BR122024000360A2

BR122024000360A2 - Molécula de ácido nucleico, população de células t humanas transduzidas por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico e seu uso

Info

Publication number: BR122024000360A2
Application number: BR122024000360-0A
Authority: BR
Inventors: Christine E. Brown; Stephen J. Forman
Original assignee: City Of Hope
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2024-02-27
Also published as: WO2016044853A1; MX2017003557A; JP2017529081A; MX2021012720A; IL251196A0; JP7171871B2; IL251196B; WO2016044811A1; IL280576B; JP2020156494A; AU2020203651A1; US20160340649A1; HK1247046A1; RU2017111298A; CA2961676A1; ES2738705T3; ES2876235T3; RU2017111300A3; US20200318069A1; IL292650B1

Abstract

molécula de ácido nucleico, população de células t humanas transduzidas por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico e seu uso. são descritos imunorreceptores transmembrana quiméricos (car) que incluem um domínio extracelular que inclui il-13 ou uma variante desta que se liga à interleucina-13r(alfa)2 (il13r(alfa)2), uma região transmembrana, um domínio coestimulador e um domínio de sinalização intracelular.

Description

FUNDAMENTOS

[001] Imunoterapias à base de célula T tumor- específicas, incluindo terapias que empregam células T modificadas geneticamente, foram investigadas para tratamento antitumoral. Em alguns casos, as células T usadas nessas terapias não permanecem ativas in vivo por um período suficientemente longo. Em alguns casos, a especificidade tumoral das células T é relativamente baixa. Portanto, há uma necessidade na técnica por terapias anticâncer tumor- específicas com funcionamento antitumoral por prazo mais longo.

[002] Gliomas malignos (MG), que incluem astrocitoma anaplásico (AA-grau III) e glioblastoma (GBM-grau IV), possuem uma taxa de incidência de aproximadamente 20.000 novos casos diagnosticados anualmente nos Estados Unidos. De acordo com a “American Brain Tumor Association”, a prevalência total de indivíduos que vivem com um tumor cerebral maligno, com base em dados do senso dos Estados Unidos de 2010, é de aproximadamente 140.000 pessoas. Embora o MG seja uma doença rara, ele é altamente agressivo e heterogêneo com relação ao seu comportamento maligno e quase uniformemente letal. As terapias-padrão atuais para MG de alto grau geram benefícios apenas de curto prazo, e esses tumores cerebrais são praticamente incuráveis. Na verdade, até mesmo com as técnicas cirúrgicas e radioterapêuticas modernas, que freqüentemente exacerbam as morbidades já severas impostas pela localização no sistema nervoso central (SNC), as taxas de sobrevida em 5 anos são bem baixas. Além disso, para a maioria dos pacientes que apresentam recidiva da doença, há poucas opções terapêuticas. Dessa forma, há uma necessidade significante por terapias mais eficazes, particularmente para aqueles pacientes que apresentaram recorrência/progrediram após terapias de primeira linha, e a participação dessa população de pacientes em experimentos clínicos é justificada.

[003] A terapia com célula T adotiva (ACT) que utiliza células T modificadas geneticamente com receptor de antígeno quimérico (CAR) pode fornecer uma forma segura e eficaz para reduzir as taxas de recorrência de MG, na medida em que células T com CAR podem ser modificadas geneticamente para reconhecer especificamente populações tumorais antigenicamente distintas (Cartellieri e cols. 2010 J. Biomed. Biotechnol. 2010: 956304; Ahmed e cols. 2010 Clin. Cancer Res. 16: 474; Sampson e cols. 2014 Clin. Cancer Res. 20: 972; Brown e cols. 2013 Clin. Cancer Res. 2012 18: 2.199; Chow e cols. 2013 Mol. Ther. 21: 629), e células T podem migrar através do parênquima cerebral para visar e matar células malignas infiltrantes (Hong e cols. 2010 Clin. Cancer Res. 16: 4.892; Brown e cols. 2007 J. Immunol. 179: 3.332; Hong e cols. 2010 Clin. Cancer Res. 16: 4.892; Yaghoubi 2009 Nat. Clin. Pract. Oncol. 6: 53). Estudos pré-clínicos demonstraram que células T CAR+ direcionadas à IL13Rα2 exibem atividade citolítica IL13Ra2-específica complexo de histocompatibilidade principal (MHC)-independente potente, contra células de glioma tanto estaminais quanto diferenciadas, e induzem regressão de xenoenxertos estabelecidos de glioma in vivo (Kahlon e cols. 2004 Cancer Res. 64: 9.160; Brown e cols. 2012 Clin. Cancer Res. 18: 2.199).

SUMÁRIO

[004] São descritos nesse relatório descritivo imunorreceptores transmembrana quiméricos (receptores de antígeno quimérico ou “CARs”) que compreendem um domínio extracelular, uma região transmembrana e um domínio de sinalização intracelular. O domínio extracelular é constituído por um ligante de IL-13 que se liga à interleucina-13Rα2 (IL13Rα2) e, opcionalmente, um espaçador, que compreende, por exemplo, uma porção de domínio Fc humano. A porção transmembrana inclui um domínio transmembrana CD4, um domínio transmembrana CD8, um domínio transmembrana CD28, um domínio transmembrana CD3 ou um domínio transmembrana de 4-1BB. O domínio de sinalização intracelular inclui o domínio de sinalização da cadeia zeta do complexo CD3 humano (CD3Z) e um ou mais domínios coestimuladores, por exemplo, um domínio coestimulador 4-1BB. O domínio extracelular permite que o CAR, quando expresso na superfície de uma célula T, dirija a atividade da célula T àquelas células que expressam IL13Rα2, um receptor expresso na superfície de células tumorais, incluindo glioma. Notavelmente, a porção de ligação de IL13Rα2 do CAR inclui uma modificação de aminoácido, por exemplo, uma mutação E13Y, que aumenta a especificidade de ligação. A inclusão de um domínio coestimulador, por exemplo, o domínio coestimulador de 4-1BB (CD137) em série com CD3Z na região intracelular permite que a célula T receba sinais coestimuladores. Células T, por exemplo, células T autólogas, paciente-específicas, podem ser modificadas geneticamente para expressar os CARs descritos nesse relatório descritivo e as células modificadas geneticamente podem ser expandidas e usadas em ACT. Vários subconjuntos de células T podem ser usados. Além disso, o CAR pode ser expresso em outras células imunes como, por exemplo, células NK. Quando um paciente é tratado com uma célula imune que expressa um CAR descrito nesse relatório descritivo, a célula pode ser uma célula T autóloga ou alogênica. Em alguns casos, as células usadas são células T de memória central (TCM) CD4+ e CD8+, que são CD45RO+CD62L+, e o uso dessas células pode aumentar a persistência de longo prazo das células após transferência adotiva, comparado com o uso de outros tipos de células T paciente-específicas.

[005] É descrita nesse relatório descritivo uma molécula de ácido nucléico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR)r, em que o receptor de antígeno quimérico compreende: IL-13 humana ou uma variante desta que possui 110 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos; um domínio transmembrana selecionado de: um domínio transmembrana CD4 ou variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD8 ou variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos, e um domínio transmembrana CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos; um domínio coestimulador; e domínio de sinalização de CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos.

[006] Em várias modalidades, o domínio coestimulador é selecionado do grupo que consiste em: um domínio coestimulador de CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos, um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante deste que possui 110 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos e um domínio coestimulador de OX40 ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos. Em certas modalidades, um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos está presente.

[007] Em uma modalidade adicional, o CAR compreende: uma variante de uma IL-13 humana que possui 1-10 modificações de aminoácidos que aumentam a especificidade de ligação para IL13Rα2 versus IL13Rα1; a IL-13 humana ou variante desta é uma variante de IL-13 que compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 3 com 1 a 5 modificações de aminoácidos, desde que o aminoácido na posição 11 do SEQ ID N°: 3 seja diferente de E; dois domínios coestimuladores diferentes selecionados do grupo que consiste em: um domínio coestimulador de CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos, um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante deste que possui 110 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos e um domínio coestimulador de OX40 ou uma variante deste que possui 1-10 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos; dois domínios coestimuladores diferentes selecionados do grupo que consiste em: um domínio coestimulador de CD28 ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, um domínio coestimulador de 4- 1BB ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos e um domínio coestimulador de OX40 ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos; IL-13 humana ou uma variante desta que possui 1-2 modificações de aminoácidos; um domínio transmembrana selecionado de: um domínio transmembrana CD4 ou variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD8 ou variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD28 ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, e um domínio transmembrana CD3Z ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos; um domínio coestimulador; e domínio de sinalização de CD3Z ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos; uma região espaçadora localizada entre a IL-13 ou variante desta e o domínio transmembrana (por exemplo, a região espaçadora compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no SEQ ID N°: 4, 14-20, 50 e 52); o espaçador compreende uma região de dobradiça de IgG; a região espaçadora compreende 10-150 aminoácidos; o domínio de sinalização de 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 6; o domínio de sinalização de CD3Z compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 7; e um vinculador de 3 a 15 aminoácidos que está localizado entre o domínio coestimulador e o domínio de sinalização de CD3Z ou variante deste. Em certas modalidades nas quais há dois domínios coestimuladores, um é um domínio coestimulador de 4-1BB e o outro um domínio coestimulador selecionado de: CD28 e CD28gg.

[008] Em algumas modalidades: a molécula de ácido nucléico expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 3148 e 52; o receptor de antígeno quimérico compreende uma região de IL-13/IgG4/CD4t/41-BB que compreende o aminoácido do SEQ ID N°: 11 e um domínio de sinalização de CD3Z que compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 7; e o receptor de antígeno quimérico compreende a sequência de aminoácidos dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

[009] Também é revelada uma população de células T humanas transduzidas por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que receptor de antígeno quimérico compreende: IL-13 humana ou uma variante desta que possui 1-10 modificações de aminoácidos; um domínio transmembrana selecionado de: um domínio transmembrana CD4 ou variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD8 ou variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, e um domínio transmembrana CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos; um domínio coestimulador; e domínio de sinalização de CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos. Em várias modalidades: a população de células T humanas compreende um vetor que expressa um receptor de antígeno quimérico que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52; a população de células T humanas é composta por células T de memória central (células TCM) (por exemplo, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% das células são células TCM; pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% das células TCM são CD4+ e pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% das células TCM são células CD8+).

[0010] Também é descrito um método de tratamento de câncer em um paciente que compreende a administração de uma população de células T humanas autólogas ou alogênicas (por exemplo, células T autólogas ou alogênicas que compreendem células TCM, por exemplo, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% das células são células TCM; pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% das células TCM são CD4+ e pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% das células TCM são células CD8+) transduzidas por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52. Em várias modalidades: a população de células T humanas compreende células T de memória central; o câncer é glioblastoma; e as células T humanas transduzidas foram preparadas por um método que compreende a obtenção de células T do paciente, o tratamento das células T para isolar células T de memória central, e transdução de pelo menos uma porção das células de memória central com um vetor viral que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

[0011] Também é descrita uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10 e dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52; uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10, 31-48 e 52, exceto pela presença de no máximo 5 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos; uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10 e dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52, exceto pela presença de no máximo 5 substituições de aminoácidos; e uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10 e dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52, exceto pela presença de no máximo 2 substituições de aminoácidos.

[0012] Certos CARs descritos nesse relatório descritivo, por exemplo, o CAR IL13(EQ)BBZ e o CAR IL13(EQ)CD28-BBZ, possuem certas características benéficas, comparados com alguns outros CARs direcionados à IL13. Por exemplo, eles possuem seletividade aumentada para IL13Rα, despertam menos produção de citocina Th2, particularmente menos produção de IL13.

[0013] Células T que expressam um CAR direcionado à IL13Rα2 podem ser úteis no tratamento de cânceres como, por exemplo, glioblastoma, além de outros cânceres que expressam IL13Rα2 que incluem, sem limitação, meduloblastoma, câncer de mama, câncer da cabeça e pescoço, câncer do rim, câncer ovariano e sarcoma de Kaposi. Dessa forma, essa revelação inclui métodos para o tratamento de câncer usando células T que expressam um CAR descrito nesse relatório descritivo.

[0014] Essa revelação também inclui moléculas de ácido nucléico que codificam qualquer um dos CARs descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, vetores que incluem uma sequência de ácidos nucléicos que codifica um dos CARs) e linfócitos T isolados que expressam qualquer um dos CARs descritos nesse relatório descritivo.

[0015] O CAR descrito nesse relatório descritivo pode incluir uma região espaçadora localizada entre o domínio IL13 e o domínio transmembrana. Diversos espaçadores diferentes podem ser usados. Alguns deles incluem pelo menos uma porção de uma região Fc humana, por exemplo, uma porção de dobradiça de uma região Fc humana ou um domínio CH3 ou variantes deste. A Tabela 1 abaixo fornece vários espaçadores que podem ser usados nos CARs descritos nesse relatório descritivo. Tabela 1: Exemplos de espaçadores.

[0016] Algumas regiões espaçadoras incluem toda ou parte de uma região de dobradiça de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), ou seja, a sequência que cai entre os domínios CH1 e CH2 de uma imunoglobulina, por exemplo, uma dobradiça de Fc de IgG4 ou uma dobradiça de CD8. Algumas regiões espaçadoras incluem um domínio CH3 de imunoglobulina, ou tanto um domínio CH3 quanto um domínio CH2. As sequências derivadas de imunoglobulina podem incluir uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, por exemplo, substituições que reduzem a ligação fora do alvo.

[0017] Uma “modificação de aminoácido” se refere a uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de proteína ou peptídeo. Uma “substituição de aminoácido” ou “substituição” se refere à troca de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de peptídeo ou proteína parental com outro aminoácido. Uma substituição pode ser feita para alterar um aminoácido na proteína resultante de forma não conservadora (ou seja, por alteração do códon de um aminoácido que pertence a um agrupamento de aminoácidos que possui um tamanho ou característica particular por um aminoácido que pertence a outro agrupamento) ou de forma conservadora (ou seja, por alteração do códon de um aminoácido que pertence a um agrupamento de aminoácidos que possui um tamanho ou característica particular por um aminoácido que pertence ao mesmo agrupamento). Essa alteração conservadora geralmente leva a menos alteração na estrutura e função da proteína resultante. A seguir serão mostrados exemplos de vários agrupamentos de aminoácidos: 1) Aminoácidos com grupos R não polares: Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofano, Metionina; 2) Aminoácidos com grupos R polares sem carga: Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina; 3) Aminoácidos com grupos R polares com carga (carregados negativamente em pH 6,0): Ácido aspártico, ácido glutâmico; 4) Aminoácidos básicos (carregados positivamente em pH 6,0): Lisina, Arginina, Histidina (em pH 6,0). Outro agrupamento pode consistir nos aminoácidos com grupos fenil: Fenilalanina, Triptofano e Tirosina.

[0018] Em certas modalidades, o espaçador é derivado de uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos substituídos com um resíduo de aminoácido diferente daquele presente em um espaçador não modificado. Os (um ou mais) resíduos de aminoácidos substituídos são selecionados, sem limitação, de um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, ou uma combinação destas. Nesse esquema de numeração, descrito com mais detalhes abaixo, o primeiro aminoácido no espaçador de IgG4 (L235E, N297Q) na Tabela 1 é 219 e o primeiro aminoácido no espaçador de IgG4 (HL-CH3) na Tabela 1 é 219, assim como o primeiro aminoácido na sequência de dobradiça de IgG e na sequência do vinculador de dobradiça de IgG4 (HL) na Tabela 1.

[0019] Em algumas modalidades, o espaçador modificado é derivado de uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 que inclui, sem limitação, um a ou mais das seguintes substituições de resíduos de aminoácidos: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, E233P, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, T299A, Y300L, V305I, V309L, E318A, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, A339Q, P331S, P396L, I332E, ou uma E333A, E333S, E333S, combinação destas. K334A, A339D,

[0020] Em certas modalidades, o espaçador modificado é derivado da região de IgG4 que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos substituídos com um resíduo de aminoácido diferente daquele presente em uma região não modificada. Os (um ou mais) resíduos de aminoácidos substituídos são selecionados, sem limitação, de um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, ou uma combinação destas.

[0021] Em algumas modalidades, o espaçador modificado é derivado de uma região de IgG4 que inclui, sem limitação, uma ou mais das seguintes substituições de resíduos de aminoácidos: 220S, 226S, 228P, 229S, 230S, 233P, 234A, 234V, 234F, 234A, 235A, 235E, 236A, 237A, 238S, 239D, 243L, 247I, 267E, 268Q, 280H, 290S, 290E, 290N, 292P, 297A, 297Q, 298A, 298G, 298D, 298V, 299A, 300L, 305I, 309L, 318A, 326A, 326W, 326E, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332E, 333A, 333S, 333S, 334A, 339D, 339Q, 396L, ou uma combinação destes, em que o aminoácido no espaçador não modificado é substituído com os aminoácidos identificados acima na posição indicada.

[0022] Para posições de aminoácidos em imunoglobulina discutidas nesse relatório descritivo, a numeração é de acordo com o índice de EU ou esquema de numeração de EU (Kabat e cols. 1991 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a Edição, “United States Public Health Service”, “National Institutes of Health”, Bethesda, inteiramente incorporado nesse relatório descritivo por referência). O índice de EU ou índice de EU como em Kabat ou no esquema de numeração de EU se refere à numeração do anticorpo EU (Edelman e cols. 1969 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 63 :78-85).

[0023] Diversos domínios transmembrana podem ser usados em CAR dirigido contra IL13Rα2. A Tabela 2 inclui exemplos de domínios transmembrana adequados. Quando um domínio espaçador está presente, o domínio transmembrana está localizado no terminal carbóxi em relação ao domínio espaçador. Tabela 2: Exemplos de domínios transmembrana.

[0024] Muitos dos CARs descritos nesse relatório descritivo incluem um ou mais (por exemplo, dois) domínios coestimuladores. O domínio coestimulador (ou domínios coestimuladores) está localizado entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização de CD3Z. A Tabela 3 inclui exemplos de domínios coestimuladores adequados em conjunto com a sequência do domínio de sinalização de CD3Z. Tabela 3: Exemplos de domínios coestimuladores.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A Figura 1 é uma representação esquemática de IL13(E13Y)-zetacina CAR (Esquerda) composto por porções de variante de IL-13 humana IL13Rα2-especifica (huIL-13(E13Y)), espaçador de Fc de IgG4 humana (huY4Fc) , CD4 humana transmembrana (huCD4 tm) e cadeia CD3Z humana citoplasmática (huCD3Z cyt), como indicado. Também é representado um IL13(EQ)BBZ CAR, que é o mesmo que IL13(E13Y)-zetacina, com a exceção das duas mutações pontuais, L235E e N297Q, indicadas em vermelho, que estão localizadas no domínio CH2 do espaçador de IgG4, e a adição de um domínio 4-1BB citoplasmático coestimulador (4-1BB cyt).

[0026] As Figuras 2A-C retratam certos vetores com quadros de leitura aberta. A é um diagrama do quadro de leitura aberta de cDNA da construção de 2.670 nucleotídeos IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t, em que a ligante IL13Ra2-específico IL13(E13Y), dobradiça de Fc de IgG4(EQ), CD4 transmembrana, sinalização citoplasmática de 4-1BB, vinculador de três glicinas e domínios de sinalização citoplasmática de CD3Z do CAR IL13(EQ)BBZ, bem como as sequências de skip de ribossomo T2A e de CD19 truncada, são indicados. O receptor alfa de GM-CSF humano e sequências sinalizadoras de CD19 que dirigem a expressão de superfície do IL13(EQ)BBZ CAR e CD19t também são indicados. B é um diagrama das sequências flanqueadas por repetições terminais longas (indicadas por ‘R’) que se integrarão no genoma do hospedeiro. C é um mapa do plasmídeo IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.

[0027] A Figura 3 retrata a construção de pHIV7.

[0028] A Figura 4 retrata os elementos de pHIV7.

[0029] A Figura 5 retrata um esquema de produção para TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+.

[0030] As Figuras 6A-C retratam os resultados de análise citométrica de fluxo da expressão de superfície do marcador de transgene e de célula T. TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram coradas simultaneamente com anti- IL13-PE e anti-CD8-FITC para detectar células CD8+ CAR+ e CD4+ (ou seja, CD8 negativas) CAR+ (A), ou anti-CD19-PE e anti-CD4-FITC para detectar células CD4+ CD19t+ e CD8+ (ou seja, CD4 negativas) CAR+ (B) . TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+ HD006.5 e HD187.1 coradas com anti-CD3 flúor-cromo-conjugado, TCR, cD4, cD8, cD62L e cD28 (histogramas cinzas) ou controles de isótipo (histogramas pretos) (C). Em todos os casos, as percentagens se basearam em linfócitos viáveis (DAPI- negativos) corados do isótipo acima.

[0031] As Figuras 7A-B retratam a caracterização funcional in vitro da função efetora IL13Ra2-específica de TcM IL13(EQ)BBZ+. TcM IL13(EQ)BBZ/cD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram usadas como efetores em um ensaio de liberação de 51cr de 6 horas usando uma proporção E:T de 10:1 com base na expressão de cD19t. Os alvos tumorais IL13Rα2-positivos foram K562 modificado geneticamente para expressar IL13Rα2 (K562-IL13Rα2) e linhagem primária de glioma PBT030-2, e o controle de alvo tumoral IL13Rα2-negativo foi linhagem parental de K562 (A).

[0032] TcM IL13(EQ)BBZ/cD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram avaliadas quanto à produção de citocina antígeno-dependente após cocultura de um dia para o outro em uma proporção E:T de 10:1 com alvos IL13Rα2-positivos e -negativos. Os níveis de citocina foram medidos usando o kit de ensaio de citocina humana TH1/TH2 “Bio-Plex Pro” e de IFN-Y são relatados (B).

[0033] As Figuras 8A-C retratam o resultado de estudos que demonstram a regressão de xenoenxertos estabelecidos tumorais de glioma após transferência adotiva de TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+. Células tumorais EGFP-ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) foram implantadas de forma estereotática no prosencéfalo direito de camundongos NSG. No Dia 5, os camundongos receberam 2 x 106 TCM IL13(EQ) BBZ/CD19t+ (1,1 x 106 CAR+; n=6), 2 x 106 TCM simulado (sem CAR; n=6) ou PBS (n=6). Camundongos representativos de cada grupo que exibem carga tumoral relativa usando “Xenogen Living Image” (A). Quantificação de fluxo de ffLuc (fótons/segundo) mostra que TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+ induzem regressão do tumor, comparadas com TCM com transdução simulada e PBS (#p<0,02, *p<0,001, ANOVA de medições repetidas) (B). curva de sobrevida de Kaplan-Meier (n=6 por grupo) que demonstra sobrevida significantemente aumentada (p=0,0008; teste de log-rank) para camundongos tratados com TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+ (C) .

[0034] As Figuras 9A-C retratam os resultados de estudos que comparam eficácia antitumoral de clones de cTL IL13(EQ)BBZ TcM e IL13-zetacina. TSs EGFP-ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) foram implantadas de forma estereotática no prosencéfalo direito de camundongos NSG. No Dia 8, os camundongos receberam 1,6 x 106 TcM simulado (sem cAR), 1,0 x 106 CAR+ IL13(EQ)BBZ TCM (1,6 x 106 células T totais; 63% de cAR), 1,0 x 106 cTL IL13-zetacina cD8+ cl. 2D7 (cAR+ clonal), ou nenhum tratamento (n=6 por grupo). Camundongos representativos de cada grupo que exibem carga tumoral relativa usando “Xenogen Living Image” (A). Linhas de regressão linear de log natural do fluxo de ffLuc (fótons/segundo) ao longo do tempo, valores-P são para comparações de interação de grupo por tempo (B). A análise de sobrevida de Kaplan-Meier (n= 6 por grupo) demonstra sobrevida significantemente aumentada (p=0,02; teste de logrank) para camundongos tratados com IL13(EQ)BBZ TCM, comparado com CTL IL13-zetacina CD8+ cl. 2D7 (C).

[0035] As Figuras 10A-C retratam os resultados de estudos que comparam a eficácia antitumoral de clones de CTL IL13(EQ)BBZ TCM e IL13-zetacina. TSs EGFP-ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) foram implantadas de forma estereotática no prosencéfalo direito de camundongos NSG. No Dia 8, os camundongos receberam 1,3 x 106 TCM simulado (sem CAR; n=6), 1,0, 0,3 ou 0,1 x 106 CAR+ IL13(EQ)BBC TCM (78% de CAR+; n=6- 7), 1,0, 0,3 ou 0,1 x 106 CTL IL13-zetacina CD8+ cl. 2D7 (CAR+ clonal; n=6-7), ou nenhum tratamento (n=5). O imageamento por “Xenogen” de camundongos representativos de cada grupo que exibem carga tumoral relativa (A). Linhas de regressão linear de log natural do fluxo de ffLuc (fótons/segundo) mostra que IL13(EQ)BBZ TCM obteve regressão superior do tumor, comparado com de primeira geração de CTL IL13-zetacina cl. 2D7, TcM simulado e apenas tumor (B). O fluxo médio por grupo no Dia 27 pós-injeção tumoral demonstrando que a dose de 0,1 x 106 IL13(EQ)BBZ TCM supera a dose dez vezes maior de 1,0 x 106 cTL IL13-zetacina cD8+ cl. 2D7 (p = 0,043; teste-t de Welch de duas amostras) (C).

[0036] A Figura 11 retrata os resultados de estudos que demonstram que clones de CTL TCM IL13(EQ)BBZ exibem persistência aumentada comparados com clones de CTL IL13- zetacina. Imunoistoquímica de CD3 que avalia persistência de célula T no local tumoral de 7 dias pós-infusão de célula T. Números significantes de células T são detectados para TCM IL13(EQ)BBZ (painel superior). Em contraste, muito poucas células T CD3+ IL13-zetacina viáveis são detectadas (painel inferior).

[0037] As Figuras 12A-D retratam os resultados de experimentos que comparam via de liberação célula T CAR+ (ou seja, versus i.v.) para grandes tumores estabelecidos. TSs EGFP-ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) foram implantadas no prosencéfalo direito de camundongos NSG. Nos Dias 19 e 26, os camundongos foram injetados i.v. através da veia da cauda com 5 x 106 TCM IL13(EQ)BBZ+ CAR+ (11,8 x 106 células totais; n=4), ou TCM simulado (11,8 x 106 células; n=4). Alternativamente, nos Dias 19, 22, 26 e 29 os camundongos foram injetados i.c. com 1 x 106 TCM IL13(EQ)BBZ+ CAR+ (2,4 x 106 células totais; n=4) ou TcM simulado (2,4 x 106 células; n=5). O fluxo médio de ffLuc (fótons/segundo) ao longo do tempo mostra que TCM IL13(EQ)BBZ liberadas i.c. medeiam a regressão do tumor de tumores de 19 dias. Por comparação, células T liberadas i.v. nos mostraram redução na carga tumoral, comparadas com controles não tratados ou TcM simulado (A). A curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstra sobrevida aumentada para camundongos tratados i.c. com TcM IL13(EQ)BBZ, comparados com camundongos tratados com TcM cAR+ administradas i.v. (p = 0,0003, teste de log rank) (B). IHc representativa de H&E e cD3 de camundongos tratados i.v. (C) versus i.c. (D) com TcM IL13(EQ)BBZ+. células T cD3+ só foram detectadas no grupo tratado i.c., sem células CD3+ detectadas no tumor ou parênquima cerebral circundante para camundongos tratados i.v.

[0038] As Figuras 13A-B retratam os resultados de estudos que mostram que células T CAR+ injetadas por via intracraniana, intratumoral (i.c.t.) ou intraventricular (i.c.v.), podem se dirigir a tumores no hemisfério oposto. TSs EGFP-ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) foram implantadas de forma estereotática nos prosencéfalos direito e esquerdo de camundongos NSG. No Dia 6, os camundongos foram injetados i.c. no local tumoral direito com 1,0 x 106 TCM IL13(EQ)BBZ + (1,6 x 106 células totais; 63% de CAR; n=4). Representação esquemática de modelo experimental de glioma multifocal (A). IHC de CD3 que mostra células T se infiltrando em ambos os locais tumorais, direito e esquerdo (B).

[0039] As Figuras 14A-C retratam os resultados de uma série de estudos que avaliam domínios coestimuladores de CAR IL13Rα2-especifico. Representação esquemática de construções de CAR IL13Ra2-específico que compara vários domínios intracelulares endo/de sinalização, incluindo o CAR de CD3z de primeira geração desprovido de coestimulação, versus CARs de segunda geração que incorporam 4-1BB ou CD28, versus um CAR de terceira geração que contém tanto CD28 quanto 41BB. Todos os cassetes de CAR também contêm as sequências de skip ribossômico T2A e de CD19 truncada (CD19t) como um marcador para células transduzidas (A). CD4 e CD8 TCM foram transduzidos de forma lentiviral e células T que expressam CAR foram imunomagneticamente enriquecidas por meio de anti- CD19. Os níveis de expressão de CD19 e IL13 (ou seja, de CAR) como medidos por citometria de fluxo (B). A estabilidade de cada construção de CAR foi determinada por divisão da intensidade de fluorescência média de CAR (IL13) (MFI) por aquela do marcador de transdução (CD19t) (C). Os CARs que contêm 4-1BB demonstraram os menores níveis de expressão, comparados com o marcador de transdução CD19t.

[0040] As Figuras 15A-B retratam os resultados de estudos que demonstram que CAR IL13Ra2-específico contendo o domínio coestimulador de 4-1BB produz menos citocinas Th1 e Th2. A habilidade das células T com transdução simulada ou que expressam CAR indicadas para matar alvos de células tumorais PBT030-2 que expressam IL13Rα2 foi determinada em um ensaio de liberação de 51Cr de 4 horas nas proporções efetor/alvo indicadas. O % médio de liberação de cromo ± D.P. de poços em triplicata é revelado (A). Como esperado, células T com transdução simulada não lisaram eficientemente os alvos. Em contraste, todas as células T que expressam CAR lisaram as células tumorais de modo similar. As células T com transdução simulada ou que expressam CAR indicadas foram cocultivadas de um dia para o outro com células tumorais PBT030-2 que expressam IL13Rα2 em uma proporção de 10:1 e os sobrenadantes foram analisados quanto aos níveis de IL-13 e IFN-Y por arranjo citométrica de microesferas (B). Médias ± D.P. de poços em triplicata são reveladas. Curiosamente, células T que expressam os CARs zeta, 41BB-zeta ou CD28- 41BB-zeta exibiram menor produção de citocina estimulada por antígeno do que células T que expressam o CAR CD28-zeta.

[0041] As Figuras 16A-C retratam os resultados de uma série de estudos da eficácia in vivo de CARs IL13Rα2- específicos. Camundongos NSG receberam uma injeção intracraniana de células tumorais PBT030-2 ffLuc+ no Dia 0, e foram randomizados em 6 grupos (n = 9-10 camundongos por grupo) para tratamento i.c. com PBS (somente tumor), células T com transdução simulada ou células T que expressam o CAR IL13Ra2-específico indicado no Dia 8. Imageamento por bioluminescência quantitativa foi então realizado para monitorar o crescimento tumoral ao longo do tempo. Imagens de bioluminescência para camundongos representativos em cada grupo (A). Média ± S.E. de níveis de fluxo total de atividade de luciferase ao longo do tempo em cada grupo (B). Níveis de fluxo para cada camundongo no Dia 27. Todos os grupos tratados com células T com CAR IL13Ra2-específico, exceto aqueles tratados com células T que expressam o CD28-CAR, mostram redução estatisticamente significante no volume do tumor, comparados com camundongos tratados com células T com transdução simulada (C).

[0042] A Figura 17 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EQ)BBZ/CD19t+ (SEQ ID N°: 10).

[0043] A Figura 18 retrata uma comparação de sequências de IL13(EQ)41BBZ[IL13{EQ}41BBZ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID N°: 12) e CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID N°: 13).

[0044] A Figura 19 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm2-41BB Zeta (SEQ ID N°: 31 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 39 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0045] A Figura 20 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-CD8h3-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 32 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 40 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0046] A Figura 21 retrata A sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-IgG4 (HL-CH3)-CD4tm-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 33 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 41 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0047] A Figura 22 retrata A sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-IgG4 (L235E, N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 34 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 42 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0048] A Figura 23 retrata A sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-Vinculador-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 35 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 43 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0049] A Figura 24 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-HL-CD28m-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 36 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 44 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0050] A Figura 25 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-IgG4 (HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 37 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 45 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0051] A Figura 26 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EmY) IgG4 (L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID N°: 38 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 46 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

[0052] A Figura 27 retrata a sequência de aminoácidos de IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm-41BB Zeta (SEQ ID N°: 47 com peptídeo sinalizador GMSCFRa; SEQ ID N°: 48 sem peptídeo sinalizador GMSCFRa).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0053] São descritas abaixo a estrutura, construção e caracterização de vários receptores de antígeno quimérico IL13Rα2-especificos. Um antígeno quimérico (CAR) é uma biomolécula recombinante que contém, no mínimo, um domínio de reconhecimento extracelular, uma região transmembrana e um domínio de sinalização intracelular. O termo “antígeno”, portanto, não está limitado às moléculas que se ligam a anticorpos, mas a qualquer molécula que possa se ligar especificamente a um alvo. Por exemplo, um CAR pode incluir um ligante que se liga especificamente a um receptor da superfície celular. O domínio de reconhecimento extracelular (também denominado o domínio extracelular ou simplesmente pelo elemento de reconhecimento que ele contém) compreende um elemento de reconhecimento que se liga especificamente a uma molécula presente na superfície celular de uma célula- alvo. A região transmembrana ancora o CAR na membrana. O domínio de sinalização intracelular compreende o domínio de sinalização da cadeia zeta do complexo CD3 humano e opcionalmente compreende um ou mais domínios coestimuladores de sinalização. CARs podem tanto se ligar ao antígeno quanto transduzir a ativação de célula T, independente da restrição de MHC. Dessa forma, CARs são imunorreceptores “universais” que podem tratar uma população de pacientes com tumores antígeno-positivos, independentemente de seu genótipo de HLA. A imunoterapia adotiva usando linfócitos T que expressam um CAR tumor-específico pode ser uma estratégia terapêutica poderosa para o tratamento de câncer.

[0054] Um CAR IL13Ra2-específico descrito nesse relatório descritivo é denominado IL13(EQ)BBZ. Esse CAR inclui diversas características importantes, incluindo: um ligante de IL13α2 que possui uma alteração de aminoácido que aumenta a especificidade de ligação à IL13α2; o domínio de CD137 (4-1BB) em série com CD3Z para fornecer coestimulação benéfica; e uma região de Fc de IgG4 que é mutada em dois sítios dentro da região CH2 (L235E; N297Q) de uma forma que reduz a ligação por receptores Fc (FcRs). Outro CAR descrito nesse relatório descritivo contém um segundo domínio coestimulador.

[0055] Em alguns casos, o CAR descrito nesse relatório descritivo, incluindo o CAR IL13(EQ)BBZ, pode ser produzido usando um vetor no qual o quadro de leitura aberta do CAR é seguido por uma sequência de skip de ribossomo T2A e uma CD19 truncada (CD19t), que não possui a cauda de sinalização citoplasmática (truncada no aminoácido 323). Nesse arranjo, a co-expressão de CD19t fornece um marcador de superfície não imunogênico, inerte, que permite a medição precisa de células com genes modificados, e permite a seleção positiva de células com genes modificados, bem como o tráfego eficiente de células e/ou imageamento das células T terapêuticas in vivo após transferência adotiva. A co- expressão de CD19t fornece um marcador para direcionamento imunológico das células transduzidas in vivo usando anticorpos e/ou reagentes de imunotoxinas clinicamente disponíveis para deletar seletivamente as células terapêuticas e, dessa forma, o funcionamento como um interruptor de suicídio.

[0056] Gliomas expressam receptores de IL-13 e, em particular, receptores de IL-13 de alta afinidade. No entanto, ao contrário do receptor de IL-13, as células de glioma superexpressam uma cadeia IL13Rα2 única capaz de ligação à IL13 independentemente da necessidade de IL4Rβ ou Yc44. Como seu homólogo IL4, IL13 possui atividade imunorreguladora pleiotrópica fora do SNC. Tanto IL13 quanto IL4 estimulam a produção de IgE por linfócitos B e suprimem a produção de citocina pró-inflamatórias por macrófagos.

[0057] Estudos detalhados usando autorradiografia com IL13 radiomarcada demonstraram ligação de IL13 abundante em quase todos os tecidos de glioma maligno estudados. Essa ligação é altamente homogênea dentro dos cortes do tumor e em análise de célula única. No entanto, a análise de sonda molecular específica para mRNA de IL13Rα2 não detectou a expressão do receptor glioma-específico por elementos cerebrais normais, e a autorradiografia com IL13 radiomarcada também não pode detectar a ligação específica de IL13 no SNC normal. Esses estudos sugerem que o receptor de IL13Rα1/IL4β/Yc compartilhado não é expresso de forma detectável no SNC normal. Portanto, IL13Rα2 é um alvo muito específico da superfície celular para o glioma e é um alvo adequado para um CAR projetado para o tratamento de um glioma.

[0058] A ligação de moléculas terapêuticas à base de IL13 ao complexo de receptor de IL13Rα1/IL4β/Yc amplamente expresso, no entanto, possui o potencial de mediar toxicidades indesejadas aos tecidos normais fora do SNC e, dessa forma, limita a administração sistêmica desses agentes. Uma substituição de aminoácido na alfa-hélice A de IL13 no aminoácido 13 de tirosina para o ácido glutâmico nativo reduz seletivamente a afinidade de IL13 para o receptor de IL13Rα1/IL4β/Yc. A ligação desse mutante (denominado IL13(E13Y)) à IL13Rα2, no entanto, era aumentada em relação à IL13 do tipo selvagem. Dessa forma, esse análogo de IL13 minimamente alterado aumenta simultaneamente a especificidade e afinidade de IL13 por células de glioma. Portanto, o CAR descrito nesse relatório descritivo inclui uma IL13 que contém uma mutação (E para Y ou E para algum outro aminoácido como, por exemplo, K ou R ou L ou V) no aminoácido 13 (de acordo com a numeração de Debinski e cols. 1999 Clin. Cancer Res. 5: 3143s). IL13 que possui a sequência natural também pode ser usada, no entanto, e pode ser útil, particularmente em situações nas quais as células T modificadas devam ser administradas localmente, por exemplo, por injeção diretamente em uma massa tumoral.

[0059] O CAR descrito nesse relatório descritivo pode ser produzido por qualquer meio na técnica, embora, preferivelmente, seja produzido usando técnicas de DNA recombinante. Ácidos nucléicos que codificam as várias regiões do receptor quimérico podem ser preparados e montados em uma sequência codificadora completa por metodologias- padrão de clonagem molecular conhecidas na técnica (pesquisa de biblioteca genômica, PCR, ligação assistida por iniciador, mutagênese sítio-dirigida etc.), como for conveniente. A região codificadora resultante é inserida preferivelmente em um vetor de expressão e usada para transformar uma linhagem de célula hospedeira de expressão adequada, preferivelmente uma linhagem celular de linfócitos T célula e, mais preferivelmente ainda, uma linhagem autóloga de linfócitos T célula.

[0060] Vários subconjuntos de células T isoladas do paciente, incluindo PBMC não selecionadas ou células T enriquecidas em CD3 ou enriquecidas em CD3 ou subconjuntos de células T de memória, podem ser transduzidos com um vetor para expressão de CAR. Células T de memória central são um subconjunto útil de células T. Células T de memória central podem ser isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por seleção de células CD45RO+/CD62L+ usando, por exemplo, o dispositivo CliniMACS® para selecionar imunomagneticamente as células que expressam os receptores desejados. As células enriquecidas para células T de memória central podem ser ativadas com anti-CD3/CD28, transduzidas com, por exemplo, um vetor lentiviral SIN que dirige a expressão de um CAR IL13Ra2-específico (por exemplo, IL13(EQ)BBZ), bem como com uma CD19 humana truncada (CD19t), um marcador de superfície não imunogênico para detecção in vivo e seleção potencial ex vivo. As células T de memória central ativadas/geneticamente modificadas podem ser expandidas in vitro com IL-2/IL-15 e depois criopreservadas.

Exemplo 1: Construção e estrutura de um CAR IL13Rα2- específico

[0061] A estrutura de um CAR IL13Ra2-específico útil é descrita abaixo. A sequência de CAR códon-otimizada contém um ligante de IL-13 anexado à membrana mutado em um único sítio (E13Y) para reduzir ligação potencial à IL13Rα1, um espaçador de Fc de IgG4 que contém duas mutações (L235E; N297Q) que reduzem acentuadamente modelos de reconhecimento mediado por receptor Fc, um domínio transmembrana CD4, um domínio de sinalização citoplasmática coestimulador de 4-1BB e um domínio citoplasmático de sinalização de CD3Z. Uma sequência de skip de ribossomo T2A separa essa sequência de CAR IL13(EQ)BBZ de CD19t, um marcador de detecção/seleção da superfície celular não imunogênico, inerte. Essa ligação de T2A resulta na expressão coordenada tanto de IL13(EQ)BBZ quanto de CD19t por um único transcrito. A Figura 1A é um desenho esquemático do quadro de leitura aberta de 2.670 nucleotídeos que codifica a construção IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t. Nesse desenho, o ligante IL13Rα2-especifico IL13(E13Y) , Fc de IgG4(EQ), CD4 transmembrana, sinalização citoplasmática de 4-1BB, vinculador de três glicinas e domínios de sinalização citoplasmática de CD3Z do CAR IL13(EQ)BBZ, bem como as sequências de skip de ribossomo T2A e de CD19 truncada são todos indicados. O receptor alfa de GM-CSF humano e sequências sinalizadoras de CD19 que dirigem a expressão de superfície do CAR IL13(EQ)BBZ e CD19t também são indicados. Dessa forma, a construção IL13(EQ)BBZ- T2ACD19t inclui uma sequência de imunorreceptor coestimulador quimérico IL13Ra2-específica, dobradiça- otimizada (designada IL13(EQ)BBZ), uma sequência de skip de ribossomo T2A e uma sequência de CD19t.

[0062] A sequência de IL13(EQ)BBZ foi gerada por fusão do peptídeo-líder do receptor alfa de GM-CSF humano com dobradiça de Fc de IgG4 de ligante 5 de IL13(E13Y) L235E/N297Q-modificado (em que a mutação dupla interfere com o reconhecimento de FcR), CD4 transmembrana, sequências de domínio de sinalização citoplasmática de 4-1BB e de domínio de sinalização citoplasmática de CD3Z. Essa sequência foi sintetizada de novo após otimização de códons. A sequência de T2A foi obtida pela digestão de um plasmídeo contendo T2A. A sequência de CD19t foi obtida a partir daquela que transpõe a sequência de peptídeo-líder até os componentes transmembrana (ou seja, pares de bases 1-972) de um plasmídeo contendo CD19. Todos os três fragmentos, 1) IL13(EQ)BBZ, 2) T2A e 3) CD19t, foram clonados no sítio de clonagem múltipla do vetor lentiviral epHIV7. Quando transfectado nas células apropriadas, o vetor integra a sequência revelada esquematicamente na Figura 1B no genoma das células hospedeiras. A Figura 1C fornece um desenho esquemático do próprio plasmídeo de 9.515 pares de bases IL13(EQ)BBZ-T2A- CD19t_epHIV7.

[0063] Como mostrado esquematicamente na Figura 2, CAR IL13(EQ)BBZ difere em vários aspectos importantes de um CAR IL13Rα2-especifico descrito previamente denominado IL13(E13Y)-zetacina (Brown e cols. 2012 Clinical Cancer Research 18: 2.199). O IL13(E13Y)-zetacina é composto por porções de muteína de IL-13 humana IL13Ra2-específica (huIL- 13(E13Y)), espaçador de Fc de IgG4 humana (huY4Fc), CD4 humana transmembrana (huCD4 tm) e cadeia CD3Z humana citoplasmática (huCD3Z cyt), como indicado. Em contraste, o IL13(EQ)BBBZ possui duas mutações pontuais, L235E e N297Q, que estão localizadas no domínio CH2 do espaçador de IgG4, e um domínio 4-1BB citoplasmático coestimulador (4-1BB cyt).

Exemplo 2: Construção e estrutura de epHIV7 usado para expressão de um CAR IL13Ra2-específico

[0064] O plasmídeo pHIV7 é o plasmídeo parental do qual o vetor clínico IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 foi derivado no “T Cell Therapeutics Research Laboratory” (TCTRL) na cidade de Hope (COH). O vetor epHIV7 usado para expressão do CAR foi produzido a partir do vetor pHIV7. Notavelmente, esse vetor usa o promotor EF1 humano para dirigir a expressão do CAR. As sequências tanto de 5’ quanto de 3’ do vetor foram derivadas de pv653RSN como derivadas previamente do pró-vírus HXBc2. As sequências do flap de DNA do trato de polipurina (cPPT) foram derivadas da cepa de HIV-1 pNL4-3 do “NIH AIDS Reagent Repository”. A sequência do elemento regulador pós-transcricional (WPRE) da marmota foi descrita previamente.

[0065] A construção de pHIV7 é revelada esquematicamente na Figura 3. Resumidamente, pv653RSN, contendo 653 bp de gag-pol mais repetições terminais longas (LTRs) 5’ e 3’ com um gene interveniente de SL3-neomicina fosfotransferase (Neo), foi subclonado em pBluescript, da seguinte forma: Na Etapa 1, as sequências da LTR 5’ para o elemento rev-responsivo (RRE) fizeram p5’HIV-1 51, e depois a LTR 5’ foi modificada por remoção de sequências a montante da TATA box, e ligada primeiro a um intensificador de CMV e depois à origem de replicação de SV40 (p5’HIV-2). Na Etapa 2, após clonagem da LTR 3’ em pBluescript para produzir p3’HIV-1, uma deleção de 400 bp no intensificador/promotor LTR 3’ foi feita para remover elementos reguladores-cis em U3 de HIV e formar p3’HIV-2. Na Etapa 3, fragmentos isolados do p5*HIV-3 e p3*HIV-2 foram ligados para produzir pHIV-3. Na Etapa 4, o p3*HIV-2 foi ainda modificado por remoção de sequências de HIV a montante extras para gerar p3’HIV-3 e um fragmento BamHI-SalI de 600 bp contendo WPRE foi adicionado ao p3’HIV-3 para produzir o p3’HIV-4. Na Etapa 5, o pHIV-3 RRE foi reduzido em tamanho por PCR e ligado a um fragmento 5’ de pHIV-3 (não mostrado) e ao p3’HIV-4, para produzir pHIV-6. Na Etapa 6, um fragmento BglII-BamHI de 190 bp contendo a sequência de flap de DNA cPPT de HIV-1 pNL4-3 (55) foi amplificado de pNL4-3 e colocado entre o RRE e as sequências de WPRE em pHIV6 para produzir pHIV-7. Esse plasmídeo parental pHIV7-GFP (GFP, proteína fluorescente verde) foi usado para empacotar o vetor parental usando um sistema de quatro plasmídeos.

[0066] Um sinal de empacotamento, psi ^, é necessário para o empacotamento eficiente do genoma viral no vetor. O RRE e WPRE aumentam o transporte do transcrito de RNA e a expressão do transgene. Foi demonstrado que a sequência de flap, em combinação com WPRE, aumenta a eficiência de transdução do vetor lentiviral em células mamíferas.

[0067] As funções helper, necessárias para a produção do vetor viral, são divididas em três plasmídeos separados para reduzir a probabilidade de geração de lentivírus replicação-competente por meio de recombinação: 1) pCgp codifica a proteína gag/pol necessária para a montagem do vetor viral; 2) pCMV-Rev2 codifica a proteína Rev, que atua sobre a sequência de RRE para ajudar no transporte do genoma viral para empacotamento eficiente; e 3) pCMV-G codifica a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV), que é necessária para infectividade do vetor viral.

[0068] Há homologia de sequência de DNA mínima entre o genoma do vetor codificado por pHIV7 e os plasmídeos helper. As regiões de homologia incluem uma região de sinal de empacotamento de aproximadamente 600 nucleotídeos, localizada na sequência de gag/pol do plasmídeo helper pCgp; uma sequência de promotor de CMV em todo os três plasmídeos helper; e uma sequência de RRE no plasmídeo helper pCgp. É altamente improvável que vírus recombinante replicação- competente pudesse ser gerado em função da homologia nessas regiões, na medida em que seriam necessários múltiplos eventos de recombinação. Adicionalmente, quaisquer recombinantes resultantes teriam perdido as sequências funcionais de LTR e tat necessárias para replicação lentiviral.

[0069] O promotor de CMV foi substituído pelo promotor EF1α-HTLV (EF1p), e o novo plasmídeo foi denominado epHIV7 (Figura 4). O EF1p possui 563 bp e foi introduzido em epHIV7 usando NruI e NheI, após o promotor de CMV ter sido removido.

[0070] O genoma lentiviral, excluindo gag/pol e ver, que são necessários para a patogenicidade do vírus do tipo selvagem e são necessários para infecção produtiva de células-alvo, foi removido desse sistema. Além disso, a construção de vetor IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 não contém um promotor de LTR 3’ intacto e, portanto, o genoma pró- viral de DNA resultante expresso e transcrito de forma reversa em células visadas terá LTRs inativas. Como resultado desse design, nenhuma sequência derivada de HIV-1 será transcrita pelo pró-vírus e somente as sequências terapêuticas serão expressas por seus respectivos promotores. Espera-se que a remoção da atividade do promotor de LTR no vetor SIN reduza significantemente a possibilidade de ativação não intencional de genes do hospedeiro (56). A Tabela 4 resume os vários elementos reguladores presentes em IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7.

Exemplo 3: Produção de vetores para a transdução de células T do paciente

[0071] Para cada plasmídeo (IL13(EQ)BBZ-T2A- CD19t_epHIV7; pCgp; pCMV-G; e pCMV-Rev2), um banco de sementes é gerado, que é usado para inocular o fermentador para produzir quantidades suficientes de DNA de plasmídeo. O DNA de plasmídeo é testado quanto à identidade, esterilidade e endotoxina antes de seu uso na produção de vetor lentiviral.

[0072] Resumidamente, as células foram expandidas a partir da célula de trabalho 293T (WCB), que foi testada para confirmar a esterilidade e a ausência de contaminação viral. Um frasco de células 293T da 293T WCB foi descongelado. As células foram desenvolvidas e expandidas até que existissem números suficientes de células para plaquear um número apropriado de fábricas de células de 10 camadas (CFs) para produção de vetor e manutenção do trem de células. Um único trem de células pode ser usado para produção.

[0073] O vetor lentiviral foi produzido em sub- bateladas de até 10 CFs. Duas sub-bateladas podem ser produzidas na mesma semana, levando à produção de aproximadamente 20 litros de sobrenadante lentiviral/semana. O material produzido por todas as sub-bateladas foi reunido em pool durante a fase de processamento posterior, a fim de produzir um lote de produto. As células 293T foram plaqueadas em CFs em meio 293T (DMEM com FBS 10%). As fábricas foram colocadas em uma incubadora a 37°C e niveladas horizontalmente a fim de obter uma distribuição igual das células em todas as camadas da CF. Dois dias mais tarde, as células foram transfectadas com os quatro plasmídeos lentivirais descritos acima usando o método de CaPO4, que envolve uma mistura de Tris/EDTA, 2 M de CaCl2, 2X HBS e os quatro plasmídeos de DNA. No Dia 3 após a transfecção, o sobrenadante contendo vetores lentivirais secretados foi coletado, purificado e concentrado. Após o sobrenadante ter sido removido das CFs, as células do final da produção foram coletadas de cada CF. As células foram tripsinizadas de cada fábrica e coletadas por centrifugação. As células foram ressuspensas em meio de congelamento e criopreservadas. Essas células posteriormente foram usadas para testagem de lentivírus replicação-competente (RCL).

[0074] Para purificar e formular vetores, o sobrenadante bruto foi clarificado por filtração em membrana para remover os restos de células. O DNA da célula hospedeira e DNA de plasmídeo residual foram degradados por digestão com endonuclease (Benzonase®). O sobrenadante viral foi clarificado de restos celulares usando um filtro de 0,45 μm. O sobrenadante clarificado foi coletado em um recipiente pré-pesado no qual a Benzonase® é adicionada (concentração final de 50 U/ml). A digestão com endonuclease para o DNA de plasmídeo residual e DNA genômico do hospedeiro foi realizada a 37°C por 6 h. A concentração inicial da ultrafiltração de fluxo tangencial (TFF) do sobrenadante tratado com endonuclease foi usada para remover componentes residuais de baixo peso molecular do sobrenadante bruto concentrando, ao mesmo tempo, o vírus aproximadamente 20 vezes. O sobrenadante viral clarificado tratado com endonuclease foi circulado através de um cartucho de fibra oca com um NMWCO de 500 kD em uma taxa de fluxo programada para manter a taxa de cisalhamento em aproximadamente 4.000 s-1 ou menos maximizando, ao mesmo tempo, a taxa de fluxo. A diafiltração do sobrenadante tratado com nuclease foi iniciada durante o processo de concentração para sustentar o desempenho do cartucho. Uma taxa de substituição de permeado de 80% foi estabelecida, usando lactose 4% em PBS como o tampão de diafiltração. O sobrenadante viral foi levado até o volume- alvo, representando uma concentração de 20 vezes do sobrenadante bruto, e a diafiltração foi continuada por mais 4 volumes de troca, com a taxa de substituição de permeado em 100%.

[0075] A concentração adicional do produto viral foi obtida pela utilização de uma técnica de centrifugação em alta velocidade. Cada sub-batelada do lentivírus foi peletizada usando uma centrífuga Sorvall RC-26 Plus a 6.000 RPM (6.088 RCF) a 6°C por 16-20 h. O pélete viral de cada sub-batelada foi então reconstituído em um volume de 50 ml com lactose 4% em PBS. O pélete reconstituído nesse tampão representa a formulação final para a preparação de vírus. Todo o processo de concentração de vetor resultou em uma redução de volume de 200 vezes, aproximadamente. Após a conclusão de todas as sub-bateladas, o material foi então colocado a -80°C, enquanto amostras de cada sub-batelada foram testadas quanto à esterilidade. Após confirmação da esterilidade das amostras, as sub-bateladas foram rapidamente descongeladas a 37°C com agitação freqüente. O material foi então reunido em pool e manualmente divido em alíquotas no gabinete de biossegurança Classe II Tipo A/B3 na sala de vetor viral. Foi usada uma configuração de enchimento de 1 ml do lentivírus concentrado em criofrascos estéreis USP classe 6, com anel em “O” rosqueado externamente. O “Quality Systems” (QS) do “Center for Applied Technology Development” (CATD) em COH liberou todos os materiais de acordo com as políticas e os padrões de procedimentos de operação para o CBG e em conformidade com as Boas Práticas de Manufatura (cGMPs) atuais.

[0076] Para assegurar a pureza da preparação de vetor lentiviral, ela foi testada quanto a contaminantes de DNA do hospedeiro residual, e à transferência de DNA do hospedeiro e de plasmídeo residual. Entre outros testes, a identidade do vetor foi avaliada por RT-PCR para assegurar que o vetor correto está presente. Todos os critérios de liberação foram obedecidos para o vetor destinado ao uso nesse estudo.

Exemplo 4: Preparação de células T adequadas para uso em ACT

[0077] Linfócitos T são obtidos de um paciente por leucoferese, e o subconjunto apropriado de células T alogênicas ou autólogas, por exemplo, células T de memória central (TCM), é geneticamente alterado para expressar o CAR, e depois administrado de volta ao paciente por qualquer meio clinicamente aceitável, para obter terapia anticâncer.

[0078] Um esquema da estratégia de fabricação para TCM é revelado na Figura 8 (Esquemas de fabricação para TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+). Especificamente, produtos de aférese obtidos de participantes da pesquisa com consentimento são resfriados, lavados e incubados de um dia para o outro. As células são então depletadas de populações de monócitos, células T reguladoras e células T naive usando reagentes de grau de GMP anti-CD14, anti-CD25 e anti-CD45RA (Miltenyi Biotec) e o dispositivo de separação CliniMACS™. Após depleção, células da fração negativa são enriquecidas para células TCM CD62L+ usando DREG56-biotina (de grau clínico COH) e microesferas antibiotina (Miltenyi Biotec) no dispositivo de separação CliniMACS™.

[0079] Após o enriquecimento, as células TCM são formuladas em X-Vivo15 completo mais 50 IU/ml de IL-2 e 0,5 ng/ml de IL-15 e transferidas para uma bolsa de cultura de células de Teflon, na qual são estimuladas com microesferas de CD3/CD28 Dynal ClinEx™ Vivo. Até cinco dias após a estimulação, as células são transduzidas com vetor lentiviral IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1,0 a 0,3. As culturas são mantidas por até 42 dias com adição de X-Vivo15 completo e citocinas IL-2 e IL-15, como necessário para expansão de células (mantendo a densidade de células entre 3 x 105 e 2 x 106 células viáveis/ml, e suplementação de citocina a cada Segunda-feira, Quarta-feira e Sexta-feira de cultura). As células tipicamente se expandem até aproximadamente 109 células sob essas condições dentro de 21 dias. Ao final do período de cultura, as células são coletadas, lavadas duas vezes e formuladas em criopreservação meio de grau clínico (Cryostore CS5, BioLife Solutions).

[0080] No dia (ou dias) de infusão de células T, o produto criopreservado e liberado é descongelado, lavado e formulado para reinfusão. Os frascos criopreservados contendo o produto de células liberado são removidos do armazenamento em nitrogênio líquido, descongelados, resfriados e lavados com um tampão de lavagem de PBS/albumina sérica humana 2% (HSA). Após centrifugação, o sobrenadante é removido e as células ressuspensas em um diluente de infusão livre de conservantes de solução salina normal (PFNS)/HSA 2%. Amostras são removidas para testagem de controle de qualidade.

[0081] Duas rodadas de qualificação nas células obtidas de doadores saudáveis foram realizadas usando a plataforma de fabricação descrita acima. A cada produto da rodada de qualificação pré-clínica foi atribuído um número de doador humano (HD) - HD006.5 e HD 187.1. Notavelmente, como mostrado na Tabela 5, essas rodadas de qualificação expandiram > 80 vezes dentro de 28 dias e as células expandidas expressavam os transgenes de IL13(EQ)BBY/CD19t. Tabela 5: Resumo de dados de expressão do produto da rodada de qualificação pré-clínica.

Exemplo 5: Análise citométrica de fluxo da expressão de superfície do marcador de transgene e de célula T em TCM IL13(EQ BBY/CD19t+

[0082] Os dois produtos da rodada de qualificação pré-clínica descritos no Exemplo 4 foram usados em estudos pré-clínicos como descrito abaixo. As Figuras 6A-C retratam os resultados de análise citométrica de fluxo da expressão de superfície do marcador de transgene e de célula T. TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram coradas simultaneamente com anti-IL13-PE e anti-CD8-FITC para detectar células CD8+ CAR+ e CD4+ (ou seja, CD8-negativas) CAR+ (Figura 6A), ou anti-CD19-PE e anti-CD4-FITC para detectar células CD4+ CD19t+ e CD8+ (ou seja, CD4-negativas) CAR+ (Figura 6B). TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram coradas com anti-CD3 fluorcromo-conjugado, TCR, CD4, CD8, CD62L e CD28 (histogramas cinzas) ou controles de isótipo (histogramas pretos) (Figura 6C). Em cada uma das Figuras 6A-C, as percentagens indicadas se baseiam em linfócitos viáveis (DAPI-negativos) corados do isótipo acima.

Exemplo 6: Atividade efetora de TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+

[0083] A atividade efetora de TCM IL13(EQ) BBZ/CD19t + foi avaliada e os resultados dessa análise são revelados nas Figuras 7A-B. Resumidamente, TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram usadas como efetores em um ensaio de liberação de 51Cr de 6 horas usando uma proporção de 10E:1T com base na expressão de CD19t. Os alvos tumorais IL13Rα2- positivos foram K562 modificado geneticamente para expressar IL13Rα2 (K562-IL13Rα2) e linhagem primária de glioma PBT030- 2, e o controle de alvo tumoral IL13Rα2-negativo foi a linhagem parental de K562 (Figura 7A). IL13(EQ)BBY/CD19t+ HD006.5 e HD187.1 foram avaliados quanto à produção de citocina antígeno-dependente após cocultura de um dia para o outro em uma proporção de 10E:1T com os mesmos alvos IL13Rα2-positivos e -negativos, como descrito acima. Os níveis de citocina foram medidos usando o kit de ensaio de citocina humana TH1/TH2 “Bio-Plex Pro” e os níveis de IFN-Y são revelados (Figura 7B).

Exemplo 7: Atividade antitumoral IN VIVO de TCM IL13(EQ BBY/CD19t+

[0084] Os estudos descritos abaixo demonstram que TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ exibem eficácia antitumoral em modelos em camundongo in vivo. Especificamente, avaliamos a potência antitumoral de TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ contra a linhagem primária de esfera de tumor de glioblastoma de baixa replicação IL13Rα2+ PBT030-2, que foi modificada geneticamente para expressar tanto EGFP quanto genes repórteres de luciferase de vaga-lume (ffLuc) (PBT030-2 EGFP:ffLuc) (6). Um painel de linhagens primárias (PBT) de amostras de glioblastoma do paciente desenvolvidas como esferas de tumor (TSs) em meios isentos de soro. Essas linhagens de TS expandidas exibem características do tipo célula-tronco, incluindo expressão de marcadores de célula- tronco, diferenciação em múltiplas linhagens e capacidade para iniciar tumores ortotópicos em camundongos imunocomprometidos (NSG) em números de células baixos. O modelo de xenoenxerto iniciado por TS PBT030-2 EGFP:ffLuc (0,1 x 106 células; enxerto de 5 dias) foi previamente usado para avaliar atividade antitumoral in vivo em camundongos NSG de CAR IL13Rα2-especifico que expressa células T, pelo qual foi demonstrado que três injeções de 2 x 106 linfócitos T citolíticos (CTLs) ao longo de um período de 2 semanas reduzem o crescimento tumoral. No entanto, naqueles experimentos, a maioria dos tumores de PBT030-2 eventualmente recidivou. Por comparação, uma única injeção de TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ (1,1 x 106 TCM CAR+; 2 x 106 TCM total) exibiu atividade antitumoral robusta contra tumores de PBT030-2 iniciados com TS EGFP:ffLuc (0,1 x 106 células; enxerto de 5 dias), como mostrado nas Figuras 8A-C. Quando comparados com camundongos NSG tratados com PBS ou TcM com transdução simulada (sem CAR), TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ reduzem significantemente o fluxo de ffLuc (p < 0,001 em > 18 dias) e aumentam significantemente a sobrevida (p = 0,0008).

[0085] Resumidamente, células tumorais PBT030-2 EGFP-ffLuc+ (1 x 105) foram implantadas de forma estereotática no prosencéfalo direito de camundongos NSG. No Dia 5, os camundongos receberam 2 x 106 TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+ (1,1 x 106 cAR+; n=6), 2 x 106 TcM simulado (sem cAR; n=6) ou PBS (n=6). A Figura 8A retrata camundongos representativos de cada grupo que exibem carga tumoral relativa usando “Xenogen Living Image”. A quantificação de fluxo de ffLuc (fótons/segundo) mostra que TCM IL13(EQ)BBZ/CD19t+ induzem regressão do tumor, comparadas com TcM com transdução simulada e PBS (#p<0,02, *p<0,001, ANOVA de medições repetidas) (Figura 8B). Como mostrado na Figura 8C, uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier (n=6 por grupo) demonstra sobrevida significantemente aumentada (p=0,0008; teste de log-rank) para camundongos tratados com TCM IL13(EQ)BBY/CD19t+.

Exemplo 8: Comparação de TCM IL13(EQ)BBZ+ e clones de CTL Não-TCM IL13-zetacina CD8+ na eficácia antitumoral e persistência de células T

[0086] Os estudos descritos abaixo comparam TCM IL13(EQ)BBZ+ e CTLs humanos CD8+ IL13Rα2-especificos criados previamente (CTL IL13-zetacina CD8+ - descrito em Brown e cols. 2012 Clin. Cancer Res. 18: 2.199 e Kahlon e cols. 2004 Cancer Res. 64: 9.160). A IL13-zetacina usa um domínio estimulador de CD3Z, não possui um domínio coestimulador e usa a mesma variante de IL13 que IL13(EQ)BBZ+.

[0087] Um painel de linhagens primárias (PBT) de amostras de glioblastoma do paciente desenvolvidas como esferas de tumor (TSs) em meios isentos de soro foi gerado (Brown e cols. 2012 Clin. Cancer Res. 18: 2.199; Brown e cols. 2009 Cancer Res. 69: 8.886). Essas linhagens de TS expandidas exibem características do tipo célula-tronco, incluindo expressão de marcadores de célula-tronco, diferenciação em múltiplas linhagens e capacidade para iniciar tumores ortotópicos em camundongos imunocomprometidos (NSG) em números de células baixos. A linhagem primária de TS de glioblastoma de baixa replicação IL13Rα2+ PBT030-2, que foi modificada geneticamente para expressar tanto EGFP quanto genes repórteres de luciferase de vaga-lume (ffLuc) (PBT030-2 EGFP:ffLuc) (Brown e cols. 2012 Clin. Cancer Res. 18: 2.199) foi usada para os experimentos descritos abaixo.

[0088] Primeiro, uma dose única (1 x 106 células T com CAR) do produto de TCM IL13(EQ)BBZ+ foi comparada com clones de CTL IL13-zetacina CD8+ avaliados contra xenoenxertos iniciados por TS PBT030-2 EGFP:ffLuc de 8 dias (0,1 x 106 células). Embora ambas as células T com CAR IL13Rα2-especifico (CTL IL13-zetacina e TCM IL13(EQ)BBZ) tenham demonstrado atividade antitumoral contra tumores de PBT030-2 estabelecidos quando comparadas com controles não tratados e de TcM simulado (cAR- negativas) (Figuras 9A e 9B), TcM IL13(EQ)BBZ+ mediaram um aumento significantemente da sobrevida e uma remissão durável do tumor com camundongos que vivem >150 dias, quando comparadas com nossos clones de cTL de primeira geração IL13-zetacina cD8+ (Figura 9C).

[0089] Para comparar ainda mais a eficácia terapêutica desses dois produtos de célula T IL13Rα2-cAR, foi realizada uma titulação de dose de 1,0, 0,3 e 0,1 x 106 células T com cAR contra tumores iniciados por TS PBT030-2 de 8 dias EGFP:ffLuc (Figuras 10A-C). A maior dose (1 x 106) de cTL IL13-zetacina cD8+ cl. 2D7 mediou respostas antitumorais como medidas por fluxo de “Xenogen” em 3 de 6 animais (Figura 10C), mas não foram observadas respostas antitumorais significantes nas doses menores de células T com cAR. Por comparação, a injeção do produto de TcM IL13(EQ)BBZ+ mediou a regressão completa do tumor na maioria dos camundongos em todos os níveis de dose, incluindo tratamento com apenas 0,1 x 106 células T com cAR. Esses dados demonstram que TCM IL13(EQ)BBZ+ é pelo menos 10 vezes mais potente do que clones de cTL IL13-zetacina cD8+ na eficácia antitumoral. A eficácia antitumoral aumentada ocorre em função de persistência aumentada de células T no microambiente do tumor. A avaliação de células T CD3+ de 7 dias pós-injeção i.c. revelou números significantes de TCM IL13(EQ)BBZ+ no tumor microambiente, enquanto muito poucos dos CTLs IL13-zeta de primeira geração estavam presentes (Figura 11).

Exemplo 9: Comparação da via de liberação de células T com CAR para o tratamento de tumores PBT iniciados por TS grandes

[0090] São descritos abaixo estudos que comparam a via de liberação, intravenosa (i.v.) ou intracraniana (i.c.), sobre a atividade antitumoral contra linhagens primárias de PBT invasivo. Em estudos-pilotos (dados não mostrados), foi observado inesperadamente que TCM IL13(EQ)BBZ+ administradas por via i.v. não forneceram benefício terapêutico, quando comparadas com PBS, para o tratamento de pequenos (5 dias) tumores PBT030-2 EGFP:ffLuc. Isso está em contraste com a eficácia terapêutica robusta observada com células T CAR+ administradas i.c. Considerando que tumores de 5 dias de PBT030-2 podem ter sido muito pequenos para recrutar células T terapêuticas da periferia, foi feita uma comparação da liberação i.v. versus i.c. contra tumores de PBT030-2 EGFP:ffLuc maiores de 19 dias. Para esses estudos, camundongos enxertados com PBT030-2 foram tratados com duas infusões i.v. (5 x 106 TCM CAR+; dias 19 e 26) ou quatro infusões i.c. (1 x 106 TCM CAR+; dias 19, 22, 26 e 29) de TCM IL13(EQ)BBZ+, ou TCM simulado (sem CAR). Aqui também não foi observado nenhum benefício terapêutico, como monitorado por imageamento por “Xenogen” ou análise de sobrevida de Kaplan-Meier, para células T CAR+ administradas i.v. (Figuras 12A e 12B). Em contraste, atividade antitumoral potente foi observada para TCM IL13(EQ)BBZ+ administradas i.c. (Figuras 12A-B). A seguir, cérebros de um coorte de camundongos 7 dias pós-injeção de célula T foram coletados e avaliados quanto às células T humanas CD3+ por IHC. Surpreendentemente, para camundongos tratados i.v. com TCM simulado ou TCM IL13(EQ)BBZ, não havia células T humanas CD3+ detectáveis no tumor ou em outras regiões cerebrais do camundongo onde células T humanas tipicamente residem (ou seja, nas leptomeninges) (Figura 12C), sugerindo um déficit no tropismo do tumor. Isto está em contraste com o número significante de células T detectadas nos camundongos tratados por via i.c. (Figura 12D).

[0091] citocinas derivadas do tumor, particularmente McP-1/ccL2, são importantes no recrutamento de células T para o tumor. Dessa forma, células tumorais PBT030-2 foram avaliadas e foi verificado que essa linhagem produz níveis elevados de McP-1/ccL2 comparáveis com células U251T (dados não mostrados), uma linhagem de glioma que foi demonstrado previamente que atrai células T efetoras cD8+ administradas i.v. para tumores enxertados i.c. Gliomas malignos são tumores altamente invasivos e são freqüentemente multifocais na apresentação. Os estudos descritos acima estabelecem que TcM IL13-BBZ podem eliminar tumores infiltrados como, por exemplo, PBT030-2, e medeiam atividade antitumoral durável de longo prazo. A capacidade de células T com cAR liberadas por via intracraniana para trafegar para doença multifocal também foi examinada. Para esse estudo, TSs de PBT030-2 EGFP:ffLuc foram implantados em ambos os hemisférios, esquerdo e direito (Figura 13A) e células T CAR+ foram injetadas apenas no local tumoral direito. De forma encorajadora, para todos os camundongos avaliados (n=3), detectamos células T por IHC de CD3 de 7 dias pós-infusão de células T tanto no local da injeção (ou seja, tumor direito), quanto também dentro do tumor no hemisfério esquerdo (Figura 13B). Esses achados fornecem evidências de que células T CAR+ são capazes de trafegar para e se infiltrar em focos de tumor em locais distantes. Achados similares também foram observados em um segundo modelo de tumor usando a linhagem de células de glioma U25IT (dados não mostrados).

Exemplo 10: Comparação de domínios coestimuladores

[0092] Uma série de estudos foi realizada para avaliar vários domínios coestimuladores. Os vários CARs avaliados são revelados esquematicamente na Figura 14A e incluíram um CD3Z CAR de primeira geração desprovido de um domínio coestimulador, dois CARs de segunda geração que incorporam um domínio coestimulador de 4-1BB ou um domínio coestimulador de CD28, e um CAR de terceira geração contendo tanto um domínio coestimulador de CD28 quanto um domínio coestimulador de 4-1BB. Todas as construções de CAR também contêm a sequência de skip ribossômico T2A e a sequência de CD19 truncada (CD19t) como um marcador para células transduzidas.

[0093] TCM CD4 e CD8 foram transduzidas de forma lentiviral e células T que expressam CAR foram imunomagneticamente enriquecidas por meio de anti-CD19. Os níveis de expressão de CD19 e IL13 (ou seja, de CAR) como medidos por citometria de fluxo. Os resultados são mostrados na Figura 14B. A estabilidade de cada construção de CAR foi determinada por divisão da intensidade de fluorescência média de CAR (IL13) (MFI) por aquela do marcador de transdução (CD19t) (Figura 14C). Os dois CARs que incluem um domínio coestimulador de 4-1BB exibiram os menores níveis de expressão, comparados com o marcador de transdução CD19t.

[0094] A habilidade das células T com transdução simulada ou que expressam CAR indicadas para matar alvos de células tumorais PBT030-2 que expressam IL13Rα2 foi determinada em um ensaio de liberação de 51Cr de 4 horas nas proporções efetor/alvo indicadas. Os resultados desse estudo estão na Figura 15A (é revelado o % médio de liberação de cromo ± D.P. de poços em triplicata). Como esperado, células T com transdução simulada não lisaram eficientemente os alvos. Em contraste, todas as células T que expressam CAR lisaram as células tumorais de modo similar. A Figura 15B retrata os resultados de um estudo no qual as células T com transdução simulada ou que expressam CAR indicadas foram cocultivadas de um dia para o outro com células tumorais PBT030-2 que expressam IL13Rα2 em uma proporção de 10:1 e os sobrenadantes foram analisados quanto aos níveis de IL-13 e IFN-Y por arranjo citométrico de microesferas. Curiosamente, células T que expressam os CARs zeta, 41BB-zeta ou CD28- 41BB-zeta exibiram menor produção de citocina estimulada por antígeno do que células T que expressam o CAR CD28-zeta.

[0095] A eficácia in vivo dos vários CARs foi examinada da forma seguinte. Resumidamente, camundongos NSG receberam uma injeção intracraniana de células tumorais PBT030-2 ffLuc+ no Dia 0, e foram randomizados em 6 grupos (n = 9-10 camundongos por grupo) para tratamento i.c. com PBS (apenas tumor), células T com transdução simulada ou células T que expressam o CAR IL13Ra2-específico indicado no Dia 8. O imageamento por bioluminescência quantitativa foi então realizado para monitorar o crescimento tumoral ao longo do tempo. Imagens de bioluminescência para camundongos representativos em cada grupo (Figura 16A). Níveis de fluxo para cada camundongo no Dia 27 (Figura 16B). Todos os grupos tratados com células T com CAR IL13Ra2-específico, exceto aqueles tratados com células T que expressam o CD28-CAR, exibem redução estatisticamente significante no volume do tumor, comparados com camundongos tratados com células T com transdução simulada (Figura 16C).

Exemplo 11: Sequência de aminoácidos de IL13(EQ)BBZ/CD19t

[0096] A sequência de aminoácidos completa de IL13(EQ)BBZ/CD19t é revelada na Figura 17. Toda a sequência (SEQ ID N°: 1) inclui: um peptídeo sinalizador de GMCSF de 22 aminoácidos (SEQ ID N°: 2), uma sequência de IL-13 de 112 aminoácidos (SEQ ID N°: 3; substituição de aminoácido E13Y mostrada em negrito); uma sequência de IgG4 229 de aminoácidos (SEQ ID N°: 4; com substituições de aminoácidos L235E e N297Q mostradas em negrito); uma sequência de CD4 transmembrana de 22 aminoácidos (SEQ ID N°: 5); uma sequência de 4-1BB de 42 aminoácidos (SEQ ID N°: 6); um vinculador de Gly de 3 aminoácidos; uma sequência de CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID N°: 7); uma sequência de T2A de 24 aminoácidos (SEQ ID N°: 8); e uma sequência de CD19t de 323 aminoácidos (SEQ ID N°: 9).

[0097] A sequência do receptor de antígeno quimérico maduro (SEQ ID N°: 10) inclui: uma sequência de IL-13 de 112 aminoácidos (SEQ ID N°: 3; substituição de aminoácido E13Y mostrada em negrito); uma sequência de IgG4 229 de aminoácidos (SEQ ID N°: 4; com substituições de aminoácidos L235E e N297Q mostradas em negrito); uma sequência de CD4 de 22 aminoácidos (SEQ ID N°: 5); uma sequência de 4-1BB de 42 aminoácidos (SEQ ID N°: 6); um vinculador de Gly de 3 aminoácidos; e uma sequência de CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID N°: 7). Dentro dessa sequência de CAR (SEQ ID N°: 10) está a sequência de IL-13/IgG4/CD4t/41-BB (SEQ ID N°: 11), que inclui: uma sequência de IL-13 de 112 aminoácidos (SEQ ID N°: 3; substituição de aminoácido E13Y mostrada em negrito); uma sequência de IgG4 229 de aminoácidos (SEQ ID N°: 4; com substituições de aminoácidos L235E e N297Q mostradas em negrito); uma sequência de CD4 de 22 aminoácidos (SEQ ID N°: 5); e uma sequência de 4-1BB de 42 aminoácidos (SEQ ID N°: 6). A sequência de IL13/IgG4/CD4t/4-1BB (SEQ ID N°: 11) pode ser unida à sequência de CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID N°: 7) por um vinculador como, por exemplo, um vinculador de Gly Gly Gly. A sequência de CAR (SEQ ID N°: 10) pode ser precedida por um peptídeo sinalizador de GMCSF de 22 aminoácidos (SEQ ID N°: 2).

[0098] A Figura 18 retrata uma comparação das sequências de IL13(EQ)41BBZ[IL13{EQ}41BBZ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID N°: 12) e CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID N°: 13).

Exemplo 12: Sequência de aminoácidos de IL13(EO BBC/CD19t

[0099] As Figuras 19-26 retratam as sequências de aminoácidos de CARs dirigidos contra IL13Rα2 adicionais. Em cada caso, os vários domínios são marcados, exceto para o espaçador de GlyGlyGly localizado entre certos domínios intracelulares. Cada um inclui IL-13 humana com uma substituição de Glu para Tyr (SEQ ID N°: 3; substituição de aminoácido E13Y mostrada em realce). No vetor de expressão usado para expressar esses CARs, a sequência de aminoácidos expressa pode incluir uma sequência de T2A de 24 aminoácidos (SEQ ID N°: 8); e uma sequência de CD19t de 323 aminoácidos (SEQ ID N°: 9) para permitir a expressão coordenada de uma sequência de CD19 truncada na superfície de células que expressam CAR.

[00100] Um painel de CARs que compreendem domínio de IL13(E13Y) humano, um domínio de CD28 tm, um domínio coestimulador de CD28gg, um domínio coestimulador de 4-1BB e um arcabouço do CAR do domínio de CD3Z e que incluem um espaçador HL (22 aminoácidos), um espaçador de dobradiça de CD8 (48 aminoácidos), um espaçador de IgG4-HL-CH3 (129 aminoácidos) ou um espaçador de IgG4(EQ) (229 aminoácidos) foi testado quanto à sua habilidade para mediar a morte IL13Ra2-específica como avaliada em um ensaio de cocultura de 72 horas. Com exceção de HL (22 aminoácidos), que parecia ter pouca expressão de CAR nesse sistema, todos eram ativos.

Claims

1. Molécula de ácido nucléico, caracterizada por codificar um receptor de antígeno quimérico, em que o receptor de antígeno quimérico compreende: IL-13 humana ou uma variante desta que possui 1-10 modificações de aminoácidos; um domínio transmembrana selecionado de: um domínio transmembrana CD4 ou variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD8 ou variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, e um domínio transmembrana CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos; um domínio coestimulador; e domínio de sinalização de CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos.

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio coestimulador é selecionado do grupo que consiste em: um domínio coestimulador de CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante deste que possui 110 modificações de aminoácidos e um domínio coestimulador de OX40 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos.

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma variante de uma IL-13 humana que possui 1-10 modificação de aminoácido que aumentam a especificidade de ligação para IL13Rα2 versus IL13Rα1.

4. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a IL-13 humana ou variante desta é uma variante de IL-13 que compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 3 com 1 a 5 modificações de aminoácidos, desde que o aminoácido na posição 11 do SEQ ID N°: 3 seja diferente de E.

5. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende dois domínios coestimuladores diferentes selecionados do grupo que consiste em: um domínio coestimulador de CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante deste que possui 110 modificações de aminoácidos e um domínio coestimulador de OX40 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos.

6. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende dois domínios coestimuladores diferentes selecionados do grupo que consiste em: um domínio coestimulador de CD28 ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos e um domínio coestimulador de OX40 ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos.

7. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: IL-13 humana ou uma variante desta que possui 1-2 modificações de aminoácidos; um domínio transmembrana selecionado de: um domínio transmembrana CD4 ou variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD8 ou variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD28 ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos, e um domínio transmembrana CD3Z ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos; um domínio coestimulador; e domínio de sinalização de CD3Z ou uma variante deste que possui 1-2 modificações de aminoácidos.

8. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma região espaçadora localizada entre a IL-13 ou variante desta e o domínio transmembrana.

9. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a região espaçadora compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no SEQ ID N°: 4, 14-20, 50 e 521.

10. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o espaçador compreende uma região de dobradiça de IgG.

11. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o espaçador compreende 10-150 aminoácidos.

12. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização de 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 6.

13. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização de CD3Z compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 7.

14. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um vinculador de 3 a 15 aminoácidos está localizado entre o domínio coestimulador e o domínio de sinalização de CD3Z ou variante deste.

15. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

16. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende uma região de IL- 13/IgG4/CD4t/41-BB que compreende o aminoácido do SEQ ID N°: 11 e um domínio de sinalização de CD3Z que compreende a sequência de aminoácidos do SEQ ID N°: 7.

17. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende a sequência de aminoácidos dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

18. População de células T humanas transduzidas por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizada pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: IL-13 humana ou uma variante desta que possui 1-10 modificações de aminoácidos; um domínio transmembrana selecionado de: um domínio transmembrana CD4 ou variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD8 ou variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, um domínio transmembrana CD28 ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos, e um domínio transmembrana CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos; um domínio coestimulador; e domínio de sinalização de CD3Z ou uma variante deste que possui 1-10 modificações de aminoácidos.

19. População de células T humanas, caracterizada por compreender um vetor que expressa um receptor de antígeno quimérico que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

20. População de células T humanas de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que as células T são compostas por uma população de células T de memória central.

21. Uso de uma população de células T humanas transduzidas por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratamento de câncer em um paciente, em que as células T humanas são autólogas ou alogênicas, e em que receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

22. Uso da população de células T humanas de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a população de células T humanas compreende células T de memória central.

23. Uso da população de células T humanas de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioblastoma.

24. Uso da população de células T humanas de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as células T humanas transduzidas foram preparadas por um método que compreende a obtenção de células T do paciente, o tratamento das células T para isolar células T de memória central, e transdução de pelo menos uma porção das células de memória central com um vetor viral que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

25. Molécula de ácido nucléico, caracterizada por codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10 e dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52.

26. Molécula de ácido nucléico, caracterizada por codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10, 31-48 e 52, exceto pela presença de no máximo 5 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.

27. Molécula de ácido nucléico, caracterizada por codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10 e dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52, exceto pela presença de no máximo 5 substituições de aminoácidos.

28. Molécula de ácido nucléico, caracterizada por codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do SEQ ID N°: 10 e dos SEQ ID N°s: 10, 31-48 e 52, exceto pela presença de no máximo 2 substituições de aminoácidos.