Campo da Invenção
A presente invenção é relacionada a processos de separação e de purificação de trans-Resveratrol e/ou Emodina, com elevado grau de pureza, a partir de extratos de plantas, bem como a composições nutracêuticas e/ou fitoterápicas contendo as referidas substâncias. Mais especificamente, são proporcionados processos de separação e purificação do polifenol transresveratrol e/ou da antraquinona emodina de Polygonum cuspidatum e/ou de Rumex acetosa (plantas de origem chinesa), através da extração seletiva de solventes. São também proporcionados fitoterápicos preparados a partir de raízes e/ou rizomas de Rumex acetosa ou de frações dos mesmos.
Antecedentes da Invenção
A antraquinona chamada emodina (3-metil-1,6,8-trihidroxiantraquinona) é conhecida por inibir a atividade de várias proteínas tirosinas quinases, como p56lck, Her2-Neu, entre outras. É também conhecida por inibir o crescimento das células cancerígenas, tipo leucêmica linfocítica e HL-60, sendo ainda utilizada na resistência à quimioterapia.
O chamado trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbeno) tem atividade antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, cardioprotetora,neuroprotetora, quimiopreventiva de câncer, além de proteger contra infecções e isquemia, reduzir a obesidade e prevenir o envelhecimento. O resveratrol (3,5,4’-trihidroxiestilbeno) é um polifenol que pode ser encontrado principalmente na casca das uvas pretas e no vinho tinto. Quanto mais intensa for a cor do vinho ou das uvas, maior é o seu conteúdo em polifenóis. Estudos parecem indicar que o resveratrol pode ajudar a diminuir os níveis de lipoproteínas de baixa densidade, também conhecidas como colesterol LDL ou colesterol "mau", e aumentar os níveis de lipoproteínas de alta densidade, colesterol HDL, ou colesterol "bom". O LDL principalmente no seu estado oxidado pode se acumular nas paredes dos vasos sanguíneos levando à formação de placas de ateroma. Estas placas estão na origem da aterosclerose que resulta na obstrução dos vasos sanguíneos. O resveratrol favorece a produção de HDL pelo fígado, a redução da produção de LDL e impede a oxidação do LDL circulante tendo assim um papel na redução do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares tais como o infarto do miocárdio.
A planta de Polygonum cuspidatum (itadori, huzhang, Mexican-bamboo Japanese knotweed) é de origem chinesa e conhecida por compreender quantidades apreciáveis de resveratrol. Usualmente, o resveratrol é separado e purificado dos extratos Polygonum cuspidatum por cromatografia: a) em sílica gel; b) em resina de adsorção de macro-poroso; c) em celulose; d) em contracorrente de alta velocidade; e) e em poliamida. A emodina, por outro lado, é separada e purificada dos extratos de Polygonum cuspidatum por cromatografia: a) em sílica gel; b) em contracorrente de alta velocidade. Esses processos utilizam equipamentos sofisticados e misturas de solventes que dificultam a recuperação dos mesmos.
Atualmente, os extratos de Polygonum cuspidatum comercializados são importados, têm baixa concentração de trans-resveratrol (~8%) e possuem contaminação por antraquinona emodina (~5%), que apresenta cor e efeito colateral indesejado (laxativo). Em formulações farmacêuticas ou composições de produtos alimentícios, nas quais é desejável uma alta concentração de 1020% de trans-resveratrol, a presença da emodina em maiores concentrações e com seu efeito laxativo é indesejada e inadequada.
As formulações farmacêuticas e/ou alimentícias que utilizam o transresveratrol como ingrediente ativo e/ou funcional em tais formulações, são aqui referidas como “composições nutracêuticas” (farmacêuticas e/ou alimentícias), em virtude das suas propriedades e dos seus benefícios. Algumas de suas fontes conhecidas são relacionadas na tabela 1.Tabela 1 - Fontes conhecidas de trans-resveratrol
A emodina inibe a atividade de várias proteínas tirosinas quinases e inibe o crescimento das células cancerígenas, sendo ainda utilizada como auxiliar nos casos de resistência à quimioterapia. O trans-resveratrol possui atividade antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, cardioprotetora, neuroprotetora, quimiopreventiva de câncer, além de proteger contra infecções e isquemia, reduzir a obesidade e prevenir o envelhecimento.
A maioria dos métodos de separação e de purificação de extratos utiliza sistemas cromatográficos que necessitam de equipamentos caros e mistura de solventes que dificulta sua recuperação. Desta forma, os processos da presente invenção propõem solucionar estas questões ao proporcionar protocolos simples e eficazes para separação e purificação do polifenol transresveratrol e/ou da emodina a partir de diferentes fontes vegetais.
Na busca por fontes alternativas e com maior disponibilidade de trans-resveratrol e/ou de emodina, desenvolveu-se um processo de obtenção de tais ativos a partir da planta Azeda (Rumex acetosa), cuja obtenção de transresveratrol, até então, não era conhecida. A Azeda, também chamada de acetosa, azeda-brava ou azedinha-da-horta é uma planta vivaz da família das poligonáceas, de folhas sagitadas, flores avermelhadas em panículas, e frutos capsulares. É nativa da Europa e Ásia, e exótica no Brasil, não sendo taxonomicamente catalogada em nosso País (ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=41241 ou na Global Biodiversity Information Facility, cujos dados estão disponíveis em http://www.secretariat.gbif.net/portal/ecat_browser.jsp?termsAccepted=true). É cultivada em função das folhas serem comestíveis, de proporcionar uma tintura vermelha que se extrai da raiz, e de usos medicinais diversos. Suas folhas têm sabor de semelhança ao “vinagre” devido à presença de ácido oxálico. Na cultura popular, é utilizada como antiescorbútico, laxante e diurético. Na literatura não foi encontrado relato da presença de trans-resveratrol nas raízes de Rumex acetosa, sendo apenas identificadas e isoladas hidroxi- antraquinonas de suas raízes (Agric. Biol. Chem. 1982, 46,1913-1914). Os únicos relatos de trans-resveratrol em plantas assemelhadas foram descritos em Rumex bucephalophorus, uma planta nativa de Israel, na qual concentração encontrada foi de 0,165 mg/g de trans-resveratrol (J. Nat. Prod. 2003, 66, 1270-1272; J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 1243-1247).
A literatura patentária contempla alguns documentos relacionados a processos de separação e/ou purificação de emodina e/ou trans-resveratrol. Embora nenhum dos documentos encontrados antecipe ou sequer sugira, ainda que indiretamente, o conceito inventivo da presente invenção, são aqui citados alguns documentos como referência.
O pedido de patente norte-americano US 2006/0135797 está relacionado a um processo para se obter diacereína com baixo teor de aloe- emodina. Primeiramente, adiciona-se à diacereína uma base fraca, preferencialmente uma base orgânica fraca; depois, uma solução aquosa do sal formado é submetida à extração contínua ou descontínua em um solvente imiscível em água (preferencialmente acetato de etila, acetato de butila, tolueno e xileno); em seguida a diacereína purificada é precipitada por acidificação. Embora esse processo também utilize a extração de emodina com tolueno, ele se diferencia da presente invenção pelo fato de compreender a adição de uma base fraca à diacereína precedendo a extração, enquanto o extrato de Polygonum cuspidatum é apenas lavado e secado para posterior extração com tolueno. Sendo assim, embora possuam um fator em comum, os processos como um todo são diferentes e visam a extração de diferentes compostos.
O pedido de patente norte-americano US 2004/0051879 descreve um processo de extração de produtos que possuem atividade farmacológica, em particular que possuem atividade antitumoral, provenientes de plantas espermatófitas. Tais produtos consistem em misturas complexas de compostos, entre eles cis-resveratrol e trans-resveratrol. A extração é realizada em meio neutralizado com um álcool alifático, preferencialmente metanol ou etanol. O solvente e o material são misturados e agitados, e o produto é extraído em atmosfera livre de oxigênio e saturada com nitrogênio. O extrato final é centrifugado e o sobrenadante recuperado e concentrado sob vácuo em baixas temperaturas, com a adição de acetato de etila ou solventes similares.
O pedido de patente norte-americano US 2005/0008664 é relacionado a formulações contendo emodina e/ou seus derivados. Particularmente, a emodina está contida em uma formulação lipídica, que proporciona a solubilização da emodina na formulação farmacêutica.
O pedido de patente japonês JP 2005/281179A é relacionado a um processo de purificação do extrato de Reynoutria japonica Houtt com uma mistura líquida de solventes polares hidrofílicos como etanol em água. O extrato é submetido à absorção com carvão ativo, e com posterior dessorção do carvão ativo através de um solvente polar, a fim de obter seletivamente resveratrol com alto grau de pureza.
O documento WO 01/03713A1 descreve um método de extração de resveratrol e/ou ε-viniferina em videiras. O referido método compreende as etapas de extração e purificação primária, preferencialmente seguida de uma purificação secundária. O extrato purificado resultante é caracterizado por possuir um alto teor de resveratrol e/ou ε-viniferina.
Dentre as diversas vantagens técnicas decorrentes da presente invenção pode-se citar a separação e purificação em um único processo, da emodina e/ou do trans-resveratrol, ambos com elevado grau de pureza, e a preparação de fitoterápicos a partir de material vegetal alternativo e de maior disponibilidade.
Sumário da Invenção
Em um dos aspectos da invenção, sendo, portanto, um de seus objetos, é proporcionado um otimizado processo de separação de trans-resveratrol e/ou de emodina a partir de fontes vegetais.
Em uma realização preferencial, o processo compreende as etapas de: a) Adição de um solvente aromático para extração e obtenção da emodina; b) Adição de um hidrocarboneto de cadeia aberta e/ou de um éter, ambos contendo até 6 átomos de carbono, para a extração e eliminação de impurezas; e c) Adição de um solvente polar para extração e obtenção do trans-resveratrol.
Em uma realização preferencial, o referido solvente aromático da etapa a) é o tolueno. Em uma realização preferencial, o referido hidrocarboneto de cadeia aberta é o hexano e o referido éter é o éter do petróleo, na etapa b).
Em uma realização preferencial, o referido solvente polar da etapa c) é éter etílico.
Em uma realização preferencial, a etapa a) é conduzida durante 2 a 40 horas.
Em uma realização preferencial, a emodina da etapa a) é obtida na forma de cristais, com rendimento de 4-6% e pureza de 91-96%.
Em uma realização preferencial, a etapa b) é conduzida durante 1 a 2 horas.
Em uma realização preferencial, a etapa c) é conduzida durante 2 a 24 horas, preferencialmente 14 horas.
Em uma realização preferencial, o trans-resveratrol é obtido com rendimento de 5-7% e pureza de 92-98%.
Em um segundo aspecto, é objeto da invenção o uso de raízes e/ou rizomas de Rumex acetosa e/ou frações dos mesmos para o preparo de composições nutracêuticas para o tratamento de isquemia, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 e/ou obesidade.
Em uma realização preferencial, a referida composição nutracêutica é fitoterápica.
Estes e outros objetos da presente invenção serão melhor compreendidos e valorizados a partir da descrição detalhada da invenção e das reivindicações anexas.
Breve descrição das figuras
A Figura 1 apresenta um monitoramento por FTIR-ATR da extração sólido-líquido do extrato de Polygonum cuspidatum em tolueno. O CCE foi determinado entre os espectros do padrão de trans-resveratrol e do padrão de emodina com os espectros dos vários tempos da extração.
A Figura 2 mostra uma comparação entre os espectros de FTIR-ATR do padrão de emodina (linha contínua) e o espectro do produto final da extração com tolueno (linha descontínua). O CCE entre os dois espectros é de 0,96.
A Figura 3 apresenta um cromatograma do produto final da extração com tolueno: coluna cromatográfica C18 de 250mm x 4,6mm d.i., partículas de 5μm. A fase móvel, inicialmente composta de água (pH=3)-acetonitrila (65:35, v/v) passa para 100% de acetonitrila, em um gradiente linear, durante 15min, com uma vazão de 1,0mL/min.
A Figura 4 apresenta um monitoramento por FTIR-ATR da extração sólido-líquido do extrato de Polygonum cuspidatum em éter etílico. O CCE foi determinado entre os espectros do padrão de trans-resveratrol e do padrão de emodina com os espectros dos vários tempos da extração.
A Figura 5 mostra uma comparação entre os espectros de FTIR-ATR do padrão de trans-resveratrol (linha contínua) e o espectro do produto final da extração com éter etílico (linha descontínua). O CCE entre os dois espectros é de 0,98.
A Figura 6 mostra um cromatograma do produto final da extração com éter etílico. Coluna cromatográfica C18 de 250mm x 4,6mm d.i., partículas de 5 μm. A fase móvel, inicialmente composta de água (pH=3)-acetonitrila (65:35, v/v) passa para 100% de acetonitrila, em um gradiente linear, durante 15min, com uma vazão de 1,0mL/min.
A Figura 7 mostra um cromatograma de um padrão de 100 ppm trans-resveratrol com tempo retenção de 5,90 min.
A Figura 8 mostra um cromatograma do extrato etanólico da raiz de Rumex acetosa diluído 100 vezes. Tempo de retenção de 5,85 min.
A Figura 9 mostra espectros de ultravioleta dos picos dos cromatogramas do padrão de trans-resveratrol (tR=5,90 min, linha continua) e do extrato da raiz de Rumex acetosa (tR=5,85 min, linha descontinua).
A figura 10 mostra uma comparação entre os espectros de FTIR-ATR do padrão de trans-resveratrol (linha contínua) e o espectro do produto isolado de Rumex acetosa (linha descontínua). O CCE entre os dois espectros é de 0,95.
Descrição Detalhada da Invenção
Em um aspecto, a presente invenção vem suprir uma lacuna no estado da arte, ao proporcionar um processo único de separação e de purificação da emodina e/ou do trans-resveratrol, em que ambos os produtos são obtidos com elevado grau de pureza.
Em um outro aspecto da invenção, a elevada pureza de tais ativos, bem como a sua obtenção a partir de diferentes e/ou novas fontes vegetais, proporciona sua vantajosa utilização na formulação de composições nutracêuticas, nesta invenção entendidas como composições farmacêuticas e/ou composições alimentícias, que contêm os ativos obtidos segundo a invenção.
Os produtos obtidos através do processo da invenção são princípios ativos que, ao serem incorporados em composições nutracêuticas proporcionam ação antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, cardioprotetora, neuroprotetora e/ou quimiopreventiva de câncer, além de proteger contra infecções e isquemia, reduzir a obesidade e prevenir o envelhecimento.
Os exemplos a seguir ilustram, mas não se limitam às formas preferenciais de concretizar a invenção.
Exemplo 1 - Obtenção de trans-resveratrol de extrato importado de Polygonum cuspidatum:
O processo de obtenção da presente concretização consiste na extração sólido-liquido, tipo Soxhlet ou similar, do extrato de Polygonum cuspidatum com diferentes solventes. O primeiro solvente utilizado é o tolueno por um período de 2-40 horas para extrair principalmente a antraquinona. O solvente é esfriado a temperatura ambiente para obter cristais de emodina (3-metil-1,6,8- trihidroxiantraquinona) com um rendimento de 4-6% e uma pureza de 91-96%. O segundo solvente é o hexano ou éter de petróleo para lavagem por um período de 1-2 horas para eliminar impurezas. O terceiro solvente é o éter etílico por um período de 2-24 horas. O solvente é evaporado para obter o trans-resveratrol (3,5,4’-trihidroxiestilbeno), com um rendimento de 5-7% e uma pureza de 92-98%. Nesta concretização, o extrato importado de Polygonum cuspidatum foi adquirido da empresa Galena Química e Farmacêutica Ltda. e os solventes foram adquiridos em empresas especializadas, sendo ambos de grau analítico. As extrações sólido-líquido foram realizadas na aparelhagem padrão de Soxhlet (Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 5th Edition, 1996). Esse processo foi acompanhado por espectroscopia Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflectance (FTIR-ATR). Os produtos foram identificados por cromatografia líquida de High Performance Liquid Cromatography (HPLC) e por FTIR-ATR.
O grau de pureza dos produtos isolados foi determinado por: a) Coeficiente de Correlação Espectral (CCE), segundo a equação abaixo, dos espectros de FTIR-ATR dos produtos isolados das extrações com os espectros de FTIR-ATR dos padrões comerciais de emodina (Sigma) e trans-resveratrol (Sigma).
onde Ai e Bi são os valores de absorbância nos espectros A e B a uma frequência, i e wi representam o peso referente aos filtros selecionados. Quando o CCE for igual a 1, os espectros estão perfeitamente relacionados, e quando o CCE for igual a zero, os dois espectros não estão relacionados. b) HPLC, comparando as concentrações conhecidas dos produtos isolados das extrações com as concentrações conhecidas dos padrões comerciais da emodina e do trans-resveratrol.
Para melhor subsidiar a descrição do processo separação e purificação do trans-resveratrol e da emodina da presente concretização preferencial, as seguintes etapas são mais detalhadamente descritas:
Foram pesados 100g de extrato de Polygonum cuspidatum e lavados com 200mL de água. O produto foi seco a temperatura ambiente e em seguida colocado no Soxhlet em um cartucho de papel e extraído com 500mL de tolueno. A cada hora foram recolhidas amostras para análise de FTIR-ATR, totalizando 40 horas, como pode ser observado na Figura 1. O produto resultante da extração foi esfriado a temperatura ambiente para cristalizar 4 a 6g de emodina (3-metil-1, 6, 8-trihidroxiantraquinona) com uma pureza de 96% por FTIR-ATR, conforme a Figura 2, e de 91% por HPLC, conforme a Figura 3.
O produto que restou no Soxhlet foi extraído com 500mL de hexano ou éter de petróleo por um período de 1 a 2 horas para eliminar impurezas.
O produto que restou no Soxhlet foi extraído com 500mL de éter etílico. A cada hora foram recolhidas amostras para análise de FTIR-ATR, totalizando 14 horas, como pode ser observado na Figura 4.
Do produto resultante da extração foi retirado o solvente sob pressão reduzida para obter de 5 a 7g de trans-resveratrol (3,5,4’-trihidroxiestilbeno) com uma pureza de 98% por FTIR-ATR (Figura 5) e de 92% por HPLC (Figura 6).
Exemplo 2 - Obtenção de trans-resveratrol de raízes de Rumex acetosa
Alternativamente, uma segunda fonte vegetal foi utilizada para obtenção do trans-resveratrol. O material vegetal foi obtido na Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. As raízes de Rumex acetosa (5g) foram lavadas e extraídas com a adição de uma solução de etanol/água (70:30) por 15 min sob agitação. O material obtido foi então centrifugado a 1000g por 10 min e depois filtrado em membrana de 0,45μm de diâmetro de poro, sendo em seguida submetido à análise de cromatografia líquida de alta eficiência. As análises foram realizadas em um cromatógrafo HPLC Perkin Elmer equipado com detector UV-VIS e coluna C18 de 250 mm de comprimento, 5 μm de diâmetro de partícula e 4,6 mm de diâmetro interno. O extrato de Rumex acetosa foi diluído 100 vezes com o eluente e 20 μL foram injetados e detectados em 306 nm. A HPLC foi conduzida com eluição isocrática (fluxo de 1,0 mL/min-1), empregando-se uma solução aquosa de acetonitrila a 25%, com pH 3,0, ajustado com H3PO4. A identificação do trans-resveratrol foi baseada nos tempos de retenção no ultravioleta (Figuras 7 e 9) e na similaridade do espectro infravermelho pelo coeficiente CCE (Figura 10) e na similaridade dos espectros de ultravioleta através do coeficiente de correção de Pearson (Tabela 2). Para a quantificação foi construída uma curva de calibração externa, com concentrações de trans-resveratrol variando entre 0,10 a 200,0 mg.L-1 (Figura 9). A quantidade de trans-resveratrol em raízes de Rumex acetosa foi de 1,2 ± 0,1 mg/g, concentração esta considerada elevada se comparada com outras fontes conhecidas dessa molécula (vide Tabela 1).Tabela 2 - Coeficiente de Correlação de Pearson para os espectros de ultravioleta da figura 9 (Calculado no programa SPSS versão 11,5)

Os produtos obtidos através deste processo único de extração, ou seja, o trans-resveratrol e a emodina, são princípios ativos que podem fazer parte de composições farmacêuticas de ação antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, cardioprotetora, neuroprotetora e/ou quimiopreventiva de câncer, além de proteger contra infecções e isquemia, tratamento de diabetes tipo 1 e 2, reduzir a obesidade e prevenir o envelhecimento. Bem como, ambos os produtos, podem constituir composições alimentícias com benefícios semelhantes.
As principais vantagens dos processos aqui descritos decorrem do fato de que tais processos proporcionam a separação e purificação, tanto da emodina como do trans-resveratrol, em um único processo com elevado grau de pureza de ambos os produtos. Isto porque, como já mencionado anteriormente, a presente invenção está relacionada ao processo de extração sólido-líquido, tipo Soxhlet ou similar, de extratos de Polygonum cuspidatum e/ou de Rumex acetosa com diferentes solventes, resultando em um processo simples e eficiente.
Exemplo 3 - Preparação de um fitoterápico com altos teores de Resveratrol a partir da Rumex acetosa
A preparação de um fitoterápico rico em Resveratrol é útil e desejada para o tratamento de diversas condições de saúde, especialmente quando as atuais fontes de Resveratrol não são muito disponíveis e/ou quando fontes novas e alternativas (como é o presente caso) proporcionam alternativas terapêuticas técnica e economicamente viáveis de melhoria da qualidade de vida dos usuários. Os inventores, buscando desenvolver novos e alternativos fitoterápicos, de forma a disponibilizar uma nova opção terapêutica rica em Resveratrol, desenvolveram um novo processo como fonte de fitoterápico a partir da Azeda, cujo uso até então não era conhecido para esta finalidade. O processo fonte do fitoterápico da invenção resulta em um produto rico em Resveratrol e compreende raízes e/ou rizomas de Rumex acetosa ou ainda frações dos mesmos. Para fins da presente invenção, entende-se como frações de raízes e/ou rizomas de Rumex acetosa os produtos obtidos por purificação e/ou extração ao menos parcial dos Resveratrol presentes nas raízes e/ou rizomas. Para evitar a utilização das folhas da Azeda, que têm sabor de “vinagre” devido à presença de ácido oxálico, a preparação do fitoterápico descrito a seguir fez uso de raízes e/ou rizomas da planta.
Raízes e rizomas lavados de Rumex acetosa foram secas em estufa a 40°C ou foram liofilizadas. O material foi triturado em moinho de facas até obter um pó. O pó resultante (5g) foi extraído com 100 mL de uma solução de etanol/água (70:30) durante 60 min sob agitação ou por ultra-som. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 1200g e filtrada. O solvente foi retirado sob pressão reduzida em temperatura de 50°C. O produto obtido foi uma pasta. Essa pasta foi liofilizada para obter um pó de Rumex acetosa, contendo 10-20% de Resveratrol, conforme determinado por cromatografia líquida de alta eficiência. Opcionalmente, a esse pó pode ser adicionado um excipiente, sendo a mistura seca um extrato de produto rico em Resveratrol. O excipiente preferencialmente usado é um polissacarídeo, mas não se limitando a esse, como açúcar, gelatina, celulose micro-cristalizada, quitosana, hidroxipropilcelulose (HPC), carboximetil-celulose (CMC), celulose, hidroxipropilmetilcelulose (HPCM), entre outros. O excipiente também pode ser um oligossacarídeo cíclico, tipo derivados de a-ciclodextrina, de β-ciclodextrina, de y-cliclodextrina, esses derivados podendo ser, mas não se limitando a: hidroxipropil, hidroxietil, glucosil, maltosil, maltotriosil carboxiamidometil, carboximetil e dietilamino. Para a obtenção de grânulos, o pó da azeda é tamisado e adicionado estearato de magnésio e essa mistura é seca e granulada. O produto resultante pode ser processado como comprimido, cápsula ou pó.
Os versados na arte valorizarão imediatamente os importantes benefícios decorrentes do uso da presente invenção, como a separação e purificação da antraquinona emodina e/ou do polifenol trans-resveratrol com elevado grau de pureza, bem como as composições nutracêuticas e/ou fitoterápicas que contêm qualquer um de tais ativos. Variações nas formas de concretizar o conceito inventivo aqui exemplificado devem ser compreendidas como dentro do espírito da invenção e das reivindicações anexas.