BR112019022459B1 - Ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo - Google Patents

Abstract

É divulgado um ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo contendo pelo menos uma 1-óó-D-arabinofuranosilcitosina como um ácido nucleico modificado com eficácia terapêutica e guanosina. Mais particularmente, um novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo contendo pelo menos um ácido nucleico modificado (N) com eficácia terapêutica e rico em guanosina (G) é sintetizado e o fato de que o novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo possui excelentes atividades apoptóticas nas células cancerígenas do sangue e células cancerígenas do sangue resistentes a fármacos é identificado. Com base nisso, é provida uma composição para prevenir, melhorar ou tratar o câncer no sangue, contendo o novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo e o novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como um ingrediente ativo.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a uma composição para prevenir, melhorar ou tratar câncer no sangue contendo um novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo que possui pelo menos uma 1- β- D-arabinofuranosilcitosina como um ácido nucleico modificado com eficácia terapêutica ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como um ingrediente ativo.

Fundamentos da Técnica

[0002] O câncer no sangue (hematológico) refere-se ao câncer no qual várias células sanguíneas são transformadas em células cancerígenas e ao tipo de câncer que ataca o sangue, medula óssea e/ou sistema linfático. Esse tipo de câncer inclui leucemia, linfoma e mieloma múltiplo. A leucemia é um câncer no sangue no qual as células cancerígenas transformadas a partir de células-tronco hematopoiéticas produzindo células sanguíneas causam superprodução de células leucêmicas, mas impedem a produção adequada de células sanguíneas normais, levando a infecção, anemia, sangramento e similares. O linfoma é um câncer que ocorre no sistema linfático, que inclui o linfoma não-Hodgkin e o linfoma de Hodgkin. O mieloma múltiplo é um câncer no sangue causado por diferenciação e proliferação anormal de células plasmáticas, que é uma espécie de glóbulos brancos no sangue. Mais especificamente, o câncer no sangue é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, mieloma solitário e anemia aplástica.

[0003] A cada ano, novos casos de leucemia, linfoma de Hodgkin e não Hodgkin e mieloma são responsáveis por quase 10% de todos os novos casos de câncer diagnosticados. Em uma sociedade em envelhecimento, o número de idosos que sofrem de câncer no sangue está aumentando, mas sua taxa de sobrevivência é muito baixa. Em particular, a taxa de sobrevivência de pacientes com 65 anos ou mais é de apenas 9,4% e a taxa de sobrevivência de pacientes com 80 anos ou mais é tão significativamente baixa quanto 0% (Blood, 2012, 120; l 165-1174).

[0004] O câncer no sangue (hematológico) é uma doença causada pela transformação em células no câncer a partir de células de mutação criadas no sangue e no sistema linfático, enquanto as células de mutação se movem por todo o corpo e existem cerca de 70 tipos de câncer no sangue. Portanto, os pacientes diagnosticados com câncer no sangue recebem, primeiramente, quimioterapia de indução de remissão para remover todas as células imunológicas do corpo, a fim de matar células anormais mutantes. Posteriormente, é realizada quimioterapia de consolidação, incluindo injeção de produtos químicos tóxicos apenas nas células anormais. A quimioterapia de indução da remissão é realizada pela administração em altas doses de uma combinação de drogas anticâncer altamente citotóxicas, que são muito tóxicas e adversas e, portanto, são inaplicáveis à administração em pacientes idosos. Essa é a razão pela qual a viabilidade de pacientes idosos com câncer no sangue é muito baixa (Blood, 2010,116:5818-5823).

[0005] Além disso, não há efeito terapêutico no câncer no sangue porque o câncer no sangue não responde mesmo à quimioterapia de indução de remissão de altas doses ou há necessidades médicas altamente não atendidas associadas ao câncer no sangue devido a uma alta taxa de resistência e uma alta taxa de recorrência em cinco anos.

[0006] Atualmente, terapias-alvo usando inibidores de anticorpo e quinase foram desenvolvidas, mas o tratamento do câncer no sangue ainda depende muito de quimioterapia e radioterapia (The New England Journal of Medicine, 2014, 371:1005-1015). Os fármacos anticâncer usados como agentes quimioterapêuticos para o câncer no sangue são fármacos citotóxicos anticancerígenos com toxicidade considerável, que são administrados em doses muito altas devido à baixa biodisponibilidade e dificuldade de entrega do alvo às células cancerígenas. Isso causa sérios efeitos colaterais aos pacientes, dificultando o tratamento. Portanto, há a necessidade de novos agentes terapêuticos possuindo menos toxicidade e eficácia terapêutica eficaz.

[0007] Sabe-se que os oligonucleotídeos ricos em guanosina têm efeitos inibitórios contra o crescimento celular em uma ampla gama de células cancerígenas e funcionam para regular o ciclo celular ligando-se a proteínas específicas nas células, por exemplo, proteínas importantes para o crescimento celular e oligonucleotídeos específicos da morte, tais como proteínas eEFlA, JNK, Ki-ras, nucleolin, stat3, telomerase e topoisomerase, ao tratar células cancerígenas da mesma forma, e essas proteínas são superexpressas nas células cancerígenas mais do que nas células normais (Christopher R. Ireson et al. Molecular cancer therapy, 2006, 2957-2962; Naijie Jing et al., Cancer research, 2004, 6603-6609; Christophe Marchand et al., The Journal of Biological Chemistry, 2002, 8906-8911).

[0008] Esses oligonucleotídeos ricos em guanosina têm características estruturais especiais, além da tripla ligação de hidrogênio à citosina. Os oligonucleotídeos ricos em guanosina podem ter uma estrutura de quatro filamentos através de ligação intramolecular ou ligação intermolecular. Em vez de formar uma estrutura de dupla hélice através de uma ligação geral de hidrogênio entre adenosina e tiamina e entre guanosina e citidina, quatro guanosinas são posicionadas em um plano para formar ligações de hidrogênio do tipo Hoogsteen, que constituem um G-quadruplex. Dois ou mais desses G-quadruplexes são continuamente posicionados para formar uma estrutura tetrahelical. Em geral, existem dificuldades no desenvolvimento de oligonucleotídeos em fármacos devido à sua baixa estabilidade no sangue e sua baixa permeabilidade celular. No entanto, sabe-se que os oligonucleotídeos que constituem um G- quadruplex possuem estabilidade relativamente alta do sangue e permeabilidade celular devido às suas características estruturais.

[0009] Como descrito na Patente US N° 7.314.926 e na Publicação de Patente US N° 2007-105805, sabe-se que os oligonucleotídeos que constituem tal G-quadruplex se ligam a proteínas específicas que são altamente expressas na superfície das células cancerígenas e depois penetram nas células cancerígenas por endocitose e se ligam a proteínas envolvidas na morte celular para inibir o crescimento celular. Foi relatado que tais oligonucleotídeos induzem apoptose devido a efeitos citostáticos em vez de efeitos citotóxicos (Paula J. Bates et al. The Journal of Biological Chemistry, 1999, 26369-26377; Bruna et al. FEBS journal, 2006, 1350-1361).

[0010] Além disso, além do efeito de inibir o crescimento de células cancerígenas, sabe-se que os oligonucleotídeos que constituem os G-quadruplexes possuem várias funções in vivo e funções reguladoras, por exemplo, a Patente US N° 5.567.604 divulga que os oligonucleotídeos que constituem os G-quadruplexes possuem atividade antiviral, a Patente US N° 6.994.959 divulga que os oligonucleotídeos que constituem os G- quadruplexes possuem atividade imunomoduladora, e a Publicação de Patente US N° 2007-105805 divulga que os oligonucleotídeos que constituem os G-quadruplexes têm efeitos terapêuticos na doença de Huntington (Cheryl A. Stoddart et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, 2113-2115; Michael Skogen, et al., BMC Neuroscience, 2006, 7:65).

[0011] Tais oligonucleotídeos que constituem os G- quadruplexes induzem apoptose devido ao efeito citostático, de modo que a taxa de apoptose não é relativamente alta. Portanto, é difícil administrar os oligonucleotídeos em combinação com um agente quimioterápico altamente tóxico (Paula J. Bates et al. Experimental and Molecular Pathology, 2009, 151-164; Christopher R. Ireson et al. Molecular Cancer Therapy, 2006, 2957 -2962).

[0012] A Patente Coreana N° 10-0998365 divulga um exemplo de melhoria de um efeito apoptótico através da introdução de um ácido nucleico modificado para tratamento que proporciona um efeito apoptótico em oligonucleotídeos formando G-quadruplexes. No entanto, a patente não divulga ácidos nucleicos modificados com oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção nem seus efeitos terapêuticos no câncer no sangue e seus efeitos apoptóticos em células cancerígenas no sangue resistentes a fármacos.

[Estado da Técnica] [Documento de patente]

[0013] Patente coreana N° 10-0998365

[0014] Patente US N° 7.314.926

[0015] Patente US submetida para exame N° 2007-105805

[0016] Patente US N° US 5.567.604

[0017] Patente US N° 6.994.959

[0018] Patente US submetida para exame N° 2007-105805

[0019] [Documento não patentário]

[0020] (Documento não patentário 1) Christopher R. Ireson et al. Molecular Cancer Therapy, 2006, 2957-2962; Naijie Jing et al. Cancer Research, 2004, 6603-6609; Christophe Marchand et al. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 8906-8911.

[0021] (Documento não patentário 2) Paula J. Bates et al. The Journal of Biological Chemistry, 1999, 26369-26377; Bruna et al. Jornal FEBS 2006 1350-1361]

[0022] (Documento não patentário 3) Cheryl A. Stoddart et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, 2113-2115; Michael Skogen et al. BMC Neuroscience, 2006, 7:65.

[0023] (Documento não patentário 4) Paula J. Bates et al. Experimental and Molecular Pathology, 2009, 151-164; Christopher R. Ireson et al. Molecular Cancer Therapy, 2006, 2957-2962.

Divulgação da Invenção Problema Técnico

[0024] Em vista dos problemas acima, os presentes inventores introduziram um ou mais de 1- β-D-arabinofuranosilcitosina, que é um ácido nucleico modificado com eficácia terapêutica para induzir apoptose por efeito citotóxico, em um oligonucleotídeo, que é rico em guanosina com um efeito citostático e, portanto, forma um G-quadruplex, a fim de melhorar a estabilidade da permeabilidade ao sangue e às células e inibir o crescimento de células cancerígenas no sangue de maneira mais eficaz e, desse modo, induzir a morte celular, e sintetizou um novo oligonucleotídeo com essa estrutura e verificaram, com base na comparação da citotoxicidade, que o oligonucleotídeo tem um efeito dramaticamente melhorado de matar células cancerígenas no sangue, em particular, tem excelente efeito anticâncer (nível de nM) nas células cancerígenas resistentes a fármacos, o que dificulta o tratamento porque eles não respondem a fármacos terapêuticos convencionais para câncer no sangue e têm excelente eficácia terapêutica sobre o câncer no sangue. Finalmente, a presente invenção foi concluída com base nesta verificação.

[0025] Portanto, é um objetivo da presente invenção prover um novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo contendo pelo menos uma 1-β-D-arabinofuranosilcitosina como um ácido nucleico modificado com um efeito terapêutico e rico em guanosina.

[0026] É outro objetivo da presente invenção prover uma composição para prevenir, melhorar ou tratar o câncer no sangue, contendo o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como ingrediente ativo.

Solução para o problema

[0027] Em um aspecto, a presente invenção provê um ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo contendo um composto representado pela Fórmula 2 a seguir para formar uma estrutura G- quadruplex:[Fórmula 2]

[0028] O ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo pode ser representado pela seguinte sequência:Sequência 1) GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG;Sequência 2) GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG;Sequência 3) NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG; ouSequência 4) NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG;em que G é guanosina ou um derivado de guanosina, T é timina ouum derivado de timina e N é 1- β-D-arabinofuranosilcitosina.

[0029] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição para prevenir, melhorar ou tratar o câncer no sangue, contendo o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como um ingrediente ativo.

Efeitos vantajosos da invenção

[0030] O novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção é um composto com uma nova estrutura capaz de formar um G-quadruplex ao incorporar pelo menos uma 1-β-D-arabinofuranosilcitosina e guanosina e é, portanto, útil como um agente preventivo e terapêutico para câncer no sangue devido à excelente atividade apoptótica e eficácia terapêutica anticâncer em células de câncer no sangue, bem como em células de câncer no sangue resistentes a fármaco.

Breve descrição dos Desenhos

[0031] Os objetos acima e outros objetos, características e outras vantagens da presente invenção serão mais claramente compreendidos a partir da seguinte descrição detalhada tomada em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:

[0032] A FIG. 1 é um gráfico que mostra os efeitos citotóxicos de um ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo sobre as células AML (MOLM13 resistente à citarabina) com resistência a fármaco à citarabina (agente terapêutico primário para câncer no sangue);

[0033] A FIG. 2 é um gráfico de efeitos antiproliferativos do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em células de câncer no sangue (MV-4-11 resistente à citarabina) com resistência a fármaco à citarabina;

[0034] A FIG. 3 mostra um gráfico mostrando a citotoxicidade in vivo do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em um modelo de xenoenxerto de câncer no sangue (Luc-MOLM13);

[0035] A FIG. 4 é uma imagem que mostra a eficácia citotóxica in vivo do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em um modelo animal de câncer no sangue (Luc-MOLM13);

[0036] A FIG. 5 é um gráfico que mostra a eficáciaantiproliferativa e a taxa de sobrevivência do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em um modelo animal de câncer no sangue (Luc- MOLM13);

[0037] A Fig. 6 mostra a eficácia anticâncer e a taxa de sobrevivência do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em um modelo singeneico de câncer no sangue (C1498);

[0038] A Fig. 7 mostra a eficácia anticâncer e a taxa de sobrevivência do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em um modelo singeneico de câncer no sangue (WEHI-3); e

[0039] A Fig. 8 mostra a eficácia antiproliferativa do ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo sobre as células mononucleares da medula óssea derivadas de pacientes recidivados/refratários.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

[0040] Referência será feita agora em detalhes às modalidades preferenciais da presente invenção, exemplos das quais são ilustradas nos desenhos anexos.

[0041] Deve-se entender que, no relatório descritivo, quando o intervalo é referido em relação a um parâmetro, o parâmetro abrange todas as figuras incluindo os pontos finais divulgados dentro do intervalo. Por exemplo, o intervalo de "5 a 10" inclui números de 5, 6, 7, 8, 9 e 10, bem como subintervalos arbitrários, tais como intervalos de 6 a 10, 7 a 10, 6 a 9, e 7 a 9, e quaisquer números, tais como 5,5, 6,5, 7,5, 5,5 a 8,5 e 6,5 a 9, entre números inteiros apropriados que se enquadram no intervalo. Ademais, por exemplo, o intervalo de "10% a 30%" abrange todos os números inteiros que incluem números tais como 10%, 11%, 12% e 13%, bem como 30% e quaisquer subintervalos de 10% a 15%, 12% a 18% ou 20% a 30%, bem como quaisquer números, tais como 10,5%, 15,5% e 25,5%, entre números inteiros apropriados que estejam dentro do intervalo.

[0042] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0043] Em um aspecto, a presente invenção está direcionada a um ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo contendo um composto representado pela seguinte Fórmula 1 para formar uma estrutura G- quadruplex:[Fórmula 1]em que Ri é hidrogênio ou um átomo de fósforo da fração de fosfato de outro ácido nucleico e R2 é hidrogênio ou um átomo de fósforo da fração de fosfato de outro ácido nucleico.

[0044] Em um aspecto, a presente invenção está direcionada a um ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo em que o composto é representado pela seguinte Fórmula 2:[Fórmula 2]

[0045] Em um aspecto da presente invenção, o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo pode ser representado pela seguinte sequência:GaTbNcem que G é guanosina ou um derivado de guanosina, T é timina ou um derivado de timina, N é um ácido nucleico modificado de 1-β-D- arabinofuranosilcitosina ou um derivado deste, G, T e N são dispostos aleatoriamente por permutação, a é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 30, b é um número inteiro selecionado a partir de 0 a 30, e c é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 30, com a condição de que um total de a, b e c não exceda 60.

[0046] Em um aspecto da presente invenção, o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo pode ser representado pela seguinte sequência:Sequência 1) GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG;Sequência 2) GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG;Sequência 3) NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG; ouSequência 4) NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG;

[0047] Na sequência acima, G é guanosina ou um derivado de guanosina, T é timina ou um derivado de timina e N é 1-β-D- arabinofuranosilcitosina como um ácido nucleico modificado.

[0048] Em um aspecto da presente invenção, a guanosina ou o derivado de guanosina pode incluir um ou mais selecionados dentre 2- desoxiguanosina, guanosina, 2'-O-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, LNA (ácido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina e D- guanosina.

[0049] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma composição para prevenir, melhorar ou tratar câncer no sangue contendo pelo menos um ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo selecionado dentre aqueles descritos acima ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como um ingrediente ativo.

[0050] Em outro aspecto, o câncer no sangue inclui pelo menos um dentre linfoma não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e mieloma solitário.

[0051] A seguir, modalidades da presente invenção serão descritas em mais detalhes.

[0052] Em um aspecto, a presente invenção provê um novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo contendo, como um ácido nucleico modificado com uma eficácia terapêutica, pelo menos uma 1- β-D- arabinofuranosilcitosina, e rico em guanosina.

[0053] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição para prevenir, melhorar ou tratar o câncer no sangue, contendo o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como um ingrediente ativo.

[0054] Como usado neste documento, o termo "G-quadruplex" refere-se a um oligonucleotídeo que contém uma grande quantidade de um ou mais selecionados dentre 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-O-metil- guanosina, 2'-fluoro-guanosina, LNA (ácido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina e D-guanosina mencionados representativamente como guanosina (G) [ver FIG. 1] e, portanto, possui uma estrutura tetrahélica, no caso de uma determinada sequência, baseada em ligações de hidrogênio do tipo Hoogsteen formadas por quatro guanosinas posicionadas em um plano. É então sintetizado de tal modo que um ácido nucleico modificado com um efeito terapêutico seja introduzido em tal estrutura.

[0055] Sabe-se que os oligonucleotídeos que formam a estrutura G-quadruplex baseada em guanosina rica são conhecidos por se ligarem mais seletivamente às células cancerígenas e por inibirem o crescimento de células cancerígenas através de diversos mecanismos dentro das células.

[0056] Os oligonucleotídeos que formam os G-quadruplexes, nos quais um ou mais ácidos nucleicos modificados são incorporados, são transferidos para as células cancerígenas. Posteriormente, o G-quadruplex exibe um efeito de inibição do crescimento celular, e o ácido nucleico modificado, que exibe um efeito terapêutico quando degradado por uma nuclease, inibe diretamente o crescimento celular, resultando, desse modo, sinergicamente na morte de células cancerígenas. Uma vez que os oligonucleotídeos formadores de G-quadruplex possuem apenas uma atividade inibidora contra o crescimento celular, quando utilizados sozinhos, a taxa de morte celular não é relativamente alta e é necessário tratamento contínuo durante um certo período de tempo. No entanto, foi identificado pela presente invenção que a incorporação do ácido nucleico modificado que tem um efeito terapêutico no câncer no sangue melhora diretamente o efeito da morte celular, aumentando, desse modo, rapidamente a taxa de morte celular.

[0057] Num aspecto, o ácido nucleico modificado com eficácia terapêutica pode ser 1- β-D-arabinofuranosilcitosina.

[0058] Em uma modalidade específica, o ácido nucleico modificado terapêutico derivado da citidina (N) usado neste documento é um derivado da citidina representado pela seguinte Fórmula 2, em que o nucleotídeo pode ser preparado na forma de fosforamidita por um método comum [Oligonucleotídeos e Análogos: A Practical Approach 1991 Fritz Eckstein et al. IRL Press: Oxford], ou pode ser produzido para incorporar, em oligonucleotídeo rico em guanosina, fosforamidita de nucleotídeo adquirida da Glen Research Corporation, Berry & Associates Inc., Okeanos Technologies, LLC., ChemGenes Corp., Proligo Corp. e similares, por síntese de fase sólida usando um sintetizador de DNA de acordo com um método convencionalmente relatado.[Fórmula 2]

[0059] O ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo pode ser produzido por um método comum usando o ácido nucleico modificado produzido na forma de fosforamidita com um sintetizador de fase sólida.

[0060] Ou seja, a fosforamidita de ácido nucleico modificado é sintetizada dissolvendo-se em acetonitrila anidro e carregando o mesmo em um sintetizador de DNA. O ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo é sintetizado usando métodos convencionais de síntese e purificação com referência ao guia (manual) provido por Glen Research Corporation e pelas patentes US N° 5.457.187 e 5.614.505.

[0061] Ademais, sequências representativas dos ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeo que podem ser sintetizadas usando o ácido nucleico modificado como descrito acima são as seguintes:Sequência 1) GGTGGTGGTTNTGGTGGTGGSequência 2) GGTGGTGGTNNTGGTGGTGGSequência 3) NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGSequência 4) NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG

[0062] Os compostos das sequências, nos quais os ácidos nucleicos modificados são incorporados em posições apropriadas, exibiram excelentes efeitos apoptóticos nas células cancerígenas do sangue e células cancerígenas resistentes a fármacos, não exibindo qualquer efeito significativo nas células normais. Também foi identificado por experimentos em animais que os compostos das sequências têm excelente eficácia terapêutica contra o câncer no sangue.

[0063] Por conseguinte, o novo ácido nucleico modificado por nucleotídeo pode ser completado através da introdução do ácido nucleico modificado por citidina, de acordo com a presente invenção, na sequência de oligonucleotídeos com atividade biológica enquanto formam G- quadruplexes através de substituição.

[0064] O ácido nucleico modificado (N) com eficácia terapêutica está presente como um composto representado pela seguinte fórmula 1 no ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo.[Fórmula 1]em que Ri é hidrogênio ou um átomo de fósforo da fração de fosfato de outro ácido nucleico e R2 é hidrogênio ou um átomo de fósforo da fração de fosfato de outro ácido nucleico.

[0065] Na sequência, G representa guanosina e preferencialmente inclui uma ou mais selecionadas dentre 2- desoxiguanosina, guanosina, 2'-O-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, LNA (ácido nucleico bloqueado)-guanosina, D- desoxiguanosina e D- guanosina, e N é 1-β-D-arabinofuranosilcitosina como ácido nucleico modificado derivado da citidina.

[0066] Os agentes terapêuticos convencionais contendo nucleosídeos com efeitos terapêuticos podem envolver efeitos colaterais, tais como toxicidade sistêmica e resistência a fármacos, e muitas células cancerígenas podem ter resistência a tais fármacos anticancerígenos de nucleosídeos terapêuticos, que podem exigir a seleção de outros fármacos. Quando o nucleosídeo com tais efeitos terapêuticos é incorporado nos oligonucleotídeos G-quadruplex relativamente mais seletivos às células cancerígenas, os efeitos sobre as células normais in vivo podem ser minimizados e as taxas de morte (apoptose) de tumores de células cancerígenas resistentes a fármacos podem ser aumentados.

[0067] Esta estrutura G-quadruplex é mais estável quando os íons de potássio (K+) estão presentes e, assim, possui uma estrutura estável por um longo período de tempo sob condições fisiológicas gerais, tais como no sangue. Portanto, na presente invenção, um oligonucleotídeo G-quadruplex contendo um ácido nucleico modificado com um efeito terapêutico é estabilizado com uma solução KC1 com uma certa concentração (30 a 70 mM) ou similar antes do uso.

[0068] O novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção exibe efeitos apoptóticos notavelmente aprimorados em células de câncer no sangue e células de câncer no sangue resistentes a fármacos, em comparação com agentes terapêuticos convencionais contendo nucleosídeos que possuem um efeito terapêutico, e exibe excelente eficácia terapêutica anticancerígena na avaliação da eficácia anticancerígena usando modelos animais.

[0069] Por conseguinte, a presente invenção provê uma composição para prevenir, melhorar ou tratar o câncer no sangue, contendo o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste como um ingrediente ativo. Os sais farmacologicamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais metálicos, sais com bases orgânicas, sais com ácidos inorgânicos, sais com ácidos orgânicos, sais com aminoácidos básicos ou ácidos e similares. Os sais metálicos adequados incluem: sais de metais alcalinos, tais como sais de sódio e sais de potássio; sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de cálcio, sais de magnésio e sais de bário; e sais de alumínio e similares. Exemplos adequados de sais com bases orgânicas incluem sais de trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, 2,6-lutidina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, ciclo-hexilamina, diciclo-hexilamina, N, N- dibenziletilenodiamina e similares. Exemplos adequados de sais com ácidos inorgânicos incluem sais de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e similares. Exemplos adequados de sais com ácidos orgânicos incluem sais de ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido p-toluenossulfônico e similares.

[0070] Exemplos adequados de sais com aminoácidos básicos incluem sais de arginina, lisina, ornitina e similares. Exemplos adequados de sais com aminoácido ácido incluem sais de ácido aspártico, ácido glutâmico e similares. Sais particularmente preferenciais incluem, quando o composto possui um grupo funcional ácido neste, sais inorgânicos tais como sais de metais alcalinos (por exemplo, sais de sódio e sais de potássio) e sais de metais alcalino-terrosos (por exemplo, sais de cálcio, sais de magnésio e sais de bário) e sais orgânicos, tais como sais de amônio. Quando o composto possui um grupo funcional básico, sais particularmente preferenciais incluem sais com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, e sais com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido metanossulfônico e ácido p-toluenossulfônico.

[0071] A composição para prevenir, melhorar ou tratar o câncer contendo o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável além do ingrediente ativo. No caso de uma solução de injeção, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser uma mistura de um conservante, um agente isotônico, um agente anestésico, um agente solubilizante, um tampão, um agente estabilizador ou semelhante. Para administração oral, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um agente solubilizante, um aglutinante, um excipiente, um dispersante, um agente estabilizante, um agente de suspensão, um agente de desintegração de cores, um lubrificante, um sabor ou semelhante. Para administração tópica, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser uma base, um excipiente, um lubrificante, um conservante ou semelhante.

[0072] A formulação da composição de acordo com a presente invenção pode ser preparada de várias formas como uma mistura com o veículo farmaceuticamente aceitável. Ademais, a composição pode ser preparada na forma de uma ampola de dosagem unitária ou em uma pluralidade de formas de dosagem para injeção e na forma de um comprimido, elixir, cápsula, suspensão, pastilha, wafer, xarope ou similar para administração oral, e pode ser formulada em um comprimido, uma pílula, uma cápsula, uma preparação com liberação sustentada ou semelhante.

[0073] Enquanto isso, exemplos de veículos, excipientes e diluentes adequados para formulação incluem celulose microcristalina, xilitol, eritritol, metilcelulose, polivinilpirrolidona, amido, acácia, alginato, gelatina, lactose, dextrose, sacarose, hidroxibenzoato de propila, celulose, água, hidroxibenzoato de metila, estearato de magnésio, talco, sorbitol, manitol, maltitol, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, óleo mineral ou semelhante.

[0074] O termo "administração" utilizado neste documento significa introdução de uma certa substância a um paciente por qualquer método adequado. A via de administração do ingrediente ativo pode ser qualquer via geral que permita a entrega de um fármaco a um tecido alvo. Exemplos da via de administração incluem, mas não estão limitados a, administração intravenosa, subcutânea, oral, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, retal, local, intranasal e intradérmica. No entanto, porque os oligonucleotídeos são digeridos quando administrados via administração oral, a composição para administração oral deve ser preparada para que possa ser decomposta e absorvida no trato gastrointestinal. Preferencialmente, pode ser administrada por injeção ou por via internasal.

[0075] O conteúdo do ingrediente ativo na preparação de acordo com a presente invenção pode ser adequadamente selecionado dependendo da capacidade de absorção do ingrediente ativo no corpo, razão de inativação, taxa de excreção, idade, gênero e condições do usuário e similares. A dose do ingrediente ativo da presente invenção pode ser de 1 a 1.000 mg/kg, preferencialmente 3 a 100 mg/kg, e pode ser administrada continuamente 1 a 3 vezes por dia ou por infusão por um período de tempo predeterminado.

Modo para a invenção

[0076] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos seguintes Exemplos e não está limitada a eles.

Exemplo 1: Síntese de novo ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo

[0077] A síntese de DNA foi realizada em uma escala de 1 pmol usando um sintetizador de DNA convencional de fase sólida. Em relação às fosforamiditas utilizadas para síntese, desoxiguanosina, timidina e a fosforamidita de 1-β-D-arabinofuranosilcitosina foram adquiridas da Glen Research Corporation, que foram dissolvidos a uma concentração de 0,067M em acetonitrila seca e carregados em um sintetizador de DNA de fase sólida da Polygene Inc. A reação prossegue na direção de 3' —> 5', e o grupo hidroxila 3' do primeiro nucleotídeo é anexado à resina. Durante a adição de uma base, repetiram-se as reações químicas em quatro etapas, incluindo a detritilação do terminal 5', o acoplamento de uma nova base, o nivelamento de uma cadeia de DNA desacoplada e a oxidação do grupo fosfato. Após concluída a reação, o grupo protetor foi removido e a resina de CPG sintetizada foi imersa em amônia aquosa e deixada para repousar a 55 °C por 5 horas. Em seguida, a amônia aquosa foi seca para obter um pó branco. A purificação foi realizada aumentando uma solução de IM NaCl para 5 a 70% em um sistema de HPLC usando uma coluna de HPLC de troca aniônica Waters. Os picos principais foram coletados, etanol a 100% foi adicionado e os oligonucleotídeos foram precipitados e depois secos. Como resultado, os oligonucleotídeos com uma pureza de 85% ou mais foram obtidos por HPLC, e os pesos moleculares foram medidos usando ESI-LC-MS (Q-TRAP 2000 ESIMS) para determinar se a síntese foi ou não bem-sucedida.

[0078] Os ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeos podem ser produzidos da mesma maneira que acima, com relação às sequências de oligonucleotídeos que já foram relatadas com a finalidade de tratamento terapêutico ou uma variedade de sequências que exibem atividade fisiológica, enquanto formam G-quadruplexes, além das sequências mostradas na seguinte tabela 1.[Tabela 1]

Exemplo 2: Produção de nova solução de ácido nucleico modificada por oligonucleotídeo

[00100] Cada ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo foidiluído em uma solução de Tris-HCl a 10 mM (pH 7,4) até uma concentração final de 100 pM. A solução diluída foi deixada para repousar a 94 °C por 5 minutos e depois o tubo foi deixado para repousar no gelo. A solução resultante foi adicionada com uma solução de KC1 2M, de modo que uma concentração final da solução de KC1 se torne 50 mM, deixada para repousar a 60 °C por 3 horas e foi lentamente resfriada à temperatura ambiente. Cada oligonucleotídeo foi diluído em uma solução de Tris-HCl a 10 mM (pH 7,4) para uma concentração de 10 pM, e foi deixado para repousar a 94 °C por 5 minutos, e o tubo foi deixado para repousar no gelo. A solução resultante foi adicionada com uma solução de KC1 2M, de modo que a concentração final da solução de KC1 se torne 50 mM, e deixada para repousar a 60 °C por 3 horas e depois lentamente resfriada à temperatura ambiente, solução a qual foi depois utilizada para o presente Exemplo.

Exemplo Experimental 1: Eficácia citotóxica em células cancerígenas do sangue e células cancerígenas resistentes a fármacos in vitro

[00101] No dia anterior ao experimento, 190 pl de um meio de cultura (a uma concentração de 104a 105células/ml) contendo células cancerígenas tais como linhas celulares HL60, MV-4-11, CCRF-CEM, MOLT-4 e MOLM-13 e células cancerígenas do sangue resistentes a fármacos, tais como linhas celulares MOLM13 resistentes à azacitidina (AZA-l), MOLM13 resistente à decitabina (Dec-5) e MOLM13 resistente à citarabina (AraC-l), e células normais tais como WI38, CCD-18co e Fa2N4 foram semeadas em uma placa de 96 poços. No dia seguinte, 10 pl da solução de ácido nucleico modificada por oligonucleotídeo preparada no Exemplo 2 foram adicionados e depois cultivados por 5 dias.

[00102] Cinco dias após o tratamento com fármacos, foi realizado o ensaio MTT para medir a citotoxicidade das linhas celulares [ver JBC 1999, 26369].

[00103] Os resultados de medição de citotoxicidade por novos ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, mostraram, como pode ser visto na Tabela 2, IC50 dos novos ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeo, ou seja, Compostos 1, 2, 3 e 4 da presente invenção, exibiram efeitos citotóxicos superiores em diversas linhas celulares de câncer no sangue [Tabela 2].

[00104] Ademais, pode ser visto que os novos ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, exibiram efeitos citotóxicos superiores em diversas células cancerígenas do sangue resistentes a fármacos também [Tabela 3].

[00105] Ademais, pode ser observado que os novos ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, exibiram efeitos citotóxicos superiores em diversas células cancerígenas do sangue, bem como em diversas células cancerígenas resistentes a fármacos, enquanto quase não tiveram efeito nas células normais [Tabela 4].

[00106] Os resultados de medição de efeitos citotóxicos são mostrados nas Tabelas 2 a 4 abaixo. Além disso, os efeitos citotóxicos dos ácidos nucleicos modificados por oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção em células cancerígenas do sangue resistentes a fármacos são identificados e mostrados nas FIGS. 1 e 2.[Tabela 2]

[00107] A tabela 2 refere-se a efeitos citotóxicos nas célulascancerígenas do sangue.[Tabela 3]

[00108] A tabe a 3 refere-se a efeitos cil otóxicos sobre as célulascancerígenas do sangue resistentes a fármacos. [Tabela 4]

[00109] A tabela 4 refere-se a efeitos citotóxicos sobre as células normais.

Exemplo Experimental 2: Eficácia anticâncer em modelo de camundongo in vivo de xenoenxerto de célula cancerígena do sangue derivado de seres humanos (Luc-MOLM13)

[00110] A fim de identificar eficácias em células cancerígenas do sangue derivadas de humanos em animais, o câncer no sangue foi induzido com camundongos NOD-SCID para avaliar a eficácia anticâncer in vivo.

[00111] Primeiro, a indução do câncer no sangue foi realizada especificamente da seguinte maneira. O grupo experimental consistiu em um grupo de veículo (8 camundongos) e um grupo de administração de fármacos (9 camundongos).

[00112] As células Luc-MOML-13 (linhas celulares de MDS/AML humano) foram injetadas por via intravenosa a uma densidade de 107(células/camundongo) em camundongos NOD-SCID com 8 semanas de idade. Como o fármaco administrado, o Composto 2 foi dissolvido em tampão de potássio a uma concentração de 2 mM, e a solução foi deixada para repousar a 94 °C por 5 minutos e lentamente resfriada à temperatura ambiente por 3 horas, que foi então usada para o presente Exemplo.

[00113] O fármaco foi administrado por via intravenosa (150 mg/kg) diariamente por duas semanas, cinco vezes por semana a partir do segundo dia após a inoculação celular, e a taxa de sobrevivência foi monitorada. Os resultados são mostrados na FIG. 5. Ademais, após 10 dias desde o início da administração de fármaco, o efeito citotóxico das células cancerígenas no sangue foi comparado com aquele do grupo de veículo por imageamento biomédico e os resultados são mostrados nas FIGS. 3 e 4.

[00114] Como pode ser visto nas FIGS. 3 e 4, as células cancerígenas no sangue do grupo de administração de fármacos foram significativamente reduzidas em comparação com o grupo de veículo.

[00115] Como pode ser visto a partir da FIG. 5, a taxa de sobrevivência do grupo de administração de fármacos foi significativamente melhorada em comparação com o grupo de veículo.

Exemplo Experimental 3: Eficácia anticâncer em camundongos de modelo in vivo singeneicos AML (C1498)

[00116] A fim de identificar a eficácia in vivo sobre células cancerígenas no sangue com um sistema imunológico, a taxa de sobrevivência de camundongos foi monitorada após o transplante de células cancerígenas no sangue derivadas de camundongo (C1498) em camundongos C57BL/6.

[00117] A indução do câncer no sangue foi realizada especificamente da seguinte maneira. O grupo experimental consistiu em um grupo de veículo (8 camundongos), um grupo de administração de fármacos (9 camundongos) e um grupo de controle (8 camundongos). O composto 2 foi injetado como o grupo de administração de fármaco a 300 mg/kg e citarabina foi injetada como o grupo de controle positivo a 30 mg/kg (citarabina na mesma quantidade que 300 mg/kg de Composto 2).

[00118] As células C1498 (linha celular AML de camundongo) foram injetadas por via intravenosa a uma densidade de 5 X 105(células/camundongo) em camundongos C57BL/6 com 8 semanas de idade. Como o fármaco administrado, o Composto 2 foi dissolvido em tampão de potássio a uma concentração de 2 mM, e a solução foi deixada para repousar a 4 °C por 6 horas.

[00119] O fármaco foi injetado subcutaneamente duas vezes ao dia por duas semanas a partir do segundo dia após a inoculação celular, e a taxa de sobrevivência foi monitorada. Os resultados são mostrados na FIG. 6.

[00120] Como pode ser visto na FIG. 6, a taxa de sobrevivência do grupo de administração de fármacos foi significativamente melhorada em comparação com o grupo de veículo e a taxa de sobrevivência do grupo de administração de fármacos foi muito superior àquela do grupo de controle positivo.

Exemplo Experimental 4: Eficácia anticâncer em camundongos de modelo in vivo singeneicos AML (WEHI-3)

[00121] A fim de identificar a eficácia in vivo sobre células AML com um sistema imunológico, a viabilidade dos camundongos foi avaliada por meio do transplante de células cancerígenas no sangue derivadas de camundongo (WEHI-3) em camundongos Balb/c.

[00122] A indução do câncer no sangue foi realizada especificamente da seguinte maneira. O grupo experimental consistiu em um grupo de veículo (7 camundongos), um grupo de administração de fármacos (7 camundongos) e um grupo de controle (7 camundongos). O composto 2 foi injetado como o grupo de administração de fármaco a 300 mg/kg e citarabina foi injetada como o grupo de controle positivo a 30 mg/kg (citarabina na mesma quantidade que 300 mg/kg de Composto 2).

[00123] As células WEHI-3 (linha celular AML de camundongo) foram injetadas por via intravenosa a uma densidade de 5 X 105(células/camundongo) em camundongos Balb/c com 8 semanas de idade. Como o fármaco administrado, o Composto 2 foi dissolvido em tampão de potássio a uma concentração de 2 mM, e a solução foi deixada para repousar a 4 °C por 6 horas.

[00124] O fármaco foi injetado subcutaneamente duas vezes ao dia por duas semanas a partir do segundo dia após a inoculação celular, e a viabilidade foi medida. Os resultados são mostrados na FIG. 7.

[00125] Como pode ser visto na FIG. 7, a taxa de sobrevivência do grupo de administração de fármacos foi significativamente melhorada em comparação com o grupo de veículo e a taxa de sobrevivência do grupo de administração de fármacos foi muito superior àquela do grupo de controle positivo.

Exemplo Experimental 5: Eficácia anticâncer em células mononucleares da medula óssea derivadas de pacientes recidivados/refratários

[00126] A fim de identificar a eficácia anticâncer em células cancerígenas no sangue de pacientes reais, células mononucleares da medula óssea derivadas de pacientes com leucemia mieloide aguda recidivada/refratária (R/R) foram usadas para a formação de colônias em relação ao Composto 2 e citarabina (AS 1411), respectivamente. As células foram providas após a aprovação do IRB no Asan Medical Center, em Seul. As células mononucleares da medula óssea foram semeadas em meios formadores de colônias e depois tratadas com 0,25 pM, 0,5 pM e 1 pM de cada fármaco, e cultivadas por 16 dias, e o número de colônias foi contado.

[00127] Como pode ser visto a partir da FIG. 8, o fármaco de controle positivo com a mesma concentração teve um efeito terapêutico insuficiente nas células cancerígenas no sangue recidivadas/refratárias, enquanto o Composto 2 teve um efeito anticâncer significativamente excelente.

Exemplo Experimental 6: Ensaios de toxicidade

[00128] Os ensaios de toxicidade nos ingredientes ativos da presente invenção foram realizados conforme a seguir.

[00129] O composto 2 foi dissolvido em tampão de potássio e a solução foi injetada a 1 g/kg em camundongos (10 camundongos por grupo) e depois observado por 7 dias. Como resultado, nenhum camundongo morreu, o que significa que a dose letal (LD50) era de pelo menos 1 g/kg.

[00130] Ademais, quando o fármaco foi administrado a camundongos normais sem câncer no sangue nas mesmas condições que no Exemplo Experimental 4, o leucócito normal foi rapidamente diminuído no grupo de controle, enquanto o grupo de administração de fármacos ao qual o Composto 2 foi administrado manteve contagem de glóbulos brancos relativamente alta (média do grupo de veículo: 6,29, intervalo do grupo de veículos: 4,70-8,97, média do grupo de administração de fármacos: 4,07, intervalo do grupo de administração de fármacos: 3,36-4,77, média do grupo de controle: 2,34, intervalo do grupo de controle: 0,95-4,31), exibindo, desse modo, segurança excelente. Em resumo, os resultados dos Exemplos Experimentais 3 a 5 mostraram que o Composto 2 mata especificamente células cancerígenas no sangue e minimiza a morte de células sanguíneas normais, exibindo assim excelentes características como um agente terapêutico direcionado ao câncer sanguíneo.

Exemplo de Preparação 1: Preparação da solução de injeção

[00131] Uma solução de injeção contendo 10 mg de Composto 2 foi preparada pelo seguinte método.

[00132] 1 g de Composto 2, 0,6 g de cloreto de sódio e 0,1 g deácido ascórbico foram

[00133] dissolvidos em água destilada para preparar uma solução de 100 ml. Uma garrafa foi preenchida com a solução e esterilizada por aquecimento a 20 °C por 30 minutos.

[00134] Os ingredientes para a solução de injeção são os seguintes: 1 g de ingrediente ativo0,6 g de cloreto de sódio0,1 g de ácido ascórbicoQuantidade adequada de água destilada

[00135] Embora as modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido divulgadas para fins ilustrativos, aqueles versados na técnica apreciarão que são possíveis diversas modificações, adições e substituições, sem se desviar do escopo e espírito da invenção, conforme divulgado nas reivindicações anexas.Texto livre da Listagem de SequênciaSequência N° 1: GGTGGTGGTTNTGGTGGTGGSequência N° 2: GGTGGTGGTNNTGGTGGTGGSequência N° 3: NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGSequência N° 4: NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG

Claims (3)

1. Ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo para formar uma estrutura G quadruplex caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo é representado pela seguinte sequência:GaTbNc,em que G é guanosina ou um derivado de guanosina;T é timina ou um derivado de timina;N é 1-β-D-arabinofuranosilcitosina como um ácido nucleico modificado;G, T e N são dispostos aleatoriamente por permutação; ea é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 20, b é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 10, e c é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 2, com a condição de que um total de a, b e c é um número inteiro selecionado a partir de 18 a 24.

2. Ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo é representado pela seguinte sequência:Sequência 1) GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG;Sequência 2) GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG;Sequência 3) NGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG; ouSequência 4) NNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG;em que G é guanosina ou um derivado de guanosina;T é timina ou um derivado de timina; eN é 1- β-D-arabinofuranosilcitosina como um ácido nucleico modificado.

3. Ácido nucleico modificado por oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a guanosina ou o derivado de guanosina compreende um ou mais selecionados dentre 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-O-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, LNA (ácido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina e D-guanosina.