BRPI0507353B1 - microrganismo produtor de l-treonina tendo gene tyrr inativado e método de produção de l-treonina usando o mesmo - Google Patents

Abstract

métodos de produção de l-treonina e de microrganismo produtor de l-treonina e microrganismo são providos um microrganismo capaz de produzir l-treonina e ter um gene tyrr inativado, um método de produção do mesmo e um método de produção de l-treonina, que usa o microrganismo. o microrganismo pode ser usado para produzir l-treonina, sob rendimento elevado.

Description

“MICRORGANISMO PRODUTOR DE L-TREONINA TENDO GENE tyrR INATIVADO E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA USANDO O MESMO” RELATÓRIO DESCRITIVO Campo Técnico A presente invenção relaciona-se a um microorganismo que tem um gene tyrR inativado, um método de produção do mesmo e um método de produção de L-treonina que usa o microorganismo.

Estado da Técnica A L-treonina é um aminoácido essencial e é extensamente usada como alimento e aditivo de alimento e também como matéria-prima e farmacêutica para sintetizar algumas drogas. Foi produzida por fermentação com mutantes artificiais do gênero Escherichia, bactérias Coryneform, Seratia e Providencia. Por exemplo, a Publicação de Patente Japonesa 10037/81 revela um método de produção de L-treonina que usa uma cepa que pertence ao gênero Escherichia que tem uma exigência de ácido diaminopimélico e metionina e tem resistência à inibição de rea-limentação por treonina do sistema biossintético de treonina. O Pedido de Patente Japonês Aberto 224684/83 revela um método de produção de L-treonina que usa uma cepa que pertence ao gênero Brevibacterium que é resistente a S-(2-aminoetil)-L-cisteína e ácido a-amino-p-hidroxi-valé-rico e tem uma exigência nutricional de L-isoleucina e L-lisina. O Pedido de Patente Coreano Aberto 8022/87 revela um método de produção de L-treonina que usa uma cepa com exigência de ácido diaminopimélico e metionina, resistente ao ácido a-amino-p-hidroxi valérico, pertencente ao gênero Escherichia, que tem uma resistência adicional a pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em rifampicina, lisina, metionina, ácido aspártico e homosserina ou tem uma capacidade reduzida de decompor a L-treonina. O Pedido de Patente Japonês Aberto 219582/90 revela um método de produção de L-treonina que usa uma cepa pertencente ao gênero Providencia que é resistente ao ácido a- aimno-p-hidroxi valérico, L-etionina, tia-isoleucina, oxitiamina e sulfa-guanidina e tem uma exigência de L-leucina e também uma exigência imperfeita de L-isoleucina.

Contudo, os métodos acima conhecidos têm as desvantagens de que falham em proporcionar uma alta produção de L-treonina ou exigir requisitos dispendiosos, tais como ácido di-aminopimélico e isoleuci-na. Noutras palavras, o uso de cepas que exigem ácido diaminopimélico na produção de L-treonina inclui uma fermentação adicional de ácido diaminopimélico e, deste modo, pode aumentar o custo. No caso em que é usada uma cepa que tem uma exigência de isoleucina para a produção de L-treonina, deve ser adicionada a dispendiosa isoleucina ao meio de fermentação, o que aumenta o custo.

Numa tentativa de superar estas desvantagens, os presentes inventores desenvolveram uma cepa de produção de L-treonina de Esche-richia coli que é resistente à L-metionina, L-treonina e análogos da L-lisina e ácido α-aminobutírico e tem uma exigência nutricional de metio-nina e uma exigência imperfeita de isoleucina. Ela produziu com sucesso L-treonina por fermentação com a cepa com rendimentos mais elevados do que as cepas anteriores. A cepa e um método de produção de L-treonina que usa a referida cepa são revelados na Publicação de Patente Coreana 92-8365. A decomposição oxidativa da tirosina tem duas rotas, isto é, a decomposição em fumarato e acetoacetato e a decomposição depois da conversão em 3,4-hidroxifenilacetato pela tirosinase. No caso anterior, a L-tirosina reage com o α-cetoglutarato para produzir L-glutamato e 4-hidroxifenilpiruvatos (Neidhardt FC e colaboradores, (Eds) Escheúchia coli and Salmonella: Céllular and Molecular Biology, 2a edn. ASM Press, Washington, DC, 1996, páginas 2649-2660). A biossíntese da tirosina e da fenilalanina inclui a transaminação. Uma enzima importante na transa-minação é codificada por genes tyrB, aspC e ilvE (Ji Yang e James Pit-tard, Journal of Bacteriology, 1987,167, páginas 4.710-4.715). Isto é, o gene tyrB codifica uma subunidade da transaminase do aminoácido aromático. Uma proteína de TyrB codificada pelo gene tyrB é envolvida na transaminação pela transaminase do aminoácido aromático na terceira etapa e etapa final da biossíntese da tirosina como subunidade (Nei-dhardt FC e colaboradores, (Eds) Escherichia coli e Salmonella: Escheri-chia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2a edn. ASM Press, Washington, DC, 1996, páginas 2.649-2.660). O gene tyrB também tem uma função semelhante ao gene aspC, de modo a ficar envolvido na síntese do aspartato (ASP) a partir do oxaloacetato (OAA), assim como também a biossíntese da tirosina e fenilalanina. ASP é um intermediário para a biossíntese da L-treonina (Neidhardt FC e colaboradores, (Eds) Eschenchia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2a edn. ASM Press, Washington, DC, 1996, páginas 358-403). O gene tyrB pertence à regulação tyrR e sofre repressão de expressão durante a transcrição por um produto codificado pelo gene t- * yrR (Ji Yang e James Pittard, Journal of Bacteriology, 1987,167, páginas 4.710-4.715).

Os presentes inventores estudaram intensivamente como selecionar cepas que têm capacidade melhorada de produzir L-treonina com base em tecnologias convencionais e, agora, constataram que a biossíntese da L-treonina pode ser facilitada por inativação do gene tyrR.

Descrição da Invenção Problema Técnico A presente invenção provê um microorganismo que tem uma capacidade melhorada de biossintetizar a L-treonina. A presente invenção também proporciona um método de produzir o microorganismo. A presente invenção também propicia um método de produzir eficazmente L-treonina usando o microorganismo.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um microorganismo capaz de produzir L-treonina e tendo um gene tyrR inativado.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um método de produção de um microorganismo de produção de L-treonina, incluindo o método: preparar um gene tyrR inativado ou um fragmento de DNA do mesmo; introduzir o gene tyrR inativado ou o fragmento de DNA do mesmo num microorganismo capaz de produzir L-treonina para ocasionar a recombinação com um gene tyrR presente num cromossomo do microorganismo; e selecionar microorganismos tendo um gene tyrR inativado.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de produção de L-treonina, incluindo o método: cultivar o microorganismo como acima descrito; e isolar a L-treonina a partir da cultura.

Solução Técnica A presente invenção provê um microorganismo capaz de produzir L-treonina e tendo um gene tyrR inativado.

Na presente invenção, o microorganismo pode produzir L-treonina e inclui microorganismos procarióticos e eucarióticos que têm um gene tyrR inativado. Por exemplo, podem ser incluídas cepas que pertencem aos gêneros Escherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Cory-nebacterium e Brevibacterium. De preferência, o microorganismo pertence à família das Enterobacteriaceae e, com maior preferência, ao gênero Escherichia. Com maior preferência, o microorganismo é Escherichia coli FTR7624 (KCCM-10538).

Também o microorganismo pode incluir mutantes de produção de L-treonina, assim como também microorganismos naturais. E-xemplos de mutantes incluem microorganismos que pertencem às Escherichia coli produtoras de L-treonina que são resistentes à L-metionina, L- treonina e análogos da L-lisina e ácido α-aminobutírico e têm uma exigência nutricional de metionina e uma exigência imperfeita de isoleucina; e microorganismos mutacionados em que está inserida, pelo menos, uma cópia do gene da carboxilase do fosfoenol piruvato (ppc) e genes thrA, t-hrB e thrC contidos num operon de treonina são inseridos num DNA cromossômico, além de gene ppc intrínseco e genes no operon de treonina. O análogo de L-metionina pode ser pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em D,L-etionina, Norleucina, a-metilmetionina e L-metionina-D, L-sulfoximina. O análogo de L-treonina pode ser pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em ácido a-amino-β-hidroxivalérico e D,L-treonina hidroxamato. O análogo de L-lisina pode ser pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em S-(2-aminoetil)-L-cisteína e Ô-metil-L-lisina.

Na presente invenção, o gene tyrR codifica uma proteína que reprime a transcrição por codificação tyrB de TyrB (transminase de ami-noácido aromático) que atua na terceira etapa e etapa final da rota de biossíntese da tirosina. Para a Escherichia coli, o gene tyrR é conhecido e pode ser obtido a partir da sequência do genoma publicada por Blattner e colaboradores (Science, 277: 1.453-1.462 (1997)) (Acesso AAC74405). A sequência de genoma pode também ser obtida a partir do National Cen-ter for Biotechnology Information (NCBI) nos EUA e do Banco de Dados de DNA do Japão (DDBJ). O gene tyrR também inclui um alelo gerado por atenuação do código genético ou mutação. A “inativação”, conforme aqui usada, refere-se à ausência de expressão de uma proteína tyrR ativa. Deste modo, a inativação do gene tyrR leva a um aumento na expressão do gene tyrB. O microorganismo da presente invenção pode ser produzido por inativação de um gene tyrR presente num cromossomo de um microorganismo capaz de produzir L-treonina. O método de inativação pode incluir ocasionar a mutação usando luz, tal como raios UV, ou substâncias químicas e isolar cepas tendo um gene tyrR inativado a partir dos mutantes. O método de inativação também inclui uma tecnologia de re- combinação do D NA. A recombinação do DNA pode ser obtida, por e-xemplo, injetando uma sequência de nucleotídeos ou vetor que inclui uma sequência de nucleotídeos com homologia para o gene tyrR no microorganismo, de modo a ocasionar a recombinação homóloga. A sequência de nucleotídeos e o vetor injetados pode incluir um marcador selecionável dominante. A presente invenção também proporciona um método de produção de um microorganismo de produção de L-treonina, que inclui: preparar um gene tyrR inativado ou fragmento de DNA do mesmo; introduzir o gene tyrR inativado ou o fragmento de DNA do mesmo num microorganismo capaz de produzir L-treonina para ocasionar a recombinação com um gene tyrR presente num cromossomo do microorganismo; e selecionar o microorganismo que tem um gene tyrR inativado, O gene tyrR “inativado*’ ou fragmento de DNA do mesmo conforme aqui usado refere-se a uma seqüência de polinucleotídeos que tem uma homologia de seqüência para o gene tyrR num hospedeiro, mas, é incapaz de expressar uma proteína tyrR ativa devido a perda, deslocamento, mutilação e inversão. A introdução do gene tyrR inativado ou fragmento de DNA do mesmo numa célula de hospedeiro pode ser realizada, por exemplo, por transformação, conjugação, transdução ou eletro-poração, mas, sem limitação.

Quando o gene tyrR inativado ou fragmento de DNA do mesmo é introduzido na célula do hospedeiro por transformação, o procedimento de inativação pode ser executado misturando a seqüência de poli-nucleotídeos com uma cultura da cepa. Embora a cepa seja naturalmente competente para a captura do DNA a ser transformado, prefere-se que a cepa possa ser previamente tomada competente para a captura do DNA por qualquer método apropriado (ver, por exemplo, LeBlanc e colaboradores, Plasrrâd 28,130-145, 1992; Pozzi e colaboradores, J. Bacteriol. 178, 6.087-6.090, 1996). O gene tyrR inativado ou fragmento de DNA do mesmo tem um pedaço de DNA estranho introduzido num fragmento de DNA do genoma e substitui a cópia cromossômica do tipo selvagem da sequência com um estado inativado. Numa modalidade da presente invenção, a sequência de polinucleotídeos inativada inclui “caudas” que incluem uma parte do DNA do local do objetivo nas extremidades 5’ e 3’ do mesmo, As caudas devem ser de pelo menos 50 pares básicos e, de preferência, maiores do que de 200 a 500 pares básicos para recombina-ção e/ou conversão de gene eficiente. Por conveniência, a seqüência de polinucleotídeos inativada pode incluir um marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência a antibiótico. No caso em que o DNA do objetivo é rompido com um gene de resistência a antibiótico, a seleção de transformantes ê realizada sobre placas de agar contendo níveis adequados de um antibiótico apropriado. A seguir à transformação, a seqüência de polinucleotídeos inativada introduzida na célula do hospedeiro sofre uma recombinaçâo homóloga com as caudas de DNA genômico, resultando na inativação da seqüência genômica do tipo selvagem. Os eventos de recombinaçâo de inativação são facilmente confirmados, por exemplo, por Southern blotting ou, mais convenientemente, por reação em cadeia da polimerase (PCR).

Numa modalidade da presente invenção, um método de produção do microorganismo de produção de L-treonina da presente invenção inclui os procedimentos seguintes.

Primeiro, o DNA genômico é isolado de uma cepa que é capaz de produzir a L-treonina e PCR ê realizada usando-a como modelo (tem-plate) por uma tecnologia convencional para amplificar o gene tyrR. A seguir, o gene tyrR obtido é clonado num plasmídio ou outro vetor apropriado. O vetor recombinante é introduzido por transdução numa célula do hospedeiro tal como E. coli. Depois do transformante ser feito crescer e serem células, é extraído o vetor recombinante tendo gene tyrR. Um fragmento de gene resistente a antibiótico é, então, inserido no i gene tyrR do vetor recombinante extraído para formar um vetor recombinante que tem um ativado gene tyrR. Este vetor recombinante é introdu- zido por transformação numa célula do hospedeiro e a célula de hospedeiro é cultivada num meio de cultura apropriado. Então, o vetor recom-binante propagado é isolado do transformante resultante e a sequência de polinucleotídeos tendo um gene tyrR inativado é obtida por diges-tâo(ões) de enzimas de restrição apropriada. Depois disso, esta seqüên-cia de polinucleotídeos é introduzida num hospedeiro que é capaz de produzir L-treonina por uma técnica convencional tal como eletropora-ção. Os microorganismos que têm resistência a antibióticos são selecionados para isolar microorganismos tendo um gene tyrR inativado.

Os especialistas qualificados reconhecerão que a seqüência de polinucleotídeos inativada desta invenção pode ser gerada por métodos gerais de clonagem. Por exemplo, podem ser usados métodos para amplificação de PCR usando iniciadores de oligonucleotídeos visados para o gene tyrR. Os métodos para amplificação de PCR são extensamente conhecidos na técnica (ver, por exemplo, PCR Protocols: A Guide to Me-thod and Application, Ed. M. Innis e colaboradores, Academic Press (1990)). A PCR compreende DNA genômico, enzimas apropriadas, iniciadores e tampões e é convenientemente executada num DNA Thermal Cy-cler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. EUA). É determinado um resultado positivo de PCR, por exemplo, detectando um fragmento de DNA apropriadamente dimensionado a seguir à eletroforese em gel de agarose.

Numa modalidade da presente invenção, foram preparados plasmídios recombínantes pT7blue/tyrR e pT7bluetyrR:: loxpCAT e foi obtida uma seqüência de polinucleotídeos inativada Δ tyrRnloxpCAT a partir deles. Então, foi transformada uma cepa de Escherichia coli que é resistente à L-metionina, L-treonina e análogos da L-lisina e ácido a-aminobutírico e tem uma exigência nutricional para metionina e uma e-xigência imperfeita para isoleucina, nomeadamente Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236, com a seqüência de polinucleotídeos inativada A i tyrR::loxpCAT por eletroporação. Como resultado, o gene tyrR do tipo selvagem fica inativado para três tipos de novas cepas capazes de produzir uma concentração mais alta de L-treonina do que a cepa do protótipo puxa. As novas cepas foram designadas como Escherichia coli FTR7624 e foram depositadas sob o Tratado de Budapeste para o Korean Culture Center of Microorganisms em 4 de dezembro de 2003 e teve atribuído o N° de Acesso KCCM-10538. A Escherichia coli FTR7624 foi derivada da Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236, que foi derivada da Escherichia coli TF4076. A Escherichia coli TF4076 (KFCC10718) exige metionina e tem resistência a análogos de treonina (por exemplo, ácido a-amino-p-hidroxi valérico, AHV), análogos da Usina (por exemplo, S-(2-aminoetil-L-cisteína, AEC), análogos da isoleucina (por exemplo, ácido α-aminobutírico), análogos da metionina (por exemplo, etionina) e semelhantes. A Escherichia coli de N° de Acesso KCCM TF4076 é descrita na Publicação de Patente Coreana 92-8365 que fica aqui incorporada na sua totalidade por refe: rência. O fosfoenol piruvato (PEP) é um precursor do oxaloacetato que é um intermediário da rota de biossintese da L-treonina. O gene ppc e o operon de treonina originados a partir dos cromossomos da Escherichia coli de N° de Acesso KCCM TF4076 foram ampliados pela PCR e foram adicionalmente integrados nos cromossomos da Escherichia coli de N° de Acesso KCCM TF4076 para gerar a Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236. Deste modo, a Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236 possui dois genes ppc e dois operons de treonina. A Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236 é, então, capaz de expressar níveis mais altos do genes ppc catalisando a formação de oxaloacetato a partir de PEP e as enzimas necessárias para a biossintese da treonina a partir do aspartato (thrA;aspartocinase 1-homosserina desidrogenase, t-hrB:homosserina cinase, thrC:treonina sintase), possibilitando, assim, um aumento na produção de L-treonina. A presente invenção também proporciona um método de produção de L-treonina, que inclui: cultivar o microorganismo capaz de pro-1 dução de L-treonina e tendo um gene tyrR inativado; e isolar a L-treonina a partir da cultura.

No método de produção da L-treonina, a cultura pode ser realizada num meio de cultura apropriado sob condições de cultura a-propriadas conhecidas na técnica e pode ser prontamente ajustada de acordo com o tipo de cepa selecionado por aqueles qualificados na técnica. A cultura pode ser realizada por operação de batelada, operação contínua ou operação de batelada alimentada (ver, por exemplo, “Biochemical Engineeriruf'por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138-176). O meio de cultura deve satisfazer corretamente os requisitos de acordo com a mancha selecionada. É revelada uma variedade de meios de cultura em literaturas (ver, por exemplo, *Manual of Methods for General Bacteúologxf pela American Society for Bacteriology, Washington D.C., EUA, 1981). O meio de cultura contém fontes de carbono, fontes de nitrogênio e quantidades de traços de ingredientes. Exemplos de fontes de carbono incluem carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, celulose; gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, óleo de coco; ácidos graxos tais como ácido palmí-tico, ácido esteárico, ácido linoleico; álcoois tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Estas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em combinação. Exemplos de fontes de nitrogênio incluem substâncias orgânicas tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor impregnado de milho (CSL) e soja; e substâncias inorgânicas tais como uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas só ou em combinação. No meio de cultura, podem ser incluídas fontes de fosfato tais como dihi-drogêniofosfato de potássio, dipotássio hidrogêniofosfato, e correspondentes sais que contêm sódio. Também o meio de cultura pode incluir sais metálicos tais como sulfato de magnésio ou sulfato ferroso. Além disso, podem ser incluídos aminoácidos, vitaminas e precursores apropriados. O meio de cultura ou o precursor podem ser adicionados à cultura de uma maneira de batelada ou no modo contínuo. 0 hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, fosfato ou ácido sulfúrico etc. é apropriadamente adicionado à cultura durante o cultivo para ajustar o pH da cultura. Também um agente anti-espumante tal como éster poliglicólico de ácido graxo é adicionado à cultura para prevenir a formação de espuma. O cultivo é executado sob condições aeróbias injetando oxigênio ou gás contendo oxigênio (por e-xemplo, ar) para a cultura. A temperatura de cultivo está na faixa de 20 a 45°C, de preferência, de 25 a 40°C. O cultivo pode ser continuado até que seja obtida a quantidade pretendida de L-treonina, de preferência de 10 a 160 horas. A L-treonina pode ser isolada da cultura por métodos ordinários conhecidos na técnica. Os métodos de isolamento incluem centrifu-gação, filtraçâo, cromatografia de permuta iônica e cristalização etc. Por exemplo, o sobrenadante obtido centrifugando a cultura a baixa velocidade para remover a biomassa pode ser isolado por cromatografia de permuta iônica.

Descrição dos Desenhos As características e vantagens acima e outras da presente invenção tomar-se-áo mais evidentes descrevendo em detalhe modalidades exemplificativas da mesma com referência aos desenhos anexos em que: a Figura 1 representa uma construção do plasmídio recombinante pTblue/tyrR que inclui um gene tyrR; e a Figura 2 representa uma construção de fragmento de DNA Δ tyrRr.loxpCAT a partir de plasmídio recombinante pT7bluetyrR: doxpCAT.

Melhor Modo Em seguida, a presente invenção será descrita mais especificamente por exemplos. Contudo, os exemplos seguintes são proporcio- nados apenas para ilustrações e, deste modo, a presente invenção não Eica limitada a eles nem por eles.

Exemplos Exemplo 1 Construção de Plasmídio Recombinante e Knock-Outáo Gene tyrR

No Exemplo presente, um gene tyrR num cromossomo de Es-cherichia coli foi desativado (knocked-outi por recombinação homóloga. Para isto, foi preparado um vetor que inclui uma parte do gene tyrR e, então, foi transformado em célula hospedeira de Escherichia coli, seguido de seleção de cepas tendo um gene tyrR desativado. O DNA genômico foi extraído a partir da cepa de Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236 de produção de L-treonina usando o QIAGEN Genomic-tip System. O fragmento de DNA (mais ou menos 1,7 kb) incluindo ORF (moldura de leitura aberta) de gene lyrR foi amplificado por PCR usando o DNA genômico extraído como modelo. Os iníciado-res usados eram um par de oligonucleotídios (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2). A PCR foi realizada durante 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação durante 30 segundos a 94°C, anelamento durante 30 segundos a 60°C e extensão durante 90 segundos a 72°C em ordem. O produto de PCR foi carregado sobre 1,0% gel de agarose e sujeito a eletroforese. O DNA foi purificado a partir da faixa de 1,7 kb gene tyrR faixa. O DNA purificado foi ligado ao sítio EcoRV do vetor de clonagem pT7Blue (Novagen Inc., EUA) durante a noite à temperatura de 16°C para construir o plasmídio recombinante pT7Blue/tyrR (ver Figura 1). A construção de plasmídio resultante foi transformada em Escherichia coli NM522. A cepa transformada foi colocada sobre placa sólida contendo 50 mg/L de carbenicilina e foi cultivada durante a noite a uma temperatura de 37°C.

As colônias formadas foram repicadas com uma alça de platina e inoculadas em 3 ml de meio líquido LB contendo carbenicilina. Depois de cultura durante a noite, os DNAs do plasmídio foram extraídos da cultura usando o kit de QIAGEN Mini Prep. O extrato do DNA do plasmídio foi digerido com a enzima de restrição Xmn I e confirmada a clonagem do gene tyrR. O plasmídio confirmado pT7Blue/tyrR foi clivado com a enzima de restrição Xmn 1 e o DNA foi purificado a partir de uma faixa de cerca de 4,6 kb em gel de agarose 0,8%. O DNA purificado foi ligado com a extremidade cega com um fragmento de cerca de 1,2 kb do gene para resistência ao cloranfenicol incluindo a região loxp, que foi obtida digerindo o plasmídio ploxpCAT2 (U. Guldenre e colaboradores, Nu-cleic Add Research 24 (13), 1996, páginas 2519-2524) com a enzima de restrição Hinc II, para construir um plasmídio recombinante de aproximadamente 5,8 kb pT7 Atyr R::loxpCAT (ver Figura 2). A Escherichia coli NM522 foi transformada com o plasmídio recombinante pT7 Δ tyrR::loxpCAT. O transformante resultante foi riscado sobre uma placa de meio sólido LB contendo 50 mg/L de carbenicilina e 50 mg/L de cloranfenicol e cultivado durante a noite a 32°C. As colônias formadas foram repicadas com uma alça de platina e inoculadas em 3 ml de meio líquido LB contendo carbenicilina e cloramfenicol. Depois de cultura durante a noite, os DNAs do plasmídio foram extraídos usando o kit de QIAGEN Mini Prep. O fragmento de DNA (de cerca de 2,9 kb) incluindo ORF do gene tyrR e sítio loxpCAT foi amplificado por PCR usando o DNA extraído do plasmídio como modelo. Os iniciadores usados foram um par de oligonucleotídios (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2). A PCR foi realizada durante 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação durante 30 segundos a 94°C, anelamento durante 30 segundos a 60°C e extensão durante 60 segundos a 72°C em ordem. O fragmento de DNA resultante Δ 1yr R::loxpCAT foi transformado em cepa de Escherichia coli de N° de Acesso KCCM 10236 de produção de L-treonina por eletroporação e o transformante resultante foi riscado sobre um meio sólido LB contendo cloranfenicol para selecionar colônias tendo um gene tyrR knock-out. As colônias selecionadas foram testadas quanto à sua produção de L-treonina em culturas de frasco.

Exemplo 2 Produção de L-Treonina em Frasco de Erlenmeyer por Cepas Selecionadas Trinta colônias selecionadas no Exemplo 1 foram cultivadas num frasco de Erlenmeyer contendo o meio de titulação de treonina dado na Tabela 1 abaixo e foi comparada a produção de L-treonina.

Tabela 1 Meio de Titulação de Treonina Cada colônia foi cultivada durante a noite em meio sólido LB numa incubadora a 32°C. Depois, uma alça de platina da cultura foi i- noculada em 25 ml do meio de titulação e cultivada a 32 °C e 250 rpm durante 48 horas. A L-treonina da cultura foi analisada por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Os resultados de análise são dados na Tabela 2 abaixo. Pode ser visto a partir dos resultados que a cepa protótipo de N° de Acesso KCCM 10236 produz 23 g/L de L-treonina e a Es-cherichia coli FTR7624 da presente invenção em que o gene tyrR foi desativado (kmcked ouí) produz 26 g/L de L-treonina. Portanto, foi observado que os presentes microorganismos transformados aumentam a produção de L-treonina até cerca de 8% em comparação com a cepa protótipo. A Escherichia coli FTR7624 selecionado foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms em 4 de dezembro de 2003 e teve atribuído o N° de Acesso KCCM-10538.

Tabela 2 Resultados de Testes de Titulação de Frascos de Cepas Conforme demonstrado pelo Exemplo, a capacidade de bios-sintetizar L-treonina de microorganismos é melhorada por desativação do gene tyrR. Isto é provavelmente porque a expressão do gene tyrB é aumentada pela desativação do gene tyrR, aumentando, assim, a taxa de suprimento do aspartato (APP) que é um intermediário para a biossíntese da L-treonina. Contudo, a melhoria na produtividade do microorganismo não é baseada apenas neste mecanismo.

Aplicabilidade Industrial Conforme descrito acima, o microorganismo que tem um gene tyrR inativado da presente invenção consegue produzir L-treonina por fermentação com elevado rendimento.

Também de acordo com o método de produção de L-treonina da presente invenção, pode ser produzido elevado rendimento de L-treonina.

Claims (3)

1 - Microrganismo da Família das Enterobacteriaceae, capaz de produzir L-treonina e tendo um gene tyrR inativado, caracterizado por que o referido microrganismo é Escherichia coli FTR7624 (KCCM-10538).

2 - Microrganismo da Família das Enterobacteriaceae, capaz de produzir L-treonina e tendo um gene tyrR inativado, caracterizado por que o referido microrganismo é Escherichia coli FTR7624 (KCCM-10538) e é ainda compreendido por pelo menos mais uma cópia do gene fosfoenol piruvato carboxilase (ppc) e dos genes thrA, thrB e thrC genes inseridos num DNA cromossômico, além dos genes intrínsecos ppc e thrA, thrB e thrC.

3 - Método de Produção de L-treonina, caracterizado por que compreende: cultivar o microrganismo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 2; e isolar a L-treonina a partir da cultura.