BR112021013488A2 - Modelo animal de laboratório antelmíntico para dirofilariose - Google Patents

Abstract

modelo animal de laboratório antelmíntico para dirofilariose. a presente invenção descreve um modelo animal de laboratório para nematoides de dirofilária, em que o referido animal de laboratório é alimentado com uma mistura dietética de ração de laboratório contendo um agente imunossupressor, por exemplo, um glicocorticoide. a invenção também descreve o uso do modelo animal de laboratório para o exame de endoparasiticidas, para o tratamento e/ou a prevenção de infecções por nematoides de filária em animais.

Description

"MODELO ANIMAL DE LABORATÓRIO ANTELMÍNTICO PARA DIROFILARIOSE" Campo da Invenção

[001] Esta invenção descreve um novo modelo animal de laboratório imunossuprimido para a avaliação de endoparasiticidas, para o tratamento e/ou a prevenção de infecções por nematoides de dirofilária em animais. O animal de laboratório é alimentado com uma mistura dietética contendo um glicocorticoide ou outro agente imunossupressor, antes e depois da inoculação das larvas de terceiro estágio (L3) de dirofilária, particularmente a Dirofilaria immitis. O animal de laboratório imunossuprimido é tolerante à infecção por D. immitis. Como tal, as larvas L3 sofrem a muda para as larvas L4; as larvas L4 migram através dos tecidos subcutâneos e musculatura por vários meses, antes de sofrerem a muda para o adulto imaturo, onde entram na corrente sanguínea para amadurecer em vermes adultos, que se instalam nas artérias pulmonares do coração e pulmões. Os vermes adultos tornam-se sexualmente maduros e liberam microfilárias circulantes na corrente sanguínea do hospedeiro; completando (expansão), assim, o ciclo infeccioso parasitário.

Antecedentes da Invenção

[002] A dirofilariose é uma doença parasitária de animais e, ocasionalmente, de seres humanos, causada por nematoides de filária filiformes, que pode resultar da infecção por uma espécie de Dirofilaria, como D. immitis, D. repens, D. tenuis, D. ursi, D. subdermata, D. lutrae, D. striata e D. spectans.

[003] Em cães, a dirofilariose cardiopulmonar (ou seja, doença do heartworm /verme do coração) é causada pelos nematoides Dirofilaria immitis (D. immitis). No caso da D. repens, os adultos são subcutâneos, portanto, embora não causem a doença do heartworm per se, eles causam doença/patologia e são prevenidos com doses de ivermectina comparáveis às utilizadas para prevenir a doença do heartworm a partir da D. immitis. A dirofilariose é uma helmintíase grave, transmitida por vetor,

de cães e gatos em todo o mundo. É transmitida por picadas de Culicidae (mosquito) e causada pelo desenvolvimento de vermes adultos de D. immitis no coração, artérias pulmonares e grandes vasos sanguíneos adjacentes. Clinicamente, leva à insuficiência cardíaca irreversível que pode resultar na morte do animal. O tratamento dos heartworm adultos é clinicamente desafiador; a prevenção é crítica para o controle dos heartworm de dirofilária de dirofilária.

[004] O ciclo de vida da D. immitis é bem conhecido (McCall et. Al., Adv.

Parasitol. 66: 193-285, 2008). Em resumo, um mosquito é infectado quando chupa o sangue de um hospedeiro infectado (por exemplo, um cachorro). O sangue infectado contém microfilárias de D. immitis. No mosquito, as microfilárias (L1) sofrem a muda para L2 e, em seguida, para o estágio larval infeccioso L3, que leva cerca de 10-14 dias depois que o mosquito é infectado com as microfilárias. Quando o mosquito infectado se alimenta novamente, ele pode transmitir as larvas L3 para um novo hospedeiro (por exemplo, outro cão). No novo hospedeiro, as larvas L3 se desenvolvem no tecido subcutâneo do hospedeiro por cerca de 3-4 dias; depois disso, elas então fazem a muda para as larvas L4 nos tecidos. O parasita permanece no estágio L4 por cerca de 2 meses, após o que sofre a muda para o estágio adulto imaturo. Os adultos imaturos migram para a corrente sanguínea do hospedeiro a partir de cerca de 70 a 120 dias após a infecção e, em seguida, movem-se para o lado direito do coração, pulmões e as artérias pulmonares, onde se tornam adultos maduros em torno de 6-7 meses. Os vermes adultos produzem ovos, os quais se desenvolvem no útero em larvas de estágio L1 longas e finas (isto é, microfilárias) que são liberadas na corrente sanguínea, as quais podem aparecer cerca de 6-9 meses após a infecção. Essas microfilárias podem ser encontradas em concentrações que variam de cerca de várias centenas a mais de 50.0000 por mililitro de sangue infectado. O comprimento e a largura médios de uma única microfilária de D. immitis é cerca de 302 µm e 6,3 µm, respectivamente. Um mosquito ingere as microfilárias circulantes quando chupa o sangue do hospedeiro infectado, e o ciclo infeccioso parasitário começa novamente. No geral, os cães desenvolvem a microfilaremia crônica que começa em 6 a 7 meses após a infecção, com os vermes adultos sobrevivendo até 7 anos. O cão é o hospedeiro definitivo, o que significa que os vermes amadurecem e se tornam adultos, acasalam-se e produzem descendentes enquanto vivem dentro do cão.

[005] A D. immitis pode ser encontrada onde quer que o seu vetor, o mosquito, e um hospedeiro canino adequado forem encontrados. Os mosquitos dos gêneros Culex, Aedes e Anopheles predominam, com mais de 50 espécies individuais de mosquitos tendo-se mostrado serem vetores da D. immitis. Em geral, a D. immitis pode ser encontrada em uma base mundial, porém são muito comuns em áreas com climas amenos e quentes.

[006] As lactonas macrocíclicas (MLs) foram introduzidas há mais de 30 anos, porém continuam a ser a única classe química de medicamento aprovado para a prevenção da doença do heartworm, no manejo da D. immitis em aplicações veterinárias. Os exemplos de MLs incluem, porém não estão limitados à: ivermectina, selamectina, eprinomectina, e inclui as milbemicinas, como a moxidectina, a milbemicina e a milbemicina oxima. No entanto, a resistência à ML é comum em uma variedade de nematoides parasitas e parece estar se desenvolvendo na D. immitis.

[007] Uma série de testes de diagnóstico foi descrita para a detecção da resistência antelmíntica em nematoides de gado e cavalos, incluindo o teste de redução da contagem de ovos fecais, o teste de incubação de ovos, o teste de desenvolvimento de larvas em microágar e os testes moleculares baseados na resistência ao benzimidazol (Coles et.al., Vet. Parasitology 136: 167-185, 2006).

Prichard et.al. (patente europeia EP0979278) descrevem uma sequência da glicoproteína P em Haemonchus contortus que pode ser útil para o diagnóstico da resistência à ML em nematoides parasitários gastrointestinais. Pritchard et.al. (patente

US 10.000.811B2) descrevem marcadores para predizer a resistência ao medicamento de ML em D. immitis. Além disso, uma série de cepas de D. immitis resistentes à ML foi identificada por teste da eficácia fenotípica em cães (Vet Parasitol.; Bourguinat, C., et.al., 2015, 201(3-4), 167-178; Parasit Vectors, McTier, T.L., et.al., 2017, 10(Suppl 2), 482; e Parasit Vectors, Pulsaki, C.N., et.al., 2014, 7, 494).

[008] Foram descritos ensaios antelmínticos para o nematoide gastrointestinal, Trichostrongylus colubriformis, em ratos imunossuprimidos, em que os ratos foram alimentados com uma dieta de acetato de hidrocortisona de 60 ppm (Veterinary Parasitology, 42, Issues 3-4, 273-279, 1992). Os valores de ED95 obtidos do rato imunossuprimido, infectado com as larvas de T. colubriformis, proporcionaram um modelo preditivo para o ensaio da atividade de medicamentos experimentais antes de iniciar estudos in vivo em ruminantes. Um modelo de esquilo-da-mongólia (Meriones unguiculatus) imunossuprimido foi desenvolvido para Haemonchus contortus (J. of Parasitology, 76 (2):168-170, 1990). Os esquilos-da-mongólia foram alimentados com uma dieta de hidrocortisona a 0,02%. Os antelmínticos de amplo espectro avaliados no modelo eram uniformemente ativos e comparáveis às doses necessárias para a eficácia em ruminantes. Os estudos em animais avaliando as abordagens de vacinas para a filariose têm sido realizados desde a década de 1940.

Esses estudos têm sido desafiadores, uma vez que os diferentes modelos de animais de filariose, incluindo a D. immitis, têm ciclos de vida distintos e vários graus de tolerância (Clin Microbiol Rev. 26(3): 381–421, 2013). Os hamsters e os esquilos-da- mongólia são hospedeiros experimentais para a filária relacionada, Acanthocheilonema viteae, do carrapato mole Ornithodoros moubata e O.

tartakovskyi, e são tolerantes à infecção por microfilaremia transitória. Os machos tendem a ser mais suscetíveis à infecção do que as fêmeas, possivelmente devido a um efeito protetor conferido pelas fêmeas pelo 17-β-estradiol e pela progesterona. A microfilaremia é tipicamente transitória, no entanto, algumas cepas inatas de hamster desenvolvem microfilaremia estável, com um ciclo de vida da microfilária normal assumido. A expansão começa em 6 a 8 semanas após a infecção, atinge um pico em aproximadamente 11 semanas e diminui para níveis indetectáveis em 19 semanas nos hamsters; enquanto a expansão começa em 7 a 10 semanas após a infecção no esquilo-da-mongólia, a qual permanece estável por cerca de 2 anos. Após esse período, os hamsters são considerados infectados "latentemente", o que significa que ainda abrigam vermes adultos, apesar de serem amicrofilarêmicos. Os estudos de transferência e de imunossupressores sugerem que os vermes adultos, em hospedeiros infectados latentemente, ainda são capazes de produzir microfilárias e que a latência é mais provavelmente devida a anticorpos IgG que induzem a citotoxicidade celular dependente de anticorpos contra as microfilárias. Como mencionado, o modelo é tolerante e exibe microfilaremia transitória e imunidade concomitante fraca.

[009] Para a D. immitis, os hospedeiros tolerantes incluem o cão e outros canídeos e o furão. Quando os cães são infectados experimentalmente, em geral mais da metade das larvas infectantes inoculadas sobreviverá até o estágio adulto.

Essencialmente, todos os cães inoculados experimentalmente por via subcutânea com as larvas L3 desenvolverão uma infecção crônica e pelo menos 80% dos cães naturalmente infectados desenvolverão microfilárias. As sequelas da infecção neste modelo podem ser extensas e terríveis, dependendo do nível de infecção. A presença obstrutiva de vermes adultos, combinada com o meio inflamatório, leva a alterações vasculares substanciais, endarterite, hipertrofia muscular arterial, hipertensão pulmonar, derrames pleurais e, às vezes, morte resultante da dificuldade respiratória ou caquexia. As outras complicações possíveis incluem a pneumonite eosinofílica, a anemia, a síndrome da veia cava e patologia renal diversa.

[010] Sabe-se também que os furões são tolerantes à D. immitis com microfilaremia transitória. Os furões machos e fêmeos inoculados com as larvas L3 desenvolvem infecção crônica com vermes adultos. Embora os vermes se desenvolvam até a maturidade sexual e produzam microfilárias por volta de 7 meses após a infecção, a duração da microfilaremia é curta. Os gatos são considerados semitolerantes à D. immitis, visto que até cerca de 70% desenvolverão infecções em adultos ao receberem inoculações experimentais. No entanto, a intensidade da infecção nos gatos é normalmente baixa, com apenas alguns vermes; além disso, as contagens de microfilárias são baixas e transitórias nos gatos. Sob condicionamento prévio, os camundongos e os ratos Lewis mostraram ser hospedeiros não tolerantes à D. immitis.

[011] Em muitos dos modelos estudados, o hospedeiro desenvolve apenas microfilaremia transitória, apesar de abrigar vermes adultos. Essa é a natureza das infecções latentes e, na maioria dos casos, está associada a anticorpos direcionados contra a bainha das microfilárias. Portanto, os únicos modelos sólidos para as investigações dos heartworm requerem o uso de furões e/ou cães. No entanto, para a maioria dos investigadores, os estudos caninos são simplesmente muito longos - pelo menos seis meses - e muito caros para justificar estudos exploratórios fora desta classe comprovada de compostos (ML’s). Recentemente, o PCT/US2018/017398 descreveu um modelo intermediário de infecção por filárias em camundongos nocautes, que permitiria aos pesquisadores examinar e avaliar rapidamente novos agentes endoparasiticidas sem o uso de cães ou furões. Os camundongos nocaute foram descritos como camundongos imunodeficientes NOD scid gamma (NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm 1 Wjl/SzJ) que podem suportar a infecção e o desenvolvimento de vermes de filária parasitários fora de seus hospedeiros definitivos. O uso de camundongos nocaute pode ser um empreendimento caro e pode ou não haver qualquer correlação entre a infecção nos camundongos imunocomprometidos NOD e os canídeos. Além disso, nessas investigações, os vermes somente puderam se desenvolver até o estágio L4, limitando o seu uso como um modelo completo de heartworm.

[012] Independentemente do uso de marcadores biológicos para determinar a resistência aos medicamentos e modelos de infecção de microfilaremia transitória em hamsters e esquilos-da-mongólia, e modelos de infecção nos cães e furões; ou do uso de camundongos nocaute imunodeficientes caros; permanece a necessidade de desenvolver um modelo animal de laboratório que seja sólido, barato e se correlacione bem com os modelos conhecidos de cães e furões. A presente invenção é um modelo animal (particularmente o roedor) de laboratório imunossuprimido para D. immitis, que torna o roedor tolerante à infecção por dirofilária; permitindo assim que os parasitas de filária contornem as defesas do roedor e se reproduzam. Este modelo de roedor imunocomprometido se correlaciona com o modelo do cão. O modelo proporciona uma infecção expandida no roedor, em que o ciclo de vida parasitário completo ocorre a partir da inoculação de L3 (infecção), depois L3 sofrem a muda para larvas L4, depois L4 sofrem a muda para vermes adultos imaturos e, em seguida, a maturação para vermes reprodutores adultos que liberam a microfilária L1 de volta para a corrente sanguínea do hospedeiro. Ao usar o modelo de roedor de laboratório imunossuprimido, menos cães são necessários para avaliar os compostos preventivos contra heartworm, especialmente para a avaliação inicial de novas bibliotecas de compostos para heartworm. Além disso, foi demonstrado que o animal de laboratório pode ser utilizado para coletar vermes adultos maduros para posterior experimentação in vitro e para avaliar a segurança dos compostos em animais com infecções existentes por heartworm adultos.

Resumo da Invenção

[013] O modelo animal de laboratório imunossuprimido tem se mostrado eficaz na investigação da eficácia preventiva e na avaliação da segurança em animais infectados com heartworm, tanto in vitro quanto in vivo, o que é de grande importância para o desenvolvimento de preventivos seguros contra os heartworm para cães e outros animais. Este modelo animal de laboratório imunossuprimido também é útil na investigação das interações parasita-hospedeiro, como o potencial para identificar novos biomarcadores para a doença do heartworm e contribuir para a complexa biologia deste parasita e de seus hospedeiros. O uso do modelo animal (por exemplo, roedor) de laboratório imunossuprimido reduz a) a quantidade de medicamento necessária para a avaliação, b) a necessidade de uso de espécies regulamentadas, especialmente o cão, durante a pesquisa de descoberta em fase inicial e c) os recursos gerais necessários para manter colônias de animais maiores por longos períodos.

[014] Em um aspecto da invenção, é um modelo animal de laboratório imunossuprimido para nematoides de dirofilária, em que o referido animal é alimentado com uma mistura dietética de um agente imunossupressor, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária. Em um aspecto, um animal de laboratório não imunossuprimido é alimentado com uma mistura dietética de ração de laboratório e um agente imunossupressor, para estabelecer e manter um animal de laboratório imunossuprimido. Em um aspecto, o animal de laboratório é um coelho e o agente imunossupressor é um glicocorticoide. Em outro aspecto, o animal de laboratório é um roedor e o agente imunossupressor é um glicocorticoide. Em outro aspecto, o roedor de laboratório é um rato. Ainda em outro aspecto, o rato de laboratório é um rato CD (Sprague Dawley) IGS e o agente imunossupressor é a hidrocortisona.

[015] Em um aspecto da invenção, o glicocorticoide é selecionado do grupo que consiste em hidrocortisona, um sal de hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triancinolona. O glicocorticoide preferido é a hidrocortisona ou um seu sal de hidrocortisona. Os sais de hidrocortisona incluem, porém não estão limitados ao: acetato, butirato, hemissuccinato, fosfato de sódio, succinato de sódio e valerato. O sal de hidrocortisona preferido é o acetato.

[016] Em outro aspecto da invenção, o nematoide de dirofilária é a Dirofilaria immitis (D. immitis) ou a Dirofilaria repens (D. repens). O nematoide de dirofilária preferido é a D. immitis.

[017] Em um aspecto da invenção, é um modelo animal de laboratório imunossuprimido para nematoides de dirofilária, em que o referido animal é alimentado com uma mistura dietética de uma ração para animais de laboratório contendo um agente imunossupressor, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária; em que o referido animal é um rato e o agente imunossupressor é o acetato de hidrocortisona e a larva L3 de dirofilária é a D. immitis.

[018] Em um aspecto da invenção, a mistura dietética de ração para animais de laboratório contém cerca de 20 ppm a 250 ppm de um glicocorticoide. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 40 a 200 ppm de um glicocorticoide. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 ppm de um glicocorticoide. Em outro aspecto, a mistura dietética pode conter quantidades intermitentes de um glicocorticoide, por exemplo, 60 ppm, 90 ppm, 115 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 165 ppm, 180 ppm, 190 ppm e semelhantes. Em um aspecto, o glicocorticoide preferido é a hidrocortisona.

[019] Em outro aspecto da invenção, a mistura dietética de ração para animais de laboratório contém cerca de 20 ppm a 250 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 40 a 200 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética pode conter quantidades intermitentes de hidrocortisona, por exemplo, 60 ppm, 90 ppm, 115 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 165 ppm, 180 ppm, 190 ppm e semelhantes. Ainda em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 50 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 75 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 100 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 150 ppm de hidrocortisona. Em outro aspecto, a mistura dietética contém cerca de 200 ppm de hidrocortisona. De preferência, o acetato de hidrocortisona é misturado com a ração para animais de laboratório para proporcionar a quantidade imunossupressora calculada de hidrocortisona. A mistura dietética é suprida ao animal ad libitum.

[020] Em um aspecto da invenção, a mistura dietética de ração para animais de laboratório contém cerca de 200 ppm de hidrocortisona que é administrada ao roedor por pelo menos 3 dias, antes da inoculação com as larvas L3 de D. immitis. Em outro aspecto, a mistura dietética que contém cerca de 200 ppm de hidrocortisona é administrada ao roedor por cerca de 5 a 10 dias, antes da inoculação com as larvas L3 de D. immitis. Em outro aspecto, a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona é administrada ao roedor por cerca de 7 a 9 dias, antes da inoculação com as larvas L3 de D. immitis. Em outro aspecto, a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona é administrada ao roedor por cerca de 8 dias, antes da inoculação com as larvas L3 de D. immitis. No ou próximo ao 9º dia, o roedor é alimentado com a dieta de 200 ppm de hidrocortisona e é inoculado com as larvas L3 de D. immitis. Após a inoculação com L3, o roedor é alimentado com a dieta de 200 ppm de hidrocortisona por um período e, em seguida, a quantidade de hidrocortisona pode ser reduzida para cerca de 50 ppm, por meio de necropsia. A necropsia pode ser realizada após os vermes adultos imaturos terem se desenvolvido e migrado para o coração, após cerca de 70 a cerca de 120 dias após a inoculação com L3 e, de preferência, em torno de 90 a cerca de 110 dias após a inoculação com L3. Esses vermes adultos imaturos podem ser coletados do roedor e utilizados para estudos de heartworm in vitro e in vivo. Além disso, a necropsia pode ser realizada após os vermes adultos imaturos terem amadurecido e estarem produzindo e liberando microfilárias circulantes na corrente sanguínea em torno de 180 dias a cerca de 260 dias após a inoculação com L3. A dieta de imunossupressão pode continuar além dos 260 dias, particularmente se os vermes adultos tiverem de ser mantidos no animal para produzir microfilária circulante para a coleta ou para estudos adicionais.

[021] Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética de ração para animais de laboratório contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos 3 dias após a inoculação com L3. Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos 5 a cerca de 20 dias após a inoculação com L3. Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos 8 a cerca de 14 dias após a inoculação com L3. Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 12 dias após a inoculação com L3.

[022] Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 21 dias.

[023] Após este período de pré- e pós-inoculação, em que o roedor foi administrado com cerca de 200 ppm de hidrocortisona em uma mistura dietética; a quantidade de hidrocortisona, em uma base de ppm por dia, foi reduzida para os períodos de alimentação subsequentes. A quantidade diária reduzida de hidrocortisona na mistura dietética pode variar de cerca de 25 ppm a cerca de 100 ppm. A quantidade reduzida preferida de hidrocortisona é cerca de 35 ppm a cerca de 75 ppm, e mais preferivelmente, cerca de 50 ppm. Esta quantidade reduzida de hidrocortisona é administrada diariamente na mistura de ração dietética por pelo menos 60 dias, por meio de necropsia. A quantidade reduzida preferida de hidrocortisona é administrada diariamente na mistura de ração dietética por pelo menos 70 dias, por meio de necropsia.

[024] Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos 3 dias a cerca de 8 dias, antes da inoculação comas larvas L3 de D. immitis; administrado com a mesma dieta de 200 ppm de hidrocortisona no dia da inoculação com L3 (isto é, Dia 9); e então administrado com a mesma dieta de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos mais 5 dias a 20 dias e, de preferência, por mais 8 dias a cerca de 14 dias e, mais preferivelmente, por cerca de 12 dias. No ou próximo ao 22º dia da dosagem de imunossupressão, o roedor é então administrado com uma mistura dietética contendo cerca de 50 ppm de hidrocortisona. A dose de 50 ppm de hidrocortisona é administrada por pelo menos 60 dias, por meio de necropsia. De preferência, a dose de 50 ppm de hidrocortisona é administrada por pelo menos 70 dias, por meio de necropsia. Mais preferivelmente, a dose de 50 ppm de hidrocortisona é administrada durante cerca de 94 dias, antes da necropsia. Após cerca de 70 dias a cerca de 120 dias após a inoculação, o roedor pode ser necropsiado e os vermes adultos imaturos coletados para uso em estudos in vitro e in vivo adicionais. De preferência, os vermes adultos imaturos são coletados em torno de 90 a cerca de 110 dias após a inoculação.

[025] Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 8 dias, antes da inoculação com as larvas L3 de D. immitis; administrado com a mesma dieta de 200 ppm de hidrocortisona no dia (isto é, Dia 9) da inoculação com L3; e então administrado com a mesma dieta de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de mais 12 dias. No ou próximo ao 22° dia da dosagem de imunossupressão, o roedor é então administrado com uma mistura dietética contendo cerca de 50 ppm de hidrocortisona. A dose de 50 ppm de hidrocortisona é administrada durante cerca de 94 dias, antes da necropsia para a coleta dos vermes adultos imaturos.

[026] Em outro aspecto, o roedor é administrado com a mistura dietética contendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos 3 a cerca de 8 dias, antes da inoculação com as larvas L3 de D. immitis; administrado com a mesma dieta de 200 ppm de hidrocortisona no dia da inoculação com L3; e então administrado com a mesma dieta de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos mais 8 dias a cerca de

14 dias e, de preferência, por cerca de 12 dias. No ou próximo ao 22º dia da dosagem de imunossupressão, o roedor é então administrado com uma mistura dietética contendo cerca de 50 ppm de hidrocortisona. A dose de 50 ppm de hidrocortisona é administrada por pelo menos 70 dias, por meio de necropsia. Após cerca de 180 dias a cerca de 260 dias de dosagem de 50 ppm de hidrocortisona, o roedor pode ser necropsiado e os vermes adultos maduros coletados para uso em outros estudos in vitro e in vivo; e as microfilárias circulantes também podem ser utilizadas. Em outro aspecto, a dose de 50 ppm de hidrocortisona é administrada por mais de 260 dias, para obter os vermes maduros, conforme descrito acima. Esses vermes em estágio posterior podem ser utilizados para outros estudos in vitro e in vivo.

[027] Em outro aspecto, a invenção é um modelo animal de laboratório imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido animal é alimentado com uma mistura dietética de um agente imunossupressor, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária. Em outro aspecto, é um modelo animal de laboratório imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido animal é alimentado com uma mistura dietética de um agente imunossupressor, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária, em que o agente imunossupressor é um glicocorticoide e o animal de laboratório é um roedor. Em outro aspecto, é um modelo de roedor imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido roedor é alimentado com uma mistura dietética compreendendo o agente imunossupressor hidrocortisona, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária, em que o nematoide dirofilária heartworm é a D. immitis ou a D. repens. Em outro aspecto, é um modelo de roedor imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido roedor é um rato e é alimentado com uma mistura dietética compreendendo cerca de 20 ppm a 250 ppm do agente imunossupressor hidrocortisona, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária, em que o nematoide dirofilária heartworm é a D. immitis. Em outro aspecto, é um modelo de rato imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido rato é alimentado com uma mistura dietética compreendendo cerca de 50 ppm a 200 ppm do agente imunossupressor hidrocortisona, antes e depois da inoculação das larvas L3 de dirofilária de D. immitis. Em outro aspecto, é um modelo de rato imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido rato é alimentado com uma mistura dietética compreendendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos três dias antes da inoculação com as larvas L3 de dirofilária de D. immitis e, então, alimentado com a mistura dietética de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 8 a 14 dias após a inoculação. Em outro aspecto, é um modelo de rato imunossuprimido para nematoides dirofilária heartworm, em que o referido rato é alimentado com uma mistura dietética compreendendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona, por pelo menos três dias antes da inoculação com as larvas L3 de dirofilária de D. immitis e, então, alimentado com a mistura dietética de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 8 a 14 dias após a inoculação e, subsequentemente, alimentado com uma mistura dietética de 50 ppm de hidrocortisona por pelo menos 70 dias, por meio de necropsia.

[028] Em um aspecto da invenção, é um método de exame de agentes endoparasitários, para a prevenção e/ou o tratamento de nematoides de dirofilária, e de preferência a D. immitis, em animais utilizando o modelo animal (por exemplo, roedores) de laboratório imunossuprimido. Em um aspecto da invenção, o agente endoparasitário inclui, porém não está limitado às: lactonas macrocíclicas (por exemplo, selamectina, ivermectina, eprinomectina e semelhantes; as milbemicinas (por exemplo, moxidectina, milbemicina, milbemicina oxima e semelhantes); ciclo- octadepsipeptídeos (por exemplo, emodepsida, compostos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5.514.773; 5.747.448; 5.646.244; e 5.874.530; publicações PCT WO2016/187534 e WO2017/116702) e pedidos PCT (PCT/US2018/62749) e PCT/US2019/031158). Ainda em outro aspecto, o modelo animal (por exemplo,

roedores) de laboratório imunossuprimido pode ser utilizado para examinar os agentes endoparasitários antifilária quanto à prevenção e/ou tratamento potenciais contra os heartworm de D. immitis em caninos. Em outro aspecto, é um método de continuar a expansão dos nematoides de D. immitis no modelo de roedor imunocomprometido, para posterior coleta dos vermes adultos para estudos de exames endoparasiticidas adicionais e para transplante em outros animais para estudos adicionais.

Definições

[029] Para os propósitos da presente invenção, conforme descrita e reivindicada neste documento, os seguintes termos e frases são definidos como se segue:

[030] "Cerca de", como utilizado neste documento, refere-se ao valor indicado da variável e a todos os valores da variável que estejam dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro do intervalo de segurança de 95% para a média) ou dentro de 10 por cento do valor indicado, o que for maior. Em cada situação, o termo "cerca de" pode ser considerado como um termo opcional, que pode ser interpretado como estando ausente da sentença, de forma que as faixas de dias sejam conforme definidas.

[031] A "mistura dietética", como utilizada neste documento, salvo indicação em contrário, refere-se a uma ração para animais de laboratório (por exemplo, Purina Rodent Laboratory Chow, LabDiet Rodent 5001 e 5002; e Animal Specialties & Provisions Rodent LabDiet) misturada com um agente imunossupressor.

[032] O "agente endoparasitário", como utilizado neste documento, salvo indicação em contrário, refere-se aos compostos (medicamentos) veterinários e farmacêuticos que, quando administrados a um animal, previnem e/ou tratam o referido animal infectado com um nematoide de filária; e, em particular, os canídeos.

[033] O(s) "agente(s) imunossupressor(es)", como utilizado(s) neste documento, salvo indicação em contrário, refere(m)-se aos glicocorticoides

(corticosteroides), por exemplo, hidrocortisona, cortisol, prednisolona, betametasona e semelhantes; hormônios imunomoduladores, por exemplo, estrogênio, progesterona, epinefrina e semelhantes; agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, nitrosoureias, compostos de platina); antimetabólitos (por exemplo, análogos do ácido fólico (por exemplo, metotrexato), análogos da purina (por exemplo, azatioprina e mercaptopurina), análogos da pirimidina (por exemplo, fluorouracil) e inibidores da síntese de proteínas; antibióticos citotóxicos (por exemplo, dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina e semelhantes); e medicamentos imunomoduladores, como a ciclosporina, o tacrolimus, o sirolimus e o everolimus.

[034] A "inoculação", como utilizada neste documento, salvo indicação em contrário, refere-se ao hospedeiro (por exemplo, rato) sendo infectado com as larvas L3 ou L4 do nematoide de dirofilária, ou os vermes adultos (imaturos ou maduros).

[035] O(s) "animal(is) de laboratório", como utilizado(s) neste documento, salvo indicação em contrário, refere(m)-se aos coelhos e roedores. O animal de laboratório preferido é um roedor. O roedor preferido é um rato.

[036] O(s) "parasita(s)", conforme utilizado(s) neste documento, salvo indicação em contrário, refere(m)-se aos endoparasitas. Os endoparasitas são parasitas que vivem dentro do corpo de seu hospedeiro e incluem os helmintos (por exemplo, trematódeos, cestódeos e nematoides) e os protozoários. Os endoparasitas preferidos são os nematoides de dirofilária. Um nematoide de dirofilária mais preferido é a Dirofilaria immitis.

[037] O(s) "roedor(es)", como utilizado(s) neste documento, salvo indicação em contrário, refere(m)-se aos animais de laboratório e inclui(em) os camundongos, os ratos, os esquilos-da-mongólia, os hamsters e os porquinhos-da-índia. Os roedores preferidos são os camundongos, os ratos e os esquilos-da-mongólia. Os roedores mais preferidos são os ratos e, em particular, o rato CD (Sprague Dawley) IGS. O rato

CD (Sprague Dawley) IGS é um rato com a marca registrada (CD®) da Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, EUA; nomenclatura: Crl:CD(SD)). CD refere-se a derivado por cesariana e IGS refere-se à Padronização Genética Internacional, que é um programa de controle utilizado para minimizar a endogamia e controlar o desvio genético aleatório que, de outra forma, levaria à divergência de colônias entre as colônias criadas em diferentes locais em todo o mundo.

[038] "Tratamento", "tratando" e/ou "tratar" referem-se todos a reverter, aliviar ou inibir a infecção ou a condição endoparasitária. Como utilizados neste documento, estes termos também abrangem, dependendo da condição do animal, a prevenção do início de um distúrbio ou condição, ou dos sintomas associados a um distúrbio ou condição, incluindo a redução da gravidade de um distúrbio ou condição ou dos sintomas associados a eles, antes do problema com a referida infecção ou infestação ou após a referida infecção ou infestação. No caso da D. immitis, tratar refere-se à prevenção das larvas L3 de sofrerem a muda para o estágio L4 e/ou das larvas L4 de sofrerem a muda para vermes adultos imaturos e, subsequentemente, vermes adultos maduros.

[039] Como utilizado neste documento, a porcentagem de componentes da composição refere-se às porcentagens do peso total da mistura dietética e é referida como "% p/p" ou "p/p %", que define a fração de massa do componente da composição expressa como uma porcentagem, determinada de acordo com a fórmula mi / mtot x 100, em que mi é a massa da substância de interesse presente na composição e mtot é a massa total da composição.

[040] Conforme utilizado neste documento, "pelo menos" se refere a um ou mais dias, semanas ou meses. Por exemplo, pelo menos 3 dias antes da inoculação refere-se a 3 dias, 4 dias, 7 dias e mais, antes da inoculação. O uso do termo "pelo menos" também se refere ao número de dias após a inoculação.

[041] Conforme utilizado neste documento, "ppm" se refere a partes por milhão.

[042] Conforme utilizado neste documento, "L3" refere-se ao estágio larval de um nematoide de dirofilária, por exemplo, Dirofilaria immitis, D. repens, D. tenuis, D.

ursi, D. subdermata, D. lutrae, D. striata e D. espectadores. A larva L3 preferida é a D.

immitis.

Descrição Detalhada

[043] O presente modelo animal de laboratório imunossuprimido, particularmente o modelo de roedor, foi desenvolvido avaliando-se diferentes doses de hidrocortisona, utilizando uma mistura dietética de ração para animais e acetato de hidrocortisona proporcionada aos roedores ad libitum, antes e depois da inoculação com as larvas L3 de D. immitis. Estudos adicionais in vivo investigaram outros parâmetros, como a não imunossupressão, a idade e o sexo do rato, os níveis de inoculação única e múltipla com os heartworm e as durações pós-inoculação. Os ratos infectados foram mantidos por quase 7 meses, quando até 8 vermes adultos de 15,24 centímetros (6 polegadas) de comprimento foram recuperados e as microfilárias observadas, confirmando a conclusão bem-sucedida do ciclo de vida até a fecundidade. Para a validação da eficácia do modelo de rato com D. immitis, foi avaliada a eficácia oral de compostos que representam múltiplas classes antiparasitárias, incluindo a ivermectina, a moxidectina, a emodepsida, os novos ciclo- octadepsipeptídeos, uma isoxazolina e uma bisamida.

[044] Embora o ciclo de vida dos heartworm seja semelhante no rato, no furão e no cão, nós determinamos que a eficácia preventiva pode ser avaliada 1 mês antes no rato (~106 dias) do que no furão e no cão (~140 dias). As lactonas macrocíclicas, ivermectina e moxidectina, que são atualmente utilizadas em terapias preventivas contra heartworm, atingiram uma eficácia de 96,5% e 100% na sua dose de uso. A emodepsida e alguns análogos do ciclo-octadepsipeptídeo também demonstraram 100% de prevenção de heartworm.

[045] O modelo também foi adaptado para apoiar a avaliação da segurança em cães infectados com heartworm adultos, tanto com um modelo in vivo quanto proporcionando heartworm adultos para o teste in vitro. Aproximadamente 4000 heartworm adultos foram gerados para o teste in vitro de mais de 200 compostos. Isso reduziu substancialmente o número de cães fortemente infectados, necessários para obter um número semelhante de vermes. A otimização contínua do modelo resultou em uma redução adicional do regime de imunossupressão para o nível mínimo necessário para garantir a infecção ideal e a saúde geral do roedor. Além disso, os heartworm do rato podem ser excisados e transferidos (transplantados) para um cão, para as avaliações de segurança in vivo com os endoparasiticidas de heartworm.

[046] Os modelos de animais de laboratório são um componente essencial na descoberta de novos medicamentos, reduzindo a necessidade de testes em espécies- alvo de ordem superior, que muitas vezes não podem sustentar o número de compostos e as avaliações necessárias para a triagem inicial na busca principal e na otimização principal. O novo modelo de roedor com heartworm demonstrou uma boa correlação com o modelo de eficácia da prevenção em cães e a capacidade de reduzir o número de cães necessários para avaliar compostos tanto in vitro quanto in vivo, ao mesmo tempo encurtando os prazos para decisões importantes. Existem diferentes raças de laboratório de rato e incluem os exemplos não limitativos: rato Wistar, rato Sprague-Dawley, incluindo o rato CD (Sprague Dawley) IGS, rato sem pelo, rato Long- Evans, rato Wistar Han IGS, rato Brown Norway, rato Copenhagen, rato Fischer, rato F344 e o rato Lewis. O rato CD (Sprague Dawley) IGS é um rato preferido devido às suas características de peso e tamanho.

[047] Os agentes imunomoduladores incluem os corticosteroides. Os corticosteroides estão envolvidos em uma ampla gama de processos fisiológicos, incluindo a resposta ao estresse, a resposta imunológica, a regulação da inflamação, o metabolismo de carboidratos, o catabolismo de proteínas, os níveis de eletrólitos no sangue e o comportamento. Os corticosteroides regulam decrescentemente o sistema imunológico e afetam a funcionalidade dos glóbulos brancos. Os corticosteroides são medicamentos sintéticos que se assemelham muito ao cortisol, um hormônio que ocorre naturalmente, produzido pelas glândulas suprarrenais de mamíferos. Pela estrutura química, os corticosteroides são classificados em diferentes grupos. O grupo A é definido como corticosteroides do tipo hidrocortisona que incluem a hidrocortisona e os seus respectivos sais (por exemplo, acetato, butirato, hemissuccinato, fosfato de sódio, succinato de sódio e valerato), o etabonato de loteprednol, a betametasona, a dexametasona, a fluorometolona, a metilprednisolona, a prednisolona, a prednisona, a rimexolona, o cortisol e a triancinolona. O grupo B é definido como acetonidas e incluem, por exemplo, a amcinonida, a butesonida, a desonida, a fluocinolona, a fluocinonida, a halcinonida e a acetonida triancinolona. O grupo C é definido como tipos betametasona e incluem, por exemplo, a beclometasona, a betametasona, a dexametasona, a fluocortolona, a halometasona e a mometasona. O corticosteroide refere-se tanto aos glicocorticoides quanto ao mineralocorticoides. Os corticosteroides preferidos são os glicocorticoides que modulam a inflamação e o sistema imunológico.

O termo glicocorticoide é uma palavra-valise (glicose + córtex (adrenal) + esteroide) composta a partir do seu papel na regulação do metabolismo da glicose, síntese no córtex adrenal (cortisol) e sua estrutura esteroide. O glicocorticoide preferido é a hidrocortisona e os seus sais de hidrocortisona, prednisolona e dexametasona. O glicocorticoide mais preferido é a hidrocortisona e os seus sais de hidrocortisona. O glicocorticoide ainda mais preferido é o acetato de hidrocortisona. Em particular, o glicocorticoide mais preferido é o hidrocortisona-21-acetato. A manipulação do sistema imunológico no roedor desta forma não parece ter afetado a função dos medicamentos preventivos contra os heartworm conhecidos em proporcionar eficácias semelhantes, como é verificado em estudos semelhantes utilizando o modelo de cão, oferecendo a segurança de que este modelo de rato será preditivo de novos compostos que proporcionarão uma eficácia preventiva semelhante contra os heartworm em cães.

[048] Além dos glicocorticoides, podem ser utilizados outros agentes imunomoduladores no modelo animal de laboratório. Esses agentes imunomoduladores adicionais incluem os hormônios que incluem, porém não estão limitados ao, estrogênio, progesterona, androgênio, progestina, testosterona, epinefrina e desidroepiandrosterona (DHEA). Além disso, agentes imunossupressores, incluindo, porém não se limitando a, agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, nitrosoureias, compostos de platina); antimetabólitos (por exemplo, análogos de ácido fólico (por exemplo, metotrexato), análogos de purina (por exemplo, azatioprina e mercaptopurina), análogos de pirimidina (por exemplo, fluorouracil) e inibidores da síntese de proteínas; antibióticos citotóxicos (por exemplo, dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina e semelhantes); e medicamentos imunomoduladores, como a ciclosporina, o tacrolimus, o sirolimus e o everolimus.

[049] O agente imunossupressor pode ser administrado ao animal de laboratório, particularmente aos roedores, por via oral, tópica e por injeção (intramuscular, subcutânea e intravenosa). As vias orais de administração são as vias preferidas e incluem a gavagem e a mistura dietética. A via preferida é por mistura dietética.

[050] A mistura de ração dietética foi preparada em um processo de duas etapas. Primeiro, foi preparada uma mistura concentrada do Tipo A (20.000 ppm; 2% p/p) de hidrocortisona. A cerca de 977,22 g (~98% p/p) de LabDiet 5002 rodent (farinha) foram adicionados 22,78 gramas de acetato de hidrocortisona (~20 g de hidrocortisona). A farinha para roedor e o acetato de hidrocortisona foram misturados uniformemente. Em segundo lugar, uma parte (ou toda) da mistura de hidrocortisona concentrada foi misturada com mais ração LabDiet 5002 rodent, em um misturador,

por cerca de 20 minutos. Uma vez uniforme, a água (10% p/p) foi adicionada à mistura e misturou-se por mais 10 minutos. A mistura úmida foi peletizada e seca. A mistura dietética peletizada contém cerca de 200 ppm de hidrocortisona. Foram feitas quantidades menores (por exemplo, 50 ppm) e maiores (por exemplo, 250 ppm) de pelotas de mistura dietética prontas para alimentação ajustando a quantidade da mistura de hidrocortisona concentrada que foi adicionada à ração. A dosagem de imunossupressão é baseada na quantidade de hidrocortisona na mistura de ração. O peso molecular da hidrocortisona é 362,46 g/mol e o peso molecular do acetato de hidrocortisona é 404,5 g/mol. Portanto, cerca de 1,116 mg de acetato de hidrocortisona é adicionado a cerca de 998,884 g de ração para preparar uma mistura dietética de 1 mg/kg (~1 ppm) de hidrocortisona.

[051] Após o recebimento, os ratos recém-adquiridos são alimentados com uma dieta normal de ração para ratos de laboratório por alguns dias, para aclimatação.

Assim que a dieta de imunossupressão começa, os ratos podem ser alimentados com uma mistura dietética de glicocorticoide (por exemplo, hidrocortisona) por cerca de 130 dias, utilizando pelo menos duas concentrações de dosagem em torno de 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, 175 ppm, 200 ppm, 225 ppm e 250 ppm. As quantidades de doses intermitentes de um glicocorticoide (por exemplo, hidrocortisona) também incluem, por exemplo, 65 ppm, 80 ppm, 115 ppm, 135 ppm, 160 ppm, 180 ppm, 190 ppm, 210 ppm, 230 ppm e 245 ppm e semelhantes.

[052] Os estudos anteriores mostraram que os ratos alimentados com uma dieta de 200 ppm de hidrocortisona, por cerca de 120 dias, tiveram uma incidência aumentada de mortalidade. Portanto, para manter o crescimento, a saúde e o comportamento normais dos ratos, a dieta de 200 ppm de hidrocortisona deve ser fornecida durante cerca de 85 dias; preferivelmente cerca de 60 dias, e mais preferivelmente cerca de 30 dias, e ainda mais preferivelmente cerca de 21 dias. A duração da dieta de 200 ppm inclui o período de pré-inoculação com L3, o dia de inoculação com L3 e o período de pós-inoculação com L3. Depois disso, os ratos podem ser alimentados com a dieta imunossupressora, com uma quantidade reduzida de hidrocortisona em torno de 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm ou 60 ppm, por meio de necropsia. A quantidade reduzida preferida de hidrocortisona é cerca de 50 ppm.

Os ratos devem ser mantidos na dieta imunossupressora contendo cerca de 50 ppm de hidrocortisona por pelo menos 60 dias, por meio de necropsia e, de preferência, por pelo menos 70 dias, por meio de necropsia. Um plano de dieta de imunossupressão preferido inclui alimentar o roedor com uma mistura dietética de 200 ppm de hidrocortisona durante cerca de 8 dias, antes da inoculação com D. immitis L3; em seguida, continuar alimentando o rato com a mesma mistura dietética de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 13 dias após a inoculação (incluindo o dia da inoculação); em seguida, continuar alimentando o rato com uma mistura dietética de 50 ppm de hidrocortisona por pelo menos 60 dias, por meio de necropsia, e, de preferência, por pelo menos 70 dias, por meio de necropsia. De preferência, o roedor é alimentado com a mistura dietética de 50 ppm de hidrocortisona por cerca de 90 dias a cerca de 100 dias e, de preferência, cerca de 94 dias, antes da necropsia, o que permite que os vermes adultos imaturos migrem para o coração e os pulmões, onde podem ser coletados mais facilmente. Uma duração mais longa (cerca de 180 a cerca de 260 dias após a inoculação de L3) da dieta de 50 ppm de hidrocortisona pode ser fornecida ao rato para permitir que os vermes adultos imaturos amadureçam e comecem a produzir e liberar as microfilárias (L1) na corrente sanguínea. Além disso, a quantidade reduzida de hidrocortisona pode ser administrada na mistura dietética por mais de 260 dias após a inoculação, para manter os vermes adultos maduros in vivo para estudos futuros.

[053] O sangue heparinizado de cães infectados com os vermes D. immitis adultos expandios e as microfilárias circulantes de D. immitis foi obtido e alimentado na membrana nos mosquitos Aedes aegypti. O sangue infectado continha cerca de

50-100 microfilárias/20 µL. Após cerca de 15-17 dias após a alimentação, os mosquitos foram coletados e esmagados para obter as larvas L3 infectantes. As larvas foram armazenadas em um meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), que é um meio de cultura de células e tecidos utilizado para o crescimento de linhagens celulares de mamíferos. O RPMI é uma mistura nutriente de aminoácidos, vitaminas, suplementos orgânicos e inorgânicos e sais. As larvas L3 foram injetadas no rato, em um volume de cerca de 0,2 mL do meio de cultura RPMI.

[054] O antígeno D. immitis pode ser monitorado utilizando um ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), para a detecção de antígeno para o antígeno D. immitis adulto, em plasma ou soro canino e felino. Por exemplo, o kit de teste DiroCHECK® pode ser utilizado para detectar o antígeno D. immitis, particularmente a partir de vermes fêmeos adultos. Outros anticorpos IgG e testes sorológicos podem ser utilizados para monitorar o(s) antígeno(s). Além disso, os testes de reação em cadeia por polimerase (PCR) podem ser realizados para comprovar ainda mais a Dirofilaria spp.

[055] O Dirofilaria é um gênero de nematoides, ou nematelmintos, na família Onchocercidae. Algumas espécies causam a dirofilariose, um estado de infecção parasitária, em humanos e animais. Existem cerca de 27 espécies no gênero. Em geral, estas são divididas em dois subgêneros, Dirofilaria e Nochtiella. Algumas espécies são parasitas bem conhecidos, incluindo a D. immitis, o heartworm de cães, a Dirofilaria repens, que afeta muitos tipos de mamíferos não humanos, e a Dirofilaria tenuis, que normalmente parasita os guaxinins, porém também pode infectar os seres humanos. A dirofilariose humana em geral é causada por D. immitis e D. repens. A primeira pode causar a dirofilariose pulmonar, que pode não apresentar sintomas.

Outra forma da infecção pode ser caracterizada por um caroço doloroso sob a pele ou uma infecção do olho. A infecção pelo nematoide é disseminada pelos mosquitos. As espécies no gênero incluem: D. acutiuscula, D. aethiops, D. ailure, D. asymmetrica, D.

cancrivori, D. conjunctivae, D. corynodes, D. desportesi, D. fausti, D. freitasi, D.

genettae, D. hystrix, D. immitis (heartworm de cães), D. indica, D. louisianensis, D.

macacae, D. macrodemos, D. magalhaesi, D. magnilarvata, D. pongoi, D. reconditum, D. repens, D. timidi, D. uniformis, D. ursi, D. tawila e D. tenuis. Os nematoides de dirofilária preferidos são a D. immitis e a D. repens. O nematoide de dirofilária mais preferido é a D. immitis.

Exemplos

[056] Em um estudo inicial, trinta e dois ratos machos CD (Sprague Dawley) IGS pesando 175-250 gramas foram randomizados em 4 grupos de tratamento (n = 8/grupo). Cada grupo recebeu uma dieta medicamentosa contendo acetato de hidrocortisona. T01, T02 e T03 receberam uma dose de 200 ppm, 100 ppm e 50 ppm de hidrocortisona, respectivamente, por 120 dias. O quarto grupo, T04, recebeu uma dose de 200 ppm até o Dia 17; a dosagem subsequente por meio de necropsia foi com 50 ppm de hidrocortisona. A ração foi administrada ad-libitum. No Dia 6, os animais foram inoculados com aproximadamente 15 larvas L3 de D. immitis (cepa Michigan), por injeção subcutânea na área inguinal. No Dia 114 pós-inoculação, os ratos foram necropsiados e as contagens de vermes adultos avaliadas. No total, cerca de 3, 11, 5 e 19 vermes adultos foram coletados dos grupos T01, T02, T03 e T04, respectivamente.

[057] Em um segundo estudo, a duração da imunossupressão e o momento da inoculação foram avaliados, para estabelecer critérios para as infecções consistentes pelos heartworm de cães adultos no rato. Foram utilizados no estudo ratos machos e fêmeos CD (Sprague Dawley) IGS pesando 40-50 gramas (Grupo A) e 151-175 gramas (Grupo B). O projeto do estudo é descrito abaixo, na Tabela 1.

Tabela 1. Projeto do Estudo quanto à duração da imunossupressão e momento da inoculação com a D. immitis nos ratos Dia No. de Inoculação Dias de Dias de Dia da pós- Grupo animais com L3 imunossupressão imunossupressão necropsia inoculação (gênero) dia 200 ppm 50 ppm (±1)

T01 6M 0 Nenhum Nenhum 98 98 (A) T02 6M 0 Nenhum Nenhum 112 112 (A) T03 6M 0 Nenhum Nenhum 126 126 (A) T04 6M 0 Nenhum Nenhum 140 140 (A) T05 6M 0 -8 a 7 7 - 98 98 98 (A) T06 6M 0 -8 a 7 7 - 112 112 112 (A) T07 6F 0 -8 a 7 7 - 112 112 112 (A) T08 6M 0 -8 a 7 7 - 126 126 126 (A) T09 6M 0 -8 a 7 7 - 140 140 140 (A) T10 6M 7 -8 a 21 21 - 98 105 98 (A) T11 6M 7 -8 a 21 21 - 112 119 112 (A) T12 6M 7 -8 a 21 21 - 126 133 126 (A) T13 6M 7 -8 a 21 21 - 140 147 140 (A) T14 6M 7 -8 a 21 21 - 98 105 98 (B) T15 6M 7 -8 a 21 21 - 112 119 112 (B) T16 6F 7 -8 a 21 21 - 112 119 112 (B) T17 6M 7 -8 a 21 21 - 126 133 126 (B) T18 6M 7 -8 a 21 21 - 140 147 140 (B)

[058] No Dia -8, a dieta de hidrocortisona medicamentosa a 200 ppm foi fornecida aos grupos de tratamento T05-T18. No Dia 0, os grupos de tratamento T01- T09 receberam uma inoculação de aproximadamente 50 larvas L3 de D. immitis (cepa Michigan), em 0,2 mL de RPMI, injetadas por via subcutânea na área inguinal. No Dia 7, T10-T18 receberam uma inoculação de aproximadamente 50 (2x25) D. immitis L3 por injeção subcutânea na área inguinal. No Dia 7, os Grupos T05 -T09 foram convertidos da dieta de 200 ppm de hidrocortisona para a dieta de 50 ppm de hidrocortisona. No Dia 21, os grupos T10 - T18 foram convertidos da dieta de 200 ppm de hidrocortisona para a dieta de 50 ppm de hidrocortisona. A dieta para todos os grupos foi administrada ad-libitum. A necropsia ocorreu nos Dias 98, 112, 126 e 140

(± 1) após a inoculação. O sangue foi obtido na necropsia, para testar o antígeno de D. immitis utilizando o teste sorológico baseado no ELISA DiroCHECK. Os dados deste estudo são apresentados abaixo, nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2. Resultados do estudo quanto à duração da imunossupressão e momento deainoculação com a D. immitis nos ratos. Contagens de vermes da Contagem média de Porcentagem de ratos Grupo digestão da cavidade vermes (faixa) com infecção (n) corporal T01 0 (0) 0 (6) 0 T02 0 (0) 0 (6) 0 T03 0,3 (0-2) 17 (6) 0 T04 0 (0) 0 (6) 0 T05 4,2 (2-8) 100 (5) 0 T06 6,0 (5-7) 100 (5) 2 T07 0 (0) 0 (6) 0 T08 5,3 (4-11) 100 (4) 7 T09 2,4 (0-6) 60 (5) 5 T10 2,2 (2-7) 60 (5) 0 T11 5,5 (2-11) 100 (4) 2 T12 5,3 (0-9) 83 (6) 4 T13 4,0 (3-6) 100 (4) 4 T14 3,6 (0-6) 83 (6) 0 T15 5,7 (2-8) 100 (6) 5 T16 0,2 (0-1) 17 (6) 0 T17 7,3 (2-16) 100 (6) 8 T18 7,7 (4-18) 100 (6) 14

[059] Como pode ser visto na Tabela 2, apenas 1 rato não imunossuprimido tinha vermes (T06), mostrando que a imunossupressão é necessária para estabelecer as cargas de vermes significativas para os estudos. Os ratos fêmeos estavam quase sem vermes, demonstrando claramente um componente de gênero nos ratos que causa um estado não tolerante, ou talvez, um estado semitolerante. Para os grupos imunossuprimidos machos, foram atingidos 96% de ratos maduros, com uma média de 5,9 vermes, e 87% de ratos recém-desmamados, com uma média de 4,3 vermes.

A extensão da duração da dieta de 200 ppm para ou após a inoculação não teve um efeito positivo ou negativo significativo. Um desafio de inoculação dupla aumentado produziu um aumento na carga de vermes e uma maior porcentagem de ratos infectados. Os ratos recém-desmamados são suscetíveis a efeitos adversos, incluindo a mortalidade em uma dieta imunossuprimida de 200 ppm. O número de vermes recuperados da cavidade corporal aumentou à medida que o dia da necropsia do estudo era estendido. A digestão pulmonar auxiliou na recuperação de vermes adicionais.

[060] Um terceiro estudo foi conduzido para avaliar a eficácia do medicamento de compostos selecionados, com os compostos e as dosagens selecionados com base na eficácia de estudos anteriores em furões e cães no modelo de rato com D.

immitis; e para determinar o efeito da retirada da imunossupressão no Dia 70. Os ratos CD (Sprague Dawley) IGS machos pesando 150-175 gramas foram randomizados em grupos de tratamento específicos (n = 6/grupo). No Dia -8, a dieta de hidrocortisona medicamentosa a 200 ppm foi fornecida ad-libitum a todos os grupos de tratamento.

No Dia 0, as larvas infectadas foram coletadas do Aedes aegypti aproximadamente 15-17 dias após a alimentação por membrana com sangue heparinizado contendo 50- 100 microfilárias/20 µl. Os ratos foram inoculados com aproximadamente 50 (2x25) larvas L3 de D. immitis (cepa Michigan), por injeção subcutânea na área inguinal. No Dia 21, todos os animais tiveram a dieta de 200 ppm de hidrocortisona removida e substituída por dieta de 50 ppm de hidrocortisona. No Dia 30, todos os grupos receberam uma medicação de tratamento (moxidectina (MOX), ivermectina (IVM),

emodepsida (EMO), uma bisamida, um ciclo-octoadepsipeptídeo ou uma isoxazolina) por injeção subcutânea. Nos Dias 34 e 38, os grupos T09, T10 e T11 receberam mais injeções subcutâneas da medicação de tratamento. No Dia 70, o grupo T13 recebeu uma dieta não medicamentosa até a necropsia. No Dia 112 (± 1) pós-inoculação, todos os animais foram necropsiados quanto à presença de vermes adultos de D. immitis.

Uma amostra de sangue foi obtida na necropsia para o antígeno D. immitis ((Ag); Ag+ (positivo)). Um procedimento de digestão pulmonar foi conduzido para coletar vermes adicionais. Os medicamentos de tratamento foram dosados por injeção subcutânea.

O projeto do estudo é mostrado abaixo, na Tabela 3, e os resultados do estudo são descritos nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 3. Projeto do estudo quanto à eficácia de vários compostos no modelo de rato imunossuprimido para D. immitis Dia da Dias da necropsia Dose Dia(s) de Dias da dieta Grupo Tratamento dieta de pós- (mg/kg) dosagem de 50 ppm 200 ppm inoculação (±1) T01 Controle 0 30 -8 a 21 21 - 112 112 T02 IVN 0.001 30 -8 a 21 21 - 112 112 T03 IVN 0.003 30 -8 a 21 21 - 112 112 T04 MOX 0.001 30 -8 a 21 21 - 112 112 T05 MOX 0.003 30 -8 a 21 21 - 112 112 T06 EMO 5 30 -8 a 21 21 - 112 112 T07 EMO 1 30 -8 a 21 21 - 112 112 T08 Bisamida 10 30 -8 a 21 21 - 112 112 30, 34 e T09 Depsi-1 10 -8 a 21 21 - 112 112 38 30, 34 e T10 Depsi-2 10 -8 a 21 21 - 112 112 38 30, 34 e T11 Depsi-3 10 -8 a 21 21 - 112 112 38 T12 Isoxazolina 30 30 -8 a 21 21 - 112 112 T13 Controle W 0 N/A -8 a 21 21 - 70 112 T14 Controle L 0 N/A -8 a 21 21 - 112 112 T15 Controle 0 N/A -8 a 21 21 - 112 120 T16 Controle 0 N/A -8 a 21 21 - 112 128 Depsi (1-3) = Novos ciclo-octadepsipeptídeos Controle L (T14) = digestão pulmonar apenas

[061] No Dia -8, a dieta de hidrocortisona medicamentosa a 200 ppm foi fornecida a todos os grupos de tratamento. No Dia 0, as larvas infectadas foram coletadas do Aedes aegypti aproximadamente 15-17 dias após a alimentação por membrana com sangue heparinizado contendo 50-100 microfilárias/20 µl. Os ratos foram inoculados com aproximadamente 50 (2x25) larvas L3 de D. immitis (cepa Michigan), por injeção subcutânea na área inguinal. No Dia 21, todos os animais tiveram a dieta de 200 ppm de hidrocortisona removida e substituída por dieta de 50 ppm de hidrocortisona. No Dia 30, todos os grupos receberam uma medicação de tratamento (moxidectina, ivermectina, emodepsida, uma bisamida, um ciclo- octoadepsipeptídeo ou uma isoxazolina) por injeção subcutânea. Nos Dias 34 e 38, os grupos T09, T10 e T11 receberam mais injeções subcutâneas da medicação de tratamento. No Dia 70, o grupo T13 recebeu uma dieta não medicamentosa até a necropsia. No Dia 112 (± 1) após a inoculação, todos os animais foram necropsiados quanto à presença de D. immitis. Uma amostra de sangue também foi obtida na necropsia para o antígeno D. immitis. Um procedimento de digestão pulmonar também foi realizado para coletar vermes adicionais.

Tabela 4. Contagens médias aritméticas de heartworm e % de eficácia em ratos No. de Dia(s) de Necropsia Contagem No. ratos Grupo Dose dosagem dia média de de % de Tratamento com (n=6) (mg/kg) pós- pós- vermes Ag+ Eficácia infecção inoculação inoculação (faixa) (n=6) 7,5 T01 Controle 0 30 112-114 6 2 N/A (5-13) 0,8 T02 IVM 0,001 30 112-114 5 2 89,3 (0-2) 0,3 T03 IVM 0,003 30 112-114 1 2 96,5 (0-2) 0,67 T04 MOX 0,001 30 112-114 4 1 91,7 (0-1) T05 MOX 0,003 30 112-114 0 0 0 100 112-114 T06 EMO 5,00 30 0 0 1 100 1,8 T07 EMO 1,00 30 112-114 3 1 75,6 (2-5) 5,8 T08 Bisamida 10 30 112-114 6 3 24,6 (2-10) 30, 34 e T09 Depsi-1 10 112-114 0 0 0 100 38

30, 34 e T10 Depsi-2 10 112-114 0 0 2 100 38 30, 34 e T11 Depsi-3 10 112-114 0 0 2 100 38 112-114 5,3 T12 Isoxazolina 30 30 6 4 28,9 (2-11)

[062] A Tabela 4 demonstra que os ratos do grupo de controle (T01) tiveram uma infecção com uma média de 7,5 vermes por rato. Os grupos de ivermectina (IVM) e moxidectina (MOX) atingiram uma resposta de eficácia da dose semelhante de 89,3% e 96,5% para a IVM a 0,001 e 0,003 mg/kg e 91,7% e 100% para a moxidectina nas mesmas doses, respectivamente. O emodepsida também atingiu uma eficácia percentual de resposta à dose de 75,6 e 100 a 1,0 e 5,0 mg/kg, respectivamente.

Todos os três ciclo-octadepsipeptídeos dosados a 10 mg/kg nos dias 30, 34 e 38 atingiram 100% de eficácia. A bisamida e a isoxazolina administradas a 10 e 30 mg/kg foram ineficazes, atingindo 24,6% e 28,9% de eficácia, respectivamente.

[063] No geral, o estudo atingiu eficácias comparáveis aos compostos que tinham sido dosados em cães e/ou furões. Os testes de antígeno (DiroCHECK) não foram totalmente preditivos de infecção por vermes; possivelmente porque o teste detecta apenas pedaços minúsculos de proteínas da pele do heartworm fêmeo (não macho) que circulam no sangue.

Tabela 5. Contagens médias aritméticas de heartworm em ratos Dia da Contagem No. de ratos No. de Grupo necropsia média de com Tratamento recuperados (n=6) pós- vermes infecção por digestão inoculação (faixa) (n=6) Controle (dia 70 de

4.5 Não T13 retirada da dieta 112-114 6 (1-8) Registrado medicamentosa) Controle (digerir no 4.5 T14 112-114 6 *12 pulmão) (2-7) Controle (estender +8 8.2 T15 120 6 3 dias) (3-13) Controle (estender +16 3.8 T16 128 6 dias) (2-10) * Sem dissecção do pulmão empregada

[064] A Tabela 5 mostra que a substituição da dieta medicamentosa no Dia 70 por não medicamentosa (T13) diminuiu moderadamente a carga de vermes, assim como a recuperação do verme por digestão pulmonar (T14), quando se compara com T13. A extensão da duração da infecção para 120 (T15) e 128 (T16) dias após a inoculação atingiu médias de carga de vermes ligeiramente aumentadas e diminuídas, respectivamente. Todos os ratos de controle tinham vermes e não foi observado qualquer efeito adverso ao longo do estudo. A digestão pulmonar demonstrou recuperar um baixo número de vermes adicionais e foi melhor empregada como um procedimento de contribuição para a dissecção.

[065] Um quarto estudo foi conduzido para determinar o efeito da retirada da dieta imunossuprimida em estágios da vida estratégicos de infecção por D. immitis em ratos. Os ratos CD (Sprague Dawley) IGS machos pesando 150-175 gramas foram utilizados para este estudo (n = 6/grupo). No Dia -8, a dieta de hidrocortisona medicamentosa a 200 ppm foi fornecida a todos os grupos de tratamento, ad libitum.

No Dia 0, L3 foram coletadas do A. aegypti aproximadamente 15-17 dias após a alimentação por membrana de sangue heparinizado contendo 50-100 microfilárias/20 µl. Os ratos foram inoculados com aproximadamente 60 (2x30) larvas L3 de D. immitis, por injeção subcutânea na área inguinal. No Dia 21, todas as dietas de 200 ppm de hidrocortisona foram substituídas por uma dieta de 50 ppm de hidrocortisona. No Dia 31, as gaiolas 1, 2 e 3 tiveram a dieta de 50 ppm de hidrocortisona removida e substituída por dieta não medicamentosa de rato padrão. No Dia 45, as gaiolas 4, 5 e 6 tiveram a dieta de 50 ppm de hidrocortisona removida e substituída por dieta não medicamentosa de rato padrão. No Dia 62, as gaiolas 7, 8, 9 e 10 tiveram a dieta de 50 ppm de hidrocortisona removida e substituída por dieta não medicamentosa de rato padrão. Todos os ratos foram necropsiados no Dia 119 (± 1) após a inoculação. O projeto do estudo é apresentado na Tabela 6 e os dados do estudo são apresentados na Tabela 7.

Tabela 6. Projeto do estudo para a retirada da dieta

Dia da Dia de Dias da Dias da necropsia No. No. da Grupo Tratamento inoculação dieta de dieta de (±1) de gaiola 200 ppm 50 ppm pós- ratos inoculação T01 Controle 0 -8 a 21 21 - 31 119 1, 2, 3 6 T02 Controle 0 -8 a 21 21 - 45 119 4, 5, 6 6 7, 8, 9, T03 Controle 0 -8 a 21 21 - 62 119 8 10 Tabela 7: Contagens médias de vermes com retirada da dieta variada Dia da Dia da Contagem retirada da necropsia de Média Média Grupo Animal dieta (pós- (pós- vermes aritmética geométrica inoculação) inoculação) vivos 1 0 2 0 3 0 4 0 31 0 0 T01 119 5 0 6 0 7 1 8 2 9 5 T02 10 0 45 119 3,17 1,91 11 0 12 11 13 2 14 1 15 3 16 6 17 0 T03 62 119 18 15 4,25 2,85 19 5 20 2

[066] Em 3 ocasiões separadas anteriores (todos os dados não mostrados), utilizando 12 ratos no total, a retirada da dieta imunossuprimida no Dia 70 pós- inoculação demonstrou pouco ou nenhum efeito sobre as carga de vermes. No geral, a redução da imunossupressão até o nível mínimo necessário é benéfica para o estado geral de saúde dos animais em estudo e reduz potencialmente qualquer efeito sobre os tratamentos administrados após a retirada da dieta medicamentosa.

[067] Os dados de vários estudos foram compilados para correlacionar os dados de dose de ratos e cães. Como pode ser visto na Tabela 8, a eficácia atingida entre o rato e o cão, nas doses recomendadas (aprovadas) de lactona macrocíclica

(ML) para o cão, foram, em geral, comparáveis no rato. Os cães foram inoculados com aproximadamente 50 larvas L3 de D. immitis (cepa suscetível UGA (University of Georgia)) e foram administrados oralmente com a ML ou a emodepsida em 1, 1,5 e/ou 2 meses após a inoculação. Os cães foram necropsiados em torno de 5 meses após a inoculação. Os ratos foram inoculados com aproximadamente 50 larvas L3 de D.

immitis (cepa susceptível Michigan) e foram administrados com a ML ou a emodepsida, por injeção subcutânea, em 1 mês após a inoculação. Os ratos foram necropsiados em torno de 4 meses após a inoculação. Como pode ser observado na Tabela 8, a eficácia entre a dosagem subcutânea no rato e a dosagem oral nos modelos de cães se correlacionou bem. Assim, a eficácia dos medicamentos antifilárias no modelo do rato se correlaciona bem com a eficácia no modelo do cão.

Os estudos estão em andamento para comparar diretamente a dosagem oral no rato versus a dosagem subcutânea utilizando cepas de heartworm suscetíveis. Também foi verificado que o ciclo de vida da D. immitis no rato imunossuprimido era cerca de 1 mês mais curto do que nos cães. Essa economia de tempo proporciona uma redução adicional no custo de alojamento da colônia de animais.

Tabela 8. Correlação da eficácia do medicamento em modelos de ratos (SQ) e cães (oral) com heartworm (D. immitis) Dose oral Dose SQ testada Dose oral aprovada no testada no cão no rato Mês(es) pós- % de Eficácia cão (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) inoculação dosada 1,25 - 1,2 100 0,625 - 2 100 Moxidectina 0,5 - 2 100 (3) - 1 1 92 - 3 1 100 1 - 1 53 2 - 1 83-97 3,3 - 1 98 6 - 1 100 Ivermectina 2 - 1,5 64 (6) 6 - 1,5 100 - 1 1 89 - 3 1 97-100 - 6 1 100 Emodepsida 1 - 1 58 (N/A) 3 - 1 88

5 - 1 97 10 - 1 97 - 1 1 76 - 5 1 100

[068] Ainda em outro estudo, a moxidectina foi utilizada para tratar ratos CD (Sprague Dawley) IGS imunossuprimidos machos (250-350g), infectados com 2 cepas de D. immitis resistentes à lactona macrocíclica caracterizadas, para avaliar a eficácia e a exposição plasmática. Os ratos foram inoculados com larvas L3 das cepas de D.

immitis ZoeMI-01 (ZM1) e JYD-34. T01 e T06 eram grupos de controle (C). Os animais receberam uma dose de 3, 12 ou 24 µg/kg de moxidectina, 28 dias após a inoculação com L3. Além disso, dois grupos, T05 e T10, receberam doses de 3 µg/kg 28, 56 e 84 dias após a inoculação com L3. A moxidectina foi administrada por gavagem oral. Os animais foram necropsiados 120 dias após a inoculação com L3 e os vermes foram coletados. Os dados para este estudo de eficácia são proporcionados na Tabela 9.

Tabela 9. Contagens Médias Geométricas de Vermes e Eficácia em Ratos Dia da Dose Dosagem Número Grup necropsia Contagen % de Cep Tratament oral pós- de ratos o (pós- s médias Eficáci a o (µg/kg inoculaçã infectado (n=4) inoculação de vermes a ) o (dia(s)) s ) T01 ZM1 C 0 28 120 5,6 4 N/A T02 ZM1 MOX 3 28 120 1,1 3 81 T03 ZM1 MOX 12 28 120 0 0 100 T04 ZM1 MOX 24 28 120 0 0 100 T05 ZM1 MOX 3 28, 56, 84 120 0 0 100 JYD- T06 C 0 28 120 3,9 4 N/A 34 JYD- T07 MOX 3 28 120 6,0 4 0 34 JYD- T08 MOX 12 28 120 2,8 *3 28 34

JYD- T09 MOX 24 28 120 0,5 1 87 34 JYD- T10 MOX 3 28, 56, 84 120 2,4 4 38 34 * Um rato morreu antes da necropsia

[069] A moxidectina administrada por gavagem oral, em 28 dias após a infecção contra uma cepa de D. immitis suscetível à lactona macrocíclica (ML) (ZM1; T-02), a 3 µg/kg, atingiu uma eficácia de 81%. Quando administrada de forma semelhante, a 12 e 24 µg/kg em 28 dias após a infecção e em 28, 56 e 84 dias após a infecção a 3 µg/kg, foi atingida uma eficácia de 100%. A moxidectina administrada por gavagem oral, em 28 dias após a infecção contra uma cepa de D. immitis resistente JYD ML, a 24 µg/kg, foi 87% eficaz. No geral, a eficácia e a exposição plasmática da moxidectina oral, utilizando regimes de dosagens variados contra duas cepas de D. immitis, demonstraram que o modelo de rato pode avaliar com precisão a susceptibilidade ao medicamento in vivo das cepas resistentes à ML que se correlacionam com resultados semelhantes no cão. Estudos adicionais estão sendo planejados para avaliar mais compostos e cepas.

Ensaios de Vermes Adultos (imaturos e maduros) de D. immitis (in vitro e in vivo)

[070] Os heartworm adultos foram obtidos do coração e dos pulmões de ratos assepticamente após a eutanásia. Os vermes adultos foram mantidos em um meio de cultura de células de uso geral durante cerca de 7-10 dias, a 37°C. Para o ensaio in vitro, os compostos de teste foram dissolvidos e diluídos em série em sulfóxido de dimetila (DMSO). As alíquotas foram adicionadas aos poços vazios das placas de ensaio. O meio de cultura de células e um único verme de D. immitis adulto (imaturo/maduro) foram adicionados a cada poço, para diluir os compostos de teste até as concentrações desejadas. As placas de ensaio foram incubadas durante aproximadamente 24 horas e os vermes nos poços de ensaio foram observados visualmente quanto ao efeito do medicamento. Os vermes foram avaliados subjetivamente quanto à sobrevivência ou paralisia, e os resultados foram descritos como Dose Efetiva Mínima (MED). Os dados para esses ensaios não estão descritos.

[071] Para os estudos futuros in vivo, os heartworm adultos imaturos, extraídos de ratos imunossuprimidos, serão cirúrgica ou diretamente transferidos para o sistema circulatório dos cães. Esses estudos, se bem-sucedidos, reduzirão ou eliminarão a necessidade de doadores caninos de heartworm adultos para estudos experimentais. Esses cães receptores serão monitorados quanto aos níveis de microfilárias e antígeno de heartworm adulto para determinar o sucesso dos procedimentos de transplante do rato para o cão.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Modelo animal de laboratório imunossuprimido para os nematoides dirofilária heartworm, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido animal é alimentado com uma mistura dietética de um agente imunossupressor antes e depois da inoculação de larvas L3 de dirofilária.

2. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente imunossupressor é um glicocorticoide.

3. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal de laboratório é um roedor.

4. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o nematoide dirofilária heartworm é Dirofilaria immitis ou Dirofilaria repens.

5. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o glicocorticoide é hidrocortisona ou um sal desta.

6. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o glicocorticoide é o acetato de hidrocortisona e o roedor é um rato.

7. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura dietética compreende cerca de 20 ppm a cerca de 250 ppm de hidrocortisona.

8. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura dietética compreende cerca de 50 ppm ou cerca de 200 ppm de hidrocortisona.

9. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o rato é alimentado com a mistura dietética compreendendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por pelo menos três dias antes da inoculação com as larvas L3 de Dirofilaria immitis.

10. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o rato é alimentado com a mistura dietética compreendendo cerca de

200 ppm de hidrocortisona por cerca de 8 dias antes da inoculação e então por cerca de 8 a cerca de 14 dias após a inoculação.

11. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o rato é alimentado com a mistura dietética compreendendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona no dia da inoculação com L3 e por cerca de 12 dias após a inoculação com L3.

12. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o rato é alimentado com uma mistura dietética compreendendo cerca de 200 ppm de hidrocortisona por cerca de 21 dias e, em seguida, alimentado com uma mistura dietética compreendendo cerca de 50 ppm de hidrocortisona por meio de necropsia.

13. Modelo animal, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o rato é alimentado com a mistura dietética compreendendo cerca de 50 ppm por pelo menos 70 dias por meio de necropsia.

14. Uso do modelo animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um roedor imunossuprimido para um modelo animal de nematoides dirofilária heartworm, em que: a. cerca de 200 ppm de um glicocorticoide em uma mistura de ração dietética é formulado para ser administrado por pelo menos 3 dias; b.o roedor é inoculado com larvas L3 de dirofilária; c. cerca de 200 ppm de um glicocorticoide em uma mistura de ração dietética é formulado para ser administrado por pelo menos 3 dias após a inoculação; e subsequentemente d. cerca de 50 ppm de um glicocorticoide em uma mistura de ração dietética é formulado para ser administrado por pelo menos 70 dias por meio de necropsia.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o roedor é um rato e o glicocorticoide é a hidrocortisona.

16. Uso do modelo animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um roedor imunossuprimido para avaliar endoparasiticidas para o tratamento e/ou a prevenção de infecções por nematoides dirofilária.