BRPI0803835A2 - aparelho e método para diagnóstico parasitológico da esquistossomose mansoni - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um aparelho e método para diagnóstico parasitológico da esquistossomose mansoni. Mais especificamente a invenção está direcionada para o diagnóstico parasitológico da esquistossomose em pacientes com baixa carga parasitária, através da técnica de gradiente salino. Ovos de helmintos intestinais, como ancilostomideos, Hymenolepis nana, Enterobius vermiculares, Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura também podem ser identificados pelo emprego desse método. Nesse contexto, a presente técnica de gradiente salinico proporciona um diagnóstico parasitológico mais sensível, reprodutível, de fácil execução e rápida análise, além do baixo custo.

Description

APARELHO E MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO DAESQUISTOSSOMOSE MANSONI

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um aparelho e métodopara diagnóstico parasitológico da esquistossomose mansonie outros helmintos. Mais especificamente a invenção estádirecionada para o diagnóstico parasitológico em pacientescom baixa carga parasitária e para o controle de cura apóstratamento quimioterápico.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Exames parasitológicos de fezes são amplamenteutilizados no diagnóstico de helmintos, por causa dapresença de formas evolutivas desses parasitos no bolofecal. Ademais, o encontro dessas formas parasitáriasestabelece um diagnóstico de certeza e de precisão.

A esquistossomose é uma doença crônica e debilitantecausada por vermes parasitas trematódeos (esquistossomos).Trata-se de uma parasitose que atinge milhões de pessoas,particularmente na zona rural dos paises emdesenvolvimento. Estima-se que existam atualmente 200milhões de pessoas infectadas, com mais da metadeapresentando sintomas e outras 600 milhões em situação derisco. Destaca-se que cerca 20 milhões de pessoasmanifestam a forma grave da doença. Cinco são as espéciesde esquistossomos que podem infectar os humanos, das quaisSchistosoma mansoni, S. japonicum e S. haematobium são asmais importantes. As duas primeiras espécies estãoassociadas com fibrose hepática e intestinal, enquanto quea infecção com o S. haematobium pode conduzir a fibrose doureter e do rim e também calcificação do trato urinário. NoBrasil, é calculada a existência de aproximadamente 8 a 10milhões de infectados pelo S. mansoni.

Atualmente, o diagnóstico da esquistossomose é baseadoprincipalmente no método quantitativo de Kato-Katz,recomendado pela Organização Mundial de Saúde. Esse métodotambém é muito usado para o diagnóstico de outroshelmintos, como Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura eancilostomatideos, que podem ter sua carga parasitáriaavaliada.

Todavia, o método quantitativo, de Kato-Katz possuirestrições de sensibilidade, principalmente em pacientescom baixa carga parasitária ou no controle de cura após otratamento quimioterápico da doença.

Dentre os helmintos de importância médica, otrematódeo S. mansoni, agente etiológico da esquistossomosemansoni, elimina uma quantidade muito pequena de ovos nasfezes. Considerando que um humano gera uma média de 200gramas de matéria fecal por dia, um casal adulto de S.mansoni produz 300-400 ovos nesse mesmo período e, ainda,que aproximadamente 50% desses ovos atinjam as fezes,calcula-se cerca de um ovo presente a cada grama de fezes.No caso, portanto, da menor infecção possível por S.mansoni, determinada por um único casal de vermes, énecessário analisar, minuciosamente, 24 lâminas para oexame de 1 (uma) grama de fezes (24 lâminas x 42 mg = 1.000mg de fezes - Método de Kato-Katz), para que se possaencontrar apenas um único ovo.Também podem ser utilizadas outras alternativas dediagnóstico da esquistossomose, como os métodos de eclosãomiracidiana e de sedimentação espontânea da matéria fecalem água.

Metodologias moleculares e/ou imunoiógicas, maissensíveis, como, respectivamente, a detecção de DNA doparasito pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou deanticorpos anti-esquistossomo, também já são conhecidas doestado da arte.

Todavia, as metodologias desenvolvidas até o momento,são dispendiosas e de difícil aplicabilidade no campo, e/oupossuem restrições de sensibilidade/especificidade.

Com base nas dificuldades acima mostradas, torna-seimperativo o desenvolvimento de metodologias paradiagnóstico parasitológico que sejam de baixo custo e comalta sensibilidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é proporcionar ummétodo mais sensível para o diagnóstico parasitológico daesquistossomose mansoni.

É ainda um objetivo da presente invenção fornecer umaparelho para diagnóstico parasitológico de esquistossomosadequado para realização do método de diagnóstico, somandoeficiência e praticidade.

Tendo em vista que o diagnóstico parasitológico deveser realizado de maneira apropriada, com maiorsensibilidade e especificidade para a detecção de ovos deS. mansoni, uma vez que dele dependerá o tratamentoespecifico, os presentes inventores desenvolveram um novoaparelho e método que utiliza a técnica de gradientesalinico, que leva em consideração a alta densidade dosovos de S. mansoni. 0 presente protocolo visa padronizarequipamentos e procedimentos para o diagnóstico daesquistossomose. Nesse contexto, a presente técnica degradiente salinico proporciona um diagnósticoparasitológico mais sensível, reprodutivel, de fácilexecução e rápida análise, além do baixo custo.

REVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 representa o aparelho da presente invenção.

A Figura 2 representa o aparelho da presente invençãoem modalidades alternativas. Figura 2A representa aparelhoda presente invenção para a realização de um único exame. A

Figura 2B representa aparelho da presente invenção para arealização de exames simultaneamente. No caso, 12 exames.Pode-se ainda aumentar a capacidade de processar um maiornúmero de exames acrescentando variações à configuração amostrada. Basicamente, aumento a capacidade do reservatóriode salina a 3% e adicionando novos tubos de separação.

A Figura 3 mostra a avaliação experimental emlaboratório do método da presente invenção comparado com ométodo de Kato-Katz.

A Figura 4 mostra que avaliação na sensibilidade dométodo da presente para amostras fixadas com formol a 10%.

A Figura 5 mostra uma avaliação preliminar dasensibilidade da presente invenção comparada com o métodode Kato-Katz em condições de campo, em 20 escolares.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

0 gradiente salino está baseado na sedimentaçãodiferencial de ovos do parasita, por exemplo de S. mansoni,em diferentes concentrações de solução salina, que por suavez provoca a suspensão de diversos detritos fecais debaixa densidade, limpando a amostra final a ser analisadasob microscopia. Por separar os ovos de parte da matériafecal, tal metodologia proporciona uma rápida e fácilanálise das lâminas obtidas, com a preservação damorfologia dos ovos. A determinação da carga parasitária éinferida da mesma forma que no método de Kato-Katz, apartir da quantificação prévia da quantidade fecalexaminada. Outros ovos de helmintos, com alta densidade,também podem ser mais facilmente visualizados a partir dométodo da presente invenção.

Desta forma, o método de gradiente salino da presenteinvenção pode atender o diagnóstico parasitológico daesquistossomose, bem como outras doenças causadas por helmintos.

Para aplicação do método da presente invenção foidesenvolvido o aparelho 10 mostrado na Figura 1.

O aparelho 10 está mostrado na Figura 1 em umaconfiguração adequada, por exemplo, para aplicação nocampo, porém, certas variações podem ser introduzidas semse afastar do escopo da presente invenção. O numerai 11representa a base do aparelho 10, a qual está representadaem um formato arredondado, porém a base 11 pode possuirqualquer forma e pode ser de qualquer tipo de materialresistente, por exemplo, de madeira.Na base 11 é colocado um pedestal 12 para sustentaçãode tubos cilíndricos transparentes. Um desses tuboscilíndricos, denominado de tubo reservatório 13 é fixado naparte superior do pedestal 12, dito tubo 13 possuindo umacapacidade de 50 mL e podendo ser graduado ou não. Naporção inferior do pedestal 12 é provido o outro tubocilíndrico, denominado de tubo de separação 14, paracolocação da amostra fecal. Os tubos 13 e 14 são fixados aopedestal 12 através de qualquer meio de fixação conhecido.

No tubo reservatório 13 é provida uma solução salina a3%. Na saida do tubo reservatório 13 é colocada umamangueira de borracha ou de plástico 15 de cerca de 25 cmde comprimento com calibre de 0,3 cm. A dita mangueira 15 éconectada ao tubo de separação 14 o qual possui umacapacidade de cerca de 10 mL.

0 tubo de separação 14 tem por finalidade separar elimpar a amostra fecal. No interior do tubo de separação14, em sua extremidade inferior, é provida uma placa porosacilíndrica 21, a qual evita o turbilhonamento durante aentrada da solução salina. A placa porosa cilíndrica é dotipo usado na aeração de aquários e possui uma altura decerca de 0,7 cm. O tubo de separação 14 possui em sua partesuperior um orifício conectado a uma mangueira de borrachaou plástico 16 para atuar como um ladrão. A mangueira 16está localizada no tubo de separação 14 em uma distânciaadequada a partir da borda do tubo de separação 14. Aextremidade inferior da mangueira 16 é inserida em umrecipiente de coleta 17.A Figura 2A mostra uma modalidade alternativa doaparelho da presente invenção. Partes comuns do aparelhomostrado na Figura 1 são representadas na Figura 2A comnumerai semelhante.

Na Figura 2A, o aparelho 10' possui uma base 11' noformato retangular. Na base 11' são previstos doispedestais 12A e 12B para sustentação de tubos cilíndricostransparentes. Um tubo cilíndrico transparente, denominadode tubo reservatório 13' é fixado no pedestal 12A, ditotubo 12A e possui uma capacidade de 50 mL, podendo aindaser graduado. No pedestal 12B é fixado o tubo de separação14', que possui a amostra fecal. A fixação dos tubos 13' e14' aos pedestais 12A e 12B pode ser através de qualquermeio de fixação conhecido.

No tubo reservatório 13' é provida a. solução salina.

Na saida do tubo reservatório 13' é provido um dosador degotas 20, para controle de fluxo de solução salina. Nasaida do dosador 20 é colocada uma mangueira de borrachade cerca de 25 cm de comprimento com calibre de 0,3 cm.

A dita mangueira 15' é conectada ao tubo de separação 14' oqual possui uma capacidade de cerca de 10 mL. O tubo deseparação 14' possui, ainda, em sua extremidade inferior,uma placa porosa cilíndrica 21' do tipo usado na aeração deaquários. O tubo de separação 14' possui em sua partesuperior uma mangueira de borracha 16' para atuar como umladrão. A mangueira 16' está localizado no tubo deseparação 14' em uma distância adequada a partir da bordado tubo 14''. A extremidade inferior da mangueira 16' éinserida em um recipiente 17'.A Figura 2B representa uma modalidade alternativa doaparelho da presente invenção para a realização de váriosexames (limpeza das amostras) ao mesmo tempo.

Para realização do método para diagnósticoparasitológico da presente invenção, ou seja, para o examequantitativo dos ovos do parasita, deve-se pesar 500 mg defezes do paciente em balança analítica ou obter uma amostraem cartão de plástico ou metálico, com orifício decapacidade de 500 mg de material fecal. É necessáriofiltrar previamente o material em tela de Kato (malha de200 um2) .

0 material fecal pode ser previamente fixado comformol a 10% na proporção de uma parte de amostra paraquatro partes do fixador. A amostra então deve ser diluidae homogeneizada em 3 mL de solução salina a 0,85%. Antes daaplicação da suspensão fecal no tubo de separação, deve-sepermitir a comunicação entre o tubo reservatório 13 e otubo cilíndrico 14. A comunicação é realizada com aregulação do dosador de gotas 20. A solução salina sai doreservatório 13, preenche a mangueira de comunicação 15, eentra no tubo de separação 14. No aparelho 10' da Figura2A, a comunicação de fluido é mantida através da aberturado dosador de gotas 20 até que a placa porosa do tubo deseparação 14 fique submersa na solução salina a 3%, contidano tubo reservatório 13. Em seguida, o dosador de gotas 20é fechado e o excesso de solução salina a 3% no tubo deseparação 14 é descartado, por exemplo, por pipetagem, demaneira que só fique uma fina lâmina de solução acima daplaca porosa.A suspensão fecal deve ser então, cuidadosamenteaplicada com o auxilio de uma pipeta no tubo de separação14, evitando-se o turbilhonamento. Em seguida, o dosador degotas 20 é calibrado para uma vazão de 10 gotas/minuto. Umfluxo continuo e homogêneo de solução salina a 3% provoca asuspensão da coluna fecal, de tal maneira que após 15-20minutos, o material fecal começa a ser drenado pelamangueira-ladrão 16 e descartado no recipiente de coleta17. Os ovos, mais pesados, ficam na superfície da placaporosa. Com o clareamento da coluna de solução salina a 3%,o excesso de sobrenadante deve ser cuidadosamentedescartado por meio de pipetagem. O restante do sedimentodeve ser montado entre lâmina e laminula para contagemtotal dos ovos sob microscopia de luz, usando-se a objetivade 10X.

Doze lâminas de Kato-Katz (12 x 42 mg - 504 mg) forammontadas para comparação. A carga parasitária pode serestimada a partir da relação ovos por grama de fezes (OPG),multiplicando-se a quantidade de ovos encontrados por 2,semelhante ao método de Kato-Katz.

Após a limpeza das amostras fecais em aparelho degradiente salinico, o sedimento pode ser conservado emformol a 10%, em proporção 4:1. Nessas condições, a análisedas lâminas pode ser feita meses após a sua preparação, semperdas significativas no conteúdo de ovos, vide Figura 4.

Assim, o método da presente invenção apresentavantagens em relação ao método do estado da arte, dentre asquais destacamos:(1) maior rendimento na detecção de ovos por grama defezes, comparando com o método-padrão de Kato-Katz;

(2) campo microscópio muito mais limpo, com ovosfacilmente identificáveis;

(3) rapidez no exame, pois com o campo microscópiomais limpo, torna-se mais fácil a identificação dos ovos;

(4) preservação da morfologia dos ovos, facilitando aidentificação;

(5) diminuição no tempo de análise, devido àdiminuição da quantidade de lâminas necessárias para aanálise de 500 mg de material fecal (de 12 lâminas de Kato-Katz para 5-6 lâminas).

Além das vantagens acima relacionadas, adisponibilidade e o baixo custo do material (água e cloretode sódio) empregado no presente método o tornam bastanteatrativo para a utilização em estudos epidemiológicos comamostras processadas previamente em campo e fixadas), bemcomo em laboratórios de análises clinicas, devido a suafácil execução e maior eficiência.

0 método para diagnóstico parasitológico daesquistossomose da invenção será agora descrito através deexemplos, os quais não devem ser considerados limitativos.

A eficácia do método da invenção, ou seja, a detecçãode ovos do parasito, foi testada com ovos de S. mansoni.Assim, foi elaborado um procedimento laboratorial no qual ométodo Kato-Katz (Katz et al. 1972) foi utilizado comoreferência para a comparação. O método Kato-Katz éconsiderado pela Organização Mundial da Saúde como padrão-ouro no diagnóstico da esquistossomose mansoni.Exemplo 1

Fezes frescas de camundongos previamente infectado com50 cercárias de S. mansoni (cepa LE) foram utilizadas comofontes de ovos, a partir do 50° dia de infecção.

As fezes foram maceradas com bastão de vidro em 10 mLde solução salina gelada a 0,85%, em recipiente plástico.

Ao recipiente plástico, também foram adicionadas cincogotas de formol a 10%, para evitar eclosão miracidiana. Omaterial homogeneizado foi filtrado com gaze cirúrgica,dobrada em quatro camadas, em um recipiente (por exemplo,um cálice) de sedimentação. Após a sedimentação domaterial, o sobrenadante foi aspirado e descartado. Osedimento total foi então misturado com 3 g de fezeshumanas, sabidamente negativas para esquistossomosemansoni. Essas fezes haviam sido previamente filtradas emtela de malha de 200 (Jin2. Desse homogenato, quatro amostrasde 500 mg foram obtidas em placa perfurada de aço inox.

Cada amostra fecal foi então diluída em 3 mL de solução a0,85% e aplicada cuidadosamente, por meio de uma pipetaPasteur, no tubo para separação (tubo de separação 14 dcaparelho 10).

É importante salientar que antes da aplicação daamostra, o dosador de gotas foi aberto (O dosador possuiuma pequena peça de rolagem. No alto, essa peça fecha ofluxo. Embaixo, a vazão fica máxima. Em posiçõesintermediárias, controla-se a vazão de gotas) para permitirque a solução salina a 3%, presente no tubo reservatório13, atinja o tubo-de separação 14, cobrindo a placa porosa.

Essa solução salina a 3% foi descartada antes da aplicaçãoda amostra. Com o auxilio do dosador de gotas, permitiu-seentão a entrada de 10 gotas/minuto no sistema. Desta forma,um fluxo continuo e homogêneo de solução salina a 3%provocou a suspensão da coluna fecal, de tal maneira gueapós 20 minutos, o material fecal começou a ser drenadopela mangueira-ladrão 16.

Os ovos, mais pesados, ficam na superfície da placaporosa. Com o clareamento da coluna de solução salina a 3%,o excesso de sobrenadante foi cuidadosamente descartado,por meio de pipetagem. O sedimento restante foi montadoentre lâmina e laminula para contagem total dos ovos sobmicroscopia de luz.

Doze lâmimas de Kato-Katz (12 x 42 mg = 504 mg) forammontadas para comparação. A carga parasitária foi estimadaa partir da relação: ovos por grama de fezes (OPG) , talcomo no método Kato-Katz.

A Figura 3 mostra que o número de ovos detectados pelométodo de gradiente salinico (média de três réplicas) ésignificativamente maior do que o obtido através da análisede 12 lâminas de Kato-Katz (P = 0, 000). O número médio deovos detectados no método de gradiente salinico da presenteinvenção foi de 6,830+1,411, enquanto a média do númerototal de ovos para o método de Kato-Katz foi de4,700+1,252.

Exemplo 2

A Figura 4 mostra a avaliação na sensibilidade dométodo da presente para amostras fixadas com formol. Omesmo procedimento usado acima foi repetido para investigara possibilidade de fixação das amostras do sedimento depoisda realização do exame pelo método de gradiente salinico dapresente invenção, possibilitando a análise em laboratóriode grade quantidade de amostras obtidas em estudosepidemiológicos.

Para tanto, trinta amostras fecais recém obtidas foramsubdivididas em dois grupos. No primeiro grupo, a análisefoi realizada com o material fecal ainda fresco, semfixação. No segundo grupo, com as amostras correspondentes,foi realizada a contagem dos ovos 45 dias após a fixação emformol a 10%.

Observa-se na Figura 4 que não há diferençasignificativa entre os valores obtidos entre as amostrasfrescas e fixadas (P = 0,428). Esse resultado tem umimportante significado, pois corrobora que as amostrasfecais podem ser fixadas em campo, após serem submetidas aométodo do gradiente salinico da presente invenção e,posteriormente, analisadas em laboratório de análisesclinicas.

Exemplo 3

A Figura 5 mostra uma avaliação preliminar em campo nasensibilidade do método da presente em comparação com asensibilidade do método de Kato-Katz, nas mesmas condições.

Fezes de vinte pacientes inicialmente consideradosnegativos para a esquistossomose após a realização deinúmeros exames de Kato-Katz (cerca de 6-9 lâminas em trêsamostras diferentes) foram coletadas. Para cada paciente,as fezes foram filtradas em tela de malha de 200 |a.m2 e duasamostras de 500 mg foram obtidas em placa perfurada de açoinox. Cinco gotas de formol a 10% foram adicionadas em cadaamostra, para evitar eclosão miracidiana.Uma das amostraspara cada paciente foi então diluida em 3 mL de solução a0,85% e aplicada cuidadosamente, por meio de uma pipetaPasteur, no tubo para separação (tubo de separação 14 doaparelho 10) . A partir daqui, o exame foi realizado comoexplicado anteriormente. A outra amostra de cada pacientefoi empregada na obtenção de 12 lâminas de Kato-Katz, paracomparação. Uma segunda coleta de fezes foi realizada paracada paciente. Os procedimentos empregados foram idênticosaos citados nesse exemplo.

Observa-se na Figura 5 que 25% dos pacientesexaminados estavam infectados com S. mansoni. No primeiroexame, tanto o exame apresentado e o padrão-ouro detectarama mesma percentagem de infecção. Após o segundo exame,entretanto, o método do gradiente salinico apresentousensibilidade de 100% enquanto o método de Kato-Katzmostrou sensibilidade menor, de 80%. Pelo método dogradiente salinico, detectou-se também a presença deEnterobius vermicularis em um paciente.

Exemplo 4

Repetindo os procedimentos do exemplo anterior para ométodo de gradiente salinico em 19 pacientes em idadeescolar, mas apenas com uma única coleta de fezes,detectou-se a presença de ovos de S. mansoni e dossequintes helmintos: ancilostomideos, Hymenolepis nana,Enterobius vermiculares, Ascaris sp., Trichuris trichiura.

Com base nos resultados aqui apresentados, verifica-seque o método da presente invenção proporciona umdiagnóstico parasitológico com maior sensibilidade eespecificidade para a detecção de ovos de S. mansoni.Acrescenta-se que ovos de outros parasitos foram tambémencontrados em uma avaliação preliminar em campo. 0 métodoapresentado é de fácil execução, rápida análise e baixo custo.

Embora a invenção tenha sido descrita em relação aoque é presentemente considerado como sendo a concretizaçãopreferida e a mais prática, deve ser entendido que ainvenção não deve ser limitada à concretização descrita,porém, ao contrário, têm-se a intenção de se cobrir váriasmodificações e disposições equivalentes incluídas noespirito e escopo das reivindicações anexas (como na Figura2B, para a realização de vários exames ao mesmo tempo).

Claims (6)

1. Aparelho para diagnóstico parasitológico daesquistossomose mansoni caracterizado por consistir de:uma base de aparelho;ao menos um pedestal fixado na dita base de aparelho;ao menos um tubo cilíndrico reservatório;ao menos um tubo cilíndrico de separação;ao menos uma mangueira plástica de comunicação;ao menos uma placa porosa provida no interior do tubocilíndrico de separação;ao menos uma mangueira-ladrão; erecipiente de coleta possuindo um orifício pararecebimento de uma mangueira-ladrão;onde o tubo cilíndrico reservatório é arranjado em umaaltura superior ao tubo cilíndrico de separação e ditamangueira possui uma extremidade conectada na parteinferior do tubo cilíndrico reservatório e a outraextremidade conectada na parte inferior do tubo cilíndricode separação.

2. Aparelho de acordo com a . reivindicação 1caracterizado por ser serem providos ao menos doispedestais, onde um pedestal de maior altura sustenta o tubocilíndrico reservatório e um pedestal de menor alturasustenta o tubo reservatório de separação.

3. Aparelho de acordo com a reivindicação 1caracterizado por na saida do tubo cilíndrico reservatórioser provido um dosador de gotas possuindo uma mangueiraplástica conectada ao tubo cilíndrico de separação.

4. Aparelho de acordo com a reivindicação 1caracterizado por serem providos vários pedestais, ondepedestais de maior altura sustentam tubos cilíndricosreservatórios e pedestais de menor altura sustentam tubosreservatórios de separação.

5. Processo para diagnóstico parasitológico daesquistossomose mansoni realizado no aparelho conformedefinido nas reivindicações de 1 a 4 caracterizado porcompreender as seguintes etapas:(a) filtração da amostra de fezes;(b) enchimento do tubo cilíndrico reservatório comsolução salina;(c) diluição e homogeneização da amostra de fezes emuma solução salina, formando uma suspensão fecal;(d) colocação da suspensão fecal no tubo cilíndrico deseparação;onde a solução salina sai do tubo cilíndrico reservatório,preenche uma mangueira de comunicação e entra no tubo deseparação, sendo que um fluxo continuo e homogêneo desolução salina provoca a suspensão da coluna fecal, de talmaneira que após 15-20 minutos, o material fecal começa aser drenado pela mangueira-ladrão e descartado norecipiente de coleta e os ovos, mais pesados, ficam nasuperfície da placa porosa.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5caracterizado por o material fecal ser previamente fixadocom formol a 10% na proporção de uma parte de amostra paraquatro partes do fixador.