BRPI0618658A2

BRPI0618658A2 - polipeptìdeo isolado, polinucleotìdeo isolado, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, método para produzir o polipeptìdeo, composição de enzima, uso do polipeptìdeo ou da composição de enzima, composição detergente, e, composição para tratamento de artigo têxtil

Info

Publication number: BRPI0618658A2
Application number: BRPI0618658-0A
Authority: BR
Inventors: Katja Salomon Johansen; Keith Gibson; Preben Nielsen; Helle Outtrup
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2005-11-16
Filing date: 2006-11-15
Publication date: 2011-09-06
Also published as: ATE515568T1; US8309338B2; JP2009517004A; EP1994148B1; CN101310017B; CN101310017A; JP5571310B2; EP1994148A1; US20110201082A1; WO2007057418A1; US20080280325A1

Abstract

POLIPEPTìDEO ISOLADO, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MéTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTìDEO, COMPOSIçãO DE ENZIMA, USO DO POLIPEPTìDEO OU DA COMPOSIçãO DE ENZIMA, COMPOSIçãO DETERGENTE, E, COMPOSIçãO PARA TRATAMENTO DE ARTIGO TêXTIL. A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. A invenção também se refere a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeo s assim como método para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO DE ENZIMA, USO DO POLIPEPTÍDEO OU DA COMPOSIÇÃO DE ENZIMA, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, E, COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO DE ARTIGO TÊXTIL". SEQÜÊNCIAS:

SEQ ID NO: 1, Seqüência de polinucleotídeos codificando endoglucanase de Bacillus sp. ACE160.

SEQ ID NO: 2, Seqüência de polipeptídeos de Bacillus sp. ACE160 endoglucanase e módulo de ligação de carboidratos.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. A invenção refere-se também a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos para produzir e usar os polipeptídeos nas indústrias de fabricação de detergente, papel e pasta, perfuração de petróleo, extração de petróleo, vinhos e sucos, ingredientes alimentícios, ração animal ou artigos têxteis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Celulose é um polímero de glicose ligado por ligações beta- 1,4-glucosídicas. As cadeias de celulose formam numerosas ligações de hidrogênio intra- e intermoleculares, que resultam na formação de micro- fibrilas de celulose insolúveis. Hidrólise microbiana de celulose em glicose envolve as três maiores classes de celulases seguintes: (i) endoglucanases (EC 3.2.1.4) que clivam ligações beta-l,4-glucosídicas aleatoriamente por todas as moléculas de celulose, também denominadas endo-beta-l,4-glucanases; (ii) celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91) que digerem celulose da extremidade não redutora; e (iii) beta-glucosidases (EC 3.2.1.21) que hidrolisam celobiase e celodextrinas de baixo peso molecular para liberar glicose.

As ligações beta-l,4-glucosídicas também estão presentes em outros polímeros de ocorrência natural, por exemplo, nos beta-glucanos de plantas como cevada e aveias. Em alguns casos, as endoglucanases também provêem hidrólise destes polímeros não celulose.

As celulases são produzidas por muitos microorganismos e com freqüência estão presentes em formas múltiplas. O reconhecimento do significado econômico da degradação enzimática de celulose promoveu uma pesquisa extensiva por celulases microbianas, que podem ser usadas industrialmente. Como um resultado, as propriedades enzimáticas e as estruturas primárias de um grande número de celulases foram investigadas. Com base nos resultados de uma análise de agrupamentos hidrofóbicos da seqüência de aminoácidos do domínio catalítico, estas celulases foram colocadas em famílias diferentes de glicosil hidrolases; glicosil hidrolases füngicas e bacterianas foram agrupadas em 35 famílias (Henrissat, B.: A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), 309-316. Henrissat, B., e Bairoch, A.: New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993), 781-788.). A maior parte das celulases consiste de um módulo de ligação de carboidratos (CBM) e um domínio catalítico (CAD) separados por um ligador que pode ser rico em resíduos de aminoácidos hidróxi e prolina. Uma outra classificação de celulases foi estabelecida com base na similaridade de seus CBMs (Gilkes et al. (1991)) dando cinco famílias de glicosil hidrolases (I-V).

As celulases são sintetizadas por um grande número de microorganismos que incluem fungos, actinomicetos, mixobactérias e bactérias verdadeiras, mas também por plantas. Especialmente endo-beta-1,4- glucanases de uma ampla variedade de especificidades foram identificadas. Muitas endoglucanases bacterianas foram descritas (Gilbert, HJ. e Hazlewood, G. P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194. Henrissat, B., e Bairoch, A.: New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993), 781-788.).

Um uso industrial importante de enzimas celulolíticas é para o tratamento de pasta de papel, por exemplo, para melhorar a drenagem ou para remover a tinta de papel reciclado. Um outro importante uso industrial de enzimas celulolíticas é para o tratamento de artigos têxteis ou tecidos celulósicos, por exemplo, como ingredientes em composições detergentes ou composições amaciantes de tecidos, para biopolimento de tecido novo (acabamento de peças de vestuário) e para obter uma aparência de tipo iiStone- Washecf de tecido contendo celulose, especialmente denim, e vários métodos para este tratamento foram sugeridos, por exemplo, em GB-A- 1 368 599, EP- A-O 307 564 e EP-A-O 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, WO 95/24471 e WO 95/26398. O pedido de patente JP n°. 13049/1999 descreve uma celulase alcalina resistente ao calor derivada de Bacillus sp. KSM-S237 (depositado como FERM-P-16067) apropriada para detergentes.

Nota-se uma necessidade sempre existente de prover novas enzimas celulase ou preparações enzimáticas que podem ser usadas para aplicações onde é desejável a atividade de celulase (endoglucanase, EC 3.2.1.4), preferivelmente uma endo-beta-l,4-glucanase,.

O objeto da presente invenção é prover polipeptídeos e composições de polipeptídeos tendo atividade de beta-1,4-glucanase substancial em condições levemente ácidas a alcalinas e desempenho melhorado no processamento de pasta de papel, tratamento de artigos têxteis, processos de lavagem de roupa, processos de extração ou em ração animal; preferivelmente, estas novas endoglucanases de alto desempenho são produzíveis ou produzidas usando técnicas recombinantes em altos rendimentos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase selecionados dentre o grupo consistindo de:

(a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 72% de identidade com aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2;

(b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob pelo menos condições de baixa estringência com (i) nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ ID NO: 1, ou (ii) um filamento complementar de (i); e

(c) uma variante compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados codificando polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase, selecionados dentre o grupo consistindo de:

(a) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 72% de identidade com aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2;

(b) um polinucleotídeo que hibridiza em condições de pelo menos uma estringência baixa com (i) nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ ED NO: 1, ou (ii) um filamento complementar de (i).

A presente invenção refere-se também a construções de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos. A presente invenção refere-se também a métodos para produzir os polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em condições conduzindo a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A endo-beta-l,4-glucanase da invenção tem propriedades de estabilidade e de atividade que tornam a mesma excepcionalmente bem apropriada para uso em aplicações envolvendo soluções alcalinas aquosas que contem tensoativos e/ou espécies ativas oxidativas como alvejantes químicos. Estas condições de aplicação são muito comumente encontradas, tanto em detergentes domésticos como industriais, tratamentos de acabamento de artigos têxteis e na fabricação ou reciclagem de pastas celulósicas.

Porque a endoglucanase da invenção manter sua atividade em uma extensão excepcional em condições de aplicação relevantes, contempla- se que ela será mais utilizável do que outras enzimas conhecidas, por exemplo, quando usada em detergentes, para processamento de papel/pasta ou para tratamento de artigos têxteis. A presente invenção, assim, refere-se também a métodos de usar os polipeptídeos da invenção em uma composição de detergente ou de tratamento de artigo têxtil, uma composição para tratamento de pasta de papel ou para degradação de biomassa, por exemplo, para a produção de etanol. Além disso, a invenção refere-se a métodos para lavagem de artigo têxtil, utensílios de cozinha ou superfícies duras com um detergente compreendendo os polipeptídeos, métodos para tratamento de artigos têxteis ou tecidos celulósicos como amaciamento, biopolimento ou stone-washing. Também, métodos para melhorar a drenagem ou para remoção da tinta de papel reciclado são incluídos.

A presente invenção ainda refere-se a construções de ácido nucleico compreendendo um gene codificando uma proteína, em que o gene é ligado operativamente a uma ou ambas de uma primeira seqüência de nucleotídeos codificando um peptídeo de sinal consistindo de nucleotídeos 1 a 99 de SEQ ID NO: 1. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1, Alinhamento da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da invenção (ACE160, SEQ ID NO: 2) com polipeptídeos relacionados na técnica anterior. Os polipeptídeos da técnica anterior são descritos como:

<table>table see original document page 7</column></row><table>

Figura 2, Arvore filogenética mostrando a relação da endoglucanase da invenção (ACE160, SEQ ID NO: 2) com as seqüências de polipeptídeos da técnica anterior foi construída por alinhamento das configurações de "default" na função ClustaIV do programa MegAlign™ versão 5.05 no pacote de programas DNAStar™.

DEFINIÇÕES

Atividade de endoglucanase: O termo "atividade de endoglucanase" é definido aqui como uma atividade hidrolítica que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, beta-D- glucanos de liquenina e cereais, EC 3.2.1.4. Um método para determinação da atividade de endoglucanase é descrito abaixo.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100% da atividade de endoglucanase do polipeptídeo consistindo da seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2, ou o domínio de núcleo catalítico consistindo dos aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2.

Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado", como usado aqui, refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro, preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, mais preferivelmente pelo menos 90% puro, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeo substancialmente puro" significa aqui uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, mais preferivelmente no máximo 1%, e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material polipeptídico com o qual está nativamente associado. Assim, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 92% ouro, preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro, e ainda mais preferivelmente 100% puro em peso do material polipeptídico total presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma pura. Em particular, é preferido que os polipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação do polipeptídeo é essencialmente livre de outro material polipeptídico com o qual está nativamente associada. Isto pode ser realizado, por exemplo, preparando o polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" é sinônimo dos termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na forma isolada".

Identidade: O parentesco entre as seqüências de aminoácidos é descrito pelo parâmetro "identidade".

Para os fins da presente invenção, o alinhamento de duas seqüências de aminoácidos é determinado usando o programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. MoL Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura do espaço é 10 e a penalidade de extensão do espaço é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido da presente invenção ("seqüência da invenção"; por exemplo, aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2 ou o domínio de núcleo catalítico dos aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2) e uma seqüência de aminoácidos ("seqüência estrangeira") é calculado como o número de correspondências exatas em um alinhamento de duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüência da invenção" ou o comprimento da "seqüência estrangeira", qual for o mais curto. O resultado é expressado em identidade percentual. Uma correspondência exata ocorre quando a "seqüência da invenção" e a "seqüência estrangeira" têm resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo que é representado por " |"). O comprimento de uma seqüência é o número de resíduos de aminoácidos na seqüência (por exemplo, o comprimento da "seqüência da invenção" de SEQ ID NO: 2 são 759 aminoácidos).

No exemplo de alinhamento abaixo, a sobreposição é a seqüência de aminoácidos "HTWGER. NLG" da seqüência 1; ou a seqüência de aminoácidos "HGWGEDANLA" da seqüência 2. Um espaço é indicado por um ".".

Exemplo de alinhamento Seqüência 1: ACMSHTWGER. NLG

| | | | ||:

Seqüência 2: HGWGEDANLAMNPS

O comprimento da sobreposição da "seqüência da invenção" pode ser pelo menos 20% do comprimento da "seqüência da invenção", mais preferivelmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou pelo menos 90% do comprimento da "seqüência da invenção".

O comprimento da sobreposição da "seqüência estrangeira" pode ser pelo menos 20% do comprimento da "seqüência estrangeira", mais preferivelmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou pelo menos 90% do comprimento da "seqüência da invenção".

Fragmento de polipeptídeo: O termo "fragmento de polipeptídeo" é definido aqui como um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletado do término amino e/ou carboxila de SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência homóloga do mesmo, em que o fragmento tem atividade de endoglucanase. Preferivelmente, o fragmento contém pelo menos 283 resíduos de aminoácidos, por exemplo, aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2.

Subseqüência: O termo "subseqüência" é definido aqui como uma seqüência de nucleotídeos tendo um ou mais nucleotídeos deletados da extremidade 5' e/ou 3' de SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência homóloga dos mesmos, em que a subseqüência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase. Preferivelmente, a subseqüência contém pelo menos 849 nucleotídeos, por exemplo, ácidos nucleicos 193 a 1041 de SEQ ID NO: 1.

Variante alélica: O termo "variante alélica" significa aqui qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo locus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações do gene podem ser silentes (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo "polinucleotídeo substancialmente puro", como usado aqui, refere-se a uma preparação de polinucleotídeos livre de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma apropriado para uso em sistemas de produção de proteína geneticamente engenheirada. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, mais preferivelmente no máximo 1%, e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material polinucleotídico com o qual ele está nativamente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro, pode, no entanto, incluir regiões não traduzidas 5' e 3' de ocorrência natural, como promotores e terminadores. E preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferivelmente pelo menos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, mais preferivelmente pelo menos 99%, e ainda mais preferivelmente 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polinucleotídeos descritos aqui estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação de polinucleotídeos seja essencialmente livre de outro material polinucleotídico com o qual estão nativamente associados. Assim, o termo "polinucleotídeo substancialmente puro" é sinônimo dos termos "polinucleotídeo isolado" e "polinucleotídeo na forma isolada". Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi- sintética, sintética, ou quaisquer combinações dos mesmos.

Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácido nucleico", como usado aqui, refere-se a uma molécula de ácido nucleico, tanto de filamento único como duplo, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou que é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que não pode, de outro modo, existir na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão" quando a construção de ácido nucleico contém seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" é definido aqui para incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estrangeira para a seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo. Estas seqüências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de pró-peptídeo, promotor, seqüência de peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor, e sinais de parada transcricional e tradução. As seqüências de controle podem ser providas com ligadores para o fim de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das seqüências de controle com a região de codificação da seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo.

Ligado operativãmente: O termo "ligado operativãmente" significa aqui uma configuração em que uma seqüência de controle é colocada em uma posição apropriada com relação à seqüência de codificação da seqüência de polinucleotídeos de modo que a seqüência de controle dirige a expressão da seqüência de codificação de um polipeptídeo.

Seqüência de codificação: Quando usado aqui, o termo "seqüência de codificação" significa uma seqüência de nucleotídeos, que especifica diretamente a seqüência de aminoácidos de seu produto de proteína. Os limites da seqüência de codificação são geralmente determinados por uma matriz de leitura aberta, que geralmente começa com o códon de parada ATG ou códons de parada alternativos como GTG e TTG. A seqüência de codificação pode ser uma seqüência de DNA, cDNA ou de nucleotídeos recombinante.

Expressão: O termo "expressão" inclui uma etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitada a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção.

Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é definido aqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção, e que é ligada operativamente a outros nucleotídeos que provêem sua expressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como usado aqui, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível a transformação, transfecção, transdução, e outros, com uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo um seqüência de aminoácidos que tem um grau de identidade para aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2, isto é, o polipeptídeo maduro de pelo menos 72%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 97%, que têm atividade de endoglucanase (a seguir "polipeptídeos homólogos). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos têm uma seqüência de aminoácidos que difere em dez aminoácidos, preferivelmente em cinco aminoácidos, mais preferivelmente em quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente em três aminoácidos, mais preferivelmente em dois aminoácidos, e ainda mais preferivelmente em um aminoácido dos aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende um domínio de núcleo catalítico nos aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2, um ou ma variante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. O polipeptídeo do domínio de núcleo catalítico tem uma seqüência de aminoácidos que tem um grau de identidade de aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 86%, mais preferivelmente pelo menos 88%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 97%. Em um outro aspecto, um polipeptídeo compreende um domínio de núcleo catalítico nos aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2, ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem uma atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dos aminoácidos 65 a 347 de SEQ LD NO: 2.

A anotação do domínio de núcleo catalítico é à base de em homologia a celulases da família 5 de glicosil hidrolase (Henrissat Β. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 309-316 (1991); Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 781-788 (1993); Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence- based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316 695-696 (1996); Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3 853-859 (1995); Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemesle L., Mornon J. -P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. Gene 81 83-95 (1989); Py B., Bortoli-German I., Haiech J., Chippaux M., Barras F. Cellulase EGZ of Erwinia chrysanthemi: structural organization and importance of His98 and Glul33 residues for catalysis. Protein Eng. 4 325-333 (1991)). A anotação de domínio do domínio de núcleo catalítico está disponível através de http://afinb.cnrs- mrs.fr/CAZY/, http://www.ebi.ac.uk/interpro/, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/, ou http://www.expasy.org/prosite/.

Em um outro aspecto da invenção, o polipeptídeo compreende um módulo de ligação de carboidrato nos aminoácidos 368 a 569 de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, a presente invenção refere-se a polipeptídeos compreendendo um módulo de ligação de carboidrato tendo um grau de identidade nos aminoácidos 368 a 569 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 67%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 97%. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende um módulo de ligação de carboidrato nos aminoácidos 368 a 569 de SEQ ID NO: 2, ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade de ligação de carboidrato. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dos aminoácidos 368 a 569 de SEQ ID NO: 2.

O módulo de ligação de carboidrato pertence à família 17/28. A anotação de CBM é à base de em homologia com seqüências conhecidas, especialmente CBM de KSM-635 (Ozaki,K. ShikatajS. Kawai,S. lto,S. OkamotojK.; "Molecular cloning and nucleotide sequence of a gene for alkaline cellulase from Bacillus sp. KSM-635."; J. Gen. Microbiol. 136:1327- 1334 (1990), Uniprot No. P19424), que foi anotado como um CBM com base em relação domínios de tipo de ligação de galactose, descritos em Ito N., Phillips S. E., Stevens C, Ogel Z. B., McPherson M. J., Keen J. N., Yadav K.D., Knowles P. F. Novel thioether bond revealed by a 1.7 A crystal structure of galactose oxidase. Nature 350 87-90 (1991); Macedo-ribeiro S., Bode W., Huber R., Quinn-Allen M.A., Kim S.W., Ortel T.L., Bourenkov G. P., Bartunik H. D., Stubbs M.T., Kane W.H., Fuentes-prior P. Crystal structures of the membrane-binding C2 domain of human coagulation factor V. Nature 402 434-439 (1999); Himanen J. P., Rajashankar K. R., Lackmann M., Cowan CA., Henkemeyer M., Nikolov D. B. Crystal structure of an Eph receptor-ephrin complex. Nature 414 933-938 (2001) [PUBMED:1 1780069] [PUB00010665]; e Marintchev A., Mullen M.A., Maciejewski M. W., Pan B., Gryk M. R., Mullen G. P. Solution structure of the single-strand break repair protein XRCCl N-terminal domain. Nat. Struet. Biol. 6 884-893 (1999). A anotação de domínio do módulo de ligação de carboidrato está disponível através de http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/, http://www.ebi.ac.uk/interpro/ http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/, ou http://www.expasy.org/prosite/.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam em condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência médias-altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas, e mais preferivelmente condições de estringência muito altas com (i) nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ ED NO: 1, (ii) uma subseqüência de (i) ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2~ edição, Cold Spring Harbor, New York). Uma subseqüência de SEQ ID NO: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos, mais preferivelmente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 nucleotídeos contíguos, ou ainda mais preferivelmente pelo menos 100 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de endoglucanase.

A seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma subseqüência da mesma, bem como a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma, podem ser usadas para projetar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos codificando DNA tendo atividade de endoglucanase de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, estas sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA ou do gênero ou espécie de interesse, de acordo com procedimentos de Southern blotting padrão, a fim de identificar e isolar o gene correspondente aos mesmos. Estas sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência total, mas devem ter pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, e mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. No entanto, é preferido que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que têm pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos preferivelmente 700 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos, ou mais preferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Ambas as sondas de DNA e de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas detectando o gene correspondente (por exemplo, com 32Ρ, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Estas sondas são englobadas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico preparada a partir de outros organismos pode, assim, ser triada para DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase. DNA genômico ou outro destes outros organismos pode ser separado por eletroforese de gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material veículo apropriado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID NO: 1 ou uma subseqüência da mesma, o material veículo é usado em um Southern blot.

Para os fins da presente invenção, hibridização indica que a seqüência de nucleotídeo hibridiza em uma sonda de ácido nucleico rotulada correspondente à seqüência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO:, seu filamento complementar, ou uma subseqüência da mesma, em condições de estringência muito baixas a muito altas. As moléculas em que a sonda de ácido nucleico hibridiza nestas condições pode ser detectada usando filme de raios X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico são os nucleotídeos 193 a 1041 de SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é uma seqüência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou uma subseqüência da mesma. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a região de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5 X SSPE, 0,3% de SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e tanto 25% de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35% de formamida para estringências médias e médias-altas, ou 50% de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada durante 15 minutos usando 2 X SSC, 0,2% de SDS, preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos 60°C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência alta) e mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta). Preferivelmente, a lavagem é conduzida usando 0,2 X SSC, 0,2% de SDS, preferivelmente pelo menos a 450C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência alta), e mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas que têm cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização, e lavagem pós-hibridização em cerca de 5°C a cerca de IO0C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Botton e McCarthy (1962, Proceeedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, 0,5% de NP-40, IX de solução de Denhardt, pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato monobásico de sódio 1 mM, ATP 0,1 nM, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão.

Para sondas curtas que têm de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1% de SDS durante 15 minutos e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a IO0C abaixo do Tm calculado.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase codificada por um polinucleotídeo compreendendo os nucleotídeos 193 a 1041 de SEQ ID NO: 1, como um motivo único.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo as seguintes propriedades físico-químicas: pl de 4,4, pH ótimo de 9, temperatura ótima de 40°C e estabilidade em pH de 5 a 10,5. A beta-l,4-glucanase da invenção não é significativamente inativada por íons de Fé (II). Uma sensibilidade da atividade enzimática do polipeptídeo na presença de íons ferrosos pode colocar restrições na aplicabilidade do polipeptídeo, como em processos realizados em recipientes ou equipamento de metal.

Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a variantes artificiais compreendendo uma substituição conservativa, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro dos mesmos. Preferivelmente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza menor, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente a duplicação e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões amino- ou carboxil-terminais pequenas, como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação trocando a carga líquida ou uma outra função, como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças de ocorrência mais comum são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Vai, Ala/Glu, e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não padrões (como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos. "Aminoácidos não naturais" são modificados após síntese de proteína, e/ou têm uma estrutura química em sua(s) cadeia(s) lateral(ais) diferente da dos aminoácidos padrão. Aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados, e, preferivelmente, estão comercialmente disponíveis, e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina, e 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, trocar o pH ótimo, e outros.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo parental podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese dirigida ao sítio ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alalina únicas são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica (isto é, atividade de endoglucanase) para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos na atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, como determinado por técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou rotulação de foto-afinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos do sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas de análises de identidades com polipeptídeos que são relacionados a um polipeptídeo de acordo com a invenção. Substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de triagem relevante, como os descritos por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; patente U.S. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese dirigida a região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Fontes de polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido de microorganismos de qualquer gênero. Para os fins da presente invenção, o termo "obtido de", como usado aqui em conexão com uma dada fonte, poderá significar que o polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos é produzido pela fonte ou por uma cepa em que a seqüência de nucleotídeos da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo como polipeptídeo de Bacillus, por exemplo, um Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus Hcheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou polipeptídeo de Bacillus thuringiensis/ou um polipeptídeo de Streptomyces lividans ou polipeptídeo de Streptomyces murinus; ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo, por exemplo, um E. coli ou um polipeptídeo de Pseudomonas sp.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um Bacillus sp. ACE160, por exemplo, o polipeptídeo de SEQID NO: 2.

Será compreendido que para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome da espécie pelo qual eles são conhecidos. Os versados na técnica irão reconhecer prontamente a identidade dos equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, os polipeptídeos podem ser identificados e obtidos a partir de outras fontes incluindo microorganismos, isolados da natureza (por exemplo, sujeira, esterco, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolar microorganismos de habitais naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode então ser obtido triando-se similarmente uma biblioteca genômica ou de cDNA de um outro microorganismo. Uma vez que seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo foi detectada com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são bem conhecidas dos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fusionados ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que um outro polipeptídeo é fusionado ao termino N ou término C do polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fusionado é produzido fusionando uma seqüência de nucleotídeos (ou uma porção da mesma) codificando um outro polipeptídeo em uma seqüência de nucleotídeos (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem a ligação das seqüências de codificação codificando os polipeptídeos de modo que eles estão em armação e que a expressão do polipeptídeo fusionado está sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polinucleotídeos

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados tendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeos é descrita em SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto, a seqüência de nucleotídeos é a região codificando o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. A presente invenção também engloba seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro da mesma, que difere da SEQ ED NO: 1 em virtude da degeneração do código genético. A presente invenção também refere-se a subseqüências de SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos de SEQ ID NO: 2 que têm atividade de endoglucanase, como o domínio de núcleo catalítico dos aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2 ou o fragmento de aminoácidos 368 a 569 de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos mutantes compreendendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a seqüência de nucleotídeos mutantes codifica um polipeptídeo que consiste de aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem o isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação dos mesmos. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir do DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando a reação de cadeia de polimerase (PCR) ou triagem de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com aspectos estruturais compartilhados. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico como reação de cadeia de ligase (LCR), amplificação à base de em transcrição ativada ligada (LAT) e em seqüência de nucleotídeos (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma cepa de Bacillus, ou um outro organismo relacionado e, assim, por exemplo, pode, ser uma variante alélica ou de espécies da região de codificação do polipeptídeo da seqüência de nucleotídeos.

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos tendo seqüências de nucleotídeos que têm um grau de identidade com a seqüência codificando o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 (isto é, nucleotídeos 100 a 2376) de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade, que codificam um polipeptídeo ativo.

A modificação de uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeo substancialmente similar ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir em algum modo engenheirado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica, estabilidade térmica, pH ótimo, ou outros. A seqüência da variante pode ser construída na base da seqüência de nucleotídeos apresentada como a região de codificação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, por exemplo, uma subseqüência da mesma, e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeos que não dão origem a uma outra seqüência de aminoácidos e seqüência do polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos, mas que correspondem ao emprego do códon do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou pela introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma seqüência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeos, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Será evidente aos versados na técnica que estas substituições podem ser feitas fora das regiões críticas à função da molécula e ainda resultar em polipeptídeo ativo. Resíduos de aminoácidos essenciais à atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção e, assim, preferivelmente não sujeitos a substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081- 1085). Na última técnica, mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de endoglucanase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos à atividade da molécula. Sítios de interação substrato-enzima também podem ser determinados por análise da estrutura tridimensional como determinado por técnicas como análise de ressonância nuclear, cristalografia ou rotulação de fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et ai., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBSLetters 309: 59-64).

A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo da presente invenção, que hibridizam em condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixas. Mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente médias-altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas, e mais preferivelmente condições de estringência muito altas com (i) nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ ID NO: 1, (ii) nucleotídeos 193 a 1041 de SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 1104 a 1707 de sis 1 ou (iv) um filamento complementar de (i) ou (iii); ou variantes alélicas e subseqüências dos mesmos (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui.

A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados obtidos por (a) hidribizando uma população de DNA em condições de estringência muito baixas, baixas, médias, médias-altas, altas, ou muito altas com (i) nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ LD NO: 1, ou (ii) um filamento complementar de (i); e (b) isolando o polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase.

Construções de ácido nucleico

A presente invenção refere-se também a construções de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção ligado operativamente a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a expressão da seqüência de codificação em uma células hospedeira apropriada em condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em vários modos para prover a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência de polinucleotídeos antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar seqüências de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinantes são bem conhecidas na técnica.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência de promotor apropriada, uma seqüência de nucleotídeos que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. A seqüência de promotor contém seqüências de controle transcricionais que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeos que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos como heterólogos na célula hospedeira.

Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do operon Iac de E. Coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene levansucrase de Bacillus subtílis (saeB), gene alfa-amilase de Bacillus lieheniformis (amyL), gene amilase de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaeiens (amyC), gene penicilinase de Bacillus lieheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene beta- lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proeeedings of the National Aeademy of Sciences USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21- 25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira de fungo filamentoso são promotores obtidos dos genes de Amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fostato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidade de Triehoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei endoglucanase, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase IIII de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes de alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isometase de Aspergillus oryzae), e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos.

Em uma célula de levedura, promotores utilizáveis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinase de Saceharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyees cerevisiae, triose fosfato isomerase de Saceharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUPl) e 3-fosfoglicerato quinase de Saceharomyces cerevisiae. Outros promotores utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência terminadora de transcrição apropriada, uma seqüência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora é ligada operativamente ao término 3' da seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Terminadores preferidos para células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidade de Aspergillus niger e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYCl)de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al, 1992, supra. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líder apropriada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução por uma célula hospedeira. A seqüência líder é ligada operativamente ao término 5' da seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Líderes preferidos para células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Líderes apropriados para células de levedura são obtidos dos genes para enolase (ENO-I) de Saccharomyces eerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyees eerevisiae, fator alfa de Saccharomyees eerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyees eerevisiae.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência ligada operativamente ao término 3' da seqüência de nucleotídeos e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Seqüências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidas dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum, e alfa- glucosidase de Aspergillus niger.

Seqüências de poliadenilação utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular CellularBiology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidos ligada ao término amino de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado na via secretória da célula. A extremidade 5' da seqüência de codificação da seqüência de nucleotídeos pode conter inerentemente uma região de codificação de peptídeo de sinal naturalmente ligada no quadro de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Além disso, a extremidade 5' da seqüência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinal que é externa à seqüência de codificação. A região de codificação de peptídeo de sinal externo pode ser requerida onde a seqüência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptídeo de sinal. Além disso, a região de codificação de peptídeo de sinal externo pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo de sinal natural a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região de codificação de peptídeo de sinal que dirige o polipeptídeo expressado na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Regiões de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus lieheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (riprT, nprS, nprM), e Bacillus subtilis prsA. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Regiões de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras fungicas filamentosas são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens e lipase de Humicola lanuginosa.

Em um aspecto preferido, a região de codificação de peptídeo de sinal são os nucleotídeos 1 a 99 de SEQ ID NO: 1 que codificam aminoácidos -33 a -1 de SEQ ID NO: 2.

Peptídeos de sinal utilizáveis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para fator-alfa de Saccharomyees eerevisiae e invertase de Saccharomyees eerevisiae. Outras regiões de codificação de peptídeo de sinal utilizáveis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidos posicionada no término amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo maduro por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A região de codificação do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, fator alfa de Saccharomyees eerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Quando ambas as regiões de peptídeo de sinal e de pró- peptídeo estão presentes no término amino de um polipeptídeo, a região de pró-peptídeo é posicionada próxima ao término amino de um polipeptídeo e a região de peptídeo de sinal é posicionada próxima ao término amino da região de pró-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências regulatórias que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo com relação à cultura da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são os que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores Iac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GALl podem ser usados. Em fungos filamentosos, e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae pode ser usado como seqüências regulatórias. Outros exemplos de seqüências regulatórias são as que permitem amplificação de genes. Em sistemas eucarióticos, estes incluem o gene diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo pode ser ligada operativamente com a seqüência regulatória. Vetores de Expressão

A presente invenção refere-se também a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcricionais e translacionais. Os vários ácidos nucleicos e seqüência de controle descritas acima podem ser unidos juntos para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo nestes sítios. Além disso, uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção pode ser expressada inserindo a seqüência de nucleotídeos ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência dm um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüência de codificação está localizada no vetor de modo que a seqüência de codificação está ligada operativamente com as seqüências de controle apropriadas para expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e pode realizar a expressão da seqüência de nucleotídeos. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, o vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente de replicação cromossômico, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um micro-cromossomo, ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o (s) cromossoma (s) em que ele foi integrado. Além disso, um vetor ou plasmídeo único ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que, juntos, contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção contêm preferivelmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem fácil seleção de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, o produto do qual provê resistência a biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia em auxotrofos, e outros.

Um gene condicionalmente essencial pode funcionar como um marcador selecionável não antibiótico. Exemplos não limitantes de marcadores selecionáveis não antibiótico condicionalmente essenciais, bacterianos, são os genes dal de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou outros Bacilli, que são somente essenciais quando a bactéria é cultivada na ausência de D-alanina. Também, os genes codificando enzimas envolvidas em turnover de UDP-galactose podem funcionar como marcadores condicionalmente essenciais em uma célula quando a célula é cultivada na presença de galactose ou cultivada em um meio que dá origem à presença de galactose. Exemplos não limitantes destes genes são os de fosforilase dependente de UTP codificando B. Subtilis ou B. Licheniformis (EC 2.7.7.10), uridiltransferase dependente de UDP-glicose (EC 2.7.7.12) ou UDP-galactose epimerase (EC 5.1.3.2). Também, um gene xilose isomerase como xylA, de Bacilli pode ser usado como marcadores selecionáveis em células cultivadas em meio mínimo de xilose como fonte de carbono única. Os genes necessários para utilizar gluconato, gntK, e gntP também podem ser usados como marcadores selecionáveis em células cultivadas em um meio mínimo com gluconato como fonte de carbono única. Outros exemplos de genes condicionalmente essenciais são conhecidos na técnica. Marcadores selecionáveis de antibióticos conferem resistência a antibiótico para antibióticos como ampicilina, canamicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, neomicina, higromicina ou metotrexato.

Marcadores apropriados para células hospedeiras de levedura são ADE2, fflS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas não estão limitados a amdS (acetamidase), argB (ornitina carbomoiltransferase), bar (fosfinotricin acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidino-5'-fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes dos mesmos. Preferidos para uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Strptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção contêm preferivelmente um elemento (s) que permite integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autonômica do vetor na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a seqüência de polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Além disso, o vetor pode conter outras seqüências de nucleotídeos para dirigir integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização (ões) exata no (s) cromossoma (s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização exata, os elementos integracionais devem, preferivelmente, conter um número suficiente de ácidos nucleicos como 100 a 10.000 pares de bases, preferivelmente 400 a 10.000 pares de bases, e mais preferivelmente 800 a 10.000 pares de bases, que têm um alto grau de identidade com a seqüência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que é homóloga à seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências de nucleotídeos de não codificação ou de codificação. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação possibilitando o vetor de replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicação autônoma mediando o replicador de plasmídeo que funciona em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador de plasmídeo" é definido aqui como uma seqüência de nucleotídeos que possibilita um plasmídeo ou vetor a replicar in vivo.

Exemplos de origens bacterianas de replicação são de origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACY177 e pACYC184 permitindo replicação em E. Coli, e pUBllO, pE194, pTA1060 e ρΑΜβΙ permitindo replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARSl e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Exemplos de origens de replicação utilizáveis em uma célula de fungo filamentoso são AMAI e ANSl (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Aeids Research 15: 9163- 9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser realizados de acordo com os métodos descritos em WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e, assim, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos dos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

A presente invenção refere-se também a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, que são vantajosamente usadas na produção recombinante de polipeptídeos. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico de auto-replicação, como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em uma grande extensão do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo, um microorganismo procariótico, ou não- unicelular, por exemplo, um eucariótico.

Microorganismos unicelulares utilizáveis são células bacterianas como bactérias gram positivas incluindo, mas não limitadas a célula de Bacillus,por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis·, ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, por exemplo, Streptomyces lividans e Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas como E. Coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ou Bacillus subtilis. Em um outro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 1 11-1 15), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771- 5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucariótico, como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungica.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula fungica. "Fungos", como usado aqui, incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al, em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8~ edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) bem como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospórico fungi (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula de levedura. "Levedura", como usado aqui, levedura ascosporogêneas, e leveduras pertencentes ao Fungi lmperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os fins desta invenção, levedura poderá ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S. M., e Davenport, R. R., eds, Soe. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Piehia, Saccharomyees, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyees earlsbergensis, Saccharomyees eerevisiae, Saccharomyees diastatieus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyees oviformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces laetis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytiea.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula de fungo filamentoso. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al, 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento hifal e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras como Saccharomyces eerevisiae é pela germinação de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penieillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Sehizophyllum, Talaromyees, Thermoaseus, Thíelavia, Tolypoeladium, Trametes, ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungos filamentosos é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungos filamentosos é uma célula da cepa de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sareochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungos filamentosos é uma célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penieillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação de protoplastos, e regeneração da parede celular de um modo conhecido per se. Procedimentos apropriados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Aeademy of Sciences USA 81:1470-1474. Métodos apropriados para transformar espécies Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, Μ. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Métodos de Produção

A presente invenção refere-se também a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula, que em sua forma do tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, em condições conduzindo a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Preferivelmente, a célula é do gênero Bacillus.

A presente invenção refere-se também a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira em condições conduzindo a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção refere-se também a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira em condições conduzindo a produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência de nucleotídeos mutante tendo pelo menos uma mutação na região de codificação do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a seqüência de nucleotídeos mutante codifica um polipeptídeo que compreende aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2, ou aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 368 a 569 de SEQID NO: 2, e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente apropriado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em frasco de agitação, e fermentação em pequena escala e grande escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada, batelada alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizadas em um meio apropriado e em condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. A cultura realiza-se em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios apropriados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos de American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não é secretado, ele pode ser recuperado de lisados de célula.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto enzimático, ou desaparecimento de um substrato enzimático. Por exemplo, um ensaio enzimático pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como descrito aqui.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeo da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, mudança iônica, afinidade, hidrofóbica, cromato-focalização e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

A presente invenção refere-se também a enzimas isoladas tendo atividade de endo-beta-l,4-glucanase e que são produzidas por um dos métodos mencionados acima, preferivelmente por técnicas de produção recombinantes. As enzimas isoladas são preferivelmente isentos de impurezas homólogas. Estas impurezas podem surgir de genes de endo-beta-1,4- glucanase endógenos, assim se a produção é realizada em uma célula hospedeira que não expressa polipeptídeos endógenos com atividade de endo- beta-l,4-glucanase, a enzima será livre de impurezas homólogas. Composições

A presente invenção refere-se também a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas neste polipeptídeo. O termo "enriquecidas" indica que a atividade de endoglucanase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de 1.1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o componente enzimático principal, por exemplo, uma composição de mono-componente. Alternativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta- glucosidase, haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenooxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. A (s) enzima (s) adicionais podem ser produzidas, por exemplo, por um microorganismo pertencente ao gênero Aspergillus, por exemplo, Arpergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroun, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum\ Humicola, preferivelmente Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma vir ide.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Exemplos são dados abaixo de usos preferidos da composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições nas quais a composição é usada pode ser determinada na base de métodos conhecidos na técnica.

Usos

Aplicações de artigos têxteis

Em uma outra forma de realização, a presente invenção refere- se ao uso da endoglucanase da invenção em processos de acabamento de artigos têxteis, como biopolimento. Biopolimento é um tratamento específico da superfície de fios que melhora a qualidade do tecido com relação ao manuseio e aparência sem perda da umectabilidade do tecido. Os efeitos mais importantes de biopolimento podem ser caracterizados por menor formação de felpas e bolinhas, brilho/lustre diminuídos, manipulação melhorada do tecido, amaciamento durável aumentado e absorbância de água alterada. O biopolimento geralmente realiza-se no processamento a úmido durante a fabricação de panos de malha e tecidos. O processamento a úmido compreende etapas como, por exemplo, remoção da cola, lavagem em água corrente, alvejamento, lavagem, tingimento/impressão e acabamento. Durante cada uma destas etapas, o tecido é mais ou menos submetido a ação mecânica.

Em geral, após os artigos têxteis serem tricotados ou tecidos, o tecido prossegue em um estágio opcional de remoção da cola, seguido por um estágio de lavagem em água corrente, etc. A remoção da cola é o ato de remover a cola dos artigos têxteis. Antes da tecelagem nos teares mecânicos, os fios de urdume são freqüentemente revestidos com cola consistindo de amido ou derivados de amido a fim de aumentar sua resistência à tração. Após a tecelagem, o revestimento de cola deve ser removido antes de outro processamento do tecido a fim de assegurar um resultado homogêneo e à prova de lavagem. No processo de lavagem em água corrente, as impurezas são removidas do tecido. A endoglucanase da invenção pode vantajosamente ser usada na lavagem com água corrente de artigos têxteis celulósicos e de algodão, bem como fibras da entrecasca e pode melhorar a eficiência da remoção de impurezas. Um dos métodos mais comumente usados para conferir uma prensa durável aos artigos têxteis celulósicos é através do acabamento com produto químico de reticulação de celulose. A reticulação imobiliza celulose em um nível molecular e reduz substancialmente o encolhimento e pregueamento de peças de vestuário à base de celulósicos. O tratamento de artigos têxteis celulósicos tratados com prensa durável com a endoglucanase da invenção pode resultar em um relaxamento seletivo de regiões tensionadas para minimizar a abrasão nas bordas. Além disso, a endoglucanase da invenção pode ser usada para remover eficientemente o excesso de pasta de impressão à base de carboximetil celulose de artigo têxtil e equipamento usado no processo de impressão.

Sabe-se que a fim de obter os efeitos de biopolimento, uma combinação de ação celulolítica e mecânica é requerida. Sabe-se também que "super-amaciamento" é obtenível quando o tratamento com uma celulase é combinado com um tratamento convencional com agentes de amaciamento. E contemplado que o uso da endoglucanase da invenção e de combinações deste enzima com outras enzimas para biopolimento de celulósicos (celulósicos, tecidos, peças de vestuário, fios e fibras naturais e fabricados) é vantajoso, por exemplo, um polimento mais completo pode ser obtido. Acredita-se que o biopolimento pode ser obtido aplicando-se o método descrito, por exemplo, em WO 93/20278. É ainda contemplado que a endoglucanase da invenção pode ser aplicada a processos a úmido simultâneos ou seqüenciais de artigos têxteis, incluindo diferentes combinações de remoção de cola, lavagem em água corrente, alvejamento, biopolimento, tingimento e acabamento).

Stone-washing

Sabe-se que uma aparência iiStone-Washed" (abrasão localizada da cor) em tecido tingido, especialmente em tecido de denim ou "jeans", pode ser provido tanto lavando-se o denim ou "jeans" feito a partir deste tecido na presença de pedra-pome de modo a proporcionar o clareamento localizado desejado da cor do tecido, ou tratando-se o tecido enzimaticamente, em particular com enzimas celulolíticas. O tratamento com uma endoglucanase da presente invenção, sozinha ou em combinação com outras enzimas, pode ser realizado tanto sozinho como descrito em US 4.832.864, junto com uma quantidade menor de pedra-pome do que a requerida no processo tradicional, ou junto com perlita como descrito em WO 95/09225. O tratamento de tecido de denim com a endoglucanase da invenção pode reduzir a retro-mancha, comparado com os métodos convencionais. Degradação de biomassa

A enzima ou a composição de enzimas de acordo com a invenção pode ser aplicada com vantagem, por exemplo como a seguir:

- Para remoção das cascas, isto é, pré-tratamento com enzimas hidrolíticas que podem degradar parcialmente a camada de câmbio rica em pectina antes da remoção de cascas em tambores mecânicos, resultando em economias de energia vantajosas.

- Para desfibração ( refino ou batida) isto é, tratamento do material contendo fibras celulósicas com enzimas hidrolíticas antes do refino ou batida, que resulta na redução de consumo de energia devido ao efeito hidrolisante das enzimas sobre as superfícies das fibras.

- Para modificação da fibra, isto é, melhora das propriedades das fibras onde uma hidrólise parcial através da parede da fibra é necessária que requer enzimas de penetração profunda (por exemplo, a fim de fabricar fibras grossas mais flexíveis).

- Para drenagem: A drenabilidade de pastas para fabricação de papel pode ser melhorada através do tratamento da pasta com enzimas hidrolisantes. O uso da enzima ou composição de enzima da invenção pode ser mais efetivo, por exemplo, resultar em um grau maior de feixes soltos de microfibrilas fortemente hidratadas na fração de finos que limita a taxa de drenagem bloqueando os espaços ocos entre as fibras e na malha de arame da máquina de papel.

O tratamento da pasta lignocelulósica pode, por exemplo, ser realizado como descrito em WO 93/08275, WO 91/02839 e WO 92/03608.

Lavagem de roupa

A enzima ou composição de enzima da invenção pode ser utilizável em uma composição detergente para uso doméstico ou na lavagem industrial de tecidos e artigos de vestuário, e em um processo para tratamento de lavagem em máquina de tecidos, compreendendo tratar os tecidos durante um ou mais ciclos de lavagem de um processo de lavagem em máquina com uma solução de lavagem contendo a enzima ou preparação de enzima da invenção.

Tipicamente, a composição detergente usada no processo de lavagem compreende ingredientes convencionais tais como, tensoativos (aniônicos, não iônicos, zwitteriônicos, anfotéricos), coadjuvantes, alvejantes (perboratos, percarbonatos ou peróxido de hidrogênio) e outros ingredientes, por exemplo, como os descritos em WO 97/01629 que são aqui incorporados como referência em sua totalidade.

Aplicações detergentes

A enzima da invenção pode ser adicionada e assim se torna um componente de uma composição detergente.

A composição detergente da invenção pode por exemplo ser formulada como uma composição detergente para lavagem de roupa em máquina ou manual, incluindo uma composição com aditivo para lavagem de roupa apropriado para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecido adicionada no enxágüe ou ser formulada como uma composição detergente para uso geral doméstico nas operações de limpeza de superfícies duras, ou ser formulada para operações de lavagem de louça em máquina ou manual, especialmente para lavagem automática de louça (ADW). A endo-beta-l,4-glucanase da invenção provê vantagens tais como, melhorada remoção de manchas e redeposição de sujeira diminuída. Certas manchas, por exemplo, algumas manchas de alimentos, contém beta- glucanos que tornam a remoção completa da mancha difícil de alcançar. Além disso, as fibras celulósicas dos tecidos podem possuir, particularmente nas regiões "não cristalinas" e da superfície, polímeros de beta-glucanos que são degradados por esta enzima. A hidrólise de tais beta-glucanos, ou na mancha ou no tecido, durante o processo de lavagem diminui a ligação das sujeiras sobre os tecidos.

Processos domésticos para lavagem de roupas são realizados sob condições variadas. Comumente, o tempo de lavagem é de 5 a 60 minutos e a temperatura de lavagem é na faixa de 15-60° C, mais comumente de 20- 40° C. A solução de lavagem é normalmente neutra ou alcalina, mais comumente com um pH de 7-10,5. Alvejantes são comumente usados, particularmente para lavagem de roupa de tecidos brancos. Estes alvejantes são comumente os alvej antes com peróxido, tais como perborato de sódio, percarbonato de sódio ou peróxido de hidrogênio.

Em um aspecto específico, a invenção provê um aditivo detergente compreendendo a enzima da invenção. O aditivo detergente assim como a composição detergente pode compreender uma ou mais dentre outras enzimas, tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma amilase, uma carboidrase, uma celulases, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lacase, e/ou uma peroxidase.

Em geral, as propriedades da enzima (s) escolhida(s) deveriam ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a enzima (s) deveria estar presente em quantidades eficazes.

Proteases: proteases apropriadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Origem microbiana é preferida. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas estão incluídos. A protease pode ser uma protease DE serina ou uma protease de metal, preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma protease com tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Baccilus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descritas em WO 89/06279). Exemplos de proteases com tripsina são tripsinas (por exemplo de origem suína e bovina) e a Fusarium protease descrita em WO 89/06270 e WO 94/25583.

Exemplos de proteases utilizáveis são as variantes descritas em WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 e 274.

As enzimas de protease preferidas comercialmente disponíveis incluem Relase®, Alcalase®, Savinase®, Primase®, Everlase®, Esperase®, Ovozyme®, Coronase®, Polarzyme® e Kannase® (Novozymes A/S), Maxatase , Maxacal , Maxapem , Properase , Puratect , Purarect OxP , FN2™, FN3™, FN4™ e Purafect Prime™ (Genencor International, Inc.), BLAP X E BLAP S (Henkel).

Lipases: Lipases apropriadas incluem as de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas estão incluídos. Exemplos de lipases utilizáveis incluem lipases de Humicola (sinônimo de Thermomyces), por exemplo de H. Ianuginosa (T. lalnuginosa) como descrito em EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolens como descrito em WO 96/13580, uma Pseudomonas lipase, por exemplo de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), Ρ. wisconsinensis (WO 96/12012), uma Bacillus lipase, por exemplo de B. subtilis (Dartois et. al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

Outros exemplos são variantes de lipase tais como as descritas em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105,WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Enzimas de lipase preferidas comercialmente disponíveis incluem Lipolase™ e Lipolase Ultra™ (Novozymes A/S).

Amilases: Amilases apropriadas ( α e/ou β) incluem as de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas estão incluídos. Amilases incluem por exemplo, α-amilases obtidas a partir de Bacillus, por exemplo uma cepa especial de B. Iicheniformis, descrita em maiores detalhes em GB 1,296.839.

Exemplos de amilases utilizáveis são as variantes descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23837, e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, e 444.

Amilases usadas comercialmente são Duramyl®, Termamyl®, Stainzyme®, Fungamyl®, e ΒΑΝ® (Novozymes A/S), Rapidase™, Purastar™, e Purastar OxAm™ (da Genencor International Inc.).

Celulases: Outras celulases apropriadas incluem as de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas estão incluídos. Celulases apropriadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo as celulases fungicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum descritas em US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 e WO 89/09259.

Celulases especialmente apropriadas são as celulases alcalinas ou neutras que tem benefícios de cuidado da cor. Exemplos de tais celulases são as celulases descritas em EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulases tais como aquelas descritas em WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e WO 99/01544.

Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™, Renozyme® e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencir International Inc.), e KAC-500(B)™(Kao Corporation).

Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases apropriadas incluem as de origem vegetal, bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas estão incluídos. Exemplos de peroxidases utilizáveis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo de C. cinereus, e variantes das mesmas como descrito em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257. Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme (Novozymes A/S).

Hemicelulases: hemicelulases apropriadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas estão incluídos. Hemicelulases apropriadas incluem mananase, lichenase, xilanase, arabinase, galactanase, acetil xilano esterease, glucorunidase, ácido ferúlico esterease, ácido cumárico esterease e arabinofuranosidase como descrito em WO 95/35362. Mananases apropriadas são descritas em WO 99/64619.

A(s) enzima (s) detergente (s) pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente através da adição separada de aditivos contendo uma ou mais enzimas, ou através da adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um detergente aditivo da invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado por exemplo como um granulado, um líquido, uma pasta fluida, etc. As formulações de aditivos detergentes preferidos são granuladas, em particular granulados não pulverulentos, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas fluidas.

Granulados não pulverulentos podem ser produzidos, por exemplo, como descrito em US 4.106.991 e 4.661.452 e podem opcionalmente ser revestidos através dos métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos com óxido de polietileno (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos.

Exemplos de materiais de revestimento formadores de película apropriados para aplicação por técnicas de leito fluido são dados em GB 1483591. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas através da adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito em EP 238.216.

A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70% de água e de 0-30% de solvente orgânico, ou não aquoso.

A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos incluindo semi-polar e/ou aniônico e/ou catiônico e/ou zwitteriônico. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de 0,1% a 60% em peso. Quando incluído na composição, o detergente irá freqüentemente conter cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico tal como alquilbenzenossulfonato, alfa-olefinassulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool, alcanossulfonato secundário, éster de metila de ácido graxo alfa-sulfo, ácido de alquil- ou alquenilsuccínico ou sabão.

Quando incluído na composição, o detergente irá freqüentemente conter de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico tal como etoxilado de álcool, etoxilado de nonilfenol, alquilpoliglicosídio, óxido de alquildimetilamina, ácido graxo etoxilado de monoetanolamida, ácido graxo de monoetanolamida, ácido graxo de poli- hidróxi alquil amida, ou N-acil N-alquil derivados de glucosamina ("glucamidas").

O detergente pode conter de 0-65% coadjuvante detergente ou agente complexante tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminapentaacético, ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst).

O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetil celulose, poli(vinilpirrolidona), poli (etileno glicol), óxido de poli(vinilpiridina -N), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros maleico/ ácido acrílico e copolímeros de metacrilato / ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema alvejante que pode compreender uma fonte de H2O2 tal como perborato ou percarbonato que pode ser combinado com um ativador alvejante formando perácido tais como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato. Alternativamente, o sistema alvejante pode compreender ácidos peróxi de por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. A(s) enzima (s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada (s) usando agentes estabilizadores convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido de fenila borônica tal como ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito em por exemplo WO 92/19709 e WO 92/19708.

O detergente pode conter também outros ingredientes detergentes convencionais tal como por exemplo, condicionadores de tecidos incluindo argilas, reforçadores de espuma, supressores de espuma, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores ópticos, hidrótropos, ou perfumes.

Na composição detergente qualquer enzima, em particular a invenção, pode ser adicionada em uma quantidade correspondente a 0,01-100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, preferivelmente de 0,05-5 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, em particular de 0,01-1 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem.

A enzima da invenção pode ser incorporada adicionalmente nas composições detergentes descritas em WO 97/07202, incorporado aqui como referência. Peptídeo de sinal e Pró-peptídeo

A presente invenção também refere -se a construções de ácido nucléico compreendendo um gene codificando uma proteína ligada operativamente a uma seqüência codificando um peptídeo de sinal, em que o gene é estranho para a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de sinal.

A presente invenção também refere-se a vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo tais construções de ácido nucléico.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir uma proteína compreendendo (a) cultivar esta célula hospedeira recombinante sob condições apropriadas para produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

A primeira e segunda seqüências de nucleotídeo podem ser ligadas operativamente a genes estranhos individualmente com outras seqüências de controle ou em combinação com outras seqüências de controle. Estas outras seqüências de controle são descritas supra. Como descrito anteriormente, onde ambos, as regiões de peptídeos de sinal e de pró- peptídeos estão presentes no término amino da proteína, a região de pró- peptídeo está posicionada depois do término amino da proteína e a região de peptídeo de sinal está posicionada depois do término amino da região de pró- peptídeo.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo "proteína" não significa aqui um comprimento específico do produto codificado e, assim, engloba peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. O termo "proteína" também engloba dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas incluem também polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação de seqüências de polipeptídeos parciais ou completas obtidas a partir de pelo menos duas proteínas diferentes onde uma ou mais podem ser heterólogas ou naturais para a célula hospedeira. Proteínas incluem ainda variações engenheiradas e alélicas de ocorrência natural das proteínas e proteínas híbridas mencionadas acima.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante do mesmo, enzima, receptor ou porção do mesmo, anticorpo ou porção do mesmo, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidoreductase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Em um aspecto ainda mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterease, alfa- galoctosidase, beta-galoctosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta- glucosidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xinalase.

O gene pode ser obtido a partir de qualquer fonte procariótica, eucariótica, ou outra.

A presente invenção é descrita ainda através dos exemplos seguintes que não devem ser construídos como limitação do escopo da invenção.

EXEMPLOS

Os produtos químicos usados como tampões e substratos eram produtos comerciais de, pelo menos um tipo reagente.

Análise da Atividade da Endoglucanase

Materiais:

Berol 537, tensoativo não iônico fornecido pela Akzo Nobel, ou similar. Tabletes de Cellazyme C, fornecidos pela Megazyme International, Irlanda. Filtros de micro-fibra de vidro, GF/C, com 9 cm de diâmetro, fornecido pela Whatman.

Solução do tampão, pH 9,5:

Dissolver 21,0 g de NaHC03 e 14,6 g de Nacl em cerca de 900 ml de água deionizada. Adicionar 10 ml de Berol 537 (tensoativo não iônico fornecido pela Akzo Nobel). Ajustar o pH para 9,5 através da adição de 4NNa0H. Depois ajustar o volume final para 1000 ml.

Método:

Em tubos de teste, misturar 1 ml de tampão com pH 9,5 e 5 ml de água deionizada. Adicionar 100 microlitros da amostra de enzima ( ou de diluições da amostra de enzima com peso conhecido: fator de diluição de peso). Adicionar 1 tablete de Cellazyme C dentro de cada tubo, tampar os tubos e misturar em um misturador de vórtice durante 10 segundos. Colocar os tubos em um banho de água com termostato, temperatura a 40° C. Após 15, 30 e 45 minutos, misturar os conteúdos dos tubos invertendo os tubos, e recolocar no banho de água. Após 60 minutos, misturar os conteúdos dos tubos invertendo-os e então filtrar em um filtro GF/C. Coletar o filtrado em tubos limpos.

Medir a absorvência (A"enz) a 590nm, com um espectrômetro. Um valor branco, Aágua, é determinado adicionando 100 μl de água em vez de 100 microlitros da diluição da enzima.

Calcular A"delta = A"enz - A"agua·

A"delta deve ser <0,5. Se resultados maiores são obtidos, repetir com um fator de diluição de enzima diferente.

Determinar DF0,1, onde DF0,1 é o fator de diluição necessário paradar Adeita = 0,1.

Definição de unidade:

1 unidade de atividade de Endo-Beta Glucanase (IEBG) é a quantidade de enzima que apresenta AdeIta = 0,10, sob as condições de teste especificadas acima. Assim, por exemplo, se a amostra de enzima apresentada, depois da diluição com um fator de diluição de 100, apresentar Adeita= 0,10, então a amostra de enzima tem uma atividade de 100 EBG/g.

Ótimos de temperatura e pH da endoglucanase são determinados realizando o teste de atividade em uma faixa de diferentes temperaturas quando o pH é fixo, e vice-versa, uma faixa de diferentes pHs quando a temperatura é fixo. Exemplo 1, Triagem para uma nova endoglucanase

Diversas cepas de Bacillus foram tríadas para produção de endoglucanase alcalina através do cultivo da bactéria em Agar TY adicionado 0,1% de AZCL-betaglucano (cevada, Megazyme). Cepa ACE160 produziu halos azuis neste substrato, a bactéria foi identificada através da determinação de uma parte do rDNA 16S, e inserção da seqüência na árvore filogenética mostrou que ACE160 representa uma nova espécie com o grupo Bacillus.

Exemplo 2, Produção de subtilases de comprimento completo Construção da biblioteca genômica

DNA cromossômico de ACE160 foi preparado através do uso de técnicas de biologia molecular padrão (Ausubel et ai. 1995 "Current protocols in molecular biology" Publ: John Wiley e filhos). O DNA preparado foi parcialmente clivado com Sau3A e separado em um gel de agarose. Fragmentos de 3 a 8 kilobases foram eluídos e precipitados e recolocados em suspensão em um tampão apropriado.

Uma biblioteca genômica foi feita através do uso de um kit com vetor pré-digerido Stratagene ZAP Express™ e um kit de clonagem Gigapack® pré-digerido Stratagene ZAP Express™ (Bam HI pré-digerido) (Stratagene Inc., USA) de acordo com as instruções/recomendações do fornecedor. A biblioteca IambdaZAP resultante compreendia 38000 ufp (unidades de formação de placa) das quais 10000 eram coletadas para excisão da massa. As 70000 colônias de E. coli resultantes foram reunidas. A reunião do clone de E. coli foi diluída misturando 100 μl com 100 ml no meio LB e colocados em placas de 100 μl por placa de agar no LB suplementado com 0,1% de (cevada, Megazyme) e 50 μg/ml de canamicina, e incubados por 2-3 dias. Dentre as 1600-1800 colônias por placa em 50 placas de agar, três colônias com halos azuis foram obtidas. A partir destas três colônias, DNA plasmídeo foi recuperado e seqüenciado com os iniciadores dos vetores.

Através da técnica progressiva de iniciador subseqüente, a seqüência completa de nucleotídeos da matriz de leitura de abertura da endo- 1,4-betaglucanase (ORP) foi caracterizada. As três colônias continham o mesmo ORF mostrado como SEQ ID NO: 1. Produção de endoglucanase de comprimento completo

Para produzir a endo-l,4-betaglucanase, o gene foi amplificado a partir do DNA cromossômico da cepa do tipo selvagem de Bacillus sp. ACE160. As enzimas foram expressas usando o peptídeo de sinal da trans membrana nativa. Iniciadores

ACE160-Bglu-Mlu 1 -4: ATTAACGCGTTCCTCGTGCTGAGCACAGAGG (SEQID NO:3)

ACE160-Bglu-Sac 1: TTATGGAGCTCAAATCAACTCTAGGAGGCTG (SEQ ID NO: 4)

O gene de endo-l,4-betaglucanase foi amplificado como um produto PCR de cerca de 2500 nt. Os iniciadores ACE160-Bglu-sacl e ACEl 60-Bglu-Mlu 1-4 foram usados. O DNA padrão foi o DNA cromossômico de Bacillus sp. ACE160. O produto PCR foi recuperado usando colunas de giro Qiaquick™ como recomendado (Qiagen, Alemanha). A qualidade do padrão isolado foi avaliada através de eletroforese do gel de agarose. PCR foi operado no seguinte protocolo: 94 °C, 40 ciclos de 2 minutos de [94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 1 minuto] completados com 68 °C durante 10 minutos. O produto PCR foi analisado em um gel com 1% de agarose em um tampão TAE manchado com brometo de etídio para confirmar uma banda única de tamanho correto. O produto PCR foi digerido com enzimas de restrição Sacl e Mlul e purificado com PCR GFX e Gel Band Purification Kit (Amertham Bioscences).

O fragmento de PCR digerido e purificado foi ligado ao plasmídeo digerido Sac 1 e Mlu 1 pDG268neoMCS- PramyQ/Prcrylll/crylllAstab/Sav (Patente US: 5.955.310).

A mistura da ligação foi usada para transformação em E. coli TOPlOF' (Invitrogen BV3 Holanda) e várias colônias foram selecionadas para miniprep (QIAprep® spin, QIAGEN GmbH, Alemanha). Os plasmídeos purificados foram verificados para inserção antes da transformação para cepa de Bacillus subtilis THl ( THl é uma cepa de Bacillus subtilis (amy-, spo-, apr-„pr-), que tem sido modificado através da inserção de uma construção, da cepa DN3 (Noone et al.2000, J Bacteriol 182 (6) 1592-1599) através da transformação e seleção para Eritromicina. O genótipo mudado é: ykdA::pDN3 (PykdA-lacZ Pspac-ykdA) Ermr. THl contém as seguintes características: O promotor ykdA completo é fusionado ao gene repórter LacZ. Além disso, o gene ykdA é colocado sob controle do promotor Pspac indutível por IPTG, de modo que o gene ykdA não tem mais sua regulação natural. A cepa pode ser usada como hospedeira para expressão de clones e bibliotecas e transformantes expressando e segregando proteína podem ser selecionados em placas contendo X-gal e IPTG. THl pode ser mantido em Agar LB + 6 μg/ml de eritromicina.

Células transformadas foram colocadas em placas Agar LB- PG, suplementadas com 1% de leite desnatado, 100 μg/L X-gal, 1 mM IPTG, 6 μg/ml de cloranfenicol e 12 μg/ml de eritromicina. As células em placas foram incubadas durante a noite a 37 0C e colônias com cor azul e sem zona de depuração foram selecionadas, a inserção correta foi confirmada por PCR e seqüenciamento de nucleotídeos.

Exemplo 3. Purificação de endoglucanase a partir do Bacillus sp. ACE160.

A endoglucanase foi purificada com 670 ml de caldo de fermentação a partir do qual as células foram removidas através de uma combinação de centrifugação e filtração do caldo.O volume foi ajustado para 21 com água deionizada e o pH titulado para 8,5. Este material foi carregado em uma coluna com sefarose-Q equilibrada com um tampão 25 mM Tris com pH a 8,5. A enzima foi eluída através da aplicação de um gradiente Nacl no mesmo tampão e as frações contendo a endoglucanase foram reunidas. Uma porção desta reunião foi fracionada em uma coluna com gel de filtração S-200 com 100 mM de acetato de sódio com pH 6 como a fase líquida. As frações contendo a endoglucanase foram combinadas e concentradas cerca de três vezes em uma unidade de ultra filtração Amicon. O concentrado foi analisado por SDS PAGE5 onde uma banda de proteína de aproximadamente 80 kD foi obtida.

Exemplo 4. Desempenho de lavagem de endoglucanase a partir do Bacillus sp. ACE160

Este procedimento é usado para determinar o "benefício de detergência da enzima".

Os testes de lavagem foram feitos lavando as amostras de tecido de algodão sujo e amostras de tecido de algodão limpas, ambas juntas, em um aparelho de teste de lavagem de escala pequena. Depois da lavagem, a sujeira no tecido de algodão é avaliada para refletância de luz. Tanto as amostras de tecido de algodão originalmente sujas quanto as amostras de tecido de algodão originalmente limpas foram avaliadas.

Tecido de algodão: tecido branco #2003 100% algodão, fornecido pela Tanigashira, 4-11-15 Komatsu Yodogawa-ku, Osaka, 533- 0004, Japão. O tecido de algodão novo é pré-lavado três vezes antes de ser usado no teste de lavagem.A pré-lavagem é feita usando uma máquina de lavagem automática com carregador pela frente de uso doméstico européia, e usando um processo de lavagem padrão a 40°C. LAS (Surfac® SDBS80 alquilbenzeno sulfonato de sódio, 80%) é adicionado à água de lavagem com uma concentração de 0,5 g por litro e o pH da solução de lavagem é ajustado a 10 através da adição de carbonato de sódio. Depois da pré-lavagem o tecido é seco em uma secadora de roupas elétrica. Amostras do tecido de algodão pré-lavado, com tamanho de 5x5cm, peso de aproximadamente 0,3 g cada, são cortadas e estas amostras são usadas para os testes de lavagem.

Amostras de algodão sujas: Estas são preparadas a partir das amostras de 5x5cm descritas acima. Amostras sujas são preparadas usando beta-glucano (viscosidade média, de cevada, fornecida pela Megazymes International, Irlanda) e negro de fumo ("carbono para testes de detergência", fornecido pela Sentaku Kagaku Kyokai, Tokyo, Japão). Dissolver cerca de 0,67 g de beta-glucano em 100 ml de água da torneira agitando e aquecendo a >50° C. Adicionar 0,33 g de negro de fumo. Misturar com um misturador Ultra Turrax T25, com uma velocidade de 4000 rpm por 2 minutos. Aplicar 250 microlitros de beta-glucano/carbono no centro de cada amostra. Deixar secar durante a noite em temperatura ambiente.

Testes de lavagem: Três amostras sujas e três amostras limpas são lavadas em uma máquina Mini-Terg-O-Tometer. A Mini-Terg-O-Tometer é uma versão em escala menor da máquina de lavagem automática de teste Terg-O-Tometer descrita por Jay C. Harris, "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd. (1954) pp. 60-61. As condições seguintes são usadas:

Tamanho do béquer 250 ml Volume da solução de lavagem 100 ml Temperatura de lavagem 40° C Tempo de lavagem 30 minutos Agitação 150 rpm

As soluções detergentes são pré-aquecidas a 40° C antes de iniciar o teste. O tecido e as enzimas são adicionados no início dos 30 minutos do período de lavagem, depois da lavagem, as amostras de tecido são enxaguadas por 5 minutos numa torneira com água corrente, depois espalhadas numa superfície plana e deixadas para secar em temperatura ambiente durante a noite.

Avaliações instrumentais: A avaliação de refletância de luz das amostras de tecido é feita usando um espectrofotômetro de refletância Macbeth Color Eye 7000. As medições são feitas a 500nm. O filtro UV não esta incluído. As medições são feitas na frente e atrás de cada amostra. As amostras sujas são medidas no centro da área suja. Os resultados médios de refletância (R, 500nm) para as amostras sujas e para as amostras limpas são então calculados a partir das seis medições em cada tipo.

Soluções detergentes: Soluções detergentes são preparadas como a seguir: Para preparar um litro de solução, dissolver em água deionizada 0,5 g de carbonato de sódio e 1,0 g de hidrogeno carbonato de sódio e adicionar 2 ml de uma solução contendo 117,8 g/l de CaCl2.2H20 e 54,3 g/l de mgCl2.6H20. Esta adição de cálcio/magnésio provê uma dureza na água de 12° dH. Adicionar 0,2 g de tensoativo não iônico (Berol® 537, Akzo Nobel) e 0,5 g de LAS (Surfac® SDBS80 alquilbenzeno sulfonato de sódio, 80%) e ajustar o volume final para 1 litro. Ajustar o pH a 9,5±0,1 (através da adição de carbonato de sódio ou de solução de ácido cítrico, 10%).

Adição de enzima: As enzimas a serem testadas são pré- dissolvidas com concentrações conhecidas em água, e a quantidade de enzima exigida é adicionada à solução detergente no início do processo de lavagem.

Cálculo de benefício de detergência da enzima: O benefício de detergência da enzima é uma medida de quanto mais limpa as amostras, tanto as originalmente sujas como as originalmente limpas, se tornam um resultado das enzimas incluídas no teste de lavagem. O benefício de detergência da enzima é calculado como a seguir:

Depois do teste de lavagem, o R médio, valor 500nm para os panos sujos é R, sujo.

Depois do teste de lavagem, o R médio, valor 500nm para os panos limpos é R, limpo.

O benefício de detergência da enzima de um teste de lavagem com enzimas é a soma de R, sujo + 5, limpo com enzimas menos a soma de R, sujo + R, limpo sem enzima adicionada.

O valor de benefício de detergência da enzima determinado desta forma é uma medida combinada de tanto remoção da sujeira do tecido como a redeposição de sujeira sobre o tecido. Assim, o valor de benefício de detergência da enzima pode ter valores que são positivos e negativos. O valor de benefício de detergência da enzima pode ser usado para comparar o desempenho de diferentes enzimas. O valor de benefício de detergência positivo mais alto é o resultado preferido. Para comparação, o desempenho de lavagem da endoglucanase do Bacillus sp. ACE160 foi comparado com o desempenho de lavagem do Bacillus da endoglucanase da técnica anterior MBl 181-7 descrito em WO 2002/099091.

Resultados:

Atividade da enzima na solução de lavagem Benefício de detergência da enzima

ACE160, 6 EBG por litro 28,1

ACE160, 12 EBG por litro 29,9

MBl 181-7, 6 EBG por litro 15,2

MB1181 -7, 12 EBG por litro 22,2

Os resultados mostraram que a endoglucanase do Bacillus sp. ACE160 apresenta um benefício de detergência de enzima superior ao da endoglucanase conhecida.

A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui descritos, porque estes aspectos são destinados como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são destinados para estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes para os versados na técnica a partir da descrição acima. Tais modificações são destinadas também a estar dentro do escopo da invenção e reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente descrição incluindo definições será o controle. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Novozymes A/S

<120> Endoglucanase

<130> 10780.204-W0

<160> 4

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 2379

<212> DNA

<213> Bacillus sp. ACE160

<220>

<221> CDS <222> (1)..(2376)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (ΐΓ. (99) <220>

<221> mat_peptide

<222> (100)..(2376)

<400> 1

gtg aga caa ccc ata ggt aaa aag ata att gct gca gga atg ate ttt 48

vai Arg Gln Pro Ile Gly Lys Lys Ile Ile Ala Ala Gly Met lie Phe

-30 -25 -20

acc etc tta ttt tcg tta ate gtc act gtg ttc cca act gct ggt caa 96

Thr Leu Leu Phe ser Leu Ile Val Thr Val Phe Pro Thr Ala Gly Gln -15 -10 -5

gca cta gaa tca gac tat age cat tta tta gga aat gat gca gtg aag 144

Ala Leu Glu Ser Asp Tyr Ser His Leu Leu Gly Asn Asp Ala Val Lys -11 5 10 15

cgc ccc tcg gaa ggc gga gct tta agt tta tgt aat gaa act act cca 192 Arg Pro. Ser Glu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Cys Asn Glu Thr Thr Pro 20 25 30

gta aaa cca aac cat gcg ggg gac cgt ggg aaa cca age cac gca ggt 240

vai Lys Pro Asn His Ala Gly Asp Arg Gly Lys Pro Ser His Ala Gly 35 40 45

aaa gga aag cct ccc cat gct ggt aag cct gaa cat gcc gga cca aag 288 Lys Gly Lys Pro Pro His Ala Gly Lys Pro Glu His Ala Gly Pro Lys 50 55 60

cgt aaa aca ctg tgt gat gca acc ggc age caa att cag etc cgg ggg 336

Arg Lys Thr Leu Cys Asp Ala Thr Gly ser Gln Ile Gln Leu Arg Gly 65 70 75

atg age act cac gga ttg caa tgg ttt ggc gag att ata aat gat aat 384 Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Glu lie Ile Asn Asp Asn 80 85 90 95

gct ttt gct gct ctt tcc aac gac tgg gag gca aat atg ate cgc ctt 432

Ala Phe Ala Ala Leu Ser Asn Asp Trp Glu Ala Asn Met Ile Arg Leu 100 105 110

gcc atg tat att ggc gaa aat gga tat gcg act aac cct gaa gta aaa 480 Ala Met Tyr Ile Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Val Lys 115 120 125

gaa ctt gtt tac gaa gga att gag ctt gca ttc aaa cat gat atg tat 528 Glu Leu Val Tyr Glu Gly lie Glu Leu Ala Phe Lys His Asp Met Tyr

130 IB 5 140

gta att gtt gac tgg cac gta cac gcc ccg gga gat cca agg gct gac 576 Val Ile vai Asp Trp His vai His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Ala Asp

145 150 155

att tat tcc ggt gct cta gac ttt ttt aaa gaa att gca gac cac tat 624 Ile Tyr Ser Gly Ala Leu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ala Asp His Tyr

160 165 170 175

aag gac cat cct aag ttc cat tat att ata tgg gaa att gca aat gaa 672 Lys Asp His Pro Lys Phe His Tyr Ile Ile Trp Glu Ile Ala Asn Glu

180 185 190

cca age cca aat aac age gga gga cct gaa att cct aat gat gaa aca 720 Pro Ser Pro Asn Asn Ser Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asn Asp Glu Thr

195 200 205

gga tgg aaa gca gta aag gaa tat gct gaa cct ate gtg gaa atg ctt 768 Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Glu Pro Ile Val Glu Met Leu

210 215 220

cgt gaa agg ggg gac aat ata att ctt gta ggc age ccg aac tgg age 816 Arg Glu Arg Gly Asp Asn Ile Ile Leu vai Gly Ser Pro Asn Trp Ser

225 230 235

cag cgc ccg gat tta gct gca gat aac cct ata gat gca aaa aat ate 864 Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Ala Lys Asn lie

240 245 250 255

atg tac tet gtc cac ttc tat act gga tet cat gaa cct tca gat aca 912 Met Tyr Ser Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Glu Pro ser Asp Thr

260 265 270

age tat cct gaa ggc act ccg tcc tcg gaa cgg aat aac gtt atg gca 960 Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Pro Ser Ser Glu Arg Asn Asn Val Met Ala

275 280 285

aat gta cga tat gca ctc gag aat ggt gct gca gtt ttt gct aca gaa 1008 Asn Val Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Ala Ala Val Phe Ala Thr Glu

290 295 300

tgg ggt aca age caa gcc aat ggt gat ggc ggc cca tac ctt gac gaa 1056 Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Leu Asp Glu

305 310 315

gct gat gta tgg ctt aac ttc ctt aac gag aac aat ate age tgg gtc 1104 Ala Asp Val Trp Leu Asn Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Val

320 325 330 335

aac tgg tca ttg aca aat aaa aac gaa aca tca gat tcc ttc act ccc 1152 Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Thr ser Gly Ser Phe Thr Pro

340 345 350

ttt gag ctg ggg aaa tcc aat gcc aca agt ctt gat ect ggc cct gaa 1200 Phe Glu Leu Gly Lys ser Asn Ala Thr ser Leu Asp Pro Gly Pro Glu

355 360 365

caa gca tgg tcc ctg ccg gaa cta age gta tca gac gag tat gtt cgt 1248 Gln Ala Trp ser Leu Pro Glu Leu Ser Val Ser Gly Glu Tyr Val Arg

370 375 380

tca cga att aaa ggt agt ccg tat gaa ccg ttt gac cgg acg aaa ttt 1296 Ser Arg Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Glu Pro Phe Asp Arg Thr Lys Phe

385 390 395 aat aaa gta ate tgg gat ttt aac gac ggt aca gtt cag ggg ttt gaa 1344

Asn Lys Val Ile Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Phe Glu 400 405 410 415

gta aat gac gac agt cct gtt aaa gaa gaa ata gct gtc age aat gea 1392

Val Asn Asp Asp Ser Pro Val Lys Glu Glu Ile Ala Val Ser Asn Ala

420 425 430

ggt aat gcc ctt caa att acc ggt ctt aat gct age aac gac ate tcc 1440

Gly Asn Ala Leu Gln Ile Thr Gly Leu Asn Ala ser Asn Asp Ile Ser 435 440 445

aca gat aac ttc tgg agt aac ctc agg ctt tca gcc aat tcc tgg gga 1488

Thr Asp Asn Phe Trp ser Asn Leu Arg Leu Ser Ala Asn Ser Trp Giy 450 455 460

gaa tcg gtt aat ate ctg ggg gea gaa gaa ctg aca tta gat gtg ate 1536

Glu Ser Val Asn Ile Leu GIy Ala Glu Glu Leu Thr Leu Asp VaT Ile 465 470 475

gtc gat gag cca act tcc gtc tca ate gea gea att ccg caa agt gea 1584

Val Asp Glu Pro Thr Ser Val Ser Ile Ala Ala lie Pro Gln Ser Ala 480 485 490 495

gea gtt gqc tgg gea aat cct aac aat gcg gtc gtt gtt tet aaa gaa 1632

Ala Val Gly Trp Ala Asn Pro Asn Asn Ala Val Val Val ser Lys Glu

500 505 510

gat ttc gea cct tat ggt ggc cag tat aag gct gtc ctg acg ata aca 1680

Asp Phe Ala Pro Tyr Gly Gly Gln Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ile Thr 515 520 525

ccg gaa gat tet cca gct ctg gat gcc ata gea aca cat agt gat gat 1728

Pro Glu Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ala Ile Ala Thr His ser Asp Asp 530 535 540

aac atg atg aat aac att ate ttg ttt ata ggt aca gaa aat gct gat 1776

Asn Met Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Ile Gly Thr Glu Asn Ala Asp 545 550 555

gta ctc tca ctt gat aac att aca gtt aaa ggt tcc ate gtt gaa att 1824

Val Leu Ser Leu Asp Asn Ile Thr Val Lys Gly Ser Ile Val Glu Ile 560 565 570 575

cca gta ate cat gat cca aag ggc ate gcg gtt ctt cct tca aac ttt 1872

Pro Val lie His Asp Pro Lys Gly Ile Ala Val Leu Pro Ser Asn Phe

580 585 590

gag gac gga acc cgc caa ggc tgg gac tgg aac cct gaa tca ggg gta 1920

Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Asn Pro Glu ser Gly Val 595 600 605

aaa act gct tta aca att aaa gag gcc gat ggt tca cat gcc cta tcc 1968

Lys Thr Ala Leu Thr Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser His Ala Leu Ser 610 615 620

tgg gag ttt gct tac ccg gaa gtt aaa cct ggt gat ggg tgg gea aca Trp Glu Phe Ala Tyr Pro Glu Val Lys Pro Gly Asp Giy Trp Ala Thr 625 630 635

2016

gct cca cga ttg gag ttt tgg aaa gat gga ctg gta aga gga gea aac 2064 Ala Pro Arg Leu Glu Phe Trp Lys Asp Gly Leu vai Arg Gly Ala Asn 640 645 650 655

gat tac ctc tca ttt gat tta tac ctt gac cct gtc cgt gcc aca gag 2112 Asp Tyr Leu ser Phe Asp Leu Tyr Leu Asp Pro vai Arg Ala Thr Glu 660 665 670 ggt gct ate aca aca cat ctc gta ttc cag ccg cca agt gct gga tac 2160 Gly Ala Ile Thr Thr His Leu vai Phe Gln Pro Pro Ser Ala Gly Tyr 675 680 685

tgg gta caa gct cca gct tet cac age ata gat ttg tta aac tta gat 2208 Trp Val Gln Ala Pro Ala Ser His Ser Ile Asp Leu Leu Asn Leu Asp 690 695 700

tca gct gat ate aca gea gat gga ctg tac cat tat gaa gtg aaa ttc Ser Ala Asp Ile Thr Ala Asp Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Phe 705 710 715

2256

aat att aga gac att aca gea att caa gat gac aca gct ctg cgc aat 2304 Asn lie Arg Asp Ile Thr Ala Ile Gln Asp Asp Thr Ala Leu Arg Asn 720 725 730 735

atg ate ctc ata ttg gag gat agg aac age gac ttc gcg ggc cgg gcg 2352 Met Ile Leu Ile Leu Glu Asp Arg Asn Ser Asp Phe Ala Gly Arg Ala 740 745 750

ttc ate gac aat gta aga ttc gaa taa 2379

Phe Ile Asp Asn Val Arg Phe Glu 755

<210> 2 <211> 792 <212> PRT

<213> Bacillus sp. ACE160 <400> 2

Val Arg Gln Pro ile Gly Lys Lys Ile Ile Ala Ala Gly Met Ile Phe -30 -25 -20

Thr Leu Leu Phe ser Leu lie Val Thr Val Phe Pro Thr Ala Gly Gln -15 -10 -5

Ala Leu Glu ser Asp Tyr Ser His Leu Leu Gly Asn Asp Ala Val Lys -11 5 10 15

Arg Pro Ser Glu Gly Gly Ala Leu ser Leu Cys Asn Glu Thr Thr Pro 20 25 30

Val Lys Pro Asn His Ala Gly Asp Arg Gly Lys Pro ser His Ala Gly 35 40 45

Lys Gly Lys Pro Pro His Ala Gly Lys Pro Glu His Ala Gly Pro Lys 50 55 60

Arg Lys Thr Leu Cys Asp Ala Thr Gly Ser Gln Ile Gln Leu Arg Gly 65 70 75

Met ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Glu Ile Ile Asn Asp Asn 80 85 90 95

Ala Phe Ala Ala Leu Ser Asn Asp Trp Glu Ala Asn Met Ile Arg Leu 100 105 110

Ala Met Tyr Ile Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Val Lys 115

120

125

Glu Leu vai Tyr Glu Gly Ile Glu Leu Ala Phe Lys His Asp Met Tyr 130 135 140

Val Ile Val Asp Trp His vai His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Ala Asp 145 150 155

Ile Tyr ser Gly Ala Leu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ala Asp His Tyr 160 165 170 175

Lys Asp His Pro Lys Phe His Tyr Ile Ile Trp Glu Ile Ala Asn Glu 180 185 190

Pro Ser Pro Asn Asn Ser Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asn Asp Glu Thr 195 200 205

Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Glu Pro Ile Val Glu Met Leu 210 215 220

Arg Glu Arg Gly Asp Asn Ile Ile Leu Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser 225 230 235

Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Ala Lys Asn Ile 240 245 250 255

Met Tyr Ser Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Glu Pro Ser Asp Thr 260 265 270

Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Pro Ser Ser Glu Arg Asn Asn Val Met Ala 275 280 285

Asn Val Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Ala Ala Val Phe Ala Thr Glu 290 295 300

Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Leu Asp Glu 305 310 315

Ala Asp Val Trp Leu Asn Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Val 320 325 330 335

Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gly Ser Phe Thr Pro 340 345 350

Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro Glu 355 360 365

Gln Ala Trp Ser Leu Pro Glu Leu Ser Val Ser Gly Glu Tyr Val Arg 370 375 380

Ser Arg Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Glu Pro Phe Asp Arg Thr Lys Phe 385 390 395 Asn Lys Val Ile Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Phe Glu 400 405 410 415

Val Asn Asp Asp Ser Pro Val Lys Glu Glu Ile Ala Val ser Asn Ala 420 425 430

Gly Asn Ala Leu Gln Ile Thr Gly Leu Asn Ala Ser Asn Asp Ile ser 435 440 445

Thr Asp Asn Phe Trp Ser Asn Leu Arg Leu Ser Ala Asn Ser Trp Gly 450 455 460

Glu Ser Val Asn Ile Leu Gly Ala Glu Glu Leu Thr Leu Asp Val Ile 465 470 475

Val Asp Glu Pro Thr Ser Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ala 480 485 490 495

Ala Val Gly Trp Ala Asn Pro Asn Asn Ala Val Val Val Ser Lys Glu 500 505 510

Asp Phe Ala Pro Tyr Gly Gly Gln Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ile Thr 515 520 525

Pro Glu Asp ser Pro Ala Leu Gly Ala Ile Ala Thr His Ser Asp Asp 530 535 540

Asn Met Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Ile Gly Thr Glu Asn Ala Asp 545 550 555

Val Leu ser Leu Asp Asn Ile Thr Val Lys Gly Ser Ile Val Glu Ile 560 565 570 575

Pro Val Ile His Asp Pro Lys Gly Ile Ala Val Leu Pro Ser Asn Phe 580 585 590

Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Asn Pro Glu Ser Gly Val 595 600 605

Lys Thr Ala Leu Thr Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser His Ala Leu ser 610 615 620

Trp Glu Phe Ala Tyr Pro Glu Val Lys Pro Gly Asp Gly Trp Ala Thr 625 630 635

Ala Pro Arg Leu Glu Phe Trp Lys Asp Gly Leu Val Arg Gly Ala Asn 640 645 650 655

Asp Tyr Leu Ser Phe Asp Leu Tyr Leu Asp Pro vai Arg Ala Thr Glu 660 665 670 Gly Ala Ile Thr Thr His Leu Val Phe Gln Pro Pro Ser Ala Gly Tyr 675 680 685

Trp Val Gln Ala Pro Ala Ser His Ser Ile Asp Leu Leu Asn Leu Asp 690 695 700

Ser Ala Asp Ile Thr Ala Asp Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Phe 705 710 715

Asn Ile Arg Asp Ile Thr Ala Ile Gln Asp Asp Thr Ala Leu Arg Asn 720 725 730 735

Met Ile Leu Ile Leu Glu Asp Arg Asn Ser Asp Phe Ala Gly Arg Ala 740 745 750

Phe Ile Asp Asn Val Arg Phe Glu 755

<210> 3 <211> 32 <212> DNA

<213> Sequencia artificial <220>

<223> Iniciador <400> 3

gattaacgcg ttcctcgtgc tgagcacaga gg 32

<210> 4 <211> 31 <212> DNA

<213> Sequencia artificial <220>

<223> Iniciador <400> 4

ttatggagct caaatcaact ctaggaggct g 31

Claims

1. Polipeptídeo isolado tendo atividade de endoglucanase, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre o grupo consistindo de: a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 72% de identidade com aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade com aminoácidos 65 a 347 de SEQ ID NO: 2; c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência baixa com (i) nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ ID NO: 1, (ii) nucleotídeos 193 a 1041 de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); d) uma variante compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos de aminoácidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 2; e) um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo que compreende nucleotídeos 100 a 2376 de SEQ ID NO: 1, ou nucleotídeo 193 a 1041 de SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um fragmento compreendendo aminoácidos 368 a 569 de SEQ ID NO: 2 tem atividade de módulo de ligação de carboidrato.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos uma das seguintes propriedades: a) pi de 4,4 b) pH ótimo de 9, c) temperatura ótima de 40°C e d) estabilidade em pH de 5 a 10,5.

4. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3.

5. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ter, pelo menos, uma mutação na seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo consistindo de aminoácidos 1 a -759 de SEQ ID NO: 2.

6. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 4 ou 5, ligado operativamente a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

7. Célula hospedeira recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definido na reivindicação -6.

8. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma célula, que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo, e (b) recuperar o polipeptídeo.

9. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma célula hospedeira, compreendendo uma construção de ácido nucleico, em que referida construção de ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo, sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo, e (b) recuperar o polipeptídeo.

10. Composição de enzima, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido na reivindicação 1-3.

11. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 ou da composição de enzima como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para a degradação de biomassa contendo celulose.

12. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 ou da composição de enzima como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser em uma composição detergente.

13. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 ou da composição de enzima como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser em processos de acabamento de artigos têxteis.

14. Composição detergente caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido nas reivindicações 1-3, ou a composição de enzima como definida na reivindicação 10.

15. Composição para tratamento de artigo têxtil, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido nas reivindicações 1- -3, ou a composição de enzima como definida na reivindicação 10.