BRPI0708331A2

BRPI0708331A2 - compostos de pirimidinil sulfonamida que inibem a adesão leucocitária mediada por vla-4

Info

Publication number: BRPI0708331A2
Application number: BRPI0708331-9A
Authority: BR
Inventors: L Smith; Semko Christopher; Ying-Zi Xu; Andrei W Konradi
Original assignee: Elan Pharm Inc
Priority date: 2006-02-27
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2011-05-24
Also published as: JP5135235B2; KR20080100271A; AU2007220068B2; EA017110B1; NO20083743L; IL193425A0; US20100016345A1; US20080058357A1; WO2007101165A1; AU2007220068A1; TW200811142A; IL193425A; EP1996559A1; ZA200807188B; AR059671A1; NZ570679A; CN101389611B; US7579466B2; JP2009528296A; MA30318B1

Abstract

COMPOSTOS DE PIRIMIDINIL SULFONAMIDA QUE INIBEM A ADESAO LEUCOCITARIA MEDIADA POR VLA-4 São revelados compostos, que se ligam a VLA-4. Certos desses compostos também inibem a adesão leucocitária e, em particular, adesão leucocitária mediada por VLA-4. Tais compostos são úteis no tratamento de doenças inflamatórias em um ser humano ou animal, como asma, doença de Alzheimer, aterosclerose, demência da AIDS, diabetes, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, artrite reumatóide, transplante de tecidos, metastase tumoral, e isquemia miocárdica. Os compostos também podem ser administrados para o tratamento de doenças cerebrais inflamatórias como esclerose múltipla.

Description

COMPOSTOS DE PIRIMIDINIL SULFONAMIDA QUE INIBEM A ADESÃOLEUCOCITÁRIA MEDIADA POR VLA-4

Fundamento da invenção

Este pedido reivindica prioridade do Pedido de PatenteProvisório U.S. No. 60/777.595, depositado em 27 defevereiro de 2006, cuja revelação é aqui incorporada em suatotalidade por referência.

Campo da invenção

Essa invenção relaciona-se a compostos que inibemadesão leucocitária e, em particular, adesão leucocitáriamediada por a4-integrinas, em que a a4-integrina épreferivelmente VLA-4. Essa invenção também relaciona-se acomposições farmacêuticas que compreendem tais compostosbem como métodos para o tratamento, por exemplo, deinflamação, com o uso dos compostos ou as composiçõesfarmacêuticas dessa invenção.Referências

As seguintes publicações são citadas nesse pedido comonúmeros sobrescritos:

1 Hemler and Takada, Publicação de Pedido de Patente IEuropéia No. 330.506, publicado em 30 de agosto de 1989

2 Elices, e cols., Cell, 60:577 584 (1990)

3 Springer, Nature, 346:425 434 (1990)

4 Osborn, Cell, 62:3 6 (1990)

5 Vedder, e cols., Surgery, 106:509 (1989)

6 Pretolani, e cols., J. Exp. Med., 180:795 (1994)

7 Abraham, e cols., J. Clin. Invest., 93:776 (1994)

8 Mulligan, e cols.Y-J. Immunology, 150:2407 (1993)

9 Cybulskyf e cols., Science, 251:788 (1991)

10 Li, e cols., Arterioscler. Thromb., 13:197 (1993)11 Sasseville, e cols., Am. J. Path., 144:27 (1994)

12 Yang, e cols., Proc. Nat. Acad. Science (USA),90:10494 (1993)

13 Burkly, e cols., Diabetes, 43:529 (1994)

14 Baron, e cols., J. Clin. Invest., 93:1700 (1994)

15 Hamann, e cols., J. Immunology, 152:3238 (1994)

16 Yednock, e cols., Nature, 356:63 (1992)

17 Baron, e cols., J. Exp. Med., 177:57 (1993)

18 van Dinther-Janssen, e cols., J. Immunology, 147:4207(1991)

19 van Dinther-Janssen, e cols., Annals. Rheumatic Dis.,52:672 (1993)

20 Elices, e cols., J. Clin. Invest., 93:405 (1994)

21 Postigo, e cols., J. Clin. Invest., 89:1445 (1991)

22 Paul, e cols., Transpl. Proceed., 25:813 (1993)

23 Okarhara, e cols., Can. Res., 54:3233 (1994) '

24 Paavonen, e cols., Int. J. Can., 58:298 (1994)

25 Schadendorf, e cols., J. Path., 170:429 (1993)

26 Bao, e cols., Diff., 52:239 (1993)

27 Lauri, e cols., British J. Câncer, 68:862 (1993)

28 Kawaguchi, e cols., Japanese J. Câncer Res., 83:1304(1992)

29 Konradi, e cols., PCT/US00/01686, filed, January 21,2000

Todas as publicações acima são aqui incorporadas emsua totalidade por referência na mesma extensão como secada publicação individual fosse especificamente eindividualmente indicada como sendo incorporada em suatotalidade por referência.Estado da técnica

VLA-4 (também referida como α4β1 integrina eCD4 9d/CD2 9), primeiramente identificada por Hemler andTakada,1 é um membro da família de β1 integrina dosreceptores de superfície celular, cada uma compreende duassubunidades, uma cadeia α e uma cadeia β. VLA-4 contém umacadeia a4 e uma cadeia β1. há pelo menos nove β1integrinas, tordas partilham a mesma cadeia β e cada umtem ma cadeia α distinta. Esses nove receptores todos seligam a um diferente complemento das várias moléculas dematriz celular, como fibronectina, laminina, e colágeno.VLA-4, por exemplo, se liga a fibronectina. VLA-4 também seliga a moléculas de não matriz que são expressas pelascélulas endoteliais e outras. Essas moléculas não matrizesincluem VCAM-1, que é expressa em células endoteliais daveia umbilical humana ativadas por citocina em cultura.Epitopos distintos de VLA-4 são responsáveis pelafibronectina e atividades de ligação de VCAM-I e cadaatividade mostrou ser inibida independentemente.2

A adesão intercelular mediada por VLA-4 e outrosreceptores de superfície celular é associada inúmerasrespostas inf lamatórias. No local d eum dano ou de outroestímulo inflamatório, as células endoteliais vascularesativadas expressam moléculas que são adesivas paraleucócitos. A mecânica da adesão leucocitária a célulasendoteliais envolve, em parte, o reconhecimento e ligaçãode receptores de superfície celular em leucócitos para asmoléculas de superfície celular correspondentes em célulasendoteliais. Uma vez ligados, os leucócitos migram por todaa parede do vaso sangüíneo para entrar no local danificadoe liberar mediadores químicos para combater a infecção.Para revisões de receptores de adesão do sistema imune,veja, por exemplo, Springer3 e Osborn.4

Distúrbios inflamatórios cerebrais, comoencefalomielite autoimune experimental (EAE), esclerosemúltipla (MS) e meningite, são exemplos de distúrbios dsistema nervoso central em que o mecanismo de adesão deendotélio/leucocitária resulta na destruição do tecidocerebral sadio. Grandes números de leucócitos migramatravés da barreira hematencefálica (BBB) em indivíduos comessas doenças inflamatórias. Os leucócitos liberammediadores tóxicos que causam extensivo dano tecidual queresulta em condução nervosa prejudicada e paralisia.

Em outros sistemas de órgãos, o dano tecidual tambémocorre por meio de um mecanismo de adesão que resulta namigração ou ativação de leucócitos. Por exemplo, foiconstatado que o dano inicial após isquemia miocárdica aotecido cardíaco pode ser também complicado por entrada deleucócitos no tecido danificado causando ainda um danomaior (Vedder, e cols.).5 Outras condições inflamatórias oumédicas mediadas por um mecanismo de adesão incluem, porvia de exemplo, asma,6"8 doença de Alzheimer,aterosclerose,9-10 demência de AIDS,11 diabetes12"14 (incluindodiabetes de surgimento juvenil aguda), doença intestinalinflamatória15 (incluindo colite ulcerativa e doença deCrohn) , esclerose múltipla,16"17 artrite reumatóide,18"21transplante de tecido,22 metástase tumoral,23"28 meningite,encefalite, AVC, e outros traumas cerebrais, nefrite,retinite, dermatite atópica, psoríase, isquemia miocárdicae dano pulmonar agudo mediado por leucócito como aquele queocorre em síndrome da angústia respiratória do adulto.

Aminopirimidina substituída, como uma classe, foirevelada como inibindo a ligacao de VLA-4 a VCAM-I e,portanto, exibe propriedades antiinflamatórias.29 Emboraesses compostos possuam propriedades antagonistas a talligação, a melhor biodisponibilidade desses compostosaumenta a sua eficácia.

Sumário da invenção

Essa invenção fornece compostos, sais e ésteresfarmaceuticamente aceitáveis desses, composições desses,síntese desses e métodos para o tratamento de doençasmediadas por VLA-4. Com base nos dados in vivo para aquelescompostos dessa invenção, que foram assim avaliados, essescompostos exibem melhor biodisponibilidade quando liberadospor via oral como medido por análise da área sob a curva(AUC) convencional.

Em uma modalidade, a presente invenção fornececompostos de formula I:

<formula>formula see original document page 6</formula>

em que:

R1 é selecionado do grupo que consiste em Ci a C4alquil e Ci a C4 haloalquil; e

R2 é selecionado do grupo que consiste em Ci a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-C6cicloalquil;

ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdesses.

Em algumas modalidades, R1 é Ci a C2 alquil. Em outrasmodalidades, R1 é metil ou trifluormetil. Ainda em outrasmodalidades, R1 é metil.

Em algumas modalidades, R2 é C1 a C4 alquil. Em outrasmodalidades, R2 é Cl Ci a C3 alquil. Ainda em outrasmodalidades, R2 é metil, etil, isopropil ou n-propil. Emuma outra modalidade R2 é metil ou etil, e ainda em outramodalidade, R2 é isopropil.

Em algumas modalidades, R2 é C3 a C6 cicloalquil. Emoutras modalidades, R2 é ciclopentil.

Em algumas modalidades, R2 é C2 a C4 alquenil. Emoutras modalidades, R2 é alil.

Em algumas modalidades, R2 é C2 a C4 alquinil. Emoutras modalidades, R2 é propargil.

Exemplos de compostos dessa invenção incluem aquelesque têm os grupos R1 e R2 citados na Tabela 1 (incluindosais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis desses).

Tabela 1

<table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table>

Em uma outra modalidade, a presente invenção forneceum composto de fórmula II:

<formula>formula see original document page 8</formula>

em que:

ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdesses.

Em algumas modalidades, R2 é C1 a C4 alquil. Em outrasmodalidades, R2 é é C1 a C3 alquil. Ainda em outrasmodalidades, R2 é metil, etil, isopropil ou n-propil. Emuma outra modalidade R2 é metil ou etil, e ainda em umaoutra modalidade, R2 é isopropil.

Exemplos de compostos dessa invenção incluem aquelesque têm os grupos R1 e R2 citados na Tabela 2 (incluindosais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis desses).

Tabela 2

<table>table see original document page 9</column></row><table><table>table see original document page 10</column></row><table>

Substituições orto e meta do grupopirrolidinilcarboniloxi na anel fenil estão também dentrodo escopo dessa invenção.

Essa invenção também fornece os compostos na tabela 3bem como seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdesses.

Tabela 3

<table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table><formula>formula see original document page 12</formula>

Em um outro aspecto, essa invenção fornece composiçõesfarmacêuticas que compreendem um veiculo farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oumais dos compostos aqui definidos.

Em um de seus aspectos do método, essa invenção édirecionada a um método para o tratamento de uma doençamediada pelo menos em parte por a.4 integrina,preferivelmente VLA-4, em um paciente, cujo métodocompreende a administração de uma composição farmacêuticaque compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e umaquantidade terapeuticamente eficaz . de um ou mais doscompostos dessa invenção.

Os compostos e composições farmacêuticas dessainvenção são úteis para o tratamento de condições de doençamediada pelo menos em parte por a4 integrinas, em que a a4integrina é preferivelmente VLA-4 ou adesão de leucócito.Tais condições de doença incluem, por via de exemplo, asma,doença de Alzheimer, aterosclerose, demência de AIDS,diabetes (incluindo diabetes de surgimento juvenil aguda),doença intestinal inflamatória (incluindo colite ulcerativae doença de Crohn), esclerose múltipla, artrite reumatóide,transplante de tecido, metástase tumoral, meningite,encefalite, AVC, e outros traumas cerebrais, nefrite,retinite, dermatite atópica, psoríase, isquemia miocárdicae dano pulmonar agudo mediado por leucócito como aquele queocorre em síndrome da angústia respiratória do adulto.

Outras condições de doença incluem, sem limitação,condições inflamatórias como eritema nodoso, conjuntivitealérgica, neurite ótica, uveíte, rinite alérgica,espondilite anquilosante, artrite psoriática, vasculite,síndrome de Reiter, lupus eritematoso disseminado,esclerose sistêmica progressiva, polimiosite,dermatomiosite, granulomatose de Wegner, aortite,sarcoidose, linfocitopenia, arterite temporal, pericardite,miocardite, insuficiência cardíaca congestiva, poliarteritenodosa, síndromes de hipersensibilidade, alergia, síndromeshipereosinofílicas, síndrome de Churg-Strauss, doençapulmonar obstrutiva crônica, pneumonite dehipersensibilidade, hepatite ativa crônica, cistiteintersticial, insuficiência endócrina autoimune, cirrosebiliar primária, anemia aplástica autoimune, hepatitepersistente crônica e tireoidite.

Em uma modalidade, a condição de doença mediada por a4integrina é uma doença inflamatória.

Em uma outra modalidade, a condição de doença é umadoença autoimune.

Em algumas modalidades, a doença é selecionada deasma, esclerose múltipla e doença intestinal inflamatória.Em outras modalidades a doença é doença de Crohn. Ainda emoutra modalidades a doença é artrite reumatóide.

Em um outro aspecto, essa invenção fornece um métodopara a preparação de um comoosto de fórmula I:

<formula>formula see original document page 14</formula>

Em que:

R2 é selecionado do grupo que consiste em Ci a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-Cscicloalquil;

ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdesses,

cujo método compreende:

a) o contato de um composto de fórmula III

<formula>formula see original document page 15</formula>

em que Pg é um grupo de proteção de carboxil;

com um Ci a C4 aldeído ou cetona, um C2 a C4 alquenilaldeido ou cetona, C2 a C4 alquinil aldeído ou cetona, C3-Cecicloalquil cetona e benzaldeído sob condições de aminaçãoredutoras para fornecer um composto de fórmula IV:

<formula>formula see original document page 15</formula>

b) o contato do composto IV com um haleto desulfonila de fórmula R1SO2Z

em que Z é halo sob condições para formar um composto de

fórmula V:

<formula>formula see original document page 15</formula>e

c) remoção do grupo de proteção de carboxil para fornecerum composto de fórmula I.

Em um outro aspecto, essa invenção fornece um métodopara a preparação de um composto de fórmula I

<formula>formula see original document page 16</formula>

Em que:

R1 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil e C1 a C4 haloalquil; e

R2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-C6cicloalquil;

ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdesses,

cujo método compreende:

o contato de um composto de fórmula VI

<formula>formula see original document page 16</formula>

em que Pg é um grupo de proteção de carboxil;

com um excesso de RSO2X para fornecer um composto defórmula VII:<formula>formula see original document page 17</formula>

b) remoção seletiva de um único grupo -SO2R' docomposto de fórmula VII para fornecer um composto defórmula VIII:

<formula>formula see original document page 17</formula>

c) contato do composto VIII com um agente dealquilação com uma fórmula R2-X, em que X é halo, ou comdimetilsulfato quando R2 é metil, para formar um compostode fórmula IX:

<formula>formula see original document page 17</formula>

d) remoção do grupo de proteção de carboxil parafornecer um composto de fórmula I.

Descrição detalhada da invenção

Como acima determinado, essa invenção relaciona-se acompostos que inibem adesão leucocitária e, em particular,adesão leucocitária mediada pelo menos em parte por a4integrinas, preferivelmente VLA-4. No entanto, antes dadescrição dessa invenção em maiores detalhes, os seguintestermos serão primeiramente definidos.Definições

A menos que determinado de outra forma, os seguintestermos usados na especificação e reivindicações têm ossignificados dados abaixo:

Como aqui usado e a menos que definido de outra forma,"alquil" refere-se a grupos hidrocarbil monovalenteslineares e ramificados que têm de 1 a 4 átomos de carbono epreferivelmente 1 a 3 átomos de carbono, esse termo éexemplificado por grupos como metil, etil, n-propil, iso-propil, n-butil, iso-butil, sec-butil, e t-butil.

"Alquenil" refere-se a grupos hidrocarbilmonovalentes lineares ou ramificados de 2 a 4 átomos decarbono e pref erivelmente 2 a 3 átomos de carbono e tendopelo menos 1 e pref erivelmente 1 sítio de insaturação devinil (>C=C<) . Exemplos de tais grupos alquenil incluemvinil (-CH=CH2), alil (-CH2CH=CH2), n-propen-l-il (-CH=CHCH3), n-buten-2-il (-CH2CH=CHCH3), e outros. Incluídosnesse termo estão os isômeros eis e trans ou misturasdesses isômeros.

"Alquinil" refere-se a grupos hidrocarbil monovalenteslineares ou ramificados que têm de 2 a 4 átomos de carbonoe preferivelmente 2 a 3 átomos de carbono e tendo pelomenos 1 e preferivelmente 1 sítio de instauraçãoacetilênica -C=C-. Exemplos de tais grupos alquinil incluemacetilenil (-C=CH), propargil (-CH2CsCH), n-propin-l-il (-CH=CHCH3), e outros.

"Halo" ou "halogênio" refere-se a flúor, cloro, bromoe iodo e preferivelmente é flúor ou cloro.

"Haloalquil" refere-se a grupos alquil que têm de 1 a5 grupos halo. Preferivelmente, tais grupos têm de 1 a 3grupos halo e 1 a 2 átomos de carbono. Exemplos de gruposhaloalquil incluem halometil (por exemplo, fluormetil),dihalometil (por exemplo, difluormetil), trihalometil (porexemplo, trifluormetil), halo etil (por exemplo 2-cloroet-l-il), trihalo etil (por exemplo , 2,2,2-trifluoret-l-il),halopropil (por exemplo, 3-cloroprop-l-il e trihalopropil(por exemplo, 3,3,3-trifluorprop-1 -il).

"Veículo farmaceuticamente aceitável" significa umveículo que é útil na preparação de uma composiçãofarmacêutica que é geralmente seguro, não tóxico e nembiologicamente nem indesejável, e inclui um veículo que éaceitável para uso veterinário bem como uso farmacêuticohumano al. "Um veículo farmaceuticamente aceitável" comousado na especificação e reivindicações inclui um e mais deum de tal veículo.

"Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a saisque retêm a eficácia biológica e propriedades os compostosdessa invenção e que não são indesejáveis. Em vários casos,os compostos dessa invenção são capazes de formar sais deácido e/ou base em virtude da presença de grupos amino e/oucarboxil ou grupos similares a eles.

Sais de adição básica farmaceuticamente aceitáveispodem ser preparados a partir de bases inorgânicas eorgânicas. Sais derivados de bases inorgânicas, incluem,por via de exemplo apenas, sais de sódio, potássio, lítio,amônio, cálcio, e magnésio. Sais derivados de basesorgânicas incluem, sem limitação, sais de aminas primárias,secundárias, e terciárias, como alquil aminas, dialquilaminas, trialquil aminas, substituído alquil aminas,di(alquil) aminas substituídas, tri(alquil) aminassubstituídas, alquenil aminas, dialquenil aminas,trialquenil aminas, alquenil aminas substituídas,di(alquenil) aminas substituídas, tri(alquenil) aminassubstituídas, cicloalquil aminas, di(cicloalquil) aminas,tri(cicloalquil)aminas, cicloalquil aminas substituídas,cicloalquil amina dissubstituídas, cicloalquil aminastrissubstituídas, cicloalquenil aminas, di(cicloalquenil)aminas, tri(cicloalquenil) aminas, cicloalquenil aminassubstituídas, cicloalquenil amina dissubstituída,cicloalquenil aminas trissubstituídas, aril aminas, diarilaminas, triaril aminas, heteroaril aminas, diheteroarilaminas, triheteroaril aminas, aminas heterocíclicas, aminasdiheterocíclicas, aminas triheterocíclicas, di- e tri-aminas mistas em que pelo menos dois dos substituintes naamina são diferentes e são selecionados do grupo queconsiste em alquil, substituído alquil, alquenil,substituído alquenil, cicloalquil, cicloalquil substituído,cicloalquenil, cicloalquenil substituído, aril, heteroaril,heterocíclico, e outros. Também são incluídas aminas em queos dois ou três substituintes, junto com o nitrogênio deamino, formam um grupo heterocíclico ou heteroaril.

Exemplos de aminas adequadas incluem, por via deexemplo apenas, isopropilamina, trimetil amina, dietilamina, tri(iso-propil) amina, tri(n-propil) amina,etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, lisina,arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina,colina, betaína, etilenodiamina, glicosamina, N-alquilglucaminas, teobromina, purinas, piperazina,piperidina, morfolina, N-etilpiperidina, e outros. Tambémdeve ser entendido que outros derivados de ácidocarboxílico devem ser úteis na prática dessa invenção, porexemplo, amidas de ácido carboxílico, incluindocarboxamidas, alquil carboxamidas inferiores, dialquilcarboxamidas e outros.

Sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveispodem ser preparados a partir de ácidos inorgânicos eorgânicos. Sais derivados de ácidos inorgânicos incluemácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico,ácido nítrico, ácido fosfórico, e outros. Sais derivados deácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido propiônico,ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácidomálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico,ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácidobenzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácidometanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido salicílico e outros.

0 termo "cátion farmaceuticamente aceitável" refere-seao cátion de um sal farmaceuticamente aceitável.

Entende-se que em todos os grupos substituídos aquidefinidos, polímeros formados pela definição desubstituintes com substituintes adicionais para si mesmos(por exemplo, aril substituído tendo um grupo arilsubstituído como um substituinte que é em si substituídocom um grupo aril substituído etc.) não são aqui incluídos.

Em tais casos, o número máximo de tais substituintes étrês. Ou seja, cada uma das definições acima é restrita poruma limitação, por exemplo, de que grupos aril substituídossão limitados a -aril substituído-(aril b substituído)-(aril substituído).

"tratar" ou "tratamento" de uma doença inclui:

(1) prevenção da doença, ou seja, impedir que ossintomas clínicos de uma doença se desenvolvam em ummamífero que pode ser exposto ou predisposto a uma doençamas que inda não experimenta ou apresenta sintomas dadoença,

(2) inibição da doença, ou seja, impedimento ouredução do desenvolvimento de uma doença ou de seussintomas clínicos, ou

(3) alívio da doença, ou seja, regressão de uma doençaou de seus sintomas clínicos.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa aquantidade de um composto que, quando administrada a ummamífero para o tratamento de uma doença, é suficiente paraefetuar tal tratamento para a doença. A "quantidadeterapeuticamente eficaz" irá variar dependendo do composto,da doença e de sua severidade e da idade, peso etc., domamífero a ser tratado.

Integrinas são uma grande família de proteínas deligante de transmembrana homólogas que são os principaisreceptores nas células animais para ligação da maior partedas proteínas de matriz extracelular, como colágeno,fibronectina, e laminina. As integrinas são heterodímerosque compreendem uma cadeia α e uma cadeia β. Até hoje,vinte diferentes heterodímeros de integrinas, feitos de 9diferentes subunidades α e 14 diferentes subunidades β,foram identificados. O termo "a-4 integrinas" refere-se àclasse de receptores de superfície celular ligados a enzimade heterodímero, que contêm a subunidade a-4 ligada aqualquer uma das subunidades β. VLA-4 é um exemplo e uma a-4 integrina, e é um heterodímero das subunidades a-4 e βΐ,e é também referido como uma α4β1-integrina.

Preparação do Composto

Os compostos dessa invenção podem ser preparados apartir de materiais de iniciação facilmente disponíveis como uso dos métodos e procedimentos gerai a seguir. Deve-seperceber que quando condições de processo típicas oupreferidas (ou seja, temperaturas de reação, tempos,proporções molares dos reagentes, solventes, pressões etc.)são dadas, outras condições de processo também podem serusadas a menos que determinado de outra forma. Condiçõesótimas de reação podem variar com os regentes particularesou solventes usados, mas tais condições podem serdeterminadas por pessoa habilitada na técnica porprocedimentos rotineiros de otimização.

Adicionalmente, como será aparente para aqueleshabilitados na técnica, grupos de proteção convencionaispodem ser necessários para evitar que certos gruposfuncionais passem por reações indesejadas. Grupos deproteção adequados para vários grupos de funcionais bemcomo condições adequadas para grupos funcionaisparticulares de proteção e desproteção são bem conhecidosna técnica. Por exemplo, numerosos grupos de proteção sãodescritos em T. W. Greene e G. M. Wuts, Grupo de proteçãosin Organic Synthesis, segunda edição, Wiley, New York,1991, e referencias aqui citadas.Além disso, os compostos dessa invenção terãotipicamente um ou mais centros quirais. Portanto, sedesejado, tais compostos podem ser preparados ou isoladoscomo estereoisômeros puros, ou seja, como enantiômeros oudiastereômeros individuais, ou como misturas enriquecidascom estereoisômeros. Todos esses estereoisômeros (emisturas enriquecidas) são incluídos no escopo dessainvenção, a menos que indicado de outra forma.Estereoisômeros puros (ou misturas enriquecidas) podem serpreparados com o uso, por exemplo, de materiais e iniciaçãooticamente ativos ou reagentes estereo-seletivos bemconhecidos na técnica. Alternativamente, misturas racêmicasde tais compostos podem ser separadas com o uso, porexemplo, de cromatografia quiral em coluna, agentes deresolução quiral e outros.

A maioria dos compostos dessa invenção foi denominadacom o uso de ChemDraw v. 10.0, (disponível de Cambridgesoftat 100 Cambridge Park Drive, Cambridge, MA 02140).

Em uma modalidade, os compostos dessa invenção podemser preparados como abaixo descrito no esquema 1 em que,para objetivos ilustrativos apenas, R1 é metil e R2 éisopropil.

Esquema 1<formula>formula see original document page 25</formula>

em que Pg é um grupo de proteção de carboxil como benzil,t-butil, e outros.

0 esquema 1 é particularmente útil na preparação decompostos em que R2 é alquil ou cicloalquil.

No Esquema 1, os intermediários de 5-aminopirimidinade iniciação, composto 1.1, são descritos em detalhe naPatente US No. US 7.026.328 Bl e, para objetivo deilustração apenas, são mostrados nesse esquema comoderivados de fenilalanina 4-substituída. Entende-se, defato, que derivados de fenilalanina 2- e 3-substituídadevem seguir uma via de reação similar.

Especificamente, no Esquema 1, 5-amino-2-dietilamino-4-substituída pirimidina, composto 1.1 (preparado de 5-nitro-pirimidina correspondente por redução com 5% Pd/C ou5% PtO2 em peso) reage sob condições de aminação redutivaconvencionais com um leve excesso de um Ci-C4 aldeído oucetona que no Esquema 1 é ilustrado por acetona. No Esquema1, o grupo 5-amino do composto 1.1 forma uma iminaintermediária (não mostrado) que é reduzida, in si tu, àamina correspondente, composto 1.2, por agentes de reduçãoconvencionais como cianoborohidreto de sódio, borohidretode sódio, hidrogênio sobre um catalisador adequado comoPt02, e outros. A reação é conduzida em um diluente inerteadequado como tetrahidrofurano, cloreto de metileno, eoutros. A reação é mantida de cerca de O0C a cerca de 30°Caté a reação estar substancialmente completa o que ocorretipicamente em cerca de 0,5 a 16 horas. Depois do final dareação, o composto 1.2 é recuperado por métodosconvencionais que incluem neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, e outrosou, alternativamente, é empregado na próxima etapa sempurificação e/ou isolamento.

A conversão do grupo amina no composto 1.2 ao grupoalquilsulfonilamido correspondente, composto 1.3, prosseguepor meio de métodos convencionais. Por exemplo, em ummétodo, composto 1.2 faz contato com um leve excesso de umhaleto de alcanossulfonil, como metanocloreto de sulfonila,na presença de uma base adequada como trietilamina,diisopropiletilamina e outros para depurar os ácido gerado.A reação é preferivelmente conduzida em um solvente inerteadequado como tetrahidrofurano, dioxano, clorofórmio eoutros. A reação é preferivelmente conduzida de cerca de -5o a -30°C e é continuada até que a reação estejasubstancialmente completa o que ocorre tipicamente em 0,5 a16 horas. Após o fimda reação, composto 1.3 pode serrecuperado por métodos convencionais que incluemneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e outros ou, alternativamente, éempregado na próxima etapa sem purificação e/ou isolamento.

Haletos de alquilsulfonil são compostos conhecidos oucompostos que podem ser preparados por procedimentossintéticos convencionais. Tais compostos são tipicamentepreparados a partir do ácido sulfônico correspondente, ouseja, dos compostos de fórmula R1-SO3H em que R1 é comoacima definido, com o uso de tricloreto de fósforo epentacloreto de fósforo. A reação é geralmente conduzidapor contato do ácido sulfônico com cerca de 2 a 5equivalentes molares de tricloreto de fósforo oupentacloreto de fósforo, puros ou em um solvente inerte,como diclorometano, em uma temperatura in na faixa de 0°C acerca de 80°C por cerca de 1 a cerca de 48 horas para geraro cloreto de sulfonila. Alternativamente, o cloreto desulfonila pode ser preparado a partir do composto do tiolcorrespondente, ou seja, a partir de compostos de fórmulaR1-SH em que R1 é como acima definido, por tratamento dotiol com cloro (Cl2) e água sob condições de reaçãoconvencionais.

Exemplos de cloretos de sulfonila para uso nessainvenção incluem, mas não são limitados a, metanocloreto desulfonila, etanocloreto de sulfonila, 2-propanecloreto desulfonila, 1-butanocloreto de sulfonila,trifluorometanocloreto de sulfonila, 2,2,2-trifluoroetanocloreto de sulfonila, e outros.

O grupo de proteção de carboxil de composto 1.3 éentão removido por condições convencionais para fornecer ocomposto 1.4, um composto de fórmula I. Em uma modalidade,um grupo de proteção de t-butil pode ser removido porcontato com ácido fórmico. Em uma outra modalidade, umgrupo de proteção de benzi 1 pode ser removido por contatocom hidrogênio na presença de um catalisadorpaládio/carbono tipicamente em um solvente prótico comometanol sob pressão de hidrogênio elevada. Após o fim dareação, composto 1.4 pode ser recuperado por métodosconvencionais que incluem neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, e outros.Em uma outra modalidade, os compostos dessa invençãopodem ser preparados como descrito abaixo no Esquema 2:

<formula>formula see original document page 28</formula>

Esquema 2

Em que R1 e R2 são como aqui definido; Pg é um grupode proteção de carboxil e X é halo.

No Esquema 2, os intermediários de 5-aminopirimidinainiciais, composto 1.1, são descritos em detalhe na PatenteUS No. US 7.026.328 Bl e, para o objetivo de ilustraçãoapenas, são mostrados nesse esquema como derivados defenilalanina 4-substituída. Entende-se, de fato, quederivados de fenilalanina 2- e 3-substituída devem seguiruma via de reação similar.Especificamente, no Esquema 2, pirimidina 5-amino-2-dietilamino-4-substituída, composto 1.1 (preparada a partirde 5-nitro-pirimidina correspondente por redução com 5%Pd/C ou 5% PtO2 em peso) reage com um leve excesso de umR1-Sulfonil haleto, como metanocloreto de sulfonila, napresença de uma base adequada como trietilamina,diisopropiletilamina e outros para depurar o ácido gerado.A reação é preferivelmente conduzida em um solvente inerteadequado como tetrahidrofurano, dioxano, diclorometano,clorofórmio e outros. A reação é preferivelmente conduzidade cerca de -5o a 30°C e é continuada até que a reaçãoesteja substancialmente completa o que ocorre tipicamenteem 0,5 a 16 horas. Após o fim da reação, o composto 1.5pode ser recuperado por métodos convencionais que incluemneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e outros ou, alternativamente, éempregado na próxima etapa sem purificação e/ou isolamento.

A remoção seletiva de um único grupo R1 SO2- docomposto 1.5 prossegue sob condições convencionais. Porexemplo, a reação do composto 1.5 com base em um solventeprótico como metanol, etanol, ou água, opcionalmente napresença de THF e outros, por exemplo uma mistura a 1:1 demetanol/tetrahidrofurano ou mistura a 1:1 deágua/tetrahidrofurano fornece o composto 1.6. A mistura dereação compreende um excesso de uma base adequada comocarbonato de potássio, carbonato de sódio e outros e areação é preferivelmente mantidas em temperaturas elevadascomo 20° a 60°C. A reação é continuada até estarsubstancialmente completa o que ocorre tipicamente em 24-144 horas. Após o fim da reação, composto 1.6 pode serrecuperado por métodos convencionais que incluemneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e outros ou, alternativamente, éempregado na próxima etapa sem purificação e/ou isolamento.

A reação do composto 1.6 com um excesso de um haletode alquila, um sulfato de dialquila, um haleto dealquenila, um haleto de alquinila, ou um haleto decicloalquila (ou seja, X-R2- o "composto de haleto")prossegue sob condições convencionais para fornecer ocomposto 1.7. A reação é tipicamente conduzida por contatodo composto 1.6 com de cerca de 1,1 a 20 equivalentes docomposto de haleto em um diluente inerte como acetona,clorofórmio, cloreto de metileno e outros na presença de abase como carbonato de potássio, trietilamina e outros paradepurar o ácido gerado durante a reação. A reação épref erivelmente conduzida em cerca de 20° a 60°C e écontinuada até que a reação esteja substancialmentecompleta o que ocorre tipicamente em 0,1 a 16 horas. Após ofim da reação, o composto 1.6 pode ser recuperado pormétodos convencionais que incluem neutralização,evaporação, extração, precipitação, cromatografia,filtração, e outros ou, alternativamente, é empregado napróxima etapa sem purificação e/ou isolamento.

0 grupo de proteção de carboxil do composto 1.7 éentão removido por condições convencionais para fornecer ocomposto 1.8, um composto de fórmula I. Em uma modalidade,um grupo de proteção de t-butil pode ser removido porcontato com ácido fórmico. Em uma outra modalidade, umgrupo de proteção de benzi 1 pode ser removido por contatocom hidrogênio na presença de um catalisador de paládiocarbono tipicamente em um solvente prótico como metanolsob pressões elevadas de hidrogênio. Após o fim da reação,o composto 1.8 pode ser recuperado por métodosconvencionais que incluem neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, e outros.

Ainda em uma outra modalidade, os compostos dessainvenção podem ser preparados como descrito abaixo noEsauema 3:

<formula>formula see original document page 31</formula>

Esquema 3

Em que R1 é como acima definido, Pg é um grupo deproteção de carboxil como benzil, t-butil, e outros e R2' éum grupo alquil, alquenil, alquinil, ou fenilalquileno quetem uma porção CH2 anexada ao grupo iodo.

No Esquema 1, os intermediários de 5-aminopirimidinade iniciação, composto 1.1, são descritos em detalhe naPatente US No 7.026.328 Bl e, para objetivo de ilustraçãoapenas, são mostrados nesse esquema como derivados defenilalanina 4-substituída. Entende-se, de fato, quederivados de fenilalanina 2- e 3-substituída devem seguiruma via de reação similar.

Especificamente, no Esquema 1,5-amino-2-dietilamino-4-substituída pirimidina, composto 1.1 (preparada a partir de5-nitro-pirimidina correspondente por redução com 5% Pd/Cou 5% PtO2 em peso) é convertida à trif luoracetamidacorrespondente, composto 1.8, por métodos convencionais.Por exemplo, um leve excesso de anidrido trifluoracético écombinado com composto 1.1 em um diluente inerte adequadocomo tetrahidrofurano, cloreto de metileno, piridina, eoutros. A reação é mantida em cerca de O0C a cerca de 30°Caté que a reação esteja substancialmente completa o queocorre tipicamente em cerca de 0,5 a 24 horas. Após o fimda reação, o composto 1.8 é recuperado por métodosconvencionais que incluem neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, e outrosou, alternativamente, é empregado na próxima etapa sempurificação e/ou isolamento.

A conversão do composto 1.8 à N (R2'), N-trifluoracetamidopirimidina correspondente, composto 1.9,novamente prossegue por meio de técnicas convencionais. Porexemplo, um excesso do haleto, R2'-I, é combinada comcomposto 1.8 em um diluente inerte adequado como DMF napresença de um excesso de uma base adequada como carbonatode potássio. Em uma modalidade, aproximadamente doisequivalentes de R2'-! e carbonato de potássio sãoempregados. A reação é mantida sob condições ambientes emum recipiente selado e é continuada até que a reação estejasubstancialmente completa o que ocorre tipicamente em 20-72horas. Após o fim da reação, o composto 1.9 é recuperadopor métodos convencionais que incluem neutralização,evaporação, extração, precipitação, cromatografia,filtração, e outros ou, alternativamente, é empregado napróxima etapa sem purificação e/ou isolamento.

O grupo trifluoracetil é então removido para fornecera amina correspondente, composto 1.10. Nessa modalidade, ogrupo trif luoracetil age como um grupo de proteção deamina. Como acima, essa reação prossegue convencionalmente,por exemplo, por contato de um composto 1.9 com um grandeexcesso de uma base adequada como carbonato de potássio emuma mistura de água e um solvente prótico como metanol. Areação é conduzida em temperaturas elevadas como 40° a 60°Ce é continuada até que a reação esteja substancialmentecompleta. Após o fim da reação, o composto 1.10 érecuperado por métodos convencionais que incluemneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e outros ou, alternativamente, éempregado na próxima etapa sem purificação e/ou isolamento.

A seguir, a conversão do grupo amina no composto 1.10ao grupo alquilsulfonilamido correspondente, composto 1.11,prossegue via métodos convencionais. Por exemplo, em ummétodo, o composto 1.10 faz contato com um leve excesso deum haleto de alquilsulfonila na presença de uma baseadequada como trietilamina, diisopropiletilamina e outrospara depurar o ácido gerado. A reação é preferivelmenteconduzida em um solvente inerte adequado comotetrahidrofurano, dioxano, clorofórmio e outros. A reação épreferivelmente conduzida de cerca de 0o a 30°C e écontinuada até que a reação esteja substancialmentecompleta o que ocorre tipicamente em 2-48 horas. Após o fimda reação, o composto 1.11 pode ser recuperado por métodosconvencionais que incluem neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, e outrosou, alternativamente, é empregado na próxima etapa sempurificação e/ou isolamento.

O grupo de proteção de carboxil de composto 1.11 podeser removido por condições convencionais para fornecer ocomposto 1.12, um composto de fórmula I. Em uma modalidade,um grupo de proteção de t-butil pode ser removido porcontato com ácido fórmico. Em uma outra modalidade, umgrupo de proteção de benzil pode ser removido por contatocom hidrogênio na presença de um catalisador de paládio/carbono tipicamente em um solvente prótico como metanolsob pressões elevadas de hidrogênio. Após o fim da reação,o composto 1.12 pode ser recuperado por métodosconvencionais que incluem neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, e outros.

A invenção também inclui ésteres dos compostos dessainvenção. A preparação de ésteres é ilustrada nos váriosesquemas acima descritos, como no Esquema 1, (composto1.3), no Esquema 2 (composto 1.7), e no Esquema 3 (composto1.11). Além disso, o Exemplo 1 descreve a preparação de(S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino)-5- (N-isopropilmetilsulfonamido)-pirimidin-4-ilamino)-3-oxopropil)fenil pirrolidina-l-carboxilato, e o Exemplo 4descreve a preparação de (S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino) -5- (Ν- (prop-2-inil) metilsulf onamido) pirimidin-

4-ilamino) -3-oxopropil) fenil pirrolidina-l-carboxilate .

Esteres dos ácidos dessa invenção também podem serpreparados a partir dos ácidos por vias bem conhecidas natécnica. Por exemplo, ésteres metílicos de aminoácido podemser preparados com o uso do método de Brenner and Huber,Hely. Chim. Acta 1953, 36, 1109.

Formulações farmacêuticas

Quando empregadas como fármacos, os compostos dessainvenção são comumente administrados na forma decomposições farmacêuticas. Esses compostos podem seradministrados por vária vias que incluem oral, retal,transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, eintranasal. Esses compostos são eficazes tanto comocomposições injetáveis quanto orais. Tais composições sãopreparadas em uma maneira bem conhecida na técnicafarmacêutica e compreendem pelo menos um composto ativo.

Essa invenção também inclui composições farmacêuticasque contêm, como o ingrediente ativo, um ou mais doscompostos de fórmula I-II acima associados com veículosfarmaceuticamente aceitáveis. Na confecção das composiçõesdessa invenção, o ingrediente ativo é comumente misturadocom um excipiente, diluídas por um excipiente ou incluídosem um tal veículo que pode estar na forma de um recipientede cápsula, sachê, papel ou outros. O excipiente empregadoé tipicamente um excipiente adequado para administração aindivíduos humanos ou outros mamíferos. Quando o excipienteserve como um diluente, ele pode ser um material sólido,semi-sólido, ou líquidos, que age como um veículo,transportador ou meio para o ingrediente ativo. Portanto,as composições podem estar na forma de comprimidos,pílulas, pós, losangos, sachês, cápsulas, elixires,suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como ummeio sólido ou em um meio líquido), pomadas que contêm porexemplo, até 10% em peso do composto ativo, cápsulas degelatina macia ou dura, supositórios, soluções injetáveisestéreis, e pós embalados estéreis.

Na preparação de uma formulação, pode ser necessáriomoer o composto ativo para fornecer o tamanho de partículaadequado antes da combinação dele com outros ingredientes.Se o composto ativo é substancialmente insolúvel, ele écomumente moído a um tamanho de partícula de menos que a200 mesh. Se o composto ativo é substancialmentehidrossolúvel, o tamanho de partícula é normalmenteajustado or moagem para fornecer uma distribuiçãosubstancialmente uniforme na formulação, por exemplo, cerca -de 40 mesh.

Alguns exemplos de excipientes adequados incluemlactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos,goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto,gelatina, sílicato de cálcio, celulose microcristalina,polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, e metilcelulose. As formulações podem inluir adicionalmente:agentes lubrificantes como talco, estearato de magnésio, eóleo mineral; agentes umectantes; agentes emulsificantes ede suspensão; agentes conservantes como metil- epropilhidroxi-benzoatos; agentes adoçantes; e agentesflavorizantes. As composições da invenção podem serformuladas de modo a fornecer liberação rápida, sustentadaou retardada do ingrediente ativo após a administração aopaciente por emprego de procedimentos conhecidos natécnica.

A administração de agentes terapêuticos por formulaçãointravenosa é bem conhecida na indústria farmacêutica. Umaformulação intravenosa deve possuir certas qualidades alémde ser apenas uma composição em que o agente terapêutico ésolúvel. Por exemplo, a formulação deve promover aestabilidade geral do ingrediente ativo(s), também, aprodução da formulação deve te3r um custo eficaz. Todosesses fatores finalmente determinam o sucesso geral eutilidade de uma formulação intravenosa.

Outros aditivos auxiliares que podem ser incluídos nasFormulações farmacêuticas de compostos da presente invençãosão como se segue: solventes: etanol, glicerol, propilenoglicol; estabilizantes: ácido etileno diamina tetraacético(EDTA), ácido cítrico; conservantes antimicrobianos: álcoolbenzilico, metil parabeno, propil parabeno; agentes detamponamento: ácido cítrico/citrato de sódio, tartrato dehidrogênio potássio, tartrato de hidrogênio sódio, ácidoacético/acetato de sódio, ácido maleico/maleato de sódio,ftalato de hidrogênio sódio, ácido fosfórico /fosfatodihidrogênio potássio, ácido fosfórico/ fosfato hidrogêniodissódico; e modificadores de tonicidade: cloreto de sódio,manitol, dextrose.

A presença de um tampão pode ser necessária paramanter o pH aquoso na faixa de cerca de 4 a cerca de 8 emais preferivelmente em uma faixa de cerca de 4 a cerca de6. O sistema de tampão é geralmente uma mistura de um ácidofraco e um sal solúvel desse, por exemplo, citrato desódio/ácido cítrico; ou o monocátion ou sal de dicátion deum ácido dibásico, por exemplo, tartrato de hidrogêniopotássio; tartrato de hidrogênio sódio, ácido fosfóricofosfato de dihidrogênio potássico, e ácido fosfórico /fosfato de hidrogênio dissódico.

A quantidade de sistema tampão usada é dependente (1)do pH desejado; e (2) da quantidade de medicamento.Geralmente, a quantidade de tampão usada está em umaproporção molar de 0,5:1 a 50:1 de tampão:medicamento (emque os moles de tampão são tomados como os moles combinadosdos ingredientes do tampão, por exemplo, citrato de sódio eácido cítrico) de formulação para manter um pH na faixa de4 a 8 e geralmente, uma proporção molar de 1:1 a 10:1 detampão (combinada) para medicamento presente é usada.

Um tampão útil na invenção é citrato de sódio ácidocítrico na faixa de 5 a 50 mg por mL de citrato de sódio a1 a 15 mg por mL de ácido cítrico, suficiente para manterum pH aquoso de 4-6 da composição.

0 agente de tampão também pode estar presente paraevitar a precipitação do medicamento por toda a formação decomplexo de metal solúvel com íons de metal dissolvidos,por exemplo, Ca, Mg, Fe, Al, Ba, que pode passa através dosrecipientes de vidro ou tampa de borracha ou estar presenteem água de torneira. 0 agente pode agir como um agente decomplexação competitiva com o medicamento e produzir umcomplexo de metal solúvel que leva à presença departiculados indesejáveis.

Em adição, a presença de um agente, por exemplo,cloreto de sódio em uma quantidade de cerca de 1-8 mg/mL,para ajustar a tonicidade ao mesmo valor de sangue humanopode ser necessária para evitar o aumento de volume ouencolhimento de eritrócitos após a administração daformulação intravenosa que leva a efeitos colateraisindesejáveis como náusea ou diarréia e possivelmente adistúrbios sangüíneos associados. Em geral, a tonicidade daformulação está de acordo com aquela de sangue humano queestá na faixa de 282 a 288 mOsm/kg, e é em geral de 285mOsm/kg , que é equivalente ã pressão osmótica quecorresponde a uma solução a 0,9% de cloreto de sódio.

A formulação intravenosa pode ser administrada porinjeção intravenosa direta, em bolo i.v., ou pode seradministrada por infusão por adição a uma solução deinfusão adequada como injeção de cloreto de sódio a 0,9% ououtra solução e infusão compatível.

As composições são preferivelmente formuladas em jumaforma de dosagem unitária oral, cada dosagem contendo decerca de 1 a cerca de 250 mg, mais comumente de cerca de 5a cerca de 100 mg, por exemplo cerca de 10 a cerca de 30mg, do ingrediente ativo. O termo "formas de dosagemunitárias" refere-se a unidades fisicamente distintasadequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos eoutros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidadepredeterminada de material ativo calculada para produzir oefeito terapêutico desejado, em associação com umexcipiente farmacêutico adequado.

O composto ativo é eficaz por uma ampla faixa dedosagem e é geralmente administrado em uma quantidadefarmaceuticamente eficaz. Será entendido, no entanto, que aquantidade do composto realmente administrada serádeterminada por um medido, em vista das circunstânciasrelevantes, que incluem a condição a ser tratada, a via deadministração escolhida, o composto real administrado, aidade, peso, e resposta do paciente individual, daseveridade dos sintomas do paciente, e outros.

Para a preparação de composições sólidas comocomprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com fum excipiente farmacêutico para formar uma composição depré-formulação sólida que contém uma mistura homogênea deum composto da presente invenção. Quando em referencia aessas composições de pré-formulação como homogêneas,entende-se que o ingrediente ativo seja dispersouniformemente por toda a composição de modo que acomposição possa ser facilmente subdividida em formas dedosagem unitárias igualmente eficazes como comprimidos,pílulas e cápsulas. Essa pré-formulação sólida é entãosubdividida em formas de dosagem unitárias do tipo acimadescrito contendo, por exemplo, de 0,1 a cerca de 500 mg doingrediente ativo da presente invenção.

Os comprimidos ou pílulas da presente invenção podemser revestidos ou compostos para fornecer uma forma dedosagem que gera a vantagem de ação prolongada. Porexemplo, o comprimido ou pílula pode compreender umcomponente de dosagem interno e um componente de dosagemexterno, o último estando na forma de um envelope sobre oprimeiro. Os dois componentes podem ser separados por umacamada entérica que serve para resistir à desintegração noestomago e permitem que o componente interno passe intactono duodeno ou que tenha a liberação retardada. Váriosmateriais podem ser usados para tais camadas ourevestimentos entéricos, tais materiais incluindo inúmerosácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos comtais materiais como goma-laca, álcool cetílico, e acetatode celulose.

As formas líquidas em que as novas composições dapresente invenção podem ser incorporadas para administraçãooral ou por injeção incluem soluções aquosas, xaropesadequadamente flavorizados, suspensões aquosas ou oleosas,e emulsões flavorizadas com óleos comestíveis como óleo dealgodão, óleo de gergelim, óleo de coco, ou óleo deamendoim, bem como elixires e veículos farmacêuticossimilares.

As composições para inalação ou insuflação incluemsoluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicosfarmaceuticamente aceitáveis, ou misturas desses, e pós. Ascomposições líquidas ou sólidas podem conter excipientesfarmaceuticamente aceitáveis como acima descrito.Preferivelmente as composições são administradas pela viarespiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico.Composições em solventes preferivelmente farmaceuticamenteaceitáveis podem ser nebulizadas pelo so de gases inertes.Soluções nebulizadas podem ser respiradas diretamente apartir do dispositivo de nebulização ou o dispositivo denebulização pode sr anexado a máscaras de face, ou aparelhode respiração de pressão positiva intermitente. Ascomposições em solução, suspensão ou pó podem seradministradas, preferivelmente por via oral ou nasal, apartir de dispositivos que liberam a formulação em umamaneira adequada.

Os seguintes Exemplos de Formulação ilustram ascomposições farmacêuticas da presente invenção.

Exemplo de Formulação 1Cápsulas de gelatina dura que contêm os seguintesingredientes são preparadas:

Ingrediente Quantidade

(mg/cápsula)Ingrediente ativo 3 0,0

Amido 305,0

Estearato de magnésio 5,0

Os ingredientes acima são misturados e preenchidos emcápsulas de gelatina dura em quantidades de 34 0 mg.

Exemplo de Formulação 2

Uma fórmula de comprimido é preparada com o uso dosingredientes abaixo:

Ingrediente Quantidade (mg/comprimido)

Ingrediente ativo 25,0

Celulose, microcristalina 200,0

Dióxidod e silício coloidal 10,0

Ácido esterárico 5,0

Os componentes são misturados e compressos para formarcomprimidos, cada um pesando 24 0 mg.

Exemplo de Formulação 3

Uma formulação de inalador de pó seco é preparadacontendo os seguintes componentes:

Ingrediente peso %

Ingrediente ativo 5

Lactose 95

0 Ingrediente ativo é misturado com a lactose e amistura é adicionada a um aparelho de inalação de pó seco.Exemplo de Formulação 4

Comprimidos, cada um contendo 3 0 mg de Ingrediente ativo, são preparados como se segue:<table>table see original document page 43</column></row><table>

O ingrediente ativo, amido, e celulose são passadosatravés de uma peneira de 20 mesh. U.S. e misturadocompletamente. A solução de polivinilpirrolidona émisturada com os pós resultantes, que são então passadosatravés de uma peneira de 16 mesh U.S. Os grânulos assimproduzidos são secos em 50°C a 60°C e passados através umapeneira de 16 mesh U.S. Sódio carboximetil amido, estearatode magnésio, e talco, previamente passados através de umapeneira de 30 mesh U.S. são então adicionados aos grânulosque, após mistura, são compressos em uma máquina decomprimido para gerar comprimidos cada um pesando 120 mg.

Exemplo de Formulação 5

Cápsulas, cada uma contendo 4 0 mg de medicamento sãofeitas como se segue:

<image>image see original document page 43</image>

O Ingrediente ativo, amido e estearato de magnésio sãomisturados, passados através de uma peneira de 20 meshU.S., e preenchidos em cápsulas de gelatina dura emquantidades de 150 mg.Exemplo de Formulação 6

Supositórios, cada um contendo 25 mg de ingredienteativo são feitos como se segue:

<table>table see original document page 44</column></row><table>

O Ingrediente ativo é é passado através de uma peneirade 60 mesh U.S. e suspenso nos glicerideos de ácido graxosaturado previamente fundidos com o uso do calor mínimonecessário. A mistura é então despejada em um molde desupositório de capacidade nominal 2,0 g e deixada pararesfriar.

Exemplo de Formulação 7

Suspensões, cada um contendo 50 mg de medicamento pordose de 5,0 mL são feitos como se segue:

<table>table see original document page 44</column></row><table>

O Ingrediente ativo, sacarose e goma xantana sãomisturados, passados através de uma peneira de 10 meshU.S., e então misturados com uma solução previamente feitada celulose microcristalina e carboximetil celulose desódio em água. 0 benzoato de sódio, sabor, e cor sãodiluídos com alguma da água e adicionados com agitação.Água suficiente é então adicionada para produzir o volumenecessário.

Exemplo de Formulação 8

Ingrediente Quantidade(mg/cápsula)

Ingrediente ativo 15,0 mgAmido 4 07,0 mg

Estearato de magnésio 3,0 mgTotal 425,0 mg

0 ingrediente ativo, amido, e estearato de magnésiosão misturados, são passados através de uma peneira de 20mesh U.S., e preenchidos em cápsulas de gelatina dura emquantidade de 425,0 mg.

Exemplo de Formulação 9

Uma formulação subcutânea pode ser preparada como sesegue:

Ingrediente Quantidade

Ingrediente ativo 5,0 mg

Óleo de milho 1,0 mL

Exemplo de Formulação 10

Uma formulação intravenosa pode ser preparada como sesegue:

Ingrediente Quantidade

Ingrediente ativo 250 mg

Solução salina isotônica 1.000 mL

Uma outra formulação empregada nos métodos da presenteinvenção emprega dispositivos de liberação transdérmica("emplastros"). Tais emplastros transdérmicos podem serusados para fornecer infusão contínua ou descontínua doscompostos da presente invenção em quantidades controladas.A construção e uso de emplastros transdérmicos para aliberação de agentes farmacêuticos é bem conhecida natécnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. 5.023.252, emitidaem 11 de junho de 1991, aqui incorporada por referência.Tais emplastros podem ser construídos para liberaçãocontínua, pulsátil, ou em demanda de agentes farmacêuticos.

Freqüentemente, será desejável ou necessáriointroduzir a composição farmacêutica ao cérebro,diretamente ou indiretamente. Técnicas diretas comumenteenvolvem a colocação de um cateter de liberação demedicamento no sistema ventricular do hospedeiro parasobrepor a barreira hematencefálica. Um sistema deliberação implantável usado para o transporte de fatoresbiológicos a regiões anatômicas específicas do corpo édescrito na Patente U.S. 5.011.472, que é aqui incorporadapor referência.

Técnicas indiretas, comumente envolvem a formulaçãodas composições para fornecer latência de medicamento pelaconversão de medicamentos hidrofílicos em medicamentoslipossolúveis. A latência é geralmente realizada através dobloqueio de grupos hidroxil, carbonil, sulfato, e aminaprimária presentes no medicamento para torná-los maislipossolúveis e passíveis de transporte pela barreirahematencefálica. Alternativamente, a liberação demedicamentos hidrofílicos pode ser aumentada por infusãointra-arterial de soluções hipertônicas, que podem abrirtransitoriamente a barreira hematencefálica.

Outras paraformulações adequadas para uso na presenteinvenção podem ser encontradas em Remington'sPharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company,PhiIadelphia, PA, 17a ed. (1985).

Como acima notado, os compostos aqui descritos sãoadequados para uso em vários sistemas de liberação demedicamento acima descritos. Adicionalmente, para melhorara meia-vida sérica in vivo do composto administrado, oscompostos podem ser encapsulados, introduzidos no lúmen delipossomos, preparados como um colóide, ou podem serempregadas outras técnicas convencionais que fornecem umameia-vida sérica estendida dos compostos. Vários métodossão disponíveis para a preparação de lipossomos, comodescrito, por exemplo, em Szoka, e cols., Patentes U.S.Nos. 4.235.871, 4.501.728 e 4.837.028 cada ma dessas é aquiincorporada por referência.

Os compostos que têm a atividade biológica desejadapodem ser modificados como necessário para fornecerpropriedades desejadas como melhores propriedadesfarmacológicas (por exemplo, estabilidade in vivo,biodisponibilidade), ou a capacidade de serem detectados emaplicações diagnosticas. A estabilidade pode ser avaliadade várias formas como por medição da meia-vida dasproteínas durante incubação com peptidases ou plasma ousoro humanos. Inúmeros ensaios de estabilidade de proteínaforam descritos (veja, por exemplo, Verhoef e cols., Eur.J. DrugMetab. Pharmacokinet , 1990, 15 (2) :83-93) .

Os conjugados dessa invenção são antagonistas de VLA-4e são contemplados para fornecer melhor retenção in vivoquando comparados aos compostos não conjugados. Tal melhorretenção do conjugado no corpo deve resultar em menoresdosagens necessárias do medicamento, que, por sua vez, deveresultar em menores efeitos colaterais e probabilidadereduzida de toxicidade. Além disso, a formulação demedicamento pode ser administrada menos freqüentemente aopaciente embora atinja um efeito terapêutico similar oumelhor.

Os conjugados dessa invenção devem exibir inibição, invivo, da adesão de leucócitos a células endoteliais mediadapor VLA-4 por ligação competitiva a VLA-4. Preferivelmente,os compostos dessa invenção podem ser usados nasformulações intravenosas para o tratamento de doençasmediadas por VLA-4 ou adesão leucocitária. Tais doençasincluem doenças inflamatórias em mamíferos como asma,doença de Alzheimer, aterosclerose, demência de AIDS,diabetes (incluindo diabetes juvenil aguda), doençaintestinal inflamatória (incluindo colite ulcerativa edoença de Crohn), esclerose múltipla, artrite reumatóide,transplante de tecido, metástase tumoral, meningite,encefalite, AVC, e outros traumas cerebrais, nefrite,retinite, dermatite atópica, psoríase, isquemia miocárdicae dano pulmonar agudo mediado por leucócito como aquele queocorre em síndrome da angústia respiratória do adulto. Asformulações da presente invenção são especialmente úteis notratamento de doença intestinal inflamatória, comoesclerose múltipla de Crohn e artrite reumatóide.

Modelos adequados in vivo para demonstrar a eficáciano tratamento de condições inflamatórias incluem EAE(encefalomielite experimental autoimune) em camundongos,ratos, porquinhos da índia ou primatas, bem como outrosmodelos inflamatórios dependentes de a4 integrinas.Doença intestinal inflamatória ou "IBD" refere-se aogrupo de distúrbios que torna os intestinos inflamados,geralmente manifestada com sintomas que incluem cólicas edores abdominais, diarréia, perda de peso e sangramentointestinal. IBD é um termo coletivo para duas doençassimilares colite ulcerativa ("UC") e doença de Crohn("CD").

Doença de Crohn ("CD") é um distúrbio autoimunecrônico que resulta em inflamação do trato gastrointestinal(GI). Embora qualquer área do trato GI possa ser envolvida,CD afeta mais comumente o intestino delgado e/ou cólon. Nadoença de Crohn, todas as camadas do intestino podem estarenvolvidas, e pode haver intestino saudável normal entretrechos de intestino doente. CD é associada com fibrose,estenose e fissuras, fistulas entre o trato doente eestruturas adjacentes (ou seja, bexiga, outros segmentosintestinais, pele) e abcesso. Os patients com CD têmtipicamente diarréia, dor abdominal e perda de peso. A dorabdominal é comumente é insidioso pode estar associada comuma massa inflamatória macia. Febre, perda de peso,estomatite, fistulas perianais e/ou fissuras, artrite, eeritema nodoso são todos comumente observados. Háconsiderável morbididade associada com CD, particularmenteem pacientes com doença não controlada pelos medicamentosatualmente disponíveis. Até 75% dos pacientes com doençamoderada a severa requerem cirurgia e até 75% dessespacientes experimentarão recorrência de doença pós-cirurgiaem 10 anos e até 50% terão que repetir a cirurgia em 20anos. Essa alta taxa de recorrência indica uma necessidadepor novos tratamentos eficazes para doença ativa emanutenção da remissão da doença.

Colite ulcerativa ou "CU" é uma doença inflamatóriacrônica, episódica, do intestino grosso e retocaracterizada por diarréia sanguinolenta. A coliteulcerativa é uma resposta inflamatória amplamente limitadaà mucosa e submucosa do cólon. A colite ulcerativa pode sercategorizada de acordo com a localização: "proctite"envolve apenas o reto, "proctosigmoidite" afeta o reto ecólon sigmóide, "colite de lado esquerdo" engloba o ladoesquerdo inteiro do intestino grosso, "pancolite" atinge ocólon inteiro. Linfócitos e macrófagos são numerosos emlesões da doença intestinal inflamatória e podem contribuirpara o dano inflamatório. Um modelo animal de exemplo dedoença intestinal inflamatória (IBD) é realizado com ratostransgênicos HLA-B27. Esses ratos superexpressam a moléculahumana HLA-B27 (gene de cadeia pesada e de beta globulina)que está associada com espondiloartropatias, um grupo decondições inflamatórias que afetam o esqueleto. Antes dsurgimento de mudanças inflamatórias do esqueleto, essesanimais desenvolvem inflamação não granulomatosa nointestino delgado e abcessos difusos no cólon, umapatologia que é similar àquela de doença de Crohn emhumanos. Foram realizados estudos de eficácia no ratotransgênico HLA-B27 modelo IBD com os compostos dessainvenção como descrito no Exemplo J abaixo.

Asma é uma doença caracterizada por resposta aumentadada árvore traqueobrônquica a vários estímulos potenciando aconstrição paroxística das vias aéreas brônquicas. Oestímulo causa a liberação de vários mediadores deinflamação de mastócitos revestidos com IgE incluindohistamina, fatores quimiotáticos eosinofílicos eneutrofílicos, leucotrienos, prostaglandina e fator deativação de plaquetas. A liberação desses fatores recrutabasófilos, eosinófilos e neutrófilos, que causam danoinf lamatório.

Alguns modelos animais adequados para o estudo in vivode asma podem incluir o modelo de asma de rato, modelo deasma de camundongo e o modelo de asma de carneiro comodescrito no Exemplo E.

Aterosclerose é uma doença das artérias (por exemplo,coronárias, carótida, aorta e iliaca). A lesão básica, oateroma, consiste em uma placa focai elevada na intima, queem um núcleo de lipideo e uma cobertura fibrosa. Ateromascomprometem o fluxo sangüíneo arterial e enfraquece asartérias afetadas. Infartos miocárdicos e cerebrais são aprincipal conseqüência dessa doença. Macrófagos eleucócitos são recrutados a ateromas e contribuem para odano inflamatório.

Artrite reumatóide é uma doença inflamatória crônica,recorrente que causa primariamente a destruição dasarticulações. Artrite reumatóide afeta comumente primeiroas pequenas articulações das mãos e pés mas então podeenvolver os punhos, cotovelos, tornozelos e joelhos. Aartrite resulta da interação de células sinoviais comleucócitos que se infiltram a partir da circulação para acamada sinovial das articulações. Veja, por exemplo, Paul,Immunology (3a ed., Raven Press, 1993). Com o tempo, aerosão óssea , destruição da cartilagem, e completa perdada integridade das articulações pode ocorrer. Finalmente,múltiplos sistemas de órgãos podem ser afetados.O dano às articulações na artrite reumatóide iniciacom a proliferação de macrófagos sinoviais e fibroblastosapós um incidente ativador, possivelmente autoimune ouinfeccioso. Os linfócitos infiltram as regiõesperivasculares, e as células endoteliais proliferam. Entãoocorre a neovascularização. Os vasos sangüíneos naarticulação afetada tornam-se ocluídos com pequenoscoágulos de células inflamatórias. Com o tempo, o tecidosinovial inflamado começa a crescer irregularmente,formando tecido de pannus invasivo. 0 Pannus invade edestrói a cartilagem e osso. Múltiplas citoquinas,interleucinas, proteinases, e fatores de crescimento sãoliberados, causando uma destruição articular adicional e odesenvolvimento de complicações sistêmicas. Veja, FiresteinG.S. Etiology and pathogenesis of reumathoid arthritis,Ruddy S, Harris ED, Sledge CB, Kelley WN, eds. Kelley'sTextbook of Rheumatology, 7 a ed. Philadelphia: W.B.Saunders, 2005:996-1042.

Modelos animais adequados para o estudo de artritereumatóide podem incluir Artrite Induzida por Adjuvante(wAIAw) e Artrite Induzida por Colágeno ("CIA") comodescrito nos Exemplos GeH nessa.

Uma outra indicação para os compostos dessa invenção éno tratamento de rejeição a órgão ou enxertos mediada porVIA-4. Nos últimos anos tem havido um considerável avançona eficiência de técnicas cirúrgicas para transplante detecidos e órgãos como pele, rim, fígado, coração, pulmão,pâncreas e medula óssea. Talvez o maior e principalproblema seja a ausência de agentes satisfatórios para aindução de imunotolerância no receptor do aloenxerto ouórgão transplantado. Quando células alogênicas ou órgãossão transplantados a um hospedeiro (ou seja, o doador ereceptor são indivíduos diferentes da mesma espécie), osistema imune do hospedeiro provavelmente construirá umaresposta imune a antígenos estranhos no transplante (doençahospedeiro-versus-enxerto) que leva à destruição do tecidotransplantado. Células CD8', células CD4 e monócitos sãotodos envolvidos na rejeição de tecidos de transplante. Oscompostos dessa invenção que se ligam a alfa-4 integrinasão úteis, entre outros, para bloquear respostas imunesinduzidas por aloantígeno no receptor assim evitando quetais células participem na destruição do tecido ou órgãotransplantado. Veja, por exemplo, Paul e cols., TransplantInternational 9, 420-425 (1996); Georczynski e cols.,Immunology 87, 573-580 (1996); Georcyznski e cols.,Transplant. Immunol. 3, 55-61 (1995); Yang e cols.,Transplantation 60, 71-76 (1995); Anderson e cols., APMIS102, 23-27 (1994) .

Um uso relatado para compostos dessa invenção, que seligam a VLA-4 é na modulação da response imune envolvida emdoença "enxerto versus hospedeiro" ("GVHD"). Veja, porexemplo, Schlegel e cols., J. Immunol. 155, 3856-3865(1995). GVHD é uma doença potencialmente fatal que ocorrequando células imunologicamente competentes sãotransferidas para um receptor alogênico. Nessa situação, ascélulas imunocompetentes do doador podem atacar tecidos noreceptor. Tecidos da pele, epitélio do intestino e fígadosão alvos freqüentes e podem ser destruídos durante GVHD. Adoença apresenta um problema especialmente severo quando otecido imune está sendo transplantado, como em transplantede medula óssea; mas GVHD menos severa também tem sidorelatada em outros casos também, incluindo transplantes decoração e de fígado. Os agentes terapêuticos da presenteinvenção são usados, entre outros, para bloquear a ativaçãodas células T doadoras assim interferindo com suacapacidade de lisar células alvo no hospedeiro.

Um uso adicional dos compostos dessa invenção é ainibição de metástases tumorais. Foram relatadas váriascélulas que expressam VLA-4 e compostos, que se ligam aVLA-4 bloqueiam a adesão de tais células a célulasendoteliais. Steinback e cols., Urol. Res. 23, 175-83(1995); Orosz e cols., Mt. J. Câncer 60, 867-71 (1995);Freedman e cols., Leuk. Lymphoma 13, 47-52 (1994); Okaharae cols., Câncer Res. 54, 3233-6 (1994).

Um uso adicional dos compostos dessa invenção é notratamento de esclerose múltipla. Esclerose múltipla é umadoença autoimune neurológica progressiva que afeta umaestimativa de 250.000 a 350.000 pessoas nos Estados Unidos.Acredita-se que a esclerose múltipla seja o resultado deuma reação autoimune específica em que certos leucócitosatacam e iniciam a destruição de mielina, a bainha deisolamento que cobre as fibras nervosas. Em um modeloanimal para esclerose múltipla, anticorpos monoclonais demurídeo direcionados contra VLA-4 mostraram bloquear aadesão de leucócitos ao endotélio, e assim evitaminflamação do sistema nervoso central e subseqüenteparalisia nos animais.16

As composições farmacêuticas da invenção são adequadaspara uso em uma variedade de sistemas de liberação demedicamento. Formulações adequadas para uso na presenteinvenção são encontrdas em Remington's PharmaceuticalSciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17aed. (1985).

A quantidade administrada ao paciente irá variardependendo do que está sendo administrado, do objetivo daadministração, como profilaxia ou terapia, do estado dopaciente, do modo de administração, e outros. Em aplicaçõesterapêuticas, as composições são administradas a umpaciente que já sofre da doença em uma quantidadesuficiente para curar ou pelo menos retardar parcialmenteos sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidadeadequada para realizar isso é definida como "doseterapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para usodependerão da condição de doença sendo tratada bem como dojulgamento do clínico que depende de fatores como aseveridade da inflamação, da idade, peso e condição geraldo paciente, e outros, com referencia aos dados de modeloanimal adequado, como aquele aqui fornecido. Métodos paraestimar sa dosagens humanas adequadas, com base em taisdados, são conhecidos na técnica. (veja, por exemplo,Wagner, J.G. Pharmacokinetics for the PharmaceuticalScientist. Technomic, Inc., Lancaster, PA 1993).

As composições administradas a um paciente estão naforma de composições farmacêuticas acima descritas. Essascomposições podem ser esterilizadas por técnicasconvencionais de esterilização, ou podem ser filtradas deforma estéril. As soluções aquosas resultantes podem serembaladas para uso como estão, ou Iiofilizadas, apreparação liofilizada sendo combinada com um veículoaquoso estéril antes da administração.Os compostos que têm a atividade biológica desejadapodem ser modificados como necessário para fornecerpropriedades desejadas como melhores propriedadesfarmacológicas (por exemplo, estabilidade in vivo,biodisponiblidade) , ou a capacidade de ser detectada emaplicações diagnosticas. A estabilidade pode ser avaliadade vários modos como poer medição da meia-vida dasproteínas durante incubação com peptidases ou plasma ousoro humano. Inúmeros ensaios de estabilidade de proteínaforam descritos (veja, por exemplo, Verhoef e cols., Eur.J. DrugMetab. Pharmacokinet , 1990, 15(2):83-93).

A dosagem terapêutica dos compostos da presenteinvenção irá variar de acordo com, por exemplo, o usoparticular para o qual o tratamento é feito, o modo deadministração do composto, a saúde e condição do paciente,e o julgamento do profissional médico. Por exemplo, paraadministração intravenosa, a dose tipicamente estará nafaixa de cerca de 20 μg a cerca de 2.000 μg por quilogramade peso corporal, preferivelmente cerca de 20 μg a cerca de500 μg, mais preferivelmente cerca de 100 μg a cerca de 300μg por quilograma de peso corporal. Faixas de dosagemadequadas para administração intranasal são geralmente decerca de 0,1 μg a 1 mg por quilograma de peso corporal.Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvasdose-resposta derivadas de sistemas de teste de modelo invitro ou animal.

Compostos dessa invenção são também capazes de ligarou antagonizar as ações de α4β1, e α4β7 integrinas.Portanto, os compostos dessa invenção são também úteis paraa prevenção ou reversão dos sintomas, distúrbios ou doençasinduzidas pela ligação dessas integrinas aos seus ligantesrespectivos.

Em um outro aspecto da invenção, os compostos ecomposições aqui descritos podem ser usados para inibir amigração de células imunes da corrente sangüínea para osistema nervoso central no caso, por exemplo, de esclerosemúltipla, ou para áreas que resultam na destruição induzidapor reação inflamatória da mielina. Preferivelmente, essesreagentes inibem a migração de células imunes em umamaneira que inibe a desmielinização e que também podepromover a remielinização. Os reagentes também podem evitara desmielinização e promover remielinização do sistemanervoso central para distúrbios metabólicos congênitos emque as células imunes infiltrantes afetam o desenvolvimentoda bainha mielínica, principalmente no SNC. Os reagentespreferivelmente também reduzem a paralisia quandoadministrados a um indivíduo com paralisia induzida por umadoença ou condição desmielinizante.

Doenças inflamatórias que são incluídas paratratamento pelas composições, compostos e métodos aquirevelados incluem geralmente condições relacionadas àdesmielinização. Histologicamente, anormalidade da mielinasão desmielinizantes ou dismielinizantes. A desmielinizaçãoimplica a destruição da mielina. A desmielinização refere-se à formação defeituosa ou manutenção de mielina queresulta da disfunção dos oligodendrócitos. Preferivelmente,as composições e métodos aqui revelados são contempladospara tratar doenças e condições relacionadas adesmielinização e ajudam com remielinização. Doenças oucondições adicionais contempladas para tratamento incluemmeningite, encefalite, e danos à medula espinhal econdições geralmente que induzem desmielinização como umresultado de uma resposta inflamatória.

As composições, compostos e coquetéis aqui reveladossão contemplados para uso no tratamento de condições edoenças associadas com desmielinização. Doenças e condiçõesque envolvem a desmielinização incluem, sem limitação,esclerose múltipla, distúrbios metabólicos congênitos (porexemplo, fenilcetonúria (PKU), doença de Tay-Sachs, doençade Niemann-Pick, doença e Gaucher, síndrome de Hurler,doença de Krabbe e outras leucodistrofias que afetam abainha em desenvolvimento) , neuropatias com mielizaçãoanormal (por exemplo, Guillain Barré, polineuropatia dedesmielinização imune crônica (CIDP), CIDP multifocal,Neuropatia Motora Multifocal (MMN), síndrome anti-MAG(Glicoproteína Associada a Mielina), síndrome GALOP(Polineuropatia de distúrbio de caminhada de Autoanticorpo,de surgimento em de idade avançada), síndrome de anticorpoanti-sulfatídeo, síndrome de anticorpo anti-GM2, síndromePOEMS (Polineuropatia, Organomegalia, Endocrinopatia, M-Proteína e mudanças de pele) também conhecida como síndromeCrow-Fukase e doença de Takatsuki, perineurite, síndrome deanticorpo IgM anti-GD lb) , desmielinização relacionada adrogas (por exemplo, causada pela administração decloroquina, FK506, perhexilina, procainamida, e zimeldina),outras condições hereditárias desmielinizantes (porexemplo, glicoproteína deficiente de carboidrato, síndromede Cockayne, hipomielinização congênita, distrofia muscularcongênita, doença de Farber, síndrome de Marinesco-Sjògren,leucodistrofia metacromática, doença de Pelizaeus-Merzbacher, doença de Refsum, condições relacionadas apríons e doença de Salla) e outras condições ou doençasdesmielinizantes (por exemplo, meningite, encefalite(também conhecida como encefalopatia disseminada aguda,ADEM), ou dano da medula espinhal).

Há vários modelos de doença que podem ser usados paraestudar essas doenças in vivo. Por exemplo, modelos animaisincluem, sem limitação:

Tabela 4

<table>table see original document page 59</column></row><table>

A doença desmielinizante mais comum é esclerosemúltipla ("MS"), mas vários outros distúrbios metabólicos einflamatórios resultam em mielinização deficiente ouanormal. MS é uma doença neurológica crônica, que aparecena vida adulta precoce e progride para uma deficiênciasignificativa na maioria dos casos. Há aproximadamente350.000 casos de MS nos Estados Unidos isoladamente. Alémde trauma, MS é a causa mais freqüente de deficiêncianeurológica na vida adulta precoce à média.

A causa de MS ainda está para ser determinada. MS écaracterizada por inflamação crônica, desmielinização egliose (cicatrização). A desmielinização pode resultar emefeitos negativos ou positivos sobre condução axonal.Anormalidades de condução positiva incluem condução axonalmais lenta, bloqueio de condução variável que ocorre napresença de séries de alta mas não de baixa freqüência deimpulsos ou bloqueio completo da condução. Anormalidades decondução positivas incluem geração de impulso ectópica,espontaneamente ou após estresse mecânico e "cross-talk"(linha cruzada) anormal entre exons desmielinizados.

Células T reativas contra proteínas de mielina,proteína básica de mielina BP) ou proteína de proteolipídeomielina (PLP) foram observada para mediar a inflamação deSNC em encefalomielite alérgica experimental. Pacientestambém foram observados como tendo níveis elevados deimunoglobulina de SNC (Ig). É também possível que algum dodano tecidual observado em MS seja mediado por produtos decitocina de células T ativadas, macrófagos ou astrócitos.

Atualmente, 8 0% de pacientes diagnosticados com MSvivem 20 anos após o surgimento da doença. Terapias para ocontrole de MS incluem: (1) tratamento para modificar aduração da doença, incluindo tratamento de exacerbaçãoaguda e direcionada a supressão de longo termo da doença;(2) tratamento dos sintomas de MS; (3) prevenção etratamento de complicações médicas; e (4) controle dopessoal secundário e de problemas sociais.

0 surgimento de MS pode ser dramático ou tão suave demodo a não levar um paciente a procurar cuidados médicos.Os sintomas mais comuns incluem fraqueza em um ou maismembros, visão borrada devido à neurite ótica, distúrbiossensoriais, diplopia e ataxia. A duração da doença pode serestratifiçada em três categorias gerais: (1) MS derecorrência, (2) MS progressiva crônica, e (3) MS inativa.MS de recorrência é caracterizada por ataques recorrentesde disfunção neurológica. Os ataques de MS geralmenteprogridem por dias a semanas e podem ser seguidos porrecuperação completa, parcial ou nenhuma recuperação. Arecuperação de ataques geralmente ocorre em semanas avários meses a partir do pico os sintomas, embora raramentealguma recuperação possa continuar por 2 ou mais anos.

MS progressiva crônica resulta em piora progressivagradual sem períodos de estabilização ou remissão. Essaforma se desenvolve em pacientes com uma história prévia deMS recorrente, embora em 20% de f pacientes, nenhumarecorrência possa ser lembrada. Recorrências agudas tambémpodem ocorrer durante o curso progressivo.

Uma terceira forma é MS inativa. MS inativa écaracterizada por déficits neurológicos fixos de magnitudevariável. A maioria dos pacientes com MS inativa tem umahistória prévia de MS recorrente.

A duração da doença é também dependente da idade dopaciente. Por exemplo, fatores prognósticos favoráveisincluem surgimento precoce (excluindo infância), umaduração recorrente e pouca deficiência residual 5 anos apóso ataque. Em contraste, prognóstico pobre está associadocom uma idade tardia de ataque (ou seja, idade de 4 0 oumais) e uma duração progressiva. Essas variáveis sãointerdependentes, uma vez que MS progressiva crônica tendea iniciar em uma idade posterior que a MS recorrente. Adeficiência da MS progressiva crônica é comumente devida àparaplegia progressiva ou quadriplegia (paralisia) empacientes. Em um aspecto da invenção, pacientes serãopreferivelmente tratados quando o paciente está em remissãoem vez de em um estagio de recaída da doença.

Uso de curta duração de hormônio adrenocorticotrópicoou corticosteróides orais (por exemplo, prednisona oral oumetilprednisolona intravenosa) é a única medida terapêuticaespecífica para o tratamento de pacientes com exacerbaçãoaguda de MS.

Terapias mais novas para MS incluem o tratamento dopaciente com interferon beta-Ib, interferon beta-la, eCopaxone® (anteriormente conhecido como copolímero 1).Esses três medicamentos mostraram reduzirsignificativamente a taxa de recaída da doença. Essesmedicamentos são auto-administrados por via intramuscularou subcutânea.

No entanto, nenhuma das modalidades de tratamentoatuais inibe a desmielinização, promove ou permite aremielinização espontânea ou reduz a paralisia. Um aspectoda invenção contempla o tratamento de MS com agentes aquirevelados isoladamente ou em combinação com outrasmodalidades padrão de tratamento.

Radiação também pode induzir desmielinização.Acredita-se que a toxicidade ao sistema nervoso central(SNC) devida à radiação seja causada por (1) dano àsestruturas dos vasos, (2) deleção de progenitores deoligodendrócito-2 astrócito e oligodendrócitos maduros, (3)deleção de populações de célula tronco neural no hipocampo,cerebelo e córtex, e alterações generalizada da expressãode citocina. A maior parte do dano por radiação resulta deradioterapias administradas durante o tratamento de certoscânceres. Veja, para revisão Belka e cols., 2001 Br. J.Câncer 85: 1233-9. No entanto, a exposição à radiaçãotambém pode ser um problema para astronautas (Hopewell,1994 Adv. Space Res. 14: 433-42) bem como no evento deexposição a substâncias radioativas.

Essas condições e doenças são também contempladas paratratamentos paliativos ou de melhoria.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos sintéticos e biológicos sãooferecidos para ilustrar essa invenção e não devem serinterpretados de qualquer forma como limitantes do escopodessa invenção. A menos que determinado de outra forma,todas as temperaturas são em graus Celsius. Nos exemplosabaixo, as seguintes abreviações têm os seguintessignificados. Se uma abreviação não é definida, ela tem seusignificado geralmente aceito

<table>table see original document page 63</column></row><table>g = grama

HBSS = solução salina balanceada de Hank

HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico

HPLC = cromatografia liquida de alta performance

hrs ou h = horas

IC50 = a concentração de um inibidor que é necessáriopara 50% de inibição de uma enzima in vitro

in.= polegada

i.p. = via intraperitoneal

i-PrOH = iso-propanol

kg = quilograma

L = litros

LC/MS = cromatografia liquida/espectroscopia demassa

m = multipleto

m2 = metros qudrados

M = molar

mbar = milibar

mg = miligrama

MHz = megahertz

min. = minutos

mL = mililitros

mm = milímetros

mM = milimolar

mmol = milimoles

mOsm = miliosmol

MTBE = metil terc-butiléter

m/z ou M/Z = proporção massa para carga

N = normalng = nanogramasnm = nanômetros

NMR = ressonância magnética nuclear

PBS = solução salina tamponada por fosfato

PBS++ = PBS com cálcio e magnésio

ppm = partes por milhão

psi = libras por polegada quadrada

ρ.o. = por os, literalmente "pela boca", inclui ingestãooral

q = quarteto

q.s. = quantidade suficiente

Rf = fator de retenção (proporção da distância

percorrida pela substância/ distância percorridapor frente de solvente)rpm = rotações por minutort ou RT = temperatura ambienteRt = tempo de retençãosingletotripleto

ácido trifluoracéticotetrahidrofuranocromatografia de camada finaultravioleta

proporção peso para pesoproporção peso para volumemicrogramasmicronsmicromolar

st

TFA =THF =TLC =UV

wt/Wtw/v -

μ9

μπιμΜ

Exemplo 1Preparação de ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-Exemplo

isopropilmetilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico

O protocolo sintético empregado noresumido no Esquema 4 ilustrado abaixo:

<formula>formula see original document page 66</formula>

No Esquema 4, o composto 4 foi preparado em umaseqüência tripla a partir de 5-nitropirmidina composto 1. 0protocolo sintético do Esquema 4 simplificasignificativamente a preparação desse composto em um oumais dos seguintes:

1) uma etapa de redução de grupo nitrosubstancialmente acelerada;

2) uma seqüência de aminação de redução /redutivaeficiente que é realizada no mesmo frasco com o mesmosolvente e o mesmo catalisador, assim as manipulações sãoreduzidas e a exposição dos produtos sensíveis a oxigênioao ar é minimizada;3) as condições para a etapa de aminação redutivaminimizam a geração de um subproduto de bis isopropilaminopirimidina assim eliminando a necessidade por mapurificação cromatográfica do composto 3;

4) são descritas condições em que é possível purificaro intermediário de monoisopropilaminopirimidina, composto2, por trituração do sal de ácido L-tartáricocorrespondente (embora a necessidade por essa levepurificação do composto 2 também tenha se tornadodesnecessária pelas melhorias na etapa de aminaçãoredutiva), e

5) condições para a leve purificação do composto 3 porcristalização a partir de MTBE-hexano ou MTBE-ciclohexanoforam identificadas.

Nas etapas de reação do Esquema 4, cromatografia flashfoi realizada com o uso de Biotage Flash 75L, usandocartuchos de sílica de 800 g KP-Sil (32-63 μΜ, 60 angstrom,500-550 m2/g)· *fs são relatados para cromatografiaanalítica de camada fina, usando EM Sciences Sílica Gel 60F (254) placas de espessura de 250 μΜ para fase normal.Espectros de NMR foram obtidos em um espectrômetro VarianGemini 3 00 MHz (3 00 MHz para espectro de 1H e 75 MHz paraespectro de 13C). HPLC analítica foi realizada em umAgilent 1100 Series HPLC com uma coluna Fenomenex Luna7 3μm, C-18, 30 χ 4,6 mm. 0 detector foi UV a 210nm. Solventesforam 0,1% TFA em água e 0,1% TFA em acetonitrila. A taxade fluxo padrão foi 1,5 mL/min. e o método padrão foidenominado Ml com o gradiente de solvente mudando de 20%CH3CN para 70% CH3CN por 2,33 minutos. Um métodoalternativo foi denominado M2 com uma taxa de fluxo de 2mL/min. e uma mudança de gradiente de 20% CH3CN para 70%CH3CN por %, 75 minuto. Método M15 teve uma taxa de fluxo de1,5 ml/min. com a composição do solvente mudando de 20%CH3CN para 70% CH3CN por 10 min. , mantendo a 70% por 2min. , então elevando para 95% por 1 min. e mantendo a 95%por 2 minutos. LC/MS foi realizada em Agilent 1100 SeriesHPLC com Series 1100 MSD com ionização de eletrospray (amenos que indicado de outra forma como ionização química).A coluna e condições foram combinadas à HPLC livre.Etapa 1: Preparação de (S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino)-5-(isopropilamino)pirimidin-4-ilamino)-3-oxopropil)fenil pirrolidina-l-carboxilato (2)

<formula>formula see original document page 68</formula>

Nitropirimidina-carbamato 1(100 g, 189 mmol) e PtO2(6,33 g, 27,85 mmol) foram suspensos em 3 60 mL de THF úmido(5% H2O). A mistura foi agitada em temperatura ambiente sobhidrogênio (413,68 KPa). Depois de 3 horas, TLC (50%EtOAc/hexanos em sílica gel) indicou redução completa dogrupo nitro (análise de TLC em sílica com EtOAc mostrou Rf=0,2 (listrado) para a amino-pirimidina e Rf = 0,8 6 para anitropirimidina-carbamato inicial). Com relação a isso, ouso de PtO2 para ambas etapas nesse processo de duas etapaspermitiu a reação de uma fase com aquela característicaadicionada que a taxa de redução do grupo nitro foidramaticamente acelerada. Em qualquer evento, deve-se tomarcuidado para minimizar a exposição ao ar/oxigênio uma vezque o produto de aminopirimidina é propenso à oxidação.

Etanol (200 mL) , acetona (21 mL, 1,5 eq.), e ácidoacético glacial (3,0 mL, 0,28 eq.) foram adicionados àsolução de aminopirimidina no frasco de hidrogenação.Depois de purificação, o frasco foi pressurizado com H(413,68 KPa) . A aminação redutiva foi continuada de um diapara o outro. TLC em silica usando EtOAc como o eluentegerou um Rf= 0,41 (listrado) para a isopropilamino-pirimidina e um Rf = 0,11 para aminopirimidina carbamato deinicio. Tanto TLC quanto LC/MS confirmaram completa reaçãocom virtualmente nenhuma bis-isopropilaminopirimidinaproduzida. Se necessário, HPLC pode ser usada como um meioalternativo para monitorar o progresso da reação. A soluçãode reação bruta foi diluída com EtOAc (1 L) e filtradaatravés de um absorvente de alumina básica (400 mL) . Aalumina foi enxaguada com EtOAc (200 mL) e EtOH (2 00 mL) eas soluções orgânicas combinadas foram concentradas invácuo. 0 frasco foi ventilado sob N2. 0 óleo viscoso foiredissolvido em tolueno anidro (700 mL) e concentrado.Depois de ventilação do frasco sob nitrogênio, o produtofoi seco novamente por remoção azeotrópica de mais 4 00 mLde tolueno. Um oleo viscos marrom avermelhado foi obtido.

Como evidenciado por LC/MS, muito poucas impurezas debis-isopropilaminopirimidina carbamato foram produzidas comesse procedimento quando comparado a métodos prévios em queas impurezas de bisisopropilamino pirimidina carbamatonecessitavam remoção por cromatografia.

Se uma purificação formal da etapa de mono-isopropilamino pirimidina 2 for necessária, ela pode serprecipitada de THF/éter como o sal de ácido (L)-tartárico etriturado. Um exemplo de pequena escala se segue: (5,09 g,99,6% de rendimento) ácido L-Tartárico (1,42 g) foidissolvido em THF quente (45 mL) . A solução de ácidotartárico quente foi adicionada à goma da isopropilamino-pirimidina 2 (5,1 g). A mistura foi turbilhonada e aquecidaaté estar homogênea. A solução mudou de rosa-roxo para acor castanha. A solução foi concentrada in vácuo para geraruma goma castanha. Éter (-150 mL) foi adicionado enquantofoi observada formação de óleo. A mistura de éter foiconcentrada in vácuo. Acetona (-20 mL) e então éter (-200mL) foi adicionado, e a formação de um óleo em forma degoma foi novamente observada. A mistura foi concentrada umaterceira vez. Cloreto de metileno (5-10 mL) foi adicionadoseguido por éter (-80 mL) . Um precipitado castanho foiobservado se formando debaixo de um sobrenadante laranja-rosa brilhante. A mistura foi filtrada. 0 precipitado foienxaguado com éter (50 mL) e então novamente com a mistura(-60 mL) de acetona e éter (1:1). 0 precipitado foi secosob vácuo de um dia para o outro para gerar um sólido decor creme (4,9 g, 76% de rendimento). Uma pequena alíquotado sal de ácido tartárico sólido foi dissolvida em i-PrOH eEtOH e passada através de um pequeno absorvente de aluminabásica para gerar a base livre. A alíquota de base livrefoi analisada por TLC e LC/MS. 0 sal restante foi suspensoem uma mistura de CH2Cl2 (250 mL) e IN NaHCO3 (150 mL) . Commistura e algum borbulhamento, o sólido dissolvido e aamina de base livre foi extraída em uma camada orgânica. Acamada aquosa foi extraída uma vez mais com EtOAc (150 mL)e os extratos orgânicos foram combinados e secos sobreMgSO4 (~150g). A solução orgânica seca foi passada atravésde um plugue de alumina básica (-100 g) para gerar umasolução rosa claro que foi concentrada in vácuo para geraruma goma castanha/rosa (3,28 g, 64% de rendimento a partirde nitrocarbamato de iniciação).

Vários outros ácidos foram investigados em umatentativa de formar sais com monoisopropilaminopirimidinacarbamato 2. Ácido p-Toluenossulfônico e ácidometanossulfônico geraram óleos. Sais sólidos podem serformados com HCl e H3PO4, mas ácido tartárico surgiu paragerar as características de solubilidade mais favoráveis.Os sais de HCl e de ácido fosfórico pareceram se dissolverfacilmente em CH2Cl2, i-PrOH, e acetona, enquanto o sal deácido tartárico pareceu ser principalmente insolúvel emCH2Cl2 e apenas parcialmente solúvel nos outros solventes.Etapa 2: Preparação de (S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino) -5- (N-isopropilmetilsulfonamido) pirimidin-4-ilamino) -3-oxopropil) fenil pirrolidina-l-carboxilato (3)

<formula>formula see original document page 71</formula>

Isopropilaminopirimidina carbamato 2 da Etapa 1 (18 9mmol) foi dissolvido em piridina (680 mL) e a solução foiresfriada a O0C sob N2. Metanocloreto de sulfonila (44 mL,3,0 eq.) foi adicionado via bomba de seringa por 20 min. àsolução fria de piridina de isopropilaminopirimidinacarbamato. 0 banho de gelo foi removido e a solução foideixada para aquecer até a RT. A solução foi deixada em umarápida análise foi realizada (diluída com EtOAc, lavadacom 5% KH2PO4, salmoura, e então seca sobre MgSO4) . Análisepor TLC mostrou que a reação estava completa e geralmentelimpa (apenas um ponto além de um ponto de base da piridinaresidual). A solução de reação foi concentrada. Quando 650mL de destilado foi coletado, o óleo vermelho sangue foidiluído com EtOAc (2 L) . A solução orgânica foi lavada com5% KH2PO4 (1 L e 750 mL) , 0,2 N ácido cítrico (1 L) , esalmoura (1 L) . A solução orgânica foi seca sobre MgSO4(150 g). A solução orgânica seca foi filtrada através deum absorvente de sílica gel (1 L) para gerar uma soluçãoverde-preta. 0 frasco e sílica gel foram enxaguados comEtOAc (1,5 L) para trazer o volume total de soluçãoorgânica a 3,5 L. A solução foi filtrada através de umabsorvente de alumina básica (3 00 mL) para gerar umasolução verde forte. A solução foi concentrada in vácuo.Foi obtida uma goma avermelhada (150 g).

O frasco foi depurado com nitrogênio, tampado ecolocado no refrigerador enquanto se formou um sólidomarrom avermelhado. LC/MS indicou pureza aceitável, mas aanálise de TLC indicou um ponto de base vermelho brilhantebem como duas a três leves impurezas. O odor de piridinafoi ainda presente. O sólido marrom avermelhado foidissolvido em uma mistura de CH2Cl2 (100 mL) , THF (200 mL) ,e éter (800 mL) . A solução foi filtrada/eluída através deum absorvente de sílica gel (IL) e a sílica foi enxaguadacom éter (3 L) . a maior parte das impurezas de basecoloridas foi retida na sílica gel. A solução foiconcentrada para gerar um óleo vermelho que secou a umsólido espumoso rosa (100 g) que foi analisado como sendo94,7% puro por LC/MS. O material foi então cromatografadoem sílica gel (2 L) eluído com CH2Cl2 (3 L) , CH2Cl2 e éter(1:1; 4 L) , éter (4 L), éter:THF (1:1; 4 L), e EtOAc com 5%Et3N e 2% EtOH (4 L) . 0 eluente de CH2Cl2: éter gerou um óleovermelho de frações mistas (12,4 g; Fração A) e o eluentede éter gerou um óleo castanho (13 g; Fração B) que foigeralmente pura. 0 volume do material permaneceu na colunae foi percebido que o produto desejado tinha secristalizado na coluna. Eluição com éter:THF e EtOAc (com5% Et3N e 2% EtOH) permitiu que o produto se redissolvessee fosse eluído em plugue concentrado (Fração C) Fração A eFração B foram combinadas e concentradas juntas. Fração Cfoi concentrada separadamente. Após concentração e secagem,foram formados cristais em ambas frações. Investigaçõesadicionais constataram que o sólido pode ser recristalizadode metil terc-butil éter (MTBE), ciclohexano, éter-hexano(1:1), MTBE-hexanos, ou ciclohexano-hexanos. Asfrações combinadas AeBe Fração C foram cada umarecristalizadas de MTBE-hexanos para gerar o éster terc-butílico 3 como um sólido branco (57,75g total com umapureza >99%) e filtrado vermelho/líquido-mãe. Os líquidos-mãe foram concentrados para gerar um óleo vermelho (24 g) .O óleo do liquido-mãe foi cromatografado em um Biotage 7 5e eluído com 4% THF em CH2Cl2 (12 L) para gerar fraçõesenriquecidas que foram então concentradas e recristalizadaspara gerar mais 14 g de éster terc-butílico purificado.

LC/MS por método M2 gerou tR=l,97 min. com M/Z = 619para [M+l]+ para o produto desejado.

LC/MS por método M15 gerou tR=6,09 min. com M/Z = 619para [M+l]+ para o produto desejado.

1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ, ppm: 0,88 (d, j = 6 Hz,1, 4H) , 1,04 (d, j = 6 Hz, 2H) , 1,20 (m, 10H) , 1,37 (s,4, 8Η), 1,39 (S, 4,8Η) , 1,93 (AA'BB' , 4Η) , 2,80 (s, 1,7Η),2,9 (s, 1,6Η) , 3,18 (m, 2,4Η), 3,4-3,7 (m sobrepondo doisaparentes tripletos, 8,3H), 4,40 (sexteto, j = 6 Hz, 1,1H),4,8 (sexteto, 1H), 5,64 (d, j = 6,5 Hz, 0,5H), 5,70 (d, j =6,5 Hz, 0,5H) , 7,03 (m, 2H) , 7,18 (aparente dd, 2H) , 7,80(d, j = 4 Hz, 1H) . A 1H NMR mostra rotâmeros.

É contemplado que o tratamento com o metanocloreto desulfonila pode ser feito em THF com pouca ou nenhuma baseadicional. Se a base for usada, uma base como trietilaminaou diisopropiIetilamina deve ser empregada.

Etapa 3: Preparação de ácido (S)-2 -(2 -(dietilamino)-5-(N-isopropilmetil-sulfonamido) pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico (4)

<formula>formula see original document page 74</formula>

Uma solução de ácido fórmico (1,5 L) do éster t-butílico da Etapa 2 (57,75 g, 0,093 mol) foi aquecida a50°C de um dia para o outro e então concentrada in vácuo.Alternativamente, a reação pode ser também realizada a 70°ou 80° por 60-90 minutos.

Água (-100 mL) foi adicionada ao produto bruto e amistura foi concentrada até secar. O resíduo foi seco sobalto vácuo. O produto bruto foi dissolvido e concentradoduas vezes de 1,0N HCl (250 mL e 200 mL). O produto foidissolvido duas vezes em THF quente e concentrado até secarpara gerar um sólido espumoso. O sólido espumoso foi secosob alto vácuo a 65° por duas horas. Esse sólido foiraspado do frasco e seco no forno a vácuo de um dia para ooutro (60°C, 28 in. Hg) para gerar o sal de cloridrato desulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanóico -5 (50,9 g; 98,3% puro).

LC/MS pelo método M15 gerou tR=l,96 min, com M/Z =563.

LC/MS pelo método M2 gerou tR=l,43 min, com M/Z = 563.1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ, ppm: 0,80 (d, j = 6 Hz,1, 4H) , 1,02 (d, j = 6 Hz, 1,6H), 1,23 (m, 9,2H), 1,80-2,0(AA'BB' + m, 5,2H), 2,99 (d, 3,2H), 3,2-3,45 (m, 4,5H),3,45-3,8 (m, 7,6H), 4,40 (sexteto, 1H) , 4,90 (m, 3H) , 7,00(d, 2H) , 7,23 (d, 2H) , 7,60 (d, 0,25H), 7,75 (d, 1H) , 7,83(d, 0,25H).

13C NMR (CD3OD, 75 MHz) δ, ppm: 6,5, 14,7, 14,8,15,4,15,5, 19,4, 20,0, 20,2, 29,91, 30,44, 33,95, 34,15, 41,03,41,08, (41,71, 41,99, 42,28, 42,6, 42,8, 43,1 - picos desolvente), 47,21, 47,36, 50,01, 50,42, 62,43, 102,11,102,23, 116,78, 124,9, 125,19, 128,54, 129,01, 138,49,139,02, 145,53, 145,60, 145,78, 148,68, 156,77, 156,86,166,91, 167,07.

Exemplo 2

Preparação de ácido (S) -2-(2-(dietilamino)-5-(N-etilmetilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi) fenil)propanóico (7)

Etapa 1: redução de uma etapa/etilação redutiva de (S)-4-ácido

(S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-isopropilmetil(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino)-5-nitropirimidin-4-ilamino)-3-oxoorotjil) fenil r>irrolidina-l-carboxilato (6)

<formula>formula see original document page 76</formula>

Nitro-carbamato (composto 5, 10,8 g, 20 mmol) foidissolvido em THF (35 mL) e água (1 mL, 3 vol%) foiadicionada. A solução foi agitada, catalisador de Adams(0,360 g, 6 mol %) foi adicionado e a solução foidesoxigenada por três ciclos de evacuação (50 mm Hg) erepreenchimento com nitrogênio seco (68,94 KPa) .Finalmente, um frasco de reação foi pressurizado comhidrogênio (413,68 KPa) e mistura de reação foivigorosamente agitada por 90 min. Se necessário oudesejado, o progresso da reação de hidrogenação pode sermonitorada por TLC (silica gel, eluindo comdiclorometano:metanol (95:5)). Rf de nitrocarbamato é 0,95,amina primária = 0,16.

O hidrogênio foi substituído por nitrogênio seco (trêsciclos de evacuação e preenchimento com nitrogênio). 0etanol (25 mL), ácido acético (0,3 mL) e acetaldeído (1,2mL, 21 mmol, 1,05 eq) foram adicionados, o frasco foiparcialmente evacuado em baixas pressões (cerca de 150 mmHg) para minimizar a perda do acetaldeído volátil,repreenchido com nitrogênio (68,94 KPa) e a mistura dereação foi agitada vigorosamente por 50 minutos. Ao finaldesse tempo, nitrogênio foi substituído por hidrogênio(413,68 KPa) por evacuação parcial e re-pressurização comhidrogênio duas vezes. A mistura foi agitada por mais 45minutos. O progresso da aminação redutiva pode sermonitorado por TLC (silica gel, eluindo comdiclorometano:metanol (95:5). Rf de amina primária = 0,16,amina secundária - 0,32 e amina terciária = 0,43. Ao finaldo processo, hidrogênio foi depurado por três ciclos deevacuação e repreenchimento com nitrogênio, o catalisadorfoi filtrado em um leito de Celite usando metanol paraenxaguar, os filtrados foram esvaziados até secar paragerar um óleo âmbar (11,9 g) . 0 produto é sensível aoxigênio, resultando em considerável escurecimento esurgimento de material de baixo Rf em TLC. Todo o manuseiodeve ser feito com precauções adequadas.

O produto de foi purificado por cromatografia flashusando mistura de diclorometano:metanol (97:3), contendo0,3% de hidróxido de amônio. As frações que contêm oproduto de N-etil foram combinadas para gerar 7,9 g docomposto 6 com um óleo âmbar (98,5% puro; 73% derendimento). A pureza do produto bruto parece ser adequadapara vários objetivos, especialmente se o produto dassubseqüentes reações antecipadas é conhecido como sendocristalino.

1H-NMR, CDCl3, (δ): 7,60 (s, 1H) , 7,17 (d, J=8,4Hz,2H) , 7,05 (d, J=8,4Hz, 2H) , 5,75 (d, J=7,5Hz, 1H) , 4,84 (q,J=6, 6Hz, 1H), 3,64-3,46 (m, 8H) , 3,19 (d, J=6,3Hz, 2H) ,2,86 (q, J=7, 2Hz, 2H) , 1,94 (m, 4H) , 1,39 (s, 9H) , 1,20-1,11 (m, 9H).

13C-NMR, CDC13, (6): 171,7, 157,7, 157,5, 153,1,150,3, 145,8, 133,7, 130,2, 121,5, 117,4 81,8, 54,7, 46,4,46,3, 41,7, 37,4, 28,0, 25,8, 24,9, 15,5, 13,5.MS (m/z): 527,3 [M+l].Etapas 2 e 3: ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etilmetilsulfonamido)-pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanõico 7

Após os procedimentos das etapas 2 e 3 do Exemplo 1, ocomposto 6 foi convertido ao ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5- (Netilmetilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico 7correspondente que foi caracterizado como se segue:

1H-NMR, CDCl3, (δ): 8,17 (s, 1H) , 7,77 (s, 1H) , 7,26-7,23 (m, 2H) , 7,00-6,98 (d, 2H) , 4,85-4,82 (m, 1H) , 3,58-3,51 (m, 6H) , 3,43-3,39 (m, 3H) , 2,96-2,84 (m, 3H) , 2,01-1,91 (m, 4H), 1,29-0,97 (m, 9H);

13C-NMR, CDCl3, (Ô) : 175, 6, 165,7, 157,2, 155,2, 152,0,151,8, 151,7, 151,3, 136,0, 135,9, 131,5, 123,0, 110,5,56,7, 43,8, 39,4, 39,2, 37,4, 26,7, 25,8, 14,4, 13,3; e

MS: M(+H) 549.

Exemplo 3

Preparação de ácido (S)-2-(5-(N-ciclopentilmetilsulfonamido)-2-(dietilamino) pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico (8)

<formula>formula see original document page 78</formula>

Após os procedimentos do Exemplo 1 e emprego deciclopentanona no lugar de acetona (Exemplo 1) ouacetaldeído (Exemplo 2), ácido (S)-2-(5-(N-ciclopentilmetilsulfonamido)-2-(dietilamino)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidinalO 1-carboniloxi)fenil)propanóico 8 foipreparado e caracterizado como se segue:

1H-NMR, CDCl3, (δ): 7,74-7,71 (d, 1H) , 7,28-7,24 (m,2H) , 7,04-7,00 (m, 2H) , 5,00-4,95 (m, 1H) , 4,37-4,27 (m,1H) , 3,60-3,37 (m, 9H) , 3,00-2,97 (d, 3H) , 2,03-1,78 (m,6H) , 1,67-1,40 (m, 6H) , 1,31-1,23 (m, 6H) ;

13C-NMR, CDCl3, (δ): 173,6, 173,4, 163,1, 155,1, 152,4,152,0, 145,3, 144,7, 135,5, 135,1, 131,6, 131,4, 123,2,109,6, 109,4, 62,5, 62,3, 56,7, 56,5, 48,1, 40,3, 40,1,36,8, 36,4, 31,2, 30,5, 26,7, 25,8, 23,2, 23,1, 12,7; eMS: M(+H) 589.

Exemplo 4

Preparação de ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-(prop-2-inil)metilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanõico (13)

O protocolo sintético empregado no Exemplo 4 éresumido no Esquema 6 ilustrado abaixo:

<formula>formula see original document page 79</formula><formula>formula see original document page 80</formula>

Esquema 6

Etapa Is (S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino)-5-(N-(metilsulfonil) -metilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino) -3-oxopropil)fenil pirrolidina-l-carboxilato (10)

Aminopirimidina (2,0 g, 4,0 mmol - composto 9)(preparado por redução de composto 1) foi dissolvido emdiclorometano (10 mL) . THF (10 mL) e trietilamina (2,8 mL,20 mmol) foram adicionados e a reação resfriada em um banhode gelo. Metanocloreto de sulfonila (1,1 mL, 14 mmol) foiadicionada e a reação aquecida até a temperatura ambientepor 18 horas. A mistura de reação foi concentrada in vácuoe o resíduo retido em acetato de etila. A solução foilavada com 0,2 N de ácido cítrico, água, NaHCO3 saturado, esalmoura. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4,filtrada, e concentrada in vácuo para gerar produto brutocomo uma espuma marrom. 0 resíduo foi purificado porcromatografia flash (2:3 acetato de etila/hexanos) paragerar 2,2 g (73%) do material di-sulf onilado como umaespuma amarela (composto 1£).

Etapa 2s (S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino)-5-(metilsulfonamido)-pirimidin-4-ilamino)-3-oxopropil)fenilpirrolidina-l-carboxilato (11)

Composto 10 (2,2 g, 3,4 mmol) foi dissolvido emmetanol (5 mL) e THF (5 mL) . 1,0 M K2CO3 (10 mL) foiadicionado e a mistura de reação foi aquecida a 40°C por 96horas. A mistura de reação foi acidifiçada ao pH 3 com 2NHCl e extraída com acetato de etila. A camada orgânica foilavada com salmoura, seca sobre Na2SO4, filtrada, econcentrada in vácuo para gerar 1,68 g (86%) de produtocomo uma espuma bege, composto Yl. O material bruto foiusado sem purificação.

Etapa 3: (S)-4-(3-terc-butoxi-2-(2-(dietilamino)-5-(N-(prop-2-inil)metil-sulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-oxopropil)fenil pirrolidina-l-carboxilato (12)

Composto 11 (0,20 g, 0,35 mmol), K2CO3 (0,073 g, 0,53mmol), e acetona (3 mL) foram colocados em um tubo selado eagitados em temperatura ambiente por uma hora. Cloreto depropargila (0,26 mL, 3,5 mmol) foi adicionado e a reaçãofoi selada e aquecida em refluxo por 48 horas. A mistura dereação foi concentrada in vácuo e o resíduo retido emacetato de etila. A solução foi lavada com água e salmoura.A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada, econcentrada in vácuo para gerar o produto bruto como umfilme laranja. O resíduo foi purificado por cromatografiafIash (1:1 acetato de etila/hexanos) para gerar 0,11 g(51%) de composto 12 como um filme transparente.

MS (m/z) 615, (M+H)+.

Etapa 4: ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-(prop-2-inil)metilsulfonamido)-pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanõico (13)

Ácido fórmico (2 mL) foi adicionado a éster t-butílico(100 mg) e agitado a 40°C de um dia para o outro. O ácidofórmico foi removido sob pressão reduzida para gerarcomposto 13 em rendimento quantitivo e caracterizado comose segue:

1H-NMR, CDCl3, (δ): 8,13 (s, 1H) , 7,97 (s, 1H) , 7,26-7,24 (d, 2H) , 7,02-6,99 (d, 2H) , 4,59-4,44 (m, 1H) , 4,04-3,79 (m, 1H) , 3,64-3,53 (m, 6H) , 3,45-3,39 (t, 3H) , 3,08-2,84 (m, 4H) , 2,84-1,89 (m, 4H)1,22-1,17 (t, 6H) ;

13C-NMR, CDCl3, (δ): 165,3, 155,3, 151,8, 136,1, 131,5,123,0, 76,1, 76,0, 56,8, 49,9, 48,1, 43,8, 41,2, 40,2,37,4, 26,7, 25,9, 13,3; e

MS:M(+H) 559.

Exemplo 5

Preparação de ácido (S)-2 -(2 -(dietilamino)-5-(Ν-metilmetilsulfonamido)-pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanóico (14)

<formula>formula see original document page 82</formula>

Seguinao *os procedimentos ao exemplo 4 e empregandodimetilsulfato no lugar de cloreto de propargila, ocomposto de título foi preparado e foi caracterizado comose segue:

1H-NMR, CDCl3, (δ): 8,14 (s, 1H) , 7,83 (s, 1H) , 7,26-7,23 (d, 2H) , 7,01-6,98 (d, 2H) , 4,84-4,81 (m, 1H) , 3,60-3,53 (m, 6H) , 3,43-3,38 (m, 3H) , 3,09 (s, 3H) , 2,94 (s,3H) , 2,00-1,91 (m, 4H) , 1,22-1,18 (t, 6H) ;

13C-NMR, CDCl3, (δ): 175,5, 165,4, 160,7, 156,3, 155,3,151,8, 149,1, 136,0, 131,6, 123,0, 113,4, 56,9, 43,9, 38,8,38,1, 37,4, 26,7, 25,8, 13,2; e

MS: M(+H) 535.

Exemplo A

Ensaio de adesão de α4β1 Integrina: Adesão de célulaJurkat™ a Fibronectina de Plasma Htimano

Procedimento

Placas de 96 cavidades (placas Costar 3590 EIA) foramrevestidas com fibronectina humana (Gibco/BRL, cat #33016-023) em uma concentração de 10 pg/mL de um dia para o outroa 4°C. As placas foram então bloqueadas com uma solução dealbumina bovina sérica (BSA; 0,3%) em solução salina.Células Jurkat™ (mantidas em crescimento em fase log)foram rotuladas com calceína AM de acordo com as instruçõesdo fabricante, e suspensas em uma concentração de 2 χ IO6células/mL em Hepes/solução salina/BSA. As células foramentão expostas a compostos de teste e controle por 3 0minutos em temperatura ambiente antes de transferência paracavidades individuais da placa revestida com fibronectina.

A adesão foi permitida por 35 minutos a 37°C. As cavidadesforam então lavadas por leve aspiração e pipetagem comsolução salina fresca. Fluorescência associada com ascélulas aderentes restantes foi quantificada com o uso deum leitor fluorescência de placa a EX 485/EM 530.

As culturas de células foram preparadas por divisãodas células Jurkat™ em fase estacionária a 1:10 no dia um1:2 no dia dois para realizar o ensaio no dia 3. As célulasdivididas a 1:10 no dia um foram divididas a 1:4 no dia 3para um ensaio de dia 4.

As placas do ensaio foram preparadas primeiramentefazendo uma solução de trabalho de Gibco/BRL FibronectinaHumana (cat # 33016-023) em PBS++, a 10 μg/mL.

Uma placa Costar 3590 EIA foi então revestida com5Ομίνcavidade por 2 horas em temperatura ambiente (eboraela possa ser deixada de um dia para o outro a 4 °C).Finalmente a placa foi aspirada e bloqueada com tampãoHepes/Solução salina, 100 μL/cavidadeí por 1 hora em rtseguido por lavagem três vezes com 150 μΐι de PBS++.

As diluições do Composto foram realizadas porpreparação de diluições em série de 1:3 dos compostos comose segue. Para cada placa (4 compostos/placa) 600 μL, foramadicionados a 4 Bio-Rad Titertubes em uma estante deTitertube. Composto suficiente foi adicionado a cada tuboadequado para gerar uma concentração de 2X com o uso demétodos bem conhecidos na técnica. Com o uso de FalconFlexiplates, 100 μL, de tampão Hepes/Solução salina ou sorohumano foram adicionados as fileiras BaG. Um pipetador demulticanal ajustado a 18 0 μL foi usado com quatro pontasespaçadas uniformemente no pipetador. Cada conjunto dequarto tubos foi misturado 5 vezes e 18 0 μL de 2X compostofoi transferido à primeira coluna de cada diluição decomposto na fileira B, deixando a fileira A vazia. 180 μLforam adicionados às outras cavidades na fileira A.Diluições em série foram realizadas na placa portransferência de 50 μL à próxima diluição e mistura 5vezes, trocando as pontas a cada vez depois da mistura. Asdiluições foram interrompidas na fileira F. a fileira G nãoteve qualquer composto presente.

Uma solução de 20 μg/mL no tampão HEPES/solução salinaou soro humano de anticorpo 21/6 foi o controle positivo efoi deixada de lado em um reagente para adicionar à placade suspensão de células.

A coloração da célula foi realizada primeiramente porcoleta das células Jurkat™ de fase log por centrifugaçãoem tubos de 50 mL (1.100 rpm por 5 minutos). As célulasforam ressuspensas em 50 mL PBS++, giradas, e ressuspensasem 20 mL PBS++. As células foram coradas por adição de 20μm de Calceína AM por 3 0 minutos em RT. O volume foitrazido a 50 mL com tampão HEPES/solução salina e ascélulas foram contadas, giradas, e ressuspensas a 2 χ IO6células/mL em tampão HEPES/solução salina ou soro humano.

Os compostos foram incubados com o uso do seguinteprocedimento. Em uma nova flexiplate, 65 μL, de célulascoradas foram adicionados às fileiras BaH. então 65 μL,de 2X compostos foram adicionados às fileiras adequadasseguindo o ajuste de placa e misturadas 3X. 65 μL, deanticorpo 2X-21/6 foram adicionados à fileira H emisturados 3 vezes. Finalmente, a placa foi incubada emtemperatura ambiente por 30 minutos.

A adesão de fibronectina foi medida com o uso de umleitor de placa fluorescente a EX 485/EM 530 depois doseguinte procedimento de desenvolvimento. Após incubação,as células foram misturadas 3X e 100 μL foram transferidospara as placas revestidas com fibronectina e incubadas a37°C por cerca de 35 minutos. Cada placa foi lavada,fileira por fileira, por leve pipetagem de 100 μL de RTPBS++ nas laterais das cavidades e virando a placa 90 grauspara aspirar. Esse procedimento foi repetido por um totalde 3 lavagens. Cada cavidade foi preenchida com 100 μL,depois de lavagem por pipetagem das laterais da cavidade.

Um valor de IC50 foi calculado para cada composto,ambos na presença do soro humano e na ausência de sorohumano. IC50 é a concentração em que o crescimento ouatividade é inibida em 50%. Os compostos aqui reveladostodos tiveram uma IC50 de menos que 0,1 μΜ quando testadosde acordo com o ensaio de fibronectina.

Exemplo B

Ensaio de saturação in vitro para determinação da ligaçãode compostos candidatos para α4βι

Células Jurkat™ em crescimento Iog foram lavadas eressuspensas em plasma animal normal contendo 20 μ9/πι1ι doanticorpo 15/7 (Yednock, e cols., J. Biol. Chem., (1995)270(48):28740).

As células Jurkat™ foram diluídas duas vezes emamostras de plasma normal contendo quantidades conhecidasdo composto candidato em várias concentrações, variando de66 μΜ a 0,01 μΜ, usando uma diluição serial padrão de 12pontos para uma curva-padrão, ou em amostras de plasmaobtidas do sangue periférico de animais tratados com ocomposto candidato.

As células foram então incubadas por 3 0 minutos emtemperatura ambiente, lavadas duas vezes com solução salinatamponada com fosfato ("PBS") contendo 2% soro bovino fetale 1 mM de cada um de cloreto de cálcio e cloreto demagnésio (meio de ensaio) para remover anticorpo 15/7 nãoligado.

As células foram então expostas à Fc de IgG de cabraF(ab')2 anticamundongo conjugada à ficoeritrina(Immunotech, Westbrook, ME), que havia sido adsorvida paraqualquer reatividade cruzada inespecífica por co-incubaçãocom soro 5% da espécie animal que está sendo estudada, a1:200, e incubadas no escuro a 40C por 3 0 minutos.

As células foram lavadas duas vezes com meio deensaio, e ressuspensas no mesmo. Elas foram entãoanalisadas por análise em um classificador de célulaspadronizado ativado por fluorescência ("FACS"), comodescrito em Yednock e cols., J. Biol. Chem., 1995, 270:28.740.

Os dados foram então transformados em um gráfico defluorescência versus dose, por exemplo, de uma forma dose-resposta normal. Os níveis de dose que resultam no platôsuperior da curva representam os níveis necessários para seobter eficácia em um modelo in vivo.

Os resultados do ensaio de potência dependente de a4in vitro indicam que certos compostos dessa invenção,quando testados neste ensaio, mostraram inibição daintegrina α4βι em uma EC50 de menos de 2 0 μg/mL.

Exemplo C

Ensaio in vitro para a determinação da ligação de compostosà VLA-4

Foi usado um ensaio in vitro para avaliar a ligação decompostos candidatos à integrina α4βι· Compostos que seligam nesse ensaio podem ser usados para avaliar os níveisde VCAM-I em amostras biológicas por ensaios convencionais(por exemplo, ensaios competitivos). Esse ensaio é sensívelaos valores de IC50 tão baixos quanto cerca de 1 μΜ.

A atividade da integrina α4βι foi medida pelainteração de VCAM-I solúvel com células Jurkat™ (porexemplo, Nos na "American Type Culture Collection" TIB 152,TIB 153, e CRL 8163), uma linhagem de célula T humana queexpressa altos níveis de integrina α4βι· VCAM-I interagecom a superfície celular de uma forma dependente daintegrina α4βι (Yednock, e cols. J. Biol. Chem., 1995, 270:28.740) .

VCAM-I solúvel recombinante foi expressa como umaproteína de fusão quimérica contendo os sete domíniosextracelulares de VCAM-I no terminal Nea região constanteda cadeia pesada de IgGi humana no terminal C. A proteínade fusão de VCAM-I foi feita e purificada pela formadescrita por Yednock, supra.

As células Jurkat™ cresceram em RPMI 164 0suplementado com soro bovino fetal 10%, penicilina,estreptomicina e glutamina, como descrito por Yednock,supra.

As células Jurkat™ foram incubadas com 1,5 mM de MnCle 5 μg/mL de anticorpo 15/7 por 3 0 minutos no gelo. Mn+2ativa o receptor para intensificar a ligação de ligante, e15/7 é um monoclonal anticorpo que reconhece umaconformação ocupada de ativada/ligante da integrina α4βχ etrava a molécula nessa conformação estabilizando, dessaforma, a interação VCAM-I/integrina α4βι. Yednock, e cols.,supra. Foram preparados anticorpos similares ao anticorpo15/7 por outros pesquisadores (Luque, e cols., 1996, J.Biol. Chem. 271: 11,067) e podem ser usados nesse ensaio.

As células foram então incubadas por 3 0 minutos emtemperatura ambiente com compostos candidatos, em váriasconcentrações, variando de 66 μΜ a 0,01 μΜ, com o uso deuma diluição serial padronizada de 5 pontos. Foram entãoadicionados 15 μΐ, de proteína de fusão de VCAM-I solúvelrecombinante às células Jurkat™, e estas foram incubadaspor 30 minutos no gelo. Yednock e cols., supra.

As células foram então lavadas duas vezes eressuspensas em Fc de IgG de cabra F(ab')2 anticamundongoconjugado à PE (Immunotech, Westbrook, Me.) a 1:200, eincubadas no gelo, no escuro, por 3 0 minutos. As célulasforam lavadas duas vezes e analisadas por análise com umclassificador de células padrão ativado por fluorescência("FACS"), como descrito em Yednock, e cols., supra.

Os compostos que possuem uma IC50 de menos de cerca de15 μΜ possuem afinidade de ligação por α4βι.

Quando testados nesse ensaio, os compostos preparadosnos exemplos acima possuem, ou espera-se que possuam, umaIC50 de 15 μΜ ou menos (ou espera-se que sejam ativos invivo). Certo composto desse ensaio teve uma IC50 de menosde 5 μΜ.

Exemplo D

Dosagem do cassete e análise sêrica para determinação debiodisponibilidade

A biodisponibilidade oral foi avaliada dosando-seratos com um cassete, ou seja, uma mistura de 6 compostospor solução de dosagem. 0 cassete inclui 5 artigos de testee um composto-padrão, para uma dose total de 10 mg/kg. Cadacomposto/artigo de teste foi convertido no sal de sódio com1 N NaOH eqüimolar, e dissolvido em água a 2 mg/mL. 0cassete foi preparado por mistura de volumes iguais de cadauma das seis soluções. A solução de dosagem do cassete foibem misturada, e então o pH foi ajustado até 7,5-9. Asolução de dosagem foi preparada no dia anterior ao estudo,e era agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente.

Machos de ratos Sprague Dawley (SD) de Charles RiverLaboratories, com 6-8 semanas de idade, foram usados nessaavaliação. Os ratos permaneceram em quarentena por pelomenos um dia, e tinham acesso contínuo à ração e água. Nanoite anterior à administração do cassete, os ratos ficaramem jejum por aproximadamente 16 horas.

Quatro ratos SD foram designados a cada cassete. Umadose única da solução de dosagem foi administrada oralmenteem cada rato. 0 volume de dosagem (5 mL/kg) e o momentoforam registrados, e os ratos foram alimentados 2 horasapós a dosagem.

Foram coletadas amostras de sangue por meio de punçãocardíaca nos seguintes pontos do tempo: 4 h, 8 h e 12 h.Imediatamente antes da coleta de sangue, os ratos eramanestesiados com gas CO2 por até 10-20 segundos. Após asamostras de 12 horas terem sido coletadas, os ratos foramsacrificados por meio de asfixia com CO2, seguida pordeslocamento cervical.

As amostras de sangue forma mantidas em tubosmicrotainer heparinizados em uma temperatura abaixo datemperatura ambiente (4°C), antes de serem processados. Asamostras de sangue foram centrifugadas (10.000 rpm por 5minutos) , e as amostras de plasma foram removidas earmazenadas em um congelador a -20°C, até serem analisadasquanto aos níveis medicamento. Os níveis de medicamento noplasma foram analisados com o uso do seguinte protocolopara precipitação direta do plasma.

As amostras de plasma in vivo foram preparadas em umaplaca de 96 cavidades de 1,5 mL, adicionando-se, em ordem,100 μm do plasma de teste, 150 μΐ, de metanol, seguindo porturbilhonamento por 10-20 segundos. Foram acrescentados 150μΕ de 0,05 ng^L de um Padrão Interno em acetonitrila, eturbilhonados por 3 0 segundos.

As amostras da curva-padrão foram preparadas em umaplaca de 96 cavidades de 1,5 mL, adicionando-se, em ordem,100 μL de plasma de camundongo de controle, seguido por 150μL de metanol, e turbilhonamento por 10-20 segundos. Foramacrescentados 150 μΙ, de 0,05 ng^L de um Padrão Interno emacetonitrila, e turbilhonados por 30 segundos. As amostrasforam salpicadas com 0-200 ng (10 concentrações) docomposto de interesse em metanol 50%, para se obter umafaixa da curva-padrão de 0,5 ng/mL a 2.000 ng/mL.Novamente, a amostra é turbilhonada por 3 0 segundos.

As amostras foram então centrifugadas por 20-3 0minutos a 3.000 rpm em uma microcentrifuga Eppendorf, antesde 80-90% dos sobrenadantes serem transferidos em uma placade 96 cavidades limpa. O solvente orgânico era entãoevaporado, até que as amostras estejam secas (sob N2 a40°C/30-60 min (Zymark Turbovap)).

0 resíduo foi então dissolvido em 200-600 L de fasemóvel (CH3OH 50%/TFA 0,1%). LC/MS/MS foi então executadacom o uso de um espectrômetro de massa triplo de quadripoloPE-Sciex API-3000 (SN0749707), Perkin-Elmer, auto-samplerSérie 200 e bomba Shimadzu de 10 A. A aquisição foi feitacom PE-Sciex Analyst (v 1.1) e a análise e quantificaçãodos dados foram obtidas com o uso de PE-Sciex Analyst (v1.1). Um volume de amostra de 5-50 μΐ, foi injetado sobreuma coluna de fase reversa Thermo Hypersil DASH-18(Keystone 2,0 χ 20 mm, 5 μτη, Peça Numerada: 8823025-701),usando uma fase móvel de CH3OH 25%, TFA 0,1%-100% CH3OH,TFA 0,1%. O tempo de execução foi de cerca de 8 minutos, emuma taxa de fluxo de cerca de 3 00 pL/minuto.

A Área sob a Curva (AUC) foi calculada com o uso daregra trapezoidal linear de t = 0 até o último tempo decoleta de concentração de plasma tx (veja "Handbook ofBasic Pharmacokinetics", Wolfgang A. Ritschel e Gregory L.Kearns, 5a ed, 1999).

<formula>formula see original document page 92</formula>

No caso do paradigma de dosagem do cassete, amostrasem 4, 8 e 12 horas após a dosagem extravascular, a AUC foicalculada a partir de t = O até t = 12 h.

Cada um dos compostos nos Exemplos 1-5 acima, quandotestados nesse ensaio, forneceu uma AUC de pelo menos 5μgh/mLf quando normalizada para administração em uma dosede 10 mg/kg.

Exemplo E

Modelos de asma (El)

As condições inflamatórias mediadas pela integrinaα4βι incluem, por exemplo, influxo de eosinófilos, ahiperreatividade das vias aéreas e oclusão que ocorre naasma crônica. A seguir, serão descritos modelos animais deasma que são usados para estudar os efeitos in vivo doscompostos dessa invenção para uso no tratamento de asma.

Modelo de asma em ratos (E2)

De acordo com os procedimentos descritos por Chapman,e cols., Am J. Resp. Crit. Care Med., 153-4, A219 (1996) eChapman, e cols., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 155:4, A881(1997), ambos incorporados por referência em suatotalidade.

Ovalbumina (OA; 10. μg/mL) é misturada com hidróxidoalumínio (10 mg/mL) e injetada (i.p.) em ratos Brown Norwayno dia 0. As injeções de OA, junto com adjuvante, sãorepetidas nos dias 7 e 14. No dia 21, os animaissensibilizados são contidos em tubos plásticos e expostos(60 minutos) a um aerossol de OA (10 mg/kg) em um sistemade exposição exclusivamente nasal. Os animais sãosacrificados 72 horas mais tarde com pentobarbital (250mg/kg, i.p.) . Os pulmões são lavados por meio de uma cânulatraqueal usando 3 alíquotas (4 mL) de solução de Hank (HBSSχ 10, 100 mL; EDTA 100 mM, 100 mL; HEPES 1 M, 25 mL;completado até 1 L com H2O) ; as células recuperadas sãoreunidas em pool, e o volume total de líquido recuperadoajustado até 12 mL por adição de solução de Hank. Ascélulas totais são contadas (contador de microcélulasSysmex F-500, TOA Medicai Electronics Otd., Japão) e sãofeitos esfregaços por diluição do líquido recuperado (atéaproximadamente IO6 células/mL), e pipeta-se uma alíquota(100 μL) em uma centrífuga (Cytospin, Shandon, U.K.). Osesfregaços são secos ao ar, fixados usando uma solução deverde rápido em metanol (2 mg/mL) por 5 segundos e coradoscom eosina G (5 segundos) e tiazina (5 segundos)(DiffQuick, Browne Ltd. U.K.), em ordem, para diferenciareosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos. Um totalde 500 células por esfregaço é contado por microscopiaóptica sob imersão em óleo (x 100) . Os compostos dessainvenção podem ser formulados em uma suspensão decarboximetilcelulose 0,5% e Tween 8 0 2%, e administradosoralmente aos ratos que haviam sido sensibilizados aoalérgeno, ovalbumina. Os compostos que inibiram acúmulo deleucócitos induzido por alérgeno nas vias aéreas de ratosBrown Norway sensibilizados ativamente são consideradoscomo sendo ativos neste modelo.

Modelo de asma em camundongos (E3)

Os compostos também são avaliados em um modelo emcamundongos de inflamação pulmonar aguda de acordo com osprocedimentos descritos por Kung, e cols., Am. J. Respir.Cell Mol. Biol., 13: 360-365, (1995) e Schneider, e cols.,(1999). Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20: 448-457, (1999),cada um dos quais sendo incorporado por referência em suatotalidade. Fêmeas de camundongos Black/6 (8-12 semanas deidade) são sensibilizadas no dia 1 por uma injeçãointraperitoneal de 0,2 mL de uma mistura de ova/alumecontendo 20 μg de ova (Grau 4, Sigma) e 2 mg de Alumeinjetado (Pierce). Uma injeção de reforço é administrada nodia 14. Os camundongos são atacados nos dias 28 e 29 com 1%ova em aerossol (em solução salina 0,9%) por 20 minutos. Oscamundongos são sacrificados, e são coletadas amostras delavado bronco-aveolar (3 mL) no dia 30, 4 8 horas após oprimeiro ataque. Os eosinófilos são quantificados por ummétodo de coloração FACS/FITC. Os compostos dessa invençãosão formulados em uma suspensão de carboximetilcelulose0,5% e Tween 80 2%, e administrados oralmente aoscamundongos que haviam sido sensibilizados ao alérgeno,ovalbumina. Os compostos que inibiram o acúmulo deleucócitos induzido por alérgeno nas vias aéreas decamundongos C57BL/6 sensibilizados ativamente sãoconsiderados como sendo ativos neste modelo.Modelo de asma em carneiros (E4)

Esse modelo emprega os procedimentos descritos porAbraham, e cols., J. Clin, Invest, 93: 776-787 (1994) eAbraham, e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156: 696-703 (1997), ambos incorporados por referência em suatotalidade. Os compostos dessa invenção são avaliados poradministração intravenosa (solução salina aquosa), oral(Tween 80 2%, carboximetilcelulose 0,5%) e aerossol acarneiros que são hipersensíveis ao antígeno de Ascarissuum. Os compostos que diminuem a resposta precoce inicialinduzida por antígeno e/ou bloqueiam a resposta da fasetardia das vias aéreas, por exemplo, possuem um efeitoprotetor contra respostas tardias induzidas por antígeno ehiperreatividade das vias aéreas ("AHR"), são consideradoscomo sendo ativos neste modelo.

Carneiros alérgicos que comprovadamente desenvolvemrespostas brônquicas tanto precoces quanto tardias aoantígeno inalado de Ascaris suum são usados para estudar osefeitos nas vias aéreas dos compostos candidatos. Apósanestesia tópica das passagens nasais com lidocaína 2%, umcateter em balão é introduzido através da narina até ointerior do esôfago inferior. Os animais são entãoentubados com um tubo endotraqueal com balão através daoutra narina, com um broncoscópio flexível de fibra ópticacomo guia.

A pressão pleural é estimada de acordo com Abraham(1994). Os aerossóis (veja a formulação abaixo) são geradoscom o uso de um nebulizador médico descartável que gera umaerossol com um diâmetro aerodinâmico mediano de massa de3,2 μm, como determinado com um impactador em cascataAndersen. O nebulizador é conectado a um sistema dedosímetro que consiste em uma válvula solenóide e uma fontede ar comprimido (137,89 kPa) . A saída do nebulizador édirigida a um tubo em "T" de plástico, do qual uma dasextremidades está conectada ao acesso inspiratório de umrespirador em pistão. A válvula solenóide é ativada por 1segundo no início do ciclo inspiratório do respirador. Osaerossóis são liberados a um VT de 500 mL e a uma taxa de20 respirações/minuto. Uma solução somente de bicarbonatode sódio 0,5% é usada como controle.

Para avaliar a capacidade de resposta brônquica, sãogeradas curvas cumulativas de concentração-resposta aocarbacol de acordo com Abraham (1994). São feitas biópsiasbrônquicas antes e depois do início do tratamento, e 24horas após o ataque com o antígeno. As biópsias brônquicassão realizadas de acordo com Abraham (1994).

Um estudo de adesão in vitro de macrófagos alveolarestambém pode ser realizado de acordo com Abraham (1994), euma percentagem de células aderentes pode ser calculada.

Formulação em aerossolUma solução do composto e uma solução de bicarbonatode sódio 0,5%/solução salina (p/v) em uma concentração de30,0 mg/mL são preparadas usando o seguinte procedimento:

A. Preparação de solução de estoque de bicarbonato desódio 0,5%/solução salina: 100/0 mL

<table>table see original document page 96</column></row><table>

Procedimento:

1. Adicionar 0,5 g de bicarbonato de sódio em umfrasco volumétrico de 100 mL.

2. Adicionar aproximadamente 90,0 mL de solução salinae sonificar até dissolvidos.

3. Q.S. até 100.0 mL com solução salina e misturarcuidadosamente.

<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table>

Procedimento:

1. Adicionar 0,3 00 g do composto em um frascovolumétrico de 10,0 mL.

2. Adicionar aproximadamente 9,7 mL de solução deestoque de bicarbonato de sódio 0,5%/solução salina.

3. Sonificar até que o composto esteja completamentedissolvido.

4. Q.S. até 10,0 mL com solução de estoque debicarbonato de sódio 0,5%/solução salina e misturarcuidadosamente.

Exemplo F

Artrite induzida por adjuvante em ratos

A artrite induzida por adjuvante ("AIA") é um modeloanimal útil no estudo de artrite reumatóide ("RA "), que éinduzida por injeção de M. tuberculosis na base do rabo deratos Lewis. Entre 10 e 15 dias após a injeção, os animaisdesenvolvem uma artrite grave e progressiva.

Geralmente, os compostos são testados quanto à suahabilidade para alterar o edema da pata traseira e o danoósseo que resultam do edema induzido por adjuvante emratos. Para quantificar a inibição do edema da patatraseira resultante de AIA, foram definidas duas fases deinflamação: (1) a pata traseira primária e secundáriainjetada, e (2) a pata traseira secundária não injetada,que geralmente começa a se desenvolver cerca de onze dias apartir a indução de inflamação na pata injetada. A reduçãodesse último tipo de inflamação é uma indicação deatividade imunossupressora. Cf. Chang, Arth. Rheum., 20,1.135-1.141 (1977).

A utilização de um modelo animal de RA, como AIA,permite o estudo dos eventos celulares envolvidos nosestágios iniciais da doença. A expressão de CD44 emmacrófagos e linfócitos está supra-regulada durante odesenvolvimento inicial da artrite por adjuvante, enquantoa expressão de LFA 1 é está supra-regulada mais tarde nodesenvolvimento da doença. A compreensão das interaçõesentre as moléculas de adesão e o endotélio nos estágiosmais iniciais da artrite por adjuvante poderia levar aavanços significativos nos métodos usados no tratamento da RA.

Exemplo G

Artrite induzida por colágeno em ratos

Finalidade: determinar a eficácia de um composto dainvenção representativo ("Composto A") administrado pordosagem por via oral duas vezes ao dia (Dias (-1) -2 0) parainibição da inflamação, destruição de cartilagem ereabsorção óssea que ocorre no desenvolvimento de artritepor colágeno do tipo II em ratos.

Animais: 54 fêmeas de ratos Lewis (Harlan), pesando125-150 g na chegada (injetar 50 com colágeno para gerar 50responsivos nos dias 10, 11, 12 para 6 grupos de 10). Osanimais (10/grupo para artrite, 4/grupo para controlenormal), abrigados a 4-5/gaiola, foram aclimatados por 4-8dias. Os animais foram dosados a 3 mg/kg por via oral duasvezes ao dia, 10 mg/kg por via oral duas vezes ao dia e 30mg/kg por via oral duas vezes ao dia.Materiais: agentes ou medicamentos em veículo,colágeno do Tipo II, adjuvante incompleto de Freund,metotrexate (Sigma), Composto A

Design geral do estudo

A dosagem foi iniciada no dia menos 1.

Os animais aclimatados foram anestesiados comisoflurano e receberam injeções de colágeno (DO). No dia 6,eles foram anestesiados novamente para a segunda injeção decolágeno. 0 colágeno foi preparado produzindo-se umasolução de 4 mg/mL em 0,01 N ácido acético. Volumes iguaisde colágeno e adjuvante incompleto de Freund foramemulsifiçados misturando-se manualmente, até que um glóbulodesse material mantivesse sua forma ao ser colocado naágua. Cada animal recebeu 3 00 μΐϋ da mistura em cada vez,espalhados sobre 3 locais no dorso.

As medições das articulações normais do tornozelodireito e esquerdo (pré-doença) foram feitas no dia 9.

Nos dias 10-12, ocorreu o surgimento da artrite.

Os ratos foram pesados nos dias (-) 1, 6, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 do estudo e as médicascom compasso dos tornozelos foram feitas todos os dias,começando no dia 9. Os pesos corporais finais foram medidosno dia 20. Após a medida final do peso corporal, os animaisforam anestesiados para a coleta de plasma terminal edepois sacrificados.

Tanto as patas traseiras e quanto os joelhos foramremovidos. As patas traseiras foram pesadas, colocadas (comos joelhos) em formalina e então processadas paramicroscopia.

Processamento das articulaçõesApós 1-2 dias de fixadas e depois 4-5 dias emdescalcificador, as articulações do tornozelo foramcortadas na metade longitudinalmente, os joelhos formacortados na metade no plano frontal, processados,embebidos, cortados e corados com azul de toluidina.

O composto A demonstrou inibição significativa,comparado com controles que não receberam tratamento para ainflamação do tornozelo e histopatologia do tornozelo nasdoses testadas (3,0 mg/kg, 10,0 mg/kg e 30,0 mg/kg).

Exemplo H

Indução de colite em ratos HLA-B27

A eficácia dos compostos da presente invenção nareversão de colite foi determinada em ratos transgênicosHLA-B27. Ratos transgênicos HLA-B27 têm sido utilizadoscomo um modelo animal de doença intestinal inflamatória quesimula a doença de Crohn em seres humanos. Os ratossuperexpressam as proteínas da cadeia pesada humana daclasse I de MHC HLA-B27 e da microglobulina beta-2, queinduzem diversas doenças autoimunes que incluem inflamaçãodo cólon.

O efeito terapêutico do Composto A dessa invenção naresolução de colite foi avaliado em ratos transgênicos HLA-B27. Os ratos doentes receberam doses subcutâneas de 100mg/kg do Composto A dessa invenção duas vezes ao dia, por16 dias. As amostras dos animais que receberam 100 mg/kg doComposto A dessa invenção mostravam resolução clínica ehistológica de colite e simularam eficácia similar com ogrupo de controle positivo tratado com anticorpo anti-alfa4GG5/3.

As pontuações do índice de Atividade da Doença (DAI)indicaram pontuações gerais melhores para ratos quereceberam 100 mg/kg do Composto A dessa invenção e 10 mg/kgde GG5/3 (controle positivo) do que ratos que receberamveículo. A consistência fecal e as pontuações FOB para osratos que receberam o Composto A e GG5/3 foramestatisticamente diferentes do grupo de veículo.

Indução de coliteVinte ratos transgênicos HLA-B2 7 (6-9 semanas deidade) foram obtidos de Taconic. Os ratos se aclimataramnas instalações dos animais por 10 semanas. A forração dosleitos dos animais de diferentes gaiolas foi misturada umavez por semana para controlar a flora ambiental "suja".

Tratamentos

Os ratos foram arrolados e randomizados em quatrogrupos (n = 5) com base no peso e nas pontuações DAI (FC >3, FOB > 2). Os grupos experimentais receberamadministrações subcutâneas do Composto A de 100 mg/kg (pH2,8) duas vezes ao dia, por 16 dias. Os grupos de controleincluíram um grupo tratado com veículo (pH 3,2) e um grupode controle positivo GG5/3 (anticorpo de camundongo anti-integrina alfa-4 de rato) que recebeu administraçõessubcutâneas de 10 mg/kg (5 mL/kg) em dO, d3 e d6, eterminaram em platô no d8 (Tabela Hl) . Os tratamentos comComposto A e veículo foram formulados a cada 5 dias.

Tabela Hl - Design do estudo para IBP.

<table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table>

Leituras finais

As pontuações do índice de Atividade da Doença, oteste de consistência fecal e o teste de sangue oculto nasfezes foram feitos 4 vezes por semana para a geração depontuações clínicas in-life. A leitura primária para oestudo foi uma análise histopatológica do ceco, cólonproximal, cólon médio e cólon distai. Foi aplicado umsistema de pontuação IBD (Tabela H2).

Tabela H2 - Sistema de pontuação IBD

<table>table see original document page 102</column></row><table>

As pontuações do índice de Atividade da Doença (DAI)foram menores para ratos que receberam o Composto A e GG5/3(controle positive) do que para o grupo de veículo. Aspontuações AUC para o teste de consistência fecal e desangue oculto nas fezes para os grupos que receberam oComposto A e GG5/3 (controle positivo) também foramestatisticamente diferentes das do veículo.

Embora tenham sido ilustradas e descritas algumasmodalidades da invenção, será observado que poderão serfeitas várias modificações, sem se afastar do espírito e doescopo da invenção.

Claims

1. Composto de fórmula I:<formula>formula see original document page 104</formula>caracterizado pelo fato de que:R1 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil e C1 a C4 haloalquil; eR2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-C6cicloalquil;ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdestes.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R1 é C1 a C 2 alquil.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R1 é metil ou trifluormetil.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R1 é metil.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R2 é C1 a C 4 alquil.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R2 é C1 a C 3 alquil.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que R2 é metil ou etil.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que R2 é isopropil.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R2 é C3 a C6 cicloalquil.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que R2 é ciclopentil.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R2 é C2 a C4 alquenil.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que R2 é alil.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que R2 é C2 a C4 alquinil.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que R2 é propargil.

15. Composto de fórmula II:<formula>formula see original document page 105</formula>caracterizado pelo fato de que:R1 é selecionado do grupo que consiste em Ci a C4alquil e C1 a C4 haloalquil; eR2 é selecionado do grupo que consiste em Ci a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-C6cicloalquil;ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdestes.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R1 é Ci a C2 alquil.

17. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R1 é metil ou trif luormetil.

18. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R1 é metil.

19. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R2 é Ci a C4 alquil.

20. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R2 é Ci a C3 alquil.

21. Composto, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que R2 é metil ou etil.

22. Composto, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que R2 é isopropil.

23. Composto, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que R2 é C3 a C6 cicloalquil.

24. Composto, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que R2 é ciclopentil.

25. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R2 é C2 a C4 alquenil.

26. Composto, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que R2 é alil.

27. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R2 é C2 a C4 alquinil.

28. Composto, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que R2 é propargil.

29. Composto caracterizado por ser selecionado dogrupo que consiste em:ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etil-l,l,l-trifluormetilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-isopropilmetilsulfonaraido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(5-(N-ciclopentilmetilsulfonamido)-2-(dietilamino)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-metilmetilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-(prop-2-inil)metilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etilmetilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(5-(N-alilmetilsulfonamido)-2-(dietilamino)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-1-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etilbutilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)-propanóico;ácido (S)-2-(5-(3-cloro-N-etilpropilsulfonamido)-2-(dietilamino)-pirimidin-4-ilamino) -3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi) fenil)propanóico;ácido (S)-2-(5-(3-cloro-N-metilpropil-sulfonamido)-2-(dietilamino)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi) fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etil-3,3,3-trifluorpropilsulfonamido)-pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)propanóico;ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etilpropilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3-(4-(pirrolidina-l-carboniloxi)fenil)-propanóico; eácido (S)-2-(2-(dietilaraino)-5-(N-etil-2-metilpropilsulfonamido)pirimidin-4-ilamino)-3- (4-(pirrolidina-l-carboniloxi)-fenil)propanóico;assim como sais ou ésteres farmaceuticamenteaceitáveis destes.

30. composição farmacêutica caracterizada porcompreender um veículo farmaceuticamente aceitável e umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais doscompostos como apresentado na reivindicação 1.

31. Método para o tratamento de uma doença mediadapelo menos em parte por a4 integrina em um paciente, cujométodo caracterizado por compreender a administração de umacomposição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30.

32. Método para a redução e/ou prevenção de umcomponente inflamatório de uma doença em um pacientemamífero, cujo método caracterizado por compreender aadministração ao referido mamífero da composiçãofarmacêutica da reivindicação 30.

33. Método para a redução e/ou prevenção de umaresposta autoimune em um paciente mamífero, cujo métodocaracterizado por compreender a administração ao referidomamífero da composição farmacêutica da reivindicação 30.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada deasma, esclerose múltipla e doença intestinal inflamatória.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a doença é doença de Crohn.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a doença é artritereumatóide.

37. Método para a preparação de um composto defórmula I:<formula>formula see original document page 109</formula>em que:R1 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil e C1 a C4 haloalquil; eR2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-C6cicloalquil;ou sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveisdestes,o método caracterizado por compreender:a) o contato de um composto de fórmula III<formula>formula see original document page 109</formula>em que Pg é um grupo de proteção de carboxil;com um C1 a C4 aldeído ou cetona, um C2 a C4 alquenilaldeído ou cetona, C2 a C4 alquinil aldeído ou cetona, C3-C6cicloalquil cetona e benzaldeído sob condições de aminaçãoredutoras para fornecer um composto de fórmula IV:<formula>formula see original document page 110</formula>b) o contato do composto IV com um haleto desulfonila de fórmula R1SO2Zem que Z é halo sob condições para formar um compostode fórmula V:<formula>formula see original document page 110</formula>c) remoção do grupo de proteção de carboxil parafornecer um composto de fórmula I.

38. Método para a preparação de um composto defórmula I:<formula>formula see original document page 110</formula>em que:R1 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil e C1 a C4 haloalquil; eR2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil, C2 a C4 alquinil, e C3-C6cicloalquil;ou sais ou ésteres farraaceuticamente aceitáveisdestes,o método caracterizado por compreender:a) o contato de um composto de fórmula VI<formula>formula see original document page 111</formula>em que Pg é um grupo de proteção de carboxil;com um excesso de r'S02X para fornecer um composto defórmula VII:<formula>formula see original document page 111</formula>b) remoção seletiva de um único grupo -SO2R' docomposto de fórmula VII para fornecer um composto defórmula VIII:<formula>formula see original document page 111</formula>c) contato do composto VIII com um agente dealquilação com uma fórmula R2-X, em que X é halo, ou comdimetilsulfato quando R2 é metil, para formar um compostode fórmula IX:<formula>formula see original document page 112</formula>d) remoção do grupo de proteção de carboxil parafornecer um composto de fórmula I.