BRPI0620264A2

BRPI0620264A2 - quinazolonas aril-substituìdas e sua utilização

Info

Publication number: BRPI0620264A2
Application number: BRPI0620264-0A
Authority: BR
Inventors: Michael Pierce; Sudhir Sahasrabudhe; Robert Selliah; Longwu Qi; Raj Gopal Venkat; Paul B Robbins
Original assignee: Prolexys Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2011-11-08
Also published as: CA2634768A1; AU2006330883A1; US20110092489A1; US8575143B2; TW200804350A; WO2007076087A2; JP2009521484A; EP1999116A2; WO2007076087A3

Abstract

QUINAZOLONAS ARIL-SUBSTITUìDAS E SUA UTILIZAçãO. Compostos representados pela Fórmula Estruturei (1) são úteis, por exemplo, na efetiva aniquilação ou redução da taxa de proliferação das células cancerosas, tais como em pacientes que sofrem de câncer. Em adição aos composros propriamente, a invenção proporciona composições farmaceuticas dos compostos e método de tratamento utilizando os compostos.

Description

"QUINAZOLONAS ARIL-SUBSTITUIDAS E SUA UTILIZAÇÃO"

Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica o beneficio dos Pedidos Provisionais Nos. 60/753,801, depositado em 22 de dezembro de 2005, e 60/833,855, depositado em 27 de julho de 2006, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência.

Antecedentes da Invenção

Muitos fármacos administrados para tratar uma do- ença têm por alvo as diferenças gerais entre uma célula do- ente e uma célula normal. Por exemplo, o paclitaxel, que é usado para tratar câncer de ovário e de mama e inibir a fun- ção microtúbulo, é considerada apresentar especificidade pa- ra células tumorais com base na maior taxa de proliferação das células tumorais relativamente às células normais (Mil- ler e Ojima, Chem. Rec. 1 : 195-211 , 2002). Todavia, a des- peito dessa visão consensual, a atividade em vitro do pacli- taxel varia amplamente de acordo com as linhagens das célu- las tumorais (Weinstein e colaboradores, Science 275:343- 349, 1997), indicando que fatores os fatores genéticos podem modificar a sensibilidade das células tumorais ao paclitaxel e que a responsividade das células tumorais não é apenas de- terminada por suas taxas de proliferação.

A terapêutica molecularmente objetivada representa uma nova abordagem para a descoberta de fármacos anti-câncer (Shawver e colaboradores, Câncer Cell 1: 117-23, 2002). Uti- lizando essa abordagem, moléculas pequenas são projetadas para inibir diretamente as proteínas notadamente oncogênicas que são mutadas ou superexpressadas em tipos específicos de células tumorais. Mediante ter por alvo os específicos de- feitos moleculares encontrados nas células tumorais, essa abordagem pode em última análise produzir terapias modelada para cada constituição genética dos tumores. Dois exemplos recentes de terapêuticas anti-câncer molecularmente objetivadas são Gleevec (mesilato de imatinib) , um inibidor of the breakpoint cluster region-abelsen kinase (BCR-ABL) oncoprotein found em Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia (Capdeville e colaboradores, Nat Rev DrugDiscov 1 : 493-502, 2002) e Herceptin (trastuzumab), a monoclonal antibody targeted against the HER2/NEU oncoprotein found em metastatic breast cancers (Mokbel e Hassanally, Curr Med Res Opin 17: 51-9, 2001).

Uma estratégia complementar envolve a procura qua- na um agentes antitumor genótipo-seletivos que se tornem le- tais às células tumorais apenas em presença de oncoproteínas específicas ou em ausência de supressores específicos de tu- mor. Tais compostos genótipo-seletivos precisam atingir as oncoproteínas diretamente ou eles podem atingir outras pro- teínas críticas envolvidas nas redes de sinalização ligadas por oncoproteínas. Compostos que foram reportados apresentar letalidade sintética incluem (i) o análogo de rapamicina CCI-779 em células mieloma faltantes de PTEN (Shi e colabo- radores, Câncer Res 62: 5027-34, 2002), (ii) Gleevec em BCR- ABL-transformed cells (Druker e colaboradores, Nat Med 2: 561-6, 1996) e (iii) a variety of Iess well-caracterizado compostos (Stockwell e colaboradores, Chem Biol 6: 71-83, 1999; Torrance e colaboradores, Nat Biotechnol 19: 940-5, 2001).

Independentemente da pesquisa discutida acima, permanece uma significativa necessidade para desenvolver e/ou identificar compostos que atinjam seletivamente células tumorais.

Sumário da Invenção

Um número de compostos/agentes/fármacos úteis para o tratamento ou a prevenção de câncer (por exemplo, tumores ou leucemia que podem ser caracterizados por ativação da ro- ta da Ras como um resultado de mutações em BRAF, HRAS, NRAS ou KRAS entre outros) em um indivíduo, tal como um humano com necessidade de tratamento ou de prevenção, têm sido i- dentifiçados. Como usado aqui, os termos ^agente' e ^fárma- co' são usados de modo intercambiável; eles podem ser com- postos ou moléculas.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um com- posto representado pela Fórmula Estrutural (I):

<formula>formula see original document page 4</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: Ra é um halogênio, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, al- quinila substituída ou não substituída, aril-0- substituída ou não substituída, alquil-O- substituída ou não substituí- da, alquenil-O- substituída ou não substituída ou alquinil- O- substituída ou não substituída, onde a alquila, alquenila e alquinila estão opcionalmente interrompidas por NR, O ou S(O)n;

cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', -CON(R)2, -NRC(O)R, -SO2N(R)2, -N(R)2, -NO2, -OH e - OR' ;

cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -NRC(O)R, -SO2N(R)2, -N(R)2, -NO2, -OH e - OR' ;

R4 e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que compreende -H, alquila substituída ou não subs- tituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, heterocíclico não aromático substituído ou não substituído e arila substituída ou não substituída, onde a alquila, alquenila e alquinila estão op- cionalmente interrompidas por NR, 0 ou S(O)n; ou R4 e R5 to- mados em conjunto formam um grupo carbocíclico ou heterocí- clico;

V é -NH-L-A-Q ou o anel C é um anel heterocíclico aromático ou não aromático substituído ou não substituído;

Δ é NR ou O; ou A é uma ligação covalente; L é um grupo hidrocarbila substituído ou não subs- tituído opcionalmente interrompido por um ou mais heteroáto- mos selecionados de N, Oe S;

Q é selecionado a partir do grupo que compreende - R, -C(O)R', -C(O)N(R)2, -C(O)OR' e -S(O)2R';

cada R é independentemente -H, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituí- da, alquinila substituída ou não substituída, arila substi- tuída ou não substituída ou heterocíclico não aromático substituído ou não substituído;

cada R' é independentemente um grupo alquila subs- tituído ou não substituído, alquenila substituído ou não substituído, alquinila substituído ou não substituído, grupo heterocíclico não aromático substituído ou não substituído ou grupo arila substituído ou não substituído; j é um inteiro de 0 a 4;

k é um inteiro de 0 a 4, com a condição de que pe- lo menos um de j e k é um inteiro de 1 a 4; e cada η é independentemente 0, 1 ou 2.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona um composto representado pela Fórmula Estrutural (II):

<formula>formula see original document page 7</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: R1 é um grupo alquila substituído ou não substitu- ído, alquenila substituído ou não substituído ou alquinila substituído ou não substituído, cada um dos quais está op- cionalmente interrompido por NR, O ou S(O)n;

cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -SO2N(R)2, -OH e -OR';

cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -SO2N(R)2, -OH e -OR';

V é -NH-L-A-Q ou

<formula>formula see original document page 8</formula>

o anel C é um anel heterocíclico aromático ou não aromático substituído ou não substituído;

A é NR ou O; ou A é uma ligação covalente; L é um grupo hidrocarbila substituído ou não subs- tituído opcionalmente interrompido por um ou mais heteroáto- mos selecionados de N, 0 e S;

cada R' é independentemente uma alquila substituí- da ou não substituída, alquenila substituída ou não substi- tuída, alquinila substituída ou não substituída, grupo hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído ou grupo arila substituído ou não substituído;

j é um inteiro de 0 a 4;

k é um inteiro de 0 a 4, com a condição de que pe- lo menos um de j e k é um inteiro de 1 a 4; e

cada η é independentemente 0, 1 ou 2.

Os compostos da invenção podem ser formulados com um veículo farmaceuticamente aceitável como composições far- macêuticas .

Em aspectos adicionais da invenção, a invenção es- tá relacionada a compostos revelados aqui que seletivamente aniquilem ou inibam o crescimento de (são tóxicos a) células tumorais.

Em uma outra modalidade, a presente invenção pro- porciona métodos de tratar uma condição em um mamífero, que compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um composto da invenção.

Agentes adequados podem ter a atividade mencionada na forma existente ou após metabolismo completo ou parcial.

Em certos aspectos, o composto aniquila as células por meio de um mecanismo apoptótico ou não apoptótico.

Em certos aspectos, a células possuem aprimorada atividade na rota da Ras (por exemplo, RasV12).

Em certos aspectos, a condição é câncer.

Um outro aspecto da invenção proporciona um método de aniquilar uma célula, promover a morte da célula ou de inibir a proliferação celular, que compreende administrar a uma célula uma quantidade eficaz de um composto da invenção. Agentes adequados podem possuir a mencionada atividade na forma existente ou após o metabolismo completo ou parcial. Em certas modalidades, a célula é uma célula cancerosa.

Em uma modalidade, a presente invenção é um método de reduzir a taxa de crescimento de um tumor, que compreende administrar uma quantidade de um agente terapêutico sufici- ente para reduzir a taxa de crescimento do tumor, onde o a- gente terapêutico é um composto da invenção. Agentes adequa- dos podem ter a atividade mencionada na forma existente ou após o metabolismo completo ou parcial.

Em um aspecto, a invenção é um método para tratar um paciente que sofre de um câncer, que compreende adminis- trar ao paciente uma quantidade eficaz de um composto da in- venção. Agentes adequados podem ter a atividade mencionada na forma existente ou após o metabolismo completo ou parci- al.

Em um outro aspecto, a invenção é um método de au- mentar a sensibilidade de uma célula tumoral a um agente quimioterápico (por exemplo, de modo aditivo ou sinérgico), onde uma célula tumoral é contatada com um composto aqui re- velado. Em um aspecto correlato, a invenção é um método de reduzir a sensibilidade de uma célula normal a um agente quimioterápico, onde uma célula normal é contatada com um composto aqui revelado.

Em uma modalidade, a invenção é um método de iden- tificar pacientes os quais são prováveis de responder ao tratamento com compostos da invenção. Com a utilização de métodos padrões de caracterização conhecidos na arte, paci- entes identificados como possuindo neoplasias apresentando um ou mais dos atributos seguintes seriam esperados serem responsivos: atividade anormal da rota de sinalização da Ras como caracterizado pela ativação de um ou mais elementos da rota (por exemplo Erkl/2 fosforilado, MEK fosforilado, etc.), e/ou perfil da expressão genética e/ou sensibilidade de uma linhagem celular de genótipo similar ou idêntico na exposição de compostos da invenção tanto em vitro ou em vi- vo .

Em ainda uma outra modalidade, a invenção é um mé- todo de conduzir um negócio farmacêutico comercial, que in- clui :

(a) identificar um agente terapêutico candidato para inibir a proliferação de células, onde o agente tera- pêutico candidato é um composto aqui revelado,

(b) conduzir o levantamento do perfil terapêutico do agente candidato identificado na etapa (a) quanto à efi- cácia e toxicidade em mamíferos; e

(c) formular uma preparação farmacêutica que in- clui um ou mais dos agentes terapêuticos candidatos identi- ficados na etapa (b) como possuindo um perfil terapêutico aceitável.

Em lugar de ou adicionalmente a uma ou ambas as etapas (b) e (c), o método pode incluir o licenciamento de uma terça parte dos direitos para desenvolvimento posterior do agente terapêutico candidato. Em uma modalidade adicio- nal, o método de conduzir um negócio comercial de descoberta de fármacos compreende estabelecer um sistema de distribui- ção para a distribuição da preparação farmacêutica para co- mercialização. Opcionalmente, um grupo de vendas é estabele- cido para comercializar a preparação farmacêutica.

A presente invenção adicionalmente proporciona produtos farmacêuticos embalados. Em uma modalidade, o pro- duto farmacêutico embalado compreende: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui revelado; e (ii) instruções e/ou uma bula para a administração do agente para o tratamento de pacientes que possuem câncer. A instrução ou bula pode estar armazenada em um meio eletrônico tal como CD, DVD, disco flexível, cartão de memória, etc., que possa ser lido por um computador.

A presente invenção também proporciona o uso de um composto aqui revelado na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. Em certas modalidades, os métodos da invenção também compreendem administrar em conjunto um ou mais agentes, tal como agentes quimioterápicos que tipica- mente aniquilem as células através de um mecanismo apoptóti- co. Agentes adequados para uso na redução da taxa de cresci- mento de um tumor e no tratamento de um paciente que sofre de câncer incluem, mas não estão limitados a, moléculas pe- quenas orgânicas, peptideos, proteínas, peptidomiméticos, ácidos nucléicos, anticorpos e combinações desses menciona- dos .

É contemplado que todas as modalidades da invenção podem estar combinadas com uma ou mais outras modalidades, ainda que aquelas descritas sob aspectos diferentes da in- venção .

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a inibição no crescimento de um xenoenxerto de uma célula HT-1080 induzido pelo Composto 25.

A Figura 2 mostra a inibição no crescimento de um xenoenxerto de uma célula HT-1080 induzido pelo Composto 25.

A Figura 3 mostra a inibição no crescimento de um xenoenxerto de uma célula HT-1080 induzido pelo Composto 10.

A Figura 4 mostra proteínas identificadas por Wes- tern blot e SDS-PAGE a partir de experimentos selecionados a partir de menu de rolagem usando lisatos provenientes de cé- lulas tumorais com Compostos 4-9 imobilizados em micro- pérolas de Affi-Gel 10.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção também proporciona compostos representados pela Fórmula Estrutural (I), onde os compostos são adequados para uso nos métodos e composições aqui reve- lados :

<formula>formula see original document page 13</formula>

cada R2 é independentemente selecionado a partir do qrupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -NRC(O)R, -SO2N(R)2, -N(R)2, -NO2, -OH e - OR' ;

V é -NH-L-A-Q ou o anel C é um anel heterociclico aromático ou não aromático substituído ou não substituído;

A é NR ou O; ou A é uma ligação covalente; L é um grupo hidrocarbila substituído ou não subs- tituído opcionalmente interrompido por um ou mais heteroáto- mos selecionados de N, Oe S;

cada R é independentemente -H, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituí- da, alquinila substituída ou não substituída, arila substi- tuída ou não substituída ou heterociclico não aromático substituído ou não substituído;

cada η é independentemente 0, 1 ou 2. Para certos compostos da invenção, V é <formula>formula see original document page 16</formula>

Exemplos adequados de V abrangidos pela estrutura acima incluem

<formula>formula see original document page 16</formula>

Quando V é representado por uma dessas estruturas, A é tipicamente uma ligação covalente ou NR. Exemplos particularmente adequados de V são

<formula>formula see original document page 16</formula>

onde A é uma ligação covalente; e <formula>formula see original document page 17</formula>

onde A é NR.

Em certas modalidades, A é uma ligação covalente e Q é —R. Quando Q é -R, Q é tipicamente -H ou um grupo alquila substituído ou não substituído (por exemplo, metila, etila).

<formula>formula see original document page 17</formula>

Em tais certas modalidades, V é , A é uma ligação covalente e Q é -H, metila ou etil, particularmente metila.

Em certas modalidades, o substituinte -Q nos compostos da invenção, particularmente compostos onde V é como representado acima é um grupo acila. Grupos acila são tipicamente representeados por -C(O)R', onde R' é como definido acima. Em certas modalidades, R' em -C(O)R' é um grupo arila ou ariloxialquila substituído ou não substituído, particularmente um grupo fenila ou feniloxialquila substituído ou não substituído tal como um grupo feniloximetila substituído ou não substituído. Substituintes adequados para o grupo fenila incluem alquila C1-C6, CF3, hidroxila, alcoxila C1-C4, arila, ariloxila, halogênio, -N(R)2, nitro, ácido carboxílico, éster carboxilico, e sulfonila. Substituints adequados para o grupo fenoximetila incluem halogênios, particularmente cloro. Cloro, quando presente, está preferivelmente na posição-4 do anel fenila, para produzir um grupo -Q como mostrado abaixo:

<formula>formula see original document page 18</formula>

Em compostos onde V é representado por -NH-L-A-Q, L é tipicamente um substituído ou não substituído alquileno, ou poli(alquileno glicol) (por exemplo, poli(etileno glicol), poli(propileno glicol). Exemplos de alquilenos adequados são representados por - (CH2)j-, onde j é um inteiro de 1 a 6, tal como 2 a 4. Poli(alquileno glicóis) são geralmente 2- ou 3-meros.

R4 e R5 são tipicamente independentemente -H ou um grupo alquila substituído ou não substituído (por exemplo, alquila, alcoxilalquila, mono- ou dialquilaminoalquila, aralquila), particularmente quando V (incluindo AeQ) possui os valores descritos acima. Mais tipicamente, R4 e R5 são independentemente um grupo alquila C1-C4 substituído ou não substituído.

R1 é tipicamente um grupo alquila substituído ou não substituído, particularmente um grupo alquila C1-C4 não substituído (por exemplo, metila, etila, n-propila, i- propila, n-butila, s-butila, t-butila). Em um exemplo, Ri é tipicamente um grupo alquila substituído ou não substituído quando R4, R5, e V possuem os valores descritos acima.

Em certas modalidades, j é 1 , 2, 3 ou 4, tal como quando k é 0. Em certas modalidades, k é 1 , 2, 3 ou 4, tal como quando j é 0. Em certas modalidades, j é um inteiro de 1 a 4 e k é um inteiro de 1 a 4. Por exemplo, j é 1 e k é 1 , j é 1 e k é 2, jéleké3, jéleké4, jé2eké 1, jé2eké2, jé2eké3, jé2eké4, jé3eké 1, jé3eké2, jé3eké3, jé3eké4, jé4eké 1 , j é4eké2, j é4eké3, ouj é4eké4.

Quando um ou mais grupos substituintes R2 e/ou R3 estão presentes, eles são geralmente independentemente selecionados a partir do grupo que compreende alquila polar substituída, alcoxila polar substituída, arila carbocíclica polar substituída, heteroarila substituída ou não substituída (por exemplo, heteroarila contendo nitrogênio tal como imidazolila, oxazolila, tiazolila, piridinila, pirimidinila, triazolila) e heterocíclico não aromático substituído ou não substituído (por exemplo, pirrazolila, piperadinila, piperazinila, morfolinila, homopiperazinila) . De modo vantajoso, esses grupos melhoram a solubilidade em água do composto. Substituintes polares particularmente adequados incluem amino, amido, guanidino, -SO3H, -PO3H, -OH e -COOH (incluindo ésteres que hidrolisam a -COOH), incluindo sais desses mencionados. Outros substituintes adequados incluem nitro, halogênios tais como cloro, bromo e iodo, e grupos alquila e alcoxila halogênío-substituídos (por exemplo, -CF3, -OCF3) .

Valores adicionais adequados para R2 e.ou R3 incluem -NRC(O)R e -N(R)2, particularmente -NHC(O)R e -NHR. Para -NHC(O)R e -NHR, R é tipicamente -H ou um grupo alquila substituído. Os substituintes nos tais grupos alquila são vantajosamente grupos que sejam capazes de reagir com um outro grupo funcional para formar uma ligação covalente, tal como uma amina, ácido carboxílico, haleto ácido, halogênio ou semelhantes. Preferivelmente, R é uma aminoalquila (por exemplo, onde a alquila é tipicamente C3-Ce) quando R2 e/ou R3 é -NHC(O)R ou -NHR ou R é -H quando R2 e/ou R3 é -NHR. Exemplos de R2 e/ou R3 incluem -NH2, -NHC(O)(CH2)3NH2 e - NH (CH2) 6NH2.

Em certa modalidade, os compostos de Fórmula Estrutural (I) são representados pelas estruturas particulares apresentadas a seguir:

<formula>formula see original document page 20</formula> Na Fórmula Estrutural (Ia), R2 é tipicamente -NHR (por exemplo, -NH2) e Ra é tipicamente alcoxila (por exemplo, metoxila, etoxila). Na Fórmula Estrutural (Ib), R3 é tipicamente um halogênio ou -OCF3 e Ra é tipicamente um halogênio ou alcoxila (por exemplo, metoxila, etoxila). Em certas modalidades, R3 na Fórmula Estrutural (Ia) está presente no memo lugar como R3 na Fórmula Estrutural (Ib) .

Compostos particularmente adequados da invenção possuem uma ou mais das seguintes características: (1) V é 4-piperazinila, 4-homopiperazinila, 4-metil-homopiperazinila ou 4-(4-clorofenoxiacetil)piperazinila, preferivelmente 4- metilhomopiperazinila; (2) R4 é -H ou um grupo alquila não substituído, preferivelmente -H ou metila; (3) R5 é -H ou um grupo alquila não substituído, preferivelmente -H ou metila; (4) Ra é um grupo alquil-O- não substituído, preferivelmente etil-0- (isto é, etoxila); e (5) pelo menos um de R2 e R3 é um grupo que melhora a solubilidade em água (por exemplo, - NH2), -NO2, - OCF3 e/ou um halogênio. Exemplos de tais compostos adequados possuem a característica (1); características (1) e (2); características (l)-(3); características (l)-(4); ou características (l)-(5).

A presente invenção também proporciona compostos representados pela Fórmula Estrutural (II), onde os compostos são adequados para uso nos métodos e composições aqui revelados: <formula>formula see original document page 22</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde:

R1 é um grupo alquila substituído ou não substitu- ído, alquenila substituído ou não substituído ou alquinila substituído ou não substituído, cada um dos quais está op- cionalmente interrompido por NR, O ou S(O)n;

R4 e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que compreende -H, alquila substituída ou não subs- tituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, heterocíclico não aromático substituído ou não substituído e arila substituída ou não substituída, onde a alquila, alquenila e alquinila estão op- cionalmente interrompidas por NR, 0 ou S(O)n; ou R4 e R5 to- - mados em conjunto formam um grupo carbociclico ou heterocí- clico;

V é -NH-L-A-Q ou

<formula>formula see original document page 23</formula>

o anel C é um anel heterociclico aromático ou não aromático substituído ou não substituído;

A é NR ou O; ou A é uma ligação covalente;

L é um grupo hidrocarbila substituído ou não subs- tituído opcionalmente interrompido por um ou mais heteroáto- mos selecionados de N, O e S;

cada R' é independentemente uma alquila substituí- da ou não substituída, alquenila substituída ou não substi- tuída, alquinila substituída ou não substituída, grupo hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído ou grupo arila substituído ou não substituído; j é um inteiro de 0 a 4; k é um inteiro de 0 a 4, com a condição de que pe- lo menos um de j e k é um inteiro de 1 a 4; e

cada n é independentemente 0, 1 ou 2. Para certos compostos da invenção, V é

<formula>formula see original document page 24</formula>

Exemplos particularmente adequados de V são:

<formula>formula see original document page 24</formula>

onde A é uma ligação covalente; e

<formula>formula see original document page 24</formula>

onde A é NR. Em certas modalidades, A é uma ligação covalente e Q é -R. Quando Q é -R, Q é tipicamente -H ou um grupo alquila substituído ou não substituído (por exemplo, metil,

<formula>formula see original document page 25</formula>

etil). Em tais certas modalidades, V é , A é uma ligação covalente e Q é -H, metila ou etil, particularmente metila. Em certas modalidades, o substituinte -Q nos compostos da invenção, particularmente compostos onde V é como representado acima é um grupo acila. Grupos acila são tipicamente representados por -C(O)R' , onde R' é como definido acima. Em certas modalidades, R' em -C(O)R' é um grupo arila ou ariloxialquila substituído ou não substituído, particularmente um grupo fenila ou feniloxialquila substituído ou não substituído tal como um grupo feniloximetila substituído ou não substituído.

Substituintes adequados para o grupo fenila incluem alquila C1-C6, CF3, hidroxila, alcoxila C1-C4, arila, ariloxila, halogênio, -N(R)2, nitro, ácido carboxílico, éster carboxílico, e sulfonila. Substituintes adequados para o grupo feniloximetila incluenm halogênios, particularmente cloro. Cloro, quando presente, está preferivelmente na posição-4 do anel fenila, para produzir um grupo -Q como mostrado abaixo: <formula>formula see original document page 26</formula>

Em compostos onde V é representado por -NH-L-A-Q, L é tipicamente um substituído ou não substituído alquileno, ou poli(alquileno glicol) (por exemplo, poli(etileno glicol), poli(propileno glicol). Exemplos de alquilenos adequados são representados por -(CH2)j-, onde j é um inteiro de 1 a 6, tal como 2 a 4. Poli (alquileno glicóis) são geralmente 2- ou 3-meros.

R4 e R5 são tipicamente independentemente -H ou um grupo alquila substituído ou não substituído (por exemplo, alquila, alcoxilalquila, mono- ou dialquilaminoalquila, aralquila), particularmente quando V (incluindo A e Q) possui os valores descritos acima. Mais tipicamente, R4 e R5 são independentemente um grupo alquila C1-C4 substituído ou não substituído.

Em certas modalidades, j é 1 , 2, 3 ou 4, tal como quando k é 0. Em certas modalidades, k é 1 , 2, 3 ou 4, tal como quando j é 0. Em certas modalidades, j é um inteiro de 1 a 4 e k é um inteiro de 1 a 4 . Por exemplo, j é 1 e k é 1 , j é 1 e k é 2, j é 1 e k é 3, j é 1 e k é 4, jé2eké 1, jé2eké2, jé2eké3, jé2eké4, jé3eké 1, jé3eké2, j é 3 e k é 3, j é 3 e k é 4, jé4eké 1 , j é4eké2, j é4eké3, ouj é4eké4.

Quando um ou mais grupos substituintes R2 e/ou R3 estão presentes, eles são geralmente independentemente selecionados a partir do grupo que compreende alquila polar substituída, alcoxila polar substituída, arila carbocíclica polar substituída, heteroarila substituída ou não substituída (por exemplo, heteroarila contendo nitrogênio tal como imidazolila, oxazolila, tiazolila, piridinila, pirimidinila, triazolila) e heterocíclico não aromático substituído ou não substituído (por exemplo, pirrazolila, piperadinila, piperazinila, morfolinila, homopiperazinila). De modo vantajoso, esses grupos melhoram a solubilidade em água do composto. Substituintes polares particularmente adequados incluem amino, amido, guanidino, -SO3H, -PO3H, -OH e -COOH (incluindo ésteres que hidrolisam a -COOH), incluindo sais desses mencionados. Outros substituintes adequados incluem nitro, halogênios tais como cloro, bromo e iodo, e grupos alquila e alcoxila halogênio-substituídos (por exemplo, -CF3, -OCF3).

Valores adicionais adequados para R2 e/ou R3 incluem -NRC(O)R e -N(R)2, particularmente -NHC(O)R e -NHR. Para -NHC(O)R e -NHR, R é tipicamente -H ou um grupo alquila substituído. Os substituintes nos tais grupos alquila são vantajosamente grupos que sejam capazes de reagir com um outro grupo funcional para formar uma ligação covalente, tal como uma amina, ácido carboxílico, haleto ácido, halogênio ou semelhantes. Preferivelmente, R é uma aminoalquila (por exemplo, onde a alquila é tipicamente C3-C6) quando R2 e/ou R3 é -NHC(O)R ou -NHR ou R é -H quando R2 e/ou R3 é -NHR.

Exemplos de R2 e/ou R3 incluem -NH2, -NHC(O)(CH2)3NH2 e - NH(CH2)6NH2.

Compostos particularmente adequados da invenção possuem uma ou mais das seguintes características: (1) V é -4-piperazinila, 4-homopiperazinila, 4-metil-homopiperazinila ou 4-(4-clorofenoxiacetil)piperazinila, preferivelmente 4- metilhomopiperazinila; (2) R4 é -H ou um grupo alquila não substituído, preferivelmente -H ou metila; (3) R5 é -H ou um grupo alquila não substituído, preferivelmente -H ou metila; (4) Ra é um grupo alquil-O- não substituído, preferivelmente etil-O- (isto é, etoxila); e (5) pelo menos um de R2 e R3 é um grupo que melhora a solubilidade em água (por exemplo, - NH2), -NO2, - OCF3 e/ou um halogênio. Exemplos de tais compostos adequados possuem a característica (1); características (1) e (2); características (1)-(3); características (1)-(4); ou características (1)-(5).

Compostos representativos incluem os Compostos (1) , (2) e (3) : <formula>formula see original document page 29</formula>

Compostos representativos adicionais incluem os Compostos (4)- (9) : <formula>formula see original document page 30</formula> <formula>formula see original document page 31</formula> Compostos representativos adicionais são mostrados nos exemplos. Compostos incluídos na invenção incluem enantiômeros e diastereômeros dos compostos aqui revelados. A invenção também inclui sais, preferivelmente sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui revelados. Em adição, a invenção inclui solvatos, hidratos e formas cristalinas polimórficas dos compostos aqui revelados.

É contemplado que todas as modalidades da invenção podem ser combinadas com uma ou mais modalidades, mesmo que aquelas descritas sob diferentes aspectos da invenção.

O termo 'acila' como usado aqui inclui tais frações como podem ser representadas pela fórmula geral:

<formula>formula see original document page 32</formula>

onde grupos R adequados incluem, mas não estão limitados a, H, alquila, alcoxila, aralquila, ariloxila, arila, heteroarila, heteroarilalquila, heteroariloxila, e cicloalquila, onde qualquer desses grupos pode opcionalmente estar adicionalmente substituídos.

O termo "hidrocarbila" se refere grupos hidrocarbonetos cíclicos ou acíclicos, saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos. Quando indicado, átomos de hidrocarbila podem estar interrompidos por meio de um ou mais heterátomos tal como N, O e S (isto é, os heteroátomos não são um terminal do grupo). O termo "alquila" se refere a grupos hidrocarbonetos saturados substituídos ou não substituídos, incluindo grupos alquila de cadeia linear e grupos alquila de cadeia ramificada, incluindo grupos haloalquila tais como trifluormetila, 2,2,2-trifluoroetila, etc. Alquila C0 indica um hidrogênio onde o grupo está numa posição terminal, uma ligação se interno. Os termos "alquenila" e "alquinila" se refere a grupos alifáricos insaturados substituídos ou não substituídos análogos possíveis de substituição às alquilas descritas acima, mas que contêm pelo menos uma dupla ou tripla ligação, respectivamente.

O termo termo "alcoxila" se refere a um oxigênio que possui um grupo alquila anexado a ele. Grupos alcoxila representativos incluem metoxila, etoxila, propoxsila, ter- butoxila, e semelhantes. Um "éter" são dois hidrocarbonetos ligados de modo covalente por um oxigênio. Conseqüentemente, o substituinte de uma alquila que torna essa alquila um éter é ou se parece com uma alcoxila.

O termo "aralquila", como usado aqui, se refere a um grupo alquila substituído com um grupo arila.

O termo "carboxíclico", como usado aqui inclui grupos alifáticos cíclicos de anel único, saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos, 3- a 8 elementos nos quais cada átomo do anel é carbono.

O termo "heterocíclico", como usado aqui inclui grupos cíclicos de anel único substituído ou não substituído de 3 a 8 elementos, preferivelmente de 4 a 8 elementos nos quais o anel inclui de 1 a 3 heteroátomos. Exemplos de grupos heterocíclicos não aromáticos incluem pirrolidina, piperadina, piperazina, tetraidrofurano e tetraidrotiofeno.

O termo "arila", como usado aqui, inclui grupos aromáticos carboxiclicos ou heterociclicos de anel único substituídos ou não substituídos. O termo "arila" também in- clui sistemas anel policíclico que possuem dois ou mais a- néis cíclicos nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes onde pelo menos um dos anéis é aromá- tico, por exemplo, os outros anéis cíclicos podem ser ciclo- alquilas, cicloalquinilas, arilas e/ou heterociclilas. Gru- pos aril carbocíclicos incluem benzeno, benzeno, naftaleno, fenantreno, fenol, anilina, e semelhantes. 0 termo "heteroa- rila" inclui estruturas anel aromático de 5 a 7 elementos, substituídos ou não substituídos, mais preferivelmente anéis de 5 a 6 elementos, cujas estruturas anel incluem um a qua- tro heteroátomos. 0 termo "heteroarila" também inclui siste- mas anel policíclico possuindo dois ou mais anéis cíclicos nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis ad- jacentes onde pelo menos um dos anéis é heteroaromático, por exemplo, os outros anéis cíclicos podem ser cicloalquilas, cicloalquenilas, cicloalquinilas, arilas, e/ou heterocicli- las. Grupos heteroarila incluem, por exemplo, pirrol, fura- no, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, pi- ridina, pirazina, piridazina e pirimidina, e semelhantes.

O termo "heteroátomo", como usado aqui, significa um átomo de qualquer elemento outro que carbono ou hidrogê- nio. Heteroátomos preferidos são nitrogênio, oxigênio, fós- foro, e enxofre.

Os termos "policiclila" ou "policíclico" se refe- rem a dois ou mais anéis (por exemplo, cicloalquilas, ciclo- alquenilas, cicloalquinilas, arilas, heteroarilas, e/ou he- terociclilas) nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes, por exemplo, os anéis são "anéis fun- didos". Cada um dos anéis do policiclo pode estar substituí- do ou não substituído.

O termo "substituído" se refere a frações possuin- do substituintes que substituem um hidrogênio em um ou mais carbonos da estrutura da cadeia principal. Será entendido que "substituição" ou "substituído com" inclui a condição implícita que tal substituição está de acordo com a Valencia permitida do átomo substituído e do substituinte, e que a substituição resulta em um composto estável, por exemplo, que não experimenta espontaneamente transformação, tal como, por rearranjo, ciclização, eliminação, etc. Como usado aqui, o termo "substituído" é contemplado incluir todos os substi- tuintes permissíveis de compostos orgânicos. Em um aspecto amplo, os substituintes permissíveis incluem substituintes cíclicos e acíclicos, ramificados e não ramificados, carbo- cíclicos e heterocíclicos, aromáticos e não aromáticos de compostos orgânicos. Os substituintes permissíveis podem ser um ou mais e iguais ou diferentes para os apropriados com- postos orgânicos. Para os propósitos dessa invenção, os he- teroátomos tais como nitrogênio podem ter substituintes hi- drogênio e/ou quaisquer substituintes permissíveis de com- postos orgânicos descritos aqui os quais satisfaçam as va- lências dos heteroátomos. Os substituintes podem incluir, por exemplo, um halogênio, uma hidroxila, uma carbonila (tal como a carboxila, uma alcoxicarbonila, uma formila, ou uma acila), uma tiocarbonila (tal como um tioéster, um tioaceta- to, ou um tioformiato), uma alcoxila, uma fosforila, um fos- fato, um fosfonato, um fosfinato, um amino, um amido, uma amidina, uma imina, um ciano, um nitro, uma azida, uma sul- fidrila, um alquiltio, um sulfato, um sulfonato, uma sulfa- moila, uma sulfonamida, uma sulfonila, uma heterociclila, uma aralquila, ou uma fração aromática ou heteroaromática. Será entendido por aqueles usualmente versados na técnica que as frações substituídas na cadeia hidrocarboneto podem estar propriamente substituídas, se apropriado.

O termo "molécula pequena orgânica" se refere a um composto não polimérico que possui um peso molecular de me- nos de 2000 amu. Tipicamente, tais moléculas possuem um peso molecular de menos de 1000 amu, tal como menos de 500 amu.

Aniquilação Celular Seletiva

A capacidade dos compostos genótipo-seletivos ser- virem como ensaios moleculares está baseada na premissa da genética química, que moléculas pequenas podem ser usadas para identificar proteínas e rotas que servem por base aos efeitos biológicos (Schreiber, 1998, Bioorg. Med. Chem. 6, 1127-1152; Stockwell, 2000, Nat Rev Genet 1, 116-25; Stock- well, 2000, Trends Biotechnol 18, 449-55). Por exemplo, a observação de que o produto natural rapamicina retarda o crescimento celular torna possível a descoberta o alvo mamí- fero da Rapamicina (mTOR) como uma proteína que regula o crescimento celular (Brown e colaboradores, 1994, Nature 369, 756-758; Sabatini e colaboradores, 1994, Cell 78, 35- 43). Uma série de células tumorais humanas foram produzidas por engenharia com definidos elementos genéticos para uso na identificação dessas rotas criticas cujas rupturas leva a um fenótipo tomorigênico (Hahn e colaboradores, 1999, Nat Med 5, 1164-70; Hahn e colaboradores, 2002, Nat Rev Câncer 2, 331-41; Lessnick e colaboradores, 2002, Câncer Cell 1, 393- 401). É esperado que essas células transformadas experimen- talmente irão permitir a identificação de agentes genótipo- seletivos que apresentem letalidade sintética na presença de específicos alelos relacionados ao câncer. Compostos com le- talidade genótipo-seletivas podem servir como ensaios mole- culares de redes de sinalização presentes nas células tumo- rais, como a conduzir ao subseqüente desenvolvimento de fár- macos clinicamente eficazes com um favorável índice terapêu- tico e/ou como um fármaco eficaz.

A invenção proporciona compostos que aniquilam cé- lulas cancerosas, especialmente células cancerosas genótipo- específicas, tais como aquelas com elevada atividade da Ras.

Desse modo, um aspecto da invenção proporciona um método para seletivamente aniquilar células cancerosas, es- pecialmente aquelas com elevada atividade Ras, o método com- preendendo administrar a um paciente mamífero com necessida- de de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui revelado.

Como é bem conhecido na arte, a ativação constitu- tiva da Ras aparenta ser um fator importante para o cresci- mento maligno de células cancerosas humanas. Mutações dos proto-oncogenes da Ras (H-RAS, N-RAS, K-RAS) são anormalida- des genéticas freqüentes encontradas em 20% a 30% da totali- dade dos tumores humanos, embora as incidências no tipo de tumor varie grandemente (Bos, Câncer Res. 49: 4682-4689, 1989). As maiores taxas de mutações da Ras foram detectadas em adenocarcinomas de pâncreas (90%), de cólon (50%), e de pulmão (30%). Em carcinomas foliculares e não diferenciados da tireóide, a incidência das mutações da Ras é também con- siderável (50%). As mutações da Ras mais comumente observa- das surgem em locais sítios críticos para a regulação da Ras - ou seja, códons 12, 13, e 61. Cada uma dessas mutações re- sulta na anulação da atividade normal da GTPase da Ras. A ativação da Ras é também freqüentemente observada em malig- nidades hematológicas tais como leucemias mielóides e mile- momas múltiplos. Em cerca de um terço das síndromes mielo- displásicas (MDS) e leucemias mielóides agudas (AML), os ge- nes da Ras são ativados de modo mutacional. As mutações das Ras ocorrem em cerca de 40% dos pacientes recém diagnostica- dos com mieloma múltiplo, e a freqüência aumenta com a pro- gressão da doença.

Células com uma ativada rota da Ras podem ser se- letivamente aniquiladas por meio dos compostos aqui revela- dos, igualmente por meio de um mecanismo apoptótico.

Desse modo, em certas modalidades, as células can- cerosas de certos genótipos específicos podem ser seletiva- mente aniquiladas por mio dos compostos da invenção. Estas podem incluir cânceres que abrigam mutações da Ras constitu- tivamente ativas ou mutações de rotas de sinalização da Ras, e aprimorada atividade ERKl, MEKl. Em certas outras modalidades, o genótipo das célu- las alvo podem ser separadamente alterados, tal que as célu- las alvos anteriormente não suscetíveis aos compostos da in- venção sejam agora suscetíveis ao aniquilamento por meio desses compostos.

Em certas modalidades, a invenção proporciona um método de aniquilar seletivamente células cancerosas que possuam elevada atividade da rota da Ras ao mesmo tempo em que protegendo as células relativamente normais que não pos- suam elevada atividade da Ras. Isso pode ser útil uma vez que muitos cânceres abrigam as Ras V12 somáticas ou outras mutações similares que levam a elevada atividade de sinali- zação da Ras em células cancerosas, enquanto que as células normais no mesmo paciente/indivíduo usualmente não possuem a mesma Ras V12 ou outras mutações de rota da Ras. Os compos- tos da invenção podem ser usados para aniquilar seletivamen- te essas células cancerosas. 0 método em questão pode ser eficaz em aniquilar as células cancerosas uma vez que as cé- lulas normais provavelmente não possuem elevada atividade de sinalização da Ras.

Em algumas modalidades, a elevada atividade da Ras é manifestada por uma constitutivamente ativa mutação da Ras (Ν-, H-, ou K-Ras) nas posições aminoácidos 12, 13, e/ou 61.

Em algumas outras modalidades, a elevada atividade da Ras é manifestada pela aprimorada atividade de um ou mais componentes situados mais adiante das proteínas da rota da Ras, que incluem, mas não estão limitadas a Raf, MEK, ΜΆΡΚ, etc. Em ainda outras modalidades, as células podem ser sintetizadas ao(s) agente(s) através da introdução ou ex- pressão de uma proteína ou proteínas alvo. A expressão pode ser conseguida pela infecção das células alvos com vetores, tais como vetores adenovirais ou retrovirais que expressem a proteína alvo (ver adiante) . De modo alternativo, a proteína alvo pode ser diretamente provida às células alvos.

Por exemplo, a(s) proteína(s) pode ser introduzi- das nas células alvos utilizando diversos métodos conhecidos na arte (ver detalhes adiante). Em uma modalidade, a proteí- na pode ser provida à célula alvo mediante enreda-la em Ii- possomas que portam cargas positivas em suas superfícies (por exemplo, lipofectinas) e que são opcionalmente marcadas com anticorpos contra os antígenos de superfície da célula do tecido alvo, por exemplo, anticorpos contra um antígeno de superfície de uma célula cancerosa. Em uma outra modali- dade, a proteína pode ser provida às células alvos por transcitose, utilizando qualquer das xpeptídeos internali- zantes' capazes de mediar esse efeito, incluindo mas não Ii- mitado ao domínio N-terminal da proteína HIV Tat (por exem- plo, resíduos 1-72 da Tat ou um seu fragmento menor que pos- sa promover a transcitose), total ou uma parte da proteína Drosophila antenopedia III, uma parte suficiente de mastopa- ran, etc. (ver adiante).

Em outras modalidades, a proteína diminuída (e/ou outras proteínas alvos) pode ser conseguida mediante aplicar um anticorpo, RNAi (siRNA, RNA de curta Hairpina, etc.), se- qüência antisentido, ou um inibidor de molécula pequena es- pecífico para tal proteína alvo.

A aplicação de tais antagonistas de uma proteína a uma célula alvo é bem conhecida na arte, ver por exemplo, WO 04078940A2, EP 1439227A1, WO 04048545A2, US 20040029275A1, WO 0307 6592A2, WO 04076674A1, WO 9746671A1, todas aqui in- corporadas por referência.

Um outro aspecto da invenção proporciona um método terapêutico associado que utiliza compostos da invenção e um ou mais agentes ou terapias (por exemplo, radioterapia) que aniquila as células por meio de um mecanismo apoptótico. Tais agentes incluem muitos dos fármacos quimioterápicos descritos adiante.

É acreditado que certas proteínas possuem elevados níveis de expressão em células sensíveis aos compostos da invenção.

Em certas modalidades, células alvos são manipula- das para expressar um nível maior de uma proteína(s) alvo(s) de modo a melhorar a suscetibilidade de aniquilar ou de fre- ar a taxa de proliferação por meio dos compostos da inven- ção.

Por exemplo, uma proteína alvo pode ser introduzi- da nas células alvos utilizando diversos métodos conhecidos na arte (ver detalhes adiante) . Em uma modalidade, a proteí- na alvo pode ser provida à célula alvo mediante enreda-la em lipossomas que mantêm cargas positivas sobre suas superfí- cies (por exemplo, lipofectinas) e os quais são opcionalmen- te marcados com anticorpos contra antígenos de superfície celular do tecido alvo, por exemplo, anticorpos contra um antigeno de superfície de uma célula cancerosa.

De modo alternativo, ácidos nucléicos que codifi- cam um alvo funcional podem ser introduzidos em tais células alvos, utilizando, por exemplo, vetores adenovirais ou re- trovirais.

Em adição, a atividade endógena da proteína alvo pode ser estimulada por meio de um agente que ou estimula a expressão, ou suprime a atividade de um inibidor de proteína alvo (inibidor de transcrição ou de tradução, ou inibidor que promova renovação de proteína em uma célula) .

Em certos aspectos, o método da invenção também envolve administrar um agente que aumenta a abundância de proteína alvo numa célula. 0 agente para aumentar a abundân- cia da proteína alvo pode, por exemplo, incluir um polinu- cleotídeo que codifica a proteína adaptado para ser trans- portado para dentro da célula, por exemplo, fundido com um domínio heterólogo de internalização ou formulado na prepa- ração de lipossoma.

Em certos aspectos, o método da invenção também envolve administrar um agente que reduza a abundância de uma proteína alvo numa célula. 0 agente reduzir a abundância de uma proteína alvo pode, por exemplo, inibir a expressão da proteína endógena, suprimir a expressão da proteína ou me- lhorar a função de um inibidor de proteína.

As seções seguintes descrevem certas modalidades representativas da invenção, as quais são contempladas para serem capazes de se combinar umas com as outras. Em adição, as modalidades são apenas para propósitos ilustrativos, e não deverão ser consideradas como limitantes em nenhum as- pecto.

Linhagens Celulares

Relatórios anteriores indicaram que é possível converter células humanas primárias em células tumorigênicas mediante introdução de vetores que expressam hTERT e proteí- nas Ras oncogênicas bem como outras que rompem a função de p53, RB e PP2A (Hahn e colaboradores, 2002, Mol Cell Biol 22, 2111-23/ Hahn e colaboradores, 1999, Nature 400, 464-8; Hahn e Weinberg, 2002, Nat Rev Câncer 2, 331-41; Lessnick e colaboradores, 2002, Câncer Cell 1, 393-401). Uma série de células tumorigênicas humanas construídas e seus precursores podem ser usados nos ensaios descritos aqui. Uma variedade de características dessas células tumorigênicas construídas têm sido reportadas anteriormente, incluindo seus tempos de duplicação, suas resistências ao envelhecimento replicativo e crise no cultivo, a resposta delas a irradiação gama, a capacidade delas para crescer em um modo independente da an- coragem e a capacidade delas para formar tumores em ratos imunodeficientes (Hahn e colaboradores; 1999, supra; Hahn e colaboradores, 2002, supra; Lessnick e colaboradores, 2002, supra).

Métodos de Classificação para Compostos Genótipo- Seletivos

Como usado aqui, o termos agente e fármaco são u- sados de modo intercambiável. Como usado aqui, o termo 'é tóxico a' se refere à capacidade de um agente ou composto para aniquilar ou inibir o crescimento/proliferação das cé- lulas tumorigênicas. Classificações em grande escala incluem telas onde centenas ou milhares de compostos são classifica- dos em um formado de alto débito quanto à toxicidade seleti- va às células tumorigênicas construídas. Em uma modalidade da invenção, a toxicidade seletiva é determinada mediante comparar a viabilidade celular das células de teste, as quais são células tumorigênicas, e células controle após contato com um agente candidato. Um controle apropriado é uma célula que é do mesmo tipo de célula como aquela das cé- lulas de teste exceto que a célula controle não é tumorigê- nica. Por exemplo, as células controle podem ser células ge- radoras primárias a partir das quais as células de teste são derivadas. As células controle são contatadas com o agente candidato sob as mesmas condições como as das células de teste. Um controle apropriado pode ser corrido simultanea- mente, ou ele pode ser pré-estabelecido (por exemplo, um pa- drão ou referência pré-estabelecidos). A viabilidade celular pode ser determinada por meio de qualquer de uma variedade de meios conhecidos na arte, incluindo o uso de fingidores tais como Sytox, éster acetoximetil calceína (calceína AM) e Alamar Blue. Em certas modalidades da invenção, um fingidor tal como calceína AM é aplicado às células teste e controle após tratamento com um agente candidato. Em células vivas, calceína AM é clivada por meio de esterases intracelulares, formando o derivado aniônico fluorescente de calceína, que não pode se difundir par fora das células vivas. Portanto, as células vivas apresentam uma fluorescência verde quando incubadas com calceína AM, enquanto que as células mortas não. A fluorescência verde que é exibida pelas células vivas pode ser detectada e pode desse modo proporcionar uma medi- ção da viabilidade da célula.

Em certas modalidades da invenção, um agente que foi identificado como um que induza seletivamente a morte celular em vitro é também caracterizado em um modelo animal. Os modelos animais incluem cobaias, ratos, coelhos, e maca- cos, os quais podem ser não transgênicos (por exemplo, tipo selvagem) ou animais transgênicos. O efeito do agente que seletivamente induz a morte celular em células tumorigênicas fabricadas pode ser avaliado em um modelo animal quanto a qualquer número de efeitos, tal como sua capacidade para in- duzir seletivamente a morte celular em células tumorigênicas no animal e sua toxicidade geral para o animal. Por exemplo, o método pode compreender também avaliar a toxicidade sele- tiva de um agente (fármaco) em relação às células tumorigê- nicas em um apropriado modelo rato.

O efeito do agente que induz morte nas células tu- morigênicas pode ser avaliado em um modelo animal quanto a qualquer número de efeitos, tais como sua capacidade para induzir morte em células tumorigênicas no animal e sua toxi- cidade geral para o animal. Por exemplo, o método pode com- preender também avaliar a toxicidade de um agente (fármaco) às células tumorigênicas em um apropriado modelo rato. Para ilustrar, um agente pode ser também avaliado met utilizar um ensaio de crescimento de tumor que avalia a capacidade do agente testado para inibir o crescimento de tumores sólidos estabelecidos em ratos. O ensaio pode ser realizado mediante implantar células tumorais nos blocos de gordura de ratos pelados. As células tumorais são então deixadas a crescer até um certo tamanho antes dos agentes serem administrados. Os volumes dos tumores são monitorados quanto a um número de semanas, por exemplo, três semanas. A saúde geral dos ani- mais testados é também monitorada durante o transcurso do ensaio.

Um agente que tem sido identificado como um que seletivamente aniquila ou inibe o crescimento/proliferação de células tumorigênicas pode ser também caracterizado nos ensaios baseados em células para avaliar seu mecanismo de ação. Por exemplo, o agente pode ser testado em ensaios de apoptose para avaliar sua capacidade de induzir morte celu- lar por meio de uma rota pro-apoptótica. Adicionalmente, um agente que induz morte em células tumorais pode ser avaliada quanto a sua capacidade para induzir morte em células tumo- rigênicas por meio de uma rota não apoptótica. Por exemplo, o agente pode ser testado em ensaios de apoptose para avali- ar sua incapacidade para induzir morte celular por meio de uma rota pro-apoptótica.

Se a viabilidade das células de teste é mais que aquela das células controle nos ensaios descritos acima, en- tão um agente (fármaco) que seletivamente suprima a toxici- dade celular é identificada. As células controle são conta- tadas com o agente candidato sob as mesmas condições como as das células de teste. Um controle apropriado pode ser corri- do simultaneamente, ou ele pode ser pré-estabelecido (por exemplo, um padrão ou referência pré-estabelecidos). Compostos Genótipo-Seletivos da Invenção A expressão de RASvl2 leva à ativação de diversas rotas de sinalização bem caracterizadas, incluindo a cascata de sinalização RAF-MEK-MAPK, a rota de sinalização fosfati- dilinositol 3-knase (PBK) e a rota do fator de dissociação Ral-guanina (Ral-GDS). Cada uma dessas rotas está implicada em cânceres humanos, e trabalhos recentes demonstram que es- sas rotas trabalham de acordo com esse sistema de transfor- mação de células (Hamad e colaboradores, 2002, Genes Dev 16, 2045-57) .

Métodos de Identificação de Alvos para Compostos Genótipo-Seletivos

Em certas modalidades, a invenção está relacionada ao uso de compostos da invenção, também referidos aqui como iligandos' para identificar alvos (também referidos aqui co- mo "componentes celulares" (por exemplo, proteínas, ácidos nucléicos, ou lipídios) envolvidos em conferir o fenótipo de células adoentadas.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um méto- do para identificar componentes celulares envolvidos na tu- morigênese, por meio do que uma célula tumorigênica, tal co- mo uma célula tumorigênica humana fabricada, tecido, órgão, organismo ou um lisado ou um extrato desses mencionados é contatado com um composto antitumor em questão; e após o contato, os compostos celulares que interagem (diretamente ou indiretamente) com um ligando são identificados, resul- tando na identificação de componentes celulares envolvidos na tumorigênese. Em uma outra modalidade, a invenção propor- ciona um método para identificar componentes celulares en- volvidos na tumorigênese. Nesse método, (a) uma célula tumo- rigênica, tal como uma célula tumorigênica humana fabricada, tecido, órgão, organismo ou um lisado ou um extrato desses mencionados é contatado com um inibidor de um ligando e con- tatado com o ligando; e (b) componentes celulares que inte- ragem (diretamente ou indiretamente) com o inibidor do li- gando são identificados, sujos componentes celulares estão envolvidos na tumorigênese. A célula pode ser contatada com o ligando e o inibidor do ligando seqüencialmente ou simul- taneamente. Os componentes celulares que interagem com o li- gando ou qualquer agente da presente invenção podem ser i- dentifiçados através de métodos conhecidos.

Como descrito aqui, o composto em questão (ou Ii- gando) desses métodos pode ser criado por meio de qualquer método químico. 0 ligando pode ser opcionalmente derivado com um outro composto. Uma vantagem dessa modificação é que o composto de derivação pode ser usado para facilitar a co- leta do complexo ligando alvo ou a coleta do ligando, por exemplo, após a separação do ligando e alvo. Exemplos não limitantes de grupos de derivação incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, poli-histidina, micro-pérolas magnéticas, glutationa S transferase, reticuladores foto-ativáveis ou qualquer combinação desses mencionados. Grupos de derivacao podem ser também usados em conjunto com os alvos (por exemplo, uma proteína ligante erastina) a fim de facilitar a detecção deles. De acordo com a presente invenção, um alvo (compo- nente celular) pode ser uma biomolécula naturalmente ocor- rente sintetizada em vivo ou em vitro. Um alvo pode ser com- preendido de aminoácidos, ácidos nucléicos, açúcares, Iipi- dios, produtos naturais ou qualquer combinação desses men- cionados. Uma vantagem da presente invenção é que não é ne- cessário conhecimento anterior da identidade ou função do alvo.

A interação entre o ligando e alvo pode ser cova- lente ou não-covalente. Opcionalmente, o ligando de um par ligando-alvo pode ou não apresentar afinidade quanto a ou- tros alvos. O alvo de um par ligando-alvo pode ou não apre- sentar afinidade quanto a outros ligandos.

Por exemplo, a ligação entre e um ligando e um al- vo pode ser identificada ao nivel de proteína utilizando mé- todos bioquímicos em vitro, incluindo foto-reticulação, li- gação ligando rádio-marcada, e afinidade de cromatografia (Jakoby WB e colaboradores, 1974, Métodos em Enzymology 46: 1) . Alternativamente, moléculas pequenas podem ser imobili- zadas num adequado suporte sólido ou matriz de afinidade tal como matriz agarose e usadas para classificar extratos de uma variedade de tipos celulares e organismos. De modo simi- lar, as moléculas pequenas podem ser contatadas com a célu- la, tecido, órgão, organismo ou lisado ou extratos desses mencionados e o suporte sólido pode ser acrescentado poste- riormente para recuperar as moléculas pequenas e associar as proteínas alvos.

A clonagem da expressão pode ser usada para testar quanto ao alvo dentro de uma pequena piscina de proteínas (Kinq RW e colaboradores, 1997, Science 277:973). Peptideos (Kieffer e colaboradores, 1992, PNAS 89:12048), derivados nucleosídeos (Haushalter KA e colaboradores, 1999, Curr. Bi- ol. 9:174), e conjugado fármaco-albumina de soro bovino (fármaco-BSA) (Tanaka e colaboradores, 1999, Mol. Pharmacol. 55:356) têm sido usados na clonagem da expressão.

Uma outra técnica útil para associar intimamente a ligação do ligando com DNA que codifica o alvo é apresentar fago. Na exibição de fago que tem sido predominantemente u- sada no campo de anticorpos, bibliotecas de peptídeos ou de proteínas são criadas sobre a superfície viral e classifica- das quanto a atividade (Smith GP, 1985, Science 228:1315). Os fagos são preparados quanto ao alvo que está conectado a uma fase sólida (Parmley SF e colaboradores, 1988, Gene 73:305). Uma das vantagens de exibir fago é que o cDNA está no fago e desse modo não é requerida etapa de clonagem em separado.

Um exemplo não limitante inclui condições de rea- ção de ligação onde o ligando compreende um marcador tal co- mo etiqueta biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, rádio-isótopo, histidina, uma micro- pérola magnética, uma enzima ou combinações desses menciona- dos. Em uma modalidade da invenção, os alvos podem ser clas- sificados em um ensaio baseado em mecanismo, tal como um en- saio para detectar ligandos que se liguem ao alvo. Isso pode incluir um evento de ligação em fase sólida ou fase fluida com um ou outro o ligando ou a proteína ou um indicador de um ou outro sendo detectado. Alternativamente, o gene que codifica a proteína com função previamente indefinida pode ser transfectado com um sistema mensageiro (por exemplo, β- galactosidase, luciferase, ou proteína fluorescente verde) ao interior de uma célula e classificado contra a biblioteca preferivelmente por meio de um método de classificação de alto débito ou com elementos individuais da biblioteca. Ou- tros ensaios de ligação baseados em mecanismo podem ser usa- dos, por exemplo, ensaios bioquímicos medindo um efeito so- bre a atividade enzimática, ensaios baseados em célula nos quais o alvo e um sistema mensageiro (por exemplo, lucifera- se ou β-galactosidase) tenham sido introduzidos numa célula, e ensaios de ligação os quais detectem alterações na energia livre. Ensaios de ligação podem ser realizados com o alvo fixo a uma cavidade, pérola ou chip ou capturado por meio de um anticorpo imobilizado ou resolvido por eletroforese capi- lar. Os ligandos ligados podem ser usualmente detectados u- tilizando ressonância plasma colorimétrica ou fluorescência ou de superfície.

Em certas modalidades, a presente invenção também contempla métodos de tratar ou de prevenir uma doença (por exemplo, câncer) mediante modular a função (por exemplo, a- tividade ou expressão) de um alvo (componente celular) que é identificado de acordo com a invenção. Para ilustrar, se um alvo é identificado para promover o crescimento tumoral, um agente terapêutico pode ser usado para modificar ou reduzir a função (atividade ou expressão) do alvo. Alternativamente, se um alvo é identificado inibir o crescimento tumoral, um agente terapêutico pode ser usado para melhorar a função (a- tividade ou expressão) do alvo. O agente terapêutico é um composto da invenção.

Métodos de Tratamento

Em certas modalidades, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo. Os termos "câncer," "tumor," e "neoplasia" são usados de modo intercambiável aqui. Como usado aqui, um câncer (tumor ou neoplasia) é caracterizado por meio de uma ou mais das seguintes pods: crescimento celular não é regulado pelas influências bioquímicas e físicas normais no ambiente; anaplasia (por exemplo, falta de diferenciação celular coordenada normal); e em alguns casos, metástase. Doenças cancerosas incluem, por exemplo, carcinoma anal, carcinoma de bexiga, carcinoma de mama, carcinoma de cérvix, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica, carcinoma endometrial, leucemia de células capilar, carcinoma de cabeça e pescoço, carcinoma de pulmão (célula pequena), mieloma múltiplo, linfona de não-Hodgkin, linfoma folicular, carcinoma de ovário, tumores cerebrais, carcinoma colo- retal, carcinoma hepato-celular, sarcoma de Kaposi, pulmão (carcinoma de célula não-pequena), melanoma, carcinoma pancreático, carcinoma de próstata, carcinoma de células renais e sarcoma do tecido mole. Distúrbios cancerosos adicionais podem ser encontrados em, por exemplo, Isselbacher e colaboradores (1994) Harrison's Principies of Internai Medicine 1814- 1877, aqui incorporado por referência. Tipicamente, os cânceres descritos acima e tratáveis através dos métodos descritos aqui apresentam atividade desregulada na rota da Ras. Em uma modalidade, os cânceres descritos acima contêm uma mutação na rota de sinalização da Ras, resultando em elevada atividade de sinalização de Ras. Por exemplo, a mutação pode ser uma mutação constitutivamente ativa no gene da Ras, tal como Ras V12. A mutação pode estar também em qualquer dos genes relacionados com a rota-Ras que possa resultar em ativação ou atividade alterada da rota.

Em uma modalidade, a invenção está relacionada a um método de tratar ou prevenir câncer em um individuo, que compreende administrar ao individuo uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um composto que is seletivamente tóxico a uma célula tumorigênica humana fabricada, ou uma célula cancerosa de genótipo especifico (ou genótipo especificamen- te alterado). Em certas modalidades, o câncer é caracteriza- do por células que compreendem uma rota Ras ativada. Em cer- tas modalidades adicionais, o câncer é caracterizado por cé- lulas que expressam oncoproteinas T pequenas SV40, ou que apresentam modulações de alvos de sT e/ou RAS oncogênicas.

Em uma modalidade relacionada, a invenção contem- pla a prática do método da invenção em conjunto com outras terapias antitumor tal como quimioterapia convencional dire- cionada contra tumores sólidos e para o controle do estabe- lecimento de metástases. A administração das outras terapias antitumor pode ser conduzida durante ou após quimioterapia. Tais agentes são tipicamente formulados com um veiculo far- maceuticamente aceitável, e podem ser administrados de modo intravenoso, oral, bucal, parenteral, por meio de um borrifo para inalação, por aplicação tópica ou transdérmica. Um a- gente pode também ser administrado por administração local.

Preferivelmente, um ou mais agentes adicionais administração em conjunto com um agente quimioterápico anticâncer (por e- xemplo, um composto da invenção) inibe células cancerosas em modo comparativamente aditivo ou sinérgico.

Um amplo conjunto de compostos convencionais tem mostrado possuir atividades antitumor. Esses compostos têm sido usados como agentes farmacêuticos em quimioterapia para encolher tumores sólidos, prevenir metástases e posterior crescimento ou reduzir o número de células malignas em ma- lignidades leucêmicas ou de medula óssea. Embora a quimiote- rapia seja eficaz no tratamento de diversos tipos de malig- nidades, muitos compostos antitumor induzem efeitos colate- rais indesejáveis. Em muitos casos, quando dois ou mais tra- tamentos são combinados, os tratamentos podem funcionar de modo sinérgico e permitir a redução da dosagem de cada um dos tratamentos, reduzindo desse modo os prejudiciais efei- tos colaterais exercidos por cada um dos compostos em dosa- gens mais altas. Em outros casos, as malignidades que sejam refratárias a um tratamento pode responder a uma terapia de combinação de dois ou mais diferentes tratamentos.

Portanto, compostos e combinações farmacêuticas da presente invenção podem ser administrados em conjunto com um convencional composto antitumor composto. Compostos antitumor convencionais incluem, apenas como ilustração: aminoglutetimide, amsacrina, anastrozol, asparaginase, bcg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfan,

camptotecina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, cladribina, clodronato, colchicina, ciclophosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dienestrol, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramustina, etoposida, exemestan, filgrastima, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracila, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, genisteina, goserelin, hidroxiurea, idarubicin, ifosfamide, imatinib, interferon, irinotecan, ironotecan, letrozol, leucovorin, leuprolide, levamisole, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterone, megestrol, melphalan, mercaptopurina, mesna, metotrexate, mitomicina, mitotane, mitoxantrone, nilutamide, nocodazol, octreotida, oxaliplatina, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfimer, procarbazina, raltitrexed, rituximab, streptozocina, suramin, tamoxifen, temozolomida, teniposida, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloreto de titanoceno, topotecan, trastuzumab, tretinoina, vinblastina, vincristina,

vindesina, e vinorelbina.

Em outras modalidades, compostos e composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em conjunto com um composto antitumor convencional selecionado de: um antagonista de receptor-EGF, sulfeto de arsênico, adriamicina, cisplatina, carboplatina, cimetidina, carminomicina, cloridrato de mecloretamina, pentametilmelamina, tiotepa, teniposida, ciclofosfamida, clorambucil, demetoxiihipocrelin Α, melfalan, ifosfamida, trofosfamida, Treosulfan, podofilotoxina ou derivados de podofilotoxina, fosfato de etoposida, teniposida, etoposida, leurosidina, leurosina, vindesina, 9-aminocamptotecina, camptoirinotecan, crisnatol, megestrol, metopterin, mitomicina C, ecteinascidin 743, busulfan, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), lovastatina, ion l-metil-4- fenilpiridinium, semustina, staurosporina, streptozocina, ftalocianina, dacarbazina, aminopterin, metotrexato, trimetrexato, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribina, citarabina (ara C), porfiromicina, 5-fluorouracila, 6-mercaptopurina, cloridrato de doxorubicina, leucovorin, ácido micofenólico, daunorubicina, deferoxamina, floxuridina, doxifluridina, raltitrexed, idarubicina, epirubican, pirarubican, zorubicina, raitoxantrona, sulfato de bleomicina, actinomicina D, safracinas, saframicinas, quinocarcinas, discodermolidas, vincristina, vinblastina, vinorelbine tartrate, vertoporfin, paclitaxel, tamoxifen, raloxifene, tiazofuran, tioguanina, ribavirin, EICAR, estramustina, estramustine phosphate sodium, flutamide, bicalutamide, buserelin, leuprolida, pteridinas, enediinas, levamisol, aflacon, interferon, interleucinas, aldesleucina, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, betametasona, cloridrato de gemcitabina, verapamil, VP-16, altretamina, thapsigargin, oxaliplatina, iproplatina, tetraplatina, lobaplatina, DCP, PLD-14 7, JMl18, JM216, JM335, satraplatin, docetaxel, deoxygenated paclitaxel, TL- 139, 5'-nor-anhidrovinblastina (daqui emdiante: 5'-nor-vinblastina), camptotecina, irinotecan (Camptosar, CPT-11), topotecan (Hycamptin), BAY 38-3441, 9-nitrocamptotecina (Orethecin, rubitecan), exatecan (DX-8951), lurtotecan (GI- 147211C), gimatecan, homocamptotecinas diflomotecan (BN-80915) e 9- aminocamptotecina (IDEC-131), SN-38, ST1481, karanitecina (BNP1350), indolocarbazóis (por exemplo, NB-506), protoberberinas, intoplicinas, idenoisoquinolonas, bènzo- fenazinas ou NB-506.

Em uma outra modalidade relacionada a invenção contempla a prática do método em conjunto com outras terapi- as antitumor tal como radiação. Como usado aqui, o termo "radiação" é pretendido incluir qualquer tratamento de uma célula neoplásica ou indivíduo por meio de fótons, nêutrons, elétrons, ou de outro tipo de radiação ionizante. Tais radi- ações incluem, mas não estão limitadas a, raios-X, radiação gama, ou partículas iônicas pesadas, tal como partículas al- va ou beta. Adicionalmente, a radiação pode ser radioativa. Os meios para irradiar células neoplásicas em um em um indi- víduo são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, te- rapia de feixe externo, e braquiterapia.

Métodos para determinar se um câncer (tumor ou ne- oplasia) está sendo tratado são bem conhecidos por aqueles usualmente versados na técnica e incluem, por exemplo, uma redução no número de células tumorais (por exemplo, uma re- dução na proliferação de células ou uma redução no tamanho do tumor). É reconhecido que o tratamento da presente inven- ção pode ser uma resposta duradoura e completa ou pode a- branger uma resposta clinica parcial ou transitória. Ver, por exemplo, Isselbacher e colaboradores (1996) Harrison's Principies of Internai Medicine 13 ed., 1814-1882, incorpo- rado aqui por referência. Ensaios para testar a sensibilida- de ou a acentuada morte das células tumorais são bem conhe- cidos na arte, incluindo, por exemplo, ensaios padrões de dose-resposta que avaliam a viabilidade da célula; eletrofo- rese por gel de agarose de extrações de DNA ou citometria de fluxo para determinar a fragmentação do DNA, uma caracterís- tica da morte celular; ensaios que medem a atividade de po- lipeptídios envolvidos na apoptose; e ensaios quanto as si- nais morfológicos da morte celular. Os detalhes com respeito a tais ensaios estão descritos em alguma parte neste pedido. Outros ensaios incluem ensaios de cromatina (por exemplo, contagem da freqüência de cromatina nuclear condensada) ou ensaios de resistência ao fármaco como descritos em, por e- xemplo, Lowe e colaboradores (1993) Cell 74:95 7-697, aqui incorporados por referência. Ver também a Patente U.S. No. 5.821.072, também aqui incorporada por referência.

Composições Farmacêuticas

Agentes farmacêuticos prospectivos podem ser ana- lisados quanto ao seu perfil a fim de determinar sua condi- ção de serem adequados para a inclusão numa composição far- macêutica. Uma medição usual para tais agentes é o índice farmacêutico, que é a relação da dose terapêutica relativa- mente a uma dose tóxica. Os limiares para a dose terapêutica (eficácia) e dose tóxica podem ser ajustados como apropriado (por exemplo, a necessidade de uma resposta terapêutica ou a necessidade para minimizar uma resposta tóxica). Por exem- plo, uma dose terapêutica pode ser a quantidade terapeutica- mente eficaz de um agente (relativamente ao tratamento de uma ou mais condições) e a dose tóxica pode ser a dose que induza morte (por exemplo, uma LD5o) ou provoque um efeito indesejado numa proporção da população tratada. Preferivel- mente, o índice terapêutico de um agente é de pelo menos 2, mais preferivelmente de pelo menos 5, e ainda mais preferi- velmente de pelo menos 10. 0 levantamento do perfil de um agente terapêutico pode também incluir a medição fármaco- cinética do agente, para determinar sua biodisponibilidade e/ou absorção quando administrado em diversas formulações e/ou por meio de diversas rotas.

Um composto da presente invenção pode ser adminis- trado a um indivíduo com necessidade disso. Em certas moda- lidades, o indivíduo é um mamífero tal como um humano, ou um mamífero não humano. Quando administrado a um indivíduo, o composto da invenção pode ser administrado como uma composi- ção farmacêutica contendo, por exemplo, o composto da inven- ção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos far- maceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na arte e in- cluem, por exemplo, soluções aquosas tal como água ou salino fisiologicamente tamponado ou outros solventes ou veículos tais como glicóis, gliceróis, óleos tais como óleo de oliva ou ésteres orgânicos injetáveis. Em uma modalidade preferi- da, quando tais composições farmacêuticas são para adminis- tração humana, a solução aquosa é livre de pirogênios, ou substancialmente livre de pirogênios. Os excipientes podem ser escolhidos, por exemplo, para efetuar a liberação retar- dada de um agente ou para atingir seletivamente uma ou mais células, tecidos, ou órgãos.

Um veiculo farmaceuticamente aceitável pode conter agentes fisiologicamente aceitáveis que atuem, por exemplo, para estabilizar ou aumentar a absorção de um composto da invenção. Tais agentes fisiologicamente aceitáveis incluem, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sacarose ou dextranos, antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou glu- tationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecu- lar ou outros estabilizantes ou excipientes. A escolha de um veículo farmaceuticamente aceitável, incluindo um agente fi- siologicamente aceitável, depende, por exemplo, da rota de administração da composição. A composição farmacêutica (pre- paração) também pode ser um lipossoma ou outra matriz poli- mérica, que pode ter incorporada em seu interior, por exem- plo, um composto da invenção. Lipossomas, por exemplo, que consistem de fosfolipídios ou outros lipídios, são veículos não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis e metabolizáveis que são relativamente simples de produzir e de administrar.

Uma composição farmacêutica (preparação) contendo um composto da invenção pode ser administrada a um indivíduo por meio de qualquer de um número de rotas de administração incluindo, por exemplo, oral, intramuscular, intravenosa, anal, vaginal, parenteral, nasal, intraperitoneal, subcutã- nea, e tópica. A composição pode ser administrada por meio de injeção ou por meio de incubação. Em certas modalidades, o composto da presente in- venção pode ser usado sozinho ou administração em conjunto com um outro tipo de agente terapêutico antitumor. Como usa- da aqui, a frase "administração em conjunto" se refere a qualquer forma de administração em combinação de dois ou mais compostos terapêuticos diferentes tal que o segundo composto é administrado enquanto o composto terapêutico pre- viamente administrado ainda está eficaz no organismo (por exemplo, os dois compostos estão simultaneamente eficazes no paciente, que pode incluir efeitos sinérgicos dos dois com- postos) . tos) . Por exemplo, os diferentes compostos terapêu- ticos podem ser administrados ou na mesma formulação ou em formulação em separado, ou de forma concomitante ou seqüen- cial. Desse modo, um indivíduo que receba tal tratamento po- de se beneficiar de um efeito combinado dos diferentes com- postos terapêuticos.

É contemplado que o composto da presente invenção será administrado a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, preferivelmente um humano) em uma quantidade terapeuticamen- te eficaz (dose) . Por "quantidade terapeuticamente eficaz" é significada a concentração de um composto que seja suficien- te para eliciar o desejado efeito terapêutico (por exemplo, tratamento de uma condição, a morte de uma célula neoplási- ca) . É entendido de modo geral que a quantidade eficaz do composto irá variar de acordo com o peso, sexo, idade, e histórico médico do indivíduo. Outros fatores que influenci- am a quantidade eficaz pode incluir, mas não estão limitadas a, gravidade da condição do paciente, do distúrbio que está sendo tratado, da estabilidade do composto, e, se desejado, de um outro tipo de agente terapêutico que está sendo admi- nistrado com o composto da invenção. Tipicamente, para um indivíduo humano, uma quantidade eficaz irá variar na faixa de a partir de cerca de 0,001 mg/kg de massa corporal até cerca de 50 mg/kg de massa corporal. Uma dose total maior pode ser aplicada por meio de administrações múltiplas do agente. Métodos para determinar a eficácia e a dosagem são conhecidos por aqueles usualmente versados na técnica. Ver, por exemplo, Isselbacher e colaboradores (1996) Harrison's Principies of Internai Medicine 13 ed., 1814- 1882, aqui in- corporado por referência.

Exemplificações

A invenção que está sendo agora descrita de forma geral, será agora mais facilmente compreendida com referência aos exemplos apresentados a seguir, os quais são incluídos meramente para os propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não são pretendidos a limitar a invenção.

Exemplo 1

Preparação de 2-(1-(4-(2-(4- clorofenoxi)acetil)piperazin-1-il)etil)-7-cloro-3-(2- etxifenil)quinazolin-4(3H)-ona

2-(1-(4-(2-(4-clorofenoxiacetil)piperazin-1- il)etil)-7-cloro-3- (2-etoxifenil)quinazolin-4(3H) -ona (Composto 1) foi preparado de acordo com as reações mostradas no Esquema 1.]] <formula>formula see original document page 63</formula>

Esquema 1

Em resumo, ácido 2-amino-4-clorobenzóico foi acilado com cloreto de propionila em trietilamina (TEA) e tetraidrofurano (THF). O composto acilado foi mantido em refluxo com 2-etoxianinila em tricloreto de fósforo e tolueno para produzir 2-etil-7-cloro-3-(2- etoxifenil)quinazolin-4 (3H)-ona. A 2-etil-7-cloro-3-(2- etoxifenil)quinazolin-4(3H)-ona foi bromada com N- bromosuccinimida (NBS) em tetracloreto de carbono, o produto do qual foi em seguida reagido com piperazina em THF. A fração piperazinila foi acetilada com cloreto de 4- clorofenoxiacetila em THF e TEA para produzir o produto final.

EXEMPLO 2

Preparação de 3-(2-Etoxifenil)-2-[(hexahidro-4- metil-lH-l,4-diazepin-l-il)metil]quinazolin-4(3H) -ona .

3-(2-Etoxifenil)-2-[(hexahidro-4-metil-lH-l, 4- diazepin-l-il)metil]quinazolin-4(3H)-ona (Composto 10) foi preparado de acordo com as reações apresentadas no Esquema 2. <formula>formula see original document page 64</formula>

Em resumo, ácido 2-amino-4-nitrobenzóico foi acilado com cloreto de propionila em trietilamina (TEA) e tetraidrofurano (THF). O composto acilado foi mantido em refluxo com 2-etoxianilina em oxicloreto de fósforo (POCI3) e tolueno para produzir 2-etil-7-nitro-3-(2- etoxifenil)quinazolin-4(3H)-ona. A 2-etil-7- nitro-3-(2-etoxifenil)quinazolin-4(3H)-ona foi bromada com N- bromosuccinimida (NBS) em tetracloreto de carbono, o produto do qual foi em seguida reagido com Ν- metil-homopiperazina em THF. O produto dessa reação foi submetido a condições de hidrogenacao utilizando quantidades cataliticas de Pd/carvão (10% Pd) para permirir o composto 10.

EXEMPLO 3

Inibição do Crescimento Celular por meio do Com- posto 1

A capacidade do Composto 1, em DMSO, para inibir o crescimento do tumor e de células normais foi medida. O com- posto foi ensaiado por meio da classificação primária Sytox, um ensaio fenotípico que monitora alterações na sobrevivén- cia-proliferação de células como um resultado do tratamento pelo composto. Foi visualizado como método de alta vazão pa- ra identificar compostos que alterem especificamente o po- tencial de crescimento de células que abrigam as mutações causais encontradas em pacientes de câncer embora não afe- tando o crescimento as células normais. 0 ensaio se baseia numa leitura barata, simples e confiável de uma tintura flu- orescente impermeável à membrana (Sytox, da Molecular Pro- bes) que se liga ao ácido nucléico. Em células saudáveis, não é detectado sinal porque a membrana de uma célula está intacta e o tingidor não vai entrar. Se a membrana de uma célula está comprometida como um resultado da apoptose ou necrose, um sinal fluorescente proporcional ao número de cé- lulas similarmente afetadas será detectado. Mediante utili- zar uma leitura em duas etapas (leitura final em presença de detergente para permitir a marcação de todas as células), o ensaio pode identificar compostos que produzam citostasis, citotoxicidade e/o mitogênese. A primeira leitura ou leitura da "célula morta", proporciona uma estimativa da toxicidade de um dado composto mediante indicar o número de células mortas ou tingidas na cultura no momento do ensaio. A segun- da leitura ou leitura de "célula total", captura ambos os efeitos cumulativos da citotoxicidade em reduzir o tamanho da população celular bem como quaisquer efeitos citostáticos ou anti-proliferativos que um composto de teste possa exer- cer sobre as células na população de teste em ausência de toxicidade. As células foram semeadas de um dia para o outro em placas de 96 cavidades em densidades que sem tratamento puderam permitir 95% de confluência nas cavidades 72 horas mais tarde. No dia seguinte, as células foram expostas aos compostos de teste em uma série de diluições durante um pe- ríodo de 48 horas. Em seguida a esse período de incubação, o reagente Sytox foi acrescentado às culturas na concentração recomendada pelo fabricante e a leitura da fluorescência das células mortas foi tomada. Após o término dessa medição, o detergente Saponin foi acrescentado a cada cavidade das cul- turas para permeabilizar as membranas permitindo ao reagente Sytox adentrar a cada célula, facilitando desse modo a medi- ção do número total de células que permaneceram na cultura. Para a avaliação dos dados, não foi feita diferenciação en- tre os compostos que apresentaram efeitos citotóxicos ou ci- tostáticos.

Os resultados dos ensaios são apresentados na Fi- gura 2. O composto 1 inibiu o crescimento das células tumo- rais com um IC50 de cerca de 10 μΜ.

Os compostos 2 e 3, mostrados nas Figuras 3 e 4, inibiram a proliferação de células HT-1080 com valores de IC50 de 100 nM e 200 nM, respectivamente.

EXEMPLO 4

Inibição do Crescimento de Células HT-1080

A capacidade de diversos compostos da invenção, em DMS0, para inibir o crescimento de células HT-1080 foi medi- da. A linhagem de células HT-1080 usada nesses experimentos foi derivada de um paciente com fibrosarcoma e portando uma mutação de ativação no gene N-ras no códon 12. O composto foi ensaiado usando o ensaio descrito no Exemplo 3. Os re- sultados do ensaio são mostrados na tabela baixo, onde a a- tividade corresponde às seguintes faixas: A - menos que 10 nM, B - 10-100 nM, C - 100-1000 nM, D - 1000-2000 nM, E - maior que 2000 nM.

COMPLETAR TABELA

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Exemplo 5

Tratamento de Xenoenxertos de Tumores A capacidade dos compostos 10 e 25 para inibir o crescimento de xenoenxertos de HT-1080 em seguida a administração intravenosa diária foi avaliada utilizando métodos similares (descritos adiante). Os compostos 10 e 25 foram administrados por 5 dias consecutivos e foram avaliados em suas respectivas doses IV MTD. Sumário:

A linhagem de células HT-1080 usadas nesse estudo de xenoenxerto foi derivada de um paciente com fibrosarcoma e abriga uma mutação de ativação no gene N-ras no códon 12. Os compostos inibiram o crescimento tumoral HT-1080. regres- são robusta do tumor foi observada quando os compostos eram administrados em suas respectivas MTD. Não foram observados sinais clínicos adversos.

Raça de Ratos:

Balb/c pelados (raça Nu/Nu, Charles River Laboratories), femeas, 5-6 semanas de idade (-22 g média de peso corporal)

Grupos de Estudo

A: Controle não tratado, η = 6

Β: Controle veículo para o Composto 10, QD x 5 dias, IV, n = 6

D: Composto 10 @ 25 mg/Kg (MTD), QD x 5 dias, IV,

n = 6

Ε: Composto 10 @ 12,5 mg/Kg (1/2 MTD), QD x 5

dias, IV, n = 6

Programação de Tratamento

Iniciando quando o volume médio do tumor atingiu -300 mm3 e e os tumores começaram a crescer ativamente (dia 1 do estudo), e continuando ao longo do dia 5, cada dia, cada animal foi administrado numa única injeção IV de um dos tratamentos acima mencionados, para um total de 5 tratamentos. Implantes de Tumor e Escalonamento

Cada um dos 50 ratos foi implantado com 1 χ 107 Células HT-1080 através de injeção SC de 0,1 cc de inóculo no flanço traseiro direito. Uma agulha de tamanho 26 G χ 3/8" foi usada. O inóculo de célula tumoral foi preparado utilizando células HT-1080 (isolado ATCC, estoque freezer em 6a passagem) que foi cultivado em DMEM [Gibco, No. 10569- 010] + 10% FCS [Gibco, No. F-2442]. No momento da colheita das células, as células tinham crescido a 95-100% de confluência. O inóculo HT-1080 foi preparado em meio DMEM estéril + 10% FCS numa densidade de 1,0 χ 108 células/mL. No dia +10 do implante pós-tumor, os animais foram colocados em grupos na forma de grupos de tratamento e grupos controle, com cada grupo consistindo de 6 ratos. Um total de 14 discrepantes foram excluídos do estudo devido a tumores que eram ou muito pequenos ou muito grandes. Isso foi considerado o Dia 1 do estudo, e o tratamento foi iniciado nesse dia.

Preparação de Solução Estoque do Composto 10

Na manhã de cada dia de administração de composto, uma solução estoque do composto 10 era preparada fresca, para uma concentração de 20 mg/mL mediante primeiramente dissolver 20 mg do composto 10 até um volume final de 0,2 mL, em um solvente consistindo de 400 mM HCl em água. A so- lução resultante 100 mg/mL foi em seguida diluída 1:5 para uma concentração de 20 mg/mL utilizando um diluente que con- sistiu de 1,1% (78 mM) fosfato sódico dibásico e 3% (90 mM) sacarose. Isto foi feito mediante misturar o volume de 0,2 mL da solução de 100 mg/mL com 0,8 mL de diluente. A solução resultante era de pH = 6,8 e 304 mOsm. Essa solução foi em seguida esterilizada por filtração (0,45 μm) , e foi usada para a preparação de soluções finais de injeção (ver abai- xo).

Preparação das Soluções de Injeção do Composto 10: Em cada um dos 5 dias nos quais o composto foi ad- ministrado, soluções de injeção foram preparadas por dilui- ção da solução estoque de 20 mg/mL usando 5% dextrose para injeção (Baxter, No. 2B0064, NDC 0338-0017-04), como mostra- do na tabela abaixo (as concentrações das 2 soluções de in- jeção foram baseadas numa massa corporal média de 22,0 gra- mas):

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Controle Veiculo para o composto 10

Um controle veiculo foi preparado mediante mistu- rar primeiramente 0,1 mL de 400 mM de HCl com 0,4 mL de di- luente que consistiu de 1,1% (78 mM) fosfato dibásico de só- dio e 3% (90 mM) sacarose. A solução resultante foi em se- guida também diluída, 1:7,27, pela adição de 3,135 mL de 5% dextrose para injeção (Baxter, No. 2B0064, NDC 0338- 0017- 04). O pH da solução foi em seguida ajustado para 7,4 utili- zando NaOH 5M. A solução final correspondeu ao veículo pre- sente na solução de injeção preparada para o grupo D, mas sem o composto presente. A solução controle veiculo foi es- terilizada por filtração antes da administração.

Sumário de dosagem (baseado num peso corporal mé- dio de 22,0 g)

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Medição do Tumor

Começando no Dia 1, todos os animais foram pesa- dos, e as dimensões do tumor (L & W - Comprimento & Largura) foram medidas, dia sim dia não. As módulos do tumor foram então convertidas ao volume do tumor (mm3) usando a seguinte fórmula:

Volume do tumor =L x W x W/2

Os valores resultantes do volume do tumor foram tirados em média para cada grupo de estudo para cada momento no tempo, e foram em seguida marcados em gráfico contra o tempo. A variância foi expressa como erro padrão da média (±SEM). Os resultados desses experimentos são mostrados nas Figuras 1-3.

Os estudos de xenoenxertos indicam que os compos- tos escolhidos são capazes de induzir robusta regressão do tumor HT-1080. não foram observados sintomas clínicos adver- sos nos animais que foram dosados com compostos Prolexys. Esses compostos, portanto, apresentam morte seletiva para as células tumorais.

Exemplo 6

Identificação de Compostos com aumentada potência ou atividade em presença de alelos específicos câncer- relacionados.

É descrito aqui um método para identificar compos- tos com aumentada potência ou atividade em presença de RASvl2. Embora o mt descrito aqui utilize RASvl2 como um gene transformante, outros estudos podem fazer uso de uma ampla variedade de alelos câncer-associados utilizando essa meto- dologia a fim de definir as redes de sinalização que envol- vem muitos oncogenes e supressores de tumor. A classificação primária testa o efeito de tratar células tumorigênicas com cad composto por 48 horas numa concentração de 4 μg/mL, cor- respondente a 10 μΜ para um composto com um peso molecular de 400. A viabilidade da célula é medida utilizando o método Sytox descrito acima ou o tingidor éster de acetoximetil calceína (calceína AM) (Wang e colaboradores, 1993, Hum. Im- munol. 37, 264-270), que é um composto não fluorescente que se difunde livremente para dentro das células. Em células vivas, a calceina AM é clivada por meio de esterases intra- celulares, formando o derivado fluorescente aniônico de cal- ceina, que não pode se difundir para fora das células vivas. Portanto, as células vivas apresentam uma fluorescência ver- de quando incubadas com calceina AM, enquanto que as células mortas não apresentam, as células mortas e tingidas fluores- cem quando incubadas com Sytox. Compostos que induzem a flu- orescência que é diferençável daquela observada nas células controle são subseqüentemente testadas numa série de dilui- ções em células controle e tumorigênicas para identificar compostos que apresentem letalidade sintética, que é a Ieta- lidade em células tumorigênicas mas não em células primárias isogênicas.

EXEMPLO 7

Identificação e Caracterização de Parceiros Ligan- tes de Compostos

Ensaios destrutivos utilizando compostos imobili- zados da invenção e lisados de células são usados para iden- tificar parceiros ligantes para compostos da invenção dentro de uma célula. Experimentos destrutivos são realizados com lisados de células tumorais integrais. Nesses experimentos, um composto da invenção é imobilizado a Affigel 10 e incuba- do com lisado sob condições padrões de destruição. As micro- pérolas são lavadas e o eluidas com erastina 100 μΜ ou um composto da invenção ou 0,8% N-Iauroilsarcosina (sarkosil). Os eluatos são submetidos à análise por espectrometria de massa.

A Figura 4 mostra os resultados de um ensaio des- trutivo usando lisados de célula integral BJELR e compostos (4)-(9).

Incorporação por Referência

Todas as publicações e patentes mencionadas aqui são aqui incorporadas por referência em suas totalidades co- mo se cada publicação ou patente individual fosse especifi- camente e individualmente indicada para ser incorporada por referência. No caso de conflito, o presente pedido, incluin- do quaisquer definições aqui, serão controladas.

Equivalentes

Embora modalidades especificas da invenção em questão tenham sido discutidas, a especificação acima é i- lustrativa e não restritiva. Muitas variações da invenção se tornarão evidentes para aqueles usualmente versados na téc- nica quando do estudo dessa especificação e das reivindica- ções apresentadas adiante. O escopo completo da invenção de- verá ser determinado por referência às reivindicações, jun- tamente com seus escopos completos de equivalentes, e a es- pecificação, juntamente com tais variações.

Claims

1. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que é re- presentado pela Fórmula Estrutural (I) : <formula>formula see original document page 78</formula> ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: Ra é um halogênio, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, al- quinila substituída ou não substituída, aril-0- substituída ou não substituída, alquil-0- substituída ou não substituí- da, alquenil-O- substituída ou não substituída ou alquinil- O- substituída ou não substituída, onde a alquila, alquenila e alquinila estão opcionalmente interrompidas por NR, 0 ou S(O)n; cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -NRC(O)R, -SO2N(R)2, -N(R)2, -NO2, -OH e - OR' ; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -NRC(O)R, -SO2N(R)2, -N(R)2, -NO2, -OH e - OR'; R4 e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que compreende -H, alquila substituída ou não subs- tituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, heterocíclico não aromático substituído ou não substituído e arila substituída ou não substituída, onde a alquila, alquenila e alquinila estão op- cionalmente interrompidas por NR, O ou S(O)n; ou R4 e R5 to- mados em conjunto formam um grupo carbocíclico ou heterocí- clico; V é -NH-L-A-Q ou <formula>formula see original document page 79</formula> o anel C é um anel heterocíclico aromático ou não aromático substituído ou não substituído; A é NR ou O; ou A é uma ligação covalente; L é um grupo hidrocarbila substituído ou não substituído opcional- mente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados de N, O e S; Q é selecionado a partir do grupo que compreende - R, -C(O)R', -C(O)N(R)2, -C(O)OR' e -S(O)2R'; cada R é inde- pendentemente -H, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substi- tuída ou não substituída, arila substituída ou não substitu- ida ou heterocíclico não aromático substituído ou não subs- tituído; cada R' é independentemente um grupo alquila subs- tituído ou não substituído, alquenila substituído ou não substituído, alquinila substituído ou não substituído, grupo heterocíclico não aromático substituído ou não substituído ou grupo arila substituído ou não substituído; j é um inteiro de 0 a 4; k é um inteiro de 0 a 4, com a condição de que pe- lo menos um de j e k é um inteiro de 1 a 4; e cada η é independentemente 0, 1 ou 2.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que V é

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que V é <formula>formula see original document page 81</formula>

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que Q é -C(O)R' ou -R.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que Q é -H, metila ou etila.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que A é uma ligação covalente ou NR.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R5 são -H ou um grupo alquila substituído ou não substituído.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R5 são — H ou um grupo alquila C1-C4 não substituído.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que Ra é um grupo alquil-0- subs- tituído ou não substituído.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que Ra é um grupo alquil (C1-C4) -0- não substituído.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que j é um inteiro de 1 a 4.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende -NRC(O)R, -NR2, halogênio, alquila polar substituída, arila carbocíclica po- lar substituída, heteroarila substituída ou não substituída e heterocíclico não aromático substituído ou não substituí- do.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto está representado pela Fórmula Estrutural (Ia): <formula>formula see original document page 82</formula>

14. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que k é um inteiro de 1 a 4.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende alquila polar substituída, arila carbocíclica polar substituída, heteroa- rila substituída ou não substituída e heterocíclico não aro- mático substituído ou não substituído.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto está representado pela Fórmula Estrutural (Ib): <formula>formula see original document page 83</formula>

17. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que j é um inteiro de 1 a 4 e k é um inteiro de 1 a 4.

18. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que é re- presentado pela Fórmula Estrutural (II): <formula>formula see original document page 83</formula> ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: R1 é um grupo alquila substituído ou não substitu- ido, alquenila substituído ou não substituído ou alquinila substituído ou não substituído, cada um dos quais está op- cionalmente interrompido por NR, 0 ou S(O)n; cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, hete- rociclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -SO2N(R)2, -OH e -OR'; cada R3 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende halogênio, alquila substituída ou não substituída, arila substituída.ou não substituída, hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído, -CN, -COOR', - CON(R)2, -SO2N(R)2, -OH e -OR'; R4 e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que compreende -H, alquila substituída ou não subs- tituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, heterocíclico não aromático substituído ou não substituído e arila substituída ou não substituída, onde a alquila, alquenila e alquinila estão op- cionalmente interrompidas por NR, O ou S(O)n; ou R4 e R5 to- mados em conjunto formam um grupo carbocíclico ou heterocí- clico; V é -NH-L-A-Q ou <formula>formula see original document page 84</formula> o anel C um anel heterocíclico aromático ou não aromático substituído ou não substituído; A é NR ou O; ou A é uma ligação covalente; L é um grupo hidrocarbila substituído ou não subs- tituído opcionalmente interrompido por um ou mais heteroáto- mos selecionados de Ν, Oe S; Q é selecionado a partir do grupo que compreende - R, -C(O)R', -C(O)N(R)2, -C(O)OR' e -S(O)2R'; cada R é independentemente -H, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituí- da, alquinila substituída ou não substituída, arila substi- tuída ou não substituída ou heterocíclico não aromático substituído ou não substituído; cada R' é independentemente uma alquila substituí- da ou não substituída, alquenila substituída ou não substi- tuída, alquinila substituída ou não substituída, grupo hete- rocíclico não aromático substituído ou não substituído ou grupo arila substituído ou não substituído; j é um inteiro de 0 a 4; k é um inteiro de 0 a 4, com a condição de que pe- lo menos um de j e k é um inteiro de 1 a 4; e cada η é independentemente 0, 1 ou 2.

19. Composto, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que V é <formula>formula see original document page 85</formula>

20. Composto, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que V é <formula>formula see original document page 86</formula>

21. Composto, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que Q é -R.

22. Composto, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que Q é -H, metila ou etila. CARACTERIZADO pelo fato de que Δ é uma ligação covalente ou NR.

23. Composto, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que A e uma ligacao covalente ou NR.

24. Composto, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e Rs são -H ou um grupo alquila substituído ou não substituído.

25. Composto, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R5 são -H ou um grupo alquila C1-C4 não substituído.

26. Composto, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que Ri é um grupo alquila substi- tuído ou não substituído.

27. Composto, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que Ri é um grupo alquila Ci-C4 não substituído.

28. Composto, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que j é um inteiro de 1 a 4.

29. Composto, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende -NRC(O)R, -NR2, halogênio, alquila polar substituída, arila carbocíclica po- lar substituída, heteroarila substituída ou não substituída e heterocíclico não aromático substituído ou não substituí- do.

30. Composto, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que k é um inteiro de 1 a 4.

31. Composto, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que cada R2 é independentemente selecionado a partir do grupo que compreende alquila polar substituída, arila carbocíclica polar substituída, heteroa- rila substituída ou não substituída e heterocíclico não aro- mático substituído ou não substituído.

32. Composto, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que j é um inteiro de 1 a 4 e k é um inteiro de 1 a 4.

33. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

34. Método de tratar uma condição em um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao ma- mífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células possuem atividade mensurável de sinalização Ras.

36. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida condição é câncer.

37. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO por adicionalmente compreender administrar de modo conjunto ao referido mamífero um agente que aniquila as células através de um mecanismo apoptótico.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente é um agente quimioterápico.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente quimioterápico é selecionado de: antagonista de receptor EGF, sulfeto de arsênico, adriamicina, cisplatina, carboplatina, cimetidina, carminomicina, cloridrato de mecloretamina, pentametilmelamina, tiotepa, teniposida, , ciclofosfamida, clorambucil, demetoxi-hipocrelina A, melfalan, ifosfamida, trofosfamida, Treosulfan, podofilotoxina ou derivados podofilotoxina, fosfato de etoposida, teniposida, etoposida, leurosidina, leurosina, vindesina, 9-aminocamptotecina, camptoirinotecan, crisnatol, megestrol, metopterin, mitomicin C, ecteinascidin 743, busulfan, carmustina, lomustina, lovastatia, íon l-metil-4- fenilpiridinium, semustina, estaurosporina, estreptozocina, ftalocianine, dacarbazina, aminopterina, metotrexato, trimetrexato, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribina, citarabina, porfiromicina, 5- fluorouracila, 6-mercaptopurina, cloridrato de doxorubicina, leucovorina, ácido micofenólico, daunorubicina, deferoxamina, floxuridina, doxifluridina, raltitrexed, idarubicina, epirubican, pirarubican, zorubicina, mitoxantrona, sulfato de bleomicina, actinomicina D, safracinas, safrarnicinas, quinocarcinas, discoderraolidas, vincristina, vinblastina, tartarato de vinorelbina, vertoporfina, paclitaxel, tamoxifeno, raloxifeno, tiazofurano, tioguanina, ribavirina, EICAR, estramustina, fosfato sódico de estramustina, flutamida, bicalutamida, buserelina, leuprolida, pteridinas, enediinas, levamisol, aflacon, interferon, interleucinas, aldesleucina, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, betametosona, cloridrato de gemcitabina, verapamil, VP- 16, altretamina, tapsigargina, oxaliplatina, iproplatina, tetraplatina, lobaplatina, DCP, PLD-147, JM118, JM216, JM335, satraplatina, docetaxel, paclitaxel desoxigenado, TL- -139, 5'-nor-anidrovinblastina, camptotecina, irinotecan, topotecan, BAY 38-3441, 9-nitrocamptotecina, exatecan, lurtotecan, gimatecan, homocamptotecinas diflomotecan e 9- aminocamptotecina, SN-38, ST1481, karanitecina, indolcarbazóis, protoberberinas, intoplicinas, idenoisoquinolonas, benzo-fenazinas e NB-506.

40. Método de aniquilar uma célula, CARACTERIZADO prd compreende administrar a uma célula uma quantidade efi- caz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1-32 e de um agente que aumente a abundancia de VDAC numa célula.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula é uma célu- la cancerosa.

42. Método uma célula, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a uma célula uma quantidade efi-· caz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1-32 e um agente que reduza a abundancia de VDAC na célula.

43. Método de promover a morte celular ou a inibi- ção do crescimento celular, CARACTERIZADO prd compreende ad- ministrar à célula uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

44. Método de reduzir a taxa de crescimento celu- lar de um tumor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar o tumor com uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

45. Método de aumentar a sensibilidade de uma cé- lula tumoral a um agente quimioterápico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar a célula tumoral com uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

46. Composição farmacêutica embalada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32; e (ii) instruções, rótulo ou ambos para a adminis- tração do agente para o tratamento de pacientes que possuem câncer.