BR112019024630A2

BR112019024630A2 - Ácido nucleico isolado, gene recombinante, célula hospedeira, planta, partes e sementes de plantas, planta ou célula vegetal ou parte de planta ou semente, métodos para produzir uma planta transgênica e para efetuar a expressão induzível e uso do ácido nucleico

Info

Publication number: BR112019024630A2
Application number: BR112019024630-4A
Authority: BR
Inventors: Cabre Lisa; Lisa CABRE; Ducerf Sophie; Sophie DUCERF; Peyrard Stephane; Stephane Peyrard; Sirven Catherine; Catherine Sirven; Pelissier Bernard; Bernard Pelissier
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC; Centre National De La Recherche Scientifique; Institut National Des Sciences Appliquees De Lyon; Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2020-06-23
Also published as: WO2018217474A1; AR111690A1; UY37733A; US11845944B2; US20200102569A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um promotor que é induzido pela ferrugem causada por fungos. Mais especificamente, o promotor da invenção é induzido pelo patógeno Phakopsora pachyrhizi, isto é, a ferrugem asiática da soja.

Description

“ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, GENE RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, PLANTA, PARTES E SEMENTES DE PLANTAS, PLANTA OU CÉLULA VEGETAL OU PARTE DE PLANTA OU SEMENTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA E PARA EFETUAR A EXPRESSÃO INDUZÍVEL E USO DO ÁCIDO NUCLEICO”

[001] A presente invenção refere-se a um promotor que é induzido pela ferrugem causada por fungos. Mais especificamente, o promotor da invenção é induzido pelo patógeno Phakopsora pachyrhizi, isto é, a ferrugem asiática da soja.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os patógenos vegetais, incluindo fungos, bactérias e vírus, são responsáveis por muitas doenças nas culturas cultivadas, o que pode levar a perdas significativas nas culturas, perdas essas geralmente consideradas entre 20 a 40% da produção esperada.

[003] As ferrugens são doenças vegetais causadas por patógenos basidiomicetos fúngicos da ordem Pucciniales. Eles são considerados um dos patógenos vegetais mais prejudiciais na agricultura. Eles constituem um grupo devastador de patógenos vegetais que causam enormes perdas em culturas de cereais e leguminosas em todo o mundo (Brown e Hovmøller, 2002, Science 297: 537-541). Sua importância foi destacada em 2012, quando a Puccinia spp. infectante de cereais foi indicada em terceiro lugar entre os dez principais patógenos fúngicos (Dean et al., 2012, Mol. Plant Path. 13: 414-430). Exemplos de doenças denominadas de ferrugem que são economicamente importantes incluem aquelas causadas por fungos das espécies Puccinia graminis no trigo, Puccinia striiformis no trigo, Uromyces phaseoli e Uromyces appendiculatus no feijão, ou Phakopsora pachyrhizi na soja.

[004] A ferrugem asiática da soja é a doença causada nas culturas de soja (Glycine max) pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Essa doença se expandiu dramaticamente nos últimos anos em muitas regiões geográficas nas quais as culturas de soja são cultivadas e está causando graves perdas nessas culturas (Hartman et al., 2011, Food Security 3: 5-17).

[005] Muitos genes foram identificados como induzidos em plantas de soja após infecção por Phakopsora pachyrhizi (Tremblay et al., 2010, Plant Science 179:183-193; Tremblay et al., 2011, Sequencing 2011: 1- 14).

[006] Dentre os genes induzidos nas plantas após a infecção por qualquer fungo, são conhecidos os genes da quitinase (Punja et al., 1993, J.

Nematology 24(4): 526-540). As quitinases são de fato consideradas parte do arsenal de defesa das plantas contra fungos, em particular como enzimas que possuem a capacidade de degradar a quitina, ou seja, o principal componente da parede celular dos fungos.

[007] As plantas geralmente têm muitos genes que codificam isoformas diferentes de quitinases, que foram agrupadas em quatro classes principais, a saber: quitinases de Classe I até quitinases de Classe IV (Punja et al., 1993, J. Nematology 24 (4): 526-540). Algumas dessas quitinases são expressas constitutivamente nas plantas, e algumas têm sua expressão induzida por vários fatores. Foi demonstrado que as quitinases induzidas se tornam expressas após a infecção por vários patógenos (vírus, bactérias, fungos). Também foi demonstrado que os genes vegetais que codificam as quitinases são induzidos pelo substrato das quitinases, a quitina, ou seja, o principal componente das paredes celulares dos fungos. Também foi demonstrado que esses genes são induzidos por vários fito-hormônios conhecidos por estarem envolvidos nas reações de defesa dos vegetais, como, por exemplo, etileno, ácido salicílico ou ácido jasmônico. Devido a essas diferentes fontes de indução, a indução das quitinases vegetais é geralmente considerada inespecífica (Punja et al., 1993, J. Nematology 24 (4): 526-540).

[008] Dentre muitos outros genes, também foi demonstrado que as quitinases são induzidas na soja durante a infecção por Phakopsora pachyrhizi. Em particular, Tremblay et al. relataram que vários genes que codificam proteínas quitinase são regulados positivamente durante a infecção, incluindo uma quitinase Classe IV, e esses autores enfatizaram ainda em outros estudos que esses genes também são induzidos após a síntese de ácido jasmônico (Tremblay et al., 2010, Plant Science 179 : 183-193).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[009] Os presentes inventores identificaram um promotor de um gene da quitinase de soja que, de forma surpreendente, é induzido por ferrugens fúngicas, mais especificamente pela ferrugem asiática da soja, Phakopsora pachyrhizi.

[010] Ao contrário de todos os genes da quitinase vegetal conhecidos, o promotor do gene da quitinase de acordo com a invenção não é induzido pela quitina ou pelos fito-hormônios usuais conhecidos por estarem envolvidos na defesa vegetal. Ele também não é induzido por ferimentos e também parece não ser induzido por outros fungos. O promotor de acordo com a invenção parece ser especificamente induzido por ferrugens fúngicas, mais especificamente pela ferrugem asiática da soja, Phakopsora pachyrhizi.

[011] Em um aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende atividade promotora induzida pela ferrugem causada por fungos (ferrugem fúngica) selecionado a partir do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional do mesmo; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica possuindo cerca de pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento funcional do mesmo; e (c) o ácido nucleico de um promotor funcional que hibridiza sob condições estringentes com a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional do mesmo.

[012] A SEQ ID NO: 1 representa a sequência longa de cerca de 3,5 kpb do promotor a montante do início da tradução de um gene que codifica uma enzima quitinase na soja, Glycine max.

[013] A SEQ ID NO: 1 é um fragmento de promotor preferido na presente invenção. Entretanto, fragmentos funcionais alternativos podem ser utilizados. Tal fragmento funcional seria preferencialmente maior que 1 kpb, maior que 2 kpb ou maior que 3 kpb de nucleotídeos consecutivos a montante do sítio de início da transcrição e promoveria a transcrição de um ácido nucleico operacionalmente ligado preferencialmente de maneira induzível por ferrugem fúngica. Assim, um fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 3400 até o nucleotídeo na posição 3454.

Alternativamente, um fragmento do promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 3300 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento do promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 3200 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento do promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 3100 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 3000 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 2500 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 2000 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 1500 até o nucleotídeo na posição 3454. Outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 1000 até o nucleotídeo na posição 3454. Um fragmento de promotor adicional de acordo com a invenção pode compreender uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 a partir do nucleotídeo na posição 500 até o nucleotídeo na posição 3454.

[014] O ácido nucleico compreendendo a atividade promotora induzível por ferrugem fúngica de acordo com a invenção também pode estar compreendido em uma molécula de DNA maior.

[015] De acordo com a invenção, o ácido nucleico promotor possui atividade induzível por ferrugem fúngica. Assim, “atividade promotora induzível por ferrugem fúngica” significa que a atividade do promotor é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes ou pelo menos 20 vezes ou até pelo menos 100 vezes maior quando a planta ou parte da planta é submetida a infecção por ferrugem fúngica do que em uma condição controle. Em outras palavras, na atividade do promotor induzível por ferrugem fúngica, a transcrição do ácido nucleico operacionalmente ligada ao promotor da invenção é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 100 vezes maior quando a planta ou parte da planta é submetida a uma infecção por ferrugem fúngica do que na condição de controle. Em outras palavras, o promotor induzível por ferrugem fúngica controla a expressão do ácido nucleico operacionalmente ligado a ele.

[016] De acordo com um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico do promotor de acordo com a invenção também possui atividade promotora específica para a ferrugem fúngica (ferrugem fúngica-específica). A expressão “atividade promotora ferrugem fúngica-específica” designa que a atividade do promotor é induzida especificamente por uma ferrugem fúngica e por nenhum outro elemento ou grupo de fungos.

[017] De acordo com outro exemplo de realização, a atividade do ácido nucleico promotor induzível por ferrugem fúngica de acordo com a invenção é uma indutibilidade local no ponto de infecção. De preferência, essa indutibilidade local não tem efeito sistêmico, ou seja, não se espalha pela planta além do ponto de infecção da ferrugem fúngica.

[018] A “ferrugem fúngica” capaz de induzir, preferencialmente de maneira específica, o promotor de acordo com a invenção é preferencialmente causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi.

[019] Conforme utilizado na presente invenção, “promotor” ou “promotor funcional” significa uma região da sequência de DNA que é essencial para o início da transcrição do DNA, resultando na geração de uma molécula de RNA que é complementar ao DNA transcrito; essa região também pode ser denominada de “região reguladora 5' ”. Os promotores geralmente estão localizados a montante da sequência codificante a ser transcrita e têm regiões que atuam como sítios de ligação à RNA polimerase II e outras proteínas, como fatores de transcrição (fatores de proteína transativadores que regulam a transcrição) para iniciar a transcrição de um gene operacionalmente ligado. Os próprios promotores podem conter subelementos (ou seja, motivos de promotor), como elementos cis ou domínios acentuadores que regulam a transcrição de genes operacionalmente ligados. Os promotores da presente invenção podem ser alterados para conter “DNA acentuador” (enhancer) para auxiliar na elevação da expressão gênica. Como é conhecido no estado da técnica, certos elementos de DNA podem ser utilizados para melhorar a transcrição do DNA. Estes acentuadores/potenciadores (enhancers) são frequentemente encontrados a 5' para o início da transcrição em um promotor que funciona em células eucarióticas, mas podem frequentemente ser inseridos a montante (5') ou a jusante (3') da sequência codificante. Em alguns casos, esses elementos de DNA acentuador 5' são íntrons. Dentre os íntrons úteis como DNA acentuador (enhancer) estão os íntrons 5' do gene da actina 1 de arroz (vide a patente US 5.641.876), o gene da actina 2 de arroz, o gene da álcool desidrogenase de milho, o gene da proteína 70 de choque térmico do milho (vide a patente US 5.593.874), o milho o gene shrunken 1 de milho, o gene 1 sensível à luz de Solanum tuberosum, o íntron histona 4 de Arabidopsis e o gene da proteína 70 de choque térmico de Petunia hybrida (vide a patente US 5.659.122). Um elemento acentuador preferido de acordo com a invenção é o ativador da transcrição do vírus etch do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed (1990, J. Virol. 64(4): 1590-7). Assim, tal como contemplado na presente invenção, um promotor ou região promotora inclui variações de promotores derivados pela inserção ou exclusão de regiões reguladoras ao submeter o promotor à mutagênese aleatória ou sítio-dirigida, etc. A atividade ou força de um promotor pode ser medida em termos de quantidades de RNA que ele produz, ou a quantidade do acúmulo de proteínas em uma célula ou tecido, em relação a um promotor cuja atividade transcricional foi previamente avaliada.

[020] Um “fragmento funcional” de um promotor de acordo com a invenção deve ter pelo menos a funcionalidade de um promotor e a funcionalidade de ser especificamente induzida por uma ferrugem fúngica. A atividade do promotor para um fragmento de promotor funcional sob infecção por ferrugem fúngica pode ser determinada pelos técnicos versados na técnica, por exemplo, usando a análise de acúmulo de RNA produzido a partir do ácido nucleico que está operacionalmente ligado ao promotor conforme descrito presente invenção, de modo que o ácido nucleico que está operacionalmente ligado ao promotor pode ser o ácido nucleico que está naturalmente ligado ao promotor, ou seja, o gene endógeno cuja expressão é controlada pelo promotor.

[021] O acúmulo de RNA, ou níveis de RNA, tal como o mRNA, podem ser medidos em um único momento ou em vários momentos e, dessa forma, o aumento em vezes pode ser um aumento médio ou um valor extrapolado derivado dos valores medidos experimentalmente. Como é uma comparação de níveis, qualquer método que mede os níveis de mRNA pode ser utilizado. Em um aspecto preferido, o tecido ou órgãos comparados são tecidos foliares.

[022] A capacidade de expressão induzida por ferrugem fúngica do fragmento identificado ou gerado do promotor também pode ser convenientemente testada pela ligação operacional de tais moléculas de DNA com outra molécula de DNA que codifica um marcador de fácil marcação, tal como, por exemplo, um gene da beta-glucuronidase (GUS), introduzindo um gene recombinante em uma planta e analisando o padrão de expressão do marcador na planta, por exemplo, nas folhas, em comparação com o padrão de expressão do marcador em uma planta de controle. Outros candidatos para um marcador (ou um gene repórter) são; cloranfenicol acetil transferase (CAT) e proteínas com propriedades fluorescentes, como a proteína verde fluorescente (GFP) de Aequora victoria. Para definir uma região promotora mínima, um segmento de DNA representando a região promotora é removido da região 5' do gene de interesse e é operacionalmente ligado à sequência codificante de um gene marcador (repórter) por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas no estado da técnica. O gene repórter está ligado a jusante do promotor, de modo que os transcritos iniciados no promotor prossigam através do gene repórter. Os genes repórter geralmente codificam proteínas que são facilmente medidas, incluindo, entre outras, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), beta-glucuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), beta- galactosidase (beta-GAL) e luciferase. O cassete de expressão contendo o gene repórter sob o controle do promotor pode ser introduzido em um tipo de célula apropriado por técnicas de transfecção bem conhecidas no estado da técnica. Para testar a proteína repórter, são preparados lisados celulares e são realizados ensaios apropriados, que são bem conhecidos no estado técnica, para a proteína repórter. O nível de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima produzida, que, por sua vez, revela o nível de expressão e a funcionalidade específica do promotor induzível por ferrugem fúngica ou fragmento do promotor de interesse. Este nível de expressão também pode ser comparado com outros promotores para determinar a força relativa do promotor em estudo. Uma vez confirmada a atividade e a funcionalidade, análises adicionais de mutação e/ou deleção podem ser empregadas para determinar a região e/ou sequências mínimas necessárias para iniciar a transcrição. Assim, as sequências podem ser deletadas na extremidade 5' da região promotora e/ou na extremidade 3' da região promotora, e introduzidas substituições nucleotídicas. Essas construções são novamente introduzidas nas células e sua atividade e/ou funcionalidade são determinadas.

[023] Além disso, deve ficar claro que promotores equivalentes, ou seja, promotores induzíveis por ferrugem, ortólogos, podem ser isolados de outras plantas que não a Glycine max, que também são conhecidas por serem hospedeiras do patógeno Phakopsora pachyrhizi, tal como, por exemplo, outras plantas da família Fabaceae, como, por exemplo, Cajanus cajan, Lupinus sp., Phaseolus vulgaris ou Vigna unquiculata. Para este fim, fragmentos de promotores ortólogos podem ser isolados de outras plantas usando a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento funcional possuindo pelo menos 600 nucleotídeos consecutivos da mesma como sonda e identificando as sequências nucleotídicas dessas outras plantas que hibridizam nas condições de hibridação descritas na presente invenção. A título de exemplo, um promotor da invenção pode ser usado para rastrear uma biblioteca genômica de uma cultura ou planta de interesse para isolar as sequências promotoras correspondentes de acordo com técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Assim, uma sequência promotora da invenção pode ser usada como uma sonda para hibridação com uma biblioteca genômica em condições de estringência média a alta. Como alternativa, os promotores equivalentes podem ser isolados utilizando as sequências codificantes dos genes controlados pelos promotores das SEQ ID NO: 1, ou seja, quitinases, para rastrear uma biblioteca genômica (por exemplo, por hibridação ou in silico) de uma cultura de interesse. Quando é obtida uma identidade suficiente entre as sequências codificantes (por exemplo, mais de 95% de identidade), as regiões promotoras podem ser isoladas a montante dos genes ortólogos.

[024] São adequados para a invenção os ácidos nucleicos que compreendem a atividade do promotor induzível por ferrugem fúngica que compreendem uma sequência nucleotídica que possui pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com os promotores descritos na presente invenção e regiões do promotor ou fragmentos funcionais do mesmo e são também referidos como variantes. O termo “variante” em relação à sequência nucleotídica reguladora da transcrição de SEQ ID NO: 1 da invenção pretende designar sequências substancialmente idênticas. As variantes alélicas de ocorrência natural tal como estas podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas da biologia molecular, como, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, tal como descrito anteriormente na presente invenção. As sequências nucleotídicas variantes também incluem sequências nucleotídicas derivadas sinteticamente, tal como àquelas geradas, por exemplo, usando a mutagênese sítio-dirigida na SEQ ID NO: 1. De modo geral, as variantes da sequência nucleotídica da invenção terão geralmente pelo menos 95%, ou seja, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência nucleotídica com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou um fragmento funcional da mesma. Os derivados das moléculas de DNA divulgadas na presente invenção podem incluir, mas não estão limitados a, deleções de sequência, mutações pontuais ou múltiplas, alterações em um determinado sítio de restrição enzimática, adição de elementos funcionais ou outros meios de modificação molecular que podem melhorar ou caso contrário, alterar a expressão do promotor. As técnicas para obter esses derivados são bem conhecidas no estado da técnica (veja, por exemplo, J.F. Sambrook, D.W. Russell e N. Irwin (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edição; Volumes 1, 2 e 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Por exemplo, um versado na técnica pode delimitar os elementos funcionais dentro dos promotores divulgados no presente documento e excluir quaisquer elementos não essenciais. Os elementos funcionais podem ser modificados ou combinados para aumentar a utilidade ou expressão das sequências da invenção para qualquer aplicação específica. Os especialistas no assunto estão familiarizados com os materiais de recursos padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos etc.), bem como a geração de organismos recombinantes e a triagem e isolamento de moléculas de DNA.

[025] De acordo com a presente invenção, o termo “identidade de sequência” deve ser entendido como o número de nucleotídeos de um polinucleotídeo que são idênticos aos nucleotídeos de outro polinucleotídeo, expresso como uma porcentagem do número total de nucleotídeos de um comprimento considerado desses polinucleotídeos. A identidade de sequência é preferencialmente determinada comparando as sequências dos polinucleotídeos da presente invenção com outros polinucleotídeos usando programas de computador apropriados para alinhamento de sequência com base em algoritmos de alinhamento global ou local.

[026] Se os polinucleotídeos que são comparados têm comprimentos diferentes, a porcentagem de identidade de sequência deve ser determinada de modo que o número de nucleotídeos da sequência mais curta que são comuns à sequência mais longa, determine o comprimento sobre o qual a porcentagem de identidade de sequência é determinada. Esses programas de computador geralmente utilizam o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências ao longo de todo o comprimento, maximizando o número de correspondências e minimizando o número de lacunas (gaps). Geralmente, são utilizados os parâmetros padrão (pré-carregados), com uma penalidade por criação de lacunas (gap creation penalty) = 10 e penalidade por extensão de lacunas (gap extension penalty) = 0,5 (ambos para alinhamentos de nucleotídeos e proteínas). Preferencialmente, a identidade é determinada por meio do programa de computador ClustalW, que é bem conhecida e está disponível publicamente (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22, 4673-4680). O ClustalW está disponível ao público em http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalW2/index.html.

[027] Preferencialmente, a versão 2.1 do programa ClustalW é utilizada para determinar a identidade entre as sequências nucleotídicas das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo, e sequências nucleotídicas de outras moléculas de ácido nucleico. Ao fazê-lo, os seguintes parâmetros devem ser definidos: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted.

[028] De acordo com a presente invenção, o termo “hibridização sob condições estringentes” refere-se a condições sob as quais um polinucleotídeo hibridiza (geralmente projetado como uma sonda) com outro com um grau detectavelmente maior que outros polinucleotídeos (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). As condições estringentes dependem da sequência e diferem de acordo com as circunstâncias. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, os polinucleotídeos que são 100% idênticos na sequência à sonda polinucleotídica podem ser identificados (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum não pareamento nas sequências (mismatching), de modo que polinucleotídeos com graus menores de identidade de sequência sejam detectados (sondagem heteróloga).

Geralmente, uma sonda de polinucleotídeo é menor do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente menor do que 500 nucleotídeos de comprimento.

[029] De modo geral, as condições estringentes são selecionadas para estarem cerca de 5ºC mais baixas do que o ponto de fusão térmico (Tm) para sequências específicas na força iônica e pH definidos. O T m é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50% de uma sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. Normalmente, serão escolhidas condições estringentes nas quais a concentração de sal é de cerca de 0,02 molar em pH 7 e a temperatura é de pelo menos 60ºC. A diminuição da concentração de sal e/ou o aumento da temperatura aumenta a estringência.

As condições estringentes para hibridizações de RNA-DNA (Northern blots usando uma sonda de, por exemplo, 100 nt) são, por exemplo, aquelas que incluem pelo menos uma lavagem em SSC 0,2 X a 63ºC por 20 min, ou condições equivalentes. As condições estringentes para hibridizações de DNA- DNA (Southern blots usando uma sonda de, por exemplo, 100 nt) são, por exemplo, aquelas que incluem pelo menos uma lavagem (normalmente 2) em

SSC 0,2 X em uma temperatura de 50, normalmente cerca de 55ºC, por 20 min, ou condições equivalentes. Veja também, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; e nos volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EUA.

[030] Um “fragmento funcional” de um ácido nucleico compreendendo a atividade promotora induzida por ferrugem fúngica denota um ácido nucleico compreendendo um trecho de sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 ou do ácido nucleico possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência da SEQ ID NO: 1, que é de pelo menos 50 pb e ainda exerce a função desejada, ou seja, que possui atividade promotora induzível por ferrugem fúngica. Os ensaios para determinar a atividade do promotor induzível por ferrugem são fornecidos na presente invenção.

Preferencialmente, um fragmento funcional do promotor induzível por ferrugem fúngica contém os motivos promotores conservados, como, por exemplo, motivos promotores conservados, conforme descrito na DoOP (doop.abc.hu, bases de dados de Promotores Ortólogos, Barta E. et al. (2005) Nucleic Acids Research Vol. 33, D86-D90). Um fragmento funcional pode ser um fragmento de pelo menos cerca de 50 pb, pelo menos cerca de 100 pb, pelo menos cerca de 200 pb, pelo menos cerca de 300 pb, pelo menos cerca de 400 pb, pelo menos cerca de 500 pb do sítio de inicio da transcrição; ou de pelo menos cerca de 1000 pb, pelo menos cerca de 1500 pb, pelo menos cerca de 2000 pb, pelo menos cerca de 2500 pb, pelo menos cerca de 3000 pb do sítio de início da tradução.

[031] Um fragmento funcional de acordo com a invenção também pode ser uma combinação de fragmento funcional, ou seja, um fragmento funcional pode compreender dois ou mais fragmentos de ácido nucleico do promotor de acordo com a invenção. Por exemplo, um fragmento funcional pode compreender, alternativamente, consistir de, estar operacionalmente ligado, a um fragmento do ácido nucleico promotor de acordo com a invenção com a funcionalidade de ativação da transcrição e outro fragmento de ácido nucleico promotor de acordo com a invenção possuindo a funcionalidade de indução por ferrugem fúngica.

[032] Os promotores de acordo com a invenção podem ser adicionalmente utilizados para criar promotores híbridos, ou seja, promotores contendo (partes de) um ou mais promotores da presente invenção e (partes de) outro promotor que pode ser identificado ou conhecido recentemente no estado da técnica. Tais promotores híbridos podem ter especificidade tecidual ou nível de expressão otimizados.

[033] Um exemplo de realização adicional fornece um gene recombinante compreendendo o ácido nucleico que possui atividade promotora induzida por ferrugem descrita acima, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica um produto da expressão de interesse e, opcionalmente, uma terminação de transcrição e sequência de poliadenilação, de preferência uma terminação de transcrição e região de poliadenilação funcional em células vegetais.

[034] O termo “gene recombinante” refere-se a qualquer gene artificial que contenha: a) sequências de DNA, incluindo sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas na natureza, ou b) sequências que codificam partes de proteínas que não estão naturalmente ligadas, ou c) partes de promotores que não estão naturalmente associados.

Consequentemente um gene recombinante pode incluir sequências regulatórias e sequências codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou compreende sequências regulatórias e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza.

[035] O termo “heterólogo” refere-se à relação entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que são derivadas de diferentes fontes.

Por exemplo, um promotor é heterólogo em relação a uma região de DNA ao qual está operacionalmente ligado, tal como uma sequência codificante, se essa combinação normalmente não for encontrada na natureza. Além disso, uma sequência específica pode ser “heteróloga” em relação a uma célula ou organismo na qual está inserida (ou seja, não ocorre naturalmente nessa célula ou organismo específico). Por exemplo, o gene recombinante divulgado na presente invenção é um ácido nucleico heterólogo.

[036] O termo “operacionalmente ligado” significa que os elementos genéticos do gene recombinante estão ligados entre si de tal maneira que sua função é coordenada e permite a expressão da sequência codificante. A título de exemplo, um promotor está funcionalmente ligado a uma sequência codificante quando ele é capaz de garantir a expressão da referida sequência codificante, ou seja, sua transcrição para uma molécula de RNA, seja um mRNA (que codifica uma proteína) ou qualquer outro tipo de RNA (por exemplo, um dsRNA). A construção de um gene recombinante de acordo com a presente invenção e a montagem de seus diversos elementos podem ser realizadas utilizando técnicas bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto, em especial àquelas descritas em Sambrook et al. (2001, “Molecular Cloning : A Laboratory Manual”, Terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). “Funcionalmente ligado” é um termo equivalente.

[037] O termo “produto da expressão” refere-se a um produto de transcrição. O referido produto da expressão pode ser o RNA transcrito. Deve- se compreender que o RNA que é produzido é um RNA biologicamente ativo.

O referido produto da expressão também pode ser um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, quando o referido RNA biologicamente ativo é um mRNA e a referida proteína é produzida pela tradução do referido mRNA.

[038] Como exemplo, o promotor de acordo com a invenção pode ser usado para direcionar a expressão de um produto da expressão que transmita a morte celular, como por exemplo, o uso combinado das enzimas barnase e barstar. Preferencialmente, o promotor de acordo com a invenção é utilizado para conduzir a expressão da enzima barnase em plantas transformadas com um segundo gene recombinante compreendendo um promotor constitutivo operacionalmente ligado à proteína barstar.

[039] Alternativamente, o ácido nucleico heterólogo, operacionalmente ligado aos promotores da invenção, também pode codificar um RNA capaz de modular a expressão de um gene. O referido RNA capaz de modular a expressão de um gene pode ser um RNA que reduz a expressão de um gene. O referido RNA pode reduzir a expressão de um gene, por exemplo, através do mecanismo de silenciamento gênico mediado por RNA.

[040] O referido RNA capaz de modular a expressão de um gene pode ser um RNA de silenciamento que regula negativamente a expressão de um gene alvo. Conforme utilizado na presente invenção, “RNA de silenciamento” ou “molécula de RNA de silenciamento” refere-se a qualquer molécula de RNA, que após a introdução em uma célula vegetal, reduz a expressão de um gene alvo. Esse RNA de silenciamento pode, por exemplo, ser o chamado de “RNA antisense”, em que a molécula de RNA compreende uma sequência de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com 95% de identidade de sequência com o complemento da sequência de ácido nucleico alvo, preferencialmente a sequência codificadora do gene alvo. Entretanto, o RNA antisense também pode ser direcionado para sequências reguladoras de genes alvo, incluindo as sequências promotoras e os sinais de terminação da transcrição e poliadenilação. O RNA de silenciamento pode inclui ainda o chamado “RNA sense”, em que a molécula de RNA compreende uma sequência de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com 95% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico alvo.

Outro RNA de silenciamento pode ser “RNA não poliadenilado” compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com 95% de identidade de sequência com o complemento da sequência de ácido nucleico alvo, tal como descrito no documento WO01/12824 ou na patente US 6.423.885 (ambos documentos incorporados ao presente como referência). Outro tipo de RNA de silenciamento é uma molécula de RNA, conforme descrito no documento

WO03/076619 (incorporado ao presente como referência) compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com 95% de identidade de sequência com a sequência do ácido nucleico alvo ou seu complemento, e compreendendo ainda uma grande região em fita dupla, conforme descrito no documento WO03/076619 (incluindo regiões em grande parte de fita dupla,

compreendendo um sinal de localização nuclear de um viroide do tipo viroide do tubérculo afilado da batata ou compreendendo repetições de trinucleotídeos

CUG). O RNA de silenciamento também pode ser um RNA de fita dupla,

compreendendo uma fita sense e antisense, conforme definido na presente invenção, em que as fitas sense e antisense são capazes de parear uma base entre si para formar uma região de RNA de fita dupla (preferencialmente, os referidos pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos do RNA sense e antisense são complementares entre si). A região sense e antisense também pode estar presente dentro de uma molécula de RNA, de modo que um RNA em grampo

(hairpin) (hpRNA) pode ser formado quando a região sense e antisense formam uma região de RNA de fita dupla.

O hpRNA é bem conhecido no estado da técnica (vide, por exemplo, o documento WO99/53050, incorporado ao presente como referência). O hpRNA pode ser classificado como hpRNA longo, possuindo regiões longas, sense e antisense que podem ser amplamente complementares, mas não precisam ser totalmente complementares (geralmente maiores que cerca de 200 pb, variando entre 200-1000 pb). O hpRNA também pode ser bastante pequeno, variando em tamanho de cerca de 30 a cerca de 42 pb, mas não muito maior que 94 pb (vide o documento WO04/073390, incorporado ao presente como referência).

O RNA de silenciamento também pode ser moléculas artificiais de micro-RNA, conforme descrito, por exemplo, nos documentos WO2005/052170, WO2005/047505 ou US 2005/0144667 ou ta-siRNAs, conforme descrito nos documentos WO2006/074400 (todos os documentos são incorporados ao presente por referência). O referido RNA capaz de modular a expressão de um gene também pode ser um RNA ribozima.

[041] O referido RNA capaz de modular a expressão de um gene pode modular, de preferência sub-regular, a expressão de outros genes (ou seja, de genes alvo), por exemplo, presentes em um patógeno que infecta a planta transgênica.

[042] A sequência de ácido nucleico heteróloga aos promotores de acordo com a invenção pode geralmente ser qualquer sequência de ácido nucleico que aumente, altere (por exemplo, em um órgão diferente) ou reduza o nível de transcrição de um gene para o qual essa modulação de expressão é desejada. A sequência de ácido nucleico pode, por exemplo, codificar uma proteína de interesse.

[043] A expressão “região de terminação da transcrição e de poliadenilação”, conforme utilizada na presente invenção, designa uma sequência que controla a clivagem do RNA nascente, depois disso uma cauda de poli(A) é adicionada na extremidade resultante do RNA 3', funcional nas células vegetais. Os sinais de terminação da transcrição e poliadenilação funcionais nas células vegetais incluem, mas não se limitam a, 3'nos, 3'35S, 3'his e 3'g7.

[044] Qualquer um dos promotores e sequências heterólogas de ácido nucleico descritas acima pode ser fornecido em um vetor recombinante.

Um vetor recombinante compreende tipicamente, na orientação 5' para 3': um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico. O vetor recombinante pode compreender ainda um terminador de transcrição 3', um sinal de poliadenilação 3', outras sequências de ácidos nucleicos não traduzidas, sequências de ácidos nucleicos de trânsito e de direcionamento, marcadores selecionáveis, acentuadores (enhancers) e operadores, conforme desejado. A expressão “5' UTR” refere-se à região não traduzida do DNA a montante, ou 5', da região codificante de um gene e “3 'UTR” refere-se à região não traduzida do DNA a jusante, ou 3', da região codificante de um gene. Os meios para a preparação de vetores recombinantes são bem conhecidos no estado da técnica. Métodos para produzir vetores recombinantes particularmente adequados para a transformação de plantas estão descritos nas patentes US 4.971.908, US

4.940.835, US 4.769.061 e US 4.757.011. Os vetores típicos úteis para a expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos no estado da técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens.

[045] O vetor recombinante também pode conter uma ou mais sequências adicionais de ácidos nucleicos. Estas sequências adicionais de ácido nucleico podem geralmente ser quaisquer sequências adequadas para uso em um vetor recombinante. Tais sequências de ácidos nucleicos incluem, sem limitação, qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos e suas formas modificadas descritas acima. As sequências estruturais adicionais de ácido nucleico também podem estar operacionalmente ligadas a qualquer um dos promotores descritos acima. Uma ou mais sequências de ácidos nucleicos estruturais podem ser operativamente ligadas a promotores separados.

Alternativamente, as sequências estruturais de ácidos nucleicos podem estar operacionalmente ligadas a um único promotor (isto é, um único operon).

[046] Outros exemplos de realização fornecem uma célula hospedeira, tal como uma célula de E. coli, uma célula de Agrobacterium, uma célula de levedura ou uma célula vegetal, compreendendo o ácido nucleico isolado de acordo com a invenção ou os genes recombinantes de acordo com a invenção.

[047] Outras sequências de ácidos nucleicos também podem ser introduzidas na célula hospedeira juntamente com o promotor e sequência de ácido nucleico estrutural, por exemplo, também em ligação com o vetor da invenção. Essas outras sequências podem incluir terminadores da transcrição 3', sinais de poliadenilação 3', outras sequências de ácidos nucleicos não traduzidas, sequências de trânsito ou de direcionamento, marcadores selecionáveis, acentuadores (enhancers) e operadores. As sequências de ácidos nucleicos preferidas da presente invenção, incluindo vetores recombinantes, sequências estruturais de ácidos nucleicos, promotores e outros elementos reguladores, estão descritos acima.

[048] Em outros exemplos de realização, é fornecida uma planta compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos ou genes recombinantes de acordo com a invenção. Outro exemplo de realização fornece partes da planta e sementes que podem ser obtidas a partir da planta de acordo com a invenção. Estas partes e sementes de plantas compreendem os genes recombinantes descritos acima. Em outro exemplo de realização, as plantas, partes de plantas ou sementes de acordo com a invenção são plantas, partes de plantas ou sementes de algodão, soja ou trigo.

[049] A célula vegetal ou planta compreendendo qualquer um dos genes recombinantes de acordo com a invenção pode ser uma célula vegetal ou uma planta compreendendo um gene recombinante a partir do qual o promotor ou a sequência heteróloga de ácidos nucleicos operacionalmente ligada ao referido promotor são heterólogas em relação à célula vegetal.

Tais células vegetais ou plantas podem ser plantas transgênicas nas quais o gene recombinante é introduzido por transformação.

Alternativamente, a célula vegetal da planta pode compreender o promotor de acordo com a invenção derivado da mesma espécie operacionalmente ligada a um ácido nucleico que também é derivado da mesma espécie, isto é, nem o promotor nem o ácido nucleico operacionalmente ligado são heterólogos em relação à célula vegetal,

mas o promotor está operacionalmente ligado a um ácido nucleico ao qual não está ligado na natureza.

Um gene recombinante pode ser introduzido na planta ou na célula vegetal por transformação, de modo que tanto o promotor quanto o nucleotídeo operacionalmente ligado estejam em uma posição no genoma na qual não ocorrem naturalmente.

Alternativamente, o promotor de acordo com a invenção pode ser integrado de maneira direcionada no genoma da planta ou célula vegetal a montante de um ácido nucleico endógeno que codifica um produto da expressão de interesse, ou seja, para modular o padrão de expressão de um gene endógeno.

O promotor que é integrado de maneira direcionada a montante de um ácido nucleico endógeno pode ser integrado em células de uma espécie vegetal da qual é originalmente derivado, ou em células de espécies vegetais heterólogas.

Alternativamente, um ácido nucleico heterólogo pode ser integrado de maneira direcionada ao genoma vegetal ou célula vegetal a jusante do promotor de acordo com a invenção, de modo que o referido ácido nucleico heterólogo seja expresso após infecção por ferrugem fúngica.

O referido ácido nucleico heterólogo é um ácido nucleico que é heterólogo em relação ao promotor, ou seja, a combinação do promotor com o referido ácido nucleico heterólogo não é normalmente encontrada na natureza.

O referido ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que é heterólogo em relação às referidas espécies vegetais nas quais está inserido,

mas também pode ocorrer naturalmente nas referidas espécies vegetais em um local diferente no genoma da planta. O referido promotor ou o referido ácido nucleico heterólogo pode ser integrado de maneira direcionada no genoma da planta por inserção de sequência direcionada, utilizando, por exemplo, os métodos descritos no documento WO2005/049842.

[050] “Plantas” abrange “plantas monocotiledôneas” e “plantas dicotiledôneas”.

[051] As “plantas monocotiledôneas”, também conhecidas como “monocotiledôneas” são bem conhecidas no estado da técnica e são plantas cujas sementes geralmente possuem um cotilédone. Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, como Poa (grama de prado, meadow grass, blue grass), grama forrageira como festuca, lolium, grama temperada, como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.

[052] As “plantas dicotiledôneas”, também conhecidas como “dicotiledôneas” são bem conhecidas no estado da técnica e são plantas cujas sementes geralmente possuem dois cotilédones. Exemplos de famílias de plantas dicotiledôneas são Brassicaceae, Solanaceae, Fabaceae, Malvaceae.

Uma planta dicotiledônea preferida é a soja (Glycine max).

[053] A expressão “partes da planta” utilizada na presente invenção indica partes da planta, que podem ser células, tecidos ou órgãos, como sementes, partes cortadas, como raízes, folhas, flores, pólen, fibras etc.

[054] As plantas ou sementes das plantas de acordo com a invenção podem ser adicionalmente tratadas com um composto químico, tal como um composto químico selecionado a partir da seguinte lista: Herbicidas: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfem, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobaque-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina,

Tidiazuron; inseticida para aplicação em algodão como Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamipride, Benzoato de Emamectina, Imidaclopride, Indoxacarb, Lambda-Cihalotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama-Cihalotrina, Espiromesifem, Piridalil, Flonicamide, Flubendiamide, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiaclopride, Dinetofuran, Flubendiamide, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, gama-cihalotrina, 4-[[(6- Cloriridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarbe, Avermectina, Flonicamide, Piridalil, espiromesifem, Sulfoxaflor; e fungicidas para aplicação no algodão como Azoxistrobina, Bixafem, Boscalide, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Iprodiona, Isopirazam, Isotianil, Mancozebe, Manebe, Metominostrobina, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propinebe, Protioconazol, Piraclostrobina, Quintozeno, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metílico, Trifloxistrobina, Clopiralide, Diclofop, Etametsulfurom, Fluazifop, Metazaclor, Quinmeraque, Quizalofope.

Fungicidas/PGRs: Azoxistrobina, N-[9-(diclorometileno)- 1,2,3,4-tetrahidro- 1,4- metanonaftalen-5-il]-3-(difluorometil)-1-metil-1H-pirazol-4-carboxamida (Benzovindiflupir, Benzodiflupir), Bixafen, Boscalide, Carbendazim, Carboxin, cloreto de Clormequat, Coniothyrium minitans, Ciproconazol, Ciprodinil, Difenoconazol, Dimetomorfe, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Famoxadona, Fluazinam, Fludioxonil, Fluopicolida, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluquinconazol, Flusilazol, Flutianila, Flutriafol, Fluxapiroxade, Iprodiona, Isopirazam, Mefenoxam, cloreto de Mepiquat, Metalaxil, Metconazol, Metominostrobina, Paclobutrazol, Penflufem, Pentiopirade, Picoxistrobina, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobina, Sedaxano, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metílico, Tiram, Triadimenol, Trifloxistrobin, Bacillus firmus, Bacillus firmus cepa 1-1582, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis cepa

GB03, Bacillus subtilis cepa QST 713, Bacillus pumulis, Bacillus pumulis cepa GB34. Inseticidas: Acetamiprida, Aldicarbe, Azadiractina, Carbofuran, Clorantraniliprol (Rinaxipir), Clotianidina, Ciantraniliprol (Ciazipir), (beta- )Ciflutrina, gama-Cialotrina, lambda-Cialotrina, Cipermetrina, Deltametrina, Dimetoato, Dinetofuran, Etiprol, Flonicamide, Flubendiamida, Fluensulfona, Fluopiram, Flupiradifurona, tau-Fluvalinate, Imiciafos, Imidaclopride, Metaflumizona, Metiocarbe, Pimetrozina, Pirifluquinazon, Espinetoram, Espinosade, Espirotetramato, Sulfoxaflor, Tiaclopride, Tiametoxam, l-(3- cloropiridin-2-il)-N-[4-ciano-2-metil-6-(metilcarbamoil)plienil]-3-{[5- (trifluorometil)-2H-tetrazol-2-il]metliil}-1Hpirazol-5-carboxamida, 1-(3- cloropiridin-2-il)-N-[4-ciano-2-metil-6-(metilcarbamoil)plienil]-3-{[5- (trifluorometil)-1H-tetrazol-1-il]metil}-1H-pirazol-5-carboxamida, 1-{2-fluoro-4- metil-5-[(2,2,2-trifluoretil)sulfinil]fen(lE)-N-[(6-cloropiridin-3-il)metil]-N'-ciano-N- (2,2-difluoroetil)etlianimidamida, Bacillus firmus, Bacillus firmus cepa 1-1582, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis cepa GB03, Bacillus subtilis cepa QST 713, Metarhizium anisopliae F52.

[055] Sempre que é feita referência a uma “planta” ou “plantas” de acordo com a invenção, entende-se que também as partes da planta (células, tecidos ou órgãos, vagens, sementes, partes cortadas, como raízes, folhas, flores, pólen, etc..), a descendência das plantas que mantêm as características distintivas das plantas parentais, como sementes obtidas por abandono ou cruzamento, por exemplo, sementes híbridas (obtidas através do cruzamento de duas linhagens parentais consanguíneas), plantas híbridas e partes de plantas delas derivadas estão abrangidas no presente documento, exceto quando indicado de outra forma.

[056] Em alguns exemplos de realização, as células vegetais da invenção, bem como as células vegetais geradas de acordo com os métodos da invenção, podem ser células não propagantes.

[057] As plantas obtidas de acordo com a invenção podem ser utilizadas em um esquema de melhoramento ou propagação convencional para produzir mais plantas com as mesmas características e/ou introduzir a mesma característica em outras variedades da mesma espécie ou de espécies relacionadas, ou em plantas hibridas. As plantas obtidas podem ser adicionalmente usadas para criar material de propagação. As plantas de acordo com a invenção podem ser adicionalmente utilizadas para produzir gametas, sementes (incluindo sementes trituradas e bolos de sementes), óleo de sementes, fibras, fios, embriões zigóticos ou somáticos, progênies ou plantas híbridas obtidas pelos métodos da invenção. As sementes obtidas a partir das plantas de acordo com a invenção também são abrangidas pela invenção.

[058] “Criar material de propagação”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer meio conhecido no estado da técnica para produzir outras plantas, partes de plantas ou sementes e inclui, entre outros, os métodos de reprodução vegetativa (por exemplo, alporquia ou mergulhia simples, divisão, enxertia (broto), micropropagação, estolões ou calos rastejantes (runners), órgãos de armazenamento como bulbos, colmos, tubérculos e rizomas, enraizamento de uma estaca (striking) ou escalonamento duplo (twin-scaling)), reprodução sexual (cruzando com outra planta) e reprodução assexuada (por exemplo, apomixia, hibridação somática).

[059] Outros exemplos de realização fornecem um método para produzir uma planta transgênica compreendendo as etapas de (a) introdução ou fornecimento de qualquer um dos genes recombinantes de acordo com a invenção a uma célula vegetal para criar células transgênicas; e (b) regeneração de plantas transgênicas a partir da referida célula transgênica.

[060] A “introdução” em relação ao presente pedido refere-se à colocação de informação genética em uma célula ou planta vegetal por meios artificiais. Isso pode ser efetuado por qualquer método conhecido no estado da técnica para introduzir RNA ou DNA em células vegetais, protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, mudas, embriões, pólen e micrósporos, e outros tecidos vegetais ou plantas inteiras. A “introdução” também compreende a integração estável no genoma vegetal. A introdução do gene recombinante pode ser realizada por transformação ou cruzamento com uma planta obtida por transformação ou seu descendente (também conhecido como “introgressão”).

[061] O termo “fornecimento” pode se referir à introdução de uma molécula de DNA exógena em uma célula vegetal por transformação, opcionalmente seguida pela regeneração de uma planta a partir da célula vegetal transformada. O termo também pode se referir à introdução da molécula de DNA recombinante pelo cruzamento de uma planta transgênica compreendendo a molécula de DNA recombinante com outra planta e selecionando plantas descendentes que herdaram a molécula de DNA recombinante ou o transgene. Em outro significado alternativo o termo “fornecer/fornecimento” refere-se à introdução da molécula de DNA recombinante por técnicas como a fusão de protoplastos, opcionalmente seguida pela regeneração de uma planta a partir dos protoplastos fundidos.

[062] O gene recombinante pode ser introduzido em uma célula vegetal por métodos bem conhecidos no estado da técnica.

[063] O termo “transformação” refere-se à introdução (ou transferência) de ácido nucleico em um hospedeiro receptor, tal como uma planta ou quaisquer partes ou tecidos de plantas, incluindo células vegetais, protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, fibras, mudas, embriões e pólen. As plantas que contêm a sequência de ácido nucleico transformada são referidas como “plantas transgênicas”.

[064] “Transformado”, “transgênico” e “recombinante” referem-se a um organismo hospedeiro, tal como uma planta na qual uma molécula de ácido nucleico heteróloga (por exemplo, um cassete de expressão ou um vetor recombinante) foi introduzida. O ácido nucleico pode ser integrado de maneira estável no genoma da planta.

[065] Conforme utilizado na presente invenção, a expressão “planta transgênica” refere-se a uma planta que possui um ácido nucleico integrado de maneira estável em seu genoma, por exemplo, os genomas nucleares ou plastídiais. Em outras palavras, as plantas que contêm a sequência de ácidos nucleicos transformada são referidas como “plantas transgênicas” e incluem plantas obtidas diretamente a partir da transformação e seus descendentes (gerações Tx). “Transgênico” e “recombinante” referem-se a um organismo hospedeiro, tal como uma planta, no qual uma molécula de ácido nucleico heteróloga (por exemplo, o promotor, o gene recombinante ou o vetor conforme descrito na presente invenção) foi introduzida. O ácido nucleico pode ser integrado de maneira estável no genoma da planta.

[066] Para obter as células ou plantas de acordo com a invenção, os especialistas no assunto podem usar um dentre os numerosos métodos de transformação conhecidos.

[067] Um desses métodos consiste em colocar as células ou tecidos dos organismos hospedeiros a serem transformados em contato com polietilenoglicol (PEG) e os vetores da invenção (Chang e Cohen, 1979, Mol.

Gen. Genet. 168: 111-115; Mercenier e Chassy, 1988, Biochimie 70: 503-517).

A eletroporação é outro método que consiste em submeter às células ou tecidos que serão transformados e os vetores da invenção a um campo elétrico (Andreason e Evans, 1988, Biotechniques 6:650-660; Shigekawa e Dower, 1989, Aust, J. Biotechnol 3: 56-62 ). Outro método consiste em injetar diretamente os vetores para dentro das células ou tecidos por microinjeção (Gordon e Ruddle, 1985, Gene 33: 121-136). Vantajosamente, o método

“biolístico” pode ser usado. Ele consiste em bombardear células ou tecidos com partículas sobre as quais os vetores da invenção são adsorvidos (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9692 -9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10: 286-291; US 4.945.050). Preferencialmente, a transformação de células ou tecidos vegetais pode ser realizada utilizando bactérias do gênero Agrobacterium, preferencialmente por infecção das células ou tecidos das referidas plantas pelo A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem.

6:143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23: 315-330) ou A. rhizogenes (Bevan e Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16: 357-384; Tepfer e Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4: 24-28). De preferência, a transformação de células ou tecidos vegetais com Agrobacterium tumefaciens é realizada de acordo com o protocolo descrito por Hiei et al. (1994, Plant J. 6: 271-282). Os especialistas na técnica escolherão o método apropriado de acordo com a natureza dos organismos hospedeiros a serem transformados.

[068] As moléculas de DNA recombinante de acordo com a invenção podem ser introduzidas nas plantas de maneira estável ou transitória, utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica. Os genes recombinantes podem ser introduzidos nas plantas ou podem ser gerados dentro da célula vegetal, conforme descrito, por exemplo, no documento EP

1339859.

[069] São adicionalmente fornecidos métodos para efetuar a expressão induzível por ferrugem fúngica de um ácido nucleico, compreendendo a introdução de um gene recombinante de acordo com a invenção que compreende um promotor possuindo uma atividade promotora induzível por ferrugem fúngica no genoma de uma planta, ou proporcionando a planta de acordo com a invenção. Também é fornecido um método para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, a arquitetura das raízes, a eficiência no uso de nutrientes, a resistência a nematoides ou o rendimento de uma planta, compreendendo a introdução do gene recombinante de acordo com a invenção no genoma de uma planta ou fornecendo a planta de acordo com a invenção.

[070] Também é fornecido o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção para regular a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado em uma planta e o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção ou do gene recombinante compreendendo o ácido nucleico que possui atividade promotora induzida por ferrugem fúngica para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, a arquitetura radicular, a eficiência no uso de nutrientes ou o rendimento em uma planta. Em outro exemplo de realização, a referida planta é uma planta de algodão, soja ou trigo.

Também é fornecido o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade promotora preferencial na raiz (raiz-preferencial), induzível pelo estresse ou raiz- preferencial e induzida pelo estresse.

[071] Outro exemplo de realização proporciona um método de produção de alimentos, rações, ou um produto industrial que compreende (a) obter a planta ou uma parte da mesma, de acordo com a invenção; e (b) preparar alimentos, rações ou produtos industriais a partir da planta ou de parte dela. Em outro exemplo de realização, o referido alimento ou ração é óleo, farinha, sementes trituradas ou moídas, flocos de soja, grãos, amido, farinha ou proteína, ou o referido produto industrial é biocombustível, fibra, produtos químicos industriais, farmacêutico ou nutracêutico. Esses alimentos, ração ou produtos industriais contêm o promotor raiz-preferencial, induzível por estresse e raiz-preferencial e induzível por estresse descrito na presente invenção.

[072] A presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento de fibras e um método para aumentar o rendimento de sementes.

Em um exemplo de realização adicional, o aumento no rendimento em comparação com uma planta controle é de pelo menos 5%.

[073] Uma “planta de controle”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma planta que se assemelha geneticamente à planta testada, mas não carrega o gene recombinante, tal como plantas tipo selvagem ou plantas segregantes nulas.

[074] As células vegetais transformadas e as plantas obtidas pelos métodos descritos na presente invenção podem ser adicionalmente utilizadas em procedimentos de melhoramento bem conhecidos no estado da técnica, como cruzamento, autofecundação e retrocruzamento. Os programas de melhoramento podem envolver o cruzamento para gerar uma geração F1 (primeira filial), seguida por várias gerações de autofecundação (gerações F2, F3, etc.). O programa de melhoramento também pode envolver etapas de retrocruzamento (BC), na qual a progênie é retrocedida para uma das linhas parentais, denominada parental recorrente.

[075] Consequentemente, também é divulgado um método para produzir plantas compreendendo o gene recombinante divulgado na presente invenção, compreendendo a etapa de cruzar a planta divulgada na presente invenção com outra planta ou consigo mesma e selecionar a progênie que compreende o referido gene recombinante.

[076] As células vegetais transformadas e as plantas obtidas pelos métodos divulgados na presente invenção também podem ser adicionalmente utilizadas em procedimentos de transformação subsequentes, por exemplo, para introduzir um gene recombinante adicional.

[077] Um “ácido nucleico isolado”, usado de forma intercambiável com “DNA isolado”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um ácido nucleico que não ocorre no seu contexto genômico natural, independentemente do seu comprimento e sequência. O DNA isolado pode, por exemplo, se referir ao DNA fisicamente separado do contexto genômico,

como um fragmento de DNA genômico. O DNA isolado também pode ser um DNA produzido artificialmente, tal como um DNA quimicamente sintetizado, ou um DNA produzido por meio de reações de amplificação, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida na técnica. O DNA isolado pode se referir ainda ao DNA presente em um contexto de DNA no qual não ocorre naturalmente. Por exemplo, DNA isolado pode se referir a um pedaço de DNA presente em um plasmídeo. Além disso, o DNA isolado pode se referir a um pedaço de DNA presente em outro contexto cromossômico que não o contexto no qual ele ocorre naturalmente, tal como, por exemplo, em outra posição no genoma que não a posição natural, no genoma de outra espécie que não a espécie na qual ele ocorre naturalmente ou em um cromossomo artificial.

[078] As frases “DNA”, “sequência de DNA”, “sequência de ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico” “sequência de nucleotídeo”, “sequência nucleotídica” e “ácido nucleico” referem-se a uma estrutura física que compreende um arranjo ordenado de nucleotídeos. A sequência de DNA ou sequência nucleotídica pode estar contida dentro de uma molécula nucleotídica maior, vetor ou semelhante. Além disso, o arranjo ordenado de ácidos nucleicos nessas sequências pode ser representado na forma de uma listagem de sequências, figura, tabela, meio eletrônico ou semelhante.

[079] Conforme utilizado na presente invenção, “compreendendo” deve ser interpretado como especificando a presença de recursos, números inteiros, etapas ou componentes declarados, conforme referido, mas não impede a presença ou adição de um ou mais recursos, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos dos mesmos. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles realmente citados, ou seja, o ácido nucleico ou proteína está incorporado em um ácido nucleico ou proteína maior. Um gene recombinante compreendendo um ácido nucleico que é definido funcional ou estruturalmente pode compreender regiões adicionais de DNA etc. Entretanto, no contexto da presente divulgação, o termo “compreendendo” também inclui “consistindo em”.

[080] A listagem de sequências contida no arquivo nomeado “BCS174006_ST25.txt”, que é de 5,53 kilobytes (tamanho medido no Microsoft Windows®), contendo 7 sequências, da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 7, é depositada com a presente invenção por envio eletrônico e incorporada ao presente como referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[081] SEQ ID NO: 1: Sequência nucleotídica do promotor de Glycine max induzível pela Phakopsora pachyrhizi.

[082] SEQ ID NO: 2: sequência do iniciador direto (primer forward) para amplificação por PCR de transcritos do gene sob controle do promotor de SEQ ID NO: 1 em Glycine max.

[083] SEQ ID NO: 3: sequência do iniciador reverso (primer reverse) para amplificação por PCR de transcritos do gene sob controle do promotor de SEQ ID NO: 1 em Glycine max.

[084] SEQ ID NO: 4: Sequência do iniciador direto para amplificação por PCR de transcritos do gene que codifica a proteína actina em Glycine max.

[085] SEQ ID NO: 5: Sequência do iniciador reverso para amplificação por PCR de transcritos do gene que codifica a proteína actina em Glycine max.

[086] SEQ ID NO: 6: Sequência do iniciador direto para amplificação por PCR de transcritos do gene que codifica a proteína metaloproteinase em Glycine max.

[087] SEQ ID NO: 7: Sequência do iniciador reverso para amplificação por PCR de transcritos do gene que codifica a proteína metaloproteinase em Glycine max.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[088] Figura 1: Acúmulo de transcrito do gene da quitinase na folha de soja durante a infecção por P. pachyrhizi. A abundância de transcrito (via qRT-PCR) a partir de folhas individuais de soja após inoculação de P.

pachyrhizi às 0, 8, 24, 48 e 72 horas após a infecção (hpi). O nível do gene da quitinase é comparado aos níveis de mRNA de referência e, em seguida, normalizado pelo tratamento simulado (mock) a cada momento da medição. As inoculações mock e com P. pachyrhizi são realizadas na mesma folha. As barras indicam erro padrão de 4 replicatas biológicas. As estrelas representam uma diferença significativa em comparação com 0 hpi, usando o teste t de Student (* para p < 0,05; ** para p < 0,01).

[089] Figura 2: Indução do promotor do gene da quitinase durante a infecção por P. pachyrhizi. A quantificação da intensidade de fluorescência relativa em folhas WT e Promotor-GFP (eventos 133 e 129) em áreas de inoculação de patógenos (+) ou simulado (mock) (-). Observação 24 horas após o tratamento. Os valores são médias de 9 inoculações (3 inoculações em 3 plantas por eventos). As barras indicam erro padrão de 9 replicatas.

[090] Figura 3: Indução do promotor do gene da quitinase durante a infecção por P. pachyrhizi. A quantificação da intensidade de fluorescência relativa em folhas WT e Promotor-GFP (eventos 133 e 129) em áreas inoculadas com patógenos (+) ou mock (-). As observações foram realizadas em 24, 48 e 72 horas após o tratamento (hpi). Os valores são fornecidos como a média de 2 inoculações.

[091] Os diversos aspectos da invenção serão compreendidos de maneira mais completa por meio dos exemplos experimentais abaixo.

[092] Todas as operações ou métodos descritos a seguir são fornecidos a título de exemplo e correspondem a uma escolha feita entre os vários métodos disponíveis para alcançar o mesmo resultado. Essa escolha não afeta a qualidade do resultado e, consequentemente, qualquer método apropriado pode ser utilizado pelos técnicos no assunto para alcançar o mesmo resultado. Em particular, e a menos que especificado de outra forma nos exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante empregadas são realizadas de acordo com os protocolos padrão descritos em Sambrook e Russel (2001, Molecular cloning: A laboratory manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), em Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current protocols, EUA, Volumes 1 e 2) e em Brown (1998, Molecular Biology LabFax, segunda edição, Academic Press, Reino Unido). Os materiais e métodos-padrão para a biologia molecular de plantas estão descritos em Croy R.D.D. (1993, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications (Reino Unido)). Os materiais e métodos padrão para a PCR (reação em cadeia da polimerase) também são descritos em Dieffenbach e Dveksler (1995, PCR Primer: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e em McPherson et al. (2000, PCR - Basics: From background to bench, 1ª ed., Springer Verlag, Alemanha).

EXEMPLOS EXEMPLO 1

NÍVEIS DE TRANSCRIÇÃO DO GENE DA QUITINASE EM SOJA APÓS INFECÇÃO POR PHAKOPSORA PACHYRHIZI

[093] Para mensurar os níveis de transcrição do gene da quitinase em folhas de soja, foi utilizada a qPCR. O RNA total foi extraído a partir das folhas de soja usando o kit RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN) e tratado com o kit TURBO DNA-free® (Invitrogen). 1μg de RNA foi usado para sintetizar o cDNA com o kit ThermoScript® RT-PCR System (Invitrogen). O cDNA foi diluído com

98 μL de água livre de RNAse para um volume final de 100 μL. Foram utilizados 5 μL de cDNA diluído em uma reação de 20 μL contendo 10 μL de SsoAdvanced® Universal SYBR® Grenn Supermix (BOI-RAD), 1 μL de iniciador direto (primer forward), 1 μL de iniciador reverso (primer reverse) e 3 μL de água livre de RNAse. A qRT-PCR foi realizado usando o instrumento LightCycler 480.

Os iniciadores utilizados para seguir a expressão do gene da quitinase estão listados na Tabela 1. As condições de termociclagem foram as seguintes: desnaturação a 95ºC por 10 minutos e para amplificação foram 45 ciclos de 10 segundos a 95ºC, 10 segundos a 60ºC e 10 segundos a 70ºC. Após o ciclo final, a análise da curva de dissociação foi realizada para verificar se a amplificação ocorreu especificamente e se nenhum produto dímero de iniciador foi gerado durante o processo de amplificação. Os genes de actina e metaloproteinase (sequências de iniciadores na tabela 1) foram usados como genes endógenos de referência para normalizar o cálculo usando o método do valor Ct comparativo. O nível de abundância do transcrito em relação ao gene de referência (denominado ΔCt) foi determinado de acordo com a função ΔCt = Ct(gene de teste) - Ct(gene de referência). Em seguida, a função ΔΔCt foi determinada pela primeira vez usando a equação ΔΔCt = ΔCt(tratamento) - ΔCt(controle) (onde o controle representava plantas tratadas com simulação (mock)). A proporção de tratamento/controle foi calculada pela equação 2Δ(–ΔΔCt). Todos os cálculos foram realizados com o programa de computador LightCycler® 480SW15.

TABELA 1 SEQUÊNCIAS DE INICIADORES PARA QRT-PCR Tamanho do Gene Nome do iniciador Sequência do iniciador amplicon GmACTIN_F CGGT GGTT CTATCTT GGC AT C Actina 142pb GmACTIN_R GTCTTT CGCTT CAATA AC CCT A Gmcons7_F* AT GAAT GACGGTT C CC AT GT A Metaloprotinase 114pb Gm cons_R* GGCATTAAGGCAGCTCACTCT

Tamanho do Gene Nome do iniciador Sequência do iniciador amplicon GmCHIT_F GAG ATT AAC G GT GC AT C AG G Quitinase prevista 330pb G mC HI T _ R ATTAAC ACGAGCCT G AAC AGT ACT * a partir de Hirschburger et al., 2015

[094] Os níveis de transcrição foram analisados nos tempos; 0h, 8h, 24h, 48h e 72h pós-infecção por P. pachyrhizi. Os resultados estão apresentados na Figura 1, mostrando aumentos significativos nos níveis de transcrição do gene em 8h a 72h após a infecção, demonstrando assim a indução do promotor desse gene após a infecção por P. pachyrhizi.

E XEMPLO 2

ATIVIDADE DO P ROMOTOR APÓS O TRATAMENTO COM V ÁRIOS E LEMENTOS

2.1 CONSTRUÇÃO DE UM GENE REPÓRTER PARA MONITORAR A ATIVIDADE DO

PROMOTOR

[095] Um fragmento de DNA de 3.454 pb a montante da sequência codificante do gene da quitinase, considerada como compreendendo o promotor putativo, foi sintetizado com a adição dos sít ios das enzimas de restrição Aatll e PlmlI, respectivamente, nas extremidades 5' e 3' da sequência. O promotor putativo foi clonado, usando os sítios das enzimas de restrição, para direcionar a expressão de uma sequência codificante de GFP (proteína Verde Fluorescente) em um vetor também contendo o gene que codifica a enzima HPPD (4- hidroxifenil-piruvato dioxigenase) sob o controle de um Promotor p35S (usado como marcador selecionável para transformação de plantas). O novo vetor obtido foi nomeado pBay00457. Um clone positivo foi então sequenciado a partir da borda esquerda (LB) para a borda direita (RB), e o T-DNA foi transferido para a planta via transformação por Agrobacterium tumefaciens.

2.2 TRATAMENTO DA SOJA E INOCULAÇÃO DE PATÓGENOS

[096] Para os ensaios de fito-hormônio, duas folhas de plantas do tipo selvagem (WT), controle positivo ou T1 transformadas com o vetor pBay00457 (contendo 2 cópias do transgene) foram coletadas e colocadas no filtro Watman com algodão ao redor do pecíolo. Uma folha foi espalhada com indutor químico da via do fito-hormônio (+) e uma folha foi tratada com simulação (mock) (-).

[097] Para a ativação da via do jasmonato (JA), as folhas foram pulverizadas com EC4% e análogo JA metílico (coronatina) a 3ppm (+), ou apelas EC4% (-).

[098] Para a ativação da via salicilato (SA), as folhas foram tratadas com 2,5 mM de SA em etanol a 10% (+) ou apenas etanol a 10% (-).

[099] Para a ativação da via do etileno (ET), as folhas foram tratadas com o precursor do etileno (ácido 1-aminociclopropano-1- carboxílico: ACC) a 20mM (+) ou H 2O (-).

[100] A ferida foi realizada cortando 3 discos foliares (0,3 cm de diâmetro) de uma folha da planta WT e de uma folha da planta transformada “promotor-GFP”.

[101] As inoculações de P. pachyrhizi foram realizadas por meio de plugues de ágar (0,5 cm de diâmetro). Os esporos crio- conservados foram reidratados primeiro 24 horas antes da infecção. 2 mL de uma solução a 1 mg de esporos/mL foram igualmente espalhados em uma placa de ágar a 3%, permitindo uma concentração de 600 esporos/plugue. Os plugues foram colocados sobre as folhas cortadas que foram incubadas a 24ºC, com 80% de umidade por 24h no escuro, seguido de um fotoperíodo 12/12. Os plugues foram removidos 24 horas após a inoculação.

[102] As inoculações de Sclerotinia sclerotiorum foram realizadas com um plugue de ágar com micélio do fungo com 5 dias de idade. As folhas foram colocadas a 24ºC, umidade saturada e fotoperíodo de 12/12. Os plugues foram removidos 48 horas após a inoculação.

[103] Foram realizadas inoculações simuladas e com patógenos na mesma folha, com 3 inoculações simuladas (mocks) no lado esquerdo e 3 inoculações com o fungo no lado direito da folha.

2.3 O BSERVAÇÕES DA GFP

[104] A expressão do gene repórter da proteína verde fluorescente, GFP, sob o controle do promotor de acordo com a invenção foi mensurada em dois eventos de transformação da soja (eventos 133 e 129). A expressão da GFP foi visualizada com uma câmera macroscópica LEICA Z16APO equipada com filtro GFP, lente 1X, ampliação 6,95 X, tempo de exposição 1s, ganho 3. A quantificação da fluorescência foi realizada no programa de computador MetaMorph.

[105] Para folhas infectadas por P. pachyrhizi, foram realizadas observações de fluorescência nos tempos; 0, 24, 48 e 72 horas após a infecção.

[106] Para folhas infectadas por S. sclerotiorum, foram realizadas observações de fluorescência nos tempos; 48 e 72 horas após a infecção.

[107] Para folhas feridas ou tratadas com fito-hormônios, as observações de fluorescência foram realizadas às 0, 48 e 72 horas, respectivamente, após o ferimento e pós-tratamento.

[108] Uma planta de soja T2 homozigótica contendo a GFP sob o controle de um promotor conhecido por responder ao estresse biótico e abiótico (construção pBay00174, contendo o promotor PDF1.2 de Arabidopsis, descrito em Manners et al. 1998, Plant Mol. Biol. 38: 1071- 1080), foi usado como controle positivo. Os resultados são exibidos na Tabela 2.

TABELA 2 PERFIL DE EXPRESSÃO DA CONSTRUÇÃO PROMOTOR-GFP Estresse Indução da via dos Estresse biótico abiótico fito-hormônios Construção Evento Phakopsora Sclerotinia Ferimento JA ET SA pachyrhizi sclerotiorum + (1) 129 + - - - - pBay00457 + (1) 133 + nd - - - Ø WT - - - - - - controle pBay00174 + + + (2) + + - (3) positivo Ø: ausência de construção; - : não foi observada diferença na fluorescência da GFP após o tratamento; + : aumento da fluorescência da GFP após o tratamento; nd: não determinado (1) resposta local apenas no local do ferimento, sem propagação (2) resposta local e propagada (3) o promotor usado para o controle positivo (PDF1.2) é sabido por não responder ao SA

[109] Os resultados mostrados na Tabela 2 demonstram que o promotor de acordo com a invenção é especificamente induzido por infecção da planta de soja por Phakopsora pachyrhizi, enquanto que não é induzido pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum. Estes resultados também demonstram que este promotor não é induzido pela maioria dos elementos conhecidos por induzir uma resposta de defesa nas plantas, em particular pelo tratamento com fito- hormônios ácido jasmônico, ácido salicílico e etileno. Finalmente, quando se trata da resposta ao ferimento, os resultados mostram que o promotor é ativado localmente apenas no ponto do ferimento.

[110] Estes experimentos demonstram a aparente especificidade deste promotor à infecção por P. pachyrhizi.

2.4 EXPRESSÃO DO PROMOTOR AO LONGO DO TEMPO APÓS A INFECÇÃO POR P.

PACHYRHIZI

[111] A expressão de GFP sob o controle do promotor de acordo com a invenção foi medida em dois eventos de transformação de soja (eventos 133 e 129) em 24h, 48h e 72h após a infecção por P. pachyrhizi. Os resultados são apresentados nas Figuras 2 e 3.

[112] Os resultados demonstram a rápida indução da atividade do promotor 24 horas após a infecção por P. pachyrhizi (Figuras 2 e 3), e sua atividade contínua ao longo do tempo por 48 e 72 horas após a infecção (Figura 3).

EXEMPLO 3

IDENTIFICAÇÃO DE PROMOTORES ORTÓLOGOS

[113] O promotor induzível por ferrugem fúngica de acordo com a invenção pode ser usado para identificar promotores ortólogos, ou seja, promotores com uma sequência de ácido nucleico substancialmente idêntica e com a mesma funcionalidade de ser induzível por ferrugem fúngica.

[114] Isto pode, por exemplo, ser feito, in silico, procurando em bancos de dados genômicos as sequências de ácidos nucleicos que possuem uma sequência de ácidos nucleicos substancialmente idêntica em outras espécies de plantas. Por exemplo, sabe-se que ferrugens fúngicas infectam muitas espécies de plantas e, portanto, promotores semelhantes com funcionalidades semelhantes podem ser identificados nessas outras espécies.

[115] Além disso, sabe-se que a ferrugem asiática da soja, Phakopsora pachyrhizi, infecta outras plantas hospedeiras além da soja

(Glycine max), como, por exemplo, Cajanus cajan, Lupinus sp., Phaseolus vulgaris ou Vigna unquiculata, nas quais também podem ser identificados promotores semelhantes com funcionalidades semelhantes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO possuindo atividade promotora induzível por ferrugem fúngica, selecionado a partir do grupo caracterizado por consistir: a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou um fragmento funcional do mesmo; b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional do mesmo; e c) o ácido nucleico de um promotor funcional capaz de hibridizar sob condições estringentes com a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional do mesmo.

2. GENE RECOMBINANTE, compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por estar operacionalmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um produto da expressão de interesse e, opcionalmente, uma sequência de terminação da transcrição e poliadenilação funcional em plantas.

3. GENE RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo produto da expressão de interesse ser uma proteína ou molécula de RNA capaz de modular a expressão de um gene.

4. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizado por compreender o gene recombinante de acordo com a reivindicação 2 ou 3.

5. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser uma célula vegetal.

6. PLANTA, caracterizado por compreender o gene recombinante da reivindicação 2 ou 3.

7. PARTES E SEMENTES DE PLANTAS, obtidas a partir da planta de acordo com a reivindicação 6, as quais são caracterizadas por compreenderem o gene recombinante de acordo com a reivindicação 2 ou 3.

8. PLANTA OU CÉLULA VEGETAL OU PARTE DE PLANTA OU SEMENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 7, caracterizados por ser uma planta ou célula vegetal ou parte de planta ou semente de soja.

9. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizado por compreender as etapas de: a) introdução ou fornecimento do gene recombinante de acordo com a reivindicação 2 ou 3 a uma célula vegetal para criar células vegetais transgênicas; e b) regeneração de plantas transgênicas a partir da referida célula transgênica.

10. MÉTODO PARA EFETUAR A EXPRESSÃO INDUZÍVEL por ferrugem fúngica de um ácido nucleico, caracterizado por compreender a introdução do gene recombinante de acordo com a reivindicação 2 ou 3 no genoma de uma planta ou fornecer a planta de acordo com a reivindicação 6.

11. USO DO ÁCIDO NUCLEICO isolado de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por regular a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado em uma planta.

12. USO DO ÁCIDO NUCLEICO isolado de acordo com a reivindicação 1, ou do gene recombinante de acordo com a reivindicação 2 ou 3 caracterizado por aumentar a resistência à infecção por fungos em uma planta.

13. USO DO ÁCIDO NUCLEICO isolado de acordo com a reivindicação 1 para identificar outros ácidos nucleicos caracterizado por compreender atividade promotora induzível por ferrugem fúngica.