BR112020011999A2

BR112020011999A2 - probióticos e metabólitos de fermentação para a prevenção e tratamento de doenças e afecções em animais

Info

Publication number: BR112020011999A2
Application number: BR112020011999-7A
Authority: BR
Inventors: Steven K. Kazemi; Naseer Sangwan
Original assignee: Pure Cultures 2020 Inc.
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-11-17
Also published as: EP3723513A1; US12257275B2; US20190192587A1; WO2019118843A1; US20200390834A1; CA3085456A1; EP3723513A4; US10758577B2; EP3723513B1; CN112020308A; EP3723513C0

Abstract

a presente invenção refere-se às composições que compreendem uma mistura de micróbios e metabólitos produzidos quando os micróbios são cultivados em conjunto. a invenção se refere, ainda, aos métodos para produzir e usar as composições.

Description

RELATÓRIO “PROBIÓTICOS E METABÓLITOS DE FERMENTAÇÃO PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DOENÇAS E AFECÇÕES EM ANIMAIS”” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido se baseia e reivindica prioridade ao Pedido Provisório nº de série U.S. 62/598.730, depositado em 14 de dezembro de 2017, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente revelação refere-se a microrganismos probióticos e metabólitos de fermentação produzidos pelos mesmos. Em particular, a presente revelação diz respeito a probióticos e metabólitos de fermentação que podem ser usados para tratar ou prevenir uma doença ou afecção em animais.

2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[0003] Os antibióticos têm desempenhado um papel integral na indústria de produção de ração para animais como aditivos de melhoramento de desempenho, desde a descoberta de antibióticos, no início da década de 1940 (McKenna, 2017). Na maioria das fazendas, os antibióticos são usados para tratar infecções clínicas, controlar e prevenir a propagação da doença, e predominantemente, para intensificar o crescimento animal (American Meat Institute, 2013). Estudos de campo mostraram que, quando usados como intensificadores de crescimento, os antibióticos promovem a saúde do rebanho, estabilizando-se a flora microbiana intestinal, melhorando-se o desempenho geral e prevenindo- se patologias intestinais (Hassan, 2010). Por exemplo, foi mostrado que o uso de tetraciclina e tilosinas em doses subterapêuticas, durante longos períodos de tempo, pode aumentar a taxa de conversão de ração em aves, suínos e bovinos (Landers, 2012). Esses efeitos benéficos levaram a indústria a práticas de produção centradas em antibióticos. Atualmente, nos Estados Unidos, doze classes de antibióticos podem ser usadas em diferentes momentos do ciclo de vida do gado, muitos dos quais são análogos de antibióticos humanos (Landers, 2012). Em 2012, mais de 185 milhões de reais (cerca de 30 milhões de libras) de antibióticos foram vendidos para uso animal, mais de quatro vezes a quantidade usada para a saúde humana, subjacente ao importante papel dos antibióticos na indústria alimentar (Taillant, 2015). No entanto, à medida que o uso de antibióticos na produção de alimentos tem crescido, foram identificadas preocupações consideráveis associadas aos antibióticos. Notavelmente, o uso generalizado de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de agentes patogênicos resistentes aos antibióticos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] Um aspecto da presente revelação é direcionado a uma composição que compreende pelo menos dois micróbios e, de preferência, os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação. Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; e preferencialmente os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação.

[0005] Outro aspecto da presente revelação é direcionado a um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou afecção em um animal que precise do mesmo. O método compreende administrar, ao animal, uma composição que compreende pelo menos dois micróbios e, de preferência, os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação. Em determinadas modalidades, a composição compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; e preferencialmente os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação. Outros aspectos e recursos da presente revelação serão, em parte, evidentes e, em parte, assinalados doravante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0006] A Figura 1 é um diagrama de um modelo de

[0007] A Figura 2 é um diagrama de uma árvore filogenética exemplificativa.

[0008] A Figura 3 é uma tabela que resume certos resultados experimentais relacionados com a produção de composições exemplificativas.

[0009] A Figura 4 é um diagrama que resume os resultados obtidos no desempenho de um experimento, notadamente um mapa de calor e agrupamento de perfis de quinoma. O sinal de quinoma bruto da matriz de peptídeos foi introduzido no pacote de software personalizado PIIKA

2. O PIIKA 2 combina os replicados biológicos para cada tratamento e tecido, normaliza os dados e gera um perfil de quinoma representativo. Os perfis são comparados para similaridade relativa, e um mapa de calor mostra a fosforilação relativa de cada peptídeo na matriz.

[0010] A Figura 5 é um diagrama que resume os resultados obtidos no desempenho de um experimento, notavelmente um mapa de calor BioSub e agrupamento de perfis de quinoma de tratamento, em relação aos perfis de quinoma de controle. O sinal de quinoma bruto da matriz de peptídeos foi introduzido no pacote de software personalizado PIIKA 2. O PIIKA 2 combina os replicados biológicos para cada tratamento e tecido, normaliza os dados e gera um perfil de quinoma representativo. Os perfis de cada grupo de tratamento são comparados com o perfil de quinoma dos grupos de controle. Os perfis de quinoma resultantes são, então, comparados quanto à semelhança relativa, e um mapa de calor mostra a fosforilação relativa de cada peptídeo na matriz para um determinado grupo de tratamento, em relação ao controle.

[0011] A Figura 6 é um gráfico de enumeração por mês.

[0012] A Figura 7 apresenta dados para os testes de estabilidade a 90 ºC.

[0013] A Figura 8 apresenta testes de estabilidade de seis meses

[0014] A Figura 9 apresenta comparações de perfil de ácido orgânico de composições e suas cepas componentes.

[0015] A Figura 10 apresenta perfis de impressão digital de ácido orgânico para fermentações em lote.

[0016] A Figura 11 apresenta perfis de impressão digital de ácido orgânico para fermentações em lote, comparadas entre duas composições e suas cepas componentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERENCIAL

[0017] São fornecidos, no presente documento, métodos e composições para o tratamento e prevenção de doenças ou afecções animais. As composições incluem probióticos, notavelmente, uma mistura de pelo menos dois micróbios. Em certas modalidades, os micróbios são selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium. Em certas modalidades, a composição inclui adicionalmente um ou mais de Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum. Em certas modalidades,

as composições da presente invenção compreendem não apenas micróbios, mas produtos de fermentação dos micróbios, quando cultivados em combinação, por exemplo, metabólitos pós-bióticos, notavelmente ácidos graxos de cadeia curta. Outros aspectos da invenção são direcionados ao uso das composições da invenção tratar ou prevenir doenças Ou afecções animais.

[0018] Verificou-se que as combinações dos micróbios da presente invenção produzem diferentes produtos de fermentação dos micróbios, quando fermentados isoladamente, e/ou produtos de fermentação, em diferentes razões, oriundos dos micróbios, quando fermentados isoladamente. Verificou-se adicionalmente que as combinações dos micróbios da presente invenção, em conjunto com a sua mistura única de metabólitos de fermentação, notavelmente os metabólitos de ácidos graxos de cadeia curta, oferecem benefícios para a saúde dos animais. Isso é benéfico porque, por exemplo, as rações entregues aos animais de produção não são as mais eficazes, para o animal, para serem convertidas em ácidos graxos de cadeia curta pelos micróbios da presente invenção. Entregando-se uma quantidade confiável e quantitativa dos metabólitos de ácidos graxos de cadeia curta na composição, por via oral, diretamente ao animal, os ácidos graxos de cadeia curta podem ser usados indiretamente na produção de piruvato, acetil-coenzima A ou acetil-CoA. Esses são intermediários vitais no ciclo energético de Krebs. Além disso, as composições da presente revelação incluem razões de ácidos graxos de cadeia curta que podem ser entregues em concentrações benéficas para o animal. Em contrapartida, a dosagem oral direta de ácidos graxos de cadeia curta pode limitar a absorção, devido ao fato de que as quantidades entregues podem exceder as quantidades que um sistema gastrointestinal de um animal está habituado a receber. É ainda benéfico que a administração de composições, da presente invenção, a um animal, possa reduzir, ou mesmo eliminar, a necessidade de antibióticos.

[0019] Verificou-se adicionalmente que as composições e os metabólitos de fermentação da presente revelação, como os ácidos graxos de cadeia curta, são estáveis ao calor e podem tolerar as condições de calor elevado durante o trânsito, armazenamento e peletização, tudo comum no sistema de produção de ração para animais. A geração de ácidos graxos benéficos estáveis ao calor é, por isso, um benefício da presente invenção na indústria agrícola e outras indústrias.

1. COMPOSIÇÕES

[0020] Em um aspecto, uma composição da revelação compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; e preferencialmente os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação. Em certos aspectos, são selecionados pelo menos dois micróbios do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; de preferência, em conjunto com produtos de fermentação probiótica dos micróbios, quando cultivados em combinação, notavelmente ácidos graxos de cadeia curta. Em certas modalidades, a composição inclui adicionalmente um ou mais micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum. Em certas modalidades, as composições da revelação compreendem pelo menos um micróbio selecionado a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium e pelo menos um micróbio selecionado a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, de preferência, em conjunto com produtos de fermentação probiótica dos micróbios, quando cultivados em combinação, notavelmente ácidos graxos de cadeia curta.

[0021] Em certas modalidades, a composição compreende Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus fermentum; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; ou Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; em cada caso preferencialmente em conjunto com os produtos de fermentação probiótica dos micróbios, quando cultivados em combinação, notavelmente ácidos graxos de cadeia curta.

[0022] Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; de preferência, em conjunto com os seus metabólitos, quando cultivados em combinação, notavelmente os ácidos graxos de cadeia curta. As composições exemplificativas da presente invenção incluem, mas sem limitação, composições que compreendem: Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici; Lactobacillus reuteri e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri e Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Pediococcus acidilactici e Pediococcus pentosaceus; Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri Pediococcecus acidilactici e Pediococcus pentosaceus; Enterococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri e Lactobacillus acidophilus; Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus Pediophilus; e

Coccus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus reuteri e Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus reuteri e Lactobacillus reuteri; Lactobacillus reuteri e Lactobacillus plantarum; Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; Enterococcus faecium e Lactobacillus fermentum; Enterococcus faecium e Lactobacillus plantarum; Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus acidophilus; Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus fermentum; Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus plantarum; Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; Pediococcus acidilactici e Lactobacillus fermentum; Pediococo acidilactici e Lactobacillus plantarum; Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus fermentum; Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus plantarum; ou Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; em cada caso isolado ou em combinação com micróbios adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; em cada caso, de preferência, em conjunto com produtos de fermentação probiótica dos micróbios, quando cultivados em combinação, notavelmente ácidos graxos de cadeia curta.

[0023] Em cada uma das modalidades discutidas acima, podem ser usadas uma ou mais das seguintes cepas Lactobacillus reuteri PCRT7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Enterococcus faecium PCEFO02, Pediococcus pentosaceus PCPOl, Lactobacillus fermentum PCFOl e um Lactobacillus acidophilus PCLAI8 disponível comercialmente. Certas modalidades da presente invenção compreendem uma combinação de Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Enterococcus faecium PCEFO02 e Pediococcus pentosaceus PCPOl; ou Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLOl, Enterococcus faecium FO2, Pediococcus pentosaceus PCPPO0l e Lactobacillus fermentum PCFO0l, de preferência, em conjunto com produtos de fermentação probiótica dos micróbios, quando cultivados em combinação. A cepa de E. faecium, tal como o PCEFO02, de preferência, tem baixa toxicidade, aceitável para o uso pretendido.

[0024] Verificou-se que as combinações dos micróbios da presente invenção produzem diferentes produtos de fermentação dos micróbios, quando fermentados sozinhos. Além disso, alguns dos micróbios podem estar presentes em número reduzido após a fermentação, devido à competição entre os micróbios, durante o processo de fermentação. Conforme detalhado no Exemplo 14, uma que compreende Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus produz metabólitos de fermentação diferentes dos micróbios individuais. Outras combinações de micróbios que produzem diferentes produtos de fermentação estão listadas na tabela abaixo.

TABELA 1. PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO

Áci Sa ás : cido Ácido Ácido sz Picos- |Acétic SAD sos = Formulação propiôni |butíric |Enumeração chave o co (ppm) jo (ppm) (ppm) 17010: PCLAI8,|6 2760,0 PCLFO1, PCLLO1 |picos 5 31,81 20,62? 17011 1: PCLAI18, 10 2872,5 6 PCLFO1, Picos o 31,44 3,35 6,5x10 PCLLO1, PCEFO2 17011 2 USDA 41: PCLA18,|8 7 PCLLO1, picos 2336 39,65 3,45 3,9x10 PCEFO02, PCR7 17001 3: PCLAIL8, 2557,7 6 PCLFO1, cos o "134,43 3,8 7,5x10º PCLLO1, Pp PCR7

[0025] Em uma modalidade, a composição pode compreender adicionalmente uma ou mais espécies adicionais de microrganismos dos gêneros selecionados a partir de Pediococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Leuconostoc, Streptococcus e Bacillus.

[0026] Em uma modalidade adicional, a composição pode adicionalmente compreender uma ou mais espécies de microrganismos selecionados a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus plantarum; Lacotobacillus rhamnosus; Lactobacillus fermentum; Lactobacillus fermentum bifidus; Lactobacillus brevis; Lactobacillus bulgaricus; Lactobacillus casei; Lactobacillus delbrueckii; Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus helveticus; Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus lactis;

Lactobacillus lactis ssp. Cremoris; Lactobacillus lactis ssp. Lactis; Lactobacillus paracase; Lactococcus cremoris; Lactococcus Zactis; Lactococcus lactis Sssp. Cremoris; Bifidobacterium infantis; Bifidobacterium lactis; Bifidobacterium animalis; Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides; Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris; Streptococcus bovis; Streptococcus salivarius; Streptococcus varius ssp. Thermophilus; Bacillus coagulans; Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus licheniformis; Bacillus subtilis; e Bacillus lentus.

[0027] Em cada uma das modalidades discutidas acima, podem ser usadas uma ou mais das seguintes cepas Lactobacillus reuteri PCRT7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Enterococcus faecium PCEFO02, Pediococcus pentosaceus PCPOl, Lactobacillus fermentum PCFOl e um Lactobacillus acidophilus PCLAI8 disponível comercialmente.

[0028] Os microrganismos incluídos nas composições da presente revelação podem ser obtidos a partir de uma coleção de microrganismos, como à Coleção de Microrganismos Norte-Americana (American Type Culture Collection (ATCC)) ou comprados de fornecedores comerciais de cepas microbianas ou probióticas. De acordo com o presente documento, os microrganismos são, então, cultivados em meio de fermentação em condições adequadas para cultivar os microrganismos. Certos microrganismos proprietários foram depositados na Coleção Agrícola de Serviço de Pesquisa (Agricultural Research Service Culture Collection NRRL) -

Northern Research Service Culture Collection Laboratory Peroria, Illinois, conforme mostrado na tabela a seguir. TABELA 2. NÚMEROS NRRL acidilacticia reuteri faecium acidophilus A. PROCESSO DE FERMENTAÇÃO

[0029] Muitos produtos probióticos no mercado simplesmente fornecem um único micróbio ou combinação de micróbios. No entanto, em certas modalidades da presente invenção, as composições da presente invenção são produzidas, primeiramente, fermentando-se as combinações de micróbios em um meio de fermentação adequado para produzir metabólitos ou “pós-bióticos” que estão incluídos na composição.

[0030] Em uma modalidade, por exemplo, uma composição que compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium e, opcionalmente, um ou mais de Pediococceus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus,

Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, o que inclui qualquer uma das composições descritas em mais detalhes acima, pode ser adicionada a um meio de fermentação e cultivada. Além disso, os pelo menos dois micróbios podem produzir metabólitos que estão incluídos na composição.

[0031] Os meios de fermentação adequados podem incluir, por exemplo, melaço, melaço à base de suco de beterraba sacarina, caldo de cana, sacarose, dextrose, glicose, sólidos concentrados ou licor concentrado de milho.

[0032] Em uma modalidade, a quantidade de melaço no meio de fermentação pode ser de cerca de 1% em v/v a cerca de 10% em v/v. Em algumas modalidades, a quantidade de melaço no meio de fermentação pode ser de cerca de 1% em v/v, cerca de 2% em v/v, cerca de 3% em v/v, cerca de 4% em v/v, cerca de 5% em v/v, cerca de 6% em v/v, cerca de 7% em v/v, cerca de 8% em v/v, cerca de 9% em v/v ou cerca de 10% em v/v.

[0033] Em algumas modalidades, o meio de fermentação pode incluir melaço em quantidades mais elevadas. Em algumas modalidades, o meio de fermentação pode incluir melaço:água em uma razão de cerca de 20:80 em v/v a cerca de 35:65 em v/v. Em outras modalidades, o meio de fermentação pode incluir melaço em uma razão de cerca de 20:80 em v/v, cerca de 25:75 em v/v, cerca de 30:70 em v/v ou cerca de 35:65 em v/v.

[0034] os meios de fermentação também podem incluir agentes de formulação, por exemplo, um ou mais agentes prebióticos exógenos, como fruto-oligossacarídeo (FOS), galacto-oligossacarídeo, xilo-oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, oligossacarídeos de inulina, glico-oligossacarídeos, oligossacarídeos de soja, lactossacarose, palatinose, eritritol, ou um mananoligossacarídeo para preparar uma formulação líquida ou uma formulação sólida, por exemplo, cerca de 5%.

[0035] O meio de fermentação também pode incluir glicerol, por exemplo, cerca de 0,5% a 3% do meio de fermentação.

[0036] Em certas modalidades, a invenção revelada compreende uma composição que compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium e, opcionalmente, um ou mais de Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, o que inclui qualquer uma das composições descritas acima, adicionadas a um meio de fermentação que consiste em melaço e, opcionalmente, glicerol, em qualquer uma das concentrações acima e cultivadas para produzir metabólitos. Em certas modalidades, uma composição que compreende Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici,

Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus fermentum; ou Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus é adicionada a um meio de fermentação que compreende melaço em qualquer uma das concentrações acima e que, opcionalmente, contém glicerol, inulina e/ou FOS, e cultivada para produzir metabólitos. Em certas modalidades, um meio fraco, com baixas quantidades de melaço, e opcionalmente glicerol, é usado, enquanto ainda produz uma composição com micróbios e metabólitos suficientes para tratar ou prevenir uma doença ou afecção. Em certas modalidades, são usadas uma ou mais das seguintes cepas: Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Enterococcus faecium PCEFO02, Pediococcus pentosaceus PCPPO01, Lactobacillus fermentum PCFO1l e Lactobacillus acidophilus PCLAI8 comercialmente disponível.

[0037] o meio de fermentação também pode compreender uma fonte de nitrogênio, uma fonte de proteína, um oligoelemento, vitamina, um agente de tampão ou outros componentes.

[0038] Em uma modalidade, o meio de fermentação pode incluir uma fonte de nitrogênio. As fontes de nitrogênio adequadas incluem, sem limitação, extrato de levedura, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, isoleucina, citrato de amônia, serina, valina e sulfato de amônia, sais de amônia, extrato de soro de leite, leite em pó desnatado, licor ou sólidos concentrados de milho, carne de soja, peptona de vagem, peptona de milho, peptona, peptona de ervilha, peptona de trigo, peptona de batata, hidrolisado de caseína, peptona de tremoço, extrato de malte, peptona de carne e peptona de arroz. Em certas modalidades, a fonte de nitrogênio pode ser de 1 a 15% da formulação. Em uma modalidade, o processo de fermentação pode incluir o uso de agentes como hidróxido de amônia, hidróxido de sódio, carbonato de sódio, carbonato de cálcio para ser usado como controle de pH.

[0039] Em uma modalidade, o meio de fermentação pode incluir uma fonte de proteína. As fontes de proteína adequadas incluem, sem limitação, um extrato de soja, um extrato de levedura, um extrato de ervilha, extrato de vagem, extrato de milho, um extrato de batata, um extrato de leite desnatado, um extrato de tapioca, extrato de malte, extrato de carne, extrato de malte e um extrato de arroz. Em certas modalidades, a fonte de proteína pode ser de 1 a 15% da formulação.

[0040] Em uma modalidade, o meio de fermentação pode incluir um oligoelemento. Os oligoelementos adequados incluem, sem limitação, ferro, zinco, cobre, manganês, magnésio, molibdênio e cobalto.

[0041] As faixas típicas para oligoelementos são apresentadas na tabela a seguir. TABELA 3. OLIGOELEMENTOS KHsPO, 1,0 a 4,0

MgSO, *7H; O 0,25 a 3,0 NaMoO,*2H;0 0,01 a 0,1

[0042] A Tabela reimpressa de Principles of fermentation Technology P.F. Stanbury, A. Whitaker e S.J. Hall segunda edição, página 103

[0043] Em uma modalidade, o meio de fermentação pode incluir um agente de tampão. Os agentes de tampão adequados incluem, sem limitação, difosfato de potássio, fosfato de potássio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio e bicarbonato de potássio.

[0044] As faixas típicas de agentes de tampão são definidas na tabela a seguir. TABELA 4. AGENTES DE TAMPÃO Citrato monossódico 0,5 a 10 Citrato dissódico 0,5 a 10 Citrato trissódico 0,5 a 10 Hidróxido de sódio Usado para titular o PH em uma faixa mais básica Hidróxido de amónio Usado para titular o pH em

LO um Faixa mais vásica

[0045] Em algumas modalidades, o meio de fermentação contém peptona, extrato de carne bovina, extrato de levedura, glicose, acetato de sódio, polissorbato 80, hidrogenofosfato dipotássico, acetato de amônio, sulfato de magnésio e sulfato de manganês.

[0046] Em algumas modalidades, o meio de fermentação contém de cerca de 0,5% a cerca de 2,5% de peptona de caseína, de cerca de 0,5% a cerca de 3,5% de extrato de carne bovina, de cerca de 0,1% a cerca de 3,5% de extrato de levedura, de cerca de 1,0% a cerca de 5,0% de glicose, de cerca de 0,1% a cerca de 5,0% de acetato de sódio, cerca de 0,05% a 0,5% de 0,5% de 0,5% de 0,5% 80, de cerca de 0,05% a cerca de 0,5% de hidrogenofosfato dipotássico, de cerca de 0,05% a cerca de 0,5% de acetato de amônio, de cerca de 0,005% a cerca de 0,1% de sulfato de magnésio e de cerca de 0,0005 a cerca de 0,01% de sulfato de manganês.

[0047] Em algumas modalidades, o meio de fermentação pode ser modificado, incluindo, por exemplo, substituindo-se peptona de caseína por peptona de ervilha, peptona de soja ou peptona de batata, peptona de milho, peptona de vagem e peptona de carne.

[0048] Em algumas modalidades, o meio de fermentação, antes do início do crescimento dos microrganismos, pode incluir o aminoácido lisina, que, sem ser ligado pela teoria, pode aumentar a produção do butirato de ácidos graxos de cadeia curta.

[0049] Em certas modalidades, a invenção revelada compreende uma composição que compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium e, opcionalmente, um ou mais de Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, o que inclui qualquer uma das composições acima descritas, adicionadas a um meio de fermentação que consiste em melaço, em qualquer uma das concentrações acima e, opcionalmente, glicerol.

[0050] As condições de fermentação adequadas incluem uma faixa de temperatura de cerca de 25 ºC a cerca de 42 ºC. Em algumas modalidades, a temperatura de fermentação pode ser de cerca de 25 ºC, cerca de 26 “ºC, cerca de 27 ºC, cerca de 28 ºC, cerca de 29 ºC, cerca de 30 ºC, cerca de 31 ºC, cerca de 32 ºC, cerca de 33 ºC, cerca de 34 ºC, cerca de 35 ºC, cerca de 36 ºC, cerca de 37 ºC, cerca de 38 ºC, cerca de 39 ºC, cerca de 40 ºC, cerca de 41 ºC ou cerca de 42 “ºC.

[0051] Os tempos de fermentação típicos variam de 18 a 50 horas. O tempo-alvo de fermentação é baseado em uma combinação de PH, leitura de OD, acidez total e alcalinidade da solução.

[0052] O recipiente em que os microrganismos são cultivados é mantido em condições anaeróbicas ou aeróbicas.

B. FORMULAÇÃO

[0053] Em algumas modalidades, após a conclusão do crescimento microbiano, o meio e as células podem ser formulados em uma formulação que compreende os microrganismos probióticos em conjunto com os metabólitos de fermentação produzidos pelos microrganismos, que podem incluir um ou mais dos ácidos graxos de cadeia curta produzidos, açúcar, oligossacarídeos ou bacteriocinas. Em certas modalidades, a formulação compreende metabólitos secundários e/ou terciários. Além disso, alguns dos micróbios podem ser reduzidos, em número, no produto de fermentação, devido à concorrência entre micróbios durante o processo de fermentação. As formulações podem estar em formas líquidas ou sólidas.

[0054] Em uma modalidade, os metabólitos podem incluir um ácido graxo de cadeia curta. Os ácidos graxos de cadeia curta adequados incluem, sem limitação, ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido succínico e ácido isovalérico.

[0055] Os microrganismos, durante o crescimento, produzem quantidades substanciais de ácidos graxos de cadeia curta no meio de fermentação, por exemplo, na faixa de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 30,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a quantidade de ácidos graxos de cadeia curta produzidos no meio de fermentação pode ser de cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 10,0 mg/ml, cerca de 10,5 mg/ml, cerca de

11,5 mg/ml, cerca de 12,0 mg/ml, cerca de 12,5 mg/ml, cerca de 13,0 mg/ml, cerca de 13,5 mg/ml, cerca de 14,0 mg/ml, cerca de 14,5 mg/ml, cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 15,5 mg/ml, cerca de 16,5 mg/ml, cerca de 17,0 mg/ml, cerca de 17,5 mg/ml, cerca de 18,0 mg/ml, cerca de 18,5 mg/ml, cerca de 19,5 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml, cerca de 21,5 mg/ml, cerca de 22,0 mg/ml, cerca de 22,5 mg/ml, cerca de 23,0 mg/ml, cerca de 24,0 mg/ml, cerca de 24,5 mg/ml, cerca de 25,5 mg/ml, cerca de 25,5 mg/ml, cerca de 26,5 mg/ml, cerca de 26,5 mg/ml, cerca de 27,5 mg/ml, cerca de 28,5 mg/ml, cerca de 29,5 mg/ml, ou cerca de 30,0 mg /ml.

[0056] Em outra modalidade, os metabólitos podem incluir um açúcar. Os açúcares adequados incluem, sem limitação, um açúcar de 4 átomos de carbono, um açúcar de 5 átomos de carbono e um açúcar de 6 átomos de carbono. Os açúcares de 4 átomos de carbono adequados incluem, sem limitação, eritrose e treose. Os açúcares de 5 átomos de carbono adequados incluem, sem limitação, ribose, arabinose, xilose e lixose. Os açúcares de 6 átomos de carbono adequados incluem, sem limitação, glicose, galactose, manose, alose, altrose, gulose, idose e talose. Tais metabólitos são geralmente produzidos como metabólitos intermediários que são consumidos pelos micróbios durante o processo de fermentação para produzir os metabólitos finais contidos nas composições da presente invenção.

[0057] Em outra modalidade, os metabólitos podem incluir um oligossacarídeo. Os oligossacarídeos adequados incluem, sem limitação, fruto-oligossacarídeos, galacto-

oligossacarídeos, xilo-oligossacarídeos, eritritol palatinose, isomalto-oligossacarídeos e mananoligossacarídeos. Certos “prebióticos” de oligossacarídeos são consumidos pelas bactérias durante o processo de fermentação. Alguns novos “prebióticos"” são formados pelas bactérias durante o processo de fermentação.

[0058] Em outra modalidade, os metabólitos podem incluir uma bacteriocina. As bacteriocinas adequadas incluem, sem limitação, acidofilina, acidolina e reutericina.

[0059] No entanto, outros metabólitos de fermentação que podem ser produzidos incluem peptídeos, proteínas funcionais, enzimas, aminoácidos, sulfeto de hidrogênio, peróxido de hidrogênio, álcool, dióxido de carbono, dióxido de enxofre, polifenóis, manitol e vitaminas.

[0060] Em algumas modalidades, após a conclusão do cultivo microbiano, as composições obtidas, ou seja, o meio de cultivo, que inclui os microrganismos probióticos e metabólitos de fermentação, podem ser usadas diretamente para prevenir ou tratar uma doença ou afecção em animais. Em algumas modalidades, após a conclusão do cultivo, o meio e as células podem ser preparados para obter uma formulação líquida ou sólida que compreende a composição. Desse modo, por exemplo, as composições podem ser incluídas diretamente no abastecimento de água dos animais.

[0061] Em uma modalidade, as composições reveladas no presente documento, que compreendem pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium, e opcionalmente um ou mais de Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, o que inclui qualquer uma das composições acima descritas em mais detalhes, e os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação, podem ser formuladas como um líquido ou sólido.

[0062] Certas modalidades da invenção compreendem as composições reveladas no presente documento, que compreendem pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium, e opcionalmente um ou mais de Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, o que inclui qualquer uma das composições acima descritas em mais detalhes, e os metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios, quando cultivados em combinação em um meio que compreende melaço, e, opcionalmente, glicerol, inulina e/ou FOS, tal como descrito acima.

[0063] Em certas modalidades, uma composição compreende Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; ou Lactobacillus reuteri, Pediococo acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus e os metabólitos produzidos pelos micróbios, quando cultivados em conjunto, em um meio que compreende melaço em qualquer uma das concentrações acima, e, opcionalmente, glicerol, inulina e/ou FOS.

[0064] Verificou-se que as combinações dos micróbios da presente invenção, em conjunto com aàa sua mistura única de metabólitos de fermentação, notavelmente os metabólitos de ácidos graxos de cadeia curta, oferecem benefícios para a saúde dos animais, conforme discutido mais detalhadamente nos Exemplos 12 a 14.

[0065] A formulação como líquido ou sólido pode ser obtida por técnicas geralmente conhecidas na técnica. Tais técnicas para a formação de formulações sólidas incluem secagem por pulverização, evaporação, centrifugação, filtração de fluxo tangencial e microfiltração. Os equipamentos de secagem que podem ser usados incluem, sem limitação, um secador por pulverização, um forno de convecção, secador de micro-ondas, Buflowvac, liofilização ou um secador de tambor rotativo. As formulações em pó podem ser preparadas para incluir um agente de volume como maltodextrina, amido de milho, amido de tapioca, dextrose de tapioca, celulose microcristalina, farinha de arroz, amido de arroz, um prebiótico como inulina e fos.

[0066] Em algumas modalidades, a composição líquida pode ser concentrada para formar uma composição líquida mais concentrada. As composições líquidas podem ser concentradas com uso de técnicas geralmente conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a composição líquida mais concentrada pode ser preparada por centrifugação, ultrafiltração e evaporação.

[0067] Em algumas modalidades, as composições sólidas podem ser em pó ou peletizadas. As composições sólidas podem ser pulverizadas ou peletizadas com uso de técnicas geralmente conhecidas na técnica.

[0068] Em algumas modalidades, uma formulação pode ser preparada para obter uma contagem microbiana específica. Em algumas modalidades, a formulação pode conter uma contagem bacteriana de ácido láctico de pelo menos cerca de 1,0X105 ufc/grama ou ufc/ml. Em outras modalidades, a formulação pode conter uma contagem bacteriana de ácido láctico de pelo menos 1,0X107 ufc/grama ou ufce/ml. As contagens bacterianas típicas do ácido láctico variam de 1,0X105 a 1,0X1010 ufc/grama ou ufc/ml. II. MÉTODOS

[0069] Em um aspecto, um método da revelação compreende o tratamento ou a prevenção de uma doença ou afecção em um animal que necessite do mesmo, sendo que o método inclui a administração, ao animal, de uma composição que compreende pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, e Enterococcus faecium e, opcionalmente, um ou mais de Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, o que inclui qualquer uma das composições de micróbios descritas acima, em conjunto com os metabólitos produzidos por pelo menos dois micróbios cultivados em conjunto em qualquer um dos meios acima, o que inclui qualquer uma das composições descritas em mais detalhes acima.

[0070] Em certas modalidades, os métodos de revelação incluem o tratamento ou a prevenção de uma doença ou afecção de um animal que necessite dos mesmos, sendo que o método inclui a administração, ao animal, de uma composição que compreende Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici, Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; ou Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus, e os metabólitos produzidos pelos micróbios, quando cultivados em conjunto em qualquer um dos meios descritos acima.

[0071] Em uma modalidade, a doença ou afecção pode ser uma doença gastrointestinal. Em uma modalidade adicional, a doença ou afecção pode afetar uma porção do trato gastrointestinal. Em uma modalidade, a doença Ou afecção pode afetar a porção duodenal do trato gastrointestinal. Em outra modalidade, a doença ou afecção pode afetar a porção jejunal do trato gastrointestinal.

[0072] Em uma modalidade, a doença ou afecção pode ser enterite necrótica, enterite de Salmonella, coccidiose, mastite, gripe aviária, varíola de aves, bronquite infecciosa, bronquite de codorna, Laringotraqueíte, Doença de Newcastle, envenenamento por micotoxina, sarna sarcóptica porcina, pleuropneumonia, úÚlceras gástricas, torção intestinal, doença de Glasser, parbovírus suíno, doença com excreção e vômito, diarreia epidêmica suína, complexo de doença respiratória bovina, doença clostridial, sincicial respiratório bovino, diarreia viral bovina, Haemophilus Somnus, rinotraqueíte infecciosa bovina, Parinflenza tipo 3, Pasteurella Haemolytical , ou Pasteurella Multocida. Em uma outra modalidade, a doença ou afecção pode ser enterite necrótica, enterite de Salmonella ou mastite coccidiose.

[0073] Em uma modalidade, a doença ou afecção pode ser uma doença ou afecção de fertilidade. Por exemplo, a administração de uma formulação da invenção a um animal pode aumentar a frequência de deposição de ovos de aves domésticas, reduzir a incidência de nascidos mortos ou de nascimentos de múmias, em animais de produção de mamíferos, e/ou aumentar o número de nascidos vivos em animais de produção de mamíferos.

[0074] Em uma modalidade, a doença ou afecção pode ser causada por um agente microbiano infeccioso. Em algumas modalidades, o agente microbiano infeccioso pode ser uma espécie de Clostridium. A espécie de Clostridium pode ser, sem limitação, Clostridium absonum, Clostridium aceticum, Clostridium acetireducens, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acidisoli, Clostridium aciditolerans, Clostridium acidurici, Clostridium aerotolerans, Clostridium aestuarii, Clostridium akagii, Clostridium aldenense, Clostridium aldrichii, Clostridium algidicarnis, Clostridium algidixylanolyticum, Clostridium algifaecis, Clostridium algoriphilum, Clostridium alkalicellulosi, Clostridium amazonense, Clostridium aminophilum, Clostridium aminovalericum, Clostridium amygdalinum, Clostridium amylolyticum, Clostridium arbusti, Clostridium arcticum, Clostridium argentinense, Clostridium asparagiforme, Clostridium aurantibutyricum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium baratii, Clostridium barkeri, Clostridium bartlettii, Clostridium beijerinckii, Clostridium bifermentans, Clostridium bolteae, Clostridium bornimense, Clostridium botulinum, Clostridium bowmanii, Clostridium bryantii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium caenicola, Clostridium caminithermale, Clostridium carboxidivorans, Clostridium camis, Clostridium cavendishii, Clostridium celatum, Clostridium celerecrescens, Clostridium cellobioparum, Clostridium cellulofermentans, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellulosi, Clostridium cellulovorans, Clostridium chartatabidum, Clostridium chauvoei, Clostridium chromiireducens, Clostridium citroniae, Clostridium clariflavum, Clostridium clostridioforme, Clostridium coccoides, Clostridium cochlearium, Clostridium colletant, Clostridium cocleatum, Clostridium colicanis, Clostridium colinum, Clostridium collagenovorans, Clostridium cylindrosporum, Clostridium difficile, Clostridium diolis, Clostridium disporicum, Clostridium drakei, Clostridium durum, Clostridium estertheticum,

Clostridium estertheticum estertheticum, Clostridium estertheticum laramiense, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium fervidum, Clostridium fimetarium, Clostridium formicaceticum, Clostridium frigidicarnis, Clostridium frigoris, Clostridium ganghwense, Clostridium gasigenes, Clostridium qghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium glycyrrhizinilyticum, Clostridium grantii, Clostridium haemolyticum, Clostridium halophilum, Clostridium hastiforme, Clostridium hathewayi, Clostridium herbivorans, Clostridium hiranonis, Clostridium histolyticum, Clostridium homopropionicum, Clostridium huakuii, Clostridium hungatei, Clostridium hydrogeniformans, Clostridium hydroxybenzoicum, Clostridium hylemonae, Clostridium jeddahense, Clostridium jejuense, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium intestinale, Clostridium irregulare, Clostridium isatidis, Clostridium josui, Clostridium kluyveri, Clostridium lactatifermentans, Clostridium lacusfryxellense, Clostridium laramiense, Clostridium lavalense, Clostridium lentocellum, Clostridium lentoputrescens, Clostridium leptum, Clostridium limosum, Clostridium litorale, Clostridium liquoris, Clostridium lituseburense, Clostridium ljungdahlii, Clostridium lortetii, Clostridium lundense, Clostridium luticellarii, Clostridium magnum, Clostridium malenominatum, Clostridium mangenotii, Clostridium mayombei, Clostridium maximum, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium methylpentosum, Clostridium moniliforme, Clostridium neopropionicum, Clostridium nexile, Clostridium nitrophenolicum, Clostridium novyi, Clostridium oceanicum, Clostridium orbiscindens, Clostridium oroticum, Clostridium oryzae, Clostridium oxalicum, Clostridium papyrosolvens, Clostridium paradoxum, Clostridium paraperfringens (Alias: C. welchii), Clostridium paraputrificum, Clostridium pascui, Clostridium pasteurianum, Clostridium peptidivorans, Clostridium perenne, Clostridium perfringens, Clostridium pfennigii, Clostridium bphytofermentans, Clostridium piliforme, Clostridium polysaccharolyticum, Clostridium polyendosporum, Clostridium populeti, Clostridium bpropionicum, Clostridium proteoclasticum, Clostridium proteolyticum, Clostridium psychrophilum, Clostridium puniceum, Clostridium punense, Clostridium purinilyticum, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium quercicolum, Clostridium quinii, Clostridium ramosum, Clostridium rectum, Clostridium roseum, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharogumia, Clostridium saccharolyticum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium sardiniense, Clostridium sartagoforme, Clostridium saudiense, Clostridium senegalense, Clostridium scatologenes, Clostridium schirmacherense, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium sporosphaeroides, Clostridium stercorarium, Clostridium stercorarium leptospartum, Clostridium stercorarium, Clostridium stercorarium thermolacticum,

Clostridium sticklandii, Clostridium straminisolvens, Clostridium subterminale, Clostridium sufflavum, Clostridium sulfidigenes, Clostridium swellfunianum, Clostridium symbiosum, Clostridium tagluense, Clostridium tarantellae, Clostridium tepidiprofundi, Clostridium termitidis, Clostridium tertium, Clostridium tetani, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermaceticum, Clostridium thermautotrophicum, Clostridium thermoalcaliphilum, Clostridium thermobutyricum, Clostridium thermocellum, Clostridium thermocopriae, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermolacticum, Clostridium thermopalmarium, Clostridium thermopapyrolyticum, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium thermosuccinogenes, Clostridium thermosulfurigenes, Clostridium thiosulfatireducens, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium uliginosum, Clostridium ultunense, Clostridium ventriculi, Clostridium villosum, Clostridium vincentii, Clostridium viride, Clostridium vulturis, Clostridium xylanolyticum, ou Clostridium xylanovorans. Em uma outra modalidade, a espécie Clostridium pode ser Clostridium perfringens.

[0075] Em uma modalidade, a composição pode reduzir a quantidade de agentes patogênicos presentes nas fezes do animal.

[0076] Em uma modalidade, a composição pode reduzir o teor de amônia das fezes do animal.

[0077] Em uma modalidade, a composição pode reduzir a quantidade de metano produzido e expulso pelo animal, quer em ação respiratória ou em liberação de gás digestivo para o ambiente.

[0078] Em uma modalidade, a composição pode afetar positivamente a taxa de conversão de ração.

[0079] Em uma modalidade, a composição pode reduzir a taxa de mortalidade animal.

[0080] Em uma modalidade, a composição pode aumentar o ganho de peso diário médio.

[0081] Em uma modalidade, a composição pode aumentar a qualidade da casca de ovo e o peso do ovo.

[0082] Em uma modalidade, a composição pode modular o microbioma gastrointestinal de um animal. Em outra modalidade, a composição pode modular a resposta imune gastrointestinal de um animal. Em outras modalidades, a composição pode modular a fosforilação de proteínas gastrointestinais de um animal.

[0083] Em algumas modalidades, as composições sólidas podem ser adicionadas a uma quota de ração do animal ou fornecidas ao animal como um suplemento.

[0084] Em uma modalidade, a composição pode ser fornecida de forma sólida e adicionada a uma quota de ração para animais. Em algumas modalidades, a composição sólida pode ser adicionada a uma quota de ração para animais em uma quantidade de cerca de 0,1 kg/tonelada a cerca de 2,0 kg/tonelada de ração. Em outras modalidades, a composição sólida pode ser adicionada a uma quota de ração animal em uma quantidade de cerca de 0,1 kg/tonelada, cerca de 0,25 kg/tonelada, cerca de 0,5 kg/tonelada, cerca de 0,75 kg/tonelada, cerca de 1,0 kg/tonelada, cerca de 1,25 kg/tonelada, cerca de 1,5 kg/tonelada, cerca de 1,75 kg/tonelada, ou cerca de 2,0 kg/tonelada.

[0085] Em algumas modalidades, as composições líquidas podem ser adicionadas ao abastecimento de água potável do animal.

[0086] Em uma modalidade, a composição pode ser fornecida em uma forma líquida e adicionada à água potável de um animal. Em algumas modalidades, a composição líquida pode ser adicionada à água potável do animal em uma quantidade de cerca de 0,1 ml/dia/animal a cerca de 10 ml/dia/animal. Em outras modalidades, a composição líquida pode ser adicionada à água potável de um animal em uma quantidade de cerca de 0,1 ml/dia, cerca de 0,25 ml/dia, cerca de 0,5 ml/dia, cerca de 1,0 ml/dia, cerca de 1,25 ml/dia, cerca de 1,5 ml/dia, cerca de 1,75 ml/dia, cerca de 2,0 ml/dia, cerca de 2,25 ml/dia, cerca de 2,5 ml/dia, cerca de 2,75 ml/dia, cerca de 3,0 ml/dia, cerca de 3,25 ml/dia, cerca de 3,5 ml/dia, cerca de 3,75 ml/dia, cerca de 4,0 ml/dia, cerca de 4,25 ml/dia, cerca de 4,75 ml/dia, cerca de 5,0 ml/dia, cerca de 6,25 ml/dia, cerca de 6,5 ml/dia, cerca de 6,75 ml/dia, cerca de 7,0 ml/dia, cerca de 7,25 ml/dia, cerca de 7,75 ml/dia ml/dia, cerca de 8,0 ml/dia, cerca de 8,25 ml/dia, cerca de 8,5 ml/dia, cerca de 8,75 ml/dia, cerca de 9,0 ml/dia, cerca de 9,25 ml/dia, cerca de 9,5 ml/dia, cerca de 9,75 ml/dia, ou cerca de 10,0 ml/dia.

[0087] Em uma modalidade, a composição pode ser fornecida em uma forma líquida e adicionada à água potável de um frango. Em algumas modalidades, a composição líquida pode ser adicionada à água potável de um frango em uma quantidade de cerca de 0,l ml/dia a cerca de 2 ml/dia/animal. Em outras modalidades, a composição líquida pode ser adicionada à água potável de um frango em uma quantidade de cerca de 0,1 ml/dia/animal, cerca de 0,25 ml/dia/animal, cerca de 0,5 ml/dia/animal, cerca de 1,0 ml/dia/animal, cerca de 1,25 ml/dia/animal, cerca de 1,5 ml/dia/animal, cerca de 1,75 ml/dia/animal, ou cerca de 2,0 ml/dia/animal.

[0088] Em uma modalidade, a composição pode ser fornecida em uma forma líquida e adicionada à água potável de um porco. Em algumas modalidades, a composição líquida pode ser adicionada à água potável de um porco em uma quantidade de cerca de 0,5 ml/dia/animal a cerca de 10 ml/dia/animal. Em outras modalidades, a composição líquida pode ser adicionada à água potável de um porco em uma quantidade de cerca de 0,5 ml/dia/animal, cerca de 0,75 ml/dia/animal, cerca de 1,0 ml/dia/animal, cerca de 1,25 ml/dia/animal, cerca de 1,5 ml/dia/animal, cerca de 1,75 ml/dia/animal, cerca de 2,0 ml/dia/animal, cerca de 2,25 ml/dia/animal, cerca de 2,5 ml/dia/animal, cerca de 2,75 ml/dia/animal, cerca de 3,0, ml/dia/animal, cerca de 3,25 > ml/dia/animal, cerca de 3,5 ml/dia/animal, cerca de 3,75 ml/dia/animal, cerca de 4,0 ml/dia/animal, cerca de 4,25 ml/dia/animal, cerca de 4,5 ml/dia/animal, cerca de 4,75 ml/dia/animal, cerca de 5,0 ml/dia/animal, cerca de 5,25 ml/dia/animal, cerca de 5,5 ml/dia/animal, cerca de 5,75 ml/dia/animal, cerca de 6,0 ml/dia/animal, cerca de 6,25 ml/dia/animal, cerca de 6,5 ml/dia/animal, cerca de 6,75 ml/dia/animal, cerca de 7,0 ml/dia/animal, cerca de 7,25 ml/dia/animal, cerca de 7,5 ml/dia/animal, cerca de 8,0 ml/dia/animal, cerca de 8,25 ml/dia/animal, cerca de 8,5 ml/dia/animal, cerca de 8,75 ml/dia/animal, cerca de 9,0 ml/dia/animal, 9,25 ml/dia/animal, cerca de 9,50 ml/dia/animal, cerca de 9,75 ml/dia/animal ou cerca de 10,0 ml /dia/animal

[0089] Aqueles de habilidade na técnica devem, à luz da presente revelação, observar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado semelhante ou similar, sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

DEFINIÇÕES

[0090] As espécies bacterianas são apresentadas no presente documento por nomes latinos, de acordo com o sistema de classificação biológica taxonômica Linnaean. Por conseguinte, faz-se referência a microrganismos que podem ser identificados, em referência a determinados gêneros, espécies, subespécies e nomes de cepas.

[0091] O termo “microbioma”, conforme usado no presente documento, refere-se à comunidade de espécies microbianas presentes no sistema gastrointestinal de um animal.

[0092] Os termos “probiótico” e “microrganismo probiótico”", tal como usados no presente documento,

referem-se a uma composição de uma ou mais espécies de microrganismos que, quando administrados por via oral, podem fornecer benefícios à saúde de um animal.

[0093] O termo “prebiótico”", conforme usado no presente documento, significa um ingrediente não microbiano para inclusão opcional em uma formulação probiótica com capacidade de induzir o crescimento ou a atividade de microrganismos probióticos no sistema gastrointestinal.

[0094] O termo “pós-biótico”", conforme usado no presente documento, significa um produto bacteriano não viável ou metabólico por produtos de microrganismos probióticos que têm atividade biológica no hospedeiro.

[0095] Os termos “ácidos graxos de cadeia curta” ou “SCFAs”, como podem ser usados de forma intercambiável no presente documento, incluem ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido succínico e ácido isovalérico.

[0096] Conforme usado no presente documento, “animal” se refere, mas sem limitação, a um humano, um animal de gado, um animal de companhia, um animal de laboratório e um animal zoológico. Em outra modalidade, o animal pode ser um animal de gado. Em uma modalidade, o animal pode ser um animal bovino, um animal suíno ou um animal de aves domésticas. Em outras modalidades, o animal pode ser uma vaca, um porco ou um frango. Os exemplos sem limitação de animais de gado adequados podem incluir porcos, vacas, cavalos, caprinos, ovinos, lhamas e alpacas.

Em outra modalidade, o sujeito pode ser um animal de companhia. Os exemplos sem limitação de animais de companhia podem incluir animais de estimação como cães, gatos, coelhos e aves. Em outra modalidade, o animal pode ser um animal de zoológico. Em uma modalidade alternativa, o animal pode ser um humano.

EXEMPLOS

[0097] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar várias modalidades da presente revelação. Deve ser observado por aqueles de habilidade na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam técnicas constatadas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção, podendo, assim, ser consideradas como modos preferenciais para sua prática. No entanto, aqueles de habilidade na técnica devem, à luz da presente revelação, observar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado semelhante ou similar, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLO 1. MÉTODO DE AQUISIÇÃO DE

MICRORGANISMOS PARA USO EM UMA FORMULAÇÃO DE COQUETEL DE FERMENTAÇÃO

[0098] As cepas usadas foram culturas de organismos de cepa única armazenadas em glicerol: meio de 15% a 25%. As cepas eram espécies únicas obtidas pelos inventores da Pure Cultures, Inc., ou obtidas por bioprospecção de suplementos dietéticos comerciais ou obtidas do banco de cultura USDA/NRRL.

EXEMPLO 2. MÉTODO DE COLETA DE AMOSTRAS E

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DE FEZES

[0099] As amostras de fezes frescas foram colhidas de caninos saudáveis no Colorado, EUA, e imediatamente congeladas a aproximadamente -18 ºC. À matéria fecal, foi adicionada água de peptona (10% em peso/vol.) e centrifugadas para homogeneizar totalmente as amostras. As diluições seriais do homogeneato fecal foram então listradas em ágar MRS para isolamento. As colônias únicas foram selecionadas, adicionalmente purificadas através do isolamento de ágar MRS, e posteriormente enriquecidas em caldo MRS, uma vez que uma colônia pura foi obtida. O meio enriquecido foi então diluído com 30% de glicerol:solução de água. Em seguida, foram colocadas alíquotas de 1 ml em criofrascos de 2 ml e armazenadas a -80 ºC EXEMPLO 3. MÉTODO DE COLETA E ISOLAMENTO DE

BACTÉRIAS DO PRODUTO SUPLEMENTO ALIMENTAR COMERCIAL

[0100] O produto probiótico comprado foi inoculado em meios de MRS não animais. O meio inoculado foi incubado a 37º por aproximadamente 15 horas. Um ciclo de inoculação estéril foi mergulhado no meio com crescimento e listrado em uma placa de ágar MRS não animal. A placa foi incubada durante a noite, por aproximadamente 18 horas. A colônia única foi coletada e colocada em meio não animal autoclavado e incubada a 37 ºC. O meio enriquecido foi então diluído 1:1 com 50% de glicerol:solução de água. Em seguida, foram colocadas alíquotas de 1 ml em criofrascos de 2 ml e armazenadas a -80 ºC

EXEMPLO 4. MÉTODO DE SEQUENCIAMENTO DE 16sRNA PARA IDENTIFICAÇÃO DE CEPAS

[0101] As cepas foram enviadas para o MIDI Laboratories Newark, DE 19713. Aproximadamente 500 pares de base foram sequenciados e comparados com a versão 3.01 da Biblioteca D16M3.

EXEMPLO 5. MÉTODO DE SEQUENCIAMENTO

GENÔMICO COMPLETO DE CEPAS BACTERIANAS

[0102] Cada cepa foi processada de acordo com os SOPs estabelecidos no ATCC-CTM. O DNA genômico foi extraído de cada cepa com uso de um Mini Kit QiAmp DNA (Qiagen Cat nº/ID 51304) e posteriormente quantificado fluorometricamente com uso de um fluorômetro QUBIT 2.0 de acordo com as instruções do fabricante (ThermoFisher Scientific).

[0103] O fluxo de trabalho para o sequenciamento genoma completo foi conduzido conforme recomendado por Illumina. A preparação da biblioteca foi realizada com o Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina Cat nº FC-131- 1096) de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez que a biblioteca foi preparada e controlada pela qualidade - a mesma, foi então, sequenciada com uso de uma Illumina MiSeg com o Kit de Reagente MiSeq V3 de 600 ciclos (Illumina Cat nº MS-102-3003). As sequências resultantes foram avaliadas quanto à qualidade e precisão de leitura com uso do software de aplicação FASTQC da Babrahm Bioinformatics, Instituto Babraham, Cambridge, Reino Unido (<https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastac

/>). As sequências filtradas de QC'd foram então montadas em contigs e anotadas com uso da plataforma Genômica Microbiana Avançada (AMG) de propriedade da ATCC-CTM. EXEMPLO 6. MÉTODO DE ENSAIO DAS SCFAs

[0104] Um método de HPLC que usa a unidade de HPLC da série 1100 da Agilent. Coluna de Análise de Ácido Orgânico Bio-Rad Coluna de Exclusão de Íons Aminex HPX-87H com fase móvel estacionária de 0,2 N H2S0O4. Aquecido a 60 ºC.

[0105] O mecanismo de alimentação cruzada baseado na dieta, como mostrado na Figura l, é uma característica fundamental no microbioma intestinal de mamíferos, aviários e reptilianos. A fim de compreender o mecanismo de alimentação cruzada, foi realizada uma modelagem adicional e comparada com os modelos metabólicos do genoma inteiro (das mesmas quatro cepas) em relação a vários produtores de SCFAs fundamentais (espécies de microbioma intestinal de referência). Juntamente com nossos quatro modelos metabólicos do genoma inteiro, o modelo final de alimentação cruzada foi construído com uso do Bacteroides thetaiotaomicron, Escherichia coli str k 12, Clostridium ramosum VPI, Lactobacillus plantarum. O modelo de alimentação cruzada foi executado em dois principais SCFAs (por exemplo, butirato) que produzem metabólitos, isto é, lactato (secundário) e xilano (primário). Curiosamente, todas as quatro cepas apresentaram interações significativas de alimentação cruzada com outras cepas de referência. Esse resultado destaca o fato de que as cepas têm o potencial genético/metabólico para produzir eficientemente os SCFAs com uso de precursores metabólicos primários (xilano) e secundários (lactato) para a produção de SCFAs.

EXEMPLO 7. MÉTODO DE AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO

DE AGENTES PATOGÉNICOS

[0106] As atividades antimicrobianas das cepas de LAB foram testadas com ensaio de difusão de poços, com uso de placas de ágar TSB. O padrão de patógeno conhecido foi inoculado durante a noite em TSB e incubado a 37 ºC durante 24 horas +/- 4 horas. 100 pl foram espalhados na placa de ágar TSB. Os furos foram perfurados no ágar e 25 pl de caldo de fermentação durante a noite foram inoculados no poço e deixados incubar durante a noite a 37 ºC. O tamanho do halo de inibição é medido em ml. Os resultados para certas cepas são mostrados na Tabela a seguir.

TABELA 5. INIBIÇÃO DE CEPAS DE E. COLI COM

DIFERENTES MEIOS Cepa ágar Ref. do Caderno Difusão de P q de laboratório poço (mm) Lactobacillus acidophilus A TSB SKK1016p.006 14 PCLAI8 Lactobacillus reuteri A TSB SKK1016p.006 11 R4 Lactobacillus reuteri PCRT SRI DI GpoOS Lactobacillus reuteri LR2 cepa A TSB SKK1016p.006 12 comercialmente disponível de laboratório poço (mm) mo po e fe acidophilus TSB SKK1016p.006 15 PCLAI8 EEE e mes Esse bo fe eme de Ene: e o E reuteri LR2 cepa TSB SKK1016p.006 15 comercialmente disponível EXEMPLO 8. MÉTODO PARA DADOS DE SEQUÊNCIA

JATEAMENTO CONTRA BANCOS DE DADOS CONHECIDOS

[0107] Como mostrado na Figura 3, os genomas de rascunho foram anotados (nível de Via e Enzima) 15 com uso do conjunto de programas Prokka (<https://github.com/tseemann/prokka>). A situação taxonômica foi atribuída a cada genoma que usa o conjunto de dados do gene de 400 marcadores e, finalmente, comparada com os genomas de referência. Uma árvore de máxima verossimilhança foi construída (inicialização = 1000) com todos os quatro genomas de rascunho e seus 50 vizinhos filogenéticos mais próximos.

[0108] A análise filogenética baseada no genoma inteiro (mencionada acima) estabeleceu claramente a identidade do nível da espécie para cada genoma. A identidade do nível de cepa de cada genoma foi analisada em pares com uso da análise de identidade nucleotídea (ANI) média de genoma total com um corte estabelecido de nível de cepa de 99,9%. Os cálculos de ANI em pares destacaram claramente que todas as quatro cepas, ou seja, L. reuteri PCR7, P. acidilactici PCLLOl, E. faecium PCEFO2 e L. fermentum PCFl, são cepas inovadoras, em comparação com oO genótipo de nível de espécies mais próximo.

[0109] Com uso de dados simulados de micobioma (a partir do conjunto de dados do genoma personalizado dos genomas produtores de SCFA), foram previstas taxas de replicação in situ em cada genoma com uso da ferramenta iRep (<https://github.com/christophertbrown/iRep>). A análise a jusante das taxas de replicação in situ destacou claramente o crescimento rápido in situ, em um ambiente intestinal (simulado com uso de >500 genomas de espécies de referência cultivadas). Foram usadas biopeças para extrair as sequências quase completas dos genes codificadores de proteínas para fatores de ligação ao muco e à fibronectina, implicados na adesão às células intestinais. Curiosamente, L. fermentum PCFl e L. reuteri PCR7 mostraram acerto positivo (BlastX, valor e-= 10-e5) para mucina e proteínas de ligação à fibronectina. Com uso do conjunto de programas Abricate (<https://github.com/tseemann/abricate>), os conjuntos de genoma de rascunho foram adicionalmente selecionados para quaisquer genes ARG presentes na proximidade de transposons e/ou Integrons. Conforme esperado para uma cepa probiótica, nenhum dos quatro rascunhos de genoma mostrou qualquer gene ARG na proximidade de um transposons e/ou Integron. Esses resultados destacam claramente o potencial mínimo de transferência de genes horizontais das cepas. Os fatores de virulência foram anotados pesquisando-se as Contagens de Recursos do Subsistema da saída do RAST para os fatores identificados no subsistema Virulência, Doença e Defesa. A presença de bacteriocinas nas sequências montadas foi determinada por buscas abrangentes do banco de dados BACTIBASE (<http://bactibase.hammamilab.org/main.php>). O BACTIBASE contém propriedades físico-químicas calculadas ou previstas de 230 bacteriocinas produzidas por bactérias Gram-positivas (206) e Gram-negativas (19). As informações contidas nesse banco de dados permitem uma rápida previsão das relações estrutura/função, além dos organismos-alvo desses peptídeos, o que fornece uma melhor exploração de sua atividade biológica tanto nos setores médico quanto alimentar. Cada conjunto foi usado individualmente como consultas para as pesquisas.

EXEMPLO 9. MÉTODO DE AVALIAÇÃO DE SCFA COM

CROMATOGRAFIA GASOSA E DETECTOR DE FID

[0110] Os extratos de amostra foram analisados em um cromatógrafo de gás da série 6890 Agilent, equipado com detecção de ionização por chama (GC-FID; Agilent Inc., Santa Clara, CA). A taxa de injeção foi de 10:1, e a temperatura de entrada foi de 22 ºC, e a temperatura da linha de translet foi mantida a 230 ºC. A separação foi alcançada em uma coluna TG-WAX-A de 30 m (ThermoScientific, 0,25 mm ID, espessura do filme de 0,25 um) a 100 ºC por 1 minuto e taxa de elevação de 8 ºC por minuto a 180 ºC, realizada a 180 ºC durante 1 minuto, com elevação para 200

ºC a 20 ºC/min. e mantida durante 5 minutos. O fluxo de veículo de hélio foi mantido a 1,2 ml por minuto. Os ácidos graxos de cadeia curta foram quantificados com uso de curvas-padrão de 5 pontos de padrões comercialmente comprados (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e normalizados para sinal padrão interno. Conforme mostrado na Figura 4, O ácido acético tem um tempo de retenção de 5,4 e 5,5 minutos. O ácido propiônico tem um tempo de retenção de 6,5 minutos. O ácido butírico tem um tempo de retenção de 7,7 minutos. O ácido láctico tem um tempo de retenção de 13,2 e 14,78 minutos, enquanto o ácido ascórbico tem tempos de retenção de 14,04 e 15,09 minutos.

EXEMPLO 10. MÉTODO DE AVALIAÇÃO DE

CONJUNTOS GENOMAS COM USO DE CONJUNTO DE PROGRAMAS PROKKA

[0111] Sequências genômicas brutas foram montadas em conteúdos com uso do montador IDBA, um novo montador para sequenciamento monocelular e metagenômico. Os contigs foram anotados com uso do banco de dados UniProt. Os resultados anotados foram analisados com uso do Banco de Genes BioPython. Com uso de scripts BASH e Python personalizados, os arquivos anotados foram analisados em matrizes funcionais de nível de enzima e via, conforme mostrado na tabela abaixo.

TABELA 6. PROTEÍNAS ESTABILIZADAS AO CALOR a E térmico de 18 kDa eosaas te meme ho ho

Nome —da —Proteínapcim] — lpcrFO2 PCLLOlI |PCRT Estável ao Calor Repressor de transcrição induzível|l 1 1 1 pelo calor HRCa Proteína de chaperona 7 7 CipB Das emanerenea ho DnaJ P í h DnaK Chaperona molecular 2 1 Hsp31 e glioxalase A tabela lista o número de cópias presentes no genoma.

EXEMPLO 11. FORMULAÇÃO PROBIÓTICA

[0112] Foram obtidas cepas dos seguintes microrganismos: Lactobacillus acidophilus PCLAI8, Lactobacillus reuteri, a cepa PCR7, Pediococcus acidilacti, a cepa PCLLOl e o Enterococcus faecium PCEFO2 foram combinados e cultivados em meio de crescimento líquido com aproximadamente 5% de melaço, 5% de inulina e 2,5% em v/v glicerol. Após a conclusão do cultivo, o meio, em conjunto com a bactéria, foi coletado. O material coletado pode ser usado como probiótico.

EXEMPLO 12. FOSFORILAÇÃO DE PROTEÍNAS

DUODENAIS E JEJUNAIS POR UMA FORMULAÇÃO PROBIÓTICA

[0113] Uma formulação probiótica foi preparada, conforme descrito no Exemplo 11, e usada em experimentos de alimentação de frango. Foram avaliadas as porções duodenal e jejunal do quinoma do trato digestivo (Manning et ah,

2002) dos frangos. Foram avaliados os seguintes grupos de frangos: controle não tratado (grupo (i1)); frangos tratados com formulação probiótica (grupo (ii)); frangos desafiados com Clostridium perfringens (grupo (iii)); frangos desafiados com Clostridium perfringens e tratados com a formulação probiótica (grupo (iv)); frangos tratados com uma vacina contra a coccidiose e formulação probiótica (grupo (v)); e frangos com Clostridium perfringens e tratados com uma vacina contra a coccidiose e formulação probiótica (grupo (vi)). As amostras biológicas de replicados de 5 aves por grupo foram combinadas para gerar perfis representativos de quinoma. Após a combinação e normalização dos dados, a análise de agrupamento foi realizada nos 12 perfis de quinoma resultantes (um para cada tecido (jejuno e duodeno) (2) grupo de tratamento X ((i) a (vi)) (6)) que usa o pacote de software personalizado PIIKA 2 (Trost et ah, 2013). A Figura 6 mostra um mapa de calor e agrupamento que exibem a semelhança relativa entre os 12 perfis baseados na fosforilação de proteínas individuais. Um mapa de calor adicional foi criado representando os perfis quinoma das combinações tratamento/ tecido, em relação aos perfis de quinoma de controle para cada respectivo tecido, como mostra a Figura 7.

[0114] Um efeito da formulação probiótica pode ser visto na Figura 6. O tecido de jejuno obtido de frangos tratados com a formulação probiótica tende a se aglomerar. Amostras de tecido duodeno não parecem desenvolver um padrão específico de agrupamento. As amostras de tecido de jejuno obtidas de frangos não tratados com a formulação probiótica também formam um agrupamento. Isso sugere que o tratamento probiótico tem um efeito distinto no tecido jejunal, separado do efeito do desafio de Clostridium perfringens

[0115] Em referência -se à Figura 7, amostras de tecido duodeno novamente mostram pouca diferenciação entre os grupos. As amostras de tecido de jejuno parecem novamente se agrupar com base no tratamento de metabólito com o grupo tratado de formulação não probiótica que se mantém separado. O grupo mais removido do agrupamento de metabólitos é o agrupamento tratado com enterite necrótica induzida por Clostridium perfringens, que sugere as maiores alterações que ocorrem nesse agrupamento, em relação ao controle, quando comparado com os outros grupos tratados com metabólito.

EXEMPLO 13. IDENTIFICAÇÃO DE PROCESSOS

BIOLÓGICOS JEJUNAIS E VIAS DE SINALIZAÇÃO APÓS TRATAMENTO COM FORMULAÇÃO PROBIÓTICA

[0116] Em uma matriz de peptídeos obtida dos grupos de frangos (i) - (iv) descritos no Exemplo 12, foram identificados peptídeos individuais que exibiram padrões diferenciais de fosforilação em amostras de tecido jejunal, em relação aos frangos de controle não tratados (1). Esses indivíduos foram submetidos a uma análise da proteína STRING (Szklarczyk D et al., 2015; <https://string-db.org>) para revelar processos biológicos relevantes (GO), e uma análise KEGG (Kanesha M, Goto Ss, 2000; <https://www.genome.jp/kegg/pathway.html>) para revelar vias de sinalização relevantes. A Tabela 7 e a Tabela 8 mostram os resultados STRING e KEGG obtidos com frangos tratados com probióticos (grupo (ii)); a Tabela 9 e a Tabela 10 mostram os resultados STRING e KEGG obtidos por meio de frangos desafiados com Clostridium perfringens (grupo (iii)); e a Tabela 11 e a Tabela 12 mostram os resultados STRING e KEGG obtidos com uso de frangos desafiados com Clostridium perfringens tratados com probiótico (grupo (iv)).

[0117] Note-se que alguns dos processos biológicos podem se sobrepor entre as Tabelas, os membros dos processos biológicos tiveram que ser únicos para serem incluídos na análise. Por isso, os mesmos termos podem aparecer entre os grupos, mas estão sendo enriquecidos de maneiras diferentes entre os grupos. Isso indica que os vários processos biológicos enriquecidos estão se comportando de diferentes maneiras entre os grupos de tratamento.

[0118] São destacados na Tabela 7 e na Tabela 9 os termos relacionados à sinalização imune. Todos os processos biológicos destacados nos grupos probióticos (Tabela 7) também aparecem nos grupos de desafio Clostridium perfringens (Tabela 9), mas é importante notar que as listas usadas para gerar essas tabelas foram únicas para cada grupo. Desse modo, embora os mesmos termos apareçam, representam mudanças nos mesmos processos biológicos entre os grupos de tratamento. Curiosamente, o grupo de desafio Probiótico+Clostridium perfringens (Tabela 11) não tem as mesmas vias imunobiológicas relacionadas enriquecidas nas principais vias da análise STRING. Isso mostra que a sobreposição dos dois tratamentos, desafio probiótico e Clostridium perfringens, provavelmente está transmitindo seus próprios efeitos únicos para o tecido jejunal, que, quando reunidos, não enriquecem novos processos imunobiológicos relacionados.

[0119] No que diz respeito à Tabela 8, Tabela 10 e Tabela 12, observa-se que as vias KEGG podem se sobrepor entre as Tabelas, os membros das vias tiveram que ser únicos para serem incluídos na análise, por isso, os mesmos termos podem aparecer entre os grupos, mas estão sendo enriquecidos de diferentes maneiras entre os grupos. Isso indica que as várias vias de KEGG enriquecidas estão se comportando de maneiras diferentes entre os grupos de tratamento.

TABELA 7. 20 PRINCIPAIS PROCESSOS BIOLÓGICOS (GO) ENRIQUECIDOS EXCLUSIVAMENTE EM TECIDO DE JEJUNO DE FRANGOS TRATADOS COM PROBIÓTICOS, EM COMPARAÇÃO

COM FRANGOS NÃO TRATADOS * de Falso Processo Biológico proteí constatas nas Taxa Resposta celular ao estímulo químico Resposta celular à substância orgânica Fosforilação Via de sinalização da quinase tirosina|/21 1,13E-10

Fal td de 2=so nTn: ; |Constataç Processo Biológico proteí ão nas Taxa de proteína do receptor transmembranar | Via de sinalização da proteína do 23 2,10E-10 receptor ligado à enzima Fosforilação de proteína 21 — J1,03E-09 Regulação de sinalização 34 — |7,356-09 Regulação de resposta ao estímulo 36 — |6,906-o0s Regulação de resposta imune 19 — |6,906-o08 Processo metabólico de fósforo l27 —]7,126-08 Resposta à substância orgânica 31 — |7,128-08 Regulação de comunicação celular 33 — |9,58E-08 R laçã i Regu ação de processo do sistema 1,57E-07 imunológico Processo metabólico composto que contém 26 1,94E-07 fosfato Via de | sinalização de receptor de 27 6,22E-07 superfície celular Regulação de transdução de sinal 29 — |6,586-07 Resposta a produtos químicos 36 — |9,236-07 Fegulação positiva de processo de 17 2,70E-06 sistema imunológico Resposta imune inata 18 —|2,706-06 P lie 7 rocesso metabólico de um ânicnlar larsencos organismo TABELA 8. 20 PRINCIPAIS VIAS KEGG

ENRIQUECIDAS EXCLUSIVAMENTE EM TECIDO DE JEJUNO DE FRANGOS TRATADOS COM PROBIÓTICOS, EM COMPARAÇÃO COM FRANGOS NÃO

TRATADOS * de Taxa . de Via KEGG s constatação proteínas falsa Via de sinalização de PISK-ake — 14 ———— |6,90x-09 Fagocitose mediada por Fc gama R |9 6,90E-09

T: . Hd de axa . de Via KEGG ; constatação proteínas falsa Infecção pelo vírus Epstein-Barr 11 — |1,56E-08 Doença hepática gordurosa não E-07 alcoólica (DHGNA) 3,08E-O Via de sinalização Ras 106 — |4,998-07 Influenza À lo |5,576-07 Diferenciação de osteoclastos lê |7,90g-07 Hepatite C le | 9,40r-07 Hepatite B l8 | 1,426-06 Via de sinalização de VEGF lê “| 2,15E-06 Via de sinalização do receptor Toll-like 7 2, 40E- 06 Via de sinalização TNF 7 — |3,146-06 Via de sinalização Fc epsilon RI lê — |3,49r-06 Vi di i 1i ã di ia de sinalização e 3,61E-06 adipocitocinas Via de sinalização de prolactina lê “| 4,08E-06 Junção de Aderência lê 4,198-06 TABELA 9. 20 PRINCIPAIS PROCESSOS BIOLÓGICOS (GO) ENRIQUECIDOS EXCLUSIVAMENTE EM TECIDO DE JEJUNO DE FRANGOS DESAFIADOS POR CP, EM COMPARAÇÃO COM FRANGOS NÃO DESAFIADOS. td de Taxa de Processo Biológico proteína |constatação s falsa Regulação de resposta imune l2o — 13,90x-09 Processo metabólico de proteínas 38 = l1,158-08 Processo metabólico de proteínas 35 1,31E-08 celulares

À de Taxa de Processo Biológico proteína |constatação s falsa Regulação positiva do processo 35 1,80E-08 metabólico Regulação do processo metabólico 24 1, 80E-08 fosfato Transdução intracelular de sinal las — | 1,80r-08 Resposta de defesa 23 = l2,025-08 Regulação da fosforilação 22 — l2,026-08 Regulação positiva da resposta imunel1s6s — = |2,026-08 Via de sinalização de regulação hs faremos resposta imune Regulação de processo de modificação 24 2,47E-08 de proteínas Fosforilação de proteína 18 = 3,178-08 Resposta imune inata 19 13,935-08 R laçã : Regu ação de processo do sistema — fasoncos imunológico Ativação de resposta imune 24 |s,116-08 Resposta ao composto de nitrogênio 18 8,2115208 T ã 1 ã ransdução de sinal de ativação “hs = hisseoo resposta imune Via de sinalização do receptor Fc 11 f1,35E-07 Via de sinalização de receptor "eho — haenos epsilon Regulação de fosforilação o sono proteínas TABELA 10. 20 PRINCIPAIS VIAS DE KEGG

ENRIQUECIDAS EXCLUSIVAMENTE EM TECIDO DE JEJUNO DE FRANGOS DESAFIADOS Cp, EM COMPARAÇÃO COM FRANGOS NÃO DESAFIADOS Falso : d: z Via KEGG bd Se Constatação Peptídeos Taxa Via de sinalização da insulina 8 — la,18E-06 Via de sinalização de receptor de 7 5,66E-06 células T

Fal : À de 2=so z Via KEGG ; Constatação Peptídeos Taxa Via de sinalização da 7 1,14E-05 neurotrofina Citotoxicidade mediada por células natural killer Po uses Adesão focal lê ]2,008-05 Câncer de próstata le “ l2,006-05 Via de sinalização de estrogênio le “ 12,936-05 Via de sinalização Fc epsilon RI ls “ l8,246-05 Diferenciação de osteoclastos le “ l8,796-05 Via de sinalização de prolactina ls “ 8,796-05 Hepatite C le — lo,000102 Via de sinalização ErbB ls — Jorooo163 Via de sinalização MAPK 7 — lo,o00416 Câncer do endométrio lá lo,000436 câ d 1mã d élul ã pequenas Via de sinalização FoxO ls — lo,o0osos TABELA 11. 20 PRINCIPAIS PROCESSOS BIOLÓGICOS (GO) ENRIQUECIDOS EXCLUSIVAMENTE EM TECIDO DE JEJUNO DE FRANGOS Cp DESAFIADOS TRATADOS COM PROBIÓTICOS,

EM COMPARAÇÃO COM FRANGOS NÃO TRATADOS NÃO DESAFIADOS | de Falso : Ss ; |Constataç Processo Biológico proteí ão nas Taxa Autofosforilação de proteínas 11 la,876-09 Via de sinalização. da proteína do 17 5,74E-08 receptor ligado à enzima

Via de sinalização da quinase tirosina 15 1,05E-07 de proteína do receptor transmembranar R laçã óli egqu ação do processo metabólico de 21 1,08E-05 proteínas celulares Regulação da transdução intracelular “ho [ossos sinal Regulação positiva da atividade de 1,18E-05 quinase Regulação : positiva de processo|, 1,18E-05 metabólico lipídico Transdução intracelular de sinal 18 ——la,558-05 Regulação de atividade de proteína 4,55E-05 quinase Resposta ao estímulo externo 18 —la,88m-05 Regulação positiva de atividade 16 4,88E-05 catalítica R' laçã âni egulação de processo orgânico|,, 4,88E-05 multicelular Regulação positiva de função molecular 17 — |6,06E-o5 Fosforilação de peptidil-tirosina 7 —le,85e-os Fosforilação de proteína 12 — Jo,000123 R laçã ê egulação de biogênese de componentes 11 0,000123 celulares Regulação de processo de modificação “hs — lorooosza proteínas Regulação de fosforilação de proteínas 14 — Jo,o001268 Regulação positiva de transdução 12 0,000132 intracelular de sinal Orientação de nitrogênio lo — lorooo1s1 TABELA 12. 20 PRINCIPAIS VIAS DE KEGG

ENRIQUECIDAS EXCLUSIVAMENTE EM TECIDO DE JEJUNO DE FRANGOS Cp DESAFIADOS TRATADOS COM PROBIÓTICOS, EM COMPARAÇÃO COM

FRANGOS NÃO TRATADOS NÃO DESAFIADOS T.

. * de axa 2 de Via KEGG z constatação proteínas falsa Via de sinalização AMPK 7 4,40E-06

T . d de axa de Via KEGG z constatação proteínas falsa Leucemia mielóide aguda ls B,238205 Via de sinalização de quimiocina le — lo,o00441 Via de sinalização da insulina ls loroo125 Via de sinalização de PI3K-Akt le — lo,00685 Migração transendotelial a Joroosss leucócitos Via de sinalização mTOR 8 lo,o146 Via de sinalização ErbB 8 lo,o32 Fagocitose mediada por Fc gama R 8 — lo,o329 R laçã i 1 egulação de citoesqueleto “kl ovos actina Proteoglicanos em câncer la — lo,o4os Câncer de tireóide 2 — lorogos EXEMPLO 14. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE

SAÚDE ANIMAL APÓS TRATAMENTO COM FORMULAÇÃO PROBIÓTICA

[0120] Uma formulação probiótica foi preparada, conforme descrito no Exemplo 11, e usada em experimentos de alimentação de frango. Vários parâmetros de saúde animal foram avaliados. Foram avaliados os seguintes grupos de frangos: controle não tratado (Tl); frangos tratados com formulação probiótica (T2); frangos desafiados com vacina coccidiose (T3); frangos desafiados com Clostridium perfringens e tratados com vacina coccidiose (T4); frangos com Clostridium perfringens (T5); frangos desafiados com Clostridium perfringens e tratados com formulação probiótica (T6); frangos tratados com vacina coccidiose e formulação probiótica (T7); e frangos desafiados com Clostridium perfringens e tratados com vacina coccidiose e probiótica formulação (T8). Foram avaliados os seguintes parâmetros de saúde: (a) unidades formadoras de colônias de Clostridium perfringens no intestino; (b) ganho de peso corporal; (c) lesões de enterite necrótica induzidas por Clostridium perfringens; e (d) mortalidade. O projeto experimental está adicionalmente resumido na Tabela 13. TABELA 13. PROJETO EXPERIMENTAL : Clostridiu Pontu Pesos Desafio = Tratam : sas m ação Grupos Corporai |Coccidia ento s 1 perfringen da s lesão : Controle Dia 17 112 2 Dia Ti negativo 14, 21 Não Não 21 Controle neg. +|Dia 17/12 2 Dia T2* N N Probiótico 14, 21 [99º ao 21 : Dia 1, : 2 Dia ” ese va = | 22 Da não 21 Cocci Vac + : os Dia 114. Dia 17,18|Dia T4 Clostridium 14, 21 Dia 14 e 19* 21 perfringens Controle positivo delDia 17/12 Dia 17,18|Dia P Clostridium 14, 21 [No e 19* 21 perfringens Perri 14, 21 e 19* 21 Probiótico Cocci Vac +|Dia 1, : 2 Dia 7x ' Esstaçaco” CBS 21 Coccivact Clostridium Dia 17/12 Dia 17,18|Dia T8 ; Não perfringens +|14, 21 e 19* 21 Probiótico

[0121] Os seguintes resultados foram obtidos ao comparar T8 com T4 e T5: (a) Observou-se redução significativa na UFC total de Clostridium perfringens no intestino (1,7 x 105 (T8) vs. 6,2 x 105 (T4) e 14,0 x 105 (T5), respectivamente); (b) Um aumento significativo de peso corporal maior: (781 gramas (T8) vs. 697 gramas (T4) e 695 gramas (T5), respectivamente). Como comparação, Tl (controle negativo) apresentou ganho de peso médio de 805 gramas; (c) redução significativa na pontuação da lesão: (0,56 (T8) vs. 2,3 (T4) e 3,0 (T5), respectivamente); e (d) redução significativa na mortalidade: (1/50 (T8) vs. 12/50 (T4) e 21/50 (T5), respectivamente).

EXEMPLO 15. PRODUZIR E DETECTAR UMA MISTURA

ÚNICA DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM UM COQUETEL LÍQUIDO DE CONSÓRCIO PARA SAÚDE DE AVES

[0122] INTRODUÇÃO. As bactérias do ácido láctico (Lactobacilli) têm sido estudadas há décadas, e uma função bem conhecida desses organismos é a sua capacidade de metabolizar ácidos orgânicos de cadeia curta a partir de fontes de açúcar de 5 e 6 átomos de carbono (Urdaneta, et al., 1995). Exemplos de tais ácidos incluem acético, butírico, fórmico, láctico e propiônico (Zalan, Hudacek, Stetina, Chumchalova, & Halasz, 2009).

[0123] MÉTODOS. Todas as técnicas foram realizadas assepticamente. Para cada ensaio de fermentação, foram escolhidas até quatro cepas individuais de Lactobacilli entre 15% -25% de estoques congeladores de glicerol/MRS. As mesmas foram posteriormente incubadas durante 1 a 2 dias a 37 ºC +/- 2 ºC. Após esta propagação inicial, todas as cepas foram combinadas em meio pasteurizado e água desionizada e incubadas durante 5 a 15 dias a 30 a 37 ºC +/- 2 ºC. As amostras resultantes foram resolvidas individualmente por HPLC, com uso de AO AC 986.13 (mod). A análise foi realizada com um detector de índice de refração, e os picos foram identificados por comparação com os padrões de ácido orgânico.

[0124] RESULTADOS. Os pequenos ácidos orgânicos são os produtos finais da fermentação de uma fonte de carbono (açúcar) escolhida por uma combinação escolhida de Lactobacilli. A seleção de uma determinada combinação de fonte de carbono e de microrganismos pode resultar na produção de três ácidos orgânicos principais, conforme indicado no quadro 14 e no quadro 15. TABELA 14. PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO Organismo único Principais picos 9 . não (ácido Ácido láctico e em meios de... PR + láctico ejácido acético melaço Ss acético) PCLLO1 2 Ácido láctico 7.000 ; 3,4,5 razões de e 21 Pediococo , ppm Ácido acético as o área 3:1:2 acidilactici 1.000 ppm PCEFO02 Ácido láctico 10.000 3,5 sem pico 4 ; , Enterococcus = ppm Ácido acético : razão 1:5 faecium 3.000 ppm PCR7 Pico 3 e >S&M | Ácido láctico 7.000 ; pico 4. Grande í 4 Lactobacillus À ppm Ácido acético Reuteri pico no tempo de 2.000 ppm retenção 20,93 ' PCPPO1l - Ácido láctico 9.000 , 3,4,5 razões de e 11 Pediococus z ppm Ácido acético ; área 3:1:2 pentosáceo <1.000 ppm

[0125] Vários lotes foram avaliados com uso do SOP

SCFAHLCOO01 interno da Pure Cultures para a pureza e impressão digital de ácidos graxos de cadeia curta. O primeiro lote 17014 que contém cepas Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceusYPVCQF e Enterococcus faecium PCEFOl, produzido para teste * 1 na Universidade do Texas A&M, foi analisado após seis meses e, além disso, foi aquecido a 90 ºC por 5 minutos. Foi estudado o segundo lote 18007, que contém cepas Lactobacillus fermentum PCLFOl, Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceus PCPPO0l1, Enterococcus faecium PCEFO02 com uso do mesmo SOP de avaliação para pureza. TABELA 15. PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO Produto de | Principais picos consórcio com 4lnão (ácido Ácido láctico e organismos em/láctico elácido acético meios com melaço acético) Áci lácti . 17014 3,4,5 razões de cido í áctico 3 000 : sos ; ppm Ácido acético Ensaio original área 1:1:1 <1.000 ppm ; - Ácido láctico 3.000 17014 aquecido a/3,4,5 razões de í 4 o , ppm Ácido acético 90 ºC área 1:1:1 <1.000 ppm es 2 - Ácido láctico 4.000 17014 verificação/3,4,5 razões de Ás ses , ppm Ácido acético de seis meses área 1:1:1

1.000 ppm 3,4,5 razões de Ácido láctico 4.000 18007 ; ppm Ácido acético área 1:1:1

2.000 ppm

[0126] Discussão. As técnicas descritas no presente documento fornecem um método rápido e confiável para a detecção e caracterização inicial de ácidos orgânicos produzidos em solução por fermentação.

Fornecimento de evidências de um processo de fermentação reprodutível e a capacidade de produzir uma formulação única e proprietária. A seleção cuidadosa de fontes de carbono e/ou microrganismos pode resultar em um ambiente de fermentação controlado para a produção de ácidos orgânicos específicos. Conforme discutido na Introdução, a seleção de ácidos orgânicos específicos é importante tanto para o ganho de peso como para a inibição de antipatógenos em aves domésticas.

EXEMPLO 16. TESTES DE ENUMERAÇÃO.

[0127] Baseado em Testes de Enumeração Microbiana da USP<2021> para Suplementos Dietéticos. Método de placa de contagem microbiana total.

[0128] As amostras são coletadas e enviadas para laboratórios de terceiros. As amostras são enviadas durante a noite com pacotes de gelo para garantir armazenamento a <10 ºC PREPARAÇÃO DE MEIOS: O ágar Lactobacilli MRS + 0,5 g/L-Cisteína é preparado por instruções na embalagem com a adição de L cisteína. Meio MRS + 0,5 g/L-cisteína é preparado por instruções na embalagem com a adição de L cisteína.

10,0 g de amostra é pesado assepticamente e diluído em 90 ml de peptona tamponada estéril. A amostra e o tampão são homogeneizados. 1 ml é removido e diluído com tampão de peptona de 99 ml para fazer diluição de -3 log. Continuar a diluir em série até que sejam feitas 3 diluições em torno da estimativa da contagem final de bactérias do ácido láctico. Inocular 0,1 ml por placa de ágar MRS +Cisteína. Espalhar com espalhador estéril. Permitir que o inóculo absorva no ágar. Colocar em câmara de anaeróbio e incubar a 37 ºC durante 48 a 72 horas. Após o tempo de incubação adequado, as colónias são contadas em placas de ágar com um rendimento-alvo entre 30 e 300 por placa. Os resultados são mostrados na Figura 6 e na Tabela 16. TABELA 16. ENUMERAÇÃO DE BACTÉRIAS DE ÁCIDO

LÁCTICO DE LOTES : 7,5 ces z Ensaio ! meses 8,3 meses [Especificação Data de e : Lote : LAB e final de fabrica io temperatu E sz origina temperatur produto 10 M ção 1 ra a ambiente jufc/ml ambiente 2,0 meses 4º , 1/2/201 300000 300.000 20000 >5,0x10a7 3,3 18001 oo 8 ufc/ml ufc/ml ufe/ml meses >1,0xL0AT7 Ensaio 3,9 meses|/ 5,4 meses [Especificação Lote EE LAB e e final de t ão origina |temperatur temperatur produto 10 M Ss 1 a ambiente a ambiente jJufc/ml 4,0 meses

272.000 |220.000.00 Z 29/03/2 1.100.000 >5,0xLOA7 4,5 18004 . 000 o 018 ufe/ml lJufe/ma ufe/ml meses >1,0xLOAT7 Ensaio /3,9 meses|5,4 meses Especificação D: Lote ao LAB e e final de + ão origina |temperatur temperatur produto 10 M ç 1 a ambiente a ambiente jufc/ml 1,5 meses

245. 19/05/2 5.000 1.200.000 |200.000 >5,0xLOA7 2,5 18006 .000 018 fec/ml ufce/ml ufce/ml meses ve >1,0xL0A7

Ensaio /1,23 meses|4,1 meses Especificação D: Lote ao LAB e e final de + ão origina |temperatur temperatur produto 10 M ç 1 a ambiente a ambiente jufc/ml

420.000 21? meses 25/08/2 81.000.000|13.000.000 |>5,0xLOA7 4,0 18007 .000 018 ufe/ml ufe/ml ufe/ml meses >1,0xLOA7 Data de ago ao meses Especificação final Lote * fabricaç dos de produto 10 M ão origina jtemperatur ufec/ml 1 a ambiente

1.100.0 181023FV 25/10/20 00.00 270000 -oo 1,8 meses >5,0x10a7 18 o 2,6 meses >1,0xL0A7 ufe/ml ufe/ml Média de 2,2 meses €& >5,0x10a7; Média de 4,83 meses & >1,0x10a7 Lote 18001 contém cepas Lactobacillus fermentum PCLFOl, Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1l, Pediococcus pentosaceus PCPPO01, Enterococcus faecium PCEFO1l Lote 18004 contém cepas Lactobacillus fermentum PCLFOl1, Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceus PCPPO01, Enterococcus faecium PCEFO1l Lote 18006 contém cepas Lactobacillus fermentum PCLFO1, Lactobacillus 15 reuteri PCRT7, Pediococcus acidilactici PCLLOl, Pediococcus pentosaceus PCPPO01, Enterococcus “faecium PCEFOl Lote 18007 contém cepas Lactobacillus fermentum PCLFOl1, Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1l, Pediococcus pentosaceus PCPPO01, Enterococcus faecium PCEFO1l Lote 181023 contém cepas Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceus PCPPO0l, Enterococcus faecium PCEFOl EXEMPLO 17. TESTE DE ESTABILIDADE A 90 “ºC.

[0129] O lote de formulação 17014 que contém cepas de Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceus PPPCOl e Enterococcus faecium PCEFO01, em meios de melaço, foi colocado em forno de aquecimento, a um ponto de ajuste de temperatura de 90 ºC. Aproximadamente 10 mis de amostra foram aquecidos a 90 ºC, em forno de aquecimento. Um pedaço de folha de alumínio foi colocado em cima do copo, enquanto estava sendo aquecido. Uma vez que a amostra atingiu 90 ºC, iniciou-se um temporizador. Aos 5 minutos, a amostra foi retirada do forno e colocada no frigorífico até que a temperatura fosse de aproximadamente 40 ºC. A amostra foi enviada para os Laboratórios Midi em Omaha, NE, onde os Ácidos Orgânicos foram avaliados com uso do ensaio AO AC 986.13 (mod).

[0130] Um método de HPLC que usa a unidade de HPLC da série 1100 da Agilent. Coluna de Análise de Ácido Orgânico Bio-Rad Coluna de Exclusão de Íons Aminex HPX-87H com fase móvel estacionária de 0,2 N H2SO4.

[0131] A cromatografia ácida orgânica foi avaliada quanto às similaridades em picos e áreas de cada pico presente entre uma amostra que não foi aquecida e uma amostra que foi aquecida a 90 ºC. Etapa l. Determinar que existem 9 picos presentes em ambos os cromatógrafos. Se houver um novo pico presente em qualquer uma das amostras, assegurar-se de que a sua área não seja > 1,5% de todas as áreas adicionadas em conjunto. ETAPA 2. Garantir que a área de picos 3,4 e 5 esteja na razão de 1:1:1. ETAPA 3. Verificar se as concentrações de ácido láctico e ácido acético em ambas as amostras são +/- 0,5% da concentração de cada amostra. Os resultados são mostrados na Figura 7.

EXEMPLO 18. TESTE DE ESTABILIDADE DE SEIS MESES.

[0132] O lote de formulação 17014 com cepas Lactobacillus reuteri PCR7, Lactobacillus fermentum PCLFO1, Pediococcus acidilactici PCLLOl, Pediococcus pentosaceus PPCOl e Enterococcus faecium PCEFOl em melaços foi armazenado à temperatura ambiente, aproximadamente 22 “ºC +/- 2 ºC. O mesmo foi armazenado em uma garrafa plástica de HDPE de 227 gramas (8 onças). Após seis meses de armazenamento, uma amostra foi enviada aos Laboratórios Midi em Omaha, NE, onde os Ácidos Orgânicos foram avaliados com uso do ensaio AO AC 986.13 (mod).

[0133] Um método de HPLC que usa a unidade de HPLC da série 1100 da Agilent. Coluna de Análise de Ácido Orgânico Bio-Rad Coluna de Exclusão de Íons Aminex HPX-87H com fase móvel estacionária de 0,2 N H2SO4.

[0134] A cromatografia ácida orgânica foi avaliada quanto a similaridades em picos e áreas de cada pico presentes entre uma amostra que foi avaliada 5 dias após lote, em relação a uma amostra de seis meses de idade e armazenada à temperatura ambiente. ETAPA 1. Determinar que existem 9 picos presentes em ambos os cromatógrafos. Se houver um novo pico presente na amostra de seis meses, certificar-se de que a sua área não seja > 1,5% de todas as áreas adicionadas em conjunto. ETAPA 2. Garantir que a área de picos 3,4 e 5 esteja na razão de 1:1:1. ETAPA 3. Verificar se as concentrações de ácido láctico e ácido acético na amostra de seis meses são +/- 0,5% da concentração da amostra original. Os resultados são mostrados na Figura 8.

EXEMPLO 19. TESTES DE ESTABILIDADE DE

SECAGEM

[0135] A formulação 17003 com cepas Lactobacillus reuteri PCR7, Lactobacillus fermentum PCLFO1 e Enterococcus faecium PCEFO0l em um meio de melaço foi enviada para Bluegrass Dairy para secagem por pulverização e secagem em tambor de rolos. Usar técnicas-padrão para a técnica de secagem. Foi necessário adicionar quase 85% p/p de maltodextrina para ambos os processos de secagem.

[0136] Após o processo de secagem, foram enviadas amostras para os Laboratórios Midi em Omaha, NE, onde os Ácidos Orgânicos foram avaliados com uso do ensaio AO AC

986.13 (mod).

[0137] Um método de HPLC que usa a unidade de HPLC da série 1100 da Agilent. Coluna de Análise de Ácido Orgânico Bio-Rad Coluna de Exclusão de Íons Aminex HPX-87H com fase móvel estacionária de 0,2 N H2S0O4.

[0138] A cromatografia de ácido orgânico foi avaliada quanto a semelhanças em picos e áreas de cada pico presente entre uma amostra que era o material de partida líquido contra pós secos tanto dos processos de secagem por pulverização quanto de tambor de rolos. ETAPA 1. Determinar que a concentração de ácido láctico no material seco está dentro da concentração teórica +/- 25%. Cálculo: Tomar o resultado do ácido láctico em% e multiplicar por 99 e dividir por 85 (a % de diluição com o veículo). Se o ácido acético for < 0,5% no líquido de origem, pode não estar presente no material seco, uma vez que é mais suscetível à degradação do calor e à volatização quando aquecido.

EXEMPLO 20. COMPARAÇÃO DE LOTES E CEPAS COMPONENTES.

[0139] os perfis de ácidos orgânicos para determinados lotes de múltiplas cepas foram determinados com uso dos métodos descritos acima no Exemplo 18. As comparações entre 4 composições e seus componentes são mostradas na Figura 10. A Figura 11 retrata um perfil de “impressão digital” de ácido orgânico para quatro composições. A Figura 12 retrata uma comparação de certas composições e cepas componentes. ET8 contém cepas Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceus PCPPO01, Enterococcus faecium PCEFO2. ET4 contém cepas Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Pediococcus pentosaceus PCPPO0l1, Enterococcus faecium PCEFO2.

REFERÊNCIAS

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[0140] Todas as referências citadas são expressamente incorporadas ao presente documento a título de referência, na sua totalidade, para sua revelação relevante.

[0141] A partir do exposto, será visto que esta invenção é bem adaptada para atingir todos os fins e objetivos apresentados acima, em conjunto com as outras vantagens que são óbvias e que são inerentes à invenção.

[0142] Uma vez que muitas modalidades possíveis da invenção sem podem ser produzidas, sem se afastar do escopo da mesma, deve-se entender que todas as questões apresentadas no presente documento OPT ou mostradas nos desenhos anexos devem ser interpretadas como ilustrativas, e não em um sentido limitante.

[0143] Embora as modalidades específicas tenham sido mostradas e discutidas para fins de ilustração, várias modificações podem, certamente, ser feitas, e a invenção não se limita às formas específicas ou disposições de partes e etapas descritas no presente documento, exceto na medida em que tais limitações estejam incluídas nas seguintes reivindicações.

Além disso, será entendido que certos recursos e subcombinações são de utilidade e podem ser empregados sem referência a outros recursos &e subcombinações.

Isso é contemplado por, e está dentro do escopo das reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada por compreender pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum, e metabólitos produzidos pelos pelo menos dois micróbios cultivados em combinação.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição é caracterizada por compreender pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium,y e os metabólitos produzidos pelos micróbios pelo menos dois micróbios cultivados em combinação.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição é caracterizada por compreender pelo menos um micróbio selecionado a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; e os metabólitos produzidos pelos micróbios cultivados em combinação.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição é caracterizada por compreender uma combinação de micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici; Lactobacillus reuteri,

Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição é caracterizada por compreender uma combinação de micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici Lactobacillus reuteri e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri e Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Pediococcus acidilactici e Pediococcus pentosaceus; Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri e Lactobacillus acidophilus; Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; e Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a composição é caracterizada por compreender Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLOI. Enterococcus faecium PCEFO2 e Pediococcus pentosaceus PCPPO01; ou compreende Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1l, Enterococcus faecium PCEFO02, Pediococcus pentosaceus PCPPO1 e Lactobacillus fermentum PCFO01; e os metabólitos produzidos pelos micróbios cultivados em combinação.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a composição é caracterizada por compreender adicionalmente uma ou mais espécies adicionais de microrganismos dos gêneros selecionados a partir de Pediococcus; Lactobacillus; Lactococcus; Bifidobacterium; Leuconostoc; Streptococcus e Bacillus.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição é caracterizada por compreender adicionalmente uma ou mais espécies de microrganismos selecionados a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus plantarum; Lacotobacillus rhamnosus; Lactobacillus fermentum; Lactobacillus fermentum bifidus; Lactobacillus brevis; Lactobacillus bulgaricus; Lactobacillus casei; Lactobacillus delbrueckii; Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus helveticus; Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus lactis; Lactobacillus lactis ssp. Cremoris; Lactobacillus lactis ssp. Lactis; Lactobacillus paracase; Lactococcus cremoris;

Lactococcus Zactis; Lactococcus lactis Sssp. Cremoris; Bifidobacterium infantis; Bifidobacterium lactis; Bifidobacterium animalis; Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides; Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris; Streptococcus bovis; Streptococcus salivarius; Streptococcus varius ssp. Thermophilus; Bacillus coagulans; Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus licheniformis; Bacillus subtilis; e Bacillus lentus.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 8, caracterizada pelos metabólitos compreenderem um ácido graxo de cadeia curta, de preferência, um ácido graxo de cadeia curta selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido succínico e combinações dos mesmos.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 9, caracterizada pelos metabólitos compreenderem um açúcar.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo açúcar ser selecionado do grupo que consiste em um açúcar de 4 átomos de carbono, um açúcar de 5 átomos de carbono, um açúcar de 6 átomos de carbono e combinações dos mesmos.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelos metabólitos compreenderem um oligossacarídeo.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo oligossacarídeo ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fruto- oligossacarídeo, um galacto-oligossacarídeo, um xilo- oligossacarídeo, um isomalto-oligossacarídeo, um oligossacarídeo de inulinay um mananoligossacarídeo e combinações dos mesmos.

14, Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelos metabólitos compreenderem uma bacteriocina.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela bacteriocina ser selecionada a partir do grupo que consiste em acidofilina, acidolina ou reutericina.

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelos metabólitos compreenderem metabólitos produzidos quando os micróbios são cultivados em um meio que compreende melaço.

17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelos metabólitos compreenderem metabólitos produzidos quando os micróbios são cultivados em meio que compreende melaço, prebiótico de inulina ou fos e glicerol.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada por uma porção dos micróbios que compreende a composição ser viável após armazenamento à temperatura ambiente por 2,2 meses >

50.000.000 ufc/ml, de preferência, por 4,8 meses >

10.000.000 ufce/ml.

19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada por um perfil de ácido orgânico da composição ser estável após o armazenamento, por seis meses, à temperatura ambiente.

20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada por um perfil de ácido orgânico da composição ser estável, quando a composição é aquecida a 90 ºC, por 6 minutos.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por um perfil de ácido orgânico da composição ser estável após secagem de rolos e/ou secagem por pulverização da composição

22. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou afecção em um animal que precise do mesmo sendo que o método é caracterizado por compreender administrar, ao animal, uma composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo animal ser um bovino, um suíno ou uma ave doméstica.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo animal ser uma vaca, um porco ou um frango.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo animal ser um animal canino, felino ou outro animal de companhia.

26. Método, de acordo com a reivindicação

22, caracterizado pelo animal ser um ser humano.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pela doença ou afecção ser uma doença gastrointestinal.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela doença ou afecção afetar a porção duodenal do trato gastrointestinal.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pela doença ou afecção afetar a porção jejunal do trato gastrointestinal.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pela doença ou afecção ser enterite necrótica, enterite de Salmonella ou mastite coccidiose.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pela doença ou afecção ser causada por um agente microbiano infeccioso.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pela doença ou afecção ser causada por uma espécie de Clostridium.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela doença ou afecção ser causada por Clostridium perfringens.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, caracterizado pela composição modular o microbioma gastrointestinal do animal.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, caracterizado pela composição modular a resposta imune gastrointestinal do animal.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, caracterizado pela composição modular a fosforilação de proteínas gastrointestinais do animal.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 36, caracterizado pela composição ser formulada em uma forma sólida ou líquida.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela composição ser preparada para ser fornecida ao animal como uma formulação em pó ou uma formulação peletizada.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela composição ser fornecida sob forma sólida e estar inclusa em uma quota de ração para animais a uma concentração de cerca de 0,25 kg/tonelada a cerca de 2,0 kg/tonelada de ração.

40. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela composição ser formulada em forma líquida e adicionada ao sistema de água potável do animal.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela composição ser dosada de cerca de 0,4 ml/frango/dia a cerca de 2,0 ml/frango/dia.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela composição ser dosada de cerca de 0,5 ml/porco/dia a cerca de 5,0 ml/porco/dia.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 42, caracterizado pela composição ser formulada para conter pelo menos uma contagem bacteriana de ácido láctico de cerca de 1,0X10”.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 42, caracterizado pela composição ser formulada para conter pelo menos uma contagem bacteriana de ácido láctico de cerca de 1,0X10º.

45. Composição caracterizada por ser produzida pelo método de fermentação da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em um meio que compreende melaço e, opcionalmente, glicerol e um prebiótico, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em inulina e fos.

46. Composição caracterizada por compreender pelo menos dois micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; e pelo menos um micróbio selecionado a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum; e os metabólitos produzidos pelos micróbios cultivados em combinação.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 46, sendo que a composição é caracterizada por compreender uma combinação de micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici,

Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus.

48. Composição, de acordo com a reivindicação 46, sendo que a composição é caracterizada por compreender uma combinação de micróbios selecionados a partir do grupo que consiste em Lactobacillus reuteri e Pediococcus acidilactici Lactobacillus reuteri e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri e Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Pediococcus acidilactici e Pediococcus pentosaceus; Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Enterococcus faecium; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus reuteri e Lactobacillus acidophilus; Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus reuteri, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus acidophilus; e Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus.

49. Composição, de acordo com a reivindicação 46, sendo que a composição é caracterizada por compreender Lactobacillus reuteri PCR7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Enterococcus faecium PCEFO2 e Pediococcus pentosaceus PCPPOl1l; ou compreender Lactobacillus reuteri PCRT7, Pediococcus acidilactici PCLLO1, Enterococcus faecium PCEFO02, Pediococcus pentosaceus PCPPOl e Lactobacillus fermentum PCFOl; e os metabólitos produzidos pelos micróbios cultivados em combinação.

50. Composição, de acordo com a reivindicação 46, sendo que a composição é caracterizada por compreender adicionalmente uma ou mais espécies adicionais de microrganismos dos gêneros selecionados a partir de Pediococcus; Lactobacillus; Lactococcus; Bifidobacterium; Leuconostoc; Streptococcus e Bacillus.

51. Composição, de acordo com a reivindicação 46, sendo que a composição é caracterizada por compreender adicionalmente uma ou mais espécies de microrganismos selecionados a partir do grupo que consiste em Pediococcus pentosaceus; Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus plantarum; Lacotobacillus rhamnosus; Lactobacillus fermentum; Lactobacillus bifidus; Lactobacillus brevis; Lactobacillus bulgaricus; Lactobacillus casei; Lactobacillus delbrueckii; Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus helveticus; Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus lactis; Lactobacillus lactis ssp. Cremoris; Lactobacillus lactis ssp. Lactis; Lactobacillus paracase; Lactococcus cremoris; Lactococcus Zactis; Lactococcus lactis ssp. Cremoris, Bifidobacterium infantis; Bifidobacterium lactis;

Bifidobacterium animalis; Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides; Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris; Streptococcus bovis; Streptococcus salivarius; Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus; Bacillus coagulans; Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus licheniformis; Bacillus subtilis; e Bacillus lentus.

52. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelos metabólitos compreenderem um ácido graxo de cadeia curta, de preferência, um ácido graxo de cadeia curta selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido succínico e combinações dos mesmos.

53. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelos metabólitos compreenderem um açúcar selecionado a partir do grupo que consiste em um açúcar de 4 átomos de carbono, um açúcar de átomos de carbono, um açúcar de 6 átomos de carbono e combinações dos mesmos.

54. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelos metabólitos compreenderem um oligossacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um fruto-oligossacarídeo, um galacto- oligossacarídeo, um xilo-oligossacarídeo, um isomalto- oligossacarídeo, um oligossacarídeo de inulina, um mananoligossacarídeo e combinações dos mesmos.

55. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelos metabólitos compreenderem uma bacteriocina selecionada a partir do grupo que consiste em acidofilina, acidolina ou reutericina.

56. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelos metabólitos compreenderem metabólitos produzidos quando os micróbios são cultivados em um meio que compreende melaço.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelos metabólitos compreenderem metabólitos produzidos quando os micróbios são cultivados em meio que compreende melaço, prebiótico de inulina ou fos e glicerol.

58. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada por uma porção dos micróbios que compreendem a composição ser viável após armazenamento à temperatura ambiente durante 2,2 meses >

50.000.000 ufc/ml, de preferência, durante 4,8 meses >

10.000.000 ufc/ml.

59. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada por um perfil de ácido orgânico da composição ser estável, quando a composição é armazenada de forma independente, durante seis meses, à temperatura ambiente, aquecida a 90 ºC, durante 6 minutos, ou seca em rolo e/ou seca por pulverização

60. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou afecção em um animal que necessite do mesmo,

sendo que o método é caracterizado por compreender a administração, ao animal, de uma composição, de acordo com a reivindicação 46.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo animal ser um animal bovino, um animal suíno, uma ave doméstica, um animal canino, um animal felino ou outro animal de companhia.

62. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo animal ser um ser humano.

63. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela doença ou afecção ser uma doença gastrointestinal.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pela doença ou afecção afetar a porção duodenal ou porção jejunal do trato gastrointestinal.

65. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela doença ou afecção ser enterite necrótica, enterite de Salmonella ou mastite coccidiose.

66. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela doença ou afecção ser causada por um agente microbiano infeccioso,

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pela doença ou afecção ser causada por uma espécie de Clostridium.

68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pela doença ou afecção ser causada por Clostridium perfringens.

69. Método, de acordo com a reivindicação

60, caracterizado pela composição modular o microbioma gastrointestinal do animal, a resposta imune gastrointestinal do animal e/ou a fosforilação das proteínas gastrointestinais do animal.

70. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela composição ser formulada em uma forma sólida ou líquida.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela composição ser preparada para ser fornecida ao animal como uma formulação em pó ou uma formulação peletizada.

72. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela composição ser fornecida sob forma sólida, e incluída em uma quota de ração para animais a uma concentração de cerca de 0,25 kg/tonelada a cerca de 2,0 kg/tonelada de ração.

73. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela composição ser formulada em forma líquida e adicionada ao sistema de água potável do animal.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pela composição ser dosada de cerca de 0,4 ml/frango/dia a cerca de 2,0 ml/frango/dia.

75. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pela composição ser dosada de cerca de 0,5 ml/porco/dia a cerca de 5,0 ml/porco/dia.

76. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela composição ser formulada para conter pelo menos uma contagem bacteriana de ácido láctico de cerca de 1,0X10º.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pela composição ser formulada para conter pelo menos uma contagem bacteriana de ácido láctico de cerca de 1,0X10º.

78. Composição caracterizada por ser produzida pelo método de fermentação da composição, de acordo com a reivindicação 1, em um meio que compreende melaço e, opcionalmente, glicerol e um prebiótico, selecionado, de preferência, a partir do grupo que consiste em inulina e fos.