BR122024025180A2 - Anticorpos contra interleucina-22, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, composição farmacêutica e uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere à ligação de anticorpos à IL22 e inibir a sua interação com um ou mais de seus ligantes naturais. Exemplos específicos de tais anticorpos são providos. Os usos terapêuticos dos anticorpos e métodos de gerar tais também são providos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a anticorpos anti-IL22. Tais anticorpos aqui providos são úteis no tratamento de inflamação de pele, em particular, de dermatite atópica.

FUNDAMENTOS

[0002] A dermatite atópica (AD), também conhecida como eczema atópico, é uma condição inflamatória que resulta na disfunção e espessamento da epiderme, lesões eczematosas e prurido. A condição é predominante em pessoas de todas as idades e etnias e tem a maior carga de doença de todas as doenças de pele medida pelos anos de vida ajustados por incapacidade (Laughter et al, Br. J. Dermatol. 2020; Epub ahead of print). AD é uma condição complexa e a sua fisiopatologia é influenciada por múltiplos fatores, tais como fatores genéticos, ambientais e imunológicos. Embora mecanismos imunológicos tipo 2 sejam importantes na patologia de dermatite atópica, evidência crescente sustenta um papel para diversos caminhos imunológicos.

[0003] Os tratamentos usados para AD incluem imunossupressores sistêmicos tais como ciclosporina, metotrexato, micofenolato mofetila e azatioprina. Antidepressivos e naltrexona podem ser usados para controlar prurido. Em 2016, crisaborol, um inibidor da fosfodiesterase-4 tópico, foi aprovado para eczema de brando para moderado, e em 2017, dupilumab, um antagonista de anticorpo monoclonal de IL-4Rα foi aprovado para tratar eczema de moderado a severo. As opções de tratamento correntes, entretanto, oferecem apenas alívio temporário, incompleto, sintomático.

[0004] IL22 é um membro da família da citocina IL10 com funções múltiplas em várias respostas inflamatórias e teciduais, dependendo do contexto ambiental. IL22 é principalmente produzida pelas células linfóides tais como células T auxiliares 1 (Th1), células Th17 e células Th22, células T Yδ, células Matadoras Naturais (NK) e células linfóides inatas (ILCs) 3 assim como células não linfóides tais como fibroblastos, neutrófilos, macrófagos e mastóides (Para uma vista geral ver: Lanfranca MP, et al J. Mol. Med. (Berl) (2016) 94(5): 523-534). Os sinais de IL22 através de um complexo receptor de transmembrana heterodimérico composto de receptor 1 de IL22 (IL22R1, também conhecido como IL22RA1 ou como subunidade alfa-1 do receptor de Interleucina 22) e receptor 2 de IL-10 (IL10R2), enquanto IL-10 sinaliza através de IL10R1 e IL-10R2. Similar a outros membros da família IL-10, IL22 medeia seus efeitos através do complexo IL22R1/IL-10R2 e os caminhos de sinalização subsequentes de transdutor de sinal JAK e ativador de transcrição (STAT), incluindo Jak1, Tyk2 e STAT3. Ao contrário de IL-10, IL22 também é relatada sinalizar através de vários dos caminhos de MAPK tais como ERK1/2, JNK e p38. Na pele, IL22 atua sobre queratinócitos através da ligação à IL22R1 expressa nestas células.

[0005] Diferente de outros membros da família da citocina IL10, IL22 tem um receptor secretado solúvel, conhecida como proteína de ligação de IL22 (IL22BP, também conhecida como IL22RA2, ou como Interleucina-22 Subunidade de Receptor Alfa 2). Embora IL22BP compartilhe a homologia estrutural mais alta com a cadeia de IL22R1, IL22BP exibe uma afinidade muito mais alta para IL22 do que IL22R1 e, portanto, impede a ligação de IL22 a IL22R1.

[0006] Foi mostrado que IL22BP, que é específico para IL22, bloqueia a sua atividade. A inibição de IL22 total tem mostrado sinais eficazes em pacientes com dermatite atópica severa ou em pacientes com alta expressão de IL22 de linha de base (Guttman-Yassky E et al. J Am Acad Dermatol. 2018; 78(5): 872-881 e Brunner PM et al, J Allergy Cin Immunol. 2019; 143(1): 142-154). A inibição da IL22R1 também foi proposta como uma opção terapêutica potencial para inibir IL22 que também parcialmente bloquearia o efeito de IL-20 e IL-24. Até agora, nenhuma opção terapêutica existe que é projetado para alvejar especificamente IL22 biologicamente ativa que não é ligado a IL22BP, assim não impactando na função biológica normal de IL22BP.

[0007] A expressão aumentada de citocina Th22 IL22 é uma verificação característica na dermatite atópica (AD). Entretanto, o papel específico de IL22 na patogênese de AD in vivo não é completamente entendido. O papel de IL22 no desenvolvimento e manutenção de AD não foi especificamente explorado mas foi levantada a hipótese de que a IL22 desempenhasse um papel importante no desenvolvimento de AD pelo comprometimento da função de barreira da pele, desregulagem imunológica e prurido.

[0008] A US8906375 e US7901684 descrevem anticorpos ligando IL22 e a utilidade de tais anticorpos no tratamento de AD. US7737259 descreve anticorpos específicos anti-IL22 úteis no tratamento de psoríase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção trata da necessidade para novos tratamentos da dermatite atópica pela provisão de anticorpos anti-IL22 com as propriedades funcionais e estruturais como aqui descritas.

[0010] A presente invenção provê um anticorpo isolado que liga a interleucina humana 22 (IL22), em que o anticorpo é capaz de inibir ou atenuar a ligação de IL22 ao receptor 1 de IL22 (IL22R1) e proteína de ligação de IL22 (IL22RA2).

[0011] A presente invenção também provê um anticorpo isolado que liga IL22 humana que é definido por um conjunto de sequências de CDR específicas e/ou sequências da região variável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A presente invenção é descrita abaixo pela referência aos seguintes desenhos, nas quais:

[0013] A Figura 1 mostra a humanização da cadeia leve de anticorpo 11041. As variantes geradas para estas cadeias também são mostradas. As sequências de CDR estão sublinhadas.

[0014] A Figura 2 mostra a humanização da cadeia pesada de anticorpo 11041. As variantes geradas para esta cadeia também são mostradas. As sequências de CDR são sublinhadas.

[0015] A Figura 3A mostra a humanização da cadeia leve de anticorpo 11070. As variantes para esta cadeia também são mostradas. As sequências de CDR são sublinhadas. A Figura 3B mostra a humanização da cadeia pesada de anticorpo 11070. As variantes geradas para esta cadeia também são mostradas. As sequências de CDR estão sublinhadas.

[0016] A Figura 4 mostra o mapa de cobertura de peptídeo IL22 do experimento HDX-MS.

[0017] A Figura 5 mostra os resultados da análise de HDX-MS para 11041gL13gH14 Fab. (A) peptídeos mostrando incorporação de deutério reduzida significante na ligação de anticorpo são listados. Os peptídeos mostrando um padrão de troca similar na presença e ausência do anticorpo têm uma incorporação de deutério não significante e são exibidos em cinza claro. (B) o epítopo Fab Fab 11041gL13gH14determinado é projetado sobre a estrutura 3D de IL22 e destacado em preto. A ligação de Fab 11041gL13gH14 relativa à IL22 a partir dos dados de raio X é exibida por referência.

[0018] A Figura 6 mostra os resultados de análise HDX-MS para Fab 11070gL7gH16. (A) peptídeos mostrando incorporação de deutério reduzido significante na ligação de anticorpo são listados. Os peptídeos mostrando um padrão de troca similar na presença e ausência do anticorpo têm uma incorporação de deutério não significante e são exibidos em cinza claro. (B) o epítopo Fab 11070gL7gH16 determinado é projetado sobre a estrutura 3D de IL22 e destacado em preto.

[0019] A Figura 7 mostra os resultados de análise de raio X da ligação de Fab 11041gL13gH14 à IL22. (A) representação em desenho da ligação de Fab 11041gL13gH14 à IL-22. (B) uma vista detalhada sobre a interface de interação entre IL-22 e de Fab 11041gL13gH14.

[0020] A Figura 8 mostra que a molécula de Fab 11041gL13gH14 impede a interação de IL22 com o receptor de IL22R1 (A) IL-22 (representação de superfície) em complexo com o seu receptor IL22R1 (PDB: 3DLQ). (B) A cadeia leve da cadeia leve de Fab 11041gL13gH14 bloqueia o sítio de interação entre IL22 e IL22R1.

[0021] A Figura 9 mostra em (A) estrutura Cryo-EM de IL-22 no complexo com Fezaquinumabe e Fab 11070gL7gH16 (VR11070) no formato Fab; e em (B) Modelo de IL-22 no complexo com Fezaquinumabe e Fab 11041 (VR11041). O modelo foi criado pela sobreposição a estrutura cristalina de IL-22/Fab 11041gL13gH14 na estrutura cryo-EM no painel (A). Isto revela que Fab 11070gL7gH16 e Fab 11041gL13gH14 têm um epítopo similar na IL-22.

[0022] A Figura 10 mostra em (A) sobreposição da estrutura cristalina de IL- 22R1 ligado à IL-22, na estrutura cryo-EM de IL-22 em complexo com Fab 11070gL7gH16 e Fab Fezaquinumabe; e em (B) As cadeias laterais de resíduos de IL-22 conhecidas contribuir para a interação com IL-10R2 são mostradas como bastões. Este sítio é ocupada pela molécula de Fab Fezaquinumabe.

[0023] A Figura 11 mostra a atividade de Fab 11041gL13gH14 (VR11041) no ensaio de queratinócitos primários humanos in vitro. (A) Exemplo de resposta S100A7 no ensaio. Doador lote#438Z014, Média geométrica n = 3/6, Estimulação: IL-22 a 100 ng/ml, Fab Fezaquinumabe e Fab 11041gL13gH14 a 50 nM; (B) A inibição percentual de S100A7 pelo Fab 11041gL13gH14 no ensaio. Média ± SD, n = 2 doadores, Estimulação: IL-22 a 100 ng/ml, Estatística: log(inibidor) vs. resposta (três parâmetros).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0024] Abreviações Tabela 1. Abreviações usadas por todo o relatório descritivo Tabela 2. Abreviações de aminoácidos

Definições

[0025] Os seguintes termos são usados por todo o relatório descritivo.

[0026] O termo “armação de aceitador humano” é aqui usado é uma armação compreendendo a sequência de aminoácido de uma armação de domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma armação de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivadas a partir de uma armação de imunoglobulina humana ou uma armação de consenso humana. Uma armação de aceitador humano derivada a partir de uma armação de imunoglobulina humana ou uma armação de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácido das mesmas ou a mesma pode conter mudanças de sequência de aminoácido.

[0027] O termo “afinidade” se refere à força de todas as interações não covalente entre um anticorpo do mesmo e a proteína alvo. A menos que de outro modo indicado, como aqui usado, o termo “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula para seu parceiro de ligação pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida pelos métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos.

[0028] O termo “afinidade maturada” no contexto de anticorpo se refere a um anticorpo com uma ou mais alterações nas regiões hipervariáveis, comparado a um anticorpo precursor que não possui tais alterações, onde tais alterações resultam em uma melhora na afinidade do anticorpo para o antígeno.

[0029] O termo “anticorpo” aqui é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não limitados a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos contato que eles exibam a atividade de ligação a antígeno desejada. O termo anticorpo como aqui usado se refere a anticorpos inteiros (comprimento completo) (isto é, compreendendo os elementos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves) e fragmentos funcionalmente ativos dos mesmos (isto é, moléculas que contenham um domínio de ligação a antígeno que especificamente ligue um antígeno, também chamados de fragmentos de anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno). Os traços aqui descritos com respeito aos anticorpos também se aplicam aos fragmentos de anticorpo a menos que o contexto dite de outro modo. Um anticorpo pode compreender um Fab ligado a dois scFvs ou dsscFvs, cada scFv ou dsscFv ligando o mesmo ou um alvo diferente (por exemplo, um scFv ou dsscFv ligando um alvo terapêutico e um scFv ou dsscFv que aumenta a meia-vida pela ligação, por exemplo, de albumina). Tais anticorpos são descritos na WO2015/197772. O termo “anticorpo” abrange monovalente, isto é, anticorpos compreendendo apenas um domínio de ligação a antígeno (por exemplo anticorpos de um só braço compreendendo uma cadeia pesada de comprimento completo e uma cadeia leve de comprimento completo interconectados, também chamados de “meio-anticorpo”) e anticorpos multivalentes, isto é, anticorpos compreendendo mais do que um domínio de ligação a antígeno, por exemplo bivalente.

[0030] O termo “anticorpo ligando ao mesmo epítopo como um anticorpo de referência” se refere a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais e ao contrário, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.

[0031] O termo “Citotoxicidade celular dependente de anticorpo” ou “ADCC” é um mecanismo para induzir a morte celular que depende da interação de células alvos revestidas com anticorpo com células efetoras possuindo atividade lítica, tal como células matadoras naturais, monócitos, macrófagos e neutrófilos via receptores Fc gama (FCYR) expressos nas células efetoras.

[0032] O termo “fragmento de ligação a antígeno” como aqui utilizado se refere a fragmentos de ligação que ligam anticorpo funcionalmente ativo incluindo, mas não limitados a Fab, Fab modificado, Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, anticorpos de domínio único, scFv, Fv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos acima (ver por exemplo Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Um “fragmento de ligação” como aqui utilizado se refere a um fragmento capaz de ligar um peptídeo ou antígeno alvo com afinidade suficiente para caracterizar o fragmento como específico para o peptídeo ou antígeno.

[0033] O termo “variante de anticorpo” se refere a um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo possuindo as características desejadas aqui descritas e compreendendo um VH e/ou um VL que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido com um VH e/ou um VL do anticorpo de referência. Tais variantes de anticorpo incluem, por exemplo, anticorpos em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados ao ou deletado do domínio VH e/ou um VL. Ordinariamente, uma variante de anticorpo terá pelo menos cerca de 80% de sequência de identidade de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido, a um anticorpo aqui descrito. Opcionalmente, anticorpos variantes não terão mais do que uma substituição de aminoácido conservativa quando comparados com uma sequência de anticorpo aqui provida, alternativamente não mais do que cerca de qualquer um de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácido conservativas quando comparada a uma sequência de anticorpo aqui provida. Em modalidades, uma “variante de anticorpo” se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um VH e/ou um VL em que as regiões não CDR do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido, com um anticorpo aqui descrito.

[0034] O termo “domínio de ligação a antígeno” como aqui utilizado se refere a uma porção do anticorpo, que compreende uma parte ou o todo de um ou mais domínios variáveis, por exemplo uma parte ou o todo de um par de domínios variáveis VH e VL, que interagem especificamente com o antígeno alvo. No contexto da presente invenção o termo é usado em relação a três antígenos diferentes: IL13, IL22 e albumina. Consequentemente, tais domínios de ligação a antígeno são aludidos como “domínio de ligação à IL13”, “domínio de ligação à IL22” e “domínio de ligação à albumina”. Um domínio de ligação pode compreender um anticorpo de domínio único. Cada domínio de ligação pode ser monovalente. Cada domínio de ligação pode compreender não mais do que um VH e um VL.

[0035] O termo “biespecífico” ou “anticorpo biespecífico” como aqui utilizado se refere a um anticorpo com duas especificidades de antígeno.

[0036] O termo “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs” se refere geralmente, a anticorpos compreendendo seis CDRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). As CDRs do domínio variável de cadeia pesada estão localizados nos resíduos 31 a 35 (CDR-H1), resíduos 50 a 65 (CDR-H2) e resíduos 95 a 102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Entretanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), a alça equivalente à CDR-H1 se estende do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim, a menos que indicado de outro modo “CDR-H1” como aqui utilizada é intencionada a se referir aos resíduos 26 a 35, como descrito por uma combinação do sistema de numeração de Kabat e definição de alça topológica de Chothia. As CDRs do domínio variável de cadeia leve estão localizadas nos resíduos 24 a 34 (CDR-L1), resíduos 50 a 56 (CDR-L2) e resíduos 89 a 97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. A menos que indicado de outro modo, os resíduos de CDR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são aqui numerados de acordo com Kabat.

[0037] O termo anticorpo “quimérico” se refere a um anticorpo no qual o domínio variável (ou pelo menos uma porção do mesmo) da cadeia pesada e/ou leve é derivado de a partir uma fonte ou espécie particular, enquanto o resto da cadeia pesada e/ou leve (isto é, os domínios constantes) é derivado a partir de uma fonte ou espécie diferente. (Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)). Os anticorpos quiméricos podem por exemplo compreender domínios variáveis não humanos e domínios constantes humanos. Os anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinante. Uma subcategoria de “anticorpos quiméricos” é de “anticorpos humanizados”.

[0038] A “classe” de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuído pela sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e diversos destes podem ser adicionalmente dividido em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas de α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.

[0039] O termo “citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” se refere a um mecanismo para induzir a morte de célula na qual um domínio efetor de Fc de um anticorpo ligado ao alvo se liga e ativa o componente de complemento C1q que por sua vez ativa a cascata de complemento levando à morte da célula alvo.

[0040] Os termos “domínio(s) constante(s)” ou “região constante”, como aqui usado são intercambiavelmente usados para se referir ao(s) domínio(s) de um anticorpo que esteja fora das regiões variáveis. Os domínios constantes são idênticos em todos os anticorpos do mesmo isótipo, mas são diferentes de um isótipo para um outro. Tipicamente, a região constante de uma cadeia pesada é formada, do terminal N para o C, pela CH1-dobradiça -CH2-CH3-opcionalmente CH4, compreendendo três ou quatro domínios constantes.

[0041] O termo “anticorpo competidor” ou “anticorpo competidor cruzado” deve ser interpretado como significando que o anticorpo reivindicado se liga (i) na mesma posição no antígeno ao qual o anticorpo de referência se liga ou (ii) uma posição no antígeno onde o anticorpo estericamente impede a ligação do anticorpo de referência ao antígeno.

[0042] O termo “Derivados” como aqui usado é intencionado a incluir derivados reativos, por exemplo grupos reativos seletivos em tiol tais como maleimidas e semelhantes. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligador ao polímero. Será avaliado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos formam parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

[0043] O termo “derivado de” no contexto de gerar sequências variáveis se refere ao fato de que a sequência utilizada ou uma sequência altamente similar à sequência utilizada foi obtido a partir do material genético original, tal como a cadeia leve ou pesada de um anticorpo.

[0044] O termo “diacorpo” como aqui utilizado se refere a dois pares Fv, um primeiro par VH/VL e um par VH/VL adicional que têm dois ligadores inter-Fv, tal que o VH de um primeiro Fv é ligado ao VL do segundo Fv e o VL do primeiro Fv é ligado ao VH do segundo Fv.

[0045] O termo “DiFab” como aqui utilizado se refere a duas moléculas Fab ligadas via seu terminal C das cadeias pesadas.

[0046] O termo “DiFab’” como aqui utilizado se refere a duas moléculas Fab’ ligadas via uma ou mais ligações de dissulfeto na região de dobradiça das mesmas.

[0047] O termo “dsscFv” ou “fragmento variável de cadeia única estabilizada com dissulfeto” como aqui utilizado se refere a um fragmento variável de cadeia única que é estabilizado por um ligador de peptídeo entre o domínio variável VH e VL e também inclui uma ligação de dissulfeto interdomínio entre VH e VL. (ver por exemplo, Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012, WO2007109254.

[0048] O termo “DVD-Ig” (também conhecida como IgG de domínio V dual) se refere a um anticorpo de comprimento completo com 4 domínios variáveis adicionais, um no terminal de terminal N de cada cadeia pesada e cada leve.

[0049] O termo “funções efetoras” se refere àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isótipo de anticorpo. Os exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação de Clq e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infrarregulagem de receptores de superfície celular (por exemplo receptor de célula B) e ativação de célula B.

[0050] O termo “molécula efetora” como aqui usado inclui, por exemplo, agentes antineoplásticos, fármacos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéticos ou que ocorrem naturalmente, ácidos nucléicos e fragmentos dos mesmos por exemplo DNA, RNA e fragmentos dos mesmos, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórteres tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados pela espectroscopia de RMN ou RSE.

[0051] O termo “epítopo” ou “sítio de ligação” no contexto de anticorpos se referem a um sítio (ou uma parte) em um antígeno ao qual o parátopo de um anticorpo se liga ou reconhece. Os epítopos podem ser formados tanto a partir dos aminoácidos contíguos (também frequentemente chamados “epítopos lineares”) ou aminoácidos não contíguos formados pela dobra terciária de uma proteína (frequentemente chamado “epítopos conformacionais”). Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição para desnaturar solventes ao passo que os epítopos formados pela dobra são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3 e mais usualmente, pelo menos 5 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os epítopos usualmente consistem em grupos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais 3D e carga específicas.

[0052] O “índice EU” ou “índice EU como em Kabat” ou “esquema de numeração EU” se refere à numeração do anticorpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85). Tal é geralmente usado quando se referindo a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de anticorpo (por exemplo, como relatado em Kabat et al.). A menos que de outro modo estabelecido, o esquema de numeração EU é usado para se referir aos resíduos nas regiões constantes de cadeia pesada de anticorpo aqui descritos.

[0053] O termo “Fab” como aqui usado se refere a um fragmento de anticorpo compreendendo um fragmento de cadeia leve compreendendo um domínio VL (leve variável) e um domínio constante de uma cadeia leve (CL) e um domínio VH (pesado variável) e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Dímeros de um Fab’ de acordo com a presente descrição criam um F(ab’)2 onde, por exemplo, a dimerização pode ser através da dobradiça.

[0054] O termo “Fab’-Fv” como aqui utilizado é similar ao FabFv, em que a porção Fab é substituída por um Fab’. O formato pode ser provido como uma versão PEGuilada dos mesmos.

[0055] O termo “Fab’-scFv” como aqui utilizado é uma molécula Fab’ com um scFv anexado no terminal C da cadeia leve ou pesada.

[0056] O termo “Fab-dsFv” como aqui utilizado se refere a um FabFv em que uma ligação de dissulfeto intra-Fv estabiliza as regiões variáveis de terminal C anexas. O formato pode ser provido como uma versão PEGuilada do mesmo.

[0057] O termo “Fab-Fv” como aqui utilizado se refere a um fragmento Fab com uma região variável anexada ao terminal C de cada um dos seguintes, a CH1 da cadeia pesada e CL da cadeia leve. O formato pode ser provido como uma versão PEGuilada do mesmo.

[0058] O termo “Fab-scFv” como aqui utilizado é uma molécula Fab com um scFv anexado no terminal C da cadeia leve ou pesada.

[0059] O termo “Fc”, “fragmento Fc” e “região Fc” são usados intercambiavelmente para se referir à região de terminal C de um anticorpo compreendendo a região constante de um anticorpo excluindo o domínio de imunoglobulina da primeira região constante. Assim, Fc se refere aos dois últimos domínios constantes, CH2 e CH3, de IgA, IgD e IgG ou os últimos três domínios constantes de IgE e IgM e o terminal N da dobradiça flexível para estes domínios. A região Fc de cadeia pesada de IgG1 humana é aqui definida compreender os resíduos C226 para o seu terminal carboxila, em que a numeração é de acordo com o índice EU. No contexto de IgG1 humana, a dobradiça inferior se refere às posições 226 a 236, o domínio CH2 se refere às posições 237 a 340 e o domínio CH3 se refere às posições 341 a 447 de acordo com o índice EU. A região Fc correspondente de outras imunoglobulinas pode ser identificada pelos alinhamentos de sequência.

[0060] O termo “Armação” ou “FR” se refere a resíduos de domínio variável outros que não os resíduos da região hipervariável. A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[0061] O termo “anticorpo de comprimento completo” aqui usado se refere a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contém uma região Fc como aqui definido. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH) constituída de três domínios constantes CH1, CH2 e CH3 ou quatro domínios constantes CH1, CH2, CH3 e CH4, dependendo da classe Ig. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0062] O termo “Fv” se refere a dois domínios variáveis de anticorpos de comprimento completo, por exemplo domínios variáveis cooperativos, tais como um par cognato ou domínios variáveis mutados com afinidade, isto é, um par VH e VL.

[0063] O termo “altamente similar” como utilizado no contexto de sequências de aminoácido é intencionado a se referir a uma sequência de aminoácido que no seu comprimento completo é 95% similar ou mais, tal como 96, 97, 98 ou 99% similar.

[0064] O termo “anticorpo humano” se refere a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências codificadoras de anticorpo humano. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação a antígeno não humanos.

[0065] O termo “armação de consenso humana” se refere a uma armação que representa os resíduos de aminoácido que ocorrem mais habitualmente em uma seleção de sequências de armação VL ou VH da imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH da imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1 a 3. Em algumas modalidades, para a VL, o subgrupo é o subgrupo capa I como em Kabat et al., supra. Em algumas modalidades, para a VH, o subgrupo é o subgrupo III como em Kabat et al. Em algumas modalidades, para a VH, o subgrupo é o subgrupo IV como em Kabat et al.

[0066] O termo anticorpo “humanizado” se refere a um anticorpo compreendendo os resíduos de aminoácido de HVRs não humanas e resíduos de aminoácido de FRs humanas. Tipicamente as cadeias pesadas e/ou leves contêm uma ou mais CDRs (incluindo, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) a partir de um anticorpo doador (por exemplo um anticorpo não humano tal como um anticorpo monoclonal de murino ou coelho) e é enxertado dentro de uma armação da região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (um anticorpo humano) (ver por exemplo Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). A vantagem de tais anticorpos humanizados é reduzir a imunogenicidade para os seres humanos, enquanto retêm a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Ao invés da CDR inteira ser transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinantes de especificidade de qualquer uma das CDRs descritas aqui acima podem ser transferidos para a armação de anticorpo humano (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Um anticorpo “humanizado” se refere a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácido de HVRs não humanas e resíduos de aminoácido de FRs humanas. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que passou pela humanização.

[0067] O termo “região hipervariável” ou “HVR” como aqui usado se refere a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contêm os resíduos que contatam antígeno (“contatos de antígeno”).

[0068] O termo” IC50” como aqui usado se refere à concentração inibidora meia máxima que é uma medida da eficácia de uma substância, tal como um anticorpo, em inibir uma função biológica ou bioquímica específica. A IC50 é uma medida quantitativa que indica quanto de uma substância particular é necessária para inibir um dado processo biológico em 50%.

[0069] A “identidade” entre aminoácidos na sequência indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências.

[0070] O termo “IgG-scFv” como aqui utilizado é um anticorpo de comprimento completo com um scFv no terminal C de cada uma das cadeias pesadas ou cada uma das cadeias leves.

[0071] O termo “IgG-V” como aqui utilizado é um anticorpo de comprimento completo com um domínio variável no terminal C de cada uma das cadeias pesadas ou cada uma das cadeias leves.

[0072] O termo “isolado” significa, por todo este relatório descritivo, que o anticorpo ou polinucleotídeo, como o caso pode ser, existem em um meio físico distinto daquele no qual o mesmo pode ocorrer na natureza. O termo ácido nucleico “isolado” se refere a uma molécula de ácido nucleico que foi isolada do seu ambiente natural ou que foi sinteticamente criado. Um ácido nucleico isolado pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido pelo processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos.

[0073] O termo “designações de resíduo de Kabat” ou “Kabat” se refere ao esquema de numeração de resíduo habitualmente usado para anticorpos. Tal nem sempre corresponde diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais do que na numeração de Kabat estrita correspondendo a um encurtamento de ou inserção dentro de, um componente estrutural, seja de armação ou região determinante de complementaridade (CDR), da estrutura variável de domínio básico. A numeração de Kabat correta de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”. Para detalhes ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). A menos que de outro modo indicado, a numeração de Kabat é usada por todo o relatório descritivo.

[0074] O termo “KD” como aqui usado se refere à constante de dissociação que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Kd e Ka se referem à taxa de dissociação e taxa de associação, respectivamente, de uma interação de antígeno-anticorpo particular. Os valores KD para os anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica.

[0075] O termo “anticorpo monoclonal” (ou “mAb”) se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, cada indivíduo de uma preparação de anticorpo monoclonal é idêntico exceto quanto a possíveis mutações (por exemplo, mutações que ocorrem naturalmente), que podem estar presentes em quantidades menores. Certas diferenças nas sequências de proteína ligadas às modificações pós translacionais (por exemplo, clivagem da lisina de terminal C da cadeia pesada, desamidação de resíduos de asparagina e/ou isomerização de resíduos de aspartato) podem não obstante existir entre as várias moléculas de anticorpo diferentes presentes na composição. Ao contrário das preparações de anticorpo policlonal, cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um determinante único em um antígeno.

[0076] O termo “anticorpo multiparatópico” como aqui utilizado se refere a um anticorpo como aqui descrito que compreende dois ou mais parátopos distintos, que interagem com epítopos diferentes do mesmo antígeno ou de dois antígenos diferentes. Os anticorpos multiparatópicos aqui descritos podem ser biparatópicos, triparatópicos, tetraparatópicos.

[0077] O termo “multiespecífico” ou “anticorpo multiespecífico” como aqui utilizado se refere a um anticorpo como aqui descrito que tem pelo menos dois domínios de ligação, isto é, dois ou mais domínios de ligação, por exemplo dois ou três domínios de ligação, em que os pelo menos dois domínios de ligação independentemente se ligam a dois antígenos diferentes ou dois epítopos diferentes no mesmo antígeno. Os anticorpos multiespecíficos são geralmente monovalentes para cada especificidade (antígeno). Os anticorpos multiespecíficos aqui descritos abrangem anticorpos multiespecíficos monovalentes e multivalentes, por exemplo bivalentes, trivalentes, tetravalentes.

[0078] O termo “neutralizando” (ou “neutralizar”) no contexto de anticorpos descreve um anticorpo que é capaz de inibir ou atenuar a atividade de sinalização biológica do seu alvo (proteína alvo).

[0079] O termo “parátopo” se refere a uma região de um anticorpo que reconhece e se liga a um antígeno.

[0080] O termo “porcentagem (%) de identidade de sequência (ou similaridade)” com respeito aos polipeptídeo e sequências de anticorpo é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que são idênticos (ou similares) aos resíduos de aminoácido no polipeptídeo que é comparado, depois de alinhar as sequências e introduzir interstícios, se necessário, para se obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando nenhuma das substituições conservativas como parte da identidade de sequência

[0081] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, outra que não um ingrediente ativo, que não seja tóxico para um sujeito. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, um tampão, excipiente, estabilizante ou preservante.

[0082] O termo “anticorpo policlonal” se refere a uma mistura de moléculas de anticorpo diferentes que se ligam a (ou de outro modo interagem com) mais do que um epítopo de um antígeno.

[0083] O termo “prevenir” no contexto de anticorpos é aqui usado intercambiavelmente com o termo “inibir” e indica o efeito que os anticorpos de acordo com a presente invenção têm com respeito a um processo biológico ou interação molecular particular.

[0084] O termo “scDiacorpo” se refere a um diacorpo compreendendo um ligador intra-Fv, tal que a molécula compreende três ligadores e forma um scFv normal cujos terminais VH e VL são cada um ligado a uma das regiões variáveis de um par Fv adicional.

[0085] O termo “Scdiacorpo-CH3” como aqui utilizado se refere a duas moléculas scdiacorpo cada uma ligada, por exemplo via uma dobradiça a um domínio CH3.

[0086] O termo “ScDiacorpo-Fc” como aqui utilizado é dois scdiacorpos, em que cada um é anexado ao terminal N de um domínio CH2, por exemplo via uma dobradiça, de fragmento da região constante -CH2CH3.

[0087] O termo “fragmento variável de cadeia única” ou “scFv” como aqui utilizado se refere a um fragmento variável de cadeia única que é estabilizado por um ligador de peptídeo entre os domínios variáveis VH e VL.

[0088] O termo “ScFv-Fc-scFv” como aqui utilizado se refere a quatro scFvs, em que um de cada é anexado ao terminal N e ao terminal C de ambas das cadeias pesadas de um fragmento CH2CH3.

[0089] O termo “scFv-IgG” como aqui utilizado é um anticorpo de comprimento completo com um scFv no terminal N de cada uma das cadeias pesadas ou cada uma das cadeias leves.

[0090] O termo “similaridade”, como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo similar entre as sequências. Por exemplo, leucina pode ser substituída no lugar de isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos por um outro incluem mas não são limitados a: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos tendo cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas); asparagina e glutamina (aminoácidos tendo cadeias laterais de amida); e cisteína e metionina (aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre).

[0091] O termo “anticorpo de domínio único” como aqui usado se refere a um fragmento de anticorpo consistindo em um único domínio variável monomérico. Os exemplos de anticorpos de domínio único incluem VH ou VL ou VHH ou V-NAR.

[0092] O termo “específico” como aqui utilizado no contexto de anticorpos é intencionado a se referir a um anticorpo que apenas reconhece o antígeno para o qual o mesmo é específico ou um anticorpo que tem afinidade de ligação significantemente mais alta para o antígeno para o qual o mesmo é específico comparado com a ligação aos antígenos para os quais o mesmo não é específico, por exemplo afinidade de ligação pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes mais alta.

[0093] O termo “estericamente bloqueando” ou “estericamente prevenindo” como aqui utilizado é intencionado a se referir aos meios de bloquear uma interação entre a primeira e segunda proteínas por uma terceira ligação de proteína à primeira proteína. A ligação entre a primeira e a terceira proteínas impede a segunda proteína de ligar à primeira proteína devido às interações de van der Waals ou eletrostáticas desfavoráveis entre a segunda e terceira proteínas.

[0094] Os termos “sujeito” ou “indivíduo” no contexto dos tratamentos e diagnósticos geralmente se referem a um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Mais especificamente, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[0095] O termo “scFv em Tandem” como aqui utilizado se refere a pelo menos dois scFvs ligados via um único ligador tal que existe um ligador inter-Fv único.

[0096] O termo “scFv-Fc em Tandem” como aqui utilizado se refere a pelo menos dois scFvs em tandem, em que cada um é anexado ao terminal N de um domínio CH2, por exemplo via uma dobradiça, de fragmento da região constante - CH2CH3.

[0097] O termo “alvo” ou “alvo de anticorpo” como aqui usado se refere a antígeno alvo ao qual o anticorpo se liga.

[0098] O termo “Tetracorpo” como aqui utilizado se refere a um formato similar ao diacorpo compreendendo quatro Fvs e quatro interligadores Fv.

[0099] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade de um anticorpo do mesmo que, quando administrado a um sujeito para tratar uma doença, é suficiente para produzir tal tratamento para a doença. A quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo do anticorpo, da doença e sua severidade e da idade, peso, etc., do sujeito a ser tratado.

[0100] O termo “tricorpo” (também aludido a um Fab(scFv)2) como aqui utilizado se refere a um fragmento Fab com um primeiro scFv anexado ao terminal C da cadeia leve e um segundo scFv anexado ao terminal C da cadeia pesada.

[0101] O termo “triespecífico ou anticorpo triespecífico” como aqui utilizado se refere a um anticorpo com três antígeno ligando especificidades. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo com três domínios de ligação a antígeno (trivalente), que independentemente liga três antígenos diferentes ou três epítopos diferentes no mesmo antígeno, isto é, cada domínio de ligação é monovalente para cada antígeno. Um dos exemplos de um formato de anticorpo triespecífico é TrYbe.

[0102] Os termos “prevenir” ou “prevenindo” e semelhantes, se referem à obtenção de um efeito profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmente prevenindo uma doença ou sintoma da mesma. Prevenir assim abrange impedir a doença de ocorrer em um sujeito que pode ser predisposto para a doença mas não foi ainda diagnosticado como tendo a doença.

[0103] Os termos “tratamento”, “tratar” e semelhantes, se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. Tratamento assim abrange (a) inibir a doença, isto é, impedir o seu desenvolvimento; e (b) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença.

[0104] O termo “TrYbe” como aqui utilizado se refere a um tricorpo compreendendo dois dsscFvs. dsFab como aqui utilizado se refere a um Fab com uma ligação de dissulfeto da região intravariável.

[0105] O termo “região variável” ou “domínio variável” se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) de um comprimento completo geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de armação (FRs) conservadas e três CDRs. (Ver, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007)). Um domínio VH ou VL único pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação a antígeno. Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs, arranjadas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As CDRs e a FR juntas formam uma região variável. Por convenção, as CDRs na região variável de cadeia pesada de um anticorpo são aludidas como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 e nas regiões variáveis de cadeia leve como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. Elas são numeradas sequencialmente na direção do terminal N para o terminal C de cada cadeia. As CDRs são convencionalmente numeradas de acordo com um sistema criado por Kabat.

[0106] O termo “vetor,” como aqui usado, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual o mesmo é ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira dentro da qual o mesmo foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucléicos aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são aqui aludidos como “vetores de expressão”. O termo “vetor” inclui “vetores de expressão”.

[0107] O termo “VH” se refere ao domínio variável (ou à sequência) da cadeia pesada.

[0108] O termo “V-IgG” como aqui utilizado é um anticorpo de comprimento completo com um domínio variável no terminal N de cada uma das cadeias pesadas ou cada uma das cadeias leves.

[0109] O termo “VL” se refere ao domínio variável (ou à sequência) da cadeia leve.

Interleucina 22 (IL22)

[0110] O termo “interleucina-22” ou “IL22” se refere a uma citocina classe II capaz de ligar à IL22R1 (também conhecida como IL22RA1, receptor 1 de IL22 ou subunidade alfa-1 do receptor de Interleucina-22) e/ou um complexo receptor de IL22R1 e IL10RA2 (também conhecido como IL22BP, a proteína de ligação ou Subunidade Alfa 2 do Receptor de Interleucina-22). IL22 também é conhecida como fator induzível derivado de célula T relacionado com interleucina-10 (IL-TIF). O termo se refere a proteínas IL22 de mamífero que ocorre naturalmente ou endógeno e às proteínas tendo uma sequência de aminoácido que é o mesmo como aquele de uma proteína de IL22 de mamífero que ocorre naturalmente ou endógeno correspondente (por exemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas). Consequentemente, como aqui definido, o termo inclui proteína IL22 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outra isoforma de IL22 (por exemplo, produzida pela junção alternativa ou outros processos celulares) e forma modificada ou não modificada do precedente (por exemplo, Lipidado, glicosilado). IL22 que ocorre naturalmente ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem tal como IL22 maduro, variantes polimóficas ou alélicas e outra isoforma e forma mutante que ocorre naturalmente em mamíferos (por exemplo, seres humanos, primatas não humanas). Estas proteínas e proteínas tendo a mesma sequência de aminoácido como uma IL22 que ocorre naturalmente ou endógena correspondente são aludidos pelo nome do mamífero correspondente.

[0111] A sequência de aminoácido da IL22 humana madura corresponde aos aminoácidos 34 a 179 da SEQ ID NO: 1. A análise de IL22 humana recombinante revela muitos domínios estruturais. (Nagem et al. (2002) Structure, 10: 1051-62; US2002/0187512).

Anticorpos que se ligam à IL22

[0112] A presente invenção provê anticorpos anti-IL22 que se ligam à IL22 (polipeptídeo alvo) e têm propriedades funcionais e estruturais como aqui adicionalmente descrito.

[0113] A presente descrição provê um método de identificar um anticorpo que se liga à IL22, o dito método compreendendo: a) imunizar um animal com IL22 humana; b) isolar os anticorpos anti-IL22 gerados a partir dos ditos animais; e c) selecionar anticorpos anti-IL22 que: i. se ligam à IL22 tanto de ser humano quanto macaco cinomolgo IL22; ii. neutralizar a fosforilação de STAT3 induzida por IL22 ou liberação de IL-10 dependente de IL22; e iii. se ligam à IL22 humana e impedem a ligação de IL22R1.

[0114] Qualquer animal adequado seria usado para a geração de anticorpos anti- IL22, incluindo camundongos, ratos e coelhos. A ligação à IL22 e medições de ligação cruzada seriam realizadas usando técnicas conhecidas pela pessoa versada. Os ensaios padrão são disponíveis para a medição da atividade neutralizante de anticorpos identificados. Os exemplos de tais ensaios são aqui providos nos Exemplos.

[0115] Os anticorpos no contexto da presente invenção incluem aqueles anticorpos e fragmentos de anticorpo funcionalmente ativos (isto é, moléculas que contém um domínio de ligação a antígeno que especificamente se liga a um antígeno, também chamado de fragmentos de ligação a antígeno). Traços aqui descritos também se aplicam aos fragmentos de anticorpo a menos que o contexto imponha de outro modo. O anticorpo pode ser (ou derivado de) policlonal, monoclonal, multivalente, multiespecífico, biespecífico, completamente humano, humanizado ou quimérico.

[0116] Os anticorpos adicionalmente descritos apenas para os propósitos de referência e exemplo e não limitam o escopo da invenção.

[0117] Um anticorpo usado de acordo com a invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal e é preferivelmente um anticorpo monoclonal. Um anticorpo usado de acordo com a invenção pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR (por exemplo, qualquer sequência de armação da região variável aceitadora apropriada pode ser usada considerando a classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivadas, incluindo as regiões de armação de camundongo, primata e ser humano), um nanocorpo, um anticorpo humano ou humanizado. Para a produção de anticorpos tanto monoclonais quanto policlonais, o animal usado para incitar tais anticorpos é tipicamente um mamífero não humano tal como uma cabra, coelho, rato ou camundongo, mas o anticorpo também pode ser incitado em outras espécies.

[0118] Anticorpos policlonais podem ser produzidos pelos métodos de rotina tais como imunização de um animal adequado com um antígeno de interesse. O sangue pode ser subsequentemente removido de tal animal e os anticorpos produzidos purificados.

[0119] Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não limitadas ao método do hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fago e métodos utilizando animais transgênicos contendo todos ou uma parte dos locais de imunoglobulina humana. Alguns métodos exemplares para fabricar anticorpos monoclonais são aqui descritos.

[0120] Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando a técnica do hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de célula T humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0121] Os anticorpos também podem ser gerados usando métodos de anticorpo de linfócito único pela clonagem e expressão de cDNAs da região variável da imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos por exemplo pelos métodos descritos na WO9202551, WO2004051268 e WO2004106377.

[0122] Os anticorpos gerados contra o polipeptídeo alvo podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, pela administração do polipeptídeo a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando protocolos bem conhecidos e de rotina, ver por exemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais, tais como coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, vacas, camelos ou porcos podem ser imunizados. Entretanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são geralmente usados.

[0123] Os anticorpos monoclonais também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos por Brinkman et al. (em J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280). Em certos métodos de exibição de fago, repertórios de genes VH e VL são separadamente clonados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente nas bibliotecas de fago, que podem depois ser triados para o fago de ligação a antígeno como descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Os fagos tipicamente exibem fragmentos de anticorpo, como fragmentos de Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas das fontes imunizadas proveem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno sem a exigência de hibridomas de construção. Alternativamente, o repertório ingênuo pode ser clonado (por exemplo, a partir de ser humano) para prover uma única fonte de anticorpos a uma ampla faixa de não auto e também autoantígenos sem qualquer imunização como descrito por Griffiths et al., EMBO J 12: 725-734 (1993). Finalmente, as bibliotecas ingênuos também podem ser fabricadas sinteticamente pela clonagem de segmentos de gene V não rearranjados a partir de células tronco e usando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar rearranjo in vitro, como descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). As publicações de patente descrevendo bibliotecas de fago de anticorpo humano incluem, por exemplo: US 5.750.373 e US 2005/0079574, US2005/0119455, US2005/0266000, US2007/0117126, US2007/0160598, US2007/0237764, US2007/0292936 e US2009/0002360.

[0124] A triagem para anticorpos pode ser realizada usando ensaios para medir a ligação ao polipeptídeo alvo e/ou ensaios para medir a capacidade do anticorpo para bloquear uma interação particular. Um exemplo de um ensaio de ligação é um ELISA, por exemplo, usando uma proteína de fusão do polipeptídeo alvo, que é imobilizado nas placas e utilizando um anticorpo secundário conjugado para detectar o anticorpo ligado ao alvo. Um exemplo de um ensaio de bloco é um ensaio com base na citometria de fluxo medindo o bloqueio de uma ligação de proteína de ligante ao polipeptídeo alvo. Um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado é usado para detectar a quantidade de tal ligação de proteína de ligante para o polipeptídeo alvo.

[0125] Os anticorpos podem ser isolados pelas bibliotecas combinatórias de triagem para anticorpos com a atividade ou atividades desejados. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fago e triar tais bibliotecas para anticorpos possuindo as características de ligação desejadas.

[0126] Anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados de bibliotecas de anticorpo humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpo humano.

[0127] O anticorpo pode ser um anticorpo de comprimento completo. Mais particularmente o anticorpo pode ser do isótipo IgG. Mais particularmente o anticorpo pode ser um IgG1 ou IgG4.

[0128] Os domínios da região constante do anticorpo, se presente, pode ser selecionado considerando a função proposta da molécula de anticorpo e em particular as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser domínios IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, domínios da região constante de IgG humana podem ser usados, especialmente dos isótipos IgG1 e IgG3 quando a molécula de anticorpo é intencionada para usos terapêuticos e as funções efetoras de anticorpo são requeridos. Alternativamente, os isótipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é intencionada para propósitos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo não são requeridos. Será avaliado que as variantes de sequência destes domínios da região constante também podem ser usadas. Também será conhecido pela pessoa versada na técnica que os anticorpos podem sofrer uma variedade de modificações pós-translacional. O tipo e grau destas modificações frequentemente dependem da linhagem de célula hospedeira usada para expressar o anticorpo assim como as condições de cultura de célula. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação da metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico de terminal carbóxi (tal como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Consequentemente, a lisina de terminal C da cadeia pesada do anticorpo pode estar ausente.

[0129] Alternativamente, o anticorpo é um fragmento de ligação a antígeno.

[0130] Para uma revisão de certos fragmentos de ligação a antígeno, ver Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos de scFv, ver, por exemplo, Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer- Verlag, Nova Iorque), pp. 269-315 (1994); ver também a WO 93/16185; e US 5.571.894 e US 5.587.458. Fragmentos Fab e F(ab’)2 compreendendo resíduos do epítopo de ligação ao receptor de recuperação e tendo meia-vida in vivo aumentada são descritos na US 5.869.046.

[0131] Fragmentos de ligação a antígeno e métodos de produzir os mesmos são bem conhecidos na técnica, ver por exemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181; Adair e Lawson, 2005. Therapeutic antibodies. Drug Design Reviews — Online 2(3): 209-217. O formato Fab-Fv foi primeiro descrito na WO2009/040562 e a versão estabilizada por dissulfeto do mesmo, o Fab-dsFv, foi primeiro descrito na WO2010/035012 e o formato TrYbe está descrito na WO2015/197772.

[0132] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmento de anticorpos. Tais fragmentos seriam derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, os fragmentos de anticorpo também podem ser produzidos diretamente pelas células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo debatidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab’-SH podem ser diretamente recuperadas a partir da E. coli e quimicamente acoplado para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)).

[0133] Fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente da cultura de célula hospedeira recombinante. O anticorpo pode ser um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Tais são descritos na WO 93/16185; US 5.571.894; e US 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um “anticorpo linear”, por exemplo, como descrito na US 5.641.870. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

[0134] O anticorpo pode ser um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, dsFv, scFv ou dsscFv. O anticorpo pode ser um anticorpo de domínio único ou um nanocorpo, por exemplo VH ou VL ou VHH ou VNAR. O anticorpo pode ser fragmento Fab ou Fab’ descrito na WO2011/117648, WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171.

[0135] O anticorpo pode ser um fragmento variável de cadeia única estabilizado com Dissulfeto (dsscFv).

[0136] A ligação de dissulfeto entre os domínios variáveis VH e VL pode estar entre dois dos resíduos listados abaixo: • VH37 + VL95 ver por exemplo Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997); • VH44 + VL100 ver por exemplo Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012; • VH44 + VL105 ver por exemplo J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995); • VH45 + VL87 ver por exemplo Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997); • VH55 + VL101 ver por exemplo FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995); • VH100 + VL50 ver por exemplo Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990); • VH100b + VL49; ver por exemplo Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990); • VH98 + VL 46 ver por exemplo Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997); • VH101 + VL46; ver por exemplo Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997); • VH105 + VL43 ver por exemplo; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp. 7538-7542 Brinkmann et al (1993); ou Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994), • VH106 + VL57 ver por exemplo FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995) e uma posição ou posições correspondendo a estas em um par de região variável localizado na molécula.

[0137] A ligação de dissulfeto pode ser formada entre posições VH44 e VL100.

[0138] Será avaliado pela pessoa versada que os fragmentos de ligação a antígeno aqui descritos também podem ser distinguidos como monoclonais, quiméricos, humanizados, completamente humanos, multiespecíficos, biespecíficos etc. e que o debate destes termos também se referem a tais fragmentos.

Anticorpos multiespecíficos

[0139] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multiespecíficos.

[0140] Os exemplos de anticorpos multiespecíficos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que também são considerados para o uso no contexto da descrição, incluem anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, bicorpos e tricorpos (ver por exemplo Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech 23(9): 1126-1136; Schoonjans et al. 2001, Biomolecular Engineering, 17(6), 193-202).

[0141] Uma variedade de formatos de anticorpo multiespecífico foi gerada. As diferentes classificações foram propostas, mas os formatos geralmente incluem IgG biespecíficas, IgG anexas, fragmentos de anticorpo multiespecífico (por exemplo biespecífico), proteínas de fusão multiespecíficas (por exemplo biespecíficas) e conjugados de anticorpo multiespecíficos (por exemplo biespecíficos), como descritos por exemplo em Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecifics antibodies. Mol Immunol. 67(2015): 95-106.

[0142] O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico. Em uma modalidade, o anticorpo compreende dois domínios de ligação a antígeno nos quais um domínio de ligação liga IL22 e o outro domínio de ligação liga um outro antígeno, isto é, cada domínio de ligação é monovalente para cada antígeno. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico tetravalente, isto é, o anticorpo compreende quatro domínios de ligação a antígeno, em que por exemplo dois domínios de ligação ligam IL22 e os outros dois domínios de ligação se ligam a um outro antígeno. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico trivalente.

[0143] As técnicas para fabricar anticorpos biespecíficos incluem, mas não são limitados à tecnologia CrossMab (Klein et al. Engineering therapeutic bispecific antibodies using CrossMab technology, Methods 154 (2019) 21-31), engenharia Knobs-in-holes (por exemplo WO1996027011, WO1998050431), tecnologia DuoBody (por exemplo WO2011131746), tecnologia Azymetric (por exemplo WO2012058768). Tecnologias adicionais para fabricar anticorpos biespecíficos foram descritas por exemplo em Godar et al., 2018, Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28: 3, 251-276. Os anticorpos biespecíficos incluem em particular anticorpos CrossMab, DAF (dois-em-um), DAF (quatro-em-um), DutaMab, DT-lgG, Knobs-in-holes comuns LC, montagem Knobs-in-holes, par de carga, troca de braço Fab, SEEDcorpo, Triomab, LUZ-Y, Fcab, KÀ-corpo e Fab ortogonal.

[0144] A construção de anticorpo pode ser um anticorpo tri-específico.

[0145] O anticorpo pode ser um anticorpo multiparatópico.

[0146] Em uma modalidade, cada domínio de ligação é monovalente. Preferivelmente cada domínio de ligação compreende não mais do que uma VH e uma VL.

[0147] A IgG anexada classicamente compreende IgG de comprimento completo engenheirada pelo domínio de ligação a antígeno adicional anexado ou fragmento de ligação a antígeno ao terminal N e/ou C da cadeia pesada e/ou leve da IgG. Os exemplos de tais fragmentos de ligação a antígeno adicionais incluem anticorpos sdAb (por exemplo VH ou VL), Fv, scFv, dsscFv, Fab, scFab. Os formatos de anticorpo de IgG anexados incluem em particular DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv- (H)lgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, lgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgC(L)-V, V(L)- IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, lgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody e DVI-IgG (quatro-em- um), por exemplo como descrito em Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibody. Mol Immunol. 67(2015): 95-106.

[0148] Os fragmentos de anticorpo multiespecíficos incluem nanocorpo, nanocorpo-HSA, BiTEs, diacorpo, DART, TandAb, scDiacorpo, sc-Diacorpo-CH3, Diacorpo-CH3, Corpo Triplo, Minianticorpo; Minicorpo, Tri Bi minicorpo, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab’)2, F(ab’)2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, HCAb Tetravalente, scDiacorpo-Fc, Diacorpo-Fc, Tandem scFv-Fc; e intracorpo, como descrito, por exemplo, em Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106.

[0149] As proteínas de fusão multiespecíficas incluem Dock and Lock, ImmTAC, HSAcorpo, scDiacorpo-HSA e scFv em Tandem-Toxina.

[0150] Os conjugados de anticorpo multiespecíficos incluem IgG-lgG; Cov-X- Corpo; e scFv1 -PEG-scFv2.

[0151] Os formatos de anticorpo multiespecíficos adicionais foram descritos por exemplo em Brinkmann et al, The making of bispecific antibodies, mAbs, 9:2, 182212 (2017), em particular na Figura 2, por exemplo scFv em tandem, triplocorpo, Fab-VHH, taFv-Fc, scFv4-Ig, scFv2-Fcab, scFv4-IgG. Bicorpos, tricorpos e métodos para produzir tais são descritos, por exemplo, na WO99/37791.

[0152] O anticorpo para o uso na presente invenção pode ser um Fab ligado a dois scFvs ou dsscFvs, cada scFv ou dsscFv liga o mesmo ou um alvo diferente (por exemplo, um scFv ou dsscFv liga um alvo terapêutico e um scFv ou dsscFv que aumenta a meia-vida pela ligação, por exemplo, albumina). Tais fragmentos de anticorpo são descritos na WO2015/197772. Um outro anticorpo preferido para o uso no fragmento da presente invenção compreende um Fab ligado apenas a um scFv ou dsscFv, como descrito por exemplo na WO2013/068571 e Dave et al., Mabs, 8(7) 1319-1335 (2016).

[0153] Um outro anticorpo para o uso na presente invenção é um anticorpo Knobs-into-holes (“KiH”). O mesmo é um formato de anticorpo multiespecífico consistindo em homodímeros de cadeia pesada para a heterodimerização (por exemplo, para a produção eficiente de anticorpos biespecíficos, anticorpos multiespecíficos ou anticorpos uniarmados). Geralmente, tal tecnologia envolve introduzir uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo (tal como um primeiro domínio de CH3 em uma primeira cadeia pesada de anticorpo) e uma cavidade correspondente (“furo”) na interface de um segundo polipeptídeo (tal como um segundo domínio CH3 em uma segunda cadeia pesada de anticorpo), tal que a protuberância pode ser posicionada na cavidade de modo a promover formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de cadeias laterais de aminoácido pequenas da interface do primeiro polipeptídeo (tal como um primeiro domínio CH3 em uma primeira cadeia pesada de anticorpo) com cadeias laterais maiores (por exemplo arginina, fenilalanina, tirosina ou triptofano). As cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo (tal como um segundo domínio CH3 em uma segunda cadeia pesada de anticorpo) pela substituição de cadeias laterais de aminoácido grandes com as menores (por exemplo alanina, serina, valina ou treonina). A protuberância e cavidade podem ser fabricadas alterando-se o ácido nucleico codificando os polipeptídeos, por exemplo pela mutagênese específica de sítio ou pela síntese de peptídeo. Detalhes adicionais com respeito à tecnologia “knobs-into-holes” são descritos, por exemplo, na US 5.731.168; U.S 7.695.936; WO 2009/089004; US 2009/0182127; Marvin md Z u, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6): 649-658; Kontermann Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26: 1-9; Ridgway et al, Prot Eng 9, 617-621 (1996); e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001).

[0154] Anticorpos humanizados, humanos e quiméricos e métodos de produzir tais

[0155] Os anticorpos da presente invenção podem ser, mas não são limitados a anticorpos humanizados, completamente humanos ou quiméricos.

[0156] Em uma modalidade o anticorpo é humanizado. Mais particularmente o anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.

[0157] Em certas modalidades, um anticorpo aqui provido é um anticorpo quimérico. Os exemplos de anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo “comutado em classe” no qual a classe ou subclasse foi comutada daquela do anticorpo precursor. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.

[0158] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[0159] Os anticorpos humanizados podem opcionalmente compreender adicionalmente um ou mais resíduos de armação derivados das espécies não humanas a partir das quais as CDRs foram derivadas. Será avaliado que pode ser necessário transferir apenas os resíduos determinantes de especificidade das CDRs ao invés da CDR inteira (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34).

[0160] Adequadamente, o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem um domínio variável compreendendo regiões de armação aceitadora humana assim como uma ou mais das CDRs e opcionalmente incluindo adicionalmente um ou mais resíduos de armação de doador.

[0161] Assim, é provido em uma modalidade um anticorpo humanizado em que o domínio variável compreende regiões de armação aceitadora humana e CDRs doadoras não humanas.

[0162] Quando as CDRs ou resíduos determinantes de especificidade são enxertados, qualquer sequência de armação da região variável aceitadora apropriada pode ser usada considerando a classe/tipo do anticorpo doador a partir da qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões de armação de camundongo, primata e ser humano.

[0163] Os exemplos de armações humanas que podem ser usados na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usados para a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e EU, LAY e POM pode ser usado tanto para a cadeia pesada quanto para a cadeia leve. Alternativamente, as sequências da linha germinativa humana podem ser usadas; Estes são disponíveis em: www.imgt.org. Em modalidades, a armação aceitadora é a linha germinativa humana IGKV1D-13, linha germinativa humana IGHV3-66, linha germinativa humana IGKV1-12 e/ou linha germinativa humana IGHV4-31. Em modalidades, a armação humana contém 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2 resíduos de aminoácido de anticorpo doador.

[0164] Em um anticorpo humanizado da presente invenção, as cadeias pesadas e leves aceitadoras não necessariamente precisa ser derivada do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias compósitas tendo regiões de armação derivadas das cadeias diferentes.

[0165] Em certas modalidades, um anticorpo aqui provido é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica.

[0166] Os anticorpos humanos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de comprimento completo que são “o produto de” ou “derivadas de” uma sequência da linha germinativa particulares se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento completo do anticorpo são obtidos a partir de um sistema que usa genes da imunoglobulina da linha germinativa humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico carreando genes da imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou triando uma biblioteca de gene da imunoglobulina humana exibida no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano ou fragmento do mesmo que é “o produto de” ou “derivado a partir de” uma sequência de imunoglobulina da linha germinativa humana pode ser identificado como tal pela comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano para as sequências de aminoácido das imunoglobulinas da linha germinativa humana e selecionar a sequência de imunoglobulina da linha germinativa humana que está mais próxima na sequência (isto é, maior % de identidade) para a sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é “o produto de” ou “derivado a partir de” uma sequência da imunoglobulina da linha germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido quando comparadas com a sequência da linha germinativa, devido, por exemplo, às mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou introdução intencional de mutação locodirigida. Entretanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina da linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identifica o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácido da imunoglobulina da linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linha germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido codificado pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência da linha germinativa humana particular exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5 ou mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa.

Traços estruturais dos anticorpos

[0167] O anticorpo da invenção compreende um domínio de ligação. Um domínio de ligação geralmente compreenderá 6 CDRs, três de uma cadeia pesada e três de uma cadeia leve. Em uma modalidade as CDRs são em uma armação e juntas formam uma região variável. Assim, o anticorpo tem um domínio de ligação específico para antígeno, o dito domínio de ligação compreendendo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada. Tabela 3. Sequências de aminoácido dos anticorpos anti-IL22

[0168] Em uma modalidade a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia leve que compreende pelo menos uma de: uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 5, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 6, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 7.

[0169] Em uma modalidade a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 5, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 6, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 7.

[0170] Em uma modalidade a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada que compreende pelo menos uma de: uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 8, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 9, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 10.

[0171] Em uma modalidade a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 8, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 9, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 10.

[0172] As moléculas de anticorpo da presente invenção podem compreender uma cadeia leve complementar ou uma cadeia pesada complementar, respectivamente.

[0173] Consequentemente, em uma modalidade a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo: uma região variável de cadeia leve compreendendo: uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 5, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 6, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo: uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 8, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 9, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 10.

[0174] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 72.

[0175] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 74.

[0176] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 24.

[0177] Em uma modalidade alternativa, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 72 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 74.

[0178] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é um Fab compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo: uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 5, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 6, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo: uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 8, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 9, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 10.

[0179] Em uma modalidade o anticorpo da presente invenção é um Fab compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 26 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 28.

[0180] Em uma outra modalidade, o anticorpo da presente invenção é uma IgG1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 26 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 30.

[0181] Em uma outra modalidade, o anticorpo da presente invenção é uma IgG4P compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 26 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 32.

[0182] Em uma modalidade alternativa a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia leve que compreende pelo menos uma de: uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 65, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 66, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 67. em uma modalidade alternativa a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 65, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 66, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 67.

[0183] Em uma modalidade alternativa a presente invenção provê um anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada que compreende pelo menos uma de: uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 68, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 69, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 70.

[0184] Em uma modalidade alternativa a presente invenção provê anticorpo que se liga à IL22, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 68, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 69, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 70.

[0185] Em uma modalidade alternativa a presente invenção provê anticorpo que se liga à IL22, compreendendo: uma região variável de cadeia leve compreendendo: uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 65, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 66, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 67; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo: uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 68, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 69, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 70.

[0186] Em uma modalidade alternativa, um anticorpo da presente invenção é um Fab compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo: uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 65, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 66, e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 67; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo: uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 68, uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 69, e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 70.

[0187] Já em uma outra modalidade alternativa o anticorpo da presente invenção é um Fab compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 78.

[0188] Em uma outra modalidade alternativa, o anticorpo da presente invenção é uma IgG1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 80.

[0189] Em uma outra modalidade alternativa, o anticorpo da presente invenção é uma IgG4P compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 82.

[0190] Em modalidades, a invenção provê um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 65, uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 66, uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 67; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo a SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 68, CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 69 e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 70.

[0191] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve em que a cadeia pesada compreende um domínio CH1 e a cadeia leve compreende um domínio CL, capa ou lambda.

Propriedades funcionais dos anticorpos anti-IL22

[0192] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo neutralizante. Preferivelmente o anticorpo de acordo com a presente invenção é neutralizante da atividade de IL22. Em particular, o anticorpo é capaz de neutralizar a ligação de IL22 ao receptor 1 de IL22 (IL22R1). Um anticorpo anti-IL22 da presente invenção também se liga à IL22 e inibe a ligação de IL22 à proteína de ligação de IL22 (IL22RA2 ou IL22BP). Preferivelmente, o anticorpo é capaz de neutralizar a ligação de IL22 ao receptor 1 de IL22 (IL22R1) e proteína de ligação de IL22 (L22RA2).

[0193] Os anticorpos anti-IL22 da presente invenção se ligam à mesma região na IL22 como IL22R1. Em uma modalidade particular, a presente invenção provê um anticorpo que se liga a uma região na IL22 tal que a ligação estericamente bloqueia a interação entre IL22 e IL22R1. Em particular, a região variável do anticorpo pode bloquear estericamente a interação entre IL22 e IL22R1.

[0194] Em algumas modalidades, o anticorpo de acordo com a presente invenção se liga à IL22 que não está ligada à IL22BP (“IL22 livre”). Em algumas modalidades, o anticorpo de acordo com a presente invenção se liga à IL22 e impede IL22 de ligação à IL22BP.

[0195] Um anticorpo de acordo com a presente invenção é específico para a IL22. Em uma modalidade, o anticorpo tem uma afinidade de ligação para IL22 comparada à IL22R1. Isto é distinguido por uma constante de afinidade de dissociação (KD) pelo menos 10 vezes mais alta para IL22 do que para IL22R1 ou IL22BP. Especificamente tal é medida usando a técnica BIACore.

[0196] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga à IL22 com afinidade e especificidade suficientes. Em certas modalidades, o anticorpo liga IL22 humana com um KD de cerca de qualquer um de 1 μM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM, 0,05 nM ou 0,001 nM (por exemplo 10-8M ou menos, por exemplo de 10-8M a 10-13M, por exemplo, de 10-9M a 10-13M), incluindo qualquer faixa entre estes valores. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção liga IL22 humana com um KD de menos do que 100 pM.

[0197] Em certas modalidades, o anticorpo liga IL22 de cinomolgo com um KD de cerca de qualquer um de 1 μM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM, 0,05 nM ou 0,001 nM (por exemplo 10-8M ou menos, por exemplo de 10-8M a 10-13M, por exemplo, de 10-9M a 10-13M), incluindo qualquer faixa entre estes valores. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção liga IL22 de cinomolgo com um KD de menos do que 100 pM.

[0198] Será avaliado pela pessoa versada que o valor de KD pode diferir dependendo do formato e estrutura global do anticorpo. Por exemplo, a KD de um anticorpo diferiria no contexto dos anticorpos multiespecíficos, anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo.

[0199] Um anticorpo anti-IL22 da presente invenção é capaz de inibir a liberação de IL10 induzida por IL22 a partir das células.

[0200] Como demonstrado pelos Exemplos, os anticorpos anti-IL22 da invenção são capazes de inibir a proliferação e diferenciação de queratinócitos mediada por IL22.

[0201] Os anticorpos anti-IL22 da invenção também são capazes de inibir a liberação de peptídeos antimicrobianos induzidos por IL22, tais como, por exemplo, S100A7.

[0202] A afinidade de um anticorpo, assim como o grau ao qual um anticorpo inibe a ligação, pode ser determinada pela pessoa versada usando técnicas convencionais, por exemplo aquelas descritas por Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)) ou pela ressonância plasmônica superficial (SPR) usando sistemas tais como BIAcore. Para a ressonância plasmônica superficial, as moléculas alvos são imobilizadas em uma fase sólida e exposta aos ligantes em uma fase móvel correndo ao longo de uma célula de fluxo. Se a ligação de ligante ao alvo imobilizado ocorre, o índice refrativo local muda, levando a uma mudança no ângulo de SPR, que pode ser monitorado em tempo real pela detecção de mudanças na intensidade da luz refletida. As taxas de mudança do sinal de SPR podem ser analisadas para produzir constantes de taxa aparente para as fases de associação e dissociação da reação de ligação. A razão destes valores dá a constante de equilíbrio aparente (afinidade) (ver, por exemplo, Wolff et al, Cancer Res. 53: 2560-65 (1993)).

[0203] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 de acordo com a presente invenção se liga à IL22 que não é ligado à proteína de ligação de IL22 (“IL22 livre”). Mais especificamente, um anticorpo de acordo com a presente invenção se liga à IL22 e impede IL22 de ligação à proteína de ligação IL22.

[0204] Preferivelmente o anticorpo de acordo com a presente invenção é específico para IL22.

[0205] A descrição aqui com respeito aos anticorpos, particularmente com respeito à afinidade de ligação e especificidade e atividade, também é aplicável ao fragmento de ligação a antígenos e moléculas semelhantes a anticorpo.

Ligação de anticorpos ao mesmo epítopo

[0206] Os anticorpos podem competir para a ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como, aqueles definidos acima em termos de região de cadeia leve, cadeia pesada, variável de cadeia leve (LCVR), região variável de cadeia pesada (HCVR) ou sequências de CDR.

[0207] Em particular, a presente invenção provê um anticorpo que compete para a ligação ao IL22 com ou se liga ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende uma combinação de sequência CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR- H1/CDR-H2/CDR-H3 das SEQ ID NOs: 5/6/7/8/9/10. Um anticorpo pode competir quanto à ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende um par de sequência LCVR e HCVR das SEQ ID NOs: 22/24. Um anticorpo pode competir para a ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como um Fab compreendendo o par de sequência LC e HC dado na SEQ ID NO: 26/28.

[0208] Alternativamente, a presente invenção provê um anticorpo que compete quanto à ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende uma combinação de sequência CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR- H1/CDR-H2/CDR-H3 das SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70. Um anticorpo pode competir quanto à ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende um par de sequência LCVR e HCVR das SEQ ID NOs: 72/74. Um anticorpo pode competir quanto à ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como um Fab compreendendo o par de sequência LC e HC dado na SEQ ID NO: 76/78.

[0209] Em uma modalidade, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 que se liga a um epítopo na IL22, o dito epítopo compreendendo o um ou mais resíduos VRLIGEKLFHGVSM (SEQ ID NO: 1, resíduos 72 a 85 da sequência de aminoácido da IL22). Em algumas modalidades, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 que se liga ao polipeptídeo VRLIGEKLFHGVSM (SEQ ID NO: 96). Em modalidades, a invenção provê um anticorpo que se liga a pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou todos os resíduos selecionados dos resíduos 72 a 85 da sequência de aminoácido de IL22 definidos pela SEQ ID NO: 1.

[0210] Em uma modalidade, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 que se liga a um epítopo na IL22, o dito epítopo compreendendo pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou todos dos resíduos selecionados a partir da lista consistindo em Gln48, Glu77, Phe80, His81, Gly82, Val83, Ser84, Met85, Arg88, Leu169, Met172, Ser173, Arg175, Asn176 e Ile179 da IL22 humana (SEQ ID NO: 1) como determinada em menos do que 4 A de distância de contato. Em modalidades, a invenção provê um anticorpo que se liga a um epítopo na IL22, o dito epítopo compreendendo pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou todos dos resíduos selecionados da lista consistindo em Lys44, Phe47, Gln48, Ile75, Gly76, Glu77, Phe80, His81, Gly82, Val83, Ser84, Met85, Ser86, Arg88, Leu169, Met172, Ser173, Arg175, Asn176 e Ile179 da IL22 humana (SEQ ID NO: 1) como determinada na distância de menos do que 5A de distância de contato entre o anticorpo e IL22.

[0211] Em particular, a invenção provê um anticorpo que pode competir quanto à ligação à IL22 com ou se ligam ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende os resíduos das cadeias pesada e leve listadas nas Tabelas 4 ou 5 abaixo. Mais particular, um anticorpo da invenção compreende a sequência CDR-H3 compreendendo os resíduos 97 a 104, preferivelmente, resíduos 99 a 104 da SEQ ID NO. 24 e se ligam a um epítopo na IL22 como definido acima. Mais especificamente, um anticorpo da invenção compreende resíduos CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 como definidos nas Tabelas 4 ou 5 e se ligam a um epítopo na IL22 como definido acima.

[0212] Tabela 4 Aminoácidos das cadeias leve e pesada do anticorpo anti-IL22 da presente invenção envolvidos nas interações com IL22 que têm <4 A de distância de contato entre o anticorpo e IL-22. As posições dos resíduos correspondem à SEQ ID NO: 26 para a cadeia leve e SEQ ID NO 28 para a cadeia pesada.

[0213] Tabela 5. Aminoácidos das cadeias leve e pesada do anticorpo anti-IL22 da presente invenção envolvida nas interações com IL22 que têm < 5 A de distância de contato entre o anticorpo e IL-22. As posições dos resíduos correspondem à SEQ ID NO: 26 para a cadeia leve e SEQ ID NO 28 para a cadeia pesada.

[0214] Mais particularmente, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 que se liga a um epítopo na IL22 como definido acima e em que o dito anticorpo impede a ligação de IL22 ao IL22R1 e IL22BP. Mais especificamente a cadeia leve do anticorpo estericamente impede a ligação de IL22R1 à IL22.

[0215] O epítopo pode ser identificado por qualquer método de mapeamento de sítio de ligação adequado conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos anticorpos providos pela presente invenção. Os exemplos de tais métodos incluem triar peptídeos de comprimentos variáveis derivados da proteína alvo de comprimento completo para a ligação ao anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção e identificar um fragmento que possa especificamente se ligar ao anticorpo contendo a sequência do epítopo reconhecida pelo anticorpo. Os peptídeos alvos podem ser sinteticamente produzidos. Os peptídeos que ligam o anticorpo podem ser identificados, por exemplo, pela análise espectrométrica de massa. Em um outro exemplo, a espectroscopia de RMN ou cristalografia de raio X podem ser usadas para identificar o epítopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Tipicamente, quando a determinação de epítopo é realizada pela cristalografia de raio X, os resíduos de aminoácido do antígeno dentro de 4A das CDRs são considerados ser parte dos resíduos de aminoácido do epítopo. Uma vez identificado, o epítopo pode servir para preparar fragmentos que ligam um anticorpo da presente invenção e, se requerido, usado como um imunógeno para obter anticorpos adicionais que ligam o mesmo epítopo.

[0216] Em uma modalidade o epítopo do anticorpo é determinado pela cristalografia de raio X.

[0217] Pode-se facilmente determinar se um anticorpo de liga ao mesmo epítopo como ou compete quanto à ligação com um anticorpo de referência usando-se métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado ligar a uma proteína ou peptídeo sob condições saturantes. Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste para se ligar à proteína ou peptídeo é avaliada. Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar à proteína ou peptídeo a seguir da ligação de saturação com o anticorpo de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do que o anticorpo de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não é capaz de se ligar à proteína ou peptídeo a seguir da ligação de saturação com o anticorpo de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo como o epítopo ligado pelo anticorpo de referência da invenção ou o anticorpo de referência causa uma mudança de conformação no antígeno e consequentemente impede a ligação do anticorpo de teste.

[0218] Para determinar se um anticorpo compete quanto à ligação com um anticorpo de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas configurações experimentais diferentes. Em uma primeira configuração, o anticorpo de referência é deixado ligar ao antígeno sob condições saturantes seguidas pela avaliação da ligação do anticorpo de teste ao antígeno. Em uma segunda configuração, o anticorpo de teste é deixado ligar ao antígeno sob condições saturantes seguidas pela avaliação da ligação do anticorpo de referência à proteína/peptídeo. Se, em ambas as configurações experimentais, apenas o primeiro anticorpo (saturante) é capaz de ligação à proteína/peptídeo, então é concluído que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem quanto à ligação ao antígeno. Como será avaliado pela pessoa versada, um anticorpo que compete quanto à ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente ligar ao epítopo idêntico como o anticorpo de referência, mas pode estericamente bloquear a ligação do anticorpo de referência pela ligação de um epítopo de sobreposição ou adjacente ou causar uma mudança conformacional levando à falta de ligação.

[0219] Dois anticorpos ligam ou sobrepõem o mesmo epítopo se cada um inibe competitivamente (bloqueia) a ligação do outro ao antígeno. Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.

[0220] Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análise de ligação) pode ser depois realizada para confirmar se a falta observada de ligação do anticorpo de teste é de fato devida à ligação à mesma parte do antígeno como o anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou um outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Os experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, ressonância plasmônica superficial, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica.

Variantes de anticorpo

[0221] Em certas modalidades, variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido são providas. Os sítios de interesse para a mutagênese de substituição incluem as CDRs e FRs. As substituições de aminoácido podem ser introduzidas dentro de um anticorpo de interesse e os produtos triados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação a antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhorada.

[0222] Em certas modalidades, as variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos aqui descritos são consideradas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes de sequência de aminoácido do anticorpo anti-IL22 podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas dentro da sequência de nucleotídeo codificando a proteína ou pela síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções dentro e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácido (tais como em uma ou mais CDRs e/ou sequências de armação ou em um domínio de VH e/ou um VL) do anticorpo anti-IL22. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar na construção final, contanto que a construção final possui as características desejadas.

[0223] Em certas modalidades das sequências VH e VL variantes aqui providas, cada HVR é inalterado ou não contém não mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácido.

[0224] Será avaliado que uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de aminoácido podem ser feitas às CDRs providas pela presente invenção sem alterar significantemente a capacidade do anticorpo para ligar à IL22 e neutralizar a atividade de IL22. O efeito de qualquer uma das substituições, adições e/ou deleções de aminoácido pode ser facilmente testado por uma pessoa versada na técnica, por exemplo usando-se os métodos aqui descritos, particularmente aqueles ilustrados nos Exemplos, para determinar a ligação de IL22 e inibição das interações de IL22 com seu receptor IL22R1 e proteína de ligação de IL22.

[0225] Consequentemente, em certas modalidades das sequências de VH e VL variantes, cada CDR não contém mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácido, em que tais substituições de aminoácido são conservativas e em que o anticorpo retém as suas propriedades de ligação à IL22 e bloqueia a ligação de IL22 à IL22R1 e proteína de ligação de IL22.

[0226] Consequentemente, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas de CDR-L1 (compreendendo a SEQ ID NO: 5), CDR-L2 (compreendendo a SEQ ID NO: 6), CDR-L3 (compreendendo a SEQ ID NO: 7), CDR-H1 (compreendendo a SEQ ID NO: 8), CDR-H2 (compreendendo a SEQ ID NO: 9) e CDR-H3 (compreendendo a SEQ ID NO: 10) em que um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foi substituído com um aminoácido, por exemplo um aminoácido similar como definido aqui abaixo.

[0227] Em uma modalidade, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 compreendendo CDR-L1 (compreendendo a SEQ ID NO: 5), CDR-L2 (compreendendo a SEQ ID NO: 6), CDR-L3 (compreendendo a SEQ ID NO: 7), CDR-H1 (compreendendo a SEQ ID NO: 8), CDR-H2 (compreendendo a SEQ ID NO: 9) e CDR-H3 (compreendendo a SEQ ID NO: 10), por exemplo em que um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foi substituída com um outro aminoácido, tal como um aminoácido similar como definido aqui abaixo. Em modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs substitui um resíduo de Cisteína livre ou modifica um potencial do sítio de desamidação de asparagina. Em modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs modifica um sítio de isomerização de Ácido aspártico potencial. Em modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs remove um sítio de hidrólise de DP potencial. Em modalidades, com referência à CDR-L3 (SEQ ID NO: 7) as substituições são C91S ou C91V; N95D; S96A; ou uma combinação dos mesmos; com referência à CDR-H2 (SEQ ID NO: 9), as substituições são D54E, G55A ou uma combinação das mesmas; com referência à CDR-H3 (SEQ ID NO: 9), a substituição é D107E ou uma combinação das substituições citadas.

[0228] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende três CDRs em que a sequência de CDR-L1 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 5, CDR-L2 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 6 e/ou CDR-L3 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0229] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende três CDRs em que a sequência de CDR-H1 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 8, a CDR-H2 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e/ou a CDR-H3 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 10.

[0230] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 22.

[0231] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 24.

[0232] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 22 e/ou a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 24.

[0233] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende as sequências CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 compreendendo as SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70 respectivamente e o resto das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada têm pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a SEQ ID NO: 72 e 74 respectivamente.

[0234] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende as sequências CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 compreendendo as SEQ ID NOs: 5/6/7/8/9/10 respectivamente e o resto das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada têm pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a SEQ ID NO: 22 e 24 respectivamente.

[0235] Em uma modalidade um anticorpo anti-IL22 da presente invenção é um Fab compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 26 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 28.

[0236] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção é um Fab compreendendo as sequências CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR- H2/CDR-H3 dadas nas SEQ ID NOs: 5/6/7/8/9/10 respectivamente e o resto da cadeia leve e cadeia pesada tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com as SEQ ID Nos: 26 e 28 respectivamente.

[0237] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 22, em que um ou mais resíduos nas posições 91, 95, e/ou 96 foram substituídos por um outro aminoácido; e a região variável de cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 24, em que um ou mais resíduos nas posições 54, 55 e/ou 107 foram substituídos por um outro aminoácido.

[0238] A presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas de CDR-L1 (compreendendo a SEQ ID NO: 65), CDR- L2 (compreendendo a SEQ ID NO: 66), CDR-L3 (compreendendo a SEQ ID NO: 67), CDR-H1 (compreendendo a SEQ ID NO: 68), CDR-H2 (compreendendo a SEQ ID NO: 69) e CDR-H3 (compreendendo a SEQ ID NO: 70) na qual um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foi substituída com um outro aminoácido, por exemplo um aminoácido similar como definido aqui abaixo.

[0239] Em uma modalidade, a presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 compreendendo CDR-L1 (compreendendo a SEQ ID NO: 65), CDR-L2 (compreendendo a SEQ ID NO: 66), CDR-L3 (compreendendo a SEQ ID NO: 67), CDR-H1 (compreendendo a SEQ ID NO: 68), CDR-H2 (compreendendo a SEQ ID NO: 69) e CDR-H3 (compreendendo a SEQ ID NO: 70), por exemplo na qual um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foi substituído com um outro aminoácido, tal como um aminoácido similar como definido aqui abaixo. Em modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs substitui um resíduo de Cisteína livre ou modifica um sítio de desamidação de Asparagina potencial. Em modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs modifica um sítio de isomerização de Ácido aspártico potencial. Em modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs remove um sítio de hidrólise de DP potencial. Em modalidades, com referência à CDR-H2 (SEQ ID NO: 69) a substituição é S61T.

[0240] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende três CDRs em que a sequência de CDR-L1 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 65, CDR-L2 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 66 e/ou CDR-L3 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 67.

[0241] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende três CDRs em que a sequência de CDR-H1 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 68, CDR-H2 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 69 e/ou CDR-H3 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 70.

[0242] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente descrição compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 72.

[0243] Em uma modalidade, um anticorpo da presente descrição compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 74.

[0244] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 72 e/ou a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 74.

[0245] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção compreende as sequências CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 compreendendo as SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70 respectivamente e o resto das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada têm pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com as SEQ ID Nos: 72 e 74 respectivamente.

[0246] Em uma modalidade um anticorpo anti-IL22 da presente invenção é um Fab compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 78.

[0247] Em uma modalidade, um anticorpo anti-IL22 da presente invenção é um Fab compreendendo as sequências CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR- H2/CDR-H3 dadas nas SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70 respectivamente e o resto da cadeia leve e cadeia pesada tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade com as SEQ ID NOs: 76 e 78 respectivamente.

Identidade e similaridade de sequência

[0248] Os graus de identidade e similaridade entre as sequências podem ser facilmente calculados. A “% de identidade de sequência” (ou “% de similaridade de sequência”) é calculada por: (1) comparando duas sequências otimamente alinhada em uma janela de comparação (por exemplo, o comprimento da sequência mais longa, o comprimento da sequência mais curta, uma janela especificada, etc.), (2) determinação do número de posições contendo aminoácidos idênticos (ou similares) (por exemplo, aminoácidos idênticos ocorrem em ambas as sequências, aminoácidos similares ocorrem em ambas as sequências) para produzir o número de posições igualadas, (3) dividir o número de posições similares pelo número total de posições na janela de comparação (por exemplo, o comprimento da sequência mais longa, o comprimento da sequência mais curta, uma janela especificada) e (4) multiplicando o resultado em 100 para obter a % de identidade de sequência ou similaridade de sequência percentual.

[0249] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa quanto ao método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), pelas implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou pelo alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).

[0250] Os exemplos preferidos de algoritmos que são adequados para determinar a identidade de sequência e similaridade de sequência percentual incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2,0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). As sequências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando FASTA usando default ou parâmetros recomendados. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) provê alinhamentos e porcentagem identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências consulta e pesquisa.

[0251] Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais CDRs contanto que tais alterações não reduzem substancialmente a capacidade do anticorpo para ligar o alvo.

[0252] Por exemplo, as alterações conservativas que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas nas CDRs. Tais alterações podem ser feitas fora do antígeno contatando resíduos nas CDRs.

[0253] As substituições conservativas são mostradas na Tabela 6 junto com “substituições exemplares” mais substanciais. Tabela 6. Exemplos de substituições de aminoácido

[0254] Modificações substanciais nas propriedades biológicas de uma variante de anticorpo podem ser realizadas pela seleção de substituições que difiram significantemente no seu efeito sobre a manutenção da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou o volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, Biochemistry segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)).

[0255] Um tipo de variante substitucional envolve substituir um ou mais resíduos da região de CDR de um anticorpo precursor (anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionado(s) para estudo adicional terá mudanças em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo precursor e/ou terá substancialmente retido certas propriedades biológicas do anticorpo precursor. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo maturado por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade com base na exibição de fago. Resumidamente, um ou mais resíduos de CDR são mutados e os anticorpos variantes exibiram no fago e triados para uma atividade biológica particular (por exemplo afinidade de ligação).

[0256] As alterações (por exemplo, substituições) podem ser fabricadas nas CDRs, por exemplo, para melhorar a afinidade de anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em “pontos quentes” de HVR, isto é, resíduos codificados pelos códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (ver, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)) e/ou resíduos que contatam antígeno, com a variante VH ou VL resultante sendo testado quanto à afinidade de ligação. A maturação por afinidade pela construção e resseleção a partir de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em algumas modalidades de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida dentro de genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, embaralhamento de cadeia ou mutagênese direcionada a oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é depois criada. A biblioteca é depois triada para identificar quaisquer variantes de anticorpo com a afinidade desejada.

[0257] Um dos métodos que podem ser usados para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser alvejadas para mutagênese é a mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-1085). Neste método, um resíduo ou vários dos resíduos alvos são identificados e substituído por alanina para determinar se a interação do anticorpo com antígeno é afetada. Alternativamente ou adicionalmente, uma estrutura de raio X de um complexo de antígeno-anticorpo pode ser usada para identificar pontos de contato entre o anticorpo e seu antígeno. As variantes podem ser triadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

Variantes da região constante

[0258] Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácido podem ser introduzidas dentro da região Fc de um anticorpo aqui provido, gerando deste modo uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido.

[0259] Certas variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída aos FcRs são descritas. (Ver, por exemplo, US 6.737.056; WO 2004/056312 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).

[0260] Anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação melhorada ao receptor de Fc neonatal (FcRn) são descritos na US2005/0014934A1. Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nele que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn.

[0261] Em certas modalidades, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácido que melhoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos).

[0262] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de uma ou mais dos resíduos da região Fc 234, 235, 237, 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (ver, por exemplo, US. 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em dois ou mais de posições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327 em que o resíduo de aminoácido é numerado de acordo com o sistema de numeração EU.

[0263] Os ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação de receptor de Fc (FcR) podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo carece a ligação de FCYR (consequentemente provavelmente carecendo da atividade de ADCC), mas retém a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediar ADCC, as células NK, expressam apenas FCYRIII, ao passo que os monócitos expressam FcRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR nas células hematopoiéticas é resumida em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Os exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrita na US5.500.362; US5.821.337. Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliado in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aqueles descritos em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). Os ensaios de ligação de Clq também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar Clq e consequentemente carece da atividade de CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação de Clq e C3c na WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (ver, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al, Blood 101: 1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.I Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). A ligação de FcRn e determinações in vivo da depuração/meia-vida também pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Petkova, S.B. et al, Int l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

[0264] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presente, podem ser selecionados levando em conta a função proposta da molécula de anticorpo e em particular as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser domínios de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanas. Em particular, os domínios de região constante da IgG humana podem ser usados, especialmente dos isótipos de IgG1 e IgG3 quando a molécula de anticorpo é intencionada para usos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo são requeridas. Alternativamente, os isótipos de IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é intencionada para propósitos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo não são requeridas. Será avaliado que as variantes de sequência destes domínios da região constante também podem ser usadas.

Variantes de glicosilação

[0265] Em certas modalidades, um anticorpo aqui provido é alterado para aumentar ou diminuir o grau ao qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando-se a sequência de aminoácido tal que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos.

Anticorpos humanizados, humanos e quiméricos

[0266] Os anticorpos da presente invenção podem ser, mas não são limitados a, anticorpos humanizados, completamente humanos ou quiméricos.

[0267] Em uma modalidade, o anticorpo é humanizado. Mais particularmente o anticorpo anti-IL22 é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.

[0268] Em certas modalidades, um anticorpo aqui provido é um anticorpo quimérico. Os exemplos de anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na US4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo “comutado de classe” no qual a classe ou subclasse foi mudada daquela do anticorpo precursor.

[0269] Os anticorpos quiméricos são compostos de elementos derivados de duas espécies diferentes tal que o elemento retenha as características das espécies a partir das quais o mesmo é derivado. Geralmente um anticorpo quimérico compreenderá uma região variável de uma espécie, por exemplo um camundongo, rato, coelho ou similar e região constante de uma outra espécie tal como um ser humano.

[0270] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado.

[0271] Será avaliado que pode ser necessário apenas transferir os resíduos determinantes de especificidade das CDRs ao invés da CDR inteira (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Os anticorpos humanizados podem opcionalmente compreender adicionalmente um ou mais resíduos de armação derivados da espécie não humana a partir da qual as CDRs foram derivadas.

[0272] Adequadamente, o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem um domínio variável compreendendo regiões de armação aceitadora humana assim como uma ou mais das CDRs e opcionalmente incluindo adicionalmente um ou mais resíduos de armação doadora.

[0273] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado, em que o domínio variável compreende regiões de armação aceitadora humana e CDRs doadoras não humanas.

[0274] Quando as CDRs são enxertadas, qualquer sequência de armação da região variável aceitadora apropriada pode ser usada considerando a classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões de armação de camundongo, primata e ser humano.

[0275] Os exemplos de armações humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas tanto para a cadeia pesada quanto para cadeia leve. Alternativamente, as sequências da linha germinativa humana podem ser usadas; estas são disponíveis em: www.imgt.org. Em modalidades, a armação aceitadora é a linha germinativa humana IGKV1D-13, a linha germinativa humana IGHV3-66, a linha germinativa humana IGKV1-12 e/ou a linha germinativa humana IGHV4-31. Em modalidades, a armação humana contém 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2 resíduos de aminoácido de anticorpo doador.

[0276] Em um anticorpo humanizado da presente invenção, as cadeias pesada e leve aceitadoras não precisam necessariamente ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias compósitas tendo regiões de armação derivadas de cadeias diferentes.

[0277] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Mais particular o anticorpo anti-IL22 compreende uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano e uma região constante de cadeia leve humana.

[0278] Os anticorpos humanos compreendem as regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de comprimento completo que são derivadas de uma sequência da linha germinativa particular se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento completo do anticorpo são obtidos a partir de um sistema que usa os genes da imunoglobulina da linha germinativa humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico carreando os genes da imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou triando uma biblioteca de gene da imunoglobulina humana exibida em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é derivado de uma sequência da imunoglobulina da linha germinativa humana pode ser identificado como tal pela comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano com as sequências de aminoácido das imunoglobulinas da linha germinativa humana e selecionando a sequência da imunoglobulina da linha germinativa humana que está mais próxima na sequência (isto é, a maior % de identidade) com a sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é derivado de uma sequência da imunoglobulina da linha germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido quando comparadas com a sequência da linha germinativa, devido, por exemplo, às mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou introdução intencional da mutação direcionada ao sítio. Entretanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina da linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácido da imunoglobulina da linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linha germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência particular da linha germinativa humana não exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5 ou mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa.

[0279] Os anticorpos humanos podem ser produzidos pelos vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os anticorpos humanos podem ser fabricados pelo método do hibridoma usando mieloma humano ou linhagens de células de heteromieloma camundongo-ser humano (Kozbor, J. Immunol; (1984) 133: 3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). Os métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fago ou camundongos transgênicos ambos dos quais utilizam repertórios da região variável humana (Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12: 433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231: 11-23). Anticorpos humanos podem ser produzidos, por exemplo, pelos camundongos nos quais os genes da região variável da imunoglobulina de murino e opcionalmente da região constante foram substituídos pelas suas contrapartes humanas como descrito, por exemplo, na US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016 e US 5.770.429.

Moléculas efetoras

[0280] Se desejado um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser conjugado a uma ou mais molécula(s) efetora(s). Em uma modalidade o anticorpo não está ficado a uma molécula efetora.

[0281] Será avaliado que a molécula efetora pode compreender uma molécula efetora única ou duas ou mais de tais moléculas assim ligadas como para formar uma porção única que pode ser fixada aos anticorpos da presente invenção. Onde é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isto pode ser preparado pelos procedimentos de DNA químico ou recombinante padrão no que o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou via um agente de acoplamento à molécula efetora. As técnicas para conjugar tais moléculas efetoras aos anticorpos são bem conhecidas na técnica (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119-58 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos na WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03/031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo a ligação pode ser obtida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito na WO 86/01533 e EP0392745.

[0282] Os exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos incluindo qualquer agente que seja nocivo para (por exemplo mate) as células. Os exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.

[0283] As moléculas efetoras também incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (por exemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (por exemplo mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamidas, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas) e agentes antimitóticos (por exemplo vincristina e vinblastina).

[0284] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclídeos quelados tais como 111In e 90Y, Lu177, Bismuto213, Califórnio252, Irídio192 e Tungstênio188/Rênio188; ou fármacos tais como, mas não limitados a alquilfosfocolinas, inibidores da topoisomerase I, taxóides e suramina.

[0285] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas não são limitadas a enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. Proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não são limitados às imunoglobulinas, toxinas tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria, uma proteína tal como insulina, fator de necrose de tumor, interferon α, interferon β, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta ou ativador de plasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente antiangiogênico, por exemplo angiostatina ou endostatina ou, um modificador de resposta biológica tal como uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônia de macrófago granulócito (GM-CSF), fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF), fator de crescimento de nervo (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.

[0286] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis por exemplo em diagnóstico. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais de emissão de pósitron (para o uso na tomografia de emissão de pósitron) e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver no geral a US4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos para o uso como diagnósticos. As enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos protéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; os materiais luminescentes adequados incluem luminol; os materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e aequorina; e nuclídeos radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In e 99Tc.

[0287] Em um outro exemplo a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou realçar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial para o sistema imune. Os exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação de albumina ou compostos de ligação de albumina tais como aqueles descritos na WO2005/117984.

[0288] Onde a molécula efetora é um polímero a mesma pode, no geral, ser um polímero sintético ou um que ocorre naturalmente, por exemplo um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituída ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo um homo- ou hetero- polissacarídeo.

[0289] Os substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[0290] Os exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(álcool vinílico) ou derivados dos mesmos de cadeia reta ou ramificado opcionalmente substituídos, especialmente poli(etileno glicol) opcionalmente substituído tal como metoxipoli(etileno glicol) ou derivados dos mesmos.

[0291] Os polímeros específicos que ocorrem naturalmente incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados dos mesmos.

[0292] Em uma modalidade, o polímero é albumina ou um fragmento dos mesmos, tais como albumina sérica humana ou um fragmento dos mesmos.

[0293] O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas geralmente serão em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, por exemplo de 5000 a 40000 Da tal como de 20000 a 40000 Da. O tamanho de polímero pode em particular ser selecionado com base no uso pretendido do produto por exemplo, a capacidade para localizar em certos tecidos tais como tumores ou meia-vida circulante prolongada (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, onde o produto é pretendido deixar a circulação e penetrar o tecido, por exemplo para o uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo com um peso molecular em torno de 5000 Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais alto, por exemplo tendo um peso molecular na faixa de 20000 Da a 40000 Da.

[0294] Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado dos mesmos e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.

[0295] Em um exemplo, o anticorpo de acordo com a presente invenção é fixado às porções de poli(etileno glicol) (PEG). Em uma modalidade particular, o fragmento de ligação a antígeno de acordo com a presente invenção e as moléculas de PEG podem ser fixados através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou pode ser engenheirado no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver por exemplo US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade de terminal C da sua cadeia pesada um ou mais aminoácidos para permitir a fixação de uma molécula efetora. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode ser fixada. Os sítios múltiplos podem ser usados para fixar duas ou mais moléculas de PEG.

[0296] As moléculas de PEG adequadas são covalentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero fixada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligada ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente geralmente será uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação de enxofre-carbono. Onde um grupo tiol é usado como o ponto de fixação moléculas efetoras apropriadamente ativadas, por exemplo derivados seletivos em tiol tais como maleimidas e derivados de cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificado por polímero como descrita acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo de tiol tal como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo iodoacetamida, uma imida, por exemplo maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo da Nektar, antigamente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis usando procedimentos químicos convencionais. As moléculas de PEG particular incluem 20K metóxi-PEG-amina (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater; Rapp Polimere; e SunBio) e M-PEG- SPA (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater).

[0297] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento Fab modificado, fragmento Fab’ ou diFab que é PEGuilado, isto é, tem PEG (poli(etileno glicol)) covalentemente fixado a ele, por exemplo de acordo com o método descrito na EP 0948544 ou EP1090037 [ver também “Poly(ethilene glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, “Poly(ethilene glycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. Em um exemplo PEG é fixado a uma cisteína na região de dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado com PEG tem um grupo maleimida covalentemente ligado a um único grupo tiol em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode ser fixado um polímero de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG fixado ao fragmento Fab pode, portanto, ser de aproximadamente 40.000 Da.

[0298] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento Fab’ modificado tendo na extremidade de terminal C da sua cadeia pesada uma região de dobradiça modificada contendo pelo menos um resíduo de cisteína ao qual uma molécula efetora é fixada. Adequadamente a molécula efetora é PEG e é fixada usando os métodos descritos na (WO 98/25971 e WO 2004072116 ou na WO 2007/003898. As moléculas efetoras podem ser fixadas aos fragmentos de anticorpo usando os métodos descritos nos pedidos de patente internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 e WO 2005/003171.

[0299] Em uma modalidade o anticorpo não é fixado uma molécula efetora. Polinucleotídeos e vetores

[0300] A presente invenção também provê um polinucleotídeo isolado codificando o anticorpo ou uma parte dos mesmos de acordo com a presente invenção. O polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido pelo processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos. Tabela 7. Sequências de aminoácido dos anticorpos anti-IL22 e suas sequências de ácido nucleico correspondentes.

[0301] Os exemplos de sequências adequadas são aqui providos. Assim em uma modalidade a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado codificando um anticorpo, compreendendo uma sequência dada na SEQ ID NOs 23, 25, 27, 29, 31, 33, 73, 75, 77, 79, 81 e 83.

[0302] Em uma modalidade, a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado codificando a cadeia pesada de um fragmento Fab de anticorpo ou de um anticorpo IgG1 ou IgG4P da presente invenção que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 29, 31, 33 respectivamente.

[0303] Também é provido um polinucleotídeo isolado codificando a cadeia leve de um fragmento Fab de anticorpo ou de um anticorpo IgG1 ou IgG4 da presente invenção que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 79, 81, 83 respectivamente.

[0304] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado codificando a cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo Fab da presente invenção no qual o polinucleotídeo codificando a cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 29 ou 79 e o polinucleotídeo codificando a cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 27 ou 77.

[0305] A presente invenção também provê um vetor de clonagem ou expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos aqui descritos. Em um exemplo, o vetor de clonagem ou expressão de acordo com a presente invenção compreende um ou mais polinucleotídeos isolados compreendendo uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 73, 75, 77, 79, 81 e 83.

[0306] As técnicas padrão de biologia molecular pode ser usado para preparar sequências de DNA codificando o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo. Técnicas de mutagênese locodirigida e reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser usados como apropriado.

[0307] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. A este respeito, referência é feita ao “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e o Maniatis Manual produzido pela Cold Spring Harbor Publishing. Células hospedeiras para a produção dos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos

[0308] Também é provido uma célula hospedeira compreendendo uma ou mais sequências de polinucleotídeo isoladas de acordo com a invenção ou um ou mais vetores de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de polinucleotídeo isoladas codificando um anticorpo da presente invenção. Qualquer sistema de célula hospedeira pode ser usado para a expressão das sequências de polinucleotídeo codificando o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção. Sistemas bacterianos, por exemplo E. coli e outros sistemas microbianos podem ser usados ou sistemas de expressão de célula hospedeira eucariótica, por exemplo de mamífero, também podem ser usados. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, de mieloma ou hibridoma.

[0309] Em uma modalidade adicional, uma célula hospedeira compreendendo tal(is) ácido(s) nucleico(s) ou vetor(es) é provida. Em uma tal modalidade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo a VL do anticorpo anti-IL22 e uma sequência de aminoácido compreendendo a VH do anticorpo anti-IL22 ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo a VL do anticorpo anti-IL22 e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo a VH do anticorpo anti-IL22. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo uma célula do Ovário do Hamster Chinês (CHO) ou célula linfóide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Em uma modalidade, a célula hospedeira é procariótica, por exemplo uma célula da E. coli. Em uma modalidade, um método de fabricar um anticorpo anti-IL22 é provido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo, como provido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e opcionalmente recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[0310] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificando anticorpo incluem as células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando glicosilação e função efetora Fc não forem necessárias. Para a expressão de fragmento de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, a U.S. 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Ver também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo na E. coli). Depois da expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de célula bacteriana em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificada.

[0311] Além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificando anticorpo, incluindo fungos e cepas de levedura cujos caminhos de glicosilação foram “humanizados”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou completamente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) e Li et al., Nat. Biotech. 24: 210215 (2006).

[0312] Os tipos adequados de Ovário do Hamster Chinês (células CHO) para o uso na presente invenção podem incluir células CHO e CHO-K1 incluindo células dhfr-CHO, tais como células CHO-DG44 e células CHO-DXB11 e que podem ser usados com um marcador selecionável DHFR ou células CHOK1-SV que podem ser usados com um marcador selecionável da glutamina sintetase. Outros tipos de célula de uso na expressão de anticorpos incluem linhagens de célula linfocítica, por exemplo, células de mieloma NS0 e células SP2, as células COS. A célula hospedeira pode ser estavelmente transformada ou transfectada com as sequências isoladas de polinucleotídeo ou os vetores de expressão de acordo com a presente invenção. Processo para a produção dos anticorpos

[0313] A presente invenção também provê um processo para a produção de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção sob condições adequadas para produzir o anticorpo de acordo com a invenção e isolar o anticorpo.

[0314] O anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, em cujo caso apenas uma cadeia pesada ou cadeia leve da sequência codificadora do polipeptídeo precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos compreendendo cadeias tanto leves quanto pesadas, a linhagem de célula pode ser transfectadas com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo sequências codificando polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[0315] Assim, é provido um processo para cultivar uma célula hospedeira e expressando um anticorpo, isolar o anticorpo e opcionalmente purificar o anticorpo para prover um anticorpo isolado. Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente a etapa de conjugar uma molécula efetora ao anticorpo isolado.

[0316] A presente invenção também provê um processo para a produção de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira contendo um vetor da presente invenção sob condições adequadas para levar à expressão de proteína a partir do DNA codificando a molécula de anticorpo da presente invenção e isolar a molécula de anticorpo.

[0317] A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, em cujo caso apenas uma sequência codificadora de polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de produtos compreendendo tanto cadeias pesadas quanto leves, a linhagem de célula pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo sequências codificando polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[0318] Os anticorpos de acordo com a presente invenção são expressos em bons níveis de células hospedeiras. Assim as propriedades dos anticorpos parecem ser otimizados para processamento comercial.

Anticorpo purificado

[0319] Em uma modalidade é provido um anticorpo purificado, por exemplo um anticorpo humanizado, em particular um anticorpo de acordo com a invenção, na forma substancialmente purificada, em particular livre ou substancialmente livre de endotoxina e/ou proteína ou DNA de célula hospedeira.

[0320] Substancialmente livre de endotoxina é geralmente intencionado a se referir a um conteúdo de endotoxina de 1 EU por mg de produto de anticorpo ou menos tal como 0,5 ou 0,1 EU por mg de produto.

[0321] Substancialmente livre de proteína ou DNA de célula hospedeira é geralmente intencionado a se referir ao conteúdo de 400 μg por mg de proteína e/ou DNA de célula hospedeira de produto de anticorpo ou menos tal como 100 μg por mg ou menos, em particular 20 μg por mg, como apropriado.

Uso in vitro e ex vivo de anticorpo

[0322] A presente invenção também provê um método in vitro ou ex vivo de inibir a fosforilação de STAT3 induzida por IL-22, o método compreendendo contatar e incubar as células de queratinócitos com um anticorpo da invenção. Qualquer célula de queratinócito e seus derivados pode ser usada, incluindo, por exemplo, células HaCaT.

[0323] A presente invenção provê adicionalmente um método in vitro ou ex vivo de inibir a liberação de IL-10 induzida por IL-22, o método compreendendo contatar e incubar células epiteliais com um anticorpo de acordo com a presente invenção. Mais especificamente células COLO205 podem ser usadas.

[0324] Também é provido um método in vitro ou ex vivo de inibir a liberação de s100A7 induzida por IL22, o método compreendendo contatar e incubar queratinócitos com um anticorpo de acordo com a presente invenção.

[0325] Também é provido um método in vitro ou ex vivo de inibir o espessamento epidérmico ou corneal induzido por IL22 associado com diferenciação de queratinócito e paraqueratose aberrantes, o método compreendendo contatar e incubar um epitélio reconstituído consistindo de queratinócitos e fibroblastos dérmicos com um anticorpo de acordo com a presente invenção. Em particular a proliferação e diferenciação de queratinócito aberrantes demonstradas pelo espessamento epidérmico/ corneal e paraqueratose induzido pela IL22 são inibidas.

[0326] As células são geralmente incubadas por tempo suficiente para permitir que um anticorpo ligue à IL22 e cause o efeito biológico.

[0327] Os Exemplos proveem as descrições dos métodos envolvendo anticorpos anti-IL22 que podem ser usados para se obter certos efeitos biológicos.

Uso terapêutico dos anticorpos

[0328] Os anticorpos da invenção, formulações ou composições farmacêuticas dos mesmos podem ser administrados para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.

[0329] A presente invenção provê um anticorpo anti-IL22 da invenção ou composição farmacêutica do mesmo para o uso como um medicamento.

[0330] Nas aplicações profiláticas, anticorpos, formulações ou composições são administradas a um sujeito em risco de um distúrbio ou condição como aqui descrito, em uma quantidade suficiente para prevenir ou reduzir os efeitos subsequentes da condição ou um ou mais de seus sintomas.

[0331] Nas aplicações terapêuticas, os anticorpos são administrados a um sujeito que já sofre de um distúrbio ou condição como aqui descrito, em uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou parcialmente impedir a condição ou um ou mais de seus sintomas. Tal tratamento terapêutico pode resultar em uma diminuição na severidade de sintomas de doença ou um aumento na frequência ou duração de períodos livres de sintomas.

[0332] Os sujeitos a serem tratados podem ser animais. Preferivelmente, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são adaptadas para a administração aos sujeitos humanos.

[0333] A presente invenção provê um método de tratar um distúrbio ou condição como aqui descrito em um sujeito em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao sujeito um anticorpo de acordo com a presente invenção. Tal anticorpo é administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[0334] A presente invenção também provê um anticorpo da invenção para o uso no tratamento de um distúrbio ou condição como aqui descrita.

Indicações terapêuticas

[0335] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados no tratamento, prevenção ou melhora de qualquer condição que esteja associada com a atividade de IL22 ou IL22R1; por exemplo, qualquer condição que resulte no todo ou em parte da sinalização através do receptor de IL22R1.

[0336] Altos níveis de IL22 foram verificados nas placas psoriáticas humanas (Boniface et al., Clin Exp Immunol. 150: 407-415 (2007)) e o envolvimento desta citocina na patogênese de psoríase foi demonstrado em modelos de camundongo de inflamação de pele (Van Belle et al. J Immunol. 1 de janeiro; 188(1): 462-9 (2012)). Os ligantes, tais como IL22, que sinalizam via o IL22R1 foram implicados em várias doenças e visto que IL22R1 é predominantemente expresso nas células epiteliais e estrômicas, as doenças chaves são aquelas que afetam estromas e epitélios, por exemplo, na pele.

[0337] Os anticorpos e composições da presente invenção podem ser usados para tratar uma condição de pele inflamatória. Em certas modalidades, a condição de pele inflamatória é selecionada de psoríase, artrite psoriática, dermatite de contato, eczema de mão crônica ou dermatite atópica. Mais especificamente, a condição de pele inflamatória é dermatite atópica.

[0338] Em particular, os anticorpos e composições da invenção podem ser usados para inibir o espessamento epidérmico mediada pela IL22 associado com diferenciação de queratinócito e paraqueratose aberrantes em um sujeito diagnosticado com uma condição de pele inflamatória pela redução da proliferação e diferenciação de queratinócito mediadas por IL22 aberrantes.

[0339] Consequentemente, a invenção provê um método de atenuar a função de barreira prejudicada da pele e/ou paraqueratose e/ou a liberação de citocinas e/ou peptídeos antimicrobianos, tais como, por exemplo, S100A7 em um sujeito diagnosticado com uma condição de pele inflamatória, o método compreendendo administrar ao dito sujeito um anticorpo como provido na presente invenção.

[0340] Já em uma outra modalidade a presente invenção provê um anticorpo da invenção para o uso na atenuação da função de barreira prejudicada da pele e/ou paraqueratose e/ou a liberação de citocinas e/ou peptídeos antimicrobianos, tais como, por exemplo, S100A7 em um sujeito diagnosticados com uma condição de pele inflamatória.

[0341] Já em uma outra modalidade a presente invenção provê o uso de um anticorpo da invenção para a fabricação de um medicamento para atenuar a função de barreira prejudicada da pele e/ou paraqueratose e/ou a liberação de citocinas e/ou peptídeos antimicrobianos, tais como, por exemplo, S100A7 em um sujeito diagnosticado com uma doença inflamatória de pele.

[0342] Em particular, tal atenuação de função de barreira prejudicada da pele é obtida pela redução da proliferação e diferenciação de queratinócito mediada por IL- 22 aberrante.

[0343] Os anticorpos e composições da presente invenção podem ser usados para inibir direta ou indiretamente a proliferação, diferenciação e/ou sobrevivência de células imunes ou hematopoiéticas, tais como células mielóides, linfóides ou eritróides ou células precursoras dos mesmos.

[0344] Os anticorpos e composições da presente invenção podem ser usados para tratar uma variedade de distúrbios imunes e distúrbios hiperproliferativos.

[0345] Os exemplos de distúrbios imunes que podem ser tratados incluem, mas não são limitados a, distúrbios autoimunes, por exemplo, artrite (incluindo artrite reumatóide (RA), artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoríatica, artrite associada ao lúpus ou espondilite anquilosante), escleroderma, lúpus eritematóide sistêmico, HIV, síndrome de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tiroidite autoimune, dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematosa), miastenia grave, doença intestinal inflamatória (IBD), doença de Crohn, colite, diabete melito (tipo I); condições inflamatórias, por exemplo, da pele (por exemplo, psoríase), sistema cardiovascular (por exemplo, aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo, doença de Alzheimer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por exemplo, nefrite) e pâncreas (por exemplo, pancreatite); distúrbios cardiovasculares, por exemplo, distúrbios metabólicos de colesterol, lesão de radical livre de oxigênio, isquemia; distúrbios associados com cicatrização de ferimento; distúrbios respiratórios, por exemplo, asma e COPD (por exemplo, fibrose cística); condições inflamatórias agudas (por exemplo, endotoxemia, sepse e septicemia, síndrome do choque tóxico e doença infecciosa); rejeição de transplante e alergia.

[0346] Os anticorpos e composições da presente invenção podem ser usados para tratar um distúrbio associado com IL-22 tal como, um distúrbio artrítico, por exemplo, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática ou espondilite anquilosante; um distúrbio respiratório (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); sistema cardiovascular (por exemplo, aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo, doença de Alzheimer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por exemplo, nefrite), pâncreas (por exemplo, pancreatite) e órgãos gastrointestinais, por exemplo, colite, doença de Crohn e IBD; condições inflamatórias agudas, por exemplo, endotoxemia, sepse e septicemia, síndrome de choque tóxico e doença infecciosa; insuficiência de órgão múltiplo; doença respiratória (ARD); amiloidose; nefropatias tais como glomerulosclerose, neuropatia membranosa, arteriosclerose renal, glomerulonefrite, doenças fibroproliferativas do rim, assim como outras disfunções e tumores renais.

[0347] Os anticorpos e composições anti-IL-22 da invenção podem ser usados para tratar canceres epiteliais, por exemplo, carcinoma, melanoma e outros. A inibição de IL-22 nestes e outros estados de doença é descrita na WO 03/083062.

[0348] Os anticorpos e composições da presente invenção podem similarmente ser usados para tratar esclerose múltipla nos seres humanos. No modelo de camundongo para esclerose múltipla (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 11261130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401) e Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129), o tratamento de camundongos com anticorpos anti-IL22 pode retardar profundamente o início da doença.

[0349] Os anticorpos e composições da presente invenção podem ser usados para tratar artrite reumatóide (RA) ou outras doenças artríticas. Nas biópsias sinoviais da RA, a proteína IL22 é detectada em vimentina + fibroblastos sinoviais e alguns macrófagos CD68+ enquanto IL22R1 é detectada nos fibroblastos sinoviais. Os inibidores de IL22 melhoram sintomas de artrite reumatóide (WO2005/000897; US 6.939.545).

[0350] Os anticorpos e composições da presente invenção podem ser usados para reduzir a reação de linfócito misto (MLR) e tratar a rejeição de transplante e doenças relacionadas (por exemplo, doença do enxerto versus hospedeiro) que são dependentes de IL22. MLR e modelos de transplante foram descritos pela Current Protocols in Immunology, Segunda Edição, Coligan et al. eds., John Wiley & Sons, 1994; Kasaian et al. (Immunity (2002) 16: 559-569)).

[0351] Os anticorpos e composições da presente invenção também podem ser usados para tratar distúrbios hiperproliferativo associados com atividade aberrante de células responsivas à IL22 e células responsivas em IL22R1/IL10R2 pela administração dos anticorpos em uma quantidade suficiente para inibir ou reduzir a hiperproliferação de IL22 e/ou IL22R1 e/ou IL10R2 em um sujeito.

[0352] Consequentemente, os anticorpos da invenção podem ser usados para inibir a progressão de neoplasmos, por exemplo carcinomas de célula escamosa, carcinomas de célula basal, papilomas e carcinomas de célula transicional, adenomas, adenocarcinoma, linite plástica, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, vipoma, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma adenóide cístico, tumor carcinóide de apêndice, prolactinoma, oncocitoma, adenoma de célula de Hurthle, carcinoma de célula renal, tumor de Grawitz, adenomas endócrino múltiplo, adenoma endometróide, neoplasias de apêndice adnexal e de pele, neoplasmos mucoepidermóides, neoplasmos císticos, mucinosos e serosos, cistadenoma, pseudomixoma peritoneal, neoplasmas dutais, lobulares e medulares, neoplasmas celulares acinares, neoplasmas epiteliais complexos, tumor de Warthin, timoma, neoplasmos gonadais especializados, tumor estrômico do cordão sexual, tecoma, tumor de célula granulosa, arrenoblastoma, tumor de célula de sertoli-leydig, paraganglioma, feocromocitoma, tumor glômico, nevo melanocítico, melanoma maligno, melanoma, melanoma nodular, nevo displástico, lentigo maligno, melanoma de espalhamento superficial ou melanoma lentiginoso acral.

[0353] Os anticorpos e composições da presente invenção também podem ser usados para reduzir uma resposta de fase aguda em um sujeito.

[0354] Os anticorpos e composições da presente invenção também podem ser usados para tratar a síndrome de Sjogren ou canceres selecionados de hepatocarcinoma, lipossarcoma, carcinoma de célula escamosa oral, câncer de cólon e colorretal, câncer pancreático, câncer pulmonar de célula pequena e grande, câncer de mama, glioblastoma, linfoma de célula T cutânea, linfoma de célula grande anaplástica, linfoma de célula do manto.

Uso em diagnóstico dos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos

[0355] A presente invenção também provê o uso dos anticorpos da presente invenção como agentes diagnosticamente ativos ou nos ensaios de diagnóstico, por exemplo, para diagnosticar doenças inflamatórias de pele ou sua severidade.

[0356] O diagnóstico pode preferivelmente ser realizado nas amostras biológicas. Uma “amostra biológica” abrange uma variedade de tipos de amostras obtidas a partir de um indivíduo e pode ser usada em um ensaio de diagnóstico ou monitoramento. A definição abrange fluido cérebro-espinhal, sangue tal como plasma e soro e outras amostras líquidas de origem biológica tais como urina e saliva, As amostras sólidas e de tecido tais como um espécime de biópsia ou culturas celulares ou células derivadas das mesmas e a progênie das mesmas. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer modo depois da sua obtenção, tal como pelo tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento quanto a certos componentes, tais como polinucleotídeos.

[0357] O teste de diagnóstico pode preferivelmente ser realizada nas amostras biológicas que não estão em contato com o corpo humano ou animal. Tal teste de diagnóstico também é aludido como teste in vitro. O teste de diagnóstico in vitro pode contar com um método in vitro de detecção de IL22 livre (por exemplo não ligado a IL22BP) em uma amostra biológica, que foi obtida a partir de um sujeito. Composições farmacêuticas e de diagnóstico

[0358] Um anticorpo da invenção pode ser provido em uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica normalmente será estéril e pode adicionalmente compreende um adjuvante e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[0359] Visto que os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento, diagnóstico e/ou profilaxia de um distúrbio ou condição como aqui descrita, a presente invenção também provê uma composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais de um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0360] Em particular o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é provido como uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[0361] Estas composições podem compreender, além do(s) ingrediente(s) terapeuticamente ativo(s), um excipiente, carreador, diluente, tampão, estabilizante farmaceuticamente aceitáveis ou outros materiais bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo.

[0362] Também são providas composições, incluindo formulações farmacêuticas, compreendendo um anticorpo anti-IL22 da invenção ou polinucleotídeos compreendendo sequências codificando um anticorpo da invenção. Em certas modalidades, as composições compreendem um ou mais anticorpos da invenção ou um ou mais polinucleotídeos compreendendo sequências codificando um ou mais anticorpos da invenção. Estas composições podem adicionalmente compreender carreadores adequados, tais como excipientes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica.

[0363] As composições farmacêuticas de um anticorpo da presente invenção são preparadas misturando-se tal anticorpo tendo o grau desejado de pureza com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

[0364] Os exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser verificados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20a Edição, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.

[0365] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem, mas não são limitados a: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menor do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como complexos de sódio:metal (por exemplo complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como polietileno glicol (PEG). Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis exemplares aqui incluem adicionalmente agentes de dispersão de fármaco intersticial tais como glicoproteínas de hialuronidase neutras-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HILENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritas na US 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais tais como condroitinases.

[0366] As formulações de anticorpo liofilizadas exemplares são descritas na US 6.267.958. As formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na US 6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.

[0367] Ingrediente ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, nos sistemas de distribuição de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

[0368] As preparações de liberação prolongada também podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo películas ou microcápsulas.

[0369] As formulações a serem usadas para a administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéril.

[0370] As formulações de anticorpo liofilizadas estéreis são descritas na US 6.267.958. As formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na US 6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.

[0371] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0372] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis compreendem carreadores ou diluentes aquosos. Os exemplos de carreadores aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, água tamponada e solução salina. Os exemplos de outros carreadores incluem etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.

[0373] As composições farmacêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco.

[0374] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é o único ingrediente ativo. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção está em combinação com um ou mais ingredientes ativos adicionais. Alternativamente, as composições farmacêuticas compreendem o anticorpo da presente invenção que é o único ingrediente ativo e o mesmo pode ser administrado individualmente a um paciente em combinação (por exemplo simultaneamente, sequencialmente ou separadamente) com outros agentes, fármacos ou hormônios.

[0375] A natureza precisa do carreador ou outro material pode depender da via de administração, por exemplo as vias orais, intravenosas, cutâneas ou subcutâneas, nasais, intramusculares e intraperitoneais. Por exemplo, a forma oral sólida pode conter, junto com a substância ativa, diluentes, por exemplo lactose, dextrose, sacarose, celulose, amido de milho ou amido de batata; lubrificantes, por exemplo sílica, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicóis; agentes de ligação; por exemplo amidos, goma arábica, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou polivinil pirrolidona; agentes de desagregação, por exemplo amido, ácido algínico, alginatos ou amido glicolato de sódio; misturas efervescentes; corantes; adoçantes; agentes de umectação, tais como lecitina, polissorbatos, laurilsulfatos; e, no geral, substâncias não tóxicas e farmacologicamente inativas usadas nas formulações farmacêuticas. Tais preparações farmacêuticas podem ser fabricadas na maneira conhecida, por exemplo, por meio de misturas, granulação, tabletagem, revestimento de açúcar ou processos de revestimento com película.

[0376] As formulações orais incluem tais excipientes normalmente utilizadas como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada ou pós e contêm 10% a 95% de ingrediente ativo, preferivelmente 25% a 70%. Onde a composição farmacêutica é liofilisada, o material liofilisado pode ser reconstituído antes da administração, por exemplo uma suspensão. A reconstituição é preferivelmente efetuada em tampão.

[0377] As soluções para a administração intravenosa ou infusão podem conter como carreador, por exemplo, água estéril ou preferivelmente elas podem estar na forma de soluções salinas estéreis, aquosas, isotônicas.

[0378] Preferivelmente, a composição farmacêutica ou de diagnóstico compreende um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção. Determinação da quantidade e dosagem terapeuticamente eficazes

[0379] Os anticorpos e composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser administrados adequadamente a um paciente para identificar a quantidade terapeuticamente eficaz requerida. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura de célula ou em modelos de animal, usualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo de animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e via de administração. Tal informação pode depois ser usada para determinar doses e vias úteis para a administração em seres humanos.

[0380] A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um sujeito humano dependerá da severidade do estado de doença, da saúde geral do sujeito, da idade, peso e gênero do sujeito, dieta, tempo e frequência de administração, combinação(ões) de fármaco, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. As composições podem ser convenientemente apresentadas na forma de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da descrição por dose. As faixas de dose e regimes para qualquer uma das modalidades aqui descritas incluem, mas não são limitados a dosagens variando de doses unitárias de 1 mg a 1000 mg.

[0381] Uma dosagem adequada de um anticorpo ou composição farmacêutica da invenção pode ser determinada por um médico versado. Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para se obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem serem tóxicos para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizadas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que é utilizado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares utilizadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que é tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0382] Uma dose adequada pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 0,01 μg/kg a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal, tipicamente de cerca de 0,1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, do paciente a ser tratado.

[0383] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para prover a resposta ideal desejada (por exemplo, um resposta terapêutica). Por exemplo, uma dose única pode ser administrada, diversas doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. A forma de dosagem unitária como aqui usado se refere a unidades fisicamente separadas preparadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido.

Administração de composições ou formulações farmacêuticas

[0384] Os anticorpos aqui descritos ou formulações ou composições dos mesmos podem ser administrados para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.

[0385] Um anticorpo ou composição farmacêutica da invenção podem ser administrados por intermédio de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será avaliado pela pessoa versada, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Os exemplos de vias de administração para os anticorpos ou composições farmacêuticas da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo pela injeção ou infusão. Alternativamente, o anticorpo ou composição farmacêutica da invenção podem ser administrados por intermédio de uma via não parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucósica de administração. O anticorpo ou composição farmacêutica da invenção pode ser para a administração oral.

[0386] A forma adequada para administração inclui administração parenteral, por exemplo pela injeção ou infusão, por exemplo pela injeção de bolo ou infusão contínua, na forma intravenosa, inalável ou subcutânea. Onde o produto é para injeção ou infusão, o mesmo pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes adicionais, tais como agentes de suspensão, preservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a invenção pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado. A forma sólida adequada para solução em ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção também pode ser preparada.

[0387] Uma vez formuladas, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas diretamente ao sujeito. Consequentemente, é aqui provido o uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento.

Artigos de fabricação e kits

[0388] A presente descrição também provê kits compreendendo os anticorpos anti-IL22 da presente invenção e instruções para o uso. O kit pode conter adicionalmente um ou mais reagentes adicionais, tais como um agente terapêutico ou profilático adicionais como debatido acima.

[0389] A presente invenção provê o uso de um anticorpo de acordo com a invenção ou composição farmacêutica do mesmo para a fabricação de um medicamento.

[0390] A presente invenção também provê o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou condição como aqui descrita.

[0391] Em certas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende um recipiente contendo um ou mais dos anticorpos da invenção ou as composições aqui descritas. Em certas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende um recipiente contendo ácido(s) nucléico (s) codificando um (ou mais) dos anticorpos ou as composições aqui descritas. Em algumas modalidades, o kit inclui uma célula ou linha de célula que produz um anticorpo como aqui descrito.

[0392] Em certas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende um recipiente e um etiqueta ou inserto de pacote no ou associado com o recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente retem uma composição que é por si só ou combinado com uma outra composição eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico e pode ter um orifício de acesso estéril. Pelo menos um agente na composição é um anticorpo da presente invenção. A etiqueta ou inserto de embalagem indica que a composição é usada para o tratamento de uma condição de pele inflamatória, mais especificamente dermatite atópica.

[0393] Deve ser citado que as modalidades mencionadas acima ilustram ao invés de limitar a invenção e que aqueles versados na técnica serão capazes de projetar muitas modalidades alternativas sem divergir do escopo das reivindicações. Nas reivindicações, qualquer sinal de referência colocado em parênteses não deve ser interpretado como limitando a reivindicação.

[0394] As sequências incluídas na presente invenção são mostradas nas Tabelas 8 a 10: Tabela 8. Sequências de IL22 Tabela 9. Sequências do anticorpo 11041 e variantes relacionadas Tabela 9. Sequências do anticorpo 11070 e variantes relacionadas

EXEMPLOS Exemplo 1. Geração e seleção de anticorpos terapêuticos anti-IL22 11041 e 11070

[0395] Vários dos animais através de espécies diferentes (incluindo camundongos, ratos e coelhos) foram imunizados com IL22 humanos internamente produzidos purificados ou comercialmente disponíveis (R&D systems). A seguir de 3 a 5 doses, os animais foram sacrificados e PBMC, baço, medula óssea e linfônodos colhidos. Os soros foram monitorados para ligação à IL22 humana e de cinomolgo no ELISA.

[0396] No caso de 11041, as culturas de célula B de memória foram ajustadas e os sobrenadantes foram primeiro triados quanto à sua capacidade para ligar IL22 humana e de cinomolgo em um ensaio à base de grânulos no sistema Mirrorball da TTP Labtech. Este foi um ensaio multiplex homogêneo usando IL22 humana biotinilada e IL22 de cinomolgo biotinilado revestido sobre grânulos de estreptavidina Sol-R (TTP Labtech) e um conjugado Fc-FITC anticoelho de cabra como um agente de revelação.

[0397] Aprox. 4500 acertos positivos específico de IL22 foram identificados nas triagem Mirrorball primária de um total de experimentos de cultura B em 12 x (164400) placas. Os sobrenadantes positivas a partir deste ensaio foram depois progredidos para caracterização adicional pelo: • ELISA para confirmar a ligação à IL-22 humana e de macaco cinomolgo, • progressão em um ensaio de célula HACAT fosfo STAT3 HTRF dependente de IL22 (CisBio) para identificar neutralizadores e, • caracterização em BIAcore para estimar a taxa de dissociação e para caracterizar o modo de ação de neutralização.

[0398] A neutralização foi categorizada como bin 1 ou bin 2. Bin 1 representa um anticorpo que se liga à IL22 humana e impede a ligação de IL22R1. Bin 2 representa um anticorpo que liga IL22 humana mas permite a ligação de IL22R1. Nós selecionamos anticorpos que operaram por intermédio de bin 1. Os poços demonstrando a neutralização no ensaio fosfo STAT3 HTRF e/ou poços com perfis de BIAcore desejáveis foram progredidos para a recuperação da região V usando o método de focos fluorescentes.

[0399] As células plasmáticas de medula óssea foram também diretamente triadas quanto à sua capacidade para ligar IL22 humana usando o método de focos fluorescentes (relevante para 11070). Aqui, as células B secretando anticorpos específicos de IL22 foram implicadas com a IL22 humanas biotiniladas imobilizadas sobre pérolas de estreptavidina usando um reagente de revelação de conjugado de Fc-FITC anti-rato de cabra. Aprox. 300 focos diretos foram escolhidos.

[0400] A seguir da transcrição reversa (RT) e PCR das células escolhidas, produtos de ‘PCR transcricionalmente ativa’ (TAP) codificando as regiões V dos anticorpos foram gerados e usados para transfectar transitoriamente as células HEK- 293. Os sobrenadantes TAP resultantes, contendo anticorpo recombinante, foram testados quanto à sua capacidade para; ligar IL22 humana e de cinomolgo, ligação IL22R1 de bloco no BIAcore e neutralizam IL22 nos ensaios de célula HACAT fosfo STAT3 HTRF.

[0401] Os pares de gene da região variável de cadeia pesada e leve de produtos TAP interessantes foram depois clonados como anticorpos Fab de coelho ou camundongo e re-expressados em um sistema de expressão transitório HEK-293. Nas regiões 131 V totais foram clonados e sequenciados. Os anticorpos clonados recombinantes foram depois retestados quanto à sua capacidade para ligar IL22 humana e de cinomolgo, bloqueia a ligação de IL22R1 no BIAcore e neutralizam a liberação de IL-10 dependente de IL22 no ensaio à base de célula COLO205 IL-10 HTRF (CisBio). Seguindo esta caracterização, 2 anticorpos satisfizeram os critérios, isto é, 11041 derivada de coelho e 11070 derivada de rato.

[0402] Com base na potência de neutralização, a afinidade para IL22 tanto humana quanto de cinomolgo, conteúdo de doador nos enxertos humanizados (ver abaixo) e dados de expressão, 11041 derivada de coelho foi selecionada para progressão adicional.

Exemplo 2. Ligação de 11041 de coelho para IL22 de ser humano, de cinomolgo e de camundongo

[0403] A afinidade de Fab de 11041 de coelho purificado com a IL22 de ser humano, de cinomolgo e de camundongo foi avaliada usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) pela captura do Fab 11041 de coelho a um F(ab’)2 de IgG anti coelho imobilizado seguido pela titulação de IL22 de cada espécie. Fragmento específico de IgG-F(ab’)2 anti-Coelho de Cabra Affinipure (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado sobre um CM5 Sensor Chip por intermédio da química de ligação de amina a um nível de captura de ~5000 unidades de resposta (RUs). Tampão HBS-EP+ (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de Tensoativo P20, GE Healthcare) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 μL/min. Uma injeção de 10 μL de 11041 Fab a 0,5 μg/mL foi usada para capturar pelo Fab Anti-Coelho de Cabra imobilizado. IL22 Humana, IL22 de Cinomolgo e IL22 de camundongo foram tituladas sobre o 11041 Fab capturado (a 0 nM, 0,6 nM, 1,8 nM, 5,5 nM, 16,6 nM e 50 nM) em uma taxa de fluxo de 30 μL/min para avaliar a afinidade. O bloqueio de IL22R1 humano foi avaliado pela injeção de 100 nM de IL-22 (por 180 segundos a 30 μL/min) seguido pela injeção de IL22R1 humano (a 50 nM por 180s).

[0404] A superfície foi gerada pela injeção de 2 X 10 μL de injeção de 50 mM de HCl, intercalada por uma injeção de 10 μL de NaOH a 5 mM na taxa de fluxo de 10 μL/min. As curvas de ligação de subtração de fundo foram analisadas usando o software de avaliação Biacore T200 seguindo procedimentos padrão. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste. Os parâmetros cinéticos de ligação de 11041 purificada à IL22 humana, de cinomolgo e de camundongo são mostrados na Tabela 11. Tabela 11 Parâmetros cinéticos de ligação de 11041 de coelho à IL22 humana, de cinomolgo e de camundongo

Exemplo 3. Humanização de 11041

[0405] O anticorpo 11041 foi humanizado pelo enxerto das CDRs da região V de coelho nas armações da região V de anticorpo da linha germinativa humana. De modo a recuperar a atividade do anticorpo, vários resíduos de armação da região V de coelho foram também retidos na sequência humanizada. Estes resíduos foram selecionados usando o protocolo esboçado por Adair et al. (1991) (WO91/09967). Os alinhamentos das sequências da região V do anticorpo de coelho (doador) com as sequências da região V da linha germinativa humana (aceitadora) são mostradas nas Figuras 1 e 2, junto com as sequências humanizadas designadas. As CDRs enxertadas da sequência doadora para a aceitadora são como definidas por Kabat (Kabat et al., 1987), com a exceção da CDR-H1 onde a definição de Chothia/Kabat combinada é usada (ver Adair et al., WO91/09967).

[0406] A região V humana IGKV1D-13 mais a região J IGKJ4 (IMGT, www.imgt.org/) foi escolhida como o aceitador para as CDRs de cadeia leve do anticorpo 11041. Os resíduos de armação da cadeia leve nas variantes enxertadas humanizadas são todas do gene da linha germinativa humana, com a exceção de nenhum, um ou dois resíduos do grupo compreendendo resíduos 2 e 3 (com referência à SEQ ID NO: 38 gL1), onde os resíduos doadores Valina (V2) e Valina (V3) foram retidos, respectivamente. Em algumas variantes de enxerto humanizadas, um resíduo de Cisteína não emparelhado/livre na posição 91 na CDRL3 foi removido pela mutação para Valina (C91V) ou Serina (C91S): resíduos de cisteína livre pode estar sujeito à modificação pós-traducional, tal como cisteinilação e pode contribuir para a agregação covalente e estabilidade pobre. A mutação deste resíduo resultou em um aumento inesperado de 15 a 50 vezes na afinidade de ligação, respectivamente, como medido pela ressonância plasmônica superficial (Tabela 12, gL1gH1 (642 pM) comparado a gL1 (C91V)gH1 (41,9 pM) ou gL1(C91S)gH1 (12,4 pM)). Em algumas variantes de enxerto humanizadas, um sítio de desamidação da Asparagina potencial em CDRL3 foi modificado pela substituição do resíduo de Asparagina na posição 95 com Ácido aspártico (N95D) ou pela substituição do resíduo de Serina na posição 96 com Alanina (S96A). A modificação do sítio de desamidação pela mutação S96A significantemente reduziu o nível basal de desamidação.

[0407] A região V humana IGHV3-66 mais a região J IGHJ4 (IMGT, www.imgt.org/) foi escolhida como o aceitador para as CDRs de cadeia pesada do anticorpo 11041. Em comum com muitos anticorpos de coelho, o gene VH do anticorpo 11041 é mais curto do que o aceitador humano selecionado. Quando alinhado com a sequência aceitadora humana, a armação 1 da região VH do anticorpo 11041 carece do resíduo de terminal N, que é retido no anticorpo humanizado (Figura 2). A armação 3 da região VH de coelho 11041 também carece de dois resíduos (75 e 76, com referência à SEQ ID NO: 49 gH1) na alça entre filamentos de folha beta D e E: nas variantes de enxerto humanizado o intervalo é cheio com os resíduos correspondentes (Lisina 75, K75; Asparagina 76, N76) da sequência aceitadora humana selecionada (Figura 2). Os resíduos de armação da cadeia pesada nas variantes de enxerto humanizadas são todas do gene da linha germinativa humana, com a exceção dos resíduos 24, 48, 49, 73 e 78 (com referência à SEQ ID NO: 49 gH1), onde os resíduos doadores de Valina (V24), Isoleucina (I48), Glicina (G49), Serina (S73) e Valina (V78) foram retidos, respectivamente. A retenção de resíduos doadores V24, I48, G49 e V78 foi essencialmente para a ligação de afinidade mais alta para IL-22 humana, como medida pela ressonância plasmônica superficial. Em algumas variantes de enxerto humanizadas, um sítio de isomerização do Ácido aspártico potencial na CDRH2 foi modificado pela substituição do resíduo de Ácido aspártico na posição 54 com ácido glutâmico (D54E) ou pela substituição do resíduo de Glicina na posição 55 com Alanina (G55A). Em algumas variantes de enxerto humanizado, um sítio de hidrólise potencial na CDRH3 foi modificado pela substituição do resíduo de Ácido aspártico na posição 107 com ácido glutâmico (D107E). Tabela 12. Afinidade de ligação de variantes geradas diferentes de anticorpo 11041

Exemplo 4. Humanização de 11070

[0408] O anticorpo 11070 foi humanizado pelo enxerto das CDRs da região V de rato nas armações da região V de anticorpo da linha germinativa humana. De modo a recuperar a atividade do anticorpo, vários dos resíduos de armação da região V de rato também foram retidos na sequência humanizada. Estes resíduos foram selecionados usando o protocolo esboçado por Adair et al. (1991) (WO91/09967). Os alinhamentos das sequências da região V de anticorpo de rato (doador) com as sequências da região V da linha germinativa humana (aceitador) são mostrados nas Figuras 3A e 3B, junto com as sequências humanizadas designadas. As CDRs enxertadas da sequência doadora para a aceitadora são como definidas por Kabat (Kabat et al., 1987), com a exceção da CDR-H1 onde a definição de Chothia/Kabat combinada é usada (ver Adair et al., WO91/09967).

[0409] A região V humana IGKV1-12 mais região J IGKJ2 (IMGT, www.imgt.org/) foi escolhida como a aceitadora para as CDRs de cadeia leve do anticorpo 11070. Os resíduos de armação de cadeia leve nas variantes enxertadas humanizadas são todas do gene da linha germinativa humana, com a exceção de um ou mais resíduos do grupo compreendendo resíduos 3, 44, 58 e 68 (com referência à SEQ ID NO: 88 gL1), onde os resíduos doadores Valina (V3), Asparagina (N44), Treonina (T58) e Serina (S68) foram retidos, respectivamente. A retenção de resíduo doador N44 foi essencial para a ligação de afinidade mais alta para a IL-22 humana, como medida pela ressonância plasmônica superficial (Tabela 13).

[0410] A região V humana IGHV4-31 mais a região J IGHJ6 (IMGT, www.imgt.org/) foi escolhida como a aceitadora para as CDRs de cadeia pesada do anticorpo 11070. Os resíduos de armação da cadeia pesada nas variantes enxertadas humanizadas são todas do gene da linha germinativa humana, com a exceção de uma ou mais resíduos do grupo compreendendo resíduos 37, 41, 48, 67, 71, 76 e 78 (com referência à SEQ ID NO: 89 gH1), onde os resíduos doadores Valina (V37), Serina (S41), Metionina (M48), Leucina (L67), Arginina (R71), Serina (S76) e Valina (V78) foram retidos, respectivamente. O resíduo de Glutamina na posição 1 da armação humana foi substituída com Ácido glutâmico (E1) para proporcionar a expressão e purificação de um produto homogêneo: a conversão de Glutamina para piroGlutamato no terminal N de anticorpos e fragmentos de anticorpo é amplamente reportada. A retenção de resíduos doadores V37, L67, R71 e V78 foi essencial para a ligação de afinidade mais alta para IL-22 humana, como medida por ressonância plasmônica superficial (Tabela 13). Em algumas variantes de enxerto humanizadas, um sítio de desamidação de Asparagina potencial na CDRH2 foi modificada pela substituição do resíduo de Serina na posição 61 com Treonina (S61T). Tabela 13. Afinidade de ligação de variantes geradas diferentes de anticorpo 11070

Exemplo 5. Clonagem e produção de variantes

[0411] Os genes codificando variantes diferentes das sequências da região V de cadeia pesada e leve foram designados e construídos por um método de síntese automatizado pela ATUM (Newark, CA). Variantes adicionais das regiões V de cadeia pesada e leve foram criadas pela modificação dos genes VH e VK pela mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, incluindo, em alguns casos, mutações dentro das CDRs. Para a expressão transitória em células de mamífero, os genes da região V da cadeia leve humanizada foram clonadas dentro do vetor de expressão de cadeia leve UCB pMhCK, que contém DNA codificando a região constante de cadeia Capa humana (alotipo Km3). Os genes da região V da cadeia pesada humanizada foram clonadas dentro do vetor de expressão da cadeia pesada UCB Fab gama-1 humana pMhFabnh, que contém DNA codificando o domínio de dobradiça CH1 gama-1 humana. A cotransfecção dos vetores de cadeia pesada e leve resultando nas células em suspensão Expi293®deram a expressão dos anticorpos humanizados, recombinantes no formato Fab humano. Os anticorpos Fab humanizados variantes foram avaliados quanto à sua afinidade de ligação para IL-22 humana relativa ao anticorpo precursor, a sua potência nos ensaios in vitro, as suas propriedades biofísicas e adequadamente para o processamento a jusante.

Exemplo 6. Propriedades de ligação de anticorpo 11041 humanizado

[0412] As amostras humanizadas para o anticorpo 11041 foram testadas pela captura das amostras na IgG-F(ab’)2 anti-ser humano imobilizada depois titulação de IL22 humana sobre a superfície capturada. O ensaio foi conduzido no instrumento Biacore 8K (GE Healthcare) e BIA (Biomolecular Interaction Analysis) foi realizada usando o software de avaliação Biacore 8000. O fragmento específico IgG-F(ab’)2 anti-ser humano de Cabra Affinpure (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado sobre um Chip Sensor CM5 via a química de acoplamento de amina a um nível de captura de ~5000 unidades de resposta (RUs). Tampão HBS-EP+ (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de Tensoativo P20, GE Healthcare) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 μL/min. Uma injeção de 10 μL de amostras humanizadas de anticorpo 11041 a 0,5 μg/mL foi usada parar capturar pela IgG de Fab anti-ser humano de Cabra imobilizada. A IL22 humana (50 nM, 16,7 nM, 5,6 nM, 1,9 nM e 617 pM) e foram tituladas sobre os anticorpos 11041 capturado em uma taxa de fluxo de 30 μL/min.

[0413] A superfície foi gerada por injeções 2 X 10 μL de HCl a 50 mM, intercalada por uma injeção de 5 μL de NaOH 5 mM na taxa de fluxo de 10 μL/min. As curvas de ligação de subtração de fundo foram analisadas usando o software Insight evaluation seguindo os procedimentos padrão. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste. A afinidade de IL22 determinada a partir de um único experimento é mostrado na Tabela 14 e foi mostrado ser menor do que 100 pM. Tabela 14. Afinidade de ligação entre Fab 11041 humanizado e IL22

Exemplo 7. Bloqueio da Interação de IL22/IL22R1 pelo Fab 11041

[0414] Um ensaio de bloqueio cruzado foi realizado em um Biacore 4000 (GE Healthcare) para determinar se o anticorpo 11041 de coelho se liga ao mesmo sítio de ligação como IL22R1.

[0415] Um chip CM5 Sensor foi preparado pela ativação com uma injeção de 7 minutos (a 10 μL min-1) de uma mistura de EDC/NHS (GE Healthcare) seguido por uma injeção de 7 minutos de um Fab’2 de cabra específico de Fab de coelho (Jackson Immuno Research) a 50 μg/ml em tampão de acetato pH 5,0 (GE Healthcare) para se obter um nível de imobilização de aproximadamente 5500 RU. Finalmente, uma injeção de 7 minutos (a 10 μL min-1) de Cloridreto de etanolamina- NaOH 1M pH 8,5 foi realizada para desativar a superfície. Uma superfície de referência foi preparada como acima, omitindo o anticorpo de captura específico de coelho-Fc.

[0416] A competição cruzada foi realizada a 25°C em tampão de HBS-EP+ (GE Healthcare). Cada ciclo de análise envolveu a injeção de uma região variável, formatada como um Fab de coelho seguido por uma injeção de IL-22 humana a 100 nM e finalmente uma injeção de IL-22R1 a 50 nM. As respostas de ligação foram calculadas depois da subtração de branco de tampão e nenhuma das amostras de controle de captura. Uma resposta positiva para a IL-22R1 indicaria que o anticorpo 11041 liga a um epítopo diferente de IL-22R1. Uma falta de resposta para a IL-22R1 indicaria que o sítio de ligação de anticorpo 11041 na IL-22 sobrepõe com o sítio de ligação de IL-22R1. Depois de cada ciclo a superfície foi regenerada pelas seguintes injeções: 60s HCl 50 mM, 60s NaOH 5 mM e 60s HCl, todos a 10 μL min-1.

[0417] Como mostrado na Tabela 15, uma resposta de ligação evidente foi observada quando IL-22 humana foi injetada no 11041 mas nenhuma resposta foi observada para a injeção de IL22R1. Isto demonstra que o anticorpo 11041 e IL- 22R1 têm um sítio de ligação de sobreposição. Tabela 15. Binning de anticorpo 11041 à IL22 e IL22R1 humana

Exemplo 8. Avaliação de bloqueio do sítio de ligação de IL22BP na IL22

[0418] A ressonância plasmônica superficial (Biacore T200) foi usada para avaliar se Fab 11041gL13gH14 (como um parte de um anticorpo biespecífico) ou Fezaquinumabe são capazes de bloquear o sítio de ligação IL22BP de IL22.

[0419] Um anticorpo específico de Fab de IgG anti-ser humano de cabra (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizada sobre um CM5 Sensorchip via química de acoplamento de amina a um nível de aproximadamente 6000 RU.

[0420] Cada ciclo de análise consistiu na captura de moléculas de Fab 11041gL13gH14 ou Fezaquinumabe à superfície anti-Fab, injeção de IL22 a 20 nM (preparada internamente) seguido pela injeção de IL22BP a 100 nM, com cada uma injetada por 180 s a 30 μl/min. No final de cada ciclo a superfície foi regenerada em uma taxa de fluxo de 10 μL/min usando uma injeção de 60 s de HCl a 50 mM seguido por uma injeção de 30 s de NaOH a 5 mM e uma injeção final de 60 s de HCl a 50 mM. A ligação de fundo e deriva foram subtraídos usando ciclos de controle consistindo em injeções de captura de tampão ou análito de tampão. Tabela 16. As respostas de ligação de IL22 e IL22BP

[0421] Quando IL22 foi ligado ao Fab 11041gL13gH14 capturado pela superfície, IL22BP foi incapaz de ligar IL22. Quando IL22 foi ligado ao Fezaquinumabe IL22BP capturado na superfície foi ainda capaz de ligação à IL22. Em conclusão, Fab 11041gL13gH14 (como uma parte de um anticorpo biespecífico) bloqueia o sítio de ligação IL22BP de IL22, enquanto o Fezaquinumabe não.

Exemplo 9. Purificação de IL22.

[0422] Uma versão alvejada com His de IL-22 foi purificada amplamente como descrita por Nagem et al [Nagem et al Structure. Agosto de 2002; 10(8): 1051-62]. A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada pelo choque térmico com uma construção de expressão codificando IL-22 alvejado com His.

[0423] A sequência de proteína codificada é:

[0424] Mgsshhhhhhssgenlyfqgsqggaaapisshcrldksnfqqpyitnrtfmlakeasladnntdvrli geklfhgvsmsercilmkqvlnftleevlfpqsdrfqpymqevvpflarlsnrlstchiegddlhiqrnvqklkdtvkklges geikaigeldllfmslrnaci (SEQ ID NO: 3)

[0425] A sequência de proteína IL-22 depois da clivagem TEV (ver abaixo):

[0426] gsqggaaapisshcrldksnfqqpyitnrtfmlakeasladnntdvrligeklfhgvsmsercilmkqvl nftleevlfpqsdrfqpymqevvpflarlsnrlstchiegddlhiqrnvqklkdtvkklgesgeikaigeldllfmslrnaci (SEQ ID NO: 4)

[0427] As células foram cultivadas na presença de 100 μg/ml de ampicilina e expressão de proteína foi induzida pela adição de IPTG a uma concentração de 1 mM quando as células atingiram uma densidade óptica (medida a 600 nM) de 1. Depois de 4 horas, as células foram colhidas pela centrifugação. Depois da lise de célula com um homogeneizador de célula de alta pressão, os corpos de inclusão contendo IL-22 foram coletados pela centrifugação de alta velocidade. Os corpos de inclusão foram lavados com 50 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT e 0,5% (p/v) de DOC (pH 8) e depois mais uma vez com o mesmo tampão sem detergente. Os corpos de inclusão lavados foram solubilizados durante a noite a 4°C em um tampão contendo 50 mM de MES, 10 mM de EDTA, 1 mM de DTT e ureia 8 M. O material insolúvel foi separado pela centrifugação e IL-22 na fração solúvel foi redobrada pela diluição a 0,1 mg/ml em 100 mM de Tris-HCl, 2 mM de EDTA, 0,5 M de Arginina, 1 mM de glutationa reduzida e 0,1 mM de glutationa oxidada, com um pH final de 8,0. Depois de 72 horas de incubação a 4°C, a proteína foi concentrada e purificada pela cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 pg, equilibrada com 25 mM de MES pH 5,4 e 150 mM de NaCl. A proteína foi depois congelada a -80°C até uso adicional.

[0428] O etiqueta His foi removido pela incubação durante a noite da proteína IL- 22 com TEV protease, a 4°C. Depois de diluir a proteína em PBS contendo 25 mM de imidazol, a proteína clivada foi passada em uma coluna HisTrap®High Performance (GE Healthcare) de 5 ml e coletada no fluxo direto.

Exemplo 10. HDX-MS de IL22 na presença de Fab 11041gL13gH14 e Fab 11070gL7gH16

[0429] Espectrometria de Massa de Troca de Hidrogênio Deutério (HDX-MS) foi usada para mapeamento de epítopo de IL22 contra Fab 11041gL13gH14 e Fab 11070gL7gH16.

Preparação de amostra e aquisição de dados

[0430] Para a análise de HDX-MS, 30 μM de IL22 (preparada como descrito no Exemplo 9 e 30 μM de IL22 complexada com 90 μM de Fab 11041gL13gH14 ou Fab 11070gL7gH16 foram preparados e incubados por 1 hora a 4°C. 4 μl de IL22, complexos IL22/Fab 11041gL13gH14 ou Fab IL22/ 11070gL7gH16 foram diluídos em 57 μL de fosfato de 10 mM em H2O (pH 7,0) ou em 10 mM de fosfato em D2O (pD 7,0) a 25°C. As amostras deuteradas foram depois incubadas por 0,5, 2, 15 e 60 min a 25°C. Depois da reação, todas as amostras foram extintas misturando-se a 1:1 com um tampão de extinção (4 M de Cloridreto de Guanadina, 250 mM de Cloridreto de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 100 mM de fosfato) a 1°C. A solução de mistura foi em um pH final de 2,5. A mistura foi imediatamente injetada no módulo nanoAcquity HDX (Waters Corp.) para digestão péptica. A digestão de peptídeo foi depois realizada em linha usando uma coluna de digestão em linha enzimática (Waters) em 0,2% de ácido fórmico em água a 20°C e com uma taxa de fluxo de 100 μL/min. Todos os pontos de tempo deuterados e controles não deuterados foram realizados em triplicata com rodadas em branco entre cada ponto de dados.

[0431] Os fragmentos de peptídeo foram depois aprisionados usando uma pré- coluna Acquity BEH C18 1,7 μM VANGUARD refrigerada por 3 min. Os peptídeos foram depois eluídos em uma UPLC BEH C18 1,7 μM 1,0 x 100 Acquity refrigerada usando o seguinte gradiente: 0 min, 5% de B; 6 min, 35% de B; 7 min, 40% de B; 8 min, 95% de B, 11 min, 5% de B; 12 min, 95% de B; 13 min, 5% de B; 14 min, 95% de B; 15 min, 5% de B (A: 0,2% de HCOOH em H2O, B: 0,2% de HCOOH em acetonitrila. Os fragmentos de peptídeo foram ionizados pela eletropulverização positiva em um espectrômetros de massa Synapt G2-Si (Waters). A aquisição de dados foi conduzida no modo apenas ToF em uma faixa m/z de 50 a 2000 Th, usando um método MSe (energia de colisão baixa, 4V; energia de colisão alta: elevação de 18V a 40V). O peptídeo Glu-1-Fibrinopeptídeo B foi usado para a correção de massa de bloqueio interno.

Processamento de dados HDX-MS

[0432] Os dados de MSE de amostras de controles não deuterados de IL22, complexos IL22/Fab 11041gL13gH14 ou IL22/Fab 11070gL7gH16 foram usados para a identificação de sequência usando o Waters Protein Lynx Global Server 2.5.1 (PLGS). A pesquisa de peptídeo foi realizada contra uma base de dados apenas da sequência IL22, com limiar de intensidade precursora de 500 contagens e 3 íons de produto combinado requerido para avaliação. Os arquivos de contagem de íon para as 3 amostras de controle foram combinados em uma lista de peptídeo importado em software Dynamx v3.0.

[0433] Os peptídeos foram submetidos para filtrar adicionalmente em DynamX. Os parâmetros de filtração usados foram um comprimento de sequência de peptídeo mínimo e máximo de 4 e 25, respectivamente, intensidade mínima de 1000, produtos de MS/MS mínimo de 2, produtos mínimos por aminoácido de 0,2 e um limiar máximo MH +erro de 10 ppm. DynamX v3.0 foi usado para quantificar os envelopes isotópicos resultando da captação de deutério para cada peptídeo em cada ponto de tempo. Além disso, todos os espectros foram examinados e checados visualmente para garantir a designação correta de picos m/z e apenas peptídeos com uma alta razão de sinal para ruído foram usados para a análise de HDX-MS.

[0434] A seguir da filtração manual em Dynamx, a análise estatística e filtração foram realizadas usando Deuteros (www.academic.oup.com/bioinformatics/article/35/17/3171/5288775) que usa análise estatística publicada por Houde et al., 2011 (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21491437). Deuteros gera uma plotagem de Woods que exibe comprimento, resíduos de partida e final, cobertura global do peptídeo e uma métrica de eixo y que é a captação absoluta (em Daltons). O mesmo é a diferença na captação na presença de um ligante (ligado) e a forma apo. As plotagens de Woods primeiro aplicam filtragem de confidência para todos os peptídeos em cada ponto de tempo. Peptídeos com deuteração diferencial fora dos limites de confidência selecionados não são significantes e são mostrados em cinza claro. Os peptídeos significantes são mostrados como cinza escuro e preto. Um algoritmo interno foi usado para filtrar os resultados e identificar um epítopo. Os dados apresentados são depois de 0,5 minuto de incubação de deuteração.

Mapa de cobertura de IL22

[0435] A análise HDX de IL22 com Fab 11041gL13gH14 e Fab 11070gL7gH16 foi performada em um único experimento. Um total de 91,3% de cobertura foi obtido para o experimento HDX-MS de 47 peptídeos. A redundância de peptídeo a seguir da filtração e análise foi 3,48. (Figura 4) HDX-MS de IL22 na presença de Fab 11041gL13gH14

[0436] Sete peptídeos mostrando a incorporação de deutério reduzida estatisticamente significante na ligação de anticorpo (isto é, epítopo potencial) foram observados, seis dos quais estão de acordo com a análise SPEED (Figura 5A, destacado em preto na plotagem de Woods): 72VRLIGEKLFHGVS84, 72VRLIGEKLFHGVSM85, 75IGEKLFHGVS84, 75IGEKLFHGVSM85, 76GEKLFHGVS84 e 80FHGVSM85. Um aumento na captação de deutério (isto é, mudança conformacional potencial) foi observado em três peptídeos: 101EEVLFPQSDRF111, 103VLFPQSDRFQPYM115 e 103VLFPQSDRFQPYMQE117. O epítopo Fab 11041gL13gH14 é projetado na estrutura de IL22 (Figura 5B). Outras regiões que foram protegidos ou desprotegidos na ligação de anticorpo devido à mudança conformacional são mostrados na Figura 5B e são destacados em cinza escuro.

[0437] Em conclusão, a região protegida que representa a região de epítopo de Fab 11041gL13gH14 é dos resíduos 72 a 85 (VRLIGEKLFHGVSM). HDX-MS de IL22 na presença de Fab 11070gL7gH16

[0438] Quatro peptídeos mostrando incorporação de deutério reduzida estatisticamente significante na ligação de anticorpo (isto é, epítopo potencial) foram observadas, três dos quais estão de acordo com a análise SPEED (Figura 6A, destacados em preto na plotagem de Woods): 72VRLIGEKLFHGVSM85, 75IGEKLFHGVSM85 e 80FHGVSM85. Um aumento na captação de deutério (isto é, mudança conformacional potencial) foi observada em dois peptídeos: 43DKSNFQQPYITNRTFM58 e 105FPQSDRFQPYMQE117. O epítopo Fab 11070gL7gH16 é projetado na estrutura de IL22 (Figura 6B). Outras regiões que foram protegidos ou desprotegidos na ligação a anticorpo devido à mudança conformacional são mostradas na Figura 6B e são destacadas em cinza escuro.

[0439] Em conclusão, a região protegida que representa o epítopo de Fab 11070gL7gH16 é dos resíduos 72 a 85 (VRLIGEKLFHGVSM). Tabela 17. Lista de peptídeos que mostram mudança significante na ligação de anticorpo medida pelo HDX-MS.

Exemplo 11. Purificação e análise estrutural do complexo IL-22/11041gL13gH14

[0440] A IL-22 foi purificada como descrito no Exemplo 9.

[0441] A IL-22 clivada foi misturada com Fab 11041gL13gH14 e purificada pela cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad® 26/600 Superdex® 75 pg (GE Healthcare), equilibrada com 10 mM de Tris pH 7,4 e 150 mM de NaCl.

[0442] O complexo de IL-22/Fab 11041gL13gH14 foi concentrado a 10,1 mg/ml. As condições de cristalização para o complexo foram identificadas usando diversas triagens de cristalização comercialmente disponíveis. Estas foram realizadas no formato de sitting drop, usando placas de cristalização MRC Swissci de 96 poços 2 gotas (obtido da Molecular Dimensions, Cat No. MD11-00-100). Primeiro, os reservatórios foram cheios com 75 μL de cada condição de cristalização nas triagem usando um sistema de manuseio de líquido Microlab STAR (Hamilton). Depois, 300 nL do complexo IL-22/Fab e 300 nL das soluções de reservatório foram dispensadas nos poços das placas de cristalização usando um manuseador de líquido Mosquito (TTP LabTech). Uma condição de cristalização inicial foi identificada na condição 59 da triagem da Nextal Tubes JCSG+ (Qiagen Cat No: 130720), contendo 0,16 M de Acetato de cálcio hexa-hidratado, 0,08 M de cacodilato de sódio pH 6,5, 14,4% de PEG8000 e 20% de glicerol. Esta condição será adicionalmente aludida como JCSG+59. Os cristais otimizados foram obtidos pela adição de Cloreto de Ítrio (III) hexa-hidratado - que é incluído no Additive Screen (Hampton Research Cat No HR2-138) - a 0,01 M ao JCSG+59 que foi obtido da Molecular Dimensions (Cat No. MDSR-37-E11). Os cristais otimizados foram cultivados em Placas de Cristalização MRC Maxi de 48 Poços (Swissci), usando um volume de reservatório de 250 μL e uma gota consistindo em 2 μL de solução de reservatório misturada com 2 μL do complexo IL-22/Fab. Antes de congelar subitamente em nitrogênio líquido, os cristais foram transferidos para uma gota de 4 μL de solução de crioproteção. Esta solução foi preparada misturando-se 40 μL da solução de reservatório otimizada com 10 μL de solução CryoMixes®7, incluído com o kit CryoProtX®(Molecular Dimensions MD1-61). CryoMixes®7 contém 12,5 % v/v de Dietileno glicol, 12,5 % v/v de Etileno glicol, 25 % v/v de 1,2-Propanodiol, 12,5 % v/v de Sulfóxido de dimetila e 12,5 % v/v de Glicerol.

[0443] Os dados de difração foram coletados na linha de luz I04 (Diamond Light Source, UK). Os dados foram indexados e integrados usando XDS [Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 125-132 (2010)], seguido pelo escalonamento usando AIMLESS [Evans et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013; 69(Pt 7): 1204-1214]. A estrutura IL- 22/Fab foi resolvida pelo reposição molecular usando Phaser [McCoy et al J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674] no pacote de software Fenix [Adams et alMethods. 2011; 55(1): 94-106]. Neste procedimento, a estrutura de IL-22 1YKB [Xu et alActa Crystallogr D Biol Crystallogr. Julho de 2005; 61(Pt 7): 942-50] e estrutura Fab 5BVJ [Rondeau et al MAbs. 2015; 7(6): 1151-60] foram usados como padrões de reposição molecular. Coot [P. Emsley et al (2010). Acta Crystallographica. D66: 486501] e fenix.refine [P.V. Afonine et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-67 (2012)] foram usados nos seguintes ciclos de conclusão e refino de modelo manual. MolProbity [Williams et al. (2018) Protein Science 27: 293-315] foi usado para analisar a qualidade do modelo final.

[0444] 3 complexos IL-22/Fab 11041gL13gH14 são observados na umidade assimétrica de cristal.

[0445] A Figura 7A mostra a interação de Fab 11041gL13gH14 com IL-22, com uma vista detalhada na interface de interação (Fig 7B). NCONT no pacote de software CCP4 [Winn MD et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Abril de 2011; 67(Pt 4): 235-42] foi usado para determinar o epítopo na IL-22, reconhecido pela molécula Fab. A numeração de aminoácido IL-22 está fundamentada na entrada Q9GZX6 da UnitProtKB.

[0446] Em uma distância de contato <4 A com a molécula Fab, o epítopo de IL- 22 é composto dos resíduos: Gln48, Glu77, Phe80, His81, Gly82, Val83, Ser84, Met85, Arg88, Leu169, Met172, Ser173, Arg175, Asn176 e Ile179.

[0447] Em uma distância de contato <5 A com a molécula Fab, o epítopo IL-22 é composto dos resíduos: Lys44, Phe47, Gln48, Ile75, Gly76, Glu77, Phe80, His81, Gly82, Val83, Ser84, Met85, Ser86, Arg88, Leu169, Met172, Ser173, Arg175, Asn176 e Ile179

[0448] Tabela 18. Aminoácidos da cadeia leve de Fab 11041gL13gH14 e seus contatos correspondentes na IL22. Os resíduos em negrito estão envolvidos nos contatos entre 4 e 5 A. Outros resíduos têm distância de contato < 4 A entre o anticorpo e IL-22.

[0449] Tabela 19. Aminoácidos da cadeia pesada de Fab 11041gL13gH14 e seus contatos correspondentes na IL22. Os resíduos em negrito estão envolvidos nos contatos entre 4 e 5 A. Outros resíduos têm distância de contato < 4 A entre o anticorpo e IL-22.

[0450] A molécula Fab 11041gL13gH14 impede a interação de IL-22 com o receptor IL22R1, conforme a cadeia leve de Fab se liga à mesma região na IL22. (Fig. 8)

Exemplo 11. Determinação da estrutura de IL-22 no complexo com Fezaquinumabe e VR11070 pelo cryo-EM

[0451] Depois da realização da análise estrutural do complexo IL22/11041gL13gH14, a determinação da estrutura de IL22 no complexo com Fezaquinumabe e Fab 11070gL7gH16 (VR11070) foi realizada usando a tecnologia cryo-EM.

[0452] A IL-22 foi expressa usando células Expi293, fundido a um etiqueta Fc humano de terminal N. Depois de depurar as células pela centrifugação, o sobrenadante foi carregado em uma coluna de Proteína A HiTrap de 5 ml (Cytiva). A proteína foi eluída com um gradiente tampão de PBS para Citrato de Sódio 0,1 M no pH 2,0. A etiqueta hFc foi clivada usando TEV protease e a IL22 foi separada da etiqueta clivada por uma outra passada pelo fluxo de gravidade em 4 ml de resina de proteína A empacotada. Depois da elução da resina, a IL-22 foi adicionalmente purificada em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 pg (Cytiva), equilibrada em PBS.

[0453] 70 microlitros de Fab VR11070 a 12,1 mg/ml, 153 microlitros de Fab Fezaquinumabe a 11,5 mg/ml e 153 microlitros de IL22 a 1,36 mg/ml foram misturados. 55 microlitros foram injetados em uma coluna Superdex200 5/150 equilibrada em 10 mM de Hepes pH 7,4 e 150 mM de NaCl. Uma fração contendo o complexo IL-22+VR11070+Fezaquinumabe a 1,7 mg/ml foi coletado e usado para preparar grades de cryo-EM.

[0454] As grades de carbono furadas Quantifoil® R 1.2/1.3 (SPT Labtech) foram submetidas à descarga luminosa em um Pelco easyGlow®por 45s a 22 mA imediatamente antes do uso. A IL22 com Fab 11070gL7gH16 e Fab Fezaquinumabe depois da filtração em gel foi aplicada à grade recém submetida à descarga luminosa em um Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) por 2 s na câmara a 100% de umidade e 4°C. A grade foi depois enxuta com papel de filtro novo por 4 s na força 7 e mergulhado em etano líquido. A grade foi primeiro triada quanto à espesura do gelo e distribuição de partícula no Glacios interno operado a 200 keV e equipado com uma câmera Falcon 3. Os dados foram depois coletados no Krios2 do consórcio Cambridge equipado com um Falcon 4 e operado na voltagem de aceleração de 300 keV. Os 5700 filmes foram coletados automaticamente usando o software EPU, no modo de contagem em uma faixa de desfocagem de -1 a -2,5 μm, em um tamanho de pixel de 0,67 A com uma exposição de 12,2 s para um fluxo de elétron final de 49,36 e-/A2distribuído em 42 frações. Toda a análise de dados subsequente foi realizada no Cryosparc, versão 2.15 (Structura Biotechnology Inc). Os filmes foram alinhados usando Patch Motion, os parâmetros de função de transferência de contraste (CTF) foram estimados usando Patch CTF e as partículas foram inicialmente selecionadas com o selecionador de mancha e resultou em um total de 5,5 M de partículas. As partículas selecionadas foram binned 2X a um tamanho de caixa de 300 pixéis e submetido a uma primeira rodada de classificação 2D que resultasse na seleção de 488.000 partículas com traços distintos. Cinco modelos ab initio foram gerados, 2 dos quais diferiram um do outro nos sítios de glicosilação de IL22. Estas duas classes, por um total de 240.000 partículas, foram reunidas juntas e um refinamento não uniforme produziu uma estimativa de resolução de 3,4 A usando o critério padrão de ouro FSC 0,143.

[0455] Duas moléculas Fab e a estrutura de IL22 foram ajustadas na densidade cryo-EM usando a Quimera UCSF [Pettersen, et al J. Comput. Chem. 25(13): 16051612 (2004)]. Depois da construção do modelo manual adicional usando Coot [Emsley et al (2010) Acta Crystallographica. D66: 486—501], o mapa foi aprimorado usando a ferramenta Autosharpen [Terwilliger,. (2018). Acta Cryst. D74, 545-559.] em Fenix [Liebschner et al. Acta Cryst. D75, 861-877 (2019)] e o modelo foi adicionalmente refinado usando o refinamento em espaço real [Afonine et al Acta Cryst. D74, 531-544 (2018)] em Fenix.

[0456] NCONT no pacote de software CCP4 [Winn et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Abril de 2011; 67(Pt 4): 235-42] foi usado para determinar o epítopo na IL22, reconhecido pelas moléculas Fab 11070gL7gH16 e Fab Fezaquinumabe. A numeração de aminoácido de IL22 abaixo é baseada na entrada UnitProtKB Q9GZX6.

[0457] Em uma distância de contato <4 A com a molécula Fab 11070gL7gH16, o epítopo IL22 é composto de resíduos: Glu77, Lys78, His81, Ser84, Met85, Ser86, Arg88, Asn176, Ala177.

[0458] Em uma distância de contato <5 A com a molécula Fab 11070gL7gH16, o epítopo IL22 é composto dos resíduos: Ile75, Gly76, Glu77, Lys78, Phe80, His81, Ser84, Met85, Ser86, Arg88, Leu169, Met172, Ser173, Asn176, Ala177.

[0459] Em uma distância de contato <4 A com a molécula Fab Fezaquinumabe, o epítopo IL22 é composto dos resíduos: Gln49, Tyr51, Phe105, Ser108, Asp109, Gln112, Pro113, Tyr114, Gln116, Glu117, Pro120, Ala123, Arg124.

[0460] Em uma distância de contato <5 A com a molécula Fab Fezaquinumabe, o epítopo IL22 é composto dos resíduos: Gln49, Pro50, Tyr51, Ile52, Arg55, Phe105, Pro106, Ser108, Asp109, Gln112, Pro113, Tyr114, Gln116, Glu117, Val119, Pro120, Phe121, Ala123, Arg124.

[0461] A análise estrutural revela que Fab 11070 tem um epítopo diferente na IL- 22 do que Fezaquinumabe. Também, o Fab 11070gL7gH16 (VR11070) é similar ao epítopo de Fab 11041gL13gH14 (VR11041) na IL22. (Fig 9A e 9B). Igual ao Fab 11041gL13gH14, Fab 11070gL7gH16 bloqueia a sinalização de IL22 pela prevenção da interação com o receptor IL-22R1 (Fig 10A). Ao contrário, Fezaquinumabe bloqueia a sinalização de IL22 pela prevenção da interação de IL22 com IL10R2 (Fig 10B).

Exemplo 12. Ensaio de Liberação de IL-10 COLO205

[0462] O anticorpo foi testado em um ensaio de célula in vitro quanto à atividade contra IL22 humano. A linhagem de célula COLO205 é uma linhagem de célula epitelial de câncer colorretal humano. A IL22 se liga à IL22R1 e IL10R2 na superfície de célula para induzir a fosforilação de STAT3 e liberação de citocina a jusante (por exemplo IL-10). Neste ensaio, as células COLO205 são estimuladas com IL22 com ou sem anticorpos anti-IL-22. A resposta de IL-10 resultante é depois medida no sobrenadante de cultura de célula usando um kit FRET resolvido com o tempo homogêneo (HTRF) (Cisbio).

[0463] As células COLO205 foram semeadas a 25000 células por poço em placas de 96 poços de fundo chato tratadas para cultura de tecido. A IL-22 humana (concentração de ensaio final 30 pM) foi pré-incubada com anticorpo (concentração de ensaio final 3 nM a 1,4 pM) a 37°C por uma hora. Os complexos de anticorpo/citocina foram depois transferidos para as células COLO205 e incubadas por 48 horas a 37°C, 5% de CO2. Os sobrenadantes de cultura de célula livres de célula foram depois coletados e armazenados a -80°C. Os sobrenadantes de cultura de célula foram descongelados sobre gelo e os níveis de IL-10 foram determinados pelo HTRF.

[0464] As amostras foram conduzidas com apenas uma amostra ou em duplicata.

Resultados de Fab 11041

[0465] Os resultados confirmam que Fab 11041 inibe a resposta de IL-10 induzida por IL-22 em células COLO205 no ensaio de liberação de IL-10 em COLO205. Fab 11041 teve uma IC50 de 56,78 pM, como determinada pela média geométrica de 2 ocasiões do ensaio (Tabela 20). Estas medições são julgadas confiáveis visto que a faixa da IC50 medida em cada repetição do ensaio foi verificada variar em menos do que três vezes em cada caso. Tabela 20: Tabela de dados para Fab 11041 no ensaio de liberação de IL-10 COLO205.

Resultados de Fab 11041 gL13gH14

[0466] Os resultados confirmam que Fab 11041 gL13gH14 inibe a resposta de IL-10 induzida por IL-22 em células COLO205 no ensaio de liberação de IL-10 em COLO205. Fab 11041 gL13gH14 teve uma IC50 de 42,7 pM, como determinada pela média geométrica de 2 ocasiões do ensaio (Tabela 21). Estas medições são julgadas confiáveis visto que a faixa da IC50 medida em cada repetição do ensaio foi verificado variar em menos do que três vezes em cada caso. Tabela 21: Tabela de dados para Fab 11041 gL13gH14 no ensaio de liberação de IL-10 em COLO205.

Exemplo 13. Atividade com base em célula de queratinócito primário humano in vitro do Fab 11041gL13gH14 contra IL22 humano

[0467] A molécula de anticorpo Fab 11041gL13gH14 foi testada em um ensaio de célula in vitro contra a atividade de IL-22 humana (produzida em casa). Os queratinócitos epidérmicos neonatais humanos primários do prepúcio (NHEK) foram eticamente obtidos de doadores (Promocell, cat no#C-12001), expandidos em cultura e usados no ensaio. As células NHEK respondem à estimulação de IL-22 pela secreção de moléculas solúveis, incluindo S100A7 (psoriasina), que pode ser detectada em sobrenadantes de célula (Fig. 11A). S100A7 foi usada no ensaio como um biomarcador para avaliar a atividade de Fab 11041gL13gH14.

[0468] As células NHEK de dois doadores nas passagens 2 e 3 foram plaqueadas a 104células por poço em meio basal dérmico (LGC, cat no# ATCC- PCS-200-030) contendo o kit de cultivo de queratinócito (LGC, cat no#ATCC-PCS- 200-040) em placas de 48 poços (Corning, Costar® Clear TC-treated Plates, cat no#3548) pré-revestidas com matriz extracelular (ThermoFisher, cat no#R011K). Os queratinócitos foram cultivados em condições padrão (37°C, 5% de CO2, 100% de umidade) até que eles atingissem a confluência. No dia 3, o meio de cultura foi aspirado de todos os poços e as células foram lavadas com 200 μl de meio dérmico basal para remover quaisquer células mortas e fatores de crescimento. O anticorpo anti-IL22 Fab 11041gL13gH14 na faixa de concentrações de 50 a 0,01 nM (2500 a 1 ng/ml) foi pré-incubado com 100 ng/ml de IL22 em meio basal dérmico a 37°C por 30 minutos. Fezaquinumabe no formato Fab (anticorpo anti-IL-22, no estoque de casa, lote no# PB7490) a 50 nM (2500 ng/ml) também foi pré-incubado com 100 ng/ml de IL22 em meio basal dérmico a 37°C por 30 minutos. Depois solução de anticorpo/ citocina, 400 μl por poço, foi transferida para as células. Depois de 48 horas de estimulação, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de S100A7 foram medidos usando ELISA (LSBio, cat no#LS-F50031).

[0469] Um aumento em S100A7 foi medido após a estimulação de IL22 (Fig. 11A). Fezaquinumabe Fab a 50 nM inibiu completamente o sinal de S100A7 induzido pela IL22. Fab 11041gL13gH14 a 50 nM também mostrou inibição completa de S100A7 (Fig. 11A). Fab 11041gL13gH14 mostrou uma inibição dependente da concentração de S100A7 (Fig. 11B).

[0470] Em conclusão, Fab 11041gL13gH14 testado no ensaio de queratinócito primário humano mostrou inibição dependente da dose do biomarcador dependente de IL-22 (S100A7).

Exemplo 14. Método IL22 Fosfo STAT3

[0471] Células Hacat foram adicionadas a uma placa de cultura de tecido de fundo chato de 96 poços a 150.000 células por poço em 100 μl de DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina por poço e incubadas a 37 graus e 5% de CO2 durante a noite. Um anticorpo anti-IL22 foi diluído em meio de sobrenadante simulado a uma concentração de ensaio final de 18,75 nM e 60 μl foram adicionados às colunas 1 e 12 de uma placa de fundo em V de polipropileno de 96 poços como o controle de sinal mínimo. 60 μl de meio sobrenadante simulado foram adicionados às cols 2 e 11 da placa de fundo em V de polipropileno de 96 poços como os controles de sinal máximo. As amostras foram tituladas 1:3 em meio sobrenadante simulado deixando um volume final de 60 μl nas colunas 3 a 10 da placa de fundo em V de polipropileno de 96 poços. 30 μl de solução de IL22 foram adicionados a todos os poços dando uma concentração de ensaio final de 30 ng/ml de FAC. As placas foram pré- incubadas por 1 h a 37 graus. 75 μl do meio de cultura das placas de cultura de célula para deixar 25 ul na placa. 75 μl de titulação de amostra/controles + il22 foram transferidos para as placas de célula. Estas placas foram incubadas a 37 graus por 30 minutos. Os sobrenadantes foram removidos. O kit Cisbio STAT3 Fosfo Y705 foi usado para lisar as células restantes e gerar sinais de HTRF a partir do lisado para cada poço. As placas foram seladas e incubadas na temperatura ambiente em um agitador durante a noite por 18 horas. Os sinais do poço foram medidos usando um protocolo HTRF na leitora de placa Synergy Neo 2. Os anticorpos 11041 e 11070 demonstraram inibição evidente da fosforilação de STAT3 induzida por IL22.

[0472] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patente, documentos, livros didáticos e semelhantes e as referências neles citadas, até o grau em que eles ainda não foram, são por meio deste aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (19)

1. Anticorpo isolado, caracterizadopelo fato de que se liga à interleucina humana 22 (IL22) e inibe ou atenua a ligação de IL22 ao receptor 1 de IL22 (IL22R1), e em que o anticorpo se liga especificamente ao polipeptídeo VRLIGEKLFHGVSM (SEQ ID NO:5, 96) correspondente aos resíduos 72-85 da sequência de aminoácidos da IL22 definida pela SEQ ID NO:1.

2. Anticorpo isolado, caracterizadopelo fato de que se liga à interleucina humana 22 (IL22) e inibe ou atenua a ligação de IL22 ao receptor 1 de IL22 (IL22R1), em que o anticorpo se liga a um epítopo da IL22 humana, o epítopo compreendendo cinco ou mais resíduos selecionados entre Lys44, Phe47, Gln48, Ile75, Gly76, Glu77, Phe80, His81, Gly82, Val83, Ser84, Met85, Ser86, Arg88, Leu169, Met172, Ser173, Arg175, Asn176 e Ile179 da IL22 humana (SEQ ID NO: 1), conforme determinado a uma distância de contato inferior a 5A entre o anticorpo e a IL22.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a referida ligação é determinada por meio de cristalografia de raios X. .

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo de comprimento completo.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo, e em que o dito fragmento de anticorpo é Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, dsFv, scFv ou dsscFv.

6. Anticorpo isolado, caracterizadopelo fato de que se liga à interleucina 22 humana (IL22) e inibe ou atenua a ligação da IL22 ao receptor 1 da IL22 (IL22R1), em que o anticorpo compreende CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR- H2/CDR-H3 compreendendo as sequências dadas nas SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70 respectivamente e o restante da cadeia leve e da cadeia pesada tem pelo menos 90% de identidade ou similaridade com as SEQ ID Nos: 76 e 78, respectivamente.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 78.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de o referido anticorpo ser um anticorpo de comprimento total ou um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv ou dsscFv.

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1 compreendendo CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 compreendendo as sequências dada nas SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70, respectivamente, e o restante da cadeia leve e da cadeia pesada tem pelo menos 90% de identidade ou similaridade com as SEQ ID Nos:76 e 80, respectivamente.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de o anticorpo ser um anticorpo IgG1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 80.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é uma IgG4P compreendendo CDR- L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 compreendendo as sequências dadas nas SEQ ID NOs: 65/66/67/68/69/70 respectivamente, e o restante da cadeia leve e da cadeia pesada tem pelo menos 90% de identidade ou similaridade com as SEQ ID NO: 76 e 82, respectivamente.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de o anticorpo ser um anticorpo IgG4P compreendendo uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO:82.

13. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Vetor de expressão, caracterizadopelo fato de que carreia o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13.

15. Célula hospedeira, caracterizadapelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 14.

16. Método para produzir o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizadopelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 14 sob condições que permitam a produção do anticorpo e recuperar o anticorpo produzido.

17. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e um ou mais diluente, excipiente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.

18. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizadopelo fato de ser para fabricar um medicamento para tratar uma condição de pele inflamatória.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a dita condição de pele inflamatória é psoríase, artrite psoriática, dermatite de contato, eczema crônico das mãos ou dermatite atópica.