BRPI0309570B1 - fatores camp quiméricos para vacinação contra infecção por streptococcus - Google Patents

Abstract

"fatores camp quiméricos para vacinação contra infecção por streptococcus". é descrito o gene do fator camp de streptococcus uberis (s. uberis) , assim como a produção de fator camp recombinante a partir dele. além disso, são reveladas construções quiméricas de fator camp, que incluem epitopos de fator camp de mais de uma espécie bacteriana. os fatores camp e quimeras que incluem o mesmo podem ser usados em composições imunogênicas para a prevençao e tratamento de infecções bacterianas.

Description

FATORES CAMP QUIMERICOS PARA VACINAÇÃO CONTRA INFECÇÃO POR

STREPTOCOCCUS

Campo Técnico A presente invenção se relaciona de forma geral a antígenos bacterianos. Mais particularmente, a presente invenção pertence à produção de fator CAMP recombinante de Streptococcus uberis (S. uberis) e ao uso de fatores CAMP em composições de vacina. A presente invenção também pertence à produção e uso de construções quiméricas de fator CAMP, que compreendem epitopos de fatores CAMP de mais de uma espécie bacteriana.

Fundamentos S. uberis é uma causa importante de mastite em gado leiteiro e é responsável por cerca de 20% de todos os casos clínicos de mastite (Bramley, A. J. e Dodd, F. H. (1984) J. Dairy Res. 51: 481-512; Bramley, A. J. (1987) Animal Health Nutrition £2: 12-16; Watts, J. L. (1988) J. Dairy Sei. 71: 1616-1624). Uma vez que o tratamento antimicrobiano é geralmente ineficaz no tratamento de mastite de S. uberis, o desenvolvimento de medidas de controle deve ser baseado na compreensão de fatores de virulência e antígenos protetores envolvidos na invasão e proteção da glândula mamária (Collins e cols. (1988) J. Dairy Res. 55:25-32; Leigh e cols. (1990) Res. Vet. Sei. 49: 85-87; Marshall e cols. (1986) J. Dairy Res. 53: 507-514).

Sabe-se que algumas das cepas de S. uberis podem produzir cápsula de ácido hialurônico (Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sei. 45: 400-404), hialuronidase (Schaufuss e cols. (1989) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 271: 46-53), proteína semelhante a R (Groschup, Μ. H. e Timoney, J. F. (1993) Res. Vet. Sei. 54: 124-126), e a co-hemolisina, o fator CAMP, também conhecido como fator UBERIS (Skalka, B. e Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249: 190194). No entanto, sabe-se muito pouco sobre seus papéis na patogenicidade. O efeito do fator CAMP foi primeiro descrito por Christie e cols. em 1944 (Christie e cols. (1944) Aus. J. Exp. Biol. Med. Sei. 22^ 197-200). Esses autores verificaram que estreptococos do grupo B (GBS), como por exemplo S. agalactiae, produziam uma zona distinta de hemólise completa quando crescidos próximos à zona de difusão da beta-toxina de Staphylococcus aureus, esfingomielinase. Esse fenômeno foi chamado reação de CAMP e o composto para essa reação foi caracterizado como o fator CAMP, uma proteína extracelular com um peso molecular de 23.500 (Bernheimer e cols. (1979) Infect. Immun. 23: 838-844). 0 fator CAMP foi subseqüentemente purificado de S. agalactiae e caracterizado como uma proteína de 25.000 Da com um pi de 8,9 (Jürgens e cols. (1985) J. Chrom. 348: 363-370). A seqüências de aminoácidos do fator CAMP de S. agalactiae foi determinada por Rühlmann e cols. (Rühlmann e cols. (1988) FEBS Lett 235: 262-266). O mecanismo da reação de CAMP foi descrito. Veja, por exemplo, Bernheimer e cols. (1979) Infect. Immun. 23^ 838844; Sterzik e cols. "Interaction of the CAMP factor from S. agalactiae with artificial membranes." Em: Alouf e cols., eds. Bacterial protein toxins, Londres: Academic Press Inc, 1984; 195-196; Sterzik e cols. (1985) Zentralbl. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt. 1 Suppl. 15: 101-108; Fehrenbach e cols. "Role of CAMP-factor (protein B) for virulence." Em: Fehrenbach e cols., eds. Bacterial protein toxins, Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1988; 351-357; Fehrenbach e cols. "Interaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificial membranes." Em: Alouf e cols., eds. Bacterial protein toxins, Londres: Academic Press Inc., 1984: 317-324. 0 fator CAMP tem ação lítica em várias células-alvo que incluem eritrócitos de carneiros e bovinos, bem como em membranas artificiais, nas quais os fosfolipídeos e esfingomielina da membrana tenham sido hidrolisados por fosfolipase ou esfingomielinase. 0 papel do fator CAMP na patogenicidade não está claro. Foi demonstrado que um fator CAMP parcialmente purificado de S. agalactiae é letal para coelhos quando injetado de forma intravenosa (Skalka, B. e Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249: 190-194). Além disso, a injeção intraperitonial de fator CAMP purificado em camundongos demonstrou que eleva significativamente a patogenicidade de uma dose subletal de estreptococos do grupo B (Fehrenbach e cols. "Role of CAMP-factor (protein B) for virulence." Em: Fehrenbach e cols., eds. Bacterial protein toxins, Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1988; 351-357). Adicionalmente, como a proteína A de S. aureus, fator CAMP de GBS pode se ligar aos sítios Fc de imunoglobulinas e foi, portanto, designada proteína B (Jürgens e cols. (1987) J. Exp. Med. 165: 720-732).

Além do GBS e S. uberis, outras bactérias, incluindo Listeria monocytogenes e Listeria seeligeri (Rocourt, J. e Grimont, P. A. D. (1983) Int. J. Syst. Bacteriol. 33^: 866869) Aeromonas sp. (Figura, N. e Guglielmetti, P. (1987) J.

Clin. Microbiol. 25: 1341-1342), Rhodococcus equi (Fraser, G. (1961) Nature 189: 246), e certos Vibrio spp. (Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A 270:35-40) produzem reações similares ao efeito de CAMP.

Os genes do fator CAMP de GBS e de A. pleuropneumoniae foram clonados e expressos em Escherichia coli (Schneewind e cols. (1988) Infect. Immun. 56: 2174-2179; Frey e cols. (1989) Infect. Immun. 57: 2050-2056). Adicionalmente, o gene que codifica o fator CAMP de uma cepa de estreptococos do grupo A (GAS), S. pyogenes, também foi isolado (Gase e cols. (1999) Infect. Immun. 67: 4725-4731). Os produtos da proteína de CAMP eram de tamanho similar e possuíam homologia para as proteínas de CAMP de S. agalactiae e S. uberis. Anticorpos desencadeados contra a proteína clonada de CAMP de A. pleuropneumoniae neutralizavam a reação de CAMP mediada pela cepa de E. coli que continha o gene clonado de CAMP, bem como aquele de A. pleuropneumoniae, e também apresentavam reação cruzada com o fator CAMP de S. agalactiae. Nas cepas de GAS, a distribuição do gene cfa (CAMP) foi analisada. Esse gene era amplamente disseminado entre GAS: 82 de 100 isolados clínicos de GAS produziam uma reação CAMP positiva. Das cepas CAMP-negativas, 17 das 18 cepas de GAS continham o gene cfa. Adicionalmente, a atividade de CAMP foi detectada em estreptococos dos sorogrupos C, Μ, P, R, e U (Gase e cols. (1999) Infect. Immun. 67: 4725-4731).

No entanto, antes da descoberta dos presentes inventores, o gene do fator CAMP de S. uberis não tinha sido clonado. Além disso, a capacidade protetora do fator CAMP não tinha sido estudada previamente. Adicionalmente, a produção e uso de construções quiméricas de fator CAMP, contendo epitopos derivados de fatores CAMP de mais de um micróbio, não tinham sido descritos previamente.

Revelação da Invenção A presente invenção é baseada na descoberta do gene do fator CAMP de S. uberis, bem como na descoberta de que o fator CAMP, e construções quiméricas que incluem múltiplos epitopos de fator CAMP, são capazes de proteger indivíduos da infecção. 0 fator CAMP, fragmentos imunogênicos ativos deste, análogos ativos deste, ou proteínas quiméricas que incluem múltiplos fatores CAMP de mais de um organismo, podem ser usados, seja isoladamente ou em combinação com outros antígenos, em vacinas de subunidade inéditas para fornecer proteção contra infecção bacteriana em indivíduos vertebrados, ou como reagentes diagnósticos.

Conseqüentemente, em uma modalidade, a invenção em questão é dirigida a um polipeptídeo imunogênico que compreende ou mais epitopos de fator CAMP de mais de uma espécie bacteriana. Em certas modalidades, aquele um ou mais epitopos de fator CAMP são separados por um espaçador que consiste em 1-20 aminoácidos. Além disso, aquele um ou mais epitopos de fator CAMP pode ser de mais de uma espécie bacteriana do gênero Streptococcus, como por exemplo um selecionado do grupo que consiste em S. uberis, S. agalactiae e S. pyogenes.

Em modalidades adicionais, pelo menos um dos epitopos de fator CAMP é da região variável do terminal N do fator CAMP, que corresponde à região definida pelos aminoácidos 1-90 da Figura 2. Em certas modalidades, o epitopo está interposto dentro de uma proteína do fator CAMP que tem pelo menos 80% de identidade de seqüência para a proteína do fator CAMP da Figura 2 ou Figura 3, e a proteína do fator CAMP é de uma espécie estreptocócica diferente do epitopo de fator CAMP da região variável do terminal N. Em modalidades particulares, o epitopo de fator CAMP da região variável do terminal N compreende uma seqüência de amino ácidos que tem pelo menos 80% de identidade de seqüência para a seqüência de aminoácidos revelada nas posições 31-87 da Figura 3, e a proteína do fator CAMP tem pelo menos 80% de identidade de seqüência para a proteína do fator CAMP da Figura 2.

Em outras modalidades, o polipeptídeo imunogênico compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de seqüência para a seqüência de aminoácidos contígua revelada nas posições 27-314 da Figura 8, com ou sem uma seqüência sinalizadora. Ainda em outra modalidade, o polipeptídeo imunogênico compreende a seqüência de aminoácidos revelada na Figura 8.

Em outra modalidade, a invenção é dirigida a composições imunogênicas que compreendem uma proteína imunogênica como detalhada acima, e uma farmaceuticamente aceitável. A composição pode adicionalmente compreender um adjuvante.

Em modalidades adicionais, a invenção é dirigida a um método de produção de uma composição imunogênica que compreende as etapas de: (1) o fornecimento de um polipeptídeo imunogênico como descrito acima; e (2) a combinação do referido polipeptídeo com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em modalidades adicionais, a invenção é dirigida a um método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana em um indivíduo vertebrado que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica como detalhada acima. Em certas modalidades, a infecção é uma infecção estreptocócica e causa mastite.

Ainda em modalidades adicionais, a invenção pertence a anticorpos dirigidos contra os polipeptídeos imunogênicos descritos acima. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

Em modalidades adicionais, a invenção é dirigida a um polinucleotídeo que compreende uma seqüência codificadora que codifica um polipeptídeo imunogênico como descrito acima, um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo e pelo menos um elemento de controle ligado operacionalmente ao polinucleotídeo, pelo qual a seqüência codificadora pode ser transcrita e traduzida em uma célula hospedeira, uma célula hospedeira que compreende o vetor recombinante, e um método para a produção de um polipeptídeo imunogênico, o método compreendendo o cultivo de uma população de células hospedeiras como descrito acima sob condições para a produção do referido polipeptídeo.

Em outras modalidades, a invenção é dirigida a um método de detecção de anticorpos para Streptococcus em uma amostra biológica, que compreende: (a) a reação da amostra biológica com o polipeptídeo imunogênico como descrito acima, sob condições que permitem que os anticorpos para Streptococcus, quando presentes na amostra biológica, se liguem ao polipeptídeo para formarem um complexo anticorpo/antígeno; e (b) a detecção da presença ou ausência do complexo, e dessa forma a detecção da presença ou ausência de anticorpos para Streptococcus na amostra.

Ainda em outras modalidades, a invenção é dirigida a um kit de teste imunodiagnóstico para a detecção de infecção por Streptococcus, o kit de teste compreendendo um polipeptídeo imunogênico como descrito acima e instruções para a condução do teste imunodiagnóstico.

Essas e outras modalidades da presente invenção ocorrerão prontamente àqueles de conhecimento comum da técnica em vista da revelação deste.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 revela mapas de enzima de restrição de plasmídeo recombinante pJLD21 e subclones deste, designados pJLD21-l e pJLD21-2. As linhas indicam DNA de inserção de S. uberis, enquanto as caixas representam os múltiplos sítios de clonagem de vetor pTZ18R. As atividades de CAMP do plasmídeo recombinante pJLD21 e seus subclones derivados são indicados à direita (+, reação de CAMP positiva; -, reação de CAMP negativa). As setas horizontais pequenas representam pontos e direções de partida de experimentos de sequenciamento. 0 fragmento marcador usado para experimentos de Southern blot é indicado pela seta grande. A barra na parte de baixo indica a localização da estrutura de leitura aberta do gene do fator CAMP de S. uberis (cfu). A Figura 2 (ID. DE SEQ. Nos: 1 e 2) mostra a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos correspondente do fator CAMP de S. uberis. As posições de nucleotídeo são indicadas à esquerda, enquanto as posições de aminoácido são indicadas à direita. Ura peptídeo sinalizador ocorre nos aminoácidos 1-30 da figura e o peptídeo maduro é representado por posições de aminoácido 31-258. A Figura 3 mostra (ID. DE SEQ. Nos: 3 e 4) mostra a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos correspondente do fator CAMP de S. agalactiae. As posições de nucleotídeo são indicadas à esquerda, enquanto as posições de aminoácido são indicadas â direita. Um peptídeo sinalizador ocorre nos aminoácidos 1-29 da figura e o peptídeo maduro é representado por posições de aminoácido 30-255. A Figura 4 mostra a homologia entre proteínas de CAMP de S. agalactiae (ID. DE SEQ N°: 4) e de S. uberis (ID. DE SEQ N° : 2) . Uma seqüência de consenso (ID. DE SEQ N°: 5) também é mostrada. 0 alinhamento das seqüências publicadas das proteínas de CAMP de S. agalactiae (AgalCAMP) e de S. uberis (UberCAMP) foi gerado com PileUp, e exibido com o programa de computador Pretty (um componente do Pacote GCG Wisconsin, versão 10, fornecido pelo pacote de análise de seqüência SeqWeb, versão 1.1, do Canadian Bioinformatics Resource). A seqüência de consenso é mostrada abaixo das proteínas alinhadas. Os resíduos são numerados em cima. As linhas onduladas indicam espaços adicionados pelo algoritmo para a correção de diferentes tamanhos de proteínas. Os pontos revelam lacunas entre as seqüências alinhadas. Os traços nas seqüências de consenso representam resíduos não idênticos. Os parâmetros usados para o alinhamento foram: Tabela de comparação: blosum62; Peso da lacuna: 8 e Peso do comprimento da lacuna: 2. O início da seqüência madura é indicado com uma seta. As seqüências alinhadas mostram aproximadamente 69% de similaridade de seqüência e 63% de identidade de seqüência. Resíduos de aminoácidos 1-30 da seqüência de S. uberis mostrados na figura representam a seqüência sinalizadora, enquanto os resíduos de aminoácido 1-29 da seqüência de S. agalactiae representam a seqüência sinalizadora. A Figura 5 revela a construção de pGH-CAMP. As reações de CAMP para cada clone do qual o plasmídeo foi derivado são mostradas à direita da figura; + indica uma reação positiva e - uma reação negativa. Caixas abertas' indicam pTZ18R e caixas sombreadas indicam pGH433. A Figura 6 mostra a suposta seqüência sinalizadora do fator CAMP de S. agalactiae (Figura 6A; ID. DE SEQ N°: 6) e do fator CAMP de S. uberis (Figura 6B; ID. DE SEQ N° : 7). Os sítios previstos de divagem Peptidase Sinalizadora I (Indicados por A) das proteínas de CAMP de S. agalactiae e S. uberis são mostrados. Também são mostrados a pontuação de probabilidade e o comprimento do peptídeo sinalizador para cada uma das duas proteínas de CAMP. As seqüências foram analisadas pelo algoritmo SPScan do pacote de programas de computador GCG. A Figura 7 mostra os plasmídeos usados para a construção da quimera CAMP-3. São mostrados os plasmídeos intermediários e finais. As enzimas de restrição, a localização, e a orientação de genes relevantes são mostradas para cada plasmídeo. A construção desses plasmídeos é explicada na seção experimental. A Figura 8 revela as seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos da quimera LipoF:CAMP3 (ID. DE SEQ. Nos: 8 e 9) . É mostrada a seqüência de nucleotídeos e de proteínas da quimera CAMP-3 fundida à seqüência sinalizadora de LipoF. Os nucleotídeos são numerados à esquerda da figura, enquanto os resíduos de aminoácido são numerados â direita. A seqüência sublinhada representa a seqüência sinalizadora de LipoF. Os aminoácidos espaçadores ocorrem nas posições 87, 145 e 146. A Figura 9 mostra as SCC da média geométrica (mais 1 desvio padrão) em quartos atacados com S. uberis em grupos de vacas, como descrito nos exemplos, para 7 dias após o ataque. Os conjuntos de dados correspondem ao dia 0 (a barra mais à esquerda) , dia 1 (a segunda barra da esquerda) , dia 2 (a terceira barra da esquerda) , dia 3 (a quarta barra da esquerda), dia 4 (a quinta barra da esquerda) , dia 5 (a sexta barra da esquerda) , dia 6 (a sétima barra da esquerda), e dia 7 (a oitava barra da esquerda). Apesar da aparência da figura, as SCC para animais vacinados com (6xHis)GapC de S. dysgalactiae nos dias 7 e 8, e animais vacinados com CAMP-3 nos dias 4 e 5 pós-ataque não foram significativamente diferentes em termos estatísticos daqueles do controle.

Descrição Detalhada A prática da presente invenção irá empregar, a menos que indicado de forma diferente, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, virologia, tecnologia de DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989); DNA Cloning, Vols. I e II (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed. 1986); Immobilízed Cells and Enzymes (IRL press, 1986) ; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications). São usadas as seguintes abreviações de aminoácido ao longo do texto: Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gin (Q) Ácido glutâmico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Vai (V) A. Definições Na descrição da presente invenção, serão empregados os seguintes termos, e visam ser definidos como indicado abaixo.

Deve-se observar que, como usadas nessa especificação e nas reivindicações em apêndice, as formas singulares "um", "uma" e "os" e "as" incluem plurais referentes, a menos que o conteúdo claramente dite de forma diferente. Dessa forma, por exemplo, referência a "um fator CAMP" inclui uma mistura de dois ou mais fatores CAMP, e semelhantes . 0 termo "fator CAMP" ou uma seqüência de nucleotídeos que codifica o mesmo, se refere a uma proteína ou uma seqüência de nucleotídeos, respectivamente, que é derivada de um gene do fator CAMP encontrado em várias espécies bacterianas, que incluem, sem limitação, Streptococcus uberis, estreptococos do grupo B (GBS) tal como S. agalactiae (Jürgens e cols. (1985) J. Chromatogr. 348: 363370; Rühlmann e cols. (1988) FEBS Lett 235:262-266; Schneewind e cols. (1988) Infect. Immun. 56: 2174-2179), A. pleuropneumoniae (Frey e cols. (1989) Infect. Immun. 57:2050-2056), estreptococos do grupo A (GAS), tal como S. pyogenes (Gase e cols. (1999) Infect. Immun. 67: 4725- 4731) , e estreptococos dos sorogrupos C, Μ, P, R, e U, Listeria monocytogenes e Listeria seeligeri (Rocourt, J. e Grimont, P.A.D. (1983) Int. J. Syst. Bacteriol. 33: 866869), Aeromonas sp. (Figura, N. e Guglielmetti, P. (1987) J. Clin. Microbiol. 2J5: 1341-1342), Rhodococcus equi (Fraser, G. (1961) Nature 189: 246), e certos Vibrio spp. (Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A 270:35-40) .

Um gene representativo do fator CAMP, derivado de S. uberis, é encontrado no plasmídeo pJLD21 (N° de Acesso ATCC 69837) . A seqüência de nucleotídeos e seqüência de aminoácidos correspondentes para o fator CAMP de S. uberis é revelada na Figura 2 (ID. DE SEQ. Nos: 1 e 2). A Figura 3 (ID. DE SEQ. Nos: 3 e 4) mostra uma seqüência de nucleotídeos e seqüência de aminoácidos correspondente para o fator CAMP de S. agalactiae. As seqüências para outros fatores CAMP são conhecidas e descritas na técnica como detalhado acima.

No entanto, um fator CAMP, como aqui definido, não se limita às seqüências reveladas e descritas, uma vez que são conhecidos subtipos de cada uma dessas espécies bacterianas e ocorrerão variações em proteínas de CAMP entre eles. Além disso, a proteína ou seqüências de nucleotídeos derivadas não precisam ser fisicamente derivadas do gene descrito acima, mas podem ser geradas de qualquer forma, incluindo, por exemplo, síntese química, isolamento (por exemplo, a partir de um organismo que produz o fator CAMP), ou por produção recombinante, com base na informação aqui fornecida. 0 termo também inclui proteínas que possuem, assim como são desprovidas de, uma seqüência sinalizadora, caso esteja presente. Como mostrado nas Figuras 2, 3 e 4, tanto S. uberis quanto S. agalactiae incluem seqüências sinalizadoras que ocorrem nas posições de aminoácido 1-30 e 1-29, respectivamente. Em geral, o termo fator CAMP "maturo" se refere a um fator CAMP desprovido da seqüência sinalizadora. Dessa forma, o termo fator CAMP "maduro" com em relação às seqüências reveladas nas Figuras 2 e 3, se refere a uma seqüência de aminoácidos mostrada nas posições 31-258 da Figura 2 e nas posições 30-255 da Figura 3. O termo fator CAMP também se refere a proteínas em forma neutra ou na forma de sais de adição básica ou ácida, dependendo do modo de preparação. Tais sais de adição ácida podem envolver grupos amino livres e sais básicos podem ser formados com carboxis livres. Sais de adição ácida e básica farmaceuticamente aceitáveis são discutidos mais adiante abaixo. Alem disso, as proteínas podem ser modificadas por combinação com outros materiais biológicos tais como lipídeos (ambos de ocorrência natural com a molécula ou outros lipídeos que não destroem a atividade imunológica) e sacarídeos, ou por modificação da cadeia lateral, tais como acetilação de grupos amino, fosforilação de cadeia laterais hidroxil, oxidação de grupos sulfidril, glicosilação de resíduos de aminoácido, assim como outras modificações da seqüência primária codificada. 0 termo "fator CAMP estreptocócico" significa um fator CAMP, como definido acima, derivado de uma espécie estreptocócica que produz o mesmo, incluindo, sem limitação, S. uberis, GBS tal como S. agalactiae, GAS, tal como S. pyogenes, e estreptococos dos sorogrupos C, Μ, P, R, e U. Por exemplo, um "fator CAMP de S. uberis" é um fator CAMP como definido acima, derivado de S. uberis. Um "fator CAMP de S. agalactiae" é um fator CAMP como definido acima, derivado de S. agalactiae.

Os termos "variante" e "muteína" de uma proteína do fator CAMP se referem a derivados biologicamente ativos de um fator CAMP, como definido acima, ou fragmentos de tais derivados, que retêm atividade imunológica como aqui definida. 0 termo "muteína" se refere a peptídeos que têm um ou mais miméticos de peptídeo ("peptóides") , tais como aqueles descritos na Publicação Internacional N° WO 91/04282. Preferivelmente, a variante ou muteína tem pelo menos a mesma atividade que a molécula nativa. Métodos para a fabricação de variantes e muteínas de polipeptídeo são conhecidos na técnica e são descritos mais adiante abaixo.

Em geral, o termo "variante" se refere a compostos que têm uma seqüência e estrutura do polipeptídeo nativo com uma ou mais adições, substituições (geralmente de natureza conservadora) e/ou deleções de aminoácido, em relação à molécula nativa, desde que as modificações não destruam a atividade. Dessa forma, uma "variante" de uma proteína do fator CAMP inclui uma proteína com seqüências de aminoácidos substancialmente homólogas (como definido abaixo) a seqüências de aminoácidos contíguas codificadas pelos genes do fator CAMP, que exibem atividade imunológica. Substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservadora, ou seja, aquelas substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos -- aspartato e glutamato; (2) básicos -- lisina, arginina, histidina; (3) não polares -- alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar não carregado -- glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são algumas vezes classificados como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina com isoleucina ou valina, ou vice-versa; um aspartato com um glutamato ou vice-versa; uma treonina com uma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservadora similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um efeito importante na atividade biológica. Proteínas que têm substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas que possuem substituições menores de aminoácidos que não afetem substancialmente a imunogenicidade da proteína, estão, portanto, dentro da definição do polipeptídeo de referência.

Outras substituições incluem substituições de aminoácidos de ocorrência natural com análogos de aminoácidos. Tais análogos de aminoácidos são bem conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido piperidínico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, 6-N-metillisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina e ornitina.

Por exemplo, o polipeptídeo de interesse pode incluir até cerca de 5-10 substituições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras, ou mesmo até cerca de 15-25 ou 20-50 substituições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras, ou qualquer número inteiro entre esses valores, desde que a função desejada da molécula permaneça intacta.

Por "fragmento" significa um polipeptídeo ou polinucleotídeo que consiste em somente uma parte da seqüência de polipeptídeos e estrutura intactas, ou na sequência de nucleotídeos e estrutura, do gene de referência. O fragmento de polipeptídeo pode incluir uma deleção do terminal C e/ou uma deleção do terminal N do polipeptídeo nativo, ou pode ser derivado de uma porção interna da molécula. Similarmente, um fragmento de polinucleotídeo pode incluir uma deleção de 3' e/ou a 5' dc polinucleotídeo nativo, ou pode ser derivado de uma porçãc interna da molécula. Um "fragmento" de polipeptídeo de urr fator CAMP irá geralmente incluir pelo menos cerca de 2-5 resíduos contíguos de aminoácidos, preferivelmente pele menos cerca de 10 resíduos contíguos de aminoácidos da molécula de comprimento total, preferivelmente pelo menos cerca de 15-25 resíduos contíguos de aminoácidos da molécula de comprimento total, e mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 20-50 ou mais resíduos contíguos de aminoácidos da molécula de comprimento total, ou qualquer número inteiro entre 2 aminoácidos e a seqüência de comprimento total, desde que o fragmento em questão retenha a atividade desejada.

Um fragmento de nucleotídeo do gene de interesse geralmente inclui pelo menos cerca de 8 pares de base contíguos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10-20 pares de base contíguos, e mais preferivelmente ainda pele menos cerca de 25-50, ou mais, pares de base contíguos dc gene, ou quaisquer números inteiros entre esses valores. Tais fragmentos são úteis como marcadores e em métodos diagnósticos, discutidos com mais detalhes abaixo.

Por "mastite" significa uma inflamação da glândula mamária em mamíferos, incluindo em vacas, ovelhas, cabras, porcas, éguas, e semelhantes, causada por várias bactérias que produzem fatores CAMP, descritas com mais detalhes abaixo. A infecção propriamente dita se manifesta pela infiltração de células fagocíticas na glândula. Geralmente, são reconhecidos 4 tipos clínicos de mastite: (1) peraguda associada com edema, calor, dor, e secreção anormal n glândula e acompanhada por febre e outros sinais d distúrbio sistêmico, tais como depressão profunda, puls 5 fraco rápido, olhos afundados, fraqueza e anorexi completa; (2) aguda, com mudanças na glândula similare àquelas acima, mas onde a febre, anorexia e depressão sã de discretas a moderadas; (3) subaguda, onde não se exibe quaisquer mudanças sistêmicas e as mudanças na glândula D sua secreção são menos marcantes: e (4) subclínica, onde reação inflamatória é detectável somente por testes-padrã para mastite.

Testes-padrão para a detecção de mastite incluem, ma não estão limitados, ao Teste de Mastite da Califórnia, a 5 Teste de Mastite de Wisconsin, ao teste de Nagase, contagem eletrônica de células e às contagens de célula somáticas usadas para detectar um conteúdo de célula sangüíneas brancas persistentemente elevado no leite. E geral, uma contagem de células somáticas de cerca d 3 300.000 a cerca de 500.000 células por mL ou maior, n leite irá indicar a presença de infecção. Dessa forma, um vacina é considerada eficaz no tratamento e/ou prevenção d mastite quando, por exemplo, a contagem de célula somáticas no leite permanece abaixo de cerca de 500.00 5 células por mL. Para uma discussão de mastite e d diagnóstico desta, veja, por exemplo, The Merck Veterinar Manual. A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Diseas Prevention and Control for the Veterinarian, Merck e Co. Rahway, Nova Jersey, 1991. D O termo "epitopo" se refere ao sítio em um antígeno o hapteno ao qual células B e células T específicas respondem. 0 termo também é usado de forma intercambiável com "determinante antigênico" ou "sítio de determinante antigênico." Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser identificados em um imunoensaio simples que mostra a habilidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno-alvo.

Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo à composição ou vacina de interesse. Normalmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não está limitada, a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células γδΤ, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro irá exibir uma resposta imunológica protetora ao fator CAMP em questão, por exemplo, o hospedeiro será protegido de infecção subseqüente pelo patógeno e tal proteção será demonstrada tanto por uma redução ou ausência de sintomas normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, quanto por um tempo de recuperação mais rápido.

Os termos proteína ou polipeptídeo "imunogênico" se referem a uma seqüência de aminoácidos que desperta uma resposta imunológica como descrita acima. Uma proteína ou polipeptídeo "imunogênico", como aqui usado, inclui a seqüência de comprimento total do fator CAMP em questão, incluindo as formas precursoras e maduras, análogos destas, ou fragmentos imunogênicos destas.

Por "fragmento imunogênico" significa um fragmento de um fator CAMP que inclui um ou mais epitopos e dessa forma desperta a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando inúmeras técnicas de mapeamento de epitopo, bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em "Methods in Molecular Biology", Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nova Jersey. Por exemplo, epitopos lineares podem ser determinados, por exemplo, grandes números de peptídeos sintetizados atualmente em suportes sólidos, os peptídeos que correspondem a porções da molécula de proteína, e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão aderidos aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Patente U.S. N° 4.708.871; Geysen e cols. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1: 39984002; Geysen e cols. (1986) Molec. Immunol. 2_3: 709-715. Similarmente, epitopos conformacionais são prontamente identificados pela determinação da conformação espacial de aminoácidos tal como, por exemplo, por cristalografia por raios-X e ressonância nuclear magnética bidimensional. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Regiões antigênicas de proteínas também podem ser identificadas usando plots-padrão de antigenicidade e hidropatia, tais como aqueles calculados usando, por exemplo, o programa de comutador Omiga versão 1.0 disponível pelo Oxford Molecular Group. Esse programa de computador emprega o método de Hopp/Woods, Hopp e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 78: 3824-3828 para a determinação de perfis de antigenicidade, e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte e cols., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para plots de hidropatia.

Fragmentos imunogênicos, para as finalidades da presente invenção, terão normalmente comprimento de pelo menos cerca de 2 aminoácidos, mais preferivelmente comprimento de cerca de 5 aminoácidos, e mais preferivelmente ainda comprimento de pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos. Não há limite superior crítico para o comprimento do fragmento, o qual podería compreender aproximadamente o comprimento total da seqüência da proteína, ou até mesmo uma proteína de fusão que compreende dois ou mais epitopos do fator ou fatores CAMP em questão.

Uma "composição imunogênica" é uma composição que compreende uma molécula antigênica onde a administração de uma composição a um indivíduo resulta no desenvolvimento no indivíduo de uma resposta imune humoral e/ou celular à molécula antigênica de interesse.

Por "composição de vacina de subunidade" significa uma composição que contém pelo menos um polipeptídeo imunogênico, mas não todos os antígenos, derivado de ou homólogo a um antígeno de um patógeno de interesse. Uma composição como esta é substancialmente livre de células ou partículas intactas do patógeno, ou do lisado de tais células ou partículas. Dessa forma, uma "composição de vacina de subunidade" é preparada a partir de polipeptídeos imunogênicos pelo menos parcialmente purificados (preferivelmente substancialmente purificados) do patógeno, ou análogos recombinantes destes. Uma composição de vacina de subunidade pode compreender o antígeno ou antígenos de subunidade de interesse substancialmente livres de outros antígenos ou polipeptídeos do patógeno.

Por "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" significa um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, ou seja, o material pode ser administrado a um indivíduo em uma formulação ou composição sem causar quaisquer efeitos biológicos ou interagir de forma deletéria com quaisquer dos componentes de uma composição na qual está contido. 0 termo "epitopo múltiplo" proteína ou polipeptídeo especifica uma sequência de aminoácidos que compreende um epitopo como aqui definido, que contém pelo menos um epitopo repetido duas ou mais vezes dentro de uma molécula linear. A seqüência repetida não precisa estar diretamente conectada a ela própria; não está repetida na natureza na mesma forma e, alem disso, pode estar presente dentro de uma seqüência maior que inclui outros aminoácidos que não estão repetidos. Para as finalidades dessa invenção, a seqüência do epitopo pode tanto ser uma cópia exata de uma seqüência de epitopo do tipo selvagem, quanto uma seqüência que é "equivalente funcionalmente" como aqui definida.

Uma proteína ou polipeptídeo de "fusão" ou "quimérico" é aquele no qual seqüências de aminoácidos de mais de uma fonte estão unidas. Tais moléculas podem ser produzidas de forma sintética ou recombinante, como aqui descrito mais adiante. Uma proteína quimérica representativa que compreende a proteína madura de CAMP de S. uberis como uma estrutura central, e um peptídeo de terminal N da proteína de CAMP de S. agalactiae de uma região com baixa homologia para o produto de CAMP de S. uberis, é mostrada nas posições de aminoácido 27-314 da Figura 4. Seqüências espaçadoras ocorrem nas posições 87, 145 e 146. A quimera de CAMP revelada na Figura estava fundida à seqüência sinalizadora LipoF, representada pelas posições 1-26 da Figura 4.

Uma molécula "isolada" de ácido nucléico é uma molécula de ácido nucléico separada e distinta de todo o organismo com o qual a molécula é encontrada na natureza; ou uma molécula de ácido nucléico desprovida, no todo ou em parte, de seqüências associadas normalmente com ela na natureza; ou uma seqüência, como existe na natureza, mas tendo seqüências heterólogas (como definidas abaixo) em associação com ela.

Polipeptídeos "recombinantes" se referem a polipeptídeos produzidos por técnicas de DNA recombinante; ou seja, produzidas a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógena que codifica o polipeptídeo desejado. Polipeptídeos "sintéticos" são aqueles preparados por síntese química.

Um "vetor" é um replicon, como por exemplo, um plasmídeo, fago, ou cosmídeo, ao qual outro segmento de DNA pode estar anexado de forma a produzir a replicação do segmento anexado.

Uma "seqüência codificadora" de DNA ou uma "seqüência codificadora de nucleotídeos" de uma proteína em particular, é uma seqüência de DNA que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de elementos reguladores apropriados. Os limites de uma seqüência codificadora são determinados por um códon de início no terminal 5' (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3' (carboxi).

Uma seqüência codificadora pode incluir, mas não está limitada a, seqüências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, seqüências de DNA genômico de DNA eucariótico (por exemplo, de mamífero), e mesmo seqüências de DNA sintético. Uma seqüência de terminação de transcrição estará localizada normalmente 3' em relação à seqüência codificadora. "Elementos de controle" de DNA se referem coletivamente a promotores, sítios de ligação de ribossomo, sinais de poliadenilação, seqüências de terminação de transcrição, domínios reguladores acima, intensificadores, e semelhantes, que permitem coletivamente a transcrição e tradução de uma seqüência codificadora em uma célula hospedeira. Nem todas essas seqüências de controle precisam sempre estar presentes em um vetor recombinante, desde que o gene desejado seja capaz de ser transcrito e traduzido. "Ligado operacionalmente" se refere a um arranjo de elementos onde os componentes assim descritos estão configurados de forma a realizar sua função usual. Dessa forma, elementos de controle ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora são capazes de efetuar a expressão da seqüência codificadora. Os elementos de controle não precisam ser contíguos à seqüência codificadora, desde que funcionem para dirigir a expressão desta. Dessa forma, por exemplo, seqüências intervenientes não traduzidas embora transcritas, podem estar presentes entre um promotor e a seqüência codificadora, e o promotor ainda pode ser considerado "ligado operacionalmente" à seqüência codificadora.

Similarmente, uma seqüência codificadora está "ligada operacionalmente a" outra seqüência codificadora (ou seja, no caso de uma proteína quimérica) quando RNA polimerase irá transcrever as duas seqüências codificadoras em mRNA, que é então traduzido nos polipeptídeos codificados pelas duas seqüências codificadoras. As seqüências codificadoras não precisam ser contíguas entre elas, desde que a seqüência transcrita seja processada no final para a produção da proteína desejada.

Um elemento de controle, como por exemplo um promotor, "dirige a transcrição" de uma seqüência codificadora em uma célula quando RNA polimerase irá se ligar ao promotor e transcrever a seqüência codificadora em mRNA, que é então traduzido no polipeptídeo codificado pela seqüência codificadora.

Uma "célula hospedeira" é uma célula que foi transformada, ou é capaz de transformação, por uma molécula de ácido nucléico exógeno.

Uma célula foi "transformada" por DNA exógeno quando tal DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana da célula. DNA exógeno pode ou não ser integrado (ligado de forma covalente) em DNA cromossômico compondo o genoma da célula. Em procariotas e leveduras, por exemplo, o DNA exógeno pode ser mantido em um elemento do epissomo, como por exemplo um plasmídeo. Com relação às células eucarióticas, uma célula transformada de forma estável é uma na qual o DNA exógeno tornou-se integrado no cromossomo, de forma que ela é herdada por células filhas através da replicação do cromossomo. Essa estabilidade é demonstrada pela habilidade da célula eucariótica em estabelecer linhas de célula ou clones compostos de uma população de células-filha contendo o DNA exógeno. "Homologia" se refere ao percentual de similaridade entre dois polinucleotídeo ou duas porções de polipeptídeo. Dois DNAs, ou duas seqüências de polipeptídeo, são "substancialmente homólogos" entre eles quando as seqüências exibem pelo menos cerca de 80%-85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 95%-98% de similaridade ou identidade de seqüência ao longo de um comprimento definido das moléculas. Como aqui usado, substancialmente homólogo também se refere a seqüências que mostram identidade completa para o DNA ou seqüência de polipeptídeo especificada.

Em geral, "identidade" se refere a uma correspondência exata nucleotídeo-para-nucleotídeo ou aminoácido-para-aminoácido de dois polinucleotídeos ou seqüências de polipeptídeo, respectivamente. O percentual de identidade pode ser determinado por uma comparação direta de uma informação de seqüência entre duas moléculas alinhando-se as seqüências, contando-se o número exato coincidências entre as duas seqüências alinhadas, dividindo pelo comprimento da seqüência mais curta, e multiplicando o resultado por 100. Podem ser usados programas de computador já disponíveis para auxiliar na análise, como por exemplo, ALIGN, Dayhoff, M.O. em Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Supl. 353-358, "National biomedical Research Foundation", Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2: 482-489 para análise de peptídeo. Programas para a determinação de identidade de seqüência de nucleotídeos estão disponíveis no Pacote de Análise de Seqüência Wisconsin, Versão 8 (disponível por "Genetics Computer Group", Madison, WI) , por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA e GAP, que também se baseiam nc algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas sãc prontamente utilizados com os parâmetros-padrãc recomendados pelo fabricante e descritos no Pacote de Análise de Seqüência Wisconsin, acima referido. Por exemplo, o percentual de identidade de uma seqüência de nucleotídeos em particular para uma seqüência de referência pode ser determinado usando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela padrão de pontuação e uma penalidade de lacuna de seis posições de nucleotídeo.

Outro método de estabelecer percentual de identidade no contexto da presente invenção é o uso do pacote de programas protegido por leis de Copyright MPSRCH pela Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Por essa suíte de pacotes, o algoritmc de Smith-Waterman pode ser empregado quando os parâmetros-padrão foram usados para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade de abertura de lacuna de 12, penalidade de extensão de lacuna de um, e uma lacuna de seis) . A partir dos dados gerados, o valor "Match" reflete "identidade de seqüência". Outros programas adequados para o cálculo do percentual de identidade ou similaridade entre seqüências são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, usado corr parâmetros-padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados usando os seguintes parâmetros-padrão: códigc genético = padrão; filtro = nenhum; filamento = ambos; valor de corte = 60; previsto = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 seqüências; classificadas por = HIGH SCORE; Bases de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções GenBank CDS + Swiss proteína + Spupdate + PIR. Detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridização de polinucleotídeos sob condições que formem duplas estáveis entre regiões homólogas, seguida por digestão com de nuclease(s) específica para filamento único, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Seqüências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições rigorosas, como definidas para aquele sistema em particular. A definição de condições de hibridização apropriadas está dentro da habilidade da técnica. Veja, por exemplo, Sambrook e cols., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. 0 termo "equivalente funcionalmente" significa que a seqüência de aminoácidos do fator CAMP é uma que irá despertar uma resposta imunológica substancialmente equivalente ou intensificada, como definido acima, quando comparada com a resposta despertada por um fator CAMP que tem identidade tanto com a seqüência madura para o fator CAMP de referência, quanto para uma porção imunogênica desta.

Uma região "heteróloga" de uma construção de DNA é um segmento de DNA identificável dentro ou anexado a outra molécula de DNA que não é encontrada em associação com a outra molécula na natureza. Dessa forma, quando a região heteróloga codifica um gene bacteriano, o gene será normalmente flanqueado por DNA que não flanqueia o gene bacteriano no genoma das bactérias-fonte. Outro exemplo da seqüência codificadora heteróloga é uma construção onde a própria seqüência codificadora não é encontrada na natureza (por exemplo, seqüências sintéticas que têm códons diferentes do gene nativo). Variação alélica ou de eventos mutacionais de ocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga de DNA, como aqui usado.

Como aqui usado, uma "amostra biológica" se refere a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, que incluem, mas não se limitam a, por exemplo, sangue, plasma, soro, matéria fecal, urina, medula óssea, bile, fluido espinhal, fluido linfático, amostras da pele, secreções externas da pele, dos tratos respiratório, intestinal, e geniturinário, lágrimas, saliva, leite, células sangüíneas, órgãos, biópsias e também amostras de constituintes de cultura de célula in vitro que incluem, mas não se limitam a, meios condicionados que resultam do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, por exemplo, células recombinantes, e componentes celulares.

Como aqui usado, os termos "rótulo" e "rótulo detectável" se referem a uma molécula capaz de detecção, que inclui, mas não limitada a, isótopos radioativos, substâncias fluorescentes, substâncias quimioluminescentes, enzimas, substratos de enzima, co-fatores de enzima, inibidores de enzima, cromóforos, corantes, íons de metal, soluções de metal, ligantes (por exemplo, biotina ou haptenos) e semelhantes. 0 termo "substância fluorescente" se refere a uma substância ou uma porção desta que é capaz de exibir fluorescência na faixa detectável. Exemplos particulares de rótulos que podem ser usados sob a invenção incluem fluoresceína, rodamina, dansil, umbeliferona, vermelho Texas, luminol, NADPH e α-β-galactosidase. 0 termo "tratamento" como aqui usado se refere tanto (i) à prevenção de infecção ou reinfecção (profilaxia), quanto (ii) à redução ou eliminação de sintomas da doença de interesse (terapia).

Por "indivíduo vertebrado" significa qualquer membro do subfilo cordata, incluindo, sem limitação, mamíferos tais como gado, carneiros, porcos, cabras, cavalos, e humanos; animais domésticos tais como cachorros e gatos; e pássaros, incluindo pássaros domésticos, selvagens e animais de caça tais como pássaros macho e fêmea incluindo galinhas, perus e outros pássaros galináceos; e peixe. 0 termo não denota uma idade em particular. Dessa forma, animais adultos e recém nascidos, assim como fetos, são englobados. B. Métodos Gerais É fundamental para a presente invenção a descoberta de que o fator CAMP é capaz de despertar uma resposta imune protetora em um indivíduo vertebrado. 0 gene para o fator CAMP de S. uberis foi isolado e caracterizado, e o fator CAMP codificado por ele seqüenciado. Mostrou-se que o produto de proteína do gene do fator CAMP de S. uberis protege o gado de ataque subseqüente com S. uberis. Adicionalmente, proteínas quiméricas, incluindo epitopos de fator CAMP de múltiplas espécies bacterianas, conferem proteção contra ataque bacteriano e fornecem um antígeno de vacina que tem reação cruzada com várias espécies bacterianas e que é mais imunogênico do que os fatores CAMP individuais. Além disso, anticorpos crescidos contra um fator CAMP purificado de S. uberis reage de forma cruzada com proteína B de S. agalactiae. Como mostrado nos exemplos, o fator CAMP de S. uberis é secretado quando produzido de forma recombinante em E. coli. A sequência codificadora completa do fator CAMP de S. uberis é mostrada na Figura 2 (ID. DE SEQ N°: 1). 0 gene do fator CAMP de S. uberis codifica uma pré-proteína de cerca de 258 aminoácidos (resíduos de aminoácido 1 até 258, inclusive, da Figura 2, ID. DE SEQ N° : 2) que inclui uma seqüência sinalizadora de terminal N com comprimento de aproximadamente 30 aminoácidos (veja, Figura 6B; ID. DE SEQ N°: 7). A molécula precursora tem um peso molecular calculado de aproximadamente 28,5 kDa. O fator CAMP maduro de S. uberis inclui, dessa forma, resíduos de aminoácido 31 até 258, inclusive, como revelado na Figura 2. Adicionalmente, a seqüência codificadora de fator CAMP de S. agalactiae é mostrada na Figura 3 (ID. DE SEQ N°: 3). 0 gene do fator CAMP de S. agalactiae codifica uma pré-proteína de cerca de 255 aminoácidos (resíduos de aminoácido 1 até 255, inclusive, da Figura 3, ID. DE SEQ N°: 4) que inclui uma seqüência sinalizadora de terminal N com comprimento de aproximadamente 29 aminoácidos (veja, Figura 6A, ID. DE SEQ N° : 6) . Como discutido mais adiante abaixo, a porção do gene do fator CAMP que codifica a seqüência sinalizadora pode ser incluída em construções que codificam o fator CAMP e quimeras deste para dirigir a secreção do fator CAMP mediante expressão. Alternativamente, tais construções podem incluir uma seqüência sinalizadora heteróloga. Adicionalmente, a seqüência sinalizadora do fator CAMP e a seqüência de ácidos nucléicos que a codifica podem ser usadas com proteínas e moléculas de ácido nucléico heterólogas,para auxiliar na secreção deste.

Como mostrado na Figura 4, o alinhamento de uma seqüência de aminoácidos do fator CAMP de S. agalactiae com a seqüência deduzida do fator CAMP de S. uberis mostra uma similaridade global de cerca de 69%. Aproximadamente 63% dos resíduos de aminoácido são idênticos. As duas proteínas podem ser separadas em regiões de baixa e alta homologia. A maioria dos aminoácidos conservados está localizada após o resíduo de leucina que corresponde ao aminoácido 87 do CAMP de S. agalactiae e ao aminoácido 90 de CAMP de S. uberis. A região de baixa homologia (também denominada de região variável do terminal N nesta) inclui, dessa forma, os resíduos 1-90 de S. uberis e 1-87 de S. agalactiae e exibe uma homologia global de cerca de 49% entre as duas espécies. Na soma, o primeiro terço das duas proteínas de CAMP inclui seqüências sinalizadoras não idênticas de 29 aminoácidos (S. agalactiae) e 30 aminoácidos (S. uberis), respectivamente, seguido por regiões de 57 aminoácidos e 59 aminoácidos, respectivamente, que não compartilham grande homologia. A região de alta homologia encontrada do resíduo 91 de S. uberis e 88 de S. agalactiae, exibe uma homologia global de cerca de 79%. A localização exata e a seqüência do gene do fator CAMP consideram estudos in vitro de mutagênese para avaliar as funções de domínios diferentes na proteína de CAMP. Além disso, os presentes dados permitem a geração de mutantes deficientes na síntese estável de fator CAMP através de substituição de gene e outras técnicas moleculares. A comparação da virulência de cepas nativas e mutantes de S. uberis em animais fornece informação importante em relação à contribuição do fator CAMP para a patogenicidade de bactérias que expressam fatores CAMP.

Epitopos derivados dos vários fatores CAMP de múltiplas espécies bacterianas podem ser usados em combinação a fim de fornecer uma vacina multivalente que confere uma proteção ampla contra infecção bacteriana, como por exemplo, mastite. Tais epitopos podem ser fornecidos individualmente em uma ou mais composições de vacina de subunidade, ou podem ser convenientemente fornecidos como uma proteína quimérica, expressa de forma recombinante como uma proteína de fusão ou expressa individualmente e subsequentemente fundida.

Em particular, como explicado acima, o fator CAMP é encontrado em várias espécies bacterianas, incluindo, sem limitação, S. uberis, estreptococos do grupo B (GBS), tal como S. agalactiae (Jürgens e cols. (1985) J. Chromatogr. 348: 363-370; Rühlmann e cols. (1988) FEBS Lett 235: 262266; Schneewind e cols. (1988) Infect. Immun. 56^ 21742179), A. pleuropneumoniae (Frey e cols. (1989) Infect. Immun. 57: 2050-2056), estreptococos do grupo A (GAS), tal como S. pyogenes (Gase e cols. (1999) Infect. Immun. 67: 4725-4731), e estreptococos dos sorogrupos C, Μ, P, R, e U, Listeria monocytogenes e Listeria seeligeri (Rocourt, J. e Griraont, P.A.D. (1983) Int. J. Syst. Bacteriol. 3^: 866869), Aeromonas sp. (Figura, N. e Guglielmetti, P. (1987) J. Clin. Microbiol. 25^ 1341-1342), Rhodococcus equi (Fraser, G. (1961) Nature 189: 246), e certos Vibrio spp. (Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A. 2 70: 35-40). Com exceção da região do terminal N, as seqüências de aminoácidos das proteínas do fator CAMP produzidas pelas várias cepas bacterianas são altamente conservadas. Outras regiões variáveis localizadas ocorrem por toda a molécula de fator CAMP. Veja, por exemplo, a Figura 4. Portanto, é desejável a construção de proteínas de fusão de fator CAMP de epitopo múltiplo que compreendam epitopos derivados tanto das regiões altamente conservadas do fator CAMP, quanto das regiões variáveis das proteínas do fator CAMP de mais de uma das espécies bacterianas acima. Experimentos realizados para apoiar a presente invenção demonstraram que uma proteína como esta é capaz de despertar imunidade contra uma infecção estreptocócica, ao mesmo tempo em que fornece a vantagem econômica adicional de minimizar o número de antígenos presente na formulação final, e reduz concomitantemente o custo de produção da formulação.

Dessa forma, as quimeras de fator CAMP da presente invenção podem incluir, por exemplo, epitopos múltiplos derivados da região variável do terminal N do fator CAMP, tais como seqüências de aminoácidos contíguas que compreendem pelo menos cerca de 5-10 até cerca de 50-90 aminoácidos, ou qualquer número inteiro entre esses, da região variável do terminal N do fator CAMP representada pelos aminoácidos 1-90 do fator CAMP de S. uberis, e aminoácidos 1-87 do fator CAMP de S. agalactiae, de quaisquer das várias espécies bacterianas aqui descritas, preferivelmente 20 ou mais aminoácidos contíguos dessa região, mais preferivelmente cerca de 30-80, e ainda mais preferivelmente 40-60 aminoácidos contíguos dessa região. Preferivelmente, as quimeras incluirão epitopos da região variável do terminal N de mais de um fator CAMP estreptocócico, como por exemplo, de S. uberis e S. agalactiae. As quimeras opcionalmente incluem epitopos adicionais de outras regiões do fator CAMP e podem incluir o restante da molécula de fator CAMP de pelo menos uma espécie bacteriana, e opcionalmente mais de uma espécie bacteriana. Adicionalmente, podem estar presentes epitopos múltiplos da mesma espécie.

Epitopos para uso nas quimeras de fator CAMP da presente invenção podem ser prontamente identificadas pelo alinhamento das seqüências de fatores CAMP de, por exemplo, duas ou mais das espécies bacterianas listadas acima, e pela pesquisa das regiões variáveis e conservadas. Normalmente, é desejável incluir epitopos das regiões variáveis dos fatores CAMP a fim de conferir proteção de amplo espectro contra várias bactérias. Epitopos adicionais podem ser identificados usando-se técnicas bem conhecidas na técnica, como por exemplo, o uso de plots-padrão de antigenicidade e hidropatia, por exemplo, aquelas calculadas usando, por exemplo, o program de computador Omiga versão 1.0 disponível pelo Oxford Molecular Group. Esse programa de computador emprega o método de Hopp/Woods, Hopp e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 7_8: 38243828 para a determinação de perfis de antigenicidade, e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte e cols., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para plots de hidropatia. Esse programa pode ser usado com os seguintes parâmetros: resultados médios sobre uma janela de 7; determinação da probabilidade de superfície de acordo com Emini; flexibilidade de cadeia de acordo com Karplus-Schulz; índice de antigenicidade de acordo com Jameson-Wolf; estrutura secundária de acordo com Garnier-Osguthorpe-Robson; estrutura secundária de acordo com Chou-Fasman; e identificação dos sítios de glicosilação previstos. Aqueles habilitados na técnica podem usar prontamente a informação obtida em combinação com os ensinamentos da presente especificação para identificar regiões antigênicas que podem ser empregadas na construção das proteínas quiméricas da invenção.

Geralmente, os vários epitopos estarão separados as seqüências espaçadoras. A seqüência espaçadora é tipicamente uma seqüência de aminoácidos de 1-500 aminoácidos, preferivelmente 1-100 aminoácidos, mais preferivelmente 1-50 aminoácidos, preferivelmente 1-25 aminoácidos, e mais preferivelmente ainda 1-10 aminoácidos, ou qualquer número inteiro entre 1-500. Os aminoácidos espaçadores podem ser os mesmos ou diferentes entre os vários epitopos. Aminoácidos particularmente preferidos para uso como espaçadores são aminoácidos com grupos laterais pequenos, tais como alanina, glicina e valina.

As quimeras da presente invenção também podem incluir uma seqüência sinalizadora. A seqüência sinalizadora pode ser uma seqüência sinalizadora de fator CAMP, como por exemplo, uma das seqüências sinalizadoras reveladas nas Figuras 6A e 6B, ou pode ser qualquer uma das várias seqüências heterólogas. Exemplos não limitantes de seqüências sinalizadoras particularmente adequadas incluem a sequência sinalizadora de LipoF de E. coli, e the seqüência sinalizadora de OmpF . A seqüência sinalizadora de LipoF auxilia na secreção eficiente da célula hospedeira bacteriana e fica ligada à membrana da célula hospedeira por meio da porção de lipídeo. A proteína pode então ser extraída da superfície de célula por meio de solubilização diferencial com um detergente, tais como Sarcosil ou TritonX-100 (veja os exemplos). Seqüências sinalizadoras adicionais para uso nesta são discutidas mais adiante abaixo.

Uma modalidade especialmente preferida da presente invenção é uma quimera que inclui um ou mais epitopos de qualquer um dos vários fatores CAMP aqui descritos, interposto dentro de uma estrutura central de um fator CAMP de comprimento total de uma bactéria diferente da bactéria da qual pelo menos um dos epitopos é obtido, se forem usados epitopos múltiplos. A estrutura central pode ou não incluir a seqüência sinalizadora do fator CAMP em questão. Preferivelmente, o epitopo é da região variável do terminal N do fator CAMP representada pelos resíduos 1-90 de S. uberis e 1-87 de S. agalactiae, respectivamente. Deve-se compreender que esse epitopo pode ser derivado de outras espécies estreptocócicas e bacterianas que produzam o fator CAMP com regiões variáveis do terminal N correspondentes. Além disso, "interposto" significa que o epitopo está inserido em algum lugar interno à seqüência de comprimento total e o termo não exclui a presença de seqüências espaçadoras entre o epitopo e as regiões de terminal C do fator CAMP de comprimento total entre as quais o epitopo é inserido.

Uma construção como essa é representada pela quimera mostrada nas posições 27-314 da Figura 8, aqui denominada "CAMP-3". Os aminoácidos 1-26 da Figura 8 representam a seqüência sinalizadora de LipoF de E. coli. Os aminoácidos 27-86 na Figura 8 correspondem aos aminoácidos 31-90 da seqüência do fator CAMP de S. uberis mostrada na Figura 2 (aminoácidos 1-60, numerados em relação à seqüência madura de S. uberis). O aminoácido 87 é um aminoácido de ligação. Os aminoácidos 88-144 da Figura 8 correspondem aos aminoácidos 31-87 de uma seqüência de S. agalactiae mostrada na Figura 3 (aminoácidos 2-58, numerados em relação â seqüência madura de S. agalactiae). Os aminoácidos 145 e 146 da Figura 8 são aminoácidos espaçadores. Os aminoácidos 147-314 mostrados na Figura 8 correspondem aos aminoácidos 91-258 da seqüência do fator CAMP de S. uberis mostrada na Figura 2 (aminoácidos 63-230, numerados em relação à seqüência madura de S. uberis). Dessa forma, a quimera mostrada na Figura 8 inclui uma estrutura central de comprimento total de S. uberis com um epitopo da seqüência do terminal N do fator CAMP de S. agalactiae nela inserido.

Os fatores CAMP, fragmentos imunogênicos destes ou proteínas quiméricas que incluem os mesmos, como descritos acima, podem ser fornecidos em composições de vacina de subunidade. Em adição ao uso em composições de vacina, as proteínas ou anticorpos contra elas podem ser usados como reagentes diagnósticos para detectar a presença de infecção em um indivíduo vertebrado. Similarmente, os genes que codificam as proteínas podem ser clonados e usados para projetar marcadores para detectar e isolar genes homólogos em outras cepas bacterianas.

As composições de vacina da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir uma ampla variedade de infecções bacterianas em indivíduos vertebrados. Por exemplo, composições de vacina que incluem fatores CAMP de S. uberis, estreptococos do grupo B (GBS), como por exemplo, S. agalactiae e/ou estreptococos do grupo A (GAS), por exemplo, S. pyogenes, e estreptococos dos sorogrupos C, Μ, P, R, e U, podem ser usadas para tratar infecções estreptocócicas em indivíduos vertebrados que são causadas por essas espécies. Por exemplo, S. uberis e S. agalactiae são patógenos bacterianos comuns associados com mastite em espécies de bovinos, eqüinos, ovinos e de cabra. Adicionalmente, estreptococos do grupo B, como por exemplo, S. agalactiae, são conhecidos por causarem outras numerosas infecções em vertebrados, incluindo septicemia, meningite, bacteremia, impetigo, artrite, infecções do trato urinário, abscessos, aborto espontâneo, etc. Portanto, composições de vacina contendo fatores CAMP estreptocócicos encontrarão uso no tratamento e/ou prevenção de uma ampla variedade de infecções estreptocócicas.

Similarmente, fatores CAMP derivados de Listeria monocytogenes e L. seeligeri, Aeromonas sp., Rhodococcus equi, e Vibrio spp. encontrarão uso no tratamento de infecções bacterianas causadas por essas espécies. Por exemplo, fatores CAMP podem ser usados para prevenir ou tratar listeriose em uma ampla gama de animais e pássaros, incluindo humanos. A infecção propriamente pode ser manifestar como encefalite e meningoencefalite em espécies ruminantes e de ave tais como gansos, galinhas, perus, patos, canários e papagaios; septicemia em animais monogástricos, ruminantes neonatais e aves domésticas; e aborto espontâneo e infecções latentes em uma ampla variedade de animais. Aeromonas causa infecções em peixes, incluindo em salmonídeos, peixes de aquário, peixes dourados, peixes de água doce e marinhos; assim como infecções em pássaros engaiolados e em anfíbios e répteis. Rhodococcus equi causa infecções respiratórias, linfangite, peritonite, enterite, abscessos e aborto espontâneo em cavalos. Vibrio causa vibriose em muitos peixes cultivados, de aquário, marinhos selvagens e de estuário; infecções de feridas abertas em cetáceos; e hepatite vibriônica aviária e hepatite infecciosa aviária em galinhas.

Dessa forma, é rapidamente aparente que vacinas de fator CAMP podem ser usadas para tratar e/ou prevenir uma ampla variedade de infecções bacterianas em numerosas espécies.

Fatores CAMP de várias espécies podem ser usados tanto isoladamente quanto em combinação nas composições de vacina da presente invenção. Por exemplo, como explicado acima, será algumas vezes preferível ter mais de um epitopo de um ou mais dos fatores CAMP nas composições de vacina da presente invenção, de forma que se possa fornecer ao indivíduo em questão um amplo espectro de proteção contra infecção. Em sua forma mais simples, isso pode ser obtido pelo emprego de um polipeptídeo que codifica a seqüência completa de um dos fatores CAMP, ou pelo emprego de uma combinação de polipeptídeos que codificam as seqüências de dois ou mais dos fatores CAMP ou epitopos dos fatores CAMP. Dessa forma, as composições de vacina poderiam compreender, por exemplo, várias combinações de um ou mais dos fatores CAMP, ou uma combinação de vários dos fatores CAMP, ou até mesmo vários epitopos derivados dos fatores CAMP, tais como em quimeras de fator CAMP descritas acima.

Além disso, as composições de vacina da presente invenção podem incluir outros antígenos bacterianos, fúngicos, virais ou de protozoários. Esses antígenos podem ser fornecidos separadamente ou até mesmo como proteínas de fusão que compreendem fragmentos de um ou mais dos fatores CAMP fundidos a esses antígenos.

Produção dos Fatores CAMP

Os fatores CAMP acima descritos e fragmentos ativos, análogos e proteínas quiméricas derivadas dos mesmos, podem ser produzidos por vários métodos. Especificamente, os fatores CAMP podem ser isolados diretamente de bactérias que expressam os mesmos. Isso geralmente é obtido primeiro preparando-se um extrato bruto desprovido de componentes celulares e várias proteínas extrínsecas. As proteínas desejadas podem então ser adicionalmente purificadas, seja por cromatografia em coluna, HPLC, técnicas imunoadsorventes ou · outros métodos convencionais bem conhecidos na técnica.

Mais particularmente, foram descritas técnicas para o isolamento de fatores CAMP em, por exemplo, Skalka, B. e Smola, J. (1981) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A249: 190194; Skalka e cols. (1980) Zbl. Vet. Med. B27: 559-566; Skalka e cols. (1979) Zbl. Vet. Med. B26: 679-687; Bernheimer e cols. (1979) Infect. Immun. 22_·. 838-844; Jürgens e cols. (1985) J. Chrom. 348: 363-370; Jürgens e cols. (1987) J. Exp. Med. 165: 720-732.

Alternativamente, as proteínas podem ser produzidas de forma recombinante como aqui descrito. Como explicado acima, esses produtos recombinante podem adquirir a forma de seqüências parciais de proteína, seqüências de comprimento total, formas precursoras que incluem seqüências sinalizadoras, formas maduras sem sinais, ou até mesmo proteínas de fusão (por exemplo, com uma líder apropriada para o hospedeiro recombinante, ou com outras seqüências de antígeno de subunidade para Streptococcus ou outro patógeno).

Os genes do fator CAMP da presente invenção podem ser isolados com base na habilidade dos produtos de proteína em exibir atividade CAMP, usando ensaios de CAMP, como descritos abaixo. Dessa forma, podem ser construídas bibliotecas de gene, e os clones resultantes serem usados para transformar uma célula hospedeira apropriada. Colônias podem ser reunidas em pool e rastreadas quanto a clones que tenham atividade CAMP. As colônias também podem ser rastreadas usando soro policlonal ou anticorpos monoclonais para o antígeno.

Alternativamente, uma vez que as seqüências de aminoácidos estejam determinadas, podem ser preparados marcadores de oligonucleotídeo que contenham os códons para uma porção das seqüências determinadas de aminoácidos e usados para rastrear bibliotecas de DNA quanto aos genes que codificam as proteínas em questão. As estratégias básicas para a preparação de marcadores de oligonucleotídeo e bibliotecas de DNA, assim como seu rastreamento por hibridização de ácido nucléico, são bem conhecidos por aqueles com habilidade na técnica. Veja, por exemplo, DNA Cloning: Vol. I, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; Sambrook e cols., supra. Uma vez que um clone da biblioteca rastreada tenha sido identificado por hibridização positiva, pode ser confirmado por análise de enzima de restrição e sequenciamento de DNA que a inserção em particular da biblioteca contém o gene desejado do fator CAMP ou um homólogo desse.

Alternativamente, seqüências de DNA que codificam as proteínas de interesse podem ser preparadas sinteticamente em vez de clonadas. As seqüências de DNA podem ser projetadas com os códons apropriados para a seqüência de aminoácidos em particular. Em geral, serão selecionados códons preferidos para o hospedeiro visado caso as seqüências sejam usadas para expressão. A seqüência completa é montada a partir de oligonucleotídeos superpostos preparados por métodos-padrão e montados em uma seqüência codificadora completa. Veja, por exemplo, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair e cols. (1984) Science 223: 1299; Jay e cols. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Uma vez que as seqüências codificadoras para as proteínas desejadas tenham sido preparadas ou isoladas, elas podem ser clonadas em qualquer vetor ou replicon adequado. São conhecidos numerosos vetores de clonagem por aqueles habilitados na técnica, e a seleção de um vetor de clonagem apropriado é uma questão de escolha. Exemplos de vetores de DNA recombinante para clonagem e das células hospedeiras que eles podem transformar incluem o bacteriófago X (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGV1106 (bactérias gram-negativas) , pLAFRl (bactérias gram-negativas) , pME290 (bactérias gram-negativas diferentes de E. coli), pHV14 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) e vírus do papiloma bovino (de células de mamífero). Veja, de forma geral, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook e cols., supra; B. Perbal, supra. 0 gene pode ser colocado sob o controle de um promotor, sítio de ligação de ribossomo (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador (aqui denominado de forma coletiva como elementos de "controle"), de forma que a seqüência de DNA que codifica a proteína desejada seja transcrita em RNA na célula hospedeira transformada por um vetor que contenha essa construção de expressão. A seqüência codificadora pode ou não conter um peptídeo sinalizador ou seqüência líder. Se forem incluídas seqüências sinalizadoras, elas podem tanto ser nativas, seqüências homólogas, ou seqüências heterólogas. Por exemplo, as seqüências sinalizadoras para os fatores CAMP de S. uberis ou S. agalactiae (mostradas nas Figuras 6A e 6B, respectivamente), podem ser usadas para secreção de vários fatores CAMP, assim como podem ser usadas inúmeras outras seqüências sinalizadoras, bem conhecidas na técnica. Seqüências líder podem ser removidas pelo hospedeiro em processamento pós-tradução. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.

Também podem ser desejáveis outras seqüências reguladoras que tornem possível a regulação da expressão da seqüência das proteínas em relação ao crescimento da célula hospedeira. Seqüências reguladoras são conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e exemplos incluem aqueles fazem com que a expressão de um gene seja "ligada" ou "desligada" em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Outros tipos de elementos reguladores também podem estar presentes no vetor, por exemplo, seqüências intensificadoras.

As seqüências de controle e outras seqüências reguladoras podem estar ligadas à seqüência codificadora antes da inserção em um vetor, tais como os vetores de clonagem descritos acima. Alternativamente, a seqüência codificadora pode ser clonada diretamente em um vetor de expressão que já contém as seqüências de controle e um sítio de restrição apropriado.

Em alguns casos pode ser necessário modificar a seqüência codificadora de forma que ela talvez possa ser anexada às seqüências de controle com a orientação apropriada; ou seja, para manter a estrutura de leitura apropriada. Também pode ser desejável a produção de mutantes ou análogos do fator CAMP de interesse. Mutantes ou análogos podem ser preparados pela deleção de uma porção de uma seqüência que codifica a proteína, por inserção de uma seqüência, e/ou por substituição de um ou mais nucleotídeos dentro da seqüência. Técnicas para a modificação de seqüências de nucleotídeos, como por exemplo, mutagênese sítio-dirigida, são descritas em, por exemplo, Sambrook e cols., supra; DNA Cloning, Vols. I e II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. 0 vetor de expressão é então usado para transformar uma célula hospedeira apropriada. Inúmeras linhas de célula de mamífero são conhecidas na técnica e incluem linhas de célula imortalizadas disponíveis pela "American Type Culture Collection" (ATCC), tais como, mas não se limitam a, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLA, células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células de rim bovino de Madin-Darby ("MDBK"), assim como outras. Similarmente, hospedeiros bacterianos tais como E. coli, Bacillus subtilis, e Streptococcus spp.·, encontrarão uso com as presentes construções de expressão. Hospedeiros de levedura úteis na presente invenção incluem, entre outros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolitica. Células de inseto para uso com vetores de expressão de baculovírus incluem, entre outras, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro selecionados, as proteínas da presente invenção são produzidas pelo cultivo de células hospedeiras transformadas por um vetor de expressão descrito acima sob condições pelas quais a proteína de interesse seja expressa. A proteína é então isolada das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão secreta a proteína nos meios de crescimento, a proteína pode ser purificada diretamente dos meios. Se a proteína não for secretada, ela é isolada de lisados da célula. A seleção das condições de crescimento e dos métodos de recuperação apropriados estão dentro da habilidade da técnica.

As proteínas da presente invenção também podem ser produzidas por síntese química, como por exemplo, por síntese de peptídeo em fase sólida, usando seqüências de aminoácidos conhecidas ou seqüências de aminoácidos derivadas da seqüência de DNA dos genes de interesse. Tais métodos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A síntese química de peptídeos pode ser preferível se um pequeno fragmento do antígeno em questão for capaz de despertar uma resposta imunológica no indivíduo de interesse.

Os fatores CAMP, fragmentos, análogos e quimeras contendo os mesmos, podem ser testados quanto à atividade de CAMP usando qualquer um dos vários testes-padrão. Por exemplo, fatores CAMP são conhecidos por exibirem ação lítica em várias células-alvo, incluindo eritrócitos bovinos e ovinos. Dessa forma, um método conveniente para se testar a atividade de fator CAMP utiliza reações hemolíticas-padrão que usam eritrócitos ovinos ou bovinos. Veja, por exemplo, Christie e cols. (1944) Aus. J. Exp. Biol. Med. Sei. 22: 197-200; Brown e cols. (1974) Infect. Immun. 9: 377-383; Darling, C.L. (1975) J. Clin. Microbiol. 1: 171; Wilkinsin, H.W. (1977) J. Gin. Microbiol. 6: 42; Bernheimer e cols. (1979) Inf ect. Immun. 23: 838-844; Skalka, B. e Smola, J. (1981) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A249: 190-194; Huser e cols. (1983) J. Gen. Microbiol. 129: 1295. A atividade também pode ser testada pelo monitoramento da liberação de moléculas marcadoras capturadas de lipossomos feitas de materiais susceptíveis a ruptura por fatores CAMP. Por exemplo, a atividade de CAMP pode ser monitorada usando lipossomos contendo [14C]glicose preparados a partir de, por exemplo, esfingomielina, colesterol e dicetil fosfato, e medindo a liberação de [14C]glicose capturada devido à ruptura dos lipossomos pelo fator CAMP. Veja, por exemplo, Bernheimer e cols. (1979) Infect. Immun. 2_3: 838-844. Similarmente, a liberação de ATP por lipossomos na presença de fator CAMP pode ser monitorada como descrito em Sterzik e cols. (1984) "Interaction of the CAMP factor from S. agalactiae with artificial membranes" Em: Alouf e cols., eds. Bacterial protein toxins, Londres: Academic Press Inc., 1984: 195196; e Sterzik e cols. (1985) Zentralbl. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt. 1 Supl. 15: 101-108. Veja também, Fehrenbach e cols. (1984) "Interaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificial membranes." Em: Alouf e cols., eds. Bacterial protein toxins, Londres: Academic Press Inc., 1984: 317-324.

Os fatores CAMP da presente invenção ou seus fragmentos podem ser usados para a produção de anticorpos, tanto policlonais quanto monoclonais. Se forem desejados anticorpos policlonais, um mamífero selecionado, (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um antígeno da presente invenção, ou seu fragmento, ou um antígeno mutado. 0 soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Veja, por exemplo, Jürgens e cols. (1985) J. Chrom. 348: 363-370. Se for usado soro contendo anticorpos policlonais, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia por imunoafinidade, com o uso de procedimentos conhecidos.

Anticorpos monoclonais para os fatores CAMP e para os fragmentos destes, também podem ser prontamente produzidos por aquele com habilidade na técnica. A metodologia geral para a fabricação de anticorpos monoclonais pelo uso de tecnologia de hibridoma é bem conhecida. Linhas de células imortais produtoras de anticorpo podem ser criadas por fusão de célula, e também por outras técnicas, tais como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus de Epstein-Barr. Veja, por exemplo, M. Schreier e cols., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling e cols., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett e cols., Monoclonal Antibodies (1980); veja também Patentes U.S. Nos 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500. 4.491.632; e 4.493.890. Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra o fator CAMP de interesse, ou fragmento deste, podem ser rastreados para várias propriedades; ou seja, para isotipo, epitopo, afinidade, etc. Anticorpos monoclonais são úteis em purificação, usando técnicas de imunoafinidade, dos antígenos do indivíduo contra os quais são dirigidos. Anticorpos tanto policlonais quanto monoclonais também podem ser usados para imunização passiva ou podem ser combinados com preparações de vacina de subunidade para aumentar a resposta imune.

Formulações e Administração de Vacina Os fatores CAMP da presente invenção podem ser formulados em composições de vacina, tanto isoladamente quanto em combinação com outros antígenos, para uso na imunização de indivíduos, como descrito abaixo. Métodos de preparação de tais formulações são descritos em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 18a Edição, 1990. Tipicamente, as vacinas da presente invenção são preparadas como injetáveis, seja como soluções líquidas ou suspensões. Também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção. A preparação também pode ser emulsificada ou o ingrediente ativo encapsulado em veículos de lipossomo. O ingrediente imunogênico ativo é geralmente misturado com um veículo farmacêutico compatível, tais como, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, e combinações destes. Além disso, se desejado, o veículo pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umidificadores ou emulsificantes e agentes de tamponamento de pH.

Adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina também podem ser adicionados à formulação. Adjuvantes podem incluir, por exemplo, muramil dipeptídeos, avridina, hidróxido de alumínio, brometo de dimetildioctadecil amônio (DDA), óleos, emulsões óleo-em-água, saponinas, citocinas, e outras substâncias conhecidas na técnica. 0 fator CAMP pode estar ligado a um transportador a fim de aumentar a imunogenicidade deste. Transportadores adequados incluem macro-moléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como proteínas, que incluem albuminas do soro, hemocianina limpet em buraco de fechadura, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, e outras proteínas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica; polissacarídeos, tais como Sefarose, agarose, celulose, glóbulos de celulose e semelhantes; aminoácidos poliméricos tais como ácido poliglutâmico, polilisina, e semelhantes; copolímeros de aminoácido; e partículas virais inativas.

Os fatores CAMP podem ser usados em sua forma nativa ou seu conteúdo funcional pode ser modificado por, por exemplo, succinilação de resíduos de lisina ou reação com Cis-tiolactona. Um grupo sulfidril também podes ser incorporado no transportador (ou antígeno) por, por exemplo, reação de funções amino com 2-iminotiolana ou o N-hidroxisuccinimida éster de 3,4-ditiopiridil propionato. Transportadores adequados também podem ser modificados para incorporarem braços espaçadores (tais como hexametileno diamina ou outras moléculas bifuncionais de tamanho similar) para a adesão de peptídeos.

Outros transportadores adequados para os fatores CAMP da presente invenção incluem polipeptídeos VP6 de rotavírus, ou fragmentos funcionais destes, como revelado na Patente U.S. N° 5.071.651. Além disso, um produto de fusão de uma proteína viral e os imunógenos em questão feitos pelos métodos revelados na Patente U.S. N° 4.722.840 são úteis. Ainda outros transportadores adequados incluem células, tais como linfócitos, uma vez que a apresentação nessa forma imita o modo natural de apresentação no indivíduo, o que dá origem ao estado imunizado. Alternativamente, as proteínas da presente invenção podem ser acopladas a eritrócitos, preferivelmente aos próprios .eritrócitos do indivíduo. Métodos de acoplamento de peptídeos a proteínas ou células são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Além disso, os fatores CAMP (ou complexos destes) podem ser formulados em composições de vacina tanto nas formas neutras quanto de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres dos polipeptídeos ativos) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos hidroclórico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Os sais formados a partir de grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e semelhantes.

Formulações injetáveis de vacina irão conter uma "quantidade terapeuticamente eficaz" do ingrediente ativo, ou seja, uma quantidade capaz de despertar uma resposta imune em um indivíduo ao qual a composição é administrada. No tratamento e prevenção de mastite, por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" seria preferivelmente uma quantidade que controlasse a infecção, como medida, por exemplo, pela habilidade de uma composição para reter ou diminuir a contagem de células somáticas no leite abaixo de cerca de 500.000 células por mL. A quantidade exata é prontamente determinada por aquele com habilidade na técnica usando testes-padrão. 0 fator CAMP irá variar tipicamente de cerca de 1% a cerca de 95% (p/p) de uma composição, ou até mais ou menos, se adequado. Com as presentes formulações de vacina, 20 a 500 μ9 de ingrediente ativo por mL de solução injetada devem ser adequados para despertar uma resposta imunológica quando for administrada uma dose de 1 a 3 mL por animal.

Para imunizar um indivíduo, a vacina é geralmente administrada de forma parenteral, normalmente por injeção intramuscular. Outros modos de administração, no entanto, tais como injeção subcutânea, intraperitonial e intravenosa, também são aceitáveis. A quantidade a ser administrada depende do animal a ser tratado, da capacidade do sistema imune do animal em sintetizar anticorpos, e do grau de proteção desejado. Dosagens eficazes podem ser estabelecidas prontamente por aquele de conhecimento comum da técnica através de testes de rotina que estabelecem curvas de resposta à dose. 0 indivíduo é imunizado pela administração da vacina em pelo menos uma dose, e preferivelmente duas doses. Além disso, o animal pode receber quantas doses forem necessárias para manter um estado de imunidade â infecção.

Formulações de vacina adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações em aerossol, intranasais, orais, e formulações de liberação sustentada. Para supositórios, a composição do veículo incluirá ligantes e transportadores tradicionais, tais como glicóis polialcalinos, ou triglicerídeos. Tais supositórios podem ser formados por misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10% (p/p) , preferivelmente cerca de 1% a cerca de 2%. Veículos orais incluem excipientes normalmente empregados, tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, magnésio, estearato, celulose de sacarina sódica, carbonato de magnésio, e semelhantes. Essas composições orais de vacina podem ser ingeridas na forma de soluções, suspensões, pastilhas, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada, ou pós, e contêm cerca de 10% a cerca de 95% do ingrediente ativo, preferivelmente cerca de 25% a cerca de 70%.

Formulações intranasais incluirão normalmente veículos que não causam irritação à mucosa nasal, e nem alteram significativamente a função ciliar. Diluentes tais como água, solução salina aquosa ou outras substâncias conhecidas, podem ser empregados com a invenção em questão. As formulações nasais também podem conter preservativos tais como, mas não limitados a, clorobutanol e cloreto de benzalcônio. Um tensoativo pode estar presente para aumentar a absorção das proteínas em questão pela mucosa nasal.

Formulações de liberação controlada ou sustentada são feitas pela incorporação da proteína em transportadores ou veículos tais como lipossomos, polímeros impermeáveis não absorvíveis tais como copolímeros de etilenovinil acetato e copolímeros Hytrel®, polímeros intumescentes tais como hidrogéis, ou polímeros reabsorvíveis tais como colágeno e certos poliácidos ou poliésteres tais como aqueles usados para se fazer suturas reabsorvíveis. Os fatores CAMP também podem ser liberados usando mini-bombas implantadas, bem conhecidas na técnica.

Os fatores CAMP da presente invenção também podem ser administrados por meio de um vírus transportador que os expressem. Vírus transportadores que encontrarão uso com a presente invenção incluem, mas não se limitam, ao vírus da vacínia e outros vírus pox, adenovírus, e vírus do herpes. Como forma de exemplo, recombinantes do vírus da vacínia que expressam as proteínas inéditas podem ser construídos como segue. 0 DNA que codifica a proteína em particular é inserido primeiro em um vetor apropriado de forma que esteja adjacente a um promotor de vacínia e flanqueie seqüências de DNA de vacínia, como por exemplo a seqüência que codifica timidina quinase (TK) . Esse vetor é então usado para transfectar as células que estão simultaneamente infectadas com vacínia. A recombinação homóloga serve para inserir o promotor de vacínia mais o gene que codifica a presente proteína no genoma viral. O TK-recombinante resultante pode ser selecionado pelo cultivo das células na presença de 5-bromodesoxiuridina e selecionando-se as placas virais resistentes a ela.

Uma via de administração alternativa envolve terapia genética ou imunização com ácido nucléico. Dessa forma, seqüências de nucleotídeos (e elementos reguladores que as acompanham) que codificam os fatores CAMP em questão podem ser administradas diretamente a um indivíduo para tradução in vivo destas. Alternativamente, a transferência de gene pode ser obtida pela transfecção das células do indivíduo ou tecidos ex vivo e reintrodução do material transformado no hospedeiro. 0 DNA pode ser introduzido diretamente no organismo hospedeiro, ou seja, por injeção (veja Publicação Internacional N° WO/90/11092; e Wolff e cols. (1990) Science 247: 1465-1468) . A transferência de gene mediada por lipossomo também pode ser obtida usando-se métodos conhecidos. Veja, por exemplo, Hazinski e cols. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4: 206-209; Brigham e cols. (1989) Am. J. Med. Sei. 298: 278-281; Canonico e cols. (1991) Clin. Res. 3£: 219A; e Nabel e cols. (1990) Science 1990) 249: 1285-1288. Agentes de direcionamento, tais como anticorpos dirigidos contra antígenos de superfície expressos em tipos de célula específicos, podem ser conjugados de forma covalente à superfície lipossômica de forma que o ácido nucléico possa ser liberado a tecidos específicos e às células susceptíveis à infecção.

Ensaios Diagnósticos Como explicado acima, os fatores CAMP, variantes e fragmentos imunogênicos destes, e quimeras que compreendem epitopos de fator CAMP, também podem ser usados como diagnósticos para detectar a presença de anticorpos reativos de estreptococo, por exemplo, S. uberis, S. agalactiae e/ou S. dysgalactiae, em uma amostra biológica a fim de determinar a presença de infecção por estreptococo. Por exemplo, a presença de anticorpos reativos com um fator CAMP pode ser detectada usando técnicas eletroforéticas e imunodiagnósticas-padrão, que incluem imunoensaios tais como ensaios do tipo competição, reação direta, ou em sanduíche. Tais ensaios incluem, mas não estão limitados a, Western blots; testes de aglutinação; imunoensaios rotulados e mediados por enzima, tais como ELISAs; ensaios do tipo biotina/avidina; radioimunoensaios; imunoeletroforese; imunoprecipitação, etc. As reações geralmente incluem a revelação de rótulos tais como rótulos fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos, enzimáticos ou moléculas de corante, ou outros métodos para a detecção da formação de um complexo entre o antígeno e o anticorpo ou anticorpos que reagem com ele.

Os ensaios anteriormente mencionados geralmente envolvem a separação de anticorpo não ligado em uma fase líquida de um suporte de fase sólida ao qual os complexos antígeno-anticorpo estão ligados. Suportes sólidos que podem ser usados na prática da invenção incluem substratos tais como nitrocelulose (por exemplo, na forma de membrana ou de cavidade de microtitulação); polivinilcloreto (por exemplo, lâminas ou cavidades de microtitulação); látex de poliestireno (por exemplo, glóbulos ou placas de microtitulação); fluoreto de polivinilidina; papel diazotizado; membranas de nylon; glóbulos ativados, glóbulos que respondem magneticamente, e semelhantes.

Tipicamente, um suporte sólido primeiro é reagido com um componente da fase sólida (por exemplo, um ou mais fatores CAMP) sob condições de ligação adequadas de forma que o componente seja suficientemente imobilizado ao suporte. Algumas vezes, a imobilização do antígeno ao suporte pode ser aumentada acoplando-se primeiro o antígeno a uma proteína com melhores propriedades de ligação. Proteínas de acoplamento adequadas incluem, mas não estão limitadas a, macromoléculas tais como albuminas do soro que incluem albumina do soro bovino (BSA), hemocianina limpet em buraco de fechadura, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, e outras proteínas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Outras moléculas que podem ser usadas para ligar os antígenos ao suporte incluem polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, e semelhantes. Tais moléculas e métodos de acoplamento dessas moléculas aos antígenos, são bem conhecidos por aqueles de conhecimento comum da técnica. Veja, por exemplo, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3: 2-13; Hashida e cols., J. Appl. Biochem. (1984) 6: 5663; e Anjaneyulu e Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30: 117-124.

Após a reação do suporte sólido com o componente da fase sólida, quaisquer componentes não imobilizados da fase sólida são removidos do suporte por lavagem, e o componente ligado ao suporte é então colocado em contacto com uma amostra biológica suspeita de conter porções ligantes (por exemplo, anticorpos contra os antígenos imobilizados) sob condições de ligação adequadas. Após lavagem para a remoção de qualquer ligante não ligado, uma porção ligante secundária é adicionada sob condições de ligação adequadas, onde o ligante secundário é capaz de se associar seletivamente com o ligante ligado. A presença do ligante secundário pode então ser detectada usando-se técnicas bem conhecidas na técnica.

Mais particularmente, pode ser usado um método ELISA, onde as cavidades de uma placa de microtitulação são cobertas com uma proteína de fator CAMP. A amostra biológica contendo ou suspeita de conter moléculas de imunoglobulina anti-fator CAMP é então adicionada âs cavidades cobertas. Após um período de incubação suficiente para permitir a ligação do anticorpo ao antígeno imobilizado, a placa (s) pode ser lavada para remover porções não ligadas e é adicionada uma molécula secundária de ligação rotulada de forma detectável. Permite-se que a molécula secundária de ligação reaja com quaisquer anticorpos capturados da amostra, a placa é lavada e a presença da molécula secundária de ligação é detectada usando-se métodos bem conhecidos na técnica.

Dessa forma, em uma modalidade particular, a presença de ligantes anti-fator CAMP ligados de uma amostra biológica pode ser prontamente detectada usando-se um ligante secundário que compreende um anticorpo dirigido contra os ligantes de anticorpo. Inúmeras moléculas de imunoglobulina (Ig) antibovinas são conhecidas na técnica, as quais podem ser prontamente conjugadas a um rótulo de enzima detectável, tais como peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina ou urease, usando-se métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Um substrato de enzima adequado é então usado para gerar um sinal detectável. Em outras modalidades relacionadas, técnicas de ELISA do tipo competitivo podem ser praticadas usando-se métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Os ensaios também podem ser realizados em solução, de forma que as proteínas do fator CAMP e os anticorpos específicos para aquelas proteínas formem complexos sob condições de precipitação. Em uma modalidade particular, as proteínas do fator CAMP podem ser aderidas a uma partícula da fase sólida (por exemplo, um glóbulo de agarose ou semelhantes) usando-se técnicas de acoplamento conhecidas na técnica, como por exemplo acoplamento químico direto ou indireto. A partícula coberta por antígeno é então colocada em contato sob condições de ligação adequadas com uma amostra biológica suspeita de conter anticorpos para as proteínas do fator CAMP. A ligação cruzada entre anticorpos ligados causa a formação de agregados de complexo partícula-antígeno-anticorpo que podem ser precipitados e separados da amostra usando-se lavagem e/ou centrifugação. A mistura de reação pode ser analisada para determinar a presença ou ausência de complexos anticorpo-antígeno usando-se qualquer um de inúmeros métodos-padrão, tais como aqueles métodos imunodiagnósticos descritos acima.

Ainda em uma modalidade adicional, pode ser fornecida uma matriz de imunoafinidade, onde uma população policlonal de anticorpos de uma amostra biológica suspeita de conter moléculas anti-fator CAMP é imobilizada a um substrato. Nesse aspecto, uma purificação de afinidade inicial da amostra pode ser realizada usando-se antígenos imobilizados. A preparação da amostra resultante irá conter, dessa forma, somente porções antiestreptococo, evitando propriedades de ligação não específicas no suporte de afinidade. Inúmeros métodos de imobilização de imunoglobulinas (sejam intactas ou em fragmentos específicos) com alto rendimento e boa retenção de atividade de ligação de antígeno são conhecidos na técnica. Sem se limitar a qualquer método em particular, pode ser usada proteína A ou proteína G imobilizada para imobilizar imunoglobulinas.

Conseqüentemente, uma vez que as moléculas de imunoglobulina tenham sido imobilizadas para fornecerem uma matriz de afinidade, proteínas rotuladas do fator CAMP são colocadas em contato com os anticorpos ligados sob condições de ligação adequadas. Após qualquer antígeno ligado de forma inespecífica ter sido lavado do suporte de imunoafinidade, a presença de antígeno ligado pode ser determinada testando a presença do rótulo usando-se métodos conhecidos na técnica.

Adicionalmente, anticorpos despertados contra as proteínas do fator CAMP, em vez dos próprios os fatores CAMP, podem ser usados nos ensaios acima descritos a fim de detectar a presença de anticorpos para as proteínas em uma certa amostra. Esses ensaios são realizados essencialmente como descritos acima e são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Os reagentes de ensaio acima descritos, incluindo as proteínas do fator CAMP, ou anticorpos contra elas, podem ser fornecidos em kits, com instruções adequadas e outros reagentes necessários, a fim de conduzir imunoensaios como descritos acima. 0 kit também pode conter, dependendo do imunoensaio particular usado, rótulos adequados e outros reagentes e materiais embalados (ou seja tampões de lavagem e semelhantes). Imunoensaios-padrão, tais como aqueles descritos acima, podem ser realizados usando esses kits.

Abaixo são mostrados exemplos de modalidades específicas para a realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos somente com finalidade ilustrativa, e não visam limitar de qualquer forma o escopo da presente invenção.

Depósitos de Cepas Üteis na Prática da Invenção Foi feito um depósito de culturas biologicamente puras das seguintes cepas junto à "American Type Culture Collection", 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia, sob as normas do Tratado de Budapeste. O número de acesso indicado foi designado após teste de viabilidade bem sucedido, e as taxas necessárias terem sido pagas. Os depósitos designados serão mantidos por um período de trinta (30) anos a partir da data de depósito, ou por cinco (5) anos após o última pedido para o depósito, o que for mais longo. Caso uma cultura se torne não viável ou seja inadvertidamente destruída, ou, no caso de cepas contendo plasmídeo, perca seu plasmídeo, ela será substituída com uma cultura(s) viável da mesma descrição taxonômica.

Caso haja discrepância entre a sequência apresentada na presente aplicação e a seqüência do gene de interesse no plasmídeo depositado devido a erros no sequenciamento de rotina, a seqüência no plasmídeo depositado predomina.

Cepa_ Data do Depósito ATCC N° pJLD21 em E. coli JF1754 9 de junho de 1995 69837 C. Experimental Materiais e Métodos As enzimas foram adquiridas de fontes comerciais, e usadas de acordo com as instruções dos fabricantes. Os radionucleotídeos e filtros de nitrocelulose também foram adquiridos de fontes comerciais.

No isolamento de fragmentos de DNA, exceto quando observado, todas as manipulações de DNA foram feita de acordo com procedimentos-padrão. Veja, Sambrook e cols., supra. Enzimas de restrição, T4 DNA ligase, E. coli, DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e outros reagentes biológicos podem ser adquiridos de fornecedores comerciais e usados de acordo com as instruções dos fabricantes. Fragmentos de DNA de filamento duplo foram separados em géis de agarose.

Cepas bacterianas, plasmídeos e condições de crescimento: Exceto onde indicado, a cepa de E. coli usada para a clonagem do gene do fator CAMP de S. uberis foi JF1754 (hsdR lac gal metB leuB hisB) (McNeil, J.B. e Friesen, J.D. (1981) Mol. Gen. Genet. 184: 386-393). E. coli JF1754 competente foi feita como descrito previamente (Hanahan, D. "Techniques for transformation of E. coli." Em: Glover DM, ed. "DNA cloning (Volume I) : a practical approach." Oxford: IRL Press, 1985: 109-135). As cepas de E. coli usadas para a produção do fator CAMP quimérico foram XLI Blue MRF (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA 1, lac[F' proAB laclP ΖΔΜ15 TnlO(TetR] (Stratagene, La Jolla, CA); e J5, N° de Acesso ATCC 43745, J. Clin. Microbiol. (1987) 25: 1009-1013.

As células de E. coli cresceram em caldo Luria (Difco Laboratories) ou em placas Luria-ágar (Difco Laboratories). Foi. usada ampicilina a 50 μg/mL para o crescimento de cepas de E. coli contendo plasmídeos recombinantes. Quatro cepas de S. uberis, assim como de S. agalactiae e S. aureus, foram obtida da "American Type Culture Collection" (Nos de Acesso ATCC 9927, 13386, 13387, 19436, 27541 e 25923, respectivamente). Outras cepas de S. uberis são isolados de campo gentilmente fornecidos por M. Chirino-Trejo, Universidade de Saskatchewan. Todas as cepas estreptocócicas cresceram em caldo de infusão cérebro coração (BHI, Difco Laboratories) ou em placas de ágar sangue base # com sangue de carneiro 5% (PML microbiológicos). O vetor de clonagem pTZ18R (Mead e cols. (1986) Protein Eng. 1: 67-74) foi obtido de Pharmacia Canadá Ltd. Os vetores de clonagem usados para a preparação das construções quiraéricas de CAMP foram pAA556a e pET15-b.

Preparação de beta-toxina de S. aureus: S. aureus foi cultivado em BHI por 18 horas a 37°C e o sobrenadante obtido após centrifugação a 5.000 g foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 μΜ (empresa Nalge). Esse material, referido como beta-toxina bruta, foi estocado a -20°C.

Reação de CAMP

As bactérias foram rastreadas quanto à atividade de CAMP como descrito (Schneewind e cols. (1988) Infect. Immun. 56μ 2174-2179). De forma breve, as cepas foram riscadas de forma perpendicular a uma raia de S. aureus produtor de beta-toxina em placas de ágar sangue e após incubação de 6-20 horas a 37°C, foram observadas quanto à hemólise.

Purificação de fator CAMP O fator CAMP foi parcialmente purificado do sobrenadante da cultura de S. uberis (N° de Acesso ATCC 9927) por cromatografia em Octil-Sefarose CL-4B (Pharmacia) como descrito por Jürgens e cols. (1985) J. Chrom. 348: 363-370.

Anticorpos policlonais Para analisar o fator CAMP recombinante de S. uberis, foram obtidos anticorpos policlonais dirigidos contra o fator CAMP purificado. Os camundongos foram imunizados por injeção intraperitonial de 2 0 μg da proteína de CAMP purificada com adjuvante de Freund completo. Essa imunização primária foi seguida 3 semanas mais tarde pela segunda injeção intraperitonial da mesma quantidade de proteína de CAMP com adjuvante de Freund incompleto e outras 3 semanas mais tarde pela terceira injeção intravenosa de 2 0 μg de proteína de CAMP com adjuvante de Freund incompleto. As amostras do soro do sangue foram então retiradas 10 dias mais tarde. PAGE e imunoblotting Amostras de proteína de S. agalactiae e E. coli foram obtidas de sobrenadantes de cultura por precipitação em ácido tricloroacético (TCA) em uma concentração final de 10%. Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) de proteínas foi realizada como descrito por Laemmli (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227:680-685). As proteínas foram submetidas a eletroblot em membranas de nitrocelulose como recomendado pelo fornecedor (Bio-Rad) e os blots foram desenvolvidos como descrito em outra parte (Theisen, M. e Potter, A. A. (1992) J. Bacteriol. 174: 17-23) com as seguintes diferenças. O primeiro anti-soro usado foi anti-soro policlonal de camundongo contra proteína de CAMP parcialmente purificada de S. uberis, e foi absorvido com antígenos da cepa hospedeira de E. coli como descrito previamente (Frey e cols. (1989) Infect. Immun. ΕΓ7: 20502056). 0 segundo anticorpo usado procedimento de blotting foi a IgG anticamundongo de cabra acoplada a fosfatase alcalina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.).

Manipulações de DNA

Todas as técnicas moleculares foram feitas da forma recomendada pelo fornecedor (Pharmacia Canadá Ltd.) ou Sambrook e cols., supra. O DNA cromossõmico de S. uberis foi preparado a partir de células crescidas em 100 mL de BHI mais glicina 5% (p/v) . As células foram peletizadas e ressuspensas em 2,5 mL de tampão TES (30 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl; pH 8,0) com sacarose 25% e 1,6 mg/mL de lisozima (Sigma) . A suspensão foi incubada por 1 hora a 37°C, seguido por congelamento a -70°C. As células congeladas foram descongeladas em um banho de água a 65°C. Foram adicionados EDTA e proteinase K (Pharmacia) até concentrações finais de 20 mM e 1,2 mg/mL, respectivamente, antes da incubação a 65°C por 30 minutos. As células se romperam células completamente, foi adicionado sarcosil até 1% e incubadas a 37°C por 1 hora. Dois mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8,9) foram adicionados antes da extração com fenol:clorofórmio. 0 DNA foi recuperado por precipitação com etanol e tratado com RNase (Pharmacia Canadá Ltd.).

Fragmentos de DNA cromossômico fracionados pelo tamanho e digeridos com Sau3AI foram isolados por centrifugação por gradiente de densidade de sacarose (Sambrook e cols., supra). A seqüência de DNA foi determinada pelo método de terminação de cadeia didesoxi de Sanger e cols. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467 nos modelos de plasmídeo de filamento duplo pelo uso de um kit de Sequenciamento T7 (Pharmacia Canadá Ltd.).

Análise de RNA RNA de cepas de E. coli foi isolado como descrito previamente (Lloubes e cols. (1986) Nucleic Acid Res. 14: 2621-2636) com uma digestão adicional de DNase I livre de RNase. RNA de S. uberis foi preparado como segue. 0 pelet de célula de uma cultura de 10 mL (OD60o=0,6) foi ressuspenso em 250 μΐι de tampão TE (pH 8,0) contendo 500 u de mutanolisina (Sigma) e incubado a 37°C por 30 minutos.

Foram adicionados tampão de lise (250 μΐΟ (60 mM Tris-HCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, SDS 2%) e 100 Mg/mL (concentração final) de proteinase K e a incubação continuou por 1 hora. A amostra foi extraída uma vez com fenol 65°C (saturada em água, pH 4,0) e duas vezes com fenol em temperatura ambiente. O RNA foi recuperado por precipitação com etanol e tratado com DNase I (Pharmacia Canadá Ltd.).

Foi realizado o ensaio de extensão de iniciador como descrito por Miller e cols. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 7341-60. RNasin e transcriptase reversa do vírus da leucemia murídea de moloney foram obtidos de Pharmacia Canadá Ltd.

Exemplo 1 Clonagem e expressão do gene do fator CAMP de S. uberis DNA cromossômico de S. uberis (ATCC 9927) foi parcialmente digerido com Sau3AI e fracionado pelo tamanho em um gradiente de sacarose; a partir disso, foram recuperados fragmentos de DNA de 2 a 5 kb. As extremidades desses fragmentos foram parcialmente preenchidas com dGTP e cLATP e ligadas em pTZ18R que foram recortadas com Sall e parcialmente preenchidas com dTTP e dCTP. Após a transformação de células competentes de E. coli JF1754, os clones que expressam o gene do fator CAMP foram identificados em placas de sangue com ampicilina e beta-toxina na superfície. Seis clones de um total de 10.000 eram fenotipicamente hemolíticos e cada um mediava uma reação CAMP distinta. Um deles, contendo plasmídeo recombinante pJLD21, foi selecionado para estudo posterior. 0 plasmídeo pJLD21 continha um fragmento de inserção de 5,2 kb e o gene do fator CAMP, cfu, estava localizado em um fragmento BamHI de 3,2 kb após o subclone pJLD21-2 positivo para CAMP ter sido gerado (Figura 1). Esse subclone foi posteriormente analisado com mais enzimas de restrição com o propósito de sequenciamento.

Para estudar a expressão do fator CAMP recombinante, foi realizada a análise SDS-PAGE de proteínas do sobrenadante de E. coli JF1754 (pJLD21) Cfu+ e E. coli JF1754 (pTZ18R) hospedeira. Comparada com o controle de vetor, não foi observada qualquer banda distinguível na raia que contém sobrenadante do clone Cfu+, indicando que a expressão ocorreu em níveis muito baixos, ou que a proteína não foi secretada de forma eficiente. Para identificar o fator CAMP codificado por pJLD21, as proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e submetidas a imunoblot. 0 clone de E. coli Cfu+ que carrega pJLD21 expressou uma proteína com peso molecular de 28.000, similar ao fator CAMP nativo de S. uberis.

Outro plasmídeo de expressão para o fator CAMP de S. uberis, pGH-CAMP, foi construído como mostrado na Figura 5. Em particular, um fragmento EcoRI-BamHI de 1,7 kb de pJLD21-2 foi preenchido com polimerase de Klenow e inserido em pGH433 que foi recortado com BamHI e preenchido de forma similar. O plasmídeo pGH433 é um vetor de expressão que contém um promotor tac, um sítio de início de tradução com sítios de enzima de restrição que permitem a ligação em todas as três estruturas de leitura, seguidos por códons de parada em todas as estruturas de leitura. Veja, Theisen, M. e Potter, A. A. (1992) J. Bacteriol. 174: 17-23.

Os plasmídeos de expressão foram usados para transformar E. coli JF1754 (descrito acima). 0 fator CAMP foi preparado a partir de corpos de inclusão como descrito, por exemplo, em Rossi-Campos e cols. (1992) Vaccine 10: 512-518, para uso nos testes de vacina abaixo. De forma breve, as bactérias cresceram até a fase de log médio e foi adicionada isopropil-β,D-tiogalactosida (IPTG) e as culturas foram incubadas com agitação vigorosa a 37°C. As bactérias foram coletadas por centrifugação, ressuspensas e congeladas a -70°C. As células congeladas foram descongeladas em temperatura ambiente e foi adicionado lisozima. Uma mistura de detergente foi então adicionada. A viscosidade foi reduzida por sonificação e agregados de proteína foram coletados por centrifugação. Os grânulos foram dissolvidos em um volume mínimo de 4 M hidrocloreto de guanidina. As proteínas foram analisadas por eletroforese em gel de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida e a concentração de proteína foi estimada comparando-se a intensidade das bandas coradas por azul de coomassie com um padrão de albumina do soro bovino.

Exemplo 2 Seqüência de nucleotxdeos de gene do fator CAMP de S. uberis Para se obter uma seqüência de nucleotídeos do gene do fator CAMP de S. uberis, cada um dos fragmentos EcoRI, HindIII, HincII e Saci de pJLD21-2 foi clonado individualmente em pTZ18R. Os fragmentos foram seqüenciados em ambas as orientações como mostrado na Figura 1. A seqüência codificadora para o fator CAMP de S. uberis, assim como a seqüência deduzida de aminoácidos, são mostradas na Figura 2 (ID. DE SEQ. Nos: 1 e 2).

Exemplo 3 Comparação do fator CAMP de S. uberis com fator CAMP de S. agalactiae Para comparar o fator CAMP de S. uberis com a proteína B de S. agalactiae, um sobrenadante concentrado da cultura de S. agalactiae contendo proteína B (Jürgens e cols. (1985) J. Chrom. 348: 353-370) foi separado por SDS-PAGE e analisado por imunoblotting com anticorpos contra o fator CAMP purificado de S. uberis. Uma banda de proteína de 25 kDa do sobrenadante de S. agalactiae reagiu no imunoblot. Esses dados indicaram que anticorpos monospecíficos despertados contra o fator CAMP de S. uberis podería apresentar reação cruzada com a proteína B de S. agalactiae. Isso não surpreende, uma vez que o alinhamento de uma seqüência de aminoácidos do fator CAMP de S. agalactiae com os aminoácidos deduzidos do fator CAMP de S. uberis mostrou resíduos 66,4% idênticos (Figura 4).

Exemplo 4 Distribuição de genes do fator CAMP em oito cepas de S. uberis Para estudar a distribuição do gene do fator CAMP em outras cepas de S. uberis, DNA cromossômico preparados a partir de oito cepas de S. uberis foi digerido com a endonuclease de restrição HindIII e separado em um gel de agarose. Análise de Southern blot com o fragmento HindlII-EcoRI de 576 bp de pJLD21 como marcador (Figura 1) mostrou que um fragmento de tamanho idêntico ao fragmento HindIII (1,2 kb) em pJLD21 estava presente em três cepas de S. uberis que eram reação de CAMP positivas, enquanto nenhuma das cepas reação de CAMP negativas reagiu com o marcador. Dessa forma, as cepas CAMP-negativas não contêm o gene cfu.

Exemplo 5 Imunogenicidade e Capacidade Protetora do Fator CAMP

Foi preparado fator CAMP de S. uberis, codificado por pGH-CAMP a partir de corpos de inclusão, como descrito no Exemplo 1. 0 antígeno foi formulado em adjuvante VSA3 que é uma combinação de Emulsigen Plus™ de "MVP Laboratories", Ralston, Nebraska e brometo de dimetildioctadecil amônio (DDA) da Kodak (Rochester, NY). A concentração final foi de 25 μg por mL de fator CAMP, Emulsigen Plus 30%, Tween-80 0,9%, e 2,5 mg por mL de DDA. O volume da dose era de 2 cc contendo 50 μg de antígeno recombinante.

Quinze vacas leiteiras lactantes saudáveis do "Pennsylvania State University Mastitis Research Herd" foram usadas para estudar a habilidade do fator CAMP de S. uberis para proteger vacas de mastite. Os animais foram designados para dois grupos de cinco vacas. Os grupos de tratamento consistiram em: 1) experimental, recebeu a vacina incluindo o fator CAMP de S. uberis, administrada de forma intramuscular na secagem do leite e novamente 28 dias mais tarde, e 2) placebo (veículo) administrado por meio de intramuscular injeção na secagem e novamente 28 dias mais tarde.

Todos os animais foram atacados em um quarto com S. uberis no quarto dia de lactação. Foram obtidas amostras do leite e do sangue, como descrito na Tabela 1. A cepa de ataque de S. uberis (ATCC cepa 9927) foi obtida de um caso clínico de mastite bovina. A cultura de estoque de S. uberis cresceu em caldo de soja típico e alíquotas individuais foram estocadas a -70°C em glóbulos sangüíneos até serem necessárias. 0 ataque bacteriano foi preparado girando-se as culturas de estoque de glóbulos sobre placas de ágar sangue esculina contendo sangue total 5. Após incubação de 24 horas a 37°C, foi usada uma única colônia para inocular 100 mL de leite pasteurizado em Temperatura Ultra Elevada (UHT) e incubada por 12 horas a 37°C. A cultura de 24 horas foi bem misturada e uma alíquota de 100 μL foi removida para inocular uma segunda porção de 100 mL de leite UHT. Apos uma Segunda incubação de 9 horas a 37°C, a cultura foi diluída serialmente em incrementos de 10 vezes usando solução salina estéril. As unidades de formação de colônia (CFU) por mL de cada diluição foram determinadas por absorbância em um espectrofotômetro e confirmadas derramando-se as placas sobre placas de ágar sangue. A diluição contendo 200 CFR de S. uberis por mL de solução salina foi selecionada para cada ataque.

Foram determinadas as titulações totais de Ig para fator CAMP por um ELISA indireto. Placas de Immunlon-2 foram cobertas com antígeno em tampão de carbonato. Antes do uso, as placas foram bloqueadas com TBST (100 mM Tris Cl, pH 8,0; 150 mM NaCl; Tween-20 0,05%) e BSA 3% por 1 hora. Após o bloqueio, as placas foram lavadas com água destilada. As amostras de soro e leite foram diluídas serialmente em incrementos de 3 vezes usando TBST contendo BSA 1%. Anti-soros de coelho para o fator CAMP de S. uberis também foram diluídos e serviram como um controle positivo. Amostras de controle negativo continham TBST com BSA 1%. As amostras diluídas e os controles foram transferidos para as placas revestidas e foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas cuidadosamente com água destilada e todas as cavidades foram incubadas com um conjugado de peroxidase de raiz forte de anti-IgG de cabra diluído 1:2000 em TBST contendo BSA 1%. Após uma incubação de 1 hora em temperatura ambiente, as placas foram lavadas com água destilada. A quantidade de anticorpo presente nas amostras foi visualizada usando substrato ABT. As titulações de cada amostra foram baseadas na leitura de absorbância a 405 nm com um comprimento de onda de referência de 495 nm. Uma leitura positiva para amostras era aquela ma qual a absorbância era duas vezes a absorbância em branco (controle negativo). As titulações foram determinadas tomando-se a recíproca da última diluição que deu uma leitura positiva. A consistência nas placas de ensaio foi monitorada pela leitura de absorbância dos controle positivos.

Os resultados são mostrados nas TABELAS 2 e 3. Como pode ser observado, as titulações de anticorpo foram maiores nos animais vacinados do que no grupo placebo. 1 Titulações do soro de amostras obtidas de animais imunizados com placebo rastreados quanto ao fator CAMP. 1 Titulações de anticorpo no leite de amostras obtidas de animais imunizados com placebo rastreados quanto ao fator CAMP.

As contagens de célula somática são uma medida tradicional de mastite em vacas. Conseqüentemente, o leite foi testado para as células somáticas suando um ensaio-padrão. Os resultados são mostrados na TABELA 4. Como é facilmente observado, os animais imunizados tiveram uma contagem de células somáticas dentro dos limites normais, enquanto o grupo de placebo teve contagens de célula que indicam a presença de mastite. Dessa forma, a vacina de fator CAMP foi eficaz na prevenção de mastite. 1 SCC do leite obtidas de quartos imediatamente antes do ataque inflamatório com S. uberis. 2 SCC do leite obtidas de quartos 3 dias após ataque inflamatório com S. uberis Exemplo 6 Clonagem, expressão e purificação de uma construção de fator CAMP quimérico Foi construída uma proteína quimérica de CAMP (CAMP-3) que compreende epitopos dos fatores CAMP de S. uberis e S. agalactiae, a fim de fornecer um antígeno de vacina altamente imunogênico, com reação cruzada. A Figura 7 mostra os plasmídeos intermediários e finais para a construção da quimera de CAMP-3. As seqüências de DNA e de aminoácidos da construção final são mostradas na Figura 8. A construção inclui DNA que codifica aminoácidos 31-87 de uma seqüência de S. agalactiae mostrada na Figura 3, clonada entre aquelas que codificam resíduos Leu90 e Lys9i de CAMP de S. uberis.

As seqüências de nucleotídeos publicadas dos genes codificadores de CAMP cfb (Podbielski e cols. (1994) Med. Microbiol. Immunol. 183: 239-56) e cfx (Jiang e cols. (1996) Microbiol. Path. 2_0: 297-307), de S. agalactiae e S. uberis, respectivamente, foram usadas para projetar iniciadores de PCR (mostrados na Tabela 5) , permitindo a construção do gene quimérico codificador de CAMP, camp-3. Um fragmento de PCR que codifica resíduos de aminoácido 3 090 de cfx foi amplificado com os iniciadores CAMP-1 e CAMP- 2. O fragmento foi clonado no vetor de expressão pAA556a (que contém seqüências codificadoras de terminal OmpF, que dirigem a exportação de proteínas de fusão OmpF à superfície da célula de E. coli) usando os sítios de restrição BamHI e Ndel codificados pelo iniciador, e a construção resultante foi designada pPolyCAMP-1. Um segundo fragmento de PCR, que codifica os resíduos 31-87 de cfb, foi amplificado com os iniciadores CAMP-3 e CAMP-4 e clonado em pPoly-CAMP-1 usando sítios Xhol e Ncol para gerar pPolyCAMP-2. Finalmente, um terceiro fragmento de PCR, que codifica os resíduos 91-258 de cfx, foi amplificado com os iniciadores CAMP-5 e CAMP-6 e digerido com Eco47-3 e Ncol. Esse fragmento foi clonado em pPolyCAMP-2 digerido com Stul/Ncol, e a construção resultante, pPolyCAMP-3, continha um gene quimérico, camp- 3, que codifica uma proteína de 317 aa, com um Mr calculado de 34,956 Da e um pi de 5,5. Essa proteína é a quimera CAMP-3 fundida à sequência sinalizadora de LipoF. A construção camp-3 foi seqüenciada em ambas as direções usando os iniciadores 556-1 e 556-2. A seqüência de DNA da construção quimérica foi determinada usando um seqüenciador automático de DNA ABI 373 (Applied Biosystems). A seqüência de DNA e a seqüência de aminoácidos correspondente da quimera CAMP-3 são mostradas na Figura 8 nas posições de DNA 79-942 (posições de aminoácido 27-314) . As posições de nucleotídeo 1-78 (posições de aminoácido 1-26) representam a seqüência sinalizadora de LipoF.

Para fornecer proteína pura suficiente para os estudos de vacina subseqüentes, um fragmento Ndel/BamHI contendo a região camp-3 de pPolyCAMP-3, menos a seqüência sinalizadora de OmpF, foi clonado no vetor de expressão pET15b (Novagen, Madison, WI), que foi digerido com BamHI e Ndel. A clonagem do produto de PCR nesse sítio resulta na adição de uma seqüência codificadora em estrutura para um tag de hexahistidil (6xHis) à seqüência codificadora de CAMP. A expressão subseqüente gera uma proteína com um tag de histidina anexado, o que permite a purificação da proteína sob condições que não causem desnaturação usando cromatografia em quelato metálico. Dessa forma, a construção final, plasmídeo pET-CAMP3, codificou uma proteína de fusão (6xHis)CAMP-3. A análise da seqüência de DNA dessa construção revelou que CAMP-3 ORF não estava fundida ao peptídeo que codifica o tag de histidina, mas que sua expressão ainda eram controlada por IPTG. Essa construção foi usada para transformar cepas de E. coli, descritas acima, usando o método de polietileno glicol (Kurien e Scofield (1995) BioTechniques 1_8: 1023-1026) ou por lavagens repetidas das células em água destilada estéril, como previamente descrito (Frohelich e Scott (1991) Gene 108: 99-101).

Tabela 5.

Iniciadores de PCR e de sequenclamento CAMP-l 5'-AAAAAAGGATCCAATCAAATAAATG Iniciador avante, enrijece TTAGTCAACCA-3' para nt 91-112 da seqüência (ID. DE SEQ N°: 10) codificadora de CAMP de S.

uberis. Sítio BamHI sublinhado. CAMP-2 5'-AAAAACCATGGCTACTCGAGATTTT Iniciador reverso, enrijece CAACAGCTGAATTGCTG AATTAAC-3' para nt 267-238 (filamento (ID. DE SEQ N°: 11) oposto) da seqüência codificadora de CAMP de S. uberis. Xhol, e Ncol sublinhados. CAMP-3 5'-AAAAAACTCGAGCAAGTGACAACTC Iniciador avante, enrijece CACAAGTGG-3' para nt 91-102 da seqüência (ID. DE SEQ N°: 12) codificadora de CAMP de S. agalactiae. Sítio Xhol sublinhado. CAMP-4 5'-AAAAAACCATGGCTAAGGCCTTAAT Iniciador reverso, enrijece TTTTCCACGCTAGTAAT AGCCTC-3' para nt 261-235 (filamento (ID. DE SEQ N°: 13) oposto) da seqüência codificadora de CAMP de S. agalactiae. Sítios StuI, e Ncol sublinhados. CAMP-5 5'-AAAAAAGCGCTAAAACTTCACTTAG Iniciador avante, enrijece AGCTAATCCTG-3 ' para nt. 271-2 95 da (ID. DE SEQ N°: 14) seqüência codificadora de CAMP de S. uberis. sítio Eco47-3 sublinhado. CAMP-6 5'-AAAAACCATGGTCATTACTGTAGAG Iniciador reverso, enrijece CAGTATTTAATGCTTC-3' para nt 777-751 (filamento (ID. DE SEQ N°: 15) oposto) da seqüência codificadora de CAMP de S. uberis. Sítio Ncol sublinhado.

His-CAMP-1 5'-AAAAAACATATGTCCAATCAAATAA Iniciador avante para ATGTTAGTCAACC-3' clonagem em pET-15b, (ID. DE SEQ N°: 16) Sítio Ndel sublinhado.

His-CAMP-2 5'-TTTTTGGATCCTTACTGTAGAGCAGT Iniciador reverso para ATTTAATGC-3' clonagem em pET-15b. (ID. DE SEQ N°: 17) Sítio BamHI sublinhado. 556-1 5'- GTGTGGAATTGTGAGCGG-3' Iniciador avante para (ID. DE SEQ N°: 18) sequenciamento de inserções clonadas em pAA556a, enrijece para nt 1791-1808 556-2 5'- CTCCCTGCCTCTGTC-3' Iniciador reverso para (ID. DE SEQ N°: 19) sequenciamento das inserções clonadas em pAA556a, enrijece para nt 1979-1965 (filamento oposto). A proteína CAMP-3 foi purificada por cromatografia por troca de ânion de um lisado filtrado de uma cultura induzida por IPTG de BL21 (DE3) contendo pET-CAMP3. As células foram coletadas por centrifugação a 6.000 x g por 10 minutos a 4°C, lavadas em 0,1 M PBS (pH 7,2), e rompidas por sonificação. O volume da fração solúvel foi ajustado até 650 mL com 20 mM Na2HP04 (pH 7,5), e filtradas através de um filtro de 0,22 mm (Millipore) . Resina de Q-sefarose de troca de ânion de fluxo rápido foi comprimida em uma coluna XK2 6/2 0 até um leito com a altura de 13 cm (volume da coluna: 70 mL) . A coluna foi equilibrada com tampão A (20 mM Na2HP04, pH 7,5), e a solução de proteína foi passada em uma taxa de 7 mL/min. A coluna foi lavada com 7,4 volumes de coluna (CV) de tampão A, e a proteína foi eluída com um tampão de gradiente (tampão A 0%-tampão B 50% [tampão A + 1 M NaCl, pH 7,5] sobre 12,85 CV e de tampão B 50-100% em 3,6 CV, e finalmente 100% de tampão B para 1,7 CV) . 0 eluído da coluna foi monitorado a 2 60 nm, e as frações foram concentradas com filtros BIOMAX-30 K. A análise por SDS-PAGE e Western blot determinou que a proteína CAMP-3 eluiu no ponto de ruptura e nas frações de tampão A. A densitometria de géis de SDS-PA estimou a pureza da proteína em >60%.

Exemplo 7 Imunização e ataque de vacas lactantes com fator CAMP quimérico Foram conduzidos experimentos para testar a eficácia de vacinas que compreendem o fator CAMP quimérico, assim como a proteína estreptocócica, GapC, de S. uberis e S. dysgalactiae, em vacas lactantes como segue. Um total de 99 vacas lactantes Holstein foram rastreadas quanto a presença de IgG no soro contra células totais de S. uberis, GapC e CAMP. Quatro grupos de 8 animais foram selecionados para vacinação com um placebo, (6xHis)GapC de S. uberis, (6xHis)GapC de S. dysgalactiae e CAMP-3. Cada dose da vacina (2 mL) incluía 100 mg/mL de (6xHis)GapC purificado, CAMP-3 ou placebo livre de antígeno (solução salina 0,85% (p/v)), e VSA3 30% (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá; van Drunen Littel-van den Hurk e cols. (1993) Vaccine 11: 25-35). As vacas receberam 2 injeções subcutâneas no pescoço 36 (dia 0) e 15 dias antes do ataque. Oito dias antes do ataque, amostras de leite de cada quarto foram analisadas quanto à presença de bactérias, e os animais infectados foram excluídos do este. Subseqüentemente, 6 vacas de cada grupo foram atacadas. Três horas antes do ataque, as tetas foram lavadas com água aquecida, limpa, , secas, e esfregadas com álcool. As amostras de leite foram coletadas para contagens de células somáticas (SCC) e bacteriologia. Os quartos da teta esquerda permaneceram livres de ataque como controles. Três mL de inóculo foram administrados por infusão intramamária aos quartos direitos de cada animal, contendo 3,0 x 107 cfu/mL de uma cultura em fase exponencial de S. uberis SU21 (isolado clínico obtido do "Animal Health Laboratory", Alberta, Canadá) suspenso em solução salina 0,85% (p/v). Amostras de leite foram coletadas de todos os quartos, diariamente por 7 dias pós-ataque, para determinação de SSC e bacteriologia. Todas as amostras foram estocadas em gelo, e analisadas dentro de 48 horas após a coleta. As avaliações clínicas dos animais incluíram a medida de temperaturas retais, e edema da teta (visual e palpado). Uma pontuação numérica de 1 (normal) a 3,5 (mastite severa) foi designada a cada animal e usada como um meio de comparação da severidade de mastite dentre vários grupos de vacina. A qualidade do leite foi avaliada pela presença de coágulos.

As titulações de IgG do soro foram determinadas no momento da primeira e segunda vacinações, em 8 dias antes do ataque (dia 28), e em 11 dias pós-ataque (dia 47). Similarmente, as titulações de IgG no leite foram determinadas no dia 21 e 43. As titulações de IgA no soro foram determinadas no dia 21 e 47, e as titulações de IgA no leite foram determinadas nos dia 21 e 43. Placas de microtitulação de fundo redondo, com 96 cavidades (Nunc) foram revestidas de um dia para o outro a 4°C com CAMP-3, e (6xHis)GapC de S. uberis e S. dysgalactiae (100 ng/cavidade em 100 mL de tampão de carbonato, pH 9,6), e bloqueadas por 1 hora a 37°C com 200 mL de PBSTg. 100 mL da amostra de teste foram adicionados/cavidade, e as placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após lavagem, foi adicionado IgG de cabra antibovina conjugada a fosfatase alcalina (H & L; Kirkegaard e Perry Labs. Inc. , Gaithersburg, MD) (100 mL/cavidade), e placas as foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas, e a atividade de fosfatase alcalina foi detectada a 405 nm após incubação com p-nitrofenil fosfato em 1 M dietanolamina (pH 9,8) e 0,5 mM MgCl2 por 1,5 horas em temperatura ambiente. A determinação de IgG e IgA no leite foi realizada após tratamento do leite com uma solução de renina comercialmente disponível, como segue: um comprimido de Rennet (CHR HANSEN) foi dissolvido em 40 mL de H20, e 0,1 mL dessa solução foi adicionado a 2 mL de leite e incubado em temperatura ambiente por 4 horas. Caseína coagulada foi granulada por centrifugação a 3,000 x g por 20 minutos, e a camada média foi removida (a camada de cima era composta de gordura) e analisada da mesma forma que as amostras de soro. As titulações tanto de soro quanto de leite foram determinadas pela interseção da regressão do quadrado mínimo do OD405 versus o logaritmo da diluição como o OD405 obtido das cavidades contendo no soro. A determinação das SCC de amostras de leite foi realizada no "Pacific Milk Analysis Laboratory" (Chilliwak, Columbia Britânica). As amostras foram coletadas em 14 mL de poliestireno, tubos de fundo redondo (Falcon) contendo um preservativo. SCC foram fixadas pela mistura de 0,5 mL de amostras de leite com 10 mL de líquido fixador (0,2 mg/mL de eosina, solução de formaldeído 3,3%) por 18 horas a 30°C. As amostras foram diluídas 1/100 em uma solução de emulsificação de eletrólito (etanol 12%, Triton X-100 0,02%, 0,1 M NaCl), e incubadas a 80°C por 10 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, as SCC foram determinadas com um contador Coulter. A análise e as medidas repetidas da variância de SCC entre os tratamentos, e ao longo do tempo, foram realizadas usando o pacote de programas de computador SYSTAT 10 (SPSS Science, Chicago, EUA) . A Tabela 6 mostra titulações pré- e pós-ataque, apresentadas como médias aritméticas dos valores log naturais transformados de titulações de soro de todos os animais em cada grupo de tratamento (desvios padrão entre parênteses). Antes da vacinação, somente 4 animais mostraram qualquer titulação detectável de IgG no soro contra (6xHis)GapC. Após a vacinação, todos os animais vacinados com (6xHis)GapC mostraram um aumento significativo nas titulações de IgG anti-(6xHis)GapC tanto no soro quanto no leite, que permaneceram de forma consistente pelo menos 10 vezes maiores do que os animais de controle, enquanto as titulações de IgG anti-(6xHis)GapC em animais vacinados com CAMP-3 foram similares àquelas do grupo de controle. Titulações de IgG anti-(6xHis)GapC no leite foram consistentemente menores do que os valores correspondente no soro. No entanto, imediatamente antes do ataque era evidente o aumento nas titulações de IgG no soro e no leite em animais vacinados com (6xHis)GapC, comparados aos animais de controle e vacinados com CAMP-3. Os níveis séricos de IgA anti-(6xHis)GapC eram detectáveis em todos os grupos antes do ataque, mas cresceram significativamente após o ataque. Até mesmo o grupo vacinado com CAMP-3 mostrou um aumento nas titulações séricas de IgA anti-(6xHis)GapC, muito provavelmente resultando da exposição ao GapC associado à superfície da célula das bactérias do ataque de S. uberis. Em animais vacinados com CAMP-3, também foi observado um aumento pós-ataque nas titulações de IgG anti-(6xHis)GapC no leite, embora não tenha sido observado um aumento correspondente nas titulações de IgG no soro. Ao contrário do soro, IgA anti-(6xHis)GapC do leite era virtualmente não detectável em todos os grupos, tanto pré- quanto pós-ataque.

Após a vacinação das vacas com CAMP-3, havia um aumento marcante nas titulações de IgG anti-CAMP no soro e no leite, comparadas com aquelas dos animais de controle e vacinados com (6xHis)GapC. Além disso, ao contrário das titulações de IgG anti-(6xHis)GapC IgG, as titulações antiCAMP -3 aumentaram pós-ataque, enquanto que aquelas para (6xHis)GapC diminuíram ligeiramente. Embora a causa seja desconhecida, essa observação era consistente em todos os grupos de vacina; verificou-se que as titulações de IgG no soro anti-(6xHis)GapC pós-ataque diminuíram, enquanto que as titulações correspondentes no leite diminuíram (com exceção do grupo de S. dysgalactiae vacinado com (6xHis)GapC). As titulações no soro de IgA anti-CAMP-3 pré-ataque, eram maiores do que as titulações no soro equivalente anti-(6xHis)GapC no mesmo ponto de tempo (dia 21) , e no momento em que as amostras de soro pré-ataque foram retiradas, os níveis de IgA anti-CAMP-3 aumentaram em todos os grupos, mais significativamente naqueles vacinados com CAMP-3. Em contraste, as titulações de IgA anti-CAMP-3 no leite tanto pré- quanto pós-ataque eram virtualmente não detectáveis.

Após ataque com S. uberis SU21, não se recuperou bactéria em qualquer ponto de quaisquer animais, vacinados ou não. Isso é consistente com os resultados de um estudo prévio (Finch e cols. (1994) Infect. Immun. 62_: 3599-3603), onde nenhuma bactéria foi isolada após o ataque de vacas leiteiras vacinadas com S. uberis morto pelo calor, embora tenham sido isoladas dos animais de controle não vacinados. é possível que no estudo atual o inóculo administrado fosse muito baixo para induzir mastite sem causar infecção persistente, mesmo em animais não vacinados. No entanto, apesar da ausência de bactérias recuperáveis, os animais não exibiam sintomas clínicos de doença, SCC indicavam que tinha ocorrido inflamação. Portanto, o ataque foi considerado bem sucedido. Entre os grupos de vacina, não foram observadas quaisquer diferenças significativas nas temperaturas retais, e as pontuações clínicas determinaram que não havia diferenças significativas na severidade da infecção. Embora não tenha sido observada qualquer diferença no rendimento de leite em quaisquer animais, a qualidade do leite foi ligeiramente afetada em todos os grupos, como discutido abaixo. A teta bovina é composta de quartos não conectados, e atacando-se somente 2 quartos com S. uberis, foi fornecido um controle interno para cada animal. A Figura 9 mostra SCC ao longo da duração do teste, para cada grupo de vacina em particular. Na análise inicial, as SCC relatadas do controle grupo parecem de alguma forma variáveis; no entanto, o comportamento global foi um aumento das SCC ao longo do tempo, explicado por um relacionamento quadrático (p=0,02). Após o dia 2, as SCC do controle grupo aumentaram de forma marcante, alcançando seu nível mais elevado no dia 4 pós-ataque. As SCC então diminuíram ligeiramente, antes de crescerem de forma marcante novamente por volta do dia 7 pós-ataque. Essa tendência algo errática é consistente com os valores de SCC relatados em outro lugar, após o ataque de vacas lactantes com S. uberis (Finch e cols. (1997) Vaccine ]J5: 1138-1143; Finch e cols. (1994) Infect. Immun. 62: 3599-3603). As SCC de animais vacinados com (6xHis)GapC de S. dysgalactiae aumentaram de forma brusca imediatamente pós-ataque, alcançando um máximo no dia 3, antes de diminuírem de forma errática ao longo do restante do teste. No entanto, em nenhum momento a diminuição foi estatisticamente diferente de forma significativa daquela do grupo de controle, apesar de uma diferença aparente do dia 4 pós-ataque em diante. Esse resultado pode ser devido ao fato de que o (6xHis)GapC de S. dysgalactiae não é tão protetor quanto aquele de S. uberis. A vacinação com (6xHis)GapC de S. uberis resultou em uma diminuição significativa nas SCC, comparado ao grupo de controle. Do dia 3 em diante, as SCC nesse grupo eram estatisticamente mais baixas de forma significativa do que aquelas do grupo de controle (valores p de 0,023 no dia 3, 0,001 no dia 4, 0,011 no dia 5, 0,006 no dia 6, e 0,000 no dia 7 pós-ataque). As SCC de vacas vacinadas com o antígeno CAMP-3 eram ligeiramente maiores do que aquelas dos animais vacinados com (6xHis)GapC de S. uberis, embora ainda fossem claramente mais baixos do que aqueles do grupo de controle. A comparação de SCC do grupo do controle e dos grupos vacinados com CAMP-3 revelou diferenças estatisticamente significativas nos dias 3 (valor p de 0,033), 6 e 7 pós-ataque (valores p de 0,032, e 0,046, respectivamente), mas não nos dias 4 e 5, muito embora as SCC fossem obviamente mais baixas no grupo de vacinados com CAMP-3 naqueles dias.

Após o ataque com SU21, o tempo em que a qualidade do leite permaneceu afetada variou entre grupos de vacina. Pós-ataque, a qualidade do leite nos grupos de controle, vacinados com (6xHis)GapC de S. dysgalactiae, CAMP-3, e (6xHis)GapC de S. uberis foi reduzida por um total de 21, 24, 11, e 9 dias, respectivamente. De acordo com esses dados, mastite no grupo de vacinados com (6xHis)GapC de S. dysgalactiae não foi menos severa, se não pior, do que aquela do grupo de controle. De forma inversa, embora a vacinação com (6xHis)GapC de S. uberis não tenha evitado completamente a redução da qualidade do leite, ela reduziu significativamente a duração de tempo em que a qualidade do leite foi afetada. A vacinação com CAMP-3 parece que também reduziu a duração de tempo comprimento em que a qualidade do leite foi reduzida, embora não tanto quanto no grupo de (6xHis)GapC de S. uberis, o que está de acordo com os resultados de SCC.

Tabela 6.

Titulações de IgG e IgA Anti-GapC e anti-CAMP no Soro a Soro GapC Pré- 1 8,33(±0,87) 4,28(±0,55) 2,75(±0,85) 0,86(±1,10) Ataque 2 12,74 ( + 1,64) 7,12 (±0,34) 3,39 (±0,31) 2,11(±1,22) 3 13,21 ( + 0,84) 7,85 (+1,09) 2,72 (±1,50) 1,24 ( + 1,33) 4 9,41 (+0,69) 4,51±0,61 2,09(±1,03) 1,34(+1,26) GapC PÓS- 1 2,42(±3,75) 6,38(±0,55) 4,20(±0,97) 1,35(±1,55) Ataque 2 10,12(±1,34) 6,66(±0,22) 4,78(±0,94) 1,14(+1,25) 3 10,79(+1,07) 9,05(+1,64) 4,64(±1,02) 1,31(+1,22) 4 5,30(±4,14) 5,84( + 0,46) 3,49(±3,28) 1, 80 ( + 1,25) CAMP Pré- 1 7,35(±1,00) 4,06(±0,39) 1,63(±1,53) 0,60(+0,81) Ataque 2 7,98(±0,98) 5,33 (±0,34) 0,90 (±1,36) 1,77 (±0,90) 3 7,21(±0,99) 5,06(+0,70) 2,56(±1,90) 1,67(±1,42) 4 11,82 (±0,59) 8,37 (±1,02) 3,69 (±2,31) 1,46(±1,44) CAMP PÓS- 1 6,19(+4,82) 4,87(+1,37) 0 0,58(±0,94) Ataque 2 6,98(±3,52) 5,07 (±0,78) 1,46 (±2,42) 0,41 (+0,99) 3 6,41(±5,24) 5,26(+-1,00)2,66(+2,24) 1,85(±1,42) 4 13,47(+0,55) 8,90(±1,13) 5,09(11,42) 1,90(+1,30) a Os grupos mostrados são: 1. Controle, Vacinados com 2. (6xHis)GapC de S. dysgalactiae, 3. (6xHis)GapC de S. uberis, e 4. CAMP-3. Os dados pré-ataque correspondem às titulações IgG no soro no dia 28, e titulações de IgA no soro, IgG e IgA no leite no dia 21. Os dados pó-ataque correspondem às titulações de IgG no soro no dia 47, e titulações de soro IgA, e IgG e IgA no leite no dia 43.

Dessa forma, são revelados fatores CAMP imunogênicos, assim como métodos de fabricação e de uso dos mesmos.

Embora tenham sido descritas em algum detalhe modalidades preferidas da invenção em questão, entende-se que podem ser feitas variações óbvias sem se afastar do espirito e do escopo da invenção, como definida pelas reivindicações em apêndice.

REIVINDICAÇÕES

Claims (19)

1. Polipeptideo imunogênico caracterizado por compreender um ou mais epítopos de fator CAMP de mais de uma espécie bacteriana, em que pelo menos um dos referidos epitopos de fator CAMP é da região variável do terminal N do fator CAMP que corresponde à região definida pelos aminoácidos 1-90 da SEQ ID No. 2.

2. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido epitopo de fator CAMP da região variável do terminal N está interposto dentro de uma proteína do fator CAMP da SEQ ID No. 2 ou SEQ ID No. 4, e ainda onde a referida proteína do fator CAMP é de uma espécie estreptocócica diferente daquela do epitopo de fator CAMP da região variável do terminal N.

3. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido epitopo de fator CAMP da região variável do terminal N compreende uma sequência de aminoácidos revelada nas posições 31-87 da SEQ ID No. 4, e a referida proteína do fator CAMP é de SEQ ID No. 2.

4. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptideo compreende a sequência de aminoácidos contígua revelada nas posições 27-314 da SEQ ID No. 9.

5. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptideo compreende a sequência de aminoácidos revelada nas posições 27-314 da SEQ ID No. 9.

6. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ainda compreender uma sequência sinalizadora.

7. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida sequência sinalizadora compreende a sequência de aminoácidos revelada nas posições 1-26 da SEQ ID No. 9.

8. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID No. 9.

9. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido um ou mais epitopos de fator CAMP são separados por um espaçador que consiste em 1-20 aminoácidos.

10. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 1 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptideo compreende um ou mais epitopos de fator CAMP de mais de uma espécie bacteriana do gênero Streptococcus.

11. Polipeptideo imunogênico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida espécie bacteriana é selecionada do grupo que consiste em Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae e Streptococcus pyogenes.

12. Composição imunogênica caracterizada por compreender o polipeptideo imunogênico conforma definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

13. Método de produção de uma composição imunogênica caracterizado por compreender as etapas de: (1) fornecer o polipeptideo imunogênico, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11; e (2) combinar o referido polipeptideo com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

14. Polinucleotideo caracterizado por compreender uma sequência codificadora que codifica um polipeptideo imunogênico, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

15. Vetor recombinante caracterizado por compreender: (a) o polinucleotideo, conforme definido pela reivindicação 14; e (b) pelo menos um elemento de controle ligado operacionalmente ao referido polinucleotideo, segundo o qual a referida sequência codificadora pode ser transcrita e traduzida em uma célula hospedeira.

16. Célula hospedeira microbiana caracterizada por compreender o vetor recombinante conforme definido pela reivindicação 15.

17. Método para a produção de um polipeptideo imunogênico, o referido método caracterizado por compreender cultivar uma população de células hospedeiras, conforme definida pela reivindicação 16, sob condições para a produção do referido polipeptideo.

18. Método de detecção de anticorpos para Streptococcus em uma amostra biológica, caracterizado por compreender: (a) reagir a referida amostra biológica com um polipeptideo imunogênico, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sob condições que permitam que os referidos anticorpos para Streptococcus, quando presentes na amostra biológica, se liguem ao referido polipeptideo para formarem um complexo anticorpo/antígeno; e (b) detectar a presença ou ausência do referido complexo, e, dessa forma, a detecção da presença ou ausência de anticorpos para Streptococcus na referida amostra.

19. Kit de teste imunodiagnóstico para a detecção de infecção por Streptococcus, o referido kit de teste caracterizado por compreender um polipeptideo imunogênico, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e instruções para a condução do teste imunodiagnóstico.