BRPI0611009A2 - usos de um anticorpo monoclonal (mab), e, de um anticorpo anti-hgf de neutralização - Google Patents

Abstract

O pedido é dirigido a um método de tratamento de um tumor cerebral em um paciente compreendendo administração sistêmica de um anticorpo monoclonal.

Description

"USOS DE UM ANTICORPO MONOCLONAL (mAb), E, DE UMANTICORPO ANTI-HGF DE NEUTRALIZAÇÃO"REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido é não provisório e reivindica o benefício do60/687118, depositado em 02/06/2005 e 60/751092, depositado em15/12/2005, ambos os quais incorporados por referência em sua totalidadepara todas as finalidades.

DECLARAÇÃO DE INTERESSE DO GOVERNO

O trabalho descrito no presente pedido foi financiado, emparte, pelas Doações 1R43CA101283-01 Al e R01NS32148 do NationalInstitutes of Health. O governo Norte Americano pode ter determinadosdireitos sobre a presente invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere, de modo geral, ao tratamento detumores cerebrais com anticorpos e, mais particularmente, por exemplo, aotratamento de tumores cerebrais com anticorpos monoclonais que se ligam a eneutralizam Fator de Crescimento de Hepatócito.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) humano é umpolipeptídeo heterodimérico multifuncional produzido por célulasmesenquimais. Foi mostrado que o HGF estimula angiogênese, morfogênesee motogênese, bem como o crescimento e dispersão de vários tipos de células(Bussolino e colaboradores, J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar eMichalopoulos, J. Cell. Biol. 129: 1177, 1995; Matsumoto e colaboradores,Ciba. Found. Symp. 212: 198, 1997; Birchmeier e Gherardi, Trends Cell.Biol. 8: 404, 1998; Xin e colaboradores, Am. J. Pathol. 158: 1111, 2001). Asatividades pleiotrópicas do HGF são mediadas através de seu receptor, umaquinase de tirosina transmembrana codificada pelo proto-oncogene cMet.

Além de regulação de uma variedade de funções celulares normais, foimostrado que o HGF e seu receptor c-Met estão envolvidos no início, invasãoe metástases de tumores (Jeffers e colaboradores, J. Mol. Med. 74: 505, 1996;

Comoglio e Trusolino, J. Clin. Invest. 109: 857, 2002). HGF/cMet são co-expressos, freqüentemente super-expressos, sobre vários tumores sólidoshumanos, incluindo tumores derivados de tecido do pulmão, cólon, reto,estômago, rim, ovário, pele, mieloma múltiplo e tiróide (Prat e colaboradores,Int. J. Câncer 49: 323, 1991; Chan e colaboradores, Oncogene 2: 593, 1988;Weidner e colaboradores, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229, 1993;Derksen e colaboradores, Blood 99: 1405, 2002). O HGF atua como um fatorde crescimento autócrino (Rong e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA91: 4731, 1994; Koochekpour e colaboradores, Câncer Res. 57: 5391, 1997) eparócrino (Weidner e colaboradores, Am, J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229,1993) e regulador anti-apoptótico (Gao e colaboradores, J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) para esses tumores. Assim, moléculas antagonísticas, porexemplo, anticorpos, que bloqueiam a via de HGF-cMet têm, potencialmente,amplo potencial terapêutico anti-câncer.

O HGF é uma proteína de 102 kDa com similaridade deseqüência e estrutura ao plasminogênio e outras enzimas de coagulaçãosangüínea (Nakamura e colaboradores, Nature 342: 440, 1989; Weidner ecolaboradores, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229, 1993, cada um dosquais é incorporado aqui por referência). O HGF humano é sintetizado comoum precursor de 728 aminoácidos (preproHGF), o qual sofre clivagemintracelular a uma forma com cadeia simples inativa (proHGF) (Nakamura ecolaboradores, Nature 342: 440, 1989; Rosen e colaboradores, J. Cell. Biol.127: 1783, 1994). Quando de secreção extracelular, proHGF é clivado paraproporcionar a molécula heterodimérica dissulfeto-ligada biologicamenteativa composta de uma α-subunidade e uma β-subunidade (Nakamura ecolaboradores, Nature 342: 440, 1989; Naldini e colaboradores, EMBO J. 11:4825, 1992). A α-subunidade contém 440 resíduos (69 kDa com glicosilação)consistindo do domínio tipo grampo de cabelo N-terminal e quatro domínioskringle. A β-subunidade contém 234 resíduos (34 kDa) e tem um domíniosemelhante à protease de serina, o qual carece de atividade proteolítica.Clivagem do HGF é requerida para ativação de receptor, mas não para ligaçãoao receptor (Hartmann e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:11574, 1992; Loklcer e colaboradores, J. Biol. Chem. 268: 17145, 1992). OHGF contém 4 sítio de N-glicosilação putativos, 1 na α-subunidade e 3 na β-subunidade. O HGF tem 2 sítios de ligação célula-específicos únicos: um sítiode ligação de alta afinidade (Kd = 2 χ IO"10 Μ) para o receptor cMet e um sítiode ligação de baixa afinidade (Kd = IO"9 M) para proteoglicanas de sulfato deheparina (HSPG), os quais estão presentes sobre a superfície celular e matrizextracelular (Naldini e colaboradores, Oncogene 6: 501, 1991; Bardelli ecolaboradores, J. Biotechnol. 37: 109, 1994; Sakata e colaboradores, J. Biol.Chem., 272: 9457, 1997). NK2 (uma proteína abrangendo o N-término e osprimeiros dois domínios kringle da α-subunidade) é suficiente para ligação aocMet e ativação da cascata de sinal para motilidade, contudo, a proteína decomprimento total é requerida para a resposta mitogênica (Weidner ecolaboradores, Am. J. Respir. CelL Mol. Biol. 8: 229, 1993). HSPG se liga ao HGF através de interação com o N-término do HGF (Aoyama ecolaboradores, Biochem. 36: 10286, 1997; Sakata e colaboradores, J. Biol.Chem. 272: 9457, 1997). Papéis postulados para a interação HSPG-HGFincluem a intensificação da biodisponibilidade, atividade biológica eoligomerização de HGF (Bardelli e colaboradores, J. Biotechnol. 37: 109,1994; Zioncheck e colaboradores, J. Biol. Chem. 270: 16871, 1995).

cMet é um membro da classe IV da família de receptor dequinase de tirosina de proteína. O gene de cMet de comprimento total foiclonado e identificado como o proto-oncogene cMet (Cooper e colaboradores,Nature 311: 29, 1984; Park e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:6379, 1987). O receptor cMet é, inicialmente, sintetizado como um precursorde cadeia simples, parcialmente glicosilado, pl70(MET) (Fig. 1) (Park ecolaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 6379, 1987; Giordano ecolaboradores, Nature 339: 155, 1989; Giordano e colaboradores, Oncogene4: 1383, 1989; Bardelli e colaboradores, J. Biotechnol. 37: 109, 1994).Quando de glicosilação adicional, a proteína é proteoliticamente clivada emuma proteína madura heterodimérica de 190 kDa (1385 aminoácidos),consistindo da α-subunidade de 50 kDa (resíduos 1-307) e da β-subunidadede 145 kDa. O domínio de quinase de tirosina citoplásmico da β-subunidadeestá envolvido em transdução de sinal.

Várias abordagens diferentes foram investigadas para tentarobter uma molécula antagonística eficaz de HGF/cMET: proteínas de HGFtruncadas. tais como NKl (domínio N-terminal mais domínio kringle 1;Lokker e colaboradores, J. Biol. Chem. 268: 17145, 1993), NK2 (domínio N-terminal mais domínios kringle 1 e 2; Chan e colaboradores, Science 254:1382, 1991) e NK4 (domínio N-terminal mais quatro domínios kringle; Kubae colaboradores, Câncer Res. 60: 6737, 2000) e mAbs anti-cMet (Dodge,Master's Thesis, San Francisco State University, 1998).

Mais recentemente, Cao e colaboradores (Proc. Natl Acad. Sei.USA. 98: 7443, 2001, o qual é incorporado aqui por referência) reportaramque a administração de uma combinação de 3 mAbs ao HGF inibiu ocrescimento de xenoenxertos de glioma subeutâneo em camundongos. O WO2005/017107 A2, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidadepara todas as finalidades, reportou que tratamento com um único mAb anti-HGF poderia inibir o crescimento de xenoenxertos de glioma subeutâneo emcamundongos. Contudo, essas publicações não se dirigem à questão de se aadministração sistêmica de um mAb anti-HGF ou outro pode inibir ocrescimento de um tumor no cérebro, onde a barreira sangue-cérebrorepresenta obstáculos (Rich e colaboradores, Nat. Rev. Drug Discov. 3: 430,2004). Na verdade, a ineficácia anteriormente observada de terapias comanticorpo sistêmico contra tumores do sistema nervoso central (CNS) foiatribuída à permeabilidade vascular limitada mesmo para metástases do CNS(Bendell e colaboradores, Câncer 97: 2972, 2003).

Assim, há uma necessidade por um método para tratar tumorescerebrais através de administração sistêmica de um mAb. A presente invençãopreenche essa e outras necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade, a invenção proporciona um método detratamento de um tumor no cérebro em um paciente através de administraçãosistêmica de um mAb. O tumor no cérebro pode ser um glioma, tal como umastrocitoma, por exemplo, um glioblastoma. Administração pode ser, porexemplo, através das vias intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em umamodalidade preferida, o mAb é um mAb de neutralização ao Fator deCrescimento de Hepatócito (HGF), tal como um mAb L2G7 humanizado. Emoutra modalidade preferida, administração sistêmica de um mAb, tal como ummAb anti-HGF de neutralização, é usada para induzir à regressão de umtumor no cérebro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Atividades de ligação e bloqueio de mAbs anti-HGFmedida através de ELISA. A. Para ligação, mAbs foram capturados sobreuma lâmina de ELISA revestida com IgG anti-camundongo de cabra,bloqueadas com BSA e incubadas com HGF-Flag (1 μg/ml), seguido pormAb anti-Flag HRP-M2 (Invitrogen). B. Para bloqueio de HGF-Flag àligação Met-Fc, as lâminas foram revestidas com IgG-Fc anti-humano decabra, bloqueadas com BSA, incubadas com Met-Fc (2 μg/ml) e, então, comHGF-Flag (1 pg/ml) +/- mAbs anti-HGF. O HGF-Flag ligado foi detectadocom mAb anti-Flag HRP-M2.Figura 2. Efeitos de bloqueio do mAb L2G7 sobre asatividades de dispersão, mitogênica, angiogênica e anti-apoptótica de HGF.A. Células MDCK (ATCC) foram estimuladas com 50 ng/ml de HGF +/- 10μg/ml de L2G7 durante 2 dias conforme descrito (Cao e colaboradores, Proc.Natl Acad. Sei. USA. 98: 7443, 2001). Fotografias foram tiradas emampliação de IOOx após as células serem coradas com violeta cristal. B.Células epiteliais de pulmão de marta Mv 1 Lu (ATCC; 5 χ IO4 células/ml)foram incubadas em DMEM isento de soro com ou sem HGF (50 ng/ml) eL2G7 ou mAb de controle isotipo-equivalente (mlgG) durante 24 horas e onível de proliferação celular determinado através da adição de 3H-timidinadurante 6 horas. C. Conforme descrito (Xin e colaboradores Am. J. Pathol.158, 1111, 2001), HUYEC (CAMBREX; IO4 células/100 μΐ/cavidade) foramincubadas em EBM-2/FCS a 0,1% com ou sem HGF (50 ng/ml) e L2G7 oumAb de controle durante 72 horas e o nível de proliferação determinadoatravés da adição de WST-I. D. Conforme descrito (Xin e colaboradores Am.J. Pathol. 158, 1111, 2001), HUVEC (6 χ IO4 células/100 μΐ/cavidade) emDMEM/gel foram sobrepostas com 100 μΐ/cavidade de EMB-2/FCS a0,1%/BSA a 0,1% com ou sem 200 ng/ml de HGF +/- 20 μg/ml de L2G7.Após 48 horas de incubação, as células foram fixadas e coradas com azul detoluidina e fotografias tiradas em uma ampliação de 40x. E. Conformedescrito (Fan e colaboradores, Oncogene 24: 1749, 2005), células de tumorU87 em DMEM isento de soro foram tratadas com ou sem HGF (20 ng/ml)+/- mAb L2G7 (20 μg/ml) ou anticorpo de controle de isotipo (mlgG) durante48 horas e, então, com mAb anti-Fas CH-Il (Upstate Biotechnology, 40ng/ml) durante 24 horas e a viabilidade celular determinadas através da adiçãode WST-I. Em b, c e e, os valores são a média +/- s.d.

Figura 3. Inibição ou regressão de xenoenxertos de tumorglioma pelo L2G7. Células de tumor glioma Ul 18 (A) ou U87 (B) foramimplantadas subeutaneamente em camundongos Beges/Nus NTH III e otamanho do tumor monitorado conforme descrito (Kim e colaboradores,Nature 362: 841, 1993). Após o tamanho do tumor ter atingido -50 mm3,grupos de camundongos (n = 6 ou 7) foram tratados duas vezes por semanai.p. com 50 ou 100 μg de L2G7 ou 100 μg de mAb de controle de isotipo(mlgG) ou PBS conforme indicado; as setas mostram primeiro dia detratamento. Os valores são o volume médio do tumor +/- s.e.m. C. Células detumor U87 (IO5 por camundongo) foram injetadas intracranialmente nocaudado/putamen de camundongos Scid/beges conforme descrito (Abounadere colaboradores, FASEB J. 16, 108, 2002). Começando e terminando,respectivamente, no dia 5 e dia 52 conforme indicado pelas setas, aos gruposde camundongo (n = 10) foram administrados i.p. 100 μg de L2G7 ou PBSduas vezes por semana e a sobrevivência monitorada. Estudos desobrevivência foram analisados através de plotagens de Kaplan-Meier. D.

Seções de cérebro preparadas conforme descrito (Abounader e colaboradores,FASEB J. 16, 108, 2002) a partir de camundongos representativossacrificados no dia 21 após 3 doses de tratamento duas vezes por semana i.p.com 100 μg de L2G7 ou PBS, mostrando o tamanho dos xenoenxertosintracranianos de U87. E. Volumes de tumor U87 intracraniano noscamundongos individuais no Dia 18 antes de início de tratamento e no Dia 29após tratamento 3 vezes com L2G7. F. Seções de cérebro de camundongosrepresentativos no Dia 18 antes de tratamento e no Dia 29 após tratamentocom L2G7 ou mAb de controle.

Figura 4. Análise histológica de seções do cérebro decamundongos com xenoenxertos intracranianos U87. Os camundongos foramsacrificados após tratamento de tumores pré-estabelecidos com três dosesduas vezes por semana de L2G7 ou controle. Seções de criostato perfusão-fixadas foram coradas com H&E e o anticorpo indicado e os índicesquantificados usando análise de imagem computador-assistida. A. Anti-Ki67(DAKO) para detectar células em proliferação. B. Anti-Iaminina (LifeTechnologies) para detectar vasos sangüíneos. C. Anticorpo à caspase-3clivada (Cell Signaling Technology) para detectar respostas de célulatumorígena apoptótica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção proporciona um método de tratamento de tumorescerebrais através de administração sistêmica de um mAb de neutralização aoHGF ou anticorpos contra outras citocinas, tais como fatores de crescimentoou contra proteínas da superfície celular, tais como receptores de citocina.Embora uma compreensão do mecanismo não seja requerida para a prática dainvenção, acredita-se que o sucesso da invenção reside, pelo menos em parte,em virtude da passagem de anticorpo do sangue para tumores cerebraisdevido a uma barreira sangue-cérebro defectiva dentro dos tumores.

1. Anticorpos

Anticorpos são moléculas muito grandes, complexas (pesomolecular de -150.000 ou cerca de 1320 aminoácidos) com estrutura internaintrincada. Uma molécula de anticorpo natural contém dois pares idênticos decadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada.Cada cadeia leve e cadeia pesada, por sua vez, consiste de duas regiões: umaregião variável ("V") envolvida na ligação do antígeno alvo e uma regiãoconstante ("C") que interage com outros componentes do sistema imune. Asregiões variáveis de cadeia leve e pesada se dobram juntas em um espaçotridimensional para formar uma região variável que se liga ao antígeno (porexemplo, um receptor sobre a superfície de uma célula). Dentro de cadaregião variável de cadeia leve ou pesada, existem três segmentos curtos (emmédia 10 aminoácidos de comprimento) denominados regiões dedeterminação de complementaridade ("CDRs"). As seis CDRs em umdomínio variável de anticorpo (três da cadeia leve e três da cadeia pesada) sedobram juntas em um espaço tridimensional para formar o sítio de ligação deanticorpo real o qual se trava sobre o antígeno alvo. A posição e comprimentodas CDRs foram precisamente definidos. Kabat, E. e colaboradores,Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Healthand Human Services, 1983, 1987. A parte de uma região variável não contidanas CDRs é denominada a armação, a qual forma o ambiente para as CDRs.

Um anticorpo monoclonal (mAb) é uma espécie moléculaúnica de anticorpo e, portanto, não abrange anticorpos policlonais produzidosatravés de injeção de um animal (tal como um roedor, coelho ou cabra) comum antígeno e extração de soro do animal. Um anticorpo humanizado é umanticorpo geneticamente manipulado (monoclonal) no qual as CDRs de umanticorpo de camundongo ("anticorpo doador", o qual também pode ser derato, hâmster ou outra espécie similar) são enxertadas sobre um anticorpohumano ("anticorpo aceitador"). Anticorpos humanizados podem ser feitoscom menos do que as CDRs completas de um anticorpo de camundongo (porexemplo, Pascais e colaboradores, J. Immunol. 169: 3076, 2002). Assim, umanticorpo humanizado é um anticorpo tendo CDRs de um anticorpo doador earmação de região variável e regiões constantes de um anticorpo humano.Além disso, de forma a reter alta afinidade de ligação, pelo menos um de doiselementos estruturais adicionais pode ser empregado. Veja Patentes US No.5.530.101 e 5.585.089, cada uma das quais é incorporada aqui por referência,as quais proporcionam instruções detalhadas para construção de anticorpos humanizados.

No primeiro elemento estrutural, a armação da região variávelde cadeia pesada do anticorpo humanizado é escolhida para ter identidade deseqüência máxima (entre 65% e 95%) com a armação da região variável decadeia pesada do anticorpo doador, através de seleção adequada do anticorpoaceitador dentre os muitos anticorpos humanos conhecidos. No segundoelemento estrutural, na construção do anticorpo humanizado, aminoácidosselecionados na armação do anticorpo aceitador humano (fora das CDRs) sãosubstituídos por aminoácidos correspondentes do anticorpo doador, de acordocom regras específicas. Especificamente, os aminoácidos a serem substituídosna armação são escolhidos com base em sua capacidade de interagir com asCDRs. Por exemplo, os aminoácidos substituídos podem estar adjacentes auma CDR na seqüência do anticorpo doador ou dentro de 4-6 ângstroms deuma CDR no anticorpo humanizado, conforme medido no espaçotridimensional.

Um anticorpo quimérico é um anticorpo no qual a regiãovariável de um anticorpo de camundongo (ou outro roedor) é combinada coma região constante de um anticorpo humano; sua construção por meio deengenharia genética é bem conhecida. Tais anticorpos retêm a especificidadede ligação do anticorpo de camundongo, embora sejam cerca de dois-terçoshumanos, a proporção de seqüência não-humana presente em anticorpos decamundongo, quiméricos e humanizados sugere que a imunogenicidade deanticorpos quiméricos é intermediária entre anticorpos de camundongo ehumanizados. Outros tipos de anticorpos geneticamente manipulados quepodem ter imunogenicidade reduzida com relação a anticorpos decamundongo incluem anticorpos humanos feitos usando métodos de exibiçãode fago (Dower e colaboradores, W091/17271; McCafferty e colaboradores,W092/001047; Winter, W092/20791; e Winter, FEBS Lett. 23: 92, 1998,cada um dos quais é aqui incorporado por referência) ou usando animaistransgênicos (Lonberg e colaboradores, W093/12227; Kucherlapati,W091/10741, cada um dos quais incorporado aqui por referência).

Conforme usado aqui, o termo anticorpo "semelhante aohumano" se refere a um mAb no qual uma porção substancial da seqüência deaminoácido de uma ou ambas as cadeias (por exemplo, cerca de 50% ou mais)se origina de genes de imunoglobulina humana. Conseqüentemente,anticorpos semelhantes aos humanos abrangem, mas não estão limitados a,anticorpos humanizados e humanos. Conforme usado aqui, um "anticorpocom imunogenicidade reduzida" é um que se espera ter significativamentemenos imunogenicidade do que um anticorpo de camundongo quandoadministrado a pacientes humanos. Tais anticorpos abrangem anticorposquiméricos, humanizados e humanos, bem como anticorpos feitos através desubstituição de aminoácidos específicos em anticorpos de camundongo quepodem contribuir para epítopos de células B ou T, por exemplo, resíduosexpostos (Padlan, Mol. Immunol. 28: 489, 1991). Conforme usado aqui, umanticorpo "geneticamente manipulado" é um para o qual os genes foramconstruídos ou colocados em um ambiente não natural (por exemplo, geneshumanos em um camundongo ou um bacteriófago) com o auxílio de técnicasde DNA recombinante e, portanto, por exemplo, não abrangeria um mAb decamundongo feito com a tecnologia de hibridoma convencional.

O epítopo de um mAb está na região de seu antígeno ao qual omAb se liga. Dois anticorpos se ligam ao mesmo ou a um epítopo sobrepostose cada um inibe competitivamente (bloqueia) a ligação do outro ao antígeno.Isto é, um excesso de lx, 5x, IOx, 20x ou IOOx de um anticorpo inibe aligação do outro em pelo menos 50% mas, de preferência, 75%, 90% oumesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (veja,por exemplo, Junghans e colaboradores, Câncer Res. 50: 1495, 1990, o qual éincorporado aqui por referência). Alternativamente, dois anticorpos têm omesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácido noantígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem oueliminam a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos de sobreposição seas mesmas mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam a ligação deum anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.

2. Anticorpos anti-HGF de neutralização

Um anticorpo monoclonal (mAb) que se liga ao HGF (isto é,um mAb anti-HGF) é mencionado como neutralizando o HGF ou sendo deneutralização se ele inibe uma ou mais atividades biológicas do HGF (isto é,quando o mAb é usado como um único agente). Dentre as propriedadesbiológicas do HGF que um anticorpo de neutralização pode inibir, estão acapacidade do HGF de se ligar a seu receptor cMet, causar a dispersão dedeterminadas linhagens de células, tais como células de rim canino de Madin-Darby (MDCK); estimular a proliferação (isto é, ser mitogênico para) dedeterminadas células, incluindo hepatócitos, células epiteliais de macaco4MBr-5 e várias células de tumor humano; ou estimular angiogênese, porexemplo, conforme medido através de estimulação de proliferação de célulasendoteliais vasculares humanas (HUVEC) ou formação de tubo ou através deindução de vasos sangüíneos quando aplicados à membrana corioalantóica deembrião de galinha (CAM). Anticorpos usados na invenção, de preferência, seligam ao HGF humano, isto é, à proteína codificada pela seqüência doGenBank com número de Acesso D90334. Similarmente, um anticorpo deneutralização, isto é, antagonista, contra qualquer citocina ou receptor decitocina pode inibir a ligação da citocina ao receptor e/ou inibir a transmissãode um sinal à célula pela citocina. Se a citocina é um fator de crescimento, talcomo um anticorpo, ele pode inibir a proliferação de células induzidas pelacitocina.

Um mAb de neutralização usado na invenção inibe,tipicamente, em uma concentração, por exemplo, de 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10,20 ou 50 μg/ml, uma função biológica de uma citocina, por exemplo, HGF(por exemplo, estimulação de proliferação ou angiogênese) em cerca de pelomenos 50% mas, mais preferivelmente, 75%, mais preferivelmente em 90%ou 95% ou mesmo 99% e, ainda mais preferivelmente, aproximadamente100% (de modo essencialmente completo), conforme ensaiado pelos métodosdescritos sob Exemplos ou conhecidos na técnica. Tipicamente, a extensão deinibição é medida quando a quantidade de citocina usada é apenas suficientepara estimular completamente a atividade biológica ou é 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3 ou10 μ§/ηι1. De preferência, o mAb é de neutralização, isto é, inibe a atividadebiológica, quando usado como um único agente mas, em alguns métodos, doismAbs são usados juntos para proporcionar inibição. Mais preferivelmente, omAb neutraliza não apenas um, mas várias das atividade biológicas listadasacima; para as finalidades aqui, um mAb anti-HGF que é usado como umúnico agente que neutraliza todas as atividades biológicas do HGF édenominado "de neutralização total" e tais mAbs são mais preferíveis. mAbsusados na invenção são, de preferência, específicos para o HGF, isto é, elesnão se ligam ou se ligam apenas em um ponto muito menor, à proteínas quesão relacionadas ao HGF, tais como fator de crescimento de fibroblasto (FGF)e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os mAbs têm,tipicamente, uma afinidade de ligação (Ka) de pelo menos 107 M"1 mas, depreferência, 108 M"1 ou maior e, mais preferivelmente, 109 M"1 ou maior oumesmo 1010 M"1 ou maior.

Os mAbs usados na invenção incluem anticorpos em suaforma tetramérica natural (2 cadeias leves e 2 cadeias pesadas) e podem ser dequalquer um dos isotipos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE conhecidos e seussubtipos, isto é, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 humana e IgGl, IgG2a, IgG2b eIgG3 de camundongo. Os mAbs também se destinam a incluir fragmentos deanticorpos, tais como Fv, Fab e F(ab')2; anticorpos híbridos bifuncionais (porexemplo, Lanzavecchia e colaboradores, Eur. J. Immunol. 17: 105, 1987),anticorpos com cadeia simples (por exemplo, Huston e colaboradores, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879, 1988; Bird e colaboradores, Science 242: 423,1988); e anticorpos com regiões constantes alteradas (por exemplo, PatenteU.S. 5.624.821). Os mAbs podem ser de origem animal (por exemplo,camundongo, rato, hâmster ou galinha) ou eles podem ser geneticamentemanipulados. mAbs de roedores são feitos através de métodos padrões bemconhecidos na técnica, compreendendo imunização múltipla com HGF em umadjuvante apropriado i.p., i.v. ou na almofada da pata, seguido por extração decélulas do baço ou nódulo linfático e fusão com uma linhagem de célulaimortalizada adequada e, então, seleção por hibridomas que produzemanticorpo que se liga ao HGF, por exemplo, veja sob Exemplos. mAbsquiméricos e humanizados, feitos através de métodos conhecidos na técnicamencionados supra, são usados em modalidades preferidas da invenção.Anticorpos humanos feitos, por exemplo, através dos métodos de exibição defago ou camundongos transgênicos também são preferidos (veja, porexemplo, Dower e colaboradores, McCafferty e colaboradores, Winter,Lonberg e colaboradores, Kucherlapati, supra). Mais geralmente, anticorpossemelhantes aos humanos com imunogenicidade reduzida e geneticamentemanipulados, conforme definido aqui, são todos preferidos.

O mAb anti-HGF de neutralização L2G7 (depositado naAmerican Type Culture Collection sob o número ATCC PTA-5162 de acordocom o Tratado de Budapeste) é um exemplo preferido de um mAb para uso nainvenção. O depósito será mantido em um depositário autorizado e substituídono caso de mutação, inviabilidade ou destruição durante um período de pelomenos cinco anos após a solicitação mais recente para liberação de umaamostra ter sido recebido pelo depositário, durante um período de pelo menostrinta anos após a data do depósito ou durante a vida executável da patenterelacionada, qualquer período que seja mais longo. Todas as restrições sobre adisponibilidade ao público dessas linhagens de células será irrevogavelmenteremovida quando de emissão de uma patente a partir do pedido. mAbs deneutralização com o mesmo ou um epítopo de sobreposição que o L2G7proporcionam outros exemplos. Variantes de L2G7, tais como a formaquimérica ou humanizada de L2G7, são especialmente preferidas. Um mAbque compete com o L2G7 pela ligação ao HGF e neutraliza o HGF emensaios in vitro ou in vivo descrito aqui também é preferido. Outras variantesde L2G7, tais como mAbs que são 90%, 95% ou 99% idênticos ao L2G7quanto à seqüência de aminoácido da região variável (por exemplo, quandoalinhados através do sistema de numeração de Kabat; Kabat e colaboradores,op. cit.), pelo menos nas CDRs e mantêm suas propriedades funcionais ou osquais diferem do mesmo por um pequeno número de substituições deaminoácido funcionalmente sem conseqüências (por exemplo, substituiçõesconservativas), deleções ou inserções podem também ser usados na invenção.Outros mAbs preferidos incluem mAbs semelhantes aos humanos comimunogenicidade reduzida e geneticamente manipulados, conforme definido aqui.

Quaisquer substituições de aminoácido das imunoglobulinasexemplificadas são, de preferência, substituições de aminoácidoconservativas. Para fins de classificação de substituições de aminoácido comoconservativas ou não conservativas, os aminoácidos podem ser agrupadoscomo segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicos): met, ala, vai, leu, ile;Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III(cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn,gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação de cadeia):gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. Substituiçõesconservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe.Substituições não-conservativas constituem troca de um membro de umadessas classes por um membro de outra.

Ainda outros mAbs preferidos para uso na invenção incluemtodos os mAbs anti-HGF descritos no US 2005/0019327 Al ou WO2005/017107 A2, quer explicitamente pelo nome ou seqüência ouimplicitamente pela descrição ou relação aos mAbs explicitamente descritos(ambos os pedidos citados são aqui incorporados por referência por suadivulgação de anticorpos e todas as outras finalidades). mAbs especialmentepreferidos são aqueles produzidos pelos hibridomas designados aqui como1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 e 3.10.1 e,respectivamente, definidos por suas seqüências de região variável de cadeiapesada ou leve proporcionadas por SEQ ID NO1S 24-43 do W02005/017107A2; mAbs possuindo as respectivas CDRs conforme qualquer um daquelesmAbs listados; mAbs tendo regiões variáveis de cadeia leve e pesada que sãopelo menos 90%, 95% ou 99% idênticas às respectivas regiões variáveisdesses mAbs listados ou diferindo dos mesmos apenas por substituições,deleções ou inserções de aminoácido sem conseqüências; mAbs que se ligamao mesmo epítopo que o HGF conforme qualquer um desses mAbs listados etodos os mAbs abrangidos pelas reivindicações 1 a 94 aqui. Identidades deseqüência são determinadas entre seqüências de regiões variáveis deimunoglobulina alinhadas usando a convenção de numeração de Kabat.

Em outras modalidades, um mAb para uso na invenção, isto é,para o tratamento de um tumor no cérebro através de administração sistêmicado mAb, se liga a um ou mais dos seguintes fatores de crescimento: fator decrescimento de células endoteliais vasculares (VEGF); uma neurotrofina, talcomo fator de crescimento de nervo (NGF), fator neurotrófico derivado decérebro (BDNF) ou NT-3; um fator de transformação, tal como TGF-alfa ouTGF-beta (TGF-βΙ e/ou TGF-P2); um fator de crescimento plaqueta-derivado(PDGF); fator de crescimento epidérmico (EGF); heregulina; epiregulina;enfiregulina; uma neuregulina (NRG-Ia e/ou NRG-I β, NRG-2a e/ou NRG-2β, NRG-3 ou NRG-4), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1e/ou IGF-2); ou, em uma modalidade preferida, um fator de crescimento defibroblasto (FGF), especialmente FGF ácido (FGF-I) ou, maispreferivelmente, FGF básico (FGF-2) mas, alternativamente, FGF-n, onde η équalquer número de 3 a 23. Em geral, tal mAb é de neutralização. Em aindaoutras modalidades, o mAb para uso na invenção se liga a um receptor celularpara qualquer um ou mais dos fatores de crescimento mencionados acima.

mAbs nativos para uso na invenção podem ser produzidos apartir de seus hibridomas. mAbs geneticamente manipulados, por exemplo,mAbs quiméricos ou humanizado, podem ser expressos através de umavariedade de métodos conhecidos. Por exemplo, genes que codificam suasregiões V de cadeia leve e pesada podem ser sintetizados a partir deoligonucleotídeos de sobreposição e inseridos, junto com regiões Cdisponíveis, em vetores de expressão (por exemplo, comercialmentedisponíveis da Invitrogen) que proporcionam as regiões regulatóriasnecessárias, por exemplo, promotores, intensificadores, sítios de poli A, etc.Uso do promotor-intensifcador de CMV é preferido. Os vetores de expressãopodem, então, ser transferidos usando vários métodos bem conhecidos, taiscomo lipofecção ou eletroporação em uma variedade de linhagens de célulasde mamífero, tais como CHO ou mielomas de não-produção, incluindo Sp2/0e NSO e células expressando os anticorpos selecionados através de seleçãocom antibiótico apropriado. Veja, por exemplo, Patente US No. 5.530.101.Quantidades maiores de antibiótico podem ser produzidas através decrescimento das células em bio-reatores comercialmente disponíveis.

Uma vez expressos, os mAbs ou outros anticorpos para uso nainvenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrões natécnica, tais como microfiltração, ultrafiltração, cromatografia de afinidadeem proteína A ou G, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografiade troca de ânions, cromatografia de troca de cátions e/ou outras formas decromatografia por afinidade baseado em corantes orgânicos ou semelhante.Anticorpos substancialmente puros, com homogeneidade de pelo menos cercade 90 ou 95%, são preferidos e homogeneidade de 98% ou 99% ou mais sãomais preferidos para uso farmacêutico.3. Métodos Terapêuticos

Em uma modalidade preferida, a presente invençãoproporciona um método de tratamento com uma formulação farmacêuticacompreendendo um mAb descrito aqui. Formulações farmacêuticas dosanticorpos contêm o mAb em um veículo fisiologicamente aceitável,opcionalmente com excipientes ou estabilizantes, na forma de soluçõesaquosas ou liofilizadas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis sãonão tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas eincluem tampões, tais como fosfato, citrato ou acetato em um pH tipicamentede 5,0 a 8,0, mais freqüentemente 6,0 a 7,0; sais, tais como cloreto de sódio,cloreto de potássio, etc. para tornar isotônica; antioxidantes, conservantes,polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas, polímeros hidrofílicos, talcomo polisorbato 80, aminoácidos, carboidratos, agentes de quelação,açúcares e outros ingredientes padrões conhecidos por aqueles habilitados natécnica (Remington's Pharmaceutical Science, 16a edição, Osol, A. Ed. 1980).O mAb está, tipicamente, presente em uma concentração de 1-100 mg/ml, porexemplo, 10 mg/ml. O mAb também pode ser encapsulado em agentesveículo, tais como lipossomas.

Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona ummétodo de tratamento de um paciente com um tumor no cérebro através deadministração sistêmica de um mAb, tal como um mAb anti-HGF deneutralização ou um anticorpo contra uma citocina ou seu receptor. Opaciente é, de preferência, um ser humano, mas pode ser qualquer mamífero.Por administração sistêmica, entenda-se aqui uma via de administração naqual o mAb tem acesso geral ao sistema circulatório e, portanto, aos órgãosdo corpo, incluindo os vasos sangüíneos do cérebro. Em outras palavras, omAb é administrado sobre o lado periférico da barreira sangue-cérebro.Exemplos de administração sistêmica incluem infusão intravenosa ou injeçãode bolo ou intramuscularmente ou subcutaneamente ou intraperitonealmente.Contudo, administração sistêmica não abrange injeção diretamente ao tumorou em um órgão, tal como o cérebro ou suas membranas circundantes oufluido cérebro-espinhal. Infusão intravenosa pode ser fornecida durante tãopouco quanto 15 minutos, mas mais freqüentemente durante 30 minutos oudurante 1, 2, 3 ou mesmo 4 ou mais horas. A dose fornecida é suficiente paracurar, aliviar pelo menos parcialmente ou inibir desenvolvimento adicional dacondição que está sendo tratada ("dose terapeuticamente eficaz"). Uma doseterapeuticamente eficaz causa, de preferência, regressão ou, maispreferivelmente, eliminação do tumor. Uma dosagem terapeuticamente eficazé, usualmente, de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4mg/kg, mas pode ser tão alta quanto 10 mg/kg ou mesmo 15 ou 20 mg/kg.Uma dose unitária fixa também pode ser fornecida, por exemplo, 50, 100,200, 500 ou 1000 mg ou a dose pode ser baseada na área de superfície dopaciente, por exemplo, 100 mg/m . Uma dosagem terapeuticamente eficazadministrada em uma freqüência suficiente para curar, aliviar pelo menosparcialmente ou inibir desenvolvimento adicional da condição que está sendotratada é referida como um regime terapeuticamente eficaz. Tal regime causa,de preferência, regressão ou, mais preferivelmente, eliminação do tumor.Usualmente, entre 1 e 8 doses (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) sãoadministradas para tratar câncer, mas 10, 20 ou mais doses podem serfornecidas. O mAb pode ser administrado diariamente, bi-semanalmente,semanalmente, semana sim, semana não, mensalmente ou em algum outrointervalo dependendo, por exemplo, da meia-vida do mAb, durante 1 semana,2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses ou mais. Cursos repetidos detratamento também são possíveis, assim como a administração crônica.

Os métodos da presente invenção, por exemplo, administraçãosistêmica de um mAb, tal como mAb anti-HGF, especialmente L2G7 e suasvariantes, incluindo L2G7 humanizado, pode ser usado para tratar todos ostumores cerebrais, incluindo meningiomas; gliomas, incluindo ependimomas,oligodendrogliomas e todos os tipos de astrocitomas (baixo grau, anaplásticoe glioblastoma multiforme ou simplesmente glioblastoma); medulablastomas,gangliogliomas, schwanomas, cordomas; e tumores cerebrais primariamentede crianças, incluindo tumores neuroectodérmicos primitivos. Tumorescerebrais primários (isto é, originários no cérebro) e secundários ou tumorescerebrais metastáticos podem ser tratados através dos métodos da invenção,tumores cerebrais que expressam Met e/ou HGF, especialmente em níveiselevados, são particularmente adequados para tratamento através deadministração sistêmica de um anticorpo anti-HGF de neutralização, tal comoL2G7 ou suas variantes.

Em uma modalidade preferida, o mAb é administrado juntoem combinação (isto é, antes, durante ou após) com outra terapia anti-câncer.Por exemplo, o mAb, por exemplo, um mAb anti-HGF, tal como L2G7 e suasvariantes, pode ser administrado junto com qualquer um ou mais dosfármacos quimioterapêuticos conhecidos por aqueles habilitados na técnica deoncologia, por exemplo, agentes de alquilação, tais como carmustina,clorambucil, cisplatina, carboplatina, oxiplatina, procarbazina eciclofosfamida; anti-metabólitos, tais como fluorouracila, floxuridina,fludarabina, gemcitabina, metotrexato e hidroxiuréia; produtos naturais,incluindo alcalóides vegetais e antibióticos, tais como bleomicina,doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, etoposídeo, mitomicina,mitoxantrona, vinblastina, vincristina e Taxol (paclitaxel) ou compostosrelacionados, tal como Taxotere®; agentes especificamente aprovados paratumores cerebrais, incluindo temozolomida e wafer Gliadel® contendocarmustina; e outros fármacos, incluindo irinotecan e Gleevec® e todos osagentes anti-câncer experimentais e aprovados listados no WO 2005/017107Al (o qual é aqui incorporado por referência). O mAb pode ser administradoem combinação com 1, 2, 3 ou mais desses agentes, por exemplo, em umregime quimioterapêutico padrão. Outros agentes com os quais um mAb anti-HGF pode ser administrado incluem produtos biológicos, tais comoanticorpos monoclonais, incluindo Herceptin™ contra o antígeno HER2,Avastin™ contra VEGF, anticorpos ao receptor de EGF, tal como Erbitux®,ou um mAb anti-FGF, bem como fármacos antagonistas do receptor de EGFou anti-angiogênicos de pequena molécula, tais como Iressa® e Tarceva®.Além disso, o mAb pode ser administrado junto com qualquer forma deterapia por radiação, incluindo radiação de feixes externos, terapia porradiação com intensidade modulada (IMRT) e qualquer forma de radio-cirurgia, incluindo Gamma Knife, Cyberknife, Linac e radiação intersticial(por exemplo, sementes radioativas implantadas, balão GliaSite).

Embora, em uma modalidade preferida da invenção, o mAbnão seja ligado ou conjugado a qualquer outro agente, em outras modalidadeso mAb pode ser conjugado a um radioisótopo, fármaco quimioterapêutico oupró-fármaco ou uma toxina. Por exemplo, ele pode ser ligado a umradioisótopo que emite raios alfa, beta e/ou gama, por exemplo, 90Y,radioisótopos de iodo, tal como 1311, ou isótopos de bismuto, tais como212Bi ou 214Bi; a uma toxina de proteína bacteriana ou de planta, tal comoricina ou exotoxina de pseudomonas ou seus fragmentos, tal como PE40; auma toxina de pequena molécula, tais como compostos relacionados a ouderivados de calicheamicina, auristatina ou maytansina; ou a um fármacoquimioterapêutico, tal como doxorubina ou qualquer um dos outros fármacosquimioterapêuticos listados acima. Métodos de ligação de tais agentes a ummAb são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Administração sistêmica de um mAb, por exemplo, um mAbanti-HGF de neutralização, tal como L2G7 ou suas variantes, opcionalmentemais outro tratamento (por exemplo, quimioterapia ou terapia por radiação),pode aumentar a sobrevivência média de progressão livre ou tempo desobrevivência global de pacientes com determinados tumores cerebrais (porexemplo, glioblastomas) em pelo menos 30% ou 40% mas, de preferência,50%, 60% a 70% ou mesmo 100% ou mais, comparado com um regime decontrole sem administração do mAb. Se administração de mAb anti-HGF éacompanhada por outro tratamento, tal como quimioterapia ou radiação, ooutro tratamento também é incluído no regime de controle. Se o mAb anti-HGF é administrado sem outro tratamento, o regime de controle é um placeboou nenhum tratamento específico. Além disso ou alternativamente,administração sistêmica de um mAb, por exemplo, um mAb anti-HGF deneutralização, tal como L2G7 ou suas variantes, mais outro tratamento (porexemplo, quimioterapia ou terapia por radiação) pode aumentar a taxa deresposta completa (regressão completa do tumor, isto é, remissão), taxa deresposta parcial (uma resposta parcial em um paciente significa retraçãoparcial do tamanho do tumor, por exemplo, em pelo menos 30% ou 50%) outaxa de resposta objetiva (completa + parcial) de pacientes com determinadostumores cerebrais em pelo menos 30% ou 40% dos pacientes mas, depreferência, 50%, 60% a 70% ou mesmo 90% ou mais comparado com umregime de controle sem administração do mAb, conforme descrito acima.Alterações no tamanho de um tumor responsivo ao tratamento podem serdeterminadas através de MRI, exploração por CT e semelhantes.

Similarmente, quando sistemicamente administrado a animais(por exemplo, camundongos imunodeficientes, tais como camundongos nusou camundongos SCID) trazendo xenoenxertos intracranianos de tumores deglioma humano, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2 abaixo, omAb anti-HGF de neutralização ou mAb anti-FGF ou outro mAb, prolongaráa sobrevivência media dos animais em pelo menos cerca de 25 ou 30 ou 40dias mas, de preferência, 50, 6 0 ou 70 dias ou mesmo mais e tal extensão seráestatisticamente significativa. Isso será verdadeiro mesmo quando início detratamento é retardado em até pelo menos 5 ou 18 dias ou mais após implanteda célula tumorígena. Além disso, tal tratamento irá causar retração média dostumores em pelo menos 25% mas, de preferência, 50% ou mesmo 75%; e ovolume médio de tumor em animais tratados com o mAb será de menos de50% ou mesmo 25% ou 10% do volume médio de tumor em animais tratadoscom controle. O tamanho do tumor será, tipicamente, medido 21 ou 29 diasapós implante da célula tumorígena.

Tipicamente, em um experimento clínico (por exemplo, umexperimento em fase II, fase II/III ou fase III), os aumentos antesmencionados na sobrevivência média de progressão livre e/ou taxa deresposta dos pacientes tratados através de administração de um mAb, porexemplo, um mAb anti-HGF, opcionalmente mais outro tratamento, comrelação a pacientes que receberam um regime de controle sem o anticorpo,são estatisticamente significativos, por exemplo, ao nível ρ = 0,05 ou 0,01 oumesmo 0,001. As taxas de resposta completa e parcial são determinadasatravés de critérios objetivos comumente usados em experimentos clínicospara câncer, por exemplo, conforme listado ou aceito pelo National CâncerInstitute e/ou Food and Drug Administration.

EXEMPLOS

1. Geração e propriedades in vitro de mAbs anti-HGF

O desenvolvimento de um mAb anti-HGF totalmente deneutralização L2G7 foi descrito na Pub. de Pedido de Patente U.S. No. US2005/0019327 Al, a qual é incorporada aqui por referência. Em resumo,camundongos Balb/c foram extensivamente imunizados com HGF humanorecombinante através de injeções na almofada da pata e hibridomas foramgerados a partir dos mesmos através de meios convencionais. Proteínas defusão quiméricas consistindo de HGF fundido ao peptídeo Flag (HGF-Flag) eo domínio extracelular de Met fundido à região Fc de IgG humana (Met-Fc)foram produzidos através de técnicas recombinantes convencionais e usadospara determinar a capacidade dos mAbs anti-HGF de inibir a ligação de HGFa seu receptor Met. A Fig. Ia demonstra a capacidade de três mAbs anti-HGFdistintos, cada um reconhecendo um epítopo diferente para capturar HGF emsolução. Embora o mAb de IgG2a L2G7 tenha afinidade intermediária peloHGF, conforme julgado pela capacidade de ligação, ele é o único mAbidentificado que bloqueia completamente a ligação de HGF-Flag a Met-Fc emum ELISA (Fig. lb). O mAb L2G7 é específico para o HGF, uma vez que elenão mostra ligação a outros fatores de crescimento, tais como VEGF, FGF ouEGF.

A capacidade do mAb L2G7 de bloquear a ligação de HGF aoMet sugeria que ele inibiria todas as respostas celulares HGF-induzidas, masessa suposição requeria verificação, em virtude do fato de as subunidades α eβ do HGF mediarem diferentes atividades (Lokker e colaboradores, EMBO J.11: 2503, 1992; Hartmann e colaboradores, Proc. Natl Acad. Sei. USA 89:11574, 1992). Uma bioatividade importante do HGF mediada através de suaα-subunidade, a partir da qual seu nome alternativo "fator de dispersão"deriva, é a capacidade de induzir à dispersão celular. A Fig. 2a mostra que oL2G7 é capaz de inibir completamente a dispersão HGF-induzida de célulasepiteliais MDCK, um ensaio biológico amplamente usado para quantificaçãoda atividade de dispersão do HGF. Uma atividade biológica chave do HGFmediada por sua subunidade β é a mitogênese de determinados tipos decélulas. A Fig. 2b mostra que o L2G7, em uma proporção molar de mAb paraHGF de 1:1, inibe completamente a incorporação de 3H-timidina HGF-induzida em células epiteliais de pulmão de marta Mv 1 Lu. Assim, o mAbL2G7 bloqueia atividades biológicas HGF-induzidas atribuíveis àssubunidades α e β do HGF.

Angiogênese é requerida para crescimento de tumores sólidos.O HGF é um potente fator angiogênico (Grant e colaboradores, Proc. NatlAcad. Sei. USA 90: 1937, 1993) e os níveis de HGF em tumor secorrelacionam com a densidade vascular de malignidades humanas, incluindogliomas (Schmidt, e colaboradores Int. J. Câncer 84: 10, 1999). O HGFtambém pode estimular a produção de outros fatores angiogênicos, tal comoVEGF, e pode potencializar a angiogênese VEGF-induzida (Xin ecolaboradores Am. J. Pathol. 158, 1111, 2001). Duas etapas precocesenvolvidas em angiogênese são proliferação de células endoteliais e formaçãode túbulo. O efeito do L2G7 sobre a proliferação HGF-induzida de célulasendoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) e formação de túbulossemelhantes a vasos em géis de colágenos tridimensionais foi, portanto,determinado. Estimulação de proliferação de HUVEC pelo HGF (50 ng/ml,72 h) foi completamente inibida pelo L2G7 em uma proporção molar de mAbpara HGF de 1,5:1 (Fig. 2c). HUVECs foram suspensas em géis de colágeno3-D desenvolvidos em uma rede de túbulos com ramificação interconectadaapós estimulação com HGF (200 ng/ml, 48 h), enquanto que células tratadascom HGF mais L2G7 mostraram pouca ou nenhuma formação de tais túbulos(Fig. 2d). Conseqüentemente, o L2G7 bloqueia os aspectos proliferativos emorfogênicos HGF-induzidos de angiogênese.

O HGF protege células tumorígenas de morte apoptóticainduzida por numerosas modalidades, incluindo agente que danificam o DNAcomumente usados em terapia de câncer (Bowers e colaboradores CâncerRes. 60: 4277, 2000; Fan e colaboradores Oncogene 24: 1749, 2005). Amaioria das células de glioma maligno humano expressam o receptor demorte FAS, tornando as mesmas suscetíveis à apoptose induzida peloanticorpo anti-FAS in vitro (Weller e colaboradores J. Clin. Invest. 94: 954,1994). Assim, os efeitos do L2G7 sobre a citoproteção HGF-mediada decélulas de glioma U87 tratadas com mAb anti-FAS apoptótico CH-Il foramdeterminados. A viabilidade de células U87 após tratamento com CH-Il (24h) foi reduzida para ~45% daquela em controles não tratados, um efeito quefoi completamente revertido através de pré-incubação das células com HGFna presença de um anticorpo de controle de isotipo irrelevante, mas não peloHGF na presença de L2G7 (Fig. 2e).

2. Efeitos de mAb anti-HGF em modelos de tumor de xenoenxerto deglioma

A capacidade do L2G7 de bloquear múltiplas atividade depromoção de tumor do HGF sugeria que essa HGF teria atividade anti-tumorcontra pelo menos tumores humanos HGF+/Met+. A maioria dos gliomasparece expressar Met e HGF (Rosen e colaboradores Int. J. Câncer 67: 248,1996). Para as linhagens de células de glioma U87 e Ul 18, expressão de Metfoi confirmada através de análise citométrica de fluxo e -20-35 ng/ml de HGFem sobrenadantes de culturas confluentes de 7 dias de idade usando umELISA HGF-específico foram detectados. O efeito anti-tumor do L2G7 emmodelos com camundongos nus de xenoenxertos subcutâneos de Ul 18 e U87preestabelecidos foi determinado. L2G7 foi administrado i.p. duas vezes porsemana após os tamanhos do tumor terem atingido ~50 mm3, conformedescrito (Kim e colaboradores, Nature 362: 841, 1993, o qual é aquiincorporado por referência). A 100 μg (~5 mg/kg) por injeção, o L2G7 inibiucompletamente o crescimento de tumores Ul 18 (Fig. 3a). No modelo dexenoenxerto de U87, 50 μg ou 100 ^g de L2G7 por injeção não apenasinibiram o crescimento do tumor, mas realmente causaram regressão do tumor(Fig. 3b). mAb de controle (100 μg por injeção) inibiu apenas ligeiramente ocrescimento de tumor comparado com controle de PBS. L2G7 não teve efeitosobre o crescimento de xenoenxertos de tumor de glioma U251, o qualexpressa Met, mas não secreta HGF. Esses resultados in vivo demonstram queo L2G7, como um único agente, previne o crescimento do tumor através debloqueio específico da atividade de HGF.

Em seguida, a eficácia do L2G7 foi examinada emcamundongos trazendo xenoenxertos de glioma U87 intracranianos pré-estabelecidos. Os camundongos foram implantados com células de gliomamaligno humano U87 (100.000 células/animal) através de injeçãoestereotática no caudado/putamen direito. L2G7 (100 μg/injeção, i.p., duasvezes por semana) administrado do dia 5 pós-implante ao dia 52, prolongousignificativamente a sobrevivência do animal (Fig. 3c). Em camundongos decontrole, a sobrevivência média era de 39 dias e todos os camundongosmorreram de tumores progressivos no dia 41. Em contraste, todos oscamundongos tratados com L2G7 sobreviveram até o dia 70 e 80%sobreviveram até o dia 90, sete semanas após término de tratamento commAb (Fig. 3c). Em camundongos sacrificados, no dia 21 após três doses deL2G7, tumores de controle eram mais de 10 vezes maiores do que os tumorestratados com L2G7 (6,6 + 2,7 mm3 vs. 0,54 + 0,17 mm3) (Fig. 3d).Para testar a eficácia do mAb sob condições ainda maisrigorosas, em um experimento similar, início de tratamento com L2G7 foiretardado até o dia 18. Um subconjunto de camundongos (n = 5 por grupo) foisacrificado precocemente no curso de tratamento e os volumes do tumorforam quantificados através de medição das áreas seccionais transversais dotumor de seções de cérebro coradas com H&E usando análise de imagemcomputador-assistida. O L2G7 induziu à regressão substancial de tumor (Fig.3e, f). Especificamente, volumes do tumor pré-tratamento no dia 18 eram de26,7 + 2,5 mm3 (faixa de 19,5-54 mm3, média de 27,9 mm3). No dia 29, após3 doses de L2G7, os tumores tinham apenas 11,7 + 5,0 mm (faixa de 0- 26,2mm , média de 7,5 mm ), de modo que os tumores tinham realmenteregredido ou o tamanho retraído em média em 50% ou mais. Volumes dotumor no dia 29 de camundongos tratados com mAb de controle isotipo-equivalentes eram de 134,3 + 22,0 mm (faixa de 71,2-196,8 mm , média de128 mm). Conseqüentemente, tumores tratados com mAb de controlecresceram aproximadamente 5 vezes, com um volume médio 12 vezes maiordo que os tumores tratados com L2G7. Nos camundongos que não foramsacrificados (η = 10 por grupo), a sobrevivência média nos camundongos decontrole era de 32 dias e todos morreram pelo dia 42, enquanto que nenhumdos camundongos tratados com L2G7 morreu até o dia 46 e o L2G7prolongou a sobrevivência média para o dia 61. Assim, o L2G7 induziu àregressão de tumor em camundongos com cargas muito altas de tumor.

Uma análise mais detalhada de seções histológicas de tumoresintracranianos foi realizada para investigar os mecanismos potenciais dosefeitos anti-tumor do L2G7 (Fig. 4). Após três doses de L2G7, proliferação decélulas tumorígenas (índice de Ki-67) e angiogênese (densidade do vaso, istoé, área de vasos tumorígenos corados com anti-laminina como percentual daárea de tumor) foi reduzida em 51% e 62% respectivamente, enquanto que oíndice apoptótico de células tumorígenas quantificado pelo número de célulaspositivas para caspase-3 ativadas foi aumentado em 6 vezes. A regressão detumor pronunciada que ocorreu tão logo após início de terapia com L2G7 éindicativa de uma resposta de morte celular similar àquela observada emxenoenxertos de tumor de cólon humano Colo 205 tratados com um mAbanti-receptor 4 de morte (TRAILl) agonista (Chuntharapai e colaboradores J.Immunol. 166:4891,2001).

Os resultados reportados aqui são um exemplo impressionantede respostas de tumor cerebral a um mAb não relacionado a uma toxina ouradionuclídeo. Como uma comparação, em modelos de xenoenxertosubcutâneo, o mAb anti-VEGF de murino A4.6.1, o qual foi depoishumanizado para criar o fármaco Avastin®, inibiu o crescimento do gliomahumano G55 em apenas -50-60% (Kim e colaboradores, Nature 362: 841,1993), contrastando com inibição de crescimento essencialmente completados gliomas U87 e Ul 18 pelo mAb L2G7. Em um modelo de tumorintracraniano ortotópico, mAb anti-VEGF sistêmico administradosimultaneamente com implante de células de glioma G55 prolongou asobrevivência do animal em apenas 2-3 semanas (Rubenstein e colaboradores,Neoplasia 2: 306, 2000). Similarmente, administração sistêmica de um mAb auma variante do receptor de EGF prolongou a sobrevivência média decamundongos com xenoenxertos intracranianos de células de gliomatransfectados com o receptor de EGF variante, em geral modestamente (de 13a 21 dias ou de 13 a 19 dias, mas em um caso de 19 a 58 dias; Mishima ecolaboradores, Câncer Res. 61: 4349, 2001). Contudo, esses efeitos modestosforam obtidos quando administração do mAb começou simultaneamente comou exatamente após implante do xenoenxerto e, conseqüentemente,provavelmente foram causados, pelo menos em parte, pelo retardo no iníciode vascularização do xenoenxerto, um evento que não pode ser objetivado empacientes com tumores cerebrais pré-existente. Em contraste, administraçãosistêmica de mAb anti-HGF L2G7 prolongou a sobrevivência e causouregressão do tumor mesmo quando administrado no Dia 5 ou mesmo no Dia18 após implante, quando os tumores estavam bem estabelecidos e, assim,corresponde à situação em pacientes humanos.

Os efeitos anti-tumor pronunciados do mAb L2G7 sãoprovavelmente em virtude das propriedades multifuncionais únicas de seualvo molecular, HGF, isto é, mitogênicas, angiogênicas e citoprotetoras(Birchmeier e colaboradores, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 915, 2003;Trusolino e colaboradores Nat. Rev. Câncer 4: 289, 2002). A capacidade doL2G7 de induzir à regressão de glioma implica em uma resposta de mortecelular que poderia resultar de apoptose Fas-mediada, a qual é bloqueadaatravés de ligação de HGF ao Met (Wang e colaboradores, Cell. 9: 411, 2002)ou de inativação de vias citoprotetoras HGF-induzidas que envolvem aquinase-3 de fosfatidil inositol, Akt e intermediários de NF-kappaB (Fan ecolaboradores, Oncogene 24: 1749, 2005). A capacidade do L2G7 debloquear os efeitos citoprotetores e angiogênicos do HGF prevê que o L2G7distribuído sistemicamente potencializa modalidades citotóxicas, tais como γ-radiação e quimioterapia atualmente usadas para tratar tumores cerebraismalignos.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência àmodalidades presentemente preferidas, será compreendido que váriasmodificações podem ser feitas sem se desviar da invenção.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadossão aqui incorporados por referência em sua totalidade para todas asfinalidades até o mesmo ponto como se cada publicação, patente e pedido depatente individual fosse específica e individualmente indicado como sendoincorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

Claims (23)

1. Uso de um anticorpo monoclonal (mAb), caracterizado pelofato de ser na preparação de um medicamento para tratar um tumor cerebralem um paciente.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fatodo mAb ser quimérico, humanizado ou humano.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fatodo mAb ser um mAb anti-HGF de neutralização.

4. Uso de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fatodo mAb ser um mAb L2G7 humanizado.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fatodo mAb ser administrado intravenosamente.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fatodo tumor cerebral ser um glioma.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fatodo tumor cerebral ser um glioblastoma.

8. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fatodo paciente ser um ser humano.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fatodo paciente também ser tratado com terapia por radiação.

10. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelofato do mAb ser administrado junto com um ou mais fármacos anti-câncerativos.

11. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelofato do mAb se ligar a um fator de crescimento selecionado do grupoconsistindo de: fator de crescimento de células endoteliais vasculares(VEGF); fator de crescimento de nervo (NGF), fator neurotrófico derivado decérebro (BDNF), NT-3, fator de crescimento de transformação (TGF)-alfa(TGF-a), TGF-βΙ, TGF-β2, fator de crescimento plaqueta-derivado (PDGF),fator de crescimento epidérmico (EGF); heregulina, epiregulina, enfiregulina,neuregulina (NRG)-Ialfa (NRG-Ια), NRG-Iβ, NRG-2a, NRG-2P, NRG-3,NRG-4, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-I (IGF-1), IGF-2,fator de crescimento de fibroblasto ácido (FGF) (FGF-1), FGF básico (FGF--2) e FGF-n, onde η é qualquer número de 3 a 23.

12. Uso de um anticorpo monoclonal (mAb), caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para causar regressão deum tumor cerebral em um paciente.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do mAb ser quimérico, humanizado ou humano.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do mAb ser um mAb anti-HGF de neutralização.

15. Uso de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelofato do mAb ser um mAb L2G7 humanizado.

16. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do mAb ser administrado intravenosamente.

17. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do tumor cerebral ser um glioma.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelofato do tumor cerebral ser um glioblastoma.

19. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do paciente ser um ser humano.

20. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do paciente também ser tratado com terapia por radiação.

21. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do mAb ser administrado junto com um ou mais fármacos anti-câncerativos.

22. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelofato do mAb se ligar a um fator de crescimento selecionado do grupoconsistindo de: fator de crescimento de células endoteliais vasculares(VEGF); fator de crescimento de nervo (NGF), fator neurotrófico derivado decérebro (BDNF), NT-3, fator de crescimento de transformação (TGF)-alfa(TGF-a), TGF-β 1, TGF-p2, fator de crescimento plaqueta-derivado (PDGF),fator de crescimento epidérmico (EGF); heregulina, epiregulina, enfiregulina,neuregulina (NRG)-Ialfa (NRG-Ια), NRG-Iβ, NRG-2a, NRG-2p, NRG-3,NRG-4, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-I (IGF-1), IGF-2,fator de crescimento de fibroblasto ácido (FGF) (FGF-1), FGF básico (FGF-2) e FGF-n, onde η é qualquer número de 3 a 23.

23. Uso de um anticorpo anti-HGF de neutralizaçãocaracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento paratratamento de um tumor cerebral através de administração sistêmica.