecido pelos peritos na técnica. O limite da quantificação de HPLC para 1,2-propanodiol, que é a técnica preferida usada para quantificar este composto, é 25 mg/1.

Portanto, o termo produzir 1,2-propanodiol significa, de acordo com a invenção, que os níveis de produção devem estar acima de 25 mg/1.

O termo capaz de utilizar sacarose como única fonte de carbono indica que o microorganismo pode crescer em um meio contendo sacarose como única fonte de carbono. i

Portanto, a definição de um microorganismo capaz de í utilizar sacarose como a única fonte de carbono para a i produção de 1,2-propanodiol significa que o j microorganismo, quando crescendo em um meio contendo * sacarose como a única fonte de carbono, pode produzir pelo menos 25 mg/1 de 1,2-propanodiol. É, portanto, compreendido que no método para produzir 1,2-propanodiol de acordo com a invenção, a fonte de sacarose no meio de cultura pode compreender fontes de carbono adicionais além de sacarose tal como hexoses (tal como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarídeos, dissacarídeos (tal como sacarose, celobiose ou maltose), oligossacarídeos, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e combinações dos mesmos.

De acordo com um aspecto preferido da invenção, o microorganismo foi modificado geneticamente para ser capaz de utilizar sacarose como a única fonte de carbono, para a produção de 1,2-propanodiol.

Em uma modalidade específica da invenção, o microorganismo compreende genes funcionais codificando um sistema de utilização de sacarose PTS. Um sistema de utilização de sacarose PTS é um sistema para utilização de sacarose baseado no transporte de sacarose por um sistema de sacarose fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato (PEP) (Sacarose-PTS) . Um sistema de fosfotransferase acopla o transporte de um açúcar (por

exemplo, sacarose ou glicose) com a fosforilação do açúcar j usando PEP como doados de fosfato. Após o transporte para dentro da célula, a sacarose-fosfato é clicada em glicoseÊ

·.

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6-fosfato e frutose por uma invertase. Frutose é então fosforilada em frutose-6-fosfato por uma frutocinase. Os genes codificando este sistema de utilização de sacarose PTS podem ser controlados por uma proteína regulatória.

Em um aspecto preferido da invenção, o microorganismo expressa naturalmente ou é modificado com a introdução dos genes: scrKYABR (scrK codificando uma frutocinase, scrY codificando uma porina, scrA codificando a proteína IIBC, scrB codificando uma sacarose-6-Ρ invertase, scrR codificando um repressor) de Salmonella. Um plasmídeo de conjugação pUR400 carregando ditos genes scrKYABR pode ser usado para transformar o microorganismo. Estes genes podem ser usados todos juntos em combinação, ou em qualquer combinação compreendendo pelo menos um destes genes. Em particular, o gene scrR pode ser omitido.

A designação destes genes tem um significado mais geral de acordo com a invenção, e cobre os genes correspondentes em outros microorganismos. Usando as referências de GenBank dos genes de Salmonella, os peritos na técnica podem determinar genes equivalentes em outros ?

organismos que Salmonella.

O meio de identificação de sequências homólogas e suas homologias de percentagem são bem conhecidos dos peritos na técnica, e incluem, em particular, os programas

BLAST que podem ser usados no site da web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros padrão indicados naquele site da web. As sequências obtidas podem ser exploradas (alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), com os parâmetros padrão indicados nestes sites da web.

A base de dados PFAM (base de dados das famílias de proteína de alinhamentos e modelos de Markov ocultos http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) é uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteína. Cada PFAM torna possível visualizar múltiplos alinhamentos, visualizar domínios de proteína, avaliar distribuições entre os organismos, ganhar acesso a outras bases de dados e visualizar estruturas de proteína conhecidas.

Os COGs (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos comparando as sequências de proteínas derivadas de 66 genomas unicelulares completamente sequenciados !

representando as 14 maiores linhagens filogenéticas. Cada í ?

$

COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, i tornando possível identificar domínios conservados antigos. ¹

Várias técnicas são atualmente usadas pelos peritos

I na técnica para introduzir DNA em uma cepa bacteriana. Uma técnica preferida é a eletroporação, que é bem conhecida

I

Sá dos peritos na técnica.

Em outra modalidade da invenção, o microorganismo compreende genes funcionais codificando um sistema de utilização de sacarose não PTS. Um sistema de utilização de sacarose não PTS é um sistema para utilização de sacarose baseado no transporte de sacarose por um sistema independente de fosfoenolpiruvato. Após o transporte para dentro da célula, a sacarose é clivada em glicose e frutose por uma invertase. A frutose é então fosforilada em frutose-6-fosfato por uma frutocinase e a glicose é fosforilada em glicose-6-fosfato por uma glicocinase. Os genes codificando este sistema de utilização de sacarose não PTS podem ser controlados por uma proteína regulatória.

Em um aspecto preferido da invenção, o microorganismo 15 expressa naturalmente ou é modificado com a introdução dos genes de E. coli EC3132, isto é, os genes cscBKAR codificando um sistema de transporte de simporte de sacarose:próton (cscB), uma frutocinase (cscK), uma invertase (cscA) e um repressor específico de sacarose (cscR) . Estes genes podem ser usados todos juntos em combinação ou em qualquer combinação compreendendo pelo menos um destes genes. Em particular, o gene cscR pode ser omitido. Genes homólogos de outros organismos também podem ser usados.

A designação destes genes tem um significado mais geral de acordo com a invenção, e cobre os genes correspondentes em outros microorganismos. Usando as referências de GenBank dos genes de E. coli, os peritos na técnica podem determinar genes equivalentes em outros organismos que E. coli (ver acima).

Em um aspecto específico da invenção, o microorganismo é caracterizado por uma atividade melhorada da via de biossíntese de 1,2-propanodiol. Os microorganismos otimizados para a produção de 1,2propanodiol foram extensivamente divulgados nos pedidos de patente WO 2005/073364, WO 2008/116853, WO 2008/116852 e WO 2008/116848, que são incorporados ao presente como referências.

Os microorganismos de acordo com a invenção são bactérias, leveduras ou fungos.

De preferência, o microorganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de Enterobacteriaceae, Bacillaceae, !

Clostridíaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae. i

Mais preferivelmente, o microorganismo é selecionado :

dentre o grupo consistindo de Escherichia coli, Klebsiella « pneumoniae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolytÍcum, !

Clostridium sphenoides ou Saccharomyces cerevisiae. }^;

Ei

As condições de cultura para o processo de —ΐτ. .^-¾¾¾¾¾.. Z.S&M.'' · fermentação pode ser prontamente definido pelos peritos na técnica. Em particular, as bactérias são fermentadas a temperaturas entre 20°C e 55°C, preferivelmente entre 25°C e 40°C. e preferivelmente de cerca de 35°C para

Clostridiaceae e a cerca de 37°C para Enterobacteriaceae.

Este processo pode ser realizado tanto em um processo de batelada, em um processo de batelada alimentado ou em um processo contínuo. A fermentação é um processo clássico que pode ser efetuado sob condições aeróbias, microaeróbicas ou anaeróbicas.

Sob condições aeróbicas significa que oxigênio é fornecido à cultura dissolvendo o gás na fase líquida. Isto pode ser obtido (1) pulverizando gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na fase líquida ou (2) agitando o vaso contendo o meio de cultura a fim de transferir o oxigênio contido no espaço aéreo para dentro da fase líquida. As vantagens da fermentação sob condições aeróbicas em vez de condições anaeróbicas é que a presença de oxigênio como um aceitante de elétron melhora a capacidade da cepa para 20 produzir mais energia na forma de ATP para processos í celulares. Portanto, a cepa tem seu metabolismo geral * melhorado.

As condições microaeróbicas são definidas como £

condições de cultura sendo que baixas percentagens de ' . .

oxigênio (por exemplo, usando uma mistura de gás contendo entre 0,1 e 10% de oxigênio, completada para 100% com nitrogênio), são dissolvidas na fase liquida.

As condições anaeróbicas são definidas como condições 5 de cultura sendo que nenhum oxigênio é fornecido ao meio de cultura. Condições estritamente anaeróbicas são obtidas pulverizando um gás inerte como nitrogênio no meio de cultura para remover traços de outro gás. O nitrato pode ser usado como um aceitante de elétron para melhorar a produção de ATP pela cepa e melhorar seu metabolismo.

Em um aspecto especifico da invenção, a fonte de sacarose é obtida de biomassa, em particular de biomassa de planta. A planta total ou qualquer parte específica de uma planta pode ser usada para preparar a matéria-prima usada como fonte de sacarose. A preparação pode ser baseada em qualquer tratamento conhecido pelo perito na técnica para extrair sacarose de uma biomassa de planta contendo sacarose.

Em um aspecto preferido da invenção, a fonte de sacarose é obtida de uma planta escolhida entre o grupo consistindo de: cana-de-açúcar, beterraba, sorgo doce, bordo sacarina, palmeira doce e agave azul.

A fonte de sacarose, em particular, pode ser obtida de cana-de-açúcar ou beterraba.

Formas diferentes de fonte de sacarose podem ser usadas de acordo com a invenção, tal como um suco, um suco concentrado, um xarope, um suco clarificado, melados ou sacarose cristalizada.

Uma forma preferida é o suco bruto de cana-de-açúcar, diretamente extraído da planta sem qualquer tratamento. Resumidamente, a cana-de-açúcar colhida é limpa antes do processo de moagem para extração do suco. A estrutura da cana é rompida e então triturada, e ao mesmo tempo a sacarose é extraída com água para dar o suco bruto.

O suco bruto pode então ser clarificado adicionando cal e aquecendo e o suco clarificado é separado do precipitado. 0 xarope concentrado é obtido por evaporação.

Em outra modalidade da invenção, a fonte de sacarose pode ser um produto final, um produto intermediário ou um subproduto da indústria de cana-de-açúcar ou de beterraba.

Como algumas fontes de sacarose bruta, particularmente as obtidas de biomassa como mencionado acima, contêm outros nutrientes que podem ser usados para crescimento de microorganismos além da fonte de carbono, um meio apropriado para o crescimento de microorganismos pode ser projetado tanto usando a fonte de sacarose sozinha, isto é, o meio apropriado consiste da fonte de sacarose, ou complementando a fonte de sacarose com uma fonte de fósforo e/ou uma fonte de nitrogênio.

De preferência, a fonte de sacarose compreende pelo menos 7% de sacarose.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de duas cepas de E. coli produzindo

1,2-propanodiol e capaz de utilizar sacarose como única fonte de carbono:

A cepa MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA:;Cm,

AgloA, AaldA, AaldB, Aedd de E. coli evoluída na cultura 10 quimioestato sob condições anaeróbicas e adaptadas para crescer em meio mínimo foi obtida como descrito em WO

2008/116852. Esta cepa foi denominada cepa evoluída de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA:;Cm, AgloA,

AaldA, AaldB, Aedd.

O cassete de resistência de cloranfenicol foi eliminado em dita cepa evoluída e a presença de modificações anteriormente construídas na cepa foi checada como descrito anteriormente em WO 2008/116852.

Dois plasmídeos foram usados para conferir a capacidade de utilizar sacarose para dita cepa de E. coli:

- pUR400, carregando os genes codificando o sistema de sacarose-PTS tal como descrito em Schmid et al. (1982) pKJLlOl.l, carregando os genes codificando o sistema de sacarose permease e sinase tal como descrito em

Jahreis et al. (2002) .

Estes plasmídeos foram introduzidos separadamente na cepa evoluída de E. coli MG11655 lpd*, AtpiA, ApflAB,

AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd por eletroporação.

As duas cepas obtidas foram denominadas respectivamente:

- E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA,

AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pUR400) evoluída, e

- E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA,

AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pKJLlOl.l) evoluída.

Exemplo 2: Produção de 1,2-propanodiol com sacarose como única fonte de carbono:

As cepas obtidas como descrito no exemplo 1 e a cepa sem plasmídeo usada como controle foram cultivadas em um ensaio em frasco Erlenmeyer sob condições aeróbicas em meio mínimo MML11PG1_1OO (ver a composição acima) com 20 g/1 de glicose ou sacarose como a única fonte de carbono. Glicose como fonte de carbono foi usada como controle. !

A cultura foi realizada a 34°C e o pH mantido I tamponando o meio de cultura com MOPS. í t?

Ao término da cultura, 1,2-propanodiol e glicose ou p sacarose residual no caldo de fermentação foram analisados por HPLC e os rendimentos de 1,2-propanodiol sobre glicose ou os rendimentos de 1,2-propanodiol sobre sacarose foram i

i calculados.

Tabela 2: Produção de 1,2-propanodiol em meio mínimo com glicose ou sacarose como a fonte de carbono.

Cepa/Fonte de Carbono		Título	de	Rendimento de
		1,2-		1,2-propanodiol
		propanodio	(fonte	de
		1		carbono g/g)
		(g/1)
E. coli MG1655 lpd*,	AtpíA,	ND		-
ApflAB, AadhE, AldhA,	AgloA,	(n=l)		(n=l)
AaldA, AaldB, Aedd evoluído/
sacarose
E. coli MG1655 lpd*,	AtpiA,	3,89	+ /-	0,20 +/-	0, 01
ApflAB, AadhE, AldhA,	Agl oA,	0, 12		(n=3)
AaldA, AaldB, Aedd evoluído/ glicose	(pUR400)	(n=3)
E. coli MG1655 lpd*,	AtpiA,	2,26	+ /-	0,12 +/-	0,01
ApflAB, AadhE, AldhA,	Agl oA,	0,27		(n=6)
AaldA, AaldB, Aedd evoluído/ sacarose	(pUR400)	(n=6)
E. coli MG1655 lpd*,	AtpiA,	3,55	+ /-	0,19 +/-	0,01
ApflAB, AadhE, AldhA,	Agl oA,	0,21		(n=3)
AaldA, AaldB,	Aedd	(n=3)
(pKJLlOl.l) evoluído/glicose
E. coli MG1655 lpd*,	AtpiA,	4,86	+ /-	0,26 +/-	0,03
ApflAB, AadhE, AldhA,	AgloA,	0,77		(n=6)
AaldA, AaldB,	Aedd	(n=6)
(pKJLlOl.l) evoluído/
sacarose

ND significa não detectado.

n é o número de repetições da mesma experiência.

Os valores dados são a média e o desvio padrão dos valores obtidos para as repetições de n

Exemplo 3: Produção de 1,2-propanodiol com suco de cana-deaçúcar como fonte de carbono:

ás

As cepas obtidas como descrito no exemplo 1 foram cultivadas em um frasco de ensaio Erlenmeyer sob condições aeróbicas em meio mínimo MMLllPGl_100 com suco de cana-deaçúcar (20 g/1 de equivalente de sacarose) como a fonte de carbono.

O suco de cana-de-açúcar usado nesta experiência foi obtido de um moinho de açúcar na área do Sudeste da Ásia e foi colhido logo após a clarificação com cal do suco bruto.

A cultura foi realizada a 34°C e o pH mantido 10 tamponando o meio de cultura com MOPS. Ao término da cultura, 1,2-propanodiol, e a sacarose, glicose ou frutose residual no caldo de fermentação foram analisados por HPLC e o rendimento de 1,2-propanodiol sobre a soma de fontes de carbono foi calculado.

Tabela 3: Produção de 1,2-propanodiol em meio mínimo com suco de cana-de-açúcar como fonte de sacarose

Cepa / E	’onte de Carbono	Título 1,2- propano (g/D	de diol	Rendimento 1,2-propanodic (Fonte Carbono g/g)	de >1 de
E. coli	MG1655 lpd*,	AtpiA,	3,43	+ /-	0,15 +/- 0,01
ApflAB,	AadhE,	AldhA,	0,22		(n=2)
Agl oA,	AaldA, AaldB	, Aedd	(n=2)
(pUR400)	evoluído/ suco de
cana-de-	açúcar
E. coli	MG1655 lpd*,	AtpiA,	3, 94	+ /-	0,26 +/- 0,01
ApflAB,	AadhE,	AldhA,	0,94		(n=3)

* ϊε«8

AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pKJLlOl.l) evoluído/ suco de cana-de-açúcar

(n=3)

n é o número de repetições da mesma experiência.

Os valores dados são a média e o desvio padrão dos valores obtidos para as repetições n.

Exemplo 4: Produção de 1,2-propanodiol com suco de cana-de10 açúcar sozinho ou suplementado com nutrientes:

As cepas obtidas como descrito no exemplo 1 foram cultivadas em um frasco de ensaio Erlenmeyer sob condições aeróbicas em um meio contendo suco de cana-de-açúcar diluído (20 g/l de equivalente de sacarose) tanto sem suplementação ou suplementado com fosfato e amônio ((NH₄)₂HPO₄ 2,5 g/l), ferro (Citrato de ferro, H₂0 0,1 g/l) e tiamina (0,02 g/l).

A cultura foi realizada a 34°C e o pH mantido tamponando o meio de cultura com MOPS (40 g/l) . Ao término da cultura, 1,2-propanodiol, e sacarose, glicose e frutose residual no caldo de fermentação foram analisados por HPLC e o rendimento de 1,2-propanodiol sobre a soma das fontes de carbono foi calculado.

Tabela 4: Produção de 1,2-propanodiol em suco de cana-deaçúcar sem suplementação ou em suco de cana-de-açúcar suplementado.

Cepa / Fonte de Carbono	Título 1,2- propanc 1 (g/D	de >dio	Rendimento de 1,2- propanodiol (Fonte de carbono g/g)
E. coli MG1655 lpd*, AtpiA,	0,42		0,05
ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pUR400) evoluído/ suco de cana-de-açúcar	(n=l)		(n=l)
E. coli MG1655 lpd*, AtpiA,	1,07		0,12
ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pKJLlOl.l) evoluído/ suco de cana-de-açúcar	(n=l)		(n=l)
E. coli MG1655 lpd*, AtpiA,	2,29	+ /-	0,14 +/- 0,00
ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pUR400) evoluído/ suco de cana-de-açúcar suplementado	0, 02 (n=2)		(n=2)
E. coli MG1655 lpd*, AtpiA,	4,08	+ /-	0,26 +/- 0,00
ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pKJLlOl.l) evoluído/ suco de cana-de-açúcar suplementado	0,02 (n=2)		(n=2)

n é o número de repetições da mesma experiência.

Os valores dados são a média e o desvio padrão dos valores :

i s

obtidos para as repetições n.

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I

1/2

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir 1,2-propanodiol por fermentação, compreendendo:

- cultivar um microorganismo Escherichia coli produzindo 1,2-propanodiol em um meio apropriado compreendendo uma fonte de sacarose; e

- recuperar o 1,2-propanodiol que é produzido, caracterizado pelo fato de que o microorganismo foi geneticamente modificado para ser capaz de utilizar sacarose como uma única fonte de carbono para a produção de 1,2-propanodiol, com a introdução de genes scrKYABR que codificam um sistema fosfotransferase (PTS) de utilização de sacarose ou de genes cscBKAR que codificam um sistema de utilização de sacarose não PTS.

2/2 cana-de-açúcar, beterraba, sorgo doce, bordo doce, palmeira doce e agave azul.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é geneticamente modificado pela introdução do plasmídeo pUR400.

3. Método, de acordo caracterizado pelo fato de geneticamente modificado pela com a reivindicação 1, que o microrganismo é introdução do plasmídeo pKJL101.1.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de sacarose é obtida de biomassa, em particular de biomassa de planta.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de sacarose é obtida de uma planta escolhida do grupo consistindo em

Petição 870180037544, de 07/05/2018, pág. 17/240

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a referida fonte de sacarose está sob a forma de suco, um suco concentrado ou xarope, um suco purificado, melados ou sacarose cristalizada.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida fonte de sacarose é um produto final, um produto intermediário ou um subproduto da indústria de cana-deaçúcar ou de beterraba.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio apropriado consiste em uma fonte de sacarose.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio apropriado contém pelo menos uma fonte de fósforo e/ou uma

fonte de nitrogênio além da fonte de sacarose. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida fonte de sacarose compreende pelo menos 7% de

sacarose.

Petição 870180037544, de 07/05/2018, pág. 18/240