BRPI0616583A2 - composto, processo para a preparação de um composto, uso de um composto, e, método para a produção de um efeito redutor da permeabilidade antiangiogênica e/ou vascular em um animal de sangue quente - Google Patents

Abstract

COMPOSTO, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE UM COMPOSTO, USO DE UM COMPOSTO, E, MéTODO PARA A PRODUçãO DE UM EFEITO REDUTOR DA PERMEABILIDADE ANTIANGIOGêNICA E/OU VASCULAR EM UM ANIMAL DE SANGUE QUENTE. A presente invenção refere-se a um monoidrato de ZD6474, a processos para a preparação do monoidrato de ZD6474, A composições farmacêuticas compreendendo um monoidrato de ZD6474 como o ingrediente ativo, ao uso de um monoidrato de ZD6474 na manufatura de medicamentos para uso na produção de efeitos redutores da permeabilidade antiangiogênica e/ou vascular em animais de sangue quente, tais como humanos, e ao uso de um monoidrato de ZD6474 em métodos para o tratamento de estados doentios associados com a angiogênese e/ou aumentada permeabilidade vascular, tais como câncer, em animais de sangue quente, tais como humanos.

Description

"COMPOSTO, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMCOMPOSTO, USO DE UM COMPOSTO, E, MÉTODO PARA APRODUÇÃO DE UM EFEITO REDUTOR DA PERMEABILIDADEANTIANGIOGÊNICA E/OU VASCULAR EM UM ANIMAL DE SANGUEQUENTE"

A presente invenção refere-se a uma nova forma de ZD6474.Mais especificamente, a presente invenção refere-se a monoidrato deZD6474, a processos para a preparação de um monoidrato de ZD6474, acomposições farmacêuticas compreendendo um monoidrato de ZD6474 comoo ingrediente ativo, ao uso de monoidrato de ZD6474 na manufatura demedicamentos para uso na produção de efeitos redutores da permeabilidadeantiangiogênica e/ou vascular em animais de sangue quente, tais comohumanos, e ao uso de um monoidrato de ZD6474 em métodos para tratamentode estados doentios associados com a angiogênese e/ou aumentadapermeabilidade vascular, tal como câncer, em animais de sangue quente, taiscomo humanos.

A angiogênese normal representa um importante papel emuma variedade de processos, incluindo desenvolvimento embriônico, cura deferimentos e diversos componentes da função reprodutiva da feminina. Aangiogênese indesejável ou patológica tem estado associada com estadosdoentios incluindo retinopatia diabética, psoríase, câncer, artrite reumatóide,ateroma, sarcoma de Kaposi e hemangioma (Fan et al.,1995, TrendsPharmacolo. Sei. 16: 57 - 66: Folkman, 1995, Nature Medicina 1: 27 - 31). Aalteração da permeabilidade vascular pensa-se representar um papel emprocessos fisiológicos tanto normais como patológicos (Cullinan-Bove et al,1993, Endocrinology 133: 829 - 837; Senger et al, 1993, Câncer e MetastasisReviews, 12: 303 - 324). Diversos polipeptídeos com atividade promotora docrescimento das células endoteliais foram identificados, incluindo fatores decrescimento do fibroblasto ácidos e básicos (aFGF 7 bFGF) e fator docrescimento endotelial vascular (VEGF). Em virtude da expressão restrita deseus receptores, a atividade do fator de crescimento de VEGF5 ao contráriodaquela de FGFs, é relativamente específica em relação às células endoteliais.Evidência recente indica que o VEGF é um importante estimulador daangiogênese tanto normal como patológica (Jakeman et al, 1993,Endocrinology, 133: 848 - 859; Kolch et al, 1995, Breast Câncer Research eTreatment, 36: 139 - 155) e da permeabilidade vascular (Connolly et al, 1989,J. Biol. Chem. 264: 20017 - 20024). O antagonismo de ação do VEGF, porseqüestração de VEGF com anticorpo, pode resultar em inibição decrescimento de tumor (Kim et al, 1993, Nature 3 62: 841 - 844).

As tirosinas cinases receptoras (RTKs) são importantes natransmissão de sinais bioquímicos através da membrana plasmática dascélulas. Estas moléculas transmembrana caracteristicamente consistem de umdomínio de ligação de ligando extracelular conectado através de um segmentoda membrana plasmática a um domínio da tirosina cinase intracelular. Aligação do ligando ao receptor resulta em estimulação da atividade da tirosinacinase associada ao receptor, que resulta em fosforilação de resíduos detirosina tanto no receptor como em outras moléculas intracelulares. Estasmudanças da fosforilação da tirosina inicia uma cascata de sinalização,resultando em uma variedade de respostas celulares. Até hoje, pelo menosdezenove distintas subfamílias RTK, definidas pela homologia da seqüênciaamino ácida, foram identificadas. Uma destas subfamílias e presentementecompreendida pelo receptor da tirosina cinase semelhante-fms, Flt-1, oreceptor contendo o domínio de inserção da cinase, KDR (também referidocomo Flk-1) e outro receptor da tirosina cinase semelhante-fms), Flt-4. Duasdestas RTKs, Flt-I e KDR, têm mostrado ligarem-se a VEGF com ataafinidade (De Vries et al, 1992, Science 255: 989-991; Terman et al, 1992,Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992, 187: 1579-1586). A ligação de VEGFa estes receptores expressos em células heterólogas tem estado associada commudanças no status de fosforilação da tirosina das proteínas celulares e fluxosde cálcio.

O VEGF é um estímulo chave para vasculogênese eangiogênese. Esta citocina induz uma fenótipo de germinação vascular, pelaindução da proliferação das células endoteliais, expressão e migração deprotease e subseqüente organização de células, para formar um tubo capilar(Keck, P.J., Hauser, S.D., Krivi, G., Sanzo, K, Warren, T., Feder, J., eConnolly, D.T., Science (Washington DC), 246: 1309 - 1312, 1989;Lamoreaux, WJ., Fitzgerald, M.E., Reiner, A., Hasty, Κ. A., e Charles, S.T.,Microvasc. Res., 55: 29-42, 1998; Pepper, M.S., Montesano, R., Mandroita,SJ., Orei, L. e Vassalli, J.D., Enzyme Protein, 49: 138 - 162, 1996.). Alémdisso, o VEGF induz significativa permeabilidade vascular (Dvorak, H.F.,Detmar, M., Claffey, K.P., Nagy, J.A., van de Water, L., e Senger, D.R., (Int.Arch. Allergy Immunol, 107: 233 - 235, 1995; Bates, D.O., Heald, R.I.,Curry, F.E. e Williams, B. J. Physiol. (Lond.), 533: 263 - 272, 2001),promovendo a formação de uma rede vascular hiper-permeável, imatura, queé característica da angiogênese patológica. Tem sido mostrado que a ativaçãoapenas de KDR é suficiente para promover todas as principais respostasfenotípicas a VEGF, incluindo proliferação de células endoteliais, migração esobrevivência e a indução de permeabilidade vascular (Meyer, M., Clauss,M., Lepple- Wienhues, A., Waltenberger, J., Augustin, H.G., Ziche, M., Lanz,C, Büttner, M., Rziha, H-J., e Dehio, C., EMBO J., 18: 363 - 374, 1999; Zeng,H., Sanyal, S. e Mukhopadhyay, D., J. Biol. Chem., 276: 32714 - 32719,2001; Gille, H., Kowalski, J., Li, B., LeCouter, J., Moffat, B, Zioncheck, T.F.,Pelletier, N. e Ferrara, N., J. Biol. Chem., 276: 3222-3230, 2001).

Os compostos que inibem os efeitos do VEGF são de valor notratamento de estados doentios associados com angiogênese e/ou aumentadapermeabilidade vascular, tais como câncer (incluindo leucemia, mielomamúltipla e linfoma), diabetes, psoríase, artrite reumatóide, sarcoma de Kaposi,hemangioma, nefropatias agudas e crônicas, ateroma, restenose arterial,doenças autoimunes, inflamação aguda, formação excessiva de cicatriz eadesões, endométriose, linfoedema, sangramento uterino disfuncional edoenças oculares com proliferação do vaso retinal, incluindo regeneraçãomacular.

Os derivados da quinazolina, que são inibidores da tirosinacinase do receptor do VEGF, são descritos em WO 98/13354 e WO 01/32651.No WO 98/13354 e WO 01/32651, 10 compostos são descritos que possuematividade contra a tirosina cinase receptora do VEGF (VEGF RTK), enquantopossuindo alguma atividade contra a tirosina cinase receptora do fator decrescimento epidérmico (EGF) (EGF RTK).

ZD6474 é 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metóxi-7-(l-metilpiperidin-4-ilmetóxi)quinazolina:

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ZD6474 situa-se dentro da ampla descrição do WO 98/13354 eé exemplificada no WO 01/32651. ZD6474 é um potente inibidor da VEGFRTK e também tem alguma atividade contra a EGF RTK. A ZD6474 temmostrado eliciar atividade anti-tumor de largo espectro em uma faixa demodelos seguindo a administração oral de uma vez diariamente (Wedge S.R.,Ogilvie D.J., Dukes M. et al, Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 2001; 42: abstract3126).

O WO 01/32651 descreve a preparação de ZD6474.

No Exemplo 2a de WO 01/32651, o sal cloridreto de ZD6474é preparado e isolado.

No Exemplo 2b de WO 01/32651, a base livre de ZD6474 épreparada e isolada. Durante a etapa de isolamento, sulfato de magnésio éusado para secar o produto. Análise elementar da base livre de ZD6474isolada mostra que ela não contém água. Em outras palavras, a base livre deZD6474 isolada é uma forma anidra.

No Exemplo 2c do WO 01/32651, o sal cloridreto de ZD6474é preparado e isolado. Em um aspecto, o sal cloridreto isolado de ZD6474 édissolvido em dimetilsulfóxido e convertido na base livre de ZD6474 (emsolução de dimetilsulfóxido) pela adição de carbonato de potássio sólido. Abase livre de ZD6474 em solução de dimetilsulfóxido é em uma forma anidra.A base livre de ZD6474 em solução de dimetilsulfóxido é então convertida nosal trifluoroacetato de ZD6474, pela adição de ácido trifluoroacético.

Em outro aspecto do Exemplo 2c de WO 01/32651, a baselivre de ZD647 é isolada como um sólido. Primeiro, o sal cloridreto isoladode ZD6474 é convertido em base livre de ZD6474, suspendendo-se o salcloridreto em cloreto de metileno e lavando-se a suspensão com carbonatohidrogenado de sódio aquoso saturado, para fornecer uma solução de baselivre de ZD6474 em cloreto de metileno. A solução de cloreto de metileno dabase livre de ZD6474 é então secada usando-se sulfato de magnésio e osvoláteis removidos por evaporação. Este procedimento é repetido comoExemplo 1 do presente pedido e fornece a base livre de ZD6474 em formacristalina, anidra.

Assim, o WO 01/32651 descreve tanto o sal cloridreto deZD6474 como a base livre de ZD6474. A base livre de ZD6474, que é obtidacomo um sólido nos exemplos de WO 01/32651, é em uma forma anidra. Osprocessos descritos no WO 01/32651, para preparar o sal cloridreto deZD6474 e a forma anidra da base livre de ZD6474 são também descritos e/oureferenciados em publicações relativas às terapias de combinação incluindoZD6474, tais como WO 03/039551, WO 2004/014383, WO 2004/014426,WO 2004/032937, WO 2004/071397 e WO 2005/004870. Para evitação dedúvida, o termo "ZD6474", como usado a seguir, refere-se à base livre deZD6474, a menos que de outro modo citado.

A forma anidra de ZD6474 pode ser preparada utilizando-se osprocessos descritos no WO 01/32651. Um processo alternativo de preparar eisolar a forma anidra da base livre de ZD6474 é descrito no Exemplo 2 dopresente pedido.

A forma anidra de ZD6474 é um sólido cristalino sobcondições ambientes. Análise de Calorimetria de Varredura Diferencial(DSC) foi conduzida na forma anidra de ZD6474 de acordo com o métododescrito a seguir e mostra uma grande endoterma pronunciada, com um iníciode temperatura entre 230 0C e 240 0C, devido à fusão (Figura 1). Deve serentendido que os valores da temperatura de início e/ou pico da DSC podemvariar ligeiramente de uma máquina para outra ou de uma amostra para outrae, assim, os valores citados não devem ser interpretados como absolutos.

Análise termogravimétrica (TGA) foi conduzida na formaanidra de ZD6474 de acordo com o método descrito a seguir não mostranenhuma perda de peso antes da fusão (Figura 1). Isto é indicativo da forma anidra de ZD6474.

Análise Karl Fischer foi conduzida na forma anidra deZD6474 de acordo com o método descrito a seguir e produz uma figura de0,01 a 0,23 % peso/peso. Isto é indicativo da forma anidra de ZD6474.

A forma anidra de ZD6474 é caracterizada pelo fornecimentode pelo menos um dos seguintes valores 2-teta, medidos usando-se radiaçãoCuKa: 15,0° e 21,4°. A forma anidra de ZD6474 é caracterizada nofornecimento de um padrão de difração em pó para raio-X de CuKa, comomostrado na Figura 2, Os dez picos mais proeminentes são mostrados naTabela 1.Tabela 1 Dez picos de Difração em pó para raio-X mais proeminentespara a forma anidra de ZD6474

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vs = muito forte; s = forte

Análise de Sorção de Vapor Dinâmica (DVS) foi realizada deacordo com o método descrito a seguir e mostra que a forma anidra deZD6474 não é higroscópica (Figura 3). A 95% de umidade relativa, a formaanidra de ZD6474 absorveu somente 0,63% peso/peso de água, sugerindo quenão houve conversão a uma forma hidratada de ZD6474. A forma anidra deZD6474, portanto, é cineticamente estável na escala de tempo DVS.

É desejável identificarem-se formas alternativas estáveis deum composto farmaceuticamente ativo. As formas estáveis alternativas de umcomposto farmaceuticamente ativo, por exemplo, formas cristalinas estáveisalternativas, são vantajosas para formulação e processamento em uma escalacomercial. Por exemplo, as formas cristalinas estáveis fornecem um baixorisco de conversão para outra forma durante os procedimentos de formulação,o que fornece previsibilidade das propriedades de uma formulação final.

A presente invenção está envolvida com a identificação deformas alternativas de ZD6474, tais como formas que são diferentes da formaanidra de ZD6474 e que têm melhoradas propriedades de estado sólido emcertos ambientes. Por exemplo, em um aspecto, a presente invençãopreocupa-se com a identificação de formas alternativas de ZD6474, que sejamespecialmente úteis em sistemas aquosos e/ou em ambientes de elevadaumidade.Um exemplo de uma forma alternativa de ZD6474 é umaforma hidratada de ZD6474. No WO 01/32651 é dito que os compostos queele descreve podem existir em formas solvatadas bem como não solvatadas,tais como, por exemplo, formas hidratadas.

Em parte alguma do WO 01/32651 é dito que um hidratoparticular de um composto particular ali descrito possua propriedadesinesperadas ou benéficas.

Verificou-se agora que a forma de monoidrato de ZD6474 éuma forma cristalina vantajosamente estável de ZD6474 em temperaturaambiente e umidade. A forma de monoidrato cristalina de ZD6474 éespecialmente adequada para uso em ambientes aquosos, tais como emformulações de suspensão aquosa e/ou em ambientes de elevada umidade.

Além disso, a forma de monoidrato cristalina de ZD6474 é de processamentosimples. Por exemplo, esta forma de ZD6474 pode prontamente ser secada emlargas escalas (tais como por secagem em leito fluido durante a formulação)em uma temperatura de cerca de 30 - 40 0C sem apreciável desidratação, podesofrer granulação úmida sem risco de hidratação e pode ser armazenada emuma faixa de umidades. Adicionalmente, os processos para preparar a formade monoidrato cristalina de ZD6474 também permite fácil remoção deimpurezas solúveis em água particulares.

De acordo com a presente invenção é provido um monoidratode ZD6474. O monoidrato de ZD6474 é prontamente cristalizado, é altamentecristalino e é não-higroscópico (por medições DVS).

O monoidrato de ZD6474 em uma forma cristalina écaracterizado por fornecer pelo menos um dos seguintes valores 2-teta,medidos utilizando-se radiação CuKa: 10,8° e 21,0°. O monoidrato deZD6474 é em uma forma cristalina é caracterizado por fornecer um padrão dedifração em pó para raio-X, substancialmente como mostrado na Figura 4. Osdez mais proeminentes picos são mostrados na Tabela 2:Tabela 2 Os dez mais proeminentes picos de Difração em pó para raio-Xpara a forma de monoidrato de ZD6474_

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vs = muito forte

De acordo com a presente invenção é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos um pico específico a cerca de 2-teta= 10,8°.

De acordo com a presente invenção é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos um pico específico a cerca de 2-teta = 21,0°.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos dois picos específicos a cerca de2-teta= 10,8° e 21,0°.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com picos específicos a cerca de 2-teta = 10,8,21,0, 18,4, 11,9, 18,9, 18,1,22,1, 11,4, 20,1 e 24,0°.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X substancialmente igual ao padrão de difração empó para raio-X mostrado na Figura 4.De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos um pico específico em 2-teta =10,8° mais ou menos 0,5° 2-teta.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos um pico específico em 2-teta =21,0° mais ou menos 0,5° 2-teta.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos dois picos específicos em 2-teta= 10,8° e 21,0° em que ditos valores podem ser mais ou menos 0,5° 2-teta.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com picos específicos a 2-teta = 10,8, 21,0, 18,4,11,9, 18,9, 18,1, 22,1, 11,4, 20,1 e 24,0°, em que ditos valores podem ser maisou menos 0,5° 2-teta.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos um pico específico em 2-teta =10,8°.

De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos um pico específico a 2-teta =21,0°.

De acordo com a presente invenção é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com pelo menos dois picos específicos em 2-teta= 10,8° e 21,0°.De acordo com a presente invenção, é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X com picos específicos a 2-teta = 10,8, 21,0, 18,4,11,9, 18,9, 18,1,22,1, 11,4, 20,1 e 24,0°.

De acordo com a presente invenção é provido um monoidratode ZD6474 em uma forma cristalina, em que o monoidrato tem um padrão dedifração em pó para raio-X como mostrado na Figura 4.

Nos parágrafos precedentes, definindo os picos de difração empó para raio-X para o monoidrato de ZD6474 em uma forma cristalina, otermo "a cerca de" é usado na expressão "... a cerca de 2-teta=..." para indicarque a posição precisa dos picos (isto é, os valores de ângulo 2-teta citados)não devem ser interpretados como sendo valores absolutos porque, como seráobservado por aqueles hábeis na arte, a posição precisa dos picos pode variarligeiramente entre uma máquina e outra, de uma amostra para outra, ou comoresultado de ligeiras variações das condições de medição usadas. Em umaforma de realização, cerca de 2-teta = 10,8° significaria 2-teta = 10,8 ± 0,5°,em outra forma de realização 2-teta = 10,8 ± 0,2° e, em uma outra forma derealização, 2-teta = 10,8 ± 0,1°. É também citado nos parágrafos precedentesque o monoidrato de ZD6474 em uma forma cristalina fornece um padrão dedifração em pó para raio-X "substancialmente" igual ao padrão de difraçãoem pó para raio-X mostrado na Figura 4. Observamos que o uso do termo"substancialmente" neste contexto é também destinado a indicar que osvalores de ângulo 2-teta dos padrões de difração em pó para raio-X podemvariar ligeiramente de uma máquina para outra, de uma amostra para outra, oucomo resultado de ligeiras variações das condições de medição utilizadas, demodo que as posições pico mostradas na Figura são, repetindo, para serinterpretadas como valores absolutos.

Análise DSC (detalhes dados a seguir) foi conduzida cmmonoidrato de ZD6474 e mostra uma grande endoterma larga, com umatemperatura de início entre 50 0C e 120 0C, devido à desidratação (a fim deproduzir a forma anidra de ZD6474), bem como uma grande endotermaestreita, com uma temperatura de início entre 230 0C e 240 0C, devido à fusãoda forma anidra de ZD6474 (Figura 5).

Análise TGA (detalhes dados a seguir) foi conduzida emmonoidrato de ZD6474 e mostra uma perda de peso de cerca de 3,7% entre 690C e 111 0C (Figura 5), que corresponde à perda de água de hidratação domonoidrato de ZD6474. Deve ser entendido que os valores de temperatura daTGA pode variar ligeiramente de uma máquina para outra ou de uma amostrapara outra e, assim, os valores citados não são para ser interpretados comoabsolutos.

Análise Karl Fischer (detalhes dados a seguir) foi conduzidaem monoidrato de ZD6474 e produz um algarismo de cerca de 3,9%,sugerindo que toda a perda de peso é devida à perda de água. Como a pessoahábil observaria, a percentagem em peso de água no monoidrato de ZD6474 éde 3,65%.

Análise de Sorção de Vapor Dinâmica (DVS) (detalhes dadosa seguir) foi conduzida em monoidrato de ZD6474 e mostra que o monoidratode ZD6474 não é higroscópico (Figura 6). A análise DVS mostra que omonoidrato de ZD6474 substancialmente (menos do que 5%) não converte-sena forma anidra de ZD6474 durante a secagem a 25 0C e 0% de umidaderelativa. Uma plotagem da mudança de peso percentual na armazenagem demonoidrato de ZD6474 a 0% de umidade relativa a 25 0C (Figura 7) mostraque uma vez a umidade de superfície tenha sido removida, a taxa de perda depeso é extremamente baixa. Uma plotagem da mudança de peso percentual naarmazenagem de monoidrato de ZD6474 a 0% de umidade relativa a 40 0C(Figura 8) mostra que a taxa de perda de peso é mais rápida nestatemperatura, mais é também surpreendentemente baixa para um compostohidratado neste ambiente. O monoidrato de ZD6474, portanto, écineticamente estável na escala de tempo DVS.

Experimentos com lama foram conduzidos como descrito noExemplo 3 do presente pedido (e como descrito em Zhu, H. J., Yuen, C,Grant, D.J.W., Int. J. Pharm., (1996) 135 (1,2) 151 - 160), para identificar ascondições em que o monoidrato de ZD6474 é a forma cristalina mais estável.Estes experimentos mostram que, a 25 0C, a forma anidra de ZD6474 é aforma termodinamicamente estável em menos do que ou igual a 30% deumidade relativa. A 25 0C, o monoidrato de ZD6474 é a formatermodinamicamente estável em mais do que ou igual a 40% de umidaderelativa. Portanto, a 25 0C e 50% de umidade relativa, o monoidrato deZD6474 é a forma mais estável.

Quando for citado que a presente invenção refere-se a umaforma cristalina de monoidrato de ZD6474, o grau de cristalinidade éconvenientemente maior do que cerca de 60%, mais convenientemente maiordo que cerca de 80%, preferivelmente maior do que cerca de 90% e, maispreferivelmente, maior do que cerca de 95%. Muitíssimo preferivelmente, ograu de cristalinidade é maior do que cerca de 98%.

Para evitar dúvida, pela expressão "condições ambientes"pretendemos significar temperatura e umidade ambientes. Pela expressão"temperatura ambiente" pretendemos significar uma temperatura na faixa de15 a 30 0C, particularmente uma temperatura a cerca de 25 0C. Pela expressão"umidade ambiente" pretendemos significar entre cerca de 45 e 60% deumidade relativa. Pela expressão "umidade relativa" pretendemos significar aquantidade (%) de umidade atmosférica presente em relação à quantidade queestaria presente se o ar estivesse saturado. Como será observado por aqueleshábeis na arte, umidade relativa é função de tanto teor de umidade comotemperatura.

A forma cristalina de monoidrato de ZD6474 fornece umpadrão de difração em pó para raio-X substancialmente igual ao padrão dedifração em pó para raio-X mostrado na Figura 4 e tem substancialmente osdez picos mais proeminentes (valores de ângulo 2-teta) mostrados na Tabela2. Deve ser entendido que os valores 2-teta do padrão de difração em pó pararaio-X podem variar ligeiramente de uma máquina para outra ou de umaamostra para outro e, assim, os valores citados não devem ser interpretadoscomo absolutos.

É sabido que pode ser obtido um padrão de difração em pópara raio-X pode que tem uma ou mais variações de medição, dependendo dascondições de medição (tais como equipamento ou máquina usados). Emparticular, é geralmente sabido que as intensidades de um padrão de difraçãoem pó para raio-X pode flutuar, dependendo das condições de medição (porexemplo, orientação preferida). Portanto, deve ser entendido que a forma demonoidrato de ZD6474 da presente invenção não é limitada aos cristais quefornecem padrões de difração em pó para raio-X idênticos ao padrão dedifração em pó para raio-X mostrado na Figura 4 e quaisquer cristaisfornecendo padrões de difração em pó para raio-X substancialmente iguaisàqueles mostrados na Figura 4 situam-se dentro do escopo da presenteinvenção. Uma pessoa hábil na arte de difração em pó para raio-X é capaz dejulgar a identidade substancial dos padrões de difração em pó para raio-X.

As pessoas hábeis na difração em pó para raio-X entenderãoque a intensidade relativa dos picos pode ser afetada, por exemplo, por grãosacima de 30 micros de tamanho e alongamentos não-unitários, que podemafetar a análise das amostras. A pessoa hábil também entenderá que a posiçãode reflexões pode ser afetada pela altura precisa em que a amostra se situa nodifractômetro e a calibração zero do difractômetro. A planaridade desuperfície da amostra pode também ter pequeno efeito. Em conseqüência, osdados de padrão de difração apresentados não devem ser tomados comovalores absolutos (Jenkins, R & Snyder, RX. 'Introduction to X-Ray PowderDiffractometry' John Wiley & Sons 1996; Bunn, CW. (1948), ChemicalCrystallography, Clarendon Press, London; Klug, Η. Ρ. & Alexander, L. Ε.(1974), X-Ray Diffraction Procedures).

Geralmente, um erro de medição de um ângulo de difração deum difractograma de pó de raio-X é mais ou menos 0,5° 2-teta ou menos, porexemplo, 0,2° teta ou idealmente 0,1° 2-teta e tal grau de um erro de mediçãodeve ser levado em consideração quando considerando-se os padrões dedifração em pó para raio-X das Figuras 2 e 4 e quando lendo as Tabelas 1 e 2.

Além disso, deve ser entendido que as intensidades podem flutuar,dependendo das condições experimentais e da preparação da amostra (porexemplo, orientação preferida).

Para evitar dúvida, a expressão "base livre de ZD6474" refere-se a cada uma e toda forma de base livre de ZD6474, enquanto que "ZD6474anidro" refere-se à forma anidra particular da base livre de ZD6474 e"monoidrato de ZD6474" refere-se à forma de monoidrato particular da baselivre de ZD6474.

De acordo com mais um aspecto da invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica que compreende um monoidrato de ZD6474 comodefinido aqui antes, em associação com um excipiente ou veículofarmaceuticamente aceitável.

A composição pode ser em uma forma adequada paraadministração oral (por exemplo, como tabletes, pastilhas, cápsulas duras oumacias, suspensões aquosas ou oleosas, emulsões, pós ou grânulosdispersáveis, xaropes ou elixires), para administração por inalação (porexemplo, como um pó finamente dividido ou um aerossol líquido), paraadministração por insuflação (por exemplo, como um pó finamente dividido),para injeção parenteral (por exemplo, como uma solução, suspensão ouemulsão estéril para dosagem intravenosa, subcutânea, intramuscular ou deinfusão), para administração tópica (por exemplo, como cremes, pomadas,géis ou soluções ou suspensões aquosas ou oleosas) ou para administraçãoretal (por exemplo, como um supositório). Preferivelmente, o monoidrato deZD6474 é administrado oralmente. Em geral, as composições acima podemser preparadas de uma maneira convencional, utilizando-se excipientesconvencionais.

As composições da presente invenção são vantajosamenteapresentadas em forma de dosagem unitária. O monoidrato de ZD6474normalmente será administrado a um animal de sangue quente em uma doseunitária na faixa de 10 a 500 mg por metro quadrado de área corporal doanimal, por exemplo, aproximadamente 0,3 a 15 mg/kg em um humano. Umadose unitária na faixa, por exemplo, de 0,3 a 15 mg/kg, por exemplo, 0,5 a 5mg/kg é considerada e esta é normalmente uma dose terapeuticamente eficaz.

Uma forma de dosagem unitária, tal como tablete ou cápsula, usualmenteconterá, por exemplo, 25 a 500 mg de ingrediente ativo. Preferivelmente, umadose diária na faixa de 0,5 a 5 mg/kg é empregada. O tamanho da dosenecessária para o tratamento terapêutico ou profilático de um estado doentioparticular necessariamente será variado, dependendo do hospedeiro tratado,da via de administração e da severidade da doença sendo tratada. Porconseguinte, o clínico que está tratando qualquer paciente particular podedeterminar a dosagem ótima.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, éprovido um monoidrato de ZD6474 como definido aqui antes, para uso emum método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

Um outro aspecto da presente invenção é um monoidrato deZD6474 como definido aqui antes, para uso como um medicamento,convenientemente um monoidrato de ZD6474 como definido aqui antes, parauso como um medicamento para produzir um efeito redutor dapermeabilidade antiangiogênica e/ou vascular em um animal de sanguequente, tal como um ser humano.

Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, éprovido o uso de um monoidrato de ZD6474 como definido aqui antes, namanufatura de um medicamento para uso na produção de um efeito redutor dapermeabilidade antiangiogênica e/ou vascular em um animal de sanguequente, tal como um ser humano.

De acordo com mais um aspecto da invenção, é provido ummétodo para produzir um efeito redutor da permeabilidade antiangiogênicae/ou vascular em um animal de sangue quente, tal como um ser humano, emnecessidade de tal tratamento, que compreende administrar a dito animal umaquantidade eficaz de um monoidrato de ZD6474, como definido aqui antes.

O monoidrato de ZD6474 é um agente redutor dapermeabilidade antiangiogênica e/ou vascular e pode ser aplicado como aúnica terapia ou pode envolver, além de monoidrato de ZD6474, uma ou maisde outras substâncias e/ou tratamentos. Tal tratamento conjunto pode serconseguido por meio da administração simultânea, seqüencial ou separada doscomponentes individuais do tratamento. No campo da oncologia médica, éprática normal utilizar-se uma combinação de diferentes formas de tratamentopara tratar cada paciente com câncer. Na oncologia médica, o(s) outro(s)componente(s) de tal tratamento conjunto, além de monoidrato de ZD6474,pode(m) ser: cirurgia, radioterapia ou quimioterapia. Tal quimioterapia podecobrir três categorias principais de ácido terapêutico:

(i) outros agentes antiangiogênicos, tais como aqueles queinibem os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (por exemplo, oanticorpo do fator de crescimento das células endoteliais anti-vascularesbevazizumab [Avastin™] e aqueles que funcionam por diferentesmecanismos daqueles definidos aqui antes (por exemplo, linomida, inibidoresda função ανβ3 da integrina, agiostatina, razoxina, talidomida) e incluindoagentes de alvejamento vascular (por exemplo, fosfato de combretastina ecompostos descritos nos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 00/40529,WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 e WO 02/08213 e os agentes deavaria vascular descritos no Pedido de Patente Internacional No. WO99/02166, a inteira descrição de cujo documento é incorporada aqui porreferência (por exemplo, N-acetilcolchinol-O-fosfato));

(ii) agentes citostáticos, tais como antioestrogênios (porexemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno),reguladores descendentes do receptor do estrogênio (por exemplo,fulvestrant), progestogênios (por exemplo, acetato de megestrol), inibidoresda aromatase (por exemplo, anastrozol, letrazol, vorazol, exemestano),antiprogestogênios, antiandrogênios (por exemplo flutamida, nilutamida,bicalutamida, acetato de ciproterona), agonistas e antagonistas de LHRH (porexemplo, acetado de goserelina, luprolida, buserelina), inibidoes da 5 a-redutase (por exemplo, finasterida), agentes anti-invasão (por exemplo,inibidores da metaloproteinase como marimastat e inibidores da função doreceptor ativador do plasminogênio da urocinase) e inibidores da função defator de crescimento (tais fatores de crescimento incluem, por exemplo, fatorde crescimento derivado de plaquetas e fator de crescimento de hepatócito),tais inibidores incluem anticorpos de fator de crescimento, anticorpos dereceptor de fator de crescimento (por exemplo, o anticorpo anti-erbb2trastuzumab [Herceptin™] e o anticorpo anti-erbbl cetuximab [C225]),inibidores da farnesil transferase, inibidores da tirosina cinase, por exemplo,inibidores da família do fator de crescimento epidérmico (por exemplo,inibidores da tirosina cinase da família EGFR, tais como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxi-6-(3-morfolinopropóxi)quinazolin-4-amina (gefitinib,ZD 1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxyetóxi)quinazolin-4-amina(erlotinib, OSI-774) e 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropóxi)quinazolin-4-amina (Cl 1033)) e inibidores daserina/treonina cinase); e

(iii) medicamentos antiproliferativos/antineoplásticos e suascombinações, como usados em oncologia médica, tais como antimetabólitos(por exemplo, antifolatos como metotrexato, fluoropirimidinas como 5-fluorouracila, tegafür, análogos da purina e adenosina, citosina arabinosida);antibióticos anti-tumor (por exemplo, antraciclins como adriamicina,bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina e idarubicina,mitomicina-C, dactinomicina, mitramicina); derivados de platina (porexemplo, cisplatina, carboplatina); agentes alquilantes (por exemplo,mostarda nitrogenada, melfalan, clorambucila, busulfan, ciclofosfamida,ifosfamida, nitrosouréias, tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo,alcalóides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina, vinorrelbina, etaxóides como taxol, taxotere); inibidores da topoisomerase (por exemplo,epipodofilotoxinas como etoposida e teniposida, ansacrina, topotecan,camptotecina e também irinotecan); também enzimas (por exemplo,asparaginase); e inibidores da timidilato sintase (por exemplo, raltitrexed); etipos adicionais de agente quimioterapêutico incluem:

(iv) modificadores da resposta biológica (por exemplo,interferon);

(v) anticorpos (por exemplo, edrecolomab);

(vi) terapias antissentido, por exemplo, aquelas que sãodirigidas aos alvos listados acima, tais como ISIS 2503, um antissentido anti-ras;

(vii) abordagens de terapia genética, incluindo, por exemplo,abordagens para substituir genes aberrantes, tais como aberrante p53 ouaberrante BRCAl ou BRCA2, abordagens de GDEPT (terapia de pró-drogade enzima dirigida a gene), tais como aquelas utilizando citosina deaminase,timidina cinase ou uma enzima de nitrorredutase bacteriana e abordagens paraaumentar a tolerância do paciente à quimioterapia ou radioterapia, tais comoterapia genética de resistência a multi-medicamentos; e

(viii) abordagens de imunoterapia, incluindo, por exemplo,abordagens ex-vivo e in vivo para aumentar a imunogenicidade das célulastumorais do paciente, tais como transfecção com citocinas, tais comointerleucina 2, interleucina 4 ou fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos, abordagens para diminuir a energia das células-T, abordagensutilizando células imunes transfectadas, tais como células dendríticastransfectadas por citocina, abordagens utilizando linhagens de célulastumorais transfectadas por citocina e abordagens utilizando anticorpos anti-idiotípicos.

Por exemplo, tal tratamento conjunto pode ser conseguido pormeio da administração simultânea, seqüencial ou separada de um monoidratode ZD6474 como definido aqui antes e um agente de alvejamento vasculardescrito no WO 99/02166, tal como N-acetilcolchinol-O-fosfato (Exemplo 1de WO 99/02166).

Sabe-se pela WO 01/74360 que os antiangiogênicos podem sercombinados com antiipertensivos. Um monoidrato de ZD6474 da presenteinvenção pode também ser administrado em combinação com umantiipertensivo. Um antiipertensivo é um agente que diminui a pressãosangüínea (vide, por exemplo, WO 01/74360, que é incorporado aqui porreferência).

Assim, de acordo com a presente invenção, é provido ummétodo de tratamento de um estado doentio associado com angiogênese, quecompreende a administração de uma quantidade eficaz de uma combinação deum monoidrato de ZD6474 como definido aqui antes e um agenteantiipertensivo para um animal de sangue quente, tal como um ser humano.

De acordo com mais um aspecto da presente invenção, éprovido o uso de uma combinação de um monoidrato de ZD6474 comodefinido aqui antes e um agente antiipertensivo, para uso na manufatura deum medicamento para o tratamento de um estado doentio associado comangiogênese em um mamífero de sangue quente, tal como um ser humano.

De acordo com mais um aspecto da presente invenção, éprovida uma composição farmacêutica compreendendo um monoidrato deZD6474 como definido aqui antes e um agente antiipertensivo, para otratamento de um estado doentio associado com a angiogênese em ummamífero de sangue quente, tal como um ser humano.

De acordo com mais um aspecto da presente invenção, éprovido um método para produzir um efeito redutor da permeabilidadeantiangiogênica e/ou vascular em um animal de sangue quente, tal como umser humano, que compreende administrar a dito animal uma quantidade eficazde um monoidrato de ZD6474, como definido aqui antes e um agenteantiipertensivo.

De acordo com mais um aspecto da presente invenção, éprovido o uso de uma combinação de um monoidrato de ZD6474 comodefinido aqui antes e um agente antiipertensivo, para a manufatura de ummedicamento para produzir um efeito redutor da permeabilidadeantiangiogênica e/ou vascular em um mamífero de sangue quente, tal comoum ser humano.

Agentes antiipertensivos preferidos são bloqueadores do canalde cálcio, inibidores da enzima conversora da angiotensina (inibidores ACE),antagonistas do receptor da angiotensina II (antagonistas A-II), diuréticos,bloqueadores do receptor beta-adrenérgico (bloqueadores β), vasodilatadorese bloqueadores do receptor alfa-adrenégico (bloqueadores a). Agentesantiipertensivos particulares são bloqueadores do canal de cálcio, inibidoresda enzima conversora da angiotensina (inibidores ACE), antagonistas doreceptor da angiotensina II (antagonistas A-II) e bloqueadores do receptorbeta-adrenérgico (bloqueadores-β), especialmente bloqueadores do canal decálcio.

Como citado acima, o monoidrato de ZD6474 é de interessepara seus efeitos redutores da permeabilidade antiangiogênica e/ou vascular.Espera-se que o monoidrato de ZD6474 seja útil em um larga faixa de estadosdoentios, incluindo câncer, diabetes, psoríase, artrite reumatóide, sarcoma deKaposi, hemangiona, linfoedema, nefropatias aguda e crônica, ateroma,restenose arterial, doenças auto-imunes, inflamação aguda, excessivaformação de cicatriz e adesões, endometriose, sangramento uterinodisfuncional e doenças oculares com proliferação do vaso retinal, incluindodegeneração macular relacionada com a idade. Câncer pode afetar qualquertecido e inclui leucemia, mieloma múltipla e linfoma. Em particular, taiscompostos da presente invenção são esperados diminuir vantajosamente ocrescimento dos tumores sólidos primários e recorrentes de, por exemplo,cólon, mama, próstata, pulmões e pele. Mais particularmente, espera-se quetais compostos da invenção inibam qualquer forma de câncer associada comVEGF, incluindo leucemia, mieloma múltipla e linfoma e também, porexemplo, o crescimento daqueles tumores sólidos primários e recorrentes, quesão associados com VEGF, especialmente aqueles tumores que sãosignificativamente dependentes de VEGF, seu crescimento e espalhamento,incluindo, por exemplo, certos tumores do cólon, mama, próstata, pulmão,vulva cerebral e pele.

Além de seu uso em medicina terapêutica, o monoidrato deZD6474 definido aqui antes é também utilizável como ferramentafarmacológica, no desenvolvimento e padronização de sistemas de teste invitro e in vivo, para a avaliação dos efeitos dos inibidores da atividade tirosinacinase receptora de VEGF em animais de laboratório, tais como gatos, cães,coelhos, macacos, ratos e camundongos, como parte da pesquisa de novosagentes terapêuticos.

Os ensaios escritos no WO 01/32651 e usado no teste ZD6474são como seguem:

(a) Teste de Inibicão da Tirosina Cinase Receptora In VitroEste ensaio determina a capacidade de um composto de testeinibir a atividade da tirosina cinase. O DNA codificando VEGF ou domínioscitoplásmicos receptores do fator de crescimento epidérmico (EGF) pode serobtido por síntese genética total (Edwards M, International BiotechnologyLab 5(3), 19 - 25, 1987) ou por clonagem. Estes podem ser expressos em umsistema de expressão adequado, para obter-se polipeptídeo com atividade detirosina cinase. Por exemplo, os domínios citoplásmicos do receptor de VEGFe EGF, que foram obtidos por expressão da proteína recombinante em célulasde inseto, foram constatados exibirem atividade da tirosina cinase intrínseca.No caso do receptor de VEGF Flt (número de acesso do Genbank númeroX51602), um fragmento de DNA de 1,7 kb, codificando a maior parte dodomínio citoplásmico, começando com metionina 783 e incluindo o códon determinação, descrito por Shibuya et al. (Oncogene, 1990, 5: 519 - 524), foiisolado de cDNA e clonado dentro de um vetor de translocação dobaculovírus (por exemplo, pAcYMl (vide The Baculovirus ExpressionSystem: A Laboratory Guide, L.A. King e R. D. Possee, Chapman and Hall,1992) ou pAc360 ou pBIueBacHis (disponíveis na Invitrogen Corporation)).Esta construção recombinante foi co-transfectada dentro de células de inseto(por exemplo, Spodoptera frugiperda 21(SfZl)) com DNA viral (p. ex.,Farmingen BaculoGold), para preparar baculovírus recombinante (detalhesdos métodos para a montagem de moléculas de DNA recombinante e dapreparação e uso de baculovírus recombinante podem ser encontrados emtextos padrão, por exemplo, Sambrook et al, 1989, Molecular cloning - ALaboratory Manual, 2a. edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press e0'Reilly et al, 1992, Baculovírus Expression Vectors - A Laboratory Manual,W. H. Freeman e Co, New York). Para outras tirosinas cinases para uso emensaios, fragmentos citoplásmicos começando de metionina 806 (número deacesso do Genbank L04947, DDR) e metionina 668 (receptor EGF, Númerode acesso Genbank X00588) podem ser clonados e expressos de uma maneirasimilar.

Para expressão da atividade da tirosina cinase cFlt, célulasSf21 foram infectadas com vírus recombinante cFlt inalterado em placa emuma multiplicidade de infecção de 3 e colhidas 48 horas mais tarde. Ascélulas colhidas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato(PBS) gelada (10 mM fosfato de sódio pH 7,4, 138 mM cloreto de sódio, 2,7mM cloreto de potássio), em seguida ressuspensas em HNTG/PMSF gelado(209 mM Hepes pH 7,5, 150 mM cloreto de sódio, 10% v/v glicerol, 1% v/vTriton X100, 1,5 mM cloreto de magnésio, 1 mM ácido de etileno glicol-bis(Paminoetil éter)N,N,N',N'-tetracético (EGTA), 1 Mm PMSF (fluoreto defenilmetilsulfonila); O PMSF é adicionado logo antes do uso de uma solução1009 mM recentemente preparada em metanol), usando-se 1 ml HNTG/PMSFpor 10 milhões de células. A suspensão foi centrifugada por 10 minutos a13000 rpm a 4 0C, o sobrenadante (estoque de enzima) foi removido earmazenado em alíquotas a -70 0C. Cada nova batelada de enzima de estoquefoi titulada no ensaio por diluição com diluente de enzima (100 mM HepespH 7,4, 0,2 mM ortovanadato de sódio, 0,1% v/v Triton Xl 00, 0,2 mMditiotreitol). Para uma batelada típica, a enzima de estoque é diluída 1 em2000 com diluente enzimático e 50 μΐ de enzima diluída são usados para cadapoço de ensaio.

Um estoque da solução substrato foi preparada de umcopolímero aleatório contendo tirosina, por exemplo, Poli (Glu, Ala, Tyr)6:3:1 (Signa P3899), armazenado como 1 mg/ml de estoque em PBS a -20 0Ce diluído 1 em 500 com PBS para revestimento em placa.

No dia antes do ensaio, 100 μΐ de solução substrato diluídaforam distribuídos dentro de todos os poços das placas de ensaio(imunoplacas de 96 poços Nunc maxisorp), que foram selados e deixados delado durante a noite a 4 0C.

No dia do ensaio, a solução de substrato foi descartada e ospoços da placa de ensaio foram lavados uma vez com PBST (PB S contendo0,05% v/v Tween 20) e uma vez com 50 mM Hepes pH 7,4.Os compostos de teste foram diluídos com 10% dedimetilsulfóxido (DMSO) e 25 μΐ de composto diluídos foram transferidospara poços das placas de ensaio lavadas. Os poços de controle "total"continham 10% de DMSO em vez do composto. Vinte e cinco microlitros decloreto de manganês(II) 40 mM, contendo 8 μΜ de adenosina-5'-trifosfato(ATP), foram adicionados a todos os poços de teste, exceto os poços decontrole "em branco", que continham cloreto de manganês(II) sem ATP. Paracomeçar as reações, 50 μΐ de enzima recentemente diluída foram adicionadosa cada poço e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 20minutos. O líquido foi descartado e os poços foram lavados duas vezes comPBST. Mil microlitros de anticorpo anti-fosfotirosina IgG de camundongo(Upstate Biotechnology Inc. product 05-321), diluídos 1 em 6000 com PBSTcontendo 0,5% p/v de albumina de soro bovino (BSA), foram adicionados emcada poço e as placas foram incubadas pro 1 hora em temperatura ambienteantes de descartar o líquido e lavar os poços duas vezes com PBST. Milmicrolitros de anticorpo Ig anti-camundongo de carneiro ligado a peroxidasede rábano silvestre (HRP) (Amersham product NXA 931), diluídos 1 e 500com PBST contendo 0,5% p/v BSA, foram adicionados e as placas foramincubadas por 1 hora à temperatura ambiente antes de descartar o líquido elavar os poços duas vezes com PBST. Mil microlitros de solução de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfônico) (ABTS), recentementepreparada usando-se um tablete de ABTS de 50 mg (Boehringer 1204 521)em 50 ml de tampão de citrato de fosfato 50 mM pH 5,0 + 0,03% deperborato de sódio (produzido com 1 cápsula de tampão de citrato de fosfatocom perborato de sódio (PCSB) (sIGMA p4922) por 100 ml de águadestilada), foram adicionados a cada poço. As placas foram então incubadaspor 20 - 60 minutos em temperatura ambiente, até que o valor da densidadeóptica dos poços de controle "total", medido a 405 nm empregando-se umespectrofotômeros de leitura de placa, fosse de aproximadamente 1,0. Valoresde controle "em branco" (sem ATP) e "total" (sem composto) foram usadospara determinar a faixa de diluição do composto de teste, que forneceu 50%de inibição de atividade de enzima.

Cb) Ensaio de Proliferação HUVEC In Vitro

Este ensaio determina a capacidade de um composto de testeinibir a proliferação estimulada pelo fator de crescimento de célulasendoteliais de veia umbilical humana (HUVEC).

Células HUVEC foram isoladas em MCDB 131 (Gibco BRL)+ 7,5% v/v de soro de bezerro fetal (FCS) e foram revestidas em lâmina (napassagem 2 a 8), em MCDB 131 + 2% v/v FCS + 3 μ^/πύ de heparina + 1μg/ml de hidrocortisona, em uma concentração de 1000 células/poço emplacas de 96 poços. Após um mínimo de 4 horas, elas foram dosadas com oapropriado fator de crescimento (isto é, VEGF 3 ng/ml, EGF 3 ng/ml ou b-FGF 0,3 ng/ml) e composto. As culturas foram então incubadas por 4 dias a37° C com 7,5% de bióxido de carbono. No dia 4, as culturas foram pulsadascom 1 μ/Ci/poço de timidina tritriada (Amersham product TRA 61) eincubadas por 4 horas. As células foram colhidas utilizando-se umacolheitadeira de placa de 96 poços (Tomtek) e então ensaiadas quanto àincorporação de trítio com um contador de placa Beta. A incorporação daradioatividade dentro das células, expressa como cpm, foi usada para medir ainibição da proliferação das células estimulada por fator de crescimento peloscompostos.

(c) Modelo de Doença de Tumor Sólido In Vivo

Este teste mede a capacidade dos compostos em inibirem ocrescimento de tumor sólido.

Xenoenxertos de tumor CaLu-6 foram estabelecidos no flancode camundongos nu/nu Swiss atímicos fêmeas, por injeção subcutânea de 1 χ10^6 CaLu-6 células/camundongo em 100 μl de uma solução de 50% (v/v) deMatrigel em meio de cultura livre de soro. Dez dias após o implante celular,os camundongos foram alocados a grupos de 8 - 10, a fim de obterem-sevolumes médios de grupo comparáveis. Os tumores foram medidosutilizando-se calibres vernier e os volumes foram calculados como (1 χ w) χV(1 χ w) χ (π/6), em que 1 é o maior diâmetro e w e o diâmetro perpendicularao diâmetro maior. Os compostos de teste foram administrados oralmenteuma vez por dia por um mínimo de 25 dias e os animais de controlereceberam diluente de composto. Os tumores foram medidos duas vezessemanalmente. O nível de inibição de crescimento foi calculado procomparação do volume médio do tumor do grupo de controle versus o grupode tratamento e a significância estatística determinada usando-se um teste-t deStudents e/ou um Teste Mann-Whitney Rank Sum. O efeito inibitório dotratamento do composto era considerado significativo quando p<0,05.

O perfil toxicológico dos compostos da presente invençãopode ser avaliado, por exemplo, usando-se uma estudo de 14 dias de ratocomo descrito a seguir.

(d) Teste de Toxicidade de 14 Dias em Rato

Este teste mede a atividade dos compostos no aumento da zonade hipertrofia das placas de crescimento epifisário femoral do fêmur distai etíbia proximal e permite avaliação das mudanças histopatológicas em outrostecidos.

A angiogênese é um evento essencial na ossificaçãoendocondrial, e a invasão vascular da placa de crescimento foi sugeridadepender da produção do VEGF pelos condrócitos hipertróficos. A expansãoda zona condrócita hipertrófica e a inibição da angiogênese foi demonstradaem seguida ao tratamento com agentes que especificamente seqüestramVEGF, tais como, por exemplo, (i) uma proteína quimérica receptora doVEHF solúvel (Flt-(l-3)-IgG) em camundongos (Gerber, H-P (Gerber, H-P.,Vu, T.H., Ryan, A.M., Kowalski, J., Werb, Z. e Ferrara, N. VEGF coupleshypertrophic cartilage remodelling, ossification e angiogenesis duringendochondral bone formation, Nature Med., 5: 623-628, 1999) e (ii) umanticorpo IgGl monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante em macacocinomólogo (Ryan, A.M., Eppler, D.B., Hagler, K.E., Bruner, R.H., Tomford,PJ., Hall, R.L., Shopp, G.M. e 0'Niell, CA. Preclinical Safety Evaluation ofrhuMAbVEGF, an antiangiogenie humanised monoclonal antibody, Tox.Path., 27: 78-86, 1999).

Um inibidor da atividade da tirosina cinase do receptor deVEGF deve, portanto, também inibir a invasão vascular da cartilagem eaumentar a zona de hipertrofia nas placas de crescimento epifisário femoraldo fêmur distai e tíbia proximal em animais em desenvolvimento.

Os compostos foram inicialmente formulados por suspensãoem uma solução de 1% (v/v) de monoleato de poloxietileno (20) sorbitano emágua deionizada, por moagem de bolas a 4 0C durante a noite (pelo menos 15horas). Os compostos foram ressuspensos por agitação imediatamente antesda dosagem. Ratos jovens Alderley Park (derivados de Wistar, 135-150 g depeso, 4 a 8 semanas de idade, 5 - 6 por grupo) foram dosados uma vezdiariamente por gavagem oral durante 14 dias consecutivos com o composto(a 0,25 ml/100 g peso corporal) ou veículo. No dia 15, os animais foramhumanamente terminados empregando-se uma concentração crescente debióxido de carbono e um post-mortem realizado. Uma faixa dos tecidos, queincluíam juntas femoro-tibiais, foi coletada e processada por técnicashistológicas padrão, para produzir seções de cera de parafina. As seçõeshistológicas foram tingidas com hematoxilina e eoxina e examinadas pormicroscopia óptica quanto à histopatologia. As áreas de placa de crescimentoepifisário femoral do fêmur distai e tíbia proximal foram medidas em seçõesde fêmur e tíbia empregando-se análise de imagem morfométrica. O aumentoda zona de hipertrofia foi determinado por comparação da área de placa decrescimento epifisário médio do grupo de controle versus o grupo detratamento e a significância estatística determinada usando-se um teste-t deStudent de uma cauda. O efeito inibitório do tratamento de composto eraconsiderado significativo quando ρ < 0,05.

Como descrito no WO 01/32651, ZD6474 (preparado deacordo com o procedimento descrito no Exemplo 2 de WO 01/32651), testadode acordo com (a), (b), (c) e (d) acima forneceu os seguintes resultados:

(a) Flt-IC50 de 1,6 μΜ

KDR-IC50 de 0,04 μπι

EGFR-IC50 de 0,5 μΜ

(b) VEGF - IC50 de 0,06 μΜ

EGF - IC50 de > 0,17 μΜ

Basal - IC50 de > 3 μΜ

(c) 78% de inibição de crescimento de tumor a 50 mg/kg; ρ <0,001 (Mann-Whitney Rank Sum Test);

(d) 75% de aumento da hipertrofia da placa de crescimentoepifisário a 100 mg/kg/dia em ratos fêmeas; ρ < 0,001 (teste-t de Students deuma cauda).

Um monoidrato de ZD6474, como definido aqui antes, podeser preparado por qualquer processo conhecido, a ser aplicável à preparaçãode compostos quimicamente relacionados. Tais processos são fornecidoscomo um outro aspecto da invenção e são como descrito aqui antes. Materiaisde partida necessários podem ser obtidos por procedimentos padrão dequímica orgânica. A forma anidra de ZD6474 pode ser preparada de acordocom qualquer um dos processos descritos em WO 01/32651, vide, emparticular, os Exemplos 2b e 2c de WO 01/32651. Alternativamente, materiaisde partida necessários são obteníveis por procedimentos análogos àquelesilustrados, que estão dentro da habilidade comum de um químico orgânico.

O seguinte processo constitui um outro aspecto da presente invenção.

Síntese de Monoidrato de ZD6474(a) Tal processo fornece um outro aspecto da presenteinvenção e compreende, por exemplo, as etapas de

(i) dissolver base livre de ZD6474 em uma mistura de solventeorgânico aquosa, para formar uma solução;

(ii) permitir que ocorra cristalização espontânea; e

(iii) isolar o sólido cristalino assim formado.

(b) Outro tal processo fornece um outro aspecto da presenteinvenção e compreende, por exemplo, as etapas de:

(i) dissolver a base livre de ZD6474 em uma mistura desolvente orgânico aquosa, para formar uma solução;

(ii) adicionar uma semente de monoidrato de ZD6474 parainiciar a cristalização do monoidrato de ZD6474; e

(iii) isolar o sólido cristalino assim formado.

Para a parte (i) de (a) e (b) acima, o solvente orgânico usadopode ser qualquer solvente não-solvatizante. Pela expressão "solvente nãosolvatizante" pretendemos significar um solvente que não forma solvatoscristalinos com ZD6474. Mais especificamente, o solvente orgânico incluiágua em uma quantidade a fim de prover uma atividade de água de cerca de0,4 a 1,0, especialmente de cerca de 0,5 a 0,95. Pela expressão "atividade deágua" pretendemos significar a água disponível em um substrato (porexemplo, um solvente) como uma fração decimal da quantidade presente,quando o substrato está em equilíbrio com a atmosfera circundante, em umaumidade relativa particular. Em outras palavras, uma umidade relativa deequilíbrio de 70% em torno do substrato significa que o substrato tem umaatividade de água de 0,70. Por exemplo, para a parte (i) de (a) e (b) acima, osolvente orgânico pode ser um éter tal como tetraidrofurano. Em particular, otetraidrofurano pode conter de 5 a 10% (em volume), particularmente 10%, deágua para prover a mistura de solvente orgânico aquosa. Em outras palavras, amistura pode conter de 95 a 90% (em volume), particularmente 90%, detetraidrofurano e de 5 a 10% (em volume, particularmente 10%, de água.

Para a parte (i) de (a) e (b), a mistura pode, se necessário, seraquecida ao refluxo, até ocorrer a dissolução. Alternativamente, a misturapode, por exemplo, ser aquecida a uma temperatura menor do que atemperatura de refluxo da mistura de solvente, desde que a dissolução desubstancialmente todo o material sólido tenha ocorrido. Observamos quepequenas quantidades de material insolúvel podem ser removidas porfiltragem da mistura aquecida.

Em (a) e (b) acima, o sólido cristalino assim formado pode serisolado por qualquer método convencional, por exemplo, por filtragem. Asólida cristalina isolada pode então ser secada. Por exemplo, quando o sólidocristalino é secado sem umidificação, uma temperatura de secagem adequadaé de cerca de 20 a 30 0C, especialmente cerca de 25 0C. Quando o sólidocristalino é secado sem umidificação, a temperatura de secagem é de cerca de30 a 50 0C, especialmente cerca de 40 0C.

A invenção é ilustrada a seguir por meio dos seguintesExemplos não-limitativos, Dados e Figuras em que, a menos que de outromodo citado:

(i) as evaporações foram realizadas por evaporação rotativa invácuo e os procedimentos de elaboração foram realizados após remoção dossólidos residuais, tais como agentes de secagem, por filtragem.

(ii) as produções são dadas para ilustração somente e não sãonecessariamente o máximo obtenível;

(iii) os pontos de fusão não são corrigidos e foramdeterminados usando-se um Mettler DSC820e;

(iv) as estruturas dos produtos finais foram confirmadas porressonância nuclear (geralmente protônica) magnética (NMR) e técnicasespectrais de massa; os valores de mudança química por ressonânciamagnética protônica foram medidos na escala delta e multiplicidades pico,como mostrado como segue: s, singleto; d, dupleto; t, tripleto; m, multipleto;br, amplo; q, quarteto; quin, quinteto; todas as amostras passadas em umBruker DPX 400 MHz a 300K no solvente indicaram 16 varreduras, tempo derepetição de pulso 10 segundos;

(v) os intermediários não foram geralmente totalmentecaracterizados e a pureza foi avaliada por análise NMR; e

(vi) as seguintes abreviações foram usadas:

RH umidade relativa

THF tetraidrofurano

IPA isopropanol

DMSO dimetilsulfóxido

DSC Calorimetria De Varredura Diferencial

TGA Análise Termogravimétrica

v/v relação de volume/volume

p/p relação de peso/peso

Exemplo 1: Repetição da etapa de isolamento da base livre de ZD6474 doExemplo 2c de WO 01/32651

Como examinado acima, no Exemplo 2c de WO 01/32651, abase livre de ZD6474 é isolada como um sólido. No Exemplo 2c de WO01/32651, o sal cloridreto de ZD6474 é convertido na base livre de ZD6474suspendendo-se o sal cloridreto em cloreto de metileno e lavando-se asuspensão com carbonato hidrogenado de sódio aquoso saturado, parafornecer uma solução de base livre de ZD6474 em cloreto de metileno. Asolução de cloreto de metileno da base livre de ZD6474 é então secadausando-se sulfato de magnésio e os voláteis removidos por evaporação.

Neste exemplo do presente pedido, a etapa de isolamento doExemplo 2c do WO 01/32651 foi repetida da etapa pela qual uma solução debase livre de ZD6474 em cloreto de metileno foi provida (que é lavada comágua). Como uma pessoa hábil na arte observaria, as etapas usadas antes daetapa de isolamento para preparar a solução de base livre de ZD6474 emcloreto de metileno são irrelevantes quanto à forma de ZD6474 que é providapor meio da etapa de isolamento particular. Adicionalmente, quaisqueretapa(s) de neutralização não tem efeito sobre a forma de ZD6474 que éprovida.

Uma amostra de ZD6474 (250,5 mg) foi colocada em umfrasco de cintilação de vidro descartável Wheaton e diclorometano (10 ml) foiadicionado. O frasco foi tampado e a mistura foi girada suavemente por 10minutos para dissolver o sólido. Água (5 ml) foi então adicionada à solução ea mistura foi agitada vigorosamente por 30 segundos. A mistura foi permitidarepousar por 2 minutos e então a camada de diclorometano foi removida comuma pipeta de vidro e colocada em outro frasco de cintilação de vidro. Osulfato de magnésio foi adicionado à solução e a mistura foi girada paratotalmente dispersar o sólido. A adição de sulfato de magnésio foi continuadaaté o sólido não mais aglomerar-se, porém formar uma fina dispersão no giro.

A mistura foi permitida repousar durante a noite. O sulfato de magnésio foientão removido por filtragem e enxaguado com diclorometano (1 ml). Ofiltrado e as lavagens foram combinados e permitidos evaporar para fornecerum fino sólido cristalino branco. Este material foi então analisado por XRPD(de acordo com o método descrito a seguir). O rastro de XRPD (Figura 9)mostra que o material é a forma anidra de ZD6474 (vide Figura 2). Como apessoa hábil observaria, quaisquer diferenças de altura de pico são devidas àorientação do cristal preferida.

Exemplo 2: Preparação de ZD6474 Anidro

A base livre de ZD6474 foi preparada de acordo com oprocedimento descrito no Exemplo 2b de WO 01/32651. A base livre deZD6474 (10 g) foi suspensa em tetraidrofiirano (50 ml), água (25 ml) e n-butilacetato (40 ml) e a suspensão aquecida ao refluxo para fornecer uma solução.

A fase aquosa foi separada e a fase orgânica foi filtrada e lavada comtetraidrofurano (5 ml), n-butil acetato (60 ml) foi adicionado e a misturadestilada em pressão atmosférica até uma temperatura do conteúdo de 106 0Cser conseguida. A lama resultante de ZD6474 foi esfriada e o sólido isoladopor filtragem, lavado com acetato de etila (20 ml) e secado para fornecerZD6474 anidro (9,1 g, 92%); Espectro NMR (piridina-d5) 1,49 (2H, m), 1,75- 1,90 (5H, m), 2,15 (3H, s), 2,76 (2H, m), 3,63 (3H, s), 3,97 (2H, d), 7,38(1H, ddd), 7,49 (1H, dd), 7,64 (1H, s), 7,88 (1H, t), 7,89 (1H, s), 9,01 (1H, s),10,37 (1H, s); Espectro de massa MHf 475.

Exemplo 3: Experimentos de Lama em Isopropanol Aquoso em

Atividades de Água Específicas para investigar a forma mais estável deZD6474 em diferentes Umidades Relativas

ZD6474 anidro (50 mg) e monoidrato de ZD6474 (50 mg)foram transformados em lama em diferentes relações de isopropanol/água,tendo atividades de água de 0,3, 0,4 e 0,5 (correspondendo a 30% de umidaderelativa, 40% de umidade relativa e 50% de umidade relativa,respectivamente) por 24 horas a 25 0C. O material resultante foi então filtradoe secado por ar. Estes experimentos indicaram que a 25 0C ZD6474 anidro é aforma termodinamicamente estável a < 30% de umidade relativa e omonoidrato de ZD6474 é a forma termodinamicamente estável a > 40% deumidade relativa.

Exemplo 4: Preparação de Monoidrato de ZD6474

A base livre de ZD6474 foi preparada de acordo com oprocedimento descrito no Exemplo 2b de WO 01/32651. A base livre deZD6474 (10,06 g) foi adicionada a tetraidrofurano aquoso (90% etraidrofurano / 10% de água, volume/volume) em temperatura ambiente. Amistura foi agitada e aquecida a 40 0C, até todo o sólido ter-se dissolvido.Mais base livre de ZD6474 (1,44 g) foi adicionada à mistura a 42 0C e amistura foi agitada por 20 minutos para fornecer uma solução transparente. Asolução foi aquecida a 50 0C e agitada nesta temperatura por 4 horas. Asolução foi então esfriada à temperatura ambiente e agitada por 12 dias parafornecer uma lama. O sólido resultante foi filtrado sob vácuo (600 a 700mbar) e secado em ar sob vácuo (200 mbar) por 1 hora. Análise Karl Fischerfoi conduzida no produto ZD6474 secado, de acordo com o método descrito aseguir e produziu um algarismo de 3,904 %, que é consistente commonoidrato de ZD6474; Espectro NMR (piridina-d5) 1,49 (2H, m), 1,75-1,90(5H, m), 2,15 (3H, s), 2,76 (2H, m), 3,63 (3H, s), 3,97 (2H, d), 7,38 (1H,ddd), 7,49 (1H, dd), 7,64 (1H, s), 7,88 (1H, t), 7,89 (1H, s), 9,01 (1H, s),10,37 (1H, s); Espectro de massa MH+ 475.

Exemplo 5: Método de preparação alternativo de monoidrato de ZD6474

Este foi preparado em um vaso de reação de vidro controladopor temperatura ajustado a 30°C. O vaso foi carregado com ZD6474 anidro.

A este foram adicionados 3 volumes relativos de tetraidrofurano(estabilizado) e 7 volumes relativos de água purificada (isto é, 3 litros de THFe 7 litros de água seriam usados para 1 kg de ZD6474). Os conteúdos foramagitados para formar uma lama colorida creme. A reação foi tipicamentecompletada em 1 hora, porém uma pequena amostra da lama pôde ser pegaapós uma hora, filtrada e então um espectro de XRD de pó tirado paraconfirmar isto. O sólido foi isolado por filtragem em um funil Buchnerdividido. O vaso de reação foi lavado com 2 volumes relativos de água. Alavagem do vaso de reação foi então usada como uma lavagem dedeslocamento da torta de filtro no funil Buchner. Uma outra lavagem foirealizada usando-se mais 2 volumes relativos de água adicionados ao vaso dereação, que foi novamente usada para lavar a torta de filtro.

O sólido foi transferido para um forno de vácuo e secado emtemperatura ambiente até seco. Durante a secagem, o sólido foi transformadoem lama regularmente. A secagem foi muito lenta, tipicamente uma bateladade 350 g leva aproximadamente 2 semanas para secar.

Exemplo 6; Método de preparação alternativo de monoidrato de ZD6474A base livre de ZD6474 é preparada de acordo com oprocedimento descrito no Exemplo 2b de WO 01/32651. A base livre deZD6474 (10,06 g) é adicionada a tetraidrofurano aquoso (90% detetraidrofurano / 10% água, volume/volume) em temperatura ambiente em umvaso de reação de vidro controlado em temperatura. A mistura é agitada eaquecida a 40 0C, até todo o sólido ser dissolvido. Mais base livre de ZD6474(1,44 g) é adicionada à mistura a 42 0C e a mistura é agitada por 20 minutospara fornecer uma solução transparente. Opcionalmente, a solução é avaliadaneste ponto. A solução é então aquecida a 50 0C e é agitada nesta temperaturapor 4 horas. A solução é então esfriada à temperatura ambiente e é agitada por1 dia para fornecer uma lama. Então uma pequena amostra da lama é retiradafiltrada e um espectro XRD de pó obtido. Se o espectro de XRD mostrar quetodo o ZD6474 anidro tiver sido convertido no monoidrato, este é isoladocomo detalhado abaixo. Se o espectro de XRD mostrar uma mistura deZD6474 anidro e monoidrato de ZD6474, então a solução é agitada por mais4 horas em temperatura ambiente, idealmente cerca de 20 0C e então éretestada. Se o espectro XRD mostrar predominantemente todo o ZD6474anidro, então um cristal semente de monoidrato de ZD6474 (0,1 - 1 % empeso da produção final teórica) e a solução é agitada por mais 4 horas emtemperatura ambiente, idealmente cerca de 20 0C e então pode ser retestada.Este processo pode ser repetido até todo o ZD6474 anidro ser convertido emmonoidrato de ZD6474.

O sólido é isolado por filtragem em um funil buchner dividido.O vaso de reação é lavado com 2 volumes relativos de água. A lavagem dovaso de reação é então usado como uma lavagem de deslocamento da torta defiltro dentro do funil buchner. Uma outra lavagem é realizada usando-se 2volumes relativos adicionais de água adicionados ao vaso de reação, que énovamente usado para lavar a torta de filtro.

O sólido é transferido para um forno de vácuo e é secado emtemperatura ambiente até seco. Durante a secagem o sólido é transformadoem lama regularmente. A secagem é muito lenta, tipicamente uma batelada de350 g leva aproximadamente 2 semanas para secar.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figure 1: Termogramas DSC e TGA Thermograms paraZD6474 anidro - com a temperatura em 0C, plotada no eixo geométricohorizontal e perda de peso %/fluxo de calor no eixo geométrico vertical. Aplotagem de topo é a plotagem TGA e a plotagem inferior é a plotagem DSC.A escala no eixo das ordenadas para a plotagem TGA é 2 mg, como indicadono gráfico e a escala no eixo das ordenadas para a plotagem DSC é de 10mW, como indicado no gráfico.

Figura 2: Padrão de Difração em pó para raio-X paraZD6474 anidro - com os valores 2 teta plotados no eixo geométricohorizontal e a intensidade de linha relativa (contagens) plotada no eixogeométrico vertical.

Figura 3: Plotagem da Isoterma DVS para ZD6474 anidroa 25 0C - com umidade relativa alvo (%) no eixo geométrico horizontal emudança de massa (%) no eixo geométrico vertical, em que os losangosrepresentam Sorção do Ciclo 1, os quadrados representam Dessorção do Ciclo1, os triângulos representam Sorção do Ciclo 1 e os quadrados representamDessorção do Ciclo 2.

Figura 4: Padrão de Difração em pó para raio-X paramonoidrato de ZD6474 - com os valores 2 teta plotados no eixo geométricohorizontal e a intensidade de linha relativa (contagens) plotada no eixogeométrico vertical.

Figura 5: Termogramas DSC e TGA para monoidrato deZD6474 - com temperatura em 0C plotada no eixo geométrico horizontal eperda peso %/fluxo calor no eixo geométrico vertical. A plotagem de topo é aplotagem TGA e a plotagem inferior é a plotagem DSC. A escala no eixo dasordenadas para a plotagem TGA é de 2 mg, como indicado no gráfico e aescala no eixo das ordenadas para a plotagem DSC é 10 mW, como indicadono gráfico.

Figura 6: Plotagem da Isoterma DVS para monoidrato deZD6474 a 25 0C - com umidade relativa alvo (%) no eixo geométricohorizontal e mudança de massa (%) no eixo geométrico vertical, em que oslosango e representam Sorção do Ciclo 1, os quadrados representamDessorção do Ciclo 1, os triângulos representam Sorção do Ciclo 2 e osquadrados representam Dessorção do Ciclo 2.

Figura 7: Plotagem da Isoterma DVS para monoidrato deZD6474 a 0 % de umidade relativa e 25 0C - com tempo em minutos noeixo geométrico horizontal e mudança de massa (% de peso inicial) no eixogeométrico vertical.

Figura 8: Plotagem da Isoterma DVS para monoidrato deZD6474 a 0% de umidade relativa e 40 0C - com tempo em minutos noeixo geométrico horizontal e mudança de massa (% de peso inicial) no eixogeométrico vertical.

Figura 9: Padrão de Difração em pó para raio-X paraZD6474 anidro formado no Exemplo 1 do presente pedido - com os valores2 teta plotados no eixo geométrico horizontal e a intensidade de linha relativa(contagens) plotada no eixo geométrico vertical.

Detalhes das Técnicas Usadas

Difração em pó para raio-X

Tabela 3

<table>table see original document page 39</column></row><table>

* As intensidades relativas são derivadas dos difractogramas medidos com incisões fixas

Instrumento Analítico: Siemens D5000, calibradoempregando-se quartzo.Os espectros de difração em pó para raio-X foramdeterminados fixando-se uma amostra do material ZD6474 cristalino nosengastes de pastilha de cristal de silício único (SSC) e dispersando-se aamostra para dentro de uma camada delgada com o auxílio de uma lâmina demicroscópio. A amostra foi girada a 30 revoluções por minuto (para melhorara estatística de contagem) e irradiada com raios-X gerados por um tubo defoco fino comprido de cobre, operado a 40 kV e 40 mA, usando-se radiaçãoCuKa com um comprimento de onda de 1,5406 angstrons. A fonte de raios-Xcolimada foi passada através de uma fenda de divergência variável automáticaajustada em V20 e a radiação refletida dirigida através de uma fendaantiespalhamento de 2 mm e uma fenda detectora de 0,2 mm. A amostra foiexposta por 1 segundo por incremento de 0,02 grau 2-teta (modo de varreduracontínuo) durante a faixa de 2 graus a 40 graus 2-teta no modo teta-teta. Otempo de realização foi de 31 minutos e 41 segundos. O instrumento foiequipado com um contador de cintilação como detector. O controle e capturade dados foram por meio de um Dell Optiplex 686 NTY 4.0 Workstationoperando com software Difract+. As pessoas hábeis na arte de difração em pópara raio-X entenderão que a intensidade relativa dos picos pode ser afetadapor, por exemplo, grãos acima de 30 micros de tamanho e alongamentos não-unitários que podem afetar a análise das amostras. A pessoa hábil tambémentenderá que a posição de reflexões pode ser afetada pela altura precisa emque a amostra fica no difractômetro e pela calibração zero do difractômetro. Aplanaridade de superfície da amostra pode também ter um pequeno efeito.Daí, os dados do padrão de difração não serem para ser tomados como valoresabsolutos.

Sorcão de Vapor Dinâmica

Instrumento Analítico: Surface Measurements SystemsDynamic Vapour Sorption Analyser (Analisador de Sorção de VaporDinâmica Sistemas de Medição de Superfície),calibrado com uma soluçãosalina, tal como cloreto de sódio.

Cerca de 5 mg do material contido em um suporte de quartzoem uma temperatura especificada foram submetidos a nitrogênio umidificadoem uma taxa de fluxo de 200 ml/minuto de nitrogênio nas seguintes umidadesrelativas (RH): 0, 20, 40, 60, 80, 95, 80, 60, 40, 20, 0% UR em duplicata.

O peso do material em uma umidade relativa particular foiconstantemente monitorado empregando-se uma balança in-situ até ficarestável, de acordo com um critério de peso de mudança de 0,002 % em pesopor minuto com média calculada durante 10 minutos. Se a altura estivesseainda mudando, então ela permaneceria em uma umidade relativa particular,até o peso ficar estável (até um tempo máximo de 12 horas).

Calorimetria de Varredura Diferencial (I)SC)

Instrumento Analítico: Mettler DSC820e.A DSC foi conduzida por DSC de refluxo de calor,empregando-se metal índio como uma calibração padrão. Tipicamente menosdo que 5 mg do material contido em uma panela de alumínio de 40 μl,equipada com uma tampa perfurada, foi aquecido durante a faixa detemperatura de 25 °C a 325 °C em uma taxa de aquecimento constante de 10°C por minuto. Um gás de purga empregando nitrogênio foi usado - taxa defluxo 100 ml por minuto. Para mais informações sobre DSC o leitor éreportado para: DSC/TGA Instrumental analysis 1986 Christian & O1Reilly,publicado por Allyn e Bacon ISBN00205086853.

Análise Termogravimétrica (TGA)

Instrumento Analítico: Mettler TG851 calibrado para pesoutilizando-se um peso de calibração padrão

Tipicamente entre 3 e 12 mg de material contido em umcadinho de alox (óxido de alumínio) de 70 μl foram aquecidos durante a faixade temperatura de 25°C a 325°C, em uma taxa de aquecimento constante de10°C por minuto, enquanto constantemente monitorando-se o pesoutilizando-se uma balança in situ. Um gás de purga empregando hélio foiusado - taxa de fluxo de 50 ml por minuto.

Para mais informações sobre TGA o leitor é reportado a:DSC/TGA Instrumental analysis (1986) Christian & 0'Reilly, Publicado porAllyn Bacon ISBN00205086853,

Karl Fischer Water Content (Teor de Água Fischer KarDInstrumento Analítico: Mitsubishi Moisture Meter CA-05.Tipicamente aproximadamente 50 mg de material foram usados.

Para mais informações sobre a medição de Karl Fischer WaterContent o leitor é reportado para: Fundamentais of Analytical Chemistry(1996) por Skoog, West e Holler, publicado por Brooks/Cole ISBN0-03-005938-0.

Claims (11)

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser monoidrato deAZD6474.

2. Composto sendo monoidrato de AZD6474, de acordo com areivindicação 1, em uma forma cristalina, caracterizado pelo fato de que omonoidrato tem um padrão de difração em pó para raio-X com pelo menosum pico específico a cerca de 2-teta = 10,8°.

3. Composto sendo monoidrato de AZD6474, de acordo com areivindicação 1, em uma forma cristalina, dito monoidrato caracterizado pelofato de ter um padrão de difração em pó para raio-X com pelo menos um picoespecífico a cerca de 2-teta = 21,0°.

4. Composto sendo monoidrato de AZD6474, de acordo com areivindicação 1, em uma forma cristalina, dito monoidrato caracterizado pelofato de ter um padrão de difração em pó para raio-X com pelo menos doispicos específicos a cerca de 2-teta = 10,8 e 21,0°.

5. Composto sendo monoidrato de AZD6474, de acordo com areivindicação 1, em uma forma cristalina, dito monoidrato caracterizado pelofato de ter um padrão de difração em pó para raio-X com picos específicos acerca de 2-teta = 10,8,21,0, 18,4, 11,9, 18,9, 18,1,22,1, 11,4, 20,1 e 24,0°.

6. Composto sendo monoidrato de AZD6474, de acordo com areivindicação 1, em uma forma cristalina, dito monoidrato caracterizado pelofato de ter um padrão de difração em pó para raio-X substancialmente igualao padrão de difração em pó para raio-X mostrado na Figura 4.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um monoidrato de ZD6474 como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, em associação com um excipiente ou veículofarmaceuticamente aceitável.

8. Processo para a preparação de um composto sendomonoidrato de ZD6474 na forma cristalina como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 6, dito processo caracterizado pelo fato decompreender:(i) dissolver a base livre de ZD6474 em um solvente orgânicoaquoso, para formar uma solução;(ii) permitir que ocorra cristalização espontânea; e(iii) isolar o sólido cristalino assim formado.

9. Processo para a preparação de um composto sendomonoidrato de ZD6474 na forma cristalina, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de a mistura de solventes orgânicos aquosacompreender 90% (em volume) de tetraidrofurano e 10% (em volume) deágua.

10. Uso de um composto sendo monoidrato de ZD6474 comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato deser na manufatura de um medicamento para uso na produção de um efeitoredutor da permeabilidade antiangiogênica e/ou vascular em um animal desangue quente, tal como um ser humano.

11. Método para a produção de um efeito redutor dapermeabilidade antiangiogênica e/ou vascular em um animal de sanguequente, tal como um ser humano, em necessidade de tal tratamento,caracterizado pelo fato de compreender administrar a dito animal umaquantidade eficaz de um monoidrato de ZD6474, como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 6.