BR122024003085A2

BR122024003085A2 - Uso de um antagonista de ligação de eixo pd-1 e/ou anticorpo anti- gpc3 e kit

Info

Publication number: BR122024003085A2
Application number: BR122024003085-3A
Authority: BR
Inventors: Mika Endo; Atsuhiko Kato; Toshihiko Ohtomo; Kenji Adachi; Yasuko Kinoshita; Yoshinori Narita
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha; Genentech, Inc.
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2024-07-09

Abstract

"USO DE UM ANTAGONISTA DE LIGAÇÃO DE EIXO PD-1 E/OU ANTICORPO ANTI-GPC3 E KIT". A presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de cânceres. Os métodos compreendendo adminis-trar um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti- GPC3. As composições compreendendo uma composição farmacêuti-ca para o tratamento de câncer que compreende um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. São também referidas uma composição farmacêutica a ser usada em combinação com um antagonista de ligação de eixo PD-1 para o tratamento de câncer que compreende um anticorpo anti-GPC3 como o ingrediente ativo; e uma composição farmacêutica a ser usada em combinação com um anti-corpo anti-GPC3 para o tratamento de câncer que compreende como o ingrediente ativo um antagonista de ligação de eixo PD-1.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Esta invenção refere-se aos métodos de tratamento de câncer por administração de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Câncer hepatocelular é reportamente a quinta principal causa de mortes por câncer no mundo todo, sendo responsável por aproximadamente 600.000 mortes a cada ano (Não Patente de Litera-tura 1). A maioria dos pacientes com câncer hepatocelular more em um período de 1 ano após ser diagnosticado com a doença. Infelizmente, os casos de câncer hepatocelular são frequentemente diagnosticados no último estágio que raramente responde às terapias curativas. Ainda, os tratamentos médicos incluindo quimoterapia, quimioem- bolização, ablação, e terapia com feixe de próton são insuficientemente eficazes para tais pacientes. A maioria dos pacientes exibe recorrência da doença com invasão vascular e múltiplas mestátases intra- hepáticas, que rapidamente progrides para o estágio avançado. Suas taxas de sobrevivência de 5 anos são de apenas 7% (Literatura de Não Patente 2). Pacientes com câncer hepatocelular passíveis à res- secção de focos locais têm prognósticos relativamente bons, embora suas taxas de sobrevivência de 5 anos ainda permaneçam em um nível de 15% e 39% (Literatura de não Patente 3). Desse modo, tem havido uma demanada na técnica por nova terapia para tal doença maligna, câncer hepatocelular.

[003] Câncer hepatocelular é reportadamente responsável por mais do que 90% dos casos de câncer hepático primário no Japão. Métodos médicos para o tratamento de tal câncer hepatocelular inclu-em, por exemplo, terapia de embolização arterial transcateter (TAE) com base em quimioterapia, que envolve a indução da necrose seletiva do câncer hepatocelular pela injeção de uma mistura de um meio de contraste com base em óleo (Lipiodol), um agente anticâncer, e uma substância de obstrução (Gelfoam) na artéria hepatica (que funciona como uma via de fornecimento de nutriente) resultando na obstrução da artéria de nutriente. Além disso, métodos invasivos são usados, tais como injeção de etanol percutânea, terapia de coagulação de micro-ondas percutânea, e ablação de radiofrequência. Além disso, testes clínicos foram conduzidos em quimioterapia sistêmica usando agentes quimioterapêuticos tais como fluorouracila (5-FU), uracil- tegafur (UFT), mitomicina C (MMC), mitoxantrona (DHAD), adriamicina (ADR), epirubicina (EPI), e cisplatina (CDDP) sozinhos ou em combinação com interferon (IFN) (Literatura de não Patente 4).

[004] Enquanto isso, uma forma oralmente ativa de sorafenibe (Nexavar, BAY43-9006) foi aprovada, que é mais vantajosamente efi-caz do que os agentes quimioterapêuticos descritos acima, de modo que este agente bloqueie o crescimento de células de câncer inibindo a Raf cinase na transdução de sinal de Raf/MEK/ERK enquanto o agente exerce efeitos antiangiogênicos alvejando VEGFR-2, VEGFR- 3, e PDGFR-.beta. tirosina cinases. A eficácia de sorafenibe foi estudada em dois testes controlados por placebo de multicentro de fase III (teste de Protocolo Randomizado de Avaliação de HCC de Sorafenibe (SHARP) e teste Asiático-Pacífico) alvejando o câncer hepatocelular avançado. Sorafenibe foi confirmado prolongar as durações de sobre-vivência, com HR de 0,68, em ambos destes testes. No teste SHARP, sorafenibe prolongou a duração de sobrevivência para 10,7 meses versus 7,9 meses com o placebo. No teste Asiático, este agente pro-longou a duração para 6,5 meses versus 4,2 meses com o placebo. O agente, entretanto, teve uma baixa resposta objetiva e não mostrou nenhum prolongamento de um tempo para progressão sintomática, embora o agente tenha prolongado um tempo para a progressão de tumor (5,5 meses versus 2,8 meses no teste Europeu e Americano e 2,8 meses versus 1,4 meses no teste Asiático) nas imagens. As coor-tes asiáticas exibiram uma curta duração de prolongamento de vida, que é provavelmente por causa de seus tratamentos foram iniciados em um estágio levemente posterior durante o processo da doença na região Asiática em comparação com a Europa e Estados Unidos (Lite-raturas de não Patente 5 e 6).

[005] Visto que o câncer hepático progride, seus sintomas espe cíficos associados com disfunção hepatica são geralmente observados, tais como anorexia, perda de peso, mal-estar geral, massa hipo- condrial direita palpável, dor hipocondrial direita, sensação de plenitude abdominal, febre e icterícia. Os agentes quimioterapêuticos (por exemplo, sorafenibe), entretanto, têm complicações a serem resolvidos, incluindo suas reações adversas inerentes tais como diarreia ou constipação, anemia, supressão do sistema imunológico para causar infecção ou sepse (com gravidade letal), hemorragia, toxicidade cardí-aca, toxicidade hepática, toxicidade renal, anorexia, e perda de peso.

[006] Embora os sintomas de estágio de fase inical particulares não sejam inicialmente observados em câncer hepático, seus sintomas específicos associados com disfunção hepatica, tais como anorexia, perda de peso, mal-estar geral, massa hipocondrial direita papálvel, dor hipocondrial direita, sensação de plenitude abdominal, febre e icterícia, são geralmente observados com a progressão do câncer hepático. De acordo com observação clínica, tais sintomas são realçados pelo uso dos agentes quimioterapêuticos. Por exemplo, anorexia em um paciente com células de câncer hepático detectáveis e sintomas tal como perda de peso associados com ou independente da anorexia pode ser mais realçada pela administração dos agentes quimiotera- pêuticos ao paciente do que sem o uso dos agentes quimioterapêuti- cos. Em alguns casos, o uso de agentes quimioterapêuticos deve ser descontinuado pelo paciente tendo tais sintomas. Estes sintomas real-çados são impedimentos aos tratamentos com os agentes quimiotera- pêuticos. Desse modo, tem havido uma demanda para o estabeleci-mento de excelente terapia do ponto de vista, por exemplo, da melhora de efeitos terapêuticos ou melhora de QOL de pacientes a serem tra-tados.

[007] Glipicano 3 (GPC3) é frequentemente expresso em um ní vel elevado em câncer hepático e como tal, parece ser útil na identifi-cação de suas funções em câncer hepático ou como um alvo terapêu-tico ou diagnóstico de câncer hepático.

[008] Sob as circunstâncias descritas acima, os fármacos em de senvolvimento com GPC3 como um alvo terapêutico de câncer hepáti-co. Um fármaco de câncer hepático compreendendo um anticorpo anti- GPC3 como um ingrediente ativo foi desenvolvido, o anticorpo tendo atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (aqui a se-guir, referida como "ADCC") e/ou atividade de citotoxicidade depen-dente de complemento (aqui a seguir, referida como "CDC") contra as células expressando GPC3 (Literatura de Patente 1). Além disso, um fármaco alvejando GPC3 que compreende um anticorpo anti-GPC3 humanizado tendo atividade de ADCC e atividade de CDC como um ingrediente ativo foi desenvolvido (Literatura de Patente 2). Além disso, fármacos alvejando GPC3 foram desenvolvidos, que compreendem um anticorpo anti-GPC3 humanizado com atividade de ADCC realçada (Literaturas de Patente 3 e 4) ou um anticorpo anti-GPC3 tendo ativi-dade de ADCC e atividade de CDC, bem como dinâmicos plasmáticos melhorados (Literatura de Patente 5). Estes anticorpos anti-GPC3 em terapia de combinação com os agentes quimioterapêuticos tal como sorafenibe foram constatados atenuar as reações adversas, por exemplo, provocadas pela terapia exclusiva dos agentes quimiotera- pêuticos (por exemplo, sorafenibe) e também constatados exibir efeitos sinérgicos com base nestes agentes (Literatura de Patente 6). Consequentemente, métodos excelentes para o tratamento de câncer hepático estão no processo de serem estabelecidos usando fármacos de alvejamento de GPC3 como o núcleo do ponto de vista, por exem-plo, da melhora de efeitos terapêuticos ou melhora de QOL de pacien-tes a serem tratados.

[009] Por outro lado, a provisão de dois sinais distintos a células T é um modelo amplamente aceito para ativação de linfócito de linfóci- tos T em repouso por células de apresentação de antígeno (APCs). Lafferty et al, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci 53: 27-42 (1975). Este modelo também fornece a discriminação de auto e não autointolerância imunológica. Bretscher et al, Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987). O sinal primário, ou sinal es-pecifico de antígeno, é transduzido através do receptor de célula T (TCR) após reconhecimento de peptídeo de antígeno estranho apre-sentado no contexto do principal complexo de histocompatibilidade (MHC). O segundo sinal ou coestimulatório é liberado às células T por moléculas coestimulatórias expressas em células de apresentação de antígeno (APCs), induzindo às células T promoverem a expansão clo-nal, secreção de citocina e função efetora. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996). Na ausência de coestimulação, as células T podem se tornar refratárias à estimulação de antígeno, não montam uma resposta imunológica eficaz, e também podem resultar na exaus-tão ou tolerância a antígenos estranhos.

[0010] No modelo de dois sinais, as células T receberam tanto si nais coestimulatórios secundários positivos quanto negativos. A regu- lação de tais sinais positivos e negativos é crítica para maximizar as respostas imunológicas protetivas do hospedeiro, enquanto mantendo a tolerância imunológica e impedindo a autoimunidade. Sinais secun-dários negativos parecem necessários para a indução de tolerância de célula T, enquanto sinais positivos promovem a ativação de célula T. Enquanto o modelo de dois sinais simples fornece uma explicação vá-lida para os linfócitos naive, uma resposta imunológica do hospedeiro é um processo dinâmico, e sinais coestimulatórios podem também ser fornecidos para células T expostas ao antígeno. O mecanismo de co- estimulação é de interesse terapêutico porque a manipulação de sinais coestimulatórios tem mostrado fornecer um meio para realçar ou ter-minar a resposta imunológica com base em célula. Recentemente, descobriu-se que a disfunção de célula T ou anergia ocorre concorren-temente com uma expressão induzida ou prolongada do receptor inibi-tório, polipeptídeo de morte programada 1 (PD-1). Como um resultado, o alvejamento terapêutico de PD-1 e outras moléculas que sinalizam através das interações com PD-1, tal como ligante de morte progra-mada 1 (PD-L1) e ligante de morte programada 2 (PD-L2) são uma área de intenso interesse.

[0011] PD-L1 é superexpresso na maioria dos cânceres e é fre quentemente associado com prognóstico ruim (Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007 19(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). Interessantemente, a maioria dos linfócitos T de infiltração tumoral predominantemente expressam PD-1, ao contrário dos linfóci- tos T em tecidos normais e linfócitos T de sangue periférico indicando que a super-regulação de PD-1 em células T reativas a tumor podem contribuir para respostas imunológicas antitumor prejudicadas (Blood 2009 114(8): 1537). Isto pode ser devido à exploração de sinalização de PD-L1 mediada por células de tumor expressando PD-L1 interagin-do com células T expressando PD-1 para resultar na atenuação de ativação de célula T e evasão da vigilância imunológica (Sharpe et al., Nat Rev 2002) (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677). Por-tanto, a inibição da interação de PD-L1/PD-1 pode realçar o extermínio mediado por célula T CD8+ de tumores.

[0012] O alvejamento terapêutico de PD-1 e outras moléculas que sinalizam as interações com PD-1, tais como ligante de morte progra-mada 1 (PD-L1) e ligante de morte programada 2 (PD-L2) são uma área de intenso interesse. A inibição de sinalização de PD-L1 foi pro-posta como um meio para realçar a imunidade de célula T ao trata-mento de câncer (por exemplo, imunidade ao tumor) e infecção, inclu-indo tanto infllamação aguda quanto crônica (por exemplo, persistente). Um tratamento terapêutico ideal pode combinar o bloqueio de interação de ligante/receptor de PD-1 com um agente que diretamente inibe o crescimento de tumor. Permanece uma necessidade de uma terapia ideal para o tratamento, estabilização, prevenção, e/ou retardo de desenvolvimento de vários cânceres.

[0013] Todas as referências citadas aqui, incluindo os pedidos de patente, publicações de patentes e números de acesso de UniPro- tKB/Swiss-Prot, são incorporadas aqui por referência em sua totalida-de, como se cada referência individual fosse específica e individual-mente indicada a ser incorporada por referência.

[0014] A presente invenção fornece:

[0015] [1] Uma composição farmacêutica para o tratamento ou re tardo de progressão de câncer em um indivíduo para uso em combi-nação com um antagonista de ligação de eixo PD-1, a referida compo-sição compreendendo um anticorpo anti-GPC3 como um ingrediente ativo.

[0016] [2] A composição farmacêutica de acordo com [1], em que o anticorpo anti-GPC3 é administrado antes da administração do anta-gonista de ligação de eixo PD-1, simultaneamente com a administra- ção do antagonista de ligação de eixo PD-1, ou após a administração do antagonista de ligação de eixo PD-1.

[0017] [3] A composição farmacêutica de acordo com [1] ou [2], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2.

[0018] [4] A composição farmacêutica de acordo com [3], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-1.

[0019] [5] A composição farmacêutica de acordo com [4], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a seus parcei-ros de ligação de ligante.

[0020] [6] A composição farmacêutica de acordo com [5], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L1.

[0021] [7] A composição farmacêutica de acordo com [5], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L2.

[0022] [8] A composição farmacêutica de acordo com [5], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 tanto a PD-L1 quanto PD-L2.

[0023] [9] A composição farmacêutica de acordo com [5], em que o antagonista de ligação de PD-1 é um anticorpo.

[0024] [10] A composição farmacêutica de acordo com [5], em que o antagonista de ligação de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em nivolumabe, lambrolizumabe (pembrolizumabe), e pidilizumabe.

[0025] [11] A composição farmacêutica de acordo com [2], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L1.

[0026] [12] A composição farmacêutica de acordo com [11], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a PD- 1.

[0027] [13] A composição farmacêutica de acordo com [11], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a B7- 1.

[0028] [14] A composição farmacêutica de acordo com [11], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 tanto a PD-1 quanto a B7-1.

[0029] [15] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [12] a [14], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é um an-ticorpo anti-PD-L1.

[0030] [16] A composição farmacêutica de acordo com [11], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em: YW243.55.S70, Atezolizumabe, MPDL3280A, MDX-1105, avelumabe, e MEDI4736 (durvalumabe).

[0031] [17] A composição farmacêutica de acordo com [15], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada compre-endendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:19, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:20, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:23, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

[0032] [18] A composição farmacêutica de acordo com [15], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25 ou 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequên-cia de aminoácido de SEQ ID NO:4.

[0033] [19] A composição farmacêutica de acordo com [3], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L2.

[0034] [20] A composição farmacêutica de acordo com [19], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é um anticorpo.

[0035] [21] A composição farmacêutica de acordo com [19], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é uma imunoadesina.

[0036] [22] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [1] a [21], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma ca-deia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:34, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:35, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:36; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:37, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:38, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:39.

[0037] [23] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [1] a [21], em que o anticorpo anti-GPC3 é capaz de ligar-se a um etítopo ao qual um segundo anticorpo pode ligar-se, em que o refe-rido segundo anticorpo compreende uma cadeia pesada compreen-dendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:42, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:43, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:44; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:45, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:46, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:47.

[0038] [24] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [1] a [23] em que o anticorpo anti-GPC3 é um anticorpo huma-nizado.

[0039] [25] A composição farmacêutica de acordo com [24], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:52.

[0040] [26] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [1] a [25], em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovari- ano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[0041] A presente invenção também fornece:

[0042] [27] Uma composição farmacêutica para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo para uso em combi-nação com um anticorpo anti-GPC3, a referida composição compreen-dendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 como um ingrediente ativo.

[0043] [28] A composição farmacêutica de acordo com [27], em que o anticorpo anti-GPC3 é administrado antes da administração do antagonista de ligação de eixo PD-1, simultaneamente com a adminis-tração do antagonista de ligação de eixo PD-1, ou após a administra-ção do antagonista de ligação de eixo PD-1.

[0044] [29] A composição farmacêutica de acordo com [27] ou [28], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2.

[0045] [30] A composição farmacêutica de acordo com [29], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-1.

[0046] [31] A composição farmacêutica de acordo com [30], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a seus parceiros de ligação de ligante.

[0047] [32] A composição farmacêutica de acordo com [31], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L1.

[0048] [33] A composição farmacêutica de acordo com [31], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L2.

[0049] [34] A composição farmacêutica de acordo com [31], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 tanto a PD-L1 quanto PD-L2.

[0050] [35] A composição farmacêutica de acordo com [31], em que o antagonista de ligação de PD-1 é um anticorpo.

[0051] [36] A composição farmacêutica de acordo com [31], em que o antagonista de ligação de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em nivolumabe, lambrolizumabe (pembrolizumabe), e pidili- zumabe.

[0052] [37] A composição farmacêutica de acordo com [28], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L1.

[0053] [38] A composição farmacêutica de acordo com [37], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a PD- 1.

[0054] [39] A composição farmacêutica de acordo com [37], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a B7- 1.

[0055] [40] A composição farmacêutica de acordo com [37], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 tanto a PD-1 quanto a B7-1.

[0056] [41] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [38] a [40], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é um an-ticorpo anti-PD-L1.

[0057] [42] A composição farmacêutica de acordo com [37], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em: YW243.55.S70, Atezolizumabe, MPDL3280A, MDX-1105, avelumabe, e MEDI4736(durvalumabe).

[0058] [43] A composição farmacêutica de acordo com [41], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada compre-endendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:19, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:20, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:23, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

[0059] [44] A composição farmacêutica de acordo com [41], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25 ou 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequên-cia de aminoácido de SEQ ID NO:4.

[0060] [45] A composição farmacêutica de acordo com [29], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L2.

[0061] [46] A composição farmacêutica de acordo com [45], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é um anticorpo.

[0062] [47] A composição farmacêutica de acordo com [45], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é uma imunoadesina.

[0063] [48] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [27] a [47], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma ca deia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:34, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:35, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:36; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:37, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:38, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:39.

[0064] [49] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [27] a [47], em que o anticorpo anti-GPC3 é capaz de ligar-se a um etítopo ao qual um segundo anticorpo pode ligar-se, em que o refe-rido segundo anticorpo compreende uma cadeia pesada compreen-dendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:42, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:43, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:44; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:45, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:46, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:47.

[0065] [50] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [27] a [49] em que o anticorpo anti-GPC3 é um anticorpo huma-nizado.

[0066] [51] A composição farmacêutica de acordo com [50], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:52.

[0067] [52] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [27] a [51], em que o câncer é selecionado do grupo que consis-te em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[0068] A presente invenção também fornece:

[0069] [53] Uma composição farmacêutica para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo compreendendo uma combinação de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3 como um ingrediente ativo.

[0070] [54] A composição farmacêutica de acordo com [53], em que a composição farmacêutica é uma combinação de preparação.

[0071] [55] A composição farmacêutica de acordo com [53], em que o anticorpo anti-GPC3 é administrado antes da administração do antagonista de ligação de eixo PD-1, simultaneamente com a adminis-tração do antagonista de ligação de eixo PD-1, ou após a administra-ção do antagonista de ligação de eixo PD-1.

[0072] [56] A composição farmacêutica de acordo com [53] ou [55], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2.

[0073] [57] A composição farmacêutica de acordo com [56], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-1.

[0074] [58] A composição farmacêutica de acordo com [57], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a seus parceiros de ligação de ligante.

[0075] [59] A composição farmacêutica de acordo com [58], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L1.

[0076] [60] A composição farmacêutica de acordo com [58], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L2.

[0077] [61] A composição farmacêutica de acordo com [58], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 tanto a PD-L1 quanto PD-L2.

[0078] [62] A composição farmacêutica de acordo com [58], em que o antagonista de ligação de PD-1 é um anticorpo.

[0079] [63] A composição farmacêutica de acordo com [58], em que o antagonista de ligação de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em nivolumabe, lambrolizumabe (pembrolizumabe), e pidili- zumabe.

[0080] [64] A composição farmacêutica de acordo com [55], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L1.

[0081] [65] A composição farmacêutica de acordo com [64], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a PD- 1.

[0082] [66] A composição farmacêutica de acordo com [64], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a B7- 1.

[0083] [67] A composição farmacêutica de acordo com [64], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 tanto a PD-1 quanto a B7-1.

[0084] [68] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [65] a [67], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é um an-ticorpo anti-PD-L1.

[0085] [69] A composição farmacêutica de acordo com [64], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em: YW243.55.S70, Atezolizumabe, MPDL3280A, MDX-1105, avelumabe, e MEDI4736(durvalumabe).

[0086] [70] A composição farmacêutica de acordo com [68], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada compre-endendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:19, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:20, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:23, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

[0087] [71] A composição farmacêutica de acordo com [68], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25 ou 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequên-cia de aminoácido de SEQ ID NO:4.

[0088] [72] A composição farmacêutica de acordo com [56], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L2.

[0089] [73] A composição farmacêutica de acordo com [72], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é um anticorpo.

[0090] [74] A composição farmacêutica de acordo com [72], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é uma imunoadesina.

[0091] [75] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [53] a [74], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma ca deia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:34, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:35, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:36; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:37, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:38, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:39.

[0092] [76] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [53] a [74], em que o anticorpo anti-GPC3 é capaz de ligar-se a um etítopo ao qual um segundo anticorpo pode ligar-se, em que o refe-rido segundo anticorpo compreende uma cadeia pesada compreen-dendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:42, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:43, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:44; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:45, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:46, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:47.

[0093] [77] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [53] a [76] em que o anticorpo anti-GPC3 é um anticorpo huma-nizado.

[0094] [78] A composição farmacêutica de acordo com [77], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:52.

[0095] [79] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [53] a [78], em que o câncer é selecionado do grupo que consis-te em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[0096] A presente invenção também fornece:

[0097] [80] Uma composição farmacêutica para realçar as respos tas imunológicas contra as células de tumor em indivíduos para uso em combinação com um antagonista de ligação de eixo PD-1, a referi-da composição compreendendo um anticorpo anti-GPC3 como um in-grediente ativo.

[0098] [81] Uma composição farmacêutica para realçar as respos tas imunológicas contra as células de tumor em indivíduos para uso em combinação com um anticorpo anti-GPC3, a referida composição compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 como um in-grediente ativo.

[0099] [82] Uma composição farmacêutica para realçar as respos tas imunológicas contra as células de tumor em indivíduos compreen-dendo uma combinação de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3 como um ingrediente ativo.

[00100] [83] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [80] a [82], em que o anticorpo anti-GPC3 é administrado antes da administração do antagonista de ligação de eixo PD-1, simultanea-mente com a administração do antagonista de ligação de eixo PD-1, ou após a administração do antagonista de ligação de eixo PD-1.

[00101] [84] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [80] a [83], em que o câncer é selecionado do grupo que consis-te em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[00102] A presente invenção também fornece:

[00103] [85] Um método para o tratamento ou retardo de progres são de câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indiví-duo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3.

[00104] [86] O método de acordo com [85], em que o anticorpo anti- GPC3 é administrado antes da administração do antagonista de liga- ção de eixo PD-1, simultaneamente com a administração do antago-nista de ligação de eixo PD-1, ou após a administração do antagonista de ligação de eixo PD-1.

[00105] [87] O método de acordo com [85] ou [86], em que o anta gonista de ligação de eixo PD-1 é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2.

[00106] [88] O método de acordo com [87], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-1.

[00107] [89] O método de acordo com [88], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a seus parceiros de ligação de ligante.

[00108] [90] O método de acordo com [89], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L1.

[00109] [91] O método de acordo com [89], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L2.

[00110] [92] O método de acordo com [89], em que o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 tanto a PD-L1 quanto PD- L2.

[00111] [93] O método de acordo com [89], em que o antagonista de ligação de PD-1 é um anticorpo.

[00112] [94] O método de acordo com [89], em que o antagonista de ligação de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em nivoluma- be, lambrolizumabe (pembrolizumabe) e pidilizumabe.

[00113] [95] O método de acordo com [81], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L1.

[00114] [96] O método de acordo com [95], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a PD-1.

[00115] [97] O método de acordo com [95], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a B7-1.

[00116] [98] O método de acordo com [95], em que o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 tanto a PD-1 quanto a B7-1.

[00117] [99] O método de acordo com qualquer um de [96] a [98], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1.

[00118] [100] O método de acordo com [95], em que o antagonista de ligação de PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em: YW243.55.S70, Atezolizumabe, MPDL3280A, MDX-1105, avelumabe, e MEDI4736(durvalumabe).

[00119] [101] O método de acordo com [99], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:19, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:20, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:21 ; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:23, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

[00120] [102] O método de acordo com [99], em que o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada com-preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25 ou 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4.

[00121] [103] O método de acordo com [87], em que o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L2.

[00122] [104] O método de acordo com [103], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é um anticorpo.

[00123] [105] O método de acordo com [103], em que o antagonista de ligação de PD-L2 é uma imunoadesina.

[00124] [106] O método de acordo com qualquer um de [85] a [105], em que o anticorpo anti-GPC3 compreende uma cadeia pesada com-preendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:34, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:35, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:36; e uma cadeia leve compreendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:37, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:38, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:39.

[00125] [107] O método de acordo com qualquer um de [85] a [105], em que o anticorpo anti-GPC3 é capaz de ligar-se a um etítopo ao qual um segundo anticorpo pode ligar-se, em que o referido segundo anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:42, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:43, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:44; e uma cadeia leve com-preendendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:45, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:46, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:47.

[00126] [108] O método de acordo com qualquer um de [85] a [107] em que o anticorpo anti-GPC3 é um anticorpo humanizado.

[00127] [127] [109] O método de acordo com [108], em que o anti corpo anti-GPC3 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO:52.

[00128] [110] O método de acordo com qualquer um de [85] a [109], em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer he-pático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[00129] A presente invenção também fornece:

[00130] [111] Um método para realçar as respostas imunológicas contra as células de tumor em indivíduos para uso em combinação com um antagonista de ligação de eixo PD-1, a referida composição compreendendo um anticorpo anti-GPC3 como um ingrediente ativo.

[00131] [112] Um método para realçar as respostas imunológicas contra as células de tumor em indivíduos para uso em combinação com um anticorpo anti-GPC3, a referida composição compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 como um ingrediente ativo.

[00132] [113] Um método para realçar as respostas imunológicas contra as células de tumor em indivíduos compreendendo uma combi-nação de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti- GPC3 como um ingrediente ativo.

[00133] [114] O método de acordo com qualquer um de [111] a [113], em que o anticorpo anti-GPC3 é administrado antes da adminis-tração do antagonista de ligação de eixo PD-1, simultaneamente com a administração do antagonista de ligação de eixo PD-1, ou após a administração do antagonista de ligação de eixo PD-1.

[00134] [115] A composição de método de acordo com qualquer um de [111] a [114], em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovari- ano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[00135] A presente invenção também fornece:

[00136] [116] Uma composição para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3.

[00137] [117] A combinação de acordo com [116], em que o anticor po anti-GPC3 é administrado antes da administração do antagonista de ligação de eixo PD-1, simultaneamente com a administração do an-tagonista de ligação de eixo PD-1, ou após a administração do anta-gonista de ligação de eixo PD-1.

[00138] A combinação de acordo com [116] ou [117], em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[00139] A presente invenção também fornece:

[00140] [119] Um kit compreendendo (1) uma composição farma cêutica compreendendo um anticorpo anti-GPC3 como um ingrediente ativo, (2) um recipiente e (3) um rótulo ou folheto de embalagem com-preendendo instruções para administração da composição farmacêutica em combinação com um antagonista de ligação de eixo PD-1 para o tratamento ou retardo de progressão de um câncer em um indivíduo.

[00141] [120] Um kit compreendendo uma primeira composição farmacêutica compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 como um ingrediente ativo e uma segunda composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-GPC3 como um ingrediente ativo.

[00142] [121] O kit de acordo com [119] ou [120], em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico e câncer de próstata.

[00143] A presente invenção também fornece:

[00144] [122] Uso de um antagonista de ligação de eixo PD-1 na fabricação de um medicamento para o tratamento ou retardo de pro-gressão de câncer em um indivíduo, em que o medicamento compre-ende o antagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceutica- mente aceitável opcional, e em que o tratamento compreende adminis-tração do medicamento em combinação com uma composição com-preendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional.

[00145] [123] Uso de um anticorpo anti-GPC3 na fabricação de um medicamento para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo, em que o medicamento compreende o anticorpo an ti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e em que o tratamento compreende administração do medicamento em combina-ção com uma composição compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00146] Os inventores descobriram que combinando-se um anticorpo anti-GPC3 com um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano, melhores efeitos terapêuticos podem ser obtidos em um paciente de câncer do que quando tal um anticorpo anti-GPC3 ou um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano é usado sozinho.

[00147] Em um aspecto, é fornecido aqui um método para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e um anticorpo anti-GPC3.

[00148] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de realçar as respostas imunológicas contra as células tumorais em um indivíduo tendo câncer compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. Por exemplo, resposta imunológica realçada contra células tumorais inclui infiltração de células imunológicas incluindo macrófagos e células gigantes multinucleadas nos tecidos tumorais. Por outro exemplo, resposta imunológica realçada contra células tumorais inclui o aumento de linfócitos positivos de CD45, linfócitos positivos de CD3ε e linfóci- tos T positivos de CD8 em linfócitos infiltrados de tumor (TILs).

[00149] Em outro aspecto, é fornecido aqui uso de um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano na fabricação de um medicamento para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo, em que o medicamento compreende o antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e em que o tratamento compreende administração do medicamento em combinação com uma composição compreendendo um anticorpo anti- GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional.

[00150] Em outro aspecto, é fornecido aqui uso de um anticorpo anti-GPC3 na fabricação de um medicamento para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo, em que o medicamento compreende o anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceutica- mente aceitável opcional, e em que o tratamento compreende administração do medicamento em combinação com uma composição com-preendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e o veí-culo farmaceuticamente aceitável opcional.

[00151] Em outro aspecto, é fornecido aqui uma composição com-preendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e o veí-culo farmaceuticamente aceitável opcional para uso no tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo, em que o tratamento compreende administração da referida composição em combinação com uma segunda composição, em que a segunda composição com-preende um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente acei-tável opcional.

[00152] Em outro aspecto, é fornecido aqui uma composição com-preendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional para uso no tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo, em que o tratamento compreende adminis-tração da referida composição em combinação com uma segunda composição, em que a segunda composição compreende um antago-nista de ligação de eixo PD-1 humano e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional.

[00153] Em outro aspecto, é fornecido aqui um kit compreendendo um medicamento compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e um folheto de embalagem compreendendo instruções para administração do me- dicamento em combinação com uma composição compreendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo.

[00154] Em outro aspecto, é fornecido aqui um kit compreendendo um primeiro medicamento compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e um segundo medicamento compreendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional. Em algumas modalida-des, o kit também compreende um folheto de embalagem compreen-dendo instruções para administração do primeiro medicamento e do segundo medicamento para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo.

[00155] Em outro aspecto, é fornecido aqui um kit compreendendo um medicamento compreendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e um folheto de embalagem compreendendo instruções para administração do medicamento em combinação com uma composição compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo.

[00156] Em algumas modalidades dos métodos, uso, composições, e kits descritos acima e aqui, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado, o anticorpo quimérico ou um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação de antí- geno é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, scFv e Fv.

[00157] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a seus par-ceiros de ligação de ligante. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L1. Em algumas mo-dalidades, o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 tanto a PD-L1 quanto PD-L2. Em algumas mo-dalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é um anticorpo. Em algu-mas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em MDX-1106 (nivolumabe), MK-3475 (pembroli- zumabe, lambrolizumabe), CT-011 (pidilizumabe), PDR001, REGN2810, BGB A317, SHR-1210, AMP-514 (MEDI0680), e AMP- 224.

[00158] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L1. Em algumas modalida-des, o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a PD- 1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 a B7-1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 tanto a PD-1 quanto a B7-1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-L1 é um anticorpo. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em: YW243.55.S70, Ate- zolizumabe, MPDL3280A, MDX-1105, avelumabe, e MEDI4736 (durva- lumabe). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 compreen-de uma cadeia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:19, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:20, e sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; e/ou uma cadeia leve compreendendo se- quência de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO:23, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:24. Em alguma mo-dalidade, o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25 ou 26 e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 compreende as três sequências de HVR de cadeia pesada de anticorpo YW243.55.S70 e/ou as três sequências de HVR de cadeia leve de anticorpo YW243.55.S70 descrito no WO2010/077634 e Patente dos Estados Unidos n° 8.217.149, que são incorporados aqui por referência. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 compreende a sequência de região variável de cadeia pesada de anticorpo YW243.55.S70 e/ou a sequência de região variá-vel de cadeia leve de anticorpo YW243.55.S70. Em algumas modali-dades, o anticorpo anti-PD-L1 é Atezolizumabe.

[00159] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um antagonista de ligação de PD-L2. Em algumas modalida-des, o antagonista de ligação de PD-L2 é um anticorpo. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-L2 é uma imunoadesão.

[00160] Em algumas modalidades dos métodos, usos, composições, e kits descritos acima e aqui, o anticorpo anti-GPC3 é um anticorpo humanizado, o anticorpo quimérico ou um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação de antí- geno é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, scFv e Fv.

[00161] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 é GC33 ou codrituzumab. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 compreende uma cadeia pesada compreendendo sequência HVR-H1 de SEQ ID NO:42, sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO:43, e se- quência de HVR-H3 de SEQ ID NO:44; e/ou uma cadeia leve compre-endendo sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO:45, sequência de HVR- L2 de SEQ ID NO:46, e sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO:47. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 e/ou uma região variável de cadeia leve compreen-dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:51. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:52. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades, o anticorpo anti-GPC3 não é GC33 ou codrituzumabe.

[00162] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui (por exemplo, um antagonista de ligação de eixo PD-1 anticorpo ou um an-ticorpo anti-GPC3) compreende uma mutação de sítio de aglicosila- ção. Em algumas modalidades, a mutação de sítio de aglicosilação é uma mutação por substituição. Em algumas modalidades, a mutação por substituição está em um resíduo de aminoácido N297, L234, L235, e/ou D265 (EU numbering). Em algumas modalidades, a mutação por substituição é selecionada do grupo que consiste em N297G, N297A, L234A, L235A, e D265A. Em algumas modalidades, a mutação por substituição é uma mutação de D265A e uma mutação de N297G. Em algumas modalidades, a mutação de sítio de aglicosilação reduz a função efetora do anticorpo. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1, um an-ticorpo anti-PD-L1, ou um anticorpo anti-PD-L2) é uma IgG1 humana tendo substituição de Asn por Ala na posição 297 de acordo com a numeração de EU.

[00163] Em algumas modalidades dos métodos, usos, composições e kits descritos acima e aqui, o câncer é um câncer positivo de GPC3. Em algumas modalidades, o câncer é câncer hepático, câncer de ma-ma, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de be-xiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico, câncer de próstata, ou outros cânceres des-critos aqui. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer ou foi diagnosticado com câncer. Em algumas modalidades, as células de câncer no indivíduo expressam PD-L1.

[00164] Em algumas modalidades dos métodos, usos, composições, e kits descritos acima e aqui, o tratamento ou administração do antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e o anticorpo anti-GPC3 resulta emu ma resposta prolongada no indivíduo após a cessação do tratamento. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 é admi-nistrado antes do antagonista de ligação de eixo PD-1, simultaneous com o antagonista de ligação de eixo PD-1, ou depois do antagonista de ligação de eixo PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anticorpo anti-GPC3 estão na mesma com-posição. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anticorpo anti-GPC3 estão em composições separadas.

[00165] Em algumas modalidades dos métodos, usos, composições, e kits descritos acima e aqui, o antagonista de ligação de eixo PD-1 e/ou o anticorpo anti-GPC3 é administrado intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, trans- dermicamente, intraperitonealmente, intraorbitalmente, por implantação, por inalação, intratecalmente, intraventricularmente, ou intrana- salmente. Em algumas modalidades dos métodos, usos, composições, e kits descritos acima e aqui, o tratamento também compreende admi-nistrar um agente quimioterapêutico para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado com um agente quimioterapêutico antes do trata- mento de combinação com o antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anti-GPC3 anticorpo. Em algumas modalidades, o indivíduo tratado com a combinação do antagonista de ligação de eixo PD-1 e/ou o anti-corpo anti-GPC3 é refretário a um tratamento com agente quimio- terapêutico. Algumas modalidades dos métodos, usos, composições, e kits descritos por todo o pedido, também compreendem administrar um agente quimioterapêutico para o tratamento ou retardo de progressão de câncer.

[00166] Em algumas modalidades dos métodos, usos, composições e kits descritos acima e aqui, células T CD8 no indivíduo têm atividade de iniciação, ativação, proliferação e/ou citolítica com relação a antes da administração da combinação. Em algumas modalidades, o número de células T CD8 é elevado com relação a antes da administração da combinação. Em algumas modalidades, a célula T CD8 é uma célula T CD8 específica de antígeno.

[00167] Deve-se entendido que uma, algumas, ou todas as proprie-dades das várias modalidades descritas aqui podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Estes e outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes para alguém versado na técnica. Estas e outras modalidades da invenção são também descritas pela descrição detalhada que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [Figura 1]

[00168] A Figura 1 é um diagrama mostrando o Hepa1-6 expressando mudanças de volume de tumor de GPC3 humano em cada um dos camundongos tratados três vezes semanalmente por controle de veículo, 1 mg/kg ou 5 mg/kg de mGC33. A seta indica a data da inje-ção. Cinco camundongos por cada grupo foram tratados. [Figura 2A]

[00169] A Figura 2A é um diagrama mostrando as imagens de he- matoxilina e manchamento por eosina (HE) ou manchamento imuno- histoquímico por F4/80 (IHC) de tecidos isolados dos camundongos tratados ou pelo controle de veículo ou 5 mg/kg de mGC33. [Figura 2B]

[00170] A Figura 2B é um diagrama mostrando as imagens de he- matoxilina e manchamento por eosina (HE) ou manchamento histo- químico por PD-L1 (IHC) de tecidos isolados dos camundongos trata-dos ou pelo controle de veículo ou 5 mg/kg de mGC33. A seta indica imunorreatividade de PD-L1 observada em membranas celulares de células imunológicas inflitradas. [Figura 3A]

[00171] A Figura 3A é um diagrama mostrando o CT26 expressando mudanças de volume de tumor de GPC3 humano em cada um dos camundongos tratados ou por monoterapia (mGC33 ou 10F.9G2 (anti- PD-L1)) ou combinação (mGC33 + 10F.9G2). A seta indica a data da injeção. Cinco camundongos por grupo foram tratados. Média de vo-lume de tumor em cada grupo e barra de SD foram plotadas. [Figura 3B]

[00172] A Figura 3B é um diagrama mostrando a taxa de sobrevivência livre de progressão em camundongos transportando CT26/hGPC3 tratados ou por monoterapia (mGC33 ou 10F.9G2 (anti- PD-L1)) ou combinação (mGC33 + 10F.9G2). A progressão foi definida quando o tamanho de tumor alcançou mais do que 100 mm3. [Figura 4A]

[00173] A Figura 4A é um diagrama mostrando o CT26 expressando mudanças de volume de tumor de GPC3 humano em cada um dos camundongos tratados ou por monoterapia ou combinação. A seta in-dica a data da injeção. Cinco camundongos por grupo foram tratados. Média de volume de tumor em cada grupo e barra de SD foram plota- das. Os valores de inibição de crescimento de tumor de 5 mg/kg ou 25 mg/kg de mGC33, 10F.9G2, 5 mg/kg ou 25 mg/kg de mGC33 + 10F.9G2 were 52%, 58%, 68%, 75% e 85%, respectivamente. [Figura 4B]

[00174] A Figura 4B é um diagrama mostrando o volume de tumor individual no dia 29. Média (*) de volume de tumor em cada grupo foi também plotada. [Figura 5A]

[00175] A Figura 5A é um diagrama mostrando o Hepa1-6 expressando mudanças de volume de tumor de GPC3 humano em cada um dos camundongos tratados ou pelo controle de veículo, 1 mg/kg, 5 mg/kg ou 25 mg/kg de mGC33, 10F.9G2 ou combinação de 5 mg/kg ou 25 mg/kg de GC33 e 10F.9G2. A seta indica a data da injeção. Cinco camundongos por cada grupo foram tratados. [Figura 5B]

[00176] A Figura 5B é um diagrama mostrando a área de tumor in-dividual ou média + SD de área de tumor em cada grupo tratado no dia 34. A área de tumor (mm2) foi calculada por (comprimento (mm) de eixo longo de tecido tumoral) x (comprimento (mm) de eixo curto de tecido tumoral) após manchamento por HE de tecidos tumorais isolados de cada um dos camundongos, e os resultados de avaliação patológica de cada um dos tecidos tumorais foram adicionados na parte inferior dos gráficos. Processo patológico de doença (pPD) foi definido como "nenhuma regressão de tumor foi observada". A regressão parcial patológica (pPR) foi definida como "degeneração e/ou necrose de cé-lulas tumorais com infiltração de célula imunológica foi observada". Regressão patológica completa (pCR) foi definida como "nenhuma cé-lula tumoral foi observada no sítio de implentação de tumor". [Figura 6A]

[00177] A Figura 6A é um diagrama mostrando o Hepa1-6 expressando mudanças de volume de tumor de GPC3 humano em cada um dos camundongos tratados ou por monoterapia ou combinação of mGC33 e 6E11 (anti-PD-L1) com vários níveis e programações de do-se indicados. A seta indica a data da injeção. Cinco camundongos por cada grupo foram tratados. [Figura 6B]

[00178] A Figura 6B é um diagrama mostrando os valores médios do Hepa1-6 expressando mudanças de volume de tumor de GPC3 humano em cada grupo de camundongos tratados ou por monoterapia ou combinação de mGC33 e 6E11. O crescimento de tumor no grupo foi significantemente inibido em comparação com aqueles nos grupos tratados ou por monoterapia com GC33 ou 6E11. A seta indica a data da injeção. Cinco camundongos por cada grupo foram tratados. *: P < 0,05 por Wilcoxon (SAS Institute Inc.) [Figura 6C]

[00179] A Figura 6C é um diagrama mostrando os valores médios das mudanças de peso corporal em cada um dos grupos de tratamento de camundongos transportando Hepa1-6 expressando GPC3 humano. Barras de SD são adicionadas. [Figura 7]

[00180] A Figura 7 é um diagrama mostrando fotomicrográficos de tecidos tumorais no subcutâneo em cada grupo. A área cinza indica a área de tumor ou tecidos linfoides/de granulação sem necrose. A área azul indica a área de tumor ou tecido de granulação com necrose. A linha pontilhada indica a borda da massa. L significa o tecido linfoide, G significa tecido de granulação, pCR significa resposta patológica completa (nenhum tecido tumoral na lâmina de histopatologia), e MOR significa animal de sacrifício moribundo causado por progressão de tumor. [Figura 8A]

[00181] A Figura 8A é um diagrama mostrando fotomicrográficos representativos de tecidos tumorais manchados por HE na periferia de ajustando-se ao estroma em cada um dos grupos tratados. Necrose de tumor com infiltração de células imunológicas incluindo macrófagos/ células gigantes multinucleadas é observada em todos os grupos tra-tados. A gravidade das lesões é da seguinte ordem: mGC33 5 mg/kg simples + 6E11 q7d x 3 > mGC33 5 mg/kg simples ou 6E11 q7d x 3. S significa o estroma ajustando a massa tumoral, e P significa periferia da massa tumoral. [Figura 8B]

[00182] A Figura 8B é um diagrama mostrando fotomicrográficos representativos de IHC de F4/80 de tecidos tumorais na periferia de massa ajustando-se ao estroma em cada um dos grupos tratados. No veículo, células positivas de F4/80 são principalmente observadas no estroma. Por outro lado, gravidade aumentada de células imunológicas positivas de F4/80 incluindo macrófagos/células gigantes multinuclea- das são observada principalmente na periferia da massa tumoral em todos os grupos tratados. A gravidade da infiltração de célula positiva é da seguinte ordem: mGC33 5 mg/kg simples + 6E11 q7d x 3 > mGC33 5 mg/kg simples ou 6E11 q7d x 3. S significa estroma ajustando massa tumoral, e P significa periferia de massa tumoral. [Figura 8C]

[00183] A Figura 8C é um diagrama mostrando fotomicrográficos representativos de IHC de PD-L1 de tecidos tumorais na periferia de massa ajustando-se ao estroma em cada um dos grupos tratados. No veículo, reações positivas de PD-L1 são principalmente observada no citoplasma de células tumorais com intensidade fraca. Por outro lado, gravidade aumentada de reações positivas de PD-L1 em células imu- nológicas incluindo macrófagos/células gigantes multinucleadas são observada com intensidade fraca a média em todos os grupos tratados. S significa estroma ajustando massa tumoral, e P significa perife- ria de massa tumoral. [Figura 9]

[00184] A Figura 9 é um diagrama mostrando a porcentagem de células positivas marcadoras observadas em tecidos tumorais em cada um dos grupos tratados. Valores individuais e media em cada um dos grupos plotados e valores médios são indicados em cada um dos gráficos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00185] Os dados na aplicação mostram que a combinação de um anticorpo anti-GPC3 com a terapia anti-PD-L1 imune resultou na inibi-ção realçada de crescimento de tumor, taxas de respostas aumentadas e respostas duráveis. Os inventores demonstraram o benefício de combiner as duas terapias: a atividade citotóxica contra células tumo- rais expressando juntamente com a inibição sinalização de PD-1/PD- L1 supressivo de célula T resulta em efeitos terapêuticos realçados e respostas a longo prazo duráveis.

[00186] Em um aspecto, são fornecidos aqui métodos, composições e usos para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e um anticorpo anti- GPC3.

[00187] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos, composições e usos para realçar as respostas imunológicas contra células tu- morais em um indivíduo tendo câncer compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 humano e um anticorpo anti-GPC3. Por exemplo, resposta imunológi- ca realçada contra células tumorais inclui infiltração de células imuno- lógicas incluindo macrófagos e células gigantes multinucleadas nos tecidos tumorais. Por outro exemplo, resposta imunológica realçada contra células tumorais inclui o aumento de linfócitos positivos de CD45, linfócitos positivos de CD3ε e linfócitos T positivos de CD8 em linfócitos infiltrados de tumor (TILs).

Definições

[00188] Antes de descrever a invenção em detales, deve-se entender que esta invenção não está limitada à composições particulares ou sistemas biológicos, que podem, certamente, variar. Deve-se entender também que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas, e não se destina a ser limitante.

[00189] Como usado na especificação e as reivindicações anexadas, as formas singulares "um/uma(a)", " um/uma(an)" e "o/a" incluem plurais referentes, a menos que, claramente, de outro modo indicado. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma molécula" opcional-mente inclui uma combinação de duas ou mais tais moléculas, e simi-lares.

[00190] O termo "a cerca de", como usado aqui, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor facilmente conhecido pela pessoa versada no campo técnico. A referência a "cerca de", um valor ou pa-râmetro aqui, inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas àquele valor ou parâmetro de per si.

[00191] Entende-se que aspectos e modalidades da invenção descritas aqui incluem "compreendendo", "consistindo", e "consistindo es-sencialmente em" aspectos e modalidades.

[00192] O termo "Antagonista de ligação de eixo PD-1" refere-se a uma molécula que inibe a interação de um parceiro de ligação de eixo PD-1 com um ou mais de seu parceiro de ligação, de modo a remover a disfunção de célula T resultando da sinalização do eixo de sinalização de PD-1 - com um resultado sendo restaurar ou realçar a função de célula T (por exemplo, proliferação, produção de citocina, morte de célula alvo). Como usado aqui, um antagonista de ligação de eixo PD- 1 inclui um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2.

[00193] O termo "antagonista de ligação de PD-1" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere na transdução de sinal que resultam da interação de PD-1 com um ou mais de seu parceiro de ligaçãos, tal como PD-L1, PD-L2. Em algumas modalida-des, o antagonista de ligação de PD-1 é uma molécula que inibe a li-gação de PD-1 a um ou mais de seu parceiro de ligaçãos. Em um as-pecto específico, o antagonista de ligação de PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD-L1 e/ou PD-L2. Por exemplo, antagonistas de inibição de PD-1 incluem anticorpos anti-PD-1, fragmentos de ligação de antígeno tdos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interfe-rem na transdução de sinal que resultam da interação de PD-1 com PD-L1 e/ou PD-L2. Em uma modalidade, um antagonista de ligação de PD-1 reduz o sinal coestimulador negativo mediado por meio de super-fície celular expressa em sinalização mediada por linfócitos T por meio de PD-1 de modo a render uma célula T disfuncional menos disfuncio- nal (por exemplo, realçando respostas eficazes ao reconhecimento de antígeno). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1. Em um aspecto específico, um antagonista de ligação de PD-1 é MDX-1106 (nivolumabe) descrito aqui. Em outro aspecto específico, um antagonista de ligação de PD-1 é MK-3475 (lambrolizumabe) descrito aqui. Em outro aspecto específico, um anta-gonista de ligação de PD-1 é CT-011 (pidilizumabe) descrito aqui. Em outro aspecto específico, um antagonista de ligação de PD-1 é AMP- 224 ou AMP-514 (MEDI0680) descrito aqui. Em outro aspecto especí-fico, um antagonista de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em PDR001, REGN2810, BGB A317 e SHR-1210 descrito aqui.

[00194] O termo "atagonista de ligação de PD-L1" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere na transdução de sinal que resultam da interação de PD-L1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1, B7-1. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação de PD-L1 é uma molécula que inibe a liga-ção de PD-L1 ao seu parceiro de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação de PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 ao PD-1 e/ou B7-1. Em algumas modalidades, os antagonistas de ligação de PD-L1 incluem anticorpos anti-PD-L1, fragmentos de ligação de antí- geno dos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem na transdução de sinal que resultam da interação de PD-L1 com um ou mais de seu parceiro de ligaçãos, tal como PD-1, B7-1. Em uma modalidade, um antagonista de ligação de PD-L1 reduz o sinal coesti- mulador negativo mediado por ou através de proteínas de superfície celular expressas em sinalização mediada por linfócitos T através de PD-L1 de modo que renda uma célula T disfuncional menos disfuncio- nal (por exemplo, realçando respostas eficazes ao reconhecimento de antígeno). Em algumas modalidades, um antagonista de ligação de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em um aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é o YW243.55.S70 ou Atezolizumab descrito aqui. Em outro aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é o MDX-1105 descrito aqui. Em outro aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é o avelumabe descrito aqui. Em ainda outro aspecto específico, um an-ticorpo anti-PD-L1 é MPDL3280A descrito aqui. Em ainda outro aspec-to específico, um anticorpo anti-PD-L1 é MEDI4736 (durvalumabe) descrito aqui.

[00195] O termo "Antagonista de ligação de PD-L2" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere na transdução de sinal que resultam da interação de PD-L2 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação de PD-L2 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L2 a um ou mais de seu parceiro de ligaçãos. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação de PD-L2 inibe a ligação de PD-L2 ao PD-1. Em algumas modalidades, os antagonistas de PD-L2 incluem anticorpos anti-PD-L2, fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem na transdução de sinal que resultam da interação de PD-L2 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1. Em uma modalidade, um antagonista de ligação de PD-L2 reduz o sinal coestimulador negativo mediado por ou através de proteínas de superfície celular expressas em sinalização mediada por linfócitos T através de PD-L2 de modo a render uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, realçando respostas eficazes ao reconhecimento de antíge- no). Em algumas modalidades, um antagonista de ligação de PD-L2 é uma imunoadesina.

[00196] O termo "disfunção" em relação à disfunção imune, refere- se a um estado de reduzida responsividade à estimulação antigênica. O termo inclui os elementos comuns tanto de exaustão quanto/ou ane- rgia em que o reconhecimento de antígeno pode ocorrer, porém a ga-rantia da resposta immune é eficaz para controlar a infecção ou cres-cimento de tumor.

[00197] O termo "disfuncional", como usado aqui, também inclui re-fratário ou não responsivo ao reconhecimento de antígeno, especifica-mente, capacidade prejudicada de traduzir o reconhecimento de antíge- no em funções eficazes de célula T a jusante, tais como proliferação, produção de citocina (por exemplo, IL-2) e/ou morte de célula alvo.

[00198] O termo "anergia" refere-se ao estado de falta de resposta ao estímulo de antígeno, resultando de sinais incompletes ou insulfici- entes liberados através do receptor de célula T (por exemplo, aumento no Ca+2 intracelular na ausência de ativação de ras). A anergia de célu- la T pode também resultar na estimulação com antígeno na ausência de coestimulação, resultando na célula transformando-se refratária à ativação subsequente pelo antígeno mesmo em relação à coestimula- ção. O estado não resposivo pode frequentemente ser sobrescrito pela presença de interleucina-2. As células T anérgicas não sofrem expan-são clonal e/ou adquirem efetoras.

[00199] O termo "exaustão" refere-se à exaustão da célula T como um estado de disfunção de célula T que se origina de sinalização de TCR prolongada que ocorre durante infecções muito crônicas e cãn- cer. Ele se distingue da anergia pelo fato de não se originar por meio de sinalização incomplete ou deficiente, porém de sinalização prolongada. Define-se por má função efetora, expansão prolongada de receptores inibidores e estado transcricional distinto daquele das células T de memória ou efetoras funcionais. A exaustão impede o controle ideal de infecção e tumores. A exaustão pode resultar tanto de série de reações reguladoras negativas extrínsecas (por exemplo, citocinas imunorreguladoras) bem como série de reações reguladoras negativas instrínsecas (costimulatory) (PD-1, B7-H3, B7-H4, etc.).

[00200] "Realce de função de célula T" significa induzir, causar ou estimular uma célula T a ter uma função biológica amplificada ou pro-longada, ou renovar ou reativar as células T inativas ou exaustas. Os exemplos de realce de função de célula T incluem: secreção aumenta-da de interferon Y de células T CD8+, proliferação aumentada, respon- sividade de antígeno aumentada (por exemplo, depuração viral, pató- gena, ou de tumor) em relação a tais níveis antes da invenção. Em uma modalidade, o nível de realce é pelo menos 50%, alternativamente 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. A maneira de medição deste realce é conhecida por alguém versado na técnica.

[00201] Um "distúrbio disfuncional de célula T" é um distúrbio ou condição de células T caracterizado por responsividade diminuída a estímulo antigênico. Em uma modalidade particular, um distúrbio dis- funcional de célula T é um distúrbio que é especialmente associado com sinalização aumentada inapropriada através de PD-1. Em outra modalidade, um distúrbio de disfunção de células T é aquele em que as células T são anérgicas ou têm capacidade diminuída de citocinas secretas, proliferativas, ou executam atividade citolítica. Em um aspec-to específico, a responsividade diminuída resulta em controle ineficaz de um patógeno ou tumor que expressa um imunógeno. Os exemplos de distúrbio disfuncional de células T caracterizados por disfunção de célula T incluem infecção aguda não resolvida, infecção crônica e imu-nidade de tumor.

[00202] "Imunidade de tumor" refere-se ao processo em que os tu-mores escapam ao reconhecimento imune e depuração. Desse modo, como um conceito terapêutico, a imunidade de tumor é "tratada" quan-do tal evasão é atenuada, e os tumores são reconhecidos e atacados pelo sistema imune. Os exemplos de reconhecimento de tumor incluem ligação de tumor, encolhimento de tumor e depuração de tumor.

[00203] "Imunogenicidade" refere-se à capacidade de uma substância particular provocar uma resposta imunológica. Os tumores são imunogênicos e realçam o auxílio de imunogenicidade na depuração das células de tumor pela resposta imunológica. Os exemplos de realce de imunogenicidade de tumor incluem tratamento com um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3.

[00204] "Resposta prolongada" refere-se ao efeito prolongado da redução de crescimento de tumor após a cessação de um tratamento. Por exemplo, o tramanho de tumor pode permanecer o mesmo ou me-nor em comparação ao tamanho no início da fase de administração. Em algumas modalidades, a resposta prolongada tem uma duração pelo menos igual à duração de tratamento, pelo menos 1,5X, 2,0X, 2,5X, ou 3,0X de comprimento da duração de tratamento.

[00205] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que é de tal forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém nenhum componente adicional que seja inaceitavelmente tóxica a um indivíduo ao qual a formulação seria administrada. Tais formulações são estéreis. Os exci- pientes "farmaceuticamente acietáveis" (veículos, aditivos) são aqueles que podem razoavelmente ser administrados a um indivíduo mamífero para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.

[00206] Como usado aqui, o termo "tratamento" refere-se a intervenção clínica planejada após o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada durante o decorrer da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem decréscimo da taxa de progressão de doença, melhoramento ou paliação do estado de doença, eremissão ou melhor prognóstico. Por exemplo, um indivíduo é sucessivamente "tratado" se um ou mais sintomas associados com câncer são mitigados ou eliminados, incluindo, porém não são limitados a, redução da proliferação de (ou destruição) células cancerosas, redução do cres-cimento de tumor, ddiminuição dos sintomas que resultam da doença, aumentando da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outros medicamentos requeridos para tratar a doença, e/ou prolonger a sobrevivência de indivíduos.

[00207] Como usado aqui, "retardo da progressão de uma doença" significa diferir, dificultar, atrasar, retarder, estabilizar, e/ou adiar o de-senvolvimento da doença (tal como câncer). Este retardo pode ser di-ferentes período de tempo, dependendo da história da doença e/ou indivíduo a ser tratado. Como é evidente para aquele versado na téc-nica, um retardo suficiente ou significante pode, de fato, abranger pre-venção, em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer de estágil final, tal como desenvolvimento de metástase, pode ser retardado.

[00208] Uma "quantidade eficaz" é pelo menos a quantidade mínima requerida para afetar uma melhora ou prevenção mensurável de um distúrbio particular. Uma quantidade eficaz aqui pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do paciente, e da capacidade do anticorpo elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz é também aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do tratamento é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados tal como eliminação ou re-dução do risco, diminuendo a gravidade, ou ritardando o início da do-ença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamen- tal da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediá-rios que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resul-tados clínicos tal como diminuição de um ou mais sintomas que resul-tam da doença, aumentando a qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuendo a dose de outras modificações requeridas para tratar a doença, realçando o efeito de outra medicação tal como por meio de alvejamento, retardando a progressão da doença, e/ou pro-longando a sobrevivência. No caso de câncer ou tumor, uma quantida-de eficaz do fármaco pode ter o efeito na redução do número de células de câncer; reduzindo o tamanho de tumor; inibindo (isto é, retartar até certo ponto ou desejavelmente interromper) a infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; inibindio (isto é, retardo até certo ponto e desejavelmente interrupção) a metástase de tumor; inibindo até certo ponto o crescimento de tumor; e/ou aliviando até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o distúrbio. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para propósitos desta invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, com-posto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar tratamento profilático ou terapêutico diretamente ou indireta-mente. Como é entendida no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto, ou composição farmacêutica pode ou não pode ser obtida juntamente com outro fármaco, composto, ou compo-sição farmacêutica. Desse modo, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada em relação à administração a um ou mais agentes tera-pêuticos, e um agente único pode ser considerado ser fornecido em uma quantidade eficaz se, juntamente com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é obtido.

[00209] Como usado aqui, "juntamente com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento além de outra modalidade de tratamento. Como tal, "juntamente com" refere-se à adminnistração de uma modalidade de tratamento antes, durante, após a adminnistração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[00210] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento, incluindo, porém não limitada a, doenças ou distúrbios crônicos e agudos incluindo aquelas condições patológicas que pre-dispõem o mamífero ao distúrbio em questão.

[00211] Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio prolife- rativo" refere-se a distúrbios que são associados com algum grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio prolifera- tivo celular é câncer. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo ce-lular é um tumor.

[00212] "Tumor", como usado aqui, refere-se a todo crescimento e proliferação celular neoplástica, seja maligna ou benigna, e todas as células e tecidos cancerosos e pré-cancerosos. Os termos "câncer", "canceroso", "distúrbio proliferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos, como referido aqui.

[00213] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem a condição psicológica, em mamíferos, que tipicamente caracteri- zada por crescimento celular desregulado. Os exemplos de cancer in-cluem, porém não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sar-coma, e leucemia ou malignidades linfoides. Mais exemplos particula-res de tais cânceres incluem, porém não são limitados a, câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epite- liais), cãncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de células peque-nas, cancer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer do estômago ou gástrico, incluindo cancer gas-trointestinal e cancer estromal gastrointestinal, cancer pancreático, glioblastoma, cancer cervical, cancer ovariano, cancer de fígado, cân-cer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, cancer de mama, cancer de cólon, cancer retal, cancer colorretal, carcinoma endometrial ou carcinoma uterino, carcinoma da glândula salivar, cancer do rim ou renal, cancer de próstata, cancer vulvar, cancer da tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, melanoma disseminado superficial, melanoma lentiginoso maligno, acral lentigi-nous melanomas, nodular melanomas, mieloma múltiplo e B-cell linfo- ma (incluindo low grade/follicular não Hodgkin's linfoma (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); grau intermediário/NHL folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblásti- co de alto grau; NHÇ de célula não clivada pequena de alto grau; NHL de doença volumosa; mantle cell linfoma; linfoma relacionado com AIDS; e macroglobulinemia de Waldenstrom); leukemia linfocítica crô-nica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula ca-pilar; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio linfoproliferativo pós- transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada com facomatose, edema (tal como aquele associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, cérebro, bem como câncer de cabeça e pescoço, e mestátase associada. Em certas modalidades, os cânce- res que são receptivos ao tratamento pelos anticorpos da invenção incluem incluem cãncer de mama, cancer colorretal, cancer retal, can-cer de pulmão de células não pequenas, glioblastoma, linfoma linfoma Hodgkins (NHL), cãncer de célula renal, câncer de próstata, cãncer de fígado, cancer pancreático, sarcoma de tecido macio, sarcoma de ka-posi, carcinoma carcinoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, mesotelioma, e mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de: cãncer de ulmão de célula pequena, gliblas- toma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, câncer gástri-co, câncer colorretal (CRC), e carcinoma hepatocelular. Ainda, em al-gumas modalidades, o câncer é selecionado de: câncer de pulmão de célula não pequena, câncer colorretal, glioblastoma, carcinoma de mama e carcinoma hepatocelular, incluindo formas metastática daque-les cânceres.

[00214] O termo "agente citotóxico" como usado aqui refere-se a qualquer agente que seja prejudicial para as células (por exemplo, causa morte cellular, inibe a proliferação, ou de outro modo dificulta uma função celular). Os agentes citotóxicos incluem, porém não são limitados a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterapêuticos; agentes inibidores de crescimento; enzi-mas e fragmentos dos mesmos tal como enzimas nucleolíticas; e toxi-nas tal como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamen- te ativas de origem bacteriana, fúngica, animal ou de planta, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos. Os agentes citotóxicos exem-plares podem ser selecionados de agentes agentes antimicrotúbulo, complexos de coordenação de platina, agentes de alquilação, agentes antibióticos, inibidores de topoisomerase II, antimetabólitos, inibidores de topoisomerase I, homônimos e análogos hormonais, inibidores de série de reações de transdução de sinal, inibidores de angiogênese de tirosina cinase não receptora, agentes imunoterapêuticos, agentes proapoptótico, inibidores de LDH-A, inibidores de biossíntese de ácido graxo, iniidores de sinalização de cíclo celular, inibidores de HDAC, inibidores de proteassoma, e inibidores de metabolismo de câncer. Em uma modalidade, o agente citotóxico é um taxano. Em uma modalida-de, o taxano é paclitaxel ou docetaxel. Em uma modalidade, agente citotóxico é um agente de platina. Em uma modalidade, o agente cito- tóxico é um antagonista de EGFR. Em uma modalidade, o antagonista de EGFR é N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietóxi)quinazolin-4-amina (por exemplo, erlotinibe). Em uma modalidade, o agente citotóxico é um inibidor de RAF. Em uma modalidade, o inibidor de RAF é um inibidor de BRAF e/ou CRAF. Em uma modalidade, o inibidor de RAF é vemurafenibe. Em uma modalidade, o agente citotóxico é um inibidor de PI3K.

[00215] "Agente quimioterapêutico" inclui, porém não é limitado a, análogos de mostarda nitrogenada, sulfonates de alquila, iminas de etileno, nitrosoureias, epóxidos, outros agentes de alquilação, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, outros agentes antimetabólicos, alcanoides de vinca ou análogos, derivados de podofilotoxina, análogos de camptotecano, derivados de colcicina, taxanos, outros alcanoides de planta ou produtos naturais, actinomici- nas, antraciclinas ou substãncias relacionadas, outros antibióticos cito- tóxicos, compostos de platina, metilidrazinas, inibidores de cinase, en-zimas, inibidres de histone desacetilase, retinoides, inibidores de ponto de checagem imune, anticorpos e outro fármaco de alvo molecular.

[00216] "Agente quimioterapêutico" também inclui compostos úteis no tratamento de câncer. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem erlotinibe (TARCEVA (registrado), Genentech/OSI Pharm.), bortezomibe (VELCADE (registrado), Millennium Pharm.), dissulfiram, galato de epigalocatequina, salinosporamida A, carfilzomibe, 17-AAG (geldanamicina), radicicol, lactate desidrogenase A (LDH-A), fulves- trante (FASLODEX (registrado), AstraZeneca), sunitibe (SUTENT (re-gistrado), Pfizer/Sugen), letrozol (FEMARA (registrado), Novartis), me- silato de imatinibe (GLEEVEC (registrado), Novartis), finasunato (VA- TALANIB (registrado), Novartis), oxaliplatina (ELOXATIN (registrado), Sanofi), 5-FU (5-fluorouracila), leucovorina, Rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNE (registrado), Wyeth), Lapatinibe (TYKERB (registrado), GSK572016, Glaxo Smith Kline), Lonafamibe (SCH 66336), sorafenibe (NEXAVAR (registrado), Bayer Labs), gefitinibe (IRESSA (registrado), AstraZeneca), AG1478, agentes de alquilação tais como tiotepa e ci- closfosfamida de CYTOXAN (registrado); sulfonatos de alquila tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e meti- lamelaminas incluindo altretaminas, trietilenomelaminas, trietilenofosfo- ramida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelaminas; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluin-do topotecano e irinotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluin-do seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); adrenocor- ticosteroides (incluindo prednisona e prednisolona); acetate de ciprote- rona; 5α-reductases incluindo finasterida e dutasterida); vorinostato, romidepsina, panobinostato, ácido valproico, dolastatina mocetinosta- to; aldesleucina, duocarmicina de talco (incluindo os análogos sintéti-cos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarco- dictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambuci- la, clomafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloreta- minas, hidrocloreto de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiqui- na, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; ni- trosoureias tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos tal como o antibióticos enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina Y1I e ca- liqueamicina w1I (Angew Chem. Intl. Edição. Engl. 1994 33: 183-186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como cromoforo de estatina de neocarzino e cromoforos antibiótico de enedina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, ADRIAMICINA (registrado) (doxorrubicina), morfolino- doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelo- micina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, noga- lamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quela- micina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos tais como metotre- xato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico tais como de- nopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análo-gos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, car- mofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitioestanol, mepitioestano, testolactona; antiadrenais tais como ami- noglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; eda- traxato; defofaminas; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptíneo; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxoureia; len- tinano; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitoci- nas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamnol; nitraerina; pentoestati- na; fenameto; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2- etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo de PSK (regis-trado) (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizo- furano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilaminas; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomus- tina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, TAXOL (pacli-taxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE (registrado) (livre de Cremophor), as formulações de nanopartícula cri-adas com albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11.), e TAXOTERE (registrado) (docetaxel, doxetaxel; Sanofi-Aventis); clorambucila; GEMZAR (registrado) (gemcitabina); 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tal como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE (registrado) (vinorelbina); no-vantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capeci- tabina (XELODA (registrado)); ibandronato; CPT-11; inibidor de to-poisomerase RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinoico; e ácidos e sais farmaceuticamente aceitáveis, e derivados de qualquer dos acima.

[00217] O agente quimioterapêutico também inclui anticorpos tal como alemtuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN (registrado), Genentech); cetuximabe (ERBITUX (registrado), Imclone); pani- tumumabe (VECTIBIX (registrado), Amgen), rituximabe (RITUXAN (re-gistrado), Genentech/Biogen Idec), pertuzumabe (OMNITARG (regis-trado), 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN (registrado), Genentech), tositumomabe (Bexxar, Corixia), e o conjugado de fárma- co anticorpo, ozogamicina de gemtuzumabe (MYLOTARG (registrado), Wyeth). Anticorpos monoclonais humanizados adicionais com potencial terapêutico como agentes em combinação com os compostos das invenção incluem: apolizumabe, aselizumabe, atlizumabe, bapineuzu- mabe, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizuma- be, certolizumabe pegol, cidfusituzumabe, cidtuzumabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizumabe, epratuzumabe, erlizumabe, felvizumabe, fontolizumabe, gentuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumabe, labetuzumabe, lintuzumabe, matuzumabe, mepolizuma- be, motavizumabe, motovizumabe, natalizumabe, nimotuzumabe, nolovizumabe, numavizumabe, ocrelizumabe, omalizumabe, palivizu- mabe, pascolizumabe, pecfusituzumabe, pectuzumabe, pexelizumabe, ralivizumabe, ranibizumabe, reslivizumabe, reslizumabe, resyvizuma- be, rovelizumabe, ruplizumabe, sibrotuzumabe, siplizumabe, sontuzu- mabe, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumabe, talizumabe, tefibazu- mabe, tocilizumabe, toralizumabe, tucotuzumabe celmoleucina, tucusi- tuzumabe, umavizumabe, urtoxazumabe, ustecinumabe, visilizumabe, e o anti-interleucina-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research e Abbott La-boratories) que é uma sequência uma sequência exclusivamente hu-mana recombinante, À anticorpo de IgG1 de tamanho natural geneti-camente modificado para reconhecer a proteína p40 de interleucina- 12.

[00218] Um "agente de inibidor de crescimento" quando usado aqui, refere-se a um composto ou combinação que inibe crescimento de uma célula in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, o agente inbidor de crescimento é anticorpo inibidor de crescimento que previne ou reduz proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual o anti-corpo se liga. Em outra modalidade, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que significativamente reduz a porcentagem de células em fase de S. Os exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão de ciclo celular (em um lugar diferente da fase S), tais como agentes que induzem a parade de G1 e a parade da fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos inclu- em as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores de to-poisomerase II tais como doxorrubicina, epirubicina, daunorrubicina, etoposida, e bleomicina. Aqueles agentes que param o G1 também transbordam na para de fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA tal como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretaminas, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila, e ara-C. Outra informação pode ser encontrada em Mendelsohn and Israel, edições, The Molecular Ba-sis of Cancer, Chapter 1, entitulada "Cell cycle regulation, oncogenes, e antineoplastic drugs" por Murakami et al., (W.B. Saunders, Philadel-phia, 1995), por exemplo, p. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticâncer ambos derivados do teixo. O Docetaxel (TA-XOTERE (registrado), Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo euro-peu, é um análogo semissintético de paclitaxel (TAXOL (registrado), Bristol-Myers Squibb). O paclitaxel e o docetaxel promovem a monta-gem de microtubos de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbu- los prevenindo-se a despolimerização, que resulta na inibição de mito-se em células.

[00219] Por "terapia de radiação" entende-se o uso de raios gama direcionados ou raios beta para induzir dano suficiente a um célula de modo a limitar sua capacidade de funcionar normalmente ou destruir a célula conjuntamente. Apreciar-se-á que haverá muitas maneiras co-nhecidas na técnica para determinar a dosage e duração de tratamento. Os tratamentos típicos são fornecidos como uma adminnistração única e doses típicas variando de 10 a 200 unidades (Grays) por dia.

[00220] Um "sujeito" ou um "indivíduo", para propósitos de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais de fazenda e domésticos, e zoológico, esportes, ou animais de estimação, tais como cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. preferivelmente, o mamífero é um ser humano.

[00221] O termo "antibiótico" aqui é usado no sentido mais amplo e especificamente reveste anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo com tanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[00222] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que podem interferir com pesquisa, usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado (1) em mais do que 95% por peso do anticorpo como deter-minado, por exemplo, pelo método de Lowry, e em algumas modalida-des, mais do que 99 % por peso; (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido interno ou de terminal de N por uso de, por exemplo, um sequenciador giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob redução ou sob condi-ções de redução ou não redução usando, por exemplo, mancha azul coomassie ou prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro das células recombinants, visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorponão estará presente. Ordinariamente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[00223] "Anticorpos nativos" são geralmente glicoproteínas hetero- tetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto cova-lente, ao mesmo tempo em que o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de isótipos de imunoglobulina diferen-tes. Cada cadeia leve e pesada também tem ponte de dissulfeto intra- cadeia regularmente espaçada. Cada cadeia pesada tem em uma ex- tremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domí-nios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e uma domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e a cadeia leve o domínio variável de ca-deia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredi-ta-se que os resíduos de aminoácido particulares são formam uma in-terface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada.

[00224] O termo "domínio constante" refere-se à porção de uma molécula de imunoglobulina tendo uma sequência de aminoácido mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação de antígeno. O domínio cons-tante contém os domínios de CH1, CH2 e CH3 (coletivamente, CH) da cadeia pesada e o domínio de CHL (ou CL) da cadeia leve.

[00225] A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se aos domínios de terminal de amino da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação de antígeno.

[00226] O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre anticorpos e são usadas na ligação e a especifidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Entretanto, a capacidade não é uniformemente distribuída ao longo dos domínios de anticorpos. Ela é concentrada nestes segmentos chamados chamados de regiões hi- pervariáveis (HVRs) tanto na cadeia leve quanto nos domínios variá-veis de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de vários domínios são as chamadas regiões estruturais (FR). Os domí-nios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem qua- tro regiões de FR, amplamente adotando uma configuração, conecta-das por três HVRs, que formam alças conectando, e em alguns casos formam parte de, a estrutura de beta-folha. As HVRs em cada cadeia são juntas em proximidade estreita pelas regiões de FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (veja Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não são envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, porém exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo em toxici-dade celular dependendo do anticorpo.

[00227] As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de quaisquer espécies de mamífero podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa ("K") e lambda ("À"), com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes.

[00228] O termo IgG "isótipo" ou "subclasse", como usado aqui, en-tende qualquer das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas ca-racterísticas químicas e antigênicas de suas regiões constantes.

[00229] Dependendo das sequências de aminoácido dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Existiam cinco classes prin-cipais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser também divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imu- noglobulinas são chamados α, Y, ε, Y, e μ, respectivamente. As estrutu-ras de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes clas-ses de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas geralmente em, por exemplo, Abbas et al., Cellular e Mol. Immunology, 4a edição (W.B. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma mo- lécula de fusão mais ampla, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo com um ou mais outras proteínas ou peptídeos.

[00230] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados aqui intercabiavelmente para referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, fragmentos de anticorpo, como definido aqui abaixo. Os termos particularmente refere-se a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm uma região de Fc.

[00231] Um "anticorpo nu" para os propósitos aqui é um anticorpo que não é conjugado a uma porção citotóxica ou radiorrótulo.

[00232] "Fragmentos de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente compreendendo a região de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o fragmento de an-ticorpo descrito aqui é um fragmento de ligação de antígeno. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2, scFv e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[00233] Digestão de papína de anticorpos produz dois fragmentos de antígeno idênticos, chamados de fragmentos de "Fab", cada com um sítio de ligação de antígeno único, e um fragment de "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar facilmente. O tratamento de pepsina produz um fragmento de F(ab')2 que tem dois sítios de combinação de antígeno e é ainda capaz de antígeno de ligação cru-zada.

[00234] "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação de antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia leve e um de cadeia pesada em associação não covalente, apertada. Em uma espécia de Fv d e cadeia única (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve pode ser cova- lentemente ligado por um peptídeo flexível de tal forma que as cadeias pesadas e leves possam associar-se a uma estrutura "dimérica" aná-loga àquela em uma espécie de Fv de duas cadeias. É nesta configu-ração que as três HVRs de cada dompinio variável interagem para de-finir um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero VH- VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antí- geno, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.

[00235] O fragmento de Fab’ contém os domínios variáveis de cadeia leve e pesada e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos de Fab’ diferem de fragmentos de Fab’ pela adição de alguns resíduos no terminal de carbóxi do domínio de CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cis- teína dos domínios constantes suporta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo de F(ab')2, originalmente, foram produzidos como pares de fragmentos de Fab’ que têm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

[00236] "Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo de "scFv" compreendem os domínios de VH e VL de anticorpos, em que estes domínios são presentes em uma cadeia de polipeptídeo única. Geral-mente, o polipeptídeo de scFv também compreende um ligador de po- lipeptídeo entre os domínios de VH e VL que permitem que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revi- são de scFv, veja, por exemplo, Pluckthuen, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg and Moore, edições (Springer-Verlag, Nova Iorque, 1994), páginas 269 a 315.

[00237] O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Usando-se um ligador que é muito curto para permitir o pare- amento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos são descritos mais com-pletamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 90: 6444-6448 (1993). Os triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

[00238] O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, por exemplo, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que podem ser apresentadas em quantidades menores. Desse modo, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em certas modalidades, tal anticorpo monoclonal, tipicamente, inclui um anticorpo compreendendo uma sequência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a sequência de polipeptí- deo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma sequência de polipeptídeo de ligação alvo única a partir de várias sequências de polipeptídeo. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único a partir de vários clones, tal como uma mistura de clones de hibridoma, clones de fago, ou clones de DNA recombinantes. Deve-se entender que uma sequência de ligação alvo selecionada pode ser também alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade com o alvo, para humanizer a sequência de ligação alvo, para melhorar sua produção em cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo compreendendo a sequência de ligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal da invenção. Em contraste com as preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada ananticorpo monoclonal de uma preparação de anti-corpo monoclonal é direcionado contra um determinante único em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonais são vantajosas pelo fato de serem tipicamente não con-taminadas por outras.

[00239] O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anti-corpos monoclonais a serem usados de acordo com a invenção podem ser feitos por várias técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1988); Hammerling et al, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinantes (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567), tecnologias de tecnologias de exibição de fagos (veja, por exemplo, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou tipo humanos em animais que têm partes ou todas os locais ou genes de imunoglobulina humana que codificam as sequências de imunoglobuli- na humana (veja, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes dos Estados Unidos nos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lon- berg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

[00240] Os anticorpos monoclonais aqui, especificamente, incluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica às ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, ao mesmo tempo em que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico às ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou per-tencente a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como frag-mentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade bioló-gica desejada (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos incluem anti-corpos PRIMATTZED (registrado) em que a região de ligação de antí- geno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por, por exemplo, imunização de macacos macaque com o antígeno de inte-resse.

[00241] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murina) são anticorpo quiméricos que contêm sequência mí-nima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo recipiente) em que os resíduos de uma HVR do recipiente são substi-tuídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anti-corpo doador) tal como camundongo, rato, coelho, ou primate não hu-mano tendo a especificidade, afinidade, e/ou capacidade desejada. Em alguns exemplos, os resíduos de FR da imunoglobulina são substi-tuídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os an-ticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são en-contrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modi-ficações podem ser feitas para também refinar o desempenho do anti-corpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substanci-almente todo de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variá-veis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondentes de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente tam-bém compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes, veja, por exemplo, Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Veja também, por ex-emplo, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); e Patentes dos Estados Unidos nos 6.982.321 e 7.087.409.

[00242] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que foi feita usando qualquer das técnicas para fazer anticorpos humanos, como descrito aqui. Esta definição de um anticorpo humano, especificamente, exclui um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação de antígeno não humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias habilidades conhecidas na técnica, incluindo biblioteca de exibição de fago. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também disponível para a preparação de anticorpos monoclonais humanos são os métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Veja tam-bém van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados administrando- se o antígeno a um animal trangênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, porém cujos locais endógenos foram incapacitados, por exemplo, xenocamundongos imunizados (veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nos 6.075.181 e 6.150.584 com respeito à tecnologia de XENOMOUSE (nome comercial)). Veja também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América, 103:3557-3562 (2006) com respeito aos anticorpos humanos gerados por meio de tecnologia de hibridoma de célula B humana.

[00243] Um "anticorpo dependente de espécie" é aquele que tem uma afinidade de ligação mais forte com um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que tem com um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo de-pendente de espécie "liga-se especificamente" a um antígeno humano (por exemplo, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) não mais do que cerca de 1x10-7M, preferivelmente não mais do que cerca de 1x10- 8M e preferivelmente não mais do que cerca de 1x10-9M), porém tem uma afinidade de ligação com um homólogo do antígeno de uma se-gunda espécie de mamífero não humana que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação com o antíge- no humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser qualquer dos vários tipos de anticorpos, como definido acima, porém preferivelmente é anticorpo humano ou humanizado.

[00244] O termo "região hipervariável", "HVR", ou "HV", quando usado aqui, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam estruturalmente alças definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (HI, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3, em particular, apresente um papel único no fornecimento de especificidade fina aos anticorpos. Veja, por exemplo, Xu et al., Im-munity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Bi-ology 248:1-25 (Lo, edição, Human Press, Totowa, N.J., 2003). De fato, os anticorpos de camelídeo de ocorrência natural que consistem em uma cadeia pesada apenas são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Veja, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[00245] Vários delineações de HVR estão em uso e são abrangidas aqui. As Regiões de Determinação de Complementaridade de Kabat (CDRs) são com base na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunolo-gical Interest, 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia refere-se, em vez disso, à lo-cação das alças estruturais (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901917 (1987)). As HVRs de AbM representam um compromisso entre entre as HVRs de Kabat e as alças estruturais de Chothia, e são usadas por software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. As HVRs de "contacto" são com base em uma análise das estruturas de cristal de complexo disponíveis. Os resíduos de cada destas HVRs são observadas abaixo. Loop Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[00246] As HVRs podem compreender "HVRs estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) nas VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra, para cada destas definições.

[00247] Os resíduos de "Estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de HVR como aqui definidos.

[00248] Os termos "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Kabat", e variações dos mesmos, referem-se ao Sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoáci- do linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou HVR do domí- nio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma inserção de aminoácido único (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, os resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para dado anticorpo por alinhamento em regiões de ho- mologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão".

[00249] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se referindo a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1 a 107 da cadeia leve e resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "Sistema de numeração de EU" ou "índice de EU" é geralmente usado quando se referindo a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice de EU descrito em Kabat et al., supra). O "índice de EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduo do anticorpo de EU de IgG1 humano.

[00250] A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al., (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Re-sumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos de Fd tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve de complementaridade, forma um par de regiões de ligação de antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[00251] Como usado aqui, o termo "liga-se", "especificamente, ligase a" ou é "específico para" refere-se a interações mensuráveis e re-produzíveis, tal como ligação entre um alvo e um anticorpo, o que é determinativo da presença do alvo na presença de uma população he terogênea de moléculas que incluem moléculas biológicas. Por exem-plo, um anticorpo que se liga a ou especificamente se liga a um alvo (que pode ser um epítopo) é um anticorpo que se liga a este alvo com maior afinidade, avidez, mais facilmente, e/ou com duração maior do que quando se liga a outros alvos. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo a um alvo não relacionado é menor do que cerca de 10% da ligação do anticorpo ao alvo, como mensurado, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que, especificamente, se liga a um alvo tem uma constante de dissociação (Kd) de ^ 1 μM, ^ 100 nM, ^ 10 nM, ^ 1 nM, ou ^ 0,1 nM. Em certas modalidades, um anticorpo, especificamente, se liga a um epítopo em uma proteína que é conservada entre a proteína de espécies diferentes. Em outra modalidade, a ligação específica pode incluir, porém não requerer ligação exclusiva.

II. Antagonistas de Ligação do Eixo PD-1

[00252] É fornecido aqui um método para tratar ou retarder a pro-gressão de câncer em um indivíduo compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. É também fornecido aqui um método de realce de respostas imunes contra células de tumor em um indivíduo tendo câncer compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. Por exemplo, as respostas imunes realçadas contra células de tumor incluem infiltração de células imunes incluindo macrófagos e células gigantes multinucleadas nos tecidos de tumor. Para um outro exemplo, as respostas imunes realçadas contra células de tumor inclui aumento de linfócitos de CD45-positivo, linfóci- tos de CD3ε-positivo e Linfócitos T de CD8-positivo em linfócitos de tumor infiltrados (TILs). Por exemplo, um antagonista de ligação de eixo PD-1 inclui um antagonista de ligação de PD-1, um antagonista de ligação de PD-L1 e um antagonista de ligação de PD-L2. PD-1 (morte programada 1) é também referido, na técnica, como "morte de célula programada 1", PDCD1, CD279 e SLEB2. PD-L1 (ligante de morte programada 1) é também referido, na técnica, como "ligante de morte de célula programada 1", PDCD1LG1, CD274, B7-H, e PD-L1. PD-L2 (ligante de morte programada 2) é também referido, na técnica, como "ligante 2 de morte de célula programada 1", PDCD1LG2, CD273, B7-DC, Btdc, e PDL2. Em algumas modalidades, PD-1, PD- L1, e PD-L2 são PD-1, PD-L1 e PD-L2 humanos.

[00253] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD- 1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-1 a seus parceiros de ligação de ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação de ligante PD-1 são PD-L1 e/ou PD-L2. Em outra modalidade, um an-tagonista de ligação de PD-L1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L1 ao seu parceiro de ligação. Em um aspecto específico, os par-ceiros de ligação de PD-L1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modalidade, o antagonista de ligação de PD-L2 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L2 ao seu parceiro de ligação. Em um aspecto específico, um parceiro de ligação de PD-L2 é PD-1. O antagonista pode ser um anti-corpo, um fragment de ligação de antígeno do mesmo, uma imunoa- desina, uma proteína de fusão, ou oligopeptídeo.

[00254] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico). Em algumas mo-dalidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que consiste em MDX-1106 (nivolumabe), MK-3475 (lambrolizumabe), e CT-011 (pi- dilizumabe). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina compre-endendo uma porção de ligação de PD-1 ou extracelular de PD-L1 ou PD-L2 fundida a uma região constante (por exemplo, uma região de Fc de uma sequência de imunoglobulina)). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é AMP-224 ou AMP-514 (MEDI0680). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é seleci-onado do grupo que consiste em PDR001, REGN2810, BGB A317 e SHR-1210. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD- L1 é anticorpo de anti-PD-L1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação anti-PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em YW243.55.S70, Atezolizumabe, MPDL3280A, MDX-1105, avelumabe, e MEDI4736 (durvalumabe). O anticorpo YW243.55.S70 é um anti-PD- L1 descrito em WO2010/077634. MDX-1105, também conhecido como BMS-936559, é um anticorpo anti-PD-L1 descrito em WO2007/005874. Avelumabe é um anticorpo anti-PDL1 descrito em WO2013079174. ME- DI4736 (durvalumabe), é um anticorpo monoclonal anti-PD-L1 descrito em WO2011/066389 e US2013/034559. Nivolumabe, também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, e OP- DIVO (registrado), é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2006/121168. Pembrolizumabe, também conhecido como MK- 3475, Merck 3475, lambrolizumabe, KEYTRUDA (registrado), e SCH- 900475, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2009/114335. CT- 011, também conhecido como hBAT, hBAT-1 ou pidilizumabe, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2009/101611. AMP-224, também conhecido como B7-DCIg, é um receptor solúvel de fusão PD-L2-Fc descrito em WO2010/027827 e WO2011/066342.

[00255] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é capaz de inibir a ligação entre PD-L1 e PD-1 e/ou entre PD-L1 e B7-1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em fragmentos de Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, e (Fab')2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo humano.

[00256] Os exemplos de anticorpos anti-PD-L1 úteis aos métodos da invenção, e os métodos para preparação dos mesmos são descritos nos pedidos de patente PCT WO2010/077634, WO2007/005874, WO2011/066389, e US2013/034559, que são incorporados aqui por referência. Os anticorpos anti-PD-L1 úteis na invenção, incluindo com-posições contendo tais anticorpos, podem ser usados em combinação com um anticorpo anti-GPC3 para tratar câncer.

Anticorpos Anti-PD1

[00257] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é MDX1106. Os nomes alternativos para "MDX-1106" incluem MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 ou Nivolumab. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Nivolumabe (Número de Registo CAS: 946414-94-4). Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti-PD-1 isolado, compreendendo uma região variável de cadeia pesada, com-preendendo a sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:1 e/ou uma região variável de cadeia leve, compreendendo a sequência de aminoácido de região variável de ca-deia leve de SEQ ID NO:2. Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti-PD-1 isolado, compreendendo uma sequência de cadeia pesada e/ou uma de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada mencionada na SEQ ID NO:1, e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pe- lo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequên-cia com a sequência de cadeia leve mencionada na SEQ ID NO:2.

Anticorpo anti-PD-L1

[00258] Em algumas modalidades, o anticorpo na formulação com-preende pelo menos um triptofan (por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, ou pelo menos quatro) na sequência de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas modalidades, triptofan de aminoácido é nos regimes de CDR, regiões estruturais e/ou regiões constantes do anti-corpo. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende dois ou três resíduos triptofan nos regimes de CDR. Em algumas modalidades, o anticorpo na formulação é um anticorpo anti-PD-L1. PD-L1 (ligante de morte programada 1), também conhecido como PD-L1, B7-H1, B7-4, CD274, e B7-H, é uma proteína de transmembrana, e sua interação com PD-1 inibe a ativação de célua T e a produção de citocina. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 descrito aqui se liga a PD-L1 humano. Os exemplos de anticorpos anti-PD-L1 que podem ser usados nos métodos descritos aqui são Atezolizumabe, ou anticorpos anti-PD-L1 descritos no pedido de patente PCT WO 2010/077634 A1 e US 8.217.149, que são incorporados aqui por referência.

[00259] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é capaz de inibir a ligação entre PD-L1 e PD-1 e/ou entre PD-L1 e B7-1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo mono-clonal. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um frag-mento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em fragmentos de Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, e (Fab')2. Em algumas modalidades, o anti-corpo anti-PD-L1 é um anticorpo humanizado. Em algumas modalida-des, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo humano.

[00260] Os anticorpos anti-PD-L1 descritos no WO 2010/077634 A1 e US 8.217.149 podem ser usados nos métodos descrito aqui. Em al- gumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma se-quência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:3 e/ou uma sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:4. Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 iso-lado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e/ou uma de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada mencionada na SEQ ID NO:3, e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve mencionada na SEQ ID NO:4.

[00261] Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada polipeptídeo compreendendo uma sequência de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que: (a) a sequência de HVR-H1 é GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO:5); (b) a sequência de HVR-H2 é AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO:6); (c) a sequência HVR-H3 é RHWPGGFDY (SEQ ID NO:7);

[00262] Também em que: X1 é D ou G; X2 é S ou L; X3 é T ou S. Em um aspecto específico, X1 é D; X2 é S e X3 é T.

[00263] Em outro aspecto, o polipeptídeo também compreende se-quências de estrutura de cadeia pesada de região variável justapostas entre as HVRs de acordo com a fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC- FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). Em ainda outro aspec- to, as sequências estruturais são derivadas de sequências estruturais de consenso humanas. Em um outro aspecto, as sequências estruturais são estrutura de consenso de subgrupo III de VH. Ainda em um outro aspecto, pelo menos uma das sequências estruturais é a seguinte: HC-FR1 é EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:8) HC-FR2 é WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:9) HC-FR3 é RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:10) HC-FR4 é WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:11).

[00264] Ainda em um outro aspecto, o polipeptídeo de cadeia pesa- em que: X4 é D ou V; X5 é V ou I; X6 é S ou N; X7 é A ou F; X8 é V ou L; X9 é F ou T; X10 é Y ou A; X11 é Y, G, F, ou S; X12 é L, Y, F ou W; X13 é Y, N, A, T, G, F ou I; X14 é H, V, P, T ou I; X15 é A, W, R, P ou T. Ainda em um outro aspecto, X4 é D; X5 é V; X6 é S; X7 é A; X8 é V; X9 é F; X10 é Y; X11 é Y; X12 é L; X13 é Y; X14 é H; X15 é A.

[00265] Ainda em um outro aspecto, a cadeia leve também compre-ende sequências de estrutura de cadeia leve de região variável justapostas entre as HVRs de acordo com a fórmula: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC- FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências de estrutura de consenso humanas. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais são estrutura de consenso de VL kappa I. Ainda em um outro aspecto, pelo menos uma das sequências de estrutura é a seguinte: LC-FR1 é DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:15) LC-FR2 é WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:16) LC-FR3 é GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:17) LC-FR4 é FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:18).

[00266] Em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 isolado ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma ca- pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em em que: X1 é D ou G; X2 é S ou L; X3 é T ou S; X4 é D ou V; X5 é V ou I; X6 é S ou N; X7 é A ou F; X8 é V ou L; X9 é F ou T; X10 é Y ou A; X11 é Y, G, F, ou S; X12 é L, Y, F ou W; X13 é Y, N, A, T, G, F ou I; X14 é H, V, P, T ou I; X15 é A, W, R, P ou T. Em um aspecto específico, X1 é D; X2 é S e X3 é T. Em outro aspecto, X4 é D; X5 é V; X6 é S; X7 é A; X8 é V; X9 é F; X10 é Y; X11 é Y; X12 é L; X13 é Y; X14 é H; X15 é A. Em ainda outro aspecto, X1 é D; X2 é S e X3 é T, X4 é D; X5 é V; X6 é S; X7 é A; X8 é V; X9 é F; X10 é Y; X11 é Y; X12 é L; X13 é Y; X14 é H e X15 é A.

[00267] Em um outro aspecto, a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)- (HVR-H3)-(HC-FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve compreen-dem uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)- (LC-FR4). Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências de estrutura de consenso humanas. Ainda em um outro aspecto, as sequências de estrutura de cadeia pesada são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, ou III de Kabat. Ainda em um outro aspecto, a sequência de estrutura de cadeia pesa- da é uma sequência de estrutura de subgrupo III de VH. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pe-sada são mencionadas como SEQ ID NOs:8, 9, 10 e 11. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, III ou IV de Kabat kappa. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são estrutura de consenso de VL kappa I. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve são mencionadas como SEQ ID NOs:15, 16, 17 e 18.

[00268] Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo também compreende uma região constante humana ou de murino. Ainda em um outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. Ainda em um outro aspecto específico, a região constante humana é IgG1. Ainda em um outro aspecto, a região constante de murino é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Ainda em um outro aspec-to, a região constante de murino é IgG2A. Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo tem função efetora reduzida ou mínima. Ainda em um outro aspecto específico, a função efetora mínima resulta de uma "mutação de Fc menos efetora" ou aglicosilação. Em ainda outra modalidade, a mutação de Fc menos efetora é uma substituição de N297A ou D265A/N297A na região constante.

[00269] Em ainda outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada também compreende uma sequência de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 tendo pelo menos identidade de se-quência a 85% com GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:19), AWIS- PYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:20) e RHWPGGFDY (SEQ ID NO:21), respectivamente, ou (b) a cadeia leve também compreende uma sequência de HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 tendo pelo menos identidade de sequência a 85% com RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:22), SASFLYS (SEQ ID NO:23) e QQYLYHPAT (SEQ ID NO:24), respectivamente.

[00270] Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00271] Em outro aspecto, a região variável de cadeia pesada com-preende uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)- (HVR-H3)-(HC-FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve compreen-dem uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)- (LC-FR4). Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais são deri-vadas de sequências de estrutura de consenso humanas. Ainda em um outro aspecto, as sequências de estrutura de cadeia pesada são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, ou III de Kabat. Ainda em um outro aspecto, a sequência de estrutura de cadeia pesada é uma sequência de estrutura de subgrupo III de VH. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pesada são mencionadas como SEQ ID NOs:8, 9, 10 e 11. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, III ou IV de Kabat kappa. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são estru-tura de consenso de VL kappa I. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve são mencionadas como SEQ ID NOs:15, 16, 17 e 18.

[00272] Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo também compreende uma região constante humana ou de murino. Ainda em um outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. Ainda em um outro aspecto específico, a região constante humana é IgG1. Ainda em um outro aspecto, a região constante de murino é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Ainda em um outro aspec-to, a região constante de murino é IgG2A. Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo tem função efetora reduzida ou mínima. Ainda em um outro aspecto específico a função efetora mínima resulta de uma "mutação de Fc menos efetora" ou aglicosilação. Em ainda outra modalidade, a mutação de Fc menos efetora é uma substituição de N297A ou D265A/N297A na região constante.

[00273] Em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 isolado compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de regi-ão variável de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada men-cionada na SEQ ID NO:25, e/ou (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve mencionada na SEQ ID NO:4.

[00274] Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em outro aspecto, a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC- FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve com-preendem uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR- L3)-(LC-FR4). Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências de estrutura de consenso humanas. Em um outro aspecto, as sequências de estrutura de cadeia pesada são deri- vadas de uma sequência de subgrupo I, II, ou III de Kabat. Ainda em um outro aspecto, a sequência de estrutura de cadeia pesada é uma sequência de estrutura de subgrupo III de VH. Ainda em um outro as-pecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pesada são mencionadas como SEQ ID NOs: 8, 9, 10 e WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:27).

[00275] Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, III ou IV de Kabat kappa. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são estrutura de consenso de VL kappa I. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve são mencionadas como SEQ ID NOs:15, 16, 17 e 18.

[00276] Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo também compreende uma região constante humana ou de murino. Ainda em um outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. Ainda em um outro aspecto específico, a região constante humana é IgG1. Ainda em um outro aspecto, a região constante de murino é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Ainda em um outro aspec-to, a região constante de murino é IgG2A. Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo tem função efetora reduzida ou mínima. Ainda em um outro aspecto específico, a função efetora mínima resulta de produção em células procarióticas. Ainda em um outro aspecto especí-fico, a função efetora mínima resulta de uma "mutação de Fc menos efetora" ou aglicosilação. Em ainda outra modalidade, a mutação de Fc menos efetora é uma substituição de N297A ou D265A/N297A na região constante.

[00277] Em um outro aspecto, a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)- (HVR-H3)-(HC-FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve compreen-dem uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)- (LC-FR4). Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências de estrutura de consenso humanas. Ainda em um outro aspecto, as sequências de estrutura de cadeia pesada são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, ou III de Kabat. Ainda em um outro aspecto, a sequência de estrutura de cadeia pesada é uma sequência de estrutura de subgrupo III de VH. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pesada é a seguinte: HC-FR1 é EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO:29) HC-FR2 é WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO:30) HC-FR3 é RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:10) HC-FR4 é WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:27).

[00278] Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, III ou IV de Kabat kappa. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são estrutura de consenso de VL kappa I. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve é a seguinte: LC-FR1 é DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15) LC-FR2 é WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 16) LC-FR3 é GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17) LC-FR4 é FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 28).

[00279] Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo também compreende uma região constante humana ou de murino. Ainda em um outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. Ainda em um outro aspecto específico, a região constante humana é IgG1. Ainda em um outro aspecto, a região constante de murino é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Ainda em um outro aspec-to, a região constante de murino é IgG2A. Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo tem função efetora reduzida ou mínima. Ainda em um outro aspecto específico, a função efetora mínima resulta de uma "mutação de Fc menos efetora" ou aglicosilação. Em ainda outra modalidade, a mutação de Fc menos efetora é uma substituição de N297A ou D265A/N297A na região constante.

[00280] Em ainda outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada também compreende uma uma se-quência de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 tendo pelo menos identidade de sequência a 85% com GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:19), AWIS- PYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:20) e RHWPGGFDY (SEQ ID NO:21), respectivamente, e/ou (b) a cadeia leve também compreende uma sequência de HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 tendo pelo menos identidade de sequência a 85% com RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:22), SASFLYS (SEQ ID NO:23) e QQYLYHPAT (SEQ ID NO:24), respectivamente.

[00281] Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00282] Em outro aspecto, a região variável de cadeia pesada com-preende uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)- (HVR-H3)-(HC-FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve compreen-dem uma ou mais sequências de estrutura justapostas entre as HVRs como: (LC-FRl)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)- (LC-FR4). Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais são deri-vadas de sequências de estrutura de consenso humanas. Ainda em um outro aspecto, as sequências de estrutura de cadeia pesada são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, ou III de Kabat. Ainda em um outro aspecto, a sequência de estrutura de cadeia pesada é uma sequência de estrutura de subgrupo III de VH. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pesada são mencionadas como SEQ ID NOs: 8, 9, 10 e WGQGTLVTVS- SASTK (SEQ ID NO:31).

[00283] Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de uma sequência de subgrupo I, II, III ou IV de Kabat kappa. Ainda em um outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são estrutura de consenso de VL kappa I. Ainda em um outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve são mencionadas como SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18. Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo também compreende uma região constante humana ou de murino. Ainda em um outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. Ainda em um outro aspecto específico, a região constante humana é IgG1. Ainda em um outro aspecto, a região constante de murino é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Ainda em um outro aspecto, a região constante de murino é IgG2A. Ainda em um outro aspecto específico, o anticorpo tem função efetora reduzida ou mínima. Ainda em um outro aspecto específico, a função efetora mínima resulta de uma "mutação de Fc menos efetora" ou aglicosilação. Em ainda outra modalidade, a mu-tação de Fc menos efetora é uma substituição de N297A ou D265A/N297A na região constante.

[00284] Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 isolado compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada mencionada na SEQ ID NO:26, ou (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve mencionada na SEQ ID NO:4.

[00285] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 isolado compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que a sequência de região variável de cadeia leve tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 isolado compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que a sequência de região variável de cadeia pesada tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 isolado compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variá-vel de cadeia leve, em que a sequência de região variável de cadeia leve tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO:4 e a sequência de região variável de cadeia pesada tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um, dois, três, quatro ou cinco resíduos de aminoácido no terminal de N da cadeia pesada e/ou leve podem ser deletados, substituídos ou modificados.

[00286] Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 isolado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada men-cionada na SEQ ID NO:32, e/ou (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve mencionada na SEQ ID NO:33.

[00287] Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 isolado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada men-cionada na SEQ ID NO: 55, e/ou (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve mencionada na SEQ ID NO:33.

[00288] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti- PD-L1 isolado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve tem pelo me- nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:33. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 isolado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve, em que a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32 ou 55. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-PD-L1 isolado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:33 e a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32 ou 55.

[00289] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 isolado é aglicosilado. A glicosilação deanticorpos é tipicamente ligado a N ou ligado a O. Ligado a N refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia de sítio de um resíduo de asparagina. As sequências de tripep- tídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qual-quer aminoácido, exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia de sítio de asparagina. Desse modo, a presença destas sequências de tripep- tídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A gli- cosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N- acetilgalactosaminas, galactose, ou xilose a um ácido de hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina possa também ser usada. A remoção de sítios de glicosi- lação forma um anticorpo que é convenientemente acompanhado por alteração da sequência de aminoácido, de tal forma que uma das se-quências de tripeptídeo descrita acima (para sítios de glicosilação liga-dos a N) é removida. A alteração pode ser feita por substituição de um resíduo de asparagina, serina ou treonina dentro do sítio de glicosila- ção por outro resíduo de aminoácido (por exemplo, glicina, alanina ou uma substituição conservadora).

[00290] Em qualquer das modalidades aqui, o anticorpo anti-PD-L1 isolado pode se ligar a um PD-L1 humano, por exemplo, um PD-L1 humano como mostrado em UniProtKB/Swiss-Prot n° de acesso Q9NZQ7.1, ou uma variante do mesmo.

[00291] Ainda em outra modalidade, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica qualquer dos anticorpos descritos aqui. Em algu-mas modalidades, o ácido nucleico também compreende um vetor adequado para expressão do ácido nucleico que codifica qualquer dos anticorpos anti-PD-L1 previamente descritos. Ainda em um outro as-pecto específico, o vetor é em uma célula hospedeira adequada para expressão do ácido nucleico. Ainda em um outro aspecto específico, a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. Ainda em um outro aspecto específico, a célula eucariótica é uma cé- lula de mamífero, tal como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[00292] O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode ser feito usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um processo compreendendo cultivo de uma célula hospedeira contendo ácido nucleico que codifica qualquer dos anticorpos anti- PD-L1 previamente descritos ou fragmento de ligação de antígeno em uma forma adequada para expressão, sob condições adequadas para produzir tal anticorpo ou fragmento, e recuperação do anticorpo ou fragmento.

III. Anticorpos Anti-GPC3

[00293] É fornecido aqui um método para tratar ou retardar a pro-gressão de cancer em um indivíduo compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. É também fornecido aqui um método de realçar as respostas imunes contra células de tumor em um indivíduo tendo câncer compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. Por exemplo, as respostas imunes realçadas contra células de tumor incluem infiltração de células imunes incluindo macrófagos e células gigantes multinucleadas nos tecidos de tumor. Para um outro exemplo, as respostas imunes realçadas contra células de tumor incluem aumento de linfócitos de CD45-positivo, lin- fócitos de CD3ε-positivo e linfócitos T de CD8-positivo em linfócitos infiltrados de tumor (TILs).

[00294] São fornecidos aqui anticorpos que se ligam a um glipicano humano 3 (GPC3). Os nomes alternativos para "GPC3" incluem SGB, DGSX, MXR7, SDYS, SGBS, OCI-5, SGBS1 e GTR2-2. O termo "GPC3" como usado aqui, refere-se a qualquer GPC3 nativo de qual-quer fonte humana. O termo abrange GPC3 não processado e de "comprimento total" bem como qualquer forma de GPC3 que resulte de processamento na célula (por exemplo, proteína madura), incluindo, porém não limitado a, um peptídeo de terminal de C de GPC3. O termo também abrange variantes de ocorrência natural e isoformas de GPC3, por exemplo, variantes de ligação ou variantes alélicas. Por exemplo, as descrições e sequências de GPC3 são fornecidas em UniProtKB/Swiss-Prot n° de acesso P51654.1.

[00295] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 se liga ao GPC3 e inibe a proliferação celular ou crescimento de células de cân-cer. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 é co- drituzumabe.

[00296] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-GPC3 pode incluir um conjugado de fármaco anticorpo (ADC) (WO2007/137170) compreendendo um anticorpo de 1G12 (WO2003/100429) (vendido sob o catálogo n° B0134R por BioMosaics Inc.) conjugado com uma substância citotóxica.

[00297] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-GPC3 é um anticorpo anti-GPC3 humanizado descrito em WO2006/006693 ou WO2007/047291.

[00298] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-GPC3 inclui um anticorpo anti-GPC3 humanizado descrito em WO2006/006693 ou WO2009/041062. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-GPC3 humanizado compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que também: (i) a sequência de HVR-H1 é DYSMH (SEQ ID NO:34) (ii) a sequência de HVR-H2 é WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:35) (iii) a sequência HVR-H3 é LY (SEQ ID NO:36) (b) a cadeia leve compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, em que também: (i) uma sequência de HVR-L1 é KSSQSLLHSDGKTFLN (SEQ ID NO:37) (ii) uma sequência de HVR-L2 é LVSRLDS (SEQ ID NO:38) (iii) uma sequência de HVR-L3 é CQGTHFPRT (SEQ ID NO:39).

[00299] Em um aspecto específico, o anticorpo anti-GPC3 é huma-nizado. O anticorpo anti-GPC3 humanizado pode ser preparado usan-do, como modelos para humanização, estrutura humana apropriada-mente selecionadas tendo alta identidade de sequência com uma se-quência de fragmento de cadeia pesada representada por SEQ ID NO:40 ou uma sequência de estrutura de cadeia leve representada por SEQ ID NO:41.

[00300] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um anticorpo quimérico anti-GPC3 ou um anticorpo anti-GPC3 humanizado compre-endendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que também: (i) a sequência de HVR-H1 é DYEMH (SEQ ID NO:42) (ii) a sequência de HVR-H2 é ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO:43) (iii) a sequência HVR-H3 é FYSYTY (SEQ ID NO:44) (b) a cadeia leve compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, em que também: (i) uma sequência de HVR-L1 é RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO:45) (ii) uma sequência de HVR-L2 é KVSNRFS (SEQ ID NO:46) (iii) uma sequência de HVR-L3 é SQNTHVPPT (SEQ ID NO:47).

[00301] O anticorpo anti-GPC3 humanizado pode ser preparado usando, como modelos para humanização, sequências de estrutura humana apropriadamente selecionadas tendo alta identidade de se-quência com uma sequência de fragmento de cadeia pesada repre-sentada por SEQ ID NO:48 ou uma sequência de estrutura de cadeia leve representada por SEQ ID NO:49.

[00302] Em uma outra modalidade, é fornecido aqui um anticorpo anti-GPC3 humanizado capaz de se ligar a um epítopo ao qual um segundo anticorpo pode se ligar, em que o referido segundo anticorpo compreendendo uma cadeia pesada e uma sequência de região variá-vel de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que também: (i) a sequência de HVR-H1 é DYEMH (SEQ ID NO:42) (ii) a sequência de HVR-H2 é ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO:43) (iii) a sequência HVR-H3 é FYSYTY (SEQ ID NO:44) (b) a cadeia leve compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, em que também: (i) uma sequência de HVR-L1 é RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO:45) (ii) uma sequência de HVR-L2 é KVSNRFS (SEQ ID NO:46) (iii) uma sequência de HVR-L3 é SQNTHVPPT (SEQ ID NO:47).

[00303] Em uma outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- GPC3 humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pe-sada selecionada do grupo que consiste em regiões variáveis de ca-deia pesada representadas por SEQ ID NOs:50 e uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO:51. Em um outro aspecto não limitante alternativo, é fornecido um anticorpo anti-GPC3 humani-zado compreendendo uma região variável de cadeia pesada selecio-nada do grupo de regiões variáveis de cadeia pesada representadas por SEQ ID NO:50 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo de regiões variáveis de cadeia leve representadas por SEQ ID NO:52.

[00304] Ainda em outra modalidade, é fornecido um anticorpo anti- GPC3 humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pe-sada representada por SEQ ID NO:53 e uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO:54.

[00305] Os exemplos alternativos do anticorpo anti-GPC3 da presente invenção incluem um anticorpo anti-GPC3 tendo atividade cito- tóxica. Na presente invenção, os exemplos não limitantes da atividade citotóxica incluem citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo ou atividade citotóxica celular dependente de anticorpo (ADCC), atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e atividade citotóxica com base em células T. Na presente in-venção, a atividade de CDC significa atividade citotóxica provocada pelo sistema complemento. Por outro lado, a atividade de ADCC signi-fica a atividade de danificação de células alvo por, por exemplo, imunócitos, através da ligação dos imunócitos por meio de receptores de FCY expressos sobre os imunócitos às regiões de Fc de moléculas de ligação de antígeno compreendendo domínios de ligação de antí- geno capazes de ligação às moléculas expressas sobre as membranas de célula das células alvos. Se ou não a molécula de ligação de antígeno de interesse tem atividade de ADCC ou tem atividade de CDC cpode ser determinado por um método conhecido na técnica (por exemplo, Current protocols in Immunology, Capítulo 7. Immunologic studies in humans, Coligan et al., edição (1993)).

[00306] Em algumas modalidades, os exemplos alternativos do an-ticorpo anti-GPC3 da presente invenção incluem um anticorpo anti- GPC3 conjugado com uma substância citotóxica. Tal um conjugado de anticorpo anti-GPC3-fármaco (ADC) é especificamente descrito em, por exemplo, WO2007/137170, embora o conjugado da presente invenção não é limitado àqueles descritos aqui. Especificamente, a substância citotóxica pode ser qualquer dos agentes quimioterapêuti- cos listados abaixo ou pode ser um composto descrito no Alley et al., (Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14, 529-537) ou WO2009/140242. As moléculas de ligação de antígeno são conjugadas com estes compostos por meio de ligantes apropriados ou similares.

[00307] Em algumas modalidades, os exemplos alternativos do anti-corpo anti-GPC3 da presente invenção incluem um anticorpo anti-GPC3 compreendendo uma região de Fc modificada por ligação de FCYR tendo atividade de ligação maior contra os receptores de FCY do que da região de Fc de IgG humano nativo contra receptores de Fcy. A modificação pode incluir modificação de aminoácido em qualquer posição, contanto que a região de Fc resultante tenha atividade de ligação maior contra receptores de Fcy do que aquela da região de Fc de IgG humano nativo contra receptores de Fcy. Quando as moléculas de ligação de antígeno contêm uma região de Fc de IgG1 humana como uma região de Fc humana, a modificação preferivelmente permite que a região de Fc contenha uma cadeia de açúcar contendo fucose como uma ligação de cadeia de açú-car à posição 297 (EU numbering) e é eficaz para produção de atividade de ligação maior contra receptores de Fcy do que aquela da região de Fc de IgG humano nativo contra receptores de Fcy. Tal modificação de ami- noácido foi reportada, por exemplo, na Publicação Internacional nos WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260, WO2006/023403 e WO2014/097648.

[00308] Em algumas modalidades, a região de Fc contida no anticorpo anti-GPC3 fornecida pela presente invenção pode também incluir uma região de Fc modificada de tal forma que uma proporção maior de cadeias de açúcar deficiente em fucose é ligada à região de Fc ou uma proporção maior de seccionamento de N-acetilglicosaminas é adicionada à região de Fc na composição de cadeias de açúcar ligadas à região de Fc. WO2006/046751 e WO2009/041062 descrevem exemplos específicos do anticorpo anti-GPC3 compreendendo a região de Fc modificada de tal forma que uma proporção maior de cadeias de açúcar deficientes em fucose seja ligada à região de Fc ou uma proporção maior de seccionamento de N-acetilglicosaminas seja adici-onada à região de Fc na composição de cadeias de açúcar ligadas à região de Fc.

[00309] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 que pode ser usado na presente invenção inclui um anticorpo anti-GPC3 tendo um resíduo de aminoácido modificado para alterar seu ponto isoelétri- ca (pI). Os exemplos preferidos da "alteração da mudança elétrica de um resíduo de aminoácido" no anticorpo anti-GPC3 são descritos em WO2009/041062.

[00310] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 inclui uma forma modificada do anticorpo que recebeu uma modificação pós- translacional do polipeptídeo que constitui a estrutura primár do anti-corpo anti-GPC3. A modificação pós-translacional de um polipeptídeo refere-se à modificação química fornecida ao polipeptídeo translatado durante biossíntese de polipeptídeo. Por exemplo, um anticorpo anti- GPC3 que recebeu a modificação de glutaminas de terminal de N para ácido piroglutâmico por piroglutamilação é também incluído no anticor-po anti-GPC3 da presente invenção, como um fato lógico. Além disso, por exemplo, um anticorpo anti-GPC3 pós-translacionalmente modifi-cado compreendendo cadeias pesadas e leves ou cadeias pesadas ligadas por meio de uma "ligação dissulfeto", que significa que uma ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre é incluída no anticorpo anti-GPC3 da presente invenção. Um grupo de tiol contido em uma cisteína de aminoácido pode formar uma ligação ou reticula- ção de dissulfeto com um segundo grupo de tiol. Nas moléculas de IgG gerais, as regiões de CH1 e CL são ligadas por meio de uma ligação de dissulfeto, e dois polipeptídeos que constituem cadeias pesadas são ligados por meio de uma ligação de dissulfeto entre resíduos de cisteína nas posições 226 e 229 com base na numeração de EU. Um anticorpo anti-GPC3 pós-translacionalmente modificado tendo tal ligação por meio de uma ligação de dissulfeto é também incluído no anticorpo anti-GPC3 da presente invenção.

[00311] Ainda em outra modalidade, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica qualquer dos anticorpos descritos aqui. Em algu-mas modalidades, o ácido nucleico também compreende um vetor adequado para expressão do ácido nucleico que codifica qualquer dos anticorpos anti-GPC3 previamente descritos. Ainda em um outro as-pecto específico, o vetor é em uma célula hospedeira adequada para expressão do ácido nucleico. Ainda em um outro aspecto específico, a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. Ainda em um outro aspecto específico, a célula eucariótica é uma cé-lula de mamífero, tal como célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[00312] O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode ser feito usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um processo compreendendo cultivo de uma célula hospedeira contendo ácido nucleico que codifica qualquer dos anticorpos anti- GPC3 previamente descritos ou fragmento de ligação de antígeno em uma forma adequada para expressão, sob condições adequadas para produzir tal anticorpo ou fragmento, e recuperação do anticorpo ou fragmento.

IV. Preparação de Anticorpo

[00313] O anticorpo descrito aqui é preparado usando habilidades disponíveis na técnica para geração de anticorpos, os métodos exem-plares das quais são descritos com maior detalhe nas seções seguin-tes.

[00314] O anticorpo é direcionado contra um antígeno de interesse (isto é, PD-L1 (tal como um PD-L1 humano) ou GPC3 (tal como um glipicano humano 3)). Preferivelmente, o antígeno é um polipeptídeo biologicamente importante e a adminnistração do anticorpo a um ma-mífero que sofre de um distúrbio pode resultar em um benefício tera-pêutico naquele mamífero.

[00315] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido aqui tem uma constante de dissociação (Kd) de ^ 1μM, ^ 150nM, ^ 100nM, ^ 50nM, ^ 10nM, ^ 1nM, ^ 0,1nM, ^ 0,01nM, ou ^ 0,001nM (por exemplo, 10-8M ou menos, por exemplo, de 10-8M a 10-13M, por exemplo, de 10-9M a 10-13M).

[00316] Em uma modalidade, Kd é medido por um ensaio de ligação de antígeno radiorrotulado (RIA) realizado com a versão de Fab’ de um anticorpo de interesse e seu antígeno como descrito pelo ensaio seguinte. A afinidade de ligação da solução de Fabs com antígeno é medida equilibrando-se o Fab’ com uma concentração mínima de antígeno (125I)-rotulado na presença de uma série de titulação de antí- geno não rotulado, em seguida capturando o antígeno ligado com uma placa de de revestimento de anticorpo anti-Fab (veja, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para estabelecer condi-ções para o ensaio, as placas de múltiplas cavidades (Termo Científico) MICROTITER (registrado) são revestidas durante a noite com 5 μg/ml de um anticorpo de anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio a 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente bloqueados com 2% (peso/volume) de albumina de soro bovina em PBS durante duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não absorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM [125I]-antígeno são misturados com diluições em série de um Fab’ de interesse. O Fab’ de ineteresse é em seguida incubado durante a noite; entretanto, a incubação pode continuar durante um período maior (por exemplo, cerca de 65 horas) para assegurar que o equilíbrio seja alcançado. Após isso, as misturas são transferidas à placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, durante uma hora). A solução é em seguida removida e a placa lavada oito vezes com 0,1% de polissorbato 20 (TWEEN-20 (registrado)) em PBS. Quando as placas estão secas, 150μl/cavidade de cintilante (MI- CROSCINT-20 (marca comercial); Packard) são adicionados, e as pla-cas são contadas em um Contador gama (Packard) TOPCOUNT (mar-ca comercial) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab’ que fornecem menos do que ou igual a 20% de ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitivos.

[00317] De acordo com outra modalidade, Kd é medido usando ensaios de ressonância de plasmônio de superfície usando um BIACO- RE (registrado)-2000 ou um BIACORE (registrado)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com chips de antígeno CM5 imobilizado a ~10 unidades de resposta (UR). Resumidamente, chips de biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio a 10 mM, pH 4,8, a 5 μg/ml (~0,2 μM) antes da injeção em uma taxa de fluxo de 5 μl/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, etanolamina a 1 M é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para medições cinéticas, dilui-ções seriais de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de polissorbato 20 (tensoativo TWEEN-20 (nome comercial)) (PBST) a 25°C em uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadas usando um modelo de Langmuir de ligação um-a-um sim-ples (BIACORE (registrado) Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a relação k0ff/kon. Veja, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Se a taxa de associação excede 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância de plasmônio de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada usando uma técnica de extinção fluorescente que mede o aumento ou decréscimo na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm passagem de banda) a 25°C de um anticorpo antiantígeno a 20 nM (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno como medido em um espectrômetro, tal como um espec- trofômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um es- pectrofômetro série 8000 SLM-AMINCO (nome comercial) (ThermoS- pectronic) com uma cuveta agitada. (i) Preparação de antígeno

[00318] Antígenos solúveis ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente conjugados a outras moléculas, podem ser usados como imunógenos para geração de anticorpos. Para moléculas de trans- membrana, tais como receptores, fragmentos destes (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser usados como o imunógeno. Alternativamente, células expressando a molécula de transmembrana podem ser usadas como o imunógeno. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens de célula de câncer) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula de transmembrana. Outros antígenos e formas dos mesmos úteis para a preparação de anticorpos serão evidentes para aqueles versados na técnica. (ii) Certos Métodos com Base em Anticorpo

[00319] Anticorpos monoclonais são preferivelmente elevados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antíge- no relevante a uma proteína que é imunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina lapa em buraco de fechadura, albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifunctional ou de derivação, por exemplo, éster de sulfossuccinimida de maleimidobenzoíla (conjugação através de resí-duos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferente.

[00320] Os animais são imunizados contra os conjugados imunogê- nicos contra o antígeno, conjugados imunogênicos, ou derivados com-binando, por exemplo, 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adju-vante completo de Freund e injetando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a 14 dias depois, os animai são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao título de anticorpo. Os animais são reforçados até o platô de título. Preferivelmente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo an- tígeno, porém conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura celular recombinante como fusões de proteína, Além disso, agentes de agregação tal como alúmen são adequadamente usado para realçar a resposta imunológica.

[00321] Anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados usando o método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Na-ture, 256:495 (1975), e também descrito, por exemplo, em Hongo et al., Hybridoma, 14(3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A La-boratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) considerando hibridomas humanos-humanos. Métodos adicio-nais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 7.189.826 considerando a produção de anticorpos IgM natu-ral humano monoclonal de linhagens de célula de hibridoma. A tecno-logia de hibridoma humano (Trioma technology) é descrito no Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

[00322] Para outras técnicas de hibridoma, veja, por exemplo, US2006/258841; US2006/183887 (anticorpos totalmente humanos), US2006/059575; US2005/287149; US2005/100546; US2005/026229; e Patentes dos Estados Unidos n°s 7.078.492 e 7.153.507. Um protocolo exemplar para a produção de anticorpos monoclonais usando o método de hibridoma é descrito como segue. Em uma modalidade, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado para eliciar os linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que especificamente se ligarão à pro-teína usada para imunização. Anticorpos são aumentados em animais por múltiplas subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de um polipeptí- deo da invenção ou um fragmento do mesmo, e um adjuvante, tal como monofosforil lipídio A (MPL)/trehalose dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Um polipeptídeo da invenção (por exemplo, antígeno) ou um fragmento do mesmo pode ser preparado usando métodos conhecidos na técnica, tal como métodos recombinantes, alguns dos quais são também descritos aqui. O soro de animais imunizados é avaliado quanto ao anticorpos antiantí- geno, e imunizações de reforço são opcionalmente administradas. Lin- fócitos de animais que produzem anticorpos antiantígeno são isolados. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[00323] Os linfócitos são em seguida fundidos com células de mi- eloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno gli- col, para formar uma célula hibridoma. Veja, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59 a 103 (Academic Press, 1986). Células de mieloma podem ser usadas que se fudem eficientemente, suportam a produção de nível elevado estável de anticorpo pelas células de produção de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio tal como meio de HAT. Células de mieloma exemplares incluem, porém não estão limitadas a, linhagens de mi- eloma de murino, tal como aqueles derivados de tumores de camun-dongos de MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Dis-tribution Center, San Diego, Calif. EUA, e células SP-2 ou X63-Ag8- 653 disponíveis da Coleção de Cultura do Tipo Americano, Rockville, Md. EUA. Linhagens de célula de heteromieloma de camundongo- humano e mieloma humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).

[00324] As células de hibridoma desse modo preparadas são se-meadas e cultivadas em um meio de cultura adequado, por exemplo, um meio que contém uma ou mais substâncias que inibem o cresci-mento ou sobrevivência das células de mieloma não fundidas, paren-tais. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não tiverem a enzima, hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hi- poxantina, aminopterina, e timidina (meio de HAT), cujas substâncias impedem o crescimento de células deficientes de HGPRT. Preferivel-mente, métodos de cultura de hibridoma livre de soro são usados para reduzir o uso de soro derivado de animal tal como soro bovino fetal, como descrito, por exemplo, em Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

[00325] Oligopeptídeos como ferramentas para a melhora da produ-tividade de culturas de célula de hibridoma são descritos no Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Especifica-mente, meios de cultura padrões são enriquecidos com certos amino- ácidos (alanina, serina, asparagina, prolina), ou com frações de hidro- lisado de proteína, e apoptose podem ser significantemente suprimidos por oligopeptídeos sintéticos, constituídos de três a seis resíduos de aminoácido. Os peptídeos estão presentes em milimolar ou concen-trações mais elevadas.

[00326] Meio de cultura em que as células de hibridoma são cultivadas pode ser avaliado quanto à produção de anticorpos monoclo- nais que se ligam a um anticorpo da invenção. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma pode ser determinado por imunoprecipitação ou por um ensaio de liga-ção in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsor- vente ligado à enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por análise Scatchard analysis. Veja, por exemplo, Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[00327] Após células de hibridoma serem identificadas que produzem anticorpos da especificidade, afinidade, e/ou atividade, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição e culti-vadas por métodos padrões. Veja, por exemplo, Goding, supra. Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio de D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal. Anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente se-parados do meio de cultura, fluidos de ascitos, ou soro por procedi-mentos de purificação de imunoglobulina convencional tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletro-forese de gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. Um procedimento para isolamento de proteínas de células de hibridoma é descrito no US2005/176122 e Patente dos Estados Unidos n° 6.919.436. O método inclui usando sais mínimos, tal como sais liotrópicos, no processo de ligação e preferivelmente também usando pequenas quantidade de solventes orgânicos no processo de eluição. (iii) Anticorpos Derivados de Biblioteca

[00328] Anticorpos da invenção podem ser isolados por análise de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de bibliotecas de exibição de fago e análise para anticorpos possuindo as características de ligação desejadas. Métodos adicionais são revisados, por exemplo, em Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Hu-man Press, Totowa, NJ, 2001) e também descritos, por exemplo, no McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Hu-man Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299- 310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132(2004).

[00329] Em certos métodos de exibição de fago, repertórios de genes de VH e VL são separadamente clonados por reação de cadeia polimerase (PCR) e randomicamente recombinados em bibliotecas de fago, que podem então ser analisados quanto ao fago de ligação de antígeno como descrito no Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12:433455 (1994). O fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpo, ou como fragmentos de Fv de cadeia simples (scFv) ou como fragmentos de Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno sem o requesito de construção de hibri- domas. Alternativamente, o repertório naive pode ser clonado (por exemplo, de humano) para fornecer uma fonte simples de anticorpos para uma ampla variedade de não auto e também autoantígenos sem qualquer imunização como descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas naive podem também ser preparadas sinteticamente clonando-se segmentos de gene V não re- arranjados de células tronco, e usando iniciadores de PCR contendo sequência randômica para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, como descrito por Hooge- nboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381-388 (1992). Publicações de patente que descrevem biblioteca de fago de anticorpo humano inclu-em, por exemplo: Patente dos Estados Unidos n° 5.750.373, e Publi- cações de Patente dos Estados Unidos n°s 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, e 2009/0002360.

[00330] Anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados de bibliotecas de anticorpo humano são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpo humano aqui. (iv) Anticorpos Quiméricos, Humanizados e Humanos

[00331] Em certas modalidades, um anticorpo é fornecido aqui é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, nas Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho, primate não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, o anticorpo quimérico é um anticorpo de "classe permutada" em que a classe ou a subclasse foi mudada daquela do anticorpo origem. Anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.

[00332] Em certas modalidades, o anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir imunogenicidade a humanos, enquanto mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geral-mente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos com resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade de anticorpo.

[00333] Anticorpos humanizados e métodos para prepará-los são revisados, por exemplo, em Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), e são também descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Na- t'lAcad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes dos Estados Uni-dos n°s 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (descrevendo o enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (descrevendo "refaceamen- to"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (descrevendo "emba-ralhamento de FR"); e Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (descrevendo o método de "seleção orientada" para embaralhamento de FR).

[00334] Regiões estruturais humanas que podem ser usadas para humanização incluem, porém não estão limitadas às: regiões estrutu-rais selecionadas usando o me'todo de "melhor ajuste" (veja, por exemplo, Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (ve-ja, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:4285 (1992); e Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)); regiões estrutu-rais maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões estruturais de linhagem germinativa humana (veja, por exemplo, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas de análise de bibliotecas de FR (veja, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

[00335] Em certas modalidades, um anticorpo é fornecido aqui um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Anticorpos humanos são descri-tos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

[00336] Anticorpos humanos podem ser preparados administrando um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais tipicamente contêm todo ou uma porção dos locis de imunoglobulina humana, que substitui os loci de imunoglobulina endógena, ou que es-tão presentes extracromossomicamente ou integrados randomicamen- te nos cromossomas do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena foram de forma geral inativados. Para revisão de métodos para obtenção de anticorpos humanos de animais transgênicos, veja Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Veja também, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.075.181 e 6.150.584 descrevendo tecnologia XENOMOUSE technology (nome comercial); Patente dos Estados Unidos n° 5.770.429 descrevendo HUMAB technology (registrado); Patente dos Estados Unidos n° 7.041.870 descrevendo K-M MOUSE technology (registrado), e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos n° US2007/0061900, descrevendo VELOCIMOUSE technology (registra-do)). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por tais animais podem ser também modificados, por exemplo, combinan-do-se com uma região constante humana diferente.

[00337] Anticorpos humanos podem também ser preparados por métodos com base em hibridoma. Linhagens de célula de heteromi- eloma de camundongo-humano e mieloma humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Veja, por exemplo, Kozbor J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).) Anticorpos humanos gerados por meio de tecnologia de hibri- doma de célula B humana são também descritos no Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos de IgM humanos monoclonais de linhagens de célula de hibridoma) e Ni, Xiandai Mi- anyixue, 26(4):265-268 (2006) (descrevendo hibridomas de humano- humano). Tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de Trioma) é também descrita no Vollmers and Brandlein, Histology and Histo-pathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

[00338] Anticorpos humanos podem também ser gerados isolando sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas de biblio-tecas de exibição de faço derivadas de humano. Tais sequências de domínio variável podem em seguida ser combinados com um domínio constante humano desejado. Técnicas para seleção de anticorpos hu-manos de bibliotecas de anticorpo são descritas abaixo.

(v) Fragmentos de Anticorpo

[00339] Fragmentos de anticorpo podem ser gerados por métodos tradicionais, tais como digestão enzimática, ou por técnicas recombi- nantes. Em certas circunstâncias, existem vantagens de usar os frag-mentos de anticorpo, diferentes daqueles anticorpos completos. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida clearance, e pode levar ao acesso melhorado aos tumores sólidos. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, veja Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134.

[00340] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo de Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em e secre- tados de E. coli, desse modo permitindo a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo descritas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outro método, fragmentos de F(ab’) 2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Fragmentos de Fab e F(ab') 2 com meia vida in vivo aumentada compreendendo recuperar os resíduos de epítopo de ligação de receptor são descritos no Patente dos Estados Unidos n° 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes pelo técnico versado. Em certas modalidades, um anticorpo é um fragmento de Fv de cadeia simples (scFv). Veja o WO93/16185; Patentes dos Estados Unidos n°s 5.571.894; e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; desse modo, elas podem ser adequadas para ligação não específica reduzida duranteo uso in vivo. Proteínas de fusão de scFv podem ser construídas para produzir a fusão de uma proteína efetora no terminal amino ou carbóxi de um scFv. Veja Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito no Patente dos Estados Unidos n° 5.641.870, por exemplo. Tais anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(vi) Anticorpos de Domínio Simples

[00341] Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpo de domínio simples. Um anticorpo de domínio simples é uma cadeia de polipeptídeo simples compreendendo todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio simples é um anticorpo de domínio simples humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.248.516). Em uma modalidade, um anticorpo de domínio simples consiste em todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo.

(vii) Variantes de Anticorpo

[00342] Em algumas modalidades, modificação(s) de sequência de aminoácido dos anticorpos descritos aqui são contemplados. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou ou-tras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequência de aminoácido do anticorpo pode ser preparado introduzindo mudanças apropriadas na sequência de nucleotídeo codificando o anticorpo, ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, dele- ções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos nas se-quências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de dele- ção, inserção, e substituição pode ser feita para chegar à construção final, contanto que a construção final possuísse as características de-sejadas. As alterações de aminoácido podem ser introduzidas na se-quência de aminoácido de anticorpo objeto ao mesmo tempo em que a sequência é feita.

(viii) Variantes de Substituição, Inserção e Deleção

[00343] Em certas modalidades, variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições de aminoácido são fornecidas. Sítios de interes- se para mutagênese substitucional incluem as HVRs e FRs. Substitui-ções conservadoras são mostradas na tabela 1 sob o título de "Substi-tuições Preferidas." Mudanças mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o título de "Substituições Exemplares," e como descrito abaixo com referência às classes de cadeia de aminoácido. Substitui-ções de aminoácido podem ser introduzidas em um anticorpo de inte-resse e os produtos analisados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno mantida/melhorada, imunogenicidade diminuída, ou ADCC ou CDC melhorado. Tabela 1 Table 1- Exemplary Substitutions. Legendas da tabela: Tabela 1: substituições exemplares - resíduo original - substituições exemplares - substituições preferidas - norleucina.

[00344] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com pro-priedades de cadeia lateral comum: a. hidrofóbricos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; b. hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; c. acídicos: Asp, Glu; d. básicos: His, Lys, Arg; e. resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; f. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[00345] Substituições não conservadoras implicará a permute de um membro de uma destas classes por outra classe.

[00346] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo origem (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a variante(s) resultante selecionada para outro estudo terá modificações (por exemplo, melhoras) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) relativas ao composto origem e/ou terá certas propriedades biológicas substan-cialmente mantidas do anticorpo origem. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo maturado de afinidade, que pode ser conve-nientemente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade com base em exibição de fago tal como aquelas descritas aqui. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos no fago e analisados quanto a uma ativi-dade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).

[00347] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, melhorar a afinidade de anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em "hotspots" de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em frequência elevada durante o processo de maturação somática (veja, por exemplo, Chowdhury, Me-thods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou SDRs (a-CDRs), com a VH ou VL de variante resultante sendo testada quanto à afinidade de liga-ção. A maturação de afinidade por construção e resseleção de biblio-tecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) Em algumas modalidades de maturação de afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis para ma-turação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, embaralhamento de cadeia, ou mutagênese di-recionada a oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então cria-da. A biblioteca é em seguida analisada para identificar quaisquer vari-antes de anticorpo com a afinidade desejada. Outro método para in-troduzir envolve métodos direcionados à HVR, em que diversos resí-duos de HVR (por exemplo, 4-6 resíduos de cada vez) são randomiza- dos. Os resíduos de HVR envolvidos em ligação de antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando modelagem ou mutagênese de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3, em particular são frequentemente alvejadas.

[00348] Em certas modalidades, substituições, inserções, ou dele- ções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de ligar o antígeno. Por exemplo, alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras como fornecido aqui) que não substancialmente reduzem a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem ser for a das SDRs ou "hotspots" de HVR. Em certas modalidades das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterada, ou não contém mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácido.

[00349] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser alvejados para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanine" como descrito por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) são identicados e substituídos por um ami- noácido neutron ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antíge- no é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nas locali-zações de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional às substi-tuições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo de antígeno-anticorpo para identificar os pontos de contato entre o anticorpo e antígeno. Tais resíduos de conta-to e resíduos vizinhos podem ser alvejados ou eliminados como candi-datos para substituição. Variantes podem ser analisadas para determi-nar se elas contêm as propriedades desejadas.

[00350] As inserções de sequência de aminoácido incluem fusões de terminais amino- e/ou carboxila variando no comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácido simples ou múl-tiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila de terminal N. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia vida do soro do anticorpo.

(ix) Variantes de glicosilação

[00351] Em certas modalidades, um anticorpo é fornecido aqui alterado para aumentar ou diminuir a extensão a qual o anticorpo é glicosi- lado. Adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácido de modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou re-movidos.

[00352] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato ligado a ele pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células mamíferas tipicamente compreendem um oligossacarídeo ra-mificado, biantenário que é geralmente ligado por uma ligação de N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Veja, por exemplo, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários car- boidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galac-tose, e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no "tronco" da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas mo-dalidades, modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da in-venção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com cer-tas propriedades melhoradas.

[00353] Em uma modalidade, variantes de anticorpo são fornecidas compreendendo uma região Fc, em que uma estrutura de carboidrato ligada à região Fc tem fucose reduzida ou não tem fucose, que pode melhorar a função de ADCC. Especificamente, anticorpos são contemplados aqui que têm fucose reduzida com relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma célula CHO do tipo selvagem. Isto é, eles são caracterizados por ter uma menor quantidade de fucose do que eles teriam de outro modo se fossem produzidos por células CHO nativas (por exemplo, uma célula CHO que produz um parceiro de glico- silação nativo, tal como, uma célula CHO contendo um gene FUT8 nativo). Em certas modalidades, o anticorpo é aquele em que menos do que cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, ou 5% dos glicans ligado a N nele compreendem fucose. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal um anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. Em certas modalidades, o anticorpo é aquele em que nenhum dos glicans ligados a N neles compreende fucose, isto é, em que o anticorpo é completamente sem fucose, ou não tem nenhuma fucose ou é afucosilado. A quantidade de fucose é determinada calculando-se a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, com relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas de manose complexas, hibrídas e elevadas) como medido por espectrometria de massa de MALDI-TOF, como descrito no WO2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de aspara- gina localizado a cerca de posição 297 na região Fc (numeração Eu de resíduos de região Fc); entretanto, Asn297 podem também estar locali-zado a cerca de ±3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido às menores variações de sequências nos anticorpos. Tais variantes de fucosilação podem ter função de ADCC melhorada. Veja, por exemplo, Publicações de Patente dos Estados Unidos n°s US2003/0157108 (Presta, L.); US2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas às variantes de "desfucosilado" ou "deficiente de fucose" variantes de anticorpo incluem: US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO de Lec13 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533545 (1986); Publicação de Patente dos Estados Unidos n° US2003/0157108, Presta, L; e WO2004/056312, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens de célula de nocaute, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO de nocaute (veja, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e WO2003/085107).

[00354] Variantes de anticorpo são também fornecidos com oligos- sacarídeos bissectados, por exemplo, em que um oligossacarídeo bi- antenário ligado à regiao de Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpo são descritos, por exemplo, no WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Pa-tente dos Estados Unidos n° 6.602.684 (Umana et al.); US2005/0123546 (Umana et al.), e Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5):851-861 (2006). Variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à refião de Fc são também fornecidas. Tais variantes de anticorpo podem ter fun-ção de CDC melhorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, no WO1997/30087 (Patel et al.); WO1998/58964 (Raju, S.); e WO1999/22764 (Raju, S.).

[00355] Em certas modalidades, as variantes de anticorpo compre-endendo uma região Fc descrita aqui são capazes ligar-se a um FcyRIII. Em certas modalidades, as variantes de anticorpo compreen-dendo uma região Fc descrita aqui têm atividade de ADCC na presença de células efetoras humanas ou têm atividade de ADCC aumentada na presença de células efetoras humanas em comparação com o mesmo anticorpo de outro modo compreendendo uma região Fc de IgG1 do tipo selvagem humana.

(x) Variantes de região Fc

[00356] Em certas modalidades, uma ou mais modificações de ami- noácido podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido aqui, desse modo gerando uma variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) a uma ou mais posições de aminoácido.

[00357] Em certas modalidades, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, porém não todas as funções efe- toras, que a tornam um candidato desejável para aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é importante mesmo se certas funções efetoras (tais como complemente e ADCC) forem desnecessárias ou nocivas. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser con-duzidos para confirmar a redução/depleção de atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação de receptor de Fc (FcR) po-dem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não tenha ligação de FCYR (consequentemente, provavelmente sem atividade de ADCC), porém mantém a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FCYRIII apenas, en-quanto os monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR nas células hematopoieticas é sumariada na tabela 3 na página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos no Patente dos Es-tados Unidos n° 5.500.362 (veja, por exemplo, Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (veja, Brugge- mann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, métodos de ensaio não radioativos podem ser empregados (veja, por exemplo, ACTI (nome comercial) ensaio de citotoxicidade não radioati-vo para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e CytoTox 96 (registrado) ensaio de citotoxicidade não radioativo (Pro- mega, Madison, WI). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células exter- minadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a ativi-dade de ADCC da molécula de interesse pode ser ensaiada in vivo, por exemplo, em um modelo de animal tal como aquele descrito em Clynes et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Os ensaios de ligação de C1q podem também ser realizados para confirma que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, não tem atividade de CDC. Veja, por exemplo, ELISA de ligação de C1q e C3c no WO2006/029879 e WO2005/100402. Para avaliar a ativação de com-plemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (veja, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. and M.J. Glen-nie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Ligação de FcRn e determinações de meia vida/clearance in vivo também ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

[00358] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais resíduos de região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente dos Estados Unidos n° 6.737.056). Tais mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em uma ou mais posições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o assim chamado mutante de Fc "DANA" com substituição de resíduos 265 e 297 por alanina (Patente dos Estados Unidos n° 7.332.581).

[00359] Certas variantes de anticorpo com ligação às FcRs melhorada ou diminuída são descritas. (Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.737.056; WO2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).)

[00360] Em certas modalidades, uma variante de anticorpo com-preende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácido que melhoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos). Na modali-dade exemplar, o anticorpo compreendendo as seguintes substituições de aminoácido em sua região Fc: S298A, E333A, e K334A.

[00361] Em algumas modalidades, alterações são feitas na região Fc que resultam na ligação de C1q alterada (isto é, melhorada ou di-minuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 6.194.551, WO99/51642, e Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).

[00362] Anticorpos com meias vidas aumentadas e ligação melhorada para o receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável para a transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos no US2005/0014934 (Hinton et al.)). Aqueles anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nela que melhoram a ligação da região Fc a FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos de região de Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (Patente dos Estados Unidos n° 7.371.826). Veja também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente dos Estados Unidos n° 5.648.260; Patente dos Estados Unidos n° 5,624,821; e WO94/29351 envolvendo outros exemplos de variantes de região Fc.

(xi) Derivados de Anticorpo

[00363] Os anticorpos da invenção podem ser também modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis. Em certas modalidades, as por-ções adequadas para derivação do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água in-cluem, porém não estão limitados a polietileno glicol (PEG), copolíme- ros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímero de etileno/anidrido maléico, poliaminoácidos (ho- mopolímeros ou copolímeros randômicos), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co- polímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxieti- lados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mes-mos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabri-cação devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ramificado ou não ramificado. O nú-mero de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais do que um polímero for ligado, eles poderão ser moléculas iguais ou diferen- tes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivação pode ser determinado com base nas considerações incluindo, porém não limitadoas às propriedades ou funções particulares do anticorpo a serem melhoradas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob as condições definidas, etc.

(xii) Vetores, Células Hospedeiras e Métodos recombinantes

[00364] Anticorpos podem também ser produzidos usando métodos recombinantes. Para produção recombinante de anticorpo antiantí- geno, ácido nucleico codificando o anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável para outra clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA codificando o anticorpo pode ser facilmente isolados e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes de vetor geralmente incluem, porém não estão limitados a, um ou mais dos se-guintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento realçador, um promotor, e uma sequência d eterminação de transcrição. (a) Componente de Sequência de Sinal

[00365] Um anticorpo da invenção pode ser produzido recombinan- temente não apenas diretamente, porém também como um polipeptí- deo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de cliva-gem específica no terminal N da proteína madura ou polipeptídeo. A sequência de sinal heterólogo selecionada preferivelmente é aquela que é reconhecida e processada (por exemplo, clivada por um sinal peptidase) pela célula hospedeira. Para células hospdeiras procarióti- cas não reconhecem e processam uma sequência de sinal de anticorpo nativa, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótico selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase al-calina, penicilinase, lpp, ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor. Para secreção de levedura, a sequência de sinal nativa pode ser subs-tituída, por exemplo, pelo líder de levedura invertase, um fator líder (incluindo líderes de fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder de fosfatase ácida, o líder de C. albicans glucoamylase, ou o sinal descrito no WO90/13646. Em expressão de célula mamífera, sequência de sinal mamífera bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simples, são disponíveis. (b) Origem de Replicação

[00366] Tanto os vetores de expressão quanto clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, esta sequência é uma que permite que o vetor se replique independentemente do DNA cromossômico, e inclui origens de sequências de replicação ou autonomamente replicantes. Tais sequências são bem conhecidas por uma variedade de bactérias, le-vedura, e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é ade-quada para a maioria das bactérias Gram negativas, os 2μ, origem de plasmídeo é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para os vetores de clo-nagem em células mamíferas. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada apenas porque ela contém o promotor anterior). (c) Seleção de Componente de Gene

[00367] Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também chamado um marcador selecionado. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a an-tibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, meto- trexato, ou tetraciclina, (b) deficiências auxotróficas de complemento, ou (c) fornecimento de nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli.

[00368] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas de forma bem sucedida com um gene heterólogo produzem uma proteína conferindo resistência ao fármaco e, desse modo, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de seleção dominante usam os fármacos: neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[00369] Outro exemplo de marcadores selecionáveis para células mamíferas são aqueles que permitem a identificação de células com-petentes para apreender o ácido nucleico codificando anticorpo, tal como DHFR, glutamina sintetase (GS), timidina cinase, metalotionei- na-I e -II, preferivelmente genes de metalotioneína de primata, adeno- sina desaminase, ornitina decarboxilase, etc.

[00370] Por exemplo, células transformadas com o gene DHFR são identificadas por cultura dos transformantes em um meio de cultura contendo metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Sob estas condições, o gene DHFR é ampliado junto com qualquer outro ácido nucleico cotransformado. Uma linhagem de célula de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR endógena (por exemplo, ATCC CRL-9096) pode ser usada.

[00371] Alternativamente, células transformadas com o gene GS são identificadas por cultura dos transformantes em um meio de cultura contendo L-metionina sulfoximina (Msx), um inibidor de GS. Sob estas condições, o gene GS é amplificado junto com qualquer outro ácido nucleico cotransformadas. O sistema de seleção/amplificação de GS pode ser usado em combinação com o sistema de seleção/am plificação de DHFR descrito acima.

[00372] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente, hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transfor-madas ou cotransformadas com sequências de DNA codificando um anticorpo de interesse, gene de DHFR do tipo selvagem, e um outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) pode ser selecionado pelo crescimento da célula em meio con-tendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Veja, Patente dos Estados Unidos n° 4.965.199.

[00373] Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp 1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). O gene trp 1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de desenvolver-se em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão de trp 1 no geno- ma de célula hospedeira de levedura então fornece um ambiente eficaz para detector a transformação por crescimento na ausência de triptofano. Similarmente, cepas de levedura deficientes de Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos transformando o gene Leu2.

[00374] Além disso, os vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 μm pKD1 podem ser usados para a transformação de leveduras de Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para pro-dução em grande escala de quimiosina de bezerro recombinante foi reportado por K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Vetores de expressão de múltiplas cópias estáveis para secreção de albumina de soro humano recombinante maduro por cepas industriais de Kluyveromyces foram também descritos. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). (d) Componente de promotor

[00375] Vetores de expressão e clonagem geralmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operavel- mente ligado ao ácido nucleico codificando um anticorpo anticorpo. Promotores adequados para uso em hospedeiros procarióticos incluem o promotor de phoA, sistemas de promotor de β-lactamase e lactose, promotor de fosfatase alcalina, um sistema de promotor de tripto- fano (trp), e promotores híbridos tal como o promotor tac. Entretanto, otutros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operavelmente ligada ao DNA codificando um anticorpo.

[00376] Sequências de promotor são conhecidas por eucariotas. Virtualmente, todos os gene eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência constatada de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos é uma sequência de AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda de poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos.

[00377] Exemplos de sequências de promotor adequadas para uso com hospedeiras de levedura incluem os promotores para 3-fos- foglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfate desidrogenase, hexocinase, piruvato descarbo- xilase, fosfofructocinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfate isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicocinase.

[00378] Outros promotores de levedura, que são promotores indu- zíveis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condi-ções de crescimento, são as regiões de promotor para álcool desidro- genase 2, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas degradativas as-sociadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeí- do-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso na expressão de levedura são também descritos no EP73.657. Realçado- res de levedura também são vantajosamente usados com promotores de levedura.

[00379] A transcrição de anticorpo de vetores em células hospedeiras mamíferas pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como como vírus do polioma, vírus do epitelioma contagioso, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retro- vírus, vírus da hepatite B, Vírus Símio 40 (SV40), ou de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, forne-cidos tais promotores são compatíveis com os sistemas de célula hos-pedeira.

[00380] Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são con-venientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem viral SV40 de replicação. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição de HindIII E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus doo papi- loma humano como um vetor é descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente dos Estados Unidos n° 4.601.978. Veja também Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de β-interferon uma- no em células de camundongo sob o controle de um promotor de timi- dina cinase do vírus da herpes simples. Alternativamente, o vírus do Rous Sarcoma junto com a repetição terminal pode ser usado como o promotor. (e) Componente de Elemento Realçador

[00381] A transcrição de um DNA codificando um anticorpo desta invenção por eucariotas superiors é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência de realçador no vetor. Muitas sequências de realçador são atualmente conhecidas de gene mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína, e insulina). Tipicamente, entretanto, alguém usará um realçador de um vírus de célula eucariótica. Exem-plos incluem o realçador de SV40 no lado tardio da origem de replica- ção (bp 100-270), o realçador de promotor precoce de citomegaloví- rus, o realçador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e realadores de adenovírus. Veja também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre o realce de elementos para ativação de promotores euca- rióticos. O realçador pode ser ligado no vetor em uma posição 5' ou 3' à sequência codificando o anticorpo, porém é preferivelmente localizado em um sítio 5' do promotor. (f) Componente de Terminação de Transcrição

[00382] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eu- carióticas (levedura, fungos, inseto, planta, animal, humano, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão se-quências necessárias para a terminação de transcrição e para estabili-zação do mRNA. Tais sequências são comumente disponíveis das re-giões não trasladadas 5' e, ocasionalmente de eucarióticos ou DNAs ou cDNAs virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não trasladada do mRNA codificando anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação de hormônio de cresci-mento bovino. Veja W094/11026 e o vetor de expressão descrito nele. (g) Seleção e Transformação de Células Hospdeiras

[00383] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA no vetores aqui são as células procariotas, levedura, ou eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram nega-tivos ou Gram positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrito em DD 266,710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudo-monas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras linhagens tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Estes exemplos são ilus-trativos, ao invés de limitantes.

[00384] Anticorpo de tamanho natural, proteínas de fusão de anticorpo, e fragmentos de anticorpo podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) que por si só mostra a eficácia na destruição de célula tumoral. Anticorpos de tamanho natural têm maior meia vida na circulação. Produção em E. coli é mais rápida e mais barata. Para expressão de fragmentos de anticorpo e poli- peptídeos em bactérias, veja, por exemplo, Patente dos Estados Uni-dos n° 5.648.237 (Carter et al.), Patente dos Estados Unidos n° 5.789.199 (Joly et al.), Patente dos Estados Unidos n° 5.840.523 (Simmons et al.), que descreve a região de iniciação de traslação (TIR) e sequências de sinal para otimizar a expressão e secreção. Veja tam-bém Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254, descrevendo expres-são de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após a expressão, o anti-corpo pode ser isolado da pasta celular de E. coli em uma fração solú-vel e pode ser purificado através, por exemplo, de uma coluna de pro-teína A ou G dependendo no isotipo. A purificação final pode ser reali-zada pelo processo de purificação de anticorpo expresso, por exemplo, em células CHO.

[00385] Além do procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificando anticorpo. Saccha- romyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais comu- mente usado entre os micro-organismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Entretanto, diversos outros gêneros, espécies, e linhagens são comumente diponíveis e úteis aqui, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces tais como, por exemplo, K. lac- tis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicke- ramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP402,226); Pi- chia pastoris (EP183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occi- dentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger. Para uma revisão descrevendo o uso de leveduras e fungos filamentosos para a produção de proteínas terapêuticas, veja, por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004).

[00386] Certas cepas de levedura e fungos podem ser selecionadas, em que a via de glicosilação foi "humanizada," resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Veja, por exemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24:210215 (2006) (descrevendo a humanização da via de glicosilação em Pi- chia pastoris); e Gerngross et al., supra.

[00387] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são também derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrado incluem células de planta e inseto. Numerosas cepas baculovirais e variantes e células de inseto hospedeiro correspondente permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes ae- gypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogas- ter (mosca da fruta), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção está publicamente disponível, por exemplo, a variante de L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o ví-rus aqui de acordo com a invenção, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00388] Culturas de célula de planta de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, lentilha (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula), e tabaco podem também ser utilizadas como hospedeiras. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos n°s 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, e 6.417.429 (descrevendo tecnologia PLANTICORPOS (nome comercial) para produção de anticorpos em plantas trans- gênicas).

[00389] Células de vertebrado podem ser usadas como hospedeiras, e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira mamífera úteis são a linhagem de CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou 293 células subclonadas para o cultivo em cultura de suspensão, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de camundongo Sertoli (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim cani-no (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células de TRI (Mather et al, Annals NY. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células de MRC 5; células de FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras li-nhagens de célula hospedeira mamífera úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células de DHFR- CHO (Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens de célula de mieloma tal como NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linha-gens de célula hospedeira mamífera adequadas para a produção de anticorpo, veja, por exemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.

[00390] Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção de anticorpo e cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados como apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou ampliação dos genes codificando as sequências desejadas. (h) Cultura das Células Hospedeiras

[00391] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes dos Estados Unidos n°s 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO90/03430; WO87/00195; ou Re. de Patente dos Estados Unidos 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hos-pedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado quando necessário e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como clore-to de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco GENTAMICINA (nome comercial)), elementos de traço (defi-nidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concen-trações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem tam-bém ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conheci-das por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tal como temperatura, pH, e similares, são aquelas anteriormente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para o técnico versado.

(xiii) Purificação de Anticorpo

[00392] Quando usando técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltragem. Carter et al., Bio/Technology 10:163167 (1992) descrevem um procedimento para o isolamento de anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 min. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifuga- ção. Onde o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore. Um inibi-dor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.

[00393] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxila- patita, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese de gel, diá- lise, e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade estando entre uma das etapas de purificação tipicamente preferidas. A adequabilidade de proteína A como um ligante de afinidade depende das espécies e isotipo de qualquer domínio de Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para puri-ficar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas de y1, Y2, ou Y4 humano (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A pro-teína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para Y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz a qual o ligante de afinidade é ligado é mais frequentemente agarose, porém outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil) benzeno permi-tem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais cur-tos do que podem ser obtidos com agarose. Onde o anticorpo com-preende um domínio de CH3, a resina Bakerbond ABX (nome comer-cial) (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteína tais como fracionação em uma coluna de permute de íon, precipitação de etanol, HPLC de fase rever-sa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE (nome comercial), cromatografia em uma resina de permuta de ânion ou cátion (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocali- zação, SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônio estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[00394] Em geral, várias metodologias para a preparação dos anti-corpos para uso em pesquisa, teste, e clínica são bem estabelecidas na técnica, consistentes com as metodologias descritas acima e/ou como considerado apropriado por alguém versado na técnica para um anticorpo particular de interesse.

C. Seleção de Anticorpos Biologicamente Ativos

[00395] Anticorpos produzidos como descrito acima podem ser submetidos a um ou mais ensaios de "atividade biológica" para seleci-onar um anticorpo com propriedades benéficas de uma perspectiva terapêutica ou seleção de formulações e condições que mantêm a ati-vidade biológica do anticorpo. O anticorpo pode ser testado quanto à sua capacidade de ligar o antígeno contra o qual ele foi elevado. Por exemplo, métodos conhecidos na técnica (tais como ELISA, Western Blot, etc.) podem ser usados.

[00396] Por exemplo, para um anticorpo anti-PD-L1, as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo podem ser avaliadas em um ensaio que detecta a capacidade de ligar-se a PD-L1. Em algumas modalidades, a ligação do anticorpo pode ser determinada por ligação por saturação; ELISA; e/ou ensaios de competição (por exemplo, RI-A's), por exemplo. Além disso, o anticorpo pode ser submetido a outros ensaios de atividade biológica, por exemplo, a fim de avaliar a sua efi-cácia como um produto terapêutico. Tais ensaios são conhecidos na técnica e dependem do antígeno alvo e uso pretendido para o anticor-po. Por exemplo, os efeitos biológicos de bloqueio de PD-L1 pelo anti-corpo pode ser avaliado em células T CD8+, um modelo de camun-dongo de vírus de coriomeningite linfocítica (LCMV) e/ou um modelo de tumor singeneico, por exemplo, como descrito na Patente dos Es- tados Unidos 8.217.149.

[00397] Para analisar os anticorpos que se ligam a um epítopo par-ticular no antígeno de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação do anticorpo anti-PD-L1 do exemplo a PD-L1), um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como aquele descrito no Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and Da-vid Lane (1988), pode ser realizado. Alternativamente, o mapeamento de epítopo, por exemplo, como descrito em Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), pode ser realizado para determinar se o anticorpo liga um epítopo de interesse.

D. Formulações e Composições Farmacêuticas

[00398] São também fornecidas aqui formulações e composições farmacêuticas compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD- 1 e/ou um anticorpo descrito aqui (tal como um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-GPC3) como um ingrediente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00399] "Combinação" como descrito aqui, refere-se a uma combinação de ingredientes ativos para uso de combinação, e inclui ambos os modos, onde substâncias separadas são usadas em combinação na administração ou onde elas são fornecidas como uma mistura (pre-paração de combinação).

[00400] Formulações e composições farmacêuticas como descrito aqui podem ser preparadas misturando os ingredientes ativos (tais como um anticorpo anti-PD-L1 e/ou um anticorpo anti-GPC3) tendo o grau desejado de pureza com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Edi-ção, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de fomulações liofilizadas ou solu-ções aquosas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações emprega-das, e incluem, porém não estão limitados a: tampões tais como fosfa- to, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido as- córbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de amônio octade- cildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; clore-to de benzetônio; phenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinil- pirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, his- tidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelan- tes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos me-tálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tal como polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares aqui também incluem agentes de dispersão de fármaco instersticial tais como glicoproteínas de hialuronidase ativa, neutra solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuroni- dase PH-20 humana solúvel, tal como rHuPH20 (HYLENEX (registra-do), Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e méto-dos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos no Publicações de Pa-tente dos Estados Unidos n°s 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosamino- glicanases adicionais tal como condroitinases.

[00401] Formulações de formulações de anticorpo liofilizadas exemplares são descritas na Patente dos Estados Unidos n° 6.267.958. Formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na Patente dos Estados Unidos n° 6.171.586 e WO2006/044908, as formulações posteriores incluindo um tampão de acetato de histidi- na. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 descrito aqui es- tá em uma formulação compreendendo o anticorpo em uma concen-tração de cerca de 60 mg/mL, acetato de histidina em uma concentra-ção de cerca de 20 mM, sucrose em uma concentração de cerca de 120 mM, e polissorbato (por exemplo, polissorbato 20) em uma con-centração de 0,04% (p/v), e a formulação tem um pH de cerca de 5,8. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 descrito aqui está em uma formulação compreendendo o anticorpo em uma concentração de cerca de 125 mg/mL, acetato de histidina em uma concentração de cerca de 20 mM, sacarose está em uma concentração de cerca de 240 mM, e polissorbato (por exemplo, polissorbato 20) em uma concentração de 0,02% (p/v), e a formulação tem um pH de cerca de 5,5.

[00402] A composição e formulação aqui podem também conter mais do que um ingrediente ativo como necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aquelas com atividades com-plementares que não se afetam adversamente entre si. Tais ingredien-tes ativos são adequadamente presentes em combinação em quanti-dades que são eficazes para o propósito pretendido.

[00403] Ingredientes ativos podem ser capturados em microcápsu- las preparadas, por exemplo, por técnicas coacervação ou por polime- rização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipos- somas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

[00404] Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos molda- dos, por exemplo, películas, ou microcápsulas. As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A es-terilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtragem através de membranas de filtragem estéril.

IV. Métodos de Tratamento

[00405] São fornecidos aqui métodos para o tratamento, prevenção ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. Em algumas modali-dades, o tratamento resulta em uma resposta prolongada no indivíduo após cessação do tratamento. Os métodos descritos aqui podem en-contrar uso no tratamento de condições, onde a imunogenicidade real-çada é desejada tal como aumento de imunogenicidade de tumor para o tratamento de câncer. Também são fornecidos aqui métodos de real-çar as respostas imunológicas contra as células tumorais em um indi-víduo tendo câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. Por exemplo, a resposta imunológica realçada contra células tumorais inclui infiltração de células imunológicas inclu-indo macrófagos e células gigantes multinucleadas nos tecidos tumo- rais. Para outro exemplo, resposta imunológica realçada contra células tumorais inclui o aumento de linfócitos positivos de CD45, linfócitos positivos de CD3ε e linfócitos T positivos de CD8 em linfócitos infiltra-dos de tumor (TILs). Qualquer um dos antagonistas de ligação de eixo PD-1 e dos anticorpos anti-GPC3 conhecidos na técnica ou descritos aqui podem ser usados nos métodos.

[00406] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer positivo de GPC3. Em algumas modalidades, câncer positivo de GPC3 é câncer hepático, câncer de mama, câncer de mama, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer endométrico, câncer de colo, câncer de rim, câncer esofágico, ou câncer de próstata. Em al-gumas modalidades, o câncer hepático é um carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, o câncer de mama é um carcinoma de mama ou um adenocarcinoma de mama. Em algumas modalidades, o carcinoma de mama é um carcinoma ductal invasivo. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão é um adenocarcinoma de pulmão. Em algumas modalidades, o câncer de colo é um adenocarcinoma co- lorretal. Em algumas modalidades, as células de câncer no indivíduo expressam PD-L1. Em algumas modalidades, as células de câncer no indivíduo expressam proteína GPC3 em um nível que é detectável (por exemplo, detectável usando métodos conhecidos na técnica).

[00407] Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado com uma terapia alvejada por GPC3 antes do tratamento de combinação com um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. Em al-gumas modalidades, a terapia alvejada por GPC3 inclui o tratamento com uma ou mais moléculas pequenas, por exemplo, sorafenibe.

[00408] Em algumas modalidades, a terapia de combinação da in-venção compreende administração de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e um anticorpo anti-GPC3. O antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anticorpo anti-GPC3 podem ser administrados de qualquer maneira conhecida na técnica. Por exemplo, o antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anticorpo anti-GPC3 podem ser administrados se-quencialmente (em momentos diferentes) ou concorrentemente (ao mesmo tempo). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 está em uma composição separada como o anticorpo anti- GPC3. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 está na mesma composição como o anticorpo anti-GPC3.

[00409] O antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anticorpo anti- GPC3 podem ser administrados pela mesma rotina de administração ou por rotinas diferentes de administração. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 é administrado intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, transdermicamente, intraperitonealmente, intraorbitalmente, por im-plantação, por inalação, intratecalmente, intraventricularmente, ou in- tranasalmente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GPC3 é administrado intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamen- te, topicamente, oralmente, transdermicamente, intraperitonealmente, intraorbitalmente, por implantação, por inalação, intratecalmente, intra- ventricularmente, ou intranasalmente. Uma quantidade eficaz do anta-gonista de ligação de eixo PD-1 e do anticorpo anti-GPC3 pode ser administrada para prevenção ou tratamento de doença. A dosagem apropriada do antagonista de ligação de eixo PD-1 e/ou do anticorpo anti-GPC3 pode ser determinada com base no tipo de doença a ser tratada, no tipo do antagonista de ligação de eixo PD-1 e no anticorpo anti-GPC3, na gravidade e curso da doença, na condição clínica do indivíduo, no histórico clínico do indivíduo e responsta ao tratamento, e na discrição do médico assistente.

[00410] Como uma proporção geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo administrada ao humano estará na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paciente se por uma ou mais administrações. Em algumas modalidades, o anticorpo usado é de cerca de 0,01 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 35 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 25 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 15 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg, ou cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg administrados diariamente, por exemplo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado em 15 mg/kg. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em uma modalidade, um anticorpo anti-PD-L1 descrito aqui é administrado a um humano em uma dose de cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg ou cerca de 1400 mg no dia 1 de ciclos de 21 dias. A dose pode ser administrada como uma dose simples ou como múltiplas doses (por exemplo, 2 ou 3 doses), tal como infusões. A dose do anticorpo administrada em um tratamento com composição pode ser reduzida em comparação com um tratamento simples. O processo desta terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais.

[00411] Em algumas modalidades, os métodos podem também compreender uma terapia adicional. A terapia adicional pode ser terapia de radiação, cirurgia (por exemplo, lumpectomia e uma mastecto- mia), quimioterapia, terapia de gene, terapia de DNA, terapia viral, terapia de RNA, imunoterapia, transplante de medula óssea, nanotera- pia, terapia de anticorpo monoclonal, ou uma combinação dos anteriores. A terapia adicional pode estar na forma de terapia de adjuvante ou neoadjuvante. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de inibidor enzimático de molécula pequena ou agente anti- metástico. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de agentes limitantes de efeito collateral (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou gravidade de efeitos colaterais de tratamento, tal como agentes antináusea, etc.). Em algumas moda-lidades, a terapia adicional é terapia de radiação. Em algumas modali-dades, a terapia adicional é cirurgia. Em algumas modalidades, a tera-pia adicional é uma combinação de terapia de radiação e cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é gama irradiação. Em al-gumas modalidades, a terapia adicional é terapia alvejando a via de PI3K/AKT/mTOR, inibidor de HSP90, inibidor de tubulina, inibidor de apoptose, e/ou agente quimiopreventivo. A terapia adicional pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos descritos aqui.

V. Artigos de Fabricação ou Kits

[00412] Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação ou um kit é fornecido compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e/ou um anticorpo anti-GPC3. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit também compreende o folheto de embalagem compreendendo instruções para o uso do antagonista de ligação de eixo PD-1 em conjunção com um anticorpo anti-GPC3 para tratar ou retardar a progressão de câncer em um indivíduo ou para realçar as respostas imunológicas contra as células tumorais de um indivíduo tendo câncer. Por exemplo, resposta imunológica realçada contra célu-las tumorais inclui infiltração de células imunológicas incluindo macró- fagos e células gigantes multinucleadas nos tecidos tumorais. Por outro exemplo, resposta imunológica realçada contra células tumorais inclui o aumento de linfócitos positivos de CD45, linfócitos positivos de CD3ε e linfócitos T positivos de CD8 em linfócitos infiltrados de tumor (TILs). Qualquer um dos antagonistas de ligação de eixo PD-1 e/ou anticorpos anti-GPC3 descritos aqui podem ser incluídos no artigo de fabricação ou kits.

[00413] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de eixo PD-1 e o anticorpo anti-GPC3 estão no mesmo recipiente ou recipien-tes separados. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frasconetes, bolsas e seringas. O recipiente epode ser formado de uma variedade de materiais tais como vidro, plástico (tal como cloreto de polivinila ou poliolefina), ou liga metálica (tal como aço inoxidável ou hastelloy). Em algumas modalidades, o recipiente mantém a formu-lação e o rótulo em, ou associado com, o recipiente pode indicar as orientação para uso. O artigo de fabricação ou kit pode também incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuá- rio, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e fo-lhetos de embalagem com instruções para o uso. Em algumas modali-dades, o artigo de fabricação também inclui um ou mais dos outros agentes (por exemplo, um agente quimioterapêutico, e agente antine- oplásico). Recipientes adequados para um ou mais agentes incluem, por exemplo, garrafas, frasconetes, bolsas e seringas.

[00414] A especificação é considerada ser suficiente para garantir que alguém pratique a invenção. Várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica da descrição anterior e se incluem no es-copo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pe-didos de patentes citados aqui são pelo presente incorporados por re-ferência em sua totalidade para todos os propósitos. Exemplo 1 Linhagens celulares de camundongo expressando Glipicano-3 humano (GPC3)

[00415] Linhagens de célula de câncer de camundongo, Hepa1-6 (ATCC No. CRL-1830) e CT26 (ATCC No. CRL-2638) foram transfec- tadas com vetor de expressão de GPC3 humano, pCXND2/hGPC3 (FL) [Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832-9838] usando Fu- GENE6 (Roche Diagnostics Corp) e selecionadas com 1 mg/mL de G418 (Invitrogen). Células que cresceram mesmo na presença de G418 foram coletadas, e as colônias foram isoladas por diluição limi- tante. Expressão de GPC3 humano foi confirmada usando FACS usando anti-GPC3 humano anticorpo, GC33 [Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832-9838]. Clones representativos foram selecionados e usados para os experimentos. Exemplo 2 Atividade antitumor de anticorpo anti-GPC3 em modelo de camundon-go singênico usando linhagem de célula Hepa1-6 expressando GPC3 humano

[00416] Células Hepa1-6/hGPC3 foram cultivadas usando frascos de cultura celular em um incubador (estabelecido a 37°C e 5% de CO2). As células foram separadas dos frascos com tripsina e lavadas com D-MEM contendo 10% (v/v) de FBS, 0,6 mg/mL de G418. Em seguida, as células foram ressuspensas em D-MEM (2 x 108 células/mL), e um volume igual de Matrigel foi adicionado. As concentrações de célula para implante foram 1 x 108 células/mL. As células foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito de cada camundongo C57BL/6J (Charles River Laboratories, Japão) (1 x 107 células/camun- dongo). Uma vez que os tumores palpáveis foram estabilizados, os animais foram randomizados nos grupos de teste, de modo que cada grupo tenha volumes de tumor médios similares quando o estudo iniciou. 1 ou 5 mg/kg de anticorpo mononoclonal humano anti-GPC3 de GC33 de camundongo [WO2006/006693] diluídos em PBS, ou PBS como um controle de veículo foi injetado no dia 14, 21 e 28 intravenosamente após inoculação de tumor. GC33 de camundongo mostrou a inibição do crescimento de tumor com dependência de dose em comparação com o controle de veículo (Figura 1). Exemplo 3 Mudanças patológicas induzidas por anticorpo anti-GPC3 em modelo de camundongo singênico usando linhagem de célula Hepa1-6 ex-pressando GPC3 humano

[00417] Para avaliar as mudanças no tecido tumoral de Hepa1-6 tumor por tratamento com GC33 de camundongo, o tecido tumoral isolado após 3 ou 7 dias a partir da injeção simples de anticorpo de GC33 de camundongo ou controle de veículo foi usado para o exame patológico. Os tecidos tumorais foram fixados por paraformaldeído a 4% (PFA) e embebidos em parafina pelo método AMeX [Suzuki et al, J Toxicol Sci. 2002; 27:165-172, Watanabe et al, J Toxicol Pathol. 2015; 28: 43-49]. Três ecções de parafina de micrômetros foram manchadas com hematoxilina e eosina (HE) ou imuno-histoquimicamente (IHC). Manchamento por IHC foi realizado de acordo com o método de estra- ptavidina-biotina rotulada (LSAB) (estreptavidina de rábano picante rábano RTU). Anticorpos contra F4/80 (antígeno marcador de macró- fagos de murino; A3-1, BioLegend), PD-L1 (antígeno marcador de B7- H1/PD-L1 de camundongo; AF1019, sistemas R&D) foram usados co-mo os anticorpos primários. Os sinais positivos foram visualisados pela reação de peroxidase-diaminobenzidina, e as secções foram contra- manchadas com hematoxilina.

[00418] Por injeção de GC33 de camundongo, infiltração de células imunológicas e morte de célula tumoral foram observadas nas regiões periféricasdos tecidos tumorais. Além disso, infiltração aumentada de células de macrófago positivo de F4/80 foi observada na área na qual a morte da célula tumoral foi observada nos tecidos tumorais tratados por GC33 de camundongo, enquanto células positivas de F4/80 princi-palmente observadas nas regiões estromais no tecido tumoral com controle de véiculo (Figura 2A). Subsequentemente, a expressão de PD-L1 foi aumentada por GC33 de camundongo especialmente nas células imunológicas inflitradas, em comparação ao veículo de controle, que sugeriu que PD-L1 poderia ser induzido para suprimir a atividade antitumor por GC33 de camundongo (Figura 2B). Exemplo 4

[00419] Atividade antitumor em combinação com os anticorpos anti- GPC3 (GC33) e anti-PD-L1 (10F.9G2) em modelo de camundongo singênico usando linhagem de célula CT26 expressando GPC3 huma-no

[00420] Para avaliar as atividades antitumor de monoterapias anti- GPC3 ou anti-PD-L1 ou combinação em modelo de CT26/hGPC3 de camundongo, ou GC33 de camundongo anticorpo e/ou 500 μg de anti- corpo de rato de PD-L1 anticamundongo, 10F.9G2 (adquirido de BioXCell) foram injetados a partir do dia 3 (modelo de tratamento pre-coce) ou dia 15 (modelo estabelecido) após inoculação subcutânea de 1x106 de células CT26/hGPC3. Na modelo de tramento precoce, 5 ou 25 mg/kg de GC33 de camundongo foram injetados no dia 3, 6, 10 e 13 intravenosamente, e 500 μg de anticorpo anti-PD-L1, 10F.9G2, foram injetados na mesma programação como agente simples ou com-binação. No modelo de estabelecimento, 5 ou 25 mg/kg de GC33 de camundongo foram injetados no dia 15 e 18 intravenosamente, e 500 μg de anticorpo anti-PD-L1, 10F.9G2, foram injetados na mesma pro-gramação como agente simples ou combinação.

[00421] Em ambos os modelos, a combinação de 25 mg/kg de GC33 e 10F.9G2 mostrou atividade antitumor mais potente em comparação com aqueles por cada monoterapia (Figuras 3 e 4). Exemplo 5

[00422] Atividade antitumor em combinação com the anti-GPC3 (GC33) e anti-PD-L1 anticorpos (10F.9G2) in modelo de camundongo singênico usando linhagem de célula Hepa1-6 expressando GPC3 humano

[00423] 1, 5, ou 25 mg/kg de anticorpo de GC33 de camundongo uma vez por semana durante 3 semanas ou 200 μg de anticorpo de rato de PD-L1 anticamundongo, 10F.9G2 seguidos por 100 μg sema-nalmente durante 2 semanas como um agente simples ou combinação foram injetados intravenosamente a camundongos transportando He- pa1-6 tão igual quanto acima. O exame patológico foi conduzido com seções de manchamento por HE que foram preparadas com métodos convencionais descritos acima. Como ao IHC, os 1°s anticorpos lista-dos na Tabela 2 foram usados para cada um dos marcadores e visuali-zados por métodos de LSAB descritos acima ou método ENV+. IHC foi conduzido para 3 animais representativos de cada grupo. [Tabela 2] Table2: List of antibodies used in the IHC staining ' Biotinylated Rabbit Anti-Goat IgS Antibody (Vector Laboratoties, Inc.) LSAB, Streptavidin, Horseradish Peroxidase, R.T.U. (Vector Laboratoties, Inc. or Dakoj ENV+ EnVisionr System- HRP. Labelled Polymer. Anti-Rabbit (Dako) Legendas da tabela: Tabela 2: lista de anticorpos usados no manchamento com IHC - mar-cador - primeiro anticorpo - clone - isotipo - fonte - sistema de visua-lização - rato - coelho - camundongo - hamster - anticorpo de IgG anticabra de coelho biotinilado p estreptavidina - rábano picante pero-xidase - sistema - Polímero rotulado - Anticoelho.

[00424] Enquanto o GC33 de camundongo ou 10F.9G2 mostrou ini-bição de crescimento de tumor em comparação com o coltrole de veí-culo, a combinação de GC33 de camundongo e 10F.9G2 mostrou a atividade antitumor mais forte (Figura 5A). Cinco dias após a 3a injeção, todos os camundongos foram necropsiados e os tecidos tumorais foram patologicamente avaliados. Nos tecidos examinados, nenhuma célula tumoral viável foi observada em todos os camundongos tratados com 25 mg/kg de GC33 de camundongo em combinação com PD-L1 anticorpo e em 4 dos 5 camundongostratados com 5 mg/kg de GC33 de camundongo em combinação com PD-L1 anticorpo (Figura 5B).

[00425] Exame patológico de cada um dos tecidos tumorais tratados revelou o aumento em diversas células positivas de F4/80, expressão de PD-L1 sobre as células gigantes multinucleadas (MNGC) e células positivas de CD3 infiltradas em tecidos tumorais e decréscimo no número de células positivas de CD206, CD163, e CD11b e expressão de PD-L1 sobre as células mononucleares (MNC) por cada um dos tratamento em comparação com o controle de veículo. Por combinação, infiltração de células T positivas de CD3 foi aumentada do que cada monoterapia que tende a estar relacionada às atividades antitumor (Tabela 3). Tabela 3 Legendas da tabela: Tabela 3: avaliações patológicas de tumores tratados - veículo - célula tumoral - infiltração de célula imune em - vasculature - células mono-nuclear - célula gigante multinucleada - fravidade da lesão - muito leve - leve - moderada - acentuada. Exemplo 6 Atividade antitumor em combinação com os anticorpos anti-GPC3 (GC33) e anti-PD-L1 (6E11) em modelo de camundongo singênico usando linhagem de célula Hepa1-6 expressando GPC3 humano

[00426] GC33 de camundongo a 1 mg/kg ou 5 mg/kg foi administrado intravenosamente uma ou três vezes por semana (q7d x 3) a camundongos C57BL/6J com tumores de Hepa1-6/hGPC3 estabeleci-dos. mAb de PD-L1 anticamundongo (clone 6E11, mIgG2A, D265A e N297A; Genentech [WO2015/095418]) a 10 mg/kg intravenosamente uma vez seguido por 5 mg/kg intraperitoneal duas vezes semanalmente (q7d x 3) foram administrados.

[00427] A terapia de combinação aumentou a inibição de crescimento de tumor em comparação com o tratamento com monoterapia (Figura 6A, B). Medições finais dos valores de inibição de crescimento de tumor de 1 mg/kg de mGC33 simples, 5 mg/kg de mGC33 simples, 1 mg/kg de mGC33 q7d x 3, 5 mg/kg mGC33 q7d x 3, 6E11 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 + 1 mg/kg de mGC33 simples, 6E11 q7d x 3 + 5 mg/kg de mGC33 simples, e 6E11 q7d x 3 + 1 mg/kg de mGC33 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 + 5 mg/kg de mGC33 q7d x 3 foram respectivamente de 73%, 84%, 73%, 80%, 88%, 85%, 95%, 88%, e 104%. Um camundon-go no grupo de 5 mg/kg de mGC33 q7d x 3, um camundongo no 1 mg/kg de mGC33 q7d x 3, um camundongo no 5 mg/kg mGC33 sim-ples, dois camundongos no grupo 1 mg/kg de mGC33 simples foram submetidos à eutanase por progressão de tumor. Nenhum dos camun-dongos morreu e nenhuma perda de peso severa foi observada durante o período de administração (Figura 6C).

[00428] A partir do resultado de histopatologia, área de tumor diminuída acompanhante com ou sem gravidade aumentada de necrose foi observada por administração de mGC33, 6E11 e a combinação (Figura 7). Nos grupos 6E11 q7d x 3 + 5 mg/kg mGC33 simples ou q7d x 3, as respostas patológicas completas (pCR; nenhum tecido tumoral na lâmina de histopatologia) foram observadas em um ou dois dos cinco camundongos. Além disso, necrose de tumor com infiltração de cé- lulas imunológicas incluindo macrófagos / células gigantes multinucle- adas foi observada em todos os grupos tratados; a gravidade das le-sões foram da seguinte ordem: mGC33 5 mg/kg simples ou q7d x 3, 6E11 q7d x 3 < mGC33 5mg/kg simples ou q7d x 3 + 6E11 q7d x 3 (Fi-gura 8A). Como mostrado na figura 8B, células positivas de F4/80 ob-servadas na periferia de massa tumoral foram mais abundantes em casos de combinação, em seguida mGC33 ou 6E11 q7d x 3 e veículo nesta ordem (Figura 8B). No veículo, reações positivas de PD-L1 foram principalmente observadas no citoplasma de células tumorais com intensidade fraca. Por outro lado, intensidade (fraca à média) e fre-quências de reações positivas aumentadas de PD-L1 em células imu- nológicas incluindo macrófagos / células gigantes multinucleadas foram observadas em todos os grupos tratados (Figura 8C). Exemplo 7 Indução de células T citotóxicas em modelo de camundongo singênico usando linhagem de célula Hepa1-6 expressando GPC3 humano

[00429] Além da imunidade inata por células NK e macrófago, a in-dução de imunidade adquirida por células T citotóxicas é importante para exterminar células tumorais. Para avaliar a indução de imunidade adquirida nos camundongos tratados, as células T inflitradas em teci-dos tumorais foram avaliadas. Células Hepa1-6 expressando GPC3 humano foram inoculadas subcutaneamente em camundongos C57BL/6J. Uma vez que os tumores palpáveis foram estabelecidos, os camundongos foram alocados em 12 grupos; 3 grupos foram como controle, 3 grupos foram tratados por 5 mg/kg de GC33 de camundongo durante 2 vezes no dia 13 e 20 após inoculação de tumor, 3 grupos foram tratados por 10 mg/kg de 6E11 no dia 13 e 5 mg/kg de 6E11 no dia 20 após inoculação de tumor, ou 3 grupos foram tratados em com-binação com GC33 de camundongo (2 vezes no dia 13 e 20 após ino-culação de tumor) e 6E11 (10 mg/kg de 6E11 no dia 13 e 5 mg/kg de 6E11 no dia 20 após inoculação de tumor). Após 1, 3 e 8 dias a partir da 2a administração, os tecidos tumorais foram isolados e picados. Após digestão por gentleMACS (nome comercial) Octo Dissociator, as células foram lavadas e usadas para a citometria de fluxo para quanti-ficar os linfócitos (TILs) infiltrados de tumor positivos de CD45, CD3ε, CD4 ou CD8.

[00430] Como mostrado na figura 9, em camundongos tratados com GC33 ou 6E11 de camundongo, o aumento de linfócitos positivos de CD45, positivos de CD3ε e linfócitos T positivos de CD8, porém não linfócitos positivos de CD4 foram observados. Igual às atividades anti-tumor descritas acima, em combinação com GC33 e 6E11 de camun-dongo, indução mais forte de linfócitos incluindo TILs positivos de CD8 é observada em cada monoterapia.

Aplicabilidade Industrial

[00431] A presente invenção contribui para a melhora da eficácia de um antagonista de ligação de eixo PD-1 ou um anticorpo anti-GPC3 combinando um com o outro e melhora em QOL de um paciente a ser tratado, e é útil no tratamento de câncer incluindo câncer hepático.

Claims

1. Uso de um antagonista de ligação de eixo PD-1 e/ou an-ticorpo anti-GPC3, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição ou medicamento para o tratamento ou retardo de progres-são de câncer em um indivíduo.

2. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição ou medicamento compreendendo um antagonista de liga-ção de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e um folheto de embalagem compreendendo instruções para administra-ção do medicamento em combinação com uma composição compre-endendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente acei-tável opcional para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo.

3. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma pri-meira composição ou medicamento compreendendo um antagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e uma segunda composição ou medicamento compreendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, opcionalmente compreende ainda um folheto de embalagem compreendendo instruções para administração do primeiro medica-mento e do segundo medicamento para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo.

4. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição ou medicamento compreendendo um anticorpo anti-GPC3 e o veículo farmaceuticamente aceitável opcional, e um folheto de em-balagem compreendendo instruções para administração do medica-mento em combinação com uma composição compreendendo um an-tagonista de ligação de eixo PD-1 e o veículo farmaceuticamente acei-tável opcional para o tratamento ou retardo de progressão de câncer em um indivíduo.