BR112021001420A2

BR112021001420A2 - polipeptídeos imunogênicos quiméricos

Info

Publication number: BR112021001420A2
Application number: BR112021001420-9A
Authority: BR
Inventors: Jere W. McBride; David H. Walker
Original assignee: Research Development Foundation
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-05-04
Also published as: US11780892B2; US20240018195A1; US20200031877A1; EP3830105A1; EP3830105A4; AU2024259693A1; WO2020023950A1; CN112703197A; CA3107319A1; AU2019311181A1; US11046734B2; US20210292377A1

Abstract

POLIPEPTÍDEOS IMUNOGENICOS QUIMERICOS. A presente invenção refere-se a polipeptídeos quiméricos que podem ser usados, por exemplo, para diagnóstico de ou vacinação contra Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPE- PTÍDEOS IMUNOGÊNICOS QUIMÉRICOS".

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0001] Este pedido reivindica o privilégio do Pedido de Patente Provisória Norte-Americana Nº 62/711.005, depositado em 27 de julho de 2018, a totalidade do qual é incorporada aqui por referência.

1. Campo da Invenção

[0002] A presente invenção relaciona-se geralmente com o campo da biologia molecular e da medicina. Mais particularmente, diz respeito a polipeptídeos quiméricos que podem ser usados para fins de diag- nóstico ou vacinação.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[0003] A erliquiose monocitotrópica humana (HME) é uma doença emergente do NIAID de grupo 1 e o agente etiológico, E. chaffeensis, é classificado como um patógeno prioritário da categoria C. HME é uma doença febril indiferenciada que é fatal, o diagnóstico clínico é difícil e o diagnóstico definitivo é mais frequentemente retrospectivo (Walkere Dumler, 1997; Walker et al. 2004; Dumler et al., 2007). Em- bora mais de 8.000 casos tenham sido notificados aos Centros de Controle de Doenças a partir de 2012, esse número provavelmente subestima o número real de casos em 100 vezes (Olano et al., 2003). A doença muitas vezes não é diagnosticada devido aos sintomas não específicos associados ao início, mas resulta na internação de pacien- tes em 43 - 62% dos casos (Fishbein e al. , 1994). A progressão da doença pode resultar em um desfecho fatal e muitas vezes envolve falência múltipla, com síndrome de desconforto respiratório agudo (ARDS) e meningoencefalite sendo comum em muitos casos fatais (Fishbein et al., 1994; Paparone et al. , 1995). A ameaça à saúde pú- blica está aumentando com os novos agentes de erliquiose emergen- tes, mas as vacinas para erliquioses humanas não estão disponíveis, e as opções terapêuticas são limitadas. Novas informações e ferramen- tas de previsão de bioinformática têm sido desenvolvidas, que fazem uma identificação em todo o genoma de candidatos protetores de imu- nodiagnóstico/vacina (He et al., 2010; Magnan et al, 2010).

[0004] As perspectivas de desenvolvimento de vacinas e imunodi- agnósticos de subunidades eficazes para Ehrlichia têm sido limitadas devido a muitos fatores, não menos importante é o pequeno repertório de proteínas imunorreativas/protetoras que foram definidas molecu- larmente (McBride e Walker, 2010). As lacunas de conhecimento ne- cessárias para enfrentar esse problema para a Ehrlichia chaffeensis, tem sido estreitadas pelo progresso na compreensão dos mecanismos imunológicos protetores/patológicos (Feng e Walker 2004; Nandi et al., 2007; Winslow et al., 2000), caracterização imunomolecular de alguns antígenos de vacina/diagnóstico (Kuriakose et al., 2012; Li et al, 2002), perfis de genoma, transcriptoma e proteoma (Kuriakose et al., 2011; Lin et al., 2011), novos modelos de animais (Winslow et al., 1998; Sotomay et al., 2001), e outros avanços tecnológicos. Estudos utilizando abordagens de baixo rendimento para definir componentes antigênicos de E. Chaffeensis, produziram um pequeno grupo de antí- genos protetores, que incluem uma proteína de membrana externa principal (OMP), e uma família de efeitos secretos de proteína de repe- tição tandem (TRP), com grandes epítopos de anticorpos lineares pro- tetores (Kuriakose et al., 2012; Li et al., 2001). No entanto, esses antí- genos provavelmente representam um repertório significativo, mas in- completo de proteínas imunorreativas/protetoras. Além disso, é bem estabelecido que a imunidade mediada por anticorpos é necessária para proteção contra a infecção por E. chaffeensis (Winslow et al. ,2.000; Li et al., 2002; Kuriakose et al., 2012; Li et al., 2001; Racine et al., 2011; Yager et al., 2005), e anticorpos são a pedra angular das va- cinas mais eficazes para os seres humanos. A eliminação da E. chaf-

feensis ocorre, pelo menos em parte, durante o estágio extracelular da infecção (Li e Winslow 2003); no entanto, mecanismos imunológicos intracelulares também podem ser importantes e definir as característi- cas de antígenos/anticorpos que são protetores em ambos os ambien- tes, é crítico para o desenvolvimento eficaz da vacina. Claramente, há a necessidade de métodos novos e aprimorados para diagnosticar e vacinar contra E. chaffeensis e E. canis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente divulgação, em alguns aspectos, provê métodos e composições para o diagnóstico e vacinação contra Ehrlichia chaffe- ensis (E. chaffeensis) e/ou Ehrlichia canis (E. canis). Em algumas mo- dalidades, peptídeos imunogênicos quiméricos e polipeptídeos são providos. Em alguns aspectos, descobriu-se que a repetição contígua de diferentes sequências imunogênicas pode ser usada para gerar peptídeos ou polipeptídeos que apresentam propriedades melhoradas para diagnóstico e/ou indução de respostas imunes contra E. chaffe- ensis e/ou E. canis.

[0006] Como mostrado nos exemplos abaixo, os peptídeos imu- norreativos E. chaffeensis e E. canis foram usados para produzir po- lipeptídeos de Ehrlichia quiméricos. Os polipeptídeos quiméricos inclu- ídos na Tabela 2, foram verificados como sendo imunorreativos, utili- zando-se testes ELISA em soros humano e canino positivos de erliqui- ose monocitotrópica humana (HME). Os testes ELISA utilizando soros HME positivos, obtidos de pacientes, revelaram que os construtos abaixo provocaram respostas significativas, indicando que peptídeos (por exemplo, da Tabela 1) podem ser usados para produzir polipeptí- deos quiméricos (por exemplo, da Fórmula | ou na Tabela 2), que po- dem ser usados em métodos de diagnóstico para detectar infecção por E. chaffeensis ou E. canis, ou podem ser usados para induzir uma resposta imune em um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou um cão), contra E. chaffeensis ou E. canis.

[0007] Um aspecto da presente invenção refere-se a um polipeptí- deo isolado, no qual o polipeptídeo isolado compreende: (i) pelo me- nos duas das sequências imunogênicas da Tabela 1, ou uma sequên- cia pelo menos 90% idêntica (preferivelmente pelo menos 95% idênti- ca); e (ii) em que pelo menos uma das sequências imunogênicas é re- petida contiguamente no polipeptídeo. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 sequências imunogênicas são repetidas contiguamente no polipeptídeo isolado. Em algumas modali- dades, cada uma das pelo menos duas sequências imunogênicas da Tabela 1, ou uma sequência pelo menos 90% idêntica, são repetidas contiguamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 vezes no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado compreende um ou mais de- NOs:11-16 ou 36-42), em que um ou mais de (SEQ ID NOs:11-16 ou 36-42) são contíguos repetidos O, 1, 2 ou 3 vezes. Em algumas moda- lidades, cada uma das sequências imunogênicas é repetida contigua- mente de 1 a 3 vezes no polipeptídeo. Em algumas modalidades, cada uma das sequências imunogênicas é repetida contiguamente de 1 a 2 vezes no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isola- do compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou todas as seguintes sequências imunogênicas: TRP120 (SEQ ID NÃO:22), TRP140 (SEQ ID NO:23), ASAN1 (SEQ ID NO:7), TRP63 (SEQ ID NO:18), TRP47 (SEQ ID NO:17), TRP75 (SEQ ID NO:19), TRP28 (SEQ ID NO:2) , TRP36R1 (SEQ ID NO:3), TRP36R2 (SEQ ID NO:4), TRP36R3 (SEQ ID NO:6), TRP36CO (SEQ ID NO:36), TRP19 (SEQ ID NO:1), HSP (SEQ ID NO:24) ou uma sequência pelo menos 90% idêntica (de preferência pelo menos 95% idêntica); em que cada uma das sequências imunogênicas é repetida contiguamente de 1 a 7 ve- zes no polipeptídeo. O polipeptídeo isolado pode compreender TRP36R1 e TRP140. Em algumas modalidades, o TRP36R1 é repeti-

do contiguamente 4-8 vezes, e onde o TRP140 é repetido contigua- mente 1-3 vezes.

O polipeptídeo pode compreender ou consistir de 8 repetições de TRP36R1 e 4 repetições de TRP140. O polipeptídeo po- de compreender ou consistir de SEQ ID NO:27. O polipeptídeo pode ainda compreender TRP19. O polipeptídeo pode compreender ou con- sistir de SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, o polipeptídeo iso- lado compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos qua- tro, pelo menos cinco ou todas as sequências imunogênicas: TRP32, TRP120, TRP36R1, TRP140, TRP28 e/ou HSP.

Em algumas modali- dades, o TRP36R1, se presente, é repetido de 2-6 vezes, e em que as outras sequências imunogênicas são repetidas 1-3 vezes.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende todos de TRP32, TRP120, TRP36 (como TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO), TRP140, TRP28 e HSP.

O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compre- ende TRP120, TRP36, TRP140 e TRP28. O polipeptídeo pode com- preender ou consistir de SEQ ID NO:29. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado compreende pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todos de TRP32R1, TRP32R2, TRP32R3, TRP32R4, TRP120 e ASAN1. Em algumas modalidades, TRP120 e ASAN1 são cada uma repetida contiguamente 1, 2 ou 3 vezes.

O po- lipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:25. O po- lipeptídeo pode compreender pelo menos dois, pelo menos três ou to- dos de AS4N1, TRP63, TRP47 e/ou TRP75. O polipeptídeo pode com- preender ASAN1 e TRP63. Cada uma das sequências imunogênicas pode ser repetida contiguamente 1-2 vezes.

O polipeptídeo pode com- preender por AS4N1, TRP63 e TRP75. O polipeptídeo pode compre- ender ou consistir de SEQ ID NO:34. Em algumas modalidades, o po- lipeptídeo compreende AS4N1, TRP63 e TRP47. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:33. Em algumas modalida-

des, o polipeptídeo compreende pelo menos dois, pelo menos três, ou todos de AS4AN1, TRP63, TRP47 e/ou TRP75. O polipeptídeo pode compreender por ASAN1 e TRP63. Em algumas modalidades, cada uma das sequências imunogênicas é repetida contiguamente 1-2 ve- zes.

O polipeptídeo pode compreender AS4AN1, TRP63 e TRP75. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:34. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende AS4N1, TRP63 e TRP47. O polipeptídeo pode compreende ou consistir de SEQ ID NO:33. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos dois, pelo menos três, ou todos de AS4N1, TRP63, TRP47 e/ou TRP75. O polipeptídeo pode compreende AS4N1 e TRP63. Em algu- mas modalidades, cada uma das sequências imunogênicas é repetida contiguamente 1-2 vezes.

O polipeptídeo pode compreender AS4N1, TRP63 e TRP75. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:34. O polipeptídeo pode compreender AS4A4N1, TRP63 e TRP47. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:33. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos dois, pelo menos três, ou todos de TRP120, ASAN1I, TRP47 e/ou TRP63. O polipeptídeo pode compreende AS4N1 e TRP120. Ca- da uma das sequências imunogênicas pode ser repetida contiguamen- te 1-2 vezes.

O polipeptídeo pode compreender AS4AN1, TRP120 e TRP63. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:31. O polipeptídeo pode compreender ASA4N1, TRP120 e TRP47. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:32. O polipeptídeo pode ser compreender AS4N1, TRP120, TRP47 e TRP63. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:30. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos dois, pelo menos três ou todos os TRP36R1, TRP140, TRP95R e/ou TRP95C.

Cada uma das sequências imunogênicas pode ser repetida contiguamente 1-2 vezes.

O polipeptídeo pode compreende TRP36R1,

7ITA4 TRP140, TRP95R e TRP95C. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo compreende ou consiste em SEQ ID NO:35. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de um polipeptídeo de qualquer um dos (SEQ ID NOs: 25-35 ou 43-44). O polipeptídeo isolado pode compre- ender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou todas as seguintes sequências imunogêni- cas: TRP120, AS4N1, TRP63, TRP47, TRP75, TRP28, TRP36 (tais como TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO), TRP19, TRP140 e/ou HSP. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compre- ende ainda, pelo menos dois de TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO. O polipeptídeo pode compreender TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3. As sequências TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3 podem ser separadas por um ligante. Em algumas modalidades, as sequências TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3 não são separadas por um ligante. O polipeptídeo pode compreender TRP36R1-R2-R3 (SEQ ID NO:11), TRP36R1-R3-R2 (SEQ ID NO:12), TRP36R2-R1-R3 (SEQ ID NO:13), TRP36R2-R3-R1 (SEQ ID NO:14), TRP36R3-R1-R2 (SEQ ID NO:15), ou TRP36R3-R2-R1 (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, cada uma das sequências imunogênicas no polipeptídeo é contiguamente repetida 1, 2 ou 3 vezes. Cada uma das sequências imunogênicas po- de ser repetida contiguamente 1 ou 2 vezes. Em algumas modalida- des, as diferentes sequências imunogênicas não são separadas por um ligante ou um espaçador. Em algumas modalidades, as diferentes sequências imunogênicas são separadas por um ligante ou um espa- çador, como por exemplo um ligante de glicina. O ligante de glicina pode ter a sequência de aminoácidos - (G)x - , em que X=3 - 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem menos de 500, menos de 450, menos de 400, menos de 350, menos de 300, menos de 250, menos de 200, menos de 200, ou menos de 150 aminoácidos no com- primento.

[0008] Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica é formulada para administração parenteral, intravenosa, subcutânea, intranasal, sublingual ou intradérmica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é anexado a um suporte sólido (por exemplo, vidro ou plástico) ou composto em um kit de diagnóstico. Em algumas modali- dades, o suporte sólido está contido em um ensaio de fluxo lateral, ou dispositivo micro fluido.

[0009] Outro aspecto da presente invenção diz respeito a um po- lipeptídeo isolado da Fórmula | (As-Br-Cu-D-Ew-Fx-Gy-Hz)) , em que A, B, C, D,/ E, FE, Ge H é um peptídeo selecionado entre SEQ ID NOs:1- 24 e 36-42, ou uma sequência pelo menos 90% idêntica (preferivel- mente 95% idêntica) a qualquer uma das (SEQ ID NOs:1-24 ou 36- 42), em que s, t, u, v, x, y, e z é um inteiro 0-8, onde pelo menos dois (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) de s-z são 21 e pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) de s-z é 22 , e onde n é um inteiro 1-5. Em algumas modalidades, A é SEQ ID NO:8 (TRP36R1) e B é SEQ ID NO:23 (TRP140). Em algumas modalidades, s é de 4 a 8,té de 2a44, e n=1. Em algumas modalidades, u, v, x, y e z são zero. Em algumas modalidades, em que s=8 e t=4. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis de s, t, u, v, x, y e z são cada 2-3; e onde n=1. Em algumas modalidades, A é TRP32 (por exemplo, TRP32R3 de SEQ ID NO:5), B é TRP120 (SEQ ID NO:22), C é TRP36R1 (SEQ ID NO:8), D é TRP140 (SEQ ID NO:23), E é TRP28 (| SEQD NO:2) e F é HSP (SEQ ID NO:24). Em algumas modalidades, z=0. O polipeptídeo pode compreender ou consistir de SEQ ID NO:28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo da Tabela 2 ou qualquer um de (SEQ ID NOs: 25-35 ou 43-44).

[0010] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a uma preparação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo aqui divul- gado (por exemplo, da Fórmula | ou na Tabela 2) ou como descrito acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

A preparação farmacêutica pode ser formulada para administração parenteral, intra- venosa, subcutânea, intranasal, sublingual ou intradérmica.

O excipi- ente farmacêutico aceitável pode compreender ou consiste em um ad- juvante.

Em algumas modalidades, o adjuvante é uma emulsão ou |i- possomos, ou em que o adjuvante compreende um lipídio.

A emulsão pode ser uma emulsão óleo-em-água (O/A) ou uma emulsão água-em- óleo (A/O). Em algumas modalidades, o adjuvante compreende um triterpenoide, um esterol, um imunomodulador, um polímero (por exemplo, dietil - amino etil (DEAE)-dextran, polietileno glicol ou ácido poliacrílico) e/ou um oligonucleotídeo imunoestimulador (por exemplo, um CpG contendo ODN). Em algumas modalidades, o adjuvante com- preende DEAE Dextran, um oligonucleotídeo imunoestimulador e óleo como o óleo mineral, no qual o oligonucleotídeo imunoestimulador é um CpG contendo ODN, e onde a formulação adjuvante é uma emul- são água-em-óleo (A/O). Em algumas modalidades, o adjuvante com- preende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaterná- rio, um polímero e um ORN/ODN.

Em algumas modalidades, a sapo- nina é Quil A ou uma facção purificada desta, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA), o polímero é ácido poliacrílico e o ORN/ODN é um CpG.

Em algumas modalidades, a saponina está presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug, por dose, o esterol está presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 Vg, por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug, por dose, e o polímero está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001%, em volume, a cerca de 75%, em volume.

Em algumas modalidades, o ad- juvante compreende ainda um glicolipídio, tal como, por exemplo, ace- tato de N-(2-deoxi-2-L-leucilamino-B-D-gluco piranosil) - N-octadecil dodecanamida.

Em algumas modalidades, o adjuvante compreende uma saponina de triterpenoide, um esterol, um composto de amônio quaternário e um polímero de ácido poliacrílico.

Em algumas modali- dades, a saponina é Quil A ou uma fração purificada dela, o esterol é colesterol, e o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA). Em algumas modalidades, a saponina está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, por dose, o esterol está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, por dose, e o polímero de ácido poliacrílico está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001% v/v, a cerca de 75% v/v.

O adjuvante pode incluir uma emulsão água-em-óleo.

A emulsão água-em-óleo po- de incluir uma fase oleosa e uma fase aquosa, um carreador policatiô- nico (por exemplo, DEAE - dextran) e um CpG contendo oligonucleotí- deo imunoestimulador.

Em algumas modalidades, a composição com- preende ainda um gel de hidróxido de alumínio.

Em algumas modali- dades, o carreador policatiônico é o DEAE - dextran.

A composição pode compreender uma emulsão ou uma emulsão óleo-em-água (O/A). Em algumas modalidades, a emulsão compreende uma fase aquosa, que compreende um ácido alquil-poliacrílico (alquil-PAA) ou um polímero acrílico e brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA). Em algumas modalidades, a fase aquosa da emulsão óleo-na-água compreende brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA) e um ácido alquil-poliacrílico (alquil-PAA). Em algumas modalidades, o alquil-PAA é decil-PAA, octil-PAA, butil-PAA ou metil-PAA.

Em algumas modali- dades, o polímero acrílico é um polímero de ácido acrílico reticulado com polialil -sacarose.

A composição pode incluir uma emulsão de água em óleo (A/O) compreendendo um óleo não mineral e um emulsi- ficante (por exemplo, um emulsificante de mono-oleato de manida).

Em algumas modalidades, o adjuvante é MF59, ASO1, ASO2, ASOB3, ASOA, virossomas, CAFO1, CAFO4, CAFOS5, uma emulsão de polímero acrílico / DDA, uma emulsão de CpG/DEAE, adjuvante de saponina / colesterol / DDA ou uma emulsão de polímero de ácido poliacrílico. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma bactéria Ehrlichia. A bactéria pode ser, por exemplo, uma E. canis inativada por calor, uma E. Canis inativada quimicamente, uma E. chaffeensis inati- vada por calor ou uma E. chaffeensis quimicamente inativada. Em al- gumas modalidades, a bactéria é uma bactéria quimicamente inativada que foi inativada com formaldeído, formalina, bietileno amina, radia- ção, luz ultravioleta, tratamento de beta-propiolactona ou formaldeído.

[0011] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um ácido nucleico codificando um polipeptídeo aqui provido (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Tabela 2) ou como descrito acima. O ácido nucleico pode ser um segmento de DNA. O ácido nucleico pode estar compreendido em um vetor de expressão.

[0012] Ainda outro aspecto da presente invenção, refere-se a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico aqui provido (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Tabela 2) ou como des- crito acima. Em algumas modalidades, a célula expressa o ácido nu- cleico.

[0013] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para detectar anticorpos que ligam especificamente um organismo de Ehrlichia em uma amostra de teste, compreendendo:(a) contatar um polipeptídeo isolado aqui provido (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Tabela 2) ou como descrito acima; (b ) detectar os complexos de peptídeo-anticorpos; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpos é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo de Ehrlichia estão presentes na amostra de teste, e em que a ausência dos complexos de peptídeo-anticorpos é uma indicação de que anticorpos específicos de um organismo Ehrlichia não estão presentes na amostra de teste. A etapa de detecção pode incluir a realização de um imunoensaio ligado à enzima, um radioimu- noensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio fluorescência, um ensaio de quimioluminescência, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio mul- tiplex, um ensaio de espectrometria de massa, ou um ensaio baseado em partículas. A etapa de detecção pode incluir um ensaio de fluxo lateral ou um imunoensaio ligado à enzima, no qual o imunoensaio |i- gado à enzima é um ELISA.

[0014] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de identificação de uma infecção por Ehrlichia em um indiví- duo mamífero, compreendendo: (a) contatar uma amostra biológica do indivíduo com um polipeptídeo isolado aqui provido (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Tabela 2) ou conforme descrito aci- ma, em condições que permitem formar complexos de peptídeos- anticorpos; e (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpos; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpos é uma indica- ção de que o indivíduo tem uma infecção por Ehrlichia. A etapa de de- tecção pode compreender a realização de um imunoensaio ligado à enzima, um radioimune, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de imuno- blot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de vareta ou um ensaio baseado em partículas. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano ou um cão.

[0015] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit compreendendo: (a) um polipeptídeo isolado, aqui divulgado ou como descrito acima (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Ta- bela 2), (b) um anticorpo secundário anti-canino ou anti-humano ligado a uma molécula repórter; e (c) um reagente apropriado para detecção da molécula repórter. O peptídeo pode ser imobilizado em uma mem- brana ou em uma placa de micro titulação. A molécula repórter pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em luciferase, peroxidase de rabanete, uma nanopartícula luminosa, P-galactosidase e um rótulo fluorescente. A nanopartícula luminosa pode ser uma nanopartícula de aluminato de estrôncio. O kit pode ainda incluir um tampão de diluição para soro canino ou humano. O kit pode incluir um imunoensaio de fluxo lateral ou um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral. Em algumas modalidades, o Kit compreende um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA).

[0016] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de induzir uma resposta imune em um indivíduo mamífero, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade efe- tiva de uma preparação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo aqui provido (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Tabela 2) ou uma preparação farmacêutica como descrito acima. O indivíduo pode ser um ser humano ou um cão. A preparação farmacêutica pode ser administrada subcutaneamente, intramuscularmente, nasalmente, via inalação ou entrega aerossol, ou intradermicamente.

[0017] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratar uma infecção por Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis em um indivíduo, compreendendo: (a) contatar uma amostra biológica do indivíduo com um polipeptídeo isolado aqui provido (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula 1 ou na Tabela 2) ou como descrito acima sob condições que permitem formar complexos de peptídeo- anticorpos; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpos; em que a detecção dos complexos peptídeo-anticorpos é uma indicação de que o indivíduo tem uma infecção por Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlii- chia canis; e (c) administrar um composto terapêutico para tratar a in-

fecção por Ehrlichia no indivíduo. A etapa de detecção pode incluir a realização de um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimioluminescente, um ensaio imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de vareta ou um ensaio baseado em partículas. O indivíduo pode ser um cão ou um ser humano. O composto terapêutico pode ser um anti- biótico (por exemplo, doxiciclina).

[0018] Como aqui usado, o termo "contiguamente repetida", quan- do usado para descrever uma sequência de ácido nucleico ou sequên- cia de aminoácidos, indica que a sequência é repetida em um polipep- tídeo do N-terminal para a direção C-terminal. Por exemplo, para a se- quência de aminoácidos —X1:-, se a sequência for repetida zero vezes, então ela está incluída no polipeptídeo sem repetição como —X1-. Se a sequência —X1- for repetida contiguamente uma vez, então o polipep- tídeo contém —X—X1-. Se a sequência —-X1- for repetida duas vezes, então o polipeptídeo contém —X-X:—-X1-. O número de repetições contíguas da sequência —X:— pode ser descrito pela fórmula (X1)wn+1)-, em que (n+1) refere-se ao número de repetições contíguas. Preferi- velmente, as sequências repetidas contiguamente são repetidas sem qualquer sequência de ligante ou espaçador separando as sequências repetidas contiguamente. No entanto, em algumas modalidades, um espaçador ou ligante (por exemplo, um ligante de glicina tal como — G—- , GG- ou -GGG-) pode ser usado para separar as sequências repeti- das contiguamente. Em algumas modalidades preferidas, diferentes sequências repetidas contiguamente são separadas por um espaçador ou ligante (por exemplo, um ligante de glicina tal como -G-, -GG- ou —GGG-); por exemplo, na sequência -X1—-X1:-GG-X2>X2>, a sequência —X1— é repetida contiguamente uma vez e a sequência — X> — é conti- guamente repetida duas vezes, em que as diferentes sequências repe-

tidas contiguamente são separadas pelo ligante de glicina -GG-.

[0019] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" abrange cadei- as de aminoácidos que compreendem pelo menos 50 resíduos de aminoácidos e mais preferivelmente pelo menos 100 resíduos de ami- noácidos, sendo que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações de peptídeos covalentes. Como aqui usado, um "polipeptídeo antigênico" ou um "polipeptídeo imunorreativo" é um polipeptídeo que, quando introduzido em um vertebrado, pode estimular a produção de anticorpos no vertebrado, ou seja, é antigênico, e onde o anticorpo po- de reconhecer seletivamente e/ou ligar o polipeptídeo antigênico. Um polipeptídeo antigênico pode compreender ou consistir de uma se- quência imunorreativa derivada de uma proteína Ehrlichia imunorreati- va como descrito aqui; (por exemplo, polipeptídeos na Tabela 1, Tabe- la 2 e Fórmula |), e o polipeptídeo pode incluir uma ou mais sequên- cias adicionais. Em algumas modalidades, as sequências adicionais podem ser derivadas de um antígeno Ehrlichia nativo e podem ser he- terólogas e tais sequências podem (mas não precisam) ser imunogê- nicas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo antigênico ou o po- lipeptídeo imunorreativo, pode estar covalentemente ligado a um subs- trato sólido, por exemplo, a um imunoensaio, tal como um teste de flu- xo lateral, etc.

[0020] Polipeptídeos imunorreativos de Ehrlichia como descrito aqui (por exemplo, na Tabela 2 ou Fórmula |) podem ser um polipeptí- deo recombinante, polipeptídeo sintético, polipeptídeo purificado, po- lipeptídeo imobilizado, polipeptídeo rotulado detectável, polipeptídeo encapsulado ou um polipeptídeo expressado em vetor. Em várias mo- dalidades, os polipeptídeos imunorreativos Ehrlichia aqui providos po- dem ser truncados ou podem compreender uma mutação de exclusão, sem eliminar a imunorreatividade do peptídeo ou polipeptídeo resultan- te. Um peptídeo imunorreativo ou polipeptídeo aqui divulgado também pode estar compreendido em uma composição farmacêutica tal como, por exemplo, uma composição de vacina que é formulada para admi- nistração de um indivíduo humano ou canino.

[0021] "Bacterina" como aqui usado refere-se a uma ou mais bac- térias mortas que podem ser usadas como um componente de uma vacina ou composição imunogênica. A bacterina pode estar compre- endida em uma suspensão. Em algumas modalidades, a bacterina é uma Ehrlichia inativada pelo calor (por exemplo, uma E. Canis inativa- da pelo calor) ou uma Ehrlichia quimicamente inativada (por exemplo, uma E. Canis quimicamente inativada).

[0022] "Adjuvante" como aqui usado, refere-se a qualquer subs- tância que aumente a resposta imune humoral ou celular a um antíge- no. Em algumas modalidades, os adjuvantes são utilizados para per- mitir a liberação controlada de antígenos do local da injeção de uma vacina, e para estimular o sistema imune do indivíduo que recebe a composição da vacina.

[0023] Como usado aqui, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que nenhum dos componentes especificados foi propositalmente formulado em uma composição e/ou está presente apenas como um contaminante ou em quantidades de traço. A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não intencional de uma composi- ção está preferivelmente abaixo de 0,01%. Mais preferida é uma com- posição na qual nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com os métodos analíticos padrão.

[0024] Como usado aqui na especificação, "um" ou "uma" pode significar um(a) ou mais. Como usado aqui nas reivindicações, quando usado em conjunção com a palavra "compreendendo", as palavras "uma " ou "um" podem significar um(a) ou mais de um(a).

[0025] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para signi-

ficar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir a al- ternativas apenas, ou as alternativas são mutuamente exclusivas, em- bora a divulgação apoie uma definição que se refere a alternativas apenas e "e/ou". Como usado aqui "outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais.

[0026] Ao longo deste pedido de patente, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação ou erro inerentes do dispositivo utilizado determinar o valor, o método empregado para de- terminar o valor ou a variação que existe entre os indivíduos ou amos- tras do estudo.

[0027] Outros objetos, características e vantagens da presente in- venção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve-se entender, no entanto, que a descrição detalhada e os exem- plos específicos, enquanto indicam modalidades preferenciais da in- venção, são dados apenas por meio de ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica, partir desta des- crição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] Os desenhos a seguir fazem parte da presente especifica- ção e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por re- ferência a um ou mais desses desenhos, em combinação com a des- crição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.

[0029] FIG. 1: Purificação e Caracterização de quimera de E. chaf- feensis TRP32/TRP120/A34 (combinada = SEQ ID NO: 25). TRP32R1 = SEQ ID NO: 3; TRP32R2 = SEQ ID NO: 4; TRP32R3 = SEQ ID NO: 5; TRP32R4 = SEQ ID NO: 6; TRP120 = SEQ ID NO: 22; ASAN1I = SEQ ID NO: 7.

[0030] FIG. 2: Purificação e Caracterização de quimera de E. chaf-

feensis TRP140/TRP36/TRP19 (combinada = SEQ ID NO: 26). TRP19 = SEQ ID NO: 1; TRP36 = SEQ ID NO: 8; TRP140 = SEQ ID NO: 23.

[0031] FIG. 3: Purificação e Caracterização de quimera de E. canis TRP36/TRP140 (combinada = SEQ ID NO: 27). TRP36 = SEQ ID NO: 8; TRP140 = SEQ ID NO: 23.

[0032] FIG. 4: Purificação e Caracterização de quimera de E. chaf- feensis e E. canis TRP32/TRP120/TRP36/TRP140/HSP (combinada = SEQ ID NO: 28). TRP32 = SEQ ID NO: 5; TRP120 = SEQ ID NO: 22; TRP36 = SEQ ID NO: 8; TRP140 = SEQ ID NO: 23; P28 = SEQ ID NO: 2; HSP = SEQ ID NO: 24.

[0033] FIG. 5: Purificação e Caracterização de quimera de E. chaf- feensis e E. canis TRP120/TRP140/TRP36/TRP28 (combinada = SEQ ID NO: 29). TRP120 = SEQ ID NO: 22; TRP140 = SEQ ID NO: 23; TRP36 = SEQ ID NO: 8; P28 = SEQ ID NO: 2.

[0034] FIG. 6: Polipeptídeos quiméricos de Ehrlichia adicionais.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0035] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunorreativo (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula | ou um polipeptídeo na Ta- bela 2) descrito aqui, pode ser usado como ferramenta diagnósticas ou profilática para detecção ou imunização contra a infecção por Ehrli- chia. Em modalidades especiais, polipeptídeos imunorreativos aqui divulgados, podem ser úteis em ensaios de fase em solução, ou em ensaios nos quais o polipeptídeo imunorreativo isolado é imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte. Alternativamente, um polipeptídeo imunorreativo descrito aqui pode estar contido em uma formulação de vacina para induzir uma resposta imune protetora ou uma resposta imune contra E. chaffeensis em um indivíduo. Um ou mais polipeptídeos imunorreativos como descrito aqui podem ser imo- bilizados em uma superfície por anexação covalente, encapsulamento ou adsorção usando métodos geralmente conhecidos na técnica e po-

dem incluir o uso de reticulantes, moléculas de captura e semelhantes, aos quais os peptídeos podem ser acoplados, conjugados ou reticula- dos.

1. Polipeptídeos quiméricos

[0036] Como descrito no sumário anterior, certos aspectos da pre- sente divulgação são relacionados aos polipeptídeos de Ehrlichia qui- méricos, tais como polipeptídeos compreendendo ou consistindo em pelo menos dois dos peptídeos da Tabela 1 ou um polipeptídeo da Ta- bela 2. Os polipeptídeos quiméricos podem ser produzidos para com- preender pelo menos dois dos peptídeos da Tabela 1, que podem ser continuamente repetidos (por exemplo, de 2 a 8, preferivelmente de 2 a 6, ou até mais preferivelmente de 2 a 4 vezes) no polipeptídeo. O polipeptídeo quimérico pode incluir 3, 4, 5 ou mais dos peptídeos imu- nogênicos acima. Cada um dos peptídeos imunogênicos pode ser re- petido O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 vezes no polipeptídeo quimérico. Con- figurações exemplares incluem, mas não se limitam a, 2x2, 2x2x2, 2X2X2X2, 3x2, 2x3, 3xX2X2, 2xX3X2, 2X2X3, 3X2X2X2, 2X3X2X2xX2, 2X2X3X2, 2X2X2X3, 3X3xX3, 3X3X2, 2X2X3, 3XIX3I3X3, 3X3IX3X6 e 2X2X4X2X2x2.

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[0037] Em algumas modalidades, prevê-se que TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3 podem ser trocados dentro de um polipeptídeo quimérico. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência TRP36R1 em um polipeptídeo quimérico pode ser trocada para TRP36R2 ou TRP36R3. Em algumas modalidades, uma sequência TRP36R1, TRP36R2 ou TRP36R3 em um polipeptídeo quimérico pode ser trocada para TRP36CO. Em algumas modalidades, observou-se que TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO podem estar contigua- mente localizadas em um polipeptídeo quimérico, por exemplo, como mostrado em SEQ ID NOs:11-16 e 38-43. Em algumas modalidades, 2, 3 ou todas de TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO po- dem estar contiguamente localizadas em um polipeptídeo quimérico. Similarmente, prevê-se que, em algumas modalidades, TRP32R1, TRP32R2, TRP32R3 e TRP32R4 podem ser trocadas dentro de um polipeptídeo quimérico. Em algumas modalidades, 2, 3, ou todas de TRP32R1, TRP32R2, TRP32R3 e/ou TRP32R4 podem estar conti- guamente localizadas em um polipeptídeo quimérico (por exemplo, onde o polipeptídeo contém -TRP32R1-TRP32R2-TRP32R3- ou - TRP32R1-TRP32R2R2R2R3-TRP32R3-TRP32R4-, etc.).

[0038] Os polipeptídeos quiméricos podem ser produzidos para compreender pelo menos dois dos peptídeos acima, que podem ser continuamente repetidos (por exemplo, uma vez, de 2 a 8, preferivel- mente de 2 a 6, ou até mais preferivelmente, de 2 a 4, vezes) no po- lipeptídeo. O polipeptídeo quimérico pode incluir 3, 4, 5 ou mais dos peptídeos imunogênicos acima da Tabela 1. Cada um dos peptídeos imunogênicos pode ser repetido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 vezes no po- lipeptídeo quimérico. Os peptídeos dentro do construto do polipeptídeo podem ser separados por um ligante. O ligante pode ser um ligante de poliglicina (por exemplo, GG, GGG, GGGG ou GGGGG). Os constru- tos de polipeptídeo podem compreender uma sequência de proteína de choque térmico (HSP) (SEQ ID NO:24). Os construtos foram produ- zidos a partir dos peptídeos imunogênicos acima, como listado abaixo (por exemplo, Tabela 2) e polipeptídeos quiméricos exemplares são retratados nas em Figuras 1-5.

[0039] Em algumas modalidades, o polipeptídeo quimérico pode compreender pelo menos duas ou três isoformas de peptídeo imuno- gênico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser produzido ligando TRP 36R1, TRP36R2, TRP36R3, e/ou TRP36CO em vária configurações como listado na Tabela 1, incluindo TRP36R1-R2-R3, TRP36R1-R3- R2, TRP36R2-R1-R3, TRP36R2-R3-R1, TRP36R3-R1-R2, TRP36R3- R2-R1, TRP36CO-R1, TRP36R1-CO, TRP36CO-R3, TRP36R3-CO, TRP36R1-R3 e TRP36R3-R1. O polipeptídeo pode ser produzido lin- gando TRP95R e TRP95C como TRP95R-C ou TRP95C-R. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeco pode ser produzido ligando TRP32R1, TRP32R1, TRP32R3 e/ou TRP32R4 em várias configura- ções.

[0040] Em algumas modalidades, o construto quimérico pode ter uma sequência como descrita pela Fórmula |, abaixo: Fórmula |: (As-Bt-Cu-Dy-Ew-Fx-Gy-Hz)n, em que, A-H compreende um peptídeo selecionado entre SEQ ID NOs:1-24 e 36-42, s-z é um inteiro de 0-8, sendo que pelo menos dois de s-z são 21 e pelo menos um de s-z é 22, e n é um inteiro 1-5. Os peptídeos A-H podem ser selecionados independentemente de SEQ ID NOs:1-24 e 36-42. Preferivelmente, o construto quimérico pode ter uma sequência de Fórmula |, onde pelo menos dois de s-z são 22. O construto quimérico pode incluir um ligante ou espaçador para separar os peptídeos A-H da Fórmula |.

[0041] Derivados exemplares da Fórmula | podem incluir, mas não se limitam a: A2-B2-C>;

A1-B3-C3; A3-B3-C3; A2-B2-C2-D>; A3-B2-C2-D>; A3-B3-C6-D3; (A1-B2-C1)3; Ag-Ba; € A2-B2-C4-D2-E>2-F>2.

[0042] Em algumas modalidades, o polipeptídeo da Fórmula | compreende ou consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 11-16 ou 38-42. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da Fórmula | compre- ende ou consiste em um polipeptídeo da Tabela 2. Tabela 2: polipeptídeos quiméricos de Ehrlichia art Msegendis [Esp — — TRP32/TRP120/A34N1 SEQ ID|E chaffeensis (32R1/32R2/32R3/32R4/3 x 120/3 x 43) NO:25 TRP140/TRP36/TRP19 (19/2 x 36/140) x 3 SEQ IDJE canis NO:26 TRP36/TRP140 SEQ IDJE canis (8 x 36/4 x 140) NO:27 TRP32/TRP120/TRP36/TRP140/TRP28/HSP |SEQ ID|E. chaffeensise FE. canis (2x 32/2 x 120/4 x 36/ 2 x 140/2 x 28/2x HSP) | NO:28 TRP120/TRP140/TRP36/TRP28 SEQ ID|E. chaffeensise FE. canis (3x 120/3 x 140/6 x 36/3 x 28) NO:29 TRP120/ASAN1/TRP63/TRP47 SEQ IDE. chaffeensis (2x 120/2 x 34/2 x 63/2 x 47) NO:30 TRP120/ASAN1/TRP63 SEQ IDE. chaffeensis (2x 120/2 x 34/2 x 63) NO:31 TRP120/ASAN1/TRP47 SEQ IDE. chaffeensis (2x 120/2 x 34/2 x 63/2 x 47) NO:32 ASAN1/TRP63/TRP47 SEQ IDE. chaffeensis (2x 34/2 x 63/2 x 47) NO:33 ASANT1/TRP63/TRP75 SEQ IDE. chaffeensis (2x 34/2 x 63/2x75) NO:34

(2x 36/2 x 140/2 x 95R/2 x 95C) NO:35 (2x 36/2 x 36/2 x 36) NO:43 TRP36R1/TRP36R2 SEQ ID|E canis esa e TT

[0043] Em algumas modalidades, prevê-se que um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, 97,5%, ou pelo menos 99% de sequência de identidade a um polipeptídeo da Tabela 2 ou um polipeptídeo da Fórmula |, que retenha pelo menos parte de sua imunorreatividade, pode ser usado em várias modalida- des como aqui descrito (por exemplo, em um teste de diagnóstico, ou para induzir uma resposta imune contra Ehrlichia em um indivíduo, pa- ra inclusão em uma composição de vacina). Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode ser usado para gerar um anticorpo que se liga se- letivamente à proteína, e o anticorpo pode ser usado, por exemplo, em um ensaio de diagnóstico; por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo é rotulado ou ligado a um substrato sólido (por exemplo, em um teste de fluxo lateral).

[0044] Em alguns aspectos, uma repetição contígua de um peptí- deo específico pode incluir dois ou mais isoformas do peptídeo imuno- gênico. Por exemplo, uma repetição contígua pode compreender TRP32R1, TRP32R2, TRP32R3 e/ou TRP32RA4. Outra repetição con- tígua pode compreender TRP95C e TRP95R ou isoformas diferentes de TRP36, incluindo TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO. Assim, as mesmas ou diferentes isoformas da proteína podem, portan- to, ser repetidas contiguamente em algumas modalidades, sem sepa- ração por um espaçador ou espaçador de glicina.

[0045] Uma variedade de ligantes ou espaçadores podem ser usados em polipeptídeos de Ehrlichia quiméricos das modalidades. Em algumas personificações, um ligante ou espaçador pode ser uma série aleatória de um ou mais aminoácidos (por exemplo,2, 3, 4, 5, 10, ou 20 aminoácidos). Em outras modalidades, o ligante tem uma se- quência particular. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante ou espaçador pode ser um ligante de poliglicina (por exemplo, GG, GGG ou GGGG; também referido aqui como um ligante de glicina). Outros ligantes ou espaçadores que podem ser usados em várias mo- dalidades incluem, por exemplo, os ligantes 218 (GSTSGSGK- PGSGEGSTKG; SEQ ID NO: 45), HL (EAAAK; SEQ ID NO: 46), e G.S (GGGGS; SEQ ID NO: 47). Em algumas modalidades preferidas, gru- pos de diferentes sequências repetidas contiguamente são separados em um polipeptídeo por um ligante ou espaçador tal como, por exem- plo, um ligante de glicina (por exemplo, — X1-X1-X+-GGG-X2>— mostra a sequência de amino -X:-— repetida contiguamente duas vezes, a se- quência de aminoácidos —X>— é repetida contiguamente uma vez e as diferentes sequências repetidas contiguamente são separadas pelo ligante de poliglicina -GGG-).

[0046] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunorreativo aqui provido (por exemplo, derivado de dois ou mais peptídeos na Ta- bela 1 ou um polipeptídeo na Tabela 2) pode ser imobilizado em uma superfície de um suporte ou de um substrato sólido; por exemplo, o polipeptídeo imunorreativo pode ser imobilizado direta ou indiretamen- te por acoplamento, reticulação, adsorção, encapsulamento ou por qualquer método conhecido apropriado na técnica. A título de exemplo não limitante, a ligação de um polipeptídeo imunorreativo aqui divulga- do, por adsorção a um poço em uma placa de micro titulação ou a uma membrana pode ser alcançada contatando o peptídeo, em um tampão adequado, com a superfície do poço por um período adequado de tempo. O tempo de contato pode variar de acordo com a temperatura, mas é tipicamente entre 1 hora e 1 dia, ao usar uma quantidade de peptídeo que varia de cerca de 50 ng a cerca de 1 mg e preferivelmen-

te cerca de 250-700 ng ou cerca de 450-550 ng.

[0047] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunorreativo aqui divulgado é covalentemente anexado a um substrato de suporte, primeiro reagindo o suporte com um reagente que reagirá quimica- mente com o suporte e com um grupo funcional (ou seja, reticulação), tal como um uma hidroxila ou grupo amino, no peptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo imunorreativo pode ser reticulado a uma superfície através de um grupo amina ou carboxílico em cada extremidade do peptídeo, e um peptídeo pode ser reticulado através de um grupo em cada extremidade do polipeptídeo (ou seja, reticulação cabeça-cauda). Tais peptômeros (ou seja, peptídeos reticulados cabeça-cauda ou de outra maneira imobilizados) podem ser usados com métodos de diag- nósticos e terapêuticos da presente divulgação.

[0048] Em algumas modalidades, um polipeptídeo isolado com- preende uma sequência de um polipeptídeo da Fórmula | ou um po- lipeptídeo da Tabela 2, no qual o peptídeo isolado ou polipeptídeo é imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo con- sistindo pela Tabela 2. Inúmeros substratos de suporte para imobiliza- ção de peptídeos são conhecidos na técnica, que podem ser empre- gados com um polipeptídeo imunorreativo aqui divulgado, formado a partir de materiais tais como, por exemplo, látex, poliestireno, nylon, nitrocelulose, celulose, sílica, agarose, polímeros inorgânicos, lipídios, proteínas, açúcares ou resina magnética. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode selecionar o substrato de suporte que é apro- priado para uma determinada aplicação. Em modalidades especiais, um substrato de apoio pode ser uma câmara de reação, um poço de microplaca, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, uma conta, uma micro pérola, uma microesfera, um nano cristal, uma nano esfera, uma vareta, um cartão, um escorregador de vidro, um micro slide, um aparelho de fluxo lateral, um microchip, um pente, uma partí- cula de sílica, uma partícula magnética, uma nanopartícula, ou uma monocamada automontada. Il. Polipeptídeos imunorreativos detectavelmente rotulados

[0049] Um polipeptídeo imunorreativo (por exemplo, compreen- dendo dois ou mais peptídeos da Tabela 1, ou um polipeptídeo da Ta- bela 2) pode ser conjugado ou anexado a um rótulo detectável, tal co- mo, por exemplo, um isótopo radioativo, um isótopo não radioativo, um rótulo de particulados, um rótulo fluorescente, um rótulo de quimiolu- minescente, um rótulo paramagnético, um rótulo de enzima ou um ró- tulo de colorimétrico. O polipeptídeo detectavelmente rotulado pode ser usado, por exemplo, em métodos e composições diagnósticas ou profiláticas. Em certas modalidades, a porção de polipeptídeo do po- lipeptídeo imunorreativo detectavelmente rotulado, pode ser imobiliza- da em uma superfície de um substrato de suporte. Em outras modali- dades, o rótulo detectável pode ser usado para imobilizar o peptídeo imunorreativo detectavelmente rotulado, à superfície de um substrato de suporte.

[0050] Como aqui utilizado, "rótulo detectável" é um composto e/ou elemento que pode ser detectado devido às suas propriedades funcionais específicas, e/ou características químicas, o uso do qual permite que o peptídeo ao qual está ligado seja detectado, e/ou quanti- ficado posteriormente se desejado.

[0051] Em algumas modalidades, a sonda é uma sonda fotolumi- nescente, tal como um fluoróforo ou uma nanopartícula, tal como por exemplo uma nanopartícula de aluminato de estrôncio (por exemplo, ver Paterson et al., 2014). Rótulos exemplares incluem, mas não se limitam a, um rótulo particulado, tal como ouro coloidal, um isótopo ra- dioativo, tal como astatínio2!, um rótulo colorimétrico, tal como nitro- benzeno, cloreto de dansila, cloreto de dabsila, qualquer um dos co-

rantes azo, cianina ou triazina ou cromóforos divulgados na patentes norte-americanas U.S. 5.470,932, 5,543,504, ou 6,372,445, todas das quais são aqui incorporadas por referência; um rótulo paramagnético, tal como cromo (III), manganês (II), ferro (Ill), ferro (II), cobalto (II), ní- quel (II), cobre (II), neodímio (III), samário (Ill), itérbio (Ill), gadolínio (111), vanádio (1), térbio (Ill), disprósio (III), hólmio (III) ou érbio (Ill), um rótulo fluorescente, tal como Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, isotiocianato de fluo- resceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, verde rhodamina, vermelho rhodamina , Renographin, ROX, TAMRA, TET, tetrametil--hodamina e/ou vermelho Texas, ou amarelo Lucifer, um rótulo de enzima, tal como urease, luci- ferase, fosfatase alcalina, hidrogeno peroxidase (de rabanete), ou glu- cose oxidase, ou um rótulo quimioluminescente, tal como luminol, fta- lazinadiona e outros divulgados em qualquer uma das patentes norte- americanas U.S. 4,373,932, 4,220,450, 5,470,723, e pedido de patente norte-americana U.S. 2007/0264664, todas as quais são incorporadas aqui por referência.

III. Métodos para produzir um polipeptídeo imunorreativo

[0052] Um polipeptídeo imunorreativo, como descrito aqui, pode ser produzido usando métodos de transcrição e tradução in vitro (IVTT), pode ser recombinantemente produzido usando uma variedade de tipos de células (por exemplo, células bacterianas, células mamífe- ras, E. coli, leveduras e células de insetos, etc.), ou em alguns casos podem ser sintetizadas (por exemplo, usando síntese de fase sólida). Em algumas modalidades, os métodos sintéticos e IVTT podem prover certas vantagens sobre abordagens recombinantes, uma vez que os polipeptídeos resultantes podem produzir formas altamente puras, sem contaminar bactérias ou outras proteínas, que podem resultar em rea-

ções de falsas positivos ao utilizar proteínas recombinantes. Assim, os métodos sintéticos e IVTT têm a vantagem de não possuir muitos dos procedimentos de purificação caros e trabalhosos, muitas vezes asso- ciados a metodologias recombinantes.

[0053] Uma variedade de abordagens IVTT são conhecidas na técnica e podem ser usadas em várias modalidades. O IVTT geral- mente envolve métodos livres de células para produção ou síntese de uma proteína a partir do DNA. O sistema livre de células para produ- ção de proteínas pode usar, por exemplo, extrato de E. coli, extratos de protozoários, extratos de leveduras, extrato de células humanas, extrato de germe de trigo, extratos de mamíferos, extratos de linhas de células humanas cultivadas, lisato de reticulócito de coelho, extrato de células de insetos, ou componentes purificados de E. coli. Uma varie- dade de kits estão disponíveis comercialmente, incluindo, por exemplo, RTS (FivePrime, San Francisco, CA), Expressway"" (Life Technologi- es); S30 T7 high yield (Promega), One-step human IVT (Thermo Sci- entific, WEPROGO (CellFree Sciences), TNTO coupled (Promega), RTS CECF (5 PRIME), TNTO Coupled (Promega), Retic Iysate IVTTY (Life Technologies); TNTO T7 (Promega), EasyXpress Insect kit (Qia- gen/RiN A), PURExpressO (New England Biolabs), e PURESYSTEMO (BioComber). Tais métodos podem ser usados para incorporar amino- ácidos não naturais em proteínas, se desejado. Sistemas de expres- são livre de células, que podem ser usados em várias modalidades, também são descritos, por exemplo, em Zemella et al., 2015.

[0054] Uma proteína imunorreativa isolada, como aqui divulgado, pode ser produzida em algumas modalidades, usando um método apropriado conhecido nas técnicas da química orgânica. Por exemplo, peptídeos podem ser produzidos usando uma das técnicas de síntese de peptídeos de fase sólida estabelecidas, que são bem conhecidas. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ser sintetizados usan-

do equipamentos para síntese automatizada de peptídeos, amplamen- te disponíveis em fornecedores comerciais, tais como Perkin Elmer (Foster City, CA), ou o peptídeo pode ser quimicamente sintetizado, usando técnicas de fase de solução, tal como as descritas em Carpino et al., 2003 ou pedido de patente norte-americana U.S. 2009/0005535. Em algumas modalidades, os peptídeos ou proteínas mais curtas po- dem ser sintetizados, por exemplo, usando síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS), síntese de peptídeos em fase sólida t-Boc ou sín- tese de peptídeos em fase sólida Fmoc.

[0055] Em algumas modalidades, uma proteína imunorreativa, como aqui descrita, pode ser recombinantemente preparada a partir de um ácido nucleico codificando o peptídeo. Tal ácido nucleico pode es- tar operavelmente ligado a um vetor de expressão. A título de um exemplo não limitante, uma proteína imunorreativa pode ser expressa a partir de um vetor e isolada do meio de crescimento de uma célula hospedeira que compõe o vetor. Em algumas modalidades, a proteína imunorreativa pode ser produzida em um sistema livre de células, a partir de um ácido nucleico codificando o peptídeo.

[0056] Uma proteína imunorreativa imobilizada, como aqui divul- gado, pode ser conjugada, interligada ou adsorvida, direta ou indireta- mente, sobre uma superfície de um substrato de suporte. Em algumas modalidades, uma proteína imunorreativa imobilizada ou peptídeo po- de ser sintetizada sobre um substrato de suporte.

[0057] Prevê-se que praticamente qualquer método de imobiliza- ção de proteínas ou peptídeos conhecido na técnica, que não impacte a estrutura ou função dos peptídeos divulgados, pode ser usado para imobilizar uma proteína imunorreativa ou peptídeo, como divulgado aqui. Por exemplo, a imobilização do peptídeo pode ser realizada usando um agente de reticulação ou conjugação, tal como metil-p- hidroxibenzimidato, N-succinimidil-3-(4-hidroxifenil) propionato, usando sulfo succinimidil 4- (N-maleimido metil) ciclohexano-1-carboxylato (SSMCC), éster de N- [maleimido caproil oxi]l sulfo succinimida (SEMCS), éster de N-maleimido benzoil -N- hidroxi succinimida (MBS), glutaraldeído, 1-etil-3- (3-dimetil amino propil) carbodiimida (EDCI), bis- diazobenzidina (BDB), ou N-acetil homocisteína tiolactona (NAHT), e outros divulgados em qualquer uma das patentes norte-americanas U.S. 95,853,744, 5,891,506, 6,210,708, 6,617,142, 6,875,750, 6,951,765, 7,163,677 e 7,282,194, cada uma incorporada aqui por re- ferência. As proteínas imunorreativas podem ser conjugadas, direta ou indiretamente, a qualquer um dos substratos de suporte disponíveis comercialmente, com um revestimento superficial composto por reticu- lantes, agentes de acoplamento, agentes de derivatização de tiol ou hidroxila, grupos carboxila- ou amina-reativos, tais como de anidrido maleico (por exemplo, Pierce Immunotechnology Catalog e Handbook, em A12-A13, 1991).

[0058] Em algumas modalidades, uma proteína da invenção tam- bém pode ser imobilizada usando a complexação de quelato de metal, empregando, por exemplo, um agente quelante orgânico, tal como um anidrido do ácido dietileno triamino penta acético (DTPA); EDTA; N- cloro-p-toluenossulfonamida; e/ou tetracloro-3a-6a-difenil glicouril-3 anexado ao anticorpo (Patente norte-americana U.S. nº 4.472.509 e

4.938.948, cada uma incorporada aqui por referência). Proteínas e peptídeos também podem ser imobilizados pelo acoplamento a outros peptídeos ou a grupos de condensação imobilizados em uma superfí- cie ou presentes em um tampão de imobilização, tal como glutaraldeí- do ou periodato. Conjugados com marcadores de fluorescência tam- bém podem ser preparados na presença de tais agentes ou por reação com um isotiocianato. Um peptídeo pode ser anexado a uma superfí- cie por conjugação, reticulação ou ligação a um agente de ligação de afinidade, tal como biotina, estreptavidina, um polissacarídeo, tal como um alginato, uma lectina e afins.

[0059] Em geral, independentemente do método de preparação ou status de imobilização, as proteínas imunorreativas aqui divulgadas, são preferivelmente preparadas de forma substancialmente pura. Pre- ferivelmente, as proteínas imunorreativas são pelo menos cerca de 80% puras, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% puras e de maior preferência, pelo menos cerca de 99% puras. IV. Equivalentes funcionais biológicos

[0060] Polipeptídeos imunorreativos preferidos ou análogos espe- cificamente ou preferencialmente destes, ligam um anticorpo especiífi- co de E. chaffeensis ou E. canis. Determinar se um determinado po- lipeptídeo imunorreativo, ou um seu análogo, pode ligar um anticorpo específico de E chaffeensis ou E. Canis, pode ser avaliado usando um ensaio in vitro, tal como, por exemplo, um ensaio imunossorbente liga- do à enzima (ELISA), imunoblot, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), imunotingimento, aglutinação de látex, ensaio de hemaglutina- ção indireta (IHA), fixação complementar, ensaio de imunofluorescên- cia indireta (FA), nefelometria, ensaio de citometria de fluxo, ensaio de quimiluminescência, imunoensaio de fluxo lateral, ensaio de u-captura, ensaio de espectrometria de massa, ensaio baseado em partículas, ensaio de inibição e/ou ensaio de avidicidade.

[0061] Um polipeptídeo imunorreativo da presente divulgação, po- de ser modificado para conter substituições, inserções e/ou exclusões de aminoácidos, que não alteram suas respectivas interações com re- giões de ligação de anticorpo de anti-Ehrlichia. Tal equivalente biologi- camente funcional de um polipeptídeo imunorreativo, derivado de uma proteína Ehrlichia, poderia ser uma molécula com características se- melhantes ou desejáveis, ou seja, ligação de anticorpos específicos de Ehrlichia. Como exemplo não limitante, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em um polipeptídeo imunorreativo aqui divulgado, sem perda considerável de capacidade interativa, co- mo demonstrado pela ligação de anticorpos inalterada detectavelmen- te. Contempla-se, assim, que um polipeptídeo imunorreativo aqui di- vulgado (ou um ácido nucleico codificando tal polipeptídeo), que é mo- dificado em sequência e/ou estrutura, mas que é inalterado em utilida- de ou atividade biológica, permanece no escopo da presente divulga- ção. O polipeptídeo imunorreativo pode ter, por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 99% de identidade sequencial com polipeptídeo de E. chaffeensis de tipo selvagem e, em algumas modalidades, a proteína imunorreativa pode ter 1, 2, 3, 4, 5, ou mais substituições, inserções e/ou exclusões de aminoácidos em comparação com o corresponden- te tipo selvagem E. chaffeensis. Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição conservadora.

[0062] Também é bem compreendido pelo profissional qualificado que, inerente à definição de um peptídeo equivalente biologicamente funcional, é o conceito de que há um limite para o número de altera- ções que podem ser feitas, dentro de uma parte definida da molécula, mantendo ainda um nível aceitável de atividade biológica equivalente. Polipeptídeos equivalentes biologicamente funcionais são então defi- nidos aqui, como aqueles peptídeos nos quais certos, nem a maioria ou todos, dos aminoácidos podem ser substituídos. É claro que uma pluralidade de peptídeos distintos com diferentes substituições pode ser facilmente feita e usada de acordo com a invenção.

[0063] O profissional versado também está ciente de que, quando certos resíduos se mostram particularmente importantes para as pro- priedades biológicas ou estruturais de um peptídeo, por exemplo, resí- duos em epítopos específicos, tais resíduos geralmente não podem ser trocados. Prevê-se que uma mutação em um peptídeo imunorrea- tivo ou polipeptídeo aqui divulgado, poderia resultar em uma perda de especificidade da espécie e, por sua vez, reduzir a utilidade do peptí-

deo resultante para uso em métodos para gerar uma resposta imune anti-Ehrlichia. Assim, os polipeptídeos que são antigênicos (ou seja, ligam especificamente anticorpos anti-Ehrlichia) e compreendem subs- tituições conservadoras de aminoácidos, são entendidos como incluí- dos em aspectos da presente divulgação. Substituições conservadoras são menos propensas a alterar drasticamente a atividade de uma pro- teína. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" refere-se à substituição de aminoácidos por um aminoácido quimicamente seme- lhante, ou seja, substituindo aminoácidos não polares por outros ami- noácidos não polares; substituição de aminoácidos polares por outros aminoácidos polares, resíduos ácidos com outros aminoácidos ácidos, etc.

[0064] Substituições de aminoácidos, tais como aquelas que po- dem ser empregadas na modificação de um polipeptídeo imunorreativo aqui divulgado, são geralmente baseadas na similaridade relativa dos substituintes da cadeia lateral do aminoácido, por exemplo, sua hidro- fobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. Uma análise do tamanho, forma e tipo dos substitutos da cadeia lateral do aminoácido, revela que arginina, lisina e histidina são todos resíduos carregados positivamente; que alanina, glicina e serina são todas de tamanho si- milar; e que fenilalanina, triptofano e tirosina têm uma forma geralmen- te semelhante. Portanto, com base nessas considerações, arginina, lise e histidina; alanina, glicina e serina; e fenilalanina, triptofano e tiro- sina, são definidos aqui como equivalentes funcionais biologicamente.

[0065] A invenção também contempla isoformas dos polipeptídeos imunorreativos de E. chaffeensis aqui divulgados. Uma isoforma con- tém o mesmo número e tipos de aminoácidos como um polipeptídeo de E. chaffeensis como aqui divulgado, mas a isoforma tem uma estru- tura molecular diferente. As isoformas contempladas pela presente di- vulgação são aquelas que têm as mesmas propriedades de um peptí-

deo da invenção descrita aqui.

[0066] Aminoácidos não padronizados podem ser incorporados em proteínas por modificação química de aminoácidos existentes, ou por uma nova síntese de um polipeptídeo aqui divulgado. Um aminoácido não padronizado refere-se a um aminoácido que difere na estrutura química dos vinte aminoácidos padrão codificados pelo código genéti- co, e uma variedade de aminoácidos não padronizados são bem co- nhecidos na técnica.

[0067] Em modalidades selecionadas, a presente divulgação con- templa um derivado químico de um polipeptídeo imunorreativo aqui divulgado. "Derivado químico" refere-se a um peptídeo tendo um ou mais resíduos quimicamente derivados pela reação de um grupo late- ral funcional e retendo atividade biológica e utilidade Tais polipeptí- deos derivatizados incluem, por exemplo, aqueles em que grupos de amino livre foram derivatizados para formar sais específicos ou deriva- tizados por alquilação e/ou acilação, grupos de p-tolueno sulfonila, grupos carbo benzoxi, grupos t-butiloxi carbonila, grupos cloro acetila, grupos formila ou acetila, dentre outros. Grupos carboxila livres podem ser derivatizados para formar sais orgânicos ou inorgânicos, ésteres de metila e etila ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas e preferivel- mente amidas (primárias ou secundárias). Os derivados químicos po- dem incluir polipeptídeos que compreendem um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída por serina; e a ornitina pode ser substituída por lisina.

[0068] Deve-se notar que todas as sequências de resíduos de aminoácidos são representadas aqui por fórmulas, cuja orientação es- querda e direita, está na direção convencional do terminal-amino para o terminal-carboxi. Além disso, deve-se notar que um traço no início ou no final de uma sequência de resíduos de aminoácidos, indica uma ligação peptídica a uma nova sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos. Os aminoácidos descritos aqui são preferidos para estar na forma isomérica "L". No entanto, os resíduos na forma isomérica "D" podem ser substituídos por qualquer resíduo de L-aminoácido, desde que as propriedades funcionais desejadas, aqui estabelecidas, sejam retidas pela proteína. Mantendo a nomenclatura proteica pa- drão, abreviaturas para resíduos de aminoácidos são conhecidas na técnica.

[0069] Além dos equivalentes funcionais biológicos discutidos aci- ma, contempla-se que compostos estruturalmente semelhantes pos- sam ser formulados para imitar as porções chave de um peptídeo imu- norreativo aqui divulgado. Tais compostos, que podem ser denomina- dos peptídeos miméticos, podem ser usados da mesma forma que peptídeos imunorreativos aqui divulgados e, portanto, também são equivalentes funcionais. Métodos de geração de estruturas específicas são divulgados, por exemplo, em Mizuno et al., 2017, assim como nas patentes norte-americanas U.S. 5.446.128; 5.710.245; 5.840.833;

5.859.184; 5.440.013; 5.618.914; e 5.670.155. V. Métodos para detectar infecção por Ehrlichia

[0070] A erliquiose em humanos geralmente refere-se a infecções causadas por bactérias intracelulares obrigatórias na família Anaplas- mataceae, sobretudo nos gêneros Ehrlichia e Anaplasma. A maioria dos casos de erliquiose humana (HE) são causados por 3 espécies distintas: Ehrlichia chaffeensis, a principal entre elas (Dumler et al., 2007). As infecções por Ehrlichia em animais também são referidas como Ehbhrlichiose, juntamente com uma variedade de doenças causa- das por um grupo diversificado de patógenos dos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia e Cowdria (Dumler et al., 2007). As infec- ções por Ehrlichia são sustentadas principalmente em monócitos ou granulócitos e estudos demonstraram que os anticorpos desempe-

nham um papel essencial na resposta imune à infecção por Ehrlichia (Feng e Walker, 2004; Winslow et al., 2003; Winslow et al., 2000; Ya- ger et al., 2005).

[0071] Assim, modalidades selecionadas da presente divulgação, provêm métodos de para detectar anticorpos que ligam especificamen- te um organismo Ehrlichia em uma amostra. Tal método pode envolver o contato com um polipeptídeo imunorreativo isolado de Ehrlichia, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabela 1 ou um po- lipeptídeo da Tabela 2, com a amostra de teste, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo, e a detec- ção dos complexos de peptídeo-anticorpo. Nestas modalidades, a de- tecção dos complexos peptídeo-anticorpos é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo de Ehrlichia estão presen- tes na amostra de teste, e a ausência dos complexos peptídeo- anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos de um orga- nismo de Ehrlichia não estão presentes na amostra de teste.

[0072] Em múltiplas modalidades, a detecção de um polipeptídeo imunorreativo aqui divulgado, que especificamente liga um anticorpo de Ehrlichia (ou seja, um complexo de peptídeo-anticorpo), pode ser realizada usando um imunoensaio ligado à enzima (por exemplo ,um sanduíche ELISA, ou um ELISA competitivo), um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio fluorescente, um ensaio de quimioluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo late- ral, um ensaio de citometria de fluxo, um ensaio de espectrometria de massa, aglutinação de látex, um ensaio de hemaglutinação indireta (IHA), fixação complementar, um ensaio de inibição, um ensaio de avi- dez, um teste de vareta ou um ensaio baseado em particulados. Em algumas modalidades preferidas, complexos de peptídeo-anticorpo descritos aqui, são detectados usando um imunoensaio ligado à enzi- ma, um ensaio de fluxo lateral ou um ensaio baseado em partículas.

[0073] Como aqui usado, uma "amostra" é qualquer amostra que compreende, ou seja suspeita de compreender, anticorpos. De prefe- rência, a amostra é sangue, escarro, soro, plasma, saliva, fluido cere- brospinal ou urina. Em algumas modalidades, a amostra é uma amos- tra de sangue, soro ou plasma, obtida de um indivíduo ou paciente.

[0074] Erliquiose causada por uma infecção por E. chaffeensis em seres humanos, apresenta sintomas parecidos com gripe, de febre, calafrios, dor de cabeça e dores musculares. Em casos mais graves, náuseas, perda de apetite, perda de peso, dor abdominal, tosse, diar- reia e mudança no estado mental, também podem ser observadas. Erliquiose em humanos é potencialmente fatal.

[0075] Em cães, a erliquiose é mais frequentemente causada por bactérias E. chaffeensis ou E. canis, e progride em três fases: uma fa- se aguda, uma fase subclínica e uma fase crônica. A fase aguda nor- malmente se estende semanas após a infecção e apresenta sintomas semelhantes aos da erliquiose humana, tais como febre, letargia, per- da de apetite, respiração curta, dor nas articulações e rigidez, e tam- bém pode incluir sintomas mais graves como anemia, depressão, he- matomas e linfonodos, fígado e baço aumentados. A fase subclínica pode persistir por anos e, na maioria das vezes, não apresenta sinto- mas, embora anticorpos para antígenos de Ehrlichia possam ser de- tectáveis. A fase crônica da infecção por Ehrlichia geralmente apresen- ta sintomas recorrentes de perda de peso, anemia, disfunção neuroló- gica, sangramento, inflamação ocular, edema da perna e febre, e apresenta um perfil sanguíneo que muitas vezes leva a um diagnóstico errado da leucemia. Uma infecção por Ehrlichia que progride para o estágio crônico da doença, é muitas vezes fatal.

[0076] Os sintomas não específicos de uma infecção por Ehrlichia e sua semelhança com sintomas leves e graves de influenza, dificul- tam o diagnóstico de erliquiose em humanos e cães. O diagnóstico pode ser ainda mais dificultado pelos procedimentos atuais de testes laboratoriais para a infecção por Ehrlichia, que não são testes de ponto de atendimento, ou seja, os exames não estão disponíveis na maioria dos hospitais, clínicas e consultórios médicos ou veterinários onde um paciente pode receber tratamento.

[0077] Assim, modalidades selecionadas da presente divulgação fornecem métodos de identificação de uma infecção por Ehrlichia em um indivíduo mamífero. Tal método pode envolver contatar uma amos- tra do sujeito com um polipeptídeo imunorreativo isolado aqui divulga- do, por exemplo, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabe- la 1, ou mais preferivelmente um polipeptídeo da Tabela 2, sob condi- ções que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo, e detectar os complexos de peptídeo-anticorpo. Nessas modalidades, a detecção dos complexos peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o indivíduo tem uma infecção por Ehrlichia. O organismo de Ehrlichia pode ser um organismo de E. chaffeensis ou um organismo de E. ca- nis. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano ou um cão. Como acontece com outros métodos aqui divulgados, a etapa de detecção pode ser realizada utilizando qualquer tipo de ensaio ade- quado conhecido na técnica, podendo ser realizado preferencialmente usando um ensaio de fluxo lateral ou um ELISA.

[0078] Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados intercambia- velmente aqui, e podem se referir a um mamífero, especialmente um ser humano ou um cão. Em certas modalidades, um "indivíduo" ou "paciente" refere-se a um hospedeiro de Ehrlichia mamífero (ou seja, animal infectado com um organismo Ehrlichia). Um hospedeiro de Ehr- lichia pode ser, por exemplo, primata humano ou não humano, bovino, canino, caprino, corvino, equino, felino, lapino, leporino, lupino, murino, ovino, suíno, vulpino, e similares, incluindo animais, espécimes zooló- gicos, exóticos, além de animais companheiros, animais de estimação e qualquer animal sob os cuidados de um praticante veterinário. Um indivíduo pode ou não estar infectado com um organismo de Ehrlichia, e um indivíduo pode ser um mamífero suspeito de estar infectado com um organismo de Ehrlichia.

[0079] Sem querer ser vinculado pela teoria, os polipeptídeos imu- norreativos de Ehrlichia aqui divulgados, compreendem pelo menos uma parte de um grande epítopo de Ehrlichia, que explica uma imuno- genicidade específica da espécie em humanos e animais. O termo "epítopo" é usado aqui para indicar essa porção de uma substância imunogênica especificamente identificada, reconhecida e ligada por um anticorpo ou receptor de superfície celular de um sistema imunoló- gico hospedeiro, que tenha montado uma resposta imune à substância imunogênica determinada por qualquer método conhecido na técnica. (ver, por exemplo, Geysen et al., 1984). Assim, um epítopo que é "es- pecífico da espécie" é um epítopo que pode ser usado para diferenciar uma espécie do gênero Ehrlichia de outra espécie de Ehrlichia.

[0080] Modalidades especiais referem-se a determinar se um indi- víduo foi imunizado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um organismo de Ehrlichia. Nestas modalidades, o método compreen- de contatar com uma amostra do indivíduo a pelo menos um dos pep- tídeos imunorreativos isolados da Tabela 1, ou mais preferencialmente um polipeptídeo da Tabela 2, que não é um componente de uma vaci- na de Ehrlichia, e detectar se um anticorpo na amostra se liga especi- ficamente ao polipeptídeo imunorreativo isolado de Ehrlichia. De acor- do com o método, se um anticorpo na amostra se liga especificamente ao polipeptídeo imunorreativo isolado, então o indivíduo tem uma in- fecção ativa de Ehrlichia, e se um anticorpo não se liga especificamen- te ao peptídeo imunorreativo isolado, então o sujeito está previamente imunizado com uma vacina de Ehrlichia ou não é infectado com um organismo de Ehrlichia. Um organismo de Ehrlichia pode ser um orga-

nismo de E. chaffeensis ou um organismo de E. canis.

[0081] Um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia (por exemplo, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabela 1 ou um po- lipeptídeo da Tabela 2) pode ser usado para ligar um anticorpo especí- fico de Ehrlichia ou específico E. chaffeensis, usando uma variedade de métodos ou kits. A ligação específica entre um anticorpo e um pep- tídeo imunorreativo da presente divulgação pode, portanto, ser avalia- da por qualquer método apropriado conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a, um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA), um ELISA sanduiche, um ELISA competitivo, imunoblot, imu- noprecipitação, radioimunoensaio (RIA), imunotingimento, aglutinação de látex, ensaio de hemaglutinação indireta (IHA), fixação complemen- tar, ensaio de imunofluorescência indireta (FA), nefelometria, ensaio de citometria de fluxo, ensaio de quimiluminescência, imunoensaio de fluxo lateral, ensaio de u-captura, ensaio de espectrometria de massa, ensaio baseado em partículas, ensaio de inibição e/ou ensaio de avidi- cidade. Métodos exemplares de detectar a ligação de um anticorpo específico de Ehrlichia a um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia conforme aqui divulgado, podem incluir, por exemplo, um ELISA reali- zado em uma microplaca, um teste de fluxo lateral realizado usando um dispositivo de vareta ou de fluxo lateral, ou um ensaio de matriz de suspensão baseado em particulados, realizado usando o sistema Bio- Plex6 (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA). A. ELISA

[0082] Em certas modalidades, a detecção de um complexo de peptídeo-anticorpo descrito aqui, é realizada usando um ensaio imu- nossorbente ligado à enzima (ELISA). Este ensaio pode ser realizado primeiro contatando um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia (por exemplo, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabela 1 ou um polipeptídeo da Tabela 2) que foi imobilizado em um suporte sóli-

do, comumente o poço de uma placa de micro titulação, com a amos- tra, de tal forma que anticorpos específicos para o peptídeo dentro da amostra, sejam permitidos a se ligar ao peptídeo imobilizado. A amos- tra não ligada é então removida do peptídeo imobilizado e um rea- gente de detecção, capaz de se ligar ao complexo de anticorpo- polipeptídeo imobilizado, é adicionado. A quantidade de reagente de detecção que permanece vinculada ao suporte sólido é então determi- nada, usando um método apropriado para o reagente de detecção es- pecífico.

[0083] Em algumas modalidades, o reagente de detecção contém um agente de ligação (tal como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, lectina ou antígeno livre) conjugado ou covalentemen- te anexado a um grupo repórter ou rótulo. Grupos repórteres ou rótulos exemplares incluem: enzimas (tal como peroxidase de rabanete), substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos lu- minescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação de agente de ligação ao grupo repórter ou rótulo, pode ser alcançada utilizando métodos padrão conhecidos daqueles com habilidades ordinárias na técnica. Agentes de ligação comuns também podem ser adquiridos conjugados a uma variedade de grupos repórteres de muitas fontes comerciais (por exemplo, Zymed Laboratories, São Francisco, CA; e Pierce, Rockford, IL.).

[0084] Em um aspecto da presente divulgação, a presença ou au- sência de anticorpos específicos de Ehrlichia pode ser determinada na amostra, comparando-se o nível de um sinal detectado de um grupo repórter ou rótulo na amostra, com o nível de um sinal que correspon- de a uma amostra de controle ou valor de corte predeterminado. Em certas modalidades, o valor de corte pode ser o sinal médio obtido quando o peptídeo imunorreativo de Ehrlichia imobilizado é incubado com amostras de um indivíduo não infectado. O valor de corte pode ser determinado usando um método estatístico ou programa de com- putador. B. Testes de fluxo lateral

[0085] Testes de fluxo lateral também podem ser chamados de testes de tira imunocromatográfica (ICS) ou simplesmente testes de tiras. Em geral, um teste de fluxo lateral é uma forma de ensaio em que a amostra de ensaio flui lateralmente ao longo de um substrato sólido, via capilaridade, ou, alternativamente, sob controle fluídico. Es- ses testes são muitas vezes baratos, requerem uma quantidade muito pequena (por exemplo, uma gota) da amostra, e normalmente podem ser realizados de forma reprodutível com treinamento mínimo. A sim- plicidade econômica e a robustez de muitos formatos de ensaio de flu- xo lateral, tornam esses tipos de testes ideais para identificar uma in- fecção por Ehrlichia (por exemplo, E. chaffeensis ou E. canis) nos pon- tos de atendimento médico, o que pode ser particularmente importante quando o indivíduo é, por exemplo, um ser humano ou cão exibindo anticorpos detectáveis durante a fase aguda tratável da infecção.

[0086] Exemplos de formatos de dispositivo de fluxo lateral inclu- em, mas não se limitam a uma vareta, um cartão, um chip, um micro slide e um cassete, e é amplamente demonstrado na arte técnica que escolha do formato é em grande parte dependente das características de um determinado ensaio. Assim, os dispositivos de fluxo laterais são agora onipresentes na medicina humana e veterinária e bastante vari- ados, fornecendo muitas opções ao profissional normalmente qualifi- cado para detectar um complexo de peptídeo-anticorpo em uma amos- tra usando um ensaio de fluxo lateral (veja qualquer uma das patentes norte-americanas U.S. 7,344,893, 7,371,582, 6,136,610, e pedidos de patentes norte-americanas U.S. 2005/0250141 e 2005/0047972, ou Koczula et al. (2016), cada um incorporado aqui por referência.) . À título de um exemplo não limitante, uma amostra de um indivíduo sus-

peito de ter uma infecção por Ehrlichia, é aplicada a um dispositivo de fluxo lateral compreendendo pelo menos uma zona de amostra e uma zona de ligação. A amostra pode ser uma amostra de soro, podendo ser extraída lateralmente da zona amostral para a zona de ligação, que compreende um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia aqui di- vulgado (por exemplo, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabela 1 ou um polipeptídeo da Tabela 2) imobilizados a uma superfí- cie do dispositivo de fluxo lateral. Neste exemplo, a ligação do polipep- tídeo imunorreativo imobilizado no dispositivo de fluxo lateral, é uma indicação de que anticorpos específicos de Ehrlichia estão presentes na amostra do indivíduo, indicando uma infecção por Ehrlichia no indi- víduo, tal como uma infecção por E. chaffeensis no indivíduo.

[0087] Em modalidades relacionadas, um ensaio ELISA conforme descrito acima, pode ser realizado em um rápido fluxo, fluxo lateral ou formato de teste de tira, em que o antígeno é imobilizado em uma membrana, tal como uma membrana nitrocelulose. Neste teste de flu- xo, os anticorpos de Ehrlichia dentro da amostra, se ligam ao peptídeo imunorreativo de Ehrlichia imobilizado, à medida que a amostra passa pela membrana. Um reagente de detecção, tal como a proteína A rotu- lada com ouro, um fluoróforo ou um cromóforo, liga-se ao complexo de peptídeo-anticorpo como a solução contendo o reagente de detecção, flui através da membrana. Os complexos de peptídeo-anticorpos liga- dos ao reagente de detecção podem então ser detectados, conforme apropriado para o reagente de detecção utilizado (por exemplo, com base na presença ou ausência de uma cor visivelmente detectável ou rótulo fluorescente, uma nanopartícula, uma nanopartícula de terras raras luminescente, uma nanopartícula luminosa, uma nanopartícula luminosa, uma nanopartícula de aluminato de estrôncio (por exemplo, ver Paterson et al. , 2014; e Wang et al. , 2017, etc.).

[0088] Em um aspecto, pode-se realizar um formato de fluxo de

ELISA em que uma extremidade da membrana à qual um peptídeo imunorreativo Ehrlichia (por exemplo, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabela 1 ou um polipeptídeo da Tabela 2) está imo- bilizado, pode ser imerso em uma solução contendo a amostra, ou a amostra pode ser adicionada a uma área (ou seja, uma zona de amos- tra) em uma extremidade da membrana. A amostra migra ao longo da membrana através de uma região (ou seja, uma zona de rotulagem), compreendendo o reagente de detecção, e flui para a área (ou seja, uma zona de ligação) compreendendo o peptídeo imunorreativo de Ehrlichia imobilizado. Um acúmulo de reagente de detecção na zona de ligação indica a presença de anticorpos específicos de Ehrlichia na amostra.

[0089] Tipicamente, um ELISA de fluxo pode apresentar um rea- gente de detecção aplicado a uma tira de teste em um padrão, tal co- mo uma linha, que pode ser lido visualmente. Como em outros testes de fluxo lateral, a ausência de tal padrão normalmente indica um resul- tado negativo. Está dentro da capacidade de um profissional normal- mente qualificado, selecionar uma quantidade do polipeptídeo imunor- reativo de Ehrlichia para imobilização na membrana que pode gerar um padrão visualmente discernível, quando a amostra biológica con- tém um nível de anticorpos que seria suficiente para gerar um sinal positivo em um formato padrão ELISA. Preferivelmente, a quantidade de peptídeo imobilizado na membrana varia de cerca de 25 ng a cerca de 1 mg.

C. Ensaios baseados em particulados

[0090] Em geral, ensaios à base de partículas usam um parceiro de ligação de captura, tal como um anticorpo ou um antígeno no caso de um imunoensaio, revestido na superfície de partículas, como mi- croesferas, cristais, chips ou nanopartículas. Os ensaios baseados em partículas podem ser efetivamente multiplexados ou modificados para avaliar inúmeras variáveis de interesse, incorporando partículas rotu- ladas fluorescentemente ou partículas de diferentes tamanhos em um único ensaio, cada um revestido ou conjugado a um ou mais parceiros rotulados de ligação de captura. O uso de tecnologias sensíveis de detecção e amplificação, com plataformas de ensaio baseadas em partículas, conhecidas na técnica, resultou em numerosos sistemas de ensaio flexíveis e sensíveis para escolher na realização de um método aqui descrito. Por exemplo, um ensaio baseado em partículas multi- plex, como o sistema de ensaio bio-plex& de suspensão disponível nos Laboratórios Bio-Rad, Inc. (Hércules, CA) e Luminex, Inc. (Austin, TX) pode ser útil na identificação de anticorpos de Ehrlichia em uma amostra.

[0091] Em um aspecto, a presente divulgação contempla a imobili- zação de um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia isolado (por exemplo, compreendendo pelo menos dois peptídeos da Tabela 1 ou um polipeptídeo da Tabela 2) sobre uma superfície de uma partícula para uso em um imunoensaio baseado em partículas. Como descrito aqui, os métodos de imobilização de peptídeos em superfícies de su- porte são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferenci- al, um polipeptídeo imunorreativo rotulado her, divulgado aqui, é imobi- lizado sobre uma superfície de uma partícula e o complexo peptídeo- partícula é empregado em um ELISA ou em um ensaio de citometria de fluxo, de acordo com protocolos estabelecidos. VI. Vacina de Ehrlichia e composições imunogênicas

[0092] Trabalhos anteriores mostraram que proteínas de Ehrlichia que induzem respostas de anticorpos, podem fornecer respostas imu- nes protetoras; assim, em algumas modalidades, uma proteína de Ehr- lichia aqui fornecida (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2) pode ser incluída em uma composição far- macêutica, tal como uma composição de vacina para administração a um mamífero ou indivíduo humano. Por exemplo, a proteção contra a infecção por E. chaffeensis tem sido demonstrada com anticorpos es- pecíficos de epítopo direcionados a OMP e TRPs, em modelos in vitro e em modelos animais (Kuriakose et al., 2012; Li et al., 2002; Li et al. 2001), demonstrando que proteínas de Ehrlichia, que provocam fortes respostas de anticorpos a epítopos lineares, são protetoras.

[0093] Em modalidades selecionadas, contempla-se que um po- lipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2, possa estar compreendido em uma composição de vaci- na e ser administrado a um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou cão), para induzir uma resposta imune protetora no indivíduo, que po- de prevenir substancialmente ou amenizar a infecção no indivíduo por um organismo de Ehrlichia, tal como Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis. Uma composição de vacina para uso farmacêutico em um indi- víduo, pode incluir um polipeptídeo imunorreativo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0094] As expressões "farmacêutica", "farmaceuticamente aceitá- vel" ou "farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades mole- culares e composições que não produzem uma reação adversa, alér- gica ou outra desagradável, quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um ser humano, conforme apropriado. Como aqui usado, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifún- gicos), agentes isotônicos, agentes de absorção, sais, medicamentos, estabilizadores de drogas, géis, pastas, excipientes, agentes de desin- tegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, corantes, tais como materiais e combinações destes, como seria co- nhecido por alguém com habilidade comum na técnica (ver, por exem- plo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing

Company, 1289-1329, 1990, incorporada aqui por referência). Exceto na medida em que qualquer carreador convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições de vacinas da pre- sente divulgação, é contemplado.

[0095] Como usado aqui, uma "resposta imune protetora" refere- se a uma resposta do sistema imunológico de um hospedeiro mamífe- ro a um antígeno de Ehrlichia, que resulta em reconhecimento aumen- tado da produção de antígenos e anticorpos pelo sistema imunológico do hospedeiro mamífero, após posterior exposição a um patógeno de Ehrlichia. Uma resposta imune protetora pode reduzir substancialmen- te ou prevenir sintomas como resultado de uma exposição subsequen- te a Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis.

[0096] Em algumas modalidades, uma composição de vacina da presente divulgação, pode incluir um polipeptídeo imunorreativo (por exemplo, ter uma sequência que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade sequencial a um polipeptídeo de Fórmula | ou um polipeptídeo da Ta- bela 2). Em algumas modalidades, uma composição de vacina com- posta pelo polipeptídeo imunorreativo, pode ser usada para induzir uma resposta imune protetora contra Ehrlichia chaffeensis (por exem- plo, em um indivíduo humano ou cão).

[0097] Uma pessoa versada nas técnicas médicas, apreciará que a quantidade real de dosagem de uma composição de vacina adminis- trada a um animal ou paciente humano, pode ser determinada por fa- tores físicos e fisiológicos, tais como peso corporal, gravidade da con- dição, o tipo de doença em tratamento, intervenções terapêuticas con- correntes ou simultâneas, idiopatia do paciente e rota da administra- ção. O praticante responsável pela administração determinará, de qualquer forma, a concentração de ingredientes ativos em uma com- posição e doses apropriadas para o sujeito individual.

[0098] Em certas modalidades, as composições de vacinai podem incluir, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1% de um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia compreendendo ou consistindo em um po- lipeptídeo da Fórmula | ou da Tabela 2. Em outras modalidades, o composto ativo pode incluir entre 2% a cerca de 75% do peso da uni- dade, ou entre cerca de 25% a cerca de 60%, por exemplo, e qualquer faixa derivável desta. Como com muitas composições de vacinas, a frequência de administração, bem como a dosagem, variam entre membros de uma população de animais ou seres humanos de manei- ras previsíveis por alguém habilitado na técnica da imunologia. A título de exemplo não limitante, as composições farmacêuticas e vacinas podem ser administradas por injeção (por exemplo, intercutânea, in- tramuscular, intravenosa ou subcutânea), intranasalmente (por aspira- ção) ou oralmente. Entre 1 e 3 doses podem ser administradas duran- te um período de 1 a 36 semanas. Em algumas modalidades, são ad- ministradas 3 doses, em intervalos de 3 a 4 meses, e as vacinas de reforço podem ser dadas periodicamente posteriormente.

[0099] Em algumas modalidades, uma "dose adequada" é uma quantidade de um polipeptídeo imunorreativo que, quando administra- do como descrito acima, é capaz de levantar uma resposta imune em um paciente imunizado, suficiente para proteger o indivíduo de uma infecção por Ehrlichia em exposições subsequentes a organismos de Ehrlichia. Em geral, a quantidade de peptídeo presente em uma dose adequada (ou produzida in situ pelo ácido nucleico em uma dose) po- de variar de cerca de 1 pg a cerca de 500 mg por kg de hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 pg a cerca de 10 mg, preferivelmente de cerca de 100 pg a cerca de 1 mg e mais preferivelmente de cerca de 100 pg a cerca de 100 microgramas.

[00100] Uma composição de vacina da presente divulgação pode incluir diferentes tipos de carreadores, dependendo se deve ser admi-

nistrado em forma sólida, líquida ou aerossol, e se ela precisa ser es- téril para tais rotas de administração como injeção. Uma composição de vacina aqui divulgada, pode ser administrada intramuscularmente, intradermicamente, subcutânea, intravenosa, interarterial, intraperito- neal, intralesional, intracraniana, intrarticulada, intraprostática, intra- pleuralmente, intratraqueicamente, intranicamente, intraconjuncional- mente, intravaginalmente, intraritalmente, topicamente, intratumoral- mente, intramuscularmente, intraperitoneal, subconjunctivamente, in- travesicularmente, mucosalmente, intrapericardial, local, oralmente, intranasalmente ou por inalação, injeção, infusão, infusão contínua, lavagem ou perfusão localizada. Uma composição de vacina também pode ser administrada a um indivíduo através de um cateter, em cre- mes, em composições lipídicas, por entrega de particulado balístico, ou por outro método ou qualquer combinação dos precedentes, como deve ser conhecido por alguém de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st. Ed. Lippincott Williams e Wilkins, 2005, incorporada aqui por referên- cia).

[00101] Embora qualquer carreador adequado, conhecido por aque- les de habilidade comum na técnica, possa ser empregado nas com- posições de vacina desta invenção, o tipo de carreador varia depen- dendo do modo de administração. Para a administração parenteral, tal como injeção subcutânea, o carreador preferivelmente compreende, soro fisiológico, álcool, gordura, cera ou tampão. Para a administração oral, qualquer um dos carreadores acima ou um carreador sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de só- dio, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio, po- dem ser empregados. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, ga- lactídio polilático) também podem ser empregadas como carreadores para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas bio-

degradáveis adequadas são divulgadas, por exemplo, nas patentes norte-americanas U.S. 4.897.268 e 5.075.109.

[00102] De particular interesse, em algumas modalidades, é uma composição de vacina que pode ser administrada por entrega de parti- culados transdérmica ou balísticas microestruturada. As microestrutu- ras como carreadoras da formulação de vacina são uma configuração desejável para aplicações de vacinas e são amplamente conhecidas na técnica (por exemplo, patentes norte-americanas U.S. 5.797.898,

5.770.219 e 5.783.208, e pedido de patente norte-americana U.S. 2005/0065463). Tal composição de vacina formulada para a entrega de particulado balística, pode incluir um polipeptídeo imunorreativo iso- lado da Tabela 1, 2 ou 3 imobilizada em uma superfície de um substra- to de suporte. Nessas modalidades, um substrato de suporte pode in- cluir, mas não se limita a, uma microcápsula, uma micropartícula, uma microesfera, uma nanocápsula, uma nanopartícula, uma nanoesfera, ou uma combinação destas.

[00103] —Microestruturas ou partículas balísticas que servem como substrato de suporte para um polipeptídeo imunorreativo de Ehrlichia aqui divulgado, podem ser compreendidas de material biodegradável e material não biodegradável, e tais substratos de suporte podem ser compreendidos por polímeros sintéticos, sílica, lipídios, carboidratos, proteínas, lectinas, agentes iônicos, reticulantes e outros componentes de microestrutura disponíveis na técnica. Protocolos e reagentes para a imobilização de um peptídeo da invenção, a um substrato de apoio composto por tais materiais, estão amplamente disponíveis comerci- almente e na técnica.

[00104] Em outras modalidades, uma composição de vacina com- preende um polipeptídeo imunorreativo imobilizado ou encapsulado da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2 e um substrato de suporte. Nessas modalidades, um substrato de suporte pode incluir, mas não se limita a, uma microesfera lipídica, uma nanopartícula lipídica, um etossomo, um lipossomo, um niossomo, um fosfolipídio, um esfingos- somo, um tensoativo, um transferossomo, uma emulsão, ou uma com- binação destes. A formação e o uso de lipossomos e outras formulações lipídicas de nano e micro carreadores são geralmente conhecidas por aqueles de habilidades comuns na técnica, e o uso de lipossomos, mi- cropartículas, nanocápsulas e semelhantes, ganharam uso generalizado na entrega de terapêuticos (por exemplo, patente norte-americana U.S.

5.741.516, especificamente incorporada aqui em sua totalidade por refe- rência). Numerosos métodos de preparações de lipossomas e de simila- res a lipossomas como potenciais carreadores de medicamentos poten- cias, incluindo encapsulamento de peptídeos, foram revisados (paten- tes norte-americanas U.S. 5.567.434; 5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587, cada uma delas especificamente incorporada em sua to- talidade por referência).

[00105] Adicionalmente aos métodos de entrega aqui descritos, uma série de técnicas alternativas também são contempladas para a administração das composições de vacinas divulgadas. Como exem- plo não limitante, uma composição de vacina pode ser administrada por sonoforese (ou seja, ultrassom), que tem sido usada e descrita na patente norte-americana U.S. 5.656.016 para melhorar a taxa e a efi- cácia da permeação de medicamentos para dentro e através do siste- ma circulatório; injeção intraóssea (Patente U.S. 5.779.708) ou entrega controlada por retorno (Patente U.S. 5.697.899), e cada uma das pa- tentes deste parágrafo é especificamente incorporada aqui, em sua totalidade, por referência.

[00106] Qualquer um de uma variedade de adjuvantes pode ser empregado nas vacinas desta invenção, para melhorar inespecifica- mente a resposta imune. A maioria dos adjuvantes contém uma subs- tância projetada para proteger o antígeno de catabolismo rápido, tal

BA4/74 como hidróxido de alumínio ou óleo mineral, e um estimulador inespe- cífico de respostas imunes, tal como lipídio A, Bortadella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. Adjuvantes adequados estão disponíveis comercialmente como, por exemplo, o Adjuvante Incompleto de Freund e o Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) e Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Outros adjuvantes adequados incluem alum, microesferas biodegradá- veis, monofosforila de lipídio A e quil A.

[00107] Um polipeptídeo pode ser formulado para uma composição em forma neutra ou de sal. Sais farmacêuticos aceitáveis, incluem os sais de adição de ácida (formados com os grupos aminos livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e afins. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgâà- nicas, tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas, tais como isopropil amina, trimetil amina, histidina, procaína e afins.

[00108] De qualquer forma, a composição pode incluir vários antio- xidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Adici- onalmente, a prevenção da ação de microrganismos pode ser provo- cada por conservantes, tais como vários agentes antibacterianos e an- tifúngicos, incluindo, mas não se limitando a, parabenos (por exemplo, metil parabenos, propil parabenos), cloro butanol, fenol, ácido sórbico, timerossal ou combinações destes.

[00109] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporan- do os peptídeos ativos, na quantidade necessária, no solvente apro- priado, com vários dos outros ingredientes enumerados acima, con- forme necessário, seguidos de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril, que contém o meio de dispersão básica e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções, suspensões ou emulsão injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vá- cuo ou de secagem congelante, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado, a partir de um meio líquido previamente filtrado dos mesmos. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário, e o diluente líquido primei- ro tornado isotônico, antes da injeção, com soro fisiológico suficiente ou glicose. Também é contemplada a preparação de composições al- tamente concentradas para injeção direta, onde o uso do DMSO como solvente é previsto para resultar em penetração extremamente rápida, proporcionando altas concentrações dos agentes ativos em uma área pequena.

[00110] A composição deve ser estável nas condições de fabrica- ção e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. Será apreciado que a contaminação por endotoxinas deve ser mantida minimamente em um nível seguro, por exemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.

[00111] Em modalidades especiais, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que atrasam a absorção, tal como, por exemplo, mono es- tearato de alumínio, gelatina ou combinações destes. A. Bacterina de Ehrlichia

[00112] Em algumas modalidades, uma composição imunogênica ou de vacina, conforme aqui divulgado, compreende uma bacterina de Ehrlichia, tal como uma bacterina de E. Canis ou uma bacterina de E. chaffeensis. A bacterina de E. Canis pode ser preparada pela inativa- ção por calor ou pela inativação quimicamente da bacterina de Ehrli- chia.

[00113] Uma variedade de métodos pode ser usada para gerar uma bacterina de E. chaffeensis ou E. canis. Por exemplo, as bactérias po- dem ser inativadas pelo calor ou psoraleno, na presença de luz ultravi- oleta para produzir a bacterina. A quantidade efetiva de imunização da bacterina de Ehrlichia inativada pode variar, dependendo da cepa ou cepas escolhidas. Prevê-se que qualquer quantidade de uma bacterina Ehrlichia isolada ou em combinação com (i) polipeptídeo quimérico, conforme aqui divulgado (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula | ou da Tabela 2) e/ou (ii) adjuvante(s), suficiente para evocar uma res- posta imune protetora, pode ser usada em várias modalidades (por exemplo, para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo). Em algumas modalidades, uma unidade de dosagem compreendendo pelo menos cerca de 1x10º TCIDso inativado de bacterina de E. chaf- feensis e/ou E. canis, pode ser usada. Métodos adicionais que podem ser usados para gerar uma bacterina de Ehrlichia incluem, mas não se limitam a, tratamento de E. chaffeensis ou E. Canis com calor, formal- deído, formalina, bietileno-amina, radiação e/ou tratamento com beta- propiolactona. Espera-se que a bacterina possa ser inativada por qualquer método adequado disponível. Métodos adicionais que podem ser usados para gerar uma bacterina de Ehrlichia ou E. canis, incluem aqueles descritos, por exemplo, em WO2005087803, EP2433646, Ve- ga et al. , 2007; ou Stuen et al. , 2015.

[00114] Em algumas modalidades, a bacterina de Ehrlichia compre- ende antígeno bruto inativado à base de bactérias E. chaffeensis e/ou E. canis inativadas. Por exemplo, em algumas modalidades, pode-se obter um “buffy coat” congelado (por exemplo, 10 ml de buffy coat con- gelado) contendo E. chaffeensis ou E. Canis, e o material foi inativado usando 0,3% de formaldeído por 48 h, à temperatura ambiente. A par- tir daí, o material pode ser testado por falta de infectividade, por méto- dos in vitro ou usando um modelo animal in vivo. Métodos para inativar bactérias usando formaldeído são descritos ainda em Tollersrud et al.,

2001. A bacterina de Ehrlichia resultante pode ser incluída com (i) 1, 2, 3, ou mais proteínas imunogênicas quiméricas ou peptídeos como descrito aqui (por exemplo, como descrito na Tabela 2) e/ou (ii) um adjuvante, para formar uma composição imunogênica ou de vacina. Por exemplo, a bacterina de E. Canis inativada pode ser preparada como uma suspensão e, em seguida, incluída em um adjuvante em emulsão, por exemplo, como descrito abaixo. B. Adjuvantes

[00115] Em alguns aspectos, uma composição imunogênica com- preende um ou mais polipeptídeos quiméricos, conforme aqui divulga- do (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula | ou da Tabela 2), tam- bém contém um adjuvante. Em algumas modalidades, a composição é uma preparação farmacêutica ou uma composição de vacina. Uma variedade de adjuvantes que são conhecidos, pode ser incluída. Por exemplo, adjuvantes, tais como MF59, ASO1, ASO2, ASO3, ASOA, vi- rossomas, CAFO1, CAFO4, CAFO5, Montanide ISATM 720 ou Monta- nide ISATM 51 (por exemplo, Bonam et al., 2017) podem ser usados em algumas personificações.

[00116] Em algumas modalidades, a composição imunogênica ou de vacina inclui um adjuvante compreendendo um triterpenoide, este- rol, imunomodulador, polímero e/ou estimulador Th2. Por exemplo, em algumas modalidades, o adjuvante compreende DEAE Dextran, um oligonucleotídeo imunoestimulador e óleo (por exemplo, um óleo mine- ral leve), em que o oligonucleotídeo imunoestimulatório é um CpG con- tendo ODN, e em que a formulação adjuvante é uma emulsão água- em-óleo (A/O). O adjuvante da vacina pode compreender opcional- mente uma bacterina de Ehrlichia (tal como um E. Canis ou E. chaffe- ensis inativada pelo calor) e/ou um peptídeo quimérico, conforme di- vulgado aqui (por exemplo, da Fórmula | ou da Tabela 2). Em algumas modalidades, a composição imunogênica ou vacina inclui um compo- nente de antígeno e uma formulação adjuvante compreendendo uma saponina (por exemplo,, presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug, por dose), um esterol (por exemplo., presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug, por dose), um composto de amônio quaternário (por exemplo, presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 .mu.g por dose), um po- límero (por exemplo., presente em uma quantidade de cerca de 0,0001% v/v a cerca de 75% v/v), e um ORN/ODN; a saponina pode ser Quil A ou uma facção purificada desta, o esterol pode ser coleste- rol, o composto de amônio quaternário pode ser brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA), o polímero pode ser ácido poliacrílico, e o ORN/ODN pode ser um CpG. O adjuvante pode compreender um gli- colipídio, tal como o acetato de N-(2-deoxi-2-L-leucil amino-B-D-gluco piranosil) -N- octadecil dodecanamida. O adjuvante pode compreender um oligonucleotídeo imunoestimulador, um polímero de ácido poliacrí- lico e pelo menos dois dos seguintes: (a) brometo de dimetil dioctade- cil amônio (DDA); (b) um esterol; e/ou (c) acetato de N-(2-deoxi-2-L- leucil amino-B-D-gluco piranosil) -N-octadecil dodecanamida. Por exemplo, a composição de vacina pode incluir um adjuvante como descrito, por exemplo, na patente norte-americana U.S. 10.238.736, U.S. 8.580.280 ou publicação U.S. 2019/0008953.

[00117] Em algumas modalidades, a composição imunogênica ou de vacina inclui um componente de antígeno e uma formulação adju- vante compreendendo uma saponina de triterpenoide, um esterol, um composto de amônio quaternário e um polímero de ácido poliacrílico, em que o componente antígeno compreende ou consiste em uma bac- terina de Ehrlichia (tal como uma E. Canis inativada pelo calor) e/ou um polipeptídeo quimérico, conforme aqui divulgado (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula | ou da Tabela 2). Em algumas modalidades,

a saponina está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, o esterol está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, e o polímero de ácido poliacrílico está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001% v/v a cerca de 75% v/v. Por exemplo, a composição de vacina pode incluir um adjuvante como des- crito, por exemplo, na patente norte-americana U.S. 9.662.385.

[00118] Em alguns aspectos, uma composição imunogênica ou de vacina, conforme aqui divulgado, compreende um adjuvante à base de óleo, compreendendo uma bacterina de Ehrlichia (tal como uma E. Canis ou E. chaffensis inativada pelo calor) e/ou um ou mais polipeptí- deos quiméricos, conforme divulgado aqui (por exemplo, um polipeptí- deo da Fórmula | ou da Tabela 2). Por exemplo, a formulação adjuvan- te pode compreender uma fase oleosa e uma fase aquosa, um carrea- dor policatiônico (por exemplo, DEAE dextran) e um CpG contendo oligonucleotídeo imunoestimulatório, no qual a vacina é uma emulsão água-em-óleo. O adjuvante pode, opcionalmente, incluir ainda um gel de hidróxido de alumínio. Em algumas modalidades, o CpG contendo oligonucleotídeo imunoestimulatório está presente na quantidade de cerca de 50 a cerca de 400 ug por dose e o DEAE Dextran está pre- sente na quantidade de cerca de 10 a cerca de 300 mg por dose. À formulação de adjuvante pode compreender um oligonucleotídeo imu- noestimulante, carreador policatiônico, esterol, saponina, amina qua- ternária, agonista TLR-3, glicolipídio e/ou MPL-A (ou um análogo) em uma emulsão de óleo. Por exemplo, a composição da vacina pode compreender um adjuvante como descrito, por exemplo, na patente norte-americana U.S. 10.117.921 e U.S. 2019/0038737.

[00119] Em algumas modalidades, a composição imunogênica é uma emulsão compreendendo (i) por uma bacterina de Ehrlichia (tal como uma E. Canis ou E. chaffeensis inativada pelo calor) e/ou (ii) um ou mais polípeptidios quiméricos, conforme aqui divulgado (por exemplo, um polipeptídeo da Fórmula | ou da Tabela 2). Por exemplo, a composição da emulsão pode compreender um adjuvante, tal como polímero acrílico e/ou brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA), na fase aquosa. A emulsão pode ser preparada, em algumas modalida- des, misturando uma fase aquosa contendo o antígeno (por exemplo, uma bacterina de E. Canis, tal como uma E. Canis inativada pelo calor, e/ou um ou mais polipeptídeos quiméricos (por exemplo, um polipeptí- deo de Fórmula | ou da Tabela 2) e adjuvante com uma fase de óleo, na presença de um emulsificante. Em algumas modalidades o compo- nente adjuvante compreende uma emulsão óleo-em-água, em que a fase aquosa da emulsão óleo-em-água compreende brometo de dime- til dioctadecil amônio (DDA) e/ou um ácido alquil-poliacrílico (alquil- PAA). Em algumas modalidades, o óleo na emulsão óleo-na-água, é óleo mineral, óleo de terpeno, óleo de soja, azeite de oliva ou um deri- vado de propileno glicol. O adjuvante pode ainda compreender o com- ponente adjuvante compreendendo ainda DNA CpG, um lipo polissa- carídeo e/ou monofosforil lipídio A. A vacina pode ainda compreender um ou mais emulsificantes. Por exemplo, a composição da vacina po- de incluir um adjuvante como descrito, por exemplo, na patente norte- americana U.S. 9.545.439 ou U.S. 8.980.288.

[00120] O adjuvante pode ser um lipossoma ou uma formulação de emulsão. Os lipossomos podem ser unilamelares, multilamelares ou multivesiculares. Em algumas modalidades, a composição imunogêni- ca ou de vacina compreende um adjuvante lipídio ou contendo lipídio. Em algumas modalidades, os lipossomos são lipossomos catiônicos. Em várias modalidades, adjuvantes tais como MF59 (por exemplo, Calabro et a/. (2013) Vaccine 31: 3363-3369), ASO1 (Didierlaurent, et al. (2014) J. Immunol. 193, 1920-1930), ASO2 (Garçon and Van

Mechelen (2011) Expert Rev.

Vaccines 10, 471486), ASO3 (Morel, S. et al. (2011) Vaccine 29, 2461-2473), ASO4 (Didierlaurent, et al. (2009) J.

Immunol. 183: 6186-6197.), Virosomes (Kúnzi, et al. (2009) Vaccine 27, 3561-3567), CAFO1 (Tandrup Schmidt, et al. (2016) Pharmaceutics 8, 7.), CAFO4 (Billeskov, et al. (2016) PLoS One 11, e0161217), CAFOS (Billeskov, et al. (2016) PLoS One 11, e0161217), Montanide ISA'Y 720 (Aucouturier, et al. (2002) Expert Rev.

Vaccines 1, 111—118), ou Montanide ISA'M 51 (Aucouturier, et al. (2002) Expert Rev.

Vaccines 1, 111-118) podem ser usados.

A Tabela 3 provê uma listagem de exemplos de formulações contendo adjuvantes, que po- dem usados em várias modalidades:

a = ". E Os 2 wo 3 o 98 aA8o fe) BD FT o o ow Oss o Ê o Ss 78 = s PRP j&So esS v Ê o Ss 2> 373 8 8 E |Eo Bo D o o õ S [TNT 8) E | | 8EÉ |6eBw õ E ke 8 e omES ES o S avio x E BO = o > = o XxX O — = 2 Om & To E Q 3 S/8 6 A Ss Ô õ ES & |5%4s 7 É Fr so 6 go $ | los oS EG ÊsÃ" o O E/S 2TI50O o O co s so E < DO E Los >? ZE 6/0 No Es SEN E |jE=E E aS so e8 SS =|ojE —a E2Z 8232 õ o 1 EO a E [8 ES os É5/68 8 |? ; x ? $8lo v oreS tax? E8O o ol |E é mn o 8 SS 2/28 [13553 2 Ss Sole e E ºÍ SN 53 Fo) o : õ o o Ss o =F É os gaja ea be E) 2 Blals 382 28 5985 = Ss < o o 0 2/57) vv o o eo S là [é ss Ss oz o7ES 2088 Z o) 12 lE Ge Elo as 5 OS |oEx Zs| |2| je [ES 2 88 ET SE EE To |&) |& [SE ol Ox 8 /9E |S2>? SG o o Es ElbBu $ 35 2o 6H E o E e 8 E E =X) o 2 232 2/8 $ TS ESTES 5 LB eg g22 |. o = o el 8 oecilasros5s 253E 2/5) | o DIS E 4/7 26 S37o o S fo S oE o q x eles SR S E o 25% 88le Pro Ss 2 8 [E E GS 2 E 5 e o Xs El E 8 E 0 E 5/0 2/S plz E co 2 &) 5 lelejel& o SE? SE [288 wmv 2 w/ 2/2 SE Aços q so El kk 9 o! = [8/8 E 3 on 2 cs og EMOS so Sn8) É SA RETE So o o E 2/8 = >3 1 E o/BE| tie| E [gg o jo ls E/S |8Z565 à | [SI8/3/2/E) |5 [Bla o 6/52 5 2 8.2 [Og o Aí ol o|6 o oo 8/8 218 Ojo E wWw Oo * E ole | | E) S/ 8 9/09 5 8 2/0 <oº”? sé Sole E ele sw e 2/20/90 E uso S | [o/2 288) |& ls 8 ES ge 5d DES 5 Ss 8 2/7 5 Ss E o 2/9 Ss o sxgo |<88 = o o S/0/ 0 E ax < Oo õ . VB oI< o = O oo = E Blz o 3 Ss 88| |g SS ES 5852 238% o | |&l8SS/8| 18 [882 8 85/92/38 ES S$ 8 | [88 S 8 | é lee 8d 8 sEMXE 2898 <s ZE & e Ss 2/08 [S/S o |ol&= 6573 oE |o32S o o 3/2 > 6|/% Tr copo asooss .p?º?ES E ERRORS so ololo| E. so So oo Ss Sieg o 8/8 = [2 29 SST SG elE we ERS 8 c 8 Elas E je es E Ed 22/28 ES FLS & | |8/8 6 732 2 5 IS/S$ 8/83 8 Ss o sslsZ25S t E ES O ola 9/9 8/8 2/8 IX 8 IS 5/85 86 PelaásS 8 [Bs e 8 Szsá 8 á 22/18 358850/95 3? S a 5 E o SIZ| > A geo 0/0 8/8 SE Eu 89d 3 Jo/2/o 6/2 E E o nl o os 6a so DE 360 PT gd a e 3 /0/S o e 3 rs 3 2 /42/0 5/)0 o/5S E SO E [ela dó 3 o 8 8 BD BB 5/33 5 3/8 50/5828 E s/ o o E 0/2 — 2/2 = E / 2 — E E o o lolol e E TXT o / 0/0 ol o o|IE E ET EST OS ESSS T O us | 5 /0/0/> 9/>/> 4 au 0 o 8 o 9 a 7 É E 2 o E o o & uu Ss 2 o Ilzs/o << & =. E MeoiS o 2º So E E/ê |S |O s x <<E |O |o o 8 uu SB 6/8 & vo 65.8 os o =| = = o o o ls SC 2 2 nl oo o 2 E E PB 28 /06/o0 EO O o Si ol «o 9/9 Bro S& O OB O 3 /Oo=lalo go Solo 8 8/2 2 > E 2 $ FR AS ssssis: E Es TlL ooo a|E 8 o r <|= <<< <> 6 jojo0/2/2 6.886 <2 WS

VII. Kits de vacinação e detecção de Ehrlichia

[00121] Várias modalidades da presente divulgação estão preocu- padas com kits para detecção de anticorpos em uma amostra que liga especificamente um organismo de Ehrlichia, tal como E. chaffeensis ou E canis. Os kits podem ser utilizados para o diagnóstico ou identifi- cação de uma infecção por Ehrlichia em um indivíduo. Em outras mo- dalidades, a invenção fornece kits para determinar se um indivíduo foi imunizado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um orga- nismo de Ehrlichia. Em outras modalidades, kits são fornecidos para a vacinação de um indivíduo contra a infecção por E. chaffeensis e em algumas modalidades é previsto que a composição pode ser usada para fornecer uma resposta imune protetora contra uma infecção por E. canis.

[00122] Em modalidades selecionadas, um kit da presente divulga- ção pode ser usado para realizar um método aqui divulgado. Por exemplo, um kit pode ser adequado para detectar anticorpos de Ehrli- chia em uma amostra, para identificar infecção por Ehrlichia individual, para determinar se um indivíduo foi imunizado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um organismo de Ehrlichia, ou para vacinar um indivíduo contra um organismo de Ehrlichia. Nestas modalidades, um ou mais peptídeos imunorreativos (por exemplo, compreendendo um polipeptídeo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2, ou um polipeptídeo com pelo menos 95% ou mais de identidade sequencial com um polipeptídeo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2) pode estar compreendido no kit. O polipeptídeo imunorreativo de Ehrli- chia no kit, pode ser detectavelmente rotulado ou imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte, também compreendido no kit. O(s) polipeptídeo(s) imunorreativo(s) pode, por exemplo, ser fornecido no kit em uma forma adequada, tal como estéril, liofilizado ou ambos.

[00123] O substrato de suporte compreendido em um Kit da inven-

ção, pode ser selecionado com base no método a ser realizado. A títu- lo de exemplo não limitante, um substrato de suporte pode ser uma placa de múltiplos poços ou microplaca, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, uma conta, uma microesfera, uma nanoesfera, uma nanopartícula, um etossomo, um lipossomo, um niossomo, um transferossomo, uma vareta, uma tira de celuloide, um slide de vidro, um micro slide, um biosensor, um aparelho de fluxo lateral , um micro- chip, um pente, uma partícula de sílica, uma partícula magnética ou uma monocamada automontada.

[00124] Conforme apropriado para o método que está sendo reali- zado, um kit pode ainda compreender um ou mais aparelhos para en- trega de uma composição a um indivíduo ou para de outra forma ma- nusear uma composição da invenção. A título de exemplo não limitante, um kit pode incluir um aparelho que é uma seringa, um conta-gotas, um aplicador de partículas balístico (por exemplo, aplicadores divulgados em patentes norte-americanas U.S. 5.797.898, 5.770.219 e 5.783.208, e pedido de patente U.S. 2005/0065463), uma scoopula, uma tampa de micro slide, um portador de tiras de teste ou capa, e afins.

[00125] Um reagente de detecção para rotular um componente do kit, pode ser compreendido opcionalmente em um Kkit para a realização de um método da presente divulgação. Em modalidades particulares, o reagente de rotulagem ou detecção é selecionado de um grupo com- posto por reagentes usados comumente na técnica e incluindo, sem limitação, elementos radioativos, enzimas, moléculas que absorvem luz na faixa UV, e fluoróforos, tais como fluoresceína, rhodamina, au- ramina, vermelho Texas, azul AMCA e amarelo Lúcifer. Em outras mo- dalidades, um kit é fornecido compreendendo um ou mais meios de recipiente e um agente de proteína BST, já rotulado com um reagente de detecção selecionado de um grupo composto por um elemento ra- dioativo, uma enzima, uma molécula que absorve luz na faixa UV, e um fluoróforo.

[00126] Em modalidades particulares, a presente divulgação forne- ce um kit para detectar anticorpos anti-Ehrlichia em uma amostra, que também pode ser usada para identificação de uma infecção por Ehrli- chia em um indivíduo, e/ou para determinar se um indivíduo foi imuni- zado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um organismo de Ehrlichia. Tal kit pode compreender um ou mais polipeptídeos imu- norreativos (por exemplo, compreendendo um polipeptídeo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2, ou tendo pelo menos cerca de 95% ou mais de identidade sequencial com um polipeptídeo compreenden- do um polipeptídeo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2), e os peptídeos podem ser detectavelmente rotulados e imobilizados a um ou mais substratos de suporte compreendidos no kit.

[00127] Em algumas modalidades, um Kit compreende um polipep- tídeo imunorreactivo comprendendo um polipeptídeo da Fórmula |, ou um polipeptídeo da Tabela 2, ou tendo cerca de 95% ou mais de iden- tidade de sequência com o polipeptídeo compreendendo um polipeptí- deo da Fórmula | ou um polipeptídeo da Tabela 2. Os peptídeos po- dem ser imobilizados a um ou mais dispositivos de ensaio de fluxo la- teral separados, tal como uma tira de teste de nitrocelulose. Nessas modalidades, cada uma das tiras de teste pode ainda compreender um reagente de detecção, por exemplo, uma proteína a rotulada por cro- móforo. Esse kit pode compreender ainda um ou mais recipientes para material de amostra, um ou mais diluentes para diluição da amostra e uma ou mais tiras indicadoras de controle, para comparação.

[00128] Quando os reagentes e/ou componentes compreendendo um kit são fornecidos em uma forma liofilizada (liofilisato) ou como pó seco, o liofilisato ou pó pode ser reconstituído pela adição de um sol- vente adequado. Em modalidades particulares, o solvente pode ser um tampão estéril, farmaceuticamente aceitável e/ou outro diluente. Pre-

vê-se que tal solvente também possa ser fornecido como parte de um kit.

[00129] “Quando os componentes de um kit são fornecidos em uma e/ou mais soluções líquidas, a solução líquida pode ser, a título de exemplo não limitante, uma solução aquosa, estéril. As composições também podem ser formuladas em composição administrativa. Neste caso, o meio recipiente pode ser uma seringa, pipeta, aplicador tópica ou semelhante, a partir da qual a formulação pode ser aplicada a uma área afetada do corpo, injetada em um indivíduo e/ou aplicada ou mis- turada com os outros componentes do kit. IV. Exemplos

[00130] Os seguintes exemplos estão incluídos para demonstrar modalidades preferenciais da invenção. Deve-se apreciar por aqueles de habilidade na arte, que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem, representam técnicas descobertas pelo inventor para funcio- nar bem na prática da invenção, podendo, portanto, ser consideradas como modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles de habi- lidade na arte devem, à luz da presente divulgação, apreciar que mui- tas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante ou semelhante sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Exemplo 1 Métodos Construção e clonagem da Quimera

[00131] Sequências representando cinco quimeras de epítopo de Ehrlichia foram sintetizadas comercialmente (GenScript). As sequên- cias quiméricas foram clonadas em pET-14 e a proteína quimérica re- combinante expressa em E. coli BL21 (DE) ou BL21-AI (Invitrogen) (Tabela 1).

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Western Blot

[00133] As amostras de proteína para análise de imunoWestern Blot, foram resolvidas pela SDS-PAGE, transferida para membrana de nitrocelulose, bloqueadas em soro fisiológico tamponado por Tris (TBS), contendo 5% de leite seco não gordo. As proteínas foram rea- gidas com soro anti-E. canis ou soro anti-E.chaffeensis (1:500). Os blots foram incubados com IgG anti-cão de cabra, rotulado com fosfa- tase, diluído em TBS (1:5000) (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MA) e reatividade proteica visualizada após a adição de substrato alcalino de fosfatase (Kirkegaard & Perry).

ELISA

[00134] Soros de pacientes humanos infectados com E. chaffeensis e de cães infectados com E. canis foram usados para avaliar a imunor- reatividade de quimera de Ehrlichia. Um ELISA foi realizado incubando 50 ng/poço de proteína quimérica, diluída em PBS em placas de ELI- SA de 96 poços (PolySorp, Nunc) e incubada durante a noite, a 4 ºC. As placas foram lavadas 3 x com 0,2% Tween 20 em TBS (TBST) e bloqueadas com 100ul de tampão de bloqueio (soro de cavalo de 10% em TBST) e incubadas à temperatura ambiente, por 1h, com agitação. As placas foram lavadas 3x com TBST, e 50 ul de anticorpo primário diluído 1:100 no tampão de bloqueio foi incubado à temperatura ambi- ente por 1h com agitação. As placas foram lavadas 3x com TBST, adi- cionados 50 ul de anticorpo secundário, AP-conjugado, diluído no tampão de bloqueio e incubado à temperatura ambiente por 1h com agitação. O substrato foi adicionado e incubado à temperatura ambien- te por 30 minutos, com agitação, no escuro e OD foi determinado usando um leitor de placa ELISA (0650 nm. Resultados

[00135] Cinco construtos quiméricos de Ehrlichia foram expressos em E. coli e a proteína recombinante purificada (FIGS. 1-5). Proteínas quiméricas específicas de E. canis ou E. chaffeensis purificadas reagi- ram com anticorpos em anti-E. canis ou anti-E. chaffeensis de cão (FIGS. 1-3). Similarmente, as proteínas quiméricas combinadas de E. canis/E. chaffeensis reagiram fortemente com ambos soros de cão an- ti-E. canis e anti-E. Chaffeensis, demonstrando a funcionalidade de epí- topos de espécies específicas representados na quimera (FIG. 4 e FIG. 5). ELISA foi realizado com um painel de soros convalescentes anti-E. Chaffeensis, para demonstrar a imunorreatividade de proteínas quiméri- cas com anticorpos. A quimera de E. chaffeensis TRP32/TRP120/A34 reagiu fortemente com soros de 10 pacientes HME, demonstrando alta imunorreatividade com todos os soros de pacientes HME (FIG. 1). Du- as quimeras específicas de E. canis (TRP140/TRP36/ITRP19 e TRP36/TRP140) foram reagidas com 10 soros de cães naturalmente in- fectados com E. canis. Todos os soros de cães infectados por E. canis reagiram fortemente com os construtos quiméricos (FIG. 2 e FIG. 3). A imunorreatividade de quimeras da combinação E. chaffeensis/E. canis foi testada com soros anti-E. canis de cão e soros de pacientes anti-E E. chaffeensis humano. Ambas as quimeras reagiram fortemente com anti- corpos de anti-E. canis e anti-E. chaffeensis, demonstrando a funcionali- dade dos epítopos específicos de espécie representados dentro da qui- mera com anticorpos E. canis e E. chaffeensis (FIG. 4 e FIG. 5).

[00136] Todos os métodos aqui divulgados e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presen- te divulgação. Embora as composições e métodos dessa invenção te- nham sido descritas em termos de modalidades preferenciais, será evidente para aqueles de habilidade na arte, que as variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método aqui descrito, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substi- tuídos pelos agentes aqui descritos, enquanto os mesmos resultados ou resultados semelhantes seriam alcançados. Todos esses substitu- tos e modificações semelhantes, aparentes aos habilitados na arte, são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexadas.

REFERÊNCIAS

[00137] As seguintes referências, na medida em que fornecem pro- cedimentos exemplares ou outros detalhes complementares aos aqui estabelecidos, são especificamente incorporadas aqui por referência. Patente Norte-Americana U.S. 9.545.439 Patente Norte-Americana U.S. 9.545.439 Patente Norte-Americana U.S. 10.117.921 Patente Norte-Americana U.S. 10.117.921 Patente Norte-Americana U.S. 10.117.921 Patente Norte-Americana U.S. 10.238.736 Patente Norte-Americana U.S. 4.220.450 Patente Norte-Americana U.S. 4.373.932 Patente Norte-Americana U.S. 4.472.509 Patente Norte-Americana U.S. 4.897.268 Patente Norte-Americana U.S. 4.938.948 Patente Norte-Americana U.S. 5.075.109 Patente Norte-Americana U.S. 5.440.013 Patente Norte-Americana U.S. 5.446.128 Patente Norte-Americana U.S. 5.470.723 Patente Norte-Americana U.S. 5.470.932 Patente Norte-Americana U.S. 5.543.504 Patente Norte-Americana U.S. 5.552.157 Patente Norte-Americana U.S. 5.565.213 Patente Norte-Americana U.S. 5.567.434

7UTA Patente Norte-Americana U.S. 5.618.914 Patente Norte-Americana U.S. 5.656.016 Patente Norte-Americana U.S. 5.670.155 Patente Norte-Americana U.S. 5.697.899 Patente Norte-Americana U.S. 5.738.868 Patente Norte-Americana U.S. 5.741.516 Patente Norte-Americana U.S. 5.770.219 Patente Norte-Americana U.S. 5.779.708 Patente Norte-Americana U.S. 5.783.208 Patente Norte-Americana U.S. 5.795.587 Patente Norte-Americana U.S. 5.797.898 Patente Norte-Americana U.S. 5.840.833 Patente Norte-Americana U.S. 5.853.744 Patente Norte-Americana U.S. 5.859.184 Patente Norte-Americana U.S. 5.891.506 Patente Norte-Americana U.S. 5.929.237 Patente Norte-Americana U.S. 6.136.610 Patente Norte-Americana U.S. 6.210.708 Patente Norte-Americana U.S. 6.372.445 Patente Norte-Americana U.S. 6.617.142 Patente Norte-Americana U.S. 6.875.750 Patente Norte-Americana U.S. 6.951.765 Patente Norte-Americana U.S. 7.163.677 Patente Norte-Americana U.S. 7.282.194 Patente Norte-Americana U.S. 7.344.893 Patente Norte-Americana U.S. 7.371.582 Patente Norte-Americana U.S. 8.580.280 Patente Norte-Americana U.S. 8.980.288 Patente Norte-Americana U.S. 8.980.288 Patente Norte-Americana U.S. 9.662.385

Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2005/0047972 Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2005/0065463 Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2005/0250141 Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2007/0264664 Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2009/0005535 Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2019/0008953 Pedido de Patente Norte-Americana U.S.2019/0038737 EP2433646 WO2005087803 Aucouturier, et al., Expert Rev. Vaccines, 1, 111—118, 2002.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que o po- lipeptídeo isolado compreende: (i) pelo menos duas sequências imunogênicas da Ta- bela 1 ou uma sequência pelo menos 90 % idêntica; e (ii) em que pelo menos uma das sequências imunogê- nicas é contiguamente repetida no polipeptídeo.

2. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das pelo menos duas se- quências imunogênicas da Tabela 1, ou a sequência pelo menos 90% idêntica, são contiguamente repetidas 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 vezes no polipeptídeo.

3. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende uma ou mais de (SEQ ID NOs:11-16 ou 36-42), em que a uma ou mais de (SEQ ID NOs:11-16 ou 36-42) é contiguamente repetida O, 1, 2, ou 3 vezes.

4. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada uma das se- quências imunogênicas é contiguamente repetida de 1 a 3 vezes no polipeptídeo.

5. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogêni- cas é contiguamente repetida de 1 a 2 vezes no polipeptídeo.

6. Peptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isola- do compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou todas das seguintes sequências imunogênicas: TRP120 (SEQ ID NO:22), TRP140 (SEQ ID NO:23), ASAN1 (SEQ ID NO:7), TRP63 (SEQ ID NO:18), TRP47 (SEQ ID NO:17), TRP75 (SEQ ID NO:19), TRP28

(SEQ ID NO:2), TRP36R1 (SEQ ID NO:3), TRP36R2 (SEQ ID NO:4), TRP36R3 (SEQ ID NO:6), TRP36CO (SEQ ID NO:36), TRP19 (SEQ ID NO:1), HSP (SEQ ID NO:24), ou uma sequência pelo menos 90 % idêntica; em que cada uma das sequências imunogênicas é contigua- mente repetida de 1 a 7 vezes no polipeptídeo.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende TRP36R1 e TRP140.

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zado pelo fato de que a TRP36R1 é contiguamente repetida 4 — 8 ve- zes e em que a TRP140 é contiguamente repetida 1 — 3 vezes.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em 8 repetições de TRP36R1 e 4 repetições de TRP140.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracte- rizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:27.

11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda TRP19.

12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 11, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:26.

13. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todas das sequências imunogênicas: TRP32, TRP120, TRP36 (tal como TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 ou TRP36CO), TRP140, TRP28 e/ou HSP.

14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizado pelo fato de que a TRP36R1, se presente, é repetida 2 - 6 ve-

zes e em que as outras sequências imunogênicas são repetidas 1-3 vezes.

15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende todas de TRP32, TRP120, TRP36, TRP140, TRP28 e HSP.

16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:28.

17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende TRP120, TRP36, TRP140 e TRP28.

18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 17, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:29.

19. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todas de TRP32R1, TRP32R2, TRP32R3, TRP32R4, TRP120 e ASAN1.

20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 19, carac- terizado pelo fato de que TRP120 e AS4AN1 são cada repetida conti- guamente 1 — 3 vezes.

21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20, carac- terizado pelo fato de que TRP120 e AS4AN1 são cada repetida conti- guamente 2 vezes.

22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:25

23. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreen-

de pelo menos duas, pelo menos três ou todas de AS4N1, TRP63, TRP47 e/ou TRP75.

24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS34N1 e TRP63.

25. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 24, carac- terizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogênicas é contiguamente repetida 1 — 2 vezes.

26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4N1, TRP63 e TRP75.

27. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:34.

28. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende A34N1 e TRP63 e TRP47.

29. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:33.

30. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreen- de pelo menos duas, pelo menos três ou todas de AS4N1, TRP63, TRP47e/ou TRP75.

31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 30, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS34N1 e TRP63.

32. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 31, carac- terizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogênicas é contiguamente repetida 1 — 2 vezes.

33. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4N1, TRP63 e

TRP75.

34. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:34.

35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4A4N1, TRP63 eTRP47.

36. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:33.

37. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreen- de pelo menos duas, pelo menos três ou todas de TRP120, AS4AN1, TRP47 e/ou TRP63.

38. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 37, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4N1 e TRP120.

39. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 38, carac- terizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogênicas é contiguamente repetida 1 — 2 vezes.

40. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4A4N1, TRP120 e TRP63.

41. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:31.

42. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4A4N1, TRP120 e TRP47.

43. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 39, carac-

terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:32.

44. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende AS4A4N1, TRP120, TRP47 e TRP63.

45. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:30.

46. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreen- de pelo menos duas, pelo menos três ou todas de TRP36R1, TRP140, TRP95R e/ou TRP95C.

47. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogênicas é contiguamente repetida 1 — 2 vezes.

48. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 46 e 47, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compre- ende TRP36R1, TRP140, TRP95R e TRP95C.

49. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 48, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:35.

50. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo de SEQ ID NOs: 25-35.

51. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou todas das seguintes sequências imu- nogênicas: TRP120, AS4N1, TRP63, TRP47, TRP75, TRP28, TRP36, TRP19, TRP140 e/ou HSP.

52. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ainda compreende pelo menos duas de TRP36R1, TRP36R2, TRP36R3 e/ou TRP36CO.

53. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 52, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3.

54. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 53 caracte- rizado pelo fato de que as sequências TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3 são separadas por um ligante.

55. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 53, carac- terizado pelo fato de que as sequências TRP36R1, TRP36R2 e TRP36R3 não são separadas por um ligante.

56. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 52, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende TRP36R1-R2-R3 (SEQ ID NO:11), TRP36R1-R3-R2 (SEQ ID NO:12), TRP36R2-R1-R3 (SEQ ID NO:13), TRP36R2-R3-R1 (SEQ ID NO:14), TRP36R3-R1-R2 (SEQ ID NO:15), ou TRP36R3-R2-R1 (SEQ ID NO:16).

57. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 6 e 7 ou 11 a 56, caracterizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogênicas é contiguamente repetida 1, 2 ou 3 vezes.

58. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 57, carac- terizado pelo fato de que cada uma das sequências imunogênicas é contiguamente repetida 1 ou 2 vezes.

59. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que as diferentes sequên- cias imunogênicas não são separadas por um ligante ou um espaça- dor.

60. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que as diferentes sequên- cias imunogênicas são separadas por um ligante ou um espaçador.

61. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 60, carac- terizado pelo fato de que o ligante é um ligante de glicina.

62. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 61, carac- terizado pelo fato de que o ligante de glicina tem a sequência de ami- noácido -(G)x—, em que X=3-5.

63. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 62, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem, em comprimento, menos que 500, menos que 450, menos que 400, me- nos que 350, menos que 300, menos que 250, menos que 200, ou menos que 150 aminoácidos.

64. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 63, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo está con- tido em uma preparação farmacêutica.

65. Preparação farmacêutica, como definida na reivindica- ção 64, caracterizada pelo fato de que a preparação farmacêutica é formulada para administração parenteral, intravenosa, subcutânea, intranasal, sublingual ou intradérmica.

66. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 63, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é anexa- do a um suporte sólido ou está compreendido em um kit de diagnósti- co.

67. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 66, carac- terizado pelo fato de que o suporte sólido é vidro ou plástico.

68. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 66, carac- terizado pelo fato de que o suporte sólido está compreendido em um ensaio de fluxo lateral ou dispositivo multifluídico.

69. Polipeptídeo isolado da Fórmula | (As-Br-Cu-Dy-Ew-Fx-Gy- Hz)n, caracterizado pelo fato de que A, B,/ C, D,/E, Fr, Ge Hé um peptídeo selecionado de SEQ ID NOs:1-24 e 36-42, ou uma sequência pelo menos 90 % idêntica a qualquer uma de (SEQ ID NOs:1-24 ou 36-42), em que s, t, u, v, x, ye z é um inteiro de 0-8, em que pelo menos dois de s-z são 21 e pelo menos um de s-z é 22, e em que n é um inteiro de 1-5.

7O. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 69, carac- terizado pelo fato de que A é SEQ ID NO:8 (TRP36R1) e B é SEQ ID NO:23 (TRP140).

71. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 70, carac- terizado pelo fato de que s é de 4a 8, té de 2a 4, e n=1.

72. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 71, carac- terizado pelo fato de que u, v, x, y, e z são zero.

73. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 71 e 72, caracterizado pelo fato de que s=8 e t=4.

74. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 73, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo é SEQ ID NO:27.

75. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 69, carac- terizado pelo fato de que pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis des, t,u,v,x,yezsão cada 2-3; e em que n=1.

76. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 75, carac- terizado pelo fato de que A é TRP32 (por exemplo, TRP32R3 de SEQ ID NO:5), B é TRP120 (SEQ ID NO:22), C é TRP36R1 (SEQ ID NO:8), D é TRP140 (SEQ ID NO:23), E é TRP28 (SEQ ID NO:2), e F é HSP (SEQ ID NO:24).

TT. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que z=0.

78. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 75, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO:28.

79. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 69, carac-

terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em qualquer um da Tabela 2 (SEQ ID NOs:25-35 ou 43-44).

80. Preparação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63 ou 69 a 79, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

81. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 80, caracterizada pelo fato de que a preparação farmacêutica é formulada para administração parenteral, intravenosa, subcutânea, intranasal, sublingual ou intradérmica.

82. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável compreende ou consiste em um adjuvante.

83. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é uma emulsão ou lipossomas, ou em que o adjuvante compreende um lipídio.

84. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que a emulsão é uma emulsão óleo- em-água (O/A) ou uma emulsão água-em-óleo (A/O).

85. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende um triterpenoide, um esterol, um imunomodulador, um polímero e/ou um oligonucleotídeo imunoestimulador.

86. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 85, caracterizada pelo fato de que o polímero é dietil — amino etil (DEAE)-dextrano, polietileno glicol ou ácido poliacrílico.

87. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 e 86, caracterizada pelo fato de que o oligonu- cleotídeo imunoestimulador é um CpG contendo ODN.

88. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 87, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende DEAE Dextrano, um oligonucleotídeo imunoestimulador e um óleo, tal como um óleo mineral, em que o oligonucleotídeo imu- noestimulador é um CpG contendo ODN e em que a formulação do adjuvante é uma emulsão água-em-óleo (A/O).

89. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, um polí- mero e um ORN/ODN.

90. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 89, caracterizada pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma facção purificada desta, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA), o polímero é um ácido poliacrílico e o ORN/ODN é um CpG.

91. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 90, caracterizada pelo fato de que a saponina está presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug, por dose, o es- terol está presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de

5.000 ug, por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug, por dose, e o polímero está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001%, em volume, a cerca de 75% v/v.

92. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 e 91, caracterizada pelo fato de que o adjuvante ainda compreende um glicolipídio.

93. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 92, caracterizada pelo fato de que o glicolipídio é acetato de N-(2- deóxi-2-L-leucilamino-B-D-gluco piranosil) -N-octadecil dodecanamida.

94. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende uma saponina triterpenoide, um esterol, um composto de amônio quaterná- rio e um polímero de ácido poliacrílico.

95. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 94, caracterizada pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma facção purificada desta, o esterol é colesterol e o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA).

96. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 e 95, caracterizada pelo fato de que a saponina está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, por dose, o esterol está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, por dose, e o polímero de ácido acrílico está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001%, em volume, a cerca de 75% v/v.

97. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende uma emulsão água-em-óleo (A/O).

98. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 97, caracterizada pelo fato de que a emulsão água-em-óleo com- preende uma fase oleosa e uma fase aquosa, um carreador policatiô- nico (por exemplo, DEAE dextrano) e um CPG contendo oligonucleotí- deo imunoestimulador.

99. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 98, caracterizada pelo fato de que a composição ainda compreen- de um gel de hidróxido de alumínio.

100. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 98 e 99, caracterizada pelo fato de que o car- reador catiônico é DEAE dextrano.

101. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma emulsão ou uma emulsão óleo-em-água (O/A).

102. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 101, caracterizada pelo fato de que a emulsão compreende uma fase aquosa, que compreende um ácido alquil-poliacrílico (alquil-PAA) ou ambos um polímero acrílico e um brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA).

103. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 102, caracterizada pelo fato de que a fase aquosa da emulsão óleo-em-água compreende brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA) e um ácido alquil-poliacrílico (alquil-PAA).

104. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 103, caracterizada pelo fato de que o alquil-PAA é decil-PAA, octil- PAA, butil-PAA ou metil-PAA.

105. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 104, caracterizada pelo fato de que o polímero acrílico é um polímero de ácido acrílico reticulado com polialil Sacarose.

106. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma emulsão água-em-óleo (A/O) compreendendo um óleo não mineral e um emulsionante.

107. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 106, caracterizada pelo fato de que o emulsionante é um emulsio- nante de mono-oleato de manida.

108. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 82, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é MF59, ASO1, ASO2, ASO3, ASOA, virossomas, CAFO1, CAFO4, CAFOS5, um polímero acrílico / emulsão DDA, uma emulsão CpG/DEAE, um adjuvante de saponina/ colesterol/ DDA, ou uma emulsão de polímero de ácido acrí- lico.

109. Preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 108, caracterizada pelo fato de que a composição ainda compreende uma bacterina de Ehrlichia.

110. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 109, caracterizada pelo fato de que a bacterina é uma E. canis inativada por calor ou uma E. canis inativada quimicamente.

111. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 109, caracterizada pelo fato de que a bacterina é uma E. chaffe- ensis inativada por calor ou uma E. chaffeensis inativada quimicamen- te.

112. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 109, caracterizada pelo fato de que a bacterina é uma bacterina inativada quimicamente, que foi inativada com formaldeído, formalina, bietileno amina, radiação, luz ultravioleta, tratamento de beta-propio- lactona ou formaldeído.

113. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63 ou 69 a 78.

114. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é um segmento de

DNA

115. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico está compreendido em um vetor de expressão.

116. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 113 a 115.

117. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a célula expressa o ácido nucleico.

118. Método para detectar anticorpos que especificamente ligam um organismo de Ehrlichia em uma amostra de teste, caracteri- zado pelo fato de que compreende: (a) contatar um polipeptídeo isola- do, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63 ou 69 a 79; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; sendo que a de- tecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo de Ehrlichia estão presen- tes na amostra de teste e em que a ausência dos complexos de peptí- deo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos de um organismo Ehrlichia não estão presentes na amostra de teste.

119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que o organismo de Ehrlichia é um organismo de Ehrlichia chaffeensis.

120. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que o organismo de Ehrlichia é um organismo de Ehrlichia canis.

121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 118 a 120, caracterizado pelo fato de que a etapa de detectar compreende realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimu- noensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio fluorescente, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multi- plex, um ensaio de espectrometria de massa ou um ensaio baseado em particulados.

122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracteri- zado pelo fato de que a etapa de detectar compreende um ensaio de fluxo lateral ou um imunoensaio ligado à enzima, em que o imunoen- saio ligado à enzima é um ELISA.

123. Método para identificar uma infecção por Ehrlichia em um indivíduo mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma amostra biológica do indivíduo com um polipeptídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63 ou 69 a 78, sob condições que permitem se formar complexos de peptí- deo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o indivíduo tem uma infecção por Ehrlichia.

124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 123-15, caracterizado pelo fato de que a etapa de detectar com- preende realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoen- saio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio fluorescente, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo late- ral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de vareta ou um ensaio baseado em particulados.

125. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

126. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um cão.

127. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o polipeptídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 63 ou 69 a 79, (b) um anticorpo secundário anticanino ou an- ti-humano ligado a uma molécula repórter; e, (c) um reagente apropri- ado para detecção da molécula repórter.

128. Kit, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que o peptídeo está imobilizado em uma membrana ou uma placa de microtitulação.

129. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 e 128, caracterizado pelo fato de que a molécula repórter é seleci- onada do grupo consistindo em luciferase, peroxidase de rabanete, uma nanopartícula luminosa, P-galactosidase e um rótulo fluorescente.

130. Kit, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula luminosa é uma nanopartícula de aluminato de estrôncio.

131. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 130, caracterizado pelo fato de que o kit ainda compreende um tampão de diluição para soro canino ou humano.

132. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 131, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um imu- noensaio de fluxo lateral ou um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.

133. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 132, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA).

134. Método para induzir uma resposta imune em um indi- víduo mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende adminis- trar ao indivíduo uma quantidade efetiva de uma preparação farmacêu- tica compreendendo um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63 ou 69 a 79, ou uma composição farmacêuti- ca, como definida em qualquer uma das reivindicações 80 a 112.

135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 134-44, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser hu- mano ou um cão.

136. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 134 e 135, caracterizado pelo fato de que a preparação farma- cêutica é administrada subcutaneamente, intramuscularmente, nasal- mente, via inalação ou entrega de aerossol, ou intradermicamente.

137. Método para tratar uma infecção por Ehrlichia chaffe- ensis ou Ehrlichia canis em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma amostra biológica do indivíduo com um po- lipeptídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63 ou 69 a 79, sob condições que permitam formar os complexos peptídeo-anticorpos; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o indivíduo tem uma infecção por Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlii- chia canis; e (c) administrar um composto terapêutico para tratar a infec- ção de Ehrlichia no indivíduo.

138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracteri- zado pelo fato de que a etapa de detectar compreende realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunopreci- pitação, um imunoensaio fluorescente, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de ci- tometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de vareta ou um ensaio baseado em particulados.

139. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um cão.

140. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

141. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 137 a 140, caracterizado pelo fato de que o composto terapêutico é um antibiótico.

142. Método, de acordo com a reivindicação 141, caracte- rizado pelo fato de que o antibiótico é doxiciclina.