BRPI0409599B1

BRPI0409599B1 - Sequência de ácido nucléico, construto de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, micro-organismo recombinante, composição de massa, métodos de produzir uma fosfolipase, de preparar uma massa ou um produto assado feito da massa, processos para reduzir o conteúdo de fósforo em um óleo vegetal e para produzir queijo

Info

Publication number: BRPI0409599B1
Application number: BRPI0409599-5A
Authority: BR
Inventors: Mary Ann Stringer; Tine Muxoll Fatum; Shamkant Anant Patkar
Original assignee: Novozymes As; Chr Hansen As
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2014-09-16
Also published as: AU2004234472B2; CA2522954C; RU2363731C2; CA2522954A1; AU2009200207B2; DK1620551T3; MXPA05011421A; EP1620551A2; AR044117A1; JP2010172343A; WO2004097012A3; RU2009111842A; NZ553115A; PL1620551T3; AU2004234472A1; JP5189130B2; AU2009200207A1; RU2005136868A; BRPI0409599A; EP1620551B1

Description

“SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, MICRO- ORGANISMO RECOMBINANTE, COMPOSIçãO DE MASSA, MÉTODOS DE PRODUZIR UMA FOSFOLIPASE, DE PREPARAR UMA

MASSA OU UM PRODUTO ASSADO FEITO DA MASSA, PROCESSOS

PARA REDUZIR O CONTEÚDO DE FÓSFORO EM UM ÓLEO VEGETAL E PARA PRODUZIR QUEIJO.” CAMPO DA INVENçãO A presente invenção refere-se a um método de hidrólise de um fosfolipídeo, a um método de produção de uma fosfolipase, a um método de preparação de queijo, e a uma fosfolipase.

FUNDAMENTOS DA INVENçãO

Soragni, E., et al. (2001) EMBO J. 20: 5079-5090 descrevem uma fosfolipase (TbSPl) de Tuber borchii e a seqüência de nucleotídeos de um cDNA de um gene codificador dela. As seguintes seqüências de peptídeo estão publicadas nas fontes indicadas, derivadas do organismo fonte indicado: • Banco de Dados de EST de Oomicetos e de Fungos Fitopatogênicos da COGEME, Unisequence ID: VD0100C34, Verticillium dahliae. • Banco de Dados de Proteínas NCBI, gi: 18307435, Neurospora crassa. • Banco de Dados de Proteínas NCBI, gi: 16519372, Helicosporum sp. HN1. • WO 0056762, SEQ ID NO: 5954, Aspergillus oryzae. • Banco de Dados de Proteínas TREMBL, EAA28927, Neurospora crassa. US 6399121 descreve o uso de fosfolipase na preparação de queijo.

SUMÁRIO DA INVENçãO

Os inventores têm analisado dados de sequências conhecidas para fosfolipases A2 fungicas de Grupo XIII, e têm identificado seqüências adicionais, quer de dados de seqüências publicados quer por triagem de seqüências relevantes de fontes naturais. Pela expressão de genes codificadores de fosfolipases A2 fungicas de Grupo XIII em um organismo hospedeiro adequado verificaram que as seqüências expressadas consistem de um peptídeo núcleo copulado a uma seqüência de peptídeo no lado N- ou C- terminal, ou em ambos, e que a expressão do gene em um organismo hospedeiro adequado pode acarretar a divagem do peptídeo expressado para obter o peptídeo núcleo sem qualquer extensão de peptídeo na terminação-N ou -C. Verificaram adicionalmente que o peptídeo núcleo sem qualquer (quaisquer) extensão(ões) possui uma atividade de fosfolipase significativamente maior do que a do peptídeo núcleo ligado na(s) extensão(ões) de peptídeo. Finalmente, verificaram que o peptídeo núcleo descoberto por este método é semelhante em comprimento e em seqüência a um peptídeo maduro conhecido de Helicosporium sp. (Wakatsuki, S. et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1522: 74-81) de função desconhecida, e às fosfolipases A2 bacterianas de Grupo XIII, que são faltantes de extensões de peptídeo diferentes de sinais de secreção (Sugiyama, M. et. al. (2002) J. Biol Chem. 277:20051-20058).

Os inventores verificaram adicionalmente que fosfolipase compartilhando similaridade de seqüência de sítio ativo e conservação de resíduo de cisteína de fosfolipase A2 fungica de Grupo XIII é útil na preparação de queijo.

Adicionalmente, os inventores descobriram e isolaram um gene codificador de uma fosfolipase nova de Fusarium venenatum A3/5, que foi originalmente depositado como Fusarium graminearum ATCC 20334 e recentemente reclassificado como Fusarium venenatum por Yoder e Christianson, 1998, Fungai Genetics and Biology 23: 62-80; e 0'Donnell et al, 1998, Fungai Genetics and Biology 23: 57-67. A fosfolipase pertence ao grupo XIII PLA2 fungico / bacteriano como definido por Soragni et al., The EMBO Journal, 20 (2001), 5079-5090. Os inventores também clonaram o gene codificador de fosfolipase em uma cepa de E. coli, e usaram o gene clonado para preparar um construto para expressar o gene de fosfolipase de Fusarium em Aspergillus oryzae. Os inventores transformaram Aspergillus oryzae com este construto, e isolaram a fosfolipase das células de Aspergillus transformadas.

Conseqüentemente, a invenção proporciona um método de produção de uma fosfolipase que compreende processar um peptídeo fungico expressado de modo a clivar um peptídeo da extremidade C-terminal e/ou um peptídeo da extremidade N-terminal para obter um peptídeo núcleo, no qual o peptídeo núcleo compreende: a) a seqüência de aminoácidos dada pelos aminoácidos 146- 153 de SEQID NO: 1, aminoácidos 87-94 de SEQID NO: 3, ou aminoácidos 79-86 de SEQ ID NO: 12; ou uma seqüência idêntica a qualquer uma destas seqüências de aminoácidos exceto pela substituição de um único aminoácido por outro aminoácido; e b) pelo menos dois resíduos de cisteína localizados no lado N- terminal da seqüência dada em a); e c) pelo menos dois resíduos de cisteína localizados no lado C- terminal da seqüência dada em a). A invenção também proporciona um método para hidrolisar um fosfolipídeo com uma fosfolipase da invenção. Em adição, a invenção proporciona um método para produzir queijo pelo contato de leite de queijo ou de uma fração de leite de queijo com uma fosfolipase e para produzir queijo a partir do leite de queijo.

Finalmente, a invenção proporciona fosfolipase que é um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80 % idêntica a certas seqüências especificadas.

DESCRIçãO DETALHADA DA INVENçãO

Peptídeo expressado A invenção usa um peptídeo fúngico expressado pertencente a um grupo definido pela similaridade de seqüência de sítio ativo e pela conservação de resíduo de cisteína utilizada na definição do grupo de "fosfolipase A2 fúngica / bacteriana de Grupo XIII" dada por Soragni, E., et al. (2001) EMBO J. 20: 5079-5090. O peptídeo é fúngico, por exemplo derivado de Tuber, Verticillium, Neurospora, Helicosporum, ou Aspergillus, particularmente T. borchii, T. albidum, V. dahliae, V. tenerum, N. crassa, Helicosporium sp.HNl ou A. oryzae. O peptídeo pode possuir atividade de fosfolipase, por exemplo atividade de fosfolipase A, tal como atividade de fosfolipase Al e/ou de fosfolipase A2.

Alguns exemplos específicos são peptídeos conhecidos possuindo seqüências de aminoácidos listadas na seguinte listagem de seqüências. Os organismos fonte e as referências de literatura também são indicados: • SEQID NO:l. Tuber borchii. Soragni, E., et al. (2001) EMBOJ. 20: 5079-5090. • SEQ ID NO: 3. Verticillium dahliae. Banco de Dados de EST de Oomicetos e de Fungos Fitopatogênicos da COGEME, Unisequence ID: VD0100C34. • SEQ ID NO: 4. Neurospora crassa. Banco de dados de Proteína NCBI, gi: 18307435. • SEQ ID NO: 5. Helicosporum sp. HN1. Banco de dados de Proteína NCBI, gi:16519372.

• SEQ ID NO: 7. Aspergillus oryzae. WO 0056762, SEQ ID NO: 5954. • SEQ ID NO 8. Neurospora crassa. Banco de dados de Proteínas TREMBL, EAA28927.

Em adição, as seguintes fosfolipases fungicas possuindo as seqüências indicadas foram isoladas pelos inventores a partir de fontes naturais obtidas de coleções públicas ou coletadas no país e no ano indicados: • SEQ ID NO: 10. Tuber albidum. Obtida do Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Países-Baixos, isolado CBS272.72. • SEQ ID NO: 12. Verticillium tenerum. Irlanda, 1996.

Os inventores inseriram o gene de I albidum (SEQ ID NO: 9) em E. coli e depositaram o clone sob os termos do Tratado de Budapeste aos 12 de fevereiro de 2003. O depósito foi feito na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemanha, e foi de acordo com o número de depósito DSM 15441.

Em uma modalidade a invenção proporciona uma fosfolípase que é um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, preferivelmente 90%, com maior preferência pelo menos 95%, idêntica aos aminoácidos 91-210 em SEQ ID NO: 10 (T. albidum), aminoácidos 92-211 em SEQ ID NO: 1 (T. borchii)> aminoácidos 30-137 em SEQ 1D NO: 12 (V. tenerum), aminoácidos 38-145 em SEQ ID NO: 3 (V. dahliae), aminoácidos 44-151 em SEQ ID NO: 4 (N. crassa), aminoácidos 37-157 em SEQ ID NO: 7 (A. oryzae), ou aminoácidos 58-168 em SEQ ID NO: 8 (N. crassa).

Processamento de peptídeo Pela análise das seqüências de fosfolipase na listagem de seqüências, os inventores verificaram que a seqüência de aminoácidos expressada consiste de um peptídeo de sinal, um peptídeo núcleo, e adicionalmente uma seqüência de peptídeo com função desconhecida ligada na terminação-C ou -N, ou em ambas, do peptídeo núcleo.

Peptídeo núcleo Os peptídeos núcleo são caracterizados pelas mesmas conservação de resíduo de cisteína e similaridade de seqüência de sítio ativo observadas por Soragni, E., et al. (2001) EMBO J. 20: 5079-5090 para a fosfolipase A2 fungica / bacteriana de Grupo XIII.

Em uma modalidade preferida da invenção os peptídeos núcleo compreendem: a) a seqüência dada pelos aminoácidos 146-153 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 87-94 de SEQ ID NO: 3, ou aminoácidos 79-86 de SEQ ID NO: 12; ou uma seqüência idêntica a qualquer uma destas seqüências de aminoácidos exceto pela substituição de um único aminoácido por outro aminoácido; e b) dois resíduos de cisteína localizados no lado N- terminal da seqüência dada em a); ou c) dois resíduos de cisteína localizados no lado C-terminal da seqüência dada em a).

Um dos resíduos de cisteína localizado no lado N-terminal da seqüência dada em a), pode estar por exemplo separado da seqüência dada em a) por 0-5 aminoácidos, tal como 0-3 aminoácidos, preferivelmente 0-2 aminoácidos, e ainda com maior preferência 1 aminoácido. Outro dos resíduos de cisteína localizado no lado N-terminal da seqüência dada em a), pode estar por exemplo separado da seqüência dada em a) por 14-20 aminoácidos, tal como 15-19 aminoácidos, preferivelmente 16-18 aminoácidos, e ainda com maior preferência 17 aminoácidos.

Um dos resíduos de cisteína localizado no lado C-terminal da seqüência dada em a), pode estar por exemplo separado da seqtiência dada em a) por 22-29 aminoácidos, tal como 23-28 aminoácidos, preferivelmente 24- 27 aminoácidos, e ainda com maior preferência 25-26 aminoácidos. Outro dos resíduos de cisteína localizado no lado C-terminal da seqüência dada em a), pode estar por exemplo separado da seqüência dada em a) por 27-49 aminoácidos, tal como 29-46 aminoácidos, preferivelmente 30-43 aminoácidos, e com maior preferência 32-42 aminoácidos, e mais preferivelmente 35-40 aminoácidos.

Em uma modalidade preferida o peptídeo núcleo compreende quatro resíduos de cisteína alinhados com os resíduos de cisteína da SEQ ID NO: 1 com números de aminoácido 128, 144, 180 e 194, respectivamente, quando a seqüência de fosfolipase expressada completa for alinhada simultaneamente com as seqüências dadas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, e SEQ IDNO: 12.

De acordo com a invenção, o polipeptídeo expressado é clivado de modo a separar o peptídeo núcleo do(s) peptídeo(s) ligado(s). A divagem pode ser feita in vivo pela expressão dela em um hospedeiro füngico filamentoso adequado ou in vitro, por exemplo por um tratamento com uma protease apropriada tal como por exemplo Kex2.

Os pontos de divagem podem ser encontrados dentro de 11 aminoácidos de uma seqüência que é FG ou dentro de 10 aminoácidos de uma seqüência que é um sítio Kex2. Os sítios Kex2 são por exemplo RR, KR, KK ou RK. Em uma modalidade o peptídeo núcleo possui um comprimento de 100-150 aminoácidos, tal como 110-140 aminoácidos, 115-133 aminoácidos, 118-129 aminoácidos, ou 118-126 aminoácidos.

Em uma modalidade da invenção a fosfolipase expressada é clivada dentro de 0-18 aminoácidos, tal como 3-16 aminoácidos, preferivelmente 5-14 aminoácidos no lado N-terminal da seqüência alinhando com aminoácidos 97-101 de SEQ ID NO: 1, quando a seqüência de fosfolipase expressada completa for alinhada simultaneamente com as seqüências dadas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 12.

Em uma modalidade a fosfolipase expressada é clivada dentro de 0-11 aminoácidos, tal como 0-9 aminoácidos, preferivelmente 0-7 aminoácidos no lado C-terminal da seqüência alinhando com aminoácidos 204-209 de SEQ ID NO: 1, quando a seqüência de fosfolipase expressada completa for alinhada simultaneamente com as seqüências dadas em SEQ ID

NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 12.

Em uma modalidade preferida a fosfolipase processada possui uma atividade de fosfolipase específica, que é maior do que a atividade do peptídeo expressado antes do processamento, por exemplo em uma modalidade a atividade de fosfolipase específica é pelo menos 2 vezes, com maior preferência pelo menos 5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 10 vezes a atividade de fosfolipase específica do peptídeo expressado antes do processamento. Em uma modalidade da invenção o peptídeo expressado não possui atividade de fosfolipase mensurável antes do processamento.

Atividade de fosfolipase pode ser por exemplo medida no ensaio Leu por hidrólise de lecitina de soja (L-alfa-fosfotidil-colina) em pH 8 e a 40°C por 2 minutos. Atividade de fosfolipase é expressada como a taxa de consumo de titulante (NaOH 1,0 M) necessária para manter o pH constante, em relação a um padrão.

Expressão em célula hospedeira fúngica fílamentosa A célula hospedeira fungica fílamentosa pode ser por exemplo uma célula de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Rhizomucor, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma, particularmente A. awamorí, A. foetidus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, Λί. oryzae. F. bactridloides, F. cerealis, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, F. graminum, F, heterosporum, F. negundi, F oxysporum, F. reticulatum, F roseum, F. sambucinum, F. sarcochroum, F. sporotrichioides, F sulphureum, F. torulosum, F. trichothecioides, F. venenatum, F. insolens, M. thermophila, N. crassa, F. purpurogenum, R. miehei, Thermomyces lanuginosus, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Em uma modalidade preferida o organismo hospedeiro é uma cepa de Aspergillus, Fusarium, ou Trichoderma, particularmente /4. niger, A oryzae, F. venenatum, F. sambucinum ou F. cerealis. A transformação, o cultivo, a expressão, a recuperação, podem ser realizados por métodos convencionais, por exemplo pelos métodos gerais descritos em EP 238023, EP 305216, WO 9600787, EP 244234 ou T.

Christensen ei tf/., ÕioTechnology, vol. 6, Dec. 1988,1419-22. DNA e polipeptídeo de fosfolipase Em uma modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos possuindo atividade de fosfolipase e quando os polipeptídeos compreendem, preferivelmente consistem de, uma seqüência de aminoácidos que possui um grau de identidade com aminoácidos 29 a 149 de SEQID NO: 16 (i.e., o polipeptídeo maduro) de pelo menos 80%, tal como de pelo menos 85%, ainda com maior preferência de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, por exemplo, de pelo menos 96%, tal como de pelo menos 97%, e ainda mais preferivelmente de pelo menos 98%, tal como de pelo menos 99%.

Preferivelmente, os polipeptídeos compreendem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; uma sua variante alélica; ou um seu fragmento que possui atividade de fosfolipase. Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo da presente invenção compreende aminoácidos 29 a 149 de SEQ ID NO: 16. Em um outra modalidade preferida, o polipeptídeo consiste de aminoácidos 29 a 149 de SEQ ID NO: 16. A presente invenção também refere-se a um polinucleotídeo compreendendo, preferivelmente consistindo de, uma seqüência de ácido nucléico que possui pelo menos 80% de identidade com nucleotídeos 133 a 495 de SEQ ID NO: 15. Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos possui pelo menos 85% de identidade, tal como pelo menos 90% de identidade, com maior preferência pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, por exemplo pelo menos 97% de identidade, ainda com maior preferência pelo menos 98% de identidade, tal como pelo menos 99% com os nucleotídeos 133 a 495 de SEQ ID NO: 15. Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo possuindo atividade de fosfolipase. A fosfolipase pode ser derivada de uma cepa de Fusarium, particularmente de F. venenatum, usando sondas planejadas tendo por base as seqüências de DNA neste relatório descritivo. Em uma modalidade a fosfolipase possui atividade de fosfolipase A. A fosfolipase pode ser produzida pela transformação de uma célula hospedeira adequada com uma seqüência de DNA codificadora da fosfolipase, cultivando o organismo transformado sob condições que permitem a produção da enzima, e recuperando a enzima da cultura. O organismo hospedeiro é preferivelmente uma célula eucariótica, em particular uma célula fungica, tal como uma célula de levedura ou uma célula füngica fílamentosa, tal como uma cepa de Aspergillus, Fusarium, Trichoderma ou Saccharomyces, particularmente A. niger, A. oryzae, F, venenatum, F. sambucinum, F. cerealis ou S. cerevisiae, por exemplo uma cepa de A. niger produtora de glicoamilase tal como aquelas descritas em US 3677902 ou um seu mutante. A produção da fosfolipase em tais organismos hospedeiros pode ser feita pelos métodos gerais descritos em EP 238,023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) ou EP 244,234 (Alko). O vetor de expressão da invenção tipicamente inclui seqüências de controle funcionando como um promotor, um sinal de iniciação de tradução, e, opcionalmente, um marcador selecionável, um terminador de transcrição, um gene repressor ou vários genes ativadores. O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, ou pode estar integrado dentro do genoma da célula hospedeira.

Identidade e alinhamento de seqüência Seqüências de nucleotídeos podem ser alinhadas com a aplicação AlignX do Vector NTI Program Suite 7.0 usando os ajustes pré- definidos, que emprega um algoritmo de ClustalW modificado (Thompson, J.D., Higgins, D.G., e Gibson TJ. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680), a matriz de resultado swgapdnarnt, uma penalidade de abertura de hiato de 15 e uma penalidade de extensão de hiato de 6.66.

Seqüências de aminoácidos podem ser alinhadas usando a aplicação AlignX do Vector NTI Program Suite v8 usando os ajustes pré- determinados, que emprega o algoritmo ClustalW modificado (Thompson, J.D., Higgins, D.G., e Gibson T.J., 1994), a matriz de resultado blosum62mt2, uma penalidade de abertura de hiato de 10 e uma penalidade de abertura de hiato de 0.1.

Em uma modalidade da invenção os alinhamentos de seqüências e o cálculo de resultados de homologia são feitos utilizando o Método de Lipman-Pearson (Lipman, D.J. e W.R. Pearson (1985) "Rapid and sensitive protein similarity searches", Science 227: 1435-1441) usando uma tabela de peso de resíduo PAM250 (Dayhoff, M.O., R.M. Schwartz, e B.C.

Orcutt (1978) "A model of evolutionary change in proteins." Em Dayhoff, M.O. (ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure; National Biomedical Research Foundation; Washington, D.C. Vol 5. Suppl. 3: pp. 345-358) e os ajustes pré-definidos no programa MegAlign, v4.03, no pacote de programas de computador Lasergene (DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715). Os ajustes pré-definidos são um conjunto de variáveis K de 2, penalidade de hiato de 4, e uma penalidade de comprimento de hiato de 12.

Hidrólise de fosfolipídeo A invenção pode ser usada na hidrólise de qualquer fosfolipídeo tal como lecitina, uma cefalina ou uma inosita. A invenção pode ser usada em analogia com os processos da arte pela substituição de fosfolipase, por exemplo na produção de produtos assados (WO 0032758, WO 9953769), de maionese (GB 1525929, US 4034124) ou no tratamento de óleo vegetal (US 5264367).

Uso de fosfolipase A fosfolipase da invenção pode ser utilizada em várias aplicações industriais de fosfolipases, por exemplo como descrito acima.

Uso em assadura A fosfolipase da invenção pode ser usada na preparação de massa de farinha, de pão e de bolos, por exemplo para melhorar a elasticidade do pão ou do bolo. Assim, a fosfolipase pode ser empregada em um processo para preparar pão, compreendendo adicionar a fosfolipase nos ingredientes de uma massa de farinha, amassar a massa e assar a massa para preparar o pão.

Isto pode ser feito em analogia com US 4567056 ou WO 99/53769.

Uso em detergente A variante pode ser usada como um aditivo de detergente, por exemplo em uma concentração (expressada como a proteína enzima pura) de 0,001-10 (por exemplo 0,01-1) mg por grama de detergente ou de 0,001-100 (por exemplo 0,01-10) mg por litro de licor de lavagem. A composição detergente da invenção pode ser por exemplo formulada como uma composição detergente para a lavagem de roupas manual ou a máquina incluindo uma composição de aditivo para a lavagem de roupas adequada para o pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecido adicionada no enxágüe, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfície dura doméstica em geral. Em um detergente para lavagem de roupas, a variante pode ser efetiva para a remoção de manchas gordurosas, para manutenção da brancura e para a limpeza de sujeira. Uma composição detergente para lavagem de roupas pode ser formulada como descrita em GB 2247025, WO 9901431 ou WO 9903962. A composição detergente da invenção pode ser particularmente formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina, por exemplo como descrito em GB 2.247.025 (Unilever) ou WO 99/01531 (Procter & Gamble). Em uma composição para lavagem de louça, a variante pode ser efetiva para a remoção de manchas gordurosas / oleosas, para a prevenção de manchamento e/ou de descoloração da louça e de componentes de plástico da lavadora de louça pelos componentes elevadamente coloridos e para a evitação de deposição de sabão de cal sobre a louça.

Outros usos A fosfolipase da invenção pode ser utilizada para melhorar a filtrabilidade de uma solução aquosa ou lama de origem de carboidrato pelo tratamento da mesma com a fosfolipase. Isto é particularmente aplicável a uma solução de lama contendo um hidrolisado de amido, especialmente um hidrolisado de amido de trigo, porque este tende a ser de difícil fíltração e dá filtrados turvos. O tratamento pode ser feito em analogia com EP 219.269 (CPC International).

Ainda mais, a fosfolipase da invenção pode ser usada para hidrólise parcial de fosfolipídeos, preferivelmente de lecitina, para obter emulsificadores de fosfolipídeo melhorados. Esta aplicação é adicionalmente descrita na Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Editor: VCH

Weinheim (1996)), Patente JP 2794574, e JP-B 6-087751.

Em adição, a fosfolipase da invenção pode ser usada em um processo para a produção de um alimento para animal que compreende misturar a fosfolipase com substâncias alimentícias e pelo menos um fosfolipídeo. Isto pode ser feito em analogia à EP 743.017.

Ainda mais a fosfolipase da invenção pode ser usada em um processo para redução do conteúdo de fosfolipídeo em um óleo edível, compreendendo tratar o óleo com a fosfolipase de modo a hidrolisar uma parte maior de fosfolipídeo, e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Este processo é aplicável à purificação de qualquer óleo edível que contenha fosfolipídeo, por exemplo óleo vegetal tal como óleo de feijão-soja, óleo de semente de colza e óleo de girassol. A fosfolipase pode ser por exemplo utilizada no processo descrito em JP-A 2- 153997 eUS 5264367. Método para produzir queijo A fosfolipase da invenção pode ser usada para produzir queijo em analogia ao processo dado em US 6399121.

Em uma modalidade preferida da invenção o queijo é produzido pelo contato do leite de queijo ou de uma fração de leite de queijo com uma fosfolipase da invenção e produção de queijo a partir do leite de queijo.

Em uma outra modalidade preferida o queijo é produzido pelo contato do leite de queijo ou de uma fração do leite de queijo com uma fosfolipase, no qual a fosfolipase compreende: a) a seqüência dada pelos aminoácidos 146-153 de SEQ ID

NO: 1, aminoácidos 87-94 de SEQ ID NO: 3, ou aminoácidos 79-86 de SEQ ID NO: 12; ou uma seqüência idêntica a qualquer uma destas seqüências de aminoácidos exceto pela substituição de um único aminoácido por outro aminoácido; e b) dois resíduos de cisteína localizados no lado N-terminal da seqüência dada em a); e c) dois resíduos de cisteína localizados no lado C-terminal da seqüência dada em a).

No presente contexto o termo leite de queijo significa incluir qualquer composição baseada em leite usada para a produção de queijo. Uma fração do leite de queijo pode ser qualquer fração do leite de queijo tal como por exemplo, creme de leite, leite desnatado, leite de manteiga, manteiga ou gordura de leite.

Em uma modalidade preferida o leite de queijo ou a fração de leite de queijo é contatado com uma fosfolipase da invenção em uma quantidade suficiente para diminuir o efeito de exsudação oleosa no queijo e/ou para aumentar o rendimento de queijo. O efeito de exsudação oleosa é a tendência do queijo de formar óleo livre durante a armazenagem e/ou a fusão.

Em um aspecto a invenção refere-se a um processo para produzir queijo compreendendo tratar uma composição láctea com uma fosfolipase da invenção e produzir queijo da composição láctea.

Outro aspecto da invenção refere-se a um processo para produzir queijo compreendendo tratar uma composição láctea com fosfolipase e produzir queijo da composição láctea, no qual a fosfolipase é selecionada do grupo XIII PLA2 de fosfolipases fungicas/bacterianas. Em uma modalidade preferida da invenção o grupo XIII PLA2 füngico/bacteriano é de um fungo, com maior preferência de um fungo pertencente a Ascomycetes. Uma fosfolipase pertencente ao grupo XIII PLA2 füngico/bacteriano pode ser qualquer fosfolipase pertencente a este grupo como definido por Soragni, E., et al EMBO J. 20 (2001), 5079-5090, e pode ser por exemplo da espécie Tuber, por exemplo T. borchii, Streptomyces, por exemplo S. coelicor, VerticiUium, por exemplo V. dahliae, Aspergillus, por exemplo A oryzae, Neurospora, por exemplo ÍV. crassa, ou Helicosporum.

Uma composição láctea de acordo com a invenção pode ser qualquer composição compreendendo constituintes lácteos. Os constituintes lácteos podem ser qualquer constituinte lácteo tal como gordura de leite, proteína de leite, proteína de soro de leite, e lactose. Uma fração de leite pode ser qualquer fração de leite tal como por exemplo leite desnatado, leite de manteiga, soro de leite, creme de leite, leite em pó, leite integral em pó, leite desnatado em pó. Em uma modalidade preferida da invenção a composição láctea compreende leite, leite desnatado, leite de manteiga, leite integral, soro de leite, creme de leite, ou qualquer uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade mais preferida a composição láctea consiste de leite, tal como leite desnatado, leite integral, creme de leite, leite de manteiga, ou qualquer combinação dos mesmos. O tratamento enzimático no processo da invenção pode ser conduzido pela dispersão da fosfolipase na composição láctea, e permitindo que a reação da enzima ocorra em um tempo de ocorrência apropriado em uma temperatura adequada. O tratamento com a fosfolipase pode ser realizado em condições escolhidas para se adequaram à(s) enzima(s) selecionada(s) de acordo com princípios bem conhecidos na arte.

O tratamento enzimático pode ser conduzido em qualquer pH adequado, tal como por exemplo, na faixa de 2-10, tal como, em um pH de 4- 9 ou 5-7. Em uma modalidade o tratamento com fosfolipase é realizado a 3- 60°C, tal como a 25-45°C (por exemplo, por pelo menos 5 minutos, tal como, por exemplo, por pelo menos 10 minutos ou pelo menos 30 minutos, por exemplo, por 5-120 minutos). A fosfolipase é adicionada em uma quantidade adequada para produzir o queijo possuindo as propriedades desejadas.

Preferivelmente, a fosfolipase é adicionada em uma quantidade efetiva para diminuir o efeito de exsudação oleosa no queijo e/ou para aumentar o rendimento de queijo. Uma dosagem de fosfolipase apropriada normalmente estará dentro da faixa de 0,001-5 mg de proteína enzimática por g de gordura de leite, preferivelmente 0,01-0,3 mg de proteína enzimática por g de gordura de leite, com maior preferência 0,02-0,1 mg de proteína enzimática por g de gordura de leite.

Os queijos produzidos pelo processo da presente invenção compreendem todas as variedades de queijo, tais como, por exemplo Campesino, Chester, Danbo, Drabant, Herregard, Manchego, Provolone, Saint Paulin, Queijo Macio, Svecia, Taleggio, Queijo Branco, incluindo queijo de coalhada produzido pela coagulação do leite por coalho; queijos maturados tais como Cheddar, Colby, Edam, Muenster, Gruyere, Emmenthal, Camembert, Parmesan e Romano; queijo azul, tal como queijo azul dinamarquês; queijos frescos tal como Feta, queijos coagulados por ácido tais como queijo cremoso, Neufchatel, Quang, Queijo Cottage e Queso Blanco.

Em uma modalidade preferida a invenção se refere a um processo para produzir queijo do tipo pasta filata, tal como por exemplo queijos Mozzarella e Pizza. Queijos de pasta filata, ou de coalhada estirada, são normalmente distinguidos por um tratamento de amassadura e de plasticização incomuns da coalhada fresca em água quente, que confere ao queijo acabado sua estrutura fibrosa característica e propriedades de estiramento e de fusão, cf. por exemplo "Mozzarella and Pizza cheese" de Paul S. Kindstedt, Chese: Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 2: "Major Cheese Groups", second edition, páginas 337-341, Chapman & Hall.

Listagem de seqüências e microorganismos depositados O presente pedido contém informação na forma de uma listagem de seqüências, que está anexada ao pedido e também submetida a um portador de dados acompanhando este pedido. Em adição, o presente pedido refere-se aos microorganismos depositados. Os conteúdos do portador de dados e dos microorganismos depositados são aqui totalmente incorporados como referência.

Depósito de material biológico 0 seguinte material biológico tem sido depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemanha, e recebido o seguinte número de acesso: MATERIAIS E MÉTODOS

Meios e substratos Meio YP+2%G 10 g de extrato de levedo 20 g de peptona água para 1 L autoclavar a 121°C, 20 minutos adicionar 100 mL de solução de glicose estéril a 20% Meio de esporulacão RA 50 g de ácido succínico 12,1 g de nitrato de sódio 1 g de glicose 20 mL de sais de Vogei 50x (Davis, R. H. e F. J. de Serres (1970), Meth. Enzymol 17A:79-143) componentes são misturados em um litro de água destilada e esterilizados por filtração.

Tampão de Britton Robinson ácido fosfórico 0,023 M

ácido acético 0,023 M

ácido bórico 0,023 M

Titulado com NaOH ou HC1 para pH desejado. Métodos Atividade de fosfolipase (LEU) Lecitina é hidrolisada sob pH e temperatura constantes, a atividade de fosfolipase é determinada como a taxa de consumo de titulante (NaOH 0,1 N) durante a neutralização do ácido graxo liberado. O substrato é lecitina de soja (L-a-Fosfatidil-Colina), nas condições de pH 8,00, 40,0°C, tempo de reação de 2 min. A unidade é definida em relação a um padrão.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Expressão de uma fosfolipase A2 de Tuber albidum em Aspergillus oryzae A seqüência de DNA descrita em Soragni et al. {supra) foi usada para projetar iniciadores para a amplificação por PCR de TbSpl de DNA genômico, com sítios de restrição apropriados adicionados nas extremidades de iniciador para facilitar a clonagem do produto de PCR (SEQ ID NO: 13 e 14). Uma cepa de Tuber albidum, CBS 272.72, foi obtida de CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Países-Baixos), e cultivada sobre ágar-X a 20°C, como recomendado por CBS em List of Cultures, 1996. Micélio foi removido da superfície da placa, e DNA total foi isolado usando um Kit FastDNA Spin (BIO101, Inc., Vista, CA), seguindo as instruções do fabricante. Amplificação por PCR foi realizada utilizando o Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Surrey, U.K.) seguindo as instruções do fabricante e usando uma temperatura de anelamento de 52°C para os primeiros 5 ciclos e de 62°C para os últimos 25 ciclos. Um único produto de PCR foi obtido, e a seqüência foi determinada e é apresentada como SEQ ID NO: 9 excluindo os sítios de restrição sintéticos adicionados.

Comparação desta seqüência genômica com a seqüência de cDNA apresentada por E. Soragni et al revelou um intron único. Quando o intron é removido, a sequência de nucleotídeos de Tuber albidum CBS 272.72 é 92,5% idêntica àquela de I borchii ATCC 96540, a cepa usada por E.

Soragni et al O peptídeo correspondente predito da sequência de gene de Tuber albidum CBS 272.72 é 93,8% idêntico à seqüência de peptídeo relatada por E. Soragni et al. O fragmento de PCR foi restrito com BamHl e Xhol e clonado em vetor de expressão pMStr57 de Aspergillus usando técnicas padrão. O

vetor de expressão pMStr57 contém elementos iguais aos de pCaHj483 (WO 98/00529), com modificações menores feitas no promotor NA2 de Aspergillus, e possui sequências para seleção e propagação em E. coli, e seleção e expressão em Aspergillus. Especificamente, seleção em Aspergillus é facilitada pelo gene amdS de Aspergillus nidulans, que permite o uso de acetamida como a única fonte de nitrogênio. Expressão em Aspergillus é mediada por um promotor de amilase II neutra modificada (NA2) de Aspergillus niger que é fusionado na seqüência líder 5' do gene codificador de triose-fosfato-isomerase (tpi) de Aspergillus nidulans, e o terminador do gene codificador de amiloglicosidase de Aspergillus niger. O gene codificador de fosfolipase A2 do construto de expressão em Aspergillus resultante, pMStr70, foi seqüenciado e a seqüência foi comparada com aquela determinada previamente para o fragmento de PCR não clonado, SEQ ID NO: 9. Uma única mutação de T para C foi encontrada 52 pb a jusante do códon de terminação.

Aspergillus oryzae foi transformado com pMStr70 usando técnicas padrão descritas em Christensen, T. et al, (1988), Biotechnology 6, 1419-1422. Transformantes foram cultivados em meio YP+2%G agitado a 275 RPM a 30°C e expressão da fosfolipase A2 de Tuber, TbPLA2, foi monitorada por SDS-PAGE.

Caracterização da proteína SDS-PAGE revelou duas bandas, com PM aproximado de 25 kDa e 16 kDa. O sobrenadante foi purificado por cromatografia de troca iônica em uma coluna SP-Sepharose equilibrada com tampão de acetato 50 mM, e eluída com NaCl 1 M pH 5,0. As duas proteínas foram eluídas em duas frações separadas. Concentração de proteína foi determinada usando Protein Assay ESL de Roche. Atividade foi determinada no ensaio LEU.

As proteínas foram submetidas ao seqüenciamento N-terminal.

Foi verificado que a seqüência N-terminal da coleção 1 (banda de 23-25 kDa) corresponde aos aminoácidos 32-50 de SEQ ID NO: 10. Separação- imobilização-em-membrana da coleção 2 (banda de 16 kDa) revelou duas bandas com seqüências N-terminais correspondendo aos aminoácidos 86-98 e 91-103, respectivamente. Análise de espectro de massa das duas bandas mostrou massas de 13934 Da e 14348 Da respectivamente, combinando dentro de 5 Da dos valores calculados das seqüências de aminoácidos 86-120 e 91-120 de SEQ ID NO: 10, respectivamente.

Exemplo 2: Procedimento de purificação para duas formas de PLA2 de Γ. albidum expressadas em Aspergillus oryzae Na maioria dos fermentações do transformante de Aspergillus oryzae descrito no Exemplo 1 que produz a PLA2 de T. albidum, duas formas da enzima foram detectadas durante a purificação. Uma forma que compreende 22-23 kDa em SDS-PAGE e corresponde ao peptídeo relatado por Soragni et al {supra). Adicionalmente, uma forma nova foi detectada a qual compreende 16-17 kDa em SDS-PAGE e que possui uma atividade específica alta e um ponto isoelétrico elevado.

Purificação do peptídeo de 22-23 kDa O sobrenadante da fermentação contendo fosfolipase de T. albidum em A. oryzae (preparado no Exemplo 1) foi esterilmente filtrado usando filtro EKS obtido de Seitz Shenk Bad Kreuznach, Bettringerstrasse 42, Alemanha, D-73550, Waldstetten. O sobrenadante filtrado estéril foi então ajustado para pH 8 e a força iônica abaixo de 4 mSi.

Cromatoerafia de troca iônica Primeira etapa de purificação foi realizada em uma cromatografia de troca iônica usando coluna Fast Flow Q™ Sepharose de 50 mL obtida da Amersham Pharmacia. A coluna foi equilibrada com tampão de Tris-acetato 50 iriM de pH 8. O caldo de fermentação filtrado estéril foi então aplicado sobre a coluna e a coluna foi lavada com o mesmo tampão até que todo o material não ligado fosse removido.

As proteínas ligadas foram eluídas com o mesmo tampão contendo cloreto de sódio 1 M de pH 8 com vazão de fluxo de 5 mL/min e para um volume final de 500 mL de tampão total. Frações de 5 mL foram, cada uma, coletadas usando coletor de fiação e a atividade de fosfolipase de todas as frações contendo foi ensaiada qualitativamente usando Lecitina como um substrato empregando L-a-fosfatidil-colina obtida da Sigma produto P- 5638 e a atividade foi ensaiada usando o kit NEFA C obtido da Wako Chemicals GmbH, Nissan Strasse 2, 41468 Neuss, Alemanha. Ensaio exato é descrito abaixo.

Soluções de substrato contendo 10 mg/mL de substrato Lecitina foram preparados em tampões diferentes tais como Acetato de 50 mM pH 5 ou Hepes de 50 mM pH 7 ou Tris-acetato de 50 mM pH 9 como tampões contendo CaCl2 2 mM e Triton X-100 a 0,1% obtido de Fluka Chemicals. Substrato foi então emulsificado por agitação e aquecimento a 50°C e então esfriado para 40°C e usado como substrato.

Ensaio da atividade foi realizado usando 300 pL da emulsão de substrato incubados com 25 pL das frações de enzima por 20 minutos a 40°C então 30 pL da mistura de ensaio foram transferidos para 300 pL do reagente A colorido NEFA C preparado como descrito pelo fabricante e incubados por 10 minutos a 37°C e 600 de solução de reagente B colorido NEFA C foram adicionados na mistura que foi adicionalmente incubada por 10 minutos. A cor azul formada foi então medida em um espectrofotômetro a 505 nm.

Caracterização da proteína Frações contendo a atividade foram então reunidas e caracterizadas para peso molecular usando eletroforese em SDS-PAGE utilizando geles vazados Novex Pre de geles de Tris-Glicina a 4-20% da Invitrogen Life Tecnologies, Carlsbad CA 92008, USA.

Proteína de 22-23 kDa foi detectada e separada-imobilizada- em-membrana e a análise N-terminal foi realizada usando um seqüenciador Applied Biosystem.

Os primeiros 19 resíduos de aminoácido da terminação N foram determinados e foi verificado que têm a seqüência de aminoácidos 32- 50 de SEQID NO: 10.

Purificação do nentídeo de 16-17 kDa Sobrenadante de fermentação filtrado estéril da fosfolipase de T. albidum expressada em A. oryzae foi ajustado para pH 4,7 e a força iÔnica foi ajustada para abaixo de 4 mSi.

Cromato grafia de troca iônica Coluna SP-Sepharose™ Fast Flow foi obtida da Amersham Pharmacia. Coluna de 50 mL foi empacotada e equilibrada com tampão de acetato de 50 mM de pH 4,7. O sobrenadante de fermentação foi então aplicado sobre a coluna e o material não ligado foi removido usando o mesmo tampão.

Proteína ligada com pi alto foi então eluída com um gradiente de sal linear usando tampão de acetato de 50 mM de pH 4,7 contendo cloreto de sódio 1 M. Frações e vazão de fluxo foram semelhantes àquelas usadas para a forma de pi baixo da fosfolipase. A atividade de fosfolipase nas frações foi ensaiada qualitativamente usando o kit NEFA como acima. Frações contendo a atividade de fosfolipase foram reunidas e SDS-PAGE foi realizada como descrito acima.

Proteína de 16-17 kDa foi observada a qual teve um ponto isoelétrico alto, acima de 9. A análise N-terminal da proteína foi realizada após a separação-imobilização-em-membrana da proteína e usando o seqüenciador Applied Biosystem que mostrou uma terminação N que foi completamente diferente daquela publicada em Soragni et al {supra). Assim, foi verificado que a PLA2 de T. albidum possui duas formas derivadas do processamento N- terminal diferencial com seqüências N-terminais correspondendo aos aminoácidos 86-105 e 91-110 de SEQID NO: 10, respectivamente.

Exemplo 3: Preparação de queijo com fosfolipase de T. albidum Creme de leite não-homogeneizado, pasteurizado (North Carolina State University Dairy Plant) foi usado para estandardizar quinhentos gramas de leite desnatado não-homogeneizado, pasteurizado (North Carolina State University Dairy Plant) para 3,5% de gordura produzindo assim queijo mozzarella totalmente gorduroso. O leite de queijo para cada experimento foi tratado quer com a fosfolipase de T. albidum de 16- 17 kD preparada de acordo com o exemplo 2, quer com fosfolipase comercial Lecitase® 10L (Novozymes A/S, Bagsvaed, Dinamarca), e deixado em um banho de água a 35°C até ficar equilibrado nesta temperatura. O pH inicial do leite de queijo foi medido e 0,01% (p/p) de cultura iniciadora foi adicionado. O pH foi monitorado até que um pH de 6,4 fosse alcançado. 250 pL de coalho (Novozym 89L) foram adicionados em 9 mL de solução total com água deionizada, um mL desta solução foi adicionado no leite de queijo e o leite de queijo foi vigorosamente agitado por 3 minutos. A barra de agitação foi removida e o leite coalhado foi permitido repousar a 35°C.

Após os tratamentos acima, a coalhada estava pronta para ser cortada quando uma espátula foi inserida e bordas nítidas foram observadas. O queijo foi cortado ao pressionar a coalhada para baixo e ao mesmo tempo segurando o becher girando rapidamente o cortador e finalmente puxando-o para cima. A coalhada foi permitida repousar por 5 minutos e então foi agitada cuidadosamente com uma colher. A temperatura foi elevada para 41°C com agitação suave intermitente por ~45 min ou até que o pH caísse para 6,0-5,9. A coalhada foi drenada usando talagarça e então reposicionada no becher e mantida a 41°C em banho de água ao mesmo tempo removendo o soro de leite conforme a necessidade.

Quando a coalhada alcançou pH 5,3, a tigela de aço inoxidável com a coalhada foi imersa em um banho de água a 69°C por 5 minutos e então a coalhada foi manualmente estirada. A coalhada foi temperada em água gelada por 30 minutos. A coalhada de queijo foi seca com papel-toalha, pesada e refrigerada durante a noite.

Experimentos de preparação de queijo de controle foram feitos na mesma batelada de leite seguindo os mesmos procedimentos exceto que não foi adicionada fosfolipase.

Rendimento de queijo real foi calculado como o peso de queijo após o estiramento em relação ao peso total de leite de queijo.

Rendimento de queijo ajustado em umidade foi expressado como o rendimento real ajustado para nível de umidade constante padrão.

Rendimento ajustado em umidade foi calculado multiplicando o rendimento real pela razão de conteúdo de umidade real para a umidade padrão, de acordo com a seguinte fórmula: na qual YajUStado = rendimento de queijo ajustado em umidade, Yreal = rendimento de queijo real, Mreai = fração de umidade real & Mpadrào = fração de umidade padrão (0,48).

Os rendimentos de queijo ajustado em umidade de todos os experimentos e controles são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 Exemplo 4: Clonagem e expressão de uma fosfolipase (FvPLA2) de Fusaríum venenatum em Aspergittus oryzae Células de Fusarium venenatum A3/5 (originalmente depositadas como Fusarium graminearum ATCC 20334 e recentemente reclassificadas como Fusarium venenatum por Yoder e Christianson, 1998, Fungai Genetics anâ Biology 23: 62-80; e 0'Donnell et al, 1998, Fungai Genetics and Biology 23: 57-67) foram crescidas por dois dias em meio mínimo de Vogei (Davis, R. H. e F. J. de Serres (1970), Meth. Enzymol 17A:79-143) a 28°C em cultura agitada, filtradas sobre Miracloth estéril (Calbiochem, San Diego, Califórnia, USA), e transferidas para "meio de esporulação RA" no qual foram inoculadas em cultura agitada por um adicional de 24 h a 28°C. Células e esporos foram coletados por centrifugação e lisados, e RNA foi extraído e transcrito em cDNA que foi clonado em pZErO-2 pelos métodos descritos em WO 00/56762. O número de clones c independentes nesta biblioteca antes da amplificação foi 2,5x10 , dos quais 92% continha insertos variando em tamanho de 550-2500 pb. Sequências de DNA parciais foram determinadas para aproximadamente 1.000 clones aleatoriamente escolhidos e as seqüências foram armazenadas em um banco de dados de computador pelos métodos descritos em WO 00/56762, A seqüência de nucleotídeos de um cDNA codificador de TbSPl, uma fosfolipase A2 de Tuber borchii, e a tradução de peptídeo correspondente foram relatadas por E. Soragni et ai, 2001. Esta seqüência de peptídeo traduzida foi comparada com as traduções das seqüências de cDNA parciais de Fusarium venenatum usando o programa TFASTXY, versão 3.3t08 (Pearson et al, 1997). Uma seqüência de F. venenatum traduzida foi identificada como possuindo 42% de identidade com TbSPl através de uma sobreposição de 125 aminoácidos. A seqüência completa do inserto de cDNA do clone correspondente, FM0700, foi determinada e é apresentada como SEQ ID NO: 15, e o peptídeo traduzido desta seqüência, FvPLA2, é apresentado como SEQ ID NO: 16. Esta seqüência foi usada para planejar os iniciadores FvPLAl e FvPLA2.2 para amplificação por PCR do gene codificador de FvPLA2 de FM0700, com sítios de restrição apropriados adicionados nas extremidades de iniciador para facilitar a subclonagem do produto de PCR.

FvPLAl: CTGGGATCCTCAAGATGAAGTTCAGCG

FvPLA2.2: GACCTCGAGACCCGCCATTTAAGATT

Amplificação por PCR foi realizada usando o Extensor Hi- Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Surrey, U.K.) seguindo as instruções do fabricante e usando uma temperatura de anelamento de 52°C e uma temperatura de extensão de 60°C para 20 ciclos. O fragmento de PCR foi restrito com BamHI e Xhol e clonado em vetor de expressão em Aspergillus pMStr57 usando técnicas padrão. O

vetor de expressão pMStr57 contém elementos iguais ao pCaHj483 (WO 98/00529), com modificações menores feitas para o promotor NA2 de Aspergillus como descrito para o vetor pMT2188 em WO 01/12794, e possui as seqüências para seleção e propagação em E. coli, e seleção e expressão em Aspergillus. Especificamente, seleção em Aspergillus é facilitada pelo gene amdS de Aspergillus nidulans, que permite o uso de acetamida como a única fonte de nitrogênio. Expressão em Aspergillus niger é fusionada na sequência líder 5' do gene codificador de triose-fosfato-isomerase (tpi) de Aspergillus nidulans, o terminador do gene codificador de amilO-glicosidase de Aspergillus niger. O gene codificador de fosfolipase do construto de expressão em Aspergillus resultante, pMStr77, foi seqüenciado e a seqüência concordou completamente com aquela previamente determinada para o inserto de FM0700. A cepa BECh de Aspergillus oryzae (WO 00/39322) foi transformada com pMStr77 usando técnicas padrão (T. Christensen et al., 1988). Transformantes foram cultivados em meio YP+2%G agitado a 275 RPM a 30°C e a expressão de FvPLA2 foi monitorada por SDS-PAGE.

Uma cepa de Escherichia coli contendo um gene codificador da fosfolipase e F. venenatum foi depositada pelos inventores sob os termos do Tratado de Budapeste aos 12 de fevereiro de 2003. O depósito foi feito na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemanha. O depósito foi aos 12 de fevereiro de 2003, e o número de acesso foi DSM 15442.

Exemplo 5: Purificação e comparação de seqüência de FvPLA2 FvPLA2 da fermentação do exemplo 4 foi purificada por cromatografia de troca iônica sobre uma coluna SP-Sepharose equilibrada com tampão de acetato de 50 mM de pH 4,7, e eluída com NaOH 1 M de pH 4,7. Frações foram analisadas em SDS-PAGE, e frações contendo uma proteína de 14 kDa foram reunidas. A identidade da proteína pura foi confirmada pela determinação da seqüência N-terminal, que foi idêntica à seqüência de aminoácidos (aa) 29-40 de SEQ ID NO: 16. Adicionalmente, a massa do peptídeo foi determinada por análise espectral de massa, devido ao fato de o tamanho aparente estimado da SDS-PAGE, 14 kDa, ser menor do que o do peptídeo predito pelo processamento do peptídeo teórico em SEQ ID NO: 16. A massa de FvPLA2 ativa, purificada, verificada foi 13336 Da. Esta massa molecular indica processamento adicional na terminação-C, e é consistente com uma divagem entre aminoácidos 149 e 150 na SEQ ID NO: 16, visto que a seqüência de peptídeo dos aminoácidos 29 a 149 possui uma massa teórica de 13335,66 Da.

Uma comparação do peptídeo processado maduro (aminoácidos 29-149 de SEQ ID NO: 16) com as seqüências conhecidas mostrou que a seqüência da arte anterior mais próxima foi uma fosfolipase de Verticillium dahliae traduzida de Unisequence ID: VD0100C34 do Banco de Dados de EST de Oomiceto e de Fungos Fitopatogênicos da COGEME

Versão 1.2 (http://cogeme.ex.ac.uk/) (Soanes et al (2002) "Genomics of phytopathogenic fungi and the development of bioinformatic resources"; Mol Plant Microbe Internet. 15(5):421-7). O processamento do peptídeo parcial predito da seqüência de V dahliae foi estimado pela comparação do processamento verificado para FvPLA2. A identidade entre aminoácidos 29 a 149 de SEQ ID NO: 16 e a seqüência estimada do peptídeo maduro da fosfolipase de V dahliae calculada foi 77%.

Exemplo 6: Propriedades físicas de GvPLA2 Atividade catalítica Atividade de fosfolipase como uma função da concentração de enzima foi determinada no ensaio LEU para FvPLA2 no exemplo 4. Os resultados são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 Perfil de temperatura A atividade da enzima como uma função da temperatura foi determinada para uma solução de enzima com uma concentração de 5,3 pg/mL. Outras condições como no ensaio LEU. Resultados são mostrados na tabela 2.

Tabela 2 Estabilidade em pH A enzima foi diluída em um tampão de Britton Robinson no pH especificado por 30 min a 30°C. Após diluição adicional em água a atividade catalítica foi medida como no ensaio LEU. Os resultados são mostrados na tabela 3.

Tabela 3 Estabilidade térmica A enzima foi diluída em tampão de Britton Robinson em pH 3 e pH 10 respectivamente, e em pH 7 com sorbitol a 30%. Após incubação na temperatura especificada por 30 minutos, a solução foi esfriada para a temperatura de reação e ensaiada no ensaio LEU. Os resultados são mostrados na tabela 4; as atividades são dadas em relação à atividade medida mais alta.

Tabela 4: Atividade relativa (%) como uma função da temperatura e do pH

Exemplo 7: Preparação de queijo com FvPLA2 Creme de leite não-homogeneizado, pasteurizado (North Carolina State University Dairy Plant) foi usado para estandardizar quinhentos gramas de leite desnatado não-homogeneizado, pasteurizado (North Carolina State University Dairy Plant) para 3,5% de gordura produzindo assim queijo mozzarella totalmente gorduroso. O leite de queijo para cada experimento foi tratado quer com a fosfolipase (FvPLA2) de F. venenatum preparada de acordo com o exemplo 5, quer com fosfolipase comercial Lecitase® 10L (Novozymes A/S, Bagsvaed, Dinamarca), e deixado em um banho de água a 35°C até ficar equilibrado nesta temperatura. O pH inicial do leite de queijo foi medido e 0,01% (p/p) de cultura iniciadora foi adicionado. O pH foi monitorado até que um pH de 6,4 fosse alcançado. 250 jjL de coalho (Novozym 89L) foram adicionados em 9 mL de solução total com água deionizada, um mL desta solução foi adicionado no leite de queijo e o leite de queijo foi vigorosamente agitado por 3 minutos. A barra de agitação foi removida e o leite coalhado foi permitido repousar a 35°C.

Rendimento ajustado em umidade foi calculado multiplicando o rendimento real pela razão de conteúdo de umidade real para a umidade padrão, de acordo com a seguinte fórmula: na qual YajUstado - rendimento de queijo ajustado em umidade, Yreai = rendimento de queijo real, Mreai = fração de umidade real & Μρ8(Μο - fração de umidade padrão (0,48).

Os rendimentos de queijo ajustado em umidade de todos os experimentos e controles são mostrados na tabela 5.

Tabela 5 Exemplo 8: Preparação de queijo com FvPLA2 Leite foi pasteurizado a 72°C por 15 segundos e então esfriado para abaixo de 10°C. Leite foi estandardizado para 2,4% de gordura com creme de leite. Após estandardização o leite foi preaquecido em um trocador de calor em uma temperatura de pré-maturação de 34,5°C. 150 kg De leite foram derramados em cada cuba de queijo e 15 g de cultura (F-DVS ST-M6) foram adicionados. A fosfolipase do exemplo 5 foi adicionada em uma dosagem de 5 LEU/g de gordura e o leite foi incubado por lha 34,5°C.

Coalho (Chy-Max Plus, 200 IMCU) foi adicionado e agitação foi continuada por não mais do que 4 min.

Após aproximadamente 60 min a coalhada foi julgada pronta para ser cortado usando facas de 10 mm. O agitador foi retomado para a cuba e após 10 min., a escaldadura foi iniciada pelo aumento da temperatura para 41°C dentro de 30 min. Após alcançar 41°C uma agitação adicional por aproximadamente 20 min. ocorreu até que fosse alcançada uma acidez titulável de 0,15-0,16%. A coalhada foi permitida sedimentar dentro da cuba, e o soro de leite foi drenado. A coalhada foi cortada em blocos uniformes e os blocos foram virados e empilhados em dois. Subseqüentemente, em intervalos de 10 min. os blocos foram virados e mantidos em pilhas de dois. Em um pH de cerca de 5,15-5,20, a coalhada foi moída em uma máquina de moagem. Os pedados de coalhada receberam adição de 2 por cento (p/p) de sal. Após moagem toda a coalhada foi adicionada em um estirador, que contém 70 L de água pré-aquecida a 74°C. Cerca de 20 L de água quente foram transferidos para a câmara superior e o queijo foi adicionado. Quando a temperatura da coalhada alcançou 62°C, o estiramento foi interrompido e a coalhada foi movida para a extrusora. Queijos foram extrusados em tabletes de 8-9 queijos, cada um de 2,3 kg, e esfriados em água de 5-7°C por 20 min. Após 20 min. de esfriamento os queijos foram movidos para a salmoura saturada e salgados por 1,5 horas a 5-6°C. A salmoura foi preparada pela misturação de 120 kg de água, adicionando sal para 22 Be, 750 g de CaCl2 (solução a 34%) e ajustada para pH 5,1. Após salgamento cada queijo foi seco por cerca de 30 min. e pesado antes da embalagem a vácuo. Amostras foram retiradas para medida de pH e análises de composição (umidade, sal, gordura e proteína) após armazenagem de cerca de 1 semana em sala fria.

Rendimento real (RR) foi ajustado para 48% de umidade no queijo: Tabela 6 Exemplo 9: Superexpressão de PLA2 de Aspergülus oryzae (AoPLA2) em Aspergülus oryzae Meio DAP2C-1 11 gdeMgS04.7H20 1 g de KH2P04 2 g de ácido cítrico, mono-hidrato 30 g de maltodextrina 6 g de K3P04.3H20 0,5 g de extrato de levedo 0,5 mL de solução de metais traço 1 mL de Pluronic PE 6100 (BASF, Ludwigshafen, Alemanha) Os componentes são misturados em um litro de água destilada e divididos em porções em frascos, adicionando 250 mg de CaC03 em cada porção de 150 mL. O meio é esterilizado em um autoclave. Após esfriamento o seguinte é adicionado em 1 litro de meio: 23 mL de (NH4)2HP04 50% (p/v), esterilizado por filtração 33 mL de ácido lático 20%, esterilizado por filtração Solução de metais traço: 6,8 g de ZnCl2 2,5gdeCuS04.5H20 0,24 g de NiCl2.6H20 13,9 g de FeS04.7H20 8,45 g de MnS04.H20 3 g de ácido cítrico, mono-hidrato Os componentes são misturados em um litro de água destilada.

A clonagem e o seqüenciamento parcial de um cDNA codificador de uma fosfolipase A2 de Aspergillus oryzae são descritas em WO 00/56762. A seqüência total do clone, AS3812, é dada na SEQID NO: 6.

Esta seqüência foi usada para planejar o iniciador AoPLAl para uso com o iniciador vetor pYESrev em amplificação por PCR do gene codificador de PLA2 a partir de AS3821 com a adição de um sítio de restrição para facilitar a subclonagem do produto de PCR: AoPLAl: TGAGGATCCATCATGAAGAACATCTTCG

PyesREV: gggcgtgaatgtaagcgtgac A amplificação por PCR foi realizada usando Extensor Hi- Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Surrey, U.K.) seguindo as instruções do fabricante e utilizando uma temperatura de anelamento de 52°C para os primeiros 5 ciclos e de 62°C para os últimos 25 ciclos, e um tempo de extensão de 1,5 minutos. 0 fragmento de PCR foi restrito com BamHI e Xhol e clonado no vetor de expressão em Aspergillus pMStr57 (descrito no Exemplo 1) usando técnicas padrão. O gene codificador de fosfolipase do construto de expressão em Aspergillus resultante, pMStr71, foi seqüenciado e a sequência concordou completamente com aquela determinada previamente para o inserto de AS3812. A cepa BECh2 de Aspergillus oryzae (WO 00/39322) foi transformada com pMStr71 usando técnicas padrão (T. Christensen et al, 1988). Transformantes foram cultivados em meio DAP2C-1 agitado a 270 RPN a 37°C por 4 dias e a expressão da fosfolipase foi monitorada por SDS- PAGE.

Exemplo 10: Purificação e determinação do processamento de peptídeo A fosfolipase de Aspergillus oryzae da fermentação do exemplo 9 foi filtrada através de filtro estéril de 0,22 μ Seitz-EKS obtido da Pall Corporation (Pall SeitzSchenk Filter Systems GmbH Pianiger Str. 137 D- 55543 Bad Kreuznach, Alemanha). A solução estéril filtrada foi então ajustada para pH 4,7 usando ácido acético diluído. A força iônica do sobrenadante da fermentação foi então ajustada de modo que a concentração de sal fosse baixa e a força iônica fosse menor do que 4 mSi. Purificação da proteína PLA2 desejada foi obtida por cromatografia de troca catiônica usando matriz SP Sepharose Fast Flow obtida da Amersham-Pharmacia (Suécia). A matriz trocadora de cátions foi empacotada, lavada, e pré- equilibrada com tampão de acetato de sódio 50 mM de pH 4,7 (Tampão A) em coluna XK26 obtida da Amersham Pharmacia. O sobrenadante de fermentação contendo a PLA2 desejada ajustado para pH e força iônica foi então aplicado na coluna. O material não ligado foi então lavado com o tampão A até que todo o material absorvente de UV fosse removido, o qual foi monitorado por detector UV acoplado no equipamento coletor de frações.

Proteínas ligadas foram então eluídas com um gradiente de sal linear usando Tampão B, que continha cloreto de sódio 1M como sal em tampão de acetato de sódio 50 mM de pH 4,7. O volume total do gradiente linear alcançando concentração de sal de 1 M foi de cerca de 500 mL (10 volumes de colunaO.

Frações de 10 mL cada foram coletadas durante a eluição. Todas as frações foram ensaiadas para atividade de fosfolipase usando Lecitina como substrato obtido de Sigma Chemicals. Ácidos graxos liberados da Lecitina durante incubação com a fosfolipase foram detectados usando o kit NEFA C obtido da Waco Chemicals. Frações contendo a atividade de fosfolipase foram então checadas para pureza da proteína usando a técnica de SDS-PAGE padrão.

Foram reunidas as frações que continham uma banda única da PLA2 desejada mostrando peso molecular ao redor de 16 kDa, como determinado por comparação com padrões de peso molecular da Amersham-Pharmacia. A identidade da proteína pura foi confirmada pela determinação da seqüência N-terminal, que foi idêntica à seqüência dos aminoácidos (aa) 37-45 de SEQ ID NO: 7. Adicionalmente, a massa do peptídeo foi determinada por análise espectral de massa. A PLA2 de Aspergillus ativa, purificada deu duas massas, 14114 Da e 14242 Da. Esta massas moleculares indicam processamento adicional na terminação-C, consistente com a divagem entre aminoácidos 121 e 122 na SEQ ID NO: 7, visto que a seqüência de peptídeo dos aminoácidos 37 a 121 possui uma massa teórica de 14114,11 Da e a divagem entre os aminoácidos 122 e 123, predizendo a seqüência de peptídeo de aminoácidos 37 a 123 com uma massa teórica de 14242,29 Da.

Exemplo 11: Expressão de fosfolipase incompletamente processada de Aspergülus oryzae e de Fusarium venenatum Processamento de PLA2 de Aspergillus oryzae (AoPLA2) e de PLA de Fusarium venenatum (FvPLA2) em ambas as terminações-N e -C ocorre em único ou múltiplos resíduos básicos (lys ou arg), típica dos sítios de divagem das maturases semelhante a Kexin, que são muitas vezes responsáveis pelo processamento de propeptídeos (Jalving, R., et al, (2000) Àppl. Environ. Microbiol 66: 363-368). Com o objetivo de determinar o efeito do processamento sobre a atividade de AoPLA2 e de FvPLA2, as enzimas foram expressadas em uma cepa de Aspergillus oryzae deficiente em Kexin. O processamento foi então avaliado por SDS-PAGE, e a atividade de fosfolipase foi medida para culturas de cepas expressando AoPLA2 e FvPLA2 em ambos os fundos deficiente em Kexin e de tipo selvagem.

Uma cepa de Aspergillus oryzae deficiente em Kexin (kexBm) foi construída por uma disrupção do gene kexB de A. oryziae (EMBL:AB056727) por métodos estabelecidos na arte, tais como aqueles descritos em WO 98/12300 e US6013452. Disrupção de kexB foi confirmada por análise de separação-imobilização-em-membrana de Southern e por monitoração da expressão de peptídeos onde KexB é conhecido por ser responsável pela maturação. A cepa kexB~ foi transformada com o construto de expressão AoPLA2 descrito no Exemplo 9, e com o construto de expressão FvPLA2 descrito no Exemplo 4. Estas cepas foram fermentadas em YP+2%G a 30°C, juntamente com as cepas de expressão kexB+ para ambos AoPLA2 e FvPLA2 descritos nos Exemplos 9 e 4, e cepas não-transformadas como controles. Cepas expressando AoPLA2 foram agitadas a 200 RPM por 4 dias enquanto que cepas expressando FvPLA2 foram agitadas a 275 RPM por 3 dias. O processamento e a expressão de fosfolipase foram avaliados por SD- PAGE.

Em análise SD-PAGE, AoPLA2 foi resolvida como uma banda única distinta em ambas as cepas kexB' e kex.B+. Quando expressada em cepa kexB+, AoPLA2 correu a cerca de 16 kDa, consistente com a migração observada no início para AoPLA2 totalmente processada (Exemplo 10), enquanto que na cepa kexB', AoPLA2 correu a cerca de 27-28 kDa, consistente com uma falta de processamento ou processamento incompleto.

Quando expressada em cepa kexB+, FvPLA2 foi resolvida como duas bandas com pesos moleculares aparentes de 17 kDa e 14 kDa. A banda de 14 kDa corresponde ao peptídeo totalmente processado (Exemplo 5), enquanto que o peptídeo de 17 kDa é uma forma parcialmente processada. Quando expressada em cepa kexB', a FvPLA2 correu como uma banda única a cerca de 18-19 kDa, um tamanho consistente com processamento incompleto.

Nenhumas bandas similares foram vistas em qualquer uma das amostras de controle de cepas não transformadas. Intensidades de banda relativas sugerem que a expressão de AoPLA2 na cepa kexB' foi 1/5 a 1/10 do nível daquela na cepa kexB+, enquanto que a expressão de FvPLA2 na cepa kexB' foi igual a 1/2 do nível daquela na cepa kexB+. A atividade das fosfolipases produzidas por cada cepa foi determinada no ensaio LEY e é mostrada na tabela 7.

Tabela 7 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <12C> SEQUÊNCIA DE_ ÁCIDO MUCLÉICO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, MICRO-ORCANISMO RECOMBINANTE, PREPARAR UMA MASSA OU UM PRODUTO ASSADO FEITO DA MASSA, PROCESSOS

PAPA REDUZIR O CONTEÚDO DE FÓSFORO EM UM ÓLEO VEGETAL E PARA

PRODUZIR QUEIJO <140> PI 0409599-5 -2!0> asp >U Slü Vil 11« Ala Glv gIp ihr oly asp vai pro asp Phe asp rtir Gin 11« Tftr Glu Pm Thr Gly Glu 01» asp Arg «1» Asp vai Ala “r i5oser ?r° Ars 5S!A,a Gly yh<> As" i4o Le“ M°Ser Cys tít Ar, Hls ASP Ph« «Tg Tyr Arg Asn ryr Lys Gin h,s a„ «. ryr Asn Glv C|S Ala tys Tyr ser Glç lbu Glu Ser Trp L|s Gly vai 195 200 205 Gly Trp Leu 210 <210> 2 <211> $88 <212> ONA <213> Verticillium dahliae <220> <221> Característica mlsc <222> (25).. (26) <223> n is a, c, g, or t <22Q>

<221> CDS <222> (72)..(587) <400> 2 cagtttgaag tcccagcccc tgctnntcet cctgcttctc cccgtccagt ctttgggatt 60 ttcctctcat c atg aag ttc aac gca att ctc ctg gcc ctc gtg cct gcc 110 Met Lys phe Asn Ala Ile Leu Leu Ala Leu vaT Pro Ala 1 5 10 gcc ctg gct ctg ccc acc acc gac gag gcg cag acc ccc aag ctc gcc 158 Ala Leu Ala Leu pro Thr Thr Asp Glu Ala Gin Thr Pro Lys Leu Ala 15 20 25 gcg cgc cag age ate acg gcc gtc acc gac age ctg tcc ttc tcc ctg 206 Ala Arg Gin ser ile Thr Ala Vai Thr Asp Ser Leu ser Phe ser Leu 30 35 40 45 acg ctg cct cag ttc acc acg cgc cgc aac aac cgc aac ccc gcc aac 254 Thr Leu Pro Gin Phe Thr Thr Arg Arg Asn Asn Arg Asn Pro Ala Asrt 50 55 60 ctc gac tgg age tcc gac ggc tgc aca acg tet cct gac aac cca ttc 302 Leu Asp Trp ser ser Asp GTy cys Thr Thr ser Pro Asp Asn pro Phe 65 70 75 gga ttc ccc ttt gtg ccg gcc tgc cac cgc cac gac ttt ggc tac cac 350 Giy Phe pro Phe vai pro Ala cys His Arg His Asp Phe cTy ryr His 80 85 90 aac ttc cgc gcc cag acc cgc ttc acc gag age aac aag ctc cgc ate 398 Asn Phe Arg Ala Gin Thr Arg Phe Thr Glu Ser Asn Lys Leu Arg Ile 95 100 105 gac aac cag ttc agg acc gat ctg agg ttc cag tgc cag tet tcg age 446 Asp Asn Gin Phe Arg Thr Asp Leu Arg phe Gin cys Gin ser ser ser 110 115 120 125 gtg cgc ggc gtg tgc aac gcc ctg gcg gac gtc tac tac tet gcc gtc 494 VaT Arg cTy VaT cys Asn Ala Leu Ala Asp vai Tyr Tyr ser Ala vai 130 135 140 cgg gcg ttc ggc ggt gac gac gcc acc ccc ggc aag agg gac gag cac 542 Arg Ala Phe GTy GTy Asp Asp Ala Thr pro GTy Lys Arg Asp Glu His 145 150 155 tcg gaa ctc gtc ggc ate tac gac gag aag gtc ggc ate tac gat a 588 ser Glu Leu Vai GTy Ile Tyr Asp Glu Lys Vai GTy Ile Tyr Asp 160 165 170 <210> 3 <2ll> 172 <212> PRT <213> vertlcillium dahliae <400> 3 Met Lys Phe Asn Ala ile Leu Leu Ala Leu vai Pro Ala Ala Leu Ala 15 10 15 Leu Pro Thr Thr Asp Glu Ala Gin Thr pro Lys Leu Ala Ala Arg Gin 20 25 30 ser ile Thr Ala vai Thr Asp ser Leu Ser Phe Ser Leu Thr Leu Pro 35 40 45 Gin Phe Thr Thr Arg Arg Asn Asn Arg Asn Pro Ala aso Leu Asp Trp 50 55 60 ser ser Asp Gly cys Thr Thr ser Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro 65 70 75 80 phe vai pro Ala cys His Arg His Asp Phe Gly Tyr His Asn phe Arg 85 90 95 Ala Gin Thr Arg Phe Thr Glu Ser Asn Lys Leu Arg Ile Asp Asn Gin 100 105 110 Phe Arg Thr Asp Leu Arg Phe Gin cys Gin ser ser Ser Vai Arg Gly 115 120 125 Vai Cys Asn Ala Leu Ala Asp vai Tyr Tyr ser Ala vai Arg Ala Phe 130 135 140 Gly Gly Asp Asp Ala Thr Pro Gly Lys Ara Asp Glu His ser Glu Leu 145 150 155 160 Vai Gly ile Tyr Asp Glu Lys Vai Gly Ile Tyr Asp 165 170 <210> 4 <211> 185 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 4 Met Lys phe Phe ser Ala Leu Ala Leu Ser Ser Leu Leu pro Thr Ala 15 10 15 Ala Trp Ala Trp Thr Gly Ser Glu ser Asp Ser Thr Gly Ala Asp Ser 20 25 30 Leu Phe Arg Arg Ala Glu Thr IIe Gin Gin Thr Thr ASp Arg Tyr Leu 35 40 45 Phe Arg lie Thr Leu Pro Gin phe Thr Ala Tyr Arg Asn Ala Arg Ser 50 55 60 Pro Ala Thr Leu Asp Trp Ser ser Asp ser cys Ser Tyr ser Pro Asp 65 70 75 80 Asn Pro Leu Gly Phe Pro Phe ser Pro Ala cys Asn Arg His Asp phe 85 90 95 Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Gin Ser Arg Phe Thr Asp Asn Asn Lys 100 105 110 Leu Lys lie Asp Gly Asn Phe Lys Thr Asp Leu Tyr Tyr Glr» Cys Asp 115 120 125 Thr His Gly Tyr Gly Ser Thr cys His Ala Leu Ala Asn Vai Tyr Tyr 130 135 140 Ala Ala Vai Arg Glu Phe Gly Arg Thr Lys Gly Glu Leu Gin Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asp Leu Leu Leu Ala His Tyr Asn Glu Leu vai Ala Glu Ala ile 165 170 175 Ala Lys Gly Glu Asp Pro Leu Tyr Tyr 180 185 <210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Hellcosporium sp, <4Q0> 5 Met Lys ser Phe Thr phe Vai Vai Leu Ala Leu Leu Pro phe ser ser 15 10 15 Ala Leu pro Phe Gly Leu Phe His Arg Gly Gly Ile Ala ser Arg Ala 20 25 30 Thr Ile Glu Glu Thr Thr Asp Thr Leu Leu Phe ser Thr Pro Ile Ala 35 40 45 Gin Phe Glu Ala Ala Arg Asn Ala Gin Asn Pro ser Thr Leu Asp Trp 50 55 60 ser ser Asp Gly cys Ser ser ser pro Asp Asp Pro Phe Gly Phe Asp 65 70 75 80 phe Leu ser ser cys His Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys 85 90 95 Lys Gin Asti Arg Phe Thr Ala Pro Asn Lys Ala Arg He Asp Thr Asn 100 105 110 phe Lys Thr asd Met tyr Asn Gin cys Asn Thr Glu Ser Asn ile phe 115 120 125 Thr Arg Ala Ala cys Lys Ala vai Ala Asp lie Tyr Tyr Glu Ala vai 130 135 140 Lys Thr Pha Gly ser Lvs Lys Arg Ala Ala Glu Ala Leu Ala Ala Arg 145 150 155 160 Gin Met Glu Glu Asn Vai Ala Lys Ala 165 <210s> 6 <211> 942 <212> DMA <213> Asperglllus oryzae <220> <221> cos <222> C61)..(726) <4Q0> 6 cgcaagcatc acatctactt cttattgcct attctgtccg agtgctagcc acttatcatc 60 atg aag aac ate ttc gtt gcc act ttg ggc ctg ttc gcc gea gtt tcg 108 Met Lys Asn ile Phe Vai Ala Thr Leu Gly Leu Phe Ala Ala Vai ser 15 10 15 tet gcc ttg ccc tac aca acc cct gtc aat gac aat ccc ate tet gct 156 Ser Ala Leu Pro Tyr Thr Thr Pro vai Asn Asp Asn Pro Ile ser Ala 20 25 30 tta caa gea cgc gcg aca aca tgc tcg gcc aag gcc acg gat aac ctc 204 Leu Gin Ala Arg Ala Thr Thr cys ser Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu 35 40 45 ate ttc aag gtc tec atg aag acc ttc cag aag gcg cgc aag gcc aag 252 Ile Phe Lys vai ser Met Lys Thr Phe Gin Lys Ala Arg Lys Ala Lys 50 55 60 aac ccc tcc aag tgc aac tgg tea tcg gac aac tgc tcc aag tea ccc 300 Asn Pro ser Lys cys Asn Trp ser Ser Asp Asn cys ser Lys Ser Pro 65 70 75 80 gat aag ccc gat gga tac aac ttc ate ccc age tgc caa aga cac gat 348 Asp Lys pro Asp Gly Tyr Asn Phe Ile Pro Ser Cys Gin Arg His Asp 85 90 95 ttc ggc tac cgg aac acg aag aag cag aag cgc ttc aca aag gcc atg 396 Phe GTy Tyr Arg Asn Thr Lys Lys Gin Lys Arg Phe Thr Lys Ala Met 100 105 110 aag aag cgc att gac gac aac ttc aag aag gat ctc tac aag tac tgc 444 Lys Lys Arg ile Asp Asp Asn Phe Lys lys Asp Leu Tyr Lys tyr cys 115 120 125 age caa ttc tcg ggc tgg age tea tgg aag gga gtg gag cgc cgt cgc 492 Ser Gin phe Ser Gly Trp ser ser Trp Lys Gly vai Glu cys Arg Arg 130 135 140 ctt gcg gat gtc tac tat act gct gtc cgc cac ttt ggc aag cgt gat 540 Leu Ala Asp vai Tyr tyr Thr Ala Vai Arg His Phe Gly Lys Arg Asp 145 150 155 160 gaa gcg ctt gag ttt gac cct gag gtt gag ttc gag aag cgt gat gag 588 Glu Ala Leu Glu Phe Asp Pro Glu Vai Glu Phe Glu Lys Arg Asp Glu 165 170 175 gtg gcc gat gtc cag cct gac gaa ttt gat aac ttt gac ggt tet gaa 636 Vai Ala Asp vai Gin Pro Asp Glu Phe Asp Asn Phe Asp Gly Ser Glu 180 185 190 gtt gac cct gat ate gag ggc cag gtc att ccc gaa gtt ctt gaa gat 684 vai Asp Pro Asp lie Glu Gly Gin vai ile Pro Glu Vai Leu Glu Asp 195 200 205 gat gga gtg gat gtg gag aac ctc gac gat att gaa aac ctg 726 Asp Gly vai Asp vai Glu Asn Leu Asp Asp ile Glu Asn Leu 210 215 220 taggttttcg gcattggctc tacactttgc aaatgggtcg tcataatcca ttggaagccg 786 gaggaggagg gaaatcaagg catcttttgg ttgtcagtaa ctttgagtgc ctagtttgtg 846 aattgttttt tgaggttcta tttgaattct gcttttgttc aatcttatag cttcctacgt 906 tgttgtcatt taaaaatgga caggagtatc tgtgag 942 <210> 7 <2U> 222 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 7 wet Lys Asn Ile Phe vai Ala Thr Leu Gly Leu Phe Ala Ala vai ser 15 10 15 ser Ala Leu Pra Tyr Thr Thr pro vai Asn Asp Asn Pro ile ser Ala 20 25 30 Leu Gin Ala Arg Ala Thr Thr cys ser Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu 35 40 45 Ile Phe Lys Vai ser Met Lys Thr Phe Gin Lys Ala Arg Lys Ala Lys 50 55 60 Asn Pro Ser Lys cys Asn Trp Ser ser Asp Asn Cys Ser Lys Ser Pro 65 70 75 80 Asp Lys Pro Asp Gly Tyr Asn Phe Ile Pro ser Cys Gin Arg His Asp 85 90 95 Phe Gly Tyr Arg Asn Thr Lys Lys Gin Lys Arg Phe Thr Lys Ala Met 100 105 110 Lys Lys αγ^ lie Asp A$p Asn phe Lys Lys Asp Leu T^r Lys Tyr cys ser Gin Phe ser Gly Trp ser ser Trp Lys Gly vai Glu Cys Arg Arg 130 135 140 Leu Ala Asp vai Tyr Tyr Thr Ala Vai Arg His Phe Gly Lys Arg Asp 145 150 155 160 Glu Ala Leu Glu Phe Asp Pro Glu vai Glu Phe Glu Lys Arg Asp Glu 165 170 175 vai Ala Asp Vai Gin Pro Asp Glu Phe Asp Asn Phe Asp Gly ser Glu 180 185 190 Vai Asp Pro Asp lie Glu Gly Gin Vai lie Pro Glu vai Leu Glu Asp 195 200 205 Asp Gly vai Asp vai Glu Asn Leu Asp Asp He Glu Asn Leu 210 215 220 <210> 8 <211> 249 <212> PRT <213> Neurospora crassa ^4Q0> 8 Met Lys Pro Phe Phe Leu ile Ser Leu Leu Vai Thr Vai Phe Met ser 15 10 15 Leu Met Leu Ala Thr Thr Ala Gin Pro ser Leu Pro Leu Asn Asn Arg 20 25 30 Arg Glu Leu Ala Glu His Pro Pro vai Lys Gly Asn Pro Pro Asn Thr 35 40 45 Gly Tyr Ala Leu Asp Trp Cys Lys Tyr Thr Ala Gly Met Leu Phe Gin 50 55 60 Trp Asp Leu Pro Thr Phe lie Lys His Arg Glu Ala Asn Phe Ser Leu 65 70 75 80 Gly Arg Leu Thr trp Asp Trp ser ser Asp Gly cys Thr His vai pro 85 90 95 Asp Asn Pro Vai Gly Phe Pro Phe Lys pro Ala cys Gin Arg His Asp 100 105 110 Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Gin vai Gin Phe His Phe Thr Pro Arg Ala 115 120 125 Arg Trp Lys lie Asp Glu Asn Phe Leu Lys Glu Met Lys Phe Gin cys 130 135 140 Xle Gly Mis Asn lie Phe Asn Ala Cys His phe Met Ala His val Tyr 145 150 155 160 His Trp Gly val Arc| Thr Phe Tyr Lys Gl^ His Glu Gin Tyr αγ| Glu ser Glu Pro ser His Lys Met Met Asp Thr Met val Ala ser Glu ser 180 185 190 Ser Asp Val Phe Asp Gly Met Asp Ala Asp Glu Ala Arg Asp Ala Leu 195 200 205 Asn Pro Tyr Leu ser Glu Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Tyr Asp Arg Ala 210 215 220 Leu Ala Arg Tyr Asn Lys cys val Glu Glu Ala Met Ala Gin Gly xle 225 230 235 240 Asp Leu Gin Lys Tyr Trp Ala Ala Phe 245 <210> 9 <211> 832 <212> DNA <213> Tuber albidum <220>

<221> CDS <222> (2)..(426) <220>

<221> CDS <222> (476)..(680) <40fo· 9 a atg gtc aag att gct gcc att gtc ctc cta atg gga att cta gcc aat 49 Met Val Lys xle Ala Ala IIe Val Leu Leu Met Gly Xle Leu Ala Asn 15 10 15 gct gcc gcc ate cct gtc age gag cca gea gcc ctg gcg aag cgt gga 97 Ala Ala Ala lie Pro val Ser Glu Pro Ala Ala Leu Ala Lys Arg Gly 20 25 30 aac gct gag gtc att gct gaa caa act ggt gat gtc ccg gat ttc aac 145 Asn Ala Glu val xle Ala Glu Gin Thr Gly Asp Val pro Asp Phe Asn 35 40 45 act caa att aca gag cca act ggg gag gga gac cgt ggg gat gtg gtc 193 Thr Gin xle Thr Glu Pro Thr Gly Glu Gly Asp Arg Gly Asp VaT Val 50 55 60 gac gaa acc gat ttg tcc acg gat att gtc cca gag acc gag gct gct 241 Asp Glu Thr Asp Leu Ser Thr Asp lie val Pro Glu Thr Glu Ala Ala 65 70 75 80 tcc ttc gcc gct agt tea gta tet gea gcc tea cca gea tet gac acc 289 ser Phe Ala Ala Ser ser val Ser Ala Ala Ser Pro Ala Ser Asp Thr 85 90 95 gac agg ctt ctc tac tca acc tcc atg ccc gcc ttc ttg act gct aag 337 Asp Ara Leu Leu Tyr ser Thr ser Met pro Ala phe Leu Thr Ala Lys 100 105 110 cgc aat aag aac ccc ggc aac ttg gac tgg age gat gat gga tgc age 385 Arg Asti Lys Asn pro Gly Asri Leu Asp Trp ser Asp Asp Gly cys Ser 115 120 125 aac tcc ccg gac agg cct gea ggg ttt aac ttc ctt gac tc 426 Asr» ser Pro Asp Arg Pro Ala Gly Phe Asn phe Leu Asp ser 130 135 140 gtaagtcctc cttcatttat gctatctaca ttcactaata ttcgaacag c tgc aag 482 Cys Lys cgt cac gac ttc ggg tac cgc aac tac aag aag cag cgc cgc ttc aca 530 Arg Hls Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Lys Gin Arg Arg Phe Thr 145 150 155 160 gag cct aat cgc aag cgc att gat gac aat ttc aag aag gac cta tat 578 Glu Pro Asn Arg Lys Arg ile Asp Asp Asn Phe Lys Lys Asp Leu Tyr 165 170 175 aat gag tgc gcc aag tac tet ggc ctc caa tcc tgg aaa gat gtt gcc 626 Asn Glu cys Ala Lys Tyr ser Giy Leu Gin Ser Trp Lys Gly vai Ala 180 185 190 tgc cgc aaa ate gcg aac act tac tac gat gct gta cgc tcc ttc gat 674 cys Arg Lys Ile Ala Asn Thr Tyr Tyr Asp Ala Vai Arg ser Phe Gly 195 200 205 tgg ttg taaatgtgcg gaagagatat caagtgggat cgaggaagag gatggtgaaa 730 Trp Leu 210 gagctgagag gtggatttct ttacattccg caatggctac tacagaagaa ctgtgctcct 790 caaatttaat ctcatttttg tgtctatcta tccactctag aa 832 <21Q> 10 <211> 210 <212> PRT <213> Tuber albidum <4Q0> 10 Met vai tys ile Ala Ala ile vai Leu Leu Met Gly ile Leu Ala Asti 15 10 15 Ala Ala Ala ile Pro vai ser Glu pro Ala Ala Leu Ala Lys Arg Gly 20 25 30 Asn Ala Glu vai ile Ala Glu Gin Thr Gly Asp vai pro Asp phe Asn 35 40 45 Thr Gin ile Thr Glu Pro Thr Gly Glu Gly Asp Arg Gly Asp vai Vai 50 55 60 Asp Glu Thr Asp Leu ser Thr Asp ile Vai pro Glu Thr Glu Ala Ala 65 70 75 80 ser Phe Ala Ala Ser ser Vai ser Ala Ala ser pro Ala Ser Asp Thr 85 90 95 Asp Arg Leu Leu Tyr ser Thr ser Met Pro Ala Phe Leu Thr Ala Lys 100 105 110 Arg Asn Lys asn pro Gly Asn Leu Asp Trp Ser Asp Asp Gly cys ser 115 120 125 Asn Ser Pro Asp Arg Pro Ala Gly Phe Asn Phe Leu Asp ser cys Lys 130 135 140 Ar^ His Asp phe Gly T^r Arg Asn Tyr Lys L^s Gin Arg Arg Phe Thr Glu Pro Asn Arg Lys Arg ile Asp Asp Asrt Phe Lys Lys Asp Leu Tyr lfiS 170 175 Asn Glu Cys Ala Lys Tyr ser Gly Leu Gin ser Trp Lys Gly vai Ala 180 185 190 Cys Ara Lys lie Ala Asn Thr Tyr Tyr Asp Ala vai Arg ser Phe Gly 195 200 205 Trp Leu 210 <210> 11 <212> 961 <212> DNA <213> verticniium tenerum <220>

<221> CDS <222> ¢5).,(628) <400> 11 caac atg aag acc acc gct gtt ctc tcc ctc gcc atg ctc cag gcc acc 49 Met Lys Thr Thr Ala vai Leu ser Leu Ala Met Leu Gin Ala Thr 15 10 15 tgg gcc tcg ccc gtg gcc aag cgc cag aac gac gtc tcc ctc gtc gac 97 Trp Ala Ser pro vai Ala Lys Arg Gin Asn Asp Vai Ser Leu vai Asp 20 25 30 aac tac atg ttc ggc ate tcg ctg ccc acc ttc tcc aac cac cac tcc 145 Asn Tyr Met Phe Gly ile Ser Leu Pro Thr Phe ser Asn His His ser 35 40 45 aac agg aac ccc cct cgc ctg gac tgg acc acc gac ggc tgc acc tcg 193 Asn Arg Asn Pro pro Arg Leu Asp Trp Thr Thr Asp Gly Cys Thr ser 50 55 60 tcg ccc aac aac ccg ctc ggc ttc ccc ttc ctg ccc gcc tgc cac cgc 241 ser Pro Asn Asn pro Leu Gly Phe Pro Phe Leu Pro Ala cys His Arg 65 70 75 cac gac ttt ggc tac cag aac ttc cgc ate cag age cgc ttc acc cag 289 His Asp Phe gTv Tyr Gin Asn Phe Arg ile Gin Ser Arg Phe Thr Gin 80 85 90 95 age aac aag etc cgc ate gac gac aag ttc aag gag gac etc tac cac 337 ser Asn Lys Leu Arg Ile Asp Asp Lys phe Lys Glu Asp Leu Tyr His 100 105 110 cag tgc gac ggc cac tgg gcc tgg gtt gcc tgc gct gcc ctc gcc gag 385 Gin cys Asp Gly His Trp Ala Trp vai Ala cys Ala Ala Leu Ala Glu 115 120 125 gtc tac tac gcc gcc gtc cgc gcc ttc ggc ggt ggt gac gcc acc ccg 433 Vai Tyr Tyr Ala Ala vai Arg Ala phe Gly Gly Gly Asp Ala Thr Pro 130 135 140 gga cgc atg cac gtc gcc gtc ttc ggc cag acc cag gcc gag cac gac 481 Gly Arg Met His vai Ala Vai phe Gly Gin Thr Gin Ala Glu His Asp 145 150 155 gcc ctc gtc tcc ate tac gag gag aag ctc gcg gcc tac gag gct gcc 529 Ala Leu Vai Ser Ile Tyr Glu Glu Lys Leu Ala Ala Tyr Glu Ala Ala 160 165 170 175 gtc gcc gag gcc gag gcc cgc ggc gag ate ccc cac gtc gag gag acc 577 vai Ala Glu Ala Glu Ala Arg Gly Glu ile Pro His Vai Glu Glu Thr 180 185 190 ctc ccc gag gag cct gcc gcc gag gag ccc gcc gcc gag gag gag cag 625 Leu Pro Glu Glu Pro Ala Ala Glu Glu pro Ala Ala Glu Glu Glu Gin 195 200 205 aag taaacacgag ccccttttag gaccgactag ctcggtgtcg ctgggctagg 678 Lys ctgagctgag tgacggggag gcacgaaaga gagcaatgca tcagacaggc tggaacatgc 738 ctttgtctga gtgatggatg gacttgatgg acttgatgga cttggatgca tttatgatac 798 cgccagtgtt gactggcaga gcgagcgact tgattttgga tttcttgaaa ggacggatgt 858 cccgaggtgg ataagggatg ccttatcacc aaettettea tgtatatatt gtactgcgca 918 gagaagcgcg ccccgaaaaa tggattgatt cttgatgaga cgt 961 <210> 12 <211> 208 <212> PftT <213> Vertí eillium tenerum <4Q0> 12 Met Lys Thr Thr Ala vai Leu ser Leu Ala Met Leu Gin Ala Thr Trp 1 5 10 15 Ala ser Pro Vai Ala Lys Arg Gin Asn Asp vai ser Leu vai Asp Asn 20 25 30 Tyr Mat Phe Gly ile ser Leu pro Thr Phe ser Asn His His ser Asn 35 40 45 Arg Asn Pro Pro Arg Leu Asp Trp Thr Thr Asp Gly cys Thr Ser Ser 50 55 60 Pro Asn Asn Pro Leu Gly Phe Pro Phe Leu Pro Ala cys Hls Arg His 65 70 75 80 Asp Phe Gly Tyr Gin Asn Phe Arg ile Gin ser Arg Phe Thr Gin Ser 85 90 95 Asn Lys Leu Arg He Asp Asp Lys Phe Lys Glu Asp Leu Tyr His Gin 10Õ 105 110 Cys Asp Gly h1s Trp Ala Trp vai Ala cys Ala Ala Leu Ala Glu vai 115 120 125 Tyr Tyr Ala Ala Vai Arg Ala Phe Gly Gly Gly Asp Ala Thr Pro Gly 130 135 140 Ara Met His Vai Ala vai Phe Gly Gin Thr Gin Ala Glu His Asp Ala 145 150 155 160 Leu Vai Ser Ile Tyr Glu Glu Lys Leu Ala Ala Tyr Glu Ala Ala vai 165 170 175 Ala Glu Ala Glu Ala Arg Gly Glu Ile Pro His vai Glu Glu Thr Leu 180 185 190 pro Glu Glu pro Ala Ala Glu Glu Pro Ala Ala Glu Glu Glu Gin Lys 195 200 205 <21G> 13 <211* 29 <212> DNA <213> Artificial <22Ü> <223> Iniciador TbPLAl <220> <223> Característica mlso <222> ¢4}..C9) <223> sítio BaroHX <400> 13 caaggatcca aaatggtcaa gattgctgc 29 <21Q> 14 <211* 34 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Inlclador TbPLA2 <220> <221> Característica_misc <222> (4)..(9) <223> sítio Xhol <400> 14 tgcctcgagt tttttctaga gtggatagat agac 34 <210> 15 <211> 690 <212> DMA <213> Fusarium venenatum <220>

Claims

1. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de DNA parcial codificadora de unia tostolipase madura de ácidos nucleicos 133 a 495 de SEQ ID NO: 15.

2. Conslruto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de DNA parcial codificadora de uma tostolipase madura definida pelos ácidos nucleicos 133 a 495 de SEQ ID NO: 15. operacionaimente ligada a uma ou mais sequências de controle capazes de dirigir a expressão da tostolipase em um hospedeiro de expressão adequado.

3. Vetor de expressão recombinante. caracterizado pelo fato de compreender o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 2, um promotor, c sinais de terminação dc transcrição c de tradução.

4. Micro-organismo recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 2.

5. Método de produzir uma fosfolipase. caracterizado pelo fato dc compreender cultivar o micro-organismo como definido na reivindicação 4 sob condições que conduzem a produção da fosfolipase. e recuperar a fosfolipase.

6. Método de preparar uma massa ou um produto assado feito da massa, caracterizado pelo fato de compreender adicionar a fosfolipase definida pelos aminoácidos 29-149 de SEQ ID NO: 16 à massa.

7. Composição dc massa, caracterizada pelo fato de compreender a fosfolipase definida pelos aminoácidos 29-149 de SEQ ID NO: 16.

8. Composição detergente, caracterizada pelo fato de compreender um tensoativo e a fosfolipase definida pelos aminoácidos 29- 149 de SEQ ID NO: 16.

9. Processo para reduzir o conteúdo de fósforo em um óleo vegetal, caracterizado pelo fato dc compreender contatar o óleo com a fosfolipase definida pelos aminoácidos 29-149 de SEQ ID NO: 16 na presença de água, e então separar uma fase aquosa do óleo.

10. Processo para produzir queijo, caracterizado pelo fato de compreender tratar uma composição láctea com uma fosfolipase e produzir queijo a partir da composição láctea, em que a fosfolipase é definida pelosaminoácidos 29-149 de SEQ ID NO: 16.