BRPI0809112A2

BRPI0809112A2 - Formulações estáveis de anticorpos

Info

Publication number: BRPI0809112A2
Application number: BRPI0809112-9A
Authority: BR
Inventors: Arvind Srivastava; Joel Goldstein
Original assignee: Imclone Llc
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2014-08-26
Also published as: UA96473C2; WO2008116103A2; EP2136839A2; EA200970880A1; AU2008228823A1; DOP2009000222A; IL200321A0; CN101668540A; US20100260766A1; TN2009000382A1; WO2008116103A3; MX2009010179A; EP2136839A4; CA2681743A1; ECSP099642A; KR20090113340A; ZA200905636B; JP2010522208A; CR11005A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE ANTICORPOS".

Referência Cruzada

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório de número US 60/919744, protocolado em 22 de março de 2007, cujo conteúdo é aqui integralmente incorporado por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos e formulações para a estabilização de anticorpos que se ligam ao receptor do tipo 1 do fator de crescimento similar à insulina .

Antecedentes da Invenção

Anticorpos em formulações líquidas estão sujeitos a uma variedade de processos químicos e físicos, incluindo hidrólise, agregação, oxidação, deamidação e fragmentação na região da dobradiça. Esses processos podem alterar ou eliminar a eficácia clínica de anticorpos terapêuticos pela diminuição da disponibilidade de anticorpos funcionais e pela redução ou eliminação das suas características em termos da ligação a antígenos. A presente invenção diz respeito à necessidade de formulações estáveis de anticorpos monoclonais da subclasse IgGI direcionados contra o receptor do fator de crescimento similar à insulina (IGF-1R) e proporciona formulações de soluções estáveis e formulações Iiofilizadas estáveis para estes anticorpos.

O IGF-1R é um receptor de tirosina quinase transmembrana onipresente essencial para o crescimento e desenvolvimento normais nos períodos fetal e pós-natal. O IGF-1R pode estimular a proliferação e a diferenciação celular, mudanças no tamanho das células e proteger as células da apoptose. Ele também vem sendo considerado quase obrigatório na transformação celular (revisão em Adams et al., Cell. Mol. Life Sei. 57: 1050-93

(2000); Baserga1 Oncogene 19: 5574-81 (2000)). O IGF-1R está localizado na superfície da maioria dos tipos celulares e serve como a molécula sinalizadora dos fatores de crescimento IGF-I e IGF-II (nomeados coletivamente, daqui em diante, IGFs). O IGF-1R também se liga à insulina, ainda que com uma afinidade três ordens de magnitude inferior do que se liga aos IGFs. O IGF-1R é um heterotetrâmero pré-formado que contém duas cadeias-alfa e duas cadeias-beta ligadas covalentemente por ligações dissulfeto. As subunidades do receptor são sintetizadas como parte de uma única cadeia de 5 polipeptídeos de 180 kd, que é então processada proteoliticamente em subunidades alfa (130 kd) e beta (95 kd).Toda a cadeia-alfa é extracelular e contém o sítio para a ligação do ligante. A cadeia-beta possui o domínio transmembrana, o domínio de tirosina quinase e uma extensão C-terminal necessária para a diferenciação e transformação celular, mas é dispensável 10 para a sinalização dos mitógenos e para a proteção da apoptose.

O IGF-1R é altamente similar ao receptor de insulina (IR), especialmente dentro da seqüência da cadeia-beta (70% de homologia). Em decorrência dessa homologia, estudos recentes demonstraram que esses receptores podem formar híbridos contendo um dímero IR e um dímero IGF15 1R (Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5: 1935-19 (1999)). A formação de híbridos ocorre tanto em células normais quanto em células transformadas e o teor de hibridez depende da concentração dos dois receptores homodímeros (IR e IGF-1R) dentro da célula. Em um estudo de 39 espécimes de câncer de mama, ainda que tanto o IR quanto o IGF-1R estivessem superexpressa20 dos em todas amostras de tumor, o teor de receptores híbridos excedia de maneira consistente os níveis de ambos homorreceptores em aproximadamente 3 vezes (Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5: 1935-44 (1999)). Ainda que os receptores híbridos sejam compostos por pares de IR e IGF-1R, os híbridos se ligam seletivamente aos IGFs, com afinidade similar àquela do 25 IGF-IR e se ligam apenas de maneira débil à insulina (Siddle e Soos, The IGF System. Humana Press. pp. 199-225. 1999). Esses híbridos, portanto, podem se ligar a IGFs e transduzir sinais tanto em células normais quanto em células transformadas.

Um segundo receptor IGF, o IGF-IIR, ou receptor de manose-6- fosfato (M6P), também sem liga ao ligante IGF-II com alta afinidade, mas não apresenta atividade de tirosina quinase (Oates et al., Breast Cancer Res. Treat. 47: 269-81 (1998)). Devido ao fato de ele resultar na degradação do IGF-II, ele é considerado um sequestrante do IGF-II1 antagonizando os efeitos de promoção do crescimento desse ligante. A perda do IGF-IIR em células tumorais pode aumentar o potencial de crescimento mediante a liberação do séu efeito antagonista sobre a ligação do IGF-II com ao IGF-1R 5 (Byrd et al., J. Biol. Chem. 274: 24408-16 (1999)).

A expressão endócrina do IGF-I é regulada primariamente pelo hormônio de crescimento e produzida no fígado, mas evidências recentes sugerem que muitos outros tipos de tecidos também são capazes de expressar o IGF-I. Esse ligante é, portanto, sujeito a regulação endócrina e 10 parácrina, assim como autócrina no caso de muitos tipos de células tumorais (Yu, H. e Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1472-89 (2000)).

Seis proteínas de ligação IGF (IGFBPs) com afinidades de ligação específicas para os IGFs foram identificadas no soro (Yu, H. e Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1472-89 (2000)). As IGFBPs podem ou aumentar 15 ou inibir a ação dos IGFs, conforme determinado pelas estruturas moleculares das proteínas de ligação como resultado de modificações pós-tradução. Seus papéis primários são de transporte de IGFs, proteção de IGFs da degradação proteolítica e regulação da interação de IGFs com IGF-1R. Somente cerca de 1% do IGF-1 do soro está presente como ligante livre; o restante 20 está associado com as IGFBPs (Yu, H. e Rohan, J., J. Natl. Caneer Inst. 92: 1472-89 (2000)).

Após ligação pelo ligante (IGFs), o IGF-1R sofre autofosforilação em resíduos de tirosina conservados dentro do domínio catalítico da cadeiabeta. A fosforilação subsequente de resíduos de tirosina adicionais dentro da 25 cadeia-beta proporciona sítios de acoplamento para o recrutamento de moléculas a jusante críticas para a cascata de sinalização. As principais vias de transdução do sinal do IGF são a proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) e a fosfatidil-inositol 3-cinase (PI3K) (revisado por Blakesley et al., In: The IGF System. Humana Press. 143-163 (1999)). A via MAPK é respon30 sável basicamente pelo sinal mitogênico disparado após a estimulação pelos IGFs e a PI3K é responsável pela indução dependente do IGF de processos antiapoptóticos ou de sobrevivência. Um papel-chave da sinalização do IGF-1R é a sua função antiapoptótica ou de sobrevivência. IGF-1R ativados sinalizam a PI3K e a fosforilação a jusante da Akt, ou proteína quinase B. A Akt pode bloquear eficazmente, mediante fosforilação, moléculas tais como a BAD1 que são essenciais para o início da morte celular programada, e inibir o início da apoptose (Datta et al., Cell 91: 231-41 (1997)). A apoptose é um importante mecanismo celular, crítico nos processos de desenvolvimento normais (Oppenheim, Annu. Ver. Neurosci. 14: 453-501 (1991)). Ele é um mecanismo-chave na efetivação da eliminação de células com danos graves e na redução do potencial de persistência de lesões mutagênicas que possam promover a tumorigênese. Com este objetivo, foi demonstrado que a ativação da sinalização pelos IGFs pode promover a formação de tumores espontâneos em um modelo de camundongo transgênico (DiGiovanni et al., Cancer Res. 60: 1561-70 (2000)). Além disso, a superexpressão do IGF pode resgatar as células da morte celular induzida pela quimioterapia e pode ser um importante fator na resistência a medicamentos por células tumorais (Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56: 1-10 (1999)). Consequentemente, mostrou-se que a modulação da via de sinalização do IGF aumenta a sensibilidade das células tumorais aos agentes quimioterápícos (Benini et al., Clinicai Cancer Res. 7:1790-97 (2001)).

Um grande número de estudos clínicos e de pesquisa implicaram o IGF-1R e os seus Iigantes (IGFs) no desenvolvimento, na manutenção e na progressão do câncer. Nas células tumorais, a superexpressão do receptor, frequentemente conjugada com a superexpressão dos Iigantes IGF, 25 leva à potencialização desses sinais e, como resultado, a maior proliferação e sobrevivência celular. Mostrou-se que o IGF-I e o IGF-II são mitógenos potentes para uma grande variedade de linhagens celulares cancerígenas, incluindo do câncer de próstata (Nickerson et al., Cancer Res. 61:6276-80

(2001); Hellawell et al., Cancer Res. 62:2942-50 (2002)), mama (Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999)), pulmão, cólon (Hassan e Macaulay, Ann. Oneoi 13:349-56 (2002)), estômago, leucemia, pâncreas, cérebro, mieloma (Ge e Rudikoff, Blood, 96:2856-61 (2000), melanoma (AliEricsson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 43:1-8 (2002)) e ovário (revisão em: Macaulay, Br. J. Cancer 65:311-20 (1990) e esse efeito é mediado através do IGF-1R. Altos níveis de IGF-I em circulação no soro foram associados com um maior risco de câncer de mama, de próstata e de cólon (Pollak, 5 Eur. J. Caneer 36:1224-28 (2000)). Em um modelo de câncer de cólon com camundongo, o aumento dos níveis de IGF-I em circulação in vivo levaram a um aumento significativo da incidência do crescimento e metástase de tumores (Wu et al., Caneer Res. 62:1030-35 (2002)). Foi demonstrado que a expressão constitutiva do IGF-I em células basais epidérmicas de camundon10 gos transgênicos promove a formação espontânea de tumores (DiGiovanni et al., Caneer Res. 60:1561-1570) (2000; Bol et al., Oneogene 14:1725-1734 (1997)). A superexpressão do IGF-II em linhagens celulares e tumores ocorre com alta frequência e pode resultar da perda de imprinting genômico do gene IGF-II (Yaginuma et al., Oneoiogy 54: 502-7 (1997)). A superexpressão 15 do receptor foi demonstrada em diversos tipos de tumores humanos, incluindo o de pulmão (Quinn et al., J. Bioi Chem. 271:11477-83 (1996)), da mama (Cullen et al., Caneer Res. 50: 48-53 (1990); Peyrat e Bonneterre, Caneer Res. 22:59-67 (1992); Lee e Yee, Biomed. Pharmaeother. 49:415-21 (1995), o sarcoma (van Valen et al.,J. Caneer Res. Clin. Oneoi 118:269-75 (1992); 20 Scotlandi et al., Caneer Res. 56:4570-74 (1996)), da próstata (Nickerson et al., Caneer Res. 61:6276-80 (2001)) e do cólon (Hassan e Macaulay, Ann. Oneol. 13:349-56 (2002). Além disso, demonstrou-se que células cancerosas altamente metastáticas possuem maior expressão do iGF-ll e do IGF-1R do que células tumorais, que têm menor tendência de sofrer metástase (Guerra 25 et al., Int. J. Caneer 65:812-20 (1996)). Um papel crítico do IGF-1R na proliferação e na transformação celular foi demonstrado em experimentos com fibroblastos de embrião de camundongos derivados de knockout do IGF-IR. Essas células primárias crescem a taxas reduzidas em meios de cultura contendo 10% de soro e deixam de se transformar na presença de uma varie30 dade de oncogenes, incluindo o SV40 Large T (Sell et al., Moi CeH Biol. 3604-12 (1994)). Foi demonstrado recentemente que a resistência ao medicamento herceptina em algumas formas de câncer de mama pode se dever à ativação da sinalização do IGF-1R nesses cânceres (Lu et al., Natl. Cancer Inst. 93:1852-57 (2001)). A superexpressão ou ativação do IGF-1R pode, portanto, não apenas ser um importante determinante da tumogenicidade, mas também da resistência medicamentosa das células tumorais.

5 A ativação do sistema IGF também foi implicada em diversas

condições patológicas além do câncer, incluindo acromegalia (Drange e Melmed. In: The IFG System. Humana Press. 699-720 (1999)), neovascularização retiniana (Smith et al., Nature Med. 12:1390-95 (1999)) e psoríase (Wraight et al., Nature Biotech. 18:521-26 (2000)). No último estudo, um pre10 parado de oligonucleotídeos antissenso direcionado ao IGF-1R foi eficaz na inibição significativa da hiperproliferação de células epidérmicas em enxertos de pele psoriática humana em um modelo de camundongo, sugerindo que as terapias anti-IGF-1 R podem ser um tratamento eficaz desse distúrbio crônico.

Uma variedade de estratégias foi desenvolvida para inibir a via

de sinalização do IGF-1R nas células. Oligonucleotídeos antissenso foram eficazes in vitro e em modelos experimentais de camundongos, como mostrado acima no caso da psoríase. Além disso, peptídeos inibidores direcionados ao IGF-1R foram gerados que apresentam atividade antiproliferativa 20 in vitro e in vivo (Pietrzkowski et al., Cancer Res. 52:6447-51 (1992); Haylor et al., J. Am. Soe. Nephrol. 11:2027-35 (2000)). Mostrou-se que uma seqüência de peptídeos sintética da região C-terminal do IGF-1R induz a apoptose e inibe significativamente o crescimento tumoral (Reiss et al., J. Cell. Phys. 181:124-35 (1999)). Vários mutantes dominantes negativos do IGF-1R 25 também foram gerados que, após superexpressão em linhagens celulares tumorais, competem com o IGF-1R de tipo selvagem pelos Iigantes e inibem de modo eficaz o crescimento celular tumoral in vitro e in vivo (Scotlandi et al., Int. J. Caneer 101:11-6 (2002); Seely et al., BMC Caneer 2:15 (2002)). Além disso, demonstrou-se que também uma forma solúvel do IGF-1R inibe 30 o crescimento tumoral in vivo (D’Ambrosio et al., Caneer Res. 56:4013-20 (1996)). Também se demonstrou que anticorpos direcionados contra o IGF1R humano inibem a proliferação celular tumoral in vitro e a tumorigênese in vivo, incluindo linhagens celulares derivadas do câncer de mama (Artega e Osborne, Cancer Res. 49:6237-41 (1989)), osteossarcoma de Ewing (Scotlandi et al., Cancer Res. 58:4127-31 (1998)), e melanoma (Furlanetto et al., Caneer Res. 53:2522-26 (1993)). Os anticorpos são uma terapêutica atraen5 te principalmente porque eles 1) podem apresentar alta seletividade para um antígeno protéico particular; 2) são capazes de exibir alta afinidade de ligação com o antígeno; 3) possuem longas meias-vidas in vivo e, uma vez que são produtos imunes naturais, devem 4) apresentar baixa toxicidade in vivo (Park e Smolen. In: Advances in Protein Chemistry. Academic Press. pp.: 10 360-421 (2001)). Anticorpos derivados de fontes não-humanas, por exemplo, camundongos, podem, contudo, produzir uma resposta imune direcionada contra o anticorpo terapêutico após aplicações repetidas, neutralizando, dessa maneira, a eficácia do anticorpo. Anticorpos inteiramente humanos oferecem o maior potencial de sucesso como terapias humanas, uma vez 15 que tendem a ser menos imunogênicos em humanos do que anticorpos de murinos ou quiméricos, de maneira similar aos anticorpos imunorresponsivos de ocorrência natural. Para este fim, há necessidade de desenvolvimento de formulações estáveis de anticorpos monoclonais anti-IGF-1R humanos de alta afinidade para uso terapêutico.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a formulações e métodos para a estabilização de preparados de anticorpos. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação em solução (ou líquida) estável compreendendo um anticorpo IgGI que se liga especificamente ao receptor do tipo 1 25 do fator de crescimento similar à insulina e um tampão. Em uma modalidade adicional, a concentração de anticorpos na formulação líquida varia entre cerca de 5 mg/ml e cerca de 30 mg/ml. Preferivelmente, o anticorpo é o IMCA12 ou o IMC-2F8. Mais preferivelmente o anticorpo é o IMC-A12.

Em uma modalidade, a formulação em solução estável de anticorpos contém um tampão citrato. Em uma modalidade adicional, o tampão citrato se encontra a uma concentração entre cerca de 5 e cerca de 50 mM. Em uma modalidade adicional, o tampão citrato se encontra a uma concentração de cerca de 10 mM.

Em uma modalidade, a formulação em solução estável de anticorpos contém glicina. Em uma modalidade adicional, a concentração de glicina é de cerca de 75 mM a cerca de 150 mM. Em uma modalidade adi5 cional, a concentração de glicina é de cerca de 100 mM.

Em uma modalidade, a formulação em solução estável de anticorpos contém NaCI. Em uma modalidade adicional, o NaCI se encontra a uma concentração de cerca de 75 a cerca de 150 mM. Em uma modalidade adicional, o NaCI se encontra a uma concentração de cerca de 100 mM.

Em uma modalidade, a formulação em solução estável de anti

corpos contém um surfactante. Em uma modalidade adicional, o surfactante é um polisorbato (TWEEN, a/k/a polietileno-polipropileno glicol) tal como o polisorbato 20 ou o polisorbato 80. Em uma modalidade adicional, o surfactante é o polisorbato 80 (TWEEN 80) a uma concentração de cerca de 15 0,001% a cerca de 1,0% (peso por volume). Em uma modalidade adicional, o TWEEN 80 se encontra a uma concentração de cerca de 0,01% (peso por volume).

Em uma modalidade, a formulação em solução estável de anticorpos tem um pH de cerca de 6,0 a 7,0. Em uma modalidade adicional, o pH é de cerca de 6,0 a 6,5. Em uma modalidade adicional, o pH é de cerca de 6,5.

Em uma modalidade, a formulação em solução estável de anticorpos compreende cerca de 5 mg/ml de IMC-A12, cerca de 10 mM de citrato de sódio, cerca de 100 mM de glicina, cerca de 100 mM de NaCI e cerca de 0,01% de TWEEN 80 e essa formulação apresenta um pH de cerca de 6,5.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação de anticorpos estável, liofilizada, compreendendo um anticorpo IgGI que se liga especificamente ao receptor do tipo 1 do fator de crescimento similar à 30 insulina , sendo essa formulação liofilizada. Em uma modalidade, o anticorpo é o IMC-A12. Em uma modalidade adicional, a concentração de IMC-A12 é de 30 mq/ml antes da liofilização. Em uma modalidade, a formulação de anticorpos estável, liofilizada, contém um tampão histidina. Em uma modalidade adicional, a concentração de histidina é de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM antes da Iiofilização. Em uma modalidade adicional, a concentração de histidina é de cerca 5 de 10 mM antes da liofilização. Em uma modalidade adicional, o tampão tem um pH de cerca de 6,5 antes da liofilização.

Em uma modalidade, a formulação de anticorpos estável, liofilizada, contém um lioprotetor. Em uma modalidade adicional, o Iioprotetor é um açúcar. Em uma modalidade adicional, o lioprotetor é uma trealose. Em 10 uma modalidade adicional, a concentração de trealose é de cerca de 4,6% antes da liofilização. Em uma modalidade, a proporção da concentração de trealose em relação à concentração de anticorpos é de cerca de 200 e de cerca de 1000 antes da liofilização. Em uma modalidade adicional, a proporção da concentração de trealose em relação à concentração de anticorpos é 15 de cerca de 600 antes da liofilização.

Em uma modalidade, a formulação de anticorpos estável, liofilizada, contém um agente de volume. Em uma modalidade adicional, o agente de volume é manitol ou glicina.

Em uma modalidade, a formulação de anticorpos estável, Iiofilizada, compreende cerca de 30 mg/ml de IMC-A12, cerca de 10 mM de histidina e cerca de 4,6% de trealose (peso/volume) e essa formulação apresenta um pH de 6,5, sendo tais concentrações e pH anteriores à liofilização. Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a variação da temperatura de fusão (Tm1) em função do pH em formulações em solução de IMC-A12. As curvas térmicas de fusão do IMC-A12 em formulações experimentais (da tabela 2) foram avaliadas por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) para determinar a temperatura de transição (Tm) do IMC-A12 nessas condições.

A figura 2 mostra a variação do percentual de perda devido à formação de agregados insolúveis em função do pH em formulações em solução de IMC-A12. As amostras, conforme descrito na tabela 2, incluindo 5 mL de IMC-A12 a 5 mg/ml em frascos de vidro de 27,5 ml_, foram apitadas a 300 rpm a temperatura ambiente por 72 horas. O percentual de perda foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 3 mostra a variação do percentual de monômeros em função do pH em formulações em solução de IMC-A12. As amostras con5 forme, descrito na tabela 2, incluindo 5 mL de IMC-A12 a 5 mg/ml em frascos de vidro de 27,5 mL, foram agitadas a 300 rpm a temperatura ambiente por 72 horas. O percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 4 mostra a variação do percentual de monômeros em função do pH a 40°C em formulações em solução de IMC-A12. O IMC-A12 a 5 mg/mL em vários tampões de pH (listados na tabela 2) foi incubado a 40°C por 3 semanas. O efeito do pH sobre o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 5 mostra a variação do percentual de monômeros em função do pH a 50°C em formulações em solução de IMC-A12. O IMC-A12 a 5 mg/mL em vários tampões de pH (tabela 2) foi incubado a 50°C por 1 semana. O efeito do pH sobre o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 6 mostra a variação do percentual de monômeros em função do pH a -20°C e a -70°C em formulações de solução de IMC-A12. O IMC-A12 a 5 mg/mL em vários tampões de pH (listados na tabela 2) foi incubado a -20°C e a -70°C por três semanas. O efeito do pH sobre o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 7 mostra um diagrama de predição do estudo com DSC das formulações em solução de IMC-A12. Foi estudado o diagrama de pre25 dição do efeito do tipo de tampão, pH, concentração de TWEEN 80, concentração de NaCI e concentração de glicina sobre a temperatura de transição. A concentração protéica foi de 5 mg/mL e a elevação da temperatura foi de 5°C a 95°C a uma taxa de leitura de 1,5°C/min. A temperatura de fusão correspondente ao pico de transição principal foi ajustada a um modelo de re30 gressão linear para estimativa do efeito das variáveis testadas.

A figura 8 mostra um diagrama de predição de um estudo de agitação das formulações em solução de IMC-A12. As amostras descritas na tabela 3 com 5 mL de IMC-A12 a 5 mg/mL em frascos de vidro de 27,5 mL foram agitadas a 300 rpm em um agitador plataforma. O estudo foi realizado a temperatura ambiente por até 72 horas. A turbidez da solução e o percentual de monômeros foram determinados em função do tempo de agitação.

5 Os efeitos das variáveis testadas sobre a turbidez e o percentual de monômeros foram estimados mediante adaptação da resposta a um modelo de regressão linear usando-se um software da JMP.

A figura 9 mostra o percentual de monômeros remanescente em uma formulação em solução de IMC-A12 após 4 semanas de incubação a 10 40°C. O IMC-A12 a 5 mg/mL nas formulações da tabela 3 foi incubado a 40°C por 4 semanas. O percentual de monômeros do material inicial e das formulações testadas após 4 semanas de incubação a 40°C foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 10 mostra o percentual de monômeros remanescente 15 em formulações em solução de IMC-A12 após 2 semanas de incubação a 50°C. O IMC-A12 a 5 mg/mL nas formulações da tabela 3 foi incubado a 50°C por 2 semanas. O percentual de monômeros do material inicial e das formulações testadas após 2 semanas de incubação a 50°C foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 11 mostra um diagrama de predição da estabilidade em

temperatura acelerada em tempo real das formulações em solução de IMCA12. O diagrama de predição do efeito do pH, da concentração de NaCI1 da concentração de glicina, do tempo e da temperatura sobre o percentual de monômeros, o percentual de agregados e o percentual de degradados foi estudado.

A figura 12 mostra uma comparação da turbidez da solução de formulações em citrato e PBS de IMC-A12 em função do tempo de agitação. As amostras contendo IMC-A12 a 5 mg/mL em fracos de vidro de 27,5 mL foram agitadas a 300 rpm em um agitador plataforma. O estudo foi realizado 30 a temperatura ambiente por até 72 horas. A turbidez foi medida por absorção a 350 nm com um espectrofotômetro Biospec Shimatzu 1601.

A figura 13 mostra uma comparação do percentual de perda de IMC-A12 em formulações em citrato e PBS em função do tempo de agitação. As amostras contendo IMC-A12 a 5 mg/mL em fracos de vidro de 27,5 mL foram agitadas a 300 rpm em um agitador plataforma. O estudo foi realizado a temperatura ambiente por até 72 horas. O percentual de perda de material 5 (devido à formação de agregados insolúveis) foi medida por SEC-HPLC.

A figura 14 mostra uma comparação do percentual de monômeros de IMC-A12 em formulações em citrato e PBS em função do tempo de agitação. As amostras contendo IMC-A12 a 5 mg/mL em fracos de vidro de 27,5 mL foram agitadas a 300 rpm em um agitador plataforma. O estudo foi 10 realizado a temperatura ambiente por até 72 horas. O percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 15 mostra uma comparação do percentual de monômeros de IMC-A12 em formulações em citrato e PBS em função do tempo incubação a 40°C. O percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 16 mostra uma comparação do percentual de agregados

de IMC-A12 em formulações em citrato e PBS em função do tempo incubação a 40°C. O percentual de agregados foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 17 mostra uma comparação do percentual de degradados de IMC-A12 em formulações em citrato e PBS em função do tempo incubação a 40°C. O percentual de agregados foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 18 mostra um SDS-PAGE (reduzido) do IMC-A12 em formulações em citrato e PBS após 3 meses de incubação a 40°C. O SDSPAGE reduzido foi realizado em um gel gradiente de tris-glicina de 4-20%. Dez pg de amostra foram carregados em um volume de 10 μΙ. O gel foi colo25 rido com azul de Coomassie. O “citrato” da banda 4 é: 5 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de citrato, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI, 0,01% de TWEEN 80, pH 6,5; o “PBS” das bandas 2 e 3 é solução salina tamponada com fosfato [ver tabelas 3 e 4, abaixo].

A figura 19 mostra um SDS-PAGE (não-reduzido) do IMC-A12 em formulações em citrato e PBS após 3 meses de incubação a 40°C. O SDS-PAGE não-reduzido foi realizado em um gel gradiente de tris-glicina de 4-20%. 10 pg de amostra foram carregados em um volume de 10 μΙ. O gel foi colorido com azul de Coomassie. O “citrato” da banda 4 é: 5 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de citrato, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI1 0,01% de TWEEN 80, pH 6,5; o “PBS” das bandas 2 e 3 é solução salina tamponada com fosfato [ver tabelas 3 e 4, abaixo].

5 A figura 20 mostra um gel de focalização isoelétrica (IEF) de

IMC-A12 em formulações em citrato e PBS após 3 meses de incubação a 40°C. A focalização isoelétrica foi realizada usando-se placas de agarose IEF IsoGel® com um uma faixa de pH de 6,0 a 10,5. As amostras sofreram troca de tampão em água Milli-Q contendo 0,5% de TWEEN 80. A amostra 10 de 10 pg foi carregada em um volume de 10 pi. O gel foi colorido com azul de Coomassie. O “citrato” da banda 4 é: 5 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de citrato, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI, 0,01% de TWEEN 80, pH 6,5; o “PBS” das bandas 2 e 3 é solução salina tamponada com fosfato [ver tabelas 3 e 4, abaixo].

A figura 21 mostra a variação do percentual de monômeros em

função do tempo a 20°C. As formulações de IMC-A12 a 5 mg/mL em formulações em PBS ou citrato foram incubadas a 20°C por até 3 meses. Após a incubação o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 22 mostra a variação do percentual de monômeros em função do tempo de incubação a -70°C. As formulações de IMC-A12 a 5 mg/mL em formulações em PBS ou citrato foram incubadas a -70°C por até 3 meses. Após a incubação o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 23 mostra a variação do percentual de monômeros em 25 função do número de ciclos de congelamento/descongelamento a -20°C. A estabilidade em congelamento/descongelamento do IMC-A12 foi avaliada mediante congelamento da amostra de teste a -20°C em um Iiofilizador com uma taxa de elevação da temperatura de 1°C/min. A amostra foi deixada para incubar por 1 hora e descongelada a 4°C a uma taxa de elevação da 30 temperatura de 1°C/min. O processo de congelamento/descongelamento foi repetido até 15 vezes e o percentual de monômeros foi analisado por SECHPLC. A figura 24 mostra a variação do percentual de monômeros em função do número de ciclos de congelamento/descongelamento a -70°C. A estabilidade em congelamento/descongelamento do IMC-A12 foi avaliada mediante congelamento da amostra de teste a -70°C em um Iiofilizador com 5 uma taxa de elevação da temperatura de 10CAnin. A amostra foi deixada para incubar por 1 hora e descongelada a 4°C a uma taxa de elevação da temperatura de 1°C/min. O processo de congelamento/descongelamento foi repetido até 15 vezes e o percentual de monômeros foi analisado por SECHPLC.

A figura 25 mostra a variação do percentual de monômeros em

função do tipo de tampão, do crio e dos lioprotetores, dos agentes de volume, do tempo e da temperatura.

A figura 26 mostra a variação do percentual de agregados em função do tipo de tampão, do crio e dos lioprotetores, dos agentes de volume, do tempo e da temperatura.

A figura 27 mostra a variação do percentual de degradados em função do tipo de tampão, do crio e dos lioprotetores, dos agentes de volume, do tempo e da temperatura.

A figura 28 mostra a variação da turbidez da solução em função do tipo de tampão, do crio e dos lioprotetores, dos agentes de volume, do tempo e da temperatura.

A figura 29 mostra a variação do percentual de monômeros das formulações Iiofilizadas de IMC-A12. O efeito da incubação a 40°C e a 50°C por 3 meses sobre o percentual de monômeros das formulações Iiofilizadas 5, 6, 9 e 10 da tabela 6 foi examinado. O percentual de monômeros foi analisado por SED-HPLC.

A figura 30 mostra a variação do percentual de agregados das formulações Iiofilizadas de IMC-A12. O efeito da incubação a 40°C e a 50°C por 3 meses sobre o percentual de agregados das formulações Iiofilizadas 5, 6, 9 e 10 da tabela 6 foi examinado. O percentual de agregados foi analisado por SED-HPLC.

A figura 31 mostra a variação do percentual de degradados das formulações Iiofilizadas de IMC-A12. O efeito da incubação a 40°C e a 50°C por 3 meses sobre o percentual de degradados das formulações Iiofilizadas 5, 6, 9 e 10 da tabela 6 foi examinado. O percentual de monômeros foi analisado por SED-HPLC.

5 A figura 32 mostra a variação da turbidez da solução das formu

lações Iiofilizadas de IMC-A12. O efeito da incubação a 40°C e a 50°C por 3 meses sobre o percentual de turbidez das formulações Iiofilizadas 5, 6, 9 e da tabela 6 foi examinado após reconstituição até 5 mg/mL com água Milli-Q. A turbidez foi analisada por absorção a 350 nm com um espectrofotômetro Biospec Shimatzu 1601.

A figura 33 mostra a variação do percentual de monômeros remanescentes após 4 meses de incubação. As formulações Iiofilizadas de IMC-A12 da tabela 7 foram incubadas a 4°C, 40°C e 50°C por até 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas com água Milli-Q até 5 mg/mL e 15 analisadas por SEP-HLPC para determinar o percentual de monômeros remanescentes.

A figura 34 mostra espectros de dicroísmo circular do IMC-A12 antes (linha pontilhada) e depois da liofilização (linha sólida). Para garantir que o processo de liofilização não tinha alterado a estrutura secundária do 20 A12, a estrutura secundária do IMC-A12 foi examinada antes e após a liofilização por dicroísmo circular. O IMC-A12 foi diluído e reconstituído em água Milli-Q até 0,1 mg/mL e os espectros de dicroísmo circular foram coletados usando-se um espectrofotômetro de dicroísmo circular Jasco 810.

A figura 35 mostra a variação do percentual de monômeros em função do tempo a 40°C. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS, citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada preferida foram incubados a 40°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 36 mostra a variação do percentual de monômeros em função do tempo a 50°C. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS, citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada preferida foram incubados a 50°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 37 mostra a variação do percentual de agregados em função do tempo a 40°C. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS, citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada preferida foram incu5 bados a 40°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e o percentual de agregados foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 38 mostra a variação do percentual de agregados em função do tempo a 50°C. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS, citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada preferida foram incubados a 50°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e o percentual de agregados foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 39 mostra a variação do percentual de degradados em função do tempo a 40°C. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS, citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada preferida foram incubados a 40°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e o percentual de degradados foi analisado por SEC-HPLC.

A figura 40 mostra a variação do percentual de degradados em função do tempo a 50°C. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS, citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada preferida foram incu20 bados a 40°C e a 50°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e o percentual de degradados foi analisado por SECHPLC.

A figura 41 mostra uma análise por SDS-PAGE (reduzido) de amostras incubadas. As formulações em solução de IMC-A12 em tampão 25 PBS ou citrato e o IMC-A12 na formulação liofilizada (preferida) foram incubados a 4°C, 40°C e 50°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas em água Milli-Q e 10 pg foram carregados em um gel gradiente de tris-glicina de 4-20%. O gel foi colorido com azul de Comassie.

Descrição Detalhada da Invenção Anticorpos em formulações líquidas são suscetíveis a processos

químicos e físicos, incluindo hidrólise, agregação, oxidação, deamidação e fragmentação na região de dobradiça. Esses processos podem alterar ou eliminar a eficácia clínica de anticorpos terapêuticos mediante a diminuição da disponibilidade dos anticorpos funcionais e mediante a redução ou eliminação das suas características de ligação a antígenos. A presente invenção diz respeito à necessidade de formulações estáveis de anticorpos monoclo5 nais e proporciona um método e uma formulação para a liofilização desses anticorpos.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação em solução estável (também denominada aqui “uma formulação líquida”) que compreende um anticorpo IgGI que se liga especificamente ao receptor 10 do tipo 1 do fator de crescimento similar à insulina e um tampão. Em uma modalidade adicional, o anticorpo é o IMC-A12. Em outra modalidade, o anticorpo é o IMC-2F8.

O IMC-A12 é um anticorpo monoclonal inteiramente humano da subclasse IgGi direcionado contra o receptor do tipo 1 do fator de cresci15 mento similar à insulina (IGF-1R). O anticorpo IMC-A12 é revelado na publicação PCT W0/2005/016970 incorporada neste por referência em sua integridade. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada do IMC-A12 estão representadas nas SEQ ID N- 1 e 2, respectivamente. A seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia leve do IMC-A12 20 está representada nas SEQ ID N— 3 e 4, respectivamente. Métodos para o tratamento do câncer ósseo usando o IMC-A12 são revelados na publicação PCT WO/2006/138729 incorporada neste por referência em sua integridade.

O IMC-2F8 é um anticorpo monoclonal inteiramente humano da subclasse IgGi também direcionado contra o receptor de tipo 1 do fator de 25 crescimento similar à insulina (IGF-1R). O anticorpo IMC-2F8 é revelado na publicação PCT W0/2005/016970 incorporada neste por referência em sua integridade. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada do IMC-2F8 estão representadas nas SEQ ID N- 1 e 2, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia leve do 30 IMC-2F8 estão representadas nas SEQ ID N— 5 e 6, respectivamente.

A formulação foi examinada para se determinar a solidez da formulação inicial, tampão fosfato-salino (PBS) a pH 7,2. Determinou-se através de análises que o IMC-A12 em PBS é sensível a agregação, precipitação, degradação, hidrólise e luz. Além disso, ele não poderia passar no teste de materiais particulados de pequeno volume injetável. Uma formulação em solução melhorada consistindo de 5 mg/ML de IMC-A12,10mM de 5 citrato de sódio, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI e 0,01% de TWEEN 80 a pH 6,5, foi desenvolvida. A formulação com citrato, diferentemente das formulações com PBS, é livre de particulados e tem melhor estabilidade.

Em uma melhoria adicional, que minimiza a hidrólise que ocorre na região de dobradiça, uma formulação liofilizada que contém 30 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de histidina a pH 6,5 e 4,6% de trealose. A hidrólise foi interrompida no IMC-A12 em uma formulação liofilizada.

A presente invenção proporciona formulações em solução que reduzem ou eliminam a degradação do anticorpo. As formulações podem compreender um ou mais dos seguintes: um tampão a um pH específico, sais, surfactantes, agentes estabilizantes, preservantes, agentes redutores e agentes quelantes.

A presente invenção proporciona formulações para a liofilização de anticorpos, incluindo fragmentos funcionais dos mesmos, que apresentam tendência a clivagem não-enzimática. As formulações podem compre20 ender elementos adicionais, tais como agentes estabilizantes, surfactantes, agentes redutores, carreadores, preservantes, aminoácidos e agentes quelantes. A presente invenção também proporciona métodos para a estabilização de uma composição de anticorpos compreendendo a liofilização de uma formulação aquosa de um anticorpo na presença de um lioprotetor. As for25 mulações podem ser Iiofilizadas para estabilizar os anticorpos durante o processamento e o armazenamento e depois reconstituídas antes da administração farmacêutica. É preferível que o anticorpo retém substancialmente sua estabilidade e integridade física e química desde a produção até a administração. Vários componentes da formulação podem ser adequados para 30 aumentar a estabilidade de acordo com a presente invenção, incluindo tampões, surfactantes, açúcares, polialcoóis, derivados de açúcares e aminoácidos. Várias propriedades da formulação podem ser adequadas para aumentar a estabilidade da presente invenção, incluindo o pH e a concentração dos componentes da formulação.

De acordo com a presente invenção, um tampão pode ser usado para manter o pH da formulação. O tampão minimiza flutuações do pH devi5 do a variações externas. As formulações da presente invenção contêm um ou mais tampões para proporcionar as formulações em um pH apropriado, preferivelmente entre cerca de 6,0 e cerca de 7,0, mais preferivelmente entre 6,0 e 6,5 e da maneira mais preferível cerca de 6,5. Exemplos de tampões incluem, mas não se limitam a, tampões orgânicos em geral, tais como histi10 dina, citrato, malato, tartarato, succinato e acetato. Em uma modalidade, a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM. Em uma modalidade adicional, a concentração do tampão é de cerca de 10 mM.

As formulações da presente invenção podem conter um ou mais agentes estabilizantes que podem ajudar a impedir a agregação e a degra15 dação dos anticorpos. Agentes estabilizantes apropriados incluem, mas não se limitam a, açúcares poli-hídricos, polialcoóis, derivados de açúcares e aminoácidos. Os agentes estabilizantes preferidos incluem, mas não se limitam a, ácido aspártico, ácido lactobiônico, glicina, trealose, manitol e sacarose.

As formulações da presente invenção podem conter um ou mais

surfactantes. As soluções de anticorpos têm alta tensão superficial na interface ar-água. Para reduzir essa tensão superficial, os anticorpos tendem a se agregar na interface ar-água. Um surfactante minimiza a agregação dos anticorpos na interface ar-água, ajudando, assim, a manter a atividade bioló25 gica do anticorpo em solução. Por exemplo, a adição de 0,01% de TWEEN 80 pode reduzir a agregação dos anticorpos na solução. Quando a formulação é liofilizada, o surfactante pode também reduzir a formação de particulados na formulação reconstituída. Nas formulações Iiofilizadas da presente invenção, o surfactante pode ser adicionado a uma ou mais das formulações 30 pré-liofilizadas, à formulações liofilizadas, e às formulações reconstituídas, mas preferivelmente às formulação pré-liofilizadas. Por exemplo, 0,01% de TWEEN 80 podem ser adicionados à solução de anticorpos antes da Iiofilização. Os surfactantes incluem, mas não se limitam a, polisorbato 20 (TWEEN 20), polisorbato 80 (TWEEN 80), polietileno-polipropileno glicol (PLURONIC F-68 CAS no. 9003-11-6) e sais biliares. Em uma modalidade, a concentração de surfactante é de cerca de 0,001% a cerca de 1,0%.

5 O processo de liofilização pode gerar uma variedade de estres

ses que podem desnaturar proteínas ou polipeptídeos. Esses estresses incluem diminuição da temperatura, formação de cristais de gelo, aumento da força iônica, alterações do pH, separação de fases, remoção da camada de hidratação e alterações de concentração. Os anticorpos sensíveis ao estres10 se do processo de congelamento e/ou secagem podem ser estabilizados mediante a adição de um ou mais lioprotetores. Um Iioprotetor é um composto que protege contra os estresses associados com a liofilização. Assim, os lioprotetores como classe incluem os crioprotetores, que protegem apenas do processo de congelamento. Um ou mais lioprotetores podem ser usados 15 para proteger dos estresses associados com a liofilização e podem ser, por exemplo, um açúcar, tal como a sacarose ou a trealose; um aminoácido, tal como o glutamato monossódico ou a histidina; uma metilamina, tal como a betaína; um sal liotrópico, tal como o sulfato de magnésio; um poliol, tal como polialcoóis tri-hídricos ou maiores, por exemplo, glicerina, eritritol, glice20 rol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propileno glicol; polietilenoglicol; Pluronics e combinações dos mesmos. Exemplos dos lioprotetores preferidos incluem, sem se limitar a, os agentes estabilizantes e surfactantes como acima descrito.

A presente invenção proporciona formulações estabilizadas que 25 podem ser preparadas através do processo de liofilização. A liofilização é um processo de estabilização no qual uma substância é primeiro congelada e então a quantidade do solvente é reduzida, primeiro por sublimação (o processo primário de secagem) e então por dessorção (o processo secundário de secagem) para valores que não mais dão suporte à atividade biológica ou 30 a reações químicas. Em uma formulação liofilizada, as reações de hidrólise, deamidação, oxidação e fragmentação associadas com as soluções podem ser evitadas ou significativamente retardadas. Uma solução liofilizada pode também evitar danos devidos a flutuações de temperatura de curto prazo durante o transporte e permitir armazenamento a temperatura ambiente. As formulações da presente invenção podem também ser secadas por outros métodos conhecidos na técnica, tais como secagem por pulverização e se5 cagem em leito fluidizado. A não ser que de outra forma especificado, as formulações da presente invenção são descritas em termos das concentrações dos seus componentes tais como medidas antes da liofilização.

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos e formulações para estabilizar anticorpos passíveis de degradação nãoenzimática, que pode ocorrer na região de dobradiça. Fatores que podem predispor um anticorpo à clivagem não-enzimática incluem seqüência de aminoácidos, conformação e processamento pós-tradução.

Pode-se determinar se um anticorpo sofre hidrólise, agregação, oxidação, deamidação, precipitação e/ou fragmentação na região de dobra15 diça por incubação do anticorpo em uma solução aquosa. Normalmente, a incubação é realizada a temperaturas elevadas para diminuir a duração do estudo, por exemplo, incubação por 3 meses a 40°C ou 50°C. Após a incubação, os produtos de degradação podem ser analisados usando cromatografia de exclusão molecular - cromatografia líquida de alto desempenho 20 (SEC-HPLC).

Além disso, as formulações de anticorpos podem ser agitadas para se examinar os efeitos protetores dos componentes da formulação sobre a degradação, a agregação e a precipitação dos anticorpos induzidas pelo estresse mecânico.

Várias técnicas analíticas conhecidas na técnica podem medir a

estabilidade dos anticorpos de uma formulação em solução ou de uma formulação liofilizada reconstituída. Tais técnicas incluem, por exemplo, determinação (i) da estabilidade térmica usando-se Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) para determinar a temperatura de fusão (Tm) principal; (ii) 30 da estabilidade mecânica usando-se agitação controlada a temperatura ambiente; (iii) da estabilidade em temperatura acelerada em tempo real a temperaturas de cerca de -20°, de cerca de 4°C, temperatura ambiente (cerca de 23°C-27°C), cerca de 40°C e cerca de 50°C; (iv) da turbidez das soluções pelo monitoramento da absorção a cerca de 350 nm e (v) da quantidade de monômeros, agregados e degradados usando-se SEC-HPLC. A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada por um período seleciona5 do.

Em uma modalidade, a formulação liofilizada proporciona uma alta concentração do anticorpo após reconstituição. Em uma modalidade adicional, a formulação liofilizada estável é reconstituída com um líquido para formar uma solução com uma concentração de anticorpos cerca de 1-10 10 vezes mais alta do que a concentração de anticorpos da formulação antes da liofilização. Por exemplo, em uma modalidade, a formulação liofilizada é reconstituída com 1 mL de água ou menos para a obtenção de uma formulação reconstituída livre de partículas com uma concentração de anticorpos de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Anticorpos de ocorrência natural normalmente têm duas cadeias

pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, estando cada cadeia leve ligada por covalência a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto intercadeia. Ligações dissulfeto múltiplas ligam, além disso, as duas cadeias pesadas uma a outra. Cadeias individuais podem se dobrar e formar domínios 20 com tamanhos (110-125 aminoácidos) e estruturas semelhantes, mas funções diferentes. A cadeia leve pode compreender um domínio variável (Vl) e/ou um domínio constante (CL). A cadeia pesada pode também compreender um domínio variável (Vl) e/ou, dependendo da classe ou isótopo do anticorpo, três ou quatro domínios constantes (CH1), (Ch2), (Ch3) e (CH4). Nos 25 humanos, os isótopos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, estando o IgA e o IgG divididos em subclasses adicionais ou subtipos (lgA-1-2 e IgG1^).

Geralmente, os domínios variáveis apresentam considerável variabilidade em suas seqüências de aminoácidos de um anticorpo para o outro, particularmente na região do sítio de ligação do antígeno. Três regiões, 30 chamadas regiões hipervaríáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs), são encontradas em cada Vl e VH, que são suportadas por regiões menos variáveis chamadas regiões de estrutura variável. A porção de um anticorpo que consiste de domínios Vl e Vh é denominada Fv (fragmento variável) e constitui a região de ligação do antígeno. Um Fv de cadeia única (scFv) é um fragmento de anticorpo contendo um domínio Vl e um domínio Vh em uma cadeia de polipeptídeos na qual a 5 região N-terminal de um domínio e a região C-terminal do outro domínio são unidas por um ligante flexível (ver, por exemplo, a patente US 4.946.778 (Ladner et al.); WO 88/09344 (Houston et al.). WO 92/01047 (McCafferty et al.) descreve fragmentos scFv na superfície de pacotes de display genéticos solúveis recombinantes, tais como bacteriófagos.

Anticorpos de cadeia única não possuem alguns dos ou todos os

domínios constantes dos anticorpos integrais dos quais derivam. Assim, eles podem superar alguns dos problemas associados ao uso de anticorpos integrais. Por exemplo, anticorpos de cadeia única tendem a estar livres de certas interações indesejadas entre regiões constantes de cadeia pesada e ou15 tras moléculas biológicas. Além disso, anticorpos de cadeia única são consideravelmente menores do que anticorpos integrais e podem apresentar maior permeabilidade do que anticorpos integrais, o que permite aos anticorpos de cadeia única localizar e se ligar a regiões de ligação de antígenos-alvo mais eficientemente. Além disso, o tamanho relativamente pequeno dos an20 ticorpos de cadeia única os torna menos passíveis de provocar uma resposta imune indesejada em um recipiente do que anticorpos integrais.

Múltiplos anticorpos de cadeia única , com cada cadeia única tendo um domínio Vh e um domínio Vl ligados por covalência por um primeiro peptídeo ligante, podem ser ligados por covalência por pelo menos um ou 25 mais peptídeos ligante para formar um anticorpo de cadeia única multivalente que pode ser monoespecífico ou multiespecífico. Cada cadeia de um anticorpo de cadeia única multivalente inclui um fragmento variável de cadeia leve e um fragmento variável de cadeia pesada e está ligado por um peptídeo ligante a pelo menos uma outra cadeia. O peptídeo ligante é composto 30 por pelo menos quinze resíduos de aminoácidos. O número máximo de resíduos de aminoácidos é de cerca de cem.

Dois anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar um diacorpo, também conhecido como dímero bivalente. Diacorpos têm duas cadeias e duas regiões de ligação e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Cada cadeia do diacorpo inclui um domínio Vh conectado a um domínio VL. Os domínios são ligados por Iigantes curtos bastante para 5 impedir o pareamento de domínios da mesma cadeia, orientando assim o pareamento entre domínios complementares de cadeias diferentes para recriar as duas regiões de ligação de antígeno.

Três anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar tricorpos, também conhecidos como trímeros trivalentes. Os tricorpos 10 são construídos com o aminoácido terminal de um domínio Vl ou Vh fundido diretamente com o terminal carboxila de um domínio Vl ou Vh, ou seja, sem qualquer seqüência ligante. O tricorpo tem três cabeças Fv com os polipeptídeos em um arranjo cíclico, da cabeça para a cauda. Uma possível conformação do tricorpo é planar com as três regiões de ligação situadas em um 15 plano com ângulo de 120 graus uma das outras. Os tricorpos podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou triespecíficos.

Fab (fragmento, de ligação a antígeno) se refere a fragmentos do anticorpo consistindo de domínios VL, Cl, Vh e CH1. Aqueles gerados ar pós a digestão de papaína são denominados simplesmente Fab e não retêm 20 a região de dobradiça de cadeia pesada. Após a digestão de pepsina, vários Fabs que retêm a região de dobradiça de cadeia pesada são gerados. Os fragmentos divalentes com as ligações dissulfeto intercadeia intactas são denominados F(ab)2, enquanto um Fab’ monovalente é resultado da nãoretenção das ligações dissulfeto. Fragmentos F(ab)2 apresentam maior avi25 dez por antígenos do que os fragmentos Fab monovalentes.

Fc (cristalização de fragmento) é a denominação da porção ou fragmento de um anticorpo que compreende domínios constantes de cadeia pesada pareados. Em um anticorpo IgG, por exemplo, o Fc compreende domínios CH2 e CH3. O Fc de um anticorpo IgA ou IgM compreende além 30 disso um domínio Ch4. O Fc se associa com a ligação ao receptor Fe, ativação de citotoxidade mediada por complemento e citotoxidade celular dependente de anticorpos (ADCC). No caso de anticorpos tais como o IgA e o IgM, que são complexos de múltiplas proteínas similares ao IgG, a formação complexa requer domínios constantes Fe.

Enfim, a região de dobradiça separa as porções Fab e Fc do anticorpo, proporcionando mobilidade para os Fabs em relação uns com os 5 outros e em relação ao Fe, assim como incluindo múltiplas ligações dissulfeto para ligação covalente das duas cadeias pesadas.

Assim, os anticorpos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, anticorpos de ocorrência natural, fragmentos bivalentes tais como (Fab’)2, fragmentos monovalentes tais como Fab, anticorpos de cadeia úni10 ca, Fv (scFv) de cadeia única, anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única multivalentes, diacorpos, tricorpos e afins que se ligam especificamente aos antígenos.

Os anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, da presente invenção, por exemplo, podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Anticorpos 15 biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que possuem duas especificidades ou regiões de ligação a antígeno diferentes. Quando um anticorpo tem mais do que uma especificidade, os epitopos reconhecidos podem ser associados a um único antígeno ou a mais de um antígeno. Assim, a presente invenção proporciona anticorpos biespecíficos, ou fragmentos dos mesmos, que se 20 ligam a dois antígenos diferentes.

A especificidade dos anticorpos, ou de fragmentos deles, pode ser determinada com base na afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com um anticorpo (Kd), mede a força de ligação entre um determinante antigênico e 25 uma região de ligação de anticorpos. A avidez é a medida da força da ligação entre um anticorpo e o seu antígeno. A avidez se relaciona tanto com a afinidade entre um epitopo e o seu lugar de ligação de antígeno no anticorpo, quanto com a valência do anticorpo, que se refere ao número de regiões de ligação de antígenos de um epitopo em particular. Os anticorpos normal30 mente se ligam com uma constante de dissociação (Kd) de 10'5 a 10'11 Iitros/mol. Qualquer (Kd) menor do que 10‘4 litros/mol é geralmente considerada indicadora de ligações não-específicas. Quanto mais baixo o valor de Kdi mais forte a força de ligação entre um determinante antigênico e a região de ligação de anticorpo.

Como aqui utilizados, os termos “anticorpos” e “fragmentos de anticorpos” incluem modificações que retêm a especificidade para um antí5 geno específico. Tais modificações incluem, mas não se limitam a, conjugação com uma molécula efetora tal como um agente quimioterapêutico (por exemplo, cisplatina, taxol, doxorrubicina) ou citotoxina (por exemplo, uma proteína, um agente quimioterápico orgânico não protéico). Os anticorpos podem ser modificados por conjugação com porções repórteres detectáveis. 10 Também incluídos estão os anticorpos com alterações que afetam características diferentes da ligação, tais como meia-vida (por exemplo, peguilação).

Proteínas e agentes não protéicos podem ser conjugados aos anticorpos por métodos conhecidos na técnica. Os métodos de conjugação incluem ligação direta, ligação via Iigantes ligados por covalência e pares de 15 ligação específica (por exemplo, avidina-biotina). Tais métodos incluem, por exemplo, aquele descrito por Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600- 6607 (1990) para a conjugação da doxorrubicina e aqueles descritos por Arnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991) e por Kiseleva et al., MoL Biol. (USSR) 25, 508-514 (1991) para a conjugação de compostos de plati20 na.

Os anticorpos da presente invenção também incluem aqueles cujas características de ligação foram melhoradas por mutação direta, métodos de maturação de afinidade, revelação de fago ou aleatoriedade de cadeia. A afinidade e a especificidade podem ser modificadas ou melhoradas 25 mediante mutação de CDRs e análise de regiões de ligação de antígenos com as características desejadas (ver, por exemplo, Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)). OS CDRs são mutados de uma variedade de maneiras. Uma maneira é pela randomização de resíduos individuais ou combinações de resíduos, de forma que em uma população com regiões de ligação 30 de outra maneira idênticas, todos os vinte aminoácidos sejam encontrados em posições específicas. Alternativamente, as mutações são induzidas em uma diversidade de resíduos de CDR por métodos de epPCR (ver, por eTl xemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Por exemplo, vetores de phage display contendo genes com regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser propagados em cepas mutantes de E. coli (ver, por exemplo, Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-386 (1996)). Esses mé5 todos de mutagênese ilustram os muitos métodos conhecidos daquele versado na técnica.

Anticorpos também podem ser modificados para conter uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc que alteram a ligação aos receptores Fe, aumentando ou diminuindo, dessa maneira, funções efetoras tais como citotoxidade mediada por células antígeno dependente e citotoxidade dependente de complementos.

Cada domínio dos anticorpos dessa invenção pode ser um domínio imunoglobulínico completo (por exemplo, um domínio variável ou constante de cadeia pesada ou longa), ou pode ser um equivalente funcional 15 ou um mutante ou um derivado de um domínio de ocorrência natural ou um domínio sintético construído, por exemplo, in vitro usando-se uma técnica tal como descrito em WO 93/11236 (Griffiths et al.). Por exemplo, é possível juntar domínios correspondentes a domínios variáveis de anticorpos aos quais falta pelo menos um aminoácido. A marca característica importante 20 dos anticorpos é a presença de uma região de ligação de antígenos. Os termos fragmento variável de cadeia pesada e de cadeia leve não devem ser entendidos como excludentes de variantes que não têm um efeito material sobre a especificidade.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção 25 podem ser obtidos, por exemplo, a partir de anticorpos de ocorrência natural, ou de bibliotecas de phage display Fab ou scFv. Entende-se que, para fazer um anticorpo de domínio único a partir de um anticorpo compreendendo um domínio Vh e um domínio VL, certas substituições de aminoácidos fora dos CDRs podem ser desejáveis para aumentar a ligação, expressão ou solubili30 dade. Por exemplo, pode ser desejável modificar resíduos de aminoácidos que de outra maneira ficariam ocultos na interface Vh-Vl

Além disso, os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção podem ser obtidos por tecnologia de hibridoma padrão (Harlow & Lane, Ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998)), que está incorporado aqui por referência) usando camundongos transgênicos (por exemplo, camundongos KM da Medarex, San Jose, Califórnia) que 5 produzem cadeias pesadas de imunoglobulina gama humana e cadeias leves de imunoglobulina kappa humana. Em uma modalidade preferida, uma' porção substancial do genoma produtor de anticorpos humanos é inserida no genoma do camundongo e é tornado deficiente na produção de anticorpos de murinos endógenos. Tais camundongos podem ser imunizados por 10 via subcutânea (s.c.) com parte ou toda a molécula-alvo em adjuvante de Freund completo.

A presente invenção também proporciona um método para tratamento compreendendo a administração de uma formulação reconstituída. As formulações reconstituídas são preparadas mediante a reconstituição das formulações Iiofilizadas da presente invenção, por exemplo com 1 mL de água. O tempo de reconstituição é preferivelmente inferior a 1 minuto. A formulação reconstituída concentrada permite flexibilidade na administração. Por exemplo, a formulação reconstituída pode ser administrada em uma forma diluída por via intravenosa ou pode ser administrada em uma forma mais concentrada por injeção. Uma formulação restituída concentrada da presente invenção pode ser diluída até uma concentração sob medida para o sujeito específico e/ou para a rota específica de administração. De acordo com isso, a presente invenção proporciona métodos de tratamento compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo a um mamífero, particularmente um humano, com necessidade do mesmo. O termo administração, conforme aqui utilizado, significa administrar a composição com o anticorpo da presente invenção a um mamífero por qualquer método que produza o resultado buscado. A formulação reconstituída pode ser administrada, por exemplo, por via intravenosa ou intramuscular. Em uma modalidade, uma formulação reconstituída concentrada é administrada por injeção.

Os anticorpos das formulações da presente invenção são preferivelmente humanos. Em uma modalidade, a composição da presente invenção pode ser usada para tratar doenças neoplásicas, incluindo tumores sólidos e não-sólidos, para o tratamento de distúrbios hiperproliferativos, para o tratamento da obesidade.

5 Quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de

anticorpo da presente invenção que, quando administrada a um mamífero, é eficaz na produção do efeito terapêutico desejado, tal como redução ou neutralização da atividade do IGF-1R, inibição do crescimento tumoral, tratamento de uma doença hiperproliferativa não-cancerosa, tratamento da obe10 sidade. A administração dos anticorpos tais como descritos na presente invenção pode ser combinada com a administração de outros anticorpos ou de qualquer agente de tratamento convencional, tal como um agente antineoplásico.

Em uma modalidade da invenção, a composição pode ser administrada em combinação com um ou mais agentes antineoplásicos. Qualquer agente antineoplásico apropriado pode ser usado, tal como agentes quimioterapêuticos, radiação ou combinações dos dois. O agente antineoplásico pode ser um agente alquilante ou um antimetabólito. Exemplos de antimetabólitos incluem, mas não se limitam a, cisplatina, ciclofosfamida, melfalan e dacarbazina. Exemplos de antimetabólitos incluem, mas não se limitam a, doxorrubicina, daunorrubicina, paclitaxel irinotecano (CPT-11) e topotecano. Quando o agente antineoplásico é a radiação, a fonte da radiação pode ser ou externa (radioterapia por feixe externo - EBRT) ou interna (braquiterapia - BT) ao paciente em tratamento. A dose de agente antineoplásico administrada depende de numerosos fatores, incluindo, por exemplo, o tipo de agente, o tipo e a gravidade do tumor em tratamento e a rota de administração do agente. Deve ser enfatizado, contudo, que a presente invenção não se limita a qualquer dose particular.

Equivalentes dos anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, da presente invenção, também incluem polipeptídeos com seqüências de aminoácidos substancialmente iguais às seqüências de aminoácidos das regiões variáveis ou hipervariáveis do anticorpo IMC-A12 integral aqui proporcionado. “Seqüências de aminoácidos substancialmente iguais” se define aqui como seqüências com pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80% e mais preferivelmente pelo menos 90% de homologia, tal como determinado pelo método de busca FASTA1 de acordo com Pearson e Lipman 5 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 2444-8 (1988)).

Exemplos

Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção, mas não devem ser entendidos de forma alguma como limitadores do escopo da invenção. Descrições detalhadas de métodos convencionais, tais como a10 queles empregados na análise de proteínas, podem ser obtidos em numerosas publicações, tais como Current Protocols in Immunology (publicado por John Wiley & Sons). Todas as referências mencionadas aqui estão incorporadas em sua inteireza.

No caso de todos os estudos de análise das formulações líquidas, a concentração protéica foi fixada em 5 mg/mL. Um tampão de múltiplos componentes consistindo de 10 mM de fosfato de sódio, 10 mM de citrato de sódio, 10 mM de acetato de sódio, 10 mM de L-histidina e 125 mM de cloreto de sódio foi usado na seleção do pH ótimo. O tipo de tampão, necessidade de TWEEN 80, concentração de glicina e concentração de NaCI foram examinados usando-se um desenho de abordagem experimental (DOE, software JMP). Uma análise de regressão linear foi realizada para determinar a significância das variáveis testadas. A formulação prevista foi confirmada usando-se uma metodologia tradicional tipo um fator de cada vez. O efeito das variáveis testadas sobre a estabilidade térmica foi examinado usando-se Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) e estudos isotérmicos em tempo real. Agitação controlada a 300 rpm a temperatura ambiente foi usada para testar a estabilidade mecânica. A fotoestabilidade das formulações líquidas foi examinada de acordo com as orientações da ICH. A estabilidade sob o congelamento/descongelamento foi determinada pelo congelamento das amostras de teste a -20°C e -70°C e descongelamento a 4°C.

No caso de formulações Iiofilizadas de IMC-A12, foram examinados o tipo de tampão, os estabilizantes e os agentes de massa usando-se um desenho experimental de modelo fatorial fracional a uma concentração de A12 de 20 mg/mL. A concentração de IMC-A12, proporção de concentração de trealose em relação à concentração de IMC-A12 e a concentração de 5 TWEEN 80 foram otimizadas usando-se um modelo de desenho misto. A formulação Iiofilizada ótima prevista foi comparada com formulações contendo PBS e citrato usando-se uma metodologia de um-fator-de-cada-vez. O efeito das variáveis sobre a estabilidade térmica foi examinado mediante estudos isotérmicos de tempo real. A fotoestabilidade da formulação Iiofiliza10 da foi examinada de acordo com as orientações da ICH.

Tabela 1: materiais, graus e fornecedores

MATERIAIS GRAU FORNECEDOR IMC-A12 1278-116, 1278-151 N/A citrato de sódio di-hidrato USP J. T. Baker ácido cítrico anidro USP J. T. Baker acetato de sódio USP J. T. Baker L-histidina USP J. T. Baker fosfato de sódio dibásico USP J. T. Baker fosfato de sódio monobásico USP J. T. Baker NaCI USP J. T. Baker Tween 80 Multi compendia J. T. Baker glicina USP J. T. Baker sacarose Multi compendia J. T. Baker trealose Multi compendia J. T. Baker manitol Multi compendia J. T. Baker O IMC-A12 para uso nos estudos foi preparado mediante troca

de tampão em tampões experimentais usando-se dispositivos de filtração centrífuga Centripep (YM 50) com limite de 50K e uma centrífuga Allegra X15 12R (Beckman). A concentração protéica foi determinada por absorção a 280 nm usando-se um coeficiente de extinção de 1,50 e a concentração foi ajustada com o tampão apropriado. TWEEN 80 foi adicionado a partir de uma solução-mãe (p/v) a 10% após os ajustes da concentração protéica. IMC-A12 a 5 mg/mL em formulação com PBS foi usado como controle. Todas as amostras foram filtradas através de um filtro de seringa de 0,22 pm (membrana de PVDF Durapore).

O processo de liofilização foi realizado usando-se um Iiofilizador 5 Lyostar II. O produto foi carregado no Iiofilizador a temperatura ambiente. A temperatura de prateleira foi resfriada até -50°C com uma taxa de resfriamento de 0,5°C/min. O tempo de umedecimento a -50°C foi de 2 horas. A secagem primária e a secagem secundária foram realizadas a -30°C e a 20°C por 12 horas, respectivamente. A temperatura foi aumentada a 10 0,5°C/min. A pressão da câmara durante secagem primária e a secagem secundária foi de 50 mT. Após a conclusão da liofilização, a câmara do IiofiIizador foi preenchida até uma pressão de meia atmosfera com N2 e tampada.

Exemplo 1: estudo de otimização do pH

Um tampão multicomponente (TMC) consistindo de 10 mM de

fosfato de sódio, 10 mM de citrato de sódio, 10 mM de acetato de sódio, 10 mM de L-histidina e 125 mM de cloreto de sódio foi usado para determinar o pH ótimo. Esse sistema de tampão teve o objetivo de minimizar counter íon (efeitos salinos) que poderiam de outra forma ter causado maiores efeitos do 20 que o pH sozinho. O plano experimental de análise do pH é mostrado na tabela 2. A concentração de IMC-A12 foi mantida a 5 mg/mL. A faixa de pH examinada foi de 5,0-8,0 a intervalos de 0,5 unidade de pH. O efeito do pH sobre as estabilidades térmica e mecânica foi estudado e os resultados são apresentados abaixo.

Tabela 2: plano experimental para análise do pH

Tampão [A12], (mg/mL) PH MCB-1 5,0 5,0 MCB-2 5,0 5,5 MCB-3 5,0 6,0 MCB-4 5,0 6,5 MCB-4 5,0 7,0 MCB-5 5,0 7,5 Tampão [A12], (mg/mL) PH MCB-6 5,0 8,0 Estudo por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)

As curvas térmicas de fusão do IMC-A12 em formulações experimentais (mostradas na tabela 2) foram analisadas por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) para se determinar a temperatura de transição (Tm) para o IMC-A12 nas condições de teste. A concentração protéica foi de 5 mg/mL e o aumento da temperatura foi de 5°C a 95°C a uma taxa de leitura de 1,5°C/min. As curvas de fusão foram ajustadas para uma soma de três Tm. A temperatura de fusão, Tm1, correspondente ao primeiro pico de transição em função do pH, é mostrada na figura 1. A Tm1 foi comparável entre os valores de pH 6,5-8,0.

Estudo de agitação

As amostras foram submetidas a estresse por agitação em um agitador plataforma. As amostras tais como descritas na Tabela 2, incluindo 5 mL de IMC-A12 a 5 mg/mL em frascos de vidros de 27,5 mL, foram agita15 das a 300 rpm com headspace ajustado para 81,8%. O estudo foi realizado a temperatura ambiente por 72 horas. O percentual de perda devido à formação de agregados insolúveis e o percentual de monômeros remanescentes em função do pH é mostrado nas figuras 2 e 3, respectivamente. O percentual de perda foi menor e o percentual de monômeros maior entre os va20 Iores de pH 6,0-7,0.

Estabilidade sob temperatura acelerada em tempo real a 40°C e 50°C

O IMC-A12 a 5 mg/mL em vários tampões de pH (tabela 2) foi incubado a 40°C por 3 semanas e 50°C por 1 semana. O efeito do pH sobre o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HLPC. A variação do 25 percentual de monômeros permaneceu em função do pH após 3 semanas de incubação a 40°C (figura 4) e 1 semana de incubação a 50°C (figura 5) são mostradas. O percentual de monômeros remanescente foi maior entre os valores de pH 6,0-6,5.

Estabilidade sob temperatura de congelamento em tempo real a -20°C e -70°C O IMC-A12 a 5 mg/mL em vários tampões de pH (listados na tabela 2) foi incubado a -20°C e -70°C por três semanas. O efeito do pH sobre o percentual de monômeros foi analisado por SEC-HPLC. A variação do percentual de monômeros em função do pH após três semanas de incuba5 ção é mostrado na figura 6. O pH não teve efeito significativo sobre o percentual de monômeros seja a -20°C, seja a -70°C.

Resumo da otimização do pH

Descobriu-se que o pH ótimo para o IMC-A12 a 5 mg/mL se encontra entre 6,0 e 6,5.

Exemplo 2: estudo dos excipientes para as formulações em solução

Os estudos de otimização do pH do exemplo 1 demonstraram que o IMC-A12 apresenta maior estabilidade entre os valores de pH 6,0 e 6,5. Neste exemplo, estudamos o efeito do tipo de tampão (citrato e histidina) sobre a estabilidade do IMC-A12 nos valores de pH 6,0 e 6,5. A exigên15 cia de TWEEN 80 e a concentração de NaCI e glicina também foram examinadas. A concentração protéica foi mantida fixa em 5 mg/mL. O plano experimental para a análise do excipiente é mostrado na tabela 3.

Tabela 3: plano experimental para otimização do excipiente

Formulações [A12], Tipo de pH Tween [NaCI] [Glicina] (mg/mL) tampão 80 (%) (mM) (mM) (10 mM) Formulação 1 5,0 histidina 6,0 o 80 140 Formulação 2 5,0 histidina 6,0 0,01 100 75 Formulação 3 5,0 histidina 6,5 0,01 75 150 Formulação 4 5,0 histidina 6,5 0 150 0 Formulação 5 5,0 histidina 6,5 0,01 100 100 Formulação 6 5,0 citrato 6,5 0 150 0 Formulação 7 5,0 citrato 6,0 0,01 150 0 Formulação 8 5,0 citrato 6,0 0 50 150 Formulação 9 5,0 citrato 6,5 0,01 50 150 Formulação 10 5,0 citrato 6,5 0,01 100 100 PBS 5,0 fosfato 7,2 0 145 0 Medição da osmolaridade

A osmolaridade das formulações da tabela 3 foi medida usandose um osmômetro de pressão de vapor Wescor. Os resultados são mostrados na tabela 4. A osmolaridade das formulações testadas ficaram dentro da 5 faixa desejada de 260-320 mOsmole/Kg.

Tabela 4: osmolaridade das formulações da tabela 3

Formulações [A12], Tipo de PH Tween [NaCI] [Gli¬ osmola¬ (mg/mL) tampão 80 (%) (mM) cina] ridade (10 mM) (mM) (mOsmo le/Kg) Formulação 1 5,0 histidina 6,0 0 80 140 302 Formulação 2 5,0 histidina 6,0 0,01 100 75 283 Formulação 3 5,0 histidina 6,5 0,01 75 150 304 Formulação 4 5,0 histidina 6,5 0 150 0 304 Formulação 5 5,0 histidina 6,5 0,01 100 100 296 Formulação 6 5,0 citrato 6,5 0 150 0 318 Formulação 7 5,0 citrato 6,0 0,01 150 0 318 Formulação 8 5,0 citrato 6,0 0 50 150 275 Formulação 9 5,0 citrato 6,5 0,01 50 150 276 Formulação 10 5,0 citrato 6,5 0,01 100 100 316 PBS 5,0 fosfato 7,2 0 145 0 294 Estudo por Calorimetria Diferencial de Varredura

Curvas térmicas de fusão para o IMC-A12 em formulações experimentais (listadas na tabela 3) foram analisadas usando-se DSC para de10 terminar a temperatura de transição (Tm) para o IMC-A12 nas condições de teste. A concentração protéica foi de 5 mg/mL e a elevação da temperatura foi de 5°C a 95°C a uma taxa de leitura de 1,5°C/min. A temperatura de fusão correspondente ao principal pico de fusão foi ajustada a um modelo de regressão linear para estimar o efeito das variáveis testadas. Opeo Rsq 15 utilizados foram de 0,003 e de 0,99, respectivamente. O diagrama de predição para o efeito do tipo de tampão, pH, concentração de TWEEN 80, concentração de NaCI, concentração de glicina sobre a temperatura de transição é mostrado na figura 7. Determinou-se que o tampão ótimo é o tampão de citrato a um pH de 6,5. A glicina aumentou a temperatura de fusão e o TWEEN 80 diminuiu levemente a temperatura de fusão. O NaCI não teve 5 efeito significativo sobre a temperatura de fusão.

Estudo de agitação

As amostras foram submetidas a estresse por agitação em um agitador plataforma. As amostras descritas na tabela 3 com 5 mL de IMCA12 a 5 mg/mL em frascos de vidro de 27,5mL foram agitadas a 300 rpm. O estudo foi realizado a temperatura ambiente por até 72 horas. A turbidez da solução e o percentual de monômeros foram determinados em função do tempo de agitação. Os efeitos das variáveis testadas sobre a turbidez e sobre o percentual de monômeros foram estimados mediante adaptação da resposta a um modelo de regressão linear usando o software JMP. O valor p para o gráfico verdadeiro versus o previsto tanto para a turbidez quanto para o percentual de monômeros foi de < 0,001. As variáveis estatisticamente significativas foram tampão, TWEEN e tempo. O diagrama de predição para o efeito do tampão, do TWEEN 80 e do tempo sobre a turbidez e o percentual de monômeros é mostrado na figura 8. O tampão de citrato com 0,01% de TWEEN apresentou a menor turbidez e a maior contagem de monômeros.

Estabilidade sob temperatura acelerada em tempo real a 40°C e 50°C

O IMC-A12 a 5 mg/mL nas formulações da tabela 3 foi incubado a 40°C por 4 semanas e a 50°C por 2 semanas. O percentual de monômeros 25 para o material inicial e para as formulações testadas após 4 semanas de incubação a 40°C e para 2 semanas de incubação a 50°C são mostrados nas figuras 9 e 10, respectivamente. Uma análise DOE das amostras submetidas a estresse de temperatura também são mostradas na figura 11. A 40°C, o percentual de monômeros para a maioria das formulações testadas 30 foi comparável, mas melhor do que o PBS. A 50°C, as formulações em tampão citrato (formulações 6-10) foram superiores às formulações em tampão histidina (formulações 1-5). Uma análise DOE da figura 11 mostra que o IMC-A12 tem estabilidade comparável entre os valores de pH 6,0-6,5 e que o NaCI tem um efeito desestabilizante, enquanto a glicina tem um efeito relativamente menor. As formulações 9 e 10 se revelaram comparáveis. Contudo, a formulação 10 foi preferida uma vez que tem menor concentração de 5 glicina (mais próxima da condição fisiológica).

Resumo do estudo dos excipientes

Os estudos por DSC mostraram que o tampão citrato, glicina e pH 6,5 aumentaram a estabilidade térmica do IMC-A12. O TWEEN 80 diminuiu levemente a estabilidade, enquanto o NaCI não teve muito efeito. O 10 IMC-A12 é sensível ao estresse mecânico. Assim, o TWEEN 80 é necessário para estabilizar contra o estresse mecânico. O IMC-A12 apresenta melhor estabilidade na formulação com citrato do que na formulação contendo histidina a temperaturas aceleradas. Ambos, os tampões histidina e citrato, são superiores à formulação com PBS. A formulação 10, que contém 5 15 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de citrato, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI,

0,01% de TWEEN 80, pH 6,5 (citrato) foi selecionada como formulação ótima.

Exemplo 3: comparação entre as formulações em solução com PBS e com citrato

Como discutido acima, desenvolvemos uma nova formulação em

solução do IMC-A12 que contém 5 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de citrato de sódio, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI, 0,01% de TWEEN 80, a um valor de pH 6,5 (citrato). Neste exemplo, comparamos a estabilidade do IMCA12 em formulação com citrato com uma formulação com PBS.

Estudo de agitação

As amostras foram submetidas a estresse por agitação em um agitador plataforma. As amostras contendo IMC-A12 a 5 mg/mL em fracos de vidro de 27,5 mL foram agitadas a 300 rpm. O estudo foi realizado a temperatura ambiente por até 72 horas. As medições de concentração e a turbi30 dez foram realizadas usando-se um espectrofotômetro Biospec Shimatzu 1601. A concentração das soluções de IMC-A12 foi calculada a partir da absorção de 280 nm usando-se um coeficiente de extinção de 1,5. A turbidez da solução foi medida pela absorção a 350 nm. A turbidez da solução, o percentual de perda material (devido à formação de agregados insolúveis) e o percentual de monômeros remanescentes em função do tempo de agitação são mostrados nas figuras 12, 13 e 14, respectivamente. No caso das formu5 lações com PBS do IMC-A12, a turbidez da solução e o percentual de perda aumentaram com o tempo de agitação, enquanto o percentual de monômeros diminuiu. A turbidez, o percentual de perda e o percentual de monômeros permaneceram todos inalterados na formulação com citrato.

Estabilidade sob temperatura acelerada em tempo real a 40°C O IMC-A12 a 5 mg/mL em formulações de PBS ou citrato foi in

cubado a 40°C por até 3 meses. Após a incubação, as amostras foram analisadas por SEC-HPLC, SDS-PAGE e IEF. Os resultados são mostrados abaixo.

Análise por SEC-HPLC: cromatografia de exclusão molecular foi realizada 15 usando-se um cromatógrafo Agilent 1100 série LC e uma coluna Tosoh Biosep G3000SWXL. A fase móvel foi de 10 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de CsCI a um pH de 7,0. Cinqüenta pg da amostra foram injetados em um volume de 10 pL. A variação do percentual de monômeros, agregados e degradados em função do tempo de incubação é mostrada nas figuras 15, 16 e 20 17, respectivamente. O percentual de monômeros e o percentual de agregados e de degradados aumentaram em ambas as formulações, mas a taxa foi menor na formulação com citrato em comparação com a formulação com PBS.

Análise por SDS-PAGE: o IMC-A12 em formulações com PBS e citrato a25 pós 3 meses de incubação a 40°C foi analisado por SDS-PAGE reduzido e não-reduzido em gel gradiente de tris-glicina de 4-20%. 10 μΙ de amostra foram carregados em um volume de 10 μΙ. O gel foi colorido com azul de Coomassie. Os resultados são mostrados nas figuras 18 e 19, respectivamente. Em comparação, bandas de impureza mais intensas foram detecta30 das na formulação com PBS do que na formulação com citrato.

Análise por IEF: focalização isoelétrica (IEF) foi realizada usando-se placas de agarose IEF IsoGel® com uma faixa de pH de 6,0 a 10,5. As amostras de teste foram submetidas a troca de tampão em água Milli-Q contendo 0,5% de TWEEN 80. A amostra de 10 pg foi carregada em um volume de 10 μΙ. O gel foi colorido com azul de Coomassie. O IMC-A12 em formulações com PBS e citrato após 3 meses de incubação a 40°C foi analisado por IEF. Os 5 resultados são mostrados na figura 20. Em comparação, bandas mais difusas e menos definidas foram detectadas na formulação com PBS do que na formulação com citrato.

Estabilidade sob temperatura de congelamento do IMC-A12 a -20°C e a 70ooC

O IMC-A12 a 5 mg/mL em formulações com PBS e citrato foi

incubado a -20°C e a -70°C por até 3 meses. O percentual de monômeros após a incubação foi analisado por SEC-HPLC. A variação do percentual de monômeros em função do tempo a -20°C e a -70° é mostrada nas figuras 21 e 22, respectivamente. O percentual de monômeros não se alterou com o tempo em qualquer das formulações.

Estabilidade sob congelamento/descongelamento do IMC-A12 a -20°C e a-70°C

A estabilidade sob congelamento/descongelamento do IMC-A12 foi avaliada mediante congelamento da amostra de teste seja a -20°C, seja a -70°C em uma secadora por pulverização (Lyo-star II, fabricada pela FTS) com uma taxa de elevação da temperatura de 1°C/min. A amostra foi deixada para incubar por 1 hora e descongelada a 4°C com uma taxa de elevação da temperatura de 1°C/min. O processo de congelamento/descongelamento foi repetido até 15 vezes. A variação do percentual de monômeros em função do número de ciclos de congelamentos/descongelamentos a -20°C e a 70°C são mostrados nas figuras 23 e 24, respectivamente. Como mostrado, o IMC-A12 na formulação com citrato apresenta melhor estabilidade sob congelamento-descongelamento do que a formulação com PBS. A diminuição do percentual de monômeros na formulação com PBS se deveu principalmente ao aumento do percentual de agregados.

Fotoestabilidade das formulações em solução do IMC-A12

O estudo de fotoestabilidade do IMC-A12 foi realizado de acordo com as orientações da ICH. O IMC-A12 a 5 mg/mL em formulações com PBS e com citrato foram expostas à Iuz a temperatura ambiente. A exposição total foi de 200 watts hora/m2 (próxima da UV) + 1,2 milhões de lux/horas (fluorescente). As amostras de controle foram embrulhadas em 5 papel preto para bloquear a luz. As amostras de controle e de teste foram colocadas dentro de uma câmara de fotoestabilidade (Caron série 6500, Caron, Marietta, Ohio). Após a exposição à luz, tanto os controles quanto as amostras de teste foram analisadas por SEC-HPLC. O percentual de monômeros, de agregados e de degradados dos controles e das amostras expos10 tas à Iuz é mostrado na tabela 5. Descobriu-se que o IMC-A12 é sensível à Iuz em ambas as formulações. Contudo, a fotoestabilidade foi significativamente melhor na formulação com citrato do que na formulação com PBS.

Tabela 5: fotoestabilidade do IMC-A12 em formulações com PBS e com citrato

Formulações Lote do Monômeros Agregados Degradados produto (%) (%) (%) Controle com PBS 1278-116 96,6 1,5 2,0 Amostra com PBS 1278-116 73,5 22,8 3,7 Controle com citrato 1278-151 95,7 1,4 2,9 Amostra com citrato 1278-151 81,9 14,2 3,9 Resumo da comparação entre as formulações com PBS e com citrato

O IMC-A12 apresenta estabilidade significativamente melhor em uma formulação de 10 mM de citrato de sódio, 100 mM de glicina, 100 mM de NaCI, 0,01% de TWEEN 80 a um pH de 6,5 (citrato) do que na formulação com PBS. O citrato é uma formulação isotônica livre de partículas, está20 vel contra agregação ou precipitação mecanicamente induzidas, apresenta agregação e desagregação induzidas pela temperatura minimizadas, é estabilizado contra a instabilidade devido ao congelamento/descongelamento e apresenta maior fotoestabilidade.

Exemplo 4: análise de tampões, crio e Iioprotetores e agentes de massa para formulações Iiofilizadas

O tipo de tampão, agentes estabiiizantes e de massa para formulações Iiofilizadas foram examinados a uma concentração de IMC-A12 de 20 mg/mL. O plano experimental é mostrado na tabela 6. Um modelo de desenho fatorial fracional foi usado. O plano experimental para a otimização da concentração de IMC-A12, proporção de concentração de trealose e concen5 tração de IMC-A12 e a concentração de TWEEN 80 é mostrado na tabela 7. Um modelo de desenho misto foi utilizado.

Tabela 6: plano experimental para análise dos estabilizantes e agentes de massa

N0 Tampão [A12} Trealose Sacarose Manitol Glicina PH (10 mM) (mg/mL) (%) (%) (%) (%) 1 histidina 20 4 0 2 0 6,5 2 histidina 20 0 2 3 0 6,5 3 histidina 20 1 1 0 0 6,5 4 histidina 20 0,5 3,5 0 2 6,5 histidina 20 4 0 0 0 6,5 6 histidina 20 0 4 0 0 6,5 7 citrato 20 1,5 0,5 0 4 6,5 8 citrato 20 0,5 1,5 4 0 6,5 9 citrato 20 4 0 0 0 6,5 citrato 20 0 4 0 0 6,5 Tabela 7: plano experimental para a otimização da concentração de A12, da

proporção molar trealose/A12 e da concentração de TWEEN 80

No. Tampão PH [A12] Proporção TWEEN 80 (10 mM) (mg/mL) molar trea- (%) lose/A12 1 histidina 6,5 50,0 200 0,000 2 histidina 6,5 10,0 1000 0,000 3 histidina 6,5 10,0 200 0,010 4 histidina 6,5 30,0 600 0,000 histidina 6,5 10,0 600 0,005 6 histidina 6,5 30,0 200 0,005 f 42

7 histidina 6,5 22,9 460 0,003 8 histidina 6,5 16,0 760 0,002 9 histidina 6,5 10,0 440 0,007 No caso da liofilização, o IMC-A12 teve o seu tampão trocado ou

para 10 mM histidina a pH 6,5 ou 10 mM citrato a pH 6,5 usando-se filtragem por fluxo tangencial Labscale e filtro Pellicon® XL de 50K (Millipore, Corporation). Lio e crioprotetores foram adicionados da concentração-mãe após a 5 troca do tampão. A concentração protéica foi determinada pela absorção a 280 nm usando-se um coeficiente de extinção de 1,50. TWEEN 80 foi adicionado de uma solução-mãe a 10% (p/v, em água deionizada) após ajustes da concentração protéica. Todas as amostras foram filtradas através de um filtro de seringa de 0,22 pm (membrana de PVDF Durapose).

O tipo de tampão, os crio e Iioprotetores e os agentes de massa

foram analisados em busca do efeito sobre os monômeros, agregados, degradados e turbidez de 20 mg/mL de IMC-A12 das formulações mostradas na tabela 6. O produto medicamentoso Iiofilizado foi incubado a 40°C e 50°C por 3 meses. Após a incubação, os produtos medicamentosos Iiofilizados 15 foram reconstituídos em água Milli-Q até 5 mg/mL. Os produtos reconstituídos foram analisados por SEC-HPLC e turbidez. Os resultados foram ajustados usando-se o software de estatística JMP. Os resultados estão resumidos abaixo.

Efeitos das variáveis sobre os monômeros, agregados, degradados e turbidez

Os produtos medicamentosos reconstituídos foram analisados por SEC-HLPC e por análise de turbidez. A variação do percentual de monômeros, agregados, degradados e turbidez em função do tipo de tampão, crio e Iioprotetores e agentes de massa são mostrados nas figuras 25, 26, 27 25 e 28, respectivamente. Os resultados demonstraram que: (1) o tampão histidina resulta em mais monômeros e menos agregados do que o tampão citrato; (2) a trealose e a sacarose aumentam o teor de monômeros e diminuem a agregação; (3) os agentes de massa, o manitol e a glicina, não tiveram efeito significativo sobre o percentual de monômeros ou de agregados. Nenhuma das variáveis testadas teve efeito significativo sobre os degradados. Confirmação dos resultados previstos pela abordagem de um fator de cada vez

Para confirmar estatisticamente os resultados previstos, as for5 mulações 5, 6, 9 e 10 foram analisadas com uma abordagem de um fator de cada vez. O efeito da incubação a 40°C e 50°C por até 3 meses sobre o percentual de monômeros, de agregados, degradados e turbidez é mostrado nas figuras 29, 30, 31 e 32, respectivamente. Os resultados confirmaram que: (1) a histidina é um tampão superior ao citrato e (2) a trealose é um es10 tabilizante melhor do que a sacarose.

Resumo da análise do tipo de tampão, crio e Iioprotetores e agente de massa

As formulações de IMC-A12 Iiofilizadas apresentam maior estabilidade em tampão histidina do que em tampão citrato. A trealose apresenta 15 melhor efeito estabilizante do que a sacarose. A presença dos agentes de massa, do manitol e da glicina, não afetou significativamente a estabilidade. Exemplo 5: otimização das concentrações de IMC-A12, trealose e TWEEN 80 para a formulação Iiofilizada ótima

O modelo de desenho misto foi usado para otimizar a concentração de IMC-A12, proporção de trealose:IMC-A12 e concentração de TWEEN 80 para uma formulação ótima. O plano experimental é mostrado na tabela

7. O IMC-A12 Iiofilizado foi incubado a 4°C, 40°C e 50°C por até 4 meses. Os resultados são discutidos abaixo.

Variação do percentual de monômeros em função da formulação

As formulações de IMC-A12 Iiofilizadas da tabela 7 foram incu

badas a 4°C, 40°C e 50°C por até 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas com água Milli-Q até 5 mg/mL. As amostras reconstituídas foram analisadas por SEC-HPLC para determinação do percentual de monômeros remanescentes. Os resultados são apresentados na figura 33.

Efeito da concentração de IMC-A12, proporção trealose:A12 e concentração de TWEEN 80 sobre a taxa de alteração dos monômeros

A taxa de alteração dos monômeros foi definida como o coeficiente da variação dos monômeros em função do tempo. O software Excel foi usado para calcular o coeficiente. A taxa de alteração dos monômeros foi menor na menor concentração de IMC-A12 e na maior proporção de trealose para IMC-A12. O TWEEN 80 não teve efeito significativo.

Resumo do estudo de otimização

O teor de monômeros previsto aumentou com a diminuição da concentração de IMC-A12 e com o aumento da proporção de trealose:IMCA12. A uma concentração fixa de IMC-A12, o teor de monômeros aumentou com o aumento da proporção de trealose:IMC-A12. O TWEEN 80 teve efeito 10 mínimo sobre o percentual de monômeros. A formulação 4, que contém 30 mg/mL de IMC-A12 e uma proporção trealose: IMC-A12 de 600 foi selecionada como formulação preferida.

Exemplo 6: caracterização do IMC-A12 Iiofilizado

Descobriu-se que o teor de umidade do produto Iiofilizado conforme determinado por uma análise Karl Fisher era de -1,0%. O IMC-A12 Iiofilizado foi reconstituído até 5 mg/mL com água Milli-Q. O tempo de reconstituição foi de cerca de 1-2 minutos.

Efeito da liofilização sobre a estabilidade do IMC-A12

Para garantir que o processo de liofilização não tinha alterado a estabilidade do IMC-A12, o IMC-A12 foi analisado por SEC-HPLC antes e após a liofilização. O IMC-A12 Iiofilizado foi reconstituído antes da análise por SEC-HPLC. O percentual de monômeros, de agregados e de degradados do A12 pré e do A12 pós-liofilização são apresentados na tabela 8.

Tabela 8: análise por SEC-HPLC do IMC-A12 pré e pós-liofilização

Monômeros Agregados Degradados (%) (%) (%) Antes da liofilização 95,7 3,0 1,4 Após a liofilização 95,6 3,1 1,5 Efeito da liofilização sobre a estabilidade conformacional do IMC-A12

Para garantir que o processo de liofilização não tinha alterado a estrutura secundária do A12, a estrutura secundária do IMC-A12 antes e spos a Iiof ilizaçao foi examinada por dicroiSmo circular. Os espectros de DC foram coletados usando-se um espectrômetro de dicroísmo circular Jasco 810, sendo a concentração de IMC-A12 de 0,1 mg/mL. Os espectros de DC antes da liofilização e após a liofilização e reconstituição são mostrados na figura 34. A estrutura secundária do IMC-A12 não foi alterada pela Iiofilização.

Efeito da liofilização sobre a contagem de particulados do IMC-A12

O efeito da liofilização sobre o teor de particulados do IMC-A12 foi medido usando-se um sistema de partículas líquidas HIAC ROYCO modelo 9703. O IMC-A12 antes e após a liofilização foi diluído/reconstituído até 5 mg/mL. Os resultados são mostrados na tabela 9. As contagens de particulados não se alteraram significativamente.

Tabela 9: Análise por HIAC do IMC-A12 antes e após a liofilização

= 10 μ m/m L = 25 μιη/mL = 50 μιτι/ιτιί Antes da liofilização 26,33 1,67 0,00 Após a liofilização 38,67 0,33 0,00 Exemplo 7: comparação entre as formulações em solução e formulações Iiofilizadas do IMC-A12

As seguintes formulações foram comparadas:

(1) formulação em solução de PBS, 5 mg/mL de IMC-A12 em PBS

(2) formulação em solução de citrato, 5 mg/mL de IMC-A12 em 10mM de citrato de sódio, 100 mM de NaCI, 100 mM de glicina, 0,01% de TWEEN 80 (p/v), pH 6,5

(3) formulação liofilizada, 30 mg/mL de IMC-A12, 10 mM de L-histidina, 4,6% de trealose, pH 6,5

Estabilidade sob temperatura acelerada em tempo real

As formulações em solução de PBS e de citrato e a formulação liofilizada foram incubadas a 4°C, 40°C e 50°C. O IMC-A12 Iiofilizado foi reconstituído para 5 mg/mL com água Milli-Q antes da análise. As formulações em solução e a formulação liofilizada reconstituída foram analisadas por SEC-HPLC e SDS-PAGE.

As formulações em solução de IMC-A12 em tampão PBS e em tampao citrato e de JMC-AI2 na formuisçao liofilizada (prefsnda) foram incubadas a 40°C e 50°C por 4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas com água Milli-Q e o percentual de monômeros foi analisado por SECHPLC. O percentual de monômeros após 4 meses de incubação a 40°C e a 50°C está mostrado nas figuras 35 e 36, respectivamente. O percentual de 5 agregados após 4 meses de incubação a 40°C e a 50°C é mostrado nas figuras 37 e 38, respectivamente. O percentual de degradados após 4 meses de incubação a 40°C e a 50°C é mostrado nas figuras 39 e 40, respectivamente.

A análise por SDS-PAGE (reduzido) das amostras após a incubação a 4°C, 40°C e a 50°C por 4 meses é mostrada na figura 41. As formulações em solução de IMC-A12 em PBS e em tampão citrato e a formulação de IMC-A12 liofilizada (preferida) foram incubadas a 4°C, 40°C e a 50°C por

4 meses. As amostras Iiofilizadas foram reconstituídas com água Milli-Q e 10 pg foram carregados em um gel de tris-glicina de 4-20%. O gel foi colorido com azul de Coomassie.

Fotoestabilidade da formulação liofilizada

A fotoestabilidade foi realizada como descrito acima. O IMC-A12 Iiofilizado e as formulações em solução de PBS e citrato foram expostas à Iuz a temperatura ambiente. A exposição total à Iuz foi de 200 Watt hora/m2 20 (UV) + 1,2 milhões de Iux hora fluorescente. A amostras de controle foram embrulhadas em papel preto para bloquear a luz. As amostras de controle e de teste foram colocadas em uma câmara de fotoestabilidade (Caron série 6500, Caron, Marietta, Ohio). Após a exposição à luz, tanto os controles quanto as amostras de teste foram analisadas por SEC-HPLC. O percentual 25 de monômeros, de agregados e de degradados dos controles e das amostras expostas à Iuz são dados na tabela 10. Descobriu-se que o IMC-A12 era sensível à Iuz em ambas as formulações. Contudo, a fotoestabilidade era significativamente melhor na formulação com citrato do que na formulação com PBS. Tabela 10: estudo de fotoestabilidade do IMC-A12 na formulação liofilizada e nas formulações em solução

Formulação Monômeros Agregados Degradados (%) (%) (%) Controle com PBS 96,6 1,5 2,0 Com PBS exposta à Iuz 73,5 22,8 3,7 Controle com citrato 95,7 1,4 2,9 Com citrato exposta à Iuz 81,9 14,2 3,9 Controle Iiofilizado 98,1 1,0 0,9 Liofilizada exposta à Iuz 94,0 4,6 1,4

Claims

1. Formulação líquida compreendendo um anticorpo IgGI que se liga especificamente ao receptor do tipo 1 do fator de crescimento similar à insulina , um tampão farmaceuticamente aceitável a um pH variando entre cerca de 6,0 a 7,0, um sal farmaceuticamente aceitável, um agente estabilizante farmaceuticamente aceitável e um surfactante farmaceuticamente aceitável.

2. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração do anticorpo IgGI varia entre cerca de 5mg/mL a cerca de30 mg/mL.

3. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o IgGI IMC-A12 ou IMC-2F8.

4. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão é um tampão orgânico selecionado do grupo consistindo nos tampões histidina, citrato, malato, tartarato, succinato e acetato em uma concentração variando de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM.

5. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 4, em que o tampão está a uma concentração de cerca de 10 mM.

6. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 4, em que o tampão é um tampão citrato.

7. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o agente estabilizante é selecionado do grupo consistindo em ácido aspártico, ácido lactobiônico, glicina, trealose, manitol e sacarose.

8. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 7, em que a concentração do agente estabilizante varia em uma faixa de cerca de 75 mM a cerca de 150 mM.

9. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 8, em que a concentração do agente estabilizante é de cerca de 100 mM.

10. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 7, em que o agente estabilizante é trealose.

11. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 7, em que o agente estabilizante é glicina.

12. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o sal é NaCI em uma concentração variando de cerca de 75 a cerca de 150 mM.

13. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 12, em que o NaCI é em uma concentração de cerca de 100 mM.

14. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o surfactante é selecionado do grupo consistindo em polisorbato 20, polisorbato 80, polietileno-polipropileno glicol e sais biliares em uma concentração variando de cerca de 0,001% a 1,0% (peso por volume).

15. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 14, em que o surfactante está em uma concentração de cerca de 0,01% (peso por volume).

16. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o pH varia de cerca de 6,0 a cerca de 6,5.

17. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 16, em que o pH é de cerca de 6,5.

18. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, que compreende cerca de 5 mg/mL de anticorpo IMC-A12, cerca de 10 mM de tampão citrato de sódio, cerca de 100 mM de estabilizante glicina, cerca de100 mM de NaCI e cerca de 0,01% de polisorbato 80, estando tal formulação líquida a um pH de cerca de 6,5.

19. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, que foi liofilizada para formar uma formulação liofilizada.

20. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 18, que compreende adicionalmente um agente de massa.

21. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 19, em que o agente de massa é a trealose.

22. Formulação liofilizada compreendendo 30 mg/mL de IMCA12, cerca de 10 mM de histidina e cerca de 4,6% de trealose, sendo que após a reconstituição a formulação tem um pH de 6,5.