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BRPI0819938B1 - Vacinas com bactérias e com emulsão tratadas com calor preparadas a partir de tais bactérias tratadas com calor - Google Patents

Vacinas com bactérias e com emulsão tratadas com calor preparadas a partir de tais bactérias tratadas com calor Download PDF

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BRPI0819938B1
BRPI0819938B1 BRPI0819938-8A BRPI0819938A BRPI0819938B1 BR PI0819938 B1 BRPI0819938 B1 BR PI0819938B1 BR PI0819938 A BRPI0819938 A BR PI0819938A BR PI0819938 B1 BRPI0819938 B1 BR PI0819938B1
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leptospira
bacteria
vaccine
porcine
bacterin
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BRPI0819938-8A
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Mark Davis Goodyear
Michael John Huether
Richard Lee Krebs
Nancee L. Oien
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Zoetis Services Llc
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Publication date
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Abstract

“vacinas com bactérias e com emulsão tratadas com calor preparadas a partir de tais bactérias tratadas com calor” bactérias tratadas com calor, um método de produção de bactérias tratadas com calor, e vacinas da porcina com emulsão preparadas a partir de tais bactérias tratadas com calor são descritas.

Description

“VACINAS COM BACTÉRIAS E COM EMULSÃO TRATADAS COM CALOR PREPARADAS A PARTIR DE TAIS BACTÉRIAS TRATADAS COM CALOR”
Campo da Invenção [OOIJEsta invenção refere-se, de modo geral, ao campo das vacinas e aos métodos de estabilização das vacinas com emulsão. Em particular, esta invenção refere-se às bactérias tratadas com calor, um método de produção de bactérias tratadas com calor, e para vacinas da porcina com emulsão preparadas a partir de tais bactérias tratadas com calor.
Antecedentes da Invenção [002]A vacinação é cada vez mais empregada para controlar as doenças infecciosas em animais. Os adjuvantes são frequentemente empregados nas vacinas porque são capazes de aumentar a resposta imune humoral e/ ou celular para um antígeno. As vacinas são muitas vezes formuladas como emulsões porque a emulsão pode agir como um adjuvante, e tem a propriedade de manter o antígeno como um depósito no local da injeção. Os emulsificantes são geralmente empregados nas vacinas com emulsão. Além de empregar os emulsificantes, a estabilidade das vacinas com emulsão pode também ser obtida através da redução do tamanho da gota da emulsão através de meios mecânicos.
[003]A Patente dos Estados Unidos Ns 5.084.269 se refere a uma formulação adjuvante contendo lecitina em combinação com óleo mineral, que produz menos irritação dentro no animal hospedeiro, e simultaneamente induz a imunidade sistêmica aumentada. As composições de acordo com a Patente dos Estados Unidos 5.084.269 estão em uso comercial sob o nome comercial AMPHIGEN®, uma marca registrada da Pfizer, Inc.
[004]De modo geral, os antígenos bacterianos são instáveis quando aquecidos e até mesmo em breve exposição a temperaturas elevadas podendo reduzir a atividade dos antígenos. Por exemplo, as vacinas contra antraz podem perder toda a
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2/17 atividade biológica com 48 horas a 37 °C (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, e R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun., 6 de setembro de 2002; 295(5): 1058-62).
Sumário da Invenção [005]Esta invenção se refere às bactérias tratadas com calor, um método de produção de bactérias tratadas com calor, e vacinas da porcina com emulsão preparadas a partir de tais bactérias tratadas com calor. O método compreende o aquecimento da bactéria em uma temperatura de cerca de 35 a 80 °C para formar uma bactéria tratada com calor.
Descrição Detalhada
Definições [006]Atividade antigênica aceitável - O termo atividade antigênica aceitável quer dizer a capacidade de induzir a uma resposta imune protetora em animais vacinados após serem provocados ou por passarem por um teste de potência codificada com organismo vivo homólogo.
[007]Bactéria - O termo bactéria quer dizer uma suspensão de bactérias mortas a qual pode ser empregada como um componente de uma vacina.
[008]Emulsificante - O termo emulsificante quer dizer uma substância empregada para preparar uma emulsão mais estável.
[009]Emulsão - O termo emulsão quer dizer uma composição de dois líquidos que não se podem misturar em que pequenas gotas de um líquido são suspensas em uma fase contínua do outro líquido.
[0010]Bactéria tratada com calor - O termo bactéria tratada com calor quer dizer uma bactéria a qual foi tratada com calor e a qual tem uma atividade da lipase de 50% ou menor do que a atividade da lipase antes do tratamento térmico, e tem atividade antigênica aceitável.
[0011]Emulsão invertida - O termo emulsão invertida quer dizer uma água
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3/17 em emulsão de óleo.
[0012]Lipase - O termo lipase quer dizer enzimas, esterases, lipases, e fosfolipases, que pode causar a ruptura de um emulsificante em uma vacina com emulsão.
[0013]Emulsão Normal - O termo emulsão normal quer dizer um óleo em emulsão de água.
[0014]Óleo em emulsão de água - O termo óleo em emulsão de água quer dizer uma emulsão em que pequenas gotas de óleo são suspensas em uma fase aquosa contínua.
[0015]Temperatura ambiente - O termo temperatura ambiente quer dizer uma temperatura de 18 a 25 °C.
[0016]Água em emulsão de óleo - O termo água em emulsão de óleo quer dizer uma emulsão em que as gotas de água são suspensas em uma fase oleosa contínua.
Descrição [0017]Esta invenção se refere às bactérias com atividade reduzida de lipase, as vacinas da porcina com emulsão preparadas a partir de tais bactérias, e um método de redução da atividade da lipase das bactérias. Além dos componentes antigênicos, algumas bactérias têm atividade da lipase. Quando as bactérias com atividade da lipase são incorporadas em uma emulsão, a lipase pode romper os emulsificantes empregados para produzir a emulsão. As vacinas com emulsão as quais contêm as bactérias tendo elevada atividade da lipase tendem a serem emulsões instáveis, e aquelas que contêm bactérias tendo baixos níveis de lipase tendem a ser estáveis. Os exemplos de bactérias que podem, quando mortas, produzir as bactérias tendo atividade da lipase incluem espécies de Leptospira, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli e Mycoplasma hyopneumoniae, tal como os patógenos conhecidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa,
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Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira bratislava e Leptospira pomona. Estas bactérias podem causar doenças em porcos, e a vacinação contra estas doenças é desejável. As bactérias de Leptospira são mais prováveis de ter uma elevada atividade da lipase embora uma bactéria Erysipelothrix rhusiopathieae possa ter uma atividade da lipase mais manejável, inferior.
[0018]A lipase, que pode romper os emulsificantes empregados para produzir a emulsão, e deste modo causar a ruptura e instabilidade da emulsão, pode incluir uma ou mais das enzimas de rompimento da emulsão, tais como, esterases, lipases, e fosfolipases. Coletivamente estas enzimas, esterases, lipases, e fosfolipases são referidos como lipase. A atividade da lipase de uma bactéria pode ser medida empregando um substrato sintético chamado O-pivaloyloxymethyl umbelliferone (CPOM). A taxa de hidrólise causada pela lipase é a medida da atividade da lipase. A taxa de reação da hidrólise causada pela lipase nesta reação é monitorada por um aumento na intensidade da fluorescência do produto da atividade da lipase. A taxa de reação é dependente das exatas condições de teste da hidrólise escolhidas, a fim de que as comparações dos níveis de atividade da lipase, como medido pelas taxas de hidrólise, devem ser preparadas empregando os dados produzidos pelas mesmas condições de teste. Os métodos da literatura são descritos em vários artigos, incluindo Kurioka S. e Matsuda M. (1976) /4na. Biochem. 75: 281-289, De Silva N.S. e Quinn PA (1987) J. CHn. Microbiol. 25: 729- 731, e Grau A. e Ortiz A. (1998) Chem. Phys. of Lipids. 91: 109-118. .
[0019]Em uma vacina com emulsão, a ruptura da emulsão causa a separação da fase dos componentes. Isto é indesejável porque quando existe a separação da fase nas doses individuais removidas do recipiente pode não conter o mesmo nível dos componentes da vacina. Além disso, a perda da emulsão pode levar a perda da atividade adjuvante do emulsificante e leva a uma redução no efeito antigênico da vacina.
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5/17 [0020]As viroses atenuadas vidas são frequentemente incluídas nas vacinas junto com as bactérias. Tais vacinas são úteis porque uma vacina simples pode ser empregada para produzir a imunidade a diferentes doenças com uma vacina. Se a atividade da lipase está presente na bactéria, irá causar a liberação do emulsificante da emulsão. Este emulsificante livre pode romper e inativar as viroses vivas da vacina, desse modo levando a uma perda de infecciosidade viral.
[0021 jüma bactéria útil nas vacinas pode ser formada pela cultura da bactéria de interesse, e em seguida matando as bactérias para produzir uma bactéria contendo uma variedade de componentes bacterianos, incluindo os componentes da parede celular. As bactérias podem ser mortas por uma variedade de métodos incluindo expondo-as a um composto tal como mertiolate, formalina, formaldeído, dietilamina, etilenamina binária (BEI), beta propiolactona (BPL), e glutaraldeído. As combinações destes compostos podem ser empregadas. Além disso, é possível matar as bactérias com a esterilização da radiação.
[0022]Já foi constatado que a atividade da lipase de uma bactéria tendo tal atividade da lipase pode ser reduzida pelo tratamento térmico. Especificamente, a atividade da lipase de uma bactéria pode ser reduzida pelo aquecimento da bactéria em uma temperatura de cerca de 35 a cerca de 80 °C para formar uma bactéria tratada com calor, que tem atividade antigênica aceitável. O tratamento térmico é conduzido durante um período de tempo suficiente a fim de que a atividade da lipase da bactéria tratada com calor é de 50 % ou menor do que aquela constatada na bactéria antes do tratamento térmico. Para a boa estabilidade da vacina com emulsão não é necessário que a atividade da lipase seja reduzida a zero. Temos constatado que as vacinas tendo uma boa vida de prateleira podem ser preparadas a partir das bactérias tratadas com calor tendo o nível da atividade da lipase que é de 50 % ou menor do que o nível da atividade da lipase antes do tratamento térmico, do substrato de teste
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6/17 [0023]Quando uma taxa de hidrólise de um substrato de teste foi empregada como uma medida da atividade da lipase de uma bactéria, e em seguida a taxa de hidrólise do substrato de teste antes do tratamento térmico é comparada à taxa de hidrólise após o tratamento térmico. O tratamento térmico é conduzido a fim de reduzir a taxa de hidrólise a 50 % ou menor do que a taxa de hidrólise que é observada para a bactéria fresca.
[0024]0 método exato de medida do nível da atividade da lipase não é crítico uma vez que o mesmo método é empregado para medir a atividade antes do tratamento térmico e a atividade após o tratamento térmico. Por exemplo, se a taxa de hidrólise de um substrato de teste é medida empregando um substrato, um substrato diferente poderia produzir uma taxa diferente. Entretanto, se o mesmo substrato é empregado para a determinação da atividade inicial e a determinação da atividade após o tratamento, as taxa relativas ainda irão mostrar o efeito do tratamento térmico.
[0025]Existem testes codificados para a atividade antigênica para Bactéria Leptospira Pomona (9 CFR §113.101), Bactéria Leptospira icterohaemorrhagiae (9 CFR §113.102), Bactéria Leptospira Canicola (9 CFR §113.103), Bactéria Leptospira Grippotyphosa (9 CFR §113.104), e Bactéria Leptospira Hardjo (9 CFR §113.105) (9 CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104, e §113.105). Para estas espécies de atividade antigênica aceitável pode ser definida como a capacidade para induzir a uma resposta imune protetora em hamsters vacinados tal que quando os hamsters são provocados com bactérias homólogas vivas, pelo menos 75 % dos hamsters vacinados sobrevivem em um modelo em que pelo menos 80 % dos hamsters não vacinados não sobrevivem. Neste caso do antígeno, Leptospira hardjo, a atividade antigênica aceitável pode ser definida como a capacidade de uma vacina induzir a um título de meio geométrico de aglutinação sorológica contra Leptospira hardjo de >40 em bezerros que foram vacinados com uma vacina compreendendo o antígeno
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7/17 bacteriano, Leptospira hardjo. Para outras bactérias da atividade antigênica aceitável é definido como a capacidade para induzir uma resposta imune protetora em animais vacinados após serem provocados ou por passarem por um teste de potência com organismo vivo homólogo.
[0026]0 tratamento térmico pode ser conduzido sobre uma faixa de temperaturas, e por um período de tempo variável. De modo geral, o aquecimento pode ser feito em uma temperatura de cerca de 35 a cerca de 80 °C durante cerca de 20 minutos a cerca de 24 horas. Quando a bactéria é aquecida a uma temperatura mais elevada, tal como cerca de 75 a cerca de 80 °C, o tempo de aquecimento está no término curto da faixa de tempo. Quando o aquecimento é feito em uma temperatura inferior, o aquecimento é feito durante um período de tempo mais longo. Outra combinação de temperatura e de tempo é o aquecimento em uma temperatura de cerca de 60 a cerca 70 °C durante cerca de 9 a cerca de 10 horas. Outra combinação de temperatura e de tempo é o aquecimento em uma temperatura de cerca de 65 a cerca de 70 °C durante cerca de 5 a cerca de 8 horas. Outra combinação de temperatura e de tempo é o aquecimento em uma temperatura de cerca de 65 a cerca de 70 °C durante cerca de uma hora. Outra combinação de temperatura e de tempo é o aquecimento em uma temperatura de cerca de 55 a cerca de 65 °C durante cerca de 5 a cerca de 8 horas.
[0027]As bactérias, após o tratamento térmico, têm uma atividade da lipase inferior as bactérias recentemente preparadas, porém pode ser, de outra forma, formuladas do mesmo modo como as bactérias recentemente preparadas. Por conseguinte, as bactérias tratadas com calor podem ser incorporadas nas vacinas por métodos ordinários de produção de vacinas. Estes métodos são bem conhecidos na técnica.
[0028]As vacinas com emulsão podem ser formadas por combinar a bactéria desejada com uma fase de óleos e um emulsificante, ou emulsificantes. A combina
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8/17 ção é em seguida submetida à agitação intensa para formar uma emulsão. Os métodos adequados de agitação incluem homogenização e subsequentemente microfluidificação. Os preservativos e os excipientes podem ser também incluídos na combinação anterior a emulsificação.
[0029]As vacinas podem incluir igualmente as bactérias e os antígenos virais. Na preparação de uma vacina que inclui as bactérias e os antígenos virais, as bactérias, quaisquer antígenos virais podem ser incluídos, o emulsificante, ou os emulsificantes, e opcionalmente os preservativos e os excipientes são combinados com uma fase oleosa, e emulsificados. Seguindo-se a formação da emulsão, o pH das formulações pode ser ajustado a um pH apropriado empregando ou as soluções de NaOH ou HCI. Para o uso da vacina, é desejável, modo geral, que o pH seja próximo ao neutro para evitar a irritação no local da injeção. Um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,3 é comum.
[0030]As fases oleosas adequadas para a formação da vacina com emulsão incluem óleos não metabolizáveis e óleos metabolizáveis. Os óleos não metabolizáveis incluem os óleos minerais, tais como óleo mineral branco, e óleo mineral leve. Os óleos metabolizáveis incluem óleos vegetais, óleos de peixe e glicerídeos de ácido graxo sintético.
[0031 ]Os exemplos de emulsificantes que podem ser empregados na preparação de vacinas com emulsão desta invenção são fosfolipídeos, ésteres de sorbitano, ésteres de sorbitano poli-etoxilado, e derivados de manitol os quais são emulsificantes comuns da vacina. Os emulsificantes de fosfolipídeos incluem lecitina, fosfatidiletanalamina, fosfatidilinisitol, fosfatidilserina, e lecitina, (por exemplo, tal como, AMPHIGEN®). Os emulsificantes de éster de sorbitano incluem monolaurato de sorbitano, (por exemplo, Span® 20 e Arlacel® 20), monooleato de sorbitano (por exemplo, Span® 80 e Arlacel® 80), monopalmitato de sorbitano (por exemplo, Span® 40 e Arlacel® 40), e monoestearato de sorbitano (por exemplo, Span® 60 e Arlacel® 60).
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9/17
Os ésteres de sorbitano poli-etoxilados incluem monolaurato de sorbitano de polietóxi (por exemplo, Tween® 20 e Tween® 21), monooleato de sorbitano de poliétoxi (por exemplo, Tween® 80), monopalmitato de sorbitano de poliétoxi (por exemplo, Tween® 40), e monoestearato de sorbitano de poliétoxi (por exemplo, Tween® 60). Os emulsificantes derivados de manitol incluem éteres octadecanóicos manitol. Span®, Arlacel®, e Tween® são marcas registradas de ICI Américas. AMPHIGEN® é uma marca registrada da Pfizer, Inc. De modo geral, as vacinas são formuladas como óleo normal em emulsões de água, se bem que é possível preparar a água invertida em emulsões oleosas.
[0032]Uma variedade de adjuvantes, tais como Quil A, colesterol, fosfato e alumínio, e hidróxido de alumínio, e preservativos tal como mertiolate pode ser empregado nas vacinas. A Quil A é mistura purificada de quillaja saponins extraída da casca da árvore Sul Americana Quillaja Saponaria Molina. A Quil A age diretamente no sistema imune para ativar um estado generalizado da sensibilidade. Fazendo assim, induz igualmente as respostas mediadas por células e humoral. A cadeia lipofílica permite a interação do antígeno e do adjuvante a serem liberados no citosol para o processamento em uma série de reações do endógeno. A Quil A é muitas vezes empregada com o colesterol porque o colesterol elimina os efeitos colaterais menos desejados quando adicionados nas proporções apropriadas. O colesterol forma complexos insolúveis com a Quil A que forma as estruturas tipo hélice como o colesterol ligando-se com a Quil A, deste modo expondo as unidades de açúcar da molécula que ajudam a estimular a resposta imune.
[0033]É comum adicionar antígenos virais de porcino às vacinas contendo as bactérias. Uma vantagem desta abordagem é que uma vacina pode ser empregada para produzir a imunidade para diversas doenças ao invés das dosagens requeridas das diversas diferentes vacinas para obter-se o mesmo resultado. Igualmente as viroses mortas e as viroses vivas atenuadas podem ser empregadas nas
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10/17 vacinas. No meio das doenças de porcino causando as viroses que podem ser empregadas são Adenovírus Porcino, Circovírus Porcino, Viroses do herpes porcino, vírus Pseudorabies, Vírus da febre suína clássica, Vírus da diarréia epidêmica porcina, Vírus da Encefalomielite Hemaglutinante Porcina, Parvovírus porcino, vírus da Corona Respiratória Porcina, Vírus Respiratório e Reprodutivo Porcino, Influenza Suína, Vírus da gastroenterite transmissível, e Vírus da estomatite vesicular.
[0034]Se a atividade da lipase está presente na bactéria, pode causar a liberação do emulsificante da emulsão. Este emulsificante livre pode romper o envelope com vírus vivo, e inativar as viroses vivas da vacina, desse modo levando a uma perda de infecciosidade viral. Por conseguinte, o tratamento térmico da bactéria serve para estabilizar a emulsão, e preservar seu efeito adjuvante, assim como preservando a infecciosidade viral das viroses.
[0035]0s exemplos que seguem são fornecidos para o propósito de outra ilustração e não são pretendidos limitar o escopo da invenção reivindicada.
Procedimentos
Procedimento 1 - Determinação da Turvação [0036]A turvação é determinada nas Unidades Nefelométricas (NU) por um método de dispersão da luz. A intensidade da luz dispersa pela amostra sob condições definidas é comparada à intensidade da luz dispersa por uma suspensão padrão de referência. Quanto maior a intensidade da luz dispersa, maior a turvação da amostra. Uma fonte de luz está direcionada na amostra e a dispersão da luz é medida a 90° para a direção da fonte de luz. O instrumento é calibrado pela medida da dispersão da luz de uma suspensão de formazin.
Calibração do Instrumento Nefelômetro [0037]A água ultra-filtrada é preparada pela filtragem da água destilada através de um filtro de membrana tendo um tamanho de poro de 0,2 pm. Uma primeira solução é preparada por dissolver 1,00 g de sulfato de hidrazina, (NH2) H2SO4, na
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11/17 água ultra filtrada e diluída com água ultra filtrada a 100 ml, em um frasco volumétrico. Uma segunda solução é preparada por dissolver 10,00 g de hexametilenotetramina em água ultra filtrada e diluindo-se com água ultra filtrada a 100 ml, em um frasco volumétrico. Uma suspensão de formazin é preparada por misturar 5,0 ml da primeira solução com 5,0 ml da segunda solução. A mistura é deixada em repouso durante 24 horas a aproximadamente 24 SC. A mistura é diluída a 100 ml com água ultra filtrada para formar uma suspensão da turvação da matéria-prima tendo uma turvação de 400 NU. Uma suspensão da turvação de formazin de 40 NU é preparada por diluir 10,00 ml da suspensão da turvação da matéria-prima de 100 ml com água ultra filtrada. Outras soluções de calibração são preparadas por diluir a solução de matéria-prima.
Medição da Turvação [0038]A amostra a ser medida é diluída com água ultra filtrada a fim de que a turvação inclua a faixa calibrada do nefelômetro. A turvação é medida e a turvação original é calculada empregando a seguinte equação:
Turvação Original na NU = Μ x (D + O) em que: M é a turvação da amostra diluída em NU
D é o volume da água de diluição, em mL
O é o volume original da amostra, em mL
Procedimento 2 - Análise da Lipase [0039]A atividade da lipase foi determinada empregando Opivaloxymethylumbelliferone como um substrato fluorogênico. A hidrólise catalisada por lipase deste substrato não fluorescente produz um hidroximetiléter, que é instável sob condições aquosas. A decomposição do hidroximetiléter instável gera o formaldeído e o produto da umbeliferona fluorescente. Monitorando a intensidade da fluorescência da umbeliferona produzida, como uma função do tempo, fornece uma medição cinética sensível da atividade enzimática da lipase.
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12/17 [0040]As soluções de O-pivaloxymethylumbelliferone (Molecular Probes product ns. P35901) foram preparadas em DMSO puro, em uma concentração de matéria-prima de 5 mM; solução não empregada foi armazenada a -20 °C, protegida da luz. A solução de O-pivaloxymethylumbelliferone a 5 mM foi diluída a 750 pm empregando 58 mM de tampão TRIS-HCI (pH 8,0), e a solução resultante pré-aquecida a 37 °C. A amostra da bactéria ou o meio/ tampão de controle foi centrifugado durante 10 minutos em temperatura ambiente a 6500 X gravidade para formar um pélete e um sobrenadante. As reações foram executadas por combinar 15 pL de 100 mM de tampão TRIS-HCI (pH 8,0) com 15 pL do sobrenadante em temperatura ambiente a partir da amostra da bactéria ou o meio/ tampão de controle, em poços de ensaio de placas de 96 cavidades de baixo volume (Corning 3393, superfície de não ligação de poliestireno negro, metade da área); pré-incubando durante 10 minutos a 37 °C; e em seguida iniciando a reação pela adição de 20 pL de 750 pm de Opivaloxymethylumbelliferone ou o meio/ tampão de controle. As misturas de reação resultantes eram de 53 mM de tampão TRIS-HCI (pH 8,0) e 0 ou 300 pm de Opivaloxymethylumbelliferone. A intensidade da fluorescência foi medida a intervalos de 30-45 segundos por um período de uma hora (Spectramax Gemini XS, 37 °C, λθχ = 360 nm, Àem = 460 nm, PMT sensibilidade ajustada ao 'meio', 6 leituras por poço). A taxa de reação foi determinada a partir da inclinação da curva progressiva resultante.
Procedimento 3 - Medição da Turvação de uma Preparação de Erysipelothrix rhusiopathieae [0041 ]A turvação de uma preparação de Erysipelothrix rhusiopathieae é medida espectrofotometricamente em um comprimento da onda de 600 nm. O resultado é relatado em unidades ópticas (OU).
Exemplos
Exemplo 1 - Redução da Atividade da Lipase pelo Tratamento Térmico
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13/17 [0042]Uma mistura de mertiolate com leptospira morta contendo as seguintes espécies Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, e Leptospira pomona foi preparada a partir de bactérias individuais. Seis amostras das bactérias combinadas foram armazenadas durante a noite (aproximadamente 12 horas) a 4 °C, 37 °C, 45 °C, 56 °C, 65 °C, e 80 °C. A amostra armazenada a 4 °C servida como o controle não tratado. As amostras armazenadas durante 12 horas a 37 °C, 45 °C, 56 °C, 65 °C, e 80 °C foram amostras tratadas termicamente. Após o armazenamento, a taxa na qual um substrato de teste hidrolisado na presença de cada bactéria foi medida de acordo com o método do Procedimento 2. A taxa de hidrólise para uma amostra dividida pela taxa de hidrólise da amostra armazenada a 4 °C multiplicada por 100 é a porcentagem da atividade da lipase original de cada bactéria que permanece após o armazenamento. O quadro que segue mostra a temperatura do armazenamento e a porcentagem da atividade da lipase original que permanece após o armazenamento.
Temperatura do Armazenamento (12 horas) 4 9C 37 9C 45 9C 56 9C 65 9C 80 9C
Porcentagem da Atividade da Lipase Original 100% 55,4 % 32,5 % 15,7% 10,8% 8,4 %
[0043]Duas séries de Leptospira Bratislava foram preparadas. As séries foram inativadas com mertiolate e em seguida submetidas a tratamento térmico a 65 °C durante 8 horas. As amostras foram extraídas do pré-tratamento e a cada duas horas durante o tratamento. A atividade da lipase foi determinada a cada momento de acordo com o método do Procedimento 2. Quando a amostra foi empregada, a taxa em que um substrato de teste hidrolisado na presença de cada amostra foi medida. A taxa de hidrólise para uma amostra dividida pela taxa da taxa de hidrólise
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14/17 inicial multiplicada por 100 é a porcentagem da atividade da lipase original de cada bactéria que permanece após o tratamento térmico. O quadro que segue mostra o tempo de amostragem e a porcentagem média da atividade da lipase original que permanece naquele momento._________________________________________
Tempo de amostragem (horas) Inicial 2 4 6 8
Porcentagem da Atividade da Lipase Original 100% 41 % 34% 28% 24%
Exemplo 2 - Preparação das Formulações Experimentais da Vacina [0044]As culturas de Leptospira canicola, Leptospira icterogorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira pomona, Leptospira Bratislava, Erysipelothrix rhusiopathieae, e Porcine parvovirus foram desenvolvidas. A turvação de cada cultura de Leptospira foi medida em unidades nefelométricas (NU). A turvação da cultura de Erysipelothrix rhusiopathieae foi medida em unidades ópticas (OU). As bactérias foram mortas com mertiolate para formar as bacterianas. Cada bactéria Leptospira foi tratada com calor a 65 °C durante 8 horas para reduzir a atividade da lipase. A bactéria Erysipelothrix rhusiopathieae não foi tratada com calor. As bactérias de Leptospira foram combinadas com Parvovirus porcino mortos e Erysipelothrix rhusiopathieae mortos e em seguida misturados com AMPHIGEN®, adjuvantes, preservativos, e diluindo o tampão a fim de que cada dose de 2 ml da vacina contidos nos componentes apresentados no quadro abaixo.
Concentrações dos Antígenos
Componente Concentração de Componente/ Dose
L. canicola 1200 NU/ dose de 2 ml
L. icterohaemorrhagiae 1200 NU/ dose de 2 ml
L. grippotyphosa 1200 NU/ dose de 2 ml
L. hardjo 2400 NU/ dose de 2 ml
L. pomona 1200 NU/ dose de 2 ml
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15/17
L. Bratislava 1200 NU/ dose de 2 ml
Erysipelothrix rhusiopathieae 14 OU/ dose de 2 ml
Porcine parvovirus 17,920 HA/,05 ml
Exemplo 3 - Teste de Potência em Hamsters e Porcos [0045JA vacina do Exemplo 2 foi administrada para hamsters e coelhos para testar a potência empregando modelos animais padrão de laboratório. Os hamsters de teste foram em seguida provocados com uma dose de Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira Bratislava, ou Leptospira pomona para testar a potência das vacinas. Os números dos sobreviventes foram medidos como uma demonstração da eficácia. Os títulos de aglutinação de coelho microscópio foram medidos contra Leptospira hardjo para demonstrar a potência daquela fração da vacina. A tabela abaixo mostra que as vacinas preparadas a partir de bactérias de Leptospira tratadas com calor são capazes de produzir uma resposta antigênica que passa os critérios de eficácia.
Condicionamento Térmico de Leptospira HAMSTER SOBREVIVENTES SOROLOGIA do Coelho
Canicola Bratislava Ictero Grippo Pomona Hardjo
65 SC (8 horas) 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 Ultrapassa
Não tratado 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 Ultrapassa
[0046]A Erysipelothrix rhusiopathieae foi testada em coelhos por combinar o título da sorológica da vacina com o título de uma vacina de referência. A vacina tem uma RP (potência relativa) de 3,0. O PPV foi testado no exame de hemaglutinação e tem um título de HA de 1024 HA/,05ml. Um título de 320 HA/,05ml é um valor aceitável para uma vacina.
Exemplo 4 - Teste Físico-químico das Vacinas [0047]Uma vacina foi preparada com as bactérias de Leptospira tratadas com calor e outros componentes de acordo com a formulação listada no Exemplo 2.
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Uma vacina similar foi preparada a partir de bactérias de Leptospira não tratadas com calor de acordo com o método do Exemplo 2. Igualmente as formulações da vacina foram armazenadas a 4 SC durante 0, 6, 12, 15 e 18 meses de idade. A análise do tamanho da partícula foi feita para cada vacina a cada momento empregando um difratômetro a laser.
[0048] A Figura 1 mostra as distribuições do tamanho de partícula para cada vacina durante meses de monitoramento (0, 6, 12, 15 e 18 meses).
[0049]A vacina preparada a partir de bactérias de Leptospira não tratadas com calor (gráfico superior) mostra um aumento no tamanho da partícula indicando a ruptura da emulsão. A vacina preparada a partir de bactérias de Leptospira tratadas com calor (gráfico inferior) mostram a retenção do tamanho da partícula através dos 18 meses de idade indicando a estabilidade da emulsão.
Exemplo 5 - Exame de hemaglutinação (HA) do PPV [0050]As formulações da vacina listada no Exemplo 2 (as vacinas na lista do Exemplo 2 serão todos os antígenos listados - mesmo as vacinas para todos os trabalhos) preparadas a partir de bactérias de Leptospira não tratadas com calor e bactérias de Leptospira tratadas com calor foram inicialmente testadas por título de HA e título de hemólise. A estabilidade dos títulos de HA em vários momentos. O exame por HÁ foi executado por ajustagem de uma amostra para pH 11 -11,2 para extrair o vírus PPV (Parvovírus porcino) a partir do gel de hidróxido de alumínio. A amostra foi em seguida centrifugada e o sobrenadante coletado para uso no exame. As células vermelhas do sangue da cobaia foram adicionadas a uma placa de 96 cavidades para servir como o indicador de aglutinação. O sobrenadante da amostra foi diluído 2 vezes através da filas duplicadas com uma diluição inicial de 1:5. A placa é incubada a 5 ± 3C durante 16-24 horas. O grau de hemaglutinação é marcado de 0-4 para cada cavidade. O título é registrado como a última diluição contendo um escore de 2 ou acima. Durante o teste das vacinas, as quais não foram tratadas com calor,
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17/17 foi observado que a vacina estava causando hemólise. O título da hemólise foi a maior diluição em que a hemólise foi observada. As vacinas tratadas com calor não produzem hemólise.
[0051 ]O quadro abaixo mostra os títulos médio do HA e os títulos da hemólise ao longo do tempo. CTC é uma vacina com bactérias de Leptospira tratadas com calor. OOP é uma vacina bactérias de Leptospira tratadas com calor.
Quadro 1 : Títulos do HA do PPV ao Longo do Tempo
HA do PPV de OOP e CTC Descoberto ao Longo do Tem po
1 2 3 4 5 7 10
Inicial mos. mos. mos. mos. mos. mos. mos.
1 2 3
OOP 160 1280 1280 1280 1280 1280 640 1280 1280 1280
CTC 1280 1280 1280 1280 1280 640 640 640 640 1280
Título de Hemólise
OOP 80 80 80 160 160 160 160 160 80 160
CTC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
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Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vacina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:
    a) uma emulsão,
    b) uma bacterina tratada com calor compreendendo uma suspensão de bactérias mortas, em que as bactérias mortas são da espécie Leptospira Bratislava, e
    c) de 1 a 13 vírus causadores de doenças porcinas selecionados a partir do grupo consistindo em Adenovírus Porcino, Circovírus Porcino, vírus do herpes Porcino, vírus Pseudorabies, vírus da febre suína Clássica, vírus da diarréia epidêmica Porcina, vírus da encefalomielite hemaglutinante Porcina, parvovírus Porcino, vírus da Corona Respiratória Porcina, Vírus Respiratório e Reprodutivo Porcino, Influenza Suína, vírus da gastroenterite Transmissível, e vírus da estomatite Vesicular;
    em que o dito tratamento com calor da bacterina consiste em aquecer a bacterina de Leptospira Bratislava de 35 °C a 80 °C, de 20 minutos a 24 horas, levando a uma redução na atividade lipase da dita bacterina de 50% ou mais em relação à bacterina antes do tratamento com calor.
  2. 2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende um preparação de lecitina e adjuvante a base de alumínio.
  3. 3. Vacina, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende uma lecitina em preparação de óleo.
  4. 4. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende:
    a) bacterinas tratadas com calor compreendendo uma suspensão de bactérias mortas, em que as bactérias mortas são de uma a cinco espécies de bactérias selecionadas a partir do grupo consistindo em Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo e Leptospira Pomona, em que o dito tratamento com calor da bacterina consiste em aquecer a bacterina de Leptospira Bratislava de 35 °C a 80 °C, de 20 minutos a 24 horas, levando a uma
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    2/2 redução na atividade lipase da dita bacterina de 50% ou mais em relação à bacterina antes do tratamento com calor, e/ou
    b) bactérias mortas da espécie Erysipelothrix rhusiopathieae que não foram submetidas ao tratamento com calor.
  5. 5. Vacina, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende uma preparação de lecitina e adjuvante a base de alumínio.
  6. 6. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende uma lecitina em preparação do óleo.
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