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BR122025013274A2 - DOUBLE-CHAIN RIBONUCLEIC ACID AGENT, CELL, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHOD FOR INHIBITING PD-L1 EXPRESSION IN A CELL, AND, USE OF AN RNAI AGENT - Google Patents

DOUBLE-CHAIN RIBONUCLEIC ACID AGENT, CELL, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHOD FOR INHIBITING PD-L1 EXPRESSION IN A CELL, AND, USE OF AN RNAI AGENT

Info

Publication number
BR122025013274A2
BR122025013274A2 BR122025013274-8A BR122025013274A BR122025013274A2 BR 122025013274 A2 BR122025013274 A2 BR 122025013274A2 BR 122025013274 A BR122025013274 A BR 122025013274A BR 122025013274 A2 BR122025013274 A2 BR 122025013274A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
nucleotide
nucleotides
sense strand
antisense strand
Prior art date
Application number
BR122025013274-8A
Other languages
Portuguese (pt)
Inventor
Gregory Hinkle
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Alnylam Pharmaceuticals, Inc.
Publication of BR122025013274A2 publication Critical patent/BR122025013274A2/en

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Abstract

A presente invenção refere-se a agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de cadeia dupla, que alvejam o gene de ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1) e métodos de uso de tais agentes de RNAi para inibir a expressão de um gene PD-L1 e métodos de tratamento de indivíduos com distúrbio associado a PD-L1.The present invention relates to RNAi agents, e.g., double-stranded RNAi agents, that target the programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) gene and methods of using such RNAi agents to inhibit the expression of a PD-L1 gene and methods of treating individuals with a PD-L1 associated disorder.

Description

Pedidos RelacionadosRelated Requests

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório U.S. n° 62/213.224, depositado em 2 de setembro de 2015, cujos conteúdos na íntegra são aqui incorporados por referência.[001] This application claims priority to U.S. Provisional Application No. 62/213,224, filed on September 2, 2015, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

Listagem de SequênciasSequence Listing

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente no formato ASCII e é aqui incorporada em sua totalidade por referência. A dita cópia em ASCII, criada em 29 de julho de 2016, é chamada 121301-04220_SL.txt e é de tamanho de 108.003 bits.[002] This application contains a Sequence Listing that has been submitted electronically in ASCII format and is incorporated herein in its entirety by reference. Said ASCII copy, created on July 29, 2016, is named 121301-04220_SL.txt and is 108,003 bits in size.

Fundamentos da InvençãoFundamentals of the Invention

[003] O ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1) é uma proteína transmembranar tipo I de 290 aminoácidos codificada pelo gene CD274 no cromossomo 19 de camundongo e no cromossomo humano 9. A expressão de PD-L1 está envolvida na evasão de respostas imunes envolvidas em infecção crônica, por exemplo, infecção viral crônica (incluindo, por exemplo, HIV, VHB, VHC e HTLV, entre outros), infecção bacteriana crônica (incluindo, por exemplo, Helicobacter pylori, entre outros) e infecção parasitária crônica (incluindo, por exemplo, Schistosoma mansoni). A expressão de PD-L1 foi detectada em vários tecidos e tipos de células, incluindo células T, células B, macrófagos, células dendríticas e células não hematopoiéticas, incluindo células endoteliais, hepatócitos, células musculares e placenta.[003] Programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) is a 290 amino acid type I transmembrane protein encoded by the CD274 gene on mouse chromosome 19 and human chromosome 9. PD-L1 expression is involved in the evasion of immune responses involved in chronic infection, e.g., chronic viral infection (including, e.g., HIV, HBV, HCV, and HTLV, among others), chronic bacterial infection (including, e.g., Helicobacter pylori, among others), and chronic parasitic infection (including, e.g., Schistosoma mansoni). PD-L1 expression has been detected in various tissues and cell types, including T cells, B cells, macrophages, dendritic cells, and non-hematopoietic cells, including endothelial cells, hepatocytes, muscle cells, and placenta.

[004] A expressão de PD-L1 também está envolvida na supressão da atividade imune antitumoral. Os tumores expressam antígenos que podem ser reconhecidos pelas células T do hospedeiro, mas a depuração imunológica de tumores é rara. Parte dessa falha se deve à supressão imune pelo microambiente tumoral. A expressão de PD-L1 em muitos tumores é um componente deste meio de supressão e atua em conjunto com outros sinais imunossupressores. A expressão de PD-L1 foi mostrada in situ em uma grande variedade de tumores sólidos, incluindo mama, pulmão, cólon, ovário, melanoma, bexiga, fígado, salivar, estômago, gliomas, tireoide, epitelial tímico, cabeça e pescoço (Brown JA et al., 2003. J. Immunol.170:1257-66; Dong H et al. 2002. Nat. Med. 8:793-800; Hamanishi J, et al. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Strome SE et al. 2003. Cancer Res. 63:6501-5; Inman BA et al. 2007. Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004. Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007. Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C, Zhu Y, Jiang J, Zhao J, Zhang XG, Xu N. 2006. Acta Histochem. 108:19-24). Além disso, a expressão do receptor para PD-L1, proteína de morte celular programada 1 (também conhecida como PD-1 e CD279) é regulada ascendentemente em linfócitos infiltrantes de tumores, o que também contribui para a imunossupressão tumoral (Blank C et al. 2003. J. Immunol. 171:4574-81). Mais importante ainda, estudos que relacionam a expressão de PD-L1 em tumores com o desfecho da doença mostram que a expressão de PD-L1 se correlaciona fortemente com o prognóstico desfavorável no câncer de rim, ovário, bexiga, mama, gástrico e pancreático (Hamanishi J et al. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Inman BA et al. 2007. Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004. Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007. Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C, Zhu Y, Jiang J, Zhao J, Zhang XG, Xu N. 2006. Acta Histochem. 108:19-24). Além disso, esses estudos sugerem que níveis mais elevados de expressão de PD-L1 nos tumores podem facilitar o avanço da fase tumoral e a invasão em estruturas de tecido mais profundas.[004] PD-L1 expression is also involved in the suppression of antitumor immune activity. Tumors express antigens that can be recognized by host T cells, but immune clearance of tumors is rare. Part of this failure is due to immune suppression by the tumor microenvironment. PD-L1 expression in many tumors is a component of this suppression pathway and acts in concert with other immunosuppressive signals. PD-L1 expression has been shown in situ in a wide variety of solid tumors, including breast, lung, colon, ovarian, melanoma, bladder, liver, salivary, gastric, gliomas, thyroid, thymic epithelial, head and neck (Brown JA et al., 2003. J. Immunol. 170:1257-66; Dong H et al. 2002. Nat. Med. 8:793-800; Hamanishi J, et al. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Strome SE et al. 2003. Cancer Res. 63:6501-5; Inman BA et al. 2007. Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004. Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007. Clinic. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004. Proc. Natl. Academic. Sci. USA 101:17174-79; Wu C, Zhu Y, Jiang J, Zhao J, Zhang XG, Xu N. 2006. Acta Histochem. 108:19-24). Furthermore, expression of the receptor for PD-L1, programmed cell death protein 1 (also known as PD-1 and CD279) is upregulated on tumor-infiltrating lymphocytes, which also contributes to tumor immunosuppression (Blank C et al. 2003. J. Immunol. 171:4574-81). Most importantly, studies relating PD-L1 expression in tumors to disease outcome show that PD-L1 expression strongly correlates with poor prognosis in kidney, ovarian, bladder, breast, gastric, and pancreatic cancer (Hamanishi J et al. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Inman BA et al. 2007. Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004. Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007. Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C, Zhu Y, Jiang J, Zhao J, Zhang XG, Xu N. 2006. Acta Histochem. 108:19-24). Furthermore, these studies suggest that higher levels of PD-L1 expression in tumors may facilitate tumor stage advancement and invasion into deeper tissue structures.

[005] A via PD-1 também pode desempenhar um papel nas doenças malignas hematológicas. PD-L1 é expresso em células de mieloma múltiplas, mas não em células plasmáticas normais (Liu J et al. 2007. Blood 110:296304). O PD-L1 é expresso em alguns linfomas primários de células T, particularmente linfomas de células T grandes anaplásicas (Brown JA et al., 2003. J. Immunol. 170:1257-66). O PD-1 é altamente expresso nas células T dos linfomas angioimunoblásticos e o PD-L1 é expresso na rede celular dendrítica folicular associada (Dorfman DM et al. 2006. Am. J. Surg. Pathol. 30:802-10). No linfoma de Hodgkin predominante de linfócitos nodulares, as células T associadas a células linfocíticas ou histiocíticas (L&H) expressam PD-1. A análise de microarranjos usando uma leitura de genes induzidos por ligação de PD-1 sugere que as células T associadas ao tumor estão respondendo a sinais PD-1 in situ no linfoma de Hodgkin (Chemnitz JM et al. 2007. Blood 110:3226-33). PD-1 e PD-L1 são expressos em células T CD4 em leucemia e linfoma de células T mediadas por HTLV-1 (Shimauchi T et al. 2007. Int. J. Cancer 121: 2585-90). Essas células tumorais são hiporresponsivas aos sinais de TCR.[005] The PD-1 pathway may also play a role in hematologic malignancies. PD-L1 is expressed on multiple myeloma cells but not on normal plasma cells (Liu J et al. 2007. Blood 110:296304). PD-L1 is expressed on some primary T-cell lymphomas, particularly anaplastic large T-cell lymphomas (Brown JA et al., 2003. J. Immunol. 170:1257-66). PD-1 is highly expressed on the T cells of angioimmunoblastic lymphomas, and PD-L1 is expressed on the follicular-associated dendritic cell network (Dorfman DM et al. 2006. Am. J. Surg. Pathol. 30:802-10). In nodular lymphocyte-predominant Hodgkin lymphoma, lymphocytic or histiocytic cell-associated (L&H) T cells express PD-1. Microarray analysis using a readout of genes induced by PD-1 ligation suggests that tumor-associated T cells are responding to PD-1 signals in situ in Hodgkin lymphoma (Chemnitz JM et al. 2007. Blood 110:3226-33). PD-1 and PD-L1 are expressed on CD4 T cells in HTLV-1-mediated T-cell leukemia and lymphoma (Shimauchi T et al. 2007. Int. J. Cancer 121:2585-90). These tumor cells are hyporesponsive to TCR signals.

[006] Estudos em modelos animais demonstram que PD-L1 em tumores inibe a ativação de células T e a lise de células tumorais e, em alguns casos, leva ao aumento da morte de células T específicas de tumor (Dong H et al. 2002. Nat. Med.8:793-800; Hirano F et al. 2005. Cancer Res.65:1089- 96). As APCs associadas ao tumor também podem utilizar a via PD-1:PD-L para controlar as respostas de células T antitumorais. A expressão de PD-L1 em uma população de DCs mieloides associadas ao tumor é regulada ascendentemente por fatores ambientais tumorais (Curiel TJ et al. 2003. Nat. Med. 9:562-67). As células dendríticas plasmocitoides (DCs) no linfonodo de drenagem de tumor de melanoma B16 expressam IDO, que ativa fortemente a atividade supressora de células T reguladoras. A atividade supressora de células T reguladoras tratadas com IDO exigiu contato celular com DCs que expressam IDO (Sharma MD et al. 2007. J. Clin. Invest. 117:2570-82).[006] Studies in animal models demonstrate that PD-L1 on tumors inhibits T cell activation and tumor cell lysis and, in some cases, leads to increased tumor-specific T cell killing (Dong H et al. 2002. Nat. Med. 8:793-800; Hirano F et al. 2005. Cancer Res. 65:1089-96). Tumor-associated APCs can also utilize the PD-1:PD-L pathway to control anti-tumor T cell responses. PD-L1 expression on a tumor-associated myeloid DC population is upregulated by tumor environmental factors (Curiel TJ et al. 2003. Nat. Med. 9:562-67). Plasmacytoid dendritic cells (DCs) in the B16 melanoma tumor-draining lymph node express IDO, which strongly activates the suppressive activity of regulatory T cells. The suppressive activity of IDO-treated regulatory T cells required cellular contact with IDO-expressing DCs (Sharma MD et al. 2007. J. Clin. Invest. 117:2570-82).

[007] Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de tratamentos eficazes para doenças associadas a PD-L1, tais como uma doença infecciosa, tal como uma doença infecciosa intracelular crônica, por exemplo, uma doença viral, por exemplo, infecção por hepatite ou uma infecção bacteriana, por exemplo, infecção tuberculosa; e câncer, por exemplo, um câncer hepático, por exemplo, carcinoma hepatocelular.[007] Accordingly, there is a need in the art for effective treatments for diseases associated with PD-L1, such as an infectious disease, such as a chronic intracellular infectious disease, e.g., a viral disease, e.g., hepatitis infection, or a bacterial infection, e.g., tuberculosis infection; and cancer, e.g., a liver cancer, e.g., hepatocellular carcinoma.

Sumário da InvençãoSummary of the Invention

[008] A presente invenção provê composições de iRNA que afetam a clivagem mediada pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene PD-L1. O gene PD-L1 pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um humano.[008] The present invention provides iRNA compositions that affect RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated cleavage of RNA transcripts of a PD-L1 gene. The PD-L1 gene may be within a cell, e.g., a cell within an individual, such as a human.

[009] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de cadeia dupla (RNAi) para inibir a expressão do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), em que o RNAi compreende uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2.[009] Accordingly, in one aspect, the present invention provides a double-stranded ribonucleic acid (RNAi) agent for inhibiting the expression of programmed cell death-ligand 1 (PD-L1), wherein the RNAi comprises a sense strand and an antisense strand, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2.

[0010] Em certas modalidades, as cadeias sentido e as cadeias antissentido compreendem sequências selecionadas de qualquer uma das sequências na Tabela 3. Em outras modalidades, as cadeias sentido e as cadeias antissentido compreendem sequências selecionadas de qualquer uma das sequências na Tabela 5.[0010] In certain embodiments, the sense strands and the antisense strands comprise sequences selected from any of the sequences in Table 3. In other embodiments, the sense strands and the antisense strands comprise sequences selected from any of the sequences in Table 5.

[0011] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de ácido ribonucleico de cadeia dupla (RNAi) para inibir a expressão do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), em que o RNAi compreende uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido, a cadeia antissentido compreendendo uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissentido listadas na Tabela 3. Em certas modalidades, as cadeias sentido e as cadeias antissentido compreendem sequências selecionadas de qualquer uma das sequências na Tabela 5.[0011] In one aspect, the present invention provides a double-stranded ribonucleic acid (RNAi) agent for inhibiting the expression of programmed cell death-ligand 1 (PD-L1), wherein the RNAi comprises a sense strand and an antisense strand, the antisense strand comprising a region of complementarity comprising at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from any of the antisense sequences listed in Table 3. In certain embodiments, the sense strands and the antisense strands comprise sequences selected from any of the sequences in Table 5.

[0012] Em certas modalidades, o RNAi compreende pelo menos um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido e todos os nucleotídeos da cadeia antissentido compreendem uma modificação. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos da cadeia sentido e todos os nucleotídeos da cadeia antissentido compreendem uma modificação.[0012] In certain embodiments, the RNAi comprises at least one modified nucleotide. In some embodiments, substantially all of the nucleotides of the sense strand and all of the nucleotides of the antisense strand comprise a modification. In some embodiments, all of the nucleotides of the sense strand and all of the nucleotides of the antisense strand comprise a modification.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção provê agentes de ácido ribonucleico de cadeia dupla (RNAi) para inibir a expressão do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), em que os agentes de RNAi compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer um dos nucleotídeos 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 10941115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 31983219, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da porção complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, e em que o agente de RNAi compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.[0013] In one aspect, the present invention provides double-stranded ribonucleic acid (RNAi) agents for inhibiting the expression of programmed cell death ligand 1 (PD-L1), wherein the RNAi agents comprise a sense strand and an antisense strand, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from any of nucleotides 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 31983219, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the complementary portion of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and wherein the RNAi agent comprises at least one modified nucleotide.

[0014] Em um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de ácido ribonucleico de cadeia dupla (RNAi) para inibir a expressão do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), em que os agentes de RNAi compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido, a cadeia antissentido compreendendo uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissentido em qualquer um dos duplexes AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD- 67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD- 67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD- 67647, AD-67626, ou AD-67645.[0014] In another aspect, the present invention provides double-stranded ribonucleic acid (RNAi) agents for inhibiting the expression of programmed cell death-ligand 1 (PD-L1), wherein the RNAi agents comprise a sense strand and an antisense strand, the antisense strand comprising a region of complementarity comprising at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from any of the antisense sequences in any of the duplexes AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD-67647, AD-67626, or AD-67645.

[0015] Em uma modalidade, as cadeias sentido e antissentido compreendem sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em qualquer uma das sequências de nucleotídeos em qualquer um dos duplexes AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD- 67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD- 67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD- 67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD- 67647, AD-67626, ou AD-67645.[0015] In one embodiment, the sense and antisense strands comprise nucleotide sequences selected from the group consisting of any of the nucleotide sequences in any of the duplexes AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD- 67647, AD-67626, or AD-67645.

[0016] Em um aspecto, a presente invenção provê um agente de RNAi de cadeia dupla para inibir a expressão do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, em que substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido e substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antissentido são nucleotídeos modificados, e em que a cadeia sentido é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’.[0016] In one aspect, the present invention provides a double-stranded RNAi agent for inhibiting the expression of programmed cell death-1 ligand 1 (PD-L1), wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2, wherein substantially all of the nucleotides of the sense strand and substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides, and wherein the sense strand is conjugated to a linker attached to the 3' terminus.

[0017] Em um aspecto, a presente invenção provê agentes de RNAi de cadeia dupla para inibir a expressão de PD-L1, que compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 10931114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 31433164, 3198-3219,3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da posição correspondente complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 de modo que a cadeia antissentido é complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos na cadeia sentido.[0017] In one aspect, the present invention provides double-stranded RNAi agents for inhibiting the expression of PD-L1, comprising a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from nucleotides 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 31433164, 3198-3219,3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the corresponding complementary position of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 such that the antisense strand is complementary to the at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides in the sense strand.

[0018] Em certas modalidades, a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 3221-3243, 351-372, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 22202241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da posição correspondente complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 de modo que a cadeia antissentido é complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos na cadeia sentido.[0018] In certain embodiments, the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from nucleotides 3221-3243, 351-372, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 22202241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the corresponding complementary position of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2 such that the antisense strand is complementary to the at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides in the sense strand.

[0019] Em certas modalidades, a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 3221-3243, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da posição correspondente complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 de modo que a cadeia antissentido é complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos na cadeia sentido.[0019] In certain embodiments, the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from nucleotides 3221-3243, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the corresponding complementary position of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2 such that the antisense strand is complementary to the at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides in the sense strand.

[0020] Em um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de ácido ribonucleico de cadeia dupla (RNAi) para inibir a expressão do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), em que os agentes de RNAi de cadeia dupla compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer um dos nucleotídeos 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 26482680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e dita cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da porção complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, em que substancialmente todos os nucleotídeos da dita cadeia sentido e substancialmente todos os nucleotídeos da dita cadeia antissentido compreendem modificações nucleotídicas, e em que a cadeia sentido é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’.[0020] In another aspect, the present invention provides double-stranded ribonucleic acid (RNAi) agents for inhibiting the expression of programmed cell death ligand 1 (PD-L1), wherein the double-stranded RNAi agents comprise a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from any of nucleotides 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and said antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the complementary portion of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2, wherein substantially all of the nucleotides of said sense strand and substantially all of the nucleotides of said antisense strand comprise nucleotide modifications, and in which the sense strand is conjugated to a linker attached to the 3' terminus.

[0021] Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido ou substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antissentido são nucleotídeos modificados, ou substancialmente todos os nucleotídeos de ambas as cadeias são modificados; e em que a cadeia sentido é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’.[0021] In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the sense strand or substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides, or substantially all of the nucleotides of both strands are modified; and wherein the sense strand is conjugated to a linker attached to the 3' terminus.

[0022] Em um aspecto, a presente invenção provê agentes de RNAi de cadeia dupla para inibir a expressão de PD-L1, que compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 15181539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da posição correspondente complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 de modo que a cadeia antissentido é complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na cadeia sentido.[0022] In one aspect, the present invention provides double-stranded RNAi agents for inhibiting the expression of PD-L1, comprising a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides of nucleotides 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides of the corresponding complementary position of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 such that the antisense strand is complementary to the at least 15 contiguous nucleotides in the sense strand.

[0023] Em certas modalidades, os agentes compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 3221-3243, 351-372, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 11671188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da posição correspondente complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 de modo que a cadeia antissentido é complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na cadeia sentido.[0023] In certain embodiments, the agents comprise a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides of nucleotides 3221-3243, 351-372, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides from the corresponding complementary position of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 such that the antisense strand is complementary to the at least 15 contiguous nucleotides in the sense strand.

[0024] Em certas modalidades, os agentes compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 3222-3243 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 3221-3243, ou 3221-3242 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da posição correspondente complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 de modo que a cadeia antissentido é complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na cadeia sentido. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido são nucleotídeos modificados. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antissentido são nucleotídeos modificados. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos de ambas as cadeias são modificados. Em modalidades preferidas, a cadeia sentido é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’.[0024] In certain embodiments, the agents comprise a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides from nucleotides 3222-3243 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 3221-3243, or 3221-3242 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides from the corresponding complementary position of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2 such that the antisense strand is complementary to the at least 15 contiguous nucleotides in the sense strand. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the sense strand are modified nucleotides. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of both strands are modified. In preferred embodiments, the sense strand is conjugated to a linker attached to the 3' terminus.

[0025] Em certas modalidades, a cadeia sentido e a cadeia antissentido compreendem uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissentido listadas em qualquer uma das Tabelas 3 e 5. Por exemplo, em uma certa modalidade, a cadeia sentido e a cadeia antissentido compreendem uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissentido dos duplexes AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD- 67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD- 67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD- 67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD- 67628, AD-67647, AD-67626, ou AD-67645. Em certas modalidades, a cadeia sentido e a cadeia antissentido compreendem uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências antissentido dos duplexes anteriores.[0025] In certain embodiments, the sense strand and the antisense strand comprise a region of complementarity comprising at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from any of the antisense sequences listed in any of Tables 3 and 5. For example, in a certain embodiment, the sense strand and the antisense strand comprise a region of complementarity comprising at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from any of the antisense sequences of duplexes AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD- 67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD- 67628, AD-67647, AD-67626, or AD-67645. In certain embodiments, the sense strand and the antisense strand comprise a region of complementarity comprising at least 15 contiguous nucleotides from any of the antisense sequences of the preceding duplexes.

[0026] Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos da cadeia sentido e todos os nucleotídeos da cadeia antissentido compreendem uma modificação. Em uma modalidade, pelo menos um dos nucleotídeos modificados é selecionado do grupo que consiste em desoxinucleotídeo, um nucleotídeo de desoxitimina (dT) de terminal 3’, um nucleotídeo modificado com 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro, um nucleotídeo modificado com 2'-desoxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo conformacionalmente restrito, um nucleotídeo de etila limitado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado com 2’- amino, um nucleotídeo modificado com 2’-O-alila, um nucleotídeo modificado com 2’-C-alquila, um nucleotídeo modificado com 2’-hidroxila, um nucleotídeo modificado com 2’-metoxietila, um nucleotídeo modificado com 2’-O-alquila, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, uma base não natural compreendendo nucleotídeo, um nucleotídeo modificado com tetra-hidropirano, um nucleotídeo modificado com 1,5-anidro-hexitol, um nucleotídeo modificado com ciclo-hexenila, um nucleotídeo que compreende um grupo fosforotioato, um nucleotídeo que compreende um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo que compreende um 5’-fosfato e um nucleotídeo que compreende um imitador de 5’-fosfato. Em uma outra modalidade, os nucleotídeos modificados compreendem uma sequência curta de nucleotídeos de desoxitimina (dT) de terminal 3’.[0026] In some embodiments, all nucleotides of the sense strand and all nucleotides of the antisense strand comprise a modification. In one embodiment, at least one of the modified nucleotides is selected from the group consisting of a deoxynucleotide, a 3'-terminal deoxythymine (dT) nucleotide, a 2'-O-methyl-modified nucleotide, a 2'-fluoro-modified nucleotide, a 2'-deoxy-modified nucleotide, a locked nucleotide, an unlocked nucleotide, a conformationally restricted nucleotide, an ethyl-constrained nucleotide, an abasic nucleotide, a 2'-amino-modified nucleotide, a 2'-O-allyl-modified nucleotide, a 2'-C-alkyl-modified nucleotide, a 2'-hydroxyl-modified nucleotide, a 2'-methoxyethyl-modified nucleotide, a 2'-O-alkyl-modified nucleotide, a morpholino nucleotide, a phosphoramidate, an unnatural base comprising a nucleotide, a tetrahydropyran-modified nucleotide, a 1,5-anhydrohexitol-modified nucleotide, a cyclohexenyl-modified nucleotide, a nucleotide comprising a phosphorothioate group, a nucleotide comprising a methylphosphonate group, a nucleotide comprising a 5'-phosphate, and a nucleotide comprising a 5'-phosphate mimetic. In another embodiment, the modified nucleotides comprise a short 3'-terminal deoxythymine (dT) nucleotide sequence.

[0027] Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido são modificados. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antissentido são modificados. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos tanto da cadeia sentido quanto da cadeia antissentido são modificados.[0027] In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the sense strand are modified. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of both the sense and antisense strand are modified.

[0028] Em certas modalidades, o duplex compreende uma cadeia antissentido modificada provida na Tabela 5. Em certas modalidades, o duplex compreende uma cadeia sentido modificada provida na Tabela 5. Em certas modalidades, o duplex compreende um duplex modificado provido na Tabela 5.[0028] In certain embodiments, the duplex comprises a modified antisense strand provided in Table 5. In certain embodiments, the duplex comprises a modified sense strand provided in Table 5. In certain embodiments, the duplex comprises a modified duplex provided in Table 5.

[0029] Em certas modalidades, a região de complementaridade entre a cadeia antissentido e o alvo tem pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a região de complementaridade entre a cadeia antissentido e o alvo é de 19 a 21 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, a região de complementaridade é de 21 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades preferidas, cada cadeia não tem mais de 30 nucleotídeos de comprimento.[0029] In certain embodiments, the region of complementarity between the antisense strand and the target is at least 17 nucleotides in length. For example, the region of complementarity between the antisense strand and the target is 19 to 21 nucleotides in length, e.g., the region of complementarity is 21 nucleotides in length. In preferred embodiments, each strand is no more than 30 nucleotides in length.

[0030] Em algumas modalidades, pelo menos uma cadeia compreende uma projeção 3’ de pelo menos um nucleotídeo, por exemplo, pelo menos uma cadeia compreende uma projeção 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.[0030] In some embodiments, at least one strand comprises a 3' overhang of at least one nucleotide, e.g., at least one strand comprises a 3' overhang of at least 2 nucleotides.

[0031] Em muitas modalidades, o agente de RNAi compreende adicionalmente um ligante. O ligante pode ser conjugado à extremidade 3’ da cadeia sentido do agente de RNAi. O ligante pode ser um derivado de N- acetilgalactosamina (GalNAc) incluindo, mas não se limitando a [0031] In many embodiments, the RNAi agent further comprises a linker. The linker may be conjugated to the 3' end of the sense strand of the RNAi agent. The linker may be a derivative of N-acetylgalactosamine (GalNAc) including, but not limited to

[0032] Um agente de RNAi exemplificativo conjugado ao ligante conforme mostrado no seguinte diagrama esquemático: e, em que X é O ou S. Em uma modalidade, o X é O.[0032] An exemplary RNAi agent conjugated to the linker as shown in the following schematic diagram: and, where X is either O or S. In one embodiment, X is O.

[0033] Em certas modalidades, o ligante pode ser um radical colesterol.[0033] In certain embodiments, the ligand may be a cholesterol moiety.

[0034] Em certas modalidades, a região de complementaridade compreende uma das sequências antissentido de qualquer uma da Tabela 3 e da Tabela 5. Em uma outra modalidade, a região de complementaridade consiste em uma das sequências antissentido de qualquer uma da Tabela 3 e da Tabela 5.[0034] In certain embodiments, the region of complementarity comprises one of the antisense sequences from any of Table 3 and Table 5. In another embodiment, the region of complementarity consists of one of the antisense sequences from any of Table 3 and Table 5.

[0035] Em um outro aspecto, a invenção um agente de RNAi de cadeia dupla capaz de inibir a expressão de PD-L1, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido complementar a uma cadeia antissentido, em que a cadeia antissentido compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que cada cadeia tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente de RNAi de cadeia dupla é representado pela fórmula (III): em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; p, p’, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; cada Na e Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; cada np, np’, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos; modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a cadeia sentido é conjugada a pelo menos um ligante.[0035] In another aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent capable of inhibiting the expression of PD-L1, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand complementary to an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to part of an mRNA encoding PD-L1, wherein each strand is about 14 to about 30 nucleotides in length, wherein the double-stranded RNAi agent is represented by formula (III): wherein: i, j, k, and l are each independently 0 or 1; p, p', q, and q' are each independently 0 to 6; each Na and Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof; each np, np', nq, and nq', each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', and Z'Z'Z' each independently represent a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides; modifications at Nb differ from the modification at Y and modifications at Nb' differ from the modification at Y'; and in which the sense strand is conjugated to at least one linker.

[0036] Em certas modalidades, i é 0; j é 0; i é 1; j é 1; tanto i quanto j são 0; ou tanto i quanto j são 1. Em uma outra modalidade, k é 0; l é 0; k é 1; l é 1; tanto k quanto l são 0; ou tanto k quanto l são 1. Em uma outra modalidade, XXX é complementar a X’X’X’, YYY é complementar a Y’Y’Y’, e ZZZ é complementar a Z’Z’Z’. Em uma outra modalidade, o motivo YYY ocorre no ou próximo ao sítio de clivagem da cadeia sentido. Em uma outra modalidade, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12 e 13 da cadeia antissentido a partir da extremidade 5'. Em uma modalidade, o Y’ é 2’-O- metila.[0036] In certain embodiments, i is 0; j is 0; i is 1; j is 1; both i and j are 0; or both i and j are 1. In another embodiment, k is 0; l is 0; k is 1; l is 1; both k and l are 0; or both k and l are 1. In another embodiment, XXX is complementary to X’X’X’, YYY is complementary to Y’Y’Y’, and ZZZ is complementary to Z’Z’Z’. In another embodiment, the YYY motif occurs at or near the cleavage site of the sense strand. In another embodiment, the Y’Y’Y’ motif occurs at positions 11, 12, and 13 of the antisense strand from the 5’ end. In an embodiment, Y’ is 2’-O-methyl.

[0037] Por exemplo, a fórmula (III) pode ser representada pela fórmula (IIIa): [0037] For example, formula (III) can be represented by formula (IIIa):

[0038] Em uma outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIb): em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 1 a 5 nucleotídeos modificados.[0038] In another embodiment, formula (III) is represented by formula (IIIb): wherein each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 1 to 5 modified nucleotides.

[0039] Alternativamente, a fórmula (III) pode ser representada pela fórmula (IIIc): em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 1 a 5 nucleotídeos modificados.[0039] Alternatively, formula (III) may be represented by formula (IIIc): wherein each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 1 to 5 modified nucleotides.

[0040] Adicionalmente, a fórmula (III) pode ser representada pela fórmula (IIId): em que cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 1 a 5 nucleotídeos modificados e cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 10 nucleotídeos modificados.[0040] Additionally, formula (III) can be represented by formula (IIId): wherein each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 1 to 5 modified nucleotides and each Na and Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 10 modified nucleotides.

[0041] Em uma certa modalidade, a região de cadeia dupla tem 15 a 30 pares de nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a região de cadeia dupla pode ter 17 a 23 pares de nucleotídeos de comprimento. A região de cadeia dupla pode ter 17 a 25 pares de nucleotídeos de comprimento. A região de cadeia dupla pode ter 23 a 27 pares de nucleotídeos de comprimento. A região de cadeia dupla pode ter 19 a 21 pares de nucleotídeos de comprimento. A região de cadeia dupla pode ter 21 a 23 pares de nucleotídeos de comprimento.[0041] In a certain embodiment, the double-stranded region is 15 to 30 nucleotide pairs in length. For example, the double-stranded region may be 17 to 23 nucleotide pairs in length. The double-stranded region may be 17 to 25 nucleotide pairs in length. The double-stranded region may be 23 to 27 nucleotide pairs in length. The double-stranded region may be 19 to 21 nucleotide pairs in length. The double-stranded region may be 21 to 23 nucleotide pairs in length.

[0042] Em certas modalidades, cada cadeia tem 15 a 30 nucleotídeos. Em outras modalidades, cada cadeia tem 19 a 30 nucleotídeos.[0042] In certain embodiments, each chain has 15 to 30 nucleotides. In other embodiments, each chain has 19 to 30 nucleotides.

[0043] As modificações nos nucleotídeos podem ser selecionadas do grupo que inclui, mas não se limita a, LNA, HNA, CeNA, 2‘-metoxietila, 2‘- O-alquila, 2‘-O-alila, 2‘-C- alila, 2‘-fluoro, 2‘-desoxi, 2‘-hidroxila, e combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações 2‘-O-metila ou 2‘-fluoro.[0043] The nucleotide modifications may be selected from the group including, but not limited to, LNA, HNA, CeNA, 2‘-methoxyethyl, 2‘-O-alkyl, 2‘-O-allyl, 2‘-C-allyl, 2‘-fluoro, 2‘-deoxy, 2‘-hydroxyl, and combinations thereof. In another embodiment, the nucleotide modifications are 2‘-O-methyl or 2‘-fluoro modifications.

[0044] Em certas modalidades, o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligado através de um ligador monovalente ou um ligador ramificado bivalente ou trivalente. Em uma modalidade, o ligante é [0044] In certain embodiments, the linker is one or more GalNAc derivatives linked through a monovalent linker or a bivalent or trivalent branched linker. In one embodiment, the linker is

[0045] O ligante pode ser ligado à extremidade 3‘ da cadeia sentido.[0045] The linker may be attached to the 3' end of the sense strand.

[0046] Uma estrutura exemplificativa de um agente de RNAi conjugado ao ligante é mostrada no seguinte diagrama esquemático [0046] An exemplary structure of a linker-conjugated RNAi agent is shown in the following schematic diagram

[0047] Em certas modalidades, o ligante pode ser um radical colesterol.[0047] In certain embodiments, the ligand may be a cholesterol moiety.

[0048] Em certas modalidades, o agente de RNAi compreende adicionalmente pelo menos uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato. Por exemplo, a ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato pode estar no terminal 3’ de uma cadeia, ou seja, a cadeia sentido ou a cadeia antissentido; ou nas extremidades de ambas as cadeias, a cadeia sentido ou a cadeia antissentido.[0048] In certain embodiments, the RNAi agent further comprises at least one phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage. For example, the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage may be at the 3' terminus of one strand, i.e., the sense strand or the antisense strand; or at the ends of both strands, the sense strand or the antisense strand.

[0049] Em certas modalidades, a ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato está no terminal 5’ de uma cadeia, ou seja, a cadeia sentido ou a cadeia antissentido; ou nas extremidades de ambas as cadeias, a cadeia sentido ou a cadeia antissentido.[0049] In certain embodiments, the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage is at the 5' terminus of one chain, i.e., the sense chain or the antisense chain; or at the ends of both chains, the sense chain or the antisense chain.

[0050] Em certas modalidades, a ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato está tanto no terminal 5’ quanto no 3’ de uma cadeia, ou seja, a cadeia sentido ou a cadeia antissentido; ou nas extremidades de ambas as cadeias, a cadeia sentido ou a cadeia antissentido.[0050] In certain embodiments, the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage is at either the 5' or 3' terminus of a strand, i.e., the sense strand or the antisense strand; or at the ends of both strands, the sense strand or the antisense strand.

[0051] Em certas modalidades, o par de bases na posição 1 da extremidade 5‘ da cadeia antissentido do duplex é um par de bases AU.[0051] In certain embodiments, the base pair at position 1 of the 5′ end of the antisense strand of the duplex is an AU base pair.

[0052] Em certas modalidades, os nucleotídeos Y contêm uma modificação 2‘-fluoro. Em uma outra modalidade, os nucleotídeos Y‘ contêm uma modificação 2‘-O-metila. Em uma outra modalidade, p‘>0. Em algumas modalidades, p‘=2. Em algumas modalidades, q’=0, p=0, q=0, e os nucleotídeos de projeção p’ são complementares ao mRNA alvo. Em algumas modalidades, q’=0, p=0, q=0, e os nucleotídeos de projeção p’ são não complementares ao mRNA alvo.[0052] In certain embodiments, the Y nucleotides contain a 2′-fluoro modification. In another embodiment, the Y′ nucleotides contain a 2′-O-methyl modification. In another embodiment, p′>0. In some embodiments, p′=2. In some embodiments, q′=0, p=0, q=0, and the p′ overhang nucleotides are complementary to the target mRNA. In some embodiments, q′=0, p=0, q=0, and the p′ overhang nucleotides are non-complementary to the target mRNA.

[0053] Em certas modalidades, a cadeia sentido tem um total de 21 nucleotídeos e a cadeia antissentido tem um total de 23 nucleotídeos.[0053] In certain embodiments, the sense strand has a total of 21 nucleotides and the antisense strand has a total of 23 nucleotides.

[0054] Em certas modalidades, pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato. Em outras modalidades, todos os np‘ são ligados a nucleotídeos vizinhos por meio de ligações de fosforotioato.[0054] In certain embodiments, at least one np' is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate bond. In other embodiments, all np' are linked to neighboring nucleotides via phosphorothioate bonds.

[0055] Em certas modalidades, o agente de RNAi é selecionado do grupo de agentes de RNAi listado em qualquer uma das Tabelas 3 e 5. Em certas modalidades, todos os nucleotídeos da cadeia sentido e todos os nucleotídeos da cadeia antissentido compreendem uma modificação.[0055] In certain embodiments, the RNAi agent is selected from the group of RNAi agents listed in either of Tables 3 and 5. In certain embodiments, all of the nucleotides of the sense strand and all of the nucleotides of the antisense strand comprise a modification.

[0056] Em um aspecto, a invenção um agente de RNAi de cadeia dupla capaz de inibir a expressão de PD-L1 em uma célula, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido complementar a uma cadeia antissentido, em que a cadeia antissentido compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que cada cadeia tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente de RNAi de cadeia dupla é representado pela fórmula (III): (III) em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; p, p’, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; cada Na e Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; cada np, np’, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2‘-O-metila ou 2‘-fluoro; modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a cadeia sentido é conjugada a pelo menos um ligante.[0056] In one aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent capable of inhibiting the expression of PD-L1 in a cell, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand complementary to an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to part of an mRNA encoding PD-L1, wherein each strand is about 14 to about 30 nucleotides in length, wherein the double-stranded RNAi agent is represented by formula (III): (III) wherein: i, j, k, and l are each independently 0 or 1; p, p', q, and q' are each independently 0 to 6; each Na and Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof; each np, np', nq, and nq', each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', and Z'Z'Z' each independently represent a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, and wherein the modifications are 2'-O-methyl or 2'-fluoro modifications; modifications on Nb differ from the modification on Y, and modifications on Nb' differ from the modification on Y'; and wherein the sense strand is conjugated to at least one linker.

[0057] Em um aspecto, a invenção um agente de RNAi de cadeia dupla capaz de inibir a expressão de PD-L1 em uma célula, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido complementar a uma cadeia antissentido, em que a cadeia antissentido compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que cada cadeia tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente de RNAi de cadeia dupla é representado pela fórmula (III): em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente, 0 ou 1; cada np, nq, e nq‘, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; p, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ ecada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2‘-O-metila ou 2‘-fluoro; modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a cadeia sentido é conjugada a pelo menos um ligante.[0057] In one aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent capable of inhibiting the expression of PD-L1 in a cell, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand complementary to an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to part of an mRNA encoding PD-L1, wherein each strand is about 14 to about 30 nucleotides in length, wherein the double-stranded RNAi agent is represented by formula (III): wherein: i, j, k, and l are each independently 0 or 1; each np, nq, and nq', each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; p, q, and q' are each independently 0 to 6; np'>0 and at least one np' is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate bond; each Na and Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', and Z'Z'Z' each independently represent a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, and wherein the modifications are either 2'-O-methyl or 2'-fluoro modifications; modifications on Nb differ from the modification on Y, and modifications on Nb' differ from the modification on Y'; and wherein the sense strand is conjugated to at least one linker.

[0058] Em um aspecto, a invenção um agente de RNAi de cadeia dupla capaz de inibir a expressão de PD-L1 em uma célula, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido complementar a uma cadeia antissentido, em que a cadeia antissentido compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que cada cadeia tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente de RNAi de cadeia dupla é representado pela fórmula (III): em que i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; cada np, nq, e nq‘, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; p, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2‘-O- metila ou 2‘-fluoro; modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e em que a cadeia sentido é conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligado através de um ligador monovalente ou um ligador ramificado bivalente ou trivalente.[0058] In one aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent capable of inhibiting the expression of PD-L1 in a cell, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand complementary to an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to part of an mRNA encoding PD-L1, wherein each strand is about 14 to about 30 nucleotides in length, wherein the double-stranded RNAi agent is represented by formula (III): wherein i, j, k, and l are each independently 0 or 1; each np, nq, and nq', each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; p, q, and q' are each independently 0 to 6; np'>0 and at least one np' is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate bond; each Na and Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', and Z'Z'Z' each independently represent a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, and wherein the modifications are 2'-O-methyl or 2'-fluoro modifications; modifications at Nb differ from the modification at Y, and modifications at Nb' differ from the modification at Y'; and wherein the sense strand is conjugated to at least one linker, wherein the linker is one or more GalNAc derivatives linked through a monovalent linker or a bivalent or trivalent branched linker.

[0059] Em um aspecto, a invenção um agente de RNAi de cadeia dupla capaz de inibir a expressão de PD-L1 em uma célula, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido complementar a uma cadeia antissentido, em que a cadeia antissentido compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que cada cadeia tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente de RNAi de cadeia dupla é representado pela fórmula (III): sentido: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissentido: 3' np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’- nq’ 5' (III) em que i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; cada np, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; p, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2‘-O- metila ou 2‘-fluoro; modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; em que a cadeia sentido compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato; e em que a cadeia sentido é conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligado através de um ligador monovalente ou um ligador ramificado bivalente ou trivalente.[0059] In one aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent capable of inhibiting the expression of PD-L1 in a cell, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand complementary to an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to part of an mRNA encoding PD-L1, wherein each strand is about 14 to about 30 nucleotides in length, wherein the double-stranded RNAi agent is represented by formula (III): sense: 5' np -Na -(X X X)i -Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antisense: 3' np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’- nq’ 5' (III) wherein i, j, k, and l are each independently 0 or 1; each np, nq, and nq’, each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; p, q, and q’ are each independently 0 to 6; np’ >0 and at least one np’ is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate bond; each Na and Na’ independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb and Nb’ independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof; XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, and Z’Z’Z’ each independently represent a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, and wherein the modifications are 2‘-O-methyl or 2‘-fluoro modifications; modifications at Nb differ from the modification at Y, and modifications at Nb’ differ from the modification at Y’; wherein the sense strand comprises at least one phosphorothioate linkage; and wherein the sense strand is conjugated to at least one linker, wherein the linker is one or more GalNAc derivatives linked through a monovalent linker or a bivalent or trivalent branched linker.

[0060] Em um aspecto, a invenção provê um agente de RNAi de cadeia dupla capaz de inibir a expressão de PD-L1 em uma célula, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido complementar a uma cadeia antissentido, em que a cadeia antissentido compreende uma região complementar a parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que cada cadeia tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, em que o agente de RNAi de cadeia dupla é representado pela fórmula (III): sentido: 5' np-Na-Y Y Y - Na- nq 3' antissentido: 3' np’-Na’- Y’Y’Y’- Na’- nq’ 5' (IIIa) em que cada np, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; p, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; YYY e Y’Y’Y’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2‘-O-metila ou 2‘-fluoro; em que a cadeia sentido compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato; e em que a cadeia sentido é conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligado através de um ligador monovalente ou um ligador ramificado bivalente ou trivalente.[0060] In one aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent capable of inhibiting the expression of PD-L1 in a cell, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand complementary to an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to part of an mRNA encoding PD-L1, wherein each strand is about 14 to about 30 nucleotides in length, wherein the double-stranded RNAi agent is represented by the formula (III): sense: 5' np-Na-Y Y Y - Na- nq 3' antisense: 3' np’-Na’- Y’Y’Y’- Na’- nq’ 5' (IIIa) wherein each np, nq, and nq’, each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; p, q, and q’ are each independently 0 to 6; np‘ >0 and at least one np‘ is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate bond; each Na and Na’ independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 nucleotides that are modified or unmodified, or combinations thereof, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; YYY and Y’Y’Y’ each independently represents a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, and wherein the modifications are 2‘-O-methyl or 2‘-fluoro modifications; wherein the sense strand comprises at least one phosphorothioate bond; and wherein the sense strand is conjugated to at least one linker, wherein the linker is one or more GalNAc derivatives linked through a monovalent linker or a bivalent or trivalent branched linker.

[0061] Em um aspecto, a invenção provê um agente de RNAi de cadeia dupla para inibir a expressão de PD-L1, em que o agente de RNAi de cadeia dupla compreende uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, em que substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido compreendem uma modificação selecionada de uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a cadeia sentido compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antisssentido compreendem uma modificação selecionada de uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a cadeia antisssentido compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 5’ e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 3, e em que a cadeia sentido é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador monovalente ou um ligador ramificado bivalente ou trivalente no terminal 3’.[0061] In one aspect, the invention provides a double-stranded RNAi agent for inhibiting the expression of PD-L1, wherein the double-stranded RNAi agent comprises a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2, wherein substantially all of the nucleotides of the sense strand comprise a modification selected from a 2'-O-methyl modification and a 2'-fluoro modification, wherein the sense strand comprises two phosphorothioate internucleotide bonds at the 5' terminus, wherein substantially all of the nucleotides of the sense strand comprise a modification selected from a 2'-O-methyl modification and a 2'-fluoro modification. antisense strand comprises a modification selected from a 2'-O-methyl modification and a 2'-fluoro modification, wherein the antisense strand comprises two phosphorothioate internucleotide bonds at the 5' terminus and two phosphorothioate internucleotide bonds at the 3' terminus, and wherein the sense strand is conjugated to one or more GalNAc derivatives linked via a monovalent linker or a bivalent or trivalent branched linker at the 3' terminus.

[0062] Em um outro aspecto, a invenção provê agentes de ácido ribonucleico (RNAi) de cadeia dupla para inibir a expressão de PD-L1, em que os agentes de RNAi de cadeia dupla compreendem uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido formando uma região de cadeia dupla, em que a cadeia sentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 3221-3243, 351372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 10941115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 31983219, 3221-3242, ou 3222-3243 da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 e a cadeia antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem por não mais que 3 nucleotídeos da porção complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, em que substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido compreendem uma modificação nucleotídica selecionada do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-fluoro, em que a cadeia sentido compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antisssentido compreendem uma modificação nucleotídica selecionada do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’- fluoro, em que a cadeia antisssentido compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 5’ e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 3, e em que a cadeia sentido é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente no terminal 3’.[0062] In another aspect, the invention provides double-stranded ribonucleic acid (RNAi) agents for inhibiting the expression of PD-L1, wherein the double-stranded RNAi agents comprise a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from nucleotides 3221-3243, 351372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 10941115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 31983219, 3221-3242, or 3222-3243 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that differ by no more than 3 nucleotides from the complementary portion of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, wherein substantially all of the nucleotides of the sense strand comprise a nucleotide modification selected from the group consisting of a 2'-O-methyl modification and a 2'-fluoro modification, wherein the sense strand comprises two bonds phosphorothioate internucleotide bonds at the 5' terminus, wherein substantially all of the nucleotides of the antisense strand comprise a nucleotide modification selected from the group consisting of a 2'-O-methyl modification and a 2'-fluoro modification, wherein the antisense strand comprises two phosphorothioate internucleotide bonds at the 5' terminus and two phosphorothioate internucleotide bonds at the 3' terminus, and wherein the sense strand is conjugated to one or more GalNAc derivatives linked through a bivalent or trivalent branched linker at the 3' terminus.

[0063] Em certas modalidades, todos os nucleotídeos da cadeia sentido e todos os nucleotídeos da cadeia antissentido são nucleotídeos modificados. Em certas modalidades, cada cadeia tem 19 a 30 nucleotídeos.[0063] In certain embodiments, all of the nucleotides of the sense strand and all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides. In certain embodiments, each strand has 19 to 30 nucleotides.

[0064] Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia sentido são modificados. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da cadeia antissentido são modificados. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos tanto da cadeia sentido quanto da cadeia antissentido são modificados.[0064] In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the sense strand are modified. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified. In certain embodiments, substantially all of the nucleotides of both the sense and antisense strand are modified.

[0065] Em um aspecto, a invenção provê uma célula contendo o agente de RNAi conforme descrito aqui.[0065] In one aspect, the invention provides a cell containing the RNAi agent as described herein.

[0066] Em um aspecto, a invenção provê um vetor que codifica pelo menos uma cadeia de um agente de RNAi, em que o agente de RNAi compreende uma região de complementaridade a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica PD-L1, em que o RNAi tem 30 pares de bases ou menos de comprimento, e em que o agente de RNAi alveja o mRNA para clivagem. Em certas modalidades, a região de complementaridade tem pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, a região de complementaridade tem 19 a 23 nucleotídeos de comprimento.[0066] In one aspect, the invention provides a vector encoding at least one strand of an RNAi agent, wherein the RNAi agent comprises a region of complementarity to at least a portion of an mRNA encoding PD-L1, wherein the RNAi is 30 base pairs or less in length, and wherein the RNAi agent targets the mRNA for cleavage. In certain embodiments, the region of complementarity is at least 15 nucleotides in length. In certain embodiments, the region of complementarity is 19 to 23 nucleotides in length.

[0067] Em um aspecto, a invenção provê uma célula compreendendo um vetor conforme descrito aqui.[0067] In one aspect, the invention provides a cell comprising a vector as described herein.

[0068] Em um aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene PD-L1 compreendendo o agente de RNAi da invenção. Em uma modalidade, o agente de RNAii é administrado em uma solução não tamponada. Em certas modalidades, a solução não tamponada é solução salina ou água. Em outras modalidades, o agente de RNAii é administrado em uma solução tamponada. Em tais modalidades, a solução tamponada pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a solução tamponada pode ser solução salina tamponada com fosfato (PBS).[0068] In one aspect, the invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting the expression of a PD-L1 gene comprising the RNAi agent of the invention. In one embodiment, the RNAii agent is administered in a non-buffered solution. In certain embodiments, the non-buffered solution is saline or water. In other embodiments, the RNAii agent is administered in a buffered solution. In such embodiments, the buffered solution may comprise acetate, citrate, prolamine, carbonate, or phosphate, or any combination thereof. For example, the buffered solution may be phosphate-buffered saline (PBS).

[0069] Em um aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o agente de RNAi de cadeia dupla da invenção e uma formulação lipídica. Em certas modalidades, a formulação lipídica compreende uma LNP. Em certas modalidades, a formulação lipídica compreende um MC3.[0069] In one aspect, the invention provides a pharmaceutical composition comprising the double-stranded RNAi agent of the invention and a lipid formulation. In certain embodiments, the lipid formulation comprises an LNP. In certain embodiments, the lipid formulation comprises an MC3.

[0070] Em um aspecto, a invenção provê um método para inibir a expressão de PD-L1 em uma célula, o método compreendendo (a) colocar a célula em contato com o agente de RNAi de cadeia dupla da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) por um tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA de um gene PD-L1, inibindo assim a expressão do gene PD-L1 na célula. Em certas modalidades, a célula está dentro de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, por exemplo, uma mulher ou um homem. Em modalidades preferidas, a expressão de PD-L1 é inibida em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95%; ou abaixo do limite de detecção do método de ensaio usado.[0070] In one aspect, the invention provides a method for inhibiting PD-L1 expression in a cell, the method comprising (a) contacting the cell with the double-stranded RNAi agent of the invention or a pharmaceutical composition of the invention; and (b) maintaining the cell produced in step (a) for a time sufficient to achieve degradation of the mRNA transcript of a PD-L1 gene, thereby inhibiting PD-L1 gene expression in the cell. In certain embodiments, the cell is within a subject, e.g., a human subject, e.g., a female or a male. In preferred embodiments, PD-L1 expression is inhibited by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95%; or below the detection limit of the assay method used.

[0071] Em um aspecto, a invenção provê um método para tratar um indivíduo que tem uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da redução na expressão de PD-L1, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção, tratando assim o indivíduo.[0071] In one aspect, the invention provides a method for treating a subject having a disease or disorder that would benefit from reduction in PD-L1 expression, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the RNAi agent of the invention or a pharmaceutical composition of the invention, thereby treating the subject.

[0072] Em um aspecto, a invenção provê um método para prevenir pelo menos um sintoma em um indivíduo que tem uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da redução na expressão de PD-L1, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz do agente de RNAi da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção, prevenindo assim pelo menos um sintoma no indivíduo que tem um distúrbio que se beneficiaria da redução na expressão de PD-L1.[0072] In one aspect, the invention provides a method for preventing at least one symptom in a subject having a disease or disorder that would benefit from reduction in PD-L1 expression, the method comprising administering to the subject a prophylactically effective amount of the RNAi agent of the invention or a pharmaceutical composition of the invention, thereby preventing at least one symptom in the subject having a disorder that would benefit from reduction in PD-L1 expression.

[0073] Em certas modalidades, a administração do RNAi ao indivíduo causa uma diminuição na via de sinalização do PD-L1. Em certas modalidades, a administração do RNAi causa uma diminuição no nível de PD-L1 no indivíduo, por exemplo, níveis séricos de PD-L1 no indivíduo.[0073] In certain embodiments, administering the RNAi to the subject causes a decrease in the PD-L1 signaling pathway. In certain embodiments, administering the RNAi causes a decrease in the level of PD-L1 in the subject, e.g., serum levels of PD-L1 in the subject.

[0074] Em certas modalidades, a doença associada a PD-L1 é uma doença infecciosa, tal como doença infecciosa intracelular crônica, por exemplo, uma doença viral, por exemplo, infecção por hepatite, ou uma infecção bacteriana, por exemplo, infecção por tuberculose.[0074] In certain embodiments, the PD-L1 associated disease is an infectious disease, such as a chronic intracellular infectious disease, e.g., a viral disease, e.g., hepatitis infection, or a bacterial infection, e.g., tuberculosis infection.

[0075] Em certas modalidades, a doença associada a PD-L1 é câncer, por exemplo, um câncer hepático, por exemplo, carcinoma hepatocelular.[0075] In certain embodiments, the PD-L1 associated disease is cancer, e.g., a liver cancer, e.g., hepatocellular carcinoma.

[0076] Em certas modalidades, a invenção compreende adicionalmente a administração de um agente antiviral a um indivíduo com uma doença associada a PD-L1. Em certas modalidades, o agente antiviral é um análogo de nucleotídeo ou nucleosídeo. Em certas modalidades, o agente antiviral é para tratamento de uma infecção pelo vírus da hepatite, por exemplo, uma infecção por VHB, uma infecção por VHD. Em certas modalidades, o agente antiviral não é um agente imunoestimulante.[0076] In certain embodiments, the invention further comprises administering an antiviral agent to a subject with a PD-L1 associated disease. In certain embodiments, the antiviral agent is a nucleotide or nucleoside analog. In certain embodiments, the antiviral agent is for treating a hepatitis virus infection, e.g., an HBV infection, an HDV infection. In certain embodiments, the antiviral agent is not an immunostimulatory agent.

[0077] Em certas modalidades, a invenção compreende adicionalmente a administração de um agente quimioterápico a um indivíduo com uma doença associada a PD-L1.[0077] In certain embodiments, the invention further comprises administering a chemotherapeutic agent to a subject with a PD-L1 associated disease.

[0078] Em certas modalidades em que a doença associada a PD-L1 é câncer, o indivíduo é adicionalmente tratado para câncer. Em certas modalidades, o tratamento para câncer inclui cirurgia. Em certas modalidades, o tratamento para câncer inclui radiação. Em certas modalidades, o tratamento para câncer inclui administração de um agente quimioterápico.[0078] In certain embodiments where the PD-L1 associated disease is cancer, the individual is additionally treated for cancer. In certain embodiments, the treatment for cancer includes surgery. In certain embodiments, the treatment for cancer includes radiation. In certain embodiments, the treatment for cancer includes administration of a chemotherapeutic agent.

[0079] Em várias modalidades, o agente de RNAi é administrado em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado em uma dose de cerca de 10 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Em certas modalidades, o agente de RNAi é administrado em uma dose selecionada de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, e 30 mg/kg. Em certas modalidades, o agente de RNAi é administrado cerca de uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, ou uma vez por trimestre (ou seja, uma vez a cada três meses) em uma dose de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5,0 mg/kg.[0079] In various embodiments, the RNAi agent is administered at a dose of about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg or about 0.5 mg/kg to about 50 mg/kg. In some embodiments, the RNAi agent is administered at a dose of about 10 mg/kg to about 30 mg/kg. In certain embodiments, the RNAi agent is administered at a dose selected from about 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, and 30 mg/kg. In certain embodiments, the RNAi agent is administered about once a week, once a month, once every two months, or once a quarter (i.e., once every three months) at a dose of about 0.1 mg/kg to about 5.0 mg/kg.

[0080] Em certas modalidades, o agente de RNAi é administrado ao indivíduo uma vez por semana. Em certas modalidades, o agente de RNAii é administrado ao indivíduo uma vez por mês. Em certas modalidades, o agente de RNAii é administrado uma vez por trimestre (ou seja, uma vez a cada três meses).[0080] In certain embodiments, the RNAi agent is administered to the subject once per week. In certain embodiments, the RNAii agent is administered to the subject once per month. In certain embodiments, the RNAii agent is administered once per quarter (i.e., once every three months).

[0081] Em certa modalidade, o agente de RNAi é administrado ao indivíduo por via subcutânea.[0081] In one embodiment, the RNAi agent is administered to the subject subcutaneously.

[0082] Em várias modalidades, os métodos da invenção compreendem adicionalmente medir os níveis de PD-L1 no indivíduo. Em certas modalidades, uma diminuição nos níveis de expressão ou atividade da via de sinalização de PD-L1 indica que a doença associada a PD-L1 está sendo tratada.[0082] In various embodiments, the methods of the invention further comprise measuring PD-L1 levels in the subject. In certain embodiments, a decrease in PD-L1 expression levels or signaling pathway activity indicates that the PD-L1-associated disease is being treated.

[0083] Em várias modalidades, é medido um marcador substituto da expressão de PD-L1. Por exemplo, no tratamento de doenças infecciosas, a presença do agente patogênico é detectada, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico do agente patogênico, por exemplo, HBsAg, HBeAg, HB cccDNA. Em certas modalidades, um indicador de uma resposta imune contra o agente patogênico é detectado, por exemplo, anticorpo anti-HBs. Em certas modalidades, é detectada uma alteração, preferivelmente uma alteração clinicamente relevante no marcador substituto indicando um tratamento eficaz da infecção. No tratamento do câncer, uma demonstração de estabilização ou redução da carga tumoral usando os critérios RECIST pode ser usada como um marcador substituto para uma redução da expressão ou atividade de PD- L1.[0083] In various embodiments, a surrogate marker of PD-L1 expression is measured. For example, in the treatment of infectious diseases, the presence of the pathogen is detected, e.g., a protein or nucleic acid from the pathogen, e.g., HBsAg, HBeAg, HB cccDNA. In certain embodiments, an indicator of an immune response against the pathogen is detected, e.g., anti-HBs antibody. In certain embodiments, a change, preferably a clinically relevant change, in the surrogate marker indicating effective treatment of the infection is detected. In the treatment of cancer, a demonstration of stabilization or reduction of tumor burden using RECIST criteria can be used as a surrogate marker for a reduction in PD-L1 expression or activity.

Breve Descrição dos DesenhosBrief Description of the Drawings

[0084] A Figura 1 é um diagrama esquemático que mostra uma sinalização de PD-L1 entre uma célula apresentadora de antígeno e uma célula T.[0084] Figure 1 is a schematic diagram showing PD-L1 signaling between an antigen-presenting cell and a T cell.

Descrição Detalhada da InvençãoDetailed Description of the Invention

[0085] A presente invenção provê composições de iRNA que efetuam a clivagem mediada pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene de ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1). O gene pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um humano. O uso desses iRNAs permite a degradação direcionada de mRNAs do gene correspondente (gene PD-L1) em mamíferos.[0085] The present invention provides iRNA compositions that effect RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated cleavage of RNA transcripts of a programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) gene. The gene may be within a cell, e.g., a cell within an individual, such as a human. Use of these iRNAs allows for targeted degradation of mRNAs of the corresponding gene (PD-L1 gene) in mammals.

[0086] Os iRNAs da invenção foram concebidos para alvejar o gene PD-L1 humano, incluindo porções do gene que são conservadas nos ortólogos de PD-L1 de outras espécies de mamíferos. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que uma combinação ou subcombinação das propriedades precedentes e os sítios alvo específicos ou as modificações específicas nesses agentes de iRNA conferem aos iRNAs da invenção maior eficácia, estabilidade, potência, durabilidade e segurança.[0086] The iRNAs of the invention are designed to target the human PD-L1 gene, including portions of the gene that are conserved in PD-L1 orthologs from other mammalian species. Without wishing to be limited by theory, it is believed that a combination or subcombination of the foregoing properties and the specific target sites or the specific modifications in these iRNA agents confers on the iRNAs of the invention increased efficacy, stability, potency, durability, and safety.

[0087] Por conseguinte, a presente invenção também provê métodos para o tratamento de um indivíduo com um distúrbio que se beneficiaria da inibição ou redução da expressão de um gene PD-L1, por exemplo, uma doença associada a PD-L1, como infecção, por exemplo, uma infecção viral, por exemplo, uma infecção por vírus da hepatite, ou câncer, tais como câncer de fígado, por exemplo, carcinoma hepatocelular, usando composições de iRNA que efetuam clivagem mediada pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene PD-L1.[0087] Accordingly, the present invention also provides methods for treating a subject with a disorder that would benefit from inhibiting or reducing the expression of a PD-L1 gene, e.g., a PD-L1-associated disease, such as an infection, e.g., a viral infection, e.g., a hepatitis virus infection, or cancer, such as liver cancer, e.g., hepatocellular carcinoma, using iRNA compositions that effect RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated cleavage of RNA transcripts of a PD-L1 gene.

[0088] Dosagens muito baixas dos iRNAs da invenção, em particular, podem mediar de forma específica e eficaz a interferência do RNA (RNAi), resultando em uma inibição significativa da expressão do gene correspondente (gene PD-L1).[0088] Very low dosages of the iRNAs of the invention, in particular, can specifically and effectively mediate RNA interference (RNAi), resulting in a significant inhibition of the expression of the corresponding gene (PD-L1 gene).

[0089] Os iRNAs da invenção incluem uma cadeia de RNA (cadeia antissentido) que tem uma região que tem cerca de 30 nucleotídeos ou menos de comprimento, por exemplo, 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento, região que é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene PD-L1. Em certas modalidades, os iRNAs da invenção incluem uma cadeia de RNA (a cadeia antissentido) que pode incluir comprimentos mais longos, por exemplo, até 66 nucleotídeos, por exemplo, 36 a 66, 26 a 36, 25 a 36, 31 a 60, 22 a 43, 27 a 53 nucleotídeos de comprimento com uma região de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de mRNA de um gene PD-L1. Esses iRNAs com as cadeias antissentido mais compridas incluem preferivelmente uma segunda cadeia de RNA (a cadeia sentido) com 20 a 60 nucleotídeos de comprimento, em que as cadeias sentido e antissentido formam um duplex de 18 a 30 nucleotídeos contíguos. O uso desses iRNAs permite a degradação direcionada de mRNAs do gene correspondente (gene PD-L1) em mamíferos. Dosagens muito baixas dos iRNAs da invenção, em particular, podem mediar de forma específica e eficaz a interferência do RNA (RNAi), resultando em uma inibição significativa da expressão do gene correspondente (gene PD-L1). Usando ensaios in vitro e in vivo, os presentes inventores demonstraram que os iRNA que alvejam um gene PD-L1 podem mediar o RNAi, resultando em uma inibição significativa da expressão de PD-L1, bem como reduzindo a sinalização através da via de PD-L1 que diminuirá um ou mais dos sintomas associados a uma doença associada a PD-L1, tal como uma doença infecciosa, por exemplo, uma doença viral ou infecção intracelular crônica; ou câncer. Assim, os métodos e composições incluindo esses iRNAs são úteis para o tratamento de um indivíduo com uma doença associada a PD-L1, tal como uma doença infecciosa, por exemplo, uma doença viral ou infecção intracelular crônica ou câncer. Os métodos e composições aqui usados são úteis para reduzir o nível de PD-L1 em um indivíduo, por exemplo, PD-L1 do fígado em um indivíduo, especialmente em um indivíduo com uma infecção intracelular crônica, especialmente uma infecção hepática crônica, ou tumor.[0089] The iRNAs of the invention include an RNA strand (antisense strand) that has a region that is about 30 nucleotides or less in length, e.g., 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18 to 20, 19 to 30, 19 to 29, 19 to 28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24, 20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23, or 21 to 22 nucleotides in length, a region that is substantially complementary to at least part of an mRNA transcript of a PD-L1 gene. In certain embodiments, the iRNAs of the invention include an RNA strand (the antisense strand) that can include longer lengths, e.g., up to 66 nucleotides, e.g., 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleotides in length with a region of at least 19 contiguous nucleotides that is substantially complementary to at least a part of an mRNA transcript of a PD-L1 gene. These iRNAs with longer antisense strands preferably include a second RNA strand (the sense strand) 20 to 60 nucleotides long, where the sense and antisense strands form a duplex of 18 to 30 contiguous nucleotides. The use of these iRNAs allows for the targeted degradation of mRNAs of the corresponding gene (PD-L1 gene) in mammals. Very low doses of the iRNAs of the invention, in particular, can specifically and effectively mediate RNA interference (RNAi), resulting in significant inhibition of the expression of the corresponding gene (PD-L1 gene). Using in vitro and in vivo assays, the present inventors have demonstrated that iRNAs targeting a PD-L1 gene can mediate RNAi, resulting in significant inhibition of PD-L1 expression, as well as reducing signaling through the PD-L1 pathway, which will alleviate one or more symptoms associated with a PD-L1-associated disease, such as an infectious disease, e.g., a viral disease or chronic intracellular infection; or cancer. Thus, the methods and compositions including these iRNAs are useful for treating a subject with a PD-L1-associated disease, such as an infectious disease, e.g., a viral disease or chronic intracellular infection, or cancer. The methods and compositions used herein are useful for reducing the level of PD-L1 in a subject, e.g., liver PD-L1 in a subject, especially in a subject with a chronic intracellular infection, especially a chronic liver infection, or tumor.

[0090] A seguinte descrição detalhada descreve como fazer e usar composições contendo iRNAs para inibir a expressão de um gene PD-L1, bem como composições, usos e métodos para tratar indivíduos com doenças e distúrbios que se beneficiariam da redução da expressão de um gene PD-L1.[0090] The following detailed description describes how to make and use compositions containing iRNAs to inhibit the expression of a PD-L1 gene, as well as compositions, uses, and methods for treating individuals with diseases and disorders that would benefit from reducing the expression of a PD-L1 gene.

DefiniçõesDefinitions

[0091] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Além disso, deve ser notado que sempre que um valor ou faixa de valores de um parâmetro são citados, pretende-se que valores e faixas intermediários para os valores indicados sejam também destinados a fazer parte desta invenção.[0091] In order that the present invention may be more easily understood, certain terms are first defined. Furthermore, it should be noted that whenever a value or range of values of a parameter is cited, it is intended that intermediate values and ranges for the indicated values are also intended to form part of this invention.

[0092] Os artigos “um” e “uma” são usados aqui para se referir a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.[0092] The articles “a” and “an” are used here to refer to one or more than one (i.e., at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, “an element” means one element or more than one element, e.g., a plurality of elements.

[0093] O termo “incluindo” é aqui usado para significar, e é usado de forma intercambiável com a frase “incluindo, mas não limitado a”.[0093] The term “including” is used herein to mean, and is used interchangeably with, the phrase “including, but not limited to.”

[0094] O termo “ou” é aqui usado para significar e é usado de forma intercambiável com o termo “e/ou”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, “cadeia sentido ou antissentido” é entendido como “cadeia sentido ou antissentido ou cadeia sentido e cadeia antissentido”.[0094] The term “or” is used herein to mean and is used interchangeably with the term “and/or” unless the context clearly indicates otherwise. For example, “sense or antisense strand” is understood to mean “sense or antisense strand or sense strand and antisense strand.”

[0095] O termo “cerca de” é aqui usado para significar dentro das faixas típicas de tolerâncias na técnica. Por exemplo, “cerca de” pode ser entendido como cerca de 2 desvios padrão da média. Em certas modalidades, cerca de significa +10%. Em certas modalidades, cerca de significa +5%. Quando cerca de está presente antes de uma série de números ou de uma faixa, entende-se que “cerca de” pode modificar cada um dos números na série ou na faixa.[0095] The term "about" is used herein to mean within typical ranges of tolerances in the art. For example, "about" may be understood as about 2 standard deviations from the mean. In certain embodiments, about means +10%. In certain embodiments, about means +5%. When about is present before a series of numbers or a range, it is understood that "about" may modify each of the numbers in the series or range.

[0096] O termo “pelo menos” antes de um número ou série de números é entendido para incluir o número adjacente ao termo “pelo menos”, e todos os números subsequentes ou inteiros que poderiam ser logicamente incluídos, como fica claro a partir do contexto. Por exemplo, o número de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico deve ser um inteiro. Por exemplo, “pelo menos 18 nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico de 21 nucleotídeos” significa que 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos têm a propriedade indicada. Quando pelo menos está presente antes de uma série de números ou de uma faixa, entende-se que “pelo menos” pode modificar cada um dos números na série ou na faixa.[0096] The term “at least” before a number or series of numbers is understood to include the number adjacent to the term “at least,” and all subsequent numbers or integers that could logically be included, as is clear from the context. For example, the number of nucleotides in a nucleic acid molecule must be an integer. For example, “at least 18 nucleotides of a 21-nucleotide nucleic acid molecule” means that 18, 19, 20, or 21 nucleotides have the indicated property. When at least is present before a series of numbers or a range, it is understood that “at least” can modify each of the numbers in the series or range.

[0097] Como usado aqui, “não mais que” ou “menor que” é entendido como o valor adjacente à frase e valores lógicos mais baixos ou números inteiros, como fica lógico a partir do contexto, até zero. Por exemplo, um duplex com uma projeção de “não mais que 2 nucleotídeos” tem uma projeção de nucleotídeo de 2, 1 ou 0. Quando “não mais que” está presente antes de uma série de números ou de uma faixa, entende-se que “não mais que” pode modificar cada um dos números na série ou na faixa.[0097] As used herein, "no more than" or "less than" is understood to mean the value adjacent to the phrase and lower logical values or integers, as is logical from the context, down to zero. For example, a duplex with an overhang of "no more than 2 nucleotides" has a nucleotide overhang of 2, 1, or 0. When "no more than" is present before a series of numbers or a range, it is understood that "no more than" can modify each of the numbers in the series or range.

[0098] No caso de um conflito entre uma sequência e seu sítio indicado em um transcrito ou outra sequência, a sequência de nucleotídeos citada no relatório descritivo tem precedência.[0098] In the event of a conflict between a sequence and its indicated site in a transcript or other sequence, the nucleotide sequence cited in the specification takes precedence.

[0099] Várias modalidades da invenção podem ser combinadas conforme determinado por um versado na técnica.[0099] Various embodiments of the invention may be combined as determined by one skilled in the art.

[00100] “Ligante 1 de morte celular programada 1”, “PD-L1” ou “CD274”, também conhecido como B7-H; B7H1; PDL1; PD-L1; PDCD1L1; DCD1LG1, homólogo de B7 1, ligante 1 PDCD1 e o ligante 1 de morte celular programada demonstraram ser constitutivamente expressos em células T e B de camundongo, CDs, macrófagos, células-tronco mesenquimais e mastócitos derivados de medula óssea. A expressão de PD-L1 também é encontrada em uma ampla gama de células não hematopoiéticas e é regulada ascendentemente em vários tipos de células após a ativação. Após a estimulação com IFN-y, a PD-L1 é expressa em células T, células NK, macrófagos, CDs mieloides, células B, células epiteliais e células endoteliais vasculares (Flies DB and Chen L (2007) J Immunother. 30 (3): 251-60). PD- L1 é notavelmente expresso em macrófagos. Mais informações sobre PD-L1 são fornecidas, por exemplo, na base de dados do Gene NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/29126 (que é aqui incorporada por referência a partir da data de depósito deste pedido).[00100] “Programmed cell death 1 ligand 1”, “PD-L1”, or “CD274”, also known as B7-H; B7H1; PDL1; PD-L1; PDCD1L1; DCD1LG1, B7 homolog 1, PDCD1 ligand 1, and programmed cell death ligand 1 have been shown to be constitutively expressed on mouse T and B cells, DCs, macrophages, mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mast cells. PD-L1 expression is also found on a wide range of non-hematopoietic cells and is upregulated on several cell types upon activation. Upon stimulation with IFN-γ, PD-L1 is expressed on T cells, NK cells, macrophages, myeloid DCs, B cells, epithelial cells, and vascular endothelial cells (Flies DB and Chen L (2007) J Immunother. 30(3):251-60). PD-L1 is notably expressed on macrophages. Further information on PD-L1 is provided, for example, in the NCBI Gene database at www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/29126 (which is incorporated herein by reference from the filing date of this application).

[00101] Como aqui usado, “ligante 1 de morte celular programada 1” é usado intercambiavelmente com o termo “PD-L1” (e opcionalmente qualquer um dos outros nomes reconhecidos listados acima) e refere-se ao gene de ocorrência natural que codifica uma proteína de ligante 1 de morte celular programada 1. O aminoácido e sequências de codificação completas da sequência de referência do gene PDL-1 humano podem ser encontrados, por exemplo, no número de acesso GenBank GI: 390979638 (n° de acesso NM_001267706.1; SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2) e n° de acesso GenBank GI: 292658763 (n° de acesso RefSeq NM_014143.3; SEQ ID NO: 9 e 10). Outras variantes de emenda são providas, por exemplo, em Grzywnowicz et al., PLoS One. 2012;7:e35178 que é aqui incorporada por referência. Ortólogos de mamíferos do gene PD-L1 humano podem ser encontrados, por exemplo, em GI: 755563510 (n° de acesso RefSeq XM_006527249.2, camundongo; SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4); GI: 672040129 (n° de acesso RefSeq XM_006231248.2, rato; SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6); n° de acesso GenBank GI: 544494555 (n° de acesso RefSeq XM_005581779.1, macaco cinomolgo; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8).[00101] As used herein, “programmed cell death ligand 1” is used interchangeably with the term “PD-L1” (and optionally any of the other recognized names listed above) and refers to the naturally occurring gene that encodes a programmed cell death ligand 1 protein. The complete amino acid and coding sequences of the human PDL-1 gene reference sequence can be found, for example, in GenBank accession number GI: 390979638 (accession no. NM_001267706.1; SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2) and GenBank accession no. GI: 292658763 (RefSeq accession no. NM_014143.3; SEQ ID NO:9 and 10). Other splice variants are provided, e.g., in Grzywnowicz et al., PLoS One. 2012;7:e35178 which is incorporated herein by reference. Mammalian orthologs of the human PD-L1 gene can be found, e.g., in GI:755563510 (RefSeq accession no. XM_006527249.2, mouse; SEQ ID NO:3 and SEQ ID NO:4); GI:672040129 (RefSeq accession no. XM_006231248.2, rat; SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6); GenBank accession no. GI:544494555 (RefSeq accession no. XM_005581779.1, cynomolgus monkey; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8).

[00102] Uma série de SNPs de ocorrência natural são conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, na base de dados SNP do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=29126 (que é aqui incorporado por referência a partir da data de depósito deste pedido) que lista SNPs em PD-L1 humano. Em modalidades preferidas, tais variantes de ocorrência natural estão incluídas no escopo da sequência do gene PD-L1.[00102] A number of naturally occurring SNPs are known and can be found, for example, in the NCBI SNP database at www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=29126 (which is incorporated herein by reference as of the filing date of this application) that lists SNPs in human PD-L1. In preferred embodiments, such naturally occurring variants are included within the scope of the PD-L1 gene sequence.

[00103] Exemplos adicionais de sequências de mRNA de PD-L1 estão prontamente disponíveis usando bancos de dados publicamente disponíveis, por exemplo, GenBank, UniProt e OMIM.[00103] Additional examples of PD-L1 mRNA sequences are readily available using publicly available databases, e.g., GenBank, UniProt, and OMIM.

[00104] Tal como aqui usado, a “sequência alvo” refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene PD-L1, incluindo mRNA que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primário. A porção alvo da sequência será pelo menos longa o suficiente para servir como um substrato para a clivagem direcionada por iRNA em ou perto da porção da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene PD-L1. Em uma modalidade, a sequência alvo está dentro da região de codificação de proteína de PD-L1.[00104] As used herein, the “target sequence” refers to a contiguous portion of the nucleotide sequence of an mRNA molecule formed during transcription of a PD-L1 gene, including mRNA that is a product of RNA processing of a primary transcription product. The target portion of the sequence will be at least long enough to serve as a substrate for iRNA-directed cleavage at or near the portion of the nucleotide sequence of an mRNA molecule formed during transcription of a PD-L1 gene. In one embodiment, the target sequence is within the protein coding region of PD-L1.

[00105] A sequência alvo pode ter de cerca de 9 a 36 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, cerca de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sequência alvo pode ter de cerca de 15 a 30 nucleotídeos, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento. As faixas e comprimentos intermediários para as faixas e comprimentos indicados acima são também considerados como parte da invenção.[00105] The target sequence may be about 9 to 36 nucleotides in length, for example, about 15 to 30 nucleotides in length. For example, the target sequence may be about 15-30 nucleotides long, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24, 20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23, or 21 to 22 nucleotides in length. Ranges and lengths intermediate to the ranges and lengths indicated above are also considered to be part of the invention.

[00106] Como aqui usado, o termo “cadeia compreendendo uma sequência” refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura de nucleotídeos padrão.[00106] As used herein, the term “strand comprising a sequence” refers to an oligonucleotide comprising a chain of nucleotides that is described by the referred sequence using standard nucleotide nomenclature.

[00107] “G”, “C”, “A”, “T” e “U” representam geralmente um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como base, respectivamente. No entanto, será entendido que o termo “ribonucleotídeo” ou “nucleotídeo” também pode se referir a um nucleotídeo modificado, como mais detalhado abaixo, ou a um radical de substituição substituto (ver, por exemplo, a Tabela 2). O versado está bem ciente de que guanina, citosina, adenina e uracila podem ser substituídas por outros radicais sem alterar substancialmente as propriedades de pareamento de bases de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo que suporta esse radical de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo que compreende inosina como sua base pode parear bases com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Assim, os nucleotídeos contendo uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos de dsRNA apresentadas na invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em um outro exemplo, a adenina e a citosina em qualquer parte do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente, para formar o pareamento de bases G-U Wobble com o mRNA alvo. Sequências contendo tais radicais de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.[00107] “G”, “C”, “A”, “T”, and “U” generally represent a nucleotide containing guanine, cytosine, adenine, thymidine, and uracil as a base, respectively. However, it will be understood that the term “ribonucleotide” or “nucleotide” may also refer to a modified nucleotide, as further detailed below, or to a substituent substitution moiety (see, for example, Table 2). One of ordinary skill is well aware that guanine, cytosine, adenine, and uracil may be replaced by other moieties without substantially altering the base-pairing properties of an oligonucleotide comprising a nucleotide bearing such a substitution moiety. For example, without limitation, a nucleotide comprising inosine as its base may base-pair with nucleotides containing adenine, cytosine, or uracil. Thus, nucleotides containing uracil, guanine, or adenine can be replaced in the dsRNA nucleotide sequences presented in the invention with a nucleotide containing, for example, inosine. In another example, adenine and cytosine anywhere in the oligonucleotide can be replaced with guanine and uracil, respectively, to form the G-U Wobble base pairing with the target mRNA. Sequences containing such substitution residues are suitable for the compositions and methods presented in the invention.

[00108] Os termos “iRNA”, “agente de RNAi” e “agente de iRNA”, “agente de interferência de RNA”, como usados intercambiavelmente neste documento, referem-se a um agente que contém RNA como o termo é definido aqui e que medeia a clivagem alvejada de um transcrito de RNA por uma via de complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O iRNA direciona a degradação específica da sequência do mRNA através de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi). O iRNA modula, por exemplo, inibe, a expressão de um gene PD-L1 em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, como um mamífero.[00108] The terms “iRNA”, “RNAi agent” and “iRNA agent”, “RNA interference agent”, as used interchangeably herein, refer to an agent that contains RNA as that term is defined herein and that mediates the targeted cleavage of an RNA transcript by an RNA-induced silencing complex (RISC) pathway. The iRNA directs the sequence-specific degradation of the mRNA through a process known as RNA interference (RNAi). The iRNA modulates, e.g., inhibits, the expression of a PD-L1 gene in a cell, e.g., a cell within an individual, such as a mammal.

[00109] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui um RNA de cadeia simples que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de PD-L1, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que o RNA de cadeia dupla longa introduzido nas células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curta de 19 a 23 pares de bases com duas projeções 3' de base características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de siRNA, permitindo que a cadeia antissentido complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Após a ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Assim, em um aspecto, a invenção se refere a um RNA de cadeia simples (siRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo RISC para efetuar o silenciamento do gene alvo, ou seja, um gene PD-L1. Por conseguinte, o termo “siRNA” é também usado aqui para se referir a um iRNA como descrito acima.[00109] In one embodiment, an RNAi agent of the invention includes a single-stranded RNA that interacts with a target RNA sequence, e.g., a PD-L1 target mRNA sequence, to direct cleavage of the target RNA. Without wishing to be bound by theory, it is believed that long double-stranded RNA introduced into cells is cleaved into siRNA by a Type III endonuclease known as Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, a ribonuclease-III type enzyme, processes dsRNA into short interfering RNAs of 19 to 23 base pairs with two characteristic 3' base overhangs (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). The siRNAs are then incorporated into an RNA-induced silencing complex (RISC), where one or more helicases unwind the siRNA duplex, allowing the complementary antisense strand to guide target recognition (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Upon binding to the appropriate target mRNA, one or more endonucleases within the RISC cleave the target to induce silencing (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Thus, in one aspect, the invention relates to a single-stranded RNA (siRNA) generated within a cell and that promotes the formation of a RISC complex to effect silencing of the target gene, i.e., a PD-L1 gene. Accordingly, the term “siRNA” is also used herein to refer to an iRNA as described above.

[00110] Em certas modalidades, o agente de RNAi pode ser um siRNA de cadeia simples (ssRNAi) que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um mRNA alvo. Agentes de RNAi de cadeia simples ligam-se à endonuclease de RISC, Argonauta 2, que então cliva o mRNA alvo. Os siRNAs de cadeia simples são geralmente de 15 a 30 nucleotídeos e são quimicamente modificados. O projeto e os testes de siRNAs de cadeia simples são descritos na Patente US n° 8.101.348 e em Lima et al., (2012) Cell 150:883-894, cujos conteúdos na íntegra são aqui incorporados por referência. Qualquer uma das sequências de nucleotídeos antissentido aqui descritas pode ser usada como um siRNA de cadeia simples como aqui descrito ou como quimicamente modificado pelos métodos descritos em Lima et al., (2012) Cell 150:883-894.[00110] In certain embodiments, the RNAi agent can be a single-stranded siRNA (ssRNAi) that is introduced into a cell or organism to inhibit a target mRNA. Single-stranded RNAi agents bind to the RISC endonuclease, Argonaute 2, which then cleaves the target mRNA. Single-stranded siRNAs are generally 15 to 30 nucleotides and are chemically modified. The design and testing of single-stranded siRNAs are described in U.S. Patent No. 8,101,348 and in Lima et al., (2012) Cell 150:883-894, the entire contents of which are incorporated herein by reference. Any of the antisense nucleotide sequences described herein can be used as a single-stranded siRNA as described herein or as chemically modified by the methods described in Lima et al., (2012) Cell 150:883-894.

[00111] Em certas modalidades, um “iRNA” para uso nas composições, usos e métodos da invenção é um RNA de cadeia dupla e é aqui chamado de um “agente de RNAi de cadeia dupla”, “molécula de RNA de cadeia dupla (dsRNA)” “agente de dsRNA” ou “dsRNA”. O termo “dsRNA” refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura duplex compreendendo duas cadeias de ácido nucleico antiparalelas e substancialmente complementares, referidas como tendo orientações “sentido” e “antissentido” em relação a um RNA alvo, isto é, um gene PD-L1. Em algumas modalidades da invenção, um RNA de cadeia dupla (dsRNA) desencadeia a degradação de um RNA alvo, por exemplo, um mRNA, através de um mecanismo de silenciamento de gene pós-transcricional aqui chamado de interferência de RNA ou RNAi.[00111] In certain embodiments, an “iRNA” for use in the compositions, uses, and methods of the invention is a double-stranded RNA and is referred to herein as a “double-stranded RNAi agent,” “double-stranded RNA (dsRNA) molecule,” “dsRNA agent,” or “dsRNA.” The term “dsRNA” refers to a complex of ribonucleic acid molecules having a duplex structure comprising two antiparallel and substantially complementary nucleic acid strands, said to have “sense” and “antisense” orientations relative to a target RNA, i.e., a PD-L1 gene. In some embodiments of the invention, a double-stranded RNA (dsRNA) triggers the degradation of a target RNA, e.g., an mRNA, through a post-transcriptional gene silencing mechanism referred to herein as RNA interference or RNAi.

[00112] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada cadeia de uma molécula de dsRNA são ribonucleotídeos, mas como aqui descrito em detalhe, cada uma ou ambas as cadeias podem também incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo ou um nucleotídeo modificado. Além disso, como usado neste relatório descritivo, um “iRNA” pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um iRNA pode incluir modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos. Como aqui usado, o termo “nucleotídeo modificado” refere-se a um nucleotídeo com, independentemente, um radical de açúcar modificado, uma ligação internucleotídica modificada, ou nucleobase modificada, ou qualquer combinação dos mesmos. Assim, o termo nucleotídeo modificado abrange substituições, adições ou remoção de, por exemplo, um grupo ou átomo funcional, a ligações internucleosídicas, radicais de açúcar ou nucleobases. As modificações adequadas para uso nos agentes da invenção incluem todos os tipos de modificações aqui descritas ou conhecidas na técnica. Quaisquer modificações, tal como usadas em uma molécula tipo siRNA, são abrangidas por “iRNA” ou “agente de RNAi” para os objetivos deste relatório descritivo e reivindicações.[00112] In general, the majority of the nucleotides in each strand of a dsRNA molecule are ribonucleotides, but as described in detail herein, each or both strands may also include one or more non-ribonucleotides, e.g., a deoxyribonucleotide or a modified nucleotide. Furthermore, as used herein, an "iRNA" may include ribonucleotides with chemical modifications; an iRNA may include substantial modifications to multiple nucleotides. As used herein, the term "modified nucleotide" refers to a nucleotide with, independently, a modified sugar moiety, a modified internucleotide linkage, or modified nucleobase, or any combination thereof. Thus, the term modified nucleotide encompasses substitutions, additions, or removal of, e.g., a functional group or atom, to internucleoside linkages, sugar moieties, or nucleobases. Modifications suitable for use in the agents of the invention include all types of modifications described herein or known in the art. Any modifications, as used in an siRNA-type molecule, are encompassed by "iRNA" or "RNAi agent" for the purposes of this specification and claims.

[00113] A região de duplex pode ter qualquer comprimento que permita a degradação específica de um RNA alvo desejado através de uma via de RISC, e pode variar de cerca de 9 a 36 pares de bases de comprimento, por exemplo, cerca de 15 a 30 pares de bases de comprimento, por exemplo 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 pares de bases de comprimento, como por exemplo 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, ou 21 a 22 pares de bases de comprimento. As faixas e comprimentos intermediários para as faixas e comprimentos indicados acima são também considerados como parte da invenção.[00113] The duplex region can be any length that allows for the specific degradation of a desired target RNA via a RISC pathway, and can range from about 9 to 36 base pairs in length, e.g., about 15 to 30 base pairs in length, e.g., 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, or 36 base pairs in length, e.g., 15 to 30, 15 to 29, 15 to 28, 15 to 27, 15 to 26, 15 to 25, 15 to 24, 15 to 23, 15 to 22, 15 to 21, 15 to 20, 15 to 19, 15 to 18, 15 to 17, 18 to 30, 18 to 29, 18 to 28, 18 to 27, 18 to 26, 18 to 25, 18 to 24, 18 to 23, 18 to 22, 18 to 21, 18 to 20, 19 to 30, 19 to 29, 19 to 28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24, 20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23, or 21 to 22 base pairs in length. Ranges and lengths intermediate to the ranges and lengths indicated above are also considered to be part of the invention.

[00114] As duas cadeias que formam a estrutura de duplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior ou podem ser moléculas de RNA separadas. Quando as duas cadeias fazem parte de uma molécula maior e, portanto, estão ligadas por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma cadeia e a extremidade 5' da respectiva outra cadeia que forma a estrutura de duplex, a cadeia de RNA de ligação é chamada de “estrutura em forma de grampo”. Uma estrutura em forma de grampo pode compreender pelo menos um nucleotídeo não pareado. Em algumas modalidades, a estrutura em forma de grampo pode compreender pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23 ou mais nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, a estrutura em forma de grampo pode ter 10 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, a estrutura em forma de grampo pode ter 8 ou menos nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, a estrutura em forma de grampo pode ter 4 a 10 nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, a estrutura em forma de grampo pode ter 4 a 8 nucleotídeos.[00114] The two strands that form the duplex structure may be different portions of a larger RNA molecule, or they may be separate RNA molecules. When the two strands are part of a larger molecule and are therefore linked by an uninterrupted chain of nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of the respective other strand that forms the duplex structure, the connecting RNA strand is called a "hairpin structure." A hairpin structure may comprise at least one unpaired nucleotide. In some embodiments, the hairpin structure may comprise at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23, or more unpaired nucleotides. In some embodiments, the hairpin structure may have 10 or fewer nucleotides. In some embodiments, the hairpin structure may have 8 or fewer unpaired nucleotides. In some embodiments, the hairpin structure may have 4 to 10 unpaired nucleotides. In some embodiments, the hairpin structure may have 4 to 8 nucleotides.

[00115] Onde as duas cadeias substancialmente complementares de um dsRNA são compreendidas por moléculas de RNA separadas, essas moléculas não precisam, mas podem ser ligadas covalentemente. Quando as duas cadeias são ligadas covalentemente por outros meios que não uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma cadeia e a extremidade 5' da respectiva outra cadeia que forma a estrutura de duplex, a estrutura de ligação é chamada de “ligador”. As cadeias de RNA podem ter um número igual ou diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotídeos na cadeia mais curta do dsRNA menos quaisquer projeções que estejam presentes no duplex. Além da estrutura de duplex, um RNAi pode compreender uma ou mais projeções de nucleotídeos.[00115] Where the two substantially complementary strands of a dsRNA are comprised of separate RNA molecules, these molecules need not, but may, be covalently linked. When the two strands are covalently linked by means other than an uninterrupted chain of nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of the respective other strand that forms the duplex structure, the linking structure is called a "linker". The RNA strands may have the same or different number of nucleotides. The maximum number of base pairs is the number of nucleotides in the shorter strand of the dsRNA minus any overhangs that are present in the duplex. In addition to the duplex structure, an RNAi may comprise one or more nucleotide overhangs.

[00116] Em certas modalidades, um agente de iRNA da invenção é um dsRNA, cada cadeia do qual compreende 19 a 23 nucleotídeos, que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, um gene PD-L1, sem desejar estar limitado pela teoria, o RNA de cadeia dupla longa introduzido nas células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curta de 19 a 23 pares de bases com duas projeções 3' de base características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de siRNA, permitindo que a cadeia antissentido complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Após a ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).[00116] In certain embodiments, an iRNA agent of the invention is a dsRNA, each strand of which comprises 19 to 23 nucleotides, that interacts with a target RNA sequence, e.g., a PD-L1 gene. Without wishing to be limited by theory, long double-stranded RNA introduced into cells is cleaved into siRNA by a Type III endonuclease known as Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, a ribonuclease-III type enzyme, processes dsRNA into short interfering RNAs of 19 to 23 base pairs with two characteristic 3' base overhangs (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). The siRNAs are then incorporated into an RNA-induced silencing complex (RISC), where one or more helicases unwind the siRNA duplex, allowing the complementary antisense strand to guide target recognition (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Upon binding to the appropriate target mRNA, one or more endonucleases within the RISC cleave the target to induce silencing (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).

[00117] Em algumas modalidades, um iRNA da invenção é um dsRNA de 24 a 30 nucleotídeos, ou possivelmente mais longo, por exemplo, 25 a 35, 27 a 53 ou 27 a 49 nucleotídeos, que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de PD-L1, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem querer estar limitado pela teoria, o RNA de cadeia dupla longa introduzido nas células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curta de 19 a 23 pares de bases com duas projeções 3' de base características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de siRNA, permitindo que a cadeia antissentido complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al, (2001) Cell 107:309). Após a ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).[00117] In some embodiments, an iRNA of the invention is a dsRNA of 24-30 nucleotides, or possibly longer, e.g., 25-35, 27-53, or 27-49 nucleotides, that interacts with a target RNA sequence, e.g., a PD-L1 target mRNA sequence, to direct cleavage of the target RNA. Without wishing to be bound by theory, long double-stranded RNA introduced into cells is cleaved into siRNA by a Type III endonuclease known as Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, a ribonuclease-III type enzyme, processes dsRNA into short interfering RNAs of 19-23 base pairs with two characteristic 3' base overhangs (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). The siRNAs are then incorporated into an RNA-induced silencing complex (RISC), where one or more helicases unwind the siRNA duplex, allowing the complementary antisense strand to guide target recognition (Nykanen, et al, (2001) Cell 107:309). After binding to the appropriate target mRNA, one or more endonucleases within the RISC cleave the target to induce silencing (Elbashir, et al, (2001) Genes Dev. 15:188).

[00118] Tal como aqui usado, o termo “projeção de nucleotídeos” refere-se a pelo menos um nucleotídeo não pareado que se projeta da estrutura de duplex de um iRNA de cadeia dupla. Por exemplo, quando uma extremidade 3' de uma cadeia de um dsRNA se estende além da extremidade 5' da outra cadeia, ou vice-versa, existe uma projeção de nucleotídeos. Um dsRNA pode compreender uma projeção de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente, a projeção pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma projeção de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) projeção(ões) pode(m) estar na cadeia sentido, na cadeia antissentido ou em qualquer combinação das mesmas. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma projeção podem estar presentes na extremidade 5', na extremidade 3', ou em ambas as extremidades de uma cadeia antissentido ou sentido de um dsRNA.[00118] As used herein, the term "nucleotide overhang" refers to at least one unpaired nucleotide that protrudes from the duplex structure of a double-stranded iRNA. For example, when a 3' end of one strand of a dsRNA extends beyond the 5' end of the other strand, or vice versa, a nucleotide overhang exists. A dsRNA may comprise an overhang of at least one nucleotide; alternatively, the overhang may comprise at least two nucleotides, at least three nucleotides, at least four nucleotides, at least five nucleotides, or more. A nucleotide overhang may comprise or consist of a nucleotide/nucleoside analog, including a deoxynucleotide/nucleoside. The overhang(es) may be on the sense strand, the antisense strand, or any combination thereof. Furthermore, the nucleotide(s) of an overhang may be present at the 5' end, the 3' end, or both ends of an antisense or sense strand of a dsRNA.

[00119] Em certas modalidades, a cadeia antissentido de um dsRNA tem 1 a 10 nucleotídeos, por exemplo, 0 a 3, 1 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 4 a 10, 5 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, projetados na extremidade 3’ ou na extremidade 5’. Em certas modalidades, a projeção na cadeia sentido ou antissentido, ou ambas, podem incluir comprimentos prolongados com mais de 10 nucleotídeos, por exemplo, 1 a 30 nucleotídeos, 2 a 30 nucleotídeos, 10 a 30 nucleotídeos ou 10 a 15 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, uma projeção prolongada está na cadeia sentido do duplex. Em certas modalidades, uma projeção prolongada está presente na extremidade 3’ da cadeia sentido do duplex. Em certas modalidades, uma projeção prolongada está presente na extremidade 5’ da cadeia sentido do duplex. Em certas modalidades, uma projeção prolongada está na cadeia antissentido do duplex. Em certas modalidades, uma projeção prolongada está presente na extremidade 3’ da cadeia antissentido do duplex. Em certas modalidades, uma projeção prolongada está presente na extremidade 5’ da cadeia antissentido do duplex. Em certas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos na projeção é substituído por um tiofosfato de nucleosídeo.[00119] In certain embodiments, the antisense strand of a dsRNA is 1-10 nucleotides, e.g., 0-3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nucleotides, projected at the 3' end or the 5' end. In certain embodiments, the overhang on the sense or antisense strand, or both, can include extended lengths greater than 10 nucleotides, e.g., 1-30 nucleotides, 2-30 nucleotides, 10-30 nucleotides, or 10-15 nucleotides in length. In certain embodiments, an extended overhang is on the sense strand of the duplex. In certain embodiments, an extended overhang is present at the 3' end of the sense strand of the duplex. In certain embodiments, an extended overhang is present at the 5' end of the sense strand of the duplex. In certain embodiments, an extended overhang is on the antisense strand of the duplex. In certain embodiments, an extended overhang is present at the 3' end of the antisense strand of the duplex. In certain embodiments, an extended overhang is present at the 5' end of the antisense strand of the duplex. In certain embodiments, one or more of the nucleotides in the overhang is replaced by a nucleoside thiophosphate.

[00120] “Cega” ou “extremidade cega” significa que não existem nucleotídeos não pareados nessa extremidade do agente de RNAi de cadeia dupla, isto é, sem projeção de nucleotídeos. Um agente de RNAi de cadeia dupla de “extremidade cega” tem uma cadeia dupla ao longo de todo o seu comprimento, ou seja, nenhuma projeção de nucleotídeo em qualquer das extremidades da molécula. Os agentes de RNAi da invenção incluem agentes de RNAi sem projeção de nucleotídeos em uma extremidade (isto é, agentes com uma projeção e uma extremidade cega) ou sem projeções de nucleotídeos em qualquer uma das extremidades.[00120] “Blunt” or “blunt-ended” means that there are no unpaired nucleotides at that end of the double-stranded RNAi agent, i.e., no nucleotide overhang. A “blunt-ended” double-stranded RNAi agent has a double strand along its entire length, i.e., no nucleotide overhang at either end of the molecule. RNAi agents of the invention include RNAi agents with no nucleotide overhang at one end (i.e., agents with both an overhang and a blunt end) or no nucleotide overhangs at either end.

[00121] O termo “cadeia antissentido” ou “cadeia guia” refere-se à cadeia de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência alvo, por exemplo, um mRNA de PD-L1. Como aqui usado, o termo “região de complementaridade” refere-se à região na cadeia antissentido que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de PD-L1, como aqui definida. Quando a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência alvo, as incompatibilidades podem estar nas regiões interna ou terminal da molécula. Geralmente, as incompatibilidades mais toleradas estão nas regiões terminais, por exemplo, dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos da extremidade 5’ ou 3’ do iRNA. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de cadeia dupla da invenção inclui uma incompatibilidade de nucleotídeos na cadeia antissentido. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de cadeia dupla da invenção inclui uma incompatibilidade de nucleotídeos na cadeia sentido. Em algumas modalidades, a incompatibilidade de nucleotídeos está, por exemplo, dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos da extremidade 3’ do iRNA. Em uma outra modalidade, a incompatibilidade de nucleotídeos está, por exemplo, no nucleotídeo do terminal 3’ do iRNA.[00121] The term “antisense strand” or “guide strand” refers to the strand of an iRNA, e.g., a dsRNA, that includes a region that is substantially complementary to a target sequence, e.g., a PD-L1 mRNA. As used herein, the term “region of complementarity” refers to the region in the antisense strand that is substantially complementary to a sequence, e.g., a target sequence, e.g., a PD-L1 nucleotide sequence, as defined herein. When the region of complementarity is not fully complementary to the target sequence, the mismatches may be in the internal or terminal regions of the molecule. Generally, the most tolerated mismatches are in the terminal regions, e.g., within 5, 4, 3, 2, or 1 nucleotides of the 5’ or 3’ end of the iRNA. In some embodiments, a double-stranded RNAi agent of the invention includes a nucleotide mismatch in the antisense strand. In some embodiments, a double-stranded RNAi agent of the invention includes a nucleotide mismatch in the sense strand. In some embodiments, the nucleotide mismatch is, for example, within 5, 4, 3, 2, or 1 nucleotide from the 3' end of the iRNA. In another embodiment, the nucleotide mismatch is, for example, in the 3' terminal nucleotide of the iRNA.

[00122] O termo “cadeia sentido” ou “cadeia passageira”, como aqui usado, refere-se à cadeia de um iRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da cadeia antissentido tal como o termo é aqui definido.[00122] The term “sense strand” or “passenger strand,” as used herein, refers to the strand of an iRNA that includes a region that is substantially complementary to a region of the antisense strand as that term is defined herein.

[00123] Como aqui usado, o termo “região de clivagem” refere-se a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. O sítio de clivagem é o sítio no alvo em que ocorre a clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende três bases em cada extremidade do, e imediatamente adjacentes ao, sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende duas bases em cada extremidade do, e imediatamente adjacentes ao, sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no sítio ligado pelos nucleotídeos 10 e 11 da cadeia antissentido, e a região de clivagem compreende os nucleotídeos 11, 12 e 13.[00123] As used herein, the term "cleavage region" refers to a region that is located immediately adjacent to the cleavage site. The cleavage site is the site on the target at which cleavage occurs. In some embodiments, the cleavage region comprises three bases at either end of, and immediately adjacent to, the cleavage site. In some embodiments, the cleavage region comprises two bases at either end of, and immediately adjacent to, the cleavage site. In some embodiments, the cleavage site occurs specifically at the site bound by nucleotides 10 and 11 of the antisense strand, and the cleavage region comprises nucleotides 11, 12, and 13.

[00124] Tal como aqui usado, e a menos que indicado de outra forma, o termo “complementar”, quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos em relação a uma segunda sequência de nucleotídeos, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou um polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucleotídeos de hibridizar e formar uma estrutura de duplex sob certas condições, com um oligonucleotídeo ou um polinucleotídeo que compreende a segunda sequência de nucleotídeos, tal como será entendido pelo versado na técnica. Tais condições podem, por exemplo, ser condições rigorosas, em que condições rigorosas podem incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50°C ou 70°C durante 12 a 16 horas, seguido de lavagem (ver, por exemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outras condições, como condições fisiologicamente relevantes que podem ser encontradas dentro de um organismo, podem ser aplicadas. O versado será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridizados.[00124] As used herein, and unless otherwise indicated, the term “complementary,” when used to describe a first nucleotide sequence relative to a second nucleotide sequence, refers to the ability of an oligonucleotide or a polynucleotide comprising the first nucleotide sequence to hybridize and form a duplex structure under certain conditions with an oligonucleotide or a polynucleotide comprising the second nucleotide sequence, as will be understood by one of skill in the art. Such conditions may, for example, be stringent conditions, where stringent conditions may include: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50°C or 70°C for 12 to 16 hours, followed by washing (see, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Other conditions, such as physiologically relevant conditions that might be found within an organism, may be applied. The skilled artisan will be able to determine the most appropriate set of conditions for a complementarity test of two sequences according to the final application of the hybridized nucleotides.

[00125] Sequências complementares dentro de um iRNA, por exemplo, dentro de um drRNA como aqui descrito, incluem pareamento de bases do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende uma primeira sequência de nucleotídeos a um oligonucleotídeo ou um polinucleotídeo que compreende uma segunda sequência de nucleotídeos ao longo de todo o comprimento das sequências de uma ou ambas as sequências de nucleotídeos. Tais sequências podem ser chamadas de “totalmente complementares” em relação umas às outras aqui. No entanto, quando uma primeira sequência é chamada de “substancialmente complementar” em relação a uma segunda sequência, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou podem formar um ou mais, mas geralmente não mais de 5, 4, 3, ou 2 pares de bases incompatíveis após a hibridização para um duplex de até 30 pares de bases, mantendo a capacidade de hibridizar sob as condições mais relevantes para a sua aplicação final, por exemplo, inibição da expressão de genes através de uma via de RISC. No entanto, quando dois oligonucleotídeos são projetados para formar, após hibridização, uma ou mais projeções de cadeia simples, tais projeções não devem ser consideradas como incompatibilidades no que se refere à determinação da complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo de 21 nucleotídeos de comprimento e outro oligonucleotídeo de 23 nucleotídeos de comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode ainda ser chamado de “totalmente complementar” para as finalidades aqui descritas.[00125] Complementary sequences within an iRNA, e.g., within a drRNA as described herein, include base pairing of the oligonucleotide or polynucleotide comprising a first nucleotide sequence to an oligonucleotide or polynucleotide comprising a second nucleotide sequence over the entire length of the sequences of one or both nucleotide sequences. Such sequences may be called "fully complementary" to each other herein. However, when a first sequence is called "substantially complementary" to a second sequence, the two sequences may be fully complementary, or may form one or more, but generally not more than 5, 4, 3, or 2, base pair mismatches upon hybridization to a duplex of up to 30 base pairs, while retaining the ability to hybridize under the conditions most relevant to their ultimate application, e.g., inhibition of gene expression through a RISC pathway. However, when two oligonucleotides are designed to form, upon hybridization, one or more single-stranded overhangs, such overhangs should not be considered mismatches for the purposes of determining complementarity. For example, a dsRNA comprising a 21-nucleotide-long oligonucleotide and another 23-nucleotide-long oligonucleotide, where the longer oligonucleotide comprises a 21-nucleotide sequence that is fully complementary to the shorter oligonucleotide, may still be termed "fully complementary" for the purposes described herein.

[00126] Sequências “complementares”, como aqui usadas, podem também incluir, ou ser formadas inteiramente a partir de pares de bases ou pares de bases não Watson-Crick formados a partir de nucleotídeos não naturais e modificados, na medida em que os requisitos acima em relação à sua capacidade de hibridizar são preenchidos. Tais pares de bases não Watson- Crick incluem, mas não estão limitados a, pareamento de bases G:U Wobble ou Hoogstein.[00126] “Complementary” sequences, as used herein, may also include, or be formed entirely from, non-Watson-Crick base pairs or base pairs formed from unnatural and modified nucleotides, provided that the above requirements regarding their ability to hybridize are met. Such non-Watson-Crick base pairs include, but are not limited to, G:U Wobble or Hoogstein base pairing.

[00127] Os termos “complementares”, “totalmente complementares” e “substancialmente complementares” aqui podem ser usados com relação à compatibilidade de bases entre a cadeia sentido e a cadeia antissentido de um dsRNA, ou entre a cadeia antissentido de um agente de RNAi de cadeia dupla e uma sequência alvo, como será entendido a partir do contexto de seu uso.[00127] The terms “complementary,” “fully complementary,” and “substantially complementary” herein may be used with respect to base compatibility between the sense strand and the antisense strand of a dsRNA, or between the antisense strand of a double-stranded RNAi agent and a target sequence, as will be understood from the context of their use.

[00128] Como aqui usado, um polinucleotídeo que é “substancialmente complementar a pelo menos parte de” um RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo,, um mRNA que codifica um gene PD-L1). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de PD-L1 se a sequência for substancialmente complementar a uma porção não interrompida de um mRNA que codifica um gene PD-L1.[00128] As used herein, a polynucleotide that is “substantially complementary to at least part of” a messenger RNA (mRNA) refers to a polynucleotide that is substantially complementary to a contiguous portion of the mRNA of interest (e.g., an mRNA encoding a PD-L1 gene). For example, a polynucleotide is complementary to at least a part of a PD-L1 mRNA if the sequence is substantially complementary to an uninterrupted portion of an mRNA encoding a PD-L1 gene.

[00129] Consequentemente, em algumas modalidades, os polinucleotídeos de cadeia sentido e os polinucleotídeos antissentido aqui descritos são totalmente complementares à sequência de PD-L1 alvo.[00129] Accordingly, in some embodiments, the sense strand polynucleotides and antisense polynucleotides described herein are fully complementary to the target PD-L1 sequence.

[00130] Em outras modalidades, os polinucleotídeos antissentido aqui descritos são substancialmente complementares à sequência de PD-L1 alvo e compreendem uma sequência de nucleotídeos contíguos que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO:1, ou um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1, tal como pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar ou 100% complementar.[00130] In other embodiments, the antisense polynucleotides described herein are substantially complementary to the target PD-L1 sequence and comprise a contiguous nucleotide sequence that is at least about 80% complementary over its entire length to the equivalent region of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO:1, or a fragment of any of SEQ ID NO:1, such as at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% complementary, or 100% complementary.

[00131] Em algumas modalidades, um iRNA da invenção inclui uma cadeia sentido que é substancialmente complementar a um polinucleotídeo antissentido, que, por sua vez, é complementar a uma sequência de PD-L1 alvo e compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos de qualquer uma das cadeias antissentido na Tabela 3 ou Tabela 5, ou um fragmento de qualquer uma das cadeias antissentido na Tabela 3 ou Tabela 5, tal como cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar ou 100% complementar.[00131] In some embodiments, an iRNA of the invention includes a sense strand that is substantially complementary to an antisense polynucleotide, which in turn is complementary to a target PD-L1 sequence and comprises a contiguous nucleotide sequence that is at least about 80% complementary over its entire length to the equivalent region of the nucleotide sequence of any of the antisense strands in Table 3 or Table 5, or a fragment of any of the antisense strands in Table 3 or Table 5, such as about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% complementary, or 100% complementary.

[00132] Em algumas modalidades, um iRNA da invenção inclui uma cadeia antissentido que é substancialmente complementar à sequência de PD- L1 alvo e compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos que é pelo menos 80% complementar ao longo de todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos de qualquer uma das cadeias sentido na Tabela 3 ou 5, ou um fragmento de qualquer uma das cadeias sentido na Tabela 3 ou 5, tal como cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar ou 100% complementar.[00132] In some embodiments, an iRNA of the invention includes an antisense strand that is substantially complementary to the target PD-L1 sequence and comprises a contiguous nucleotide sequence that is at least 80% complementary over its entire length to the equivalent region of the nucleotide sequence of any of the sense strands in Table 3 or 5, or a fragment of any of the sense strands in Table 3 or 5, such as about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% complementary, or 100% complementary.

[00133] Em um aspecto da invenção, um agente para uso nos métodos e composições da invenção é uma molécula de oligonucleotídeo antissentido de cadeia simples que inibe um mRNA alvo através de um mecanismo de inibição antissentido. A molécula de oligonucleotídeo antissentido de cadeia simples é complementar a uma sequência dentro do mRNA alvo. Os oligonucleotídeos antissentido de cadeia simples podem inibir a tradução de uma maneira estequiométrica por pareamento de bases com o mRNA e obstruir fisicamente a maquinaria de tradução, ver Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. A molécula de oligonucleotídeo antissentido de cadeia simples pode ter cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento e ter uma sequência que é complementar a uma sequência alvo. Por exemplo, a molécula de oligonucleotídeo antissentido de cadeia simples pode compreender uma sequência que tem pelo menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências antissentido aqui descritas.[00133] In one aspect of the invention, an agent for use in the methods and compositions of the invention is a single-stranded antisense oligonucleotide molecule that inhibits a target mRNA through an antisense inhibition mechanism. The single-stranded antisense oligonucleotide molecule is complementary to a sequence within the target mRNA. Single-stranded antisense oligonucleotides can inhibit translation in a stoichiometric manner by base-pairing with the mRNA and physically obstructing the translation machinery, see Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. The single-stranded antisense oligonucleotide molecule can be about 14 to about 30 nucleotides in length and have a sequence that is complementary to a target sequence. For example, the single-stranded antisense oligonucleotide molecule can comprise a sequence that is at least 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or more contiguous nucleotides of any of the antisense sequences described herein.

[00134] A frase “colocar uma célula em contato com um iRNA”, tal como um dsRNA, tal como aqui usado, inclui contactar uma célula por qualquer meio possível. Colocar uma célula em contato com um iRNA inclui o contato de uma célula in vitro com o iRNA ou o contato de uma célula in vivo com o iRNA. O contato pode ser feito direta ou indiretamente. Assim, por exemplo, o iRNA pode ser colocado em contato físico com a célula pelo indivíduo que executa o método, ou alternativamente, o iRNA pode ser colocado em uma situação que permitirá ou fará com que subsequentemente entre em contato com a célula.[00134] The phrase “contacting a cell with an iRNA,” such as a dsRNA, as used herein, includes contacting a cell by any means possible. Contacting a cell with an iRNA includes contacting a cell in vitro with the iRNA or contacting a cell in vivo with the iRNA. The contact may be made directly or indirectly. Thus, for example, the iRNA may be placed in physical contact with the cell by the individual performing the method, or alternatively, the iRNA may be placed in a situation that will allow or cause it to subsequently contact the cell.

[00135] O contato de uma célula in vitro pode ser feito, por exemplo, por incubação da célula com o iRNA. O contato de uma célula in vivo pode ser feito, por exemplo, por injeção do iRNA no ou próximo do tecido onde a célula está localizada, ou injeção do iRNA em outra área, por exemplo, na corrente sanguínea ou no espaço subcutâneo, de tal modo que o agente subsequentemente alcançará o tecido onde a célula a ser contactada está localizada. Por exemplo, o iRNA pode conter ou ser acoplado a um ligante, por exemplo, GalNAc, por exemplo, GalNAc3, que direciona o iRNA para um sítio de interesse, por exemplo, o fígado. Combinações de métodos in vitro e in vivo de contato também são possíveis. Por exemplo, uma célula pode também ser contactada in vitro com um iRNA e subsequentemente transplantada em um indivíduo.[00135] Contacting a cell in vitro can be done, for example, by incubating the cell with the iRNA. Contacting a cell in vivo can be done, for example, by injecting the iRNA into or near the tissue where the cell is located, or injecting the iRNA into another area, for example, into the bloodstream or subcutaneous space, such that the agent will subsequently reach the tissue where the cell to be contacted is located. For example, the iRNA can contain or be coupled to a ligand, for example, GalNAc, e.g., GalNAc3, that directs the iRNA to a site of interest, for example, the liver. Combinations of in vitro and in vivo methods of contacting are also possible. For example, a cell can also be contacted in vitro with an iRNA and subsequently transplanted into an individual.

[00136] Em certas modalidades, o contato de uma célula com um iRNA inclui “introdução” ou “dispensação do iRNA para dentro da célula”, facilitando ou efetuando a captação ou a absorção para dentro da célula. A captação ou absorção de um iRNA pode ocorrer através de difusão sem ajuda ou processos celulares ativos, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. A introdução de um iRNA em uma célula pode ser in vitro ou in vivo. Por exemplo, para introdução in vivo, o iRNA pode ser injetado em um sítio do tecido ou administrado sistemicamente. A dispensação in vivo pode também ser feita por um sistema de dispensação de beta-glucano, tais como os descritos nas Patentes US Nos. 5.032.401 e 5.607.677, e na Publicação US No. 2005/0281781, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. A introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica, tais como eletroporação e lipofecção. Outras abordagens são descritas abaixo ou são conhecidas na técnica.[00136] In certain embodiments, contacting a cell with an iRNA includes “introducing” or “dispensing the iRNA into the cell,” facilitating or effecting uptake or absorption into the cell. Uptake or absorption of an iRNA can occur through unaided diffusion or active cellular processes, or by ancillary agents or devices. Introduction of an iRNA into a cell can be in vitro or in vivo. For example, for in vivo introduction, the iRNA can be injected into a tissue site or administered systemically. In vivo delivery can also be accomplished by a beta-glucan delivery system, such as those described in U.S. Patent Nos. 5,032,401 and 5,607,677, and in U.S. Publication No. 2005/0281781, the entire contents of which are incorporated herein by reference. In vitro introduction into a cell includes methods known in the art, such as electroporation and lipofection. Other approaches are described below or are known in the art.

[00137] O termo “nanopartícula lipídica” ou “LNP” é uma vesícula que compreende uma camada lipídica que encapsula uma molécula farmaceuticamente ativa, tal como uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um iRNA ou um plasmídeo do qual um iRNA é transcrito. As LNPs são descritas, por exemplo, nas Patentes US Nos. 6.858.225, 6.815.432, 8.158.601 e 8.058.069, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.[00137] The term “lipid nanoparticle” or “LNP” is a vesicle comprising a lipid layer that encapsulates a pharmaceutically active molecule, such as a nucleic acid molecule, e.g., an iRNA or a plasmid from which an iRNA is transcribed. LNPs are described, for example, in U.S. Patent Nos. 6,858,225, 6,815,432, 8,158,601, and 8,058,069, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

[00138] Como usado aqui, um “indivíduo” é um animal, tal como um mamífero, incluindo um primata (tal como um humano, um primata não humano, por exemplo, um macaco e um chimpanzé), um não primata (tal como uma vaca, porco, camelo, lhama, cavalo, cabra, coelho, ovelha, hamster, porquinho-da-Índia, gato, cachorro, rato, camundongo, cavalo e baleia), ou uma ave (por exemplo, um pato ou um ganso) que expresse o gene alvo, seja endogenamente ou heterologamente, quando a sequência do gene alvo tem complementaridade suficiente ao agente de iRNA para promover o knockdown(redução da expressão) do alvo. Em certas modalidades, o indivíduo é um humano, tal como um ser humano sendo tratado ou avaliado quanto a uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução na expressão ou replicação do gene PD-L1; um humano em risco de uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução na expressão do gene PD-L1; um humano com uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução da expressão do gene PD-L1; ou humano tratado para uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução na expressão do gene PD-L1, como aqui descrito. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma mulher. Em outras modalidades, o indivíduo é um homem.[00138] As used herein, a “subject” is an animal, such as a mammal, including a primate (such as a human, a non-human primate, e.g., a monkey and a chimpanzee), a non-primate (such as a cow, pig, camel, llama, horse, goat, rabbit, sheep, hamster, guinea pig, cat, dog, rat, mouse, horse, and whale), or a bird (e.g., a duck or a goose) that expresses the target gene, either endogenously or heterologously, when the sequence of the target gene has sufficient complementarity to the iRNA agent to promote knockdown of the target. In certain embodiments, the subject is a human, such as a human being treated or evaluated for a disease, disorder, or condition that would benefit from reduction in the expression or replication of the PD-L1 gene; a human at risk for a disease, disorder, or condition that would benefit from reduction in the expression of the PD-L1 gene; a human with a disease, disorder, or condition that would benefit from reducing PD-L1 gene expression; or a human treated for a disease, disorder, or condition that would benefit from reducing PD-L1 gene expression, as described herein. In some embodiments, the individual is a woman. In other embodiments, the individual is a man.

[00139] Como aqui usado, os termos “tratando” ou “tratamento” referem-se a um resultado benéfico ou desejado incluindo, mas não limitado a alívio ou melhora de um ou mais sintomas associados à expressão do gene PD-L1 ou produção de proteína PD-L1, por exemplo, infecção, especialmente uma infecção intracelular crônica, por exemplo, uma infecção viral crônica ou câncer. “Tratamento” também pode significar o prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada na ausência de tratamento. O tratamento pode incluir a prevenção do desenvolvimento de comorbidades, por exemplo, redução da lesão hepática em um indivíduo com uma infecção hepática.[00139] As used herein, the terms “treating” or “treatment” refer to a beneficial or desired outcome including, but not limited to, alleviation or improvement of one or more symptoms associated with PD-L1 gene expression or PD-L1 protein production, e.g., infection, especially a chronic intracellular infection, e.g., a chronic viral infection, or cancer. “Treatment” may also mean prolonging survival compared to survival expected in the absence of treatment. Treatment may include preventing the development of comorbidities, e.g., reducing liver injury in an individual with a liver infection.

[00140] O termo “inferior” no contexto do nível de expressão do gene PD-L1 ou produção de proteína PD-L1 em um indivíduo, ou um marcador de doença ou sintoma, refere-se a uma diminuição estatisticamente significativa em tal nível. A diminuição pode ser, por exemplo, pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90% ou 95%, em comparação com um controle apropriado, ou abaixo do nível de detecção para o método de detecção. Em certas modalidades, a expressão do alvo é normalizada, isto é, diminuída para um nível aceito como dentro da faixa normal para um indivíduo sem tal distúrbio. Em certas modalidades, os métodos incluem uma inibição clinicamente relevante da expressão de PD-L1, por exemplo, como demonstrado por um resultado clinicamente relevante após tratamento de um indivíduo com um agente para reduzir a expressão de PD-L1.[00140] The term “lower” in the context of the level of PD-L1 gene expression or PD-L1 protein production in an individual, or a marker of disease or symptom, refers to a statistically significant decrease in such a level. The decrease may be, for example, at least 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, compared to an appropriate control, or below the level of detection for the detection method. In certain embodiments, the expression of the target is normalized, i.e., decreased to a level accepted as within the normal range for an individual without such a disorder. In certain embodiments, the methods include a clinically relevant inhibition of PD-L1 expression, e.g., as demonstrated by a clinically relevant outcome following treatment of a subject with an agent to reduce PD-L1 expression.

[00141] Como aqui usado, o termo “Doença associada a ligante 1 de morte celular programada 1” ou “doença associada a PD-L1” é uma doença ou distúrbio que é causado por, ou associado à expressão do gene PD-L1 ou produção de proteína PD-L1. O termo “doença associada a PD-L1” inclui uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria de uma diminuição na expressão do gene PD-L1, replicação, ou atividade da proteína. Exemplos não limitativos de doenças associadas a PD-L1 incluem, por exemplo, infecção, especialmente uma infecção intracelular crônica, por exemplo, infecção viral, por exemplo, infecção por hepatite, ou câncer.[00141] As used herein, the term “Programmed cell death ligand 1-associated disease” or “PD-L1-associated disease” is a disease or disorder that is caused by, or associated with, the expression of the PD-L1 gene or production of the PD-L1 protein. The term “PD-L1-associated disease” includes a disease, disorder, or condition that would benefit from a decrease in PD-L1 gene expression, replication, or protein activity. Non-limiting examples of PD-L1-associated diseases include, for example, infection, especially a chronic intracellular infection, e.g., viral infection, e.g., hepatitis infection, or cancer.

[00142] Em certas modalidades, uma doença associada a PD-L1 é infecção, especialmente uma infecção intracelular crônica, por exemplo, infecção viral, por exemplo, infecção por vírus da hepatite, por exemplo, infecção por hepatite B ou infecção por hepatite D. Em certas modalidades, a infecção é uma infecção bacteriana crônica, por exemplo, tuberculose. Em certas modalidades, uma doença associada a PD-L1 é câncer, especialmente câncer de fígado, por exemplo, carcinoma hepatocelular (CHC).[00142] In certain embodiments, a PD-L1-associated disease is infection, especially a chronic intracellular infection, e.g., viral infection, e.g., hepatitis virus infection, e.g., hepatitis B infection or hepatitis D infection. In certain embodiments, the infection is a chronic bacterial infection, e.g., tuberculosis. In certain embodiments, a PD-L1-associated disease is cancer, especially liver cancer, e.g., hepatocellular carcinoma (HCC).

[00143] “Quantidade terapeuticamente eficaz”, como usado aqui, pretende incluir a quantidade de um iRNA que, quando administrado a um paciente para tratamento de um indivíduo com uma infecção, especialmente uma infecção intracelular crônica, ou câncer, ou outra doença associada a PD- L1, é suficiente para efetuar o tratamento da doença (por exemplo, diminuindo, melhorando ou mantendo a doença existente ou um ou mais sintomas de doença ou suas comorbidades relacionadas). A “quantidade terapeuticamente eficaz” pode variar dependendo do iRNA, como é administrada, a doença e sua gravidade e o histórico, idade, peso, histórico familiar, composição genética, estágio dos processos patológicos mediados pela expressão do gene PD-L1, tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se houver, e outras características individuais do paciente a ser tratado.[00143] “Therapeutically effective amount,” as used herein, is intended to include the amount of an iRNA that, when administered to a patient for treatment of an individual with an infection, especially a chronic intracellular infection, or cancer, or other PD-L1-associated disease, is sufficient to effect treatment of the disease (e.g., decreasing, ameliorating, or maintaining existing disease or one or more symptoms of disease or its related comorbidities). The “therapeutically effective amount” may vary depending on the iRNA, how it is administered, the disease and its severity, and the history, age, weight, family history, genetic makeup, stage of the pathological processes mediated by PD-L1 gene expression, types of preceding or concomitant treatments, if any, and other individual characteristics of the patient being treated.

[00144] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” também inclui uma quantidade de um iRNA que produz algum efeito local ou sistêmico desejado a uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento. Os iRNA utilizados nos métodos da presente invenção podem ser administrados em uma quantidade suficiente para produzir uma razão benefício/risco razoável aplicável a esse tratamento. Uma quantidade terapeuticamente eficaz inclui uma quantidade que resulta em uma alteração ou estabilização clinicamente relevante, conforme apropriado, de um indicador de uma doença ou condição.[00144] A “therapeutically effective amount” also includes an amount of an iRNA that produces some desired local or systemic effect at a reasonable benefit/risk ratio applicable to any treatment. The iRNAs used in the methods of the present invention can be administered in an amount sufficient to produce a reasonable benefit/risk ratio applicable to such treatment. A therapeutically effective amount includes an amount that results in a clinically relevant change or stabilization, as appropriate, of an indicator of a disease or condition.

[00145] A frase “farmaceuticamente aceitável” é aqui utilizada para se referir aos compostos, materiais, composições, ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do juízo médico sólido, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão benefício/risco razoável.[00145] The phrase “pharmaceutically acceptable” is used herein to refer to compounds, materials, compositions, or dosage forms that are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, or other problem or complication, commensurate with a reasonable benefit/risk ratio.

[00146] A frase “carreador farmaceuticamente aceitável” tal como usado aqui significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco magnésio, estearato de cálcio ou zinco, ou ácido estérico), ou material encapsulante de solvente, envolvido no carreamento ou transporte do composto em questão de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o indivíduo a ser tratado. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estado de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênios; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e aminoácidos; (23) componente sérico, tal como albumina sérica, HDL e LDL; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas.[00146] The phrase “pharmaceutically acceptable carrier” as used herein means a pharmaceutically acceptable material, composition, or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, excipient, manufacturing aid (e.g., lubricant, magnesium talc, calcium or zinc stearate, or steric acid), or solvent encapsulating material, involved in the carrying or transport of the compound in question from one organ or portion of the body to another organ or portion of the body. Each carrier must be “acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation and not harmful to the individual being treated. Some examples of materials that may serve as pharmaceutically acceptable carriers include: (1) sugars, such as lactose, glucose, and sucrose; (2) starches, such as cornstarch and potato starch; (3) cellulose and its derivatives, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose, and cellulose acetate; (4) tragacanth powder; (5) malt; (6) gelatin; (7) lubricating agents, such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc; (8) excipients, such as cocoa butter and suppository waxes; (9) oils, such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil; (10) glycols, such as propylene glycol; (11) polyols, such as glycerin, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol; (12) esters, such as ethyl oleate and ethyl laurate; (13) agar; (14) buffering agents, such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; (15) alginic acid; (16) pyrogen-free water; (17) isotonic saline; (18) Ringer's solution; (19) ethyl alcohol; (20) pH buffered solutions; (21) polyesters, polycarbonates and/or polyanhydrides; (22) bulking agents such as polypeptides and amino acids; (23) serum component such as serum albumin, HDL and LDL; and (22) other compatible non-toxic substances used in pharmaceutical formulations.

[00147] O termo “amostra”, como usado aqui, inclui uma coleção de fluidos, células ou tecidos similares isolados de um indivíduo, assim como fluidos, células ou tecidos presentes dentro de um indivíduo. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, líquido cefalorraquidiano, fluidos oculares, linfa, urina, saliva e semelhantes. Amostras de tecidos podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, as amostras podem ser derivadas de órgãos, partes de órgãos ou fluidos ou células particulares dentro desses órgãos. Em certas modalidades, as amostras podem ser derivadas do fígado (por exemplo, fígado inteiro ou certos segmentos do fígado ou certos tipos de células no fígado, tais como, por exemplo, hepatócitos). Uma “amostra derivada de um indivíduo” pode se referir ao sangue extraído do indivíduo, ou plasma derivado do mesmo. Em certas modalidades, ao detectar um nível de PD-L1, uma “amostra” refere-se preferivelmente a um tecido ou fluido corporal de um indivíduo, em que PD-L1 é detectável antes da administração de um agente da invenção, por exemplo, uma biópsia do fígado de um indivíduo com uma infecção hepática, uma biópsia tumoral. Em certos indivíduos, por exemplo, indivíduos saudáveis, o nível de PD-L1 pode não ser detectável em vários fluidos corporais, tipos de células e tecidos.[00147] The term “sample,” as used herein, includes a collection of fluids, cells, or similar tissues isolated from an individual, as well as fluids, cells, or tissues present within an individual. Examples of biological fluids include blood, serum and serous fluids, plasma, cerebrospinal fluid, ocular fluids, lymph, urine, saliva, and the like. Tissue samples may include samples from tissues, organs, or localized regions. For example, samples may be derived from organs, parts of organs, or particular fluids or cells within such organs. In certain embodiments, samples may be derived from the liver (e.g., whole liver or certain segments of the liver, or certain types of cells within the liver, such as, for example, hepatocytes). A “sample derived from an individual” may refer to blood drawn from the individual, or plasma derived from the individual. In certain embodiments, when detecting a level of PD-L1, a "sample" preferably refers to a tissue or bodily fluid from an individual, wherein PD-L1 is detectable prior to administration of an agent of the invention, e.g., a liver biopsy from an individual with a liver infection, a tumor biopsy. In certain individuals, e.g., healthy individuals, the level of PD-L1 may not be detectable in various bodily fluids, cell types, and tissues.

a. iRNAs da invençãoa. iRNAs of the invention

[00148] A presente invenção provê iRNAs que inibem a expressão de um gene PD-L1. Em modalidades preferidas, o iRNA inclui moléculas de ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsRNA) para inibir a expressão de um gene DP-L1 em uma célula, tal como uma célula dentro de um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tal como um humano com uma doença associada a PD-L1, por exemplo, uma infecção crônica. O agente de dsRNAi inclui uma cadeia antissentido com uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene PD-L1. A região de complementaridade tem cerca de 30 nucleotídeos ou menos de comprimento (por exemplo, cerca de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 ou 18 nucleotídeos ou menos de comprimento). Em contato com uma célula que expressa o gene PD-L1, o iRNA inibe a expressão do gene PD-L1 (por exemplo, um gene PD-L1 de um humano, um primata, um não primata ou um pássaro) em pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 30%, como ensaiado, por exemplo, por um modo baseado em PCR ou DNA ramificado (bDNA) ou por um modo baseado em proteína, tal como por análise de imunofluorescência, usando, por exemplo, Western blotting ou técnicas de citometria de fluxo. Em modalidades preferidas, a inibição da expressão é determinada pelo método qPCR provido nos exemplos, por exemplo, a uma concentração de 10 nM do duplex. O nível de redução pode ser comparado a, por exemplo, um controle histórico apropriado ou um controle de amostra de população agrupada.[00148] The present invention provides iRNAs that inhibit the expression of a PD-L1 gene. In preferred embodiments, the iRNA includes double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecules to inhibit the expression of a PD-L1 gene in a cell, such as a cell within an individual, e.g., a mammal, such as a human, with a PD-L1-associated disease, e.g., a chronic infection. The dsRNAi agent includes an antisense strand with a region of complementarity that is complementary to at least a portion of an mRNA formed in the expression of a PD-L1 gene. The region of complementarity is about 30 nucleotides or less in length (e.g., about 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, or 18 nucleotides or less in length). Upon contact with a cell expressing the PD-L1 gene, the iRNA inhibits the expression of the PD-L1 gene (e.g., a PD-L1 gene from a human, a primate, a non-primate, or a bird) by at least about 20%, preferably at least 30%, as assayed, for example, by a PCR- or branched DNA (bDNA)-based method or by a protein-based method, such as by immunofluorescence analysis, using, for example, Western blotting or flow cytometry techniques. In preferred embodiments, the inhibition of expression is determined by the qPCR method provided in the examples, for example, at a 10 nM concentration of the duplex. The level of reduction can be compared to, for example, an appropriate historical control or a pooled population sample control.

[00149] Um dsRNA inclui duas cadeias de RNA que são complementares e hibridizam para formar uma estrutura de duplex sob condições nas quais o dsRNA será usado. Uma cadeia de um dsRNA (a cadeia antissentido) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e geralmente totalmente complementar, a uma sequência alvo. A sequência alvo pode ser derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene PD-L1. A outra cadeia (a cadeia sentido) inclui uma região que é complementar à cadeia antissentido, de tal modo que as duas cadeias hibridizam e formam uma estrutura de duplex quando combinadas sob condições adequadas. Como aqui descrito em um outro local e como conhecido na técnica, as sequências complementares de um dsRNA podem também estar contidas como regiões autocomplementares de uma única molécula de ácido nucleico, ao contrário de estarem em oligonucleotídeos separados.[00149] A dsRNA includes two RNA strands that are complementary and hybridize to form a duplex structure under conditions in which the dsRNA will be used. One strand of a dsRNA (the antisense strand) includes a region of complementarity that is substantially complementary, and generally fully complementary, to a target sequence. The target sequence may be derived from the sequence of an mRNA formed during expression of a PD-L1 gene. The other strand (the sense strand) includes a region that is complementary to the antisense strand, such that the two strands hybridize and form a duplex structure when combined under suitable conditions. As described elsewhere herein and as known in the art, the complementary sequences of a dsRNA may also be contained as self-complementary regions of a single nucleic acid molecule, as opposed to being on separate oligonucleotides.

[00150] Geralmente, a estrutura de duplex tem cerca de 15 a 30 pares de bases de comprimento, por exemplo, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, ou 21 a 22 pares de bases de comprimento. As faixas e comprimentos intermediários para as faixas e comprimentos indicados acima são também considerados como parte da invenção.[00150] Generally, the duplex structure is about 15 to 30 base pairs in length, e.g., 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19 to 28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24, 20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23, or 21 to 22 base pairs in length. Intermediate ranges and lengths to the ranges and lengths indicated above are also considered to be part of the invention.

[00151] De modo similar, a região de complementaridade à sequência alvo tem cerca de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento. As faixas e comprimentos intermediários para as faixas e comprimentos indicados acima são também considerados como parte da invenção.[00151] Similarly, the region of complementarity to the target sequence is about 15 to 30 nucleotides in length, e.g., 15 to 29, 15 to 28, 15 to 27, 15 to 26, 15 to 25, 15 to 24, 15 to 23, 15 to 22, 15 to 21, 15 to 20, 15 to 19, 15 to 18, 15 to 17, 18 to 30, 18 to 29, 18 to 28, 18 to 27, 18 to 26, 18 to 25, 18 to 24, 18 to 23, 18 to 22, 18 to 21, 18 to 20, 19 to 30, 19 to 29, 19 to 28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24, 20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23, or 21 to 22 nucleotides in length. Intermediate ranges and lengths to the ranges and lengths indicated above are also considered to be part of the invention.

[00152] Em algumas modalidades, o dsRNA tem cerca de 15 a 23 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 25 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em geral, o dsRNA é longo o suficiente para servir como substrato para a enzima Dicer. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que dsRNA com comprimento maior que 21 a 23 nucleotídeos de comprimento podem servir como substratos para Dicer. Como a pessoa versada também reconhecerá, a região de um RNA alvejado para clivagem será na maior parte das vezes parte de uma molécula de RNA maior, frequentemente uma molécula de mRNA. Quando relevante, uma “parte” de um alvo de mRNA é uma sequência contígua de um alvo de mRNA de comprimento suficiente para permitir que seja um substrato para clivagem direcionada por RNAi (isto é, clivagem através de uma via de RISC).[00152] In some embodiments, the dsRNA is about 15 to 23 nucleotides in length or about 25 to 30 nucleotides in length. In general, the dsRNA is long enough to serve as a substrate for the enzyme Dicer. For example, it is well known in the art that dsRNA greater than 21 to 23 nucleotides in length can serve as substrates for Dicer. As the skilled person will also recognize, the region of an RNA targeted for cleavage will most often be part of a larger RNA molecule, often an mRNA molecule. Where relevant, a “part” of an mRNA target is a contiguous sequence of an mRNA target of sufficient length to allow it to be a substrate for RNAi-directed cleavage (i.e., cleavage via a RISC pathway).

[00153] Um versado na técnica reconhecerá também que a região de duplex é uma porção funcional primária de um dsRNA, por exemplo, uma região de duplex de cerca de 9 a cerca de 36 pares de bases, por exemplo, 10 a 36, 11 a 36, 12 a 36, 13 a 36, 14 a 36, 15 a 36, 9 a 35, 10 a 35, 11 a 35, 12 a 35, 13 a 35, 14 a 35, 15 a 35, 9 a 34, 10 a 34, 11 a 34, 12 a 34, 13 a 34, 14 a 34, 15 a 34, 9 a 33, 10 a 33, 11 a 33, 12 a 33, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 9 a 32, 10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 32, 14 a 32, 15 a 32, 9 a 31, 10 a 31, 11 a 31, 12 a 31, 13 a 32, 14 a 31, 15 a 31, 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, ou 21 a 22 pares de bases. Assim, em uma modalidade, na medida em que se torna processado para um duplex funcional, por exemplo, 15 a 30 pares de bases, que tem como alvo um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA com uma região de duplex maior que 30 pares de bases é um dsRNA. Assim, um versado na técnica reconhecerá que, em uma modalidade, um miRNA é um dsRNA. Em uma outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, um agente de iRNA útil para alvejar a expressão do gene PD-L1 não é gerado na célula alvo por clivagem de um dsRNA maior.[00153] One of skill in the art will also recognize that the duplex region is a primary functional portion of a dsRNA, e.g., a duplex region of about 9 to about 36 base pairs, e.g., 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-3 ... 33, 13 to 33, 14 to 33, 15 to 33, 9 to 32, 10 to 32, 11 to 32, 12 to 32, 13 to 32, 14 to 32, 15 to 32, 9 to 31, 10 to 31, 11 to 31, 12 to 31, 13 to 32, 14 to 31, 15 to 31, 15 to 30, 15 to 29, 15 to 28, 15 to 27, 15 to 26, 15 to 25, 15 to 24, 15 to 23, 15 to 22, 15 to 21, 15 to 20, 15 to 19, 15 to 18, 15 to 17, 18 to 30, 18 to 29, 18 to 28, 18 to 27, 18 to 26, 18 to 25, 18 to 24, 18 to 23, 18 to 22, 18 to 21, 18 to 20, 19 to 30, 19 to 29, 19 to 28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24,20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23, or 21 to 22 base pairs. Thus, in one embodiment, to the extent that it becomes processed to a functional duplex, e.g., 15 to 30 base pairs, that targets a desired RNA for cleavage, an RNA molecule or complex of RNA molecules with a duplex region greater than 30 base pairs is a dsRNA. Thus, one of skill in the art will recognize that, in one embodiment, a miRNA is a dsRNA. In another embodiment, a dsRNA is not a naturally occurring miRNA. In another embodiment, an iRNA agent useful for targeting PD-L1 gene expression is not generated in the target cell by cleavage of a larger dsRNA.

[00154] Um dsRNA como aqui descrito pode incluir adicionalmente uma ou mais projeções de nucleotídeos de cadeia simples, por exemplo, 1 a 4, 2 a 4, 1 a 3, 2 a 3, 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos. Os dsRNA com pelo menos uma projeção de nucleotídeos podem ter propriedades inibidoras superiores em relação às suas contrapartes de extremidade cega. Uma projeção de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) projeção(ões) pode(m) estar na cadeia sentido, na cadeia antissentido ou em qualquer combinação das mesmas. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma projeção podem estar presentes na extremidade 5', na extremidade 3', ou em ambas as extremidades de uma cadeia antissentido ou sentido de um dsRNA.[00154] A dsRNA as described herein may further include one or more single-stranded nucleotide overhangs, e.g., 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, 1, 2, 3, or 4 nucleotides. dsRNAs with at least one nucleotide overhang may have superior inhibitory properties relative to their blunt-ended counterparts. A nucleotide overhang may comprise or consist of a nucleotide/nucleoside analog, including a deoxynucleotide/nucleoside. The overhang(es) may be on the sense strand, the antisense strand, or any combination thereof. Furthermore, the nucleotide(s) of an overhang may be present at the 5' end, the 3' end, or both ends of an antisense or sense strand of a dsRNA.

[00155] Um dsRNA pode ser sintetizado por métodos padrão conhecidos na técnica, como discutido adicionalmente abaixo, por exemplo, através do uso de um sintetizador de DNA automático, tal como estão disponíveis comercialmente junto à, por exemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.[00155] A dsRNA can be synthesized by standard methods known in the art, as discussed further below, for example, through the use of an automated DNA synthesizer, such as are commercially available from, for example, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.

[00156] Os compostos de RNAi de cadeia dupla da invenção podem ser preparados usando um procedimento de duas etapas. Primeiro, as cadeias individuais da molécula de RNA de cadeia dupla são preparadas separadamente. Então, os componentes são enovelados. As cadeias individuais do composto de siRNA podem ser preparadas usando síntese orgânica em fase de solução ou em fase sólida ou ambas. A síntese orgânica oferece a vantagem de que as cadeias de oligonucleotídeos compreendendo nucleotídeos não naturais ou modificados podem ser facilmente preparadas. De modo similar, os oligonucleotídeos de cadeia simples da invenção podem ser preparados usando síntese orgânica em fase de solução ou em fase sólida ou em ambas.[00156] The double-stranded RNAi compounds of the invention can be prepared using a two-step procedure. First, the individual strands of the double-stranded RNA molecule are prepared separately. Then, the components are folded. The individual strands of the siRNA compound can be prepared using solution-phase or solid-phase organic synthesis, or both. Organic synthesis offers the advantage that oligonucleotide strands comprising unnatural or modified nucleotides can be readily prepared. Similarly, the single-stranded oligonucleotides of the invention can be prepared using solution-phase or solid-phase organic synthesis, or both.

[00157] Em um aspecto, um dsRNA da invenção inclui pelo menos duas sequências de nucleotídeos, uma sequência sentido e uma sequência antissentido. A cadeia sentido é selecionada do grupo de sequências provido nas Tabelas 3 e 5, e a cadeia antissentido correspondente da cadeia sentido é selecionada do grupo de sequências das Tabelas 3 e 5. Nesse aspecto, uma das duas sequências é complementar à outra das duas sequências, uma das sequências sendo substancialmente complementar a uma sequência de um mRNA gerado na expressão de um gene PD-L1. Como tal, nesse aspecto, um dsRNA incluirá dois oligonucleotídeos, onde um oligonucleotídeo é descrito como a cadeia sentido na Tabela 3 ou 5, e o segundo oligonucleotídeo é descrito como a cadeia antissentido correspondente da cadeia sentido na Tabela 3 ou 5. Em certas modalidades, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em oligonucleotídeos separados. Em outras modalidades, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em um único oligonucleotídeo.[00157] In one aspect, a dsRNA of the invention includes at least two nucleotide sequences, a sense sequence and an antisense sequence. The sense strand is selected from the group of sequences provided in Tables 3 and 5, and the corresponding antisense strand of the sense strand is selected from the group of sequences in Tables 3 and 5. In this aspect, one of the two sequences is complementary to the other of the two sequences, one of the sequences being substantially complementary to a sequence of an mRNA generated upon expression of a PD-L1 gene. As such, in this aspect, a dsRNA will include two oligonucleotides, where one oligonucleotide is described as the sense strand in Table 3 or 5, and the second oligonucleotide is described as the corresponding antisense strand of the sense strand in Table 3 or 5. In certain embodiments, the substantially complementary sequences of the dsRNA are contained in separate oligonucleotides. In other embodiments, substantially complementary sequences of the dsRNA are contained in a single oligonucleotide.

[00158] Será entendido que, embora as sequências na Tabela 3 não sejam descritas como sequências modificadas ou conjugadas, o RNA do iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA da invenção, pode compreender qualquer uma das sequências estabelecidas na Tabela 3, ou as sequências da Tabela 5 que são modificadas, ou as sequências da Tabela 5 que são conjugadas. Em outras palavras, a invenção engloba dsRNA das Tabelas 3 e 5 que são não modificadas, não conjugadas, modificadas ou conjugadas, como descrito aqui.[00158] It will be understood that although the sequences in Table 3 are not described as modified or conjugated sequences, the iRNA RNA of the invention, e.g., a dsRNA of the invention, may comprise any of the sequences set forth in Table 3, or the sequences in Table 5 that are modified, or the sequences in Table 5 that are conjugated. In other words, the invention encompasses dsRNA of Tables 3 and 5 that are unmodified, unconjugated, modified, or conjugated, as described herein.

[00159] A pessoa versada está bem ciente de que dsRNAs com uma estrutura de duplex entre cerca de 20 e 23 pares de bases, por exemplo, 21, pares de bases foram apontados como particularmente eficazes na indução de interferência de RNA (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). No entanto, outros verificaram que estruturas de duplex de RNA mais curtas ou mais longas também podem ser eficazes (Chu and Rana (2007) RNA 14:17141719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências de nucleotídeos providas em qualquer uma das Tabelas 3 e 5, os dsRNA aqui descritos podem incluir pelo menos uma cadeia com um comprimento mínimo de 21 nucleotídeos. Pode ser razoavelmente esperado que os duplexes mais curtos com uma das sequências das Tabelas 3 e 5 menos apenas alguns nucleotídeos em uma ou em ambas as extremidades podem ser igualmente eficazes quando comparados com os dsRNAs descritos acima. Assim, dsRNAs tendo uma sequência de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotídeos contíguos derivados de uma das sequências das Tabelas 3 e 5, e diferindo em sua capacidade de inibir a expressão de um gene PD-L1 não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20, 25 ou 30% de inibição de um dsRNA compreendendo a sequência completa, estão contemplados como estando dentro do escopo da presente invenção.[00159] The skilled person is well aware that dsRNAs with a duplex structure between about 20 and 23 base pairs, e.g., 21, base pairs have been found to be particularly effective in inducing RNA interference (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). However, others have found that shorter or longer RNA duplex structures may also be effective (Chu and Rana (2007) RNA 14:17141719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). In the embodiments described above, by virtue of the nature of the nucleotide sequences provided in any of Tables 3 and 5, the dsRNAs described herein may include at least one chain with a minimum length of 21 nucleotides. It can be reasonably expected that shorter duplexes having one of the sequences in Tables 3 and 5 minus only a few nucleotides at one or both ends may be equally effective when compared to the dsRNAs described above. Thus, dsRNAs having a sequence of at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, or more contiguous nucleotides derived from one of the sequences in Tables 3 and 5, and differing in their ability to inhibit the expression of a PD-L1 gene by no more than about 5, 10, 15, 20, 25, or 30% inhibition of a dsRNA comprising the full-length sequence, are contemplated as being within the scope of the present invention.

[00160] Além disso, os RNAs providos nas Tabelas 3 e 5 identificam um sítio(s) em um transcrito de PD-L1 que é suscetível a clivagem mediada por RISC. Como tal, a presente invenção apresenta adicionalmente iRNAs que alvejam dentro de um desses sítios. Como aqui usado, um iRNA é referido como alvo dentro de um sítio particular de um transcrito de RNA se o iRNA promover a clivagem do transcrito em qualquer lugar dentro desse sítio particular. Tal iRNA incluirá geralmente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências providas nas Tabelas 3 e 5 acoplados a sequências de nucleotídeos adicionais retiradas da região contígua à sequência selecionada em um gene PD-L1.[00160] Furthermore, the RNAs provided in Tables 3 and 5 identify a site(s) in a PD-L1 transcript that is susceptible to RISC-mediated cleavage. As such, the present invention further features iRNAs that target within one of these sites. As used herein, an iRNA is referred to as targeting within a particular site of an RNA transcript if the iRNA promotes cleavage of the transcript anywhere within that particular site. Such an iRNA will generally include at least about 15 contiguous nucleotides from one of the sequences provided in Tables 3 and 5 coupled to additional nucleotide sequences taken from the region contiguous to the selected sequence in a PD-L1 gene.

[00161] Embora uma sequência alvo tenha geralmente cerca de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento, existe uma grande variação na adequabilidade de sequências particulares nessa faixa para direcionar a clivagem de qualquer dado RNA alvo. Vários pacotes de software e as diretrizes aqui estabelecidas proveem orientações para a identificação de sequências alvo ideais para qualquer alvo genético, mas também pode ser adotada uma abordagem empírica em que uma “janela” ou “máscara” de um determinado tamanho (como exemplo não limitativo, 21 nucleotídeos) é literal ou figurativamente (incluindo, por exemplo, in silico) colocada na sequência de RNA alvo para identificar sequências na faixa de tamanhos que podem servir como sequências alvo. Ao mover progressivamente a “janela” de sequência de um nucleotídeo a montante ou a jusante de uma localização de sequência alvo inicial, a próxima sequência alvo potencial pode ser identificada, até que o conjunto completo de sequências possíveis seja identificado para qualquer tamanho de alvo selecionado. Esse processo, juntamente com a síntese sistemática e teste das sequências identificadas (usando ensaios como aqui descritos ou como conhecidos na técnica ou providos aqui) para identificar as sequências que têm um desempenho ideal, pode identificar as sequências de RNA que, quando alvejadas com um agente de iRNA, medeiam a melhor inibição da expressão do gene alvo. Assim, enquanto as sequências identificadas, por exemplo, nas Tabelas 3 e 5 representam sequências alvo eficazes, é contemplado que a otimização adicional da eficiência de inibição pode ser conseguida progressivamente “movendo a janela” um nucleotídeo a montante ou a jusante das sequências dadas para identificar sequências com características de inibição iguais ou melhores.[00161] Although a target sequence is generally about 15 to 30 nucleotides in length, there is wide variation in the suitability of particular sequences in this range for directing cleavage of any given target RNA. Various software packages and the guidelines set forth herein provide guidance for identifying optimal target sequences for any given genetic target, but an empirical approach can also be adopted in which a “window” or “mask” of a certain size (as a non-limiting example, 21 nucleotides) is literally or figuratively (including, for example, in silico) placed on the target RNA sequence to identify sequences in the size range that can serve as target sequences. By progressively moving the sequence “window” one nucleotide upstream or downstream of an initial target sequence location, the next potential target sequence can be identified, until the full set of possible sequences is identified for any selected target size. This process, coupled with systematic synthesis and testing of the identified sequences (using assays as described herein or as known in the art or provided herein) to identify sequences that perform optimally, can identify RNA sequences that, when targeted with an iRNA agent, mediate the best inhibition of target gene expression. Thus, while the sequences identified, for example, in Tables 3 and 5 represent effective target sequences, it is contemplated that further optimization of inhibition efficiency can be achieved by progressively “moving the window” one nucleotide upstream or downstream of the given sequences to identify sequences with equal or better inhibition characteristics.

[00162] Além disso, está contemplado que para qualquer sequência identificada, por exemplo, nas Tabelas 3 e 5, otimização adicional poderia ser alcançada sistematicamente adicionando ou removendo nucleotídeos para gerar sequências mais longas ou mais curtas e testando aquelas sequências geradas movendo uma janela do tamanho mais longo ou mais curto para cima ou para baixo do RNA alvo a partir desse ponto. Mais uma vez, o acoplamento dessa abordagem para gerar novos alvos candidatos com testes para a eficácia de iRNAs com base nas sequências alvo em um ensaio de inibição, como conhecido na técnica ou como aqui descrito, pode conduzir a melhorias adicionais na eficácia da inibição. Mais ainda, tais sequências otimizadas pode ser ajustada, por exemplo, pela introdução de nucleotídeos modificados tal como aqui descrito ou como conhecido na técnica, adição ou alteração em projeção, ou outras modificações como conhecidas na técnica ou aqui discutidas para otimizar ainda mais a molécula (por exemplo, aumento da estabilidade sérica ou meia-vida circulante, aumento da estabilidade térmica, intensificação da dispensação transmembranar, alvejamento para uma localização particular ou tipo celular, aumento da interação com enzimas da via de silenciamento, aumento da liberação dos endossomas) como inibidor da expressão.[00162] Furthermore, it is contemplated that for any sequence identified in, for example, Tables 3 and 5, further optimization could be achieved by systematically adding or removing nucleotides to generate longer or shorter sequences and testing those generated sequences by moving a window of the longest or shortest size up or down the target RNA from that point. Again, coupling this approach to generating new candidate targets with testing for the efficacy of iRNAs based on the target sequences in an inhibition assay, as known in the art or as described herein, may lead to further improvements in inhibition efficacy. Furthermore, such optimized sequences can be adjusted, for example, by the introduction of modified nucleotides as described herein or as known in the art, addition or alteration in overhang, or other modifications as known in the art or discussed herein to further optimize the molecule (e.g., increasing serum stability or circulating half-life, increasing thermal stability, enhancing transmembrane delivery, targeting to a particular location or cell type, increasing interaction with silencing pathway enzymes, increasing release from endosomes) as an inhibitor of expression.

[00163] Um iRNA, como aqui descrito, pode conter uma ou mais incompatibilidades na sequência alvo. Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui não contém mais do que 3 incompatibilidades. Se a cadeia antissentido do iRNA contiver incompatibilidades a uma sequência alvo, é preferível que a área de incompatibilidade não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a cadeia antissentido do iRNA contiver incompatibilidades na sequência alvo, é preferível que a incompatibilidade seja restrita a estar dentro dos últimos 5 nucleotídeos da extremidade 5’ ou 3’ da região de complementaridade. Por exemplo, para um agente de iRNA de 23 nucleotídeos, a cadeia que é complementar a uma região de um gene PD- L1 geralmente não contém qualquer incompatibilidade entre os 13 nucleotídeos centrais. Os métodos aqui descritos ou métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar se um iRNA contendo uma incompatibilidade com uma sequência alvo é eficaz na inibição da expressão de um gene PD-L1. Considerar a eficácia do iRNAs com incompatibilidades na inibição da expressão de um gene PD-L1 é importante, especialmente se a região particular de complementaridade em um gene PD-L1 for conhecida por ter variação de sequência polimórfica dentro da população.[00163] An iRNA as described herein may contain one or more mismatches in the target sequence. In one embodiment, an iRNA as described herein contains no more than 3 mismatches. If the antisense strand of the iRNA contains mismatches to a target sequence, it is preferred that the mismatch area not be located in the center of the region of complementarity. If the antisense strand of the iRNA contains mismatches to the target sequence, it is preferred that the mismatch be restricted to being within the last 5 nucleotides of the 5' or 3' end of the region of complementarity. For example, for a 23-nucleotide iRNA agent, the strand that is complementary to a region of a PD-L1 gene generally does not contain any mismatches within the central 13 nucleotides. The methods described herein or methods known in the art can be used to determine whether an iRNA containing a mismatch to a target sequence is effective in inhibiting the expression of a PD-L1 gene. Considering the efficacy of mismatched iRNAs in inhibiting the expression of a PD-L1 gene is important, especially if the particular region of complementarity in a PD-L1 gene is known to have polymorphic sequence variation within the population.

II. iRNAs modificados da invençãoII. Modified iRNAs of the invention

[00164] Em certas modalidades, o RNA da iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, não é modificado e não compreende, por exemplo, modificações químicas ou conjugações conhecidas na técnica e aqui descritas. Em outras modalidades, o RNA de um iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, é modificado quimicamente para intensificar a estabilidade ou outras caracterticas benéficas. Em certas modalidades da invenção, substancialmente todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Em outras modalidades da invenção, todos os nucleotídeos de um iRNA ou substancialmente todos os nucleotídeos de um iRNA são modificados, isto é, não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos não modificados estão presentes em uma cadeia do iRNA.[00164] In certain embodiments, the RNA of the iRNA of the invention, e.g., a dsRNA, is unmodified and does not comprise, for example, chemical modifications or conjugations known in the art and described herein. In other embodiments, the RNA of an iRNA of the invention, e.g., a dsRNA, is chemically modified to enhance stability or other beneficial characteristics. In certain embodiments of the invention, substantially all of the nucleotides of an iRNA of the invention are modified. In other embodiments of the invention, all of the nucleotides of an iRNA or substantially all of the nucleotides of an iRNA are modified, i.e., no more than 5, 4, 3, 2, or 1 unmodified nucleotides are present in a strand of the iRNA.

[00165] Os ácidos nucleicos existentes na invenção podem ser sintetizados ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, tais como os descritos em “Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, que é aqui incorporado por referência. As modificações incluem, por exemplo, modificações de extremidade, por exemplo, modificações de extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações de extremidade 3’ (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc.); modificações de base, por exemplo, substituição com bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras ou bases que formam pares de bases com um repertório expandido de parceiros, remoção de bases (nucleotídeos básicos) ou bases conjugadas; modificações de açúcar (por exemplo, na posição 2’ ou 4’) ou substituição do açúcar; ou modificações de estrutura dorsal, incluindo modificação ou substituição das ligações de fosfodiéster. Exemplos específicos de compostos de iRNA úteis nas modalidades aqui descritas incluem, mas não se limitam a, RNAs contendo estruturas dorsais modificadas ou nenhuma ligação internucleosídica natural. Os RNAs com estruturas dorsais modificadas incluem, entre outros, aqueles que não têm um átomo de fósforo na estrutura dorsal. Para os fins deste relatório descritivo, e como por vezes referido na técnica, RNAs modificados que não têm um átomo de fósforo na sua estrutura dorsal internucleosídica podem também ser considerados oligonucleosídeos. Em algumas modalidades, um iRNA modificado terá um átomo de fósforo na sua cadeia prinicipal internucleosídica.[00165] The nucleic acids of the invention can be synthesized or modified by methods well established in the art, such as those described in “Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, which is incorporated herein by reference. Modifications include, for example, end modifications, for example, 5' end modifications (phosphorylation, conjugation, inverted bonds) or 3' end modifications (conjugation, DNA nucleotides, inverted bonds, etc.); base modifications, for example, substitution with stabilizing bases, destabilizing bases, or bases that form base pairs with an expanded repertoire of partners, removal of bases (basic nucleotides), or conjugate bases; sugar modifications (for example, at the 2' or 4' position) or sugar substitution; or backbone modifications, including modification or substitution of phosphodiester bonds. Specific examples of iRNA compounds useful in the embodiments described herein include, but are not limited to, RNAs containing modified backbones or no natural internucleoside linkage. RNAs with modified backbones include, but are not limited to, those lacking a phosphorus atom in the backbone. For purposes of this specification, and as sometimes referred to in the art, modified RNAs lacking a phosphorus atom in their internucleoside backbone may also be considered oligonucleosides. In some embodiments, a modified iRNA will have a phosphorus atom in its internucleoside backbone.

[00166] As estruturas dorsais de RNA modificadas incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros alquil fosfonatos incluindo 3'-alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tioalquilfosfotriésteres e boranofosfatos com ligações 3'-5' normais, análogos ligados a 2'-5' destes e aqueles com polaridade invertida em que os pares adjacentes de unidades de nucleosídeos são ligadas 3'-5 'a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre também estão incluídos.[00166] Modified RNA backbones include, for example, phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkylphosphotriesters, methyl and other alkyl phosphonates including 3'-alkylene phosphonates and chiral phosphonates, phosphinates, phosphoramidates including 3'-amino phosphoramidate and aminoalkylphosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thioalkylphosphotriesters, and boranophosphates with normal 3'-5' linkages, 2'-5'-linked analogs thereof, and those with reversed polarity in which adjacent pairs of nucleoside units are linked 3'-5' to 5'-3' or 2'-5' to 5'-2'. Various salts, mixed salts, and free acid forms are also included.

[00167] Patentes US representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não estão limitadas a, Patente US Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6. 239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e Patente US No. RE39464, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00167] Representative U.S. patents teaching the preparation of the above phosphorus-containing bonds include, but are not limited to, U.S. Patent Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; Nos. 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; and U.S. Patent No. RE39,464, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00168] As estruturas dorsais de RNA modificadas que não incluem um átomo de fósforo têm estruturas dorsais que são formadas por ligações internucleosídicas de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomos mistos e ligações internucleosídicas de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Essas incluem as com ligações de morfolino (formadas em parte pela porção de açúcar de um nucleosídeo); estruturas dorsais de siloxano; estruturas dorsais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas dorsais de formacetila e tioformacetila; estruturas dorsais de metileno, formacetila e tioformacetila; estruturas dorsais contendo alceno; estruturas dorsais de sulfamato; estruturas dorsais de metilenoimina e metileno-hidrazina; estruturas dorsais de sulfonato e sulfonamida; estruturas dorsais de amida; e outras tendo partes componentes de N, O, S e CH2mistas.[00168] Modified RNA backbones that do not include a phosphorus atom have backbones that are formed by short-chain alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, mixed heteroatom and alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, or one or more short-chain heteroatomic or heterocyclic internucleoside linkages. These include those with morpholino linkages (formed in part by the sugar moiety of a nucleoside); siloxane backbones; sulfide, sulfoxide, and sulfone backbones; formacetyl and thioformacetyl backbones; methylene, formacetyl, and thioformacetyl backbones; alkene-containing backbones; sulfamate backbones; methyleneimine and methylenehydrazine backbones; sulfonate and sulfonamide backbones; amide backbone structures; and others having mixed N, O, S, and CH2 component parts.

[00169] Patentes US representativas que ensinam a preparação dos oligonucleotídeos acima incluem, mas não estão limitadas a, Patente US Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00169] Representative U.S. patents teaching the preparation of the above oligonucleotides include, but are not limited to, U.S. Patent Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; and 5,677,439, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00170] Os miméticos de RNA adequados são contemplados para uso em iRNAs providos aqui, em que tanto o açúcar como a ligação internucleosídica, isto é, a estrutura dorsal, das unidades de nucleotídeos são substituídos por novos grupos. As unidades de base são mantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um tal composto oligomérico em que um RNA mimético que demonstrou ter excelentes propriedades de hibridização é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Nos compostos de PNA, a estrutura dorsal de açúcar de um RNA é substituída por uma estrutura dorsal contendo amida, em particular uma estrutura dorsal de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e estão ligadas direta ou indiretamente a átomos de nitrogênio aza da porção amida da estrutura dorsal. Patentes US representativas que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem, mas não se limitam às Patentes US Nos. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência. Compostos adicionais de PNA adequados para uso nos iRNAs da invenção são descritos, por exemplo, em Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.[00170] Suitable RNA mimetics are contemplated for use in the iRNAs provided herein, in which both the sugar and the internucleoside linkage, i.e., the backbone, of the nucleotide units are replaced with new groups. The backbone units are retained for hybridization with an appropriate nucleic acid target compound. Such an oligomeric compound in which an RNA mimetic has been demonstrated to have excellent hybridization properties is referred to as a peptide nucleic acid (PNA). In PNA compounds, the sugar backbone of an RNA is replaced with an amide-containing backbone, in particular an aminoethylglycine backbone. The nucleobases are retained and are attached directly or indirectly to aza nitrogen atoms of the amide portion of the backbone. Representative U.S. patents teaching the preparation of PNA compounds include, but are not limited to, U.S. Patent Nos. 5,539,082; 5,714,331; and 5,719,262, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference. Additional PNA compounds suitable for use in the iRNAs of the invention are described, for example, in Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

[00171] Algumas modalidades apresentadas na invenção incluem RNAs com estruturas dorsais de fosforotioato e oligonucleosídeos com estruturas dorsais de heteroátomo, e em particular --CH2--NH--CH2-, --CH2-- N(CH3)--O--CH2--[conhecido como uma estrutura dorsal de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)-- CH2-- e --N(CH3)--CH2--CH2--[em que a estrutura dorsal de fosforodiéster nativa é representada como --O--P--O--CH2--] da Patente US No. 5.489.677 mencionada acima, e as estruturas dorsais de amida da Patente US No. 5.602.240 mencionada acima. Em algumas modalidades, os RNAs aqui apresentados têm estruturas dorsais de morfolino da Patente US No. 5.034.506 mencionada acima.[00171] Some embodiments presented in the invention include RNAs with phosphorothioate backbones and oligonucleosides with heteroatom backbones, and in particular --CH2--NH--CH2-, --CH2-- N(CH3)--O--CH2--[known as a methylene (methylimino) or MMI backbone], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)-- CH2-- and --N(CH3)--CH2--CH2--[wherein the native phosphorodiester backbone is represented as --O--P--O--CH2--] of the above-mentioned U.S. Patent No. 5,489,677, and the amide backbones of the above-mentioned U.S. Patent No. 5,602,240. In some embodiments, the RNAs presented herein have morpholino backbones from the aforementioned U.S. Patent No. 5,034,506.

[00172] RNAs modificados também podem conter um ou mais radicais de açúcar substituídos. Os iRNAs, por exemplo, dsRNA, aqui apresentados, podem incluir um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-, S-, ou N-alquila; O, S-, ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O-alquila-O-alquila, em que a alquila, alquenila ou alquinila pode ser C1 a C10 alquila ou C2 a C10 alquenila e alquinila substituída ou não substituída. Modificações adequadas exemplificativas incluem O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde n e m são de 1 a cerca de 10. Em outras modalidades, dsRNAs incluem um dos seguintes na posição 2': C1 a C10 alquila inferior, alquila inferior substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um iRNA, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um iRNA, e outros substituintes com propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui uma 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, também conhecida como 2'-O-(2-metoxietil) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), isto é, um grupo alcóxi-alcóxi. Uma outra modificação exemplificativa é 2'-dimetilamino-oxietoxi, isto é, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos aqui abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietil ou 2'-DMAEOE), isto é, 2'-O--CH2-- O--CH2--N(CH2)2. Modificações exemplificativas adicionais incluem: nucleotídeos 5’-Me-2’-F, nucleotídeos 5’-Me-2’-OMe, 5’-Me-2’- desoxinucleotídeos, (tanto R quanto S isômeros nessas três famílias), 2’- alcoxialquila; e 2’-NMA (N-metilacetamida).[00172] Modified RNAs may also contain one or more substituted sugar moieties. iRNAs, e.g., dsRNA, presented herein, may include one of the following at the 2' position: OH; F; O-, S-, or N-alkyl; O, S-, or N-alkenyl; O-, S-, or N-alkynyl; or O-alkyl-O-alkyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl may be C1 to C10 alkyl or C2 to C10 alkenyl and substituted or unsubstituted alkynyl. Exemplary suitable modifications include O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, and O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, where n and m are from 1 to about 10. In other embodiments, dsRNAs include one of the following at the 2' position: C1 to C10 lower alkyl, substituted lower alkyl, alkaryl, aralkyl, O-alkaryl, or O-aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocycloalkyl, heterocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, substituted silyl, an RNA cleavage group, a reporter group, an intercalator, a group to improve the pharmacokinetic properties of an iRNA, or a group to improve the pharmacodynamic properties of an iRNA, and other substituents with similar properties. In some embodiments, the modification includes a 2'-methoxyethoxy (2'-O--CH2CH2OCH3, also known as 2'-O-(2-methoxyethyl) or 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), i.e., an alkoxy-alkoxy group. Another exemplary modification is 2'-dimethylamino-oxyethoxy, i.e., an O(CH2)2ON(CH3)2 group, also known as 2'-DMAOE, as described in the examples herein below, and 2'-dimethylaminoethoxyethoxy (also known in the art as 2'-O-dimethylaminoethoxyethyl or 2'-DMAEOE), i.e., 2'-O--CH2-- O--CH2--N(CH2)2. Additional exemplary modifications include: 5'-Me-2'-F nucleotides, 5'-Me-2'-OMe nucleotides, 5'-Me-2'-deoxynucleotides, (both R and S isomers in these three families), 2'-alkoxyalkyl; and 2'-NMA (N-methylacetamide).

[00173] Outras modificações incluem 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'- aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) e 2'-fluoro (2'-F). Modificações semelhantes podem também ser feitas em outras posições no RNA de um iRNA, em particular a posição 3' do açúcar no nucleotídeo do terminal 3' ou em dsRNAs ligados 2'-5' e a posição 5' do nucleotídeo do terminal 5'. Os iRNAs também podem ter miméticos do açúcar, tais como radicais ciclobutila em vez do açúcar pentofuranosila. Patentes US representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não estão limitadas a, Patente US Nos. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, algumas das quais são de propriedade comum com o pedido instantâneo. Os conteúdos totais de cada um dos precedentes são aqui incorporados por referência.[00173] Other modifications include 2'-methoxy (2'-OCH3), 2'-aminopropoxy (2'-OCH2CH2CH2NH2), and 2'-fluoro (2'-F). Similar modifications can also be made at other positions in the RNA of an iRNA, in particular the 3' position of the sugar in the 3'-terminal nucleotide or in 2'-5' linked dsRNAs and the 5' position of the 5'-terminal nucleotide. iRNAs can also have sugar mimetics such as cyclobutyl radicals in place of the pentofuranosyl sugar. Representative U.S. patents teaching the preparation of such modified sugar structures include, but are not limited to, U.S. Patent Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; and 5,700,920, some of which are owned in common with Instant Order. The entire contents of each of the foregoing are incorporated herein by reference.

[00174] Um iRNA também pode incluir modificações ou substituições de nucleobases (frequentemente referidas na técnica simplesmente como “base”). Como usado aqui, nucleobases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). As nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais, como a desoximitina (dT), 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metila e outros alquil derivados de adenina e guanina, 2- propila e outros alquil derivados de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2- tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas substituídas em 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas substituídas em 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8- azaguanina e 8-aza-adenina, 7-deazaguanina e 7-da-aza-adenina e 3- deazaguanina e 3-deaza-adenina. Nucleobases adicionais incluem as descritas na Pat. US No. 3.687.808, as descritas em Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; as descritas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, as descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e as descritas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algumas dessas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na invenção. Estas incluem pirimidinas substituídas em 5, 6- azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6, incluindo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. Substituições de 5- metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex do ácido nucleico em 0,6 a 1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276278) e são substituições de base exemplificativas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietila.[00174] An iRNA may also include modifications or substitutions of nucleobases (often referred to in the art simply as "base"). As used herein, "unmodified" or "natural" nucleobases include the purine bases adenine (A) and guanine (G) and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and uracil (U). Modified nucleobases include other synthetic and natural nucleobases such as deoxymycin (dT), 5-methylcytosine (5-me-C), 5-hydroxymethyl cytosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-propyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-thiouracil, 2-thiothymine and 2-thiocytosine, 5-halouracil and cytosine, 5-propynyl uracil and cytosine, 6-azo uracil, cytosine and thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl and other 8-substituted adenines and guanines. 5-halo, particularly 5-bromo, 5-trifluoromethyl and other uracils and cytosines substituted on 5, 7-methylguanine and 7-methyladenine, 8-azaguanine and 8-aza-adenine, 7-deazaguanine and 7-da-aza-adenine, and 3-deazaguanine and 3-deaza-adenine. Additional nucleobases include those described in U.S. Pat. No. 3,687,808, those described in Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; those described in The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, those described by Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and those described by Sanghvi, Y. S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Some of these nucleobases are particularly useful for increasing the binding affinity of the oligomeric compounds presented in the invention. These include 5-, 6-substituted pyrimidines, azapyrimidines and N-2-, N-6-, and O-6-substituted purines, including 2-aminopropyladenine, 5-propynyluracil, and 5-propynylcytosine. 5-Methylcytosine substitutions have been shown to increase nucleic acid duplex stability by 0.6 to 1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) and are exemplary base substitutions, even more particularly when combined with 2'-O-methoxyethyl sugar modifications.

[00175] Patentes US representativas que ensinam a preparação de algumas das nucleobases modificadas observadas acima, bem como outras nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a, Patente US Nos. 3.687.808. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; e 7.495.088, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00175] Representative U.S. patents teaching the preparation of some of the modified nucleobases noted above, as well as other modified nucleobases, include, but are not limited to, U.S. Patent Nos. 3,687,808; 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; and 7,495,088, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00176] O RNA de um iRNA pode também ser modificado para incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo com um radical ribose modificado em que o radical ribose compreende uma ponte extra ligando os carbonos 2' e 4'. Essa estrutura efetivamente “bloqueia” a ribose na conformação estrutural 3'-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados aos siRNAs demonstrou aumentar a estabilidade do siRNA em soro e reduzir os efeitos indesejáveis (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).[00176] The RNA of an iRNA can also be modified to include one or more locked nucleic acids (LNA). A locked nucleic acid is a nucleotide with a modified ribose moiety in which the ribose moiety comprises an extra bridge connecting the 2' and 4' carbons. This structure effectively "locks" the ribose in the 3'-endo structural conformation. The addition of locked nucleic acids to siRNAs has been shown to increase siRNA stability in serum and reduce undesirable effects (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).

[00177] Em algumas modalidades, o iRNA da invenção compreende um ou mais monômeros que são nucleotídeos de UNA (ácido nucleico desbloqueado). UNA é um ácido nucleico acíclico desbloqueado, em que qualquer uma das ligações do açúcar foi removida, formando um resíduo de “açúcar” desbloqueado. Em um exemplo, UNA também abrange monômero com ligações entre C1'-C4' que foram removidas (isto é, a ligação carbono- oxigênio-carbono covalente entre os carbonos C1' e C4'). Em um outro exemplo, a ligação C2'-C3' (isto é, a ligação carbono-carbono covalente entre os carbonos C2' e C3') do açúcar foi removida (ver Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) e Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 aqui incorporado por referência).[00177] In some embodiments, the iRNA of the invention comprises one or more monomers that are UNA (unlocked nucleic acid) nucleotides. UNA is an unlocked acyclic nucleic acid in which any of the sugar linkages have been removed, forming an unlocked "sugar" residue. In one example, UNA also encompasses monomer with C1'-C4' linkages that have been removed (i.e., the covalent carbon-oxygen-carbon bond between the C1' and C4' carbons). In another example, the C2'-C3' linkage (i.e., the covalent carbon-carbon bond between the C2' and C3' carbons) of the sugar has been removed (see Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 incorporated herein by reference).

[00178] O RNA de um iRNA pode também ser modificado para incluir um ou mais radicais de açúcar bicíclicos. Um “açúcar bicíclico” é um anel furanosila modificado pela ligação de dois átomos. Um “nucleosídeo bicíclico” (“BNA”) é um nucleosídeo que tem um radical de açúcar compreendendo uma ponte ligando dois átomos de carbono do anel de açúcar, formando assim um sistema de anel bicíclico. Em certas modalidades, a ponte liga o carbono 4' e o carbono 2' do anel de açúcar. Assim, em algumas modalidades, um agente da invenção pode incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo com um radical ribose modificado em que o radical ribose compreende uma ponte extra ligando os carbonos 2' e 4'. Em outras palavras, um LNA é um nucleotídeo que compreende um radical de açúcar bicíclico compreendendo uma ponte de 4'-CH2-O-2'. Essa estrutura efetivamente “bloqueia” a ribose na conformação estrutural 3'-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados aos siRNAs demonstrou aumentar a estabilidade do siRNA em soro e reduzir os efeitos indesejáveis (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Exemplos de nucleosídeos bicíclicos para uso nos polinucleotídeos da invenção incluem, sem limitação, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos do anel ribosila 4' e 2'. Em certas modalidades, os agentes polinucleotídicos antissentido da invenção incluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos compreendendo uma ponte de 4' para 2'. Exemplos de tais nucleosídeos bicíclicos com ligações em ponte de 4' a 2' incluem, mas não se limitam a 4‘-(CH2)—O-2‘ (LNA); 4‘-(CH2)—S-2‘; 4‘-(CH2)2—O-2‘ (ENA); 4‘-CH(CH3)—O-2‘ (também chamado de “etila restringida” ou “cET”) e 4- CH(CH2OCH3)—O-2‘ (e análogos do mesmo; ver, por exemplo, Patente US No. 7.399.845); 4‘-C(CH3)(CH3)—O-2‘ (e análogos do mesmo; ver, por exemplo, Patente US No. 8.278.283); 4‘-CH2—N(OCH3)-2‘ (e análogos do mesmo; ver, por exemplo, Patente US No. 8.278.425); 4‘-CH2—O—N(CH3)- 2‘ (ver, por exemplo, Publicação de Patente US No. 2004/0171570); 4‘-CH2— N(R)—O-2‘, em que R é H, C1-C12 alquila, ou um grupo protetor (ver, por exemplo, Patente US No. 7.427.672); 4‘-CH2—C(H)(CH3)-2‘ (ver, por exemplo, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); e 4‘- CH2—C(=CH2)-2‘ (e análogos do mesmo; ver, por exemplo, Patente US No. 8.278.426). Os conteúdos totais de cada um dos precedentes são aqui incorporados por referência.[00178] The RNA of an iRNA may also be modified to include one or more bicyclic sugar moieties. A "bicyclic sugar" is a furanosyl ring modified by the bonding of two atoms. A "bicyclic nucleoside" ("BNA") is a nucleoside that has a sugar moiety comprising a bridge connecting two carbon atoms of the sugar ring, thus forming a bicyclic ring system. In certain embodiments, the bridge connects the 4' carbon and the 2' carbon of the sugar ring. Thus, in some embodiments, an agent of the invention may include one or more locked nucleic acids (LNA). A locked nucleic acid is a nucleotide with a modified ribose moiety in which the ribose moiety comprises an extra bridge connecting the 2' and 4' carbons. In other words, an LNA is a nucleotide that comprises a bicyclic sugar moiety comprising a 4'-CH2-O-2' bridge. This structure effectively "locks" the ribose in the 3'-endo structural conformation. The addition of locked nucleic acids to siRNAs has been shown to increase siRNA stability in serum and reduce undesirable effects (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Examples of bicyclic nucleosides for use in the polynucleotides of the invention include, without limitation, nucleosides comprising a bridge between the 4' and 2' ribosyl ring atoms. In certain embodiments, the antisense polynucleotide agents of the invention include one or more bicyclic nucleosides comprising a 4' to 2' bridge. Examples of such bicyclic nucleosides with 4' to 2' bridges include, but are not limited to, 4‘-(CH2)—O-2‘ (LNA); 4‘-(CH2)—S-2‘; 4‘-(CH2)2—O-2‘ (ENA); 4‘-CH(CH3)—O-2‘ (also called “restricted ethyl” or “cET”) and 4-CH(CH2OCH3)—O-2‘ (and analogs thereof; see, e.g., U.S. Patent No. 7,399,845); 4‘-C(CH3)(CH3)—O-2‘ (and analogs thereof; see, e.g., U.S. Patent No. 8,278,283); 4‘-CH2—N(OCH3)-2‘ (and analogues thereof; see, e.g., U.S. Patent No. 8,278,425); 4‘-CH2—O—N(CH3)- 2‘ (see, e.g., U.S. Patent Publication No. 2004/0171570); 4‘-CH2—N(R)—O-2‘, wherein R is H, C1-C12 alkyl, or a protecting group (see, e.g., U.S. Patent No. 7,427,672); 4‘-CH2—C(H)(CH3)-2‘ (see, e.g., Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); and 4‘-CH2—C(=CH2)-2‘ (and analogues thereof; see, e.g., U.S. Patent No. 8,278,426). The entire contents of each of the foregoing are incorporated herein by reference.

[00179] Patentes US representativas adicionais e Publicações de Patente US que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácido nucleico bloqueados incluem, mas não estão limitadas às seguintes: Patente US Nos. 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.034.133;7.084.125; 7.399.845; 7.427.672; 7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425; 8.278.426; 8.278.283; US 2008/0039618; e US 2009/0012281, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00179] Additional representative U.S. patents and U.S. Patent Publications that teach the preparation of locked nucleic acid nucleotides include, but are not limited to, the following: U.S. Patent Nos. 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; and US 2009/0012281, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00180] Qualquer um dos nucleosídeos bicíclicos anteriores pode ser preparado com uma ou mais configurações de açúcares estereoquímicos incluindo, por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D-ribofuranose (ver WO 99/14226).[00180] Any of the foregoing bicyclic nucleosides may be prepared with one or more stereochemical sugar configurations including, for example, α-L-ribofuranose and β-D-ribofuranose (see WO 99/14226).

[00181] O RNA de um iRNA pode também ser modificado para incluir um ou mais nucleotídeos de etila restringida. Como usado aqui, um “nucleotídeo de etila restringida” ou “cEt” é um ácido nucleico bloqueado compreendendo um radical de açúcar compreendendo um ponte de 4'- CH(CH3)-O-2'. Em uma modalidade, um nucleotídeo de etila restringida encontra-se na conformação S aqui chamada de “S-cEt”.[00181] The RNA of an iRNA may also be modified to include one or more restrained ethyl nucleotides. As used herein, a "restrained ethyl nucleotide" or "cEt" is a restrained nucleic acid comprising a sugar moiety comprising a 4'-CH(CH3)-O-2' bridge. In one embodiment, a restrained ethyl nucleotide is in the S conformation referred to herein as "S-cEt."

[00182] Um iRNA da invenção também pode incluir um ou mais “nucleotídeos restritos conformacionalmente” (“CRN”). Os CRN são análogos de nucleotídeos com um ligador que liga os carbonos C2' e C4' da ribose ou os carbonos C3 e C5' da ribose. O CRN bloqueia o anel de ribose em uma conformação estável e aumenta a afinidade de hibridização para o mRNA. O ligador é de comprimento suficiente para colocar o oxigênio em uma posição ideal para estabilidade e afinidade, resultando em menor enrugamento do anel de ribose.[00182] An iRNA of the invention may also include one or more “conformationally constrained nucleotides” (“CRN”). CRNs are nucleotide analogs with a linker that binds the C2' and C4' carbons of ribose or the C3 and C5' carbons of ribose. The CRN locks the ribose ring in a stable conformation and increases hybridization affinity for mRNA. The linker is of sufficient length to place the oxygen in an optimal position for stability and affinity, resulting in reduced puckering of the ribose ring.

[00183] Publicações representativas que ensinam a preparação de alguns dos CRN observados acima incluem, mas não estão limitados a, Publicação de Patente US No. 2013/0190383; e publicação PCT WO 2013/036868, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00183] Representative publications teaching the preparation of some of the CRNs noted above include, but are not limited to, U.S. Patent Publication No. 2013/0190383; and PCT publication WO 2013/036868, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00184] Em algumas modalidades, o iRNA da invenção compreende um ou mais monômeros que são nucleotídeos de UNA (ácido nucleico desbloqueado). UNA é um ácido nucleico acíclico desbloqueado, em que qualquer uma das ligações do açúcar foi removida, formando um resíduo de “açúcar” desbloqueado. Em um exemplo, UNA também abrange monômero com ligações entre C1'-C4' que foram removidas (isto é, a ligação carbono- oxigênio-carbono covalente entre os carbonos C1' e C4'). Em um outro exemplo, a ligação C2'-C3' (isto é, a ligação carbono-carbono covalente entre os carbonos C2' e C3') do açúcar foi removida (ver Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) e Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 aqui incorporado por referência).[00184] In some embodiments, the iRNA of the invention comprises one or more monomers that are UNA (unlocked nucleic acid) nucleotides. UNA is an unlocked acyclic nucleic acid in which any of the sugar linkages have been removed, forming an unlocked "sugar" residue. In one example, UNA also encompasses monomer with C1'-C4' linkages that have been removed (i.e., the covalent carbon-oxygen-carbon bond between the C1' and C4' carbons). In another example, the C2'-C3' linkage (i.e., the covalent carbon-carbon bond between the C2' and C3' carbons) of the sugar has been removed (see Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 incorporated herein by reference).

[00185] Publicações US representativas que ensinam a preparação de UNA incluem, mas não se limitam à Patente US No. 8.314.227; e Publicação de Patente US Nos. 2013/0096289; 2013/0011922; e 2011/0313020, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00185] Representative U.S. publications teaching the preparation of UNA include, but are not limited to, U.S. Patent No. 8,314,227; and U.S. Patent Publication Nos. 2013/0096289; 2013/0011922; and 2011/0313020, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00186] Modificações potencialmente estabilizadoras das extremidades das moléculas de RNA podem incluir N- (acetilaminocaproil)-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N- (acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N- (aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil-uridina-3”- fosfato, dT (idT) de base invertida e outros. A descrição dessa modificação pode ser encontrada na Publicação PCT N° WO 2011/005861.[00186] Potentially stabilizing modifications of the ends of RNA molecules may include N-(acetylaminocaproyl)-4-hydroxyprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproyl-4-hydroxyprolinol (Hyp-C6), N-(acetyl-4-hydroxyprolinol (Hyp-NHAc), thymidine-2'-O-deoxythymidine (ether), N-(aminocaproyl)-4-hydroxyprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoyl-uridine-3”-phosphate, reverse base dT (idT), and others. The description of this modification can be found in PCT Publication No. WO 2011/005861.

[00187] Outras modificações de nucleotídeos de um iRNA da invenção incluem um fosfato 5’ ou imitação de fosfato 5’, por exemplo, um fosfato de terminal 5' ou imitação de fosfato na cadeia antissentido de um iRNA. Imitações de fosfato adequadas são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente US No. 2012/0157511, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência. iRNAs modificados compreendendo motivos da invenção[00187] Other nucleotide modifications of an iRNA of the invention include a 5' phosphate or 5' phosphate mimic, e.g., a 5' terminal phosphate or phosphate mimic on the antisense strand of an iRNA. Suitable phosphate mimics are described, e.g., in U.S. Patent Publication No. 2012/0157511, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference. Modified iRNAs Comprising Motifs of the Invention

[00188] Em certos aspectos da invenção, os agentes de iRNA de cadeia dupla da invenção incluem agentes com modificações químicas como descritas, por exemplo, em WO2013/075035, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência. WO2013/075035 provê motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em uma cadeia sentido ou cadeia antissentido de um agente de dsRNAi, particularmente no ou perto do sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a cadeia sentido e a cadeia antissentido do agente dsRNAi podem, de outro modo, ser completamente modificadas. A introdução desses motivos interrompe o padrão de modificação, se presente, da cadeia sentido ou antissentido. O agente de dsRNAi pode ser opcionalmente conjugado com um ligante derivado de GalNAc, por exemplo na cadeia sentido.[00188] In certain aspects of the invention, the double-stranded iRNA agents of the invention include agents with chemical modifications as described, for example, in WO2013/075035, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference. WO2013/075035 provides motifs of three identical modifications at three consecutive nucleotides in a sense strand or antisense strand of a dsRNAi agent, particularly at or near the cleavage site. In some embodiments, the sense strand and the antisense strand of the dsRNAi agent may otherwise be completely modified. Introduction of these motifs disrupts the modification pattern, if present, of the sense or antisense strand. The dsRNAi agent may optionally be conjugated to a GalNAc-derived linker, for example on the sense strand.

[00189] Mais especificamente, quando a cadeia sentido e a cadeia antissentido do agente de RNAi de cadeia dupla são completamente modificadas para ter um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no ou perto do sítio de clivagem de pelo menos uma cadeia de um agente de dsRNAi, observou-se atividade silenciadora do gene do agente de dsRNAi.[00189] More specifically, when the sense strand and the antisense strand of the double-stranded RNAi agent are completely modified to have one or more motifs of three identical modifications in three consecutive nucleotides at or near the cleavage site of at least one strand of a dsRNAi agent, gene silencing activity of the dsRNAi agent was observed.

[00190] Por conseguinte, a invenção provê agentes de RNAi de cadeia dupla capazes de inibir a expressão de um gene alvo (isto é, gene PD-L1) in vivo. O agente de RNAi compreende uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido. Cada cadeia do agente de RNAi pode ter, independentemente, 12 a 30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, cada cadeia pode ter 14 a 30 nucleotídeos de comprimento, 17 a 30 nucleotídeos de comprimento, 25 a 30 nucleotídeos de comprimento, 27 a 30 nucleotídeos de comprimento, 17 a 23 nucleotídeos de comprimento, 17 a 21 nucleotídeos de comprimento, 17 a 19 nucleotídeos de comprimento, 19 a 25 nucleotídeos de comprimento, 19 a 23 nucleotídeos de comprimento, 19 a 21 nucleotídeos de comprimento, 21 a 25 nucleotídeos de comprimento ou 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.[00190] Accordingly, the invention provides double-stranded RNAi agents capable of inhibiting the expression of a target gene (i.e., PD-L1 gene) in vivo. The RNAi agent comprises a sense strand and an antisense strand. Each strand of the RNAi agent may independently be 12 to 30 nucleotides in length. For example, each chain might be 14 to 30 nucleotides long, 17 to 30 nucleotides long, 25 to 30 nucleotides long, 27 to 30 nucleotides long, 17 to 23 nucleotides long, 17 to 21 nucleotides long, 17 to 19 nucleotides long, 19 to 25 nucleotides long, 19 to 23 nucleotides long, 19 to 21 nucleotides long, 21 to 25 nucleotides long, or 21 to 23 nucleotides long.

[00191] A cadeia sentido e a cadeia antissentido formam tipicamente um RNA de cadeia dupla duplex (“dsRNA”), também chamado aqui de “agente de dsRNAi”. A região de duplex do agente de andsRNAi pode ter 12 a 30 pares de nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a região de duplex pode ter 14 a 30 pares de nucleotídeos de comprimento, 17 a 30 pares de nucleotídeos de comprimento, 27 a 30 pares de nucleotídeos de comprimento, 17 a 23 pares de nucleotídeos de comprimento, 17 a 21 pares de nucleotídeos de comprimento, 17 a 19 pares de nucleotídeos de comprimento, 19 a 25 pares de nucleotídeos de comprimento, 19 a 23 pares de nucleotídeos de comprimento, 19 a 21 pares de nucleotídeos de comprimento, 21 a 25 pares de nucleotídeos de comprimento ou 21 a 23 pares de nucleotídeos de comprimento. Em um outro exemplo, a região de duplex é selecionada a partir de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento.[00191] The sense strand and the antisense strand typically form a double-stranded RNA (“dsRNA”) duplex, also referred to herein as a “dsRNAi agent.” The duplex region of the dsRNAi agent may be 12 to 30 nucleotide pairs in length. For example, the duplex region may be 14 to 30 nucleotide pairs long, 17 to 30 nucleotide pairs long, 27 to 30 nucleotide pairs long, 17 to 23 nucleotide pairs long, 17 to 21 nucleotide pairs long, 17 to 19 nucleotide pairs long, 19 to 25 nucleotide pairs long, 19 to 23 nucleotide pairs long, 19 to 21 nucleotide pairs long, 21 to 25 nucleotide pairs long, or 21 to 23 nucleotide pairs long. In another example, the duplex region is selected from 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 nucleotides in length.

[00192] Em certas modalidades, as cadeias sentido e antissentido podem ser ainda maiores. Por exemplo, em certas modalidades, a cadeia sentido e a cadeia antissentido são independentemente de 25 a 35 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, cada uma das cadeias sentido e antissentido tem, independentemente, 27 a 53 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 27 a 49, 31 a 49, 33 a 49, 35 a 49, 37 a 49 e 39 a 49 nucleotídeos de comprimento.[00192] In certain embodiments, the sense and antisense strands can be even longer. For example, in certain embodiments, the sense strand and the antisense strand are independently 25 to 35 nucleotides in length. In certain embodiments, the sense and antisense strands are each independently 27 to 53 nucleotides in length, e.g., 27 to 49, 31 to 49, 33 to 49, 35 to 49, 37 to 49, and 39 to 49 nucleotides in length.

[00193] Em certas modalidades, o agente de dsRNAi pode conter uma ou mais regiões de projeção ou grupos de cobertura nas extremidades 3', 5', ou ambas as extremidades de uma ou ambas as cadeias. A projeção pode ter, independentemente, 1 a 6 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 2 a 6 nucleotídeos de comprimento, 1 a 5 nucleotídeos de comprimento, 2 a 5 nucleotídeos de comprimento, 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, 2 a 4 nucleotídeos de comprimento, 1 a 3 nucleotídeos de comprimento, 2 a 3 nucleotídeos de comprimento ou 1 a 2 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, as regiões de projeção podem incluir regiões de projeção estendidas, conforme descrito acima. As projeções podem ser o resultado de uma cadeia ser mais longa que a outra, ou o resultado de duas cadeias do mesmo comprimento serem escalonadas. A projeção pode formar uma incompatibilidade com o mRNA alvo ou pode ser complementar às sequências genéticas que são alvo ou pode ser outra sequência. A primeira e segunda cadeias podem também ser unidas, por exemplo, por bases adicionais para formar um gancho, ou por outros ligadores não básicos.[00193] In certain embodiments, the dsRNAi agent may contain one or more overhang regions or capping groups at the 3', 5', or both ends of one or both strands. The overhang may be, independently, 1 to 6 nucleotides in length, e.g., 2 to 6 nucleotides in length, 1 to 5 nucleotides in length, 2 to 5 nucleotides in length, 1 to 4 nucleotides in length, 2 to 4 nucleotides in length, 1 to 3 nucleotides in length, 2 to 3 nucleotides in length, or 1 to 2 nucleotides in length. In certain embodiments, the overhang regions may include extended overhang regions as described above. The overhangs may be the result of one strand being longer than the other, or the result of two strands of the same length being staggered. The overhang may form a mismatch with the target mRNA, or it may be complementary to the target gene sequences, or it may be another sequence. The first and second strands may also be joined, for example, by additional bases to form a hairpin, or by other non-basic linkers.

[00194] Em certas modalidades, os nucleotídeos na região de projeção do agente de dsRNAi podem, cada um, independentemente, ser um nucleotídeo modificado ou não modificado, incluindo, mas não se limitando a, 2'-açúcar modificado, tal como 2’-F, 2’-O-metil, timidina (T), 2'-O- metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2'-O- metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo), e quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, TT pode ser uma sequência de projeção para qualquer extremidade em qualquer cadeia. A projeção pode formar uma incompatibilidade com o mRNA alvo ou pode ser complementar às sequências genéticas que são alvo ou pode ser outra sequência.[00194] In certain embodiments, the nucleotides in the overhang region of the dsRNAi agent can each, independently, be a modified or unmodified nucleotide, including, but not limited to, 2'-sugar modified, such as 2'-F, 2'-O-methyl thymidine (T), 2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine (Teo), 2'-O-methoxyethyladenosine (Aeo), 2'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine (m5Ceo), and any combinations thereof. For example, TT can be an overhang sequence to either end on either strand. The overhang can form a mismatch with the target mRNA, or can be complementary to the genetic sequences that are targeted, or can be another sequence.

[00195] As projeções 5’ ou 3’ na cadeia sentido, cadeia antissentido ou ambas as cadeias do agente de dsRNAi podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a(s) região(ões) de projeção contém dois nucleotídeos com um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, em que os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, a projeção está presente na extremidade 3’ da cadeia sentido, da cadeia antissentido ou de ambas as cadeias. Em algumas modalidades, essa projeção está presente na cadeia antissentido. Em algumas modalidades, essa projeção está presente na cadeia sentido.[00195] The 5’ or 3’ overhangs on the sense strand, antisense strand, or both strands of the dsRNAi agent can be phosphorylated. In some embodiments, the overhang region(s) contains two nucleotides with a phosphorothioate between the two nucleotides, wherein the two nucleotides can be the same or different. In some embodiments, the overhang is present at the 3’ end of the sense strand, the antisense strand, or both strands. In some embodiments, this overhang is present on the antisense strand. In some embodiments, this overhang is present on the sense strand.

[00196] O agente de dsRNAi pode conter apenas uma única projeção, o que pode fortalecer a atividade de interferência do RNAi, sem afetar sua estabilidade geral. Por exemplo, a projeção de cadeia simples pode estar localizada na extremidade 3' da cadeia sentido ou, alternativamente, na extremidade 3' da cadeia antissentido. O RNAi também pode ter uma extremidade cega, localizada na extremidade 5’ da cadeia antissentido (ou na extremidade 3’ da cadeia sentido) ou vice-versa. Geralmente, a cadeia antissentido do agente de dsRNAi tem uma projeção de nucleotídeos na extremidade 3’, e a extremidade 5’ é cega. Sem desejar se ater à teoria, a extremidade cega assimétrica na extremidade 5' da cadeia antissentido e na extremidade 3' da cadeia antissentido favorece o carregamento da cadeia guia no processo RISC.[00196] The dsRNAi agent may contain only a single overhang, which may enhance the interference activity of the RNAi without affecting its overall stability. For example, the single-stranded overhang may be located at the 3' end of the sense strand or, alternatively, at the 3' end of the antisense strand. The RNAi may also have a blunt end, located at the 5' end of the antisense strand (or at the 3' end of the sense strand), or vice versa. Generally, the antisense strand of the dsRNAi agent has a nucleotide overhang at the 3' end, and the 5' end is blunt. Without wishing to be bound by theory, the asymmetric blunt end at the 5' end of the antisense strand and at the 3' end of the antisense strand favors the loading of the guide strand in the RISC process.

[00197] Em certas modalidades, o agente de dsRNAi é um oligonucleotídeo de dupla extremidade cega de 19 nucleotídeos de comprimento, em que a cadeia sentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 7, 8, 9 da extremidade 5’. A cadeia antissentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.[00197] In certain embodiments, the dsRNAi agent is a double-ended, blunt-ended oligonucleotide of 19 nucleotides in length, wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications in three consecutive nucleotides at positions 7, 8, 9 from the 5' end. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications in three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.

[00198] Em outras modalidades, o agente de dsRNAi é um oligonucleotídeo de dupla extremidade cega de 20 nucleotídeos de comprimento, em que a cadeia sentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 8, 9, 10 da extremidade 5’. A cadeia antissentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.[00198] In other embodiments, the dsRNAi agent is a double-ended, blunt-ended oligonucleotide of 20 nucleotides in length, wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications in three consecutive nucleotides at positions 8, 9, 10 from the 5' end. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications in three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.

[00199] Em ainda outras modalidades, o agente de dsRNAi é um oligonucleotídeo de dupla extremidade cega de 21 nucleotídeos de comprimento, em que a cadeia sentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 da extremidade 5’. A cadeia antissentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.[00199] In still other embodiments, the dsRNAi agent is a double-ended, blunt-ended oligonucleotide of 21 nucleotides in length, wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications in three consecutive nucleotides at positions 9, 10, 11 from the 5' end. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications in three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.

[00200] Em certas modalidades, o agente de dsRNAi compreende uma cadeia sentido de 21 nucleotídeos e uma cadeia antissentido de 23 nucleotídeos, em que a cadeia sentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a partir da extremidade 5’; a cadeia antissentido contém, pelo menos, um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’, em que uma extremidade do agente de RNAi cega, enquanto a outra extremidade compreende uma projeção de 2 nucleotídeos. Preferivelmente, a projeção de 2 nucleotídeos encontra-se na extremidade 3’ da cadeia antissentido.[00200] In certain embodiments, the dsRNAi agent comprises a sense strand of 21 nucleotides and an antisense strand of 23 nucleotides, wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications in three consecutive nucleotides at positions 9, 10, 11 from the 5' end; the antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications in three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end, wherein one end of the RNAi agent is blunt, while the other end comprises a 2-nucleotide overhang. Preferably, the 2-nucleotide overhang is at the 3' end of the antisense strand.

[00201] Quando a projeção de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da cadeia antissentido, podem existir duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos de projeção e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo pareado ao lado do nucleotídeo de projeção. Em uma modalidade, o agente de RNAi, adicionalmente, tem duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleótidos terminais tanto na extremidade 5’ da cadeia sentido e na extremidade 5’ da cadeia antissentido. Em certas modalidades, cada nucleotídeo na cadeia sentido e na cadeia antissentido do agente de dsRNAi, incluindo os nucleotídeos que fazem parte dos motivos, são nucleotídeos modificados. Em certas modalidades, cada resíduo é independentemente modificado com um 2’-O-metila ou 3’-fluoro, por exemplo, em um motivo alternado. Opcionalmente, o agente de dsRNAi compreende adicionalmente um ligante (preferivelmente GalNAc3).[00201] When the 2-nucleotide overhang is at the 3' end of the antisense strand, there may be two phosphorothioate internucleotide bonds between the three terminal nucleotides, wherein two of the three nucleotides are the overhang nucleotides and the third nucleotide is a paired nucleotide next to the overhang nucleotide. In one embodiment, the RNAi agent additionally has two phosphorothioate internucleotide bonds between the three terminal nucleotides at both the 5' end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand. In certain embodiments, each nucleotide in the sense strand and the antisense strand of the dsRNAi agent, including nucleotides that are part of motifs, are modified nucleotides. In certain embodiments, each residue is independently modified with a 2'-O-methyl or 3'-fluoro, e.g., in an alternating motif. Optionally, the dsRNAi agent further comprises a linker (preferably GalNAc3).

[00202] Em certas modalidades, o agente de dsRNAi compreende uma cadeia sentido e antissentido, em que a cadeia sentido tem 25 a 30 resíduos de nucleotídeos de comprimento, em que a partir do nucleotídeo de terminal 5'(posição 1) as posições 1 a 23 da primeira cadeia compreendem pelo menos 8 ribonucleotídeos; a cadeia antissentido tem 36 a 66 resíduos de nucleotídeos de comprimento e, a partir do nucleotídeo de terminal 3', compreende pelo menos 8 ribonucleotídeos nas posições pareadas com as posições 1 a 23 da cadeia sentido para formar um duplex; em que pelo menos o nucleotídeo de terminal 3' da cadeia antissentido é não pareado com cadeia sentido, e até 6 nucleotídeos de terminal 3' consecutivos não são pareados com cadeia sentido, formando assim uma projeção de cadeia simples 3' de 1 a 6 nucleotídeos; em que o terminal 5' da cadeia antissentido compreende de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos que não são pareados com a cadeia sentido, formando assim uma projeção 5' de cadeia simples com 10 a 30 nucleotídeos; em que pelo menos os nucleotídeos de terminal 5' e terminal 3' da cadeia sentido estão pareados com nucleotídeos da cadeia antissentido quando as cadeias sentido e antissentido estão alinhadas para a complementaridade máxima, formando assim uma região substancialmente duplexada entre cadeias sentido e antissentido; e a cadeia antissentido é suficientemente complementar a um RNA alvo ao longo de pelo menos 19 ribonucleotídeos de comprimento da cadeia antissentido de reduzir a expressão do gene alvo, quando o ácido nucleico de cadeia dupla é introduzido em uma célula de mamífero; e em que a cadeia sentido contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-F em três nucleotídeos consecutivos, em que pelo menos um dos motivos ocorre no sítio de clivagem ou perto do mesmo. A cadeia antissentido contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos no ou perto do sítio de clivagem.[00202] In certain embodiments, the dsRNAi agent comprises a sense and an antisense strand, wherein the sense strand is 25 to 30 nucleotide residues in length, wherein from the 5' terminal nucleotide (position 1) positions 1 to 23 of the first strand comprises at least 8 ribonucleotides; the antisense strand is 36 to 66 nucleotide residues in length and, from the 3' terminal nucleotide, comprises at least 8 ribonucleotides at positions paired with positions 1 to 23 of the sense strand to form a duplex; wherein at least the 3' terminal nucleotide of the antisense strand is unpaired with the sense strand, and up to 6 consecutive 3' terminal nucleotides are unpaired with the sense strand, thereby forming a 3' single-stranded overhang of 1 to 6 nucleotides; wherein the 5' terminus of the antisense strand comprises 10 to 30 consecutive nucleotides that are unpaired with the sense strand, thereby forming a 10 to 30 nucleotide single-stranded 5' overhang; wherein at least the 5' terminal and 3' terminal nucleotides of the sense strand are paired with nucleotides of the antisense strand when the sense and antisense strands are aligned for maximal complementarity, thereby forming a substantially duplexed region between sense and antisense strands; and the antisense strand is sufficiently complementary to a target RNA over at least 19 ribonucleotides of the length of the antisense strand to reduce expression of the target gene when the double-stranded nucleic acid is introduced into a mammalian cell; and wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications in three consecutive nucleotides, wherein at least one of the motifs occurs at or near the cleavage site. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications in three consecutive nucleotides at or near the cleavage site.

[00203] Em certas modalidades, o agente de dsRNAi compreende cadeias sentido e antissentido, em que o agente de dsRNAi compreende uma primeira cadeia com um comprimento que tem pelo menos 25 e no máximo 29 nucleotídeos e uma segunda cadeia com um comprimento que tem no máximo 30 nucleotídeos com pelo menos um motivo de três modificações 2’- O-metila em três nucleotídeos consecutivos na posição 11, 12, 13 da extremidade 5’; em que a extremidade 3’ da primeira cadeia e a extremidade 5’ da segunda cadeia formam uma extremidade cega e a segunda cadeia é 1 a 4 nucleotídeos mais longa na sua extremidade 3’ do que a primeira cadeia, em que a região de duplex que tem pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento e a segunda cadeia é suficientemente complementar a um mRNA alvo ao longo de pelo menos 19 nucleotídeos do comprimento da segunda cadeia para reduzir a expressão do gene alvo quando o agente de RNAi é introduzido em uma célula de mamífero e em que a clivagem de Dicer do agente de dsRNAi resulta preferivelmente em um siRNA compreendendo a extremidade 3’ da segunda cadeia, reduzindo assim a expressão do gene alvo no mamífero. Opcionalmente, o agente de dsRNAi compreende adicionalmente um ligante.[00203] In certain embodiments, the dsRNAi agent comprises sense and antisense strands, wherein the dsRNAi agent comprises a first strand with a length that is at least 25 and at most 29 nucleotides and a second strand with a length that is at most 30 nucleotides with at least one motif of three 2’-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at position 11, 12, 13 from the 5’ end; wherein the 3′ end of the first strand and the 5′ end of the second strand form a blunt end and the second strand is 1 to 4 nucleotides longer at its 3′ end than the first strand, wherein the duplex region is at least 25 nucleotides in length and the second strand is sufficiently complementary to a target mRNA over at least 19 nucleotides of the length of the second strand to reduce expression of the target gene when the RNAi agent is introduced into a mammalian cell, and wherein Dicer cleavage of the dsRNAi agent preferably results in an siRNA comprising the 3′ end of the second strand, thereby reducing expression of the target gene in the mammal. Optionally, the dsRNAi agent further comprises a linker.

[00204] Em certas modalidades, a cadeia sentido do agente de dsRNAi contém pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que um dos motivos ocorre no sítio de clivagem na cadeia sentido.[00204] In certain embodiments, the sense strand of the dsRNAi agent contains at least one motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides, wherein one of the motifs occurs at the cleavage site in the sense strand.

[00205] Em certas modalidades, a cadeia antissentido do agente de dsRNAi pode também conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que um dos motivos ocorre no ou perto do sítio de clivagem na cadeia antissentido.[00205] In certain embodiments, the antisense strand of the dsRNAi agent may also contain at least one motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides, wherein one of the motifs occurs at or near the cleavage site in the antisense strand.

[00206] Para um agente de dsRNAi com uma região de duplex de 17 a 23 nucleotídeos de comprimento, o sítio de clivagem da cadeia antissentido é tipicamente em torno das posições 10, 11 e 12 da extremidade 5’. Assim, os motivos de três modificações idênticas podem ocorrer nas posições 9, 10, 11; nas posições 10, 11, 12; nas posições 11, 12, 13; nas posições 12, 13, 14; ou nas posições 13, 14, 15 da cadeia antissentido, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo da extremidade 5’ da cadeia antissentido, ou a contagem partindo do primeiro nucleotídeo pareado dentro da região de duplex da extremidade 5’ da cadeia antissentido. O sítio de clivagem na cadeia antissentido também pode mudar de acordo com o comprimento da região de duplex do agente de dsRNAi a partir da extremidade 5'.[00206] For a dsRNAi agent with a duplex region 17 to 23 nucleotides in length, the antisense strand cleavage site is typically around positions 10, 11, and 12 from the 5' end. Thus, motifs of three identical modifications may occur at positions 9, 10, 11; at positions 10, 11, 12; at positions 11, 12, 13; at positions 12, 13, 14; or at positions 13, 14, 15 of the antisense strand, counting starting from the first nucleotide of the 5' end of the antisense strand, or counting starting from the first paired nucleotide within the duplex region of the 5' end of the antisense strand. The cleavage site on the antisense strand may also change depending on the length of the dsRNAi agent duplex region from the 5' end.

[00207] A cadeia sentido do agente de dsRNAi pode conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no sítio de clivagem da cadeia; e a cadeia antissentido pode ter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no ou perto do sítio de clivagem da cadeia. Quando a cadeia sentido e a cadeia antissentido formam um duplex de dsRNA, a cadeia sentido e a cadeia antissentido podem ser alinhadas de tal modo que um motivo dos três nucleotídeos na cadeia sentido e um motivo dos três nucleotídeos na cadeia antissentido têm pelo menos uma projeçao de nucleotídeos, isto é, pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na cadeia sentido forma um par de bases com pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na cadeia antissentido. Alternativamente, pelo menos dois nucleotídeos podem se sobrepor, ou todos os três nucleotídeos podem se sobrepor.[00207] The sense strand of the dsRNAi agent may contain at least one motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides at the strand cleavage site; and the antisense strand may have at least one motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides at or near the strand cleavage site. When the sense strand and the antisense strand form a dsRNA duplex, the sense strand and the antisense strand may be aligned such that a motif of the three nucleotides in the sense strand and a motif of the three nucleotides in the antisense strand have at least one nucleotide overhang, i.e., at least one of the three nucleotides of the motif in the sense strand forms a base pair with at least one of the three nucleotides of the motif in the antisense strand. Alternatively, at least two nucleotides may overlap, or all three nucleotides may overlap.

[00208] Em algumas modalidades, a cadeia sentido do agente de dsRNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. O primeiro motivo pode ocorrer no ou perto do sítio de clivagem da cadeia e os outros motivos podem ser uma modificação de asa. O termo “modificação de asa” aqui refere-se a um motivo que ocorre em outra porção da cadeia que é separada do motivo no ou perto do sítio de clivagem da mesma cadeia. A modificação de asa é adjacente ao primeiro motivo ou é separada por pelo menos um ou mais nucleotídeos. Quando os motivos são imediatamente adjacentes um ao outro, então as químicas dos motivos são distintas umas das outras, e quando os motivos são separados por um ou mais nucleotídeos, as químicas podem ser iguais ou diferentes. Duas ou mais modificações de asa podem estar presentes. Por exemplo, quando estão presentes duas modificações de asas, cada modificação de asa pode ocorrer em uma extremidade em relação ao primeiro motivo que está no ou perto do sítio de clivagem ou em cada lado do motivo principal.[00208] In some embodiments, the sense strand of the dsRNAi agent may contain more than one motif of three identical modifications at three consecutive nucleotides. The first motif may occur at or near the cleavage site of the strand, and the other motifs may be a wing modification. The term "wing modification" herein refers to a motif that occurs in another portion of the strand that is separate from the motif at or near the cleavage site of the same strand. The wing modification is adjacent to the first motif or is separated by at least one or more nucleotides. When the motifs are immediately adjacent to each other, then the chemistries of the motifs are distinct from each other, and when the motifs are separated by one or more nucleotides, the chemistries may be the same or different. Two or more wing modifications may be present. For example, when two wing modifications are present, each wing modification may occur at one end relative to the first motif that is at or near the cleavage site or on either side of the main motif.

[00209] Tal como a cadeia sentido, a cadeia antissentido do agente de dsRNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, com pelo menos um dos motivos ocorrendo no ou perto do sítio de clivagem da cadeia. Essa cadeia antissentido pode também conter uma ou mais modificações de asa em um alinhamento semelhante às modificações de asa que podem estar presentes na cadeia sentido.[00209] Like the sense strand, the antisense strand of the dsRNAi agent may contain more than one motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides, with at least one of the motifs occurring at or near the cleavage site of the strand. Such an antisense strand may also contain one or more wing modifications in a similar alignment to the wing modifications that may be present in the sense strand.

[00210] Em algumas modalidades, a modificação de asa na cadeia sentido ou cadeia antissentido do agente de dsRNAi tipicamente não inclui os primeiros um ou dois nucleotídeos terminais na extremidade 3’, extremidade 5’, ou ambas as extremidades da cadeia.[00210] In some embodiments, the wing modification on the sense strand or antisense strand of the dsRNAi agent typically does not include the first one or two terminal nucleotides at the 3' end, 5' end, or both ends of the strand.

[00211] Em outras modalidades, a modificação de asa na cadeia sentido ou cadeia antissentido do agente de dsRNAi tipicamente não inclui os primeiros um ou dois nucleotídeos pareados dentro da região de duplex na extremidade 3’, extremidade 5’, ou ambas as extremidades da cadeia.[00211] In other embodiments, the wing modification on the sense strand or antisense strand of the dsRNAi agent typically does not include the first one or two paired nucleotides within the duplex region at the 3' end, 5' end, or both ends of the strand.

[00212] Quando a cadeia sentido e a cadeia antissentido do agente de dsRNAi contêm, cada uma, pelo menos uma modificação de asa, as modificações de asa podem cair na mesma extremidade da região de duplex e ter uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos.[00212] When the sense strand and the antisense strand of the dsRNAi agent each contain at least one wing modification, the wing modifications may fall on the same end of the duplex region and have an overlap of one, two, or three nucleotides.

[00213] Quando a cadeia sentido e a cadeia antissentido do agente de dsRNAi contém, cada uma, pelo menos duas modificações de asa, a cadeia sentido e a cadeia antissentido podem ser alinhadas de tal modo que duas modificações cada de uma cadeia ficam em uma extremidade da região de duplex, com uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações cada de uma cadeia ficam na outra extremidade da região de duplex, com uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações de uma cadeia ficam em cada lado do motivo principal, com uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos na região de duplex.[00213] When the sense strand and the antisense strand of the dsRNAi agent each contain at least two wing modifications, the sense strand and the antisense strand can be aligned such that two modifications each of one strand lie at one end of the duplex region, with an overlap of one, two, or three nucleotides; two modifications each of one strand lie at the other end of the duplex region, with an overlap of one, two, or three nucleotides; two modifications of one strand lie on either side of the backbone motif, with an overlap of one, two, or three nucleotides in the duplex region.

[00214] Em algumas modalidades, cada nucleotídeo na cadeia sentido e cadeia antissentido do agente de dsRNAi, incluindo os nucleotídeos que são parte dos motivos, pode ser modificado. Cada nucleotídeo pode ser modificado com a modificação igual ou diferente que pode incluir uma ou mais alterações de um ou ambos os oxigênios de fosfato não ligantes ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato ligantes; alteração de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da 2‘-hidroxila no açúcar ribose; substituição indiscriminada do radical fosfato por ligadores “defosfo”; modificação ou substituição de uma base de ocorrência natural; e substituição ou modificação da estrutura dorsal de ribose-fosfato.[00214] In some embodiments, each nucleotide in the sense strand and antisense strand of the dsRNAi agent, including nucleotides that are part of the motifs, can be modified. Each nucleotide can be modified with the same or different modification that can include one or more alterations of one or both of the non-bonding phosphate oxygens or one or more of the bonding phosphate oxygens; alteration of a constituent of the ribose sugar, e.g., the 2′-hydroxyl in the ribose sugar; indiscriminate replacement of the phosphate moiety with “dephospho” linkers; modification or replacement of a naturally occurring base; and replacement or modification of the ribose-phosphate backbone.

[00215] Como os ácidos nucleicos são polímeros de subunidades, muitas das modificações ocorrem em uma posição que é repetida dentro de um ácido nucleico, por exemplo, uma modificação de uma base, ou um radical fosfato, ou um O não ligante de um radical fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições sujeitas no ácido nucleico, mas em muitos casos não ocorrerá. A título de exemplo, uma modificação pode ocorrer apenas na posição terminal 3' ou 5', pode ocorrer apenas em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma cadeia. Uma modificação pode ocorrer em uma região de cadeia dupla, uma região de cadeia simples ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de cadeia dupla de um agente de dsRNAi ou pode ocorrer apenas em uma região de cadeia simples de um agente de dsRNAi. Por exemplo, uma modificação de fosforotioato em uma posição O não ligante pode ocorrer apenas em uma ou ambas as extremidades, pode ocorrer apenas em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal, ou nos últimos 2, 3, 4, 5, ou 10 nucleotídeos de uma cadeia, ou podem ocorrer em regiões de cadeia dupla e cadeia simples, particularmente nas extremidades. A extremidade ou extremidades 5’ podem ser fosforiladas.[00215] Because nucleic acids are polymers of subunits, many modifications occur at a position that is repeated within a nucleic acid, for example, a modification of a base, or a phosphate moiety, or a non-linking O of a phosphate moiety. In some cases, the modification will occur at all subject positions in the nucleic acid, but in many cases it will not. For example, a modification may occur only at the 3' or 5' terminal position, it may occur only at a terminal region, for example, at a position at a terminal nucleotide, or in the last 2, 3, 4, 5, or 10 nucleotides of a chain. A modification may occur at a double-stranded region, a single-stranded region, or both. A modification may occur only at the double-stranded region of a dsRNAi agent, or it may occur only at a single-stranded region of a dsRNAi agent. For example, a phosphorothioate modification at a non-linking O-position may occur only at one or both ends, may occur only at a terminal region, e.g., at a position at a terminal nucleotide, or in the last 2, 3, 4, 5, or 10 nucleotides of a chain, or may occur in double-stranded and single-stranded regions, particularly at the ends. The 5' end or ends may be phosphorylated.

[00216] Pode ser possível, por exemplo, intensificar a estabilidade, incluir bases particulares em projeções, ou incluir nucleotídeos modificados ou substitutos de nucleotídeos, em projeções de cadeia simples, por exemplo, em uma projeção de 5’ ou 3’, ou em ambas. Por exemplo, pode ser desejável incluir nucleotídeos de purina em projeções. Em algumas modalidades, todas ou algumas das bases em uma projeção 3’ ou 5’ podem ser modificadas, por exemplo, com uma modificação descrita aqui. Modificações podem incluir, por exemplo, o uso de modificações na posição 2’ do açúcar ribose com modificações que são conhecidas na técnica, por exemplo, o uso de desoxirribonucleotídeos, 2’-desoxi-2’-fluoro (2’-F) ou 2’-O-metila modificada em vez do riboaçúcar da nucleobase, e modificações no grupo fosfato, por exemplo, modificações de fosforotioato. As projeções não precisam ser homólogas à sequência alvo.[00216] It may be possible, for example, to enhance stability, to include particular bases in overhangs, or to include modified nucleotides or nucleotide substitutes, in single-stranded overhangs, e.g., in a 5' or 3' overhang, or both. For example, it may be desirable to include purine nucleotides in overhangs. In some embodiments, all or some of the bases in a 3' or 5' overhang may be modified, e.g., with a modification described herein. Modifications may include, for example, using modifications at the 2' position of the ribose sugar with modifications that are known in the art, e.g., using deoxyribonucleotides, 2'-deoxy-2'-fluoro (2'-F), or 2'-O-methyl modified in place of the nucleobase ribosugar, and modifications at the phosphate group, e.g., phosphorothioate modifications. Overhangs need not be homologous to the target sequence.

[00217] Em algumas modalidades, cada resíduo da cadeia sentido e de cadeia antissentido é modificado independentemente com LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’- O-metila, 2’-O-alila, 2’-C- alila, 2’- desoxi, 2’-hidroxila, ou 2’-fluoro. As cadeias podem conter mais de uma modificação. Em uma modalidade, cada resíduo da cadeia sentido e cadeia antissentido é modificado independentemente com 2’-O-metila ou 2’-fluoro.[00217] In some embodiments, each residue of the sense strand and antisense strand is independently modified with LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-methoxyethyl, 2'-O-methyl, 2'-O-allyl, 2'-C-allyl, 2'-deoxy, 2'-hydroxyl, or 2'-fluoro. The strands may contain more than one modification. In one embodiment, each residue of the sense strand and antisense strand is independently modified with 2'-O-methyl or 2'-fluoro.

[00218] Pelo menos duas modificações diferentes estão tipicamente presentes na cadeia sentido e cadeia antissentido. Essas duas modificações podem ser as modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro, ou outras.[00218] At least two different modifications are typically present on the sense strand and antisense strand. These two modifications may be the 2'-O-methyl or 2'-fluoro modifications, or others.

[00219] Em certas modalidades, Na ou Nb compreendem modificações de um padrão alternado. O termo “motivo alternado”, tal como usado aqui, refere-se a um motivo com uma ou mais modificações, cada modificação ocorrendo em nucleotídeos alternados de uma cadeia. O nucleotídeo alternado pode se referir a um a cada dois nucleotídeos ou um a cada três nucleotídeos, ou um padrão similar. Por exemplo, se A, B e C representam um tipo de modificação do nucleotídeo, o motivo alternado pode ser “ABABABABABAB ...,” “AABBAABBAABB ...,” “AABAABAABAAB .,” “AAABAAABAAAB ...,” “AAABBBAAABBB...,” ou “ABCABCABCABC...,” etc.[00219] In certain embodiments, Na or Nb comprise modifications of an alternating pattern. The term “alternating motif,” as used herein, refers to a motif with one or more modifications, each modification occurring at alternating nucleotides of a chain. The alternating nucleotide may refer to one every two nucleotides or one every three nucleotides, or a similar pattern. For example, if A, B, and C represent a type of nucleotide modification, the alternating motif may be “ABABABABABAB...,” “AABBAABBAABB...,” “AABAABAABAAB...,” “AAABAAABAAAB...,” “AAABBBAAABBB...,” or “ABCABCABCABC...,” etc.

[00220] O tipo de modificações contidas no motivo alternado pode ser o mesmo ou diferente. Por exemplo, se A, B, C, D, cada, representam um tipo de modificação no nucleotídeo, o padrão alternado, ou seja, modificações a cada dois nucleotídeos, pode ser o mesmo, mas cada uma das cadeia sentido ou cadeia antissentido pode ser selecionada de várias possibilidades de modificações dentro do motivo alternado, como “ABABAB.”, “ACACAC.” “BDBDBD.” ou “CDCDCD.” etc.[00220] The type of modifications contained in the alternating motif may be the same or different. For example, if A, B, C, D each represent a type of modification in the nucleotide, the alternating pattern, i.e., modifications every two nucleotides, may be the same, but each of the sense strand or antisense strand may be selected from several possibilities of modifications within the alternating motif, such as “ABABAB.”, “ACACAC.” “BDBDBD.” or “CDCDCD.” etc.

[00221] Em algumas modalidades, o agente de dsRNAi da invenção compreende o padrão de modificação para o motivo alternado na cadeia sentido em relação ao padrão de modificação para o motivo alternado na cadeia antissentido é deslocado. O deslocamento pode ser tal que o grupo modificado de nucleotídeos da cadeia sentido corresponda a um grupo de nucleotídeos modificado de forma diferente da cadeia antissentido e vice- versa. Por exemplo, a cadeia sentido quando pareada com a cadeia antissentido no duplex de dsRNA, o motivo alternado na cadeia sentido pode começar com “ABABAB” de 5’ a 3’ da cadeia e o motivo alternado na cadeia antissentido pode começar com “BABABA” de 5’ a 3’ da cadeia dentro da região de duplex. Como outro exemplo, o motivo alternado na cadeia sentido pode começar com “AABBAABB” de 5’ para 3’ da cadeia e o motivo alternado na cadeia antissentido pode começar com “BBAABBAA” de 5’ para 3’ da cadeia dentro da região de duplex, de modo que haja um deslocamento completo ou parcial dos padrões de modificação entre a cadeia sentido e a cadeia antissentido.[00221] In some embodiments, the dsRNAi agent of the invention comprises the modification pattern for the alternating motif in the sense strand relative to the modification pattern for the alternating motif in the antisense strand is shifted. The shift may be such that the modified group of nucleotides of the sense strand corresponds to a differently modified group of nucleotides of the antisense strand, and vice versa. For example, the sense strand when paired with the antisense strand in the dsRNA duplex, the alternating motif in the sense strand may begin with “ABABAB” from 5’ to 3’ of the strand and the alternating motif in the antisense strand may begin with “BABABA” from 5’ to 3’ of the strand within the duplex region. As another example, the alternating motif in the sense strand may start with “AABBAABB” from 5’ to 3’ of the strand and the alternating motif in the antisense strand may start with “BBAABBAA” from 5’ to 3’ of the strand within the duplex region, so that there is a complete or partial shift in modification patterns between the sense strand and the antisense strand.

[00222] Em algumas modalidades, o agente de dsRNAi compreende o padrão do motivo alternado da modificação 2'-O-metila e a modificação 2'-F na cadeia sentido tem inicialmente um deslocamento relativo ao padrão do motivo alternado da modificação 2'-O-metila e modificação 2'-F na cadeia antissentido inicialmente, ou seja, o nucleotídeo modificado com 2'-O-metila na cadeia sentido forma pares de bases com um nucleotídeo modificado com 2'-F na cadeia antissentido e vice-versa. A posição 1 da cadeia sentido pode começar com a modificação 2'-F, e a posição 1 da cadeia antissentido pode começar com a modificação 2'-O-metila.[00222] In some embodiments, the dsRNAi agent comprises the alternating motif pattern of the 2'-O-methyl modification and the 2'-F modification on the sense strand initially has an offset relative to the alternating motif pattern of the 2'-O-methyl modification and the 2'-F modification on the antisense strand initially, i.e., the 2'-O-methyl modified nucleotide on the sense strand forms base pairs with a 2'-F modified nucleotide on the antisense strand and vice versa. Position 1 of the sense strand may begin with the 2'-F modification, and position 1 of the antisense strand may begin with the 2'-O-methyl modification.

[00223] A introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos para a cadeia sentido ou cadeia antissentido interrompe o padrão de modificação inicial presente na cadeia sentido ou cadeia antissentido. Essa interrupção do padrão de modificação da cadeia sentido ou antissentido através da introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos para a cadeia sentido ou antissentido pode intensificar a atividade de silenciamento de genes contra o gene alvo.[00223] The introduction of one or more identical three-modification motifs at three consecutive nucleotides to the sense strand or antisense strand disrupts the initial modification pattern present in the sense strand or antisense strand. Such disruption of the sense or antisense strand modification pattern by the introduction of one or more identical three-modification motifs at three consecutive nucleotides to the sense or antisense strand can enhance gene silencing activity against the target gene.

[00224] Em algumas modalidades, quando o motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos é introduzido em qualquer das cadeias, a modificação do nucleotídeo ao lado do motivo é uma modificação diferente da modificação do motivo. Por exemplo, a porção da sequência que contém o motivo é “...NaYYYNb...,” onde “Y” representa a modificação do motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e “Na” e “Nb” representam uma modificação no nucleotídeo ao lado do motivo “YYY” que é diferente da modificação de Y, e onde Na e Nb podem ser modificações iguais ou diferentes. Alternativamente, Na ou Nb pode estar presente ou ausente quando há uma modificação de asa presente.[00224] In some embodiments, when the motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides is introduced into either strand, the nucleotide modification next to the motif is a different modification than the motif modification. For example, the portion of the sequence containing the motif is “...NaYYYNb...,” where “Y” represents the motif modification of three identical modifications in three consecutive nucleotides, and “Na” and “Nb” represent a modification in the nucleotide next to the “YYY” motif that is different than the Y modification, and where Na and Nb may be the same or different modifications. Alternatively, Na or Nb may be present or absent when there is a wing modification present.

[00225] O iRNA pode compreender adicionalmente pelo menos uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato. A modificação de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato pode ocorrer em qualquer nucleotídeo da cadeia sentido, cadeia antissentido, ou ambas as cadeias em qualquer posição da cadeia. Por exemplo, a modificação de ligação internucleotídica pode ocorrer em todos os nucleotídeos na cadeia sentido ou cadeia antissentido; cada modificação de ligação internucleotídica pode ocorrer em um padrão alternado na cadeia sentido ou cadeia antissentido; ou a cadeia sentido ou cadeia antissentido pode conter ambas as modificações de ligação internucleotídica em um padrão alternado. O padrão alternado da modificação de ligação internucleotídica na cadeia sentido pode ser o mesmo ou diferente a partir da cadeia antissentido, e o padrão alternado da modificação de ligação internucleotídica na cadeia sentido pode ter um deslocamento em relação ao padrão alternado da modificação de ligação internucleotídica na cadeia antissentido. Em uma modalidade, um agente de RNAi de cadeia dupla compreende 6 a 8 ligações internucleotídicas de fosforotioato. Em algumas modalidades, a cadeia antissentido compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato na extremidade 5’ e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato na extremidade 3’, e a cadeia sentido compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas de fosforotioato na extremidade 5’ ou na extremidade 3’.[00225] The iRNA may further comprise at least one phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond. The phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond modification may occur at any nucleotide of the sense strand, antisense strand, or both strands at any position on the strand. For example, the internucleotide bond modification may occur at all nucleotides in the sense strand or antisense strand; each internucleotide bond modification may occur in an alternating pattern on the sense strand or antisense strand; or the sense strand or antisense strand may contain both internucleotide bond modifications in an alternating pattern. The alternating pattern of internucleotide bond modification in the sense strand may be the same as or different from that in the antisense strand, and the alternating pattern of internucleotide bond modification in the sense strand may be offset from the alternating pattern of internucleotide bond modification in the antisense strand. In one embodiment, a double-stranded RNAi agent comprises 6 to 8 phosphorothioate internucleotide bonds. In some embodiments, the antisense strand comprises two phosphorothioate internucleotide bonds at the 5' end and two phosphorothioate internucleotide bonds at the 3' end, and the sense strand comprises at least two phosphorothioate internucleotide bonds at either the 5' end or the 3' end.

[00226] Em algumas modalidades, o agente de dsRNAi compreende uma modificação de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato na região da projeção. Por exemplo, a região de projeção pode conter dois nucleotídeos com uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato entre os dois nucleotídeos. Modificações de ligação internucleotídica também podem ser feitas para ligar os nucleotídeos de projeção com os nucleotídeos terminais pareados dentro da região de duplex. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos os nucleotídeos de projeção podem ser ligados através de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato e, opcionalmente, podem existir ligações internucleotídicas de fosforotioato ou metilfosfonato adicionais ligando o nucleotídeo de projeção com um nucleotídeo pareado que é próximo do nucleotídeo de projeção. Por exemplo, pode haver pelo menos duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são nucleotídeos de projeção, e o terceiro é um nucleotídeo pareado próximo do nucleotídeo de projeção. Esses três nucleotídeos terminais podem estar na extremidade 3’ da cadeia antissentido, na extremidade 3’ da cadeia sentido, na extremidade 5’ da cadeia antissentido ou na extremidade 5’ da cadeia antissentido.[00226] In some embodiments, the dsRNAi agent comprises a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage modification in the overhang region. For example, the overhang region may contain two nucleotides with a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage between the two nucleotides. Internucleotide linkage modifications may also be made to link the overhang nucleotides with paired terminal nucleotides within the duplex region. For example, at least 2, 3, 4, or all of the overhang nucleotides may be linked via a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage, and optionally, there may be additional phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkages linking the overhang nucleotide with a paired nucleotide that is proximal to the overhang nucleotide. For example, there may be at least two phosphorothioate internucleotide bonds between the three terminal nucleotides, where two of the three nucleotides are overhang nucleotides, and the third is a paired nucleotide near the overhang nucleotide. These three terminal nucleotides may be at the 3' end of the antisense strand, the 3' end of the sense strand, the 5' end of the antisense strand, or the 5' end of the antisense strand.

[00227] Em algumas modalidades, a projeção de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da cadeia antissentido, e existem duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos de projeção e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo pareado ao lado do nucleotídeo de projeção. Opcionalmente, o agente de dsRNAi pode adicionalmente ter duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleótidos terminais tanto na extremidade 5’ da cadeia sentido e na extremidade 5’ da cadeia antissentido.[00227] In some embodiments, the 2-nucleotide overhang is at the 3' end of the antisense strand, and there are two phosphorothioate internucleotide bonds between the three terminal nucleotides, wherein two of the three nucleotides are the overhang nucleotides and the third nucleotide is a paired nucleotide next to the overhang nucleotide. Optionally, the dsRNAi agent may additionally have two phosphorothioate internucleotide bonds between the three terminal nucleotides at both the 5' end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand.

[00228] Em uma modalidade, o agente de dsRNAi compreende incompatibilidade(s) com o alvo, dentro do duplex, ou combinações dos mesmos. A incompatibilidade pode ocorrer na região de projeção ou na região de duplex. O par de bases pode ser classificado com base em sua propensão para promover dissociação ou fusão (por exemplo, na energia livre de associação ou dissociação de um pareamento particular, a abordagem mais simples é examinar os pares em uma base de par individual, embora próximo vizinho ou análise similar também possa ser usada). Em termos de promoção de dissociação: A:U é preferido em relação a G:C; G:U é preferido em relação a G:C; e I:C é preferido em relação a G:C (I=inosina). Incompatibilidades, por exemplo, pareamentos não canônicos ou diferentes dos canônicos (como aqui descrito em outro lugar) são preferidos em relação aos pareamentos canônicos (A:T, A:U, G:C); e os pareamentos que incluem uma base universal são preferidos em relação aos pareamentos canônicos.[00228] In one embodiment, the dsRNAi agent comprises mismatch(s) with the target, within the duplex, or combinations thereof. The mismatch may occur in the overhang region or in the duplex region. The base pair may be classified based on its propensity to promote dissociation or fusion (e.g., in the free energy of association or dissociation of a particular pairing, the simplest approach is to examine the pairs on an individual pair basis, although next-neighbor or similar analysis may also be used). In terms of promoting dissociation: A:U is preferred over G:C; G:U is preferred over G:C; and I:C is preferred over G:C (I=inosine). Mismatches, e.g., non-canonical or non-canonical pairings (as described elsewhere herein) are preferred over canonical pairings (A:T, A:U, G:C); and pairings that include a universal basis are preferred over canonical pairings.

[00229] Em certas modalidades, o agente de dsRNAi compreende pelo menos um dos primeiros 1, 2, 3, 4 ou 5 pares de bases dentro das regiões de duplex da extremidade 5' da cadeia antissentido independentemente selecionada do grupo de: A:U, G:U, I:C e pares incompatíveis, por exemplo, pareamentos não canônicos ou diferentes dos canônicos ou pareamentos que incluem uma base universal, para promover a dissociação da cadeia antissentido na extremidade 5' do duplex.[00229] In certain embodiments, the dsRNAi agent comprises at least one of the first 1, 2, 3, 4, or 5 base pairs within the duplex regions of the 5' end of the antisense strand independently selected from the group of: A:U, G:U, I:C, and mismatched pairs, e.g., non-canonical or non-canonical pairings or pairings that include a universal base, to promote dissociation of the antisense strand at the 5' end of the duplex.

[00230] Em certas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região de duplex a partir da extremidade 5' na cadeia antissentido é selecionado de A, dA, dU, U e dT. Alternativamente, pelo menos um dos primeiros 1, 2 ou 3 pares de bases dentro da região de duplex a partir da extremidade 5' da cadeia antissentido é um par de bases AU. Por exemplo, o primeiro par de bases dentro da região de duplex a partir da extremidade 5' da cadeia antissentido é um par de bases AU.[00230] In certain embodiments, the nucleotide at position 1 within the duplex region from the 5' end in the antisense strand is selected from A, dA, dU, U, and dT. Alternatively, at least one of the first 1, 2, or 3 base pairs within the duplex region from the 5' end of the antisense strand is an AU base pair. For example, the first base pair within the duplex region from the 5' end of the antisense strand is an AU base pair.

[00231] Em outras modalidades, o nucleotídeo na extremidade 3' da cadeia sentido é desoxitimidina (dT) ou o nucleotídeo na extremidade 3' da cadeia antissentido é desoxitimidina (dT). Por exemplo, existe uma sequência curta de nucleotídeos de desoxitimidina, por exemplo, dois nucleotídeos dT na extremidade 3' da cadeia sentido, antissentido, ou ambas as cadeias.[00231] In other embodiments, the nucleotide at the 3' end of the sense strand is deoxythymidine (dT) or the nucleotide at the 3' end of the antisense strand is deoxythymidine (dT). For example, there is a short sequence of deoxythymidine nucleotides, e.g., two dT nucleotides at the 3' end of the sense strand, antisense strand, or both strands.

[00232] Em certas modalidades, a sequência da cadeia sentido pode ser representada pela fórmula (I): em que: i e j são, cada um, independentemente 0 ou 1; p e q são, cada um, independentemente 0 a 6; cada Na representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos modificados; cada np e nq representa independentemente um nucleotídeo de projeção; em que Nb e Y não têm a mesma modificação; e XXX, YYY, e ZZZ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. Preferivelmente YYY é todos os nucleotídeos modificados com 2’-F.[00232] In certain embodiments, the sense chain sequence may be represented by formula (I): wherein: i and j are each independently 0 or 1; p and q are each independently 0 to 6; each N independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 modified nucleotides, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 modified nucleotides; each np and nq independently represents a projection nucleotide; wherein Nb and Y do not have the same modification; and XXX, YYY, and ZZZ each independently represent a motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides. Preferably YYY is all nucleotides modified with 2'-F.

[00233] Em algumas modalidades, Na ou Nb compreende modificações de padrão alternado.[00233] In some embodiments, Na or Nb comprises alternating pattern modifications.

[00234] Em algumas modalidades, o motivo YYY ocorre no ou próximo ao sítio de clivagem da cadeia sentido. Por exemplo, quando o agente de dsRNAi tem uma região de duplex de 17 a 23 nucleotídeos de comprimento, o motivo YYY pode ocorrer na vizinhança do sítio de clivagem (por exemplo: pode ocorrer nas posições 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11,12; ou 11, 12, 13) da cadeia sentido, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo, a partir da extremidade 5’-; ou, opcionalmente, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo pareado dentro da região de duplex, a partir da extremidade 5’-.[00234] In some embodiments, the YYY motif occurs at or near the cleavage site of the sense strand. For example, when the dsRNAi agent has a duplex region of 17 to 23 nucleotides in length, the YYY motif may occur in the vicinity of the cleavage site (e.g., may occur at positions 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11,12; or 11, 12, 13) of the sense strand, counting starting from the first nucleotide, from the 5’- end; or, optionally, counting starting from the first paired nucleotide within the duplex region, from the 5’- end.

[00235] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0, ou i é 0 e j é 1, ou tanto i quanto j são 1. A cadeia sentido pode, portanto, ser representada pelas seguintes fórmulas: [00235] In one embodiment, i is 1 and j is 0, or i is 0 and j is 1, or both i and j are 1. The sense string may therefore be represented by the following formulas:

[00236] Quando a cadeia sentido é representada pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00236] When the sense strand is represented by formula (Ib), Nb represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na can independently represent an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00237] Quando a cadeia sentido é representada como fórmula (Ic), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00237] When the sense strand is represented as formula (Ic), Nb represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na can independently represent an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00238] Quando a cadeia sentido é representada como fórmula (Id), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Preferivelmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00238] When the sense strand is represented as formula (Id), each Nb independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Preferably, Nb is 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6. Each Na can independently represent an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00239] Cada um de X, Y e Z pode ser igual ou diferente um do outro.[00239] Each of X, Y, and Z may be equal to or different from each other.

[00240] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e a cadeia sentido pode ser representada pela fórmula: [00240] In other embodiments, i is 0 and j is 0, and the sense string can be represented by the formula:

[00241] Quando a cadeia sentido é representada pela fórmula (Ia), cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00241] When the sense strand is represented by formula (Ia), each Na may independently represent an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00242] Em uma modalidade, a sequência da cadeia antissentido do RNAi pode ser representada pela fórmula (II): em que: k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; p’ e q’ são, cada um, independentemente 0 a 6; cada Na’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb’ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos modificados; cada np‘ e nq‘ representa independentemente um nucleotídeo de projeção; em que Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação; e X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.[00242] In one embodiment, the sequence of the RNAi antisense strand may be represented by formula (II): wherein: k and − k are each independently 0 or 1; p' and q' are each independently 0 to 6; each Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 modified nucleotides, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 modified nucleotides; each np' and nq' independently represents a projection nucleotide; wherein Nb' and Y' do not have the same modification; and X'X'X', Y'Y'Y', and Z'Z'Z' each independently represent a motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides.

[00243] Em algumas modalidades, Na’ ou Nb’ compreende modificações de padrão alternado.[00243] In some embodiments, Na’ or Nb’ comprises alternating pattern modifications.

[00244] O motivo Y’Y’Y’ ocorre no ou próximo ao sítio de clivagem da cadeia antissentido. Por exemplo, quando o agente de dsRNAi tem uma região de duplex de 17 a 23 nucleotídeos de comprimento, o motivo Y’Y’Y’ pode ocorrer nas posições 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 da cadeia antissentido, com a contagem partindo do primeiro nucleotídeo, a partir da extremidade 5’-; ou, opcionalmente, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo pareado dentro da região de duplex, a partir da extremidade 5’-. Preferivelmente, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12, 13.[00244] The Y’Y’Y’ motif occurs at or near the cleavage site of the antisense strand. For example, when the dsRNAi agent has a duplex region of 17 to 23 nucleotides in length, the Y’Y’Y’ motif may occur at positions 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; or 13, 14, 15 of the antisense strand, with counting starting from the first nucleotide, from the 5’- end; or, optionally, counting starting from the first paired nucleotide within the duplex region, from the 5’- end. Preferably, the Y’Y’Y’ motif occurs at positions 11, 12, 13.

[00245] Em certas modalidades, o motivo Y’Y’Y’ é todos os nucleotídeos modificados com 2’-OMe.[00245] In certain embodiments, the Y’Y’Y’ motif is all nucleotides modified with 2’-OMe.

[00246] Em certas modalidades, k é 1 e l é 0, ou k é 0 e l é 1, ou tanto k quanto l são 1.[00246] In certain embodiments, k is 1 and l is 0, or k is 0 and l is 1, or both k and l are 1.

[00247] A cadeia antissentido pode, portanto, ser representada pelas seguintes fórmulas: [00247] The antisense strand can therefore be represented by the following formulas:

[00248] Quando a cadeia antissentido é representada pela fórmula (IIb), Nb’representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00248] When the antisense strand is represented by formula (IIb), Nb' represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00249] Quando a cadeia antissentido é representada como fórmula (IIc), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00249] When the antisense strand is represented as formula (IIc), Nb' represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00250] Quando a cadeia antissentido é representada como fórmula (IId), cada Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados. Preferivelmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.[00250] When the antisense strand is represented as formula (IId), each Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides. Preferably, Nb is 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[00251] Em outras modalidades, k é 0 e l é 0 e a cadeia antissentido pode ser representada pela fórmula: [00251] In other embodiments, k is 0 and l is 0 and the antisense strand can be represented by the formula:

[00252] Quando a cadeia antissentido é representada como fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00252] When the antisense strand is represented as formula (IIa), each Na’ independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00253] Cada um de X’, Y’ e Z’ pode ser igual ou diferente um do outro.[00253] Each of X’, Y’ and Z’ may be equal or different from each other.

[00254] Cada nucleotídeo da cadeia sentido e de cadeia antissentido pode ser modificado independentemente com LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’- O-metila, 2’-O-alila, 2’-C- alila, 2’-hidroxila, ou 2’-fluoro. Por exemplo, cada nucleotídeo da cadeia sentido e cadeia antissentido é modificado independentemente com 2’-O-metila ou 2’-fluoro. Cada X, Y, Z, X’, Y’, e Z’, em particular, pode representar uma modificação 2’-O-metila ou uma modificação 2’-fluoro.[00254] Each nucleotide of the sense strand and antisense strand can be independently modified with LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-methoxyethyl, 2'-O-methyl, 2'-O-allyl, 2'-C-allyl, 2'-hydroxyl, or 2'-fluoro. For example, each nucleotide of the sense strand and antisense strand is independently modified with 2'-O-methyl or 2'-fluoro. Each X, Y, Z, X', Y', and Z', in particular, can represent a 2'-O-methyl modification or a 2'-fluoro modification.

[00255] Em algumas modalidades, a cadeia sentido do agente de dsRNAi pode conter motivo YYY ocorrendo nas posições 9, 10, e 11 da cadeia quando a região de duplex é de 21 nt, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo da extremidade 5’, ou opcionalmente, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo pareado dentro da região de duplex, a partir do extremidade 5’; e Y representa uma modificação 2’-F. A cadeia sentido pode conter adicionalmente motivo XXX ou motivos ZZZ como modificações de asa na extremidade oposta da região de duplex; e XXX e ZZZ, cada um, representa, independentemente uma modificação 2’-OMe ou modificação 2’- F.[00255] In some embodiments, the sense strand of the dsRNAi agent may contain motif YYY occurring at positions 9, 10, and 11 of the strand when the duplex region is 21 nt, counting starting from the first nucleotide from the 5' end, or optionally, counting starting from the first paired nucleotide within the duplex region, from the 5' end; and Y represents a 2'-F modification. The sense strand may additionally contain motif XXX or ZZZ motifs as wing modifications at the opposite end of the duplex region; and XXX and ZZZ each independently represent a 2'-OMe modification or 2'-F modification.

[00256] Em algumas modalidades, a cadeia antissentido pode conter motivo Y’Y’Y’ ocorrendo nas posições 11, 12, 13 da cadeia, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo da extremidade 5’, ou opcionalmente, a contagem partindo do primeiro nucleotídeo pareado dentro da região de duplex, a partir do extremidade 5’; e Y representa uma modificação 2’-O- metila. A cadeia antissentido pode conter adicionalmente motivo X’X’X’ ou motivos Z’Z’Z’ como modificações de asa na extremidade oposta da região de duplex; e X’X’X’ e Z’/.’/.’, cada um, representa, independentemente uma modificação 2’-OMe ou modificação 2’-F.[00256] In some embodiments, the antisense strand may contain motif Y’Y’Y’ occurring at positions 11, 12, 13 of the strand, counting from the first nucleotide from the 5’ end, or optionally, counting from the first paired nucleotide within the duplex region, from the 5’ end; and Y represents a 2’-O-methyl modification. The antisense strand may additionally contain motif X’X’X’ or motifs Z’Z’Z’ as wing modifications at the opposite end of the duplex region; and X’X’X’ and Z’/.’/.’ each independently represents a 2’-OMe modification or 2’-F modification.

[00257] A cadeia sentido representada por qualquer uma das fórmulas acima (Ia), (Ib), (Ic), e (Id) forma um duplex com uma cadeia antissentido sendo representada por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc), e (IId), respectivamente.[00257] The sense strand represented by any of the above formulas (Ia), (Ib), (Ic), and (Id) forms a duplex with an antisense strand being represented by any of the formulas (IIa), (IIb), (IIc), and (IId), respectively.

[00258] Consequentemente, os agentes de dsRNAi para uso nos métodos da invenção podem compreender uma cadeia sentido e uma cadeia antissentido, cada cadeia tendo 14 a 30 nucleotídeos, o duplex de iRNA representado pela fórmula (III): em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; p, p‘, q, e q‘ são, cada um, independentemente 0 a 6; cada Na e Na’representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb’representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10 nucleotídeos modificados; em que cada np’, np, nq’, e nq, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; e XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ cada representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.[00258] Accordingly, dsRNAi agents for use in the methods of the invention may comprise a sense strand and an antisense strand, each strand having 14 to 30 nucleotides, the iRNA duplex represented by formula (III): wherein: i, j, k, and l are each independently 0 or 1; p, p', q, and q' are each independently 0 to 6; each Na and Na' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 25 modified nucleotides, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides; each Nb and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10 modified nucleotides; wherein each np', np, nq', and nq, each of which may or may not be present, independently represents a projection nucleotide; and XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', and Z'Z'Z' each independently represents a motif of three identical modifications in three consecutive nucleotides.

[00259] Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou tanto i quanto j são 0; ou tanto i quanto j são 1. Em uma outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou tanto k quanto l são 0; ou tanto k quanto l são 1.[00259] In one embodiment, i is 0 and j is 0; or i is 1 and j is 0; or i is 0 and j is 1; or both i and j are 0; or both i and j are 1. In another embodiment, k is 0 and l is 0; or k is 1 and l is 0; k is 0 and l is 1; or both k and l are 0; or both k and l are 1.

[00260] Combinações exemplificativas da cadeia sentido e da cadeia antissentido que forma um duplex de iRNA incluem as fórmulas abaixo: [00260] Exemplary combinations of the sense strand and the antisense strand that form an iRNA duplex include the formulas below:

[00261] Quando o agente de dsRNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00261] When the dsRNAi agent is represented by formula (IIIa), each Na independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00262] Quando o agente de dsRNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 1 a 10, 1 a 7, 1 a 5 ou 1 a 4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00262] When the dsRNAi agent is represented by formula (IIIb), each Nb independently represents an oligonucleotide sequence comprising 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, or 1 to 4 modified nucleotides. Each Na independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00263] Quando o agente de dsRNAi é representado como a fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.[00263] When the dsRNAi agent is represented as formula (IIIc), each Nb, Nb' independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides.

[00264] Quando o agente de dsRNAi é representado como a fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2, ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados. Cada um de Na, Na’, Nb, e Nb’compreende independentemente modificações de padrão alternado.[00264] When the dsRNAi agent is represented as formula (IIId), each Nb, Nb’ independently represents an oligonucleotide sequence comprising 0 to 10, 0 to 7, 0 to 10, 0 to 7, 0 to 5, 0 to 4, 0 to 2, or 0 modified nucleotides. Each Na, Na’ independently represents an oligonucleotide sequence comprising 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 modified nucleotides. Each of Na, Na’, Nb, and Nb’ independently comprises alternating pattern modifications.

[00265] Cada um de X, Y, e Z nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId) podem ser iguais ou diferentes um do outro.[00265] Each of X, Y, and Z in formulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), and (IIId) may be the same or different from each other.

[00266] Quando o agente de dsRNAi é representado pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Y pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Y’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Y formam pares de bases com os nucleotídeos Y’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos Y formam pares de bases com os nucleotídeos Y’ correspondentes.[00266] When the dsRNAi agent is represented by formula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), and (IIId), at least one of the Y nucleotides can form a base pair with one of the Y’ nucleotides. Alternatively, at least two of the Y nucleotides form base pairs with the corresponding Y’ nucleotides; or all three of the Y nucleotides form base pairs with the corresponding Y’ nucleotides.

[00267] Quando o agente de dsRNAi é representado pela fórmula (IIIb) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Z’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Z formam pares de bases com os nucleotídeos Z’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos Z formam pares de bases com os nucleotídeos Z’ correspondentes.[00267] When the dsRNAi agent is represented by formula (IIIb) or (IIId), at least one of the Z nucleotides can form a base pair with one of the Z’ nucleotides. Alternatively, at least two of the Z nucleotides form base pairs with the corresponding Z’ nucleotides; or all three of the Z nucleotides form base pairs with the corresponding Z’ nucleotides.

[00268] Quando o agente de dsRNAi é representado como fórmula (IIIc) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos X pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos X’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos X formam pares de bases com os nucleotídeos X’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos X formam pares de bases com os nucleotídeos X’ correspondentes.[00268] When the dsRNAi agent is represented as formula (IIIc) or (IIId), at least one of the X nucleotides can form a base pair with one of the X’ nucleotides. Alternatively, at least two of the X nucleotides form base pairs with the corresponding X’ nucleotides; or all three of the X nucleotides form base pairs with the corresponding X’ nucleotides.

[00269] Em certas modalidades, a modificação no nucleotídeo Y é diferente da modificação no nucleotídeo Y’, a modificação no nucleotídeo Z é diferente da modificação no nucleotídeo Z’, e/ou a modificação no nucleotídeo X é diferente da modificação no nucleotídeo X’.[00269] In certain embodiments, the modification at nucleotide Y is different from the modification at nucleotide Y’, the modification at nucleotide Z is different from the modification at nucleotide Z’, and/or the modification at nucleotide X is different from the modification at nucleotide X’.

[00270] Em certas modalidades, quando o agente de dsRNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2‘-O- metila ou 2‘-fluoro. Em outras modalidades, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2‘-O- metila ou modificações 2‘-fluoro e np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato. Em ainda outras modalidades, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2‘-O-metila ou modificações 2‘- fluoro, np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato, e a cadeia sentido é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador bivalente ou trivalente ramificado (descrito abaixo). Em outras modalidades, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2‘-O-metila ou modificações 2‘-fluoro, np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato, a cadeia sentido compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e a cadeia sentido é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador bivalente ou trivalente ramificado.[00270] In certain embodiments, when the dsRNAi agent is represented by formula (IIId), the Na modifications are 2′-O-methyl or 2′-fluoro modifications. In other embodiments, when the RNAi agent is represented by formula (IIId), the Na modifications are 2′-O-methyl modifications or 2′-fluoro modifications and np′ >0 and at least one np′ is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate linkage. In still other embodiments, when the RNAi agent is represented by formula (IIId), the Na modifications are 2′-O-methyl modifications or 2′-fluoro modifications, np′ >0 and at least one np′ is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate linkage, and the sense strand is conjugated to one or more GalNAc derivatives linked via a branched bivalent or trivalent linker (described below). In other embodiments, when the RNAi agent is represented by formula (IIId), the Na modifications are 2‘-O-methyl modifications or 2‘-fluoro modifications, np‘ >0 and at least one np‘ is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate linkage, the sense strand comprises at least one phosphorothioate linkage, and the sense strand is conjugated to one or more GalNAc derivatives linked via a branched bivalent or trivalent linker.

[00271] Em algumas modalidades, quando o agente de dsRNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações Na são modificações 2‘-O- metila ou modificações 2‘-fluoro, np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato, a cadeia sentido compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e a cadeia sentido é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador bivalente ou trivalente ramificado.[00271] In some embodiments, when the dsRNAi agent is represented by formula (IIIa), the Na modifications are 2‘-O-methyl modifications or 2‘-fluoro modifications, np‘ >0 and at least one np‘ is linked to a neighboring nucleotide via a phosphorothioate linkage, the sense strand comprises at least one phosphorothioate linkage, and the sense strand is conjugated to one or more GalNAc derivatives linked via a branched bivalent or trivalent linker.

[00272] Em algumas modalidades, o agente de dsRNAi é um multímero contendo pelo menos dois duplexes representados pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), em que os duplexes são conectados por um ligador. O ligador pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende adicionalmente um ligante. Cada um dos duplexes pode alvejar o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplexes pode alvejar o mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.[00272] In some embodiments, the dsRNAi agent is a multimer containing at least two duplexes represented by formula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), and (IIId), wherein the duplexes are connected by a linker. The linker may be cleavable or non-cleavable. Optionally, the multimer further comprises a linker. Each of the duplexes may target the same gene or two different genes; or each of the duplexes may target the same gene at two different target sites.

[00273] Em algumas modalidades, o agente de dsRNAi é um multímero contendo três, quatro, cinco, seis ou mais duplexes representados pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), em que os duplexes são conectados por um ligador. O ligador pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende adicionalmente um ligante. Cada um dos duplexes pode alvejar o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplexes pode alvejar o mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.[00273] In some embodiments, the dsRNAi agent is a multimer containing three, four, five, six, or more duplexes represented by formula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), and (IIId), wherein the duplexes are connected by a linker. The linker may be cleavable or non-cleavable. Optionally, the multimer further comprises a linker. Each of the duplexes may target the same gene or two different genes; or each of the duplexes may target the same gene at two different target sites.

[00274] Em uma modalidade, dois agentes de dsRNAi representados por pelo menos uma das fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId) são ligados um ao outro na extremidade 5’, e uma ou ambas das extremidades 3’, e são opcionalmente conjugados a um ligante. Cada um dos agentes pode alvejar o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos agentes pode alvejar o mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.[00274] In one embodiment, two dsRNAi agents represented by at least one of formulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), and (IIId) are linked to each other at the 5' end, and one or both of the 3' ends, and are optionally conjugated to a linker. Each of the agents can target the same gene or two different genes; or each of the agents can target the same gene at two different target sites.

[00275] Várias publicações descrevem iRNAs multiméricos que podem ser usados nos métodos da invenção. Tais publicações incluem Patente US No. 7.858.769, WO2007/091269, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, e WO2011/031520, cujos conteúdos de cada uma está aqui incorporada na íntegra por referência.[00275] Several publications describe multimeric iRNAs that can be used in the methods of the invention. Such publications include U.S. Patent No. 7,858,769, WO2007/091269, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, and WO2011/031520, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00276] Como descrito em mais detalhes abaixo, o iRNA que contém conjugações de um ou mais radicais carboidrato a um iRNA pode otimizar uma ou mais propriedades do iRNA. Em muitos casos, o radical carboidrato será ligado a uma subunidade modificada do iRNA. Por exemplo, o açúcar ribose de uma ou mais subunidades de ribonucleotídeo de um iRNA pode ser substituído com um outro radical, por exemplo, um carreador não carboidrato (preferivelmente cíclico) que é ligado a um ligante de carboidrato. Uma subunidade de ribonucleotídeo em que o açúcar ribose da subunidade foi substituído é chamada aqui como uma subunidade com modificação de substituição de ribose (RRMS). Um carreador cíclico pode ser um sistema de anel carbocíclico, ou seja, todos os átomos do anel são átomos de carbono, ou um sistema de anel heterocíclico, ou seja, um ou mais átomos do anel podem ser um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, enxofre. O carreador cíclico pode ser um sistema de anel monocíclico ou pode conter dois ou mais anéis, por exemplo, anéis fundidos. O carreador cíclico pode ser um sistema de anel completamente saturado ou pode conter uma ou mais ligações duplas.[00276] As described in more detail below, iRNA that contains conjugations of one or more carbohydrate moieties to an iRNA can optimize one or more properties of the iRNA. In many cases, the carbohydrate moiety will be attached to a modified subunit of the iRNA. For example, the ribose sugar of one or more ribonucleotide subunits of an iRNA can be replaced with another moiety, e.g., a non-carbohydrate (preferably cyclic) carrier that is attached to a carbohydrate linker. A ribonucleotide subunit in which the ribose sugar of the subunit has been replaced is referred to herein as a ribose substitution modified subunit (RRMS). A cyclic carrier can be a carbocyclic ring system, i.e., all atoms in the ring are carbon atoms, or a heterocyclic ring system, i.e., one or more atoms in the ring can be a heteroatom, e.g., nitrogen, oxygen, sulfur. The cyclic carrier may be a monocyclic ring system or may contain two or more rings, such as fused rings. The cyclic carrier may be a fully saturated ring system or may contain one or more double bonds.

[00277] O ligante pode ser ligado ao polinucleotídeo por meio de um carreador. Os carreadores incluem (i) pelo menos um “ponto de ligação de estrutura dorsal”, preferivelmente dois “pontos de ligação de estrutura dorsal” e (ii) pelo menos um “ponto de ligação de ancoragem”. Um “ponto de ligação de estrutura dorsal” como usado aqui refere-se a um grupo funcional, por exemplo, um grupo hidroxila, ou em geral, uma ligação disponível, e que é adequado para incorporação do carreador na estrutura dorsal, por exemplo, fosfato, ou fosfato modificado, por exemplo, a estrutura dorsal contendo enxofre de um ácido ribonucleico. Um “ponto de ligação de ancoragem” (TAP) em algumas modalidades refere-se a um átomo de anel constituinte do carreador cíclico, por exemplo, um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que provê um ponto de ligação de estrutura dorsal), que se conecta a um radical selecionado. O radical pode ser, por exemplo, um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo. Opcionalmente, o radical selecionado é conectado por um grupo químico de ancoragem interveniente ao carreador cíclico. Dessa forma, o carreador cíclico geralmente incluirá um grupo funcional, por exemplo, um grupo amino, ou em geral, proverá uma ligação, que é adequada para incorporação ou ancoragem de uma outra entidade química, por exemplo, um ligante ao anel constituinte.[00277] The linker may be attached to the polynucleotide via a carrier. Carriers include (i) at least one “backbone attachment point,” preferably two “backbone attachment points,” and (ii) at least one “anchor attachment point.” A “backbone attachment point” as used herein refers to a functional group, e.g., a hydroxyl group, or in general, an available linkage, and that is suitable for incorporation of the carrier into the backbone, e.g., phosphate, or modified phosphate, e.g., the sulfur-containing backbone of a ribonucleic acid. An “anchor attachment point” (TAP) in some embodiments refers to a constituent ring atom of the cyclic carrier, e.g., a carbon atom or a heteroatom (as distinct from an atom providing a backbone attachment point), that connects to a selected moiety. The radical can be, for example, a carbohydrate, such as a monosaccharide, disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide, oligosaccharide, or polysaccharide. Optionally, the selected radical is connected to the cyclic carrier by an intervening chemical anchoring group. Thus, the cyclic carrier will generally include a functional group, such as an amino group, or will generally provide a linkage suitable for incorporation or anchoring of another chemical entity, such as a ligand, to the constituent ring.

[00278] O iRNA pode ser conjugado a um ligante por meio de um carreador, em que o carreador pode ser um grupo cíclico ou acíclico; preferivelmente, o grupo cíclico é selecionado de pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetra-hidrofurila e decalina; preferivelmente, o grupo acíclico é uma estrutura dorsal de serinol ou estrutura dorsal de dietanolamina.[00278] The iRNA may be conjugated to a linker via a carrier, wherein the carrier may be a cyclic or acyclic group; preferably, the cyclic group is selected from pyrrolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, [1,3]dioxolane, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, morpholinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, quinoxalinyl, pyridazinonyl, tetrahydrofuryl, and decalin; preferably, the acyclic group is a serinol backbone or diethanolamine backbone.

[00279] Em certas modalidades, o iRNA é um agente selecionado de agentes listados na Tabela 3 e Tabela 5. Em uma modalidade, o agente de iRNA alveja nucleotídeos 3221-3243 da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o agente de iRNA é AD-67635 (alvejando nucleotídeos 3224-3243 da SEQ ID NO:1). Em uma outra modalidade, o agente de iRNA é AD-67637 (alvejando nucleotídeos 3223-3242 da SEQ ID NO:1). Esses agentes podem compreender adicionalmente um ligante.[00279] In certain embodiments, the iRNA is an agent selected from agents listed in Table 3 and Table 5. In one embodiment, the iRNA agent targets nucleotides 3221-3243 of SEQ ID NO:1. In one embodiment, the iRNA agent is AD-67635 (targeting nucleotides 3224-3243 of SEQ ID NO:1). In another embodiment, the iRNA agent is AD-67637 (targeting nucleotides 3223-3242 of SEQ ID NO:1). These agents can further comprise a linker.

III. iRNAs conjugados a ligantesIII. iRNAs conjugated to ligands

[00280] Outra modificação do RNA de um iRNA da invenção envolve ligar quimicamente ao iRNA um ou mais ligantes, radicais ou conjugados que intensificam a atividade, distribuição celular ou absorção celular do iRNA, por exemplo, em uma célula. Tais radicais incluem, mas não se limitam a radicais lipídicos como um radical colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060). Em certas modalidades, a modificação pode incluir um tioéter, por exemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:11111118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), um fosfolipídio, por exemplo, di-hexadecil-rac- glicerol ou trietil-amônio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), uma cadeia de poliamina ou polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), um radical palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), ou um radical octadecilamina ou hexilamino- carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923937).[00280] Another RNA modification of an iRNA of the invention involves chemically attaching to the iRNA one or more ligands, moieties, or conjugates that enhance the activity, cellular distribution, or cellular uptake of the iRNA, e.g., in a cell. Such moieties include, but are not limited to, lipid moieties such as a cholesterol moiety (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), cholic acid (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060). In certain embodiments, the modification may include a thioether, for example, beryl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), a thiocholesterol (Oberhauser et al. al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), an aliphatic chain, for example, dodecandiol or undecyl residues (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:11111118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), a phospholipid, e.g., dihexadecyl-rac-glycerol or triethylammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), a polyamine chain or polyethylene glycol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), or adamantane acetic acid (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), a palmityl radical (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), or an octadecylamine radical or hexylaminocarbonyloxycholesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923937).

[00281] Em certas modalidades, um ligante altera a distribuição, o alvejamento ou tempo de vida de um agente de iRNA em que é incorporado. Em modalidades preferidas, um ligante provê uma afinidade intensificada para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou orgânico, tecido, órgão ou região do corpo, como, por exemplo, comparado com uma espécie ausente como um ligante. Ligantes preferidos não participam de pareamento de duplexes em um ácido nucleico duplexado.[00281] In certain embodiments, a ligand alters the distribution, targeting, or lifetime of an iRNA agent into which it is incorporated. In preferred embodiments, a ligand provides enhanced affinity for a selected target, e.g., molecule, cell or cell type, compartment, e.g., a cellular or organismal compartment, tissue, organ, or region of the body, as, for example, compared to a species absent as a ligand. Preferred ligands do not participate in duplex pairing in a duplexed nucleic acid.

[00282] Os ligantes podem incluir uma substância de ocorrência natural, tal como uma proteína (por exemplo, albumina sérica humana (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou globulina); carboidrato (por exemplo, uma dextranoa, pululana, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina, N-acetilgalactosamina ou ácido hialurônico); ou um lipídio. O ligante pode ser também uma molécula recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, por exemplo, um ácido poliamino sintético. Exemplos de poliaminoácidos incluem poliaminoácido é uma polilisina (PLL), ácido poli- L-aspártico, ácido poli-L-glutâmico, copolímero de estireno-anidrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactídeo-co-glicolídeo), copolímero de divinil éter-anidrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenoglicol (PEG), álcool polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli(2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida ou polifosfazina. Exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrimérica, arginina, amidina, protamina, lipídio catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina ou um peptídeo alfa helicoidal.[00282] Binders may include a naturally occurring substance, such as a protein (e.g., human serum albumin (HSA), low-density lipoprotein (LDL), or globulin); carbohydrate (e.g., a dextran, pullulan, chitin, chitosan, inulin, cyclodextrin, N-acetylgalactosamine, or hyaluronic acid); or a lipid. The binder may also be a recombinant or synthetic molecule, such as a synthetic polymer, e.g., a synthetic polyamino acid. Examples of polyamino acids include polyamino acid is a polylysine (PLL), poly-L-aspartic acid, poly-L-glutamic acid, styrene-maleic anhydride copolymer, poly(L-lactide-co-glycolide) copolymer, divinyl ether-maleic anhydride copolymer, N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HMPA) copolymer, polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyurethane, poly(2-ethylacrylic acid), N-isopropylacrylamide polymers, or polyphosphazine. Examples of polyamines include: polyethylenimine, polylysine (PLL), spermine, spermidine, polyamine, pseudopeptide-polyamine, peptidomimetic polyamine, dendrimeric polyamine, arginine, amidine, protamine, cationic lipid, cationic porphyrin, quaternary salt of a polyamine, or an alpha helical peptide.

[00283] Os ligantes também podem incluir grupos de alvejamento, por exemplo, um agente de alvejamento de célula ou tecido, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídio ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula especificada tais como uma célula de rim. Um grupo de alvejamento pode ser uma tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensoativa A, carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina monovalente ou multivalente, manose multivalente de N-acetil-glucosamina, fucose multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídio, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina, ou um peptídeo RGD ou peptídeo RGD mimético. Em certas modalidades, o ligante é N-acetil-galactosamina monovalente ou multivalente. Em certas modalidades, o ligante é colesterol.[00283] Ligands may also include targeting groups, e.g., a cell or tissue targeting agent, e.g., a lectin, glycoprotein, lipid, or protein, e.g., an antibody, that binds to a specified cell type such as a kidney cell. A targeting group may be a thyrotropin, melanotropin, lectin, glycoprotein, surface-active protein A, mucin carbohydrate, multivalent lactose, multivalent galactose, monovalent or multivalent N-acetylgalactosamine, multivalent mannose of N-acetylgalucosamine, multivalent fucose, glycosylated polyamino acids, multivalent galactose, transferrin, bisphosphonate, polyglutamate, polyaspartate, a lipid, cholesterol, a steroid, bile acid, folate, vitamin B12, vitamin A, biotin, or an RGD peptide or RGD peptide mimetic. In certain embodiments, the linker is monovalent or multivalent N-acetylgalactosamine. In certain embodiments, the linker is cholesterol.

[00284] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercalantes (por exemplo, acridinas), reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, di-hidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano-acético, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxi- hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina) e conjugados peptídicos (por exemplo, peptídeo antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, aglomerados de imidazole, conjugados acridina-imidazol, complexos Eu3 + de tetra-azamacrociclos), dinitrofenil, HRP ou AP.[00284] Other examples of ligands include dyes, intercalating agents (e.g., acridines), crosslinkers (e.g., psoralen, mitomycin C), porphyrins (TPPC4, texaphyrin, sapphirin), polycyclic aromatic hydrocarbons (e.g., phenazine, dihydrophenazine), artificial endonucleases (e.g., EDTA), lipophilic molecules, e.g., cholesterol, cholic acid, adamantane acetic acid, 1-pyrene butyric acid, dihydrotestosterone, 1,3-Bis-O(hexadecyl)glycerol, geranyloxyhexyl group, hexadecylglycerol, borneol, menthol, 1,3-propanediol, heptadecyl group, palmitic acid, myristic acid, O3-(oleoyl)lithocholic acid, O3-(oleoyl)cholenic acid, dimethoxytrityl or phenoxazine) and peptide conjugates (e.g., antennapedia peptide, Tat peptide), alkylating agents, phosphate, amino, mercapto, PEG (e.g., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, polyamino, alkyl, substituted alkyl, radiolabeled markers, enzymes, haptens (e.g., biotin), transport/uptake facilitators (e.g., aspirin, vitamin E, folic acid), synthetic ribonucleases (e.g., imidazole, bisimidazole, histamine, imidazole clusters, acridine-imidazole conjugates, Eu3+ complexes of tetra-azamacrocycles), dinitrophenyl, HRP, or AP.

[00285] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas ou peptídeos, por exemplo, moléculas com uma afinidade específica para um coligante, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula específico, tal como uma célula hepática. Os ligantes também podem incluir hormônios e receptores hormonais. Eles também podem incluir as espécies não peptídicas, tais como lipídios, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil- galactosamina, manose multivalente de N-acetil glicosamina, ou fucose multivalente. O ligante pode ser, por exemplo, um lipopolissacarídeo, um ativador de p38 MAP quinase, ou um ativador de NF-KB.[00285] Ligands may be proteins, e.g., glycoproteins, or peptides, e.g., molecules with a specific affinity for a coligand, or antibodies, e.g., an antibody, that binds to a specific cell type, such as a liver cell. Ligands may also include hormones and hormone receptors. They may also include non-peptide species, such as lipids, lectins, carbohydrates, vitamins, cofactors, multivalent lactose, multivalent galactose, N-acetylgalactosamine, multivalent mannose, N-acetylglucosamine, or multivalent fucose. The ligand may be, e.g., a lipopolysaccharide, a p38 MAP kinase activator, or an NF-KB activator.

[00286] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fármaco, que pode aumentar a absorção do agente de iRNA para dentro da célula, por exemplo, por disrupção citoesqueleto da célula, por exemplo, por disrupção dos microtúbulos da célula, microfilamentos, ou filamentos intermediários. O fármaco pode ser, por exemplo, taxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, jasplaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholide A, indanocina ou mioservina.[00286] The ligand may be a substance, e.g., a drug, that may increase the uptake of the iRNA agent into the cell, e.g., by disrupting the cell's cytoskeleton, e.g., by disrupting the cell's microtubules, microfilaments, or intermediate filaments. The drug may be, e.g., taxon, vincristine, vinblastine, cytochalasin, nocodazole, jasplakinolide, latrunculin A, phalloidin, swinholide A, indanocine, or myoservine.

[00287] Em algumas modalidades, um ligante ligado a um iRNA como descrito aqui atua como um modulador farmacocinético (modulador PK). Os moduladores PK incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídios, peptídeos, agentes de ligação de proteína, PEG, vitaminas etc. Exemplos de moduladores PK incluem, mas não estão limitados a colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicerídeos, diacilglicerida, fosfolipídios, esfingolipídios, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina etc. Os oligonucleotídeos que compreendem um número de ligações de fosforotioato são também conhecidos por se ligarem à proteína do soro, portanto oligonucleotídedos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos de cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas ligações de fosforotioato na cadeia principal são também suscetíveis para a presente invenção como ligantes (por exemplo, como ligantes de modulação PK). Adicionalmente, aptâmeros que se ligam a componentes do soro (por exemplo, proteínas do soro) são também adequados para uso como ligantes de modulação PK nas modalidades aqui descritas.[00287] In some embodiments, a ligand linked to an iRNA as described herein acts as a pharmacokinetic modulator (PK modulator). PK modulators include lipophiles, bile acids, steroids, phospholipid analogs, peptides, protein binding agents, PEG, vitamins, etc. Examples of PK modulators include, but are not limited to, cholesterol, fatty acids, cholic acid, lithocholic acid, dialkylglycerides, diacylglyceride, phospholipids, sphingolipids, naproxen, ibuprofen, vitamin E, biotin, etc. Oligonucleotides comprising a number of phosphorothioate linkages are also known to bind to serum protein, therefore short oligonucleotides, e.g., oligonucleotides of about 5 bases, 10 bases, 15 bases, or 20 bases, comprising multiple phosphorothioate linkages in the backbone are also susceptible to the present invention as ligands (e.g., as PK modulation ligands). Additionally, aptamers that bind to serum components (e.g., serum proteins) are also suitable for use as PK modulation ligands in the embodiments described herein.

[00288] Os iRNAs conjugados com ligantes da invenção podem ser sintetizados pelo uso de um oligonucleotídeo que possui uma funcionalidade reativa pendente, tal como a derivada da ligação de uma molécula de ligação ao oligonucleotídeo (descrito abaixo). Esse oligonucleotídeo reativo pode ser reagido diretamente com ligantes comercialmente disponíveis, ligantes que são sintetizados contendo qualquer um de uma variedade de grupos protetores, ou ligantes que têm um radical de ligação ligado aos mesmos.[00288] The linker-conjugated iRNAs of the invention can be synthesized by use of an oligonucleotide that has a pendant reactive functionality, such as that derived from the attachment of a binding molecule to the oligonucleotide (described below). Such a reactive oligonucleotide can be reacted directly with commercially available linkers, linkers that are synthesized containing any of a variety of protecting groups, or linkers that have a linker moiety attached to them.

[00289] Os oligonucleotídeos usados nos conjugados da presente invenção podem ser convenientemente e rotineiramente feitos através da técnica bem conhecida da síntese em fase sólida. O equipamento para tal síntese é vendido por vários fornecedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Quaisquer outros meios para tal síntese conhecidos na técnica podem adicionalmente ou alternativamente ser utilizados. É também conhecido o uso de técnicas semelhantes para preparar outros oligonucleotídeos, tais como os fosforotioatos e derivados alquilados.[00289] The oligonucleotides used in the conjugates of the present invention can be conveniently and routinely made by the well-known technique of solid-phase synthesis. Equipment for such synthesis is sold by several suppliers, including, for example, Applied Biosystems (Foster City, California). Any other means for such synthesis known in the art can additionally or alternatively be used. It is also known to use similar techniques to prepare other oligonucleotides, such as phosphorothioates and alkylated derivatives.

[00290] Nos iRNAs conjugados ao ligante e molécula ligante contendo nucleosídeos ligados à sequência específica da presente invenção, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado utilizando precursores de nucleotídeos ou nucleosídeos padrão, ou precursores conjugados de nucleotídeos ou nucleosídeos que já têm o radical de ligação, precursores conjugados a nucleosídeos ou nucleotídeos ligantes que já têm a molécula de ligante, ou blocos de construção não contendo ligantes não nucleosídeos.[00290] In the linker-conjugated iRNAs and linker molecule containing nucleosides linked to the specific sequence of the present invention, the oligonucleotides and oligonucleosides can be assembled on a suitable DNA synthesizer using standard nucleotide or nucleoside precursors, or nucleotide or nucleoside conjugated precursors that already have the linker moiety, nucleoside or nucleotide linker conjugated precursors that already have the linker molecule, or building blocks containing no non-nucleoside linkers.

[00291] Quando se usam precursores conjugados a nucleotídeos que já têm um radical de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados à sequência específica é tipicamente completada e a molécula de ligante é então reagida com o radical de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado ao ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleotídeos ligados da presente invenção são sintetizados por um sintetizador automático usando fosforamiditas derivadas de conjugados ligante-nucleotídeo em adição às fosforamiditas padrão e fosforamiditas não padrão que estão disponíveis comercialmente e são rotineiramente usadas na síntese de oligonucleotídeos. Conjugados lipídicos[00291] When using nucleotide-conjugated precursors that already have a linker moiety, the synthesis of the sequence-specific linked nucleosides is typically completed and the linker molecule is then reacted with the linker moiety to form the linker-conjugated oligonucleotide. In some embodiments, the oligonucleotides or linked nucleotides of the present invention are synthesized by an automated synthesizer using phosphoramidites derived from linker-nucleotide conjugates in addition to the standard phosphoramidites and non-standard phosphoramidites that are commercially available and routinely used in oligonucleotide synthesis. Lipid Conjugates

[00292] Em certas modalidades, o ligante ou conjugado é um lipídio ou uma molécula à base de lipídios. Tal lipídio ou molécula à base de lipídios liga-se preferivelmente a uma proteína do soro, por exemplo, albumina sérica humana (HSA). Um ligante de ligação a HSA permite a distribuição do conjugado a um tecido alvo, por exemplo, um tecido alvo não renal do corpo. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células do parênquima do fígado. Outras moléculas que podem ligar a HSA também podem ser usadas como ligantes. Por exemplo, naproxeno ou aspirina podem ser usados. Um lipídio ou ligante à base de lipídios pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar o alvejamento ou transporte para uma célula alvo ou membrana celular, ou (c) pode ser usado para ajustar a ligação a uma proteína do soro, por exemplo, HSA.[00292] In certain embodiments, the linker or conjugate is a lipid or a lipid-based molecule. Such a lipid or lipid-based molecule preferably binds to a serum protein, e.g., human serum albumin (HSA). An HSA-binding linker allows for delivery of the conjugate to a target tissue, e.g., a non-renal target tissue of the body. For example, the target tissue may be the liver, including liver parenchymal cells. Other molecules that can bind HSA may also be used as linkers. For example, naproxen or aspirin may be used. A lipid or lipid-based linker may (a) increase resistance to degradation of the conjugate, (b) increase targeting or transport to a target cell or cell membrane, or (c) may be used to adjust binding to a serum protein, e.g., HSA.

[00293] Um ligante à base de lipídios pode ser usado para inibir, por exemplo, controlar a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo, um lipídio ou ligante à base de lipídios que se liga à HSA com maior intensidade será menos provável de ser alvejado para o rim e, portanto, menos provável de ser eliminado do corpo. Um lipídio ou ligante à base de lipídios que se liga à HSA com menos intensidade pode ser usado para alvejar o conjugado ao rim.[00293] A lipid-based ligand can be used to inhibit, for example, control, the binding of the conjugate to a target tissue. For example, a lipid or lipid-based ligand that binds to HSA more strongly will be less likely to be targeted to the kidney and therefore less likely to be eliminated from the body. A lipid or lipid-based ligand that binds to HSA less strongly can be used to target the conjugate to the kidney.

[00294] Em certas modalidades, o ligante à base de lipídios liga-se à HSA. Preferivelmente, liga-se à HSA com uma afinidade suficiente, de tal modo que o conjugado será preferivelmente distribuído para um tecido não renal. No entanto, é preferido que a afinidade não seja tão forte de modo que a ligação do ligante de HSA não possa ser revertida.[00294] In certain embodiments, the lipid-based ligand binds to HSA. Preferably, it binds to HSA with sufficient affinity such that the conjugate will preferably be distributed to non-renal tissue. However, it is preferred that the affinity is not so strong that the binding of the HSA ligand cannot be reversed.

[00295] Em outras modalidades, o ligante à base de lipídios liga-se à HSA fracamente ou não se liga, de tal modo que o conjugado será preferivelmente distribuído para o rim. Outros radicais que têm como alvo as células renais podem também ser usados em vez de, ou além do, ligante à base de lipídios.[00295] In other embodiments, the lipid-based linker binds to HSA weakly or not at all, such that the conjugate will preferentially be delivered to the kidney. Other moieties that target renal cells may also be used instead of, or in addition to, the lipid-based linker.

[00296] Em um outro aspecto, o ligante é um radical, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula alvo, por exemplo, uma célula em proliferação. Estes são particularmente úteis para o tratamento de distúrbios caracterizados por proliferação celular indesejada, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células cancerígenas. As vitaminas exemplificativas incluem vitamina A, E e K. Outras vitaminas exemplificativas incluem vitamina B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidos pelas células alvo, como as células do fígado. Também estão incluídas HSA e lipoproteína de baixa densidade (LDL).[00296] In another aspect, the ligand is a moiety, e.g., a vitamin, which is taken up by a target cell, e.g., a proliferating cell. These are particularly useful for treating disorders characterized by unwanted cell proliferation, e.g., malignant or non-malignant, e.g., cancer cells. Exemplary vitamins include vitamins A, E, and K. Other exemplary vitamins include vitamins B, e.g., folic acid, B12, riboflavin, biotin, pyridoxal, or other vitamins or nutrients taken up by target cells, such as liver cells. Also included are HSA and low-density lipoprotein (LDL).

B. Agentes de permeação celularB. Cell permeation agents

[00297] Em um outro aspecto, o ligante é um agente de permeação celular, preferivelmente um agente de permeação celular helicoidal. Preferivelmente, o agente é anfipático. Um agente exemplificativo é um peptídeo tal como tat ou antennopedia. Se o agente for um peptídeo, pode ser modificado, incluindo um peptidilmimético, invertômeros, ligações não peptídicas ou pseudopeptídicas, e uso de D-aminoácidos. O agente helicoidal é preferivelmente um agente alfa-helicoidal, que preferivelmente tem uma fase lipofílica e uma lipofóbica.[00297] In another aspect, the linker is a cell permeation agent, preferably a helical cell permeation agent. Preferably, the agent is amphipathic. An exemplary agent is a peptide such as tat or antennopedia. If the agent is a peptide, it may be modified, including a peptidylmimetic, invertomers, non-peptide or pseudopeptide bonds, and use of D-amino acids. The helical agent is preferably an alpha-helical agent, which preferably has a lipophilic and a lipophobic phase.

[00298] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético (também chamado aqui de um oligopeptidomimético) é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural. A ligação de peptídeo e peptidomiméticos a agentes de iRNA pode afetar a distribuição farmacocinética do iRNA, tal como através da intensificação do reconhecimento celular e absorção. O peptídeo ou porção peptidomimética pode ter cerca de 5 a 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento.[00298] The linker may be a peptide or peptidomimetic. A peptidomimetic (also referred to herein as an oligopeptidomimetic) is a molecule capable of folding into a defined three-dimensional structure similar to a natural peptide. The binding of peptides and peptidomimetics to iRNA agents may affect the pharmacokinetic distribution of the iRNA, such as by enhancing cellular recognition and uptake. The peptide or peptidomimetic moiety may be about 5 to 50 amino acids in length, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids in length.

[00299] Um peptídeo ou peptidomimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação celular, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático, ou peptídeo hidrofóbico (por exemplo, que consiste principalmente em Tyr, Trp, ou Phe). O radical peptídico pode ser um peptídeo dendrimérico, peptídeo restringido ou peptídeo reticulado. Em uma outra alternativa, o radical peptídico pode incluir uma sequência de translocação da membrana hidrofóbica (MTS). Um peptídeo hidrofóbico exemplificativo contendo MTS é o RFGF que tem a sequência de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 14). Uma sequência de aminoácidos análoga a RFGF (por exemplo, AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 15) contendo uma MTS hidrofóbica pode também ser um radical de alvejamento. O radical peptídico pode ser um peptídeo de “dispensação”, que pode transportar moléculas polares grandes incluindo peptídeos, oligonucleotídeos e proteína através das membranas celulares. Por exemplo, verificou-se que as sequências da proteína Tat de HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 16) e da proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 17) são capazes de funcionar como peptídeos de dispensação. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, tal como um peptídeo identificado a partir de uma biblioteca de fagos, ou uma biblioteca combinatória de um glóbulo-um-composto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Exemplos de um peptídeo ou peptidomimético ancorado a um agente de dsRNA por meio de uma unidade monomérica incorporada para fins de alvejamento celular é um peptídeo de arginina- glicina-ácido aspártico (RGD), ou imitador de RGD. Um radical peptídico pode variar em comprimento de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos. Os radicais peptídicos podem ter uma modificação estrutural, tal como para aumentar a estabilidade ou propriedades conformacionais diretas. Qualquer uma das modificações estruturais descritas abaixo pode ser utilizada.[00299] A peptide or peptidomimetic can be, for example, a cell permeating peptide, cationic peptide, amphipathic peptide, or hydrophobic peptide (e.g., consisting primarily of Tyr, Trp, or Phe). The peptide moiety can be a dendrimeric peptide, restricted peptide, or cross-linked peptide. In another alternative, the peptide moiety can include a hydrophobic membrane translocation sequence (MTS). An exemplary hydrophobic peptide containing MTS is RFGF which has the amino acid sequence AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 14). An amino acid sequence analogous to RFGF (e.g., AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 15) containing a hydrophobic MTS can also be a targeting moiety. The peptide moiety can be a “dispensing” peptide, which can transport large polar molecules including peptides, oligonucleotides, and proteins across cell membranes. For example, the sequences of the HIV Tat protein (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 16) and the Drosophila Antennapedia protein (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 17)) have been found to function as dispensing peptides. A peptide or peptidomimetic can be encoded by a random DNA sequence, such as a peptide identified from a phage library, or a one-globule-one-compound (OBOC) combinatorial library (Lam et al., Nature, 354:82–84, 1991). Examples of a peptide or peptidomimetic anchored to a dsRNA agent via an incorporated monomeric unit for cell targeting purposes are an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide, or RGD mimic. A peptide moiety can range in length from about 5 amino acids to about 40 amino acids. Peptide moieties may have a structural modification, such as to increase stability or direct conformational properties. Any of the structural modifications described below may be used.

[00300] Um peptídeo de RGD para uso nas composições e métodos da invenção pode ser linear ou cíclico e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado, para facilitar o alvejamento para um tecido(s) específico(s). Peptídeos contendo RGD e peptidomiméticos podem incluir D- aminoácidos, assim como imitadores sintéticos de RGD. Além do RGD, pode-se usar outros radicais que alvejam o ligante da integrina. Conjugados preferidos desse ligante alvejam PECAM-1 ou VEGF.[00300] An RGD peptide for use in the compositions and methods of the invention may be linear or cyclic and may be modified, e.g., glycosylated or methylated, to facilitate targeting to a specific tissue(s). RGD-containing peptides and peptidomimetics may include D-amino acids, as well as synthetic RGD mimics. In addition to RGD, other moieties that target the integrin ligand may be used. Preferred conjugates of such a ligand target PECAM-1 or VEGF.

[00301] Um “peptídeo de permeação celular” é capaz de permear uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, tal como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, tal como uma célula humana. Um peptídeo de permeação celular microbiana pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (por exemplo, LL-37 ou Ceropina P1), um peptídeo contendo ligação dissulfeto (por exemplo, α-defensina, β-defensina ou bactenecina), ou um peptídeo contendo apenas um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação celular pode também incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação celular pode ser um peptídeo anfipático bipartido, tal como MPG, que é derivado do domínio de peptídeo de fusão de gp41 de HIV-1 e o NLS de antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).[00301] A “cell permeating peptide” is capable of permeating a cell, for example, a microbial cell, such as a bacterial or fungal cell, or a mammalian cell, such as a human cell. A microbial cell permeating peptide may be, for example, a linear α-helical peptide (e.g., LL-37 or Ceropin P1), a disulfide bond-containing peptide (e.g., α-defensin, β-defensin, or bactenecin), or a peptide containing only one or two dominant amino acids (e.g., PR-39 or indolicidin). A cell permeating peptide may also include a nuclear localization signal (NLS). For example, a cell-permeating peptide can be a bipartite amphipathic peptide, such as MPG, which is derived from the fusion peptide domain of HIV-1 gp41 and the SV40 large T antigen NLS (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).

C. Conjugados de carboidratosC. Carbohydrate conjugates

[00302] Em algumas modalidades das composições e métodos da invenção, um iRNA compreende adicionalmente um carboidrato. O iRNA conjugado a carboidrato é vantajoso para a dispensação in vivo de ácidos nucleicos, bem como para composições adequadas para uso terapêutico in vivo, como aqui descrito. Como aqui usado, “carboidrato” refere-se a um composto que é ou um carboidrato per se constituído por uma ou mais unidades monossacarídicas com pelo menos 6 átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificados ou cíclicos) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto tendo como parte do mesmo um radical carboidrato constituído por uma ou mais unidades monossacarídicas cada uma com pelo menos seis átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificados ou cíclicos), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono. Carboidratos representativos incluem os açúcares (mono-, di-, tri- e oligossacarídeos contendo cerca de 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades monossacarídicas), e polissacarídeos tais como amidos, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeos. Monossacarídeos específicos incluem VHB e os açúcares acima (por exemplo, C5, C6, C7 ou C8); di e trissacarídeos incluem açúcares com duas ou três unidades monossacarídicas (por exemplo, C5, C6, C7 ou C8).[00302] In some embodiments of the compositions and methods of the invention, an iRNA further comprises a carbohydrate. Carbohydrate-conjugated iRNA is advantageous for in vivo delivery of nucleic acids, as well as for compositions suitable for in vivo therapeutic use, as described herein. As used herein, “carbohydrate” refers to a compound that is either a carbohydrate per se consisting of one or more monosaccharide units having at least 6 carbon atoms (which may be linear, branched, or cyclic) with an oxygen, nitrogen, or sulfur atom attached to each carbon atom; or a compound having as part thereof a carbohydrate radical consisting of one or more monosaccharide units each having at least six carbon atoms (which may be linear, branched, or cyclic), with an oxygen, nitrogen, or sulfur atom attached to each carbon atom. Representative carbohydrates include sugars (mono-, di-, tri-, and oligosaccharides containing about 4, 5, 6, 7, 8, or 9 monosaccharide units), and polysaccharides such as starches, glycogen, cellulose, and polysaccharide gums. Specific monosaccharides include VHB and the above sugars (e.g., C5, C6, C7, or C8); di- and trisaccharides include sugars with two or three monosaccharide units (e.g., C5, C6, C7, or C8).

[00303] Em uma modalidade, um conjugado de carboidrato para uso nas composições e métodos da invenção é um monossacarídeo. Em uma outra modalidade, um conjugado de carboidrato para uso nas composições e métodos da invenção é selecionado do grupo que consiste em: [00303] In one embodiment, a carbohydrate conjugate for use in the compositions and methods of the invention is a monosaccharide. In another embodiment, a carbohydrate conjugate for use in the compositions and methods of the invention is selected from the group consisting of:

[00304] Em uma modalidade, o monossacarídeo é uma Nacetilgalactosamina, tal como [00304] In one embodiment, the monosaccharide is a N-acetylgalactosamine, such as

[00305] Um outro conjugado de carboidrato representativo para uso nas modalidades aqui descritas inclui, mas não se limita a quando um de X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.[00305] Another representative carbohydrate conjugate for use in embodiments described herein includes, but is not limited to, when one of X or Y is an oligonucleotide, the other is a hydrogen.

[00306] Em certas modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc é ligado a um agente de iRNA da invenção através de um ligador monovalente. Em algumas modalidades, o GalNAc ou derivado de GalNAc é ligado a um agente de iRNA da invenção através de um ligador bivalente. Em ainda outras modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc é ligado a um agente de iRNA da invenção através de um ligador trivalente.[00306] In certain embodiments of the invention, the GalNAc or GalNAc derivative is linked to an iRNA agent of the invention via a monovalent linker. In some embodiments, the GalNAc or GalNAc derivative is linked to an iRNA agent of the invention via a bivalent linker. In still other embodiments of the invention, the GalNAc or GalNAc derivative is linked to an iRNA agent of the invention via a trivalent linker.

[00307] Em uma modalidade, os agentes de RNAi de cadeia dupla da invenção compreendem um GalNAc ou derivado de GalNAc ligado ao agente de iRNA. Em uma outra modalidade, os agentes de RNAi de cadeia dupla da invenção compreendem uma pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) de GalNAc ou derivados de GalNAc, cada um independentemente ligado a uma pluralidade de nucleotídeos do agente de RNAi de cadeia dupla através de uma pluralidade de ligadores monovalentes.[00307] In one embodiment, the double-stranded RNAi agents of the invention comprise a GalNAc or GalNAc derivative linked to the iRNA agent. In another embodiment, the double-stranded RNAi agents of the invention comprise a plurality (e.g., 2, 3, 4, 5, or 6) of GalNAc or GalNAc derivatives, each independently linked to a plurality of nucleotides of the double-stranded RNAi agent via a plurality of monovalent linkers.

[00308] Em algumas modalidades, por exemplo, quando as duas cadeias de um agente de iRNA da invenção são parte de uma molécula maior ligada por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma cadeia e a extremidade 5' da respectiva outra cadeia formando uma estrutura em forma de grampo compreendendo uma pluralidade de nucleotídeos não pareados, cada nucleotídeo não pareado dentro da estrutura em forma de grampo pode compreender independentemente um GalNAc ou derivado de GalNAc ligado através de um ligador monovalente. A estrutura em forma de grampo pode também ser formada por uma projeção estendida em uma cadeia do duplex.[00308] In some embodiments, for example, when the two strands of an iRNA agent of the invention are part of a larger molecule linked by an uninterrupted chain of nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of the respective other strand forming a hairpin structure comprising a plurality of unpaired nucleotides, each unpaired nucleotide within the hairpin structure may independently comprise a GalNAc or GalNAc derivative linked through a monovalent linker. The hairpin structure may also be formed by an extended overhang on one strand of the duplex.

[00309] Em algumas modalidades, o conjugado de carboidrato compreende adicionalmente um ou mais ligantes adicionais como descrito acima, tal como, mas não limitado a um modulador PK ou um peptídeo de permeação celular.[00309] In some embodiments, the carbohydrate conjugate further comprises one or more additional ligands as described above, such as, but not limited to, a PK modulator or a cell permeation peptide.

[00310] Conjugados de carboidratos adicionais adequados para uso na presente invenção incluem os descritos nas Publicações PCT Nos. WO 2014/179620 e WO 2014/179627, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00310] Additional carbohydrate conjugates suitable for use in the present invention include those described in PCT Publication Nos. WO 2014/179620 and WO 2014/179627, the contents of each of which are incorporated herein in their entirety by reference.

D. LigadoresD. Connectors

[00311] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante aqui descrito pode ser ligado a um oligonucleotídeo de iRNA com vários ligadores que podem ser cliváveis ou não cliváveis.[00311] In some embodiments, the conjugate or linker described herein may be attached to an iRNA oligonucleotide with various linkers that may be cleavable or non-cleavable.

[00312] O termo “ligador” ou “grupo de ligação” significa um radical orgânico que liga duas partes de um composto, por exemplo, liga covalentemente duas partes de um composto. Os ligadores compreendem tipicamente uma ligação direta ou um átomo tal como oxigênio ou enxofre, uma unidade tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tal como, mas não se limitando a alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, arilalquila, arilalquenila, arilalquinila, heteroarilalquila, heteroarilalquenila, heteroarilalquinila, heterociclilalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquinila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalquenila, alquilarilalquila, alquilarilalquenila, alquilarilalquinila, alquenilarilalquila, alquenilarilalquenila, alquenilarilalquinila, alquinilarilalquila, alquinilarilalquenila, alquinilarilalquinila, alquil-heteroarilalquila, alquil-heteroarilalquenila, alquil- heteroarilalquinila, alquenil-heteroarilalquila, alquenil-heteroarilalquenila, alquenil-heteroarilalquinila, alquinil-heteroarilalquila, alquinil- heteroarilalquenila, alquinil-heteroarilalquinila, alquil-heterociclilalquila, alquil-heterociclilalquenila, alquil-heterociclilalquinila, alquenil- heterociclilalquila, alquenil-heterociclilalquenila, alquenil- heterociclilalquinila, alquinil-heterociclilalquila, alquinil- heterociclilalquenila, alquinil-heterociclilalquinila, alquilaril, alquenilarila, alquinilarila, alquil-heteroarila, alquenil-heteroarila, alquinil-heteroarila, que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, ou heterocíclico substituído ou não substituído; onde R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o ligador tem entre cerca de 1 a 24 átomos, 2 a 24, 3 a 24, 4 a 24, 5 a 24, 6 a 24, 6 a 18, 7 a 18, 8 a 18, 7 a 17, 8 a 17, 6 a 16, 7 a 16, ou 8 a 16 átomos.[00312] The term “linker” or “linking group” means an organic radical that links two parts of a compound, for example, covalently links two parts of a compound. Linkers typically comprise a direct bond or an atom such as oxygen or sulfur, a unit such as NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, or a chain of atoms such as, but not limited to, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, arylalkyl, arylalkenyl, arylalkynyl, heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heteroarylalkynyl, heterocyclylalkyl, heterocyclylalkenyl, heterocyclylalkynyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, alkylarylalkyl, alkylarylalkenyl, alkylarylalkynyl, alkenylarylalkyl, alkenylarylalkenyl, alkenylarylalkynyl, alkynylarylalkyl, alkynylarylalkenyl, alkynylarylalkynyl, alkyl heteroarylalkyl, alkyl heteroarylalkynyl, alkyl heteroarylalkynyl, alkenylheteroarylalkyl, alkenylheteroarylalkynyl, alkenylheteroarylalkynyl, alkynylheteroarylalkyl, alkynyl heteroarylalkynyl, alkynylheteroarylalkynyl, alkylheterocyclylalkyl, alkylheterocyclylalkenyl, alkylheterocyclylalkynyl, alkenylheterocyclylalkyl, alkenylheterocyclylalkenyl, alkenylheterocyclylalkynyl, alkynylheterocyclylalkyl, alkynylheterocyclylalkenyl, alkynylheterocyclylalkynyl, alkylaryl, alkenylaryl, alkynylaryl, alkylheteroaryl, alkenylheteroaryl, alkynylheteroaryl, which one or more methylenes may be interrupted or terminated by O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic; wherein R8 is hydrogen, acyl, aliphatic or substituted aliphatic. In one embodiment, the linker has between about 1 to 24 atoms, 2 to 24, 3 to 24, 4 to 24, 5 to 24, 6 to 24, 6 to 18, 7 to 18, 8 to 18, 7 to 17, 8 to 17, 6 to 16, 7 to 16, or 8 to 16 atoms.

[00313] Um grupo de ligação clivável é um que é suficientemente estável fora da célula, mas que, após a entrada em uma célula-alvo é clivado para liberar as duas partes que o ligador está mantendo juntas. Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação clivável é clivado, pelo menos, cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, ou 100 vezes mais rápido em uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um indivíduo, ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).[00313] A cleavable linking group is one that is sufficiently stable outside the cell, but that, upon entry into a target cell, is cleaved to release the two parts that the linker is holding together. In a preferred embodiment, the cleavable linking group is cleaved at least about 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times faster in a target cell or under a first reference condition (which may, for example, be selected to mimic or represent intracellular conditions) than in an individual's blood, or under a second reference condition (which may, for example, be selected to mimic or represent conditions found in blood or serum).

[00314] Os grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox, ou a presença de moléculas de degradação. Geralmente, os agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados em níveis mais altos ou atividades dentro das células do que no soro ou no sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade de substrato, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores tais como mercaptanos, presentes em células, que podem degradar um grupo de ligação clivável redox por redução; esterases; endossomas ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que resultam em um pH de cinco ou menos; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável de ácido atuando como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas do substrato) e fosfatases.[00314] Cleavable linking groups are susceptible to cleavage agents, e.g., pH, redox potential, or the presence of degradation molecules. Generally, cleavage agents are more prevalent or found at higher levels or activities within cells than in serum or blood. Examples of such degradation agents include: redox agents that are selected for particular substrates or that lack substrate specificity, including, for example, oxidative or reductive enzymes or reducing agents such as mercaptans, present in cells, that can degrade a redox cleavable linking group by reduction; esterases; endosomes or agents that can create an acidic environment, e.g., those that result in a pH of five or less; enzymes that can hydrolyze or degrade an acid cleavable linking group acting as a general acid, peptidases (which may be substrate-specific), and phosphatases.

[00315] Um grupo de ligação clivável, tal como uma ligação de dissulfeto pode ser suscetível a pH. O pH do soro humano é de 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente inferior, variando entre cerca de 7,1 a 7,3. Endossomas têm um pH mais ácido, na faixa de 5,5 a 6,0, e os lisossomas têm um pH ainda mais ácido em torno de 5,0. Alguns ligadores terão um grupo de ligação clivável que é clivado a um pH preferido, liberando assim um lipídio catiônico do ligante no interior da célula, ou para o compartimento desejado da célula.[00315] A cleavable linking group, such as a disulfide bond, may be susceptible to pH. The pH of human serum is 7.4, while the average intracellular pH is slightly lower, ranging from about 7.1 to 7.3. Endosomes have a more acidic pH, in the range of 5.5 to 6.0, and lysosomes have an even more acidic pH around 5.0. Some linkers will have a cleavable linking group that is cleaved at a preferred pH, thereby releasing a cationic lipid from the linker into the cell interior, or to the desired compartment of the cell.

[00316] Um ligador pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligador pode depender da célula a ser alvejada. Por exemplo, um ligante que alveja o fígado pode ser ligado a um lipídio catiônico através de um ligador que inclui um grupo éster. As células hepáticas são ricas em esterases e, portanto, o ligador será clivado mais eficientemente nas células do fígado do que nos tipos de células que não são ricas em esterase. Outros tipos de células ricas em esterases incluem células do pulmão, córtex renal e testículos.[00316] A linker may include a cleavable linking group that is cleavable by a particular enzyme. The type of cleavable linking group incorporated into a linker may depend on the cell being targeted. For example, a ligand that targets the liver may be attached to a cationic lipid through a linker that includes an ester group. Liver cells are rich in esterases, and therefore, the linker will be cleaved more efficiently in liver cells than in cell types that are not esterase-rich. Other esterase-rich cell types include cells from the lung, renal cortex, and testis.

[00317] Os ligadores que contêm ligações peptídicas podem ser usados ao alvejar tipos de células ricos em peptidases, tais como células do fígado e sinoviócitos.[00317] Linkers containing peptide bonds can be used when targeting cell types rich in peptidases, such as liver cells and synoviocytes.

[00318] Em geral, a adequabilidade de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente (ou condição) de degradação de clivar o grupo de ligação candidato. Será também desejável testar também o grupo de ligação clivável candidato para a capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim, pode-se determinar a susceptibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, em que a primeira é selecionada para ser indicativa de clivagem em uma célula-alvo e a segunda é selecionada para ser indicativa de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sistemas livres de células, em células, em cultura celular, em cultura de órgão ou tecido, ou em animais inteiros. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições livres de células ou cultura e confirmar por avaliações adicionais em animais inteiros. Em modalidades preferidas, os compostos candidatos úteis são clivados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições intracelulares) em comparação com o sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições extracelulares).[00318] In general, the suitability of a candidate cleavable linking group can be assessed by testing the ability of a degradation agent (or condition) to cleave the candidate linking group. It will also be desirable to further test the candidate cleavable linking group for the ability to resist cleavage in blood or when in contact with other non-target tissue. Thus, the relative susceptibility to cleavage can be determined between a first and a second condition, where the first is selected to be indicative of cleavage in a target cell and the second is selected to be indicative of cleavage in other tissues or biological fluids, e.g., blood or serum. Assessments can be performed in cell-free systems, in cells, in cell culture, in organ or tissue culture, or in whole animals. It may be useful to make initial assessments in cell-free or culture conditions and confirm by additional assessments in whole animals. In preferred embodiments, useful candidate compounds are cleaved at least about 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 times faster in the cell (or under in vitro conditions selected to mimic intracellular conditions) compared to blood or serum (or under in vitro conditions selected to mimic extracellular conditions).

i. Grupos de ligação cliváveis redoxi. Redox-cleavable linking groups

[00319] Em certas modalidades, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação clivável redox que é clivado após redução ou oxidação. Um exemplo de grupo de ligação redutivamente clivável é um grupo de ligação dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um grupo de ligação clivável candidato é um “grupo de ligação redutivamente clivável” adequado ou, por exemplo, é adequado para uso com um radical de iRNA particular e agente de alvejamento particular, pode-se considerar os métodos aqui descritos. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outro agente redutor usando reagentes conhecidos na técnica, que imitam a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula alvo. Os candidatos também podem ser avaliados em condições que são selecionadas para imitar o sangue ou as condições séricas. Em um, os compostos candidatos são clivados por no máximo cerca de 10% no sangue. Em outras modalidades, os compostos candidatos úteis são degradados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições intracelulares) em comparação com o sangue (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições extracelulares). A taxa de clivagem de compostos candidatos pode ser determinada usando ensaios padrão de cinética enzimática sob condições escolhidas para imitar meio intracelular e em comparação com as condições escolhidas para imitar meio extracelular.[00319] In certain embodiments, a cleavable linking group is a redox-cleavable linking group that is cleaved upon reduction or oxidation. An example of a reductively cleavable linking group is a disulfide linking group (-S-S-). To determine whether a candidate cleavable linking group is a suitable “reductively cleavable linking group” or, e.g., is suitable for use with a particular iRNA moiety and particular targeting agent, one may consider the methods described herein. For example, a candidate may be evaluated by incubation with dithiothreitol (DTT), or another reducing agent using reagents known in the art, that mimic the rate of cleavage that would be observed in a cell, e.g., a target cell. Candidates may also be evaluated under conditions that are selected to mimic blood or serum conditions. In one, candidate compounds are cleaved by at most about 10% in blood. In other embodiments, useful candidate compounds are degraded at least about 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or about 100 times faster in the cell (or under in vitro conditions selected to mimic intracellular conditions) compared to blood (or under in vitro conditions selected to mimic extracellular conditions). The rate of cleavage of candidate compounds can be determined using standard enzyme kinetic assays under conditions chosen to mimic intracellular milieu and compared to conditions chosen to mimic extracellular milieu.

ii. Grupos de ligação cliváveis à base de fosfatoii. Phosphate-based cleavable linking groups

[00320] Em outras modalidades, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de fosfato. Um grupo de ligação clivável à base de fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que cliva grupos fosfato nas células são enzimas, como as fosfatases nas células. Exemplos de grupos de ligação à base de fosfato são -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, - S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S- P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S- P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Modalidades preferidas são - O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O- P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O- P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, e - O-P(S)(H)-S-. Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.[00320] In other embodiments, a cleavable linker comprises a phosphate-based cleavable linking group. A phosphate-based cleavable linking group is cleaved by agents that degrade or hydrolyze the phosphate group. An example of an agent that cleaves phosphate groups in cells are enzymes, such as phosphatases in cells. Examples of phosphate-based linking groups are -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, - S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S- P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S- P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Preferred embodiments are -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O- P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O- P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, and - O-P(S)(H)-S-. A preferred embodiment is -O-P(O)(OH)-O-. These candidates can be evaluated using methods analogous to those described above.

iii. Grupos de ligação cliváveis por ácidoiii. Acid-cleavable linking groups

[00321] Em outras modalidades, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável por ácido. Um grupo de ligação clivável por ácido é um grupo de ligação que é clivado sob condições ácidas. Em modalidades preferidas, os grupos de ligação cliváveis por ácido são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou inferior (por exemplo, cerca de 6,0, 5,5, 5,0 ou inferior) ou por agentes tais como enzimas que podem atuar como um ácido geral. Em uma célula, organelas de pH baixo específicas, tais como endossomas e lisossomas, podem prover um ambiente de clivagem para grupos de ligação cliváveis por ácido. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácido incluem, mas não se limitam a hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O, ou -OC(O). Uma modalidade preferida é quando o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquiloa substituída, ou grupo alquila terciária tal como dimetil pentila ou t-butila. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.[00321] In other embodiments, a cleavable linker comprises an acid-cleavable linking group. An acid-cleavable linking group is a linking group that is cleaved under acidic conditions. In preferred embodiments, acid-cleavable linking groups are cleaved in an acidic environment with a pH of about 6.5 or lower (e.g., about 6.0, 5.5, 5.0, or lower) or by agents such as enzymes that can act as a general acid. In a cell, specific low-pH organelles, such as endosomes and lysosomes, can provide a cleavage environment for acid-cleavable linking groups. Examples of acid-cleavable linking groups include, but are not limited to, hydrazones, esters, and amino acid esters. Acid-cleavable groups can have the general formula -C=NN-, C(O)O, or -OC(O). A preferred embodiment is when the carbon bonded to the ester oxygen (the alkoxy group) is an aryl group, substituted alkyl group, or tertiary alkyl group such as dimethylpentyl or t-butyl. These candidates can be evaluated using methods analogous to those described above.

iv. Grupos de ligação à base de ésteriv. Ester-based linking groups

[00322] Em outras modalidades, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de éster. Um grupo de ligação clivável à base de éster é clivado por enzimas, tais como esterases e amidases em células. Exemplos de grupos de ligação cliváveis à base de éster incluem, mas não estão limitados a ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Grupos de ligação cliváveis por éster têm a fórmula geral -C(O)O-, ou - OC(O)-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.[00322] In other embodiments, a cleavable linker comprises an ester-based cleavable linking group. An ester-based cleavable linking group is cleaved by enzymes such as esterases and amidases in cells. Examples of ester-based cleavable linking groups include, but are not limited to, esters of alkylene, alkenylene, and alkynylene groups. Ester-cleavable linking groups have the general formula -C(O)O-, or -OC(O)-. Such candidates can be evaluated using methods analogous to those described above.

v. Grupos de ligação à base de peptídeov. Peptide-based linking groups

[00323] Em ainda outras modalidades, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de peptídeo. Um grupo de ligação clivável à base de peptídeo é clivado por enzimas, tais como peptidases e proteases em células. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para render oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. Grupos cliváveis à base de peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquinileno. Uma ligação peptídica é um tipo especial de ligação amida formada entre aminoácidos para render peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem à base de peptídeo é geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação amida) formada entre aminoácidos que rende peptídeos e proteínas e não inclui todo o grupo funcional amida. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo têm a fórmula geral - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- (SEQ ID NO: __), onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.[00323] In still other embodiments, a cleavable linker comprises a peptide-based cleavable linking group. A peptide-based cleavable linking group is cleaved by enzymes such as peptidases and proteases in cells. Peptide-based cleavable linking groups are peptide bonds formed between amino acids to yield oligopeptides (e.g., dipeptides, tripeptides, etc.) and polypeptides. Peptide-based cleavable groups do not include the amide group (-C(O)NH-). The amide group can be formed between any alkylene, alkenylene, or alkynylene. A peptide bond is a special type of amide bond formed between amino acids to yield peptides and proteins. The peptide-based cleavage group is generally limited to the peptide bond (i.e., the amide bond) formed between amino acids that yields peptides and proteins and does not include the entire amide functional group. Peptide-based cleavable linking groups have the general formula - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- (SEQ ID NO: __), where RA and RB are the R groups of two adjacent amino acids. These candidates can be evaluated using methods analogous to those described above.

[00324] Em algumas modalidades, um iRNA da invenção é conjugado a um carboidrato através de um ligador. Exemplos não limitativos de conjugados de carboidratos de iRNA com ligadores das composições e métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a quando um de X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.[00324] In some embodiments, an iRNA of the invention is conjugated to a carbohydrate via a linker. Non-limiting examples of carbohydrate conjugates of iRNA with linkers of the compositions and methods of the invention include, but are not limited to when one of X or Y is an oligonucleotide, the other is a hydrogen.

[00325] Em certas modalidades das composições e métodos da invenção, um ligante é um ou mais derivados de “GalNAc” (N- acetilgalactosamina) ligado através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente.[00325] In certain embodiments of the compositions and methods of the invention, a linker is one or more derivatives of “GalNAc” (N-acetylgalactosamine) linked through a bivalent or trivalent branched linker.

[00326] Em certas modalidades, um dsRNA da invenção é conjugado a um ligador ramificado bivalente ou trivalente selecionado do grupo de estruturas mostrado em qualquer uma das fórmulas (XXXII) - (XXXV): em que: q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam independentemente para cada ocorrência 0 a 20 e em que a unidade de repetição pode ser igual ou diferente; P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C são, cada um, independentemente para cada ocorrência ausente, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH, ou CH2O; Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C são independentemente para cada ocorrência ausente, alquileno, alquileno substituído em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R’’), C≡C, ou C(O); R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C são, cada um, independentemente para cada ocorrência ausente, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B, e L5C representam o ligante; ou seja, cada um independentemente para cada ocorrência um monossacarídeo (tal como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo, ou polissacarídeo; e Ra é H ou cadeia de aminoácidos. Os derivados de GalNAc de conjugação trivalente são particularmente úteis para uso com agentes de RNAi para inibir a expressão de um gene alvo, tal como os de fórmula (XXXV): em que L5A, L5B e L5C representam um monossacarídeo, tal como um derivado de GalNAc.[00326] In certain embodiments, a dsRNA of the invention is conjugated to a bivalent or trivalent branched linker selected from the group of structures shown in any one of formulas (XXXII)-(XXXV): where: q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B, and q5C represent independently for each occurrence 0 to 20 and where the repeating unit may be the same or different; P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C are each independently for each missing occurrence CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH, or CH2O; Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C are each independently for each missing occurrence, alkylene, substituted alkylene in which one or more methylenes may be interrupted or terminated by one or more of O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R''), C≡C, or C(O); R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C are each independently for each missing occurrence, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=NO, L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B, and L5C represent the linker; that is, each independently for each occurrence a monosaccharide (such as GalNAc), disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide, oligosaccharide, or polysaccharide; and Ra is H or amino acid chain. Trivalently conjugated GalNAc derivatives are particularly useful for use with RNAi agents to inhibit the expression of a target gene, such as those of formula (XXXV): where L5A, L5B, and L5C represent a monosaccharide, such as a GalNAc derivative.

[00327] Exemplos de grupos de ligadores ramificados bivalentes e trivalentes adequados que conjugam derivados de GalNAc incluem, mas não estão limitados às estruturas citadas acima como fórmulas II, VII, XI, X e XIII.[00327] Examples of suitable bivalent and trivalent branched linker groups that conjugate GalNAc derivatives include, but are not limited to, the structures cited above as formulas II, VII, XI, X, and XIII.

[00328] Patentes US representativas que ensinam a preparação dos conjugados de RNA incluem, mas não estão limitadas a, Patente US Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928;5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; e 8.106.022, cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados na íntegra por referência.[00328] Representative U.S. patents teaching the preparation of RNA conjugates include, but are not limited to, U.S. Patent Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928;5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; and 8,106,022, the contents of each of which are incorporated herein in full by reference.

[00329] Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam uniformemente modificadas e, de fato, mais do que uma das modificações acima mencionadas pode ser incorporada em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um iRNA. A presente invenção também inclui compostos de iRNA que são compostos quiméricos.[00329] It is not necessary that all positions in a given compound be uniformly modified, and in fact, more than one of the aforementioned modifications may be incorporated into a single compound or even a single nucleoside within an iRNA. The present invention also includes iRNA compounds that are chimeric compounds.

[00330] Os compostos de iRNA “quiméricos” ou “quimeras”, no contexto desta invenção, são compostos de iRNA, preferivelmente agentes de dsRNAi, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma composta de pelo menos uma unidade monomérica, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Esses iRNAs contêm tipicamente pelo menos uma região em que o RNA é modificado de modo a conferir ao iRNA resistência aumentada à degradação da nuclease, aumento da absorção celular ou maior afinidade de ligação ao ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, a RNase H é uma endonuclease celular que cliva a cadeia de RNA de um duplex de RNA:DNA. A ativação da RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA alvo, intensificando assim enormemente a eficiência da inibição do iRNA da expressão gênica. Consequentemente, resultados comparáveis podem frequentemente ser obtidos com iRNAs mais curtos quando dsRNAs quiméricos são usados, comparados com dsRNAs de desoxifosforotioato que hibridizam com a mesma região alvo. A clivagem do alvo de RNA pode ser rotineiramente detectada por eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas conhecidas na técnica.[00330] “Chimeric” iRNA compounds or “chimeras,” in the context of this invention, are iRNA compounds, preferably dsRNAi agents, that contain two or more chemically distinct regions, each composed of at least one monomeric unit, i.e., one nucleotide in the case of a dsRNA compound. Such iRNAs typically contain at least one region in which the RNA is modified so as to confer on the iRNA increased resistance to nuclease degradation, increased cellular uptake, or increased binding affinity to the target nucleic acid. An additional region of the iRNA may serve as a substrate for enzymes capable of cleaving RNA:DNA or RNA:RNA hybrids. By way of example, RNase H is a cellular endonuclease that cleaves the RNA strand of an RNA:DNA duplex. Activation of RNase H, therefore, results in cleavage of the target RNA, thereby greatly enhancing the efficiency of iRNA inhibition of gene expression. Consequently, comparable results can often be obtained with shorter iRNAs when chimeric dsRNAs are used, compared with deoxyphosphorothioate dsRNAs that hybridize to the same target region. Cleavage of the RNA target can be routinely detected by gel electrophoresis and, if necessary, associated nucleic acid hybridization techniques known in the art.

[00331] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Um certo número de moléculas não ligantes foi conjugado a iRNAs de modo a intensificar a atividade, a distribuição celular ou a absorção celular do iRNA e os procedimentos para a realização de tais conjugações estão disponíveis na literatura científica. Tais radicais não ligantes incluem radicais lipídicos, tais como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553) que podem ser usados nos agentes da invenção. Outros radicais não ligantes incluem radicais lipídicos, ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecila (Saison- Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídio, e.g., di- hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H- fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma cadeia de poliamina ou polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), um radical palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ou um radical octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima. Protocolos típicos de conjugação envolvem a síntese de RNAs contendo um aminoligador em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é então reagido com a molécula a ser conjugada usando reagentes de acoplamento ou de ativação apropriados. A reação de conjugação pode ser realizada com o RNA ainda ligado ao suporte sólido ou após a clivagem do RNA, em fase de solução. A purificação do conjugado de RNA por HPLC tipicamente proporciona o conjugado puro.[00331] In certain cases, the RNA of an iRNA may be modified by a non-binding group. A number of non-binding molecules have been conjugated to iRNAs in order to enhance the activity, cellular distribution, or cellular uptake of the iRNA, and procedures for carrying out such conjugations are available in the scientific literature. Such non-binding moieties include lipid moieties such as cholesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553) which may be used in the agents of the invention. Other non-bonding radicals include lipid radicals, cholic acid (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), a thioether, for example, hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), a thiocholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), an aliphatic chain, for example, dodecandiol or undecyl residues (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett. 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), a phospholipid, e.g., dihexadecyl-rac-glycerol or triethylammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al. al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), a polyamine or polyethylene glycol chain (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), or adamantane acetic acid (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), a palmityl radical (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), or an octadecylamine or hexylaminocarbonyloxycholesterol radical (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Representative US patents teaching the preparation of such RNA conjugates have been listed above. Typical conjugation protocols involve the synthesis of RNAs containing an amino linker at one or more positions in the sequence. The amino group is then reacted with the molecule to be conjugated using appropriate coupling or activating reagents. The conjugation reaction can be carried out with the RNA still bound to the solid support or after RNA cleavage in the solution phase. Purification of the RNA conjugate by HPLC typically affords the pure conjugate.

IV. Dispensação de um iRNA da invençãoIV. Dispensing of an iRNA of the invention

[00332] A dispensação de um iRNA da presente invenção a uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo humano (por exemplo, um indivíduo em necessidade do mesmo, tal como um indivíduo tendo uma doença, distúrbio ou condição associada à expressão do gene PD-L1) pode ser conseguida de várias maneiras diferentes. Por exemplo, a dispensação pode ser realizada contactando uma célula com um iRNA da invenção, in vitro ou in vivo. A dispensação in vivo pode também ser feita diretamente por administração de uma composição compreendendo um iRNA, por exemplo, um dsRNA, a um indivíduo. Alternativamente, a dispensação in vivo pode ser realizada indiretamente por administração de um ou mais vetores que codificam e direcionam a expressão do iRNA. Essas alternativas são discutidas mais abaixo.[00332] Delivery of an iRNA of the present invention to a cell, e.g., a cell within an individual, such as a human individual (e.g., an individual in need thereof, such as an individual having a disease, disorder, or condition associated with PD-L1 gene expression) can be achieved in several different ways. For example, delivery can be accomplished by contacting a cell with an iRNA of the invention, in vitro or in vivo. In vivo delivery can also be accomplished directly by administering a composition comprising an iRNA, e.g., a dsRNA, to an individual. Alternatively, in vivo delivery can be accomplished indirectly by administering one or more vectors that encode and direct expression of the iRNA. These alternatives are discussed further below.

[00333] Em geral, qualquer método de dispensação de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptada para uso com um iRNA da invenção (ver, por exemplo, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 e WO94/02595, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Para a dispensação in vivo, os fatores a se considerar a fim de dispensar uma molécula de iRNA incluem, por exemplo, estabilidade biológica da molécula dispensada, a prevenção de efeitos não específicos, e a acumulação da molécula dispensada no tecido alvo. Os efeitos não específicos de um iRNA podem ser minimizados por administração local, por exemplo, por injeção direta ou implantação em um tecido ou administração tópica da preparação. A administração local a um sítio de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente aos tecidos sistêmicos que podem de outro modo ser prejudicados pelo agente ou que podem degradar o agente, e permite uma dose total mais baixa da molécula de iRNA a ser administrada. Vários estudos demonstraram um knockdown bem-sucedido de produtos genéticos quando um agente de dsRNAi é administrado localmente. Por exemplo, dispensação intra-ocular de um dsRNA de VEGF por injeção intravítrea em macacos cinomolgos (Tolentino, MJ, et al (2004) Retina 24:132-138) e injeções sub-retinianas em camundongos (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216) ambas mostraram prevenir a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada à idade. Além disso, a injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume do tumor (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos portadores de tumores (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523). A interferência de RNA também mostrou sucesso com a dispensação local ao SNC por injeção direta (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) e aos pulmões por administração intranasal (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para a administração de um iRNA sistemicamente para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou alternativamente dispensado usando um sistema de dispensação de fármaco; ambos os métodos atuam para prevenir a rápida degradação do dsRNA por endo- e exonucleases in vivo. A modificação do RNA ou do carreador farmacêutico também pode permitir o alvejamento do iRNA para o tecido-alvo e evitar efeitos indesejáveis fora do alvo. As moléculas de iRNA podem ser modificadas por conjugação química a grupos lipofílicos, como o colesterol, para intensificar a captação celular e prevenir a degradação. Por exemplo, um iRNA direcionado contra ApoB conjugado a um radical de colesterol lipofílico foi injetado sistemicamente em camundongos e resultou em knockdown de mRNA de apoB tanto no fígado como no jejuno (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). A conjugação de um iRNA a um aptâmero demonstrou inibir o crescimento do tumor e mediar a regressão tumoral em um modelo de camundongo de câncer de próstata (McNamara, JO, et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o iRNA pode ser dispensado usando sistemas de dispensação de fármaco, tais como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomas, ou um sistema de dispensação catiônico. Sistemas de dispensação catiônicos carregados positivamente facilitam a ligação de uma molécula de iRNA (carregada negativamente) e também intensificam as interações na membrana celular carregada negativamente para permitir a absorção eficiente de um iRNA pela célula. Lipídios, dendrímeros ou polímeros catiônicos podem ser ligados a um iRNA ou induzidos a formar uma vesícula ou micela (ver, por exemplo, Kim SH, et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encerra um iRNA. A formação de vesículas ou micelas evita ainda a degradação do iRNA quando administrado sistemicamente. Os métodos para preparar e administrar complexos iRNA- catiônicos estão bem dentro das capacidades de um versado na técnica (ver, por exemplo, Sorensen, DR, et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN, et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Alguns exemplos não limitativos de sistemas de dispensação de fármacos úteis para a dispensação sistêmica de iRNAs incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN, et al (2003), supra), Oligofectamina, “partículas lipídicas sólidas de ácido nucleico” (Zimmermann, TS, et al (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY, et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A, et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenoimina (Bonnet ME, et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472487), e poliamidoaminas (Tomalia, DA, et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). Em algumas modalidades, um iRNA forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Os métodos para administração e composições farmacêuticas de iRNAs e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente US No. 7.427.605, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. iRNAs codificados por vetores da invenção[00333] In general, any method of delivering a nucleic acid molecule (in vitro or in vivo) can be adapted for use with an iRNA of the invention (see, e.g., Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 and WO94/02595, which are incorporated herein by reference in their entirety). For in vivo delivery, factors to consider in order to deliver an iRNA molecule include, e.g., biological stability of the delivered molecule, the avoidance of non-specific effects, and accumulation of the delivered molecule in the target tissue. Non-specific effects of an iRNA can be minimized by local administration, e.g., by direct injection or implantation into a tissue or topical administration of the preparation. Local administration to a treatment site maximizes the local concentration of the agent, limits exposure of the agent to systemic tissues that may otherwise be harmed by the agent or that may degrade the agent, and allows for a lower total dose of the iRNA molecule to be administered. Several studies have demonstrated successful knockdown of gene products when a dsRNAi agent is administered locally. For example, intraocular delivery of a VEGF dsRNA by intravitreal injection in cynomolgus monkeys (Tolentino, MJ, et al (2004) Retina 24:132-138) and subretinal injections in mice (Reich, SJ, et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216) both showed to prevent neovascularization in an experimental model of age-related macular degeneration. Furthermore, direct intratumoral injection of a dsRNA into mice reduces tumor volume (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther. 11:267-274) and can prolong the survival of tumor-bearing mice (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523). RNA interference has also shown success with local delivery to the CNS by direct injection (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Natl. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476–484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677–10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50–55). For systemically administering an iRNA for the treatment of a disease, the RNA can be modified or alternatively dispensed using a drug delivery system; both methods act to prevent rapid degradation of the dsRNA by endo- and exonucleases in vivo. Modification of the RNA or the pharmaceutical carrier can also allow targeting of the iRNA to the target tissue and avoid undesirable off-target effects. iRNA molecules can be modified by chemical conjugation to lipophilic groups, such as cholesterol, to enhance cellular uptake and prevent degradation. For example, an iRNA directed against ApoB conjugated to a lipophilic cholesterol moiety was injected systemically into mice and resulted in knockdown of apoB mRNA in both the liver and jejunum (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Conjugation of an iRNA to an aptamer has been shown to inhibit tumor growth and mediate tumor regression in a mouse model of prostate cancer (McNamara, J.O., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). In an alternative embodiment, the iRNA can be delivered using drug delivery systems such as a nanoparticle, a dendrimer, a polymer, liposomes, or a cationic delivery system. Positively charged cationic delivery systems facilitate the binding of a negatively charged iRNA molecule and also enhance interactions at the negatively charged cell membrane to allow efficient uptake of an iRNA into the cell. Cationic lipids, dendrimers, or polymers can be bound to an iRNA or induced to form a vesicle or micelle (see, for example, Kim SH, et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) that encloses an iRNA. The formation of vesicles or micelles also prevents degradation of the iRNA when administered systemically. Methods for preparing and administering iRNA-cationic complexes are well within the capabilities of one skilled in the art (see, e.g., Sorensen, DR, et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN, et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, which are incorporated herein by reference in their entirety). Some non-limiting examples of drug delivery systems useful for the systemic delivery of iRNAs include DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, U.N., et al (2003), supra), Oligofectamine, “solid lipid nucleic acid particles” (Zimmermann, T.S., et al (2006) Nature 441:111-114), cardiolipin (Chien, P.Y., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A, et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polyethyleneimine (Bonnet M.E., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptides (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), and polyamidoamines (Tomalia, D.A., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). In some embodiments, an iRNA forms a complex with cyclodextrin for systemic administration. Methods for administration and pharmaceutical compositions of iRNAs and cyclodextrins can be found in U.S. Patent No. 7,427,605, which is incorporated herein by reference in its entirety. iRNAs encoded by vectors of the invention

[00334] O iRNA que alveja o gene PD-L1 pode ser expresso a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (ver, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A, et al., Publicação PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, Publicação PCT Internacional No. WO 00/22114, e Conrad, Patente US No. 6.054.299). A expressão pode ser transitória (na ordem de algumas horas a semanas) ou prolongada (de semanas a meses ou mais), dependendo da construção específica usada e o tecido alvo ou tipo de célula. Esses transgenes podem ser introduzidos como uma construção linear, um plasmídeo circular ou um vetor viral, que pode ser um vetor integrante ou não integrante. O transgene também pode ser construído para permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossômico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).[00334] iRNA targeting the PD-L1 gene can be expressed from transcription units inserted into DNA or RNA vectors (see, e.g., Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A, et al., PCT International Publication No. WO 00/22113, Conrad, PCT International Publication No. WO 00/22114, and Conrad, U.S. Patent No. 6,054,299). Expression can be transient (on the order of a few hours to weeks) or prolonged (weeks to months or longer), depending on the specific construct used and the target tissue or cell type. These transgenes can be introduced as a linear construct, a circular plasmid, or a viral vector, which can be an integrating or non-integrating vector. The transgene can also be constructed to allow it to be inherited as an extrachromosomal plasmid (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

[00335] A cadeia individual ou cadeias de um iRNA podem ser transcritas a partir de um promotor em um vetor de expressão. Quando duas cadeias separadas devem ser expressas para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser cointroduzidos (por exemplo, por transfecção ou infecção) em uma célula alvo. Alternativamente, cada cadeia individual de um dsRNA pode ser transcrita por promotores, estando ambos localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso como polinucleotídeos de repetição invertida unidos por uma sequência polinucleotídica ligadora de tal modo que o dsRNA tem uma estrutura de haste e alça.[00335] The individual strand or strands of an iRNA can be transcribed from a promoter into an expression vector. When two separate strands must be expressed to generate, for example, a dsRNA, two separate expression vectors can be co-introduced (e.g., by transfection or infection) into a target cell. Alternatively, each individual strand of a dsRNA can be transcribed by promoters, both of which are located on the same expression plasmid. In one embodiment, a dsRNA is expressed as inverted repeat polynucleotides joined by a linker polynucleotide sequence such that the dsRNA has a stem-loop structure.

[00336] Os vetores de expressão de iRNA são geralmente plasmídeos de DNA ou vetores virais. Os vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferivelmente os compatíveis com células de vertebrados, podem ser usados para produzir construções recombinantes para a expressão de um iRNA tal como aqui descrito. Os vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de várias fontes comerciais. Tipicamente, tais vetores são providos contendo sítios de restrição convenientes para inserção do segmento de ácido nucleico desejado. A dispensação de vetores que expressam iRNA pode ser sistêmica, tal como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração a células alvo explantadas do paciente, seguida de reintrodução no paciente, ou por qualquer outro meio que permita a introdução em uma célula alvo desejada.[00336] iRNA expression vectors are generally DNA plasmids or viral vectors. Expression vectors compatible with eukaryotic cells, preferably those compatible with vertebrate cells, can be used to produce recombinant constructs for the expression of an iRNA as described herein. Eukaryotic cell expression vectors are well known in the art and are available from various commercial sources. Typically, such vectors are provided with convenient restriction sites for insertion of the desired nucleic acid segment. Delivery of iRNA-expressing vectors can be systemic, such as by intravenous or intramuscular administration, by administration to target cells explanted from the patient followed by reintroduction into the patient, or by any other means that allows introduction into a desired target cell.

[00337] Os sistemas de vetores virais que podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos incluem, mas não estão limitados a (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo, mas não limitados a vetores lentivirais, vírus da leucemia murina de moloney, etc.; (c) vetores de vírus adenoassociados; (d) vetores do vírus do herpes simplex; (e) vetores SV 40; (f) vetores de poliomavírus; (g) vetores do vírus do papiloma; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de poxvírus, tais como um ortopox, e.g., vetores de vírus vaccinia ou avipox, por exemplo, varíola de canário ou bouba aviária; e (j) um adenovírus dependente de auxiliar ou sem células. Vírus com replicação defeituosa também podem ser vantajosos. Diferentes vetores serão ou não incorporados ao genoma das células. As construções podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, a construção pode ser incorporada em vetores capazes de replicação epissômica, por exemplo, vetores EPV e EBV. As construções para a expressão recombinante de um iRNA geralmente requerem elementos reguladores, por exemplo, promotores, intensificadores, etc., para assegurar a expressão do iRNA em células alvo. Outros aspectos a serem considerados para vetores e construções são conhecidos na técnica.[00337] Viral vector systems that may be used with the methods and compositions described herein include, but are not limited to, (a) adenovirus vectors; (b) retrovirus vectors, including, but not limited to, lentiviral vectors, Moloney murine leukemia virus, etc.; (c) adeno-associated virus vectors; (d) herpes simplex virus vectors; (e) SV 40 vectors; (f) polyomavirus vectors; (g) papillomavirus vectors; (h) picornavirus vectors; (i) poxvirus vectors, such as an orthopox, e.g., vaccinia or avipox virus vectors, e.g., canarypox or fowlpox; and (j) a helper-dependent or cell-free adenovirus. Replication-defective viruses may also be advantageous. Different vectors will or will not incorporate into the genome of the cells. The constructs may include viral sequences for transfection, if desired. Alternatively, the construct may be incorporated into vectors capable of episomal replication, e.g., EPV and EBV vectors. Constructs for recombinant expression of an iRNA generally require regulatory elements, e.g., promoters, enhancers, etc., to ensure iRNA expression in target cells. Other considerations for vectors and constructs are known in the art.

V. Composições farmacêuticas da invençãoV. Pharmaceutical compositions of the invention

[00338] A presente invenção também inclui composições farmacêuticas e formulações que incluem os iRNAs da invenção. Em uma modalidade, são aqui providas composições farmacêuticas contendo um iRNA, como aqui descrito, e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas contendo o iRNA são úteis para tratar uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de um gene PD-L1. Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de dispensação. Um exemplo são composições que são formuladas para administração sistêmica via dispensação parenteral, por exemplo, por dispensação subcutânea (SC) ou intravenosa (IV). As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene PD-L1.[00338] The present invention also includes pharmaceutical compositions and formulations that include the iRNAs of the invention. In one embodiment, provided herein are pharmaceutical compositions containing an iRNA, as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical compositions containing the iRNA are useful for treating a disease or disorder associated with the expression or activity of a PD-L1 gene. Such pharmaceutical compositions are formulated based on the mode of delivery. One example is compositions that are formulated for systemic administration via parenteral delivery, e.g., by subcutaneous (SC) or intravenous (IV) delivery. The pharmaceutical compositions of the invention can be administered in dosages sufficient to inhibit the expression of a PD-L1 gene.

[00339] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene PD-L1. Em geral, uma dose adequada de um iRNA da presente invenção estará na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor por dia, geralmente na faixa de cerca de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Tipicamente, uma dose adequada de um iRNA da presente invenção estará na faixa de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5,0 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg. Um regime de dose repetida pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica de iRNA regularmente, tal como a cada dois dias ou uma vez por ano. Em certas modalidades, o iRNA é administrado cerca de uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (isto é, cerca de uma vez a cada três meses).[00339] Pharmaceutical compositions of the invention can be administered in dosages sufficient to inhibit the expression of a PD-L1 gene. In general, a suitable dose of an iRNA of the present invention will be in the range of about 0.001 to about 200.0 milligrams per kilogram of body weight of the recipient per day, generally in the range of about 1 to 50 mg per kilogram of body weight per day. Typically, a suitable dose of an iRNA of the present invention will be in the range of about 0.1 mg/kg to about 5.0 mg/kg, for example, about 0.3 mg/kg and about 3.0 mg/kg. A repeat dose regimen can include administering a therapeutic amount of iRNA on a regular basis, such as every other day or once a year. In certain embodiments, the iRNA is administered about once a month to about once a quarter (i.e., about once every three months).

[00340] Após um regime inicial de tratamento, os tratamentos podem ser administrados com menor frequência. Por exemplo, após a administração semanal ou quinzenal por três meses, a administração pode ser repetida uma vez por mês, durante seis meses ou um ano; ou mais.[00340] After an initial treatment regimen, treatments may be administered less frequently. For example, after weekly or biweekly administration for three months, administration may be repeated once a month for six months or a year; or longer.

[00341] A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez por dia, ou o iRNA pode ser administrado como duas, três ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou mesmo usando infusão contínua ou dispensação através de uma formulação de liberação controlada. Nesse caso, o iRNA contido em cada subdose deve ser correspondentemente menor para atingir a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode também ser composta para dispensação ao longo de vários dias, por exemplo, usando uma formulação de liberação prolongada convencional, que provê uma liberação prolongada do iRNA ao longo de um período de vários dias. As formulações de liberação controlada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para a dispensação de agentes em um sítio particular, tais como poderiam ser usados com os agentes da presente invenção. Nessa modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.[00341] The pharmaceutical composition may be administered once daily, or the iRNA may be administered as two, three, or more subdoses at appropriate intervals throughout the day, or even using continuous infusion or dispensing via a controlled-release formulation. In this case, the iRNA contained in each subdose must be correspondingly smaller to achieve the total daily dosage. The dosage unit may also be compounded for dispensing over several days, for example, using a conventional extended-release formulation, which provides a sustained release of the iRNA over a period of several days. Controlled-release formulations are well known in the art and are particularly useful for dispensing agents at a particular site, such as could be used with the agents of the present invention. In this embodiment, the dosage unit contains a corresponding multiple of the daily dose.

[00342] Em outras modalidades, uma dose única das composições farmacêuticas pode ser de longa duração, de tal modo que as doses subsequentes são administradas em não mais do que intervalos de 3, 4, ou 5 dias, ou em não mais do que intervalos de 1, 2, 3, ou 4 semanas. Em algumas modalidades da invenção, uma dose única das composições farmacêuticas da invenção é administrada uma vez por semana. Em outras modalidades da invenção, uma dose única das composições farmacêuticas da invenção é administrada bimensalmente. Em certas modalidades, o iRNA é administrado cerca de uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (isto é, cerca de uma vez a cada três meses).[00342] In other embodiments, a single dose of the pharmaceutical compositions can be long-acting, such that subsequent doses are administered at no more than 3-, 4-, or 5-day intervals, or at no more than 1-, 2-, 3-, or 4-week intervals. In some embodiments of the invention, a single dose of the pharmaceutical compositions of the invention is administered once a week. In other embodiments of the invention, a single dose of the pharmaceutical compositions of the invention is administered bimonthly. In certain embodiments, the iRNA is administered from about once a month to about once a quarter (i.e., about once every three months).

[00343] O versado na técnica irá reconhecer que certos fatores podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, estado geral de saúde ou idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. As estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para os iRNA individuais abrangidos pela invenção podem ser feitas usando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado, como é conhecido na técnica.[00343] One skilled in the art will recognize that certain factors may influence the dosage and time required to effectively treat an individual, including but not limited to the severity of the disease or disorder, prior treatments, the individual's general health or age, and other present conditions. Furthermore, treating an individual with a therapeutically effective amount of a composition may include a single treatment or a series of treatments. Estimates of effective dosages and in vivo half-lives for the individual iRNAs covered by the invention may be made using conventional methodologies or based on in vivo testing using an appropriate animal model, as is known in the art.

[00344] Por exemplo, modelos animais de infecção por hepatite B são conhecidos na técnica, incluindo chimpanzé, marmota, e modelos de camundongo transgênico de VHB (Wieland, 2015. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 5:a021469, 2015; Tennant and Gerin, 2001. ILAR Journal, 42:89-102; e Moriyama et al., 1990. Science, 248:361-364). O modelo de chimpanzé também pode ser usado como modelo para infecção por hepatite D. Um grande número de modelos de câncer incluindo tumores quimicamente induzidos e xenoenxertados são conhecidos na técnica.[00344] For example, animal models of hepatitis B infection are known in the art, including chimpanzee, woodchuck, and transgenic mouse models of HBV (Wieland, 2015. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 5:a021469, 2015; Tennant and Gerin, 2001. ILAR Journal, 42:89-102; and Moriyama et al., 1990. Science, 248:361-364). The chimpanzee model can also be used as a model for hepatitis D infection. A large number of cancer models including chemically induced and xenografted tumors are known in the art.

[00345] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras, dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, por um emplastro transdérmico), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdérmica, por exemplo, através de um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração intraparenquimal, intratecal ou intraventricular.[00345] The pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a variety of ways, depending on whether local or systemic treatment is desired and the area to be treated. Administration may be topical (e.g., by a transdermal patch); pulmonary, e.g., by inhalation or insufflation of powders or aerosols, including by nebulizer; intratracheal, intranasal, epidermal and transdermal, oral, or parenteral. Parenteral administration includes intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular injection or infusion; subdermal, e.g., through an implanted device; or intracranial, e.g., by intraparenchymal, intrathecal, or intraventricular administration.

[00346] O iRNA pode ser dispensado de maneira a alvejar um tecido particular (por exemplo, células do fígado).[00346] The iRNA can be delivered in a manner that targets a particular tissue (e.g., liver cells).

[00347] As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica ou transdérmica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizadores, líquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis carreadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes. Preservativos revestidos, luvas e similares também podem ser úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas em que os iRNA apresentados na invenção estão em mistura com um agente de dispensação tópica tal como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Lipídios e lipossomas adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearolifosfatidilcolina) negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiônicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropila DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Os iRNAs apresentados na invenção podem ser encapsulados em lipossomas ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomas catiônicos. Alternativamente, os iRNA podem ser complexados com lipídios, em particular lipídios catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem, mas não estão limitados a ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, 1- monocaprato de glicerila, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um C1-20 alquil éster (por exemplo, isopropilmiristato IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo). As formulações tópicas são descritas em detalhe na Patente US No. 6.747.014, que é aqui incorporada como referência. Formulações de iRNA compreendendo conjuntos moleculares membranosos[00347] Pharmaceutical compositions and formulations for topical or transdermal administration may include transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids, and powders. Conventional pharmaceutical carriers, aqueous, powder, or oily bases, thickeners, and the like may be necessary or desirable. Coated preservatives, gloves, and the like may also be useful. Suitable topical formulations include those in which the iRNAs disclosed in the invention are in admixture with a topical delivery agent such as lipids, liposomes, fatty acids, fatty acid esters, steroids, chelating agents, and surfactants. Suitable lipids and liposomes include neutral (e.g., dioleoylphosphatidyl DOPE ethanolamine, dimyristoylphosphatidylcholine DMPC, distearoylphosphatidylcholine), negative (e.g., dimyristoylphosphatidyl glycerol DMPG), and cationic (e.g., dioleoyltetramethylaminopropyl DOTAP and dioleoylphosphatidyl ethanolamine DOTMA) lipids. The iRNAs presented in the invention may be encapsulated in liposomes or may form complexes with them, in particular with cationic liposomes. Alternatively, the iRNAs may be complexed with lipids, in particular cationic lipids. Suitable fatty acids and esters include, but are not limited to, arachidonic acid, oleic acid, eicosanoic acid, lauric acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dicaprate, tricaprate, monoolein, dilaurin, glyceryl-1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, an acylcarnitine, an acylcholine, or a C1-20 alkyl ester (e.g., isopropylmyristate IPM), monoglyceride, diglyceride, or pharmaceutically acceptable salt thereof. Topical formulations are described in detail in U.S. Patent No. 6,747,014, which is incorporated herein by reference. iRNA Formulations Comprising Membrane-Spanning Molecular Assemblies

[00348] Um iRNA para uso nas composições e métodos da invenção pode ser formulado para dispensação em um conjunto molecular membranoso, por exemplo, um lipossoma ou uma micela. Como aqui usado, o termo “lipossoma” refere-se a uma vesícula composta por lipídios anfifílicos arranjados em pelo menos uma bicamada, por exemplo, uma bicamada ou uma pluralidade de bicamadas. Os lipossomas incluem vesículas unilamelares e multilamelares que têm uma membrana formada a partir de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém o iRNA. O material lipofílico isola o interior aquoso a partir de um exterior aquoso, que normalmente não inclui a composição de iRNA, embora em alguns exemplos, possa. Os lipossomas são úteis para a transferência e dispensação de ingredientes ativos para o sítio da ação. Como a membrana lipossômica é estruturalmente semelhante às membranas biológicas, quando os lipossomas são aplicados a um tecido, a bicamada lipossômica funde-se com a bicamada das membranas celulares. À medida que a fusão do lipossoma e da célula progride, os conteúdos aquosos internos que incluem o iRNA são dispensados na célula onde o iRNA pode ligar-se especificamente a um RNA alvo e pode mediar a interferência de RNA. Em alguns casos, os lipossomas são também especificamente alvejados, por exemplo, para direcionar o iRNA a tipos de células particulares.[00348] An iRNA for use in the compositions and methods of the invention may be formulated for delivery in a membranous molecular assembly, e.g., a liposome or a micelle. As used herein, the term "liposome" refers to a vesicle composed of amphiphilic lipids arranged in at least one bilayer, e.g., a bilayer or a plurality of bilayers. Liposomes include unilamellar and multilamellar vesicles that have a membrane formed from a lipophilic material and an aqueous interior. The aqueous portion contains the iRNA. The lipophilic material isolates the aqueous interior from an aqueous exterior, which typically does not include the iRNA composition, although in some instances, it may. Liposomes are useful for the transfer and delivery of active ingredients to the site of action. Because the liposomal membrane is structurally similar to biological membranes, when liposomes are applied to a tissue, the liposomal bilayer fuses with the cell membrane bilayer. As liposome-cell fusion progresses, the internal aqueous contents, which include the iRNA, are released into the cell, where the iRNA can specifically bind to a target RNA and mediate RNA interference. In some cases, liposomes are also specifically targeted, for example, to target iRNA to particular cell types.

[00349] Um lipossoma contendo um agente de iRNA pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente de modo a que as micelas sejam formadas com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um conjugado lipídico ou lipídico catiônico anfipático. O detergente pode ter uma concentração micelar crítica alta e pode ser não iônico. Detergentes exemplificativos incluem colato, CHAPS, octilglucosídeo, desoxicolato e lauroil sarcosina. A preparação do agente de iRNA é então adicionada às micelas que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos no lipídio interagem com o agente de iRNA e condensam em torno do agente de iRNA para formar um lipossoma. Após condensação, o detergente é removido, por exemplo, por diálise, para render uma preparação lipossômica do agente de iRNA.A liposome containing an iRNA agent can be prepared by a variety of methods. In one example, the lipid component of a liposome is dissolved in a detergent such that micelles are formed with the lipid component. For example, the lipid component can be an amphipathic cationic lipid or lipid conjugate. The detergent can have a high critical micelle concentration and can be nonionic. Exemplary detergents include cholate, CHAPS, octylglucoside, deoxycholate, and lauroyl sarcosine. The iRNA agent preparation is then added to the micelles that include the lipid component. The cationic groups on the lipid interact with the iRNA agent and condense around the iRNA agent to form a liposome. After condensation, the detergent is removed, for example, by dialysis, to yield a liposomal preparation of the iRNA agent.

[00350] Se necessário, um composto carreador que auxilia na condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, por adição controlada. Por exemplo, o composto carreador pode ser um polímero diferente de um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.[00350] If necessary, a carrier compound that aids in condensation may be added during the condensation reaction, for example, by controlled addition. For example, the carrier compound may be a polymer other than a nucleic acid (e.g., spermine or spermidine). The pH may also be adjusted to favor condensation.

[00351] Métodos para a produção de veículos de dispensação de polinucleotídeos estáveis, que incorporam um complexo de polinucleotídeo/lipídico catiônico como componentes estruturais do veículo de dispensação, são adicionalmente descritos em, por exemplo, WO 96/37194, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência. A formação de lipossomas também pode incluir um ou mais aspectos dos métodos exemplificativos descritos em Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; Patente US No. 4.897.355; Patente US No. 5.171.678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; e Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Técnicas comumente usadas para preparar agregados lipídicos de tamanho apropriado para uso como veículos de dispensação incluem sonicação e congelamento-descongelamento mais extrusão (ver, por exemplo, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). A microfluidização pode ser usada quando agregados consistentemente pequenos (50 a 200 nm) e relativamente uniformes são desejados (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Esses métodos são facilmente adaptados para acondicionar preparações de agentes de iRNA em lipossomas.[00351] Methods for producing stable polynucleotide delivery vehicles incorporating a cationic polynucleotide/lipid complex as structural components of the delivery vehicle are further described in, e.g., WO 96/37194, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference. Liposome formation may also include one or more aspects of the exemplary methods described in Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Patent No. 4,897,355; U.S. Patent No. 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; and Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Techniques commonly used to prepare lipid aggregates of appropriate size for use as dispensing vehicles include sonication and freeze-thaw plus extrusion (see, for example, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Microfluidization can be used when consistently small (50 to 200 nm) and relatively uniform aggregates are desired (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). These methods are easily adapted to package preparations of iRNA agents in liposomes.

[00352] Os lipossomas se dividem em duas grandes classes. Os lipossomas catiônicos são lipossomas que interagem com as moléculas de ácidos nucleicos negativamente carregadas para formar um complexo estável. O complexo de ácido nucleico/lipossoma carregado positivamente liga-se à superfície da célula carregada negativamente e é internalizado em um endossoma. Devido ao pH ácido dentro do endossoma, os lipossomas são rompidos, liberando seu conteúdo no citoplasma da célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).[00352] Liposomes fall into two major classes. Cationic liposomes are liposomes that interact with negatively charged nucleic acid molecules to form a stable complex. The positively charged nucleic acid/liposome complex binds to the negatively charged cell surface and is internalized into an endosome. Due to the acidic pH within the endosome, the liposomes are ruptured, releasing their contents into the cell cytoplasm (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

[00353] Os lipossomas que são sensíveis ao pH ou carregados negativamente captam ácidos nucleicos em vez de complexos com ele. Uma vez que tanto o ácido nucleico como o lipídio são carregados de modo semelhante, ocorre repulsão em vez de formação de complexos. No entanto, algum ácido nucleico é captado no interior aquoso desses lipossomas. Os lipossomas sensíveis ao pH têm sido usados para dispensar ácidos nucleicos que codificam o gene da timidina-quinase para monocamadas de células em cultura. Expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).[00353] Liposomes that are pH-sensitive or negatively charged take up nucleic acids rather than complex with them. Since both the nucleic acid and the lipid are similarly charged, repulsion occurs rather than complex formation. However, some nucleic acid is taken up in the aqueous interior of these liposomes. pH-sensitive liposomes have been used to deliver nucleic acids encoding the thymidine kinase gene to cultured cell monolayers. Expression of the exogenous gene has been detected in the target cells (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

[00354] Um tipo principal de composição lipossômica inclui fosfolipídios diferentes da fosfatidilcolina derivada naturalmente. As composições lipossômicas neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). As composições lipossômicas aniônicas são geralmente formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto os lipossomas fusogênicos aniônicos são formados principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossômica é formado a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de dois ou mais de fosfolipídio, fosfatidilcolina e colesterol.[00354] One major type of liposomal composition includes phospholipids other than naturally derived phosphatidylcholine. Neutral liposomal compositions, for example, can be formed from dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) or dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC). Anionic liposomal compositions are generally formed from dimyristoyl phosphatidylglycerol, while anionic fusogenic liposomes are formed primarily from dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE). Another type of liposomal composition is formed from phosphatidylcholine (PC) such as, for example, soybean PC and egg PC. Another type is formed from mixtures of two or more of the phospholipid, phosphatidylcholine, and cholesterol.

[00355] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomas em células in vitro e in vivo incluem Patente US Nos. 5.283.185 e 5.171.678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; e Strauss EMBO J. 11:417, 1992.[00355] Examples of other methods for introducing liposomes into cells in vitro and in vivo include U.S. Patent Nos. 5,283,185 and 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; and Strauss EMBO J. 11:417, 1992.

[00356] Sistemas lipossômicos não iônicos foram também examinados para determinar a sua utilidade na dispensação de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossômicas não iônicas compreendendo NovasomeTMI (dilaurato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e NovasomeTMII (diestearato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para dispensar ciclosporina-A na derme da pele de camundongo. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossômicos não iônicos foram eficazes em facilitar a deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).[00356] Nonionic liposomal systems were also examined to determine their utility in delivering drugs to the skin, in particular systems comprising nonionic surfactant and cholesterol. Nonionic liposomal formulations comprising NovasomeTMI (glyceryl dilaurate/cholesterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) and NovasomeTMII (glyceryl distearate/cholesterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) were used to deliver cyclosporine-A into the dermis of mouse skin. The results indicated that such nonionic liposomal systems were effective in facilitating the deposition of cyclosporine-A into different layers of the skin (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).

[00357] Os lipossomas também incluem lipossomas “estericamente estabilizados”, um termo que, como aqui usado, refere-se a lipossomas compreendendo um ou mais lipídios especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em tempos de circulação intensificados em relação a lipossomas que não têm tais lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da porção lipídica formadora de vesículas do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolipídios, tais como monossialogangliosídeo GM1, ou (B) é derivatizado com um ou mais polímeros hidrofílicos, tal como um radical polietilenoglicol (PEG). Embora não desejando ser limitado por qualquer teoria particular, pensa-se na técnica que, pelo menos para lipossomas estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina, ou lipídios derivatizados com PEG, a meia-vida de circulação intensificada desses lipossomas estericamente estabilizados deriva de uma redução da captação nas células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).[00357] Liposomes also include “sterically stabilized” liposomes, a term which, as used herein, refers to liposomes comprising one or more specialized lipids that, when incorporated into liposomes, result in enhanced circulation times relative to liposomes lacking such specialized lipids. Examples of sterically stabilized liposomes are those in which part of the vesicle-forming lipid portion of the liposome (A) comprises one or more glycolipids, such as monosialoganglioside GM1, or (B) is derivatized with one or more hydrophilic polymers, such as a polyethylene glycol (PEG) moiety. While not wishing to be bound by any particular theory, it is thought in the art that, at least for sterically stabilized liposomes containing gangliosides, sphingomyelin, or PEG-derivatized lipids, the enhanced circulation half-life of these sterically stabilized liposomes derives from a reduction in uptake into cells of the reticuloendothelial system (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

[00358] Vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolipídios são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relataram a capacidade do monossialogangliosídeo GM1, do sulfato de galactocerebrosídeo e do fosfatidilinositol de melhorar as meias-vidas dos lipossomas no sangue. Esses achados foram expostos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). Patente US No. 4.837.028 e WO 88/04924, ambos de Allen et al., descrevem lipossomas compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo GM1 ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. A Patente US No. 5.543.152 (Webb et al.) descreve lipossomas compreendendo esfingomielina. Lipossomas compreendendo 1,2- sn-dimiristoilfosfatidilcolina são descritos em WO 97/13499 (Lim et al).[00358] Various liposomes comprising one or more glycolipids are known in the art. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reported the ability of the monosialoganglioside GM1, galactocerebroside sulfate, and phosphatidylinositol to improve liposome half-lives in blood. These findings were expounded by Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). U.S. Patent No. 4,837,028 and WO 88/04924, both to Allen et al., describe liposomes comprising (1) sphingomyelin and (2) the ganglioside GM1 or a sulfate ester of galactocerebroside. U.S. Patent No. 5,543,152 (Webb et al.) describes liposomes comprising sphingomyelin. Liposomes comprising 1,2-sn-dimyristoylphosphatidylcholine are described in WO 97/13499 (Lim et al.).

[00359] Em algumas modalidades, são usados lipossomas catiônicos. Os lipossomas catiônicos possuem a vantagem de poder se fundir à membrana celular. Os lipossomas não catiônicos, embora não sejam capazes de se fundirem tão eficientemente com a membrana plasmática, são absorvidos pelos macrófagos in vivo e podem ser usados para dispensar agentes de iRNA aos macrófagos.[00359] In some embodiments, cationic liposomes are used. Cationic liposomes have the advantage of being able to fuse with the cell membrane. Non-cationic liposomes, although not able to fuse as efficiently with the plasma membrane, are taken up by macrophages in vivo and can be used to deliver iRNA agents to macrophages.

[00360] Outras vantagens dos lipossomas incluem: lipossomas obtidos a partir de fosfolipídios naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; lipossomas podem incorporar uma vasta gama de fármacos solúveis em água e lipídios; lipossomas podem proteger iRNAs encapsulados em seus compartimentos internos do metabolismo e degradação (Rosoff, in “Pharmaceutical Dosage Forms,” Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossomas são a carga da superfície lipídica, o tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.[00360] Other advantages of liposomes include: liposomes obtained from natural phospholipids are biocompatible and biodegradable; liposomes can incorporate a wide range of water- and lipid-soluble drugs; liposomes can protect iRNAs encapsulated in their internal compartments from metabolism and degradation (Rosoff, in “Pharmaceutical Dosage Forms,” Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Important considerations in the preparation of liposome formulations are the lipid surface charge, the vesicle size, and the aqueous volume of the liposomes.

[00361] Um lipídio catiônico sintético positivamente carregado, cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) pode ser usado para formar lipossomas pequenos que interagem espontaneamente com ácido nucleico para formar complexos de lipídio-ácido nucléico que são capazes de se fundir com os lipídios carregados negativamente das membranas celulares das células de cultura de tecidos, resultando na dispensação do agente de iRNA (ver, por exemplo, Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 e Patente US No. 4.897.355 para uma descrição de DOTMA e seu uso com DNA).[00361] A synthetic, positively charged cationic lipid, N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) can be used to form small liposomes that spontaneously interact with nucleic acid to form lipid-nucleic acid complexes that are capable of fusing with the negatively charged lipids of the cell membranes of tissue culture cells, resulting in the delivery of the iRNA agent (see, e.g., Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 and U.S. Patent No. 4,897,355 for a description of DOTMA and its use with DNA).

[00362] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3- (trimetilamônia)propano (DOTAP) pode ser usado em combinação com um fosfolipídio para formar vesículas que formam complexos de DNA. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) é um agente eficaz para a dispensação de ácidos nucleicos altamente aniônicos em células de cultura de tecidos vivos que compreendem lipossomas DOTMA carregados positivamente que interagem espontaneamente com polinucleotídeos carregados negativamente para formar complexos. Quando são usados lipossomas positivamente carregados suficientes, a carga líquida nos complexos resultantes também é positiva. Complexos carregados positivamente preparados desse modo ligam-se espontaneamente a superfícies celulares carregadas negativamente, fundem-se com a membrana plasmática e dispensam eficazmente ácidos nucleicos funcionais em, por exemplo, células de cultura de tecidos. Outro lipídio catiônico comercialmente disponível, 1,2- bis(oleoiloxi)-3,3- (trimetilamônia)propano (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana) difere do DOTMA pelo fato de os radicais oleoíla estarem ligados por éster, em vez de ligações de éter.[00362] A DOTMA analog, 1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propane (DOTAP), can be used in combination with a phospholipid to form vesicles that form DNA complexes. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) is an effective agent for delivering highly anionic nucleic acids into living tissue culture cells comprising positively charged DOTMA liposomes that spontaneously interact with negatively charged polynucleotides to form complexes. When sufficient positively charged liposomes are used, the net charge on the resulting complexes is also positive. Positively charged complexes prepared in this manner spontaneously bind to negatively charged cell surfaces, fuse with the plasma membrane, and effectively deliver functional nucleic acids into, for example, tissue culture cells. Another commercially available cationic lipid, 1,2-bis(oleoyloxy)-3,3-(trimethylammonium)propane (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), differs from DOTMA in that the oleoyl radicals are linked by ester rather than ether linkages.

[00363] Outros compostos lipídicos catiônicos descritos incluem aqueles que foram conjugados com uma variedade de radicais incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada com um de dois tipos de lipídios e inclui compostos tais como dioctaoleoilamida de 5- carboxiespermilglicina (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) e 5-carboxiespermil-amida de dipalmitoilfosfatidiletanolamina (“DPPES”) (ver, por exemplo, Patente US No. 5.171.678).[00363] Other cationic lipid compounds described include those that have been conjugated with a variety of moieties including, for example, carboxyspermine that has been conjugated with one of two types of lipids and includes compounds such as 5-carboxyspermylglycine dioctaoleoylamide (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) and dipalmitoylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermylamide (“DPPES”) (see, for example, U.S. Patent No. 5,171,678).

[00364] Outro conjugado lipídico catiônico inclui a derivatização do lipídio com colesterol (“DC-Chol”) que foi formulado em lipossomas em combinação com DOPE (Ver, Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Foi relatado que a lipopolilisina, feita pela conjugação de polilisina com DOPE, é eficaz para transfecção na presença de soro (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para certas linhagens celulares, diz-se que esses lipossomas contendo lipídios catiônicos conjugados apresentam menor toxicidade e proveem uma transfecção mais eficiente do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos lipídicos catiônicos comercialmente disponíveis incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, Califórnia) e Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Outros lipídios catiônicos adequados para a dispensação de oligonucleotídeos são descritos em WO 98/39359 e WO 96/37194.[00364] Another cationic lipid conjugate includes the derivatization of the lipid with cholesterol (“DC-Chol”) that has been formulated into liposomes in combination with DOPE (See, Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Lipopolylysine, made by conjugating polylysine with DOPE, has been reported to be effective for transfection in the presence of serum (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). For certain cell lines, these liposomes containing conjugated cationic lipids are said to exhibit lower toxicity and provide more efficient transfection than compositions containing DOTMA. Other commercially available cationic lipid products include DMRIE and DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) and Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Other cationic lipids suitable for oligonucleotide delivery are described in WO 98/39359 and WO 96/37194.

[00365] As formulações lipossômicas são particularmente adequadas para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzidos relacionados à alta absorção sistêmica do fármaco administrado, aumento do acúmulo do fármaco administrado no alvo desejado, e a capacidade de administrar o agente de iRNA na pele. Em algumas modalidades, os lipossomas são usados para a dispensação de agente de iRNA para células epidérmicas e também para intensificar a penetração do agente de iRNA em tecidos dérmicos, por exemplo, na pele. Por exemplo, os lipossomas podem ser aplicados topicamente. A dispensação tópica de fármacos formulados como lipossomas na pele foi documentada (ver, por exemplo, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).[00365] Liposomal formulations are particularly suitable for topical administration; liposomes have several advantages over other formulations. Such advantages include reduced side effects related to high systemic absorption of the administered drug, increased accumulation of the administered drug at the desired target, and the ability to deliver the iRNA agent to the skin. In some embodiments, liposomes are used for delivery of the iRNA agent to epidermal cells and also to enhance penetration of the iRNA agent into dermal tissues, e.g., the skin. For example, liposomes can be applied topically. Topical delivery of drugs formulated as liposomes to the skin has been documented (see, for example, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. 1987; 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Academic. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).

[00366] Sistemas lipossômicos não iônicos foram também examinados para determinar a sua utilidade na dispensação de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossômicas não iônicas compreendendo NovasomeTMI (dilaurato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e NovasomeTMII (diestearato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para dispensar um fármaco na derme da pele de camundongo. Tais formulações com agente de iRNA são úteis para o tratamento de um distúrbio dermatológico.[00366] Nonionic liposomal systems were also examined to determine their utility in delivering drugs to the skin, in particular systems comprising nonionic surfactant and cholesterol. Nonionic liposomal formulations comprising NovasomeTMI (glyceryl dilaurate/cholesterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) and NovasomeTMII (glyceryl distearate/cholesterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) were used to deliver a drug to the dermis of mouse skin. Such formulations with iRNA agent are useful for the treatment of a dermatological disorder.

[00367] Os lipossomas que incluem iRNA podem ser altamente deformáveis. Tal deformabilidade pode permitir que os lipossomas penetrem através dos poros que são menores que o raio médio do lipossoma. Por exemplo, os transferossomas são um tipo de lipossomas deformáveis. Os transferossomas podem ser feitos adicionando-se ativadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossômica padrão. Transferossomas que incluem iRNA podem ser dispensados, por exemplo, por via subcutânea, por infecção, de modo a dispensar iRNAs para queratinócitos na pele. Para atravessar a pele dos mamíferos intacta, as vesículas lipídicas devem passar através de uma série de poros finos, cada um com um diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Além disso, devido às propriedades lipídicas, estes transferossomas podem ser auto-otimizantes (adaptáveis ao formato dos poros, por exemplo, na pele), autorreparáveis, e podem frequentemente atingir os seus alvos sem se fragmentarem, e muitas vezes com autocarregamento.Liposomes that include iRNA can be highly deformable. Such deformability can allow liposomes to penetrate through pores that are smaller than the average radius of the liposome. For example, transferosomes are a type of deformable liposome. Transferosomes can be made by adding surface edge activators, usually surfactants, to a standard liposome composition. Transferosomes that include iRNA can be delivered, for example, subcutaneously, by infection, so as to deliver iRNAs to keratinocytes in the skin. To traverse intact mammalian skin, lipid vesicles must pass through a series of fine pores, each with a diameter of less than 50 nm, under the influence of an appropriate transdermal gradient. Furthermore, due to their lipid properties, these transferosomes can be self-optimizing (adaptable to the shape of pores, e.g., in skin), self-repairing, and can often reach their targets without fragmenting, and often self-loading.

[00368] Outras formulações receptivas à presente invenção são descritas em WO/2008/042973.[00368] Other formulations amenable to the present invention are described in WO/2008/042973.

[00369] Os transferossomas são ainda outro tipo de lipossomas, e são agregados lipídicos altamente deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de distribuição de fármacos. Os transferossomas podem ser descritos como gotículas lipídicas que são tão altamente deformáveis que são facilmente capazes de penetrar através de poros que são menores que a gotícula. Os transferossomas são adaptáveis ao ambiente em que são usados, por exemplo, são auto-otimizantes (adaptáveis ao formato dos poros da pele), autorreparáveis, frequentemente atingem seus alvos sem se fragmentarem e, muitas vezes, se autocarregam. Para fazer transferossomas, é possível adicionar ativadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossômica padrão. Os transferossomas são usados para dispensar albumina sérica à pele. A dispensação mediada por transferossomas de albumina sérica mostrou ser tão eficaz quanto a injeção subcutânea de uma solução contendo albumina sérica.Transferosomes are yet another type of liposome, and are highly deformable lipid aggregates that are attractive candidates for drug delivery vehicles. Transferosomes can be described as lipid droplets that are so highly deformable that they are easily able to penetrate through pores that are smaller than the droplet. Transferosomes are adaptable to the environment in which they are used, for example, they are self-optimizing (adaptable to the shape of skin pores), self-repairing, frequently reach their targets without fragmenting, and often self-loading. To make transferosomes, it is possible to add surface-edge activators, usually surfactants, to a standard liposomal composition. Transferosomes are used to deliver serum albumin to the skin. Transferosome-mediated delivery of serum albumin has been shown to be as effective as subcutaneous injection of a solution containing serum albumin.

[00370] Os tensoativos encontram ampla aplicação em formulações como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A maneira mais comum de classificar e ranquear as propriedades dos muitos tipos diferentes de tensoativos, tanto naturais como sintéticos, é pelo uso do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como “cabeça”) provê os meios mais úteis para categorizar os diferentes tensoativos usados nas formulações (Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).[00370] Surfactants find wide application in formulations such as emulsions (including microemulsions) and liposomes. The most common way to classify and rank the properties of the many different types of surfactants, both natural and synthetic, is by use of the hydrophilic/lipophilic balance (HLB). The nature of the hydrophilic group (also known as the “head”) provides the most useful means of categorizing the different surfactants used in formulations (Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

[00371] Se a molécula de tensoativo não estiver ionizada, ela é classificada como um tensoativo não iônico. Os tensoativos não iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são utilizáveis em uma ampla gama de valores de pH. Em geral, seus valores de HLB variam de 2 a aproximadamente 18, dependendo de sua estrutura. Os tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos tais como ésteres de etilenoglicol, ésteres de propilenoglicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose e ésteres etoxilados. Alcanolamidas e éteres não iônicos tais como etoxilatos de álcool graxo, álcoois propoxilados e polímeros de bloco etoxilados/propoxilados também estão incluídos nessa classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativos não iônicos.[00371] If the surfactant molecule is not ionized, it is classified as a nonionic surfactant. Nonionic surfactants find wide application in pharmaceuticals and cosmetics and are usable over a wide range of pH values. In general, their HLB values range from 2 to approximately 18, depending on their structure. Nonionic surfactants include nonionic esters such as ethylene glycol esters, propylene glycol esters, glyceryl esters, polyglyceryl esters, sorbitan esters, sucrose esters, and ethoxylated esters. Nonionic alkanolamides and ethers such as fatty alcohol ethoxylates, propoxylated alcohols, and ethoxylated/propoxylated block polymers are also included in this class. Polyoxyethylene surfactants are the most popular members of the nonionic surfactant class.

[00372] Se a molécula de tensoativo carrega uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Tensoativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sabões, acil lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tal como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tais como alquil benzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe do tensoativo aniônico são os alquil sulfatos e os sabões.[00372] If the surfactant molecule carries a negative charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as anionic. Anionic surfactants include carboxylates such as soaps, acyl lactylates, amino acid acyl amides, sulfuric acid esters such as alkyl sulfates and ethoxylated alkyl sulfates, sulfonates such as alkyl benzene sulfonates, acyl isethionates, acyl taurates, and sulfosuccinates, and phosphates. The most important members of the anionic surfactant class are the alkyl sulfates and soaps.

[00373] Se a molécula de tensoativo carrega uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Os tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternários e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usados dessa classe.[00373] If the surfactant molecule carries a positive charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as cationic. Cationic surfactants include quaternary ammonium salts and ethoxylated amines. Quaternary ammonium salts are the most commonly used members of this class.

[00374] Se a molécula de tensoativo tem a capacidade de carregar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Os tensoativos anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.[00374] If the surfactant molecule has the ability to carry a positive or negative charge, the surfactant is classified as amphoteric. Amphoteric surfactants include acrylic acid derivatives, substituted alkylamides, N-alkylbetaines, and phosphatides.

[00375] O uso de tensoativos em produtos farmacêuticos, formulações e em emulsões foi revisado (Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).[00375] The use of surfactants in pharmaceutical products, formulations and in emulsions has been reviewed (Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

[00376] O iRNA para uso nos métodos da invenção também pode ser provido como formulações micelares. “Micelas” são aqui definidas como um tipo particular de conjunto molecular em que as moléculas anfipáticas são arranjadas em uma estrutura esférica de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas são direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa circundante. O arranjo inverso existe se o ambiente é hidrofóbico.[00376] The iRNA for use in the methods of the invention may also be provided as micellar formulations. “Micelles” are defined herein as a particular type of molecular assembly in which the amphipathic molecules are arranged in a spherical structure such that all hydrophobic portions of the molecules are directed inward, leaving the hydrophilic portions in contact with the surrounding aqueous phase. The reverse arrangement exists if the environment is hydrophobic.

[00377] Uma formulação micelar mista adequada para dispensação através de membranas transdérmicas pode ser preparada misturando uma solução aquosa de iRNA, um metal alcalino C8 a C22 sulfato de alquila, e um composto formador de micelas. Compostos formadores de micelas exemplificativos incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido lático, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, mono-oleína, mono-oleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula, mentol, tri-hidroxi-oxo-colanil-glicina e sais farmaceuticamente aceitáveis da mesma, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e análogos dos mesmos, polidocanol alquil éteres e análogos dos mesmos, quenodesoxicolato, desoxicolato e misturas dos mesmos. Os compostos formadores de micelas podem ser adicionados ao mesmo tempo ou após a adição do alquil sulfato de metal alcalino. Micelas mistas se formarão substancialmente com qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas com mistura vigorosa, a fim de prover micelas de tamanho menor.[00377] A mixed micellar formulation suitable for delivery through transdermal membranes can be prepared by mixing an aqueous solution of iRNA, an alkali metal C8 to C22 alkyl sulfate, and a micelle-forming compound. Exemplary micelle-forming compounds include lecithin, hyaluronic acid, pharmaceutically acceptable salts of hyaluronic acid, glycolic acid, lactic acid, chamomile extract, cucumber extract, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, monoolein, monooleates, monolaurates, borage oil, evening primrose oil, menthol, trihydroxy-oxo-cholanyl-glycine and pharmaceutically acceptable salts thereof, glycerin, polyglycerin, lysine, polylysine, triolein, polyoxyethylene ethers and analogues thereof, polidocanol alkyl ethers and analogues thereof, chenodeoxycholate, deoxycholate, and mixtures thereof. The micelle-forming compounds may be added simultaneously with or after the addition of the alkali metal alkyl sulfate. Mixed micelles will form with substantially any mixture of ingredients, but vigorous mixing will provide smaller micelles.

[00378] Em um método, prepara-se uma primeira composição micelar que contém o RNAi e pelo menos o alquil sulfato de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos formadores de micelas para formar uma composição micelar mista. Em um outro método, a composição micelar é preparada misturando o RNAi, o alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um dos compostos formadores de micelas, seguido pela adição dos compostos formadores de micelas restantes, com mistura vigorosa.[00378] In one method, a first micellar composition is prepared that contains the RNAi and at least one alkali metal alkyl sulfate. The first micellar composition is then mixed with at least three micelle-forming compounds to form a mixed micellar composition. In another method, the micellar composition is prepared by mixing the RNAi, the alkali metal alkyl sulfate, and at least one of the micelle-forming compounds, followed by the addition of the remaining micelle-forming compounds, with vigorous mixing.

[00379] O fenol ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para estabilizar a formulação e proteger contra o crescimento bacteriano. Alternativamente, fenol ou m-cresol podem ser adicionados aos ingredientes formadores de micelas. Um agente isotônico, tal como glicerina, pode também ser adicionado após a formação da composição micelar mista.[00379] Phenol or m-cresol may be added to the mixed micellar composition to stabilize the formulation and protect against bacterial growth. Alternatively, phenol or m-cresol may be added to the micelle-forming ingredients. An isotonic agent, such as glycerin, may also be added after the mixed micellar composition is formed.

[00380] Para a dispensação da formulação micelar como um pulverizador, a formulação pode ser colocada em um dispensador de aerossol e o dispensador é carregado com um propulsor. O propulsor, que está sob pressão, está em forma líquida no dispensador. As razões dos ingredientes são ajustadas de modo a que as fases aquosa e propulsora se tornem uma, isto é, existe uma fase. Se houver duas fases, é necessário agitar o dispensador antes de dispensar uma porção do conteúdo, por exemplo, através de uma válvula dosada. A dose dispensada de agente farmacêutico é propelida a partir da válvula dosada em um jato fino.[00380] To dispense the micellar formulation as a spray, the formulation may be placed in an aerosol dispenser and the dispenser is loaded with a propellant. The propellant, which is under pressure, is in liquid form in the dispenser. The ingredient ratios are adjusted so that the aqueous and propellant phases become one, i.e., there is one phase. If there are two phases, it is necessary to shake the dispenser before dispensing a portion of the contents, for example, through a metered valve. The dispensed dose of pharmaceutical agent is propelled from the metered valve in a fine stream.

[00381] Os propulsores podem incluir clorofluorocarbonetos contendo hidrogênio, fluorocarbonetos contendo hidrogênio, dimetil éter e dietil éter. Em certas modalidades, pode ser usado HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano).[00381] Propellants may include hydrogen-containing chlorofluorocarbons, hydrogen-containing fluorocarbons, dimethyl ether, and diethyl ether. In certain embodiments, HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroethane) may be used.

[00382] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas por experimentação relativamente simples. Para absorção através das cavidades orais, é frequentemente desejável aumentar, por exemplo, pelo menos o dobro ou o triplo, a dosagem através de injeção ou administração através do trato gastrointestinal. Partículas lipídicas[00382] The specific concentrations of the essential ingredients can be determined by relatively simple experimentation. For absorption through the oral cavities, it is often desirable to increase, e.g., by at least doubling or tripling, the dosage by injection or administration through the gastrointestinal tract. Lipid particles

[00383] Os iRNAs, por exemplo, os agentes de dsRNAi da invenção podem ser totalmente encapsulados em uma formulação lipídica, por exemplo, uma LNP, ou outra partícula de ácido nucleico-lipídio.[00383] The iRNAs, e.g., the dsRNAi agents of the invention may be fully encapsulated in a lipid formulation, e.g., an LNP, or other nucleic acid-lipid particle.

[00384] Como aqui usado, o termo “LNP” refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lipídio estável. As LNPs contêm tipicamente um lipídio catiônico, um lipídio não catiônico e um lipídio que impede a agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídio). As LNPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, uma vez que apresentam tempos de vida de circulação prolongados após injeção intravenosa (i.v.) e acumulam-se em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados do sítio de administração). As LNPs incluem “pSPLP”, que inclui um complexo de agente de condensação-ácido nucleico encapsulado como estabelecido na publicação PCT No. WO 00/03683. As partículas da presente invenção tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, mais tipicamente de cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Além disso, os ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas lipídicas de ácido nucleico da presente invenção, são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. As partículas lipídicas de ácido nucleico e o seu método de preparação são descritos em, por exemplo, Patentes US Nos. 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; Publicação US No. 2010/0324120 e Publicação PCT No. WO 96/40964.[00384] As used herein, the term “LNP” refers to a stable nucleic acid-lipid particle. LNPs typically contain a cationic lipid, a non-cationic lipid, and a lipid that prevents particle aggregation (e.g., a PEG-lipid conjugate). LNPs are extremely useful for systemic applications, as they exhibit prolonged circulation lifetimes after intravenous (i.v.) injection and accumulate at distal sites (e.g., sites physically separated from the site of administration). LNPs include “pSPLP,” which includes an encapsulated nucleic acid-condensing agent complex as set forth in PCT Publication No. WO 00/03683. The particles of the present invention typically have an average diameter of about 50 nm to about 150 nm, more typically about 60 nm to about 130 nm, more typically about 70 nm to about 110 nm, most typically about 70 nm to about 90 nm, and are substantially non-toxic. Furthermore, the nucleic acids, when present in the nucleic acid lipid particles of the present invention, are resistant in aqueous solution to degradation with a nuclease. The nucleic acid lipid particles and their method of preparation are described in, for example, U.S. Patent Nos. 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; U.S. Publication No. 2010/0324120 and PCT Publication No. WO 96/40964.

[00385] Em uma modalidade, a razão de lipídio para fármaco (razão de massa/massa) (por exemplo, razão de lipídios para dsRNA) estará na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 50:1, de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1, ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. Faixas intermediárias para as faixas citadas acima são também contempladas como parte da invenção.[00385] In one embodiment, the lipid to drug ratio (mass/mass ratio) (e.g., lipid to dsRNA ratio) will be in the range of from about 1:1 to about 50:1, from about 1:1 to about 25:1, from about 3:1 to about 15:1, from about 4:1 to about 10:1, from about 5:1 to about 9:1, or about 6:1 to about 9:1. Ranges intermediate to the above ranges are also contemplated as part of the invention.

[00386] O lipídio catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N,N-diestearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1 -(2,3- dioleoiloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(1 -(2,3- dioleiloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3- dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-DiLinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2- Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2- Dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleioxi- 3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1- Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de 1,2-Dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto de 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2- Dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), ou 3-(N,N- Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2- propanodiol (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou análogos dos mesmos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca- 9,12-dienil)tetra-hidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1- il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1), ou uma mistura dos mesmos. O lipídio catiônico pode compreender de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol ou cerca de 40% em mol do lipídio total presente na partícula.[00386] The cationic lipid can be, for example, N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide (DDAB), N-(1-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N-(1 -(2,3- dioleyloxy)propyl)-N,N,N- trimethylammonium (DOTMA), N,N-dimethyl-2,3- dioleyloxy)propylamine (DODMA), 1,2-DiLinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 1,2- Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLenDMA), 1,2- Dilinoleylcarbamoyloxy-3-dimethylaminopropane (DLin-C-DAP) Linoleoyl-2-linoleyloxy-3-dimethylaminopropane (DLin-2-DMAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt (DLin-TMA.Cl), 1,2-Dilinoleoyl-3-trimethylaminopropane chloride salt (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleyloxy-3-(N-methylpiperazino)propane (DLin-MPZ), or 3-(N,N- Dilinoleylamino)-1,2-propanediol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleylamino)-1,2-propanediol (DOAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-(2-N,N-dimethylamino)ethoxypropane (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane (DLin-K-DMA) or analogues thereof, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimethyl-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca- 9,12-dienyl)tetrahydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-5-amine (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)piperazin-1-yl)ethylazanediyl)didodecan-2-ol (Tech G1), or a mixture thereof. The cationic lipid can comprise from about 20 mole % to about 50 mole % or about 40 mole % of the total lipid present in the particle.

[00387] Em algumas modalidades, o composto 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano pode ser usado para preparar nanopartículas de siRNA de lipídio.[00387] In some embodiments, the compound 2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane can be used to prepare lipid siRNA nanoparticles.

[00388] Em algumas modalidades, a partícula de siRNA de lipídio inclui 40% de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10% de DSPC: 40% de Colesterol: 10% de PEG-C-DOMG (percentagem molar) com um tamanho de partula de 63,0 ± 20 nm e uma razão de siRNA/Lipídio de 0,027.[00388] In some embodiments, the lipid siRNA particle includes 40% 2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane: 10% DSPC: 40% Cholesterol: 10% PEG-C-DOMG (molar percentage) with a particle size of 63.0 ± 20 nm and a siRNA/Lipid ratio of 0.027.

[00389] O lipídio ionizável/não catiônico pode ser um lipídio aniônico ou um lipídio neutro incluindo, mas não se limitando a diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil- fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano- 1- carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1 -estearoil-2- oleoil- fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol, ou uma mistura dos mesmos. O lipídio não catiônico pode compreender de cerca de 5% em mol a cerca de 90% em mol, cerca de 10% em mol ou cerca de 58% em mol, se colesterol for incluído, do lipídio total presente na partícula.[00389] The ionizable/non-cationic lipid may be an anionic lipid or a neutral lipid including, but not limited to, distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine (POPE), dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (DOPE-mal), dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE), dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE), 16-O-monomethyl PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1-trans PE, 1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine (SOPE), cholesterol, or a mixture thereof. The non-cationic lipid may comprise from about 5 mole % to about 90 mole %, about 10 mole %, or about 58 mole % if cholesterol is included, of the total lipid present in the particle.

[00390] O lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um polietilenoglicol (PEG)-lipídio incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquiloxipropila (DAA), um PEG- fosfolipídio, um PEG-ceramida (Cer) ou uma mistura dos mesmos. O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, uma PEG-dilauriloxipropila (Ci2), uma PEG-dimiristiloxipropila (Ci4), a PEG-dipalmitiloxipropila (Ci6), ou uma PEG- diesteariloxipropila (C]8). O lipídio conjugado que impede a agregação de partículas pode ser de 0% em mol a cerca de 20% em mol ou cerca de 2% em mol do lipídio total presente na partícula.[00390] The conjugated lipid that inhibits particle aggregation can be, for example, a polyethylene glycol (PEG)-lipid including, without limitation, a PEG-diacylglycerol (DAG), a PEG-dialkyloxypropyl (DAA), a PEG-phospholipid, a PEG-ceramide (Cer), or a mixture thereof. The PEG-DAA conjugate can be, for example, a PEG-dilauryloxypropyl (C12), a PEG-dimyristyloxypropyl (C14), a PEG-dipalmytyloxypropyl (C16), or a PEG-distearyloxypropyl (C18). The conjugated lipid that prevents particle aggregation can be from 0 mole % to about 20 mole % or about 2 mole % of the total lipid present in the particle.

[00391] Em algumas modalidades, a partícula de ácido nucleico-lipídio inclui adicionalmente colesterol a, por exemplo, cerca de 10% em mol a cerca de 60% em mol ou cerca de 48% em mol do lipídio total presente na partícula.[00391] In some embodiments, the nucleic acid-lipid particle further includes cholesterol at, for example, about 10 mole % to about 60 mole %, or about 48 mole % of the total lipid present in the particle.

[00392] Em uma modalidade, o lipidoide ND984HC1 (MW 1487) (ver US20090023673, que é aqui incorporado por referência), colesterol (Sigma- Aldrich), e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) pode ser usado para preparar nanopartículas de lipídio-dsRNA (isto é, partículas de LNP01). Soluções-padrão de cada um em etanol podem ser preparadas da seguinte maneira: ND98, 133 mg/ml; Colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramida C16, 100 mg/ml. As soluções-padrão ND98, colesterol, e PEG-Ceramida C16 podem então ser combinadas em uma razão molar, por exemplo, de 42:48:10. A solução lipídica combinada pode ser misturada com dsRNA aquoso (por exemplo, em acetato de sódio, pH 5), de tal modo que a concentração final de etanol é de cerca de 35 a 45% e a concentração final de acetato de sódio é de cerca de 100 a 300 mM. As nanopartículas de dsRNA-lipídio tipicamente se formam espontaneamente após a mistura. Dependendo da distribuição do tamanho de partícula desejado, a mistura de nanopartículas resultante pode ser extrusada através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, 100 nm de corte), usando, por exemplo, uma extrusora Thermobarrel, tal como extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, a etapa de extrusão pode ser omitida. A remoção de etanol e a troca simultânea de tampão podem ser realizadas, por exemplo, por diálise ou filtração de fluxo tangencial. Tampão pode ser trocado com, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, ou cerca de pH 7,4. [00392] In one embodiment, the lipidoid ND984HC1 (MW 1487) (see US20090023673, which is incorporated herein by reference), cholesterol (Sigma-Aldrich), and PEG-Ceramide C16 (Avanti Polar Lipids) can be used to prepare lipid-dsRNA nanoparticles (i.e., LNP01 particles). Stock solutions of each in ethanol can be prepared as follows: ND98, 133 mg/ml; Cholesterol, 25 mg/ml; PEG-Ceramide C16, 100 mg/ml. The ND98, cholesterol, and PEG-Ceramide C16 stock solutions can then be combined in a molar ratio, e.g., of 42:48:10. The combined lipid solution can be mixed with aqueous dsRNA (e.g., in sodium acetate, pH 5) such that the final ethanol concentration is approximately 35–45% and the final sodium acetate concentration is approximately 100–300 mM. dsRNA-lipid nanoparticles typically form spontaneously upon mixing. Depending on the desired particle size distribution, the resulting nanoparticle mixture can be extruded through a polycarbonate membrane (e.g., 100 nm cutoff) using, for example, a thermobarrel extruder, such as a Lipex extruder (Northern Lipids, Inc.). In some cases, the extrusion step can be omitted. Ethanol removal and simultaneous buffer exchange can be accomplished, for example, by dialysis or tangential flow filtration. Buffer may be exchanged with, for example, phosphate buffered saline (PBS) at about pH 7, e.g., about pH 6.9, about pH 7.0, about pH 7.1, about pH 7.2, about pH 7.3, or about pH 7.4.

[00393] As composições compreendendo LNP01 são descritas, por exemplo, na Publicação do Pedido Internacional No. WO 2008/042973, que é aqui incorporado por referência.[00393] Compositions comprising LNP01 are described, for example, in International Application Publication No. WO 2008/042973, which is incorporated herein by reference.

[00394] Formulações de dsRNA-lipídio exemplificativas adicionais são descritas na Tabela 1. Tabela 1. Formulações lipídicas exemplificativas DSPC: diestearoilfosfatidilcolina DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG, ou PEG-C14) (PEG com peso mol. médio de 2000) PEG-DSG: PEG-diestiril glicerol (C18-PEG, ou PEG-C18) (PEG com peso mol. médio de 2000) PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG com peso mol. médio de 2000)[00394] Additional exemplary dsRNA-lipid formulations are described in Table 1. Table 1. Exemplary Lipid Formulations DSPC: distearoylphosphatidylcholine DPPC: dipalmitoylphosphatidylcholine PEG-DMG: PEG-didimyristoyl glycerol (C14-PEG, or PEG-C14) (PEG with an average mol. wt. of 2000) PEG-DSG: PEG-distyryl glycerol (C18-PEG, or PEG-C18) (PEG with an average mol. wt. of 2000) PEG-cDMA: PEG-carbamoyl-1,2-dimyristyloxypropylamine (PEG with an average mol. wt. of 2000)

[00395] As composições compreendendo SNALP (l,2-Dilinoleniloxi- N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) são descritas, por exemplo, na Publicação Internacional No. WO 2009/127060, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência.[00395] Compositions comprising SNALP (1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA)) are described, for example, in International Publication No. WO 2009/127060, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00396] As composições compreendendo XTC são descritas, por exemplo, na Publicação PCT No. WO 2010/088537, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência.[00396] Compositions comprising XTC are described, for example, in PCT Publication No. WO 2010/088537, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00397] As composições compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente US No. 2010/0324120, depositada em 10 de junho de 2010, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência.[00397] Compositions comprising MC3 are described, for example, in U.S. Patent Publication No. 2010/0324120, filed June 10, 2010, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00398] As composições compreendendo ALNY-100 são descritas, por exemplo, na Publicação PCT No. WO 2010/054406, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência.[00398] Compositions comprising ALNY-100 are described, for example, in PCT Publication No. WO 2010/054406, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00399] As composições compreendendo C12-200 são descritas, por exemplo, na Publicação PCT No. WO 2010/129709, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência.[00399] Compositions comprising C12-200 are described, for example, in PCT Publication No. WO 2010/129709, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.

i. Síntese de lipídios ionizáveis/catiônicosi. Synthesis of ionizable/cationic lipids

[00400] Qualquer dos compostos, por exemplo, lipídios catiônicos e semelhantes, usados nas partículas de ácido nucleico-lipídio da invenção, podem ser preparados por técnicas de síntese orgânica conhecidas.[00400] Any of the compounds, e.g., cationic lipids and the like, used in the nucleic acid-lipid particles of the invention may be prepared by known organic synthesis techniques.

[00401] As formulações preparadas pelo método padrão ou sem extrusão podem ser caracterizadas de maneira semelhante. Por exemplo, as formulações são tipicamente caracterizadas por inspeção visual. Devem ser soluções translúcidas esbranquiçadas, livres de agregados ou sedimentos. O tamanho de partícula e distribuição de tamanho de partícula de nanopartículas lipídicas pode ser medida por dispersão de luz usando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). As partículas devem ter cerca de 20 a 300 nm, tal como 40 a 100 nm de tamanho. A distribuição do tamanho de partícula deve ser unimodal. A concentração total de dsRNA na formulação, bem como a fração captada, é estimada usando um ensaio de exclusão de corante. Uma amostra do dsRNA formulado pode ser incubada com um corante de ligação ao RNA, tal como Ribogreen (Molecular Probes) na presença ou ausência de um tensoativo de ruptura da formulação, por exemplo, Triton-X100 a 0,5%. O dsRNA total na formulação pode ser determinado pelo sinal da amostra contendo o tensoativo, relativo a uma curva padrão. A fração captada é determinada pela subtração do conteúdo de dsRNA “livre” (conforme medido pelo sinal na ausência de tensoativo) do conteúdo total de dsRNA. O dsRNA captado em porcentagem é tipicamente >85%. Para a formulação de SNALP, o tamanho de partícula é de pelo menos 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm ou 120 nm. A faixa adequada é tipicamente 50 nm a 110 nm, 60 nm a 100 nm, ou 80 nm a 90 nm.[00401] Formulations prepared by the standard or non-extrusion method can be characterized in a similar manner. For example, formulations are typically characterized by visual inspection. They should be off-white, translucent solutions, free of aggregates or sediment. The particle size and particle size distribution of lipid nanoparticles can be measured by light scattering using, for example, a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Particles should be approximately 20 to 300 nm, such as 40 to 100 nm in size. The particle size distribution should be unimodal. The total concentration of dsRNA in the formulation, as well as the fraction captured, is estimated using a dye exclusion assay. A sample of the formulated dsRNA can be incubated with an RNA-binding dye, such as Ribogreen (Molecular Probes), in the presence or absence of a formulation-disrupting surfactant, e.g., 0.5% Triton-X100. The total dsRNA in the formulation can be determined by the signal of the sample containing the surfactant, relative to a standard curve. The fraction captured is determined by subtracting the “free” dsRNA content (as measured by the signal in the absence of surfactant) from the total dsRNA content. The percentage of captured dsRNA is typically >85%. For the SNALP formulation, the particle size is at least 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, or 120 nm. The suitable range is typically 50 nm to 110 nm, 60 nm to 100 nm, or 80 nm to 90 nm.

[00402] As composições e as formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, micropartículas, nanopartículas, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. Em algumas modalidades, as formulações orais são aquelas em que os dsRNA apresentados na invenção são administrados em conjunto com um ou mais tensoativos e quelantes de intensificação de penetração. Tensoativos adequados incluem ácidos graxos ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos biliares ou sais dos mesmos. Os ácidos/sais biliares adequados incluem o ácido quenodesoxicólico (CDCA) e o ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-di-hidrofusidato de sódio e glicodi- hidrofusidato de sódio. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades, as combinações de intensificadores de penetração são usadas, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação exemplificativa é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros intensificadores de penetração incluem polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. DsRNAs existentes na invenção podem ser dispensados por via oral, em forma granular incluindo partículas secas por pulverização, ou complexados para formar micro ou nanopartículas. Agentes complexantes de DsRNA incluem poli-aminoácidos; poli-iminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poli-iminas, polulanas, celuloses e amidos derivatizados de DEAE. Agentes complexantes adequados incluem quitosana, N-trimetilquitosana, poli-L- lisina, poli-histidina, poliornitina, poliespermina, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p- amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato) poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(iso- hexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE- acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrano, polimetilacrilato, poli- hexilacrilato, poli(ácido D,L-lático) poli(ácido DL-lático-co-glicólico (PLGA), alginato e polietilenoglicol (PEG). As formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhe na patente US 6.887.906, Publ. US No. 20030027780, e Patente US No. 6.747.014, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.[00402] Compositions and formulations for oral administration include powders or granules, microparticles, nanoparticles, suspensions or solutions in water or non-aqueous media, capsules, gelcaps, sachets, tablets or minitablets. Thickeners, flavoring agents, diluents, emulsifiers, dispersion aids or binders may be desirable. In some embodiments, oral formulations are those in which the dsRNAs presented in the invention are administered together with one or more penetration-enhancing surfactants and chelators. Suitable surfactants include fatty acids or esters or salts thereof, bile acids or salts thereof. Suitable bile acids/salts include chenodeoxycholic acid (CDCA) and ursodeoxychenodeoxycholic acid (UDCA), cholic acid, dehydrocholic acid, deoxycholic acid, glucolic acid, glycolic acid, glycodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, sodium tauro-24,25-dihydrofusidate, and sodium glycodihydrofusidate. Suitable fatty acids include arachidonic acid, undecanoic acid, oleic acid, lauric acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dicaprate, tricaprate, monoolein, dilaurin, glyceryl 1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, an acylcarnitine, an acylcholine, or a monoglyceride, a diglyceride, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (e.g., sodium). In some embodiments, combinations of penetration enhancers are used, for example, fatty acids/salts in combination with bile acids/salts. An exemplary combination is the sodium salt of lauric acid, capric acid, and UDCA. Other penetration enhancers include polyoxyethylene-9-lauryl ether, polyoxyethylene-20-cetyl ether. The dsRNAs in the invention can be delivered orally, in granular form including spray-dried particles, or complexed to form micro- or nanoparticles. DsRNA complexing agents include polyamino acids; polyimines; polyacrylates; polyalkylacrylates, polyoxetanes, polyalkylcyanoacrylates; cationized gelatins, albumins, starches, acrylates, polyethylene glycols (PEG), and starches; polyalkylcyanoacrylates; polyimines, polyulanes, celluloses, and DEAE-derivatized starches. Suitable complexing agents include chitosan, N-trimethylchitosan, poly-L-lysine, polyhistidine, polyornithine, polyspermine, protamine, polyvinylpyridine, polythiodiethylaminomethylethylene P (TDAE), polyaminostyrene (e.g., p-amino), poly(methylcyanoacrylate), poly(ethylcyanoacrylate), poly(butylcyanoacrylate), poly(isobutylcyanoacrylate), poly(isohexylcyanoacrylate), DEAE-methacrylate, DEAE-hexylacrylate, DEAE-acrylamide, DEAE-albumin, and DEAE-dextran, polymethylacrylate, polyhexylacrylate, poly(D,L-lactic acid), poly(DL-lactic-co-glycolic acid (PLGA), alginate, and polyethylene glycol (PEG). Oral formulations for dsRNAs and their preparation are described in detail in U.S. Pat. No. 6,887,906, U.S. Publ. No. 20030027780, and U.S. Patent No. 6,747,014, each of which is incorporated herein by reference.

[00403] As composições e as formulações para administração parenteral, intraparenquimal (no cérebro), intratecal, intraventricular, ou administração intra-hepática podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não limitados a intensificadores de penetração, compostos carreadores e outros carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.[00403] Compositions and formulations for parenteral, intraparenchymal (into the brain), intrathecal, intraventricular, or intrahepatic administration may include sterile aqueous solutions that may also contain buffers, diluents, and other suitable additives such as, but not limited to, penetration enhancers, carrier compounds, and other pharmaceutically acceptable carriers or excipients.

[00404] As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não se limitam a soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Essas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoemulsionantes e semissólidos autoemulsionantes. As formulações incluem aquelas que alvejam o fígado quando tratam de distúrbios hepáticos, como o carcinoma hepático.[00404] The pharmaceutical compositions of the present invention include, but are not limited to, solutions, emulsions, and liposome-containing formulations. These compositions can be generated from a variety of components that include, but are not limited to, preformed liquids, self-emulsifying solids, and self-emulsifying semi-solids. The formulations include those that target the liver when treating liver disorders, such as hepatic carcinoma.

[00405] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação os ingredientes ativos com carreador(es) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando uniformemente e intimamente em associação os ingredientes ativos com carreadores líquidos ou carreadores sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, conformando o produto.[00405] The pharmaceutical formulations of the present invention, which may conveniently be presented in unit dosage form, may be prepared according to conventional techniques well known in the pharmaceutical industry. Such techniques include the step of bringing into association the active ingredients with pharmaceutical carrier(s) or excipient(s). In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active ingredients with liquid carriers or finely divided solid carriers or both, and then, if necessary, shaping the product.

[00406] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis tais como, mas não limitadas a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis macios, supositórios e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizantes.[00406] The compositions of the present invention may be formulated in any of many possible dosage forms such as, but not limited to, tablets, capsules, gelcaps, liquid syrups, soft gels, suppositories, and enemas. The compositions of the present invention may also be formulated as suspensions in aqueous, non-aqueous, or mixed media. Aqueous suspensions may further contain substances that increase the viscosity of the suspension, including, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. The suspension may also contain stabilizers.

C. Formulações adicionaisC. Additional formulations i. Emulsõesi. Emulsions

[00407] Os iRNAs da presente invenção podem ser preparados e formulados como emulsões. Emulsões são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido disperso em outro na forma de gotículas geralmente excedendo 0,1 μm de diâmetro (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, as emulsões podem ser da variedade água-em- óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a). Quando uma fase aquosa é finamente dividida e dispersa como gotículas minúsculas em uma fase oleosa volumosa, a composição resultante é chamada de emulsão água-em-óleo (a/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é finamente dividida e dispersa como gotículas minúsculas em uma fase aquosa volumosa, a composição resultante é chamada de emulsão óleo-em-água (o/a). As emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas, e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução na fase aquosa, fase oleosa ou o propriamente dito como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos, tais como emulsificantes, estabilizantes, corantes e antioxidantes, podem também estar presentes em emulsões, conforme necessário. Emulsões farmacêuticas também podem ser emulsões múltiplas que são compostas de mais de duas fases, como, por exemplo, no caso de emulsões óleo-em-água-em-óleo (o/a/o) e água-em-óleo-em-água (a/o/a). Tais formulações complexas frequentemente proveem certas vantagens que emulsões binárias simples não proveem. Múltiplas emulsões em que gotículas de óleo individuais de uma emulsão o/a englobam pequenas gotículas de água constituem uma emulsão a/o/a. Da mesma forma, um sistema de gotículas de óleo contidas em glóbulos de água estabilizados em uma fase contínua oleosa provê uma emulsão o/a/o.[00407] The iRNAs of the present invention can be prepared and formulated as emulsions. Emulsions are typically heterogeneous systems of one liquid dispersed in another in the form of droplets generally exceeding 0.1 μm in diameter (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, N.Y.; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Emulsions are often two-phase systems comprising two immiscible liquid phases intimately mixed and dispersed in each other. In general, emulsions are of the water-in-oil (w/o) or oil-in-water (o/w) variety. When an aqueous phase is finely divided and dispersed as tiny droplets in a bulk oil phase, the resulting composition is called a water-in-oil (w/o) emulsion. Alternatively, when an oil phase is finely divided and dispersed as tiny droplets in a bulk aqueous phase, the resulting composition is called an oil-in-water (o/w) emulsion. Emulsions may contain additional components beyond the dispersed phases, and the active drug may be present as a solution in the aqueous phase, the oil phase, or as a separate phase. Pharmaceutical excipients, such as emulsifiers, stabilizers, colorants, and antioxidants, may also be present in emulsions as needed. Pharmaceutical emulsions can also be multiple emulsions composed of more than two phases, such as oil-in-water-in-oil (o/w/o) and water-in-oil-in-water (w/o/w) emulsions. Such complex formulations often provide certain advantages that simple binary emulsions do not. Multiple emulsions in which individual oil droplets of an o/w emulsion enclose small water droplets constitute a w/o/w emulsion. Similarly, a system of oil droplets contained in water globules stabilized in a continuous oil phase provides an o/w/o emulsion.

[00408] Emulsões são caracterizadas por pouca ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Frequentemente, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nessa forma através dos meios de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases e cremes de pomadas à base de emulsões. Outros meios de estabilização de emulsões implicam o uso de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer fase da emulsão. Emulsificantes podem ser amplamente classificados em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes de ocorrência natural, bases de absorção e sólidos finamente dispersos (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).[00408] Emulsions are characterized by little or no thermodynamic stability. Often, the dispersed or discontinuous phase of the emulsion is well dispersed in the external or continuous phase and maintained in that form by means of emulsifiers or the viscosity of the formulation. Any of the phases of the emulsion may be a semi-solid or a solid, as is the case with emulsion-based ointment bases and creams. Other means of stabilizing emulsions involve the use of emulsifiers that may be incorporated into any phase of the emulsion. Emulsifiers can be broadly classified into four categories: synthetic surfactants, naturally occurring emulsifiers, absorption bases, and finely dispersed solids (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

[00409] Tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes de superfície ativa, têm ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revisados na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Os tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e hidrofóbica. A razão da natureza hidrofílica para a hidrofóbica do tensoativo foi denominada equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa na categorização e seleção de tensoativos na preparação de formulações. Os tensoativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).[00409] Synthetic surfactants, also known as surface-active agents, have wide applicability in emulsion formulation and have been reviewed in the literature (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Surfactants are typically amphiphilic and comprise a hydrophilic and hydrophobic portion. The ratio of the hydrophilic to hydrophobic nature of the surfactant has been termed the hydrophilic/lipophilic balance (HLB) and is a valuable tool in categorizing and selecting surfactants in the preparation of formulations. Surfactants can be classified into different classes based on the nature of the hydrophilic group: nonionic, anionic, cationic, and amphoteric (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).

[00410] Emulsificantes de ocorrência natural usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, lecitina e acácia. As bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas tais que podem absorver água para formar emulsões a/o, mas ainda assim reter suas consistências semissólidas, tais como lanolina anidra e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos também têm sido usados como bons emulsificantes especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansíveis tais como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares tais como triestearato de carbono ou glicerila.[00410] Naturally occurring emulsifiers used in emulsion formulations include lanolin, beeswax, phosphatides, lecithin, and acacia. Absorption bases have hydrophilic properties such that they can absorb water to form w/o emulsions but still retain their semi-solid consistencies, such as anhydrous lanolin and hydrophilic petrolatum. Finely divided solids have also been used as good emulsifiers, especially in combination with surfactants and in viscous preparations. These include polar inorganic solids such as heavy metal hydroxides, non-swelling clays such as bentonite, attapulgite, hectorite, kaolin, montmorillonite, colloidal aluminum silicate, and colloidal magnesium aluminum silicate, pigments, and non-polar solids such as carbon or glyceryl tristearate.

[00411] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes também está incluída em formulações de emulsão e contribui para as propriedades das emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).[00411] A wide variety of non-emulsifying materials are also included in emulsion formulations and contribute to the properties of emulsions. These include fats, oils, waxes, fatty acids, fatty alcohols, fatty esters, humectants, hydrophilic colloids, preservatives, and antioxidants (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

[00412] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas de ocorrência natural e polímeros sintéticos, como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenina, goma de guar, goma karaya e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose) e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivinila). Estes dispersam-se ou expandem em água para formar soluções coloidais que estabilizam as emulsões formando fortes filmes interfaciais em torno das gotículas da fase dispersa e aumentando a viscosidade da fase externa.[00412] Hydrophilic colloids or hydrocolloids include naturally occurring gums and synthetic polymers such as polysaccharides (e.g., acacia, agar, alginic acid, carrageenan, guar gum, karaya gum, and tragacanth), cellulose derivatives (e.g., carboxymethyl cellulose and carboxypropyl cellulose), and synthetic polymers (e.g., carbomers, cellulose ethers, and carboxyvinyl polymers). These disperse or swell in water to form colloidal solutions that stabilize emulsions by forming strong interfacial films around the dispersed phase droplets and increasing the viscosity of the external phase.

[00413] Uma vez que as emulsões geralmente contêm vários ingredientes, como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos, que podem prontamente apoiar o crescimento de micróbios, essas formulações incorporam frequentemente conservantes. Os conservantes comumente usados incluídos nas formulações de emulsão incluem metilparabeno, propilparabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico e ácido bórico. Antioxidantes também são comumente adicionados a formulações de emulsões para evitar a deterioração da formulação. Os antioxidantes usados podem ser sequestrantes de radicais livres tais como tocoferóis, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e sinergistas antioxidantes tais como ácido cítrico, ácido tartárico e lecitina.[00413] Because emulsions often contain various ingredients, such as carbohydrates, proteins, sterols, and phosphatides, which can readily support the growth of microbes, these formulations often incorporate preservatives. Commonly used preservatives included in emulsion formulations include methylparaben, propylparaben, quaternary ammonium salts, benzalkonium chloride, p-hydroxybenzoic acid esters, and boric acid. Antioxidants are also commonly added to emulsion formulations to prevent formulation deterioration. Antioxidants used may include free radical scavengers such as tocopherols, alkyl gallates, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, or reducing agents such as ascorbic acid and sodium metabisulfite, and antioxidant synergists such as citric acid, tartaric acid, and lecithin.

[00414] A aplicação de formulações de emulsões através de vias dermatológicas, orais e parenterais e métodos para sua fabricação foram revisados na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Formulações de emulsão para dispensação oral têm sido amplamente usadas por causa da facilidade de formulação, bem como eficácia do ponto de vista da absorção e biodisponibilidade (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Os laxantes à base de óleo mineral, as vitaminas solúveis em óleo e as preparações nutritivas com alto teor de gordura estão entre os materiais comumente administrados oralmente como emulsões o/a.[00414] The application of emulsion formulations via dermatologic, oral, and parenteral routes and methods for their manufacture have been reviewed in the literature (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Emulsion formulations for oral delivery have been widely used because of their ease of formulation as well as their effectiveness from the standpoint of absorption and bioavailability (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Mineral oil-based laxatives, oil-soluble vitamins, and high-fat nutritional preparations are among the materials commonly administered orally as o/w emulsions.

ii. Microemulsõesii. Microemulsions

[00415] Em uma modalidade da presente invenção, os iRNAs são formulados como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifílico, que é uma solução líquida opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Tipicamente microemulsões são sistemas que são preparados dispersando primeiro um óleo em uma solução aquosa de tensoativo e depois adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool de comprimento intermediário de cadeia para formar um sistema transparente. Portanto, microemulsões também foram descritas como dispersões termodinamicamente estáveis e isotropicamente claras de dois líquidos imiscíveis que são estabilizados por filmes interfaciais de moléculas de superfície ativa (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Microemulsões comumente são preparadas através de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água- em-óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a) depende das propriedades do óleo e do tensoativo usados e da estrutura e do acondicionamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidrocarbonetos das moléculas de tensoativo (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).[00415] In one embodiment of the present invention, the iRNAs are formulated as microemulsions. A microemulsion can be defined as a water, oil, and amphiphile system that is an optically isotropic and thermodynamically stable liquid solution (see, e.g., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV, Popovich NG, and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Typically microemulsions are systems that are prepared by first dispersing an oil in an aqueous surfactant solution and then adding a sufficient amount of a fourth component, usually an alcohol of intermediate chain length, to form a clear system. Therefore, microemulsions have also been described as thermodynamically stable and isotropically clear dispersions of two immiscible liquids that are stabilized by interfacial films of surface-active molecules (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185–215). Microemulsions are commonly prepared by combining three to five components that include oil, water, surfactant, co-surfactant, and electrolyte. Whether the microemulsion is water-in-oil (w/o) or oil-in-water (o/w) depends on the properties of the oil and surfactant used and the structure and geometric packing of the polar heads and hydrocarbon tails of the surfactant molecules (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

[00416] A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase tem sido extensivamente estudada e produziu um conhecimento abrangente, para um versado na técnica, de como formular microemulsões (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Em comparação com as emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar os fármacos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que são formadas espontaneamente.[00416] The phenomenological approach using phase diagrams has been extensively studied and has produced a comprehensive knowledge, for one skilled in the art, of how to formulate microemulsions (see, for example, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Compared to conventional emulsions, microemulsions offer the advantage of solubilizing water-insoluble drugs in a formulation of thermodynamically stable droplets that are formed spontaneously.

[00417] Os tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não estão limitados a tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij® 96, polioxietileno oleil éteres, ésteres de ácidos graxos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), mono-oleato de tetraglicerol (MO310), mono-oleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), mono-oleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), isoladamente ou em combinação com cotensoativos. O tensoativo, geralmente um álcool de cadeia curta tal como etanol, 1- propanol e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial penetrando no filme de tensoativo e consequentemente criando um filme desordenado devido ao espaço vazio gerado entre moléculas de tensoativo. As microemulsões podem, no entanto, ser preparadas sem o uso de cotensoativos e os sistemas de microemulsão autoemulsificantes livres de álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode ser tipicamente, mas não está limitada a água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propilenoglicóis e derivados de etilenoglicol. A fase oleosa pode incluir, mas não se limita a materiais tais como Captex® 300, Captex® 355, Capmul® MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácidos graxos de gliceril polioxietilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolizados, glicerídeos C8-C10 poliglicolizados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.[00417] Surfactants used in the preparation of microemulsions include, but are not limited to, ionic surfactants, nonionic surfactants, Brij® 96, polyoxyethylene oleyl ethers, polyglycerol fatty acid esters, tetraglycerol monolaurate (ML310), tetraglycerol monooleate (MO310), hexaglycerol monooleate (PO310), hexaglycerol pentaoleate (PO500), decaglycerol monocaprate (MCA750), decaglycerol monooleate (MO750), decaglycerol sequioleate (SO750), decaglycerol decaoleate (DAO750), alone or in combination with co-surfactants. The surfactant, usually a short-chain alcohol such as ethanol, 1-propanol, and 1-butanol, serves to increase interfacial fluidity by penetrating the surfactant film and consequently creating a disordered film due to the void space generated between surfactant molecules. Microemulsions can, however, be prepared without the use of co-surfactants, and alcohol-free self-emulsifying microemulsion systems are known in the art. The aqueous phase can typically be, but is not limited to, water, an aqueous solution of the drug, glycerol, PEG300, PEG400, polyglycerols, propylene glycols, and ethylene glycol derivatives. The oil phase may include, but is not limited to, materials such as Captex® 300, Captex® 355, Capmul® MCM, fatty acid esters, medium chain (C8-C12) mono-, di-, and triglycerides, polyoxyethylated glyceryl fatty acid esters, fatty alcohols, polyglycolized glycerides, saturated polyglycolized C8-C10 glycerides, vegetable oils, and silicone oil.

[00418] As microemulsões são particularmente interessantes do ponto de vista da solubilização do fármaco e da absorção intensificada de fármacos. Microemulsões à base de lipídios (tanto o/a como a/o) têm sido propostas para intensificar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (ver por exemplo, Patente US Nos. 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam vantagens de melhor solubilização do fármaco, proteção do fármaco da hidrólise enzimática, possível intensificação da absorção do fármaco devido a alterações induzidas pelo tensoativo na fluidez e permeabilidade da membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral em formas de dosagem sólidas, potência clínica melhorada e diminuição da toxicidade (ver por exemplo, Patente US Nos. 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Frequentemente microemulsões podem se formar espontaneamente quando seus componentes são reunidos à temperatura ambiente. Isso pode ser particularmente vantajoso ao se formular fármacos termolábeis, peptídeos ou iRNAs. As microemulsões também foram eficazes na administração transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. Espera-se que as composições de microemulsão e formulações da presente invenção facilitem a absorção sistêmica aumentada de iRNAs e ácidos nucleicos do trato gastrointestinal, bem como melhorem a captação celular local de iRNAs e ácidos nucleicos.[00418] Microemulsions are particularly interesting from the point of view of drug solubilization and enhanced drug absorption. Lipid-based microemulsions (both o/w and w/o) have been proposed to enhance the oral bioavailability of drugs, including peptides (see e.g., U.S. Patent Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Microemulsions offer the advantages of improved drug solubilization, protection of the drug from enzymatic hydrolysis, possible enhancement of drug absorption due to surfactant-induced changes in membrane fluidity and permeability, ease of preparation, ease of oral administration in solid dosage forms, improved clinical potency, and decreased toxicity (see, for example, U.S. Patent Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138–143). Microemulsions can often form spontaneously when their components are brought together at room temperature. This can be particularly advantageous when formulating heat-labile drugs, peptides, or iRNAs. Microemulsions have also been shown to be effective in the transdermal delivery of active ingredients in cosmetic and pharmaceutical applications. The microemulsion compositions and formulations of the present invention are expected to facilitate increased systemic absorption of iRNAs and nucleic acids from the gastrointestinal tract, as well as improve local cellular uptake of iRNAs and nucleic acids.

[00419] As microemulsões da presente invenção podem também conter componentes e aditivos adicionais, tais como monoestearato de sorbitano (Grill® 3), Labrasol®, e intensificadores de penetração para melhorar as propriedades da formulação e para intensificar a absorção dos iRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Intensificadores de penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco grandes categorias -- tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensoativos não quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uma dessas classes foi discutida acima.[00419] The microemulsions of the present invention may also contain additional components and additives, such as sorbitan monostearate (Grill® 3), Labrasol®, and penetration enhancers to improve the properties of the formulation and to enhance the absorption of the iRNAs and nucleic acids of the present invention. Penetration enhancers used in the microemulsions of the present invention can be classified as belonging to one of five broad categories -- surfactants, fatty acids, bile salts, chelating agents, and non-chelating non-surfactants (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Each of these classes has been discussed above.

iii. Micropartículasiii. Microparticles

[00420] Um iRNA da invenção pode ser incorporado em uma partícula, por exemplo, uma micropartícula. As micropartículas podem ser produzidas por secagem por pulverização, mas também podem ser produzidas por outros modos incluindo liofilização, evaporação, secagem em leito fluidizado, secagem a vácuo ou uma combinação dessas técnicas.[00420] An iRNA of the invention may be incorporated into a particle, for example, a microparticle. Microparticles may be produced by spray drying, but may also be produced by other methods including lyophilization, evaporation, fluidized bed drying, vacuum drying, or a combination of these techniques.

iv. Intensificadores de penetraçãoiv. Penetration enhancers

[00421] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários intensificadores de penetração para efetuar a dispensação eficiente de ácidos nucleicos, particularmente iRNAs, à pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução tanto nas formas ionizada quanto não ionizada. No entanto, geralmente apenas fármacos lipossolúveis ou lipofílicos atravessam facilmente as membranas celulares. Descobriu-se que mesmo fármacos não lipofílicos podem atravessar as membranas celulares se a membrana a ser atravessada for tratada com um intensificador de penetração. Além de auxiliar a difusão de fármacos não lipofílicos através das membranas celulares, os intensificadores de penetração também aumentam a permeabilidade de fármacos lipofílicos.[00421] In one embodiment, the present invention employs various penetration enhancers to effect efficient delivery of nucleic acids, particularly iRNAs, to the skin of animals. Most drugs are present in solution in both ionized and non-ionized forms. However, generally only lipid-soluble or lipophilic drugs readily cross cell membranes. It has been found that even non-lipophilic drugs can cross cell membranes if the membrane to be crossed is treated with a penetration enhancer. In addition to aiding the diffusion of non-lipophilic drugs across cell membranes, penetration enhancers also increase the permeability of lipophilic drugs.

[00422] Os intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco grandes categorias, ou seja, tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não tensoativos não quelantes (ver por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Tais compostos são bem conhecidos na técnica.[00422] Penetration enhancers can be classified as belonging to one of five broad categories, namely, surfactants, fatty acids, bile salts, chelating agents, and non-chelating non-surfactants (see, for example, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Such compounds are well known in the art.

v. Carreadoresv. Carriers

[00423] Certas composições da presente invenção também incorporam compostos carreadores na formulação. Como aqui usado, “composto carreador” ou “carreador” pode referir-se a um ácido nucleico, ou análogo do mesmo, que é inerte (isto é, não possui atividade biológica per se), mas é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico com atividade biológica, por exemplo, degradando o ácido nucleico biologicamente ativo ou promovendo a sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto carreador, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rins ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido à competição entre o composto carreador e o ácido nucleico por um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente de fosforotioato no tecido hepático pode ser reduzida quando é coadministrado com ácido poli-inosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.[00423] Certain compositions of the present invention also incorporate carrier compounds in the formulation. As used herein, “carrier compound” or “carrier” may refer to a nucleic acid, or analogue thereof, that is inert (i.e., has no biological activity per se), but is recognized as a nucleic acid by in vivo processes that reduce the bioavailability of a nucleic acid with biological activity, for example, by degrading the biologically active nucleic acid or promoting its removal from the circulation. Co-administration of a nucleic acid and a carrier compound, typically with an excess of the latter substance, may result in a substantial reduction in the amount of nucleic acid recovered in the liver, kidneys, or other extracirculatory reservoirs, presumably due to competition between the carrier compound and the nucleic acid for a common receptor. For example, the recovery of a partially phosphorothioate dsRNA in liver tissue may be reduced when it is coadministered with polyinosinic acid, dextran sulfate, polycytidic acid, or 4-acetamido-4'isothiocyano-stilbene-2,2'-disulfonic acid (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.

vi. Excipientesvi. Excipients

[00424] Em contraste com um composto carreador, um “carreador farmacêutico” ou “excipiente” é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para a dispensação de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, tendo em mente o modo de administração planejado, de modo a prover o volume, consistência, etc. desejados, quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Carreadores farmacêuticos típicos incluem, mas não estão limitados a agentes de aglutinação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose, etc.); cargas (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietilenoglicois, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, amidoglicolato de sódio, etc.); e agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.).[00424] In contrast to a carrier compound, a “pharmaceutical carrier” or “excipient” is a pharmaceutically acceptable solvent, suspending agent, or any other pharmacologically inert vehicle for the delivery of one or more nucleic acids to an animal. The excipient may be liquid or solid and is selected, with the intended mode of administration in mind, so as to provide the desired volume, consistency, etc., when combined with a nucleic acid and the other components of a given pharmaceutical composition. Typical pharmaceutical carriers include, but are not limited to, binding agents (e.g., pregelatinized cornstarch, polyvinylpyrrolidone, or hydroxypropylmethylcellulose, etc.); fillers (e.g., lactose and other sugars, microcrystalline cellulose, pectin, gelatin, calcium sulfate, ethylcellulose, polyacrylates, or calcium hydrogen phosphate, etc.); lubricants (e.g., magnesium stearate, talc, silica, colloidal silicon dioxide, stearic acid, metallic stearates, hydrogenated vegetable oils, corn starch, polyethylene glycols, sodium benzoate, sodium acetate, etc.); disintegrants (e.g., starch, sodium starch glycolate, etc.); and wetting agents (e.g., sodium lauryl sulfate, etc.).

[00425] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis apropriados para administração não parenteral, que não reagem prejudicialmente com os ácidos nucleicos também podem ser usados para formular as composições da presente invenção. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcoois, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.[00425] Pharmaceutically acceptable organic or inorganic excipients suitable for non-parenteral administration that do not react deleteriously with nucleic acids may also be used to formulate the compositions of the present invention. Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, water, saline solutions, alcohols, polyethylene glycols, gelatin, lactose, amylose, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, and the like.

[00426] As formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns, tais como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases de óleo líquidas ou sólidas. As soluções também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis apropriados para administração não parenteral, que não reagem prejudicialmente com os ácidos nucleicos podem ser usados.[00426] Formulations for topical administration of nucleic acids may include sterile and non-sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions in common solvents such as alcohols, or solutions of the nucleic acids in liquid or solid oil bases. The solutions may also contain buffers, diluents, and other suitable additives. Pharmaceutically acceptable organic or inorganic excipients suitable for non-parenteral administration that do not react deleteriously with the nucleic acids may be used.

[00427] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcool, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona, e semelhantes.[00427] Suitable pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, water, saline solutions, alcohol, polyethylene glycols, gelatin, lactose, amylose, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, and the like.

vii. Outros componentesvii. Other components

[00428] As composições da presente invenção podem conter adicionalmente outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas, nos seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais, compatível, farmaceuticamente ativos, tal como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou pode conter materiais adicionais úteis para formular fisicamente várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. Contudo, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente nas atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não interajam deleteriamente com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.[00428] The compositions of the present invention may additionally contain other adjunct components conventionally found in pharmaceutical compositions, at their art-established levels of use. Thus, for example, the compositions may contain additional, compatible, pharmaceutically active materials, such as, for example, antipruritics, astringents, local anesthetics, or anti-inflammatory agents, or may contain additional materials useful for physically formulating various dosage forms of the compositions of the present invention, such as colorants, flavoring agents, preservatives, antioxidants, opacifiers, thickening agents, and stabilizers. However, such materials, when added, should not unduly interfere with the biological activities of the components of the compositions of the present invention. The formulations may be sterilized and, if desired, mixed with auxiliary agents, for example, lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts to influence osmotic pressure, buffers, colorants, flavorings and/or aromatic substances and the like that do not interact deleteriously with the nucleic acid(s) of the formulation.

[00429] As suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizantes.[00429] Aqueous suspensions may contain substances that increase the viscosity of the suspension including, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. The suspension may also contain stabilizers.

[00430] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem (a) um ou mais iRNA e (b) um ou mais agentes que funcionam por um mecanismo não iRNA e que são úteis no tratamento de um distúrbio associado a PD-L1.[00430] In some embodiments, the pharmaceutical compositions presented in the invention include (a) one or more iRNA and (b) one or more agents that function by a non-iRNA mechanism and that are useful in treating a PD-L1 associated disorder.

[00431] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Compostos que apresentam altos índices terapêuticos são preferidos.[00431] The toxicity and therapeutic efficacy of such compounds can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals, for example, to determine the LD50 (the lethal dose for 50% of the population) and the ED50 (the therapeutically effective dose in 50% of the population). The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and can be expressed as the ratio LD50/ED50. Compounds that exhibit high therapeutic indices are preferred.

[00432] Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem das composições aqui apresentadas na invenção situa-se geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma faixa de concentração plasmática circulante do composto ou, quando apropriado, do produto polipeptídico de uma sequência alvo (por exemplo, atingindo uma concentração diminuída do polipeptídeo) que inclua o IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semimáxima dos sintomas) como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta performance.[00432] Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used to formulate a dosage range for use in humans. The dosage of the compositions presented herein generally falls within a range of circulating concentrations that include the ED50 with little or no toxicity. The dosage may vary within this range depending on the dosage form used and the route of administration employed. For any compound used in the methods presented in the invention, the therapeutically effective dose can be estimated initially from cell culture assays. A dose can be formulated in animal models to achieve a range of circulating plasma concentrations of the compound or, where appropriate, the polypeptide product of a target sequence (e.g., achieving a decreased concentration of the polypeptide) that includes the IC50 (i.e., the concentration of the test compound that achieves half-maximal inhibition of symptoms) as determined in cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. Plasma levels can be measured, for example, by high-performance liquid chromatography.

[00433] Além da sua administração, como discutido acima, os iRNAs apresentados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados pela expressão de PD-L1. Em qualquer caso, o médico administrador pode ajustar a quantidade e o momento da administração do iRNA com base nos resultados observados usando medidas padrão de eficácia conhecidas na técnica ou aqui descritas.[00433] In addition to their administration as discussed above, the iRNAs presented in the invention may be administered in combination with other known agents effective in treating pathological processes mediated by PD-L1 expression. In any case, the administering physician may adjust the amount and timing of iRNA administration based on results observed using standard measures of efficacy known in the art or described herein.

VI. Métodos para inibir a expressão de PD-L1VI. Methods to inhibit PD-L1 expression

[00434] A presente invenção também provê métodos para inibir a expressão de um gene PD-L1 em uma célula. Os métodos incluem o contato de uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de cadeia dupla, em uma quantidade eficaz para inibir a expressão de PD-L1 na célula, inibindo assim a expressão de PD-L1 na célula. Em certas modalidades da invenção, a PD-L1 é inibida preferivelmente nas células do fígado.[00434] The present invention also provides methods for inhibiting the expression of a PD-L1 gene in a cell. The methods include contacting a cell with an RNAi agent, e.g., double-stranded RNAi agent, in an amount effective to inhibit the expression of PD-L1 on the cell, thereby inhibiting the expression of PD-L1 on the cell. In certain embodiments of the invention, PD-L1 is preferably inhibited in liver cells.

[00435] O contato de uma célula com um iRNA, por exemplo, um agente de RNAi de cadeia dupla, pode ser feito in vitro ou in vivo. O contato de uma célula in vivo com o iRNA inclui o contato de uma célula ou grupo de células dentro de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, com o iRNA. Combinações de métodos in vitro e in vivo de contato com uma célula também são possíveis. O contato com uma célula pode ser direto ou indireto, como discutido acima. Além disso, o contato de uma célula pode ser realizado através de um ligante de alvejamento, incluindo qualquer ligante aqui descrito ou conhecido na técnica. Em modalidades preferidas, o ligante de alvejamento é um radical carboidrato, por exemplo, um ligante GalNAc3, ou qualquer outro ligante que direciona o agente de RNAi para um sítio de interesse.[00435] Contacting a cell with an iRNA, e.g., a double-stranded RNAi agent, can be done in vitro or in vivo. Contacting a cell with the iRNA in vivo includes contacting a cell or group of cells within an individual, e.g., a human individual, with the iRNA. Combinations of in vitro and in vivo methods of contacting a cell are also possible. Contacting a cell can be direct or indirect, as discussed above. Furthermore, contacting a cell can be accomplished through a targeting ligand, including any ligand described herein or known in the art. In preferred embodiments, the targeting ligand is a carbohydrate moiety, e.g., a GalNAc3 ligand, or any other ligand that directs the RNAi agent to a site of interest.

[00436] O termo “inibir”, como usado aqui, é usado de forma intercambiável com “reduzir”, “silenciar”, “regular descendentemente”, “supressão” e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição.[00436] The term “inhibit,” as used herein, is used interchangeably with “reduce,” “silence,” “downregulate,” “suppression,” and other similar terms, and includes any level of inhibition.

[00437] A frase “inibição da expressão de um PD-L1” pretende referir- se à inibição da expressão de qualquer gene PD-L1 (como, por exemplo, um gene PD-L1 de camundongo, um gene PD-L1 de rato, um gene PD-L1 de macaco, ou um gene PD-L1 humano), bem como variantes ou mutantes de um gene PD-L1. Assim, o gene PD-L1 pode ser um gene PD-L1 de tipo selvagem, um gene PD-L1 mutante ou um gene PD-L1 transgênico no contexto de uma célula, grupo de células ou organismo geneticamente manipulado.[00437] The phrase “inhibiting the expression of a PD-L1” is intended to refer to inhibiting the expression of any PD-L1 gene (such as, for example, a mouse PD-L1 gene, a rat PD-L1 gene, a monkey PD-L1 gene, or a human PD-L1 gene), as well as variants or mutants of a PD-L1 gene. Thus, the PD-L1 gene may be a wild-type PD-L1 gene, a mutant PD-L1 gene, or a transgenic PD-L1 gene in the context of a cell, group of cells, or genetically engineered organism.

[00438] “Inibir a expressão de um gene PD-L1” inclui qualquer nível de inibição de um gene PD-L1, por exemplo, pelo menos supressão parcial da expressão de um gene PD-L1. A expressão do gene PD-L1 pode ser avaliada com base no nível, ou na alteração no nível, de qualquer variável associada à expressão do gene PD-L1, por exemplo, nível de mRNA de PD-L1 ou nível de proteína de PD-L1. Esse nível pode ser avaliado em uma célula individual ou em um grupo de células, incluindo, por exemplo, uma amostra derivada de um indivíduo. Entende-se que a expressão de PD-L1 pode estar próxima ou abaixo do nível de detecção em um indivíduo normal em muitos tipos de células e fluidos corporais. Portanto, a inibição da expressão de PD-L1, por exemplo, pode comparar o nível de PD-L1 no fígado de um indivíduo infectado com um vírus da hepatite antes e depois do tratamento com um agente para a inibição de PD-L1 ou em um tumor antes ou depois do tratamento com um agente para a inibição de PD-L1.[00438] “Inhibiting the expression of a PD-L1 gene” includes any level of inhibition of a PD-L1 gene, e.g., at least partial suppression of the expression of a PD-L1 gene. PD-L1 gene expression can be assessed based on the level, or change in the level, of any variable associated with PD-L1 gene expression, e.g., PD-L1 mRNA level or PD-L1 protein level. This level can be assessed in an individual cell or in a group of cells, including, for example, a sample derived from an individual. It is understood that PD-L1 expression may be near or below the level of detection in a normal individual in many cell types and body fluids. Therefore, inhibition of PD-L1 expression, for example, may compare the level of PD-L1 in the liver of an individual infected with a hepatitis virus before and after treatment with an agent for inhibiting PD-L1, or in a tumor before or after treatment with an agent for inhibiting PD-L1.

[00439] Em certas modalidades, marcadores substitutos podem ser usados para detectar a inibição de PD-L1. Por exemplo, o tratamento eficaz de uma infecção, por exemplo, uma infecção pelo vírus da hepatite, como demonstrado por critérios de diagnóstico e monitoramento aceitáveis com um agente para reduzir a expressão de PD-L1, pode demonstrar uma redução clinicamente relevante no PD-L1. A estabilização ou redução da carga tumoral em um indivíduo com câncer, como determinado pelos critérios RECIST após o tratamento com um agente para reduzir PD-L1, pode ser entendida como demonstrando uma redução clinicamente relevante em PD- L1.[00439] In certain embodiments, surrogate markers can be used to detect PD-L1 inhibition. For example, effective treatment of an infection, e.g., a hepatitis virus infection, as demonstrated by acceptable diagnostic and monitoring criteria with an agent to reduce PD-L1 expression, can demonstrate a clinically relevant reduction in PD-L1. Stabilization or reduction of tumor burden in a subject with cancer, as determined by RECIST criteria following treatment with an agent to reduce PD-L1, can be understood as demonstrating a clinically relevant reduction in PD-L1.

[00440] A inibição pode ser avaliada por uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais variáveis que estão associadas à expressão de PD-L1 em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que é utilizado na técnica, por exemplo, um nível da linha de base de pré-dose, ou um nível determinado a partir de um indivíduo semelhante (por exemplo, controle histórico), célula, ou amostra que não é tratada ou tratada com um controle (como, por exemplo, controle somente de tampão ou controle de agente inativo).[00440] Inhibition can be assessed by a decrease in an absolute or relative level of one or more variables that are associated with PD-L1 expression compared to a control level. The control level can be any type of control level that is used in the art, for example, a pre-dose baseline level, or a level determined from a similar individual (e.g., historical control), cell, or sample that is untreated or treated with a control (such as, for example, buffer-only control or inactive agent control).

[00441] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a expressão de um gene PD-L1 é inibida em pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou abaixo do nível de detecção do ensaio. Em certas modalidades, os métodos incluem uma inibição clinicamente relevante da expressão de PD-L1, por exemplo, como demonstrado por um resultado clinicamente relevante após tratamento de um indivíduo com um agente para reduzir a expressão de PD- L1.[00441] In some embodiments of the methods of the invention, the expression of a PD-L1 gene is inhibited by at least 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, or below the detection level of the assay. In certain embodiments, the methods include a clinically relevant inhibition of PD-L1 expression, e.g., as demonstrated by a clinically relevant outcome following treatment of a subject with an agent to reduce PD-L1 expression.

[00442] A inibição da expressão de um gene PD-L1 pode ser manifestada por uma redução da quantidade de mRNA expressa por uma primeira célula ou grupo de células (tais células podem estar presentes, por exemplo, em uma amostra derivada de um indivíduo) em que um gene PD-L1 é transcrito e que foi tratado (por exemplo, colocando em contato a célula ou células com um iRNA da invenção, ou administrando um iRNA da invenção a um indivíduo no qual as células estão ou estavam presentes) de modo que a expressão de um gene PD-L1 é inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idênticas à primeira célula ou grupo de células, mas que não foi tratada assim (célula(s) de controle não tratada(s) com um iRNA ou não tratada(s) com um iRNA alvejado ao gene de interesse). Em modalidades preferidas, a inibição é avaliada através do método provido no Exemplo 2 nas células de carcinoma do cólon humano RKO tratadas com 10 nM de iRNA e que expressam o nível de mRNA em células tratadas como uma porcentagem do nível de mRNA em células de controle, usando a seguinte fórmula: precisa de traução [00442] Inhibition of the expression of a PD-L1 gene may be manifested by a reduction in the amount of mRNA expressed by a first cell or group of cells (such cells may be present, for example, in a sample derived from an individual) in which a PD-L1 gene is transcribed and which has been treated (for example, by contacting the cell or cells with an iRNA of the invention, or by administering an iRNA of the invention to an individual in which the cells are or were present) such that the expression of a PD-L1 gene is inhibited, as compared to a second cell or group of cells substantially identical to the first cell or group of cells but which has not been so treated (control cell(s) not treated with an iRNA or not treated with an iRNA targeting the gene of interest). In preferred embodiments, inhibition is assessed by the method provided in Example 2 on RKO human colon carcinoma cells treated with 10 nM iRNA and expressing the mRNA level in treated cells as a percentage of the mRNA level in control cells, using the following formula: translation needs

[00443] Em outras modalidades, a inibição da expressão de um gene PD-L1 pode ser avaliada em termos de uma redução de um parâmetro que está funcionalmente ligado à expressão do gene PD-L1, por exemplo, a expressão da proteína PD-L1 ou vias de sinalização de PD-L1. O silenciamento do gene PD-L1 pode ser determinado em qualquer célula que expresse PD-L1, seja endógena ou heteróloga a partir de uma construção de expressão, e por qualquer ensaio conhecido na técnica.[00443] In other embodiments, inhibition of expression of a PD-L1 gene can be assessed in terms of a reduction of a parameter that is functionally linked to PD-L1 gene expression, e.g., PD-L1 protein expression or PD-L1 signaling pathways. PD-L1 gene silencing can be determined in any cell that expresses PD-L1, whether endogenous or heterologous from an expression construct, and by any assay known in the art.

[00444] A inibição da expressão de uma proteína PD-L1 pode se manifestar por uma redução no nível da proteína PD-L1 que é expressa por uma célula ou grupo de células (por exemplo, o nível de proteína expresso em uma amostra derivada de um indivíduo). Como explicado acima, para a avaliação da supressão de mRNA, a inibição dos níveis de expressão de proteína em uma célula tratada ou em um grupo de células pode ser expressa de forma semelhante como uma porcentagem do nível de proteína em uma célula de controle ou grupo de células.[00444] Inhibition of the expression of a PD-L1 protein may be manifested by a reduction in the level of PD-L1 protein that is expressed by a cell or group of cells (e.g., the level of protein expressed in a sample derived from an individual). As explained above, for the assessment of mRNA suppression, inhibition of protein expression levels in a treated cell or group of cells may be similarly expressed as a percentage of the protein level in a control cell or group of cells.

[00445] Uma célula de controle ou um grupo de células que pode ser usada para avaliar a inibição da expressão de um gene PD-L1 inclui uma célula ou grupo de células que ainda não foi contactada com um agente de RNAi da invenção. Por exemplo, a célula de controle ou grupo de células pode ser derivada de um único indivíduo (por exemplo, um ser humano ou animal) antes do tratamento do indivíduo com um agente de RNAi.[00445] A control cell or group of cells that can be used to assess inhibition of expression of a PD-L1 gene includes a cell or group of cells that has not yet been contacted with an RNAi agent of the invention. For example, the control cell or group of cells can be derived from a single individual (e.g., a human or animal) prior to treatment of the individual with an RNAi agent.

[00446] O nível de mRNA de PD-L1 que é expresso por uma célula ou grupo de células pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para avaliar a expressão de mRNA. Em uma modalidade, o nível de expressão de PD-L1 em uma amostra é determinado por detecção de um polinucleotídeo transcrito, ou porção do mesmo, por exemplo, o mRNA do gene PD-L1. O RNA pode ser extraído de células usando técnicas de extração de RNA, incluindo, por exemplo, extração com isotiocianato ácido de fenol/guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparação de RNA RNeasyTM(Qiagen®) ou PAXgene (PreAnalytix, Suíça). Os formatos de ensaio típicos que utilizam a hibridização de ácido ribonucleico incluem ensaios nucleares, RT-PCR, ensaios de proteção de RNase, Northern blotting, hibridização in situ e análise de microssérie. O mRNA de PD-L1 circulante pode ser detectado usando os métodos do descrito na Publicação PCT WO2012/177906, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra por referência.[00446] The level of PD-L1 mRNA that is expressed by a cell or group of cells can be determined using any method known in the art for assessing mRNA expression. In one embodiment, the level of PD-L1 expression in a sample is determined by detecting a polynucleotide transcript, or portion thereof, e.g., the mRNA of the PD-L1 gene. RNA can be extracted from cells using RNA extraction techniques, including, e.g., phenol/guanidine acid isothiocyanate extraction (RNAzol B; Biogenesis), RNeasy™ RNA preparation kits (Qiagen®), or PAXgene (PreAnalytix, Switzerland). Typical assay formats utilizing ribonucleic acid hybridization include nuclear assays, RT-PCR, RNase protection assays, Northern blotting, in situ hybridization, and microarray analysis. Circulating PD-L1 mRNA can be detected using the methods described in PCT Publication WO2012/177906, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.

[00447] Em algumas modalidades, o nível de expressão de PD-L1 é determinado usando uma sonda de ácido nucleico. O termo “sonda”, como usado aqui, refere-se a qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a um PD-L1 específico. As sondas podem ser sintetizadas por um versado na técnica, ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. As sondas podem ser especificamente projetadas para serem rotuladas. Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, mas não estão limitadas a, RNA, DNA, proteínas, anticorpos e moléculas orgânicas.[00447] In some embodiments, the level of PD-L1 expression is determined using a nucleic acid probe. The term “probe,” as used herein, refers to any molecule that is capable of selectively binding to a specific PD-L1. Probes can be synthesized by one of skill in the art, or derived from appropriate biological preparations. Probes can be specifically designed to be labeled. Examples of molecules that can be used as probes include, but are not limited to, RNA, DNA, proteins, antibodies, and organic molecules.

[00448] mRNA isolado pode ser usado em ensaios de amplificação ou hibridização que incluem, mas não se limitam a, análises Southern ou northern, análises de reação em cadeia da polimerase (PCR) e matrizes de sondas. Um método para a determinação dos níveis de mRNA envolve colocar em contato o mRNA isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridizar com o mRNA de PD-L1. Em uma modalidade, o mRNA é imobilizado em uma superfície sólida e colocado em contato com uma sonda, por exemplo, fazendo funcionar o mRNA isolado em um gel de agarose e transferindo o mRNA do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. Em uma modalidade alternativa, a(s) sonda(s) são imobilizada(s) em uma superfície sólida e o mRNA é contactado com a(s) sonda(s), por exemplo, em uma matriz Affymetrix GeneChip®. Um versado na técnica pode facilmente adaptar modos de detecção de mRNA conhecidos para uso na determinação do nível de mRNA de PD-L1.[00448] Isolated mRNA can be used in amplification or hybridization assays that include, but are not limited to, Southern or northern analyses, polymerase chain reaction (PCR) analyses, and probe arrays. One method for determining mRNA levels involves contacting the isolated mRNA with a nucleic acid molecule (probe) that can hybridize to PD-L1 mRNA. In one embodiment, the mRNA is immobilized on a solid surface and contacted with a probe, e.g., by running the isolated mRNA in an agarose gel and transferring the mRNA from the gel to a membrane, such as nitrocellulose. In an alternative embodiment, the probe(s) are immobilized on a solid surface and the mRNA is contacted with the probe(s), e.g., on an Affymetrix GeneChip® array. One of skill in the art can readily adapt known mRNA detection methods for use in determining the level of PD-L1 mRNA.

[00449] Um método alternativo para determinar o nível de expressão de PD-L1 em uma amostra envolve o processo de amplificação de ácido nucleico e/ou transcriptase reversa (para preparar cDNA) de, por exemplo, mRNA na amostra, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental apresentada em Mullis, 1987, Patente US No. 4.683.202), reação em cadeia da ligase (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicação de sequência autossustentável (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Replicase Q-Beta (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), replicação do circulo rolante (Lizardi et al., Patente US No. 5.854.033) ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucleicos, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conhecidas dos versados na técnica. Esses esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estiverem presentes em números muito baixos. Em aspectos particulares da invenção, o nível de expressão de PD-L1 é determinado por RT-PCR fluorogênico quantitativo (isto é, o Sistema TaqManTM) ou o ensaio de Luciferase Dual-Glo® no Exemplo 2.[00449] An alternative method for determining the level of PD-L1 expression in a sample involves the process of nucleic acid and/or reverse transcriptase amplification (to prepare cDNA) of, e.g., mRNA in the sample, e.g., by RT-PCR (the experimental embodiment set forth in Mullis, 1987, U.S. Patent No. 4,683,202), ligase chain reaction (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), self-sustaining sequence replication (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transcriptional amplification system (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), rolling circle replication (Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033), or any other nucleic acid amplification method, followed by detection of the amplified molecules using techniques well known to those skilled in the art. These detection schemes are especially useful for the detection of nucleic acid molecules if such molecules are present in very low numbers. In particular aspects of the invention, the level of PD-L1 expression is determined by quantitative fluorogenic RT-PCR (i.e., the TaqMan™ System) or the Dual-Glo® Luciferase assay in Example 2.

[00450] Os níveis de expressão de mRNA de PD-L1 podem ser monitorados usando um blot de membrana (tal como usado na análise de hibridização, tais como northern, southern, ponto, e semelhantes), ou micropoços, tubos de amostra, géis, glóbulos ou fibras (ou qualquer suporte sólido compreendendo ácidos nucleicos ligados). Ver Patentes US Nos. 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 e 5.445.934, as quais são aqui incorporadas como referência. A determinação do nível de expressão de PD- L1 pode também compreender o uso de sondas de ácido nucleico em solução.[00450] PD-L1 mRNA expression levels can be monitored using a membrane blot (such as used in hybridization analysis, such as northern, southern, dot, and the like), or microwells, sample tubes, gels, beads, or fibers (or any solid support comprising bound nucleic acids). See U.S. Patent Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195, and 5,445,934, which are incorporated herein by reference. Determining the level of PD-L1 expression can also comprise the use of nucleic acid probes in solution.

[00451] Em modalidades preferidas, o nível de expressão de mRNA é avaliado através de ensaios de DNA ramificado (bDNA) ou PCR em tempo real (qPCR). O uso desse método de PCR é descrito e exemplificado nos exemplos aqui apresentados. Tais métodos podem também ser usados para a detecção de ácidos nucleicos patogênicos, por exemplo, ácidos nucleicos do vírus da hepatite.[00451] In preferred embodiments, the level of mRNA expression is assessed by branched DNA (bDNA) or real-time PCR (qPCR) assays. The use of this PCR method is described and exemplified in the examples presented herein. Such methods can also be used for the detection of pathogenic nucleic acids, e.g., hepatitis virus nucleic acids.

[00452] O nível de expressão da proteína PD-L1 pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para a medição dos níveis de proteína. Tais métodos incluem, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão, reações de precipitina em líquido ou gel, espectroscopia de absorção, ensaios colorimétricos, ensaios espectrofotométricos, citometria de fluxo, imunodifusão (simples ou dupla), imunoeletroforese, western blotting, radioimunoensaio (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios de imunofluorescência, ensaios de eletroquimioluminescência e semelhantes. Tais ensaios também podem ser usados para a detecção de proteínas indicativas da presença ou a replicação de patógenos, por exemplo proteínas virais.[00452] The level of PD-L1 protein expression may be determined using any method known in the art for measuring protein levels. Such methods include, for example, electrophoresis, capillary electrophoresis, high-performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography (TLC), hyperdiffusion chromatography, precipitin reactions in liquid or gel, absorption spectroscopy, colorimetric assays, spectrophotometric assays, flow cytometry, immunodiffusion (single or double), immunoelectrophoresis, western blotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), immunofluorescence assays, electrochemiluminescence assays, and the like. Such assays may also be used for the detection of proteins indicative of the presence or replication of pathogens, for example, viral proteins.

[00453] Em algumas modalidades, a eficácia dos métodos da invenção no tratamento de uma doença relacionada a PD-L1 é avaliada por uma diminuição no nível de mRNA de PD-L1 (por biópsia do fígado).[00453] In some embodiments, the efficacy of the methods of the invention in treating a PD-L1-related disease is assessed by a decrease in the level of PD-L1 mRNA (by liver biopsy).

[00454] Em algumas modalidades, a eficácia dos métodos da invenção no tratamento da infecção por VHB é monitorada através da avaliação de combinações de marcadores serológicos como discutido abaixo. A eficácia do tratamento de indivíduos com VHB pode ser monitorada detectando o nível de antígeno da heptatite B (HBsAg) ou HBeAg no indivíduo, em que uma redução no nível de HBsAg ou HBeAg, por exemplo, no soro, é indicativa de tratamento eficaz da doença. Em modalidades preferidas, a redução no nível de HBsAg ou HbeAg é clinicamente relevante, por exemplo, comparável ao nível de redução observado com o padrão de assistência. A eficácia do tratamento também pode ser determinada por uma redução clinicamente relevante do nível de DNA do VHB no indivíduo, por exemplo, comparável ao nível de redução observado com o padrão de assistência, por exemplo, supressão por pelo menos 4 log10 UI/mL, preferivelmente pelo menos 5 log10 UI/mL (Dienstag, Hepatology, 2009, 49:S112-S121). A eficácia do tratamento também pode ser determinada pela presença de anticorpos anti- HBsAg.[00454] In some embodiments, the efficacy of the methods of the invention in treating HBV infection is monitored by evaluating combinations of serological markers as discussed below. The efficacy of treatment of individuals with HBV can be monitored by detecting the level of heptad B antigen (HBsAg) or HBeAg in the individual, wherein a reduction in the level of HBsAg or HBeAg, e.g., in serum, is indicative of effective treatment of the disease. In preferred embodiments, the reduction in the level of HBsAg or HBeAg is clinically relevant, e.g., comparable to the level of reduction observed with the standard of care. Treatment efficacy can also be determined by a clinically relevant reduction in the individual's HBV DNA level, e.g., comparable to the level of reduction observed with the standard of care, e.g., suppression by at least 4 log10 IU/mL, preferably at least 5 log10 IU/mL (Dienstag, Hepatology, 2009, 49:S112-S121). Treatment efficacy can also be determined by the presence of anti-HBsAg antibodies.

[00455] Em algumas modalidades, a eficácia do método da invenção no tratamento de câncer pode ser monitorada por avaliação de um indivíduo para manutenção ou preferivelmente redução de carga tumoral do tumor primário ou tumor(es) metastático(s) ou a prevenção de metástases. Os métodos para detecção e monitoramento da carga tumoral são conhecidos na técnica, por exemplo, critérios RECIST como provido em Eisenhauer et al., 2009, New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45:228-247.[00455] In some embodiments, the efficacy of the method of the invention in treating cancer can be monitored by assessing a subject for maintenance or preferably reduction of tumor burden of the primary tumor or metastatic tumor(s) or the prevention of metastases. Methods for detecting and monitoring tumor burden are known in the art, e.g., RECIST criteria as provided in Eisenhauer et al., 2009, New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45:228-247.

[00456] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o iRNA é administrado a um indivíduo de tal modo que o iRNA é dispensado a um sítio específico dentro do indivíduo. A inibição da expressão do PD-L1 pode ser avaliada usando medições do nível ou mudança no nível de mRNA de PD-L1 ou proteína PD-L1 em uma amostra derivada de um sítio específico dentro do indivíduo, por exemplo, o fígado. Em certas modalidades, os métodos incluem uma inibição clinicamente relevante da expressão de PD-L1, por exemplo, como demonstrado por um resultado clinicamente relevante após tratamento de um indivíduo com um agente para reduzir a expressão de PD- L1.[00456] In some embodiments of the methods of the invention, the iRNA is administered to a subject such that the iRNA is delivered to a specific site within the subject. Inhibition of PD-L1 expression can be assessed using measurements of the level or change in the level of PD-L1 mRNA or PD-L1 protein in a sample derived from a specific site within the subject, e.g., the liver. In certain embodiments, the methods include a clinically relevant inhibition of PD-L1 expression, e.g., as demonstrated by a clinically relevant outcome following treatment of a subject with an agent to reduce PD-L1 expression.

[00457] Como aqui usado, os termos que detectam ou determinam um nível de um anilito significam realizar as etapas para determinar se um material, por exemplo, proteína, RNA, está presente. Como aqui usado, os métodos de detecção ou determinação incluem detecção ou determinação de um nível de anilito que está abaixo do nível de detecção para o método usado.[00457] As used herein, the terms detecting or determining a level of an anilite means performing the steps to determine whether a material, e.g., protein, RNA, is present. As used herein, methods of detecting or determining include detecting or determining a level of anilite that is below the detection level for the method used.

[00458] Modelos animais de doenças associadas a PD-L1 são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, modelos animais de infecção por hepatite B são conhecidos na técnica, incluindo chimpanzé, marmota, e modelos de camundongo transgênico de VHB (Wieland, 2015. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 5:a021469, 2015; Tennant and Gerin, 2001. ILAR Journal, 42:89-102; e Moriyama et al., 1990. Science, 248:361-364). O modelo de chimpanzé também pode ser usado como modelo para infecção por hepatite D. Modelos comparativos de infecção por vírus da coriomeningite linfocítica crônica (LCMV) vs. aguda são úteis para o estudo da exaustão imune (Matloubian et al., 1994, J. Virol. 68:8056-8063). Um grande número de modelos de câncer, incluindo tumores que expressam PD-L1, são conhecidos na técnica (Iwai et al., 2002, PNAS, 99:12293-12297).[00458] Animal models of PD-L1 associated diseases are well known in the art. For example, animal models of hepatitis B infection are known in the art, including chimpanzee, woodchuck, and transgenic mouse models of HBV (Wieland, 2015. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 5:a021469, 2015; Tennant and Gerin, 2001. ILAR Journal, 42:89-102; and Moriyama et al., 1990. Science, 248:361-364). The chimpanzee model can also be used as a model for hepatitis D infection. Comparative models of chronic lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection vs. acute infection are useful for studying immune exhaustion (Matloubian et al., 1994, J. Virol. 68:8056-8063). A large number of cancer models, including tumors expressing PD-L1, are known in the art (Iwai et al., 2002, PNAS, 99:12293-12297).

VII. Métodos para tratamento ou prevenção de doenças associadas a PD- L1VII. Methods for treating or preventing diseases associated with PD-L1

[00459] A presente invenção também provê métodos de uso de um iRNA da invenção ou uma composição contendo um iRNA da invenção para reduzir ou inibir a expressão de PD-L1 em uma célula. Os métodos incluem o contato da célula com um dsRNA da invenção e a manutenção da célula durante um tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA de um gene PD-L1, inibindo assim a expressão do gene PD-L1 na célula. A redução na expressão do gene pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma redução na expressão de PD-L1 pode ser determinada por determinação do nível de expressão de mRNA de PD-L1, por exemplo, em uma amostra de fígado, usando métodos de rotina para um versado na técnica, por exemplo, Northern blotting, qRT-PCR, por exemplo, como provido no Exemplo 2; por determinação do nível de proteína de PD-L1 usando métodos de rotina para um versado na técnica, tais como western blotting, técnicas imunológicas. Uma redução na expressão de PD-L1 pode também ser avaliada indiretamente através da medição de uma diminuição na atividade biológica de PD-L1 ou da medição do nível de PD- L1 em uma amostra de um indivíduo (por exemplo, uma amostra de soro). Uma redução na expressão de PD-L1 também pode ser avaliada indiretamente através da medição ou observação de uma alteração, preferivelmente, uma alteração clinicamente relevante em, pelo menos, um sinal ou sintoma de uma doença associada a PD-L1.[00459] The present invention also provides methods of using an iRNA of the invention or a composition containing an iRNA of the invention to reduce or inhibit the expression of PD-L1 in a cell. The methods include contacting the cell with a dsRNA of the invention and maintaining the cell for a time sufficient to achieve degradation of the mRNA transcript of a PD-L1 gene, thereby inhibiting the expression of the PD-L1 gene in the cell. The reduction in gene expression can be assessed by any methods known in the art. For example, a reduction in PD-L1 expression can be determined by determining the level of PD-L1 mRNA expression, e.g., in a liver sample, using methods routine to one of skill in the art, e.g., Northern blotting, qRT-PCR, e.g., as provided in Example 2; by determining the level of PD-L1 protein using methods routine to one of skill in the art, such as Western blotting, immunological techniques. A reduction in PD-L1 expression may also be assessed indirectly by measuring a decrease in PD-L1 biological activity or by measuring the level of PD-L1 in a sample from an individual (e.g., a serum sample). A reduction in PD-L1 expression may also be assessed indirectly by measuring or observing a change, preferably a clinically relevant change, in at least one sign or symptom of a PD-L1-associated disease.

[00460] Nos métodos da invenção, a célula pode ser contactada in vitro ou in vivo, isto é, a célula pode estar dentro de um indivíduo.[00460] In the methods of the invention, the cell may be contacted in vitro or in vivo, i.e., the cell may be within an individual.

[00461] Uma célula adequada para o tratamento usando os métodos da invenção pode ser qualquer célula que expressa um gene PD-L1, tipicamente, uma célula do fígado. Uma célula adequada para uso nos métodos da invenção pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de primata (tal como uma célula humana ou uma célula de primata não humano, por exemplo, uma célula de macaco ou uma célula de chimpanzé), célula de não primata (tal como uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de camelo, uma célula de lhama, uma célula de cavalo, uma célula de cabra, uma célula de coelho, uma célula de ovelha, um hamster, uma célula de cobaia, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de leão, uma célula de tigre, uma célula de urso ou uma célula de búfalo), uma célula de ave (por exemplo, uma célula de pato ou uma célula de ganso) ou uma célula de baleia, quando a sequência do gene alvo tem complementaridade suficiente para o agente de iRNA promover knockdown alvo. Em uma modalidade, a célula é uma célula humana, por exemplo, uma célula hepática humana.[00461] A cell suitable for treatment using the methods of the invention can be any cell that expresses a PD-L1 gene, typically a liver cell. A cell suitable for use in the methods of the invention can be a mammalian cell, e.g., a primate cell (such as a human cell or a non-human primate cell, e.g., a monkey cell or a chimpanzee cell), a non-primate cell (such as a cow cell, a pig cell, a camel cell, a llama cell, a horse cell, a goat cell, a rabbit cell, a sheep cell, a hamster, a guinea pig cell, a cat cell, a dog cell, a rat cell, a mouse cell, a lion cell, a tiger cell, a bear cell, or a buffalo cell), an avian cell (e.g., a duck cell or a goose cell), or a whale cell, when the target gene sequence has sufficient complementarity for the iRNA agent to promote target knockdown. In one embodiment, the cell is a human cell, e.g., a human liver cell.

[00462] A expressão de PD-L1 é inibida na célula em pelo menos 20%, 25%, preferivelmente pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou a um nível abaixo do nível de detecção do ensaio. Em certas modalidades, os métodos incluem uma inibição clinicamente relevante da expressão de PD-L1, por exemplo, como demonstrado por um resultado clinicamente relevante após tratamento de um indivíduo com um agente para reduzir a expressão de PD-L1.[00462] PD-L1 expression is inhibited on the cell by at least 20%, 25%, preferably at least 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, or to a level below the detection level of the assay. In certain embodiments, the methods include a clinically relevant inhibition of PD-L1 expression, e.g., as demonstrated by a clinically relevant outcome following treatment of a subject with an agent to reduce PD-L1 expression.

[00463] Os métodos in vivo da presente invenção podem incluir a administração a um indivíduo de uma composição contendo um iRNA, em que o iRNA inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene PD-L1 do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado é um mamífero tal como um humano, a composição pode ser administrada por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a vias oral, intraperitoneal ou parenteral, incluindo intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparenquimal e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, via aérea (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa. Em certas modalidades, as composições são administradas por injeção subcutânea.[00463] The in vivo methods of the present invention can include administering to a subject a composition containing an iRNA, wherein the iRNA includes a nucleotide sequence that is complementary to at least a portion of an RNA transcript of the PD-L1 gene of the mammal to be treated. When the organism to be treated is a mammal such as a human, the composition can be administered by any means known in the art including, but not limited to, oral, intraperitoneal, or parenteral routes, including intracranial (e.g., intraventricular, intraparenchymal, and intrathecal), intravenous, intramuscular, subcutaneous, transdermal, airborne (aerosol), nasal, rectal, and topical (including buccal and sublingual). In certain embodiments, the compositions are administered by intravenous infusion or injection. In certain embodiments, the compositions are administered by subcutaneous injection.

[00464] Em algumas modalidades, a administração é através de uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o iRNA de uma forma consistente ao longo de um período de tempo prolongado. Assim, uma injeção de depósito pode reduzir a frequência de dosagem necessária para se obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de PD-L1, ou um efeito terapêutico. Uma injeção de depósito também pode prover concentrações séricas mais consistentes. As injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferidas, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.[00464] In some embodiments, administration is via a depot injection. A depot injection may release the iRNA consistently over an extended period of time. Thus, a depot injection may reduce the dosing frequency required to achieve a desired effect, e.g., a desired PD-L1 inhibition, or a therapeutic effect. A depot injection may also provide more consistent serum concentrations. Depot injections may include subcutaneous injections or intramuscular injections. In preferred embodiments, the depot injection is a subcutaneous injection.

[00465] Em algumas modalidades, a administração é através de uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba implantada cirurgicamente. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica implantada subcutaneamente. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosas, subcutâneas, arteriais ou epidurais. Em modalidades preferidas, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba cirurgicamente implantada que dispensa o iRNA ao fígado.[00465] In some embodiments, administration is via a pump. The pump may be an external pump or a surgically implanted pump. In certain embodiments, the pump is a subcutaneously implanted osmotic pump. In other embodiments, the pump is an infusion pump. An infusion pump may be used for intravenous, subcutaneous, arterial, or epidural infusions. In preferred embodiments, the infusion pump is a subcutaneous infusion pump. In other embodiments, the pump is a surgically implanted pump that delivers the iRNA to the liver.

[00466] O modo de administração pode ser escolhido com base em se tratamento local ou sistêmico é desejado e baseado na área a ser tratada. A via e o sítio de administração podem ser escolhidos para intensificar o alvejamento.[00466] The mode of administration may be chosen based on whether local or systemic treatment is desired and based on the area to be treated. The route and site of administration may be chosen to enhance targeting.

[00467] Em um aspecto, a presente invenção também provê métodos para inibir a expressão de um gene PD-L1 em um mamífero. Os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição compreendendo um dsRNA que alveja um gene PD-L1 em uma célula de mamífero e manter o mamífero durante um tempo suficiente para se obter a degradação do transcrito de mRNA do gene PD-L1, inibindo assim a expressão do gene PD- L1 na célula. A redução na expressão do gene pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica e por métodos, por exemplo qRT-PCR, aqui descritos. A redução na produção da proteína pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica e por métodos, por exemplo ELISA, aqui descritos. Em uma modalidade, uma amostra de biópsia do fígado por punção serve como o material de tecido para monitorar a redução na expressão do gene ou proteína PD-L1. Em certas modalidades, a inibição da expressão de PD-L1 é confirmada pela observação de resultados clinicamente relevantes.[00467] In one aspect, the present invention also provides methods for inhibiting the expression of a PD-L1 gene in a mammal. The methods include administering to the mammal a composition comprising a dsRNA that targets a PD-L1 gene in a mammalian cell and maintaining the mammal for a time sufficient to achieve degradation of the PD-L1 gene mRNA transcript, thereby inhibiting the expression of the PD-L1 gene in the cell. The reduction in gene expression can be assessed by any method known in the art and by methods, e.g., qRT-PCR, described herein. The reduction in protein production can be assessed by any method known in the art and by methods, e.g., ELISA, described herein. In one embodiment, a liver punch biopsy sample serves as the tissue material for monitoring the reduction in PD-L1 gene or protein expression. In certain embodiments, the inhibition of PD-L1 expression is confirmed by observing clinically relevant results.

[00468] A presente invenção provê adicionalmente métodos de tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo. Os métodos de tratamento da invenção incluem a administração de um iRNA da invenção a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo que se beneficiaria de uma redução ou inibição da expressão de PD-L1, em uma quantidade terapeuticamente eficaz de um iRNA que alveja um gene PD-L1 ou uma composição farmacêutica compreendendo um iRNA que alveja um gene PD-L1.[00468] The present invention further provides methods of treating a subject in need thereof. Treatment methods of the invention include administering an iRNA of the invention to a subject, e.g., a subject who would benefit from a reduction or inhibition of PD-L1 expression, in a therapeutically effective amount of an iRNA that targets a PD-L1 gene or a pharmaceutical composition comprising an iRNA that targets a PD-L1 gene.

[00469] Um iRNA da invenção pode ser administrado como um “iRNA livre.” Um iRNA livre é administrado na ausência de uma composição farmacêutica. O iRNA nu pode estar em uma solução tampão adequada. A solução tampão pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pH e a osmolaridade da solução tampão contendo o iRNA podem ser ajustados de modo a que seja adequado para administração a um indivíduo.[00469] An iRNA of the invention may be administered as a “free iRNA.” A free iRNA is administered in the absence of a pharmaceutical composition. The naked iRNA may be in a suitable buffer solution. The buffer solution may comprise acetate, citrate, prolamine, carbonate, or phosphate, or any combination thereof. In one embodiment, the buffer solution is phosphate-buffered saline (PBS). The pH and osmolarity of the buffer solution containing the iRNA may be adjusted so that it is suitable for administration to a subject.

[00470] Alternativamente, um iRNA da invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica, tal como uma formulação lipossômica de dsRNA.[00470] Alternatively, an iRNA of the invention may be administered as a pharmaceutical composition, such as a liposomal dsRNA formulation.

[00471] Indíviduos que se beneficiariam com a redução ou a inibição da expressão do gene PD-L1 são os que têm um distúrbio que se beneficiaria de um aumento da resposta imune, por exemplo, uma doença infecciosa, por exemplo, uma doença viral, por exemplo, hepatite; ou câncer.[00471] Individuals who would benefit from reducing or inhibiting PD-L1 gene expression are those who have a disorder that would benefit from an increased immune response, e.g., an infectious disease, e.g., a viral disease, e.g., hepatitis; or cancer.

[00472] O iRNA e agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados ao mesmo tempo ou na mesma combinação, por exemplo, parenteralmente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em momentos separados ou por outro método conhecido na técnica ou aqui descrito.[00472] The iRNA and additional therapeutic agents may be administered at the same time or in the same combination, e.g., parenterally, or the additional therapeutic agent may be administered as part of a separate composition or at separate times or by another method known in the art or described herein.

[00473] Em uma modalidade, o método inclui a administração de uma composição apresentada aqui de tal modo que a expressão do gene PD-L1 alvo é reduzida, tal como, por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18 , 24 horas, 28, 32 ou cerca de 36 horas. Em uma modalidade, a expressão do gene PD-L1 alvo é diminuída durante um período estendido, por exemplo, pelo menos dois, três, quatro dias ou mais, por exemplo, cerca de uma semana, duas semanas, três semanas ou quatro semanas ou mais, por exemplo, cerca de 1 mês, 2 meses ou 3 meses.[00473] In one embodiment, the method includes administering a composition presented herein such that the expression of the target PD-L1 gene is reduced, such as for about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 hours, 28, 32, or about 36 hours. In one embodiment, the expression of the target PD-L1 gene is decreased for an extended period, e.g., at least two, three, four days, or more, e.g., about a week, two weeks, three weeks, or four weeks or more, e.g., about 1 month, 2 months, or 3 months.

[00474] Preferivelmente, os iRNAs úteis para os métodos e composições apresentados aqui alvejam especificamente RNAs (primários ou processados) do gene PD-L1 alvo. Composições e métodos para inibir a expressão desses genes usando iRNAs podem ser preparados e realizados como aqui descrito.[00474] Preferably, the iRNAs useful for the methods and compositions presented herein specifically target RNAs (primary or processed) of the target PD-L1 gene. Compositions and methods for inhibiting the expression of these genes using iRNAs can be prepared and performed as described herein.

[00475] A administração do iRNA de acordo com os métodos da invenção pode resultar em uma redução da gravidade, sinais, sintomas ou marcadores de tais doenças ou distúrbios em um paciente com, por exemplo, PD-L1 elevado ou um tumor responsivo a PD-L1. Por “redução”, nesse contexto, entende-se uma diminuição estatisticamente significativa em tal nível, por exemplo, o nível de um indicador da presença de um patógeno em um indivíduo, por exemplo, HBsAg, HBeAg ou HB cccDNA no soro de um indivíduo infectado com hepatite B. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 20%, 25%, preferencialmente pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou abaixo do nível de detecção do ensaio usado. Em certas modalidades, um aumento em um marcador, por exemplo, anticorpo anti-HBs é indicativo de uma redução da gravidade da doença. Portanto, um aumento pode ser um aumento estatisticamente significativo no nível de anticorpo, por exemplo, para um nível detectável em um indivíduo.[00475] Administration of iRNA according to the methods of the invention may result in a reduction in the severity, signs, symptoms, or markers of such diseases or disorders in a patient with, for example, elevated PD-L1 or a PD-L1-responsive tumor. By “reduction” in this context is meant a statistically significant decrease in such a level, for example, the level of an indicator of the presence of a pathogen in an individual, for example, HBsAg, HBeAg, or HB cccDNA in the serum of an individual infected with hepatitis B. The reduction may be, for example, at least about 20%, 25%, preferably at least 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, or below the level of detection of the assay used. In certain embodiments, an increase in a marker, e.g., anti-HBs antibody, is indicative of a reduction in disease severity. Therefore, an increase may be a statistically significant increase in the antibody level, e.g., to a detectable level in an individual.

[00476] A eficácia do tratamento ou prevenção da doença pode ser avaliada, por exemplo, medindo a progressão da doença, remissão da doença, gravidade dos sintomas, redução da dor, qualidade de vida, dose de uma medicação necessária para manter o efeito do tratamento, nível de um marcador da doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma determinada doença sendo tratada ou alvejada para prevenção. Está bem dentro da capacidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um desses parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de um distúrbio que se beneficiaria de uma resposta imune aumentada, por exemplo, uma doença infecciosa, por exemplo, uma doença viral, por exemplo, hepatite ou câncer.[00476] The effectiveness of disease treatment or prevention can be assessed, for example, by measuring disease progression, disease remission, symptom severity, pain reduction, quality of life, dose of a medication needed to maintain the effect of treatment, level of a disease marker, or any other measurable parameter appropriate for a particular disease being treated or targeted for prevention. It is well within the ability of one skilled in the art to monitor the effectiveness of treatment or prevention by measuring any of these parameters, or any combination of parameters. For example, the effectiveness of treating a disorder that would benefit from an enhanced immune response, e.g., an infectious disease, e.g., a viral disease, e.g., hepatitis, or cancer.

[00477] A eficácia do tratamento de uma doença infecciosa pode ser demonstrada, por exemplo, por uma redução na presença do agente infeccioso, tal como demonstrado pela incapacidade de cultura do agente a partir de uma amostra do indivíduo. A eficácia do tratamento de uma doença infecciosa pode ser demonstrada por uma redução na presença do agente infeccioso, tal como demonstrado, por exemplo, pela diminuição em uma proteína, ácido nucleico ou carboidrato presente no agente infeccioso. A eficácia do tratamento pode ser demonstrada, por exemplo, pela presença de uma resposta imune tal como demonstrado pela presença de anticorpos ou células imunes alvejadas contra o agente infeccioso. A eficácia do tratamento de uma doença infecciosa pode ser demonstrada pela diminuição da presença do agente infeccioso, como demonstrado, por exemplo, pela diminuição de um ou mais sinais ou sintomas da infecção, por exemplo, febre, dor, náuseas, vômitos, química do sangue anormal, perda de peso. Os sinais ou sintomas específicos dependerão do patógeno específico. A eficácia do tratamento de uma doença infecciosa pode ser demonstrada pelo desenvolvimento de anticorpos ou células imunes que alvejam o patógeno.[00477] The effectiveness of treating an infectious disease can be demonstrated, for example, by a reduction in the presence of the infectious agent, as demonstrated by the inability to culture the agent from a sample from the individual. The effectiveness of treating an infectious disease can be demonstrated by a reduction in the presence of the infectious agent, as demonstrated, for example, by a decrease in a protein, nucleic acid, or carbohydrate present in the infectious agent. The effectiveness of treating an infectious disease can be demonstrated, for example, by the presence of an immune response, as demonstrated by the presence of antibodies or immune cells targeted against the infectious agent. The effectiveness of treating an infectious disease can be demonstrated by a decrease in the presence of the infectious agent, as demonstrated, for example, by a decrease in one or more signs or symptoms of the infection, e.g., fever, pain, nausea, vomiting, abnormal blood chemistry, weight loss. The specific signs or symptoms will depend on the specific pathogen. The effectiveness of treating an infectious disease can be demonstrated by the development of antibodies or immune cells that target the pathogen.

[00478] A eficácia do tratamento de câncer pode ser demonstrada por estabilização ou uma diminuição na carga tumoral como demonstrado por uma estabilização ou diminuição na carga tumoral do tumor primário, tumores metastáticos, ou o retardo ou prevenção de metástases de tumores. Os métodos de diagnóstico e monitoramento são aqui providos, por exemplo, critérios RECIST.[00478] The effectiveness of cancer treatment can be demonstrated by stabilization or a decrease in tumor burden as demonstrated by a stabilization or decrease in tumor burden of the primary tumor, metastatic tumors, or the delay or prevention of tumor metastasis. Diagnostic and monitoring methods are provided herein, e.g., RECIST criteria.

[00479] Comparações das últimas leituras com as leituras iniciais proveem ao médico uma indicação de que o tratamento é eficaz. Está bem dentro da capacidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um desses parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um iRNA que alveja PD-L1 ou composição farmacêutica do mesmo, “eficaz contra” um distúrbio relacionado a PD-L1 indica que a administração de uma maneira clinicamente apropriada resulta em um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significativa de pacientes, como melhora dos sintomas, cura, redução da doença, extensão da vida, melhoria da qualidade de vida ou outros efeitos geralmente reconhecidos como positivos por médicos familiarizados com o tratamento de distúrbios relacionados a PD- L1, como providos, por exemplo, nos critérios diagnósticos para VHB providos aqui.[00479] Comparisons of the latest readings with the initial readings provide the physician with an indication that the treatment is effective. It is well within the ability of one skilled in the art to monitor the effectiveness of treatment or prevention by measuring any of these parameters, or any combination of parameters. In connection with the administration of a PD-L1-targeting iRNA or pharmaceutical composition thereof, "effective against" a PD-L1-related disorder indicates that administration in a clinically appropriate manner results in a beneficial effect for at least a statistically significant fraction of patients, such as improvement of symptoms, cure, reduction of disease, extension of life, improvement of quality of life, or other effects generally recognized as positive by physicians familiar with the treatment of PD-L1-related disorders, as provided, for example, in the diagnostic criteria for HBV provided herein.

[00480] Um tratamento ou efeito preventivo é evidente quando há uma melhora estatisticamente significativa em um ou mais parâmetros do estado da doença, ou por uma falha em piorar ou desenvolver sintomas onde eles seriam antecipados. Como exemplo, uma alteração favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável de doença e, preferivelmente, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais pode ser indicativa de tratamento eficaz. A eficácia para um dado fármaco de iRNA ou formulação desse fármaco pode também ser avaliada usando um modelo animal experimental para a dada doença como conhecido na técnica. Quando se usa um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando se observa uma redução estatisticamente significativa de um marcador ou sintoma.[00480] A treatment or preventive effect is evident when there is a statistically significant improvement in one or more parameters of the disease state, or by a failure to worsen or develop symptoms where they would be anticipated. As an example, a favorable change of at least 10% in a measurable disease parameter, and preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, or more, may be indicative of effective treatment. Efficacy for a given iRNA drug or drug formulation may also be assessed using an experimental animal model for the given disease as known in the art. When using an experimental animal model, treatment efficacy is evidenced when a statistically significant reduction in a marker or symptom is observed.

[00481] Em alternativa, a eficácia pode ser medida por uma redução na gravidade da doença, tal como determinado por um versado na técnica do diagnóstico com base em uma escala de classificação da gravidade da doença clinicamente aceita. Qualquer alteração positiva que resulte em, por exemplo, diminuição da gravidade da doença medida usando a escala apropriada, representa o tratamento adequado usando iRNA ou uma formulação de iRNA como aqui descrita.[00481] Alternatively, efficacy may be measured by a reduction in disease severity, as determined by one of ordinary skill in the diagnostic art based on a clinically accepted disease severity rating scale. Any positive change that results in, for example, a decrease in disease severity measured using the appropriate scale, represents adequate treatment using iRNA or an iRNA formulation as described herein.

[00482] Pode-se administrar aos indivíduos uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 200 mg/kg.[00482] Subjects may be administered a therapeutic amount of iRNA, such as about 0.01 mg/kg to about 200 mg/kg.

[00483] O iRNA pode ser administrado por infusão intravenosa durante um período de tempo regularmente. Em certas modalidades, após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. A administração do iRNA pode reduzir os níveis de PD-L1, por exemplo, em uma célula ou tecido do paciente em pelo menos cerca de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou abaixo do nível de detecção do método de ensaio usado. Em certas modalidades, a administração resulta em estabilização clínica ou preferivelmente redução clinicamente relevante de pelo menos um sinal ou sintoma de um distúrbio associado a PD-L1.[00483] The iRNA can be administered by intravenous infusion over a period of time on a regular basis. In certain embodiments, after an initial treatment regimen, treatments can be administered on a less frequent basis. Administration of the iRNA can reduce PD-L1 levels, for example, in a patient cell or tissue by at least about 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, or below the level of detection of the assay method used. In certain embodiments, administration results in clinical stabilization or preferably clinically relevant reduction of at least one sign or symptom of a PD-L1 associated disorder.

[00484] Em certas modalidades, uma dose completa do iRNA, pode ser administrada uma dose menor aos pacientes, tal como uma reação de infusão a 5%, e monitorar quanto a efeitos adversos, tais como uma reação alérgica. Em um outro exemplo, o paciente pode ser monitorado quanto a efeitos imunoestimulantes indesejados, tais como níveis aumentados de citocina (por exemplo, TNF-alfa ou INF-alfa).[00484] In certain embodiments, a full dose of the iRNA can be administered to patients, a smaller dose, such as a 5% infusion reaction, and monitored for adverse effects, such as an allergic reaction. In another example, the patient can be monitored for unwanted immunostimulatory effects, such as increased cytokine levels (e.g., TNF-alpha or INF-alpha).

[00485] Alternativamente, o iRNA pode ser administrado subcutaneamente, isto é, por injeção subcutânea. Um ou mais injeções podem ser usadas para dispensar a dose diária desejada de iRNA a um indivíduo. As injeções podem ser repetidas durante um período de tempo. A administração pode ser repetida regularmente. Em certas modalidades, após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Um regime de dose repetida pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica de iRNA regularmente, tal como a cada dois dias ou uma vez por ano. Em certas modalidades, o iRNA é administrado cerca de uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (isto é, cerca de uma vez a cada três meses).[00485] Alternatively, the iRNA may be administered subcutaneously, i.e., by subcutaneous injection. One or more injections may be used to deliver the desired daily dose of iRNA to an individual. The injections may be repeated over a period of time. Administration may be repeated regularly. In certain embodiments, after an initial treatment regimen, treatments may be administered on a less frequent basis. A repeat dose regimen may include administering a therapeutic amount of iRNA on a regular basis, such as every other day or once a year. In certain embodiments, the iRNA is administered about once a month to about once a quarter (i.e., about once every three months).

IX. Critérios de diagnóstico e tratamento para doenças relacionadas a PD-L1IX. Diagnostic and treatment criteria for PD-L1-related diseases

[00486] Critérios de diagnóstico e monitoramento exemplificativos para várias doenças relacionadas a PD-L1 são providos abaixo.[00486] Exemplary diagnostic and monitoring criteria for various PD-L1 related diseases are provided below.

A. Hepatite BA. Hepatitis B

[00487] Hepatite é um termo geral que significa inflamação do fígado e pode ser causada por uma variedade de diferentes vírus, como hepatite A, B, C, D e E. Como o desenvolvimento de icterícia é uma característica da doença hepática, um diagnóstico correto pode só pode ser feito testando os soros dos pacientes quanto à presença de antígenos ou anticorpos antivirais específicos. As consequências patológicas graves de infecções persistentes por VHB incluem o desenvolvimento de insuficiência hepática crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Além disso, os portadores do VHB podem transmitir a doença por muitos anos.Hepatitis is a general term for inflammation of the liver and can be caused by a variety of different viruses, such as hepatitis A, B, C, D, and E. Because jaundice is a hallmark of liver disease, a correct diagnosis can only be made by testing patient sera for the presence of specific antiviral antigens or antibodies. Serious pathological consequences of persistent HBV infections include the development of chronic liver failure, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma (HCC). Furthermore, HBV carriers can transmit the disease for many years.

[00488] O VHB é um vírus grande e não atravessa a placenta, no entanto, as mulheres grávidas infectadas com o VHB podem transmitir a doença aos seus bebês ao nascimento. Se não forem vacinadas ao nascimento, muitas dessas crianças desenvolvem infecções por VHB ao longo da vida, e muitas desenvolvem insuficiência hepática ou câncer de fígado mais tarde na vida. Após a infecção aguda pelo VHB, o risco de desenvolver infecção crônica varia inversamente com a idade. A infecção crônica pelo VHB ocorre em cerca de 90% das crianças infectadas ao nascimento, 25 a 50% das crianças infectadas com 1 a 5 anos de idade e cerca de 1 a 5% das pessoas infectadas quando crianças mais velhas e adultos. A infecção crônica pelo VHB também é comum em pessoas com imunodeficiência (Hepatite B: Organização Mundial da Saúde. Departamento de Vigilância e Resposta a Doenças Transmissíveis, disponível em www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf?ua=1 , incorporado aqui por referência).HBV is a large virus and does not cross the placenta; however, pregnant women infected with HBV can transmit the disease to their babies at birth. If not vaccinated at birth, many of these children develop HBV infections later in life, and many develop liver failure or liver cancer later in life. After acute HBV infection, the risk of developing chronic infection varies inversely with age. Chronic HBV infection occurs in about 90% of children infected at birth, 25–50% of children infected between 1 and 5 years of age, and about 1–5% of those infected as older children and adults. Chronic HBV infection is also common in people with immunodeficiency (Hepatitis B: World Health Organization. Department of Communicable Diseases Surveillance and Response, available at www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf?ua=1 , incorporated herein by reference).

[00489] Durante a fase de incubação da doença (6 a 24 semanas), os pacientes podem sentir-se indispostos com possíveis náuseas, vômitos, diarreia, anorexia e dores de cabeça. Os pacientes podem ficar ictéricos, embora a febre baixa e a perda de apetite possam melhorar. Às vezes, a infecção pelo VHB não produz icterícia nem sintomas óbvios. Os casos assintomáticos podem ser identificados através da detecção de alterações serológicas bioquímicas ou específicas do vírus no sangue. Tais indivíduos assintomáticos podem tornar-se portadores silenciosos do vírus e constituir um reservatório para posterior transmissão a outros.[00489] During the incubation phase of the disease (6 to 24 weeks), patients may feel unwell with possible nausea, vomiting, diarrhea, anorexia, and headaches. Patients may become jaundiced, although low-grade fever and loss of appetite may improve. Sometimes, HBV infection does not produce jaundice or obvious symptoms. Asymptomatic cases can be identified by detecting biochemical or virus-specific serological changes in the blood. Such asymptomatic individuals may become silent carriers of the virus and constitute a reservoir for subsequent transmission to others.

[00490] A maioria dos pacientes adultos recupera completamente de sua infecção pelo VHB, mas outros, cerca de 5 a 10%, não eliminam o vírus e progridem para se tornar portadores assintomáticos ou desenvolver hepatite crônica, possivelmente resultando em cirrose ou câncer de fígado. Raramente, alguns pacientes podem desenvolver hepatite fulminante e morrer. A infecção persistente ou crônica pelo VHB está entre as infecções virais persistentes mais comuns em humanos. Estima-se que mais de 350 milhões de pessoas no mundo atual sejam persistentemente infectadas pelo VHB. Uma grande fração destes está no leste da Ásia e na África subsaariana, onde as complicações associadas à doença hepática crônica e ao câncer de fígado são os problemas de saúde mais importantes.Most adult patients recover completely from their HBV infection, but others, approximately 5 to 10%, do not clear the virus and progress to become asymptomatic carriers or develop chronic hepatitis, possibly resulting in cirrhosis or liver cancer. Rarely, some patients may develop fulminant hepatitis and die. Persistent or chronic HBV infection is among the most common persistent viral infections in humans. It is estimated that more than 350 million people worldwide are persistently infected with HBV. A large proportion of these people live in East Asia and sub-Saharan Africa, where complications associated with chronic liver disease and liver cancer are the most important health problems.

[00491] Os três exames de sangue padrão para hepatite B (antígeno HBs, anticorpo antiHBs e antígeno HBc) podem determinar se uma pessoa está atualmente infectada com o VHB, se recuperou, se é um portador crônico ou se está suscetível à infecção pelo VHB. De: Hollinger FB, Liang TJ. Hepatitis B Virus. In: Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 4th ed., Philadelphia, Lippincott Williams &Wilkins, 2001:2971-3036.[00491] The three standard blood tests for hepatitis B (HBs antigen, anti-HBs antibody, and HBc antigen) can determine whether a person is currently infected with HBV, has recovered, is a chronic carrier, or is susceptible to HBV infection. From: Hollinger FB, Liang TJ. Hepatitis B Virus. In: Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 4th ed., Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2001:2971-3036.

[00492] Outros testes sorológicos podem ser realizados para diferenciar indivíduos com VHB crônico ou agudo, ou que podem ser portadores. Várias vacinas contra o VHB estão disponíveis e são atualmente muito mais eficazes e econômicas do que o tratamento.[00492] Other serological tests may be performed to differentiate individuals with chronic or acute HBV, or who may be carriers. Several HBV vaccines are available and are currently much more effective and cost-effective than treatment.

[00493] Atualmente, não há tratamento disponível para hepatite B aguda. O tratamento sintomático de náusea, anorexia, vômitos e outros sintomas pode ser indicado.[00493] Currently, there is no treatment available for acute hepatitis B. Symptomatic treatment of nausea, anorexia, vomiting, and other symptoms may be indicated.

[00494] O tratamento da hepatite B crônica visa eliminar a infecciosidade para prevenir a transmissão e propagação do VHB, parar a progressão da doença hepática e melhorar o quadro clínico e histológico, e prevenir o desenvolvimento do CHC, perdendo marcadores de replicação do VHB no soro e no fígado como DNA de HBV, HBeAg e HBcAg. A normalização da atividade da ALT, a resolução da inflamação hepática e a melhora dos sintomas do paciente geralmente acompanham essas mudanças virológicas. No entanto, os tratamentos atualmente disponíveis para o VHB raramente são curativos. Os pacientes devem estar em tratamento indefinidamente para suprimir a doença e prevenir a transmissão.Treatment of chronic hepatitis B aims to eliminate infectivity to prevent HBV transmission and spread, halt the progression of liver disease and improve the clinical and histological picture, and prevent the development of HCC by losing serum and liver markers of HBV replication such as HBV DNA, HBeAg, and HBcAg. Normalization of ALT activity, resolution of liver inflammation, and improvement in patient symptoms usually accompany these virological changes. However, currently available treatments for HBV are rarely curative. Patients must be treated indefinitely to suppress the disease and prevent transmission.

[00495] Existem duas classes principais de tratamento: antivirais: destinados a suprimir ou destruir o VHB, interferindo na replicação viral; e moduladores imunológicos: destinados a ajudar o sistema imunológico humano a montar uma defesa contra o vírus. Nem os corticosteroides, que induzem uma expressão intensificada de vírus e antígenos virais, e uma supressão da função dos linfócitos T, nem a adenina arabinosídeo, aciclovir ou didesoxinosina, mostraram-se benéficos para o tratamento da hepatite B crônica.[00495] There are two main classes of treatment: antivirals: intended to suppress or destroy HBV by interfering with viral replication; and immune modulators: intended to help the human immune system mount a defense against the virus. Neither corticosteroids, which induce enhanced expression of viruses and viral antigens and suppression of T-lymphocyte function, nor adenine arabinoside, acyclovir, or dideoxyinosine have been shown to be beneficial for the treatment of chronic hepatitis B.

[00496] Atualmente, a hepatite B crônica é tratada com interferons para modular a resposta imune. Os únicos aprovados são o interferon-α-2a e o interferon-α-2b. Os interferons apresentam uma variedade de propriedades que incluem efeitos antivirais, imunomoduladores e antiproliferativos. Eles intensificam a atividade auxiliar das células T, causam maturação dos linfócitos B, inibem os supressores de células T e intensificam a expressão do HLA tipo I. Para ser elegível para a terapia com interferon, os pacientes devem ter infecção documentada por pelo menos seis meses, enzimas hepáticas elevadas (AST e ALT) e um vírus em divisão ativa no sangue (testes HBeAg e/ou DNA de VHB positivos). Pacientes com infecção aguda, cirrose terminal ou outros problemas médicos importantes não devem ser tratados. O interferon-α produz uma remissão prolongada e sustentada da doença em 35% dos pacientes com hepatite B crônica, com normalização das enzimas hepáticas e perda dos três marcadores para uma infecção ativa (HBeAg, DNA de VHB e HBsAg). A eliminação completa do vírus é conseguida em alguns pacientes cuidadosamente selecionados.[00496] Currently, chronic hepatitis B is treated with interferons to modulate the immune response. The only approved interferons are interferon-α-2a and interferon-α-2b. Interferons have a variety of properties, including antiviral, immunomodulatory, and antiproliferative effects. They enhance T-cell helper activity, cause B lymphocyte maturation, inhibit T-cell suppressors, and enhance HLA type I expression. To be eligible for interferon therapy, patients must have documented infection for at least six months, elevated liver enzymes (AST and ALT), and an actively dividing virus in the blood (positive HBeAg and/or HBV DNA tests). Patients with acute infection, end-stage cirrhosis, or other significant medical problems should not be treated. Interferon-α produces a prolonged and sustained remission of the disease in 35% of patients with chronic hepatitis B, with normalization of liver enzymes and loss of the three markers of active infection (HBeAg, HBV DNA, and HBsAg). Complete elimination of the virus is achieved in a few carefully selected patients.

[00497] A terapia com interferon para pacientes com cirrose relacionada ao VHB diminui significativamente a taxa de CHC, particularmente em pacientes com uma quantidade maior de DNA de VHB sérico. Em pacientes com cirrose compensada positiva para HBeAg, a remissão virológica e bioquímica após a terapia com interferon está associada à melhora da sobrevida. Em pacientes com infecção crônica por VHB, a depuração de HBeAg após o tratamento com interferon-α está associada a melhores resultados clínicos.[00497] Interferon therapy for patients with HBV-related cirrhosis significantly decreases the rate of HCC, particularly in patients with a higher amount of serum HBV DNA. In patients with HBeAg-positive compensated cirrhosis, virological and biochemical remission after interferon therapy is associated with improved survival. In patients with chronic HBV infection, clearance of HBeAg after interferon-α treatment is associated with improved clinical outcomes.

[00498] O interferon-α (Intron A (interferon-α-2b), Schering Plough, e Roferon, (interferon-α-2a) Roche Labs) é o tratamento primário para hepatite B crônica. A duração padrão da terapia é considerada 16 semanas. Os pacientes que exibem um baixo nível de replicação viral no final do regime padrão beneficiam-se mais do tratamento prolongado.[00498] Interferon-α (Intron A (interferon-α-2b), Schering Plough, and Roferon, (interferon-α-2a) Roche Labs) is the primary treatment for chronic hepatitis B. The standard duration of therapy is considered to be 16 weeks. Patients who exhibit a low level of viral replication at the end of the standard regimen benefit most from prolonged treatment.

[00499] Os análogos de nucleotídeos e nucleosídeos são usados há muito tempo para o tratamento do VHB. Os compostos atualmente disponíveis e em desenvolvimento incluem lamivudina, adefovir, entecavir, telbivudina, tenofovir, entricitabina, clevudina, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, FTC, N-Acetil-Cisteína (NAC), PC1323, theradigm-HBV, timosina alfa, e ganciclovir. Alguns são úteis contra outras infecções virais, por exemplo, VHC, HIV, enquanto outros são eficazes predominantemente no tratamento de VHB.[00499] Nucleotide and nucleoside analogs have long been used for the treatment of HBV. Compounds currently available and in development include lamivudine, adefovir, entecavir, telbivudine, tenofovir, emtricitabine, clevudine, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, FTC, N-Acetyl-Cysteine (NAC), PC1323, theradigm-HBV, thymosin alpha, and ganciclovir. Some are useful against other viral infections, e.g., HCV, HIV, while others are effective predominantly in the treatment of HBV.

[00500] A perda permanente do DNA de VHB e do HBeAg são considerados os objetivos do tratamento antiviral, pois esses resultados estão associados a uma melhora nos danos necroinflamatórios e à redução da infectividade.[00500] Permanent loss of HBV DNA and HBeAg are considered goals of antiviral treatment, as these outcomes are associated with an improvement in necroinflammatory damage and a reduction in infectivity.

B. Hepatite DB. Hepatitis D

[00501] O vírus da hepatite delta (VHD) é um vírus defeituoso, que é apenas infeccioso na presença de infecção ativa pelo VHB. A infecção por VHD ocorre como coinfecção com VHB ou superinfecção de um portador de VHB. Coinfecção geralmente resolve. A superinfecção, no entanto, causa infecção crônica por VHD e hepatite crônica ativa. Ambos os tipos de infecções podem causar hepatite fulminante.[00501] Hepatitis delta virus (HDV) is a defective virus that is only infectious in the presence of active HBV infection. HDV infection occurs as coinfection with HBV or superinfection of an HBV carrier. Coinfection usually resolves. Superinfection, however, causes chronic HDV infection and chronic active hepatitis. Both types of infections can cause fulminant hepatitis.

[00502] As vias de transmissão são semelhantes às do VHB. Prevenir a infecção aguda e crônica pelo VHB de pessoas suscetíveis por vacinação também prevenirá a infecção por VHD. Certos tratamentos de VHB são também eficazes no tratamento de VHD, por exemplo, interferon alfa, com ou sem adefovir. No entanto, outros, como a lamivudina, um inibidor da replicação do DNA de VHB, não são úteis para o tratamento da hepatite D crônica.[00502] The routes of transmission are similar to those of HBV. Preventing acute and chronic HBV infection of susceptible individuals through vaccination will also prevent HDV infection. Certain HBV treatments are also effective in treating HDV, for example, interferon alpha, with or without adefovir. However, others, such as lamivudine, an inhibitor of HBV DNA replication, are not useful for treating chronic hepatitis D.

Tuberculose (TB)Tuberculosis (TB)

[00503] A tuberculose é uma doença causada por Mycobacterium tuberculosis. A tuberculose está associada a sintomas que incluem perda de peso inexplicável, perda de apetite, sudorese noturna, febre, fadiga, tosse por mais de três semanas, hemoptise (tosse com sangue) e dor no peito. Existem dois tipos de testes que são usados para determinar se uma pessoa foi infectada com bactérias da tuberculose: o teste cutâneo da tuberculina e os exames de sangue da TB, que incluem: teste QuantiFERON®-TB Gold InTube (QFT-GIT) e teste T-SPOT®.TB (T-Spot). No entanto, os testes não são indicativos de uma infecção ativa por TB. O diagnóstico da infecção por TB inclui a avaliação do histórico médico, exame físico, radiografia de tórax e ensaio de cultura de microbiologia diagnóstica, incluindo uma análise para resistência a medicamentos. A avaliação de alterações clinicamente relevantes em sinais ou sintomas de TB está dentro da capacidade dos versados na técnica.Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis is associated with symptoms that include unexplained weight loss, loss of appetite, night sweats, fever, fatigue, cough lasting more than three weeks, hemoptysis (coughing up blood), and chest pain. Two types of tests are used to determine whether a person has been infected with tuberculosis bacteria: the tuberculin skin test and TB blood tests, which include the QuantiFERON®-TB Gold InTube (QFT-GIT) test and the T-SPOT®.TB (T-Spot) test. However, these tests are not indicative of an active TB infection. Diagnosis of TB infection includes evaluation of the medical history, physical examination, chest X-ray, and diagnostic microbiology culture assay, including a drug resistance test. Assessment of clinically relevant changes in signs or symptoms of TB is within the capability of those skilled in the art.

D. CâncerD. Cancer

[00504] Câncer refere-se a qualquer uma de várias neoplasias malignas caracterizadas pela proliferação de células anaplásicas que tendem a invadir o tecido circundante e metastatizam para novos sítios do corpo e também se referem à condição patológica caracterizada por tais tumores malignos neoplásicos. Um câncer pode ser um tumor ou malignidade hematológica e inclui, mas não está limitado a todos os tipos de linfomas/leucemias, carcinomas e sarcomas. Em certas modalidades, o câncer inclui câncer hepático. Em certas modalidades, o câncer inclui o carcinoma hepatocelular (CHC).[00504] Cancer refers to any of various malignant neoplasms characterized by the proliferation of anaplastic cells that tend to invade surrounding tissue and metastasize to new sites in the body, and also refers to the pathological condition characterized by such neoplastic malignant tumors. A cancer may be a hematologic tumor or malignancy and includes, but is not limited to, all types of lymphomas/leukemias, carcinomas, and sarcomas. In certain embodiments, cancer includes liver cancer. In certain embodiments, cancer includes hepatocellular carcinoma (HCC).

[00505] Os critérios RECIST são critérios de avaliação clinicamente aceitos usados para prover uma abordagem padrão para a medição de tumores sólidos e proveem definições para avaliação objetiva da mudança no tamanho do tumor para uso em ensaios clínicos. Tais critérios também podem ser usados para monitorar a resposta de um indivíduo em tratamento para um tumor sólido. Os critérios RECIST 1.1 são discutidos em detalhes em Eisenhauer et al., New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45:228-247, 2009, que é incorporado aqui por referência. Os critérios de resposta para lesões alvo incluem:[00505] RECIST criteria are clinically accepted evaluation criteria used to provide a standard approach to measuring solid tumors and provide definitions for objective assessment of change in tumor size for use in clinical trials. Such criteria can also be used to monitor an individual's response to treatment for a solid tumor. RECIST 1.1 criteria are discussed in detail in Eisenhauer et al., New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45:228-247, 2009, which is incorporated herein by reference. Response criteria for target lesions include:

[00506] Resposta completa (CR): Desaparecimento de todas as lesões alvo. Qualquer linfonodo patológico (alvo ou não alvo) deve ter uma redução no eixo curto para <10 mm.[00506] Complete response (CR): Disappearance of all target lesions. Any pathological lymph node (target or non-target) must have a reduction in short axis to <10 mm.

[00507] Resposta parcial (PR): Pelo menos uma diminuição de 30% na soma dos diâmetros da lesão alvo, tomando como referência os diâmetros da soma da linha de base.[00507] Partial Response (PR): At least a 30% decrease in the sum of target lesion diameters, taking baseline sum diameters as a reference.

[00508] Doenças progressivas (PD): Pelo menos um aumento de 20% na soma dos diâmetros das lesões alvo, tomando como referência a menor soma do estudo (isso inclui a soma da linha de base, se for a menor no estudo). Além do aumento relativo de 20%, a soma também deve demonstrar um aumento absoluto de pelo menos 5 mm. (Nota: o aparecimento de uma ou mais novas lesões também é considerado progressão.)[00508] Progressive Disease (PD): At least a 20% increase in the sum of target lesion diameters, taking as a reference the smallest sum in the study (this includes the baseline sum if it is the smallest in the study). In addition to the 20% relative increase, the sum must also demonstrate an absolute increase of at least 5 mm. (Note: The appearance of one or more new lesions is also considered progression.)

[00509] Doença estável (SD): Nem encolhimento suficiente para se qualificar para PR nem aumento suficiente para se qualificar para PD, tomando como referência os menores diâmetros de soma enquanto em estudo.[00509] Stable disease (SD): Neither sufficient shrinkage to qualify for PR nor sufficient enlargement to qualify for PD, taking as reference the smallest soma diameters while on study.

[00510] Os critérios do RECIST 1.1 também consideram lesões não alvo que são definidas como lesões que podem ser mensuráveis, mas não precisam ser medidas, e devem ser avaliadas apenas qualitativamente nos momentos desejados. Os critérios de resposta para lesões não alvo incluem:[00510] RECIST 1.1 criteria also consider non-target lesions, which are defined as lesions that may be measurable but do not need to be measured and should only be assessed qualitatively at desired time points. Response criteria for non-target lesions include:

[00511] Resposta completa (CR): Desaparecimento de todas as lesões não alvo e normalização dos níveis de marcadores tumorais. Todos os linfonodos devem ser de tamanho não patológico (<10 mm de eixo curto).[00511] Complete response (CR): Disappearance of all non-target lesions and normalization of tumor marker levels. All lymph nodes should be of non-pathological size (<10 mm short axis).

[00512] Não CR/Não PD: Persistência de uma ou mais lesões não alvo e/ou manutenção do nível de marcadores tumorais acima dos limites normais.[00512] Non-CR/Non-PD: Persistence of one or more non-target lesions and/or maintenance of tumor marker levels above normal limits.

[00513] Doença progressiva (PD): Progressão inequívoca de lesões não alvo existentes. O aparecimento de uma ou mais novas lesões também é considerado progressão. Para alcançar a “progressão inequívoca” com base na doença não alvo, deve haver um nível geral de agravamento substancial da doença não alvo, de tal modo que, mesmo na presença de SD ou PR na doença alvo, a carga total do tumor aumentou o suficiente para merecer a descontinuação da terapia. Um modesto “aumento” no tamanho de uma ou mais lesões não alvo geralmente não é suficiente para se qualificar para o estado de progressão inequívoca. A designação da progressão geral apenas com base na mudança na doença não alvo em caso de SD ou PR na doença alvo será, portanto, extremamente rara.[00513] Progressive disease (PD): Unequivocal progression of existing non-target lesions. The appearance of one or more new lesions is also considered progression. To achieve “unequivocal progression” based on non-target disease, there must be an overall level of substantial worsening of the non-target disease, such that, even in the presence of SD or PR in the target disease, the total tumor burden has increased sufficiently to warrant discontinuation of therapy. A modest “increase” in the size of one or more non-target lesions is generally not sufficient to qualify for the unequivocal progression status. Designation of overall progression solely based on change in non-target disease in the case of SD or PR in the target disease will therefore be extremely rare.

[00514] Os critérios clinicamente aceitáveis para resposta ao tratamento em leucemias agudas são os seguintes:[00514] Clinically acceptable criteria for response to treatment in acute leukemias are as follows:

[00515] Remissão completa (CR): O paciente deve estar livre de todos os sintomas relacionados à leucemia e ter uma contagem absoluta de neutrófilos de >1,0 x 109/L, contagem de plaquetas >100 x 109/L, e medula óssea normal com <5% de blastos e sem bastonetes de Auer.[00515] Complete remission (CR): The patient must be free of all leukemia-related symptoms and have an absolute neutrophil count of >1.0 x 109/L, platelet count >100 x 109/L, and normal bone marrow with <5% blasts and no Auer rods.

[00516] Remissão completa com recuperação incompleta da contagem sanguínea (Cri): De acordo com CE, mas com trombocitopenia residual (contagem de plaquetas <100 x 109/L) ou neutropenia residual (contagem absoluta de neutrófilos <1,0 x 109/L).[00516] Complete remission with incomplete blood count recovery (Cri): As per CE, but with residual thrombocytopenia (platelet count <100 x 109/L) or residual neutropenia (absolute neutrophil count <1.0 x 109/L).

[00517] Remissão parcial (PR): Diminuição de >50% nos blastos de medula óssea para 5 a 25% de células anormais na medula; ou CR com <5% de blastos se os bastonetes de Auer estiverem presentes.[00517] Partial remission (PR): Decrease of >50% in bone marrow blasts to 5 to 25% abnormal cells in the marrow; or CR with <5% blasts if Auer rods are present.

[00518] Falha no tratamento: O tratamento não conseguiu alcançar CR, Cri ou PR. Recorrência.[00518] Treatment failure: Treatment failed to achieve CR, Cri, or PR. Recurrence.

[00519] Recidiva após CR confirmada: Reaparecimento de blastos leucêmicos em sangue periférico ou > 5% de blastos na medula óssea não atribuíveis a qualquer outra causa (por exemplo, regeneração da medula óssea após terapia consolidada) ou aparecimento de novas alterações displásicas.[00519] Relapse after confirmed CR: Reappearance of leukemic blasts in peripheral blood or > 5% blasts in bone marrow not attributable to any other cause (e.g., bone marrow regeneration after consolidation therapy) or appearance of new dysplastic changes.

[00520] Os usos das composições e métodos da invenção incluem a obtenção de pelo menos doença estável em um indivíduo com um tumor sólido durante tempo suficiente para satisfazer a definição de doença estável pelos critérios RECIST. Em certas modalidades, o uso das composições e métodos da invenção incluem a obtenção de pelo menos uma resposta parcial em um indivíduo com um tumor sólido durante tempo suficiente para satisfazer a definição de doença estável pelos critérios RECIST.[00520] Uses of the compositions and methods of the invention include achieving at least stable disease in a subject with a solid tumor for a time sufficient to meet the definition of stable disease by RECIST criteria. In certain embodiments, uses of the compositions and methods of the invention include achieving at least a partial response in a subject with a solid tumor for a time sufficient to meet the definition of stable disease by RECIST criteria.

[00521] Os usos das composições e métodos da invenção incluem a obtenção de pelo menos uma remissão parcial em um indivíduo com leucemia aguda durante tempo suficiente para satisfazer a definição de doença estável pelos critérios RECIST. Em certas modalidades, o uso das composições e métodos da invenção incluem a obtenção de pelo menos uma remissão completa com recuperação de contagem sanguínea incompleta em um indivíduo com leucemia aguda durante tempo suficiente para satisfazer a definição de doença estável pelos critérios RECIST.[00521] Uses of the compositions and methods of the invention include achieving at least a partial remission in a subject with acute leukemia for a time sufficient to meet the definition of stable disease by RECIST criteria. In certain embodiments, uses of the compositions and methods of the invention include achieving at least a complete remission with incomplete blood count recovery in a subject with acute leukemia for a time sufficient to meet the definition of stable disease by RECIST criteria.

[00522] Esta invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitativos. Todo o conteúdo de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido, bem como a Listagem de Sequências, são aqui incorporados por referência.[00522] This invention is further illustrated by the following examples which are not to be construed as limiting. The entire contents of all references, patents and published patent applications cited throughout this application, as well as the Sequence Listing, are incorporated herein by reference.

EXEMPLOSEXAMPLES Exemplo 1. Síntese de iRNAExample 1. iRNA Synthesis Fonte de reagentesSource of reagents

[00523] Quando a fonte de um reagente não é especificamente dada aqui, tal reagente pode ser obtido a partir de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular com um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular.[00523] When the source of a reagent is not specifically given here, such reagent may be obtained from any supplier of molecular biology reagents with a quality/purity standard for molecular biology application.

TranscritosTranscripts Projeto de siRNAsiRNA Project

[00524] Um conjunto de siRNAs que alvejam o PD-L1 humano/CD274 (humano: NCBI refseqID NM_001267706; NCBI GeneID: 29126; SEQ ID NO:1), bem como ortólogos de PD-L1 de espécies toxicológicas (camundongo: XM_006527249 (SEQ ID NO:3); rato, XM_006231248 (SEQ ID NO:5); e macaco cinomolgo: XM_005581779 (SEQ ID NO: 7)) foram projetados usando scripts R e Python personalizados. O mRNA REFSEQ PD-L1 humano tem um comprimento de 3349 bases. A lógica e o método para o conjunto de projetos de siRNA é o seguinte: a eficácia prevista para cada potencial siRNA de 19 meros da posição 109 até a posição 3349 (a região de codificação e 3’ UTR) foi determinada com um modelo linear derivado da medida direta de knockdown de mRNA de mais de 20.000 projetos distintos de siRNA que alvejam um grande número de genes de vertebrados. Subconjuntos de siRNAs de PD-L1 foram projetados com combinações perfeitas ou quase perfeitas entre o macaco humano e o cinomolgo. Um outro subconjunto foi projetado com combinações perfeitas ou quase perfeitas para ortólogos de PD-L1 de camundongo e rato. Um outro subconjunto foi projetado com correspondências perfeitas ou quase perfeitas aos ortólogos de PD-L1 de macaco, macaco cinomolgo, camundongo e rato. Para cada cadeia do siRNA, um script Python personalizado foi usado em uma pesquisa de força bruta para medir o número e as posições de incompatibilidades entre o siRNA e todos os alinhamentos potenciais no transcriptoma das espécies alvo. Foi dado peso extra a incompatibilidades na região da semente, aqui definidas como as posições 2-9 do oligonucleotídeo antissentido, bem como o sítio de clivagem do siRNA, aqui definido como as posições 10-11 do oligonucleotídeo antissentido. O peso relativo das incompatibilidades foi de 2,8;1,2:1 para incompatibilidades de sementes, sítio de clivagem e outras posições através da posição antissentido 19. Incompatibilidades na primeira posição foram ignoradas. Um escore de especificidade foi calculado para cada cadeia somando o valor de cada incompatibilidade ponderada. Foi dada preferência aos siRNAs cujo escore antissentido no macaco humano e cinomolgo foi >= 3,0 e a eficácia prevista foi >= 70% de knockdown do transcrito de PD-L1.[00524] A set of siRNAs targeting human PD-L1/CD274 (human: NCBI refseqID NM_001267706; NCBI GeneID: 29126; SEQ ID NO:1) as well as PD-L1 orthologs from toxicological species (mouse: XM_006527249 (SEQ ID NO:3); rat, XM_006231248 (SEQ ID NO:5); and cynomolgus monkey: XM_005581779 (SEQ ID NO:7)) were designed using custom R and Python scripts. The human PD-L1 mRNA REFSEQ has a length of 3349 bases. The rationale and method for the siRNA design set is as follows: the predicted efficacy for each potential 19-mer siRNA from position 109 to position 3349 (the coding region and 3' UTR) was determined with a linear model derived from direct measurement of mRNA knockdown of over 20,000 distinct siRNA designs targeting a large number of vertebrate genes. Subsets of PD-L1 siRNAs were designed with perfect or near-perfect matches between human and cynomolgus macaque. Another subset was designed with perfect or near-perfect matches to mouse and rat PD-L1 orthologs. Another subset was designed with perfect or near-perfect matches to macaque, cynomolgus macaque, mouse, and rat PD-L1 orthologs. For each siRNA strand, a custom Python script was used in a brute-force search to measure the number and positions of mismatches between the siRNA and all potential alignments in the target species transcriptome. Extra weight was given to mismatches in the seed region, here defined as positions 2–9 of the antisense oligonucleotide, as well as the siRNA cleavage site, here defined as positions 10–11 of the antisense oligonucleotide. The relative weight of mismatches was 2.8:1.2:1 for seed, cleavage site, and other positions through antisense position 19. Mismatches in the first position were ignored. A specificity score was calculated for each strand by summing the value of each weighted mismatch. Preference was given to siRNAs whose antisense score in human and cynomolgus macaque was >= 3.0 and predicted efficacy was >= 70% PD-L1 transcript knockdown.

[00525] Uma lista detalhada das sequências de cadeia sentido e antissentido PD-L1 não modificadas é mostrada na Tabela 3. Uma lista detalhada das sequências de cadeia sentido e antissentido PD-L1 modificadas é mostrada na Tabela 5.[00525] A detailed list of the unmodified PD-L1 sense and antisense chain sequences is shown in Table 3. A detailed list of the modified PD-L1 sense and antisense chain sequences is shown in Table 5.

Síntese de siRNAsiRNA synthesis

[00526] Sequências de siRNA de PD-L1 foram sintetizadas em escala de 1 μmol em um sintetizador Mermade 192 (BioAutomation) usando química de fosforamidita mediada por suporte sólido. O suporte sólido foi controlado por vidro poroso (500 A) carregado com ligante GalNAc personalizado ou suporte sólido universal (bioquímico AM). Os reagentes de síntese auxiliar, RNA 2’-F e 2’-O-Metila e desoxi fosforamiditas foram obtidos de Thermo-Fisher® (Milwaukee, WI) e Hongene (China). 2’F 2’-O- Metila, GNA (ácidos nucleicos glicol), 5’ fosfato e outras modificações são introduzidas usando as fosforamiditas correspondentes. A síntese de cadeias simples conjugadas com GalNAc 3’ foi realizada em um suporte de CPG modificado com GalNAc. O suporte sólido universal CPG personalizado foi usado para a síntese de cadeias simples antissentido. O tempo de acoplamento para todos as fosforamiditas (100 mM em acetonitrila) é de 5 min utilizando 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT) como ativador (0,6 M em acetonitrila). Ligações de fosforotioato foram geradas usando uma solução 50 mM de 3- ((dimetilamino-metilideno)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona (DDTT, obtida de Chemgenes® (Wilmington, MA, EUA)) em acetonitrila anidra/piridina (1:1 v/v). O tempo de oxidação foi de 3 minutos. Todas as sequências foram sintetizadas com a remoção final do grupo DMT (“DMT off”).[00526] PD-L1 siRNA sequences were synthesized at 1 μmol scale on a Mermade 192 synthesizer (BioAutomation) using solid support-mediated phosphoramidite chemistry. The solid support was controlled by porous glass (500 A) loaded with custom GalNAc linker or universal solid support (Biochemical AM). The auxiliary synthesis reagents, RNA 2'-F and 2'-O-Methyl and deoxy phosphoramidites were obtained from Thermo-Fisher® (Milwaukee, WI) and Hongene (China). 2'F 2'-O-Methyl, GNA (glycol nucleic acids), 5' phosphate, and other modifications are introduced using the corresponding phosphoramidites. Synthesis of GalNAc 3'-conjugated single strands was performed on a GalNAc-modified CPG support. The custom CPG universal solid support was used for the synthesis of antisense single strands. The coupling time for all phosphoramidites (100 mM in acetonitrile) is 5 min using 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT) as activator (0.6 M in acetonitrile). Phosphorothioate linkages were generated using a 50 mM solution of 3-((dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazole-3-thione (DDTT, obtained from Chemgenes® (Wilmington, MA, USA)) in anhydrous acetonitrile/pyridine (1:1 v/v). The oxidation time was 3 min. All sequences were synthesized with the final removal of the DMT group (“DMT off”).

[00527] Após a conclusão da síntese em fase sólida, os oligorribonucleotídeos foram clivados do suporte sólido e desprotegidos em placas de 96 poços profundos vedados usando 200 μL de reagentes de Metilamina Aquosa a 60°C durante 20 minutos. Para sequências contendo resíduos de ribo 2' (2'-OH) que são protegidos com um grupo terc- butildimetilsilila (TBDMS), é realizada uma segunda etapa de desproteção usando o reagente TEA.3HF (trietilamina tri-hidrofluoreto). À solução de desproteção de metilamina, foram adicionados 200 de dimetilsulfóxido (DMSO) e 300ul de reagente TEA.3HF e a solução foi incubada durante mais 20 min a 60°C. No final da etapa de clivagem e desproteção, a placa de síntese foi deixada atingir a temperatura ambiente e é precipitada pela adição de 1 mL de mistura de acetonitrila:etanol (9:1). As placas são resfriadas a - 80°C durante 2 horas, o sobrenadante foi cuidadosamente decantado com o auxílio de uma pipeta multicanal. O glóbulo de oligonucleotídeo foi ressuspenso em tampão NaOAc 20 mM e é dessalinizado usando uma coluna de exclusão de tamanho HiTrap® de 5 mL (GE Healthcare) em um sistema purificador AKTA equipado com um autoamostrador A905 e um coletor de frações Frac 950. Amostras dessalinizadas são coletadas em placas de 96 poços. As amostras de cada sequência foram analisadas por LC-MS para confirmar a identidade, UV (260 nm) para a quantificação e um conjunto selecionado de amostras por cromatografia em IEX para determinar a pureza.[00527] Upon completion of solid-phase synthesis, oligoribonucleotides were cleaved from the solid support and deprotected in sealed 96-deep-well plates using 200 μL of Aqueous Methylamine reagents at 60°C for 20 minutes. For sequences containing 2'-ribo residues (2'-OH) that are protected with a tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) group, a second deprotection step is performed using TEA.3HF (triethylamine trihydrofluoride) reagent. To the methylamine deprotection solution, 200 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO) and 300 μL of TEA.3HF reagent were added, and the solution was incubated for an additional 20 min at 60°C. At the end of the cleavage and deprotection step, the synthesis plate was allowed to reach room temperature and precipitated by the addition of 1 mL of acetonitrile:ethanol (9:1) mixture. The plates were cooled to -80°C for 2 hours, and the supernatant was carefully decanted using a multichannel pipette. The oligonucleotide pellet was resuspended in 20 mM NaOAc buffer and desalted using a 5 mL HiTrap® size exclusion column (GE Healthcare) in an AKTA purification system equipped with an A905 autosampler and a Frac 950 fraction collector. Desalted samples were collected in 96-well plates. Samples of each sequence were analyzed by LC-MS to confirm identity, UV (260 nm) for quantification, and a selected set of samples by IEX chromatography to determine purity.

[00528] O enovelamento das cadeias simples de PD-L1 foi realizado em um robô de manipulação de líquidos Tecan®. Mistura equimolar de cadeias simples sentido e antissentido foram combinadas e enoveladas em placas de 96 poços. Depois de combinar as cadeias simples complementares, a placa de 96 poços foi vedada firmemente e aquecida em um forno a 100°C durante 10 minutos e deixada chegar lentamente à temperatura ambiente durante um período de 2 a 3 horas. A concentração de cada duplex foi normalizada para 10 uM em PBS 1X.[00528] Folding of PD-L1 single chains was performed on a Tecan® liquid handling robot. Equimolar mixtures of sense and antisense single chains were combined and folded into 96-well plates. After combining the complementary single chains, the 96-well plate was tightly sealed and heated in an oven at 100°C for 10 minutes and allowed to slowly come to room temperature over a period of 2 to 3 hours. The concentration of each duplex was normalized to 10 uM in 1X PBS.

Exemplo 2 - Triagem IN VITRO:Example 2 - IN VITRO Screening: Cultura celular e plasmídeos/transfecções para ensaio Dual-Glo®:Cell culture and plasmids/transfections for Dual-Glo® assay:

[00529] Células Cos7 (ATCC®, Manassas, VA) foram cultivadas até quase confluência a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 em DMEM (ATCC®) suplementado com 10% de FBS, antes de serem liberadas da placa por tripsinização. A sequência de referência CD274 humana completa (NM_001267706.1) foi clonada no vetor de luciferase dupla psiCHECK2TM usando três construções com inserções de aproximadamente 750bp, 1,4 kb, e 1,4 kb de comprimento (SEQ ID NOs: 11-13). Os plasmídeos de luciferase dupla foram cotransfectados com siRNA em 15x103células usando LipofectamineTM2000 (InvitrogenTM, Carlsbad CA. cat # 11668-019). Para cada poço de uma placa de 96 poços, adicionou-se 0,2 ul de LipofectamineTM a 10 ng de vetor plasmídico e siRNA em 14,8 ul de Opti-MEM® e deixou-se aquecer à temperatura ambiente durante 15 minutos. A mistura foi então adicionada às células ressuspensas em 80 μL de meio completo fresco. As células foram incubadas durante 48 horas antes de a luciferase ser medida. Experimentos de dose única foram realizados a 10nM e 0,1nM de concentração de duplex final.[00529] Cos7 cells (ATCC®, Manassas, VA) were grown to near confluence at 37°C in a 5% CO2 atmosphere in DMEM (ATCC®) supplemented with 10% FBS, before being released from the plate by trypsinization. The full-length human CD274 reference sequence (NM_001267706.1) was cloned into the psiCHECK2™ dual-luciferase vector using three constructs with inserts approximately 750bp, 1.4 kb, and 1.4 kb in length (SEQ ID NOs: 11-13). The dual-luciferase plasmids were cotransfected with siRNA into 15x103 cells using Lipofectamine™2000 (Invitrogen™, Carlsbad CA. cat # 11668-019). For each well of a 96-well plate, 0.2 μl of Lipofectamine™ was added to 10 ng of plasmid vector and siRNA in 14.8 μl of Opti-MEM® and allowed to warm to room temperature for 15 min. The mixture was then added to cells resuspended in 80 μL of fresh complete medium. Cells were incubated for 48 h before luciferase was measured. Single-dose experiments were performed at 10 nM and 0.1 nM final duplex concentrations.

Ensaio Dual-Glo® LuciferaseDual-Glo® Luciferase Assay

[00530] 48 horas após os siRNAs terem sido transfectados, mediu-se Firefly (controle de transfecção) e Renilla (fundida com a sequência alvo de PD-L1 em 3' UTR). Primeiro, o meio foi removido das células. Em seguida, a atividade de Firefly luciferase foi medida adicionando 75 ul de Reagente de Luciferase Dual-Glo® igual ao volume do meio de cultura em cada poço e misturando. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da medição da luminescência (500 nm) nem um Spectramax® (Molecular Devices®) para detectar o sinal da Firefly luciferase. A atividade da Renilla luciferase foi medida adicionando 75 ul do Reagente Dual-Glo® Stop & Glo® em temperatura ambiente a cada poço e as placas foram incubadas durante 10 a 15 minutos antes de a luminescência ser novamente medida para determinar o sinal da Renilla luciferase. O reagente Dual-Glo® Stop & Glo® resfria bruscamente o sinal da firefly luciferase e a luminescência prolongada para a reação da Renilla luciferase. A atividade do siRNA foi determinada pela normalização do sinal Renilla (PD-L1) para o sinal Firefly (controle) dentro de cada poço. A magnitude da atividade de siRNA foi então avaliada em relação às células que foram transfectadas com o mesmo vetor, mas não foram tratadas com siRNA ou foram tratadas com um siRNA não alvejante. Todas as transfecções foram realizadas em triplicado. Cultura celular e transfecções para qPCR:[00530] 48 hours after the siRNAs were transfected, Firefly (transfection control) and Renilla (fused to the PD-L1 target sequence in 3' UTR) were measured. First, the medium was removed from the cells. Then, Firefly luciferase activity was measured by adding 75 ul of Dual-Glo® Luciferase Reagent equal to the volume of culture medium to each well and mixing. The mixture was incubated at room temperature for 30 minutes before measuring luminescence (500 nm) on a Spectramax® (Molecular Devices®) to detect the Firefly luciferase signal. Renilla luciferase activity was measured by adding 75 μl of Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent at room temperature to each well, and the plates were incubated for 10 to 15 minutes before luminescence was remeasured to determine the Renilla luciferase signal. Dual-Glo® Stop & Glo® reagent quenches the Firefly luciferase signal and prolonged luminescence for the Renilla luciferase reaction. siRNA activity was determined by normalizing the Renilla (PD-L1) signal to the Firefly (control) signal within each well. The magnitude of siRNA activity was then assessed relative to cells that were transfected with the same vector but were not treated with siRNA or were treated with a non-targeting siRNA. All transfections were performed in triplicate. Cell culture and transfections for qPCR:

[00531] Células de carcinoma do cólon humano RKO (ATCC®, Manassas, VA) foram cultivadas até quase confluência a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 em EMEM (ATCC®) suplementado com 10% de FBS, antes de serem liberadas da placa por tripsinização.[00531] RKO human colon carcinoma cells (ATCC®, Manassas, VA) were grown to near confluence at 37°C in an atmosphere of 5% CO2 in EMEM (ATCC®) supplemented with 10% FBS, before being released from the plate by trypsinization.

[00532] As células foram transfectadas adicionando 4,9 μl de Opti- MEM mais 0,1 μl de LipofectamineTM RNAiMax por poço (InvitrogenTM, Carlsbad CA. cat # 13778-150) a 5 μl de duplexes de siRNA por poço em uma placa de 384 poços e incubadas à temperatura ambiente por 15 minutos. 40 μl de DMEM contendo ~5 x103células foram então adicionadas à mistura de siRNA. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação de RNA. Experimentos de dose única foram realizados a 10nM e 0,1nM de concentração de duplex final. Isolamento total de RNA usando Kit de isolamento de mRNA DYNABEADS®:[00532] Cells were transfected by adding 4.9 μl of Opti-MEM plus 0.1 μl of Lipofectamine™ RNAiMax per well (Invitrogen™, Carlsbad CA. cat # 13778-150) to 5 μl of siRNA duplexes per well in a 384-well plate and incubated at room temperature for 15 minutes. 40 μl of DMEM containing ~5 x103 cells was then added to the siRNA mixture. Cells were incubated for 24 hours prior to RNA purification. Single-dose experiments were performed at 10nM and 0.1nM final duplex concentration. Total RNA isolation using DYNABEADS® mRNA Isolation Kit:

[00533] O RNA foi isolado usando um protocolo automatizado em uma plataforma BioTek-EL406 usando DYNABEADs® (InvitrogenTM, cat#61012). Resumidamente, 50 μl de tampão de lise/aglutinação e 25 μl de tampão de lise contendo 3 μl de esferas magnéticas foram adicionados à placa com células. As placas foram incubadas em um agitador eletromagnético durante 10 minutos à temperatura ambiente e depois as esferas magnéticas foram capturadas e o sobrenadante foi removido. RNA ligado a esferas foi então lavado 2 vezes com 150 μl de tampão de lavagem A e uma vez com tampão de lavagem B. As esferas foram então lavadas com 150 uL de Tampão de eluição, recapturadas e o sobrenadante removido. Síntese de cDNA usando kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade ABITM(Applied Biosystems®, Foster City, CA, Cat #4368813):[00533] RNA was isolated using an automated protocol on a BioTek-EL406 platform using DYNABEADs® (Invitrogen™, cat#61012). Briefly, 50 μL of lysis/agglutination buffer and 25 μL of lysis buffer containing 3 μL of magnetic beads were added to the plate with cells. The plates were incubated on an electromagnetic shaker for 10 minutes at room temperature and then the magnetic beads were captured and the supernatant was removed. RNA bound to beads was then washed twice with 150 μL of wash buffer A and once with wash buffer B. The beads were then washed with 150 uL of Elution Buffer, recaptured and the supernatant removed. cDNA synthesis using ABI™ High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®, Foster City, CA, Cat #4368813):

[00534] Dez μl de uma mistura principal contendo 1 μl de tampão 10X, 0,4 μl de dNTPs 25X, 1 μl de iniciadores aleatórios de 10x, 0,5 μl de transcriptase reversa, 0,5 μl de inibidor de RNase e 6,6 μl de H2O por reação foram adicionados ao RNA isolado acima. As placas foram vedadas, misturadas e incubadas em um agitador eletromagnético por 10 minutos em temperatura ambiente, seguidas por 2h a 37°C. As placas foram então incubadas a 81°C por 5 min. PCR em tempo real:[00534] Ten μl of a master mix containing 1 μl of 10X buffer, 0.4 μl of 25X dNTPs, 1 μl of 10x random primers, 0.5 μl of reverse transcriptase, 0.5 μl of RNase inhibitor, and 6.6 μl of H2O per reaction was added to the RNA isolated above. The plates were sealed, mixed, and incubated on an electromagnetic shaker for 10 min at room temperature, followed by 2 h at 37°C. The plates were then incubated at 81°C for 5 min. Real-time PCR:

[00535] Dois μl de cDNA foram adicionados a uma mistura principal contendo 0,5 μl de sonda GAPDH TaqMan® (Hs99999905), 0,5 μl de sonda CD274 (Hs01125301_m1, CD274) e 5μl de mistura principal de sonda Lightcycler® 480 (Roche Cat # 04887301001) por poço em uma placa de 384 poços (Roche cat # 04887301001). A PCR em tempo real foi realizada em um sistema de PCR em tempo real LightCycler®480 (Roche), usando o ensaio ΔΔCt(RQ). Cada duplex foi testado em quatro transfecções independentes.[00535] Two μl of cDNA was added to a master mix containing 0.5 μl of GAPDH TaqMan® probe (Hs99999905), 0.5 μl of CD274 probe (Hs01125301_m1, CD274) and 5μl of Lightcycler® 480 probe master mix (Roche Cat# 04887301001) per well in a 384-well plate (Roche cat# 04887301001). Real-time PCR was performed in a LightCycler®480 Real-Time PCR System (Roche), using the ΔΔCt(RQ) assay. Each duplex was tested in four independent transfections.

[00536] Para calcular a variação relativa, os dados em tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizados para ensaios realizados com células transfectadas com 10 nM de AD-1955, ou células simuladamente transfectadas. Tabela 2. Abreviações de monômeros de nucleotídeos usados na representação da sequência de ácidos nucleicos. Será entendido que estes monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, estão mutuamente ligados por ligações de 5'-3'-fosfodiéster. Tabela 3. Sequências de cadeia sentido e antissentido não modificadas de dsRNAs de PD-L1 Tabela 4. Dados de CD274 Dual-Glo® Luciferase e qPCR[00536] To calculate relative fold change, real-time data were analyzed using the ΔΔCt method and normalized to assays performed with cells transfected with 10 nM AD-1955, or mock-transfected cells. Table 2. Abbreviations of nucleotide monomers used in the representation of nucleic acid sequence. It will be understood that these monomers, when present in an oligonucleotide, are mutually linked by 5'-3'-phosphodiester bonds. Table 3. Unmodified sense and antisense strand sequences of PD-L1 dsRNAs Table 4. CD274 Dual-Glo® Luciferase and qPCR data

[00537] Os dados são expressos como a porcentagem de mensagens restantes em relação ao controle sem alvejamento. Tabela 5. Sequências modificadas de PD-L1 [00537] Data is expressed as the percentage of messages remaining relative to the non-bleached control. Table 5. Modified PD-L1 sequences

EQUIVALENTESEQUIVALENTS

[00538] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando apenas uma experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades e métodos específicos aqui descritos. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pelo escopo das reivindicações a seguir.[00538] Those skilled in the art will recognize, or be able to verify using only routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments and methods described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the scope of the following claims.

Claims (17)

1. Agente de ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsRNAi) para inibir a expressão do 1 ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1), caracterizadopelo fato de que as sequências de nucleotídeos das cadeias sentido e antissentido consistem nas cadeias sentido e antissentido das sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em a) 5’-ACCUGCAUUAAUUUAAUAAAA-3’ da SEQ ID NO:116 e 5’-UUUUAUUAAAUUAAUGCAGGUAC-3’ da SEQ ID NO:117; b) 5’-UACCUGCAUUAAUUUAAUAAA-3’ da SEQ ID NO:110 e 5’-UUUAUUAAAUUAAUGCAGGUACA-3’ da SEQ ID NO:111; c) 5’-CACACUGAGAAUCAACACAAA-3’ da SEQ ID NO:36 e 5’-UUUGUGUUGAUUCUCAGUGUGCUs-3’ da SEQ ID NO:37; d) 5’-UACACAUUUGGAGGAGACGUA-3’ da SEQ ID NO:40 e 5’-UACGUCUCCUCCAAAUGUGUAUC-3’ da SEQ ID NO:41; e) 5’-ACACAUUUGGAGGAGACGUAA-3’ da SEQ ID NO:46 e 5’-UUACGUCUCCUCCAAAUGUGUAU-3’ da SEQ ID NO:47; f) 5’-CACAUUUGGAGGAGACGUAAU-3’ da SEQ ID NO:52 e 5’-AUUACGUCUCCUCCAAAUGUGUA-3’ da SEQ ID NO:53; g) 5’-UUCCUAUUUAUUUUGAGUCUA-3’ da SEQ ID NO:62 e 5’-UAGACUCAAAAUAAAUAGGAAAA-3’ da SEQ ID NO:63; h) 5’-UCCUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3’ da SEQ ID NO:68 e 5’-ACAGACUCAAAAUAAAUAGGAAA-3’ da SEQ ID NO:69; i) 5’-UCCUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3’ da SEQ ID NO:70 e 5’-ACAGACUCAAAAUAAAUAGGAAA-3’ da SEQ ID NO:71; j) 5’-AUUGUAGUAGAUGUUACAAUU-3’ da SEQ ID NO:74 e 5’-AAUUGUAACAUCUACUACAAUAU-3’ da SEQ ID NO:75; k) 5’-AAGCAUAAAGAUCAAACCGUU-3’ da SEQ ID NO:78 e 5’-AACGGUUUGAUCUUUAUGCUUCC-3’ da SEQ ID NO:79; l) 5’-AGGAAGCAAACAGAUUAAGUA-3’ da SEQ ID NO:82 e 5’-UACUUAAUCUGUUUGCUUCCUCA-3’ da SEQ ID NO:83; m) 5’-UGAUUCAAAAUUCAAAAGAUA-3’ da SEQ ID NO:86 e 5’-UAUCUUUUGAAUUUUGAAUCAUG-3’ da SEQ ID NO:87; n) 5’-UCUAAAGAUAGUCUACAUUUA-3’ da SEQ ID NO:88 e 5’-UAAAUGUAGACUAUCUUUAGAAG-3’ da SEQ ID NO:89; o) 5’-GGAAAUGUAUGUUAAAAGCAA-3’ da SEQ ID NO:90 e 5’-UUGCUUUUAACAUACAUUUCCAA-3’ da SEQ ID NO:91; p) 5’-UGUUUUCUGCUUUCUGUCAAA-3’ da SEQ ID NO:92 e 5’-UUUGACAGAAAGCAGAAAACAAA-3’ da SEQ ID NO:93; q) 5’-UUUCUGUCAAGUAUAAACUUA-3’ da SEQ ID NO:94 e 5’-UAAGUUUAUACUUGACAGAAAGC-3’ da SEQ ID NO:95; r) 5’-UUCUGUCAAGUAUAAACUUCA-3’ da SEQ ID NO:96 e 5’-UGAAGUUUAUACUUGACAGAAAG-3’ da SEQ ID NO:97; s) 5’-UCCCUUUUGUCUCAUGUUUCA-3’ da SEQ ID NO:104 e 5’-UGAAACAUGAGACAAAAGGGAUA-3’ da SEQ ID NO:105; and t) 5’-CUGCAUUUGAUUGUCACUUUU-3’ da SEQ ID NO:106 and 5’-AAAAGUGACAAUCAAAUGCAGAA-3’ da SEQ ID NO:107, em que um ou mais dos nucleotídeos da referida cadeia sentido e um ou mais dos nucleotídeos da referida cadeia antissentido compreendem modificações nucleotídicas, e em que a referida cadeia sentido é conjugada a um derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc) ligado ao terminal 3'.1. A double-stranded ribonucleic acid (dsRNAi) agent for inhibiting the expression of programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1), wherein the nucleotide sequences of the sense and antisense strands consist of the sense and antisense strands of nucleotide sequences selected from the group consisting of a) 5′-ACCUGCAUUAAUUUAAUAAAA-3′ of SEQ ID NO:116 and 5′-UUUUAUUAAAUUAAUGCAGGUAC-3′ of SEQ ID NO:117; b) 5′-UACCUGCAUUAAUUUAAUAAA-3′ of SEQ ID NO:110 and 5′-UUUAUUAAUUAAUGCAGGUACA-3′ of SEQ ID NO:111; c) 5'-CACACUGAGAAUCAACACAAA-3' of SEQ ID NO:36 and 5'-UUUGUGUUGAUUCUCAGUGUGCUs-3' of SEQ ID NO:37; d) 5'-UACACAUUUGGAGGAGACGUA-3' of SEQ ID NO:40 and 5'-UACGUCUCCUCCAAAUGUGUAUC-3' of SEQ ID NO:41; e) 5'-ACACAUUUGGAGGAGACGUAA-3' of SEQ ID NO:46 and 5'-UUACGUCUCCUCCAAAUGUGUAU-3' of SEQ ID NO:47; f) 5'-CACAUUUGGAGGAGACGUAAU-3' of SEQ ID NO:52 and 5'-AUUACGUCUCCUCCAAAUGUGUA-3' of SEQ ID NO:53; g) 5'-UUCCUAUUUAUUUUGAGUCUA-3' of SEQ ID NO:62 and 5'-UAGACUCAAAAUAAAUAGGAAAA-3' of SEQ ID NO:63; h) 5'-UCCUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3' of SEQ ID NO:68 and 5'-ACAGACUCAAAAUAAAUAGGAAA-3' of SEQ ID NO:69; i) 5'-UCCUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3' of SEQ ID NO:70 and 5'-ACAGACUCAAAAUAAAUAGGAAA-3' of SEQ ID NO:71; j) 5'-AUUGUAGUAGAUGUUACAAUU-3' of SEQ ID NO:74 and 5'-AAUUGUAACAUCUACUACAAUAU-3' of SEQ ID NO:75; k) 5'-AAGCAUAAAGAUCAAACCGUU-3' of SEQ ID NO:78 and 5'-AACGGUUUGAUCUUUAUGCUUCC-3' of SEQ ID NO:79; l) 5'-AGGAAGCAAACAGAUUAAGUA-3' of SEQ ID NO:82 and 5'-UACUUAAUCUGUUUGCUUCCUCA-3' of SEQ ID NO:83; m) 5’-UGAUUCAAAAUUCAAAAGAUA-3’ of SEQ ID NO:86 and 5’-UAUCUUUUGAAUUUUGAAUCAUG-3’ of SEQ ID NO:87; n) 5'-UCUAAAGAUAGUCUACAUUUA-3' of SEQ ID NO:88 and 5'-UAAAUGUAGACUAUCUUUAGAAG-3' of SEQ ID NO:89; o) 5’-GGAAAUGUAUGUUAAAAGCAA-3’ of SEQ ID NO:90 and 5’-UUGCUUUUAACAUACAUUUCCAA-3’ of SEQ ID NO:91; p) 5'-UGUUUUCUGCUUUCUGUCAAA-3' of SEQ ID NO:92 and 5'-UUUGACAGAAAGCAGAAAACAAA-3' of SEQ ID NO:93; q) 5'-UUUCUGUCAAGUAUAAACUUA-3' of SEQ ID NO:94 and 5'-UAAGUUUAUACUUGACAGAAAGC-3' of SEQ ID NO:95; r) 5'-UUCUGUCAAGUAUAAACUUCA-3' of SEQ ID NO:96 and 5'-UGAAGUUUAUACUUGACAGAAAG-3' of SEQ ID NO:97; s) 5’-UCCCUUUUGUCUCAUGUUUCA-3’ of SEQ ID NO:104 and 5’-UGAAACAUGAGACAAAAGGGUA-3’ of SEQ ID NO:105; and t) 5’-CUGCAUUUGAUUGUCACUUUU-3’ of SEQ ID NO:106 and 5’-AAAAGUGACAAUCAAAUGCAGAA-3’ of SEQ ID NO:107, wherein one or more of the nucleotides of said sense strand and one or more of the nucleotides of said antisense strand comprise nucleotide modifications, and wherein said sense strand is conjugated to an N-acetylgalactosamine (GalNAc) derivative attached to the 3’ terminus. 2. Agente de dsRNAi de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ditas modificações nucleotídicas é selecionada do grupo que consiste em desoxinucleotídeo, um nucleotídeo de desoxitimina (dT) de terminal 3', um nucleotídeo modificado com 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro, um nucleotídeo modificado com 2'-desoxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo conformacionalmente restrito, um nucleotídeo de etila limitado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado com 2’- amino, um nucleotídeo modificado com 2’-O-alila, um nucleotídeo modificado com 2’-C-alquila, um nucleotídeo modificado com 2’-hidroxila, um nucleotídeo modificado com 2’-metoxietila, um nucleotídeo modificado com 2’-O-alquila, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, uma base não natural compreendendo nucleotídeo, um nucleotídeo modificado com tetra-hidropirano, um nucleotídeo modificado com 1,5-anidro-hexitol, um nucleotídeo modificado com ciclo-hexenila, um nucleotídeo que compreende um grupo fosforotioato, um nucleotídeo que compreende um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo que compreende um 5’-fosfato e um nucleotídeo que compreende um imitador de 5’-fosfato.2. The dsRNAi agent of claim 1, wherein at least one of said nucleotide modifications is selected from the group consisting of a deoxynucleotide, a 3'-terminal deoxythymine (dT) nucleotide, a 2'-O-methyl-modified nucleotide, a 2'-fluoro-modified nucleotide, a 2'-deoxy-modified nucleotide, a locked nucleotide, an unlocked nucleotide, a conformationally restricted nucleotide, an ethyl-constrained nucleotide, an abasic nucleotide, a 2'-amino-modified nucleotide, a 2'-O-allyl-modified nucleotide, a 2'-C-alkyl-modified nucleotide, a 2'-hydroxyl-modified nucleotide, a 2'-methoxyethyl-modified nucleotide, a 2'-methyl ... 2'-O-alkyl, a morpholino nucleotide, a phosphoramidate, an unnatural base comprising nucleotide, a tetrahydropyran-modified nucleotide, a 1,5-anhydrohexitol-modified nucleotide, a cyclohexenyl-modified nucleotide, a nucleotide comprising a phosphorothioate group, a nucleotide comprising a methylphosphonate group, a nucleotide comprising a 5'-phosphate, and a nucleotide comprising a 5'-phosphate mimic. 3. Agente de dsRNAi de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o derivado de GalNac é 3. The dsRNAi agent of claim 1 or 2, wherein the GalNac derivative is 4. Agente de dsRNAi de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o agente de dsRNAi é conjugado ao derivado de GalNac conforme mostrado no seguinte diagrama esquemático em que X é O ou S.4. The dsRNAi agent of any one of claims 1 to 3, wherein the dsRNAi agent is conjugated to the GalNac derivative as shown in the following schematic diagram where X is either O or S. 5. Agente de dsRNAi de caracterizado pelo fato de que X é O.5. dsRNAi agent characterized by the fact that X is O. 6. Agente de RNAi de reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- ACCUGCAUUAAUUUAAUAAAA -3' da SEQ ID NO:116 e a cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- UUUUAUUAAAUUAAUGCAGGUAC -3' da SEQ ID NO:117; ou (b) a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- UACCUGCAUUAAUUUAAUAAA -3' da SEQ ID NO:110 e a dita cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- UUUAUUAAAUUAAUGCAGGUACA -3' da SEQ ID NO:111.6. The RNAi agent of claim 1, wherein: (a) the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'-ACCUGCAUUAAUUUAAUAAAA -3' of SEQ ID NO:116 and the antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'-UUUUAUUAAAUUAAUGCAGGUAC -3' of SEQ ID NO:117; or (b) the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'-UACCUGCAUUAAUUUAAUAAA -3' of SEQ ID NO:110 and said antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'-UUUAUUAAAUUAAUGCAGGUACA -3' of SEQ ID NO:111. 7. Agente de RNAi de fita dupla de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- ascscugcAfuUfAfAfuuuaauaaaaL96 -3' da SEQ ID NO:218 e a cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- usUfsuuaUfuAfAfauuaAfuGfcaggusasc -3' da SEQ ID NO:219; (b) a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- ascscugcAfuUfAfAfuuuaauaaaaL96 -3' da SEQ ID NO:220 e a dita cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- UfsUfsuuaUfuAfAfauuaAfuGfcaggusasc -3' da SEQ ID NO:221; (c) a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- usasccugCfaUfUfAfauuuaauaaaL96 -3' da SEQ ID NO:212 e a dita cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- usUfsuauUfaAfAfuuaaUfgCfagguascsa -3' da SEQ ID NO:213; ou (d) a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- usasccugCfaUfUfAfauuuaauaaaL96 -3' da SEQ ID NO:214 e a dita cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- UfsUfsuauUfaAfAfuuaaUfgCfagguascsa -3' da SEQ ID NO:215; em que a, c, g, e u são 2'-O-metil (2'-OMe) A, 2'-OMe C, 2'- OMe G, e 2'-OMe U, respectivamente; Af, Cf, Gf, e Uf são 2'-fluoro A, 2'- fluoro C, 2'-fluoro G, e 2'-fluoro U, respectivamente; s é uma ligação fosforotioato; e em que a extremidade 3' da fita sentido é conjugada ao derivado GalNAc, conforme mostrado no esquema a seguir em que X é O.7. The double-stranded RNAi agent of claim 1, wherein: (a) the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'- ascscugcAfuUfAfAfuuuaauaaaaL96 -3' of SEQ ID NO:218 and the antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'- usUfsuuaUfuAfAfauuaAfuGfcaggusasc -3' of SEQ ID NO:219; (b) the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'- ascscugcAfuUfAfAfuuuaauaaaaL96 -3' of SEQ ID NO:220 and said antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'- UfsUfsuuaUfuAfAfauuaAfuGfcaggusasc -3' of SEQ ID NO:221; (c) the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'- usasccugCfaUfUfAfauuuaauaaaL96 -3' of SEQ ID NO:212 and said antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'- usUfsuauUfaAfAfuuaaUfgCfagguascsa -3' of SEQ ID NO:213; or (d) the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'-usasccugCfaUfUfAfauuuaauaaaL96 -3' of SEQ ID NO:214 and said antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'-UfsUfsuauUfaAfAfuuaaUfgCfagguascsa -3' of SEQ ID NO:215; wherein a, c, g, and u are 2'-O-methyl (2'-OMe) A, 2'-OMe C, 2'-OMe G, and 2'-OMe U, respectively; Af, Cf, Gf, and Uf are 2'-fluoro A, 2'-fluoro C, 2'-fluoro G, and 2'-fluoro U, respectively; s is a phosphorothioate linkage; and in which the 3' end of the sense strand is conjugated to the GalNAc derivative, as shown in the following scheme where X is O. 8. Agente de dsRNAi de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- UCCUAUUUAUUUUGAGUCUGU -3' da SEQ ID NO:68 e a cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- ACAGACUCAAAAUAAAUAGGAAA -3' da SEQ ID NO:69.8. The dsRNAi agent of claim 1, wherein the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'-UCCUAUUUAUUUUGAGUCUGU -3' of SEQ ID NO:68 and the antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'-ACAGACUCAAAUAAAUAGGAAA -3' of SEQ ID NO:69. 9. Agente de dsRNAi de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a cadeia sentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- uscscuauUfuAfUfUfuugagucuguL96 -3' na SEQ ID NO:170 e a cadeia antissentido consiste na sequência de nucleotídeos 5'- asCfsagaCfuCfAfaaauAfaAfuaggasasa -3' da SEQ ID NO:171; em que a, c, g, e u são 2'-O-metil (2'-OMe) A, 2'-OMe C, 2'- OMe G, e 2'-OMe U, respectivamente; Af, Cf, Gf, e Uf são 2'-fluoro A, 2'- fluoro C, 2'-fluoro G, e 2'-fluoro U, respectivamente; s é uma ligação fosforotioato; e em que a extremidade 3' da fita sentido é conjugada ao derivado GalNAc, conforme mostrado no esquema a seguir em que X é O.9. The dsRNAi agent of claim 1, wherein: the sense strand consists of the nucleotide sequence 5'-uscscuauUfuAfUfUfuugagucuguL96 -3' in SEQ ID NO:170 and the antisense strand consists of the nucleotide sequence 5'-asCfsagaCfuCfAfaaauAfaAfuaggasasa -3' of SEQ ID NO:171; wherein a, c, g, and u are 2'-O-methyl (2'-OMe) A, 2'-OMe C, 2'-OMe G, and 2'-OMe U, respectively; Af, Cf, Gf, and Uf are 2'-fluoro A, 2'-fluoro C, 2'-fluoro G, and 2'-fluoro U, respectively; s is a phosphorothioate linkage; and in which the 3' end of the sense strand is conjugated to the GalNAc derivative, as shown in the following scheme where X is O. 10. Composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene PD-L1, caracterizada pelo fato de que compreende o agente de dsRNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e uma solução não tamponada.10. Pharmaceutical composition for inhibiting the expression of a PD-L1 gene, characterized in that it comprises the dsRNAi agent as defined in any one of claims 1 to 9, and a non-buffered solution. 11. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende o agente de dsRNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e uma formulação lipídica.11. Pharmaceutical composition, characterized by the fact that it comprises the dsRNAi agent as defined in any one of claims 1 to 9, and a lipid formulation. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizadapelo fato de que a formulação lipídica compreende um LNP.12. Pharmaceutical composition according to claim 11, characterized in that the lipid formulation comprises an LNP. 13. Método para inibir a expressão de PD-L1 em uma célula IN vitro, o método caracterizadopelo fato de que compreende: colocar a célula em contato com o agente de dsRNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, inibindo assim a expressão do gene PD-L1 na célula.13. A method for inhibiting the expression of PD-L1 in a cell in vitro, the method comprising: contacting the cell with the dsRNAi agent as defined in any one of claims 1 to 9 or a pharmaceutical composition as defined in any one of claims 10 to 12, thereby inhibiting the expression of the PD-L1 gene in the cell. 14. Uso de um agente de dsRNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizadopelo fato de ser na manufatura de um medicamento para uso em um método de tratamento de uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da redução na expressão de PD- L1.14. Use of a dsRNAi agent as defined in any one of claims 1 to 9 or a pharmaceutical composition as defined in any one of claims 10 to 12, characterized in that it is in the manufacture of a medicament for use in a method of treating a disease or disorder that would benefit from the reduction in the expression of PD-L1. 15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença associada ao PD-L1.15. Use according to claim 14, characterized in that the disease or disorder is a disease associated with PD-L1. 16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a doença associada ao PD-L1 é uma infecção viral.16. Use according to claim 15, characterized in that the disease associated with PD-L1 is a viral infection. 17. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a doença associada ao PD-L1 é uma infecção pelo vírus da hepatite.17. Use according to claim 15, characterized in that the disease associated with PD-L1 is a hepatitis virus infection.
BR122025013274-8A 2015-09-02 2016-08-22 DOUBLE-CHAIN RIBONUCLEIC ACID AGENT, CELL, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHOD FOR INHIBITING PD-L1 EXPRESSION IN A CELL, AND, USE OF AN RNAI AGENT BR122025013274A2 (en)

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