BRPI0811692A2 - material com imunogenicidade - Google Patents
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Abstract
material com imunogenicidade a presente invenção descreve uma proteína de fusão que compreende um antígeno e7 do papiloma vírus humano, uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular. também descreve uma macromolécula com imunogenicidade agregada pelas proteínas de fusão. a morfologia da partícula da macromolécula é diferente da morfologia das partículas tipo vírus. a macromolécula pode ser usada para o tratamento de doenças relacionadas ao papiloma vírus humano.
Description
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende um antígeno E7 do papiloma vírus humano, uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular, uma macromolécula imunogênica polimerizada a partir da referida proteína de fusão, e os usos da mesma.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
O papiloma vírus humano (HPV) é um vírus de DNA de pequeno porte, não revestidos e de filamento duplo, que infecta através da superfície da pele e da mucosa e está implicado em uma variedade de doenças. A infecção da pele por HPV pode causar verrugas na mão ou no pé, que podem persistir durante meses ou anos. Tal alteração patológica benigna geralmente não é fatal, exceto para os casos raros, mas pode causar dor ao paciente. O HPV na mucosa infecta as regiões do ânus e os genitais, assim como a cavidade oral. Cerca de 100 tipos diferentes de HPV foram identificados até esta data. Cerca de 40 subtipos de HPV infectam especificamente o sistema genital e as membranas da mucosa da cavidade oral. Estes tipos de HPV não provocarão quaisquer sintomas durante a infecção e raramente darão origem a verrugas genitais visíveis, embora os sintomas normalmente sejam gradativamente manifestados após 2-3 meses, com infecção viral. A infecção pode não ser conhecida por períodos que variam de até três semanas a vários anos depois, pois o HPV se espalha involuntariamente. A maioria das ocorrências da infecção é assintomática, mas pode levar a verrugas genitais e câncer do ânus e do trato genital. A verruga genital resultante da infecção pelo HPV na mucosa é considerada uma de uma série de doenças sexualmente transmissíveis (DST), e sua ocorrência em todo o mundo é duas vezes maior que a infecção pelo vírus herpes simplex. A infecção persistente pelo
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HPV pode levar a uma lesão pré-maligna - neoplasia intra-epitelial cervical (NIC), e em alguns casos isto pode evoluir para câncer cervical. O câncer cervical apresenta uma ocorrência muito elevada em todo o mundo, sendo que a maioria dos casos são detectados positivos para o HPV DNA 16 e HPV DNA18 DNA (> 99%). O câncer cervical apresenta uma morbidade de 9,98 em 100 mil pessoas, resultando em um aumento de 500.000 pacientes em todo o mundo a cada ano, e é o fator mais importante causador de morte das mulheres com idade inferior a 50 anos. Além do câncer cervical, o HPV também está envolvido em muitos tipos de câncer anal e perianal.
A vacina preventiva tem sido desenvolvida no momento. A principal proteína do capsídeo para HPV tem sido expressa em células eucarióticas e pode formar partículas tipo vírus (VLP) no hospedeiro da expressão. Os VLPs purificados são úteis como vacina preventiva eficaz contra a infecção pelo HPV. No entanto, não existem ainda composições terapêuticas efetivas para a cura de tal infecção. Uma vez que o vírus faz uso de muitos dos próprios mecanismos do hospedeiro para sua replicação, é difícil desenvolver uma droga que iniba a replicação viral, sem prejudicar o hospedeiro. É sabido que o sistema imunológico desempenha um papel importante no controle da infecção pelo HPV. O fato do aumento da possibilidade de infecção por HPV entre as pessoas que receberam tratamento imunossupressor também demonstra o controle da infecção viral pelo sistema imunológico. As pesquisas sobre a redução da ocorrência natural de verrugas também demonstram evidências da capacidade do sistema imunológico para combater infecções. A redução natural de algumas verrugas genitais externas ocorrería em alguns indivíduos. Os estudos histológicos demonstraram a ocorrência de um número significativo de linfócitos T na área afetada, levando à suposição de que a resposta imune eficaz contra a infecção pelo HPV é principalmente mediada pela imunidade celular. Além disso, a redução natural das verrugas está associada com a infiltração de linfócitos, estimulação, rubefação na área da infecção e outros sintomas relevantes para as respostas imunes
3/36 mediadas por célula. A infecção por HPV seguida por indução de lesões é comumente vista em pacientes com imunidade mediada por célula comprometida. Portanto, a indução de respostas imunes efetivas, mediada por células, contra os antígenos do HPV é a chave para o desenvolvimento de vacinas contra a infecção pelo HPV.
Os estudos sobre vacina preventiva enfocam na proteína L1. Esta proteína pode ativar efetivamente os organismos para gerar imunidade humoral forte e persistente, permitindo a prevenção eficaz de certos subtipos de infecção por HPV, mas não é eficaz para o tratamento de lesões após a infecção pelo HPV. E6 e E7, duas proteínas do HPV que podem induzir e manter a transformação celular, são expressas nas células tumorais infectadas pelo HPV e são alvos terapêuticos ideais. Assim, as composições terapêuticas direcionadas para E6 e E7 oferecem opções para o controle das doenças associadas à infecção pelo HPV. Ao utilizar sistemas adequados de apresentação de antígeno (ou portadores de antígeno), E6 e E7, ou determinantes dos mesmos podem ser apresentados para o hospedeiro para induzir respostas mediadas por células fortes, duradouras e específicas, que podem curar as doenças associadas à infecção pelo HPV.
A proteína do capsídeo viral de HPV L1 e L2 foi usada como o sistema portador para transportar os antígenos de proteína HPV E6 ou E7 para induzir respostas imunes mediadas por células. A tolerância imune ao HPV pode ser induzida no hospedeiro devido a determinada imunidade ao HPV que o hospedeiro infectado possui, ou devido à latência ou infecções persistentes do HPV no hospedeiro infectado. Na verdade, apesar da proteína do capsídeo do HPV possuir imunogenicidade potencial, apenas metade dos pacientes com câncer cervical (câncer de colo do útero) podem gerar imunoglobulina G (IgG) específica para a proteína do capsídeo. Tal imunidade pré-existente ou tolerância imunológica causada pela proteína do capsídeo HPV L1 ou L2 pode limitar a eficácia da vacina terapêutica.
Quando expressa de forma recombinada em um sistema de expressão
4/36 adequada, as proteínas do capsídeo derivados de outros vírus também são capazes de automontagem em VLPs em um hospedeiro adequado. Estes VLPs também pode ser usados como sistemas de apresentação de antígenos (ou portadores de antígenos) para a apresentação de antígenos E6 ou E7 ou seus determinantes para induzir respostas imunes mediadas por células. No entanto, a purificação dos VLPs é ainda uma preocupação. Se VLPs são derivadas de vírus cujo hospedeiro é o homem, a vacina terapêutica resultante também enfrenta o problema da tolerância imunológica.
Assim, há a necessidade que a arte ofereça uma composição terapêutica para o tratamento de doenças associadas à infecção pelo HPV.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Um dos objetos da presente invenção trata-se de uma proteína de fusão que compreenda um antígeno E7 do papiloma vírus humano , uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular.
Outro objetivo desta invenção trata-se de uma macromolécula imunogênica polimerizada principalmente a partir da proteína de fusão, de acordo com esta invenção, através da automontagem da proteína de fusão.
É ainda outro objetivo desta invenção trata-se de uma composição (como vacinas) que compreenda a referida macromolécula imunogênica.
O primeiro aspecto da presente invenção trata-se uma proteína de fusão que compreende um antígeno E7 do papiloma vírus humano, uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular.
Em outra modalidade preferida, o referido antígeno E7 do papiloma vírus humano é um antígeno do papiloma vírus humano E7 de comprimento total ou um fragmento da proteína que contém o determinante antigênico do mesmo.
Em outra modalidade preferida, o referido antígeno E7 do papiloma vírus humano, a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular são ligadas por meio de aglutinações químicas ou estão acopladas
5/36 entre si. As referidas aglutinações químicas são aglutinações covalentes ou aglutinações não-covalentes.
Em outra modalidade preferida, as referidas aglutinações químicas são ligações peptídicas.
Em outra modalidade preferida, a referida proteína de fusão compreende, por sua vez, do terminal de amina ao terminal de carboxila, o antígeno E7 do papiloma vírus humano, a proteína do capsídeo viral e a proteína chaperone molecular.
Em outra modalidade preferida, um peptídeo de ligação (tais como 2-20 aa, de preferência 2-10 aa) está compreendido entre a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular, em que o referido peptídeo de ligação tem, pelo menos, um local de corte da enzima de restrição.
Em outra modalidade preferida, o referido local de corte da enzima de restrição é selecionado a partir do (mas não limitado a) local de corte da enteroquinase, local de corte da trombina ou da tripsina.
Em outra modalidade preferida, esta proteína do capsídeo viral é o antígeno do núcleo do vírus da hepatite B.
Em outra modalidade preferida, esta proteína do capsídeo viral é uma proteína do capsídeo viral de comprimento completo, ou um fragmento que retém a capacidade de automontagem da mesma, ou uma variante que mantém a capacidade de automontagem da mesma.
Em outra modalidade preferida, a referida proteína chaperone molecular é selecionada a partir de um membro da família de proteínas chaperone molecular.
Em outra modalidade preferida, a referida proteína chaperone molecular é um proteína chaperone molecular de comprimento completo, ou um fragmento que retém a atividade biológica da mesma, ou uma variante que mantém a sua atividade biológica.
Em outra modalidade preferida, a referida proteína chaperone molecular é selecionada a partir de: proteína de choque térmico 65 (Hsp65 do inglês Heat
Shock Proteins), proteínas de choque térmico 60 (Hsp60), proteína de choque térmico 70 (Hsp70), proteína de choque térmico 90 (Hsp90) ou proteína de choque térmico 100 ( Hsp100).
Em outra modalidade preferida, a referida proteína chaperone molecular é a proteína de choque térmico 65.
Em outra modalidade preferida, a referida proteína chaperone molecular é M. bovis BCG Hsp65.
Em outra modalidade preferida:
- o referido antígeno E7 do papiloma vírus humano é: (a1) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos da posição 1 a 98 retratada na SEQ ID NO: 1, ou uma proteína derivada do item (a1), com a mesma imunogenicidade da proteína definida no item (a1), formada por substituição, exclusão ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos na seqüência de aminoácidos definidas no item (a1); ou
- a referida proteína do capsídeo viral é: (b1) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos da posição 99 a 283 retratada na SEQ ID NO: 1, ou uma proteína derivada do item (b1), com a mesma função que a proteína definida no item (b1), formada por substituição, exclusão ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos na seqüência de aminoácidos definida no item (b1); ou
- a referida proteína chaperone molecular é: (c1) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos da posição 284 a 823 representada na SEQ ID NO: 1, ou uma proteína derivada de (c1), com a mesma função que a proteína definida no item (c1), formada por substituição, exclusão ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos na seqüência de aminoácidos definida no item (c1).
O segundo aspecto da presente invenção trata-se do uso da proteína de fusão na fabricação de uma macromolécula imunogênica.
O terceiro aspecto da presente invenção trata-se de uma molécula de
7/36 ácido nucléico que codifica a referida proteína de fusão.
O quarto aspecto da presente invenção trata-se de um vetor que compreende o referido ácido nucléico.
O quinto aspecto da presente invenção trata-se de células que compreendem o referido vetor ou que têm a referida molécula de ácido nucléico integrada ao seu genoma.
O sexto aspecto da presente invenção trata-se de uma macromolécula imunogênica que é um polímero de molécula múltipla formado principalmente a partir da proteína de fusão, através da automontagem da referida proteína de fusão, e que apresenta um peso molecular superior a 1.000 KD.
Em outra modalidade preferida, a referida macromolécula imunogênica é um polímero de molécula múltipla particulado com uma morfologia diferente daquela das partículas tipo vírus.
Em outra modalidade preferida, a referida macromolécula imunogênica possui um diâmetro de partícula de 1-1.000 nm.
Em outra modalidade preferida, a referida macromolécula compreende, ainda, pelo menos um imuno-estimulante para melhorar a resposta imunológica dos organismos.
Em outra modalidade preferida, o referido imuno-estimulante é acoplado à referida macromolécula imunogênica ou é embalado em tal macromolécula imunogênica; sendo que este imuno-estimulante é selecionado a partir de: RNA de filamento duplo ou CpG-DNA não metilado.
O sétimo aspecto da presente invenção trata-se de um método para preparar a referida macromolécula imunogênica, sendo que este método compreende:
(1) a cultura da referida célula para expressar a referida proteína de fusão;
(2) separação e purificação da proteína de fusão obtida de (1), onde um agente caotrópico é utilizado em uma ou mais etapas no processo de separação e purificação; e
8/36 (3) permissão para que a proteína de fusão obtida a partir do item (2) seja automontada para formar a referida macromolécula imunogênica ao remover o agente caotrópico.
Em outra modalidade preferida, o agente caotrópico é selecionado a partir da uréia ou do cloreto de guanidina.
Em outra modalidade preferida, tal uréia tem uma concentração no intervalo de 1-10 M, de preferência no intervalo de 2 -8 M, e mais preferivelmente na faixa de 4-8 M.
Em outra modalidade preferida, o cloreto de guanidina tem uma concentração na faixa de 1-10 M, de preferência no intervalo de 1 -6 M, e mais preferivelmente na faixa de 3-6 M.
O oitavo aspecto da presente invenção trata-se do uso da referida macromolécula na fabricação de uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças associadas à infecção por papiloma vírus humano (HPV).
Em outra modalidade preferida, as referidas doenças são selecionadas de (entre outros): tumores (como câncer cervical, câncer vaginal, câncer anal e perianal, câncer de orofaringe, câncer de seio maxilar, câncer de pulmão), neoplasia intra-epitelial cervical e verrugas genitais externas.
Em outra modalidade preferida, a referida macromolécula imunogênica como portador de antígeno ou vacina pode escapar da resposta imune ou tolerância imune às partículas tipo vírus que estão presentes nos organismos.
O nono aspecto da presente invenção trata-se de uma composição imunogênica que compreende: (a) a referida macromolécula imunogênica; e (b) veículo farmaceuticamente aceitável.
O décimo aspecto da presente invenção trata-se do uso da referida composição imunogênica na prevenção ou tratamento de doenças associadas à infecção pelo HPV.
O décimo primeiro aspecto da presente invenção trata-se de um método de prevenir ou tratar doenças associadas com a infecção pelo HPV, sendo que o
9/36 referido método compreende a administração ao indivíduo necessitado disso de uma quantidade efetiva da referida macromolécula imunogênica ou composição imunogênica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 mostra a construção do plasm ideo recombinante do Exemplo 1 da presente invenção.
A figura 2 é o eletroforegrama em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) a 12% para E7-Core-GcG65 expresso de forma recombinante no Exemplo 2 desta invenção.
A figura 3 é o eletrosferograma SDS-PAGE para a proteína de fusão separada e purificada E7-Core-GcG65 no Exemplo 2 da presente invenção.
A figura 4 compara os perfis da cromatografia da coluna da peneira molecular no Exemplo 2 da presente invenção.
A figura 5 são fotos de microscopia eletrônica do polímero de molécula múltipla de acordo com esta invenção.
A figura 6 mostra as determinações do tamanho das partículas do polímero de molécula múltipla, onde (A) mostra a distribuição de intensidade de luz das partículas, (B) mostra a distribuição de volume das partículas e (C) mostra o relatório de qualidade dos resultados da determinação.
DESCRIÇÃO DETALAHDA DA INVENÇÃO
Através de estudos intensos, o inventor divulga, pela primeira vez, uma proteína de fusão que compreende um antígeno E7 do papiloma vírus humano , uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular. Depois da expressão seguida de purificação em condições desnaturantes (como através do uso de uma alta concentração de agente caotrópico), a referida proteína de fusão pode sofrer renaturação e automontagem na forma solúvel para constituir uma
10/36 macromolécula com alta imunogenicidade. A referida macromolécula é um polímero de molécula múltipla particulado com uma morfologia diferente da morfologia das partículas tipo vírus e pode esquivar-se da resposta imune ou tolerância imunológica às partículas tipo vírus que estão presentes nos organismos.
Quando usados neste documento, os termos proteína de fusão de acordo com os termos desta invenção, “uma proteína de fusão que compreende um antígeno E7 do papiloma vírus humano, uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular e proteína de fusão E7-Core-Hsp65 são utilizados indiferentemente para referir-se a uma proteína formada pela fusão de um antígeno E7 do papiloma vírus humano, uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular, onde o referido antígeno E7 do papiloma vírus humano, a referida proteína do capsídeo viral e a proteína chaperone molecular podem ser unidas através de aglutinações químicas ou estão acoplados entre si. De preferência, elas são aglutinadas através aglutinações químicas (como as ligações peptídicas), com ou sem seqüência(s) de peptídeo de ligação.
Conforme usados neste documento, o termo macromolécula imunogênica refere-se a uma macromolécula com uma série de proteínas de fusão monomérica. De preferência, ela é polimerizada ou montada a partir de uma série de proteínas de fusão monomérica. A referida macromolécula imunogênica é particulada, apresentando uma morfologia diferente daquela das partículas tipo vírus.
Conforme usadas neste documento, as expressões compreendendo, ter ou incluindo (ou variantes gramaticais das mesmas) compreendem contendo, que consiste substancialmente de ... , constituído essencialmente por ... e consistindo de.... Substancialmente constituída de ..., constituído essencialmente por... e que consiste de ... são conceitos subordinados de compreendendo, ter ou incluindo.
Proteína de fusão
A presente invenção descreve uma proteína de fusão que compreende um antígeno E7 do papiloma vírus humano, uma proteína de capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular, que é útil para formar uma macromolécula imunogênica. Preferencialmente, a referida proteína de fusão é uma proteína isolada sem associação com outras proteínas, peptídeos ou moléculas, e é um produto puro, ou um extrato purificado a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes.
1. Antígeno E7 do Papiloma vírus Humano (HPV)
O Antígeno E7 do Papiloma vírus Humano (HPV) ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo (como um fragmento de proteína que contém os determinantes antigênicos do mesmo) podem ser usados na presente invenção. Entende-se por um fragmento biologicamente ativo do antígeno E7 do HPV um fragmento polipeptídico que retém todas, ou parte, da imunogenicidade do antígeno E7 do HPV de extensão total, após o mesmo ser ligado a uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular (de preferência ligado com uma proteína de capsídeo viral, mais preferivelmente ligados ao Terminal N de uma proteína de capsídeo viral) para formar uma proteína de fusão. Normalmente, o referido fragmento biologicamente ativo mantém pelo menos 50% da imunogenicidade do antígeno E7 do HPV de extensão total. Mais preferivelmente, o referido fragmento biologicamente ativo retém 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da imunogenicidade do antígeno E7 do HPV de extensão total.
O antígeno E7 do HPV de extensão total ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo compreende uma parte da seqüência com substituições de aminoácidos conservadores naquelas que, basicamente, não têm efeito sobre a referida imunogenicidade. É uma tecnologia na arte bem conhecida e de fácil execução a realização de substituições adequadas de aminoácidos, sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Geralmente, uma única alteração de
12/36 aminoácido nas regiões não-essenciais de um polipeptídio não irão basicamente alterar a atividade biológica. Ver Watson et. al., Molecular Biology of The Gene, the 4th edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., P224. Exemplos de tais substituições são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1
| Resíduos originais de aminoácidos | Substituições conservadoras |
| Ala (A) | Gly; Ser |
| Arg (R) | Lys |
| Asn (N) | Gin; His |
| Cys (C) | Ser |
| Gin (Q) | Asn |
| Glu (E) | Asp |
| Gly (G) | Ala;Pro |
| His (H) | Asn; Gin |
| He (D | Leu;Val |
| Leu (L) | lie; Vai |
| Lys (K) | Arg; Gin; Glu |
| Met (M) | Leu; Tyr; lie |
| Phe (F) | Met; Leu; Tyr |
| Ser (S) | Thr |
| Thr (T) | Ser |
| Trp (W) | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp; phe |
| Vai (V) | lie; Leu |
Podem existir substituições semelhantes que podem ser determinadas empiricamente ou com base em seqüências conservadoras conhecidas.
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Em modalidades preferidas da presente invenção, a seqüência de aminoácidos para o referido antígeno E7 do HPV pode ser essencialmente idêntica à sequência da posição 1 a 98 representada na SEQ ID N°: 1, e a seqüência da codificação do referido antígeno E7 do papiloma vírus humano pode ser essencialmente idêntica à sequência da posição 1 a 294 representada na SEQ ID N°: 2.
2. Proteína do capsídeo viral
A proteína doe capsídeo viral, de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer proteína do capsídeo adequada derivada de vírus, desde que ela seja capaz de automontagem, e conserve a capacidade de automontagem depois de ser unida ao referido antígeno à referida proteína chaperone molecular para formar a proteína de fusão de acordo com a presente invenção.
A referida proteína do capsídeo viral é uma proteína do capsídeo viral de extensão total, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma que mantém a capacidade de automontagem, ou uma variante dela que conserva a capacidade de automontagem.
Entende-se por um fragmento biologicamente ativo da proteína do capsídeo viral um fragmento polipeptídico que retém todas ou parte da capacidade de automontagem da proteína do capsídeo viral de extensão total. Normalmente, o referido fragmento biologicamente fragmento mantém pelo menos 50% da capacidade de automontagem da proteína do capsídeo viral de extensão total. Mais preferivelmente, o referido fragmento biologicamente ativo retém 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da capacidade de automontagem da proteína do capsídeo viral de extensão total.
A proteína do capsídeo viral de extensão total ou fragmento biologicamente ativo da mesma compreende uma parte da seqüência com substituições de aminoácidos conservadores naquelas, que, basicamente, não têm qualquer efeito sobre a referida capacidade de automontagem. Exemplos de tais substituições
14/36 são apresentados na Tabela 1. Podem existir substituições semelhantes que podem ser determinadas empiricamente ou com base em seqüências conservadoras conhecidas.
Em modalidades preferidas da presente invenção, a referida proteína do capsídeo viral é o antígeno de núcleo do vírus da hepatite B (HBV). Em uma modalidade particular da presente invenção, a referida proteína de capsídeo viral é o subtipo ADW2 do vírus da hepatite B.
Os métodos para produzir o fragmento biologicamente ativo ou variante da referida proteína do capsídeo estão disponíveis na literatura publicada (Koschei M, Thomssen R, V. Bruss 1999. Mutagênese extensa do gene do núcleo do vírus da hepatite B e mapeamento das mutações que permitem a formação do capsídeo. J Virol. 73(3):2153-60; Paintsil J, Muller M, Picken M, Gissmann L, Zhou J. 1996. O Terminal de carboxila da proteína L1 tipo 1 do papiloma vírus bovinonão é necessário para a formação do capsídeo. Virology. 223(1):238-44: Beames B, Lanford RE. 1995. Inserções dentro da proteína de capsídeo viral da hepatite B influenciam a formação do capsídeo e da encapsidação do Ácido Ribonucleico (ARN). J Virol.69(11):6833-8).
Em concretizações preferidas da presente invenção, a seqüência de aminoácidos da referida proteína de capsídeo viral pode ser essencialmente idêntica à sequência da posição 99 a 283 representada na SEQ ID N°: 1, e a seqüência de codificação para a referida proteína de capsídeo viral pode ser essencialmente idêntica à sequência da posição 295 a 849 representada na SEQ ID N°: 2.
3. Proteína chaperone molecular
A proteína chaperone molecular de acordo com a presente invenção pode ser qualquer proteína adequada da família da proteína chaperone molecular, desde que possam se unir com proteínas de configuração não-natural ou proteínas desnaturadas, para impedir a formação de agregados desnaturados e
15/36 facilitar a renaturação adequada dos agregados, para que a proteína de fusão desnaturada possa sofrer renaturação e automontagem.
A referida proteína chaperone molecular é uma proteína chaperone molecular, ou um fragmento biologicamente ativo que mantém a função biológica da mesma, ou uma variante que mantém a função biológica da mesma.
Entende-se por um fragmento biologicamente ativo da proteína chaperone molecular um fragmento polipeptídico que retém todas ou parte das funções biológicas da proteína chaperone molecular de extensão total. Normalmente o referido fragmento biologicamente ativo mantém pelo menos 50% da função biológica da proteína chaperone molecular de extensão total. Mais preferivelmente, o referido fragmento biologicamente ativo retém 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da função biológica da proteína chaperone molecular de extensão total.
A proteína chaperone molecular de extensão total ou um fragmento biologicamente ativo da mesma compreende uma parte da seqüência com substituições conservadoras de aminoácidos naquela, que, basicamente, não têm qualquer efeito sobre a referida função biológica. Exemplos de tais substituições são apresentados na Tabela 1. Podem existir substituições semelhantes que podem ser determinadas empiricamente ou com base em seqüências conservadoras conhecidas.
Métodos para produzir o fragmento biologicamente ativo ou variante da referida proteína chaperone molecular estão disponíveis na literatura publicada (Jewett Al, Shea JE. 2006. Enrolamento sobre a chaperone: aumento de produtividade através da amarração frouxa. J Mol. Biol. 363(5):945-57; Bhattacharyya J, Padmanabha Udupa EG, Wang J, Sharma KK. 2006. Cristalino Mini-alfaB: um elemento funcional do cristalino alphaB com atividade tipo chaperone. Biochemistry. 45(9):3069-76; Ramon-Luing LA, Cruz-Migoni A, Ruiz-Medrano R, Xoconostle-Cazarea B, Ortega-Lopez J. 2006. Purificação em
16/36 uma etapa e imobilização na celulose do domínio apical GroEL fundido em um módulo vinculativo de carboidrato e sua utilização no re-enrolamento de proteínas. Biotechnol Lett. 28(5):301-7; Fox JD, Routzahn KM, Bucher MH, Waugh DS. 2003. Proteínas de ligação de maltodextrina a partir de diversas bactérias que são realçadores poderosos de solubilidade. FEBS Lett. 537(1 -3):53-70Fox JD, Kapust RB, Waugh DS, 2001. As substituições únicas de aminoácido na superfície da proteína de ligação de maltose Escherichia coli pode ter um profundo impacto sobre a solubilidade das proteínas de fusão. Protein Sei. 10(3):622-30; Chatellier J, Buckle AM, Fersht AR. 1999. GroEL reconhece os motivos estruturais lineares sequenciais e não-sequenciais compatíveis com hélices alfa e cordões beta estendidos. J Mol. Biol. 292(1):163-72).
Em bactérias como a E. Coli, as proteínas chaperone molecular tendem a ter um nível muito alto de expressão em condições adversas, tal como a alta temperatura. Portanto, este tipo de proteínas chaperone molecular também é tradicionalmente denominado proteína de choque térmico (Hsps). A expressão das proteínas chaperone molecular geralmente está associada à indução por calor ou outras condições adversas à célula, porque o processo de enrolamento adequado das proteínas é significativamente afetado a uma temperatura relativamente elevada, de forma que as proteínas chaperone molecular são obrigadas a reparar os danos às células possivelmente causados pelo enrolamento inadequado de algumas das proteínas. As famílias de proteínas chaperone molecular comuns incluem Hsp 60, Hsp70, Hsp90, HsplOO e proteínas Hsp de pequeno peso molecular. As proteínas chaperone molecular não estão limitadas às proteínas de choque térmico. Outras proteínas chaperone molecular também podem, usando o método de acordo com esta invenção, ser fundidas com proteínas do capsídeo viral para a construção de proteínas de fusão para a preparação da macromolécula imunogênica, de acordo com a presente invenção.
Em modalidades preferidas da presente invenção, a referida proteína
17/36 chaperone molecular é M. bovis BCG Hsp65.
Em modalidades preferidas da presente invenção, a seqüência de aminoácidos para a referida proteína chaperone molecular pode ser essencialmente idêntica à sequência da posição 284 a 823 na SEQ ID N°: 1, e 5 seqüência de codificação para a referida proteína chaperone molecular pode ser essencialmente idêntica à sequência da posição 850 a 2.469 em SEQ ID N°: 2.
4. Ligação
O referido antígeno E7 do papiloma vírus humano, a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular estão unidos através de 10 aglutinações químicas ou estão acoplados entre si. As referidas aglutinações químicas são aglutinações covalentes ou aglutinações não-covalentes.
Nas modalidades preferidas da presente invenção, o referido antígeno E7 do papiloma vírus humano, a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular estão ligados através de aglutinações químicas, e as 15 referidas aglutinações químicas são preferencialmente ligações peptídicas.
Alternativamente, a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular estão ligadas através de uma ligação química, enquanto o antígeno E7 do papiloma vírus humano e a referida proteína do capsídeo viral são unidas um ao outro.
Nas modalidades preferidas da presente invenção, a referida proteína de fusão compreende do terminal de amina ao terminal de carboxila, o antígeno E7 do papiloma vírus humano, a proteína do capsídeo viral e a proteína chaperone molecular.
O referido antígeno E7 do papiloma vírus humano, a referida proteína do 25 capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular podem ser unidos uns aos outros diretamente ou através de polipeptídeos ligantes (peptídeos de ligação). Os aglutinadores, em que, cada um, por exemplo, compreende 1-50 aminoácidos, de preferência 1-30 aminoácidos, são dispostos de forma tal que
18/36 eles praticamente não têm qualquer efeito sobre a automontagem da proteína de fusão para formar macromoléculas imunogênicas.
Em modalidades preferidas da presente invenção, um peptídeo de ligação (tais como o 2-20 aa, de preferência 2-10 aa) está compreendido entre a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular. O referido peptídeo de ligação tem, pelo menos, um local de corte da enzima de restrição, que é selecionado a partir do (entre outros) sítio de divagem da enteroquinase, sítio de divagem da trombina ou da tripsina. O sítio de divagem da enzima de restrição está disposto de forma a facilitar a posterior divagem da referida proteína chaperone molecular a partir da proteína de fusão da referida partícula macromolecular. A proteína de fusão, assim concebida e construída, é submetida à expressão recombinante, separação e purificação, renaturação e automontagem para formar uma macromolécula imunogênica (polímero de molécula múltipla), a partir da qual a proteína chaperone molecular pode ser clivada utilizando uma enzima específica para obter a macromolécula final que contém apenas as proteínas do capsídeo. Por exemplo, a seqüência de Asp-Asp-Asp-Asp-Lys pode ser reconhecida pela enteroquinase. Ao introduzir tal seqüência no local da ligação da proteína de fusão de acordo com a presente invenção, a proteína chaperone molecular pode ser clivada da macromolécula formada pela referida proteína de fusão com enteroquinase para obter, após a separação e purificação, a macromolécula que contém apenas as proteínas do capsídeo.
5. Molécula do ácido nucléico
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um ácido nucléico isolado que codifica a referida proteína de fusão ou um cordão complementar da mesma. Qualquer ácido nucléico que codifique a referida proteína de fusão é útil para a presente invenção. As sequências mencionadas nos exemplos a seguir são adequadas para o método, de acordo com a presente invenção.
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A sequência de DNA que codifica a proteína da fusão de acordo com a presente invenção pode ser sintetizada artificialmente em sua extensão total. Alternativamente, a sequências de DNA, respectivamente codificando o referido antígeno E7 do papiloma vírus humano, a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular, podem ser obtidas pela amplificação de PCR e, depois, unindo-as para formar a sequência de DNA que codifica a proteína de fusão de acordo com a presente invenção.
6. Vetor da Expressão
Esta invenção fornece também um vetor que compreende a molécula de ácido nucléico que codifica a referida proteína de fusão. O referido vetor pode ainda incluir uma seqüência de regulação da expressão operacionalmente ligada à sequência da referida molécula de ácido nucléico para facilitar a expressão da referida proteína de fusão.
Como usado aqui, operacionalmente ligado a refere-se a uma condição em que certas partes de uma seqüência de DNA linear podem afetar as atividades de outras partes da mesma seqüência de DNA linear. Por exemplo, se um promotor controla a transcrição de uma seqüência de codificação, ele está operacionalmente ligado à sequência de codificação.
Qualquer vetor adequado pode ser utilizado na presente invenção, tal como alguns dos vetores usados na clonagem e expressão de células de bactérias, fungos, leveduras e de mamíferos, como descrito em Pouwels al. al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual.
7. Células Hospedeiras
As células recombinantes que compreendem a seqüência de ácido nucléico que codifica a referida proteína de fusão também estão incluídas na presente invenção.
Conforme usado neste documento, o termo células hospedeiras inclui tanto as células procariotas e eucariotas. As células hospedeiras procarióticas
20/36 comumente usadas incluem E.coli, Bacillus subtilis, etc, tais como E. coli HMS174 (DE3), ou BL21 (DE3). As células hospedeiras eucarióticas comumente usadas incluem células de levedura, células de insetos e células de mamíferos. Em modalidades preferidas da presente invenção, as células procariotas são usadas como células hospedeiras.
8. Método para produzir a proteína de fusão
O método para a produção da proteína de fusão também está incluído na presente invenção. O referido método compreende a cultura de células recombinantes, compreendendo o ácido nucléico que codifica a proteína de fusão. O referido método pode incluir permissão para que a célula expresse a proteína de fusão codificada e para que a proteína de fusão expressa sofra renaturação. O referido método pode ainda incluir a separação e/ou purificação da proteína de fusão renaturada.
A proteína de fusão obtida, como descrito acima, pode ser purificada para a proteína com homogeneidade essencial, tal como a que exibe uma faixa única em eletroforegrama SDS-PAGE.
9. Uso da proteína de fusão
A proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser usada para preparar uma macromolécula imunogênica para induzir respostas imunes no organismo, incluindo respostas imunes mediadas por células.
10. Macromolécula imunogênica e método de preparação da mesma
A presente invenção também fornece uma macromolécula imunogênica que é um polímero de molécula múltipla. O referido polímero compreende a referida proteína de fusão e, preferencialmente, o referido polímero é essencialmente polimerizado a partir da referida proteína de fusão. A referida macromolécula imunogênica é um polímero de molécula múltipla particulado com uma morfologia diferente daquela das partículas tipo vírus. A referida macromolécula imunogênica normalmente tem um diâmetro de partícula de cerca de 1-1000 nm, de preferência cerca de 5-500 nm, e mais preferivelmente aproximadamente 10-100 nm, tal como aproximadamente 20 nm, 40 nm, 60 nm ou 80 nm.
No sistema imunológico as moléculas de MHC de Classe I e de Classe II do organismo apresentam antígenos exógenos que estão na forma particulada 1.000 ou 10.000 vezes mais do que estão em antígenos monoméricos solúveis. Ou seja, os antígenos em forma particulada são muito mais imunogênicos do que os antígenos monoméricos solúveis.
Moléculas de proteína do capsídeo desnaturadas individuais tendem a formar agregados de partículas amorfas e não formam partículas tipo vírus durante a renaturação. Além disso, as moléculas de proteína do capsídeo desnaturadas individuais geralmente não podem estar presentes na forma solúvel, em soluções sem um agente caotrópico, devido à formação de partículas agregadas. Isto pode estar relacionado às interações entre os grupos hidrofóbicos nas moléculas de proteína do capsídeo. Estes grupos hidrofóbicos desempenham um papel fundamental na automontagem das moléculas de proteína do capsídeo em partículas tipo vírus e na manutenção da estabilidade das partículas tipo vírus formadas, com estes grupos hidrofóbicos sendo aprisionados no interior das partículas tipo vírus normais. Em soluções que contêm uma alta concentração de agente caotrópico, como uma solução de uréia ou uma solução de cloreto de guanidina, partículas tipo vírus sofrem dissociação parcial ou total sob a alta concentração do agente caotrópico, resultando na ruptura das estruturas mais altas das proteínas e a exposição (à solução) dos grupos hidrofóbicos aprisionados dentro das partículas tipo vírus normais. Quando o agente caotrópico é gradualmente retirado da solução, as interações entre os grupos hidrofóbicos expostos aumentam cada vez mais de forma que as proteínas do capsídeo desnaturadas formam partículas agregadas. As proteínas de fusão nas soluções que contêm uma alta concentração do agente caotrópico, como uma solução de uréia ou uma solução de cloreto de guanidina, também farão com que
22/36 os grupos hidrofóbicos de suas proteínas do capsídeo fiquem expostas à solução. No entanto, quando o agente caotrópico é gradualmente retirado da solução, os grupos hidrofóbicos expostos das proteínas do capsídeo são protegidos pelas proteínas chaperone moleculares nas proteínas de fusão, para que as proteínas de fusão possam estar presentes na forma solúvel na solução, e sofrer renaturação e automontagem para, finalmente, formar macromoléculas imunogênicas particuladas. As proteínas de fusão são as moléculas distintas das proteínas de fusão, principalmente porque o processo de tal desnaturação in vitro, renaturação e automontagem de moléculas de proteína de fusão têm naturezas completamente diferentes em termos de condições ao redor para o processo, fatores envolvidos no processo e a progressão do processo, em comparação com o processo de enrolamento natural in vivo e a automontagem das moléculas de proteína do capsídeo. Portanto, as características morfológicas da macromolécula de acordo com a presente invenção formada por desnaturação em vitro, renaturação e automontagem das proteínas de fusão são diferentes daquelas de partículas tipo vírus naturais.
Apesar da macromolécula imunogênica, de acordo com a presente invenção, não ter características morfológicas das partículas tipo vírus naturais, elas ainda têm uma imunogenicidade muito forte. Essa diferença nas características morfológicas podem fazer com que os antígenos ou determinantes do antígeno expostos pelas proteínas do capsídeo na macromolécula imunogênica, de acordo com esta invenção, sejam diferentes daqueles expostos pelas proteínas do capsídeo nas partículas tipo vírus. Uma vez que, as respostas imunes do organismo, especialmente a resposta imune humoral, têm uma estreita correlação com os antígenos expostos ou determinantes de antígeno, a diferença na exposição de antígenos ou determinantes de antígeno pelas moléculas da proteína do capsídeo entre a macromolécula imunogênica, de acordo com esta invenção, e as partículas tipo vírus oferece as seguintes vantagens:
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1. As respostas imunes no organismo induzidas por infecções virais anteriores não têm efeito sobre a macromolécula imunogênica de acordo com a presente invenção. Portanto, o uso da macromolécula imunogênica, de acordo com esta invenção, como imunogênico pode evitar o ataque imunológico contra proteínas do capsídeo viral nos organismos. Em contraste, as partículas tipo vírus são submetidas a ataque das respostas imunológicas do organismo, de modo que elas não servem como imunógeno para ativar a resposta imune no organismo;
2. Se os organismos desenvolverem a tolerância imunológica a uma infecção viral, a imunogenicidade das partículas tipo vírus correspondentes pode ser afetada pela tolerância imunológica. O efeito dessa tolerância imunológica pode ser contornado usando as macromoléculas imunogênicas, de acordo com a presente invenção,
3. O uso das macromoléculas imunogênicas, de acordo com esta invenção, como imunógenos pode evitar a geração de interferência para a análise imune das proteínas do capsídeo disponíveis comercialmente.
As macromoléculas imunogênicas, de acordo com a presente invenção, têm uma imunogenicidade muito forte, porque: (1) elas consistem em um número de monômeros e subunidades, e elas estão em forma de partículas com um peso molecular superior a 1.000 KD, considerando que um antígeno particulado é 1.000 ou 10.000 vezes mais imunogênico do que um antígeno monomérico solúvel; e (2 ), algumas das seqüências da proteína do capsídeo na proteína de fusão podem ser reconhecidas pelos mecanismos imunes inatos do organismo, que produz respostas imunes fortes e persistentes em combinação com a imunidade adquirida do organismo.
Depois de ser expresso pela tecnologia recombinante de DNA, a proteína de fusão que contém proteínas do capsídeo, de acordo com a presente invenção, pode ser separada e purificada em uma ou mais etapas, usando uma alta
24/36 concentração de agente caotrópico, como uréia ou cloreto de guanidina. A proteína de fusão purificada pode sofrer renaturação e automontagem, já que o agente caotrópico é gradualmente removido para formar as macromoléculas imunogênicas, de acordo com a presente invenção.
Um método para preparar as referidas macromoléculas imunogênicas inclui: (1) cultura de células que compõem o ácido nucléico que codifica a referida proteína de fusão, para expressar a referida proteína de fusão; (2) separação e purificação da proteína de fusão obtida de (1), onde um agente caotrópico é utilizado em uma ou mais etapas na separação e purificação; e (3), permitindo que a proteína de fusão obtida a partir de (2) realize a automontagem nas referidas macromoléculas imunogênicas, ao remover o agente caotrópico.
O agente caotrópico que pode ser utilizado é selecionado da (mas não limitado a) uréia ou cloreto de guanidina. A concentração de uréia usada pode estar na faixa de 1 -10 M, de preferência no intervalo de 2-8 Μ. A concentração do cloreto de guanidina usada pode estar no intervalo de 1-10 M, e, de preferência, no intervalo de 1-6 M.
Como a proteína do capsídeo na molécula de proteína de fusão passa por automontagem, as macromoléculas imunogênicas podem ser constituídas pela embalagem do ácido nucléico. Alguns ácidos nucléicos, tais como o RNA de filamento duplo ou o CpG-DNA não-metilado, são fortes imunoestimulantes e podem melhorar significativamente as respostas imunes do organismo.
A proteína de fusão de acordo com a presente invenção, quando separada e purificada, pode sofrer a renaturação e automontagem para formar macromoléculas imunogênicas (isto é, polímeros de múltiplas moléculas) com um peso molecular superior a 1.000 KD. As referidas macromoléculas imunogênicas estão sob a forma de particulado, de forma que sua imunogenicidade é 1.000 ou 10.000 vezes mais forte do que um antígeno monomérico solúvel. O teste por cromatografia em coluna de peneira molecular demonstrou que a posição do pico
25/36 de eluição para as macromoléculas imunogênicas, de acordo com esta invenção, é essencialmente compatível com a das partículas tipo vírus formadas por proteínas do capsídeo.
Esta invenção fornece também a utilização da referida macromolécula imunogênica na produção de uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças associadas à infecção pelo papiloma vírus humano (HPV). As referidas doenças são selecionadas a partir de (entre outras): tumores (como câncer cervical, câncer vaginal, câncer anal e perianal, câncer de orofaringe, câncer de seio maxilar, câncer de pulmão), neoplasia intra-epitelial cervical ou verrugas genitais externas.
Composição
A presente invenção também fornece uma composição imunogênica (vacina preventiva ou terapêutica), que compreende uma quantidade efetiva das referidas macromoléculas imunogênicas, de acordo com a presente invenção, e veículo farmaceuticamente aceitável.
Como usado aqui, os componentes farmaceuticamente aceitáveis se referem a uma substância adequada para uso em indivíduos humanos e/ou mamíferos, sem efeitos colaterais adversos (tais como toxicidade), e compatíveis com uma razão benefício/ risco razoável. O termo veículo farmaceuticamente aceitável se refere a um portador para a administração de um agente terapêutico, os quais incluem vários excipientes e diluentes. O termo portadores de agentes terapêuticos” refere-se a compostos que não sejam, por si só, os componentes ativos essenciais e não sejam indevidamente tóxicos após a aplicação. Os portadores adequados são bem conhecidos por aqueles com competência normal na arte. Uma descrição completa dos portadores farmaceuticamente aceitáveis pode ser encontrada em Reminton's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.,
N.J. 1991). Os portadores farmaceuticamente aceitáveis na composição podem incluir líquidos, como água, soro fisiológico, glicerol e sorbitol. Além disso, esses
26/36 portadores podem ter agentes auxiliares, como, por exemplo, agente lubrificante, deslizante ou emulsificante, substância tampão de pH e agente de estabilização, como, por exemplo, a albumina ou substância similar.
A referida composição pode ser formulada em vários tipos de dosagem apropriadas para a administração a mamíferos, incluindo, mas não limitado, a injeções, cápsulas, comprimidos, emulsões, supositórios.
Experimentos em animais mostraram que os ratos imunizados com a vacina preparada com as macromoléculas imunogênicas, de acordo com a presente invenção, tiveram uma redução na taxa de crescimento de tumor e redução no volume do tumor, o que efetivamente aumentou a sobrevida dos camundongos portadores de tumor.
Quando destinado ao uso, as macromoléculas imunogênicas, conforme esta invenção, são administradas a indivíduos mamíferos (como seres humanos) com uma quantidade segura e eficaz, na qual a referida quantidade segura e eficaz é normalmente, pelo menos, cerca de 1 pg / kg de peso corporal e, na maioria dos casos, não é mais do que cerca de 10 mg / kg de peso corporal, de preferência na faixa de 1 pg / kg de peso corporal a 1 mg / kg de peso corporal. A determinada dose administrada depende, é claro, de tais considerações, tais como a via de administração, a saúde geral do paciente e similares, que estão dentro da competência dos médicos.
Esta invenção está ainda descrita em conjunto com os seguintes exemplos em particular. Deve ser entendido que estes exemplos são ilustrativos da presente invenção e não limitam o escopo da presente invenção. Os procedimentos de experiência nos seguintes exemplos para os quais não são especificadas as condições particulares em geral seguem essas condições, como descrito em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), ou aquelas condições recomendadas pelos fabricantes. Salvo indicação em contrário, as percentagens
27/36 e as partes são por peso.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Projeto e síntese do gene para a molécula FCCP que transporta o antígeno do HPV
A proteína chaperone molecular utilizada foi derivada da Hsp65 de Mycobacterium bovis BCG (Thole JE, Keulen WJ, De Bruyn J, Kolk AH, Groothuis DG , Berwald LG, Tiesjema RH, van Embden JD. 1987. Caracterização, determinação da seqüência e imunogenicidade de uma proteína 64 kilodalton de Mycobacterium bovis BCG expressa em Escherichia coli K-12. Infect. Immun. 55 (6) : 1466-75; Número de adesão GeneBank: M17705.1). A proteína chaperone molecular foi fundida ao terminal de carboxila da proteína do capsídeo do vírus da hepatite B (HBV) subtipo ADW2 (antígeno do núcleo, número de adesão de nucleotídeo NCBI: AF324148) para formar uma mólecula de proteína chaperone capsídeo de fusão (FCCP). Proteína E7 tipo 16 do papiloma vírus humano (HPV) (número de adesão GeneBank: # K02718) foi selecionada como o antígeno a ser transportado. A proteína E7 foi fundida ao Terminal N da molécula da proteína do capsídeo em FCCP para formar uma proteína de fusão do FCCP que carrega o antígeno E7, que é E7-Core-hsp65, cuja seqüência de aminoácido é mostrada na SEQ ID N°: 1.
O peso molecular da proteína de fusão E7-Core-hsp65 foi deduzido para ficar em 89,245 KD pela sua seqüência de aminoácidos. Com base nas seqüências do GenBank, a codificação da seqüência da proteína de fusão DNA E7-Core-hsp65 (também denominada E7-Core-BCG65) foi preparada pela síntese artificial total usando métodos químicos. Esta seqüência de DNA sintetizado, 2479 bp no total, é conforme mostrado na SEQ ID N°: 2 e denominada Ankegens 2479bp. Ela foi clonada no vetor pBLUESCRIPT II SK (+/-)(Stratagene) no local Smal para obter o plasmídeo recombinante pBSK-Ankegens-2479bp (Ver Figura. 1)·
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Exemplo 2. Expressão recombinante e separação e purificação da proteína de fusão E7-Core-Hsp65
Fragmentos de DNA para a proteína de fusão E7-Core-BCG65 foram clivados do plasmídeo pBSK-Ankegens-2479bp por Ndel e EcoRI e subclonados nos locais correspondentes na expressão plasmídeo pET-23a (Emdbiosciences) para obter o plasmídeo recombinante pET-23a-2479. Este plasmídeo recombinante foi transformado em bactérias hospedeiras Rosetta-gami (DE3) de Novagen para a expressão da proteína de fusão E7-Core-hsp65. De acordo com o Manual do Sistema pET da Novagen, foi realizada cultura fermentativa e indução com 0.5mM IPTG (isopropil-tio-galactopiranosídeo) da cepa de E. coli Rosetta-gami (DE3) transformada com o plasmídeo recombinante para atingir a expressão da proteína de fusão isopropil-tio-galactopiranosídeo. O eletroforegrama SDS-PAGE do produto da expressão é mostrado na figura. 2, na qual a faixa 2 representa o resultado da eletroforese para todas as bactérias hospedeiras Rosetta-gami (DE3) sem plasmídeo recombinante, as faixas 2, 3, 4 e representam os resultados da eletroforese para todas as bactérias hospedeiras Rosetta-gami (DE3) transformadas pET-23a-2479 após a indução IPTG, e a faixa representa o resultado da eletroforese para um padrão de proteína de baixo peso molecular.
Após a fermentação, as células foram colhidas por centrifugação. 100 g de células molhadas foram suspensas em 1000 ml de tampão A (100mM Tris-HCI pH 9.0; 5mM EDTA). As células, quando totalmente suspensas, foram centrifugadas a 8.500 rpm por 30 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi suspenso em 1000 ml de tampão B (50 mM acetato de sódio, 2 mM EDTA). As células totalmente suspensas foram lisadas por homogeneização de alta pressão a 760 bar e, em seguida, o lisado foi centrifugado a 8500 rpm por 30 minutos. O sobrenadante foi coletado e o precipitado foi descartado. A uréia foi adicionada ao sobrenadante em uma razão de 0.7 g de uréia por 1 ml do sobrenadante. Em
29/36 seguida, foi adicionado NaCI para uma concentração final de 100 mM e L-cisteína foi adicionado à concentração final de 20mM . A mistura foi bem agitada a temperatura ambiente, e quando a uréia foi completamente dissolvida, a solução resultante foi agitada a 4°C durante a noite. Depois de ter sido agitada durante a noite, a amostra foi colocada em uma coluna de cromatografia XK-50 (GE Health), contendo 300ml de SP-Sepharose (GE Health) como o material de embalagem, coluna esta que foi lavada previamente com 1 M de NaCI e suficientemente equilibrada com Tampão C ( 50 mM de acetato de sódio; 100 mM NaCI , 2 mM EDTA , 8 M uréia; 10 mM L-cisteína). Após o carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de Tampão D (50 mM acetato de sódio , 100 mM NaCI; 2 mM EDTA; M 8 uréia, 10 mM L-cisteína, 2,5% Triton -X-100) durante a noite para a remoção da contaminação por endotoxina. Posteriormente, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de Tampão C para remover o Triton-X-100 e, em seguida, lavada com três volumes de coluna de Tampão E ( 50 mM acetato de sódio; 300 mM NaCI, 2 mM EDTA ; M 8 uréia; 10 mM L-cisteína) para remover outros contaminantes. A proteína de fusão E7-Core-BCG65 foi eluída a coluna com tampão H (50 mM acetato de sódio , 800 mM NaCI , 2 mM EDTA , 8 M uréia , 10 mM L-cisteína). O conjunto de proteínas eluídas foi dialisado contra 4X 40 volumes de tampão F (50 mM acetato de sódio , 6 M uréia) para remover NaCI e L-cisteína. Após a diálise, a dissociação das ligações de dissulfeto foi realizada através da adição de sulfito de sódio e tetrationato de sódio à concentração final de 200 mM e 50 mm, respectivamente, e incubação da mistura durante a noite em temperatura ambiente. Depois, a amostra resultante foi diluída com 5 volumes de Tampão F e a diluição foi carregada em uma coluna de cromatografia XK-50 com 150 ml de Q-Sepharose (GE Health) como material do invólucro, coluna esta que foi previamente lavada com 1M NaCI e suficientemente equilibrada com Tampão F. Após o carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de Tampão F a 95% e
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Tampão G a 5% (50 mM acetato de sódio; 1 M NaCI; 6 M uréia). Então, a proteína da fusão E7-Core-BCG65 foi eluída com um gradiente linear de Tampão F a 95% e Tampão G a 5% a Tampão F a 50% e Tampão G a 50% sobre 8 volumes da coluna. A proteína de fusão E7-Core-BCG65 eluída foi agrupada e, em seguida, dialisada contra a solução de diálise (1 X 40 volumes de Tris. HCI pH9.0, 1 X 40 volumes de Tris. HCI pH 7.5 e contendo 100 mM NaCI) para remover a uréia, e permitir que a proteína de fusão E7-Core-BCG65 renaturalizasse e realizasse a automontagem em um polímero de molécula múltipla.
A pureza da amostra final separada e purificada antes da diálise foi determinada por eletroforese SDS-PAGE, e o resultado mostrou que a proteína de fusão E7-Core-BCG65 foi manifestada como uma banda principal com um peso molecular de cerca de 90 KD (ver Fig. 3). Na figura 3, a faixa 1 representa o resultado da eletroforese para o padrão de proteína de baixo peso molecular, a faixa 2 representa o resultado da eletroforese para a proteína de fusão E7-Core-BCG65 com um valor de carregamento de 0.8 pg, e a faixa 3 representa o resultado da eletroforese para a proteína de fusão E7-Core-BCG65 com um valor de carregamento de 1.7 pg.
O teste por cromatografia de coluna de peneira molecular mostrou que o peso molecular da E7-Core-BCG65 renaturada, conforme refletido por seu pico de eluição, estava significativamente maior do que a proteína monomérica correspondente (albumina de soro bovino). A posição do pico de eluição da E7-Core-BCG65 renaturada era essencialmente coerente com o da partícula tipo vírus formada a partir da proteína do capsídeo principal 16 L1 do papiloma vírus humano, o que sugere que a E7-Core-BCG65 renaturada apresenta as características do polímero de molécula múltipla (Fig. 4). Na figura 4, o painel A é o cromatograma da coluna de peneira molecular para a albumina do soro bovino (68 kD), com uma concentração de proteínas de 1,2 mg / ml, o painel B é o cromatograma da coluna de peneira molecular para a E7-Core-BCG65 renaturada,
31/36 de acordo com a presente invenção, com uma concentração de proteínas de 1,5 mg / ml, e o painel C é o cromatograma da coluna de peneira molecular para a partícula tipo vírus formada do papiloma vírus humano L1 com uma concentração da proteína de 1,3 mg / ml. Os parâmetros básicos de cromatografia de coluna de peneira molecular são as seguintes: diâmetro da coluna, 1,6 cm, comprimento da coluna, 100 cm, material de embalagem, 4FF Sefarose (GE Healthcare), quantidade de material de embalagem carregado, 180 ml; fase móvel, 100 mM PB , 0,4 M NaCI, pH 6.5, velocidade de fluxo, 2 ml / minuto; quantidade de carga, 1 ml.
A observação no microscópio eletrônico mostrou que as características morfológicas típicas da partícula tipo vírus formada a partir das proteínas do capsídeo do vírus da hepatite B humano estava ausente do polímero de molécula múltipla obtido neste exemplo. Veja a figura 5, em que o painel 5B possui uma ampliação maior do que o painel 5A.
O polímero de molécula múltipla obtido no presente exemplo foi submetido ao seqüenciamento do aminoácido Terminal N, e foi determinado que a seqüência do aminoácido Terminal N era MHGDTPTLHEYMLD, que é idêntica à seqüência teórica Terminal N da E7-Core- BCG65. Em conjunto com o resultado SDS-PAGE de que o peso molecular determinado do produto separado e purificado era compatível com o peso molecular esperado de E7-Core-BCG65 (Fig. 3), foi confirmado que o polímero de molécula múltipla obtido neste exemplo consiste da E7-Core-BCG65.
O polímero de molécula múltipla preparado neste exemplo foi submetido à análise por Western Blot usando o anticorpo monoclonal contra o antígeno de núcleo do vírus da hepatite B da Abeam Corp e foi descoberto que o anticorpo monoclonal não reconheceu o antígeno de núcleo na E7-Core-BCG65. Portanto, o polímero de molécula múltipla preparado neste exemplo, quando usado como imunógeno, pode se esquivar do ataque imunológico contra a proteína do
32/36 capsídeo (antígeno de núcleo) nos organismos.
O produto final preparado neste exemplo possui um teor de endotoxina inferior a 5EU por miligrama de proteína.
Exemplo 3: Determinação do tamanho das partículas do polímero de 5 molécula múltipla
O polímero de molécula múltipla preparado no Exemplo 2 acima mencionado foi diluído cerca de 3 vezes usando tampão mops 50 mmol / L + 0,5 mol / L NaCi + 0,03% Tween-80, pH 7.0. O tamanho das partículas do polímero de molécula múltipla foi determinado utilizando Malvern Zetasizer Nano ZS (Marvern 10 Instruments Ltd., England).
Condições da determinação: 25°C, 3 minutos tempo de equilíbrio; água, utilizada como referência; DTS0012- cuveta de medição descartável, usada como copo de medição; a determinação é repetida duas vezes.
Os resultados da determinação são mostrados na figura 6, no qual (A) mostra 15 a distribuição da intensidade da luz das partículas, (B) mostra a distribuição do volume das partículas, e (C) mostra o relatório de qualidade dos resultados da determinação. É sabido a partir dos resultados que o polímero de molécula múltipla possui um tamanho médio Z de 61.3 nm, e um PDI < 0.2. Assim, os dados da determinação são confiáveis.
Exemplo 4: Os efeitos terapêuticos e preventivos do polímero de múltiplas moléculas formado da proteína de fusão E7-Core-BCG65 em experimentação animal
O polímero de molécula múltipla formado da proteína de fusão E7-Core-BCG65 carrega antígeno E7 16 do papiloma vírus humano (proteína E7).
Na presente invenção, os efeitos terapêuticos e preventivos do polímero de molécula múltipla foram avaliados em experimentos com camundongos usando a linha de células tumorais TC-1 que expressa o antígeno E7.
Os camundongos fêmeas C57BL / 6, com idades variando de seis a oito
33/36 semanas (20,0 ± 2,0 g) foram adquiridos do Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Controle de Qualidade N°: SCXK (Shanghai) 2003-0003).
A linha celular do tumor TC-1 que expressa o antígeno E7 foi obtida a partir das células primária do pulmão dos camundongos C57BL / 6. A linha de célula primária foi transformada pela introdução da linha de célula primária com o gene 16 E7 do papiloma vírus humano e um gene humano ativado C-Ha-ras, e obteve a capacidade de imortalização.
As células TC-1 foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI-1640 complementado com penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina , 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM aminoácidos não-essenciais, e 10% FBS. As células TC-1 bem desenvolvidas in vitro foram colhidas, lavadas três vezes com PBS, e ajustadas a uma densidade de célula de 1X105 células / ml. Cada um dos camundongos C57BL / 6 foi inoculado com 0,2 ml de células injetadas por via subcutânea, no flanco esquerdo. Depois, os camundongos foram randomizados em grupos e receberam o polímero de molécula múltipla de acordo com o protocolo pré-determinado. A amostra do polímero de molécula múltipla foi diluída com solução salina e injetada por via subcutânea no dorso dos camundongos. Os animais foram observados quanto ao crescimento do tumor todos os dias. Foi registrado o número de animais com tumor em diferentes momentos após a injeção, e foi calculada a taxa de formação do tumor, quer dizer, a razão entre o número de ocorrências de animais com tumor e o número de animais efetivos em cada grupo. Quando o tumor tornou-se palpável, os diâmetros longos e curtos dos tumores foram medidos usando o paquímetro duas vezes por semana para o cálculo do volume do tumor, ou seja, o volume do tumor = (diâmetro longo χ diâmetro curto2) / 2. O tempo de sobrevida de cada animal após^a ocorrência do tumor foi registrado. Os dados foram expressos em média ± DP ( ± s). Os animais experimentais foram divididos aleatoriamente em 6 grupos (ver tabela 2).
Tabela 2 Grupos do experimento animal
34/36
| Grupos | Número de ratos | Dosagem por ratos | Tempo de Administração |
| Dose grande, Terapêutica | 8 | 500 pg | Primeira imunização 48 h após a inoculação, reforço da imunização no dia 16 |
| Dose média, Terapêutica | 8 | 100 pg | Primeira imunização 48 h após a inoculação, reforço da imunização no dia 16 |
| Dose Pequena, Terapêutica | 8 | 20 pg | Primeira imunização 48 h após a inoculação, reforço da imunização no dia 16 |
| Dose grande, Preventiva | 8 | 100 pg | Duas vacinas com um intervalo de 14 dias, seguidas pela inoculação de células tumorais 14 dias após a segunda imunização |
| Dose Pequena, Preventiva | 8 | 20 pg | Duas vacinas com um intervalo de 14 dias, seguidas pela inoculação de células tumorais 14 dias após a segunda imunização |
| Controle | 6 | Solução Salina | Administrada 48h após a inoculação, período de tempo conforme disposto acima |
Foi observado crescimento do tumor subcutâneo quatro dias após os camundongos C57BL / 6 serem inoculados com células TC-1 1x105 injetadas por via subcutânea, no flanco esquerdo. Para os animais no grupo de Controle, a taxa 5 de formação de tumor atingiu 100% em 10 dias após a inoculação. Os tumores eram uniformes em tamanho, com um volume de cerca de 40 mm3. Os tumores cresceram tão rapidamente que o volume tumoral médio do grupo de Controle, foi de 7.499,84 mm3, no 36° dia após a inoculação das células tumorais. Este grupo de animais começou a morrer devido ao excesso de carga tumoral 45 dias após a 10 inoculação e todos morreram até o 60° dia.
Para os animais nos grupos terapêuticos, eles receberam a primeira
35/36 imunização 48 h após a inoculação do tumor (isto é, receberam a administração do polímero de molécula múltipla preparado no Exemplo 2) e, em seguida, receberam o reforço da imunização no dia 16. Com a imunização com a vacina terapêutica contra o HPV, os ratos apresentaram diminuição do ritmo de 5 crescimento do tumor e um menor volume do tumor. Uma relação dose-efeito estava evidente entre os grupos das diferentes doses. Todos os camundongos nos grupos Terapêuticos sobreviveram 60 dias após a inoculação do tumor (ver Tabela 2).
Para os animais nos grupos Preventivos, eles receberam duas imunizações 10 com um intervalo de 14 dias, seguido da inoculação com células tumorais 14 dia após a segunda imunização. Com a imunização com 100 pg ou 20 pg do polímero, os camundongos tiveram uma baixa taxa de formação de tumores após a inoculação do tumor, e todos eles sobreviveram 60 dias após a inoculação (ver Tabela 3).
Tabela 3 Volume de tumor médio nos diferentes grupos do experimento (mm3) (±s)_____________________________________________________________________________________
Data Grupo Terapêutico Grupo Preventivo Controle
| (dia) | 500 pg (n=8) | 100 pg (n=8) | 20 pg (n=8) | 100 pg (n=8) | 20 pg (n=8) | Grupo (n=6) |
| 10 | 8.6515.40 | 16.3318.83 | 42.54124.55* | 2.3211.06 | 5.5612.91 | 39.00119.28 |
| 13 | 41.70120.90 | 51.01120.37 | 84.72136.72* | 1.9712.44 | 10.58125.56 | 133.57169.64 |
| 16 | 31.91112.26 | 49.96120.62 | 189.07191.07* | 1.9711.42 | 5.2412.08 | 320.201149.14 |
| 19 | 35.69110.52 | 156.28146.49 | 208.49185.46 | 2.85+1.49 | 25.65110.43 | 782.651257.69 |
| 22 | 43.89121.13 | 224.711107.46 | 357.471159.47 | 2.4411.98 | 35.24180.41 | 1033.811594.12 |
| 25 | 109.04147.41 | 257.011107.19 | 756.401258.40 | 4.5212.78 | 17.3816.76 | 2414.1911201.87 |
| 28 | 127.68156.24 | 395.561128.72 | 892.541364.47 | 18.8115.42 | 69.63124.46 | 4432.6711824.46 |
| 31 | 156.12149.46 | 525.811152.94 | 1527.211510.46 | 20.57110.46 | 85.57125.85 | 6024.5412465.46 |
| 34 | 181.89175.53 | 671.341301.28 | 2048.5711050.57 | 22.42118.60 | 89.08143.09 | 7499.8413722.56 |
| 37 | 250.521120.59 | 785.691268.85 | 3051.6511253.32 | 56.83125.56 | 173.59189.41 | 9483.5814565.74 |
36/36
396.881208.12 921.87±368.03 3887.0811889.08 59.81126.79 173.92186.39 13141.4315077.39
Exemplo 5: Variante da proteína de fusão E7-Core-BCG65
Uma variante da proteína de fusão E7-Core-BCG65 foi construída com base na seqüência de aminoácidos da E7-Core-BCG 65 no Exemplo 1. Esta variante, denominada E7-Core-BCG65-M, é diferente de E7-Core-BCG 65 em que: o aminoácido na posição 8 foi alterado de Leu para lie; do aminoácido na posição 812 foi alterado de Vai para Leu e os aminoácidos Asp Asp Asp Asp Lys foram adicionados entre as posições 283 e 284. A seqüência de codificação de E7-Core-BCG65-M foi preparada por síntese artificial total usando métodos químicos e clonados no vetor pBluescript II SK (+/-)( Stratagene) no local Smal com o mesmo procedimento usado no Exemplo 1.
A expressão recombinante e a separação e purificação da proteína de fusão E7-Core-BCG65-M foram realizadas utilizando o mesmo procedimento que o disposto no exemplo 2, com o resultado final da E7-Core-BCG65-M formada no polímero de molécula múltipla particulado.
Foram realizados experimentos em animais com o polímero de molécula múltipla formado da E7-Core-BCG65-M utilizando o mesmo procedimento que o usado no Exemplo 4, e verificou-se que o polímero inibiu significativamente o crescimento das células tumorais.
Todas as publicações mencionadas nesta solicitação estão aqui incorporadas por referência na mesma extensão como que se cada publicação fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Além disso, deve-se entender que, quando da leitura da divulgação aqui estabelecida, aquelas pessoas competentes na arte podem fazer várias modificações e alterações a presente invenção, sem se afastar do âmbito da presente invenção, e estes equivalentes se destinam a estar dentro do escopo da presente invenção.
Claims (10)
- (1) cultivar as células de acordo com a reivindicação 13 para expressar a proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1;1. Uma proteína de fusão compreendendo um antígeno E7 de papiloma vírus humano, uma proteína do capsídeo viral e uma proteína chaperone molecular.
- (2) separar e purificar a proteína de fusão obtida a partir do item (1), onde um agente caotrópico é usado em uma ou mais etapas no processo de separação e purificação; e (3) permitir que a proteína de fusão obtida a partir do item (2) seja automontada para formar a referida macromolécula imunogênica ao remover o agente caotrópico.18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido agente caotrópico é selecionado a partir de uréia ou cloreto de guanidina.19. Uso da macromolécula de acordo com a reivindicação 14 na fabricação de uma composição para a prevenção ou tratamento das doenças associadas com a infecção do papiloma vírus humano.20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as referidas doenças são selecionadas a partir de tumores, neoplasia intraepitelial cervical e verruga genital externa.21. Uma composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende:fl.(a) as macromoléculas imunogênicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16; e (b) um portador farmaceuticamente aceitável.22. Uso da composição imunogênica de acordo com a reivindicação 21 na 5 prevenção ou tratamento das doenças associadas com a infecção do papiloma vírus humano.23. Um método para prevenir ou tratar as doenças associadas com a infecção do papiloma vírus humano, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a administração ao paciente necessitando do mesmo com uma2/42. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno E7 de papiloma vírus humano, a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular são ligadas por meio de aglutinações químicas ou são acopladas entre si; as referidas aglutinações químicas sendo aglutinações covalentes ou aglutinações não covalentes.
- 3/4 referida proteína de fusão e tendo um peso molecular de mais de 1,000 KD.15. Macromolécula imunogênica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a referida macromolécula compreende ainda pelo menos um imunoestimulante.16. Macromolécula imunogênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o referido imunoestimulante é acoplado à referida macromolécula imunogênica ou é acondicionado na referida macromolécula imunogênica; o referido imunoestimulante sendo selecionado a partir de: RNA de filamento duplo ou CpG-DNA não metilado.17. Um método para preparar a macromolécula imunogênica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende:3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que as referidas aglutinações químicas são aglutinações de peptídeo.
- 4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de fusão compreende, a partir do terminal de amina ao terminal de carboxila, do antígeno E7 de papiloma vírus humano, da proteína do capsídeo viral e da proteína chaperone molecular.
- 5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que um peptídeo de ligação está incluído entre a referida proteína do capsídeo viral e a referida proteína chaperone molecular, o referido peptídeo de ligação tendo pelo menos um local de corte da enzima de restrição no mesmo.
- 6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína do capsídeo viral é o antígeno de núcleo do vírus de hepatite B.
- 7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína chaperone molecular é selecionada a partir de um membro da família da proteína chaperone molecular.
- 8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida proteína chaperone molecular é selecionada a partir da proteína de choque térmico 65, proteína de choque térmico 60, proteína de choque térmico 70, proteína de choque térmico 90 ou proteína de choque térmico 100.
- 9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno E7 de papiloma vírus humano é: (a1) uma proteína tendo a sequência dos aminoácidos a partir da posição 1 a 98 na SEQ ID No: 1, ou uma proteína derivada a partir de (a1) tendo a mesma imunogenicidade que a proteína definida no item (a1), formada por substituição, exclusão ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido definida no item (a1); ou a referida proteína do capsídeo viral é: (b1) uma proteína tendo a sequência dos aminoácidos a partir da posição 99 a 283 na SEQ ID No: 1, ou uma proteína derivada a partir do item (b1) tendo a mesma função que a proteína definida no (b1), formada por substituição, exclusão ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido definida no item (b1); ou a referida proteína chaperone molecular é: (c1) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos a partir da posição 284 a 823 na SEQ ID No: 1, ou uma proteína derivada a partir do item (c1) tendo a mesma função que a proteína definida no item (c1), formada por substituição, exclusão ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido definida no item (c1).10. Uso da proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 na fabricação de uma macromolécula imunogênica.11. Uma molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico codifica a proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1.12. Um vetor, caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreende o ácido nucléico de acordo com a reivindicação 11.13. Células, caracterizadas pelo fato de que as referidas células compreendem o vetor de acordo com a reivindicação 12 ou possui o ácido nucléico de acordo com a reivindicação 11 integrado em seu genoma.14. Uma macromolécula imunogênica, caracterizada pelo fato de que a referida macromolécula é um polímero de molécula múltipla principalmente formado a partir da proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 por automontagem da
- 10 quantia efetiva das macromoléculas imunogênicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16 ou a composição imunogênica de acordo com a reivindicação 21.
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|---|---|---|---|
| B15I | Others concerning applications: loss of priority |
Free format text: PERDA DAS PRIORIDADES US60/944,780 DE 18/06/2007 E US60/951,856 DE 25/07/2007 POR NAO CUMPRIMENTO DE EXIGENCIA RELACIONADA A COMPROVACAO DE DIREITO DE PRIORIDADE. |
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| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AS 8A, 9A, 10A E 11A ANUIDADES. |
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| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |
Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2552 DE 03-12-2019 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |
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| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] |