BR112019018555A2

BR112019018555A2 - métodos e composições para tratamento de cânceres utilizando antissenso

Info

Publication number: BR112019018555A2
Application number: BR112019018555A
Authority: BR
Inventors: w andrews David; c hooper Douglas
Original assignee: Univ Jefferson
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2020-04-14
Also published as: US10357509B2; IL268872A; JP7681285B2; RU2766457C2; RU2019130010A; IL268872B2; US20210060055A1; CA3054662A1; RU2019130010A3; EP3592841A1; MX2024008496A; SG11201908054XA; CN118750590A; EP4378531A2; IL268872B1; US20240100078A1; EP3592841A4; US20190365794A1; KR20190140440A; MX2019010725A

Abstract

a presente invenção refere-se às composições e aos métodos para tratamento de cânceres utilizando ácidos nucleicos antissensos (as) direcionados contra receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (r1-fci). o as pode ser administrado aos pacientes sistemicamente, ou pode ser utilizado para produzir uma vacina autóloga de células cancerígenas. em modalidades, os as são proporcionados em uma câmara de biodifusão implantável irradiada compreendendo células tumorais e uma quantidade eficaz do as. as câmaras são irradiadas e implantadas no abdome de indivíduos e estimulam uma resposta imune que ataca tumores distalmente. as composições e os métodos descritos neste relatório podem ser utilizados para tratar muitos tipos diferentes de cânceres, por exemplo, glioblastoma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE CÂNCERES UTILIZANDO ANTISSENSO.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS [001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisória N^QS. 62/469.003 depositado em 09 de março de 2017 e 62/629.972 depositado em 13 de fevereiro de 2018, cada um, intitulado Métodos e Composições para Tratamento de Cânceres Utilizando Antissenso, cuja descrição é aqui incorporada como referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se às composições e a métodos para tratamento de cânceres utilizando ácidos nucleicos antissensos direcionados contra Receptor 1 de Fator de Crescimento semelhante à insulina (R1-FCI). A presente invenção também se refere às composições e os métodos de tratamento de cânceres por meio de tratamento de indivíduos com pelo menos uma câmara de biodifusão irradiada implantável (ver, Patente dos Estados Unidos N^Q. 6.541.036 e PCT/US2016/026970, as quais são incorporadas neste relatório como referência em suas totalidades) a qual compreende células tumorais e ácido nucleico antissenso direcionado contra R1-FCI.

DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO APRESENTADO ELETRONICAMENTE [003] O conteúdo do arquivo de texto submetido eletronicamente aqui é incorporado como referência em sua totalidade: uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequência (nome do arquivo: IMVX_005_02WO_SeqList.txt, data registrada em 8 de março de 2018, tamanho do arquivo 12 quilobytes).

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FUNDAMENTO [004] Apesar dos avanços na terapia do câncer, o prognóstico para glioma maligno, particularmente, glioblastoma multiforme, e muitos outros tipos de cânceres permanece ruim. Modificações de tratamentos padrão, tais como, por exemplo, quimioterapia, radiação de feixe externo e braquiterapia fornecem apenas pequenos incrementos de melhoria tanto na sobrevivência livre de progressão quanto na sobrevivência global. Ensaios de imunoterapia, apesar de promissores em teoria, não abordaram os desafios criados por tumores sólidos. Para o tratamento de glioma, o Instituto Nacional do Câncer estima uma incidência anual de cerca de 28.000 casos por ano, o que aumenta para mais de 50.000 se os pacientes com gliomas recorrentes fossem incluídos. Portanto, existe uma necessidade no estado da técnica de se obter tratamentos novos e aperfeiçoados para cânceres, e câncer do cérebro em particular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005] A presente invenção demonstra que um oligodesoxinucleotídeo antissenso (ODN AS) direcionado ao receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (R1-FCI) estimula eficazmente uma resposta em um indivíduo que trata câncer quando utilizada nas abordagens terapêuticas aqui descritas. Em aspectos particulares, os métodos são eficazes para tratamento de câncer em um paciente como parte de uma vacina autóloga de células cancerígenas isolada ou, opcionalmente, juntamente com administração sistêmica. Em abordagens preferidas, os métodos descritos neste relatório proporcionam terapia de câncer eficaz como uma monoterapia; isto é, na ausência de quimioterapia e na ausência de radioterapia.

[006] Em modalidades, a presente invenção proporciona uma câmara de biodifusão para implantação em um indivíduo que sofre de um tumor, a câmara de biodifusão compreendendo células tumorais

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3/88 irradiadas e oligodesoxinucleotídeo antissenso do receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina irradiado (ODN AS do R1-FCI). Em modalidades, as células tumorais são removidas a partir de um sítio de resseção do indivíduo.

[007] Em modalidades, a presente invenção proporciona uma câmara de difusão compreendendo ODN AS do R1-FCI irradiado e células tumorais morcelizadas irradiadas enriquecidas em adesão, em que a câmara de biodifusão compreende uma membrana que é impermeável às células e permeáveis ao ODN AS do R1-FCI.

[008] Em modalidades, as células tumorais são removidas a partir do sítio de resseção utilizando um dispositivo endoscópico. Em outras modalidades, as células tumorais são removidas do sítio de resseção utilizando um morcelador (morselator) de tecidos. Em outras modalidades, o morcelador (morselator) de tecidos compreende uma cânula interna recíproca de alta velocidade dentro de uma cânula externa estacionária. A cânula externa pode compreender uma abertura lateral e, adicionalmente, em que as células tumorais são arrastadas para a abertura lateral por meio de sucção variável controlada eletronicamente. Em modalidades, o morcelador de tecidos não produz calor no sítio de ressecção. Em ainda modalidades adicionais, as células tumorais são enriquecidas de expressão de nestina antes de serem colocadas na câmara de biodifusão. Em algumas modalidades, implantação da câmara inibe recrescimento do tumor no indivíduo. Em algumas modalidades, implantação da câmara inibe recrescimento do tumor por pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses ou pelo menos 36 meses.

[009] Em modalidades adicionais, a presente invenção proporciona um método de preparação de uma câmara de biodifusão para implantação em um indivíduo que sofre de um tumor, método este que compreende colocação de células tumorais na câmara de

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4/88 biodifusão na presença de um ODN AS do R1-FCI, e irradiação da câmara de biodifusão, em que as células tumorais são removidas de um sítio de resseção no indivíduo utilizando um morcelador (morselator) de tecidos que não produza calor no sítio de resseção. Tipicamente, múltiplas câmaras são utilizadas. Por exemplo, cerca de 10 câmaras, ou cerca de 20 câmaras. Vantajosamente, obtém-se uma resposta antitumoral ótima quando o número de células na câmara é de cerca de 750.000 a cerca de 1.250.000; por exemplo, cerca de 1.000.000 por câmara, onde 20 câmaras são implantadas.

[0010] Em algumas modalidades, o morcelador de tecidos é um dispositivo endoscópico. Em modalidades adicionais, o morcelador de tecidos compreende uma cânula interna recíproca de alta velocidade dentro de uma cânula externa estacionária. Em modalidades adicionais, a cânula externa compreende uma abertura lateral, e as células tumorais são arrastadas para a abertura lateral por meio de sucção variável controlada eletronicamente.

[0011] Em modalidades, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de um tumor, método este que compreende implantação de uma ou mais câmaras de biodifusão no indivíduo, em que uma ou mais câmaras de biodifusão compreendem células tumorais irradiadas e oligodesoxinucleotídeo antissenso do receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina irradiado (ODN AS do R1-FCI), em que as células tumorais são removidas de um sítio de resseção no indivíduo utilizando um morcelador de tecidos que não produza calor no sítio de resseção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0012] Figuras 1a-1g representam uma câmara de biodifusão representativa. Figura 1a. partes componentes; Figura 1b. câmara montada; Figura 1c. Plugue da porta de PMMA para selar a câmara;

Figura 1d. fotomicrografia de membrana Durapore de fluoreto de

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5/88 polivinilidina; Figura 1e. visão aérea e lateral da câmara real; Figura 1f. e Figura 1g. Η & E corou seções de parafina de membranas Durapore após explantação; Figura 1f. câmara de controle de solução salina tamponada com fosfato explantado a partir de ensaio humano 14379101; Figura 1 g. câmara de vacina explantada de ensaio humano 14379101.

[0013] Figuras 2a-2c representam medições de sobrevivência de indivíduos no ensaio de Fase I (IND 14379-101, NCT01550523). Figura 2a. Sobrevivência global de pacientes em ensaio; Figura 2b. sobrevivência do protocolo com duas coortes de sobrevivência. Nove pacientes morreram de progressão da doença, enquanto um morreu de hemorragia intracerebral e dois de sepse. Sobrevivência do protocolo global foi de 48,2 semanas e 9,2 semanas, respectivamente, para mais (N = 4) e menos (N = 8) coortes de sobrevivência (log-rank = 0,014). Figura 2c. Excluindo-se um valor atípico (outlier) profundamente linfopênico e três óbitos não relacionados à doença, regressão linear revelou alta correlação entre sobrevivência do protocolo e contagem de linfócitos no recrutamento (R² = 0,8, p = 0,0028).

[0014] Figuras 3a-3d mostra respostas radiográficas com medidas fisiológicas associadas. Figura 3a. Exemplos de imagens de pacientes de coorte de curta sobrevivência. Paciente TJ11: A-D; Paciente TJ10: E-H. A, E: imagens axiais pré-operatórias realçadas por gadolínio-T1; G: imagem coronal realçada por gadolínio-T1; C: imagem FLAIR axial pré-operatória. B, D, F, H: imagens respectivas pós-operatórias de 3 meses. Figura 3b. Exemplos de imagens de pacientes de uma coorte de sobrevivência mais longa. Paciente TJ06: A-D; Paciente TJ09: E-H. A, E: imagens axiais pré-operatórias realçadas por gadolínio-T1; C, F: imagens FLAIR axiais pré-operatórias. B, D, F, H: imagens respectivas pós-operatórias de 3 meses. Figura 3c. Relação entre o volume sanguíneo cerebral relativo no coeficiente de difusão aparente versus

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6/88 tumor em coorte de sobrevivência mais longa; existe uma alta correlação entre o ADC e o rCBV (R² = 0,96, p = 0,0005). Figura 3d. Relação entre o volume sanguíneo cerebral relativo no coeficiente de difusão aparente versus tumor em coorte de sobrevivência curta.

[0015] Figuras 4a-4c representam um exame das câmaras explantadas por coortes de sobrevivência. Figura 4a. As câmaras explantadas estavam estruturalmente intactas, sem células viáveis. As superfícies externas de membranas tanto das câmaras C-p quanto de C-v foram revestidas com células CD15+ e CD163+, com números dramaticamente elevados nas membranas C-v; Figura 4b. análise de fatores em câmaras entre coortes de sobrevivência revelou elevações significativas da câmara de VEGF, PDGF-α, IL-11, CCL5, MCP-3 e MIP1d na coorte mais longa enquanto um número de marcadores de câncer solúveis foi significativamente elevado na coorte curta, incluindo, NSE, osteonectina e YKL40. Análise discriminante da mistura identificou independentemente essas diferenças de coorte; Figura 4c. para ambas as coortes, duas quimiocinas associadas ao recrutamento de macrófagos com glioma foram significativamente menores em C-v do que outras fontes mensuráveis. Níveis de periostina e CCL2 foram significativamente menores do que valores séricos ou SN (sobrenadante de células tumorais), sugerindo a eliminação de células produtoras dessas quimiocinas nas câmaras.

[0016] Figuras 5a-5e representam níveis pós-vacinação de PBMCs e citocinas. Medições em série de alterações celulares imunoefetoras e alterações de citocinas/quimiocinas após vacinação no período póstratamento; coorte de sobrevivência mais longa (pacientes TJ03, TJ14, TJ06, TJ09); exemplo de coorte de sobrevivência curta, paciente TJ13 (para todas as outras coortes de sobrevivência curta, ver (Figura 6). Fileiras: Figura 5a. contagens em série de PBMC após vacinação; Figura 5b. avaliações em série de porcentagens de subpopulação de

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PBMC após vacinação, Figura 5c. níveis em série de CCL21 e CXCL12; Figura 5d. relação de contagens absolutas de macrófagos CD14 + CD16 com MCP-1 (CCL2); observe correlação com níveis de macrófagos na Figura 5b. e pico de CCL2 pós-operatório. Níveis de CCI2 permaneceram significativamente mais altos na coorte de sobrevivência curta (ver, (Figura 6); Figura 5e. comparações em escala de respostas putativas de citocina TH-1 após vacinações (TNF-α x 2; CXCL9 x 350; CXCL10 x 80). Correlações significativas foram observadas como seguem: picos de TNF-α foram altamente correlacionados com picos de CCL2 para ambas as coortes (R² = 0,99, p = 0,003). Houve uma significativa redução perioperatória imediata nas células CD14 + 16 (p = 0,008) não observadas na coorte curta (p = 0,78). Para a coorte mais longa apenas, houve uma correlação significativa entre CD4 e CXCL12 (R² = 0,62, p <0,0001). Também, observou-se uma alta correlação entre a contagem total de monócitos e os níveis de monócitos de CD14 + 16 ((Figuras 5B e 5D, R² = 0,8, p <0,0001) e relações inversas entre os números de células T e monócitos circulantes (R² = 0,66, p <0,0001) foram observados na coorte de sobrevivência mais longa ((Figura 5) sem diferenças significativas na coorte de sobrevivência curta (ver Figura 6).

[0017] Figuras 6a-6e representa níveis pós-vacinação de PBMC e citocinas em pacientes de coorte curta, (pacientes TJ01, TJ01, TJ07, TJ08, TJ10, TJ11, TJ12); Fileiras: Figura 6a. contagens de PBMC em série após vacinação; Figura 6b. avaliações em série de porcentagens de subpopulação de PBMC após vacinação (célula T; célula B; monócito); Figura 6c. níveis em série de CCL21 e CXCL12; Figura 6d. relação de contagens absolutas de macrófagos CD14 + CD16- com MCP-1 (CCL2). Níveis de CCI2 permaneceram significativamente mais elevados na coorte de sobrevivência curta em comparação com a coorte de sobrevivência longa. Figura 6e. comparações em escala de

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8/88 respostas putativas de citocina TH-1 após vacinações (TNF-α x 2; CXCL9 x 350; CXCL10 x 80). IFN-g também é mostrado.

[0018] Figuras 7a-7h representam a perda de populações de células de monócitos promotoras de tumores, específicas após vacinação. Regressão substancial do tumor foi observada durante um período de 3 meses. Figura 7a. Tendência monofásica de R1-FCI TME + células (escala ordinal); em casos de pares combinados de diagnóstico inicial para vacinação (N = 5) sem diferença significativa; pares combinados de vacina para autópsia (N = 4) revelam uma redução significativa em R1-FCI + células (p = 0,003). Figura 7b. Células positivas para R1-FCI em dois pacientes com seções de parafina avaliáveis a partir de diagnóstico inicial por meio de vacina e autópsia (pacientes TJ06 e TJ10). Figura 7c. Tendência bifásica para macrófagos TME CD163 M2 com aumento significativo de diagnóstico para recorrência (cinco campos Aperio de 400 x por fase de tratamento por paciente; gráfico esquerdo, pares combinados *p <0,0001, N = 6) seguido por perda significativa de recidiva para autópsia após vacinação (gráfico direito, pares combinados *p <0,0001, N = 4). Figura 7d. Células CD163+ nos mesmos dois pacientes com seções de parafina avaliáveis, a partir de diagnóstico inicial por meio de vacina e autópsia (pacientes TJ06 e TJ10); aumento em CD163 sob vacina versus recorrência (pares combinados, p = 0,052) seguido por redução significativa em macrófagos TME CD163 M2 sob autópsia versus vacina (pares combinados, *p = 0,001). Figura 7e. Correlação significativa na coorte de sobrevivência curta entre monócitos CD163 periféricos e níveis de TAM de CD163 documentados sob cirurgia (R² = 0,80, p = 0,02). Figura 7f. Correlação não significativa entre células periféricas e TAM CD163 na coorte mais longa. Figura 7g. Fotomicrografias de imuno-histoquímica de fluorescência de seções de parafina. A, C: Paciente TJ10 na segunda resseção cirúrgica antes de vacinação e B,

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D: em autópsia; E-H: amostras de autópsia obtidas a partir de pacientes com glioblastoma submetidos à re-resseção após tratamento padrão; I, J: glioblastoma post-mortem não tratado verificado incidentalmente. Figura 7h. Curso de tempo para resposta ao tratamento em TJ06, a partir de diagnóstico inicial por meio de autópsia. Ocorrência bifásica de células CD163 no TME com aumento após tratamento padrão e redução após vacinação por meio de autópsia. Perda de CD163 TAMs é associada aos aumentos tanto em valores de rCBV quanto de ADC no tumor. Níveis séricos de nitrato aumentam após cada vacinação e são associados aos aumentos concomitantes de rCBV/ADC.

[0019] Figuras 8a-8d representam diferenciação de monócitos imaturos por citocinas ou soro de indivíduo do estudo. Figura 8a. Indução de R1-FCI após polarização de monócitos com citocinas M2. Macrófagos M1 não induzem o R1-FCI, ***p = 0,0004. Figura 8b. Diferenças em distribuição de subconjuntos de monócitos após tratamento com ODN AS de R1-FCI de acordo com o protocolo de polarização de macrófagos descrito em materiais e métodos. Citometria de fluxo revela que ODN AS de R1-FCI direciona seletivamente a remoção de macrófagos M2. Figura 8c. Protocolo do soro de paciente diferencia monócitos imaturos em um fenótipo CD163+ que coexpressa R1-FCI e PD-L1. ODN AS de R1-FCI elimina essa população de macrófagos em um modo dependente de dose ao longo de uma faixa de concentração de 100 vezes. Todos os valores são intensidade média da fluorescência. Medições em duplicata para cada coincubação do soro de paciente, comparação de médias. ***p <0,0001, **p = 0,0001, *p = 0,0002, ♦ ♦♦p = 0,0003, = 0,0009, *p = 0,009, **p = 0,0018, *p = 0,026. Figura 8d. Resumo de médias na Figura 8c.

[0020] Figuras 9a-9d mostram que comparados com padrão de tratamento na primeira análise interina, houve melhorias significativas tanto na sobrevivência livre de progressão quanto na sobrevivência

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10/88 global. Figura 9a. Sobrevivência livre de progressão (SLP) de toda a coorte de estudo em comparação com o padrão de cuidados (PDC); linhas pretas pontilhadas são intervalo de confiança de 95%; Figura 9b. Sobrevivência global (SG). Em ambos os casos, o PDC cai abaixo do IC de 95% inferior, refletindo uma melhoria significativa; Figura 9c. SLP por coorte de sobrevivência sob análise interina; Figura 9d. SG por coorte de sobrevivência na análise interina.

[0021] Figuras 10a-10d representam um resumo do estudo de Fase 1b e uma comparação de níveis de interferon-gama com o ensaio anterior e entre coortes dentro do ensaio. Figura 10a. Tendência de aumentar o IFN-γ após vacinação na coorte de vacina recentemente diagnosticada (p = 0,06); Figura 10b. Aumento significativo em IFN-γ mediano na coorte de vacina recentemente diagnosticada (p = 0,02); Figura 10c. Aumentos significativos em níveis de IFN-γ em 20 coortes de câmaras ***p <0,0001, **p <0,006, *p <0,02; Figura 10d. Taxa de difusão de ODN AS do R1 -FCI marcada a partir da câmara de biodifusão ao longo do tempo.

[0022] Figuras 11a-11j representam o efeito de câmara de biodifusão totalmente formulada (tanto irradiação quanto ODN AS adicionado de forma exógena) em produção de citocina pró-inflamatória em um modelo de camundongo virgem (naive). Análise Luminex de teores da câmara de camundongo explantado em 24 horas pós-implante preenchido com células GL261 isoladas; formulação parcial com adição de 2 pg de ODN AS do R1-FCI, irradiação de células GL261 com 5 Gy de irradiação por raios X; ou a vacina autóloga totalmente formulada (GL261,2 pg de ODN AS do R1 -FCI e 5 Gy de irradiação gama). Figura 11a. G-CSF GL261-AS-irradiação versus irradiação de GL261 p <0,0117; Figura 11b. IL-1 a, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,008; Figura 11c. IL-1 b, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0067; Figura 11 d. IL-2, irradiação de GL261Petição 870190088024, de 06/09/2019, pág. 110/211

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AS versus irradiação de GL261 p <0,0002; Figura 11e. IL-9, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0413; Figura Ilf. IL-10, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0001; Figura 11g. IL-12 (p40), irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,001; Figura 11 h. IL-13, irradiação de GL261 -AS versus irradiação de GL261 p <0,0065; Figura Iii. IL-15, irradiação de GL261-AS versus GL261 p <0,0013; Figura 11 j- M-CSF, irradiação de GL261-AS versus PBS p = 0,007. Outros testados mas não mostrados: IL-6, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p< 0,0836; GM-CSF, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0854; lix, irradiação de GL261-AS versus GL261 p <0,0001; kc, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0112; TNF-α, irradiação de GL261 -AS versus irradiação de GL261 p <0,0082; VEGF, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0004; //7, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0140; IL-7, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0038; IL-12 (p70) irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0120; IFN-γ, irradiação de GL261-AS versus irradiação de GL261 p <0,0290.

[0023] Figura 12 mostra curvas de titulação para ativação de células dendríticas (CD) de células mononucleares do sangue periférico (C MSP) de dois indivíduos normais (escuro e claro) por ODN AS do R1-FCI; 750 pg de NOBEL antissenso versus 75 pg de NOBEL sense,

7,5 pg, 750 pg de DWA antissenso, 7,5 pg, controle, ***p <0,0009; 75 pg de NOBEL antissenso versus 7,5 pg de NOBEL sense, DWA antissenso.

[0024] Figuras 13a-13b representam resposta in vitro de células T a partir de teores de câmara totalmente formulada utilizando células T derivadas de camundongos vacinados. Figura 13a. Resposta próinflamatórias de células T com CDs iniciadas com antígeno recuperado de câmaras; **p <0,01 para formulação completa in vitro versus sem

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12/88 antígeno; *p <0,03 para a formulação completa versus exossomas; Figura 13b. Resposta pró-inflamatórias de células T com CDs pulsadas com antígeno recuperado de câmaras; **p <0,005 para formulação completa versus sem antígeno; *p <0,007 para formulação completa versus exossomas.

[0025] Figuras 14a-14d são representações esquemáticas de resposta bifásica para titulação de dose de NOBEL antissenso.

[0026] Figuras 15a-15b representam de polarização de M2 de monócitos alogênicos de três indivíduos normais com incubação durante a noite de soro derivado de seis pacientes com glioma diferentes. Controles não foram incubados com soro. Uma curva de diluição de 1.000 vezes revelou uma redução de macrófagos M2 coexpressando Figura 15a. PDL-1 e Figura 15b. CD163 de 100 pg de NOBEL antissenso para uma eliminação (knockdown) significativa em 1 pg. Linha em cada gráfico é uma grande média. 1 pg de NOBEL versus não tratado ***p <0,0002.

[0027] Figura 16 representa comparação de níveis de citocina da câmara de vacina explantada versus câmara de controle explantada de PBS. ***p, 0,005; ***p <0,01; ***p <0,02; **p <0,03; *p <0,05.

[0028] Figura 17 é uma curva dose-resposta, mostrando a resposta bifásica de ODN AS de R1-FCI sistêmico sobre inibição de crescimento do tumor de glioma no flanco. Foram implantadas 10⁶ células GL261 nos flancos de camundongos C57BL/6 e 20 dias posteriores, antes do período quando uma elevação em células positivas para CD163 é tipicamente observada, o camundongo foi injetado intraperitonealmente com uma única dose de 0,75 mg (quadrados) ou 0,075 mg (triângulos) de ODN AS de R1-FCI de NOBEL. Os camundongos foram então seguidos para desenvolvimento tumoral. Camundongos não-vacinados (círculos) foram usados como controle.

[0029] Figura 18 são dados de citometria de fluxo mostrando que

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13/88 tratamento sistêmico com ODN AS de R1-FCI inibiu a acumulação de monócitos M2 circulantes. Os dados são expressos como um histograma de números de células que expressam CD163 (pico da mão direita) onde uma linha rotulada veículo representa camundongos implantados em tumor tratados com PBS (veículo) e a outra linha rotulada ODN AS representam camundongos implantados tratados com ODN AS de R1-FCI de NOBEL. Essas linhas são anotadas na Figura.

[0030] Figura 19 mostra incidência de tumores em camundongos implantados no flanco com células de glioma, tratadas com ODN AS de R1-FCI de NOBEL ou PBS (veículo). Incidência de tumores entre os grupos tratados e não tratados foi significativamente diferente (* = p <0,05).

[0031] Figura 20 mostra incidência de tumores em camundongos deficientes de Tbet implantados no flanco com células de glioma e tratados com ou sem ODN AS de R1-FCI de NOBEL. Incidência de tumores entre os grupos foi significativamente diferente (* = p <0,05).

[0032] Figuras 21a, 21b e 21c mostram níveis de citocina próinflamatória (pg/ml) em soro do paciente após vacinação, reunidos a partir de extração de sangue em série ao longo do tempo (14-42 dias pós- cirurgia). Um aumento significativo dependente de dose em citocinas pró-inflamatórias foi observado no soro do paciente Figuras 21 d, 21 e, e 21 f representam a relação (melhor ajuste polinomial) entre rendimento de peso úmido de tecido tumoral e rendimento de citocina por indivíduo. Um rendimento de peso úmido de tecido de 3 gramas produziu o maior rendimento de citocina quando, após processamento, as células foram distribuídas entre 20 câmaras.

[0033] Figura 22 é um esquema de uma câmara de biodifusão totalmente formulada representativa. Quando a câmara é implantada em um paciente, moléculas antissenso e antigenos tumorais difundemPetição 870190088024, de 06/09/2019, pág. 113/211

14/88 se através das membranas porosas da câmara, levando a uma resposta imune específica ao tumor, polarização reduzida de M2 e redução no número de células M2+.

[0034] Figura 23 é um esquema de um método de imunização representativo. Se um paciente não responder adequadamente a uma primeira rodada de vacinação, o procedimento é opcionalmente repetido quantas vezes forem necessárias, às vezes em combinação com outros tratamentos.

[0035] Figuras 24a e 25b são curvas de Kaplan-Meier ilustrando sobrevivência mediana livre de progressão (SLP) e sobrevivência global mediana (SG) no grupo intenção de tratamento (N = 30), respectivamente, em pacientes humanos com tumores cerebrais. (Análise interina é mostrada na (Figura 9 acima). A população vacinada é tratada com 20 câmaras implantadas e cada câmara contendo 2 pg de NOBEL. A população SoC é representada usando dados históricos (N = 76). Os dados mostram sobrevivência substancialmente elevada tanto para progressão global quanto sem progressão do câncer.

[0036] Figuras 25a e 25b são curvas de Kaplan-Meier ilustrando sobrevivência livre de progressão e sobrevivência global, comparando o mesmo sexo e idade mediana nos grupos vacinados e Standard of Care (SoC), respectivamente. Os dados mostram uma sobrevivência substancialmente elevada tanto para progressão global quanto sem progressão do câncer.

[0037] Figuras 26a e 26b são curvas de Kaplan-Meier ilustrando sobrevivência livre de progressão e sobrevivência global quando excluídos os 5 pacientes que se retiraram do tratamento e que morreram de outras causas.

[0038] Figuras 27a e 27b são curvas de Kaplan-Meier ilustrando sobrevivência livre de progressão e sobrevivência global quando

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15/88 excluídos os 9 pacientes que não completaram o protocolo de tratamento padrão (Standard of Care) (SOC).

[0039] Figuras 28a, 28b, 28c, 28d. ilustram respostas de IFN-γ induzidas com base no rendimento celular na coorte alta de vacinas. Os dados mostram que a liberação ótima de IFN-γ, baseados no número de células na câmara. Para as Figuras 28a e 28b, o rendimento celular é mostrado em milhões de células. IFN-γ são mostrados como intensidade fluorescente média (IFM). Esses dados são a partir da coorte de 20 câmaras com cada câmara contendo 2 pg de NOBEL. Os dados são apresentados como um ajuste polinomial (cúbico). Figuras 28c e 20db são um extrato dos dados em Figuras 28a e b mostrando a relação substancialmente linear entre o rendimento do número de células versus a resposta média e pico de IFN-γ, respectivamente, até 20 milhões de células. Os dados são apresentados aqui como pg/ml.

[0040] Figuras 29a, 29b e 29c ilustram resposta das células T de IFN-γ relativa à formulação da câmara com relação à pré-incubação antissenso do R1-FCI antes de encapsulação. Figura 29a mostra o protocolo para avaliar resposta das células T ao antígeno tumoral. Em relação a Figura 29b antígeno foi preparado seguindo o paradigma da câmara clínica in vivo. Cerca de, 1 milhão de células tumorais GL261 ex-vivo foram injetados nas câmaras isoladas ou com concentrações antissenso indicadas e incubadas durante a noite na câmara que foi colocada em PBS). No dia seguinte, teor da câmara foi extraído e usado para pulsar células dendriticas virgens (naive). O teor da câmara que não foi tratado durante a noite com antissenso foi adicionado às células dendriticas com as quantidades indicadas de NOBEL. Células dendriticas também foram deixadas virgens para controle. Após um pulso durante a noite com antígeno, células dendriticas foram coletadas e incubadas durante a noite com células T de animais imunizados em uma placa de cultura de células revestida com um anticorpo de detecção

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ELIPSPOT para a citocina IFN-γ. Após incubação durante a noite, a placa revestida foi processada e desenvolvida para enumerar o número de células T produtoras de IFN-γ que responderam a cada antígeno respectivo. Os dados na Figura 29b mostram que antígenos de tumor foram detectados em materiais recuperados de câmaras contendo células GL261 mais antissenso mas não materiais de câmaras cultivadas com células isoladas, mesmo se o antissenso fosse adicionado ao material quando as células dendríticas (CD) fossem pulsadas. Os dados ilustram que o antissenso em câmaras com as células de glioma é necessário para produzir antígeno tumoral imunoestimulatório. Em relação à Figura 29c, as células GL261 foram colocadas em placas de Petri e tratadas durante a noite com 4 mg de NOBEL por 1 milhão de células ou foram deixadas sem tratamento. As células foram então coletadas e colocadas em câmaras a 1 milhão de células e 2 pg de NOBEL por câmara. As câmaras foram então incubadas durante a noite em PBS e o teor foi extraído no dia seguinte. As células dendríticas foram então pulsadas com o teor da câmara e secreção de IFN-γ foi medida como descrito acima. Os dados ilustram que o tratamento durante a noite de células GL261 com antissenso intensifica a quantidade de antígeno produzido por essas células conforme detectado por um aumento nos números de células T imunes a tumores que produzem IFN-γ.

[0041] Figuras 30a, 30b, 30c e 30d ilustram os níveis de impacto de expressão de nestina sobre eficácia em um modelo de camundongo. Figura 30a mostra que alto nível de nestina é associado a uma sobrevivência aperfeiçoada seguindo tratamento com antissenso de R1-FCI. Camundongos foram implantados no flanco com câmaras contendo células GL261 que expressam os maiores ou baixos níveis da proteína nestina, bem como, 4 mg de antissenso. Um grupo de controle recebeu altas células expressando nestina sem

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17/88 antissenso adicionado. As câmaras foram deixadas no flanco por 24 horas. A resposta imune foi em seguida deixada desenvolver-se por várias semanas e os camundongos foram desafiados intracranialmente em 35 dias pós-implantação da câmara. Os camundongos imunizados, bem como, controles não imunitários, foram monitorados quanto à sobrevivência após desafio. Figura 30b mostra que um nível elevado de nestina é associado a um melhor índice de doença clínica. Os dados mostram morbidade pontuada associada à progressão do tumor cerebral em modelo ortotópico após vacinação com câmara totalmente formulada por coorte de tratamento. Figura 30c e Figura 30d mostram produção elevada de anticorpo contra células GL261 associadas aos níveis elevados de expressão de nestina. Figura 30c mostra 28 dias de ensaio ELISA de células de implantação pós-câmara/pré-intracraniana realizados com soros de camundongos experimentais foram testados em relação à reatividade de anticorpos com células GL261; soros isolados de sangue total retirado dos camundongos. Os soros foram testados em relação à reatividade total de IgG para células GL261 com um ensaio ELISA. Figura 30d mostra dados de ELISA celular a partir de 35 dias pósdesafio intracraniano/71 dias pós-explanação da câmara, utilizando soros de camundongos experimentais, testados em relação à reatividade de anticorpos com células GL261.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições [0042] Todos os termos não definidos neste relatório apresentam seus significados comuns reconhecidos no estado da técnica.

[0043] Conforme utilizado neste relatório, termos tais como um, uma, e o, a incluem referentes singulares e plurais a não ser que o contexto claramente demande de outro modo.

[0044] Conforme utilizado neste relatório, o termo cerca de

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18/88 quando se precede um valor numérico indica o valor mais ou menos uma faixa de 10%. Por exemplo, cerca de 100 abrange 90 e 110.

[0045] Conforme utilizado neste relatório, o termo autólogo significa células ou tecidos obtidos do mesmo indivíduo.

[0046] Conforme utilizado neste relatório, o termo vacina autóloga de células cancerígenas refere-se a uma terapêutica produzida em parte através do isolamento de células tumorais de um indivíduo e processamento dessas células tumorais ex vivo. As células são então readministradas ao indivíduo a partir de quem as células tumorais foram isoladas. Em modalidades, uma vacina autóloga de células cancerígenas pode compreender componentes adicionais além das células tumorais, tais como um tampão e/ou ácidos nucleicos antissensos. Em modalidades, vacina autóloga de células cancerígenas pode referir-se a uma câmara de biodifusão contendo as células tumorais e um ou mais componentes adicionais. Em certos aspectos, a vacina autóloga de célula cancerígena pode ser uma câmara totalmente formulada também referida neste relatório como câmara de biodifusão totalmente formulada.

[0047] Conforme utilizado neste relatório, o termo câmara totalmente formulada ou câmara de biodifusão totalmente formulada é uma câmara de biodifusão que inclui células tumorais autólogas e outras células incluídas no microambiente tumoral (MAT) que podem ou não ser tratadas antes de encapsulação na câmara com uma primeira quantidade de um ODN AS de R1-FCI. As células são encapsuladas com adição exógena de uma segunda quantidade, por exemplo, pelo menos 2 pg, de ODN AS de R1-FCI e a câmara é em seguida irradiada com 5 Gy de irradiação gama.

[0048] Conforme utilizado neste relatório, o termo pequenas moléculas inclui ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas e outras substâncias químicas (tais como, por exemplo, citocinas e hormônios

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19/88 de crescimento produzidos por células), mas não inclui células, exossomas ou microvesículas.

[0049] O termo direcionando expressão de R1-FCI ou direciona expressão de R1-FCI, conforme utilizado neste relatório, refere-se à administração de um ácido nucleico antissenso que apresenta uma sequência projetada para se ligar ao R1-FCI.

[0050] Conforme utilizado neste relatório, o termo administração sistêmica refere-se à obtenção da transferência de uma substância em todo o corpo de um indivíduo. Vias sistêmicas típicas de administração incluem administração parenteral, administração transdérmica, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração subcutânea e administração intramuscular.

[0051] Outras vias de administração incluem administração oral, administração tópica de administração nasal, administração intraocular, administração bucal, administração sublingual, administração vaginal, intra-hepática, intracardíaca, intrapancreática, por inalação e através de uma bomba implantada.

Moléculas Antissensos [0052] Moléculas antissensos são ácidos nucleicos que funcionam ligando-se a uma sequência complementar direcionada de RNAm por regras de emparelhamento de bases de Watson e Crick. A tradução de RNAm alvo é inibida por um mecanismo ativo e/ou passivo quando ocorre a hibridação entre as hélices complementares. No mecanismo passivo, a hibridação entre o RNAm e a sequência nucleotídica exógena leva à formação de um duplex que impede o complexo ribossômico de ler a mensagem. No mecanismo ativo, a hibridação promove a ligação de RnaseH, que destrói o RNA, mas deixa o antissenso intacto para hibridar-se com outro alvo de RNAm complementar. Qualquer um ou ambos os mecanismos inibem a tradução de uma proteína que contribui ou sustenta um fenótipo maligno. Como agentes terapêuticos, as

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20/88 moléculas antissensos são muito mais seletivas e, como resultado, mais eficazes e menos tóxicas do que as drogas convencionais.

[0053] Os métodos e composições descritas neste relatório envolvem o uso de moléculas antissensos para tratamento de câncer. Tipicamente, a molécula antissenso é um oligodesoxinucleotídeo antissenso (ODN AS). Em algumas modalidades, a molécula antissenso compreende uma estrutura principal (backbone) de fosfato modificado. Em certos aspectos, a modificação da estrutura principal de fosfato torna o antissenso mais resistente à degradação de nuclease. Em certas modalidades, a modificação é um antissenso bloqueado. Em outras modalidades, a modificação é uma ligação fosforotiato. Em certos aspectos, o antissenso contém uma ou mais ligações fosforotioato. Em certas modalidades, as ligações de fosforotioato estabilizam a molécula antissenso conferindo resistência à nuclease, desse modo, aumentando sua meia-vida. Em algumas modalidades, o antissenso pode ser ligado parcialmente ao fosforotioato. Por exemplo, até cerca de 1%, até cerca de 3%, até cerca de 5%, até cerca de 10%, até cerca de 20%, até cerca de 30%, até cerca de 40%, até cerca de 50%, até cerca de 60%, até cerca de 70%, até cerca de 80%, até cerca de 90%, até cerca de 95%, ou até cerca de 99% do antissenso podem ser ligados ao fosforotioato. Em algumas modalidades, o antissenso é ligado totalmente ao fosforotioato. Em outras modalidades, ligações de fosforotioato podem alternar-se com ligações de fosforodiéster. Em certas modalidades, o antissenso apresenta pelo menos um monofosfato de fosforotioato terminal.

[0054] Em algumas modalidades, a molécula antissenso compreende um ou mais motivos (motifs) de CpG. Em outras modalidades, a molécula antissenso não compreende um motivo de

CpG. Em certos aspectos, um ou mais motivos de CpG são metilados.

Em outros aspectos, um ou mais motivos de CpG não são metilados.

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Em certas modalidades, um ou mais motivos de CpG não metilados desencadeiam uma resposta imune inata quando a molécula antissenso é administrada a um indivíduo. Em alguns aspectos, a resposta imune inata é mediada por ligação da molécula antissenso contendo CpG não metilado para receptores semelhantes a 7o//(RST).

[0055] Em certas modalidades, a molécula antissenso compreende pelo menos uma modificação terminal ou cap. A cobertura (cap) pode ser uma estrutura de cobertura 5’ e/ou 3’. Os termos cap ou cobertura de extremidade incluem modificações químicas em cada término do oligonucleotídeo (com relação aos ribonucleotídeos terminais), e incluindo, modificações na ligação entre os dois últimos nucleotídeos na extremidade 5' e os últimos dois nucleotídeos na extremidade 3’. A estrutura de cobertura (cap) pode aumentar a resistência da molécula antissenso a exonucleases sem comprometer as interações moleculares com a sequência-alvo ou maquinário celular. Tais modificações podem ser selecionadas com base de sua potência elevada in vitro ou in vivo. A cobertura (cap) pode estar presente no término 5’ (cap 5') ou no término 3’ (cap 3') ou pode estar presente em ambas as extremidades. Em certas modalidades, a cobertura (cap) 5' e/ou 3' é independentemente selecionada de monofosfato de fosforotioato, resíduo (porção) abásico, ligação de fosforotioato, tionucleotídeo 4', nucleotídeo carbocíclico, ligação de fosforoditioato, nucleotídeo invertido ou porção abásica invertida (2'-3' ou 3'-3'), fosforoditioato monofosfato e porção de metilfosfonato. A(s) ligação(ligações) de fosforotioato ou fosforoditioato, quando parte de uma estrutura de cobertura, são geralmente posicionadas entre os dois nucleotídeos terminais na extremidade 5' e os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3'.

[0056] Em modalidades preferidas, a molécula antissenso direciona a expressão de receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina

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22/88 (R1-FCI). O R1-FCI é um receptor da superfície celular da tirosina quinase que compartilha 70% de homologia com o receptor de insulina. Quando ativado por seus ligantes (FCI-I, FCI-II e insulina), regula as funções celulares amplas, incluindo, proliferação, transformação e sobrevivência celular. O R1-FCI não é uma exigência absoluta para crescimento normal, mas é essencial para crescimento em condições independentes de ancoragem que podem ocorrer em tecidos malignos. Uma revisão do papel de R1-FCI em tumores é proporcionada em Baserga e outros, Vitamins and Hormones, 53: 65-98 (1997), o qual é incorporado neste relatório como referência em sua totalidade.

[0057] Em certas modalidades, a molécula antissenso é um oligonucleotídeo direcionado contra DNA ou RNA de um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento, tal como, por exemplo, R1-FCI.

[0058] Em certas modalidades, o antissenso é um desoxinucleotídeo direcionado contra R1-FCI (ODN AS de R1-FCI). A sequência de codificação de comprimento completo de R1-FCI é proporcionada como SEQ ID N^Q:19 (ver, por exemplo, PCT/US2016/26970, a qual é incorporada neste relatório como referência em sua totalidade).

[0059] Em certas modalidades, a molécula antissenso compreende sequências de nucleotídeos complementares à sequência de sinal de R1-FCI, compreendendo cada RNA ou DNA. A sequência de sinal do R1-FCI é uma sequência de 30 aminoácidos. Em outras modalidades, a molécula antissenso compreende sequências de nucleotídeos complementares às porções da sequência sinalizadora de R1-FCI, compreendendo cada RNA ou DNA. Em algumas modalidades, a molécula antissenso compreende sequências nucleotídicas complementares aos códons 1-309 de R1-FCI, compreendendo cada RNA ou DNA. Em outras modalidades, a molécula antissenso

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23/88 compreende sequências nucleotídicas complementares às porções de códons 1-309 de R1-FCI, compreendendo cada RNA ou DNA.

[0060] Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI é pelo menos cerca de 5 nucleotídeos, pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, pelo menos cerca de 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, pelo menos cerca de 35 nucleotídeos, pelo menos cerca de 40 nucleotídeos, pelo menos cerca de 45 nucleotídeos ou pelo menos cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o ODN AS de R1-FCI é de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 22 nucleotídeos de comprimento. Em certos aspectos, o ODN AS de R1-FCI é de cerca de 18 nucleotídeos de comprimento.

[0061] Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI forma uma estrutura secundária a 18°C, mas não forma uma estrutura secundária a cerca de 37°C. Em outras modalidades, o ODN AS de R1-FCI não forma uma estrutura secundária a cerca de 18°C ou a cerca de 37°C. Em ainda outras modalidades, o ODN AS de R1-FCI não forma uma estrutura secundária sob qualquer temperatura. Em outras modalidades, o ODN AS de R1 -FCI não forma uma estrutura secundária a 37°C. Em modalidades particulares, a estrutura secundária é uma estrutura em forma de grampo (loop).

[0062] Em alguns aspectos, o ODN AS de R1-FCI compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N^Q: 1, ou um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI pode apresentar pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade para SEQ ID N^Q: 1, ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o ODN AS de R1-FCI compreende uma ou mais ligações de fosforotioato.

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24/88 [0063] Em certos aspectos, o ODN AS de R1 -FCI consiste em SEQ ID N^Q:1. NOBEL é um oligodesoxinucleotideo de 18-meros com uma estrutura principal de fosforotioato e uma sequência complementar aos códons 2 a 7 no gene R1-FCI. Como tai, NOBEL é um oligonucleotideo antissenso direcionado contra R1-FCI (ODN AS de R1-FCI). A sequência de NOBEL, derivada como a sequência complementar do gene de R1-FCI na extremidade 5', é:

5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT- 3'.

[0064] NOBEL apresenta uma vida útil estável e é resistente à degradação da nuclease devido à sua estrutura principal (backbone) de fosforotioato. Administração de NOBEL pode ser proporcionada em qualquer um dos métodos padrão associados à introdução de oligodesoxinucleotídeos conhecidos daquele versado no estado da técnica. Vantajosamente, os ODNs ASs descritos neste relatório, incluindo, NOBEL, podem ser administrados com pouca/nenhuma toxicidade. Mesmo níveis de cerca de 2 g/kg (escala) com base em testes com camundongos (40 pg na veia caudal) não revelaram problemas de toxicidade. NOBEL pode ser fabricado de acordo com procedimentos comuns conhecidos daquele versado no estado da técnica.

[0065] A molécula antissenso, por exemplo, a sequência de NOBEL de SEQ ID N^Q:1, pode também compreender uma ou mais modificações da estrutura principal de p-etóxi, conforme descritas na Patente dos Estados Unidos N^Q. 9.744.187, a qual é incorporada neste relatório como referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a estrutura principal de ácido nucleico da molécula antissenso compreende pelo menos uma ligação da estrutura principal de p-etóxi. Por exemplo, até cerca de 1%, até cerca de 3%, até cerca de 5%, até cerca de 10%, até cerca de 20%, até cerca de 30%, até cerca de 40%, até cerca de 50% até cerca de 60%, até cerca de 70%, até cerca de

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80%, até cerca de 90%, até cerca de 95%, ou até cerca de 99% da molécula antissenso podem ser ligados por p-etóxi. O restante das ligações podem ser ligações de fosfodiéster ou ligações de fosforotioato ou uma combinação destas. Em uma modalidade preferida, 50% a 80% das ligações da estrutura principal de fosfato em cada oligonucleotídeo são ligações da estrutura principal de p-etóxi, em que 20% a 50% das ligações da estrutura principal de fosfato em cada oligonucleotídeo são ligações da estrutura principal de fosfodiéster.

[0066] Várias sequências de antissenso R1-FCI são bioativas em alguns ou todos os efeitos multimodalidade da sequência de NOBEL. A sequência de NOBEL de 18 meros apresenta tanto atividade de inibição do receptor R1-FCI, bem como, atividade agonista de TLR, e experimento adicional em camundongos sugere que ambas as atividades são necessárias para atividade imune antitumoral in vivo. Enquanto a molécula de ODN AS apresenta atividade antitumoral, a sequência de senso complementar não apresenta, apesar de também, apresentar um motivo CpG.

[0067] Em certas modalidades, a sequência do antissenso é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N^QS. 1-14, conforme mostrada na Tabela 1. Em algumas modalidades, o antissenso apresenta 90% de identidade de sequência para uma ou mais de SEQ ID N^QS . 1-14. Em algumas modalidades, o antissenso apresenta 80% de identidade de sequência para uma ou mais de SEQ ID N^QS. 1 -14. Em algumas modalidades, o antissenso apresenta 70% de identidade sequencial para uma ou mais de SEQ ID N^QS. 1-14.

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TABELA 1: Sequências adicionais a jusante de Formulação de ODN

AS do R1-FCI

Sequências com Motivo de ACGA	Corresponde aos códons de R1-FCI	SEQ ID N^e:
5’-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3’	2-7	1
5’-TTCTCCACTCGTCGGCC-3’	26-32	2
5’-ACAGGCCGTGTCGTTGTC-3’	242-248	3
5’-GCACTCGCCGTCGTGGAT-3’	297-303	4
5’-CGGATATGGTCGTTCTCC-3’	589-595	5
5’- TCTCAGCCTCGTGGTTGC-3’	806-812	6
5’-TTGCGGCCTCGTTCACTG-3’	1.033-1.039	7
5’-AAGCTTCGTTGAGAAACT-3’	1.042-1.048	8
5’-GGACTTGCTCGTTGGACA-3’	1.215-1.221	9
5’-GGCTGTCTCTCGTCGAAG-3’	1.339-1.345	10
5’-CAGATTTCTCCACTCGTCGG-3’	27-34	11
5’-CCGGAGCCAGACTTCAT-3’	1-6	12
5’-CTGCTCCTCCTCTAGGATGA-3’	407-413	13
5’-CCCTCCTCCGGAGCC-3’	4-8	14

[0068] Em certas modalidades, o ODN AS do R1-FCI compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID N^QS. 1-14, ou fragmentos dos mesmos. Em certas modalidades, o ODN AS do R1 -FCI pode apresentar pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 98% ou 100% de identidade para qualquer uma de SEQ ID N^QS: 1-14, ou fragmentos do mesmo.

[0069] Em algumas modalidades, a molécula antissenso inibe a expressão de genes a jusante de caminho de R1-FCI em uma célula.

Em certos aspectos, o gene a jusante é hexoquinase (Hex II). Em algumas modalidades, a molécula antissenso inibe a expressão de

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27/88 genes de manutenção (housekeeping) na célula. Em alguns aspectos, o gene de manutenção (housekeeping) é L13.

[0070] Em certos aspectos, o ODN AS de R1-FCI é quimicamente sintetizado. Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI é produzido por síntese orgânica em fase sólida. Em alguns aspectos, a síntese do ODN AS de R1-FCI é realizada em um sintetizador equipado com um reator de coluna química fechado usando a tecnologia através de fluxo. Em algumas modalidades, cada sequência do ciclo de síntese no suporte sólido consiste em etapas múltiplas, as quais são realizadas sequencialmente até que o ODN AS de R1-FCI de comprimento completo, seja obtido. Em certas modalidades, o AS de R1-FCI é armazenado em uma forma líquida. Em outras modalidades, o ODN AS de R1-FCI é liofilizado antes de armazenamento. Em algumas modalidades, o ODN AS de R1-FCI liofilizado é dissolvido em água antes de utilização. Em outras modalidades, o ODN AS de R1-FCI liofilizado é dissolvido em um solvente orgânico antes de utilização. Em ainda outra modalidade, o ODN AS de R1 -FCI liofilizado é formulado em uma composição farmacêutica. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica líquida. Em outros aspectos, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica sólida. Ácidos nucleicos antissensos adicionais são também descritos na Publicação dos Estados Unidos N^Q. 2017/0056430, a qual é incorporada neste relatório como referência em sua totalidade.

Vacina Autóloga de Célula Cancerígena

Introdução [0071] Imunoterapia é atualmente utilizada para direcionar malignidades hematológicas com um antígeno celular comum. Infelizmente, tumores sólidos são muito mais complexos, representando progressão epigenética de alterações genéticas para um estado maligno com um número não identificável de alvos específicos ao tumor.

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Ainda mais desafiador, dentro de um grupo de câncer de diagnóstico de WHO (OMS), existem variações acentuadas em fenótipos de tumores. Uma vacina autóloga celular abrangería todas essas variações e todos esses alvos e representa uma imunoterapia específica ao indivíduo ideal para cânceres de tumores sólidos. Entretanto, uma vacina autóloga de células cancerígenas não pode ser derivada de culturas de células primárias porque passagens em série alteram o fenótipo do tumor, diminuindo, desse modo, o ensaio de antígenos específicos ao tumor. Isso também exigiría qualificação impossível de liberação de lote em cada passagem. A presente invenção elimina essas preocupações por plaqueamento de células tumorais morcelizadas recentemente ressecadas e reimplante das mesmas dentro de 24 horas como um antígeno de depósito, como mostrado na Figura 22. Em certos aspectos, os excelentes resultados aqui alcançados são obtidos assegurando que um número apropriado de células esteja presente na(s) câmara(s), entre outras especificidades descritas neste relatório. [0072] Estudos anteriores projetaram vacina autóloga celular através do uso de células apresentadoras de antígeno, em vez de células autólogas tumorais. Nesse paradigma, monócitos de um indivíduo são coletados a partir de uma leucoferese plasmática prétratamento e diferenciados em células dendríticas autólogas (CD) ex vivo. As células dendríticas são em seguida apresentadas com o lisado bruto do tumor do indivíduo, induzindo ativação/maturação de CD, e em um ponto de tempo posterior, as células dendríticas maduras, agora iniciadas em cruzamento com antígenos tumorais são injetadas no indivíduo como uma vacina de CD. A diferenciação ex vivo, entretanto, está faltando vários componentes estimuladores-chave que ocorrem apenas in vivo. Além disso, diferenciação de CDs de precursores hematopoiéticos requer extensas manipulações in vitro com processamento de células intensivas de trabalho em instalações caras.

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A presente invenção obvia essas preocupações proporcionando um processo de maturação endógena de CD e um oligodesoxinucleotídeo antissenso (ODN AS) imunomodulador e imunoestimulador que promove o desenvolvimento de uma resposta imune apropriada. Mais especificamente, a presente invenção proporciona uma câmara de biodifusão compreendendo células tumorais dispersas derivadas do paciente e moléculas antissensos irradiadas, a qual é implantada no paciente por um tempo terapeuticamente eficaz. Sem estar vinculado a qualquer teoria, pensa-se que a combinação de células tumorais irradiadas, antissensos e câmara de biodifusão atuem em conjunto para simular a resposta imune local e intensificar a resposta por meio de redução ou eliminação de células M2, impedindo amortecimento do sistema imune.

[0073] Desse modo, a presente invenção mostra que uma câmara de biodifusão irradiada, implantável compreendendo células tumorais recentemente ressecadas e ODN AS de R1-FCI funciona com segurança como uma vacina autóloga celular eficaz específica ao indivíduo para imunoterapia de câncer. Como tal, a utilização da câmara de biodifusão implantável reivindicada para montar uma resposta imune que visa seletivamente células tumorais em um indivíduo, proporciona uma abordagem nova e significativa para o tratamento de câncer, especialmente, GBM.

Câmara de Biodifusão [0074] Uma câmara de difusão representativa compreende um tambor de câmara com duas extremidades, uma primeira extremidade e uma segunda extremidade. Em modalidades, a câmara de biodifusão é um pequeno anel revestido de cada lado por uma membrana porosa, impermeável a células, tal como a membrana Duropore fabricada por Millipore Corporation. Opcionalmente, uma das extremidades pode ser fechada como parte do corpo da câmara deixando apenas uma

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30/88 extremidade aberta para ser selada utilizando a membrana porosa. As membranas podem ser produzidas de plástico, teflon, poliéster ou qualquer material inerte que seja forte, flexível e capaz de resistir a tratamentos químicos. A câmara pode ser produzida de qualquer substância, tal como, e não se limita a plástico, teflon, lucita, titânio, Plexiglass ou qualquer material inerte que não é tóxico e bem tolerado por humanos. Além disso, as câmaras devem ser capazes de sobreviver à esterilização. Em alguns aspectos, as câmaras de difusão são esterilizadas com óxido de etileno antes de uso. Outras câmaras adequadas são descritas em Pat. Prov. dos Estados Unidos N^Q. 62/621.295, depositada em 24 de janeiro de 2018, Patente dos Estados Unidos N^Q. 6.541.036, PCT/US16/26970, e Patente dos Estados Unidos N^Q. 5.714.170, as quais são incorporadas neste relatório como referência em sua totalidade.

[0075] Em certas modalidades, a membrana permite passagem de pequenas moléculas, mas não permite passagem de células (ou seja, as células não podem sair ou entrar na câmara). Em alguns aspectos, o diâmetro dos poros da membrana permite que os ácidos nucleicos e outros produtos químicos (tais como, por exemplo, citocinas produzidas por células) se difundam para fora da câmara, não permite a passagem de células entre a câmara e o indivíduo em que esta é implantada. As câmaras de biodifusão úteis na presente invenção incluem qualquer câmara que não permita passagem de células entre a câmara e o indivíduo em que é implantada, desde que, no entanto, a câmara permita o intercâmbio e passagem de fatores entre a câmara e o indivíduo. Desse modo, em certos aspectos, o tamanho de poros apresenta um corte que impede a passagem de materiais com mais de 100 pm³ de volume para dentro e fora da câmara. Em algumas modalidades, os poros da membrana apresentam um diâmetro de cerca de 0,25 pm ou menor. Por exemplo, os poros podem apresentar um

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31/88 diâmetro de cerca de 0,1 pm (ver (Figura 1). Em aspectos particulares, os poros variam em diâmetro de 0,1 pm a 0,25 pm. Ver, também Lange, e outros, J. Immunol., 1994, 153, 205-211 e Lanza, e outros, Transplantation, 1994, 57,1371-1375, cada um dos quais é incorporado neste relatório como referência em suas totalidades. Esse diâmetro dos poros impede a passagem de células dentro ou fora da câmara. Em certas modalidades, as câmaras de difusão são construídas a partir de anéis de Lucita de 14 mm com membranas Durapore hidrofílicas de tamanho de poros de 0,1 pm (Millipore, Bedford, Mass).

[0076] Em certas modalidades, uma câmara de biodifusão compreende uma membrana que permite o ODN AS do R1 -FCI difundirse para fora da câmara. Em algumas modalidades, cerca de 50% do ODN AS de R1-FCI difundem-se para fora da câmara em cerca de 12 horas, cerca de 60% do ODN AS do R1-FCI difundem-se para fora da câmara em cerca de 24 horas, cerca de 80% do ODN AS do R1-FCI difundem-se para fora da câmara em cerca de 48 horas, e/ou cerca de 100% do ODN AS do R1 -FCI difundem-se para fora da câmara em cerca de 50 horas.

[0077] Em uma abordagem exemplar, para montar a câmara de biodifusão, uma primeira membrana porosa é ligada a um lado de uma primeira câmara de difusão, utilizando cola e pressão para criar uma vedação estanque. Uma segunda membrana porosa é similarmente ligada a um segundo anel da câmara de difusão. As membranas podem ser fixadas na posição com juntas de borracha que podem também proporcionar uma vedação mais firme. Os anéis da câmara de difusão são deixados durante a noite (mínimo de 8 horas) para secar. Em seguida, o primeiro anel da câmara de difusão e o segundo anel da câmara de difusão são ligados um ao outro utilizando cola e deixados durante a noite (mínimo 8 horas) para secar. Em uma modalidade preferida, o processo de junção do primeiro anel da câmara e do

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32/88 segundo anel da câmara compreende o uso de 2-dicloroetano como solvente para facilitar adesão entre os dois anéis. Ver, por exemplo, (Figura 22 mostrando duas membranas porosas. Em uma abordagem alternativa, a câmara pode apresentar apenas um lado que contém uma membrana porosa.

[0078] Na porção do tambor da câmara, uma ou mais aberturas (por exemplo, portas) são proporcionadas, as quais podem ser cobertas por uma cobertura (cap) que é acessada de fora do corpo do indivíduo uma vez que a câmara é implantada, permitindo assim que a câmara de difusão seja recarregada. As aberturas permitem amostragem múltipla e sequencial dos teores, sem contaminação e sem prejudicar o indivíduo, portanto, reduzindo significativamente o número de procedimentos de implantação realizados no indivíduo. Antes de implantação no paciente, uma ou mais aberturas podem ser seladas com cera óssea, um tampão de porta ou cobertura (cap) produzida de, por exemplo, PMMA. A cobertura (cap) pode ser do tipo rosca de borracha autovedante e encaixada na abertura. Em algumas configurações, a câmara de difusão pode conter duas ou mais aberturas ou portas de injeção. Amostragem dos teores da câmara pode ser realizada acessando a abertura removendo a cobertura (cap) do lado de fora do corpo do indivíduo e inserindo uma agulha e uma seringa comuns. Em algumas modalidades, a câmara pode incluir adicionalmente um dispositivo de remoção. Tal dispositivo facilita a remoção da câmara do paciente.

[0079] Em modalidades, a câmara funciona como um depósito de antígeno projetado de tal modo que antigenos do tumor se difundam fora da câmara com a finalidade de promover uma resposta imune do hospedeiro terapêutico. O ODN AS de R1-FCI exógeno e irradiação ex vivo promovem uma resposta pró-inflamatória. Essa formulação associa-se às melhorias clínicas e radiográficas, sobrevivência

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33/88 prolongada no protocolo, e representa uma nova vacina autóloga celular que inclui um ingrediente farmacêutico ativo exógeno (IFA) e radiação que interpretamos como indutores ou intensificadores do efeito de imunidade do tumor. Além disso, a adição de baixa concentração do ODN AS de R1 -FCI é crítica para uma resposta pró-inflamatória ((Figura 12).

[0080] Em certas modalidades, a invenção proporciona uma câmara de biodifusão para implantação em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo: (a) células tumorais; e (b) uma quantidade eficaz de uma molécula antissenso. Em outras modalidades é proporcionado um método de tratamento de câncer em um indivíduo, método este que compreende: (a) obtenção de uma câmara de biodifusão compreendendo células tumorais e uma quantidade eficaz de um ácido nucleico antis-senso; (b) irradiação da câmara de biodifusão e teores; e (c) implantação da câmara de biodifusão irradiada no indivíduo por um tempo terapeuticamente eficaz.

[0081 ] Em certas modalidades, o ODN AS de R1 -FCI está presente na câmara de biodifusão em uma quantidade que varia de cerca de 0,5 pg a cerca de 10 pg. Em certos aspectos, o ODN AS de R1-FCI está presente em uma quantidade que varia de cerca de 1 pg a cerca de 5 pg por câmara, ou de cerca de 2 pg a 4 pg por câmara. Em aspectos específicos, o ODN AS de R1-FCI, está presente em uma quantidade de cerca de 2 pg por câmara. Em aspectos específicos, o ODN AS de R1 -FCI, está presente em uma quantidade de cerca de 4 pg por câmara. Sem estar ligado por teoria, pensa-se que esses níveis promovem uma resposta intensificada de Th1 em um indivíduo, enquanto evitando uma resposta imunoestimuladora de M2 no indivíduo.

[0082] Em certas modalidades, as células tumorais não são tratadas com um ODN AS de R1 -FCI antes de encapsulação na câmara.

Tipicamente, contudo, as células tumorais são tratadas com um ODN

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AS de R1-FCI antes de encapsulação na câmara. O tempo para tratamento das células de pré-encapsulação pode variar. Por exemplo, as células tumorais podem ser tratadas ex vivo com um ODN AS de R1 FCI imediatamente antes de encapsulação, por até cerca de 4 horas, até cerca de 6 horas, até cerca de 8 horas, até cerca de 12 horas ou por até cerca de 18 horas. Tipicamente, o tecido tumoral pode ser tratado ex vivo por cerca de 12 horas a cerca de 18 horas de pré-encapsulação. Convenientemente, as células podem ser encapsuladas após um prétratamento que dura até a noite. Sem estar ligado por teoria, pensa-se que o tratamento de pré-encapsulação desempenha um papel desejável na produção estimulante de antígeno tumoral.

[0083] A quantidade de ODN AS de R1-FCI utilizada para o tratamento de pré-encapsulação pode ser em uma faixa de cerca de 1 mg a 8 mg por milhão de células; por exemplo, cerca de 2 mg a cerca de 6 mg por milhão de células, cerca de 3 mg a cerca de 5 mg por milhão de células. Tipicamente, a quantidade de ODN AS de R1-FCI utilizada para tratamento antes de encapsulação é de cerca de 4 mg por milhão de células.

[0084] Em algumas modalidades, o ODN AS de R1-FCI para tratamento ex vivo das células tumorais é utilizado sob uma concentração que varia de cerca de pelo menos 2 mg/ml a pelo menos cerca de 5 mg/ml. Em certos aspectos, o ODN AS de R1 -FCI, é utilizado sob uma concentração de pelo menos 4 mg/ml. Em modalidades específicas, o ODN AS de R1 -FCI, é utilizado sob uma concentração de 4 mg/ml.

[0085] Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI usado para tratar células tumorais ex vivo e o ODN AS de R1-FCI presente na câmara são os mesmos. Em outras modalidades, o ODN AS de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais ex vivo e o ODN AS de R1-FCI presente na câmara são diferentes. Em certas modalidades, o ODN AS

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35/88 de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais ex vivo é pelo menos cerca de 5 nucleotídeos, pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, pelo menos cerca de 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, pelo menos cerca de 35 nucleotídeos, pelo menos cerca de 40 nucleotídeos, pelo menos cerca de 45 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o ODN AS de R1 -FCI utilizado para tratar células tumorais ex vivo é de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 22 nucleotídeos de comprimento. Em certos aspectos, o ODN AS de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais é de cerca de 18 nucleotídeos de comprimento. [0086] Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais ex vivo forma uma estrutura secundária a 18°C, mas não forma uma estrutura secundária a cerca de 37°C. Em outras modalidades, o ODN AS de R1 -FCI utilizado para tratar células tumorais não forma uma estrutura secundária a cerca de 18°C ou sob cerca de 37°C. Em ainda outras modalidades, o ODN AS de R1 -FCI utilizado para tratar células tumorais ex vivo não forma uma estrutura secundária em qualquer temperatura. Em outras modalidades, o ODN AS de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais não forma uma estrutura secundária a 37°C. Em modalidades particulares, a estrutura secundária é uma estrutura em forma de grampo (hairpin loop).

[0087] Em alguns aspectos, o ODN AS de R1 -FCI usado para tratar células tumorais compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N^Q: 1, ou fragmento da mesma. Em certas modalidades, o ODN AS de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais pode apresentar pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade para SEQ ID N^Q: 1, ou um fragmento da mesma.

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Em certos aspectos, o ODN AS de R1-FCI utilizado para tratar células tumorais é SEQ ID N^Q: 1.

[0088] Após o tratamento das células tumorais com o ODN AS durante um período de tempo, o ODN AS é removido e adiciona-se ODN AS fresco à câmara, a qual é em seguida irradiada antes de implantação em um indivíduo. Em certos aspectos, a câmara de biodifusão é tratada com irradiação gama em uma quantidade de cerca de 1 Gy, cerca de 2 Gy, cerca de 4 Gy, cerca de 5 Gy, cerca de 6 Gy, cerca de 10 Gy, ou até cerca de 15 Gy. Em certos aspectos, a dose de radiação não é mais que cerca de 5 Gy. Em outros aspectos, a dose de radiação é de pelo menos cerca de 5 Gy. Em alguns aspectos, a dose de radiação é de 5 Gy. Em certas modalidades, a câmara de biodifusão pode ser irradiada pelo menos uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes. Em algumas modalidades, a câmara é irradiada menos de cerca de 24 horas antes de implantação no indivíduo. Em outras modalidades, a câmara é irradiada cerca de 24 horas antes de implantação no indivíduo. Em ainda outras modalidades, a câmara é irradiada pelo menos cerca de 24 horas antes de implantação no indivíduo. Em ainda outras modalidades, a câmara é irradiada não mais do que cerca de 48 horas antes de implantação no indivíduo. Em ainda outras modalidades, a câmara é irradiada pelo menos cerca de 48 horas antes de implantação no indivíduo.

[0089] Embora as células tumorais sejam tipicamente mortas antes de implantação; por exemplo, por radiação, as células não precisam estar mortas e, de fato, pode ser vantajoso manter as células em estado vivo para promover liberação de antígeno. Desse modo, em certas modalidades, as células não podem ser irradiadas antes de implantação. Por motivos de segurança, contudo, é desejável impedir liberação de células tumorais vivas no indivíduo.

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37/88 [0090] Células tumorais podem ser colocadas em uma câmara de difusão em números variáveis. Em certas modalidades, cerca de 1 x 10⁴ a cerca de 5 x 10⁶ células tumorais são colocadas em cada câmara de difusão. Em outras modalidades, cerca de 1 x 10⁵ a cerca de 1,5 x 10⁶ células tumorais são colocadas na câmara de difusão. Em ainda outras modalidades, podem ser utilizadas cerca de 5 x 10⁵ a 1 x 10⁶células tumorais que são colocadas na câmara com um indivíduo. Aqueles versados no estado da técnica descobriram que o número de células tumorais pode afetar a resposta antitumoral dos indivíduos e que uma faixa apropriada deve ser selecionada para aumentar a chance de se obter os resultados desejados. Figura 28 mostra dados de pacientes implantados com 20 câmaras e mostra rendimento celular (milhões de células) correspondente à resposta imune. A resposta imune antitumoral é ótima em uma faixa de cerca de 750.000 a cerca de 1.250.000 células em uma câmara, com um pico em cerca de 1 milhão de células/câmara. Múltiplas câmaras contendo células tumorais irradiadas são administradas e para manter a resposta imune ótima, o número de células/câmara é preferivelmente mantido dentro da faixa. De preferência, as células tumorais são intactas e não são autolisadas ou de outro modo danificadas conforme descritas neste relatório.

[0091] Em certas modalidades, pode ser preferível manter a razão de células para ODN AS em uma câmara. Desse modo, em certos aspectos, as câmaras podem conter cerca de 2 pg de ODN AS e entre 750.000 e 1.250.000 células; por exemplo, 1.000.000 de células. A razão de células para ODN AS pode assim estar em uma faixa de cerca de 3,75 x 10⁵ a cerca de 6,25 x 10⁵ por pg de ODN AS; por exemplo, cerca de 5,0 x 10⁵ células por pg. Desse modo, em um paciente típico que recebe 20 câmaras, a dose total de ODN AS é de cerca de 40 pg.

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38/88 [0092] Tipicamente, administração será em uma câmara conforme descrita neste relatório; entretanto, em certos aspectos, as células irradiadas e o ODN AS de R1-FCI podem ser coadministrados ao indivíduo sem estar fisicamente contidos em conjunto na câmara ou outro recipiente. Em certos métodos utilizando essa abordagem, as células irradiadas do ODN AS de R1-FCI assim dispersam-se, difundem-se ou são metabolizadas no corpo limitadas pela fisiologia do indivíduo. Desse modo, em certos aspectos, por exemplo, as células tumorais para utilização podem ser preparadas conforme descritas neste relatório para a câmara e administradas com o ODN AS de R1FCI, mas a administração pode não estar contida em um recipiente físico. Tal administração é tipicamente intramuscular.

Preparação de Tecido Tumoral para Câmara [0093] As células tumorais para uso na vacinação autóloga são removidas cirurgicamente do indivíduo. Em modalidades, as células tumorais são removidas do paciente utilizando um morcelador de tecido. O dispositivo de extração combina preferencialmente uma cânula interna recíproca de alta velocidade dentro de uma cânula externa estacionária e sucção variável controlada eletronicamente. A cânula externa apresenta um diâmetro de 1,1 mm, 1,9 mm, 2,5 mm ou 3,0 mm e um comprimento de 10 cm, 13 cm ou 25 cm. O instrumento também conta com um corte de entrada lateral e uma abertura de aspiração localizada a 0,6 mm da extremidade do dessecador sem corte. A combinação de pressão suave para a frente da abertura no tecido a ser removido e sucção extrai o tecido desejado para a abertura lateral, permitindo a resseção controlada e precisa do tecido através da ação de corte recíproco da cânula interna. Uma característica fundamental é a ausência de uma lâmina de rotação; isso evita extração de tecido não intencionado para a abertura. Um exemplo de um dispositivo adequado é o aspirador de tecido Myriad® (NICO Corporation® Indianapolis, IN),

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39/88 um sistema cirúrgico minimamente invasivo que pode ser usado para a remoção de tecidos moles com visualização direta, microscópica ou endoscópica. O tecido raspado é aspirado, reunido em uma câmara de coleta e coletado em um coletor estéril de tecido. Durante coleta do tecido no coletor estéril de tecido, o sangue é removido da preparação. De preferência, o coletor estéril contém um prato de coleta na parte inferior do coletor e uma haste que fornece acesso ao coletor. A estrutura do coletor pode também conter uma estrutura interna em forma de concha que é removível do coletor para facilitar a remoção do tecido do coletor.

[0094] Preferencialmente, o morcelador (morselator) não gera calor no sítio da resseção ou ao longo de seu eixo, e não exige energia ultrassônica para remoção do tecido. Desse modo, em modalidades particulares, o tecido tumoral é morcelizado (isto é, tecido raspado de tumor obtido por corte de cavidade lateral na ausência de calor e, opcionalmente, na ausência de tratamento ultrassônico). Vantajosamente, o extrato aspirador e o tecido morcelizado apresenta maior viabilidade do que o tecido removido por outros métodos. Acreditase que o processo de extração mantém maior viabilidade de células tumorais, em parte, devido à restrição de exposição das células tumorais a altas temperaturas durante a remoção. Por exemplo, os métodos descritos neste relatório não expõem as células tumorais a mais de 25°C durante a remoção. Desse modo, as células não são expostas a temperaturas acima de temperatura corporal, isto é, cerca de 37°C.

[0095] A quantidade de tecido tumoral obtida a partir do indivíduo pode variar. Preferencialmente, a quantidade é de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3 gramas ou pelo menos 4 gramas de tecido tumoral úmido é obtida a partir do paciente. O tecido é removido do coletor estéril de tecido e desagregado por pipetagem com uma pipeta estéril para quebrar grandes fragmentos de tecido. A suspensão celular

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40/88 desagregada é em seguida colocada em placas de cultura de tecidos estéreis em meio contendo soro e incubada em uma incubadora de cultura de tecidos. Essa etapa de plaqueamento serve para enriquecer as células funcionais desejadas por aderência e também ajuda a remover os detritos da preparação. Desse modo, as células tumorais utilizadas nos tratamentos descritos neste relatório consistem, de preferência, essencialmente ou consistem em, células aderentes a partir do tecido tumoral.

[0096] Após um tempo de incubação predeterminado (por exemplo, 6, 12, 24 ou 48 horas), as células são removidas das placas. As células podem ser removidas por meio de raspagem, por métodos químicos (por exemplo, EDTA) ou por tratamento enzimático (por exemplo, tripsina). As células são colocadas em uma ou mais câmaras de difusão. Em algumas modalidades, as células são divididas entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais câmaras de difusão. Muitas vezes, 20 câmaras são utilizadas. Em algumas modalidades, cada câmara de difusão contém um número igual de células. Em algumas modalidades, uma primeira câmara de difusão contém mais células do que uma segunda câmara.

[0097] Em algumas modalidades, as células são classificadas antes de serem colocadas na câmara. Em algumas modalidades, as células são enriquecidas por meio de seleção de um ou mais marcadores celulares antes de serem colocadas na câmara. A seleção pode ser realizada, por exemplo, utilizando contas ou por técnicas de triagem de células conhecidas daqueles versados no estado da técnica. Em algumas modalidades, as células colocadas na câmara são enriquecidas para um ou mais marcadores.

[0098] Em algumas modalidades, implantação da câmara de biodifusão por um tempo terapeuticamente eficaz reduz ou elimina

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41/88 retorno do câncer no indivíduo. Em certos aspectos, implantação da câmara de biodifusão provoca uma redução de volume tumoral associado ao câncer no indivíduo. Em ainda outras modalidades, a implantação da câmara de biodifusão durante um tempo terapeuticamente eficaz induz eliminação do tumor no indivíduo. Em algumas modalidades, a implantação da câmara inibe o recrescimento do tumor durante pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 36 meses ou indefinidamente.

[0099] A câmara de biodifusão pode ser implantada em um indivíduo nas seguintes formas não limitativas: por via subcutânea, intraperitoneal e intracraniana. Em certas modalidades, a(s) câmara(s) de difusão é(são) implantada(s) em um sítio aceitante do corpo que apresenta boa drenagem linfática e/ou suprimento vascular tal como a bainha retal. Em outras modalidades, pode ser empregada uma câmara recarregável de tal modo que a câmara de difusão possa ser reutilizada para tratamentos e esvaziada após tratamentos. Em certos aspectos, uma pluralidade de câmaras de difusão, de preferência, entre 5 e 20, pode ser utilizada em um único indivíduo.

[00100] Em certas modalidades, pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, ou pelo menos cerca de 50 câmaras são implantadas no indivíduo. Em algumas modalidades, 10-20 câmaras são implantadas no indivíduo. De preferência, cerca de 20 câmaras são implantadas no indivíduo. Em certas modalidades, as células tumorais são divididas igualmente entre cada câmara.

[00101] Tipicamente, a câmara é removida após um período de tempo. Por exemplo, a câmara pode ser implantada no indivíduo

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42/88 durante cerca de 24 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas ou cerca de 96 horas. A implantação por cerca de 48 horas associa-se aos resultados terapêuticos benéficos. Consequentemente, o tempo preferido de implantação é de cerca de 48 horas. Em certas modalidades, o procedimento de vacinação é realizado uma vez por paciente. Em outras modalidades, o procedimento de vacinação é realizado várias vezes por paciente. Em modalidades, o procedimento de vacinação é realizado duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes ou oito vezes em um único paciente. Em modalidades, a vacinação é repetida a cada 7, 14 ou 28 dias, ou a cada 1, 3 ou 6 meses durante um determinado período de tempo. Em modalidades adicionais, o procedimento de vacinação é repetido periodicamente até que o paciente esteja livre de câncer.

[00102] Sem estar ligado por teoria, pensa-se que a implantação da câmara de biodifusão causa a eliminação ou redução de células M2 no sítio de implantação ou próximo deste, de tal modo que se obtém uma resposta imune contra antígenos tumorais que se difundem da câmara. Em certos aspectos, a eliminação ou redução de células M2 no sítio de implantação leva a uma apresentação acentuada de antígenos tumorais autólogos por células apresentadoras de antígenos (CAA) para as células T CD4 levando à produção de interferon-gama (IFN-γ) e a indução de imunidade tumoral tipo 1. Em certos aspectos, a produção de IFN-γ por células T CD4 específicas ao antígeno tumoral e os efeitos anti-M2 de imunidade antitumoral do tipo 1 direcionada ao ODN AS de R1-FCI e a perda de células M2 anti-inflamatórias a partir da circulação e do microambiente tumoral interferindo indiretamente no crescimento do tumor. Em alguns aspectos, a produção de IFN-γ por células T CD4 específicas ao antígeno tumoral e os efeitos anti-M2 do ODN AS de R1-FCI desencadeiam danos mediados por efetores às células tumorais e ao microambiente tumoral (células M2) e iniciam o

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43/88 processo mais longo de memória de programação de células T reconhecendo antigenos tumorais. Em certas modalidades, a resposta imune adaptativa antitumoral sustenta a regressão continuada do tumor.

[00103] Opcionalmente, as células introduzidas na câmara podem ser enriquecidas por certos tipos de células. Nestina, uma proteína de filamento intermediário (Fl) da classe VI associada ao citoesqueleto, tem sido observada tradicionalmente por sua importância como um marcador neural de células-tronco. Aqueles versados no estado da técnica descobriram que em certas amostras de tumores cerebrais, células positivas a nestina (nestina + células) são enriquecidas comparadas com o tecido benigno, e que essa associada corresponde à resposta terapêutica aperfeiçoada. Desse modo, em certos aspectos, um tumor do indivíduo pode ser submetido à biópsia para avaliar o grau de expressão da nestina e, portanto, em certos aspectos, as células da câmara são células positivas a nestina enriquecidas (+) em comparação com o tecido benigno. Sem estar ligado por teoria, pensa-se que a nestina proporciona um marcador associado aos antigenos adequados úteis na produção de uma resposta imune antitumoral. Consequentemente, as células implantadas na câmara podem ser enriquecidas por nestina + células comparadas com a população de células tumorais como um todo quando extraídas do indivíduo. (Figura 30 ilustra a intensificação da resposta imune obtida quando a amostra de tumor utilizada para estimular uma resposta é enriquecida com nestina.

Administração Sistêmica [00104] Como uma alternativa, ou suplementar a, implantação das câmaras, ODN AS de R1-FCI pode ser administrado sistemicamente. Desse modo, em modalidades, o ODN AS de R1-FCI, é proporcionado em uma composição farmacêutica para administração sistêmica. Além do ODN AS de R1-FCI, a composição farmacêutica pode compreender,

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44/88 por exemplo, solução salina (cloreto de sódio a 0,9%). A composição pode compreender fosfolipídios. Em alguns aspectos, os fosfolipídios não são carregados ou apresentam uma carga neutra sob pH fisiológico. Em alguns aspectos, os fosfolipídios são fosfolipídios neutros. Em certos aspectos, os fosfolipídios neutros são fosfatidilcolinas. Em certos aspectos, os fosfolipídios neutros são dioleoilfosfatidilcolina (DOFC). Em alguns aspectos, os fosfolipídios são essencialmente livres de colesterol.

[00105] Em alguns aspectos, os fosfolipídios e os oligonucleotídeos estão presentes em uma razão molar de cerca de 5:1 a cerca de 100:1, ou qualquer razão derivável. Em vários aspectos, os fosfolipídios e oligonucleotídeos estão presentes em uma razão molar de cerca de 5:1, 10:1,15:1,20:1,25:1,30:1,35:1,40:1,45:1,50:1,55:1,60:1,65:1,70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 ou 100:1. Em alguns aspectos, os oligonucleotídeos e fosfolipídios formam um complexo lipídicooligonucleotídeo, tal como, por exemplo, um complexo lipossoma. Em alguns aspectos, pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos lipossomas apresentam menos de 5 microns de diâmetro. Em vários aspectos, a composição compreende adicionalmente, pelo menos um tensoativo, tal como, por exemplo, polissorbato 20. Em alguns aspectos, pelo menos cerca de 5% do produto farmacêutico antissenso lipossômico total consiste em tensoativo e pelo menos cerca de 90% dos lipossomas têm menos de 5 microns de diâmetro. Em alguns aspectos, pelo menos cerca de 15% do produto de fármaco antissenso lipossômico total consiste em tensoativo e pelo menos cerca de 90% dos lipossomas têm menos de 3 microns de diâmetro. Em alguns aspectos, a população de oligonucleotídeos é incorporada na população de lipossomas.

[00106] Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é uma

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45/88 composição farmacêutica líquida. Em outros aspectos, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica sólida.

[00107] Dosagens para administração sistêmica do antissenso em indivíduos humanos podem ser de cerca de 0,025 g/kg, cerca de 0,05 g/kg, cerca de 0,1 g/kg, cerca de 0,15 g/kg, ou cerca de 0,2 g/kg. Em certas modalidades, a dosagem para administração sistêmica pode ser de 0,025 g/kg a 0,2 g/kg. Em algumas modalidades, a dosagem é de cerca de 0,2 g/kg. Em outras modalidades, a dosagem é de 0,004 g/kg a 0,01 g/kg. Em outras modalidades, a dosagem é inferior a 0,01 g/kg. Em modalidades adicionais, a dosagem não está entre 0,01 g/kg a 0,2 g/kg. Em certos aspectos, o antissenso é fornecido como um pó liofilizado e ressuspenso antes de administração. Quando ressuspenso, a concentração do antissenso pode ser de cerca de 50 mg/ml, cerca de 100 mg/ml, cerca de 200 mg/ml, cerca de 500 mg/ml, cerca de 1.000 mg/ml, ou uma faixa entre essas quantidades.

[00108] Em certas modalidades, o ODN AS pode ser administrado sistemicamente no pré-operatório; por exemplo, antes de cirurgia para reduzir carga tumoral. Por exemplo, o ODN AS pode ser administrado até 24 horas, até 36 horas, até 48 horas ou até 72 horas antes de cirurgia. Em aspectos particulares, a composição farmacêutica pode ser administrada cerca de 48 horas a cerca de 72 horas antes de cirurgia. Tipicamente, em tais circunstâncias, a administração é por bolo (bolus) intravenoso.

Terapias de Combinação [00109] Historicamente, terapia de câncer tem envolvido tratamento de indivíduos com radiação, com quimioterapia ou ambos. Tais abordagens apresentam desafios bem documentados. Vantajosamente, entretanto, os métodos de implantação de câmara descritos neste relatório podem ser utilizados para tratar um indivíduo apresentando câncer como uma monoterapia. Desse modo, prefere-se que os métodos

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46/88 aqui descritos não incluam terapia de quimioterapia ou radioterapia. Entretanto, o excelente efeito obtido por abordagens de monoterapia neste relatório, contudo, pode ser benéfico sob certas circunstâncias para combinar os métodos da câmara com outras terapias; por exemplo, terapia de radiação. Em certas modalidades, a terapia de radiação inclui, mas não se limita a, terapia de radiação de fonte interna, terapia de radiação de feixe externo e terapia de sistêmica de radiação de radioisótopo. Em certos aspectos, a terapia de radiação é radioterapia de feixe externo. Em algumas modalidades, a terapia de radiação de feixe externo inclui, mas não se limita a, terapia de radiação gama, terapia de raios X, terapia de radiação modulada por intensidade (TRMI) e terapia de radiação guiada por imagem (TRGI). Em certas modalidades, a terapia de radiação de feixe externo é a terapia de radiação gama. A radiação pode ser administrada antes de implantação da câmara ou após implantação; por exemplo, como uma terapia de salvamento. Tipicamente, essas abordagens de terapia de salvamento não são implementadas até que se determine que o câncer tenha retornado.

[00110] Desse modo, em certas abordagens de combinação, tanto os métodos de câmara, quanto os métodos e composições sistêmicas descritos neste relatório podem ser utilizados no mesmo indivíduo, isoladamente ou em combinação com radiação ou quimioterapia. Nas abordagens de combinação aqui descritas, a implantação da câmara é preferivelmente utilizada como uma terapia de primeira linha. É desejável utilizar primeiro a implantação da câmara porque o sistema imune do indivíduo pode ser inibido por outras terapias, reduzindo o benefício terapêutico da implantação da câmara.

[00111] Opcionalmente, administração sistêmica pode ser realizada antes de implantação da câmara. Tal abordagem pode ser usada para intensificar o sistema imune do indivíduo, como uma abordagem de preparação. A abordagem de preparação pode ser especialmente

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47/88 vantajosa onde a terapia anterior resultou no indivíduo apresentando um sistema imune comprometido.

[00112] Quando administração sistêmica é utilizada em combinação, o ODN AS pode ser administrado sistemicamente pelo menos duas semanas, pelo menos uma semana, pelo menos 3 dias, ou pelo menos 1 dia antes de tratamento do paciente utilizando uma vacina autóloga de células cancerígenas. Em outras modalidades, o ODN AS pode ser sistemicamente administrado pelo menos 1 dia, pelo menos 3 dias, pelo menos uma semana, ou pelo menos duas semanas seguindo tratamento do paciente utilizando uma vacina autóloga de células cancerígenas, isto é, a câmara.

[00113] Opcionalmente, o indivíduo pode ser revacinado com câmaras utilizando os métodos descritos aqui, subsequentes à primeira vacinação. Uma segunda ou outra vacinação adicional pode utilizar células tumorais tomadas do indivíduo durante a remoção do tecido e armazenadas. Opcionalmente, a segunda ou outra vacinação adicional pode utilizar tecido tumoral fresco removido do indivíduo e tratado como descrito neste relatório. Qualquer tumor remanescente no indivíduo pode expressar os mesmos antígenos e assim atuar como um depósito, proporcionando re-estimulação. Contudo, os tumores recorrentes podem desenvolver novos antígenos e, assim, proporcionar opções adicionais para estimular uma resposta antitumoral. Uma vacinação subsequente pode ocorrer após o primeiro tratamento estar completo e o tumor ter voltado ou se o indivíduo não tiver respondido ao primeiro tratamento.

Indivíduos para tratamento com o ODN AS de R1-FCI (Receptor 1 de Fator de Crescimento semelhante à Insulina) [00114] Indivíduos adequados são animais com câncer; tipicamente, o indivíduo é humano. Embora cânceres cerebrais, tal como glioblastoma, beneficiem particularmente a partir desses métodos

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48/88 descritos neste relatório, os métodos aplicam-se a câncer em geral. Consequentemente, a invenção proporciona métodos de tratamento de cânceres, incluindo, aqueles selecionados do grupo que consiste em: glioma, astrocitoma, hepatocarcinoma, câncer de mama, câncer das células escamosas da cabeça e pescoço, câncer pulmonar, carcinoma das células renais, carcinoma hepatocelular, câncer da vesícula biliar, linfoma de Hodgkin clássico, câncer de esôfago, câncer uterine, câncer retal, câncer de tireoide, melanoma, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de ovário e câncer de pâncreas. Em modalidades específicas, o câncer é um glioma. Em certos aspectos, o glioma é maligno recorrente. Em algumas modalidades, o câncer é um astrocitoma. Em certas modalidades, o indivíduo que é um candidato para tratamento sofre de tumor (WHO) OMS grau II, OMS grau III ou OMS grau IV. Em alguns aspectos, o tumor é um astrocitoma. Em certas modalidades, o tumor é selecionado de astrocitoma de grau II, Alll (astrocitoma de grau III mutante IDH1 R132H), Alll-G (IDH1 de tipo selvagem grau III com características de astrocitoma de glioblastoma multiforme) ou astrocitoma de grau IV.

[00115] O astrocitoma de grau IV é o glioma de grau mais elevado e é sinônimo com glioblastoma (GBM). Com uma incidência anual de 3 ou 4 por 100.000 glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno primário mais comum em adultos. O padrão de terapia de cuidado - tipicamente, uma combinação de radioterapia e quimioterapia utilizando Temozolomida - não funciona bem e o resultado de pacientes com glioblastoma (GBM) permanece fraco, com uma expectativa média de vida de 15-17 meses. Vantajosamente, os métodos aqui descritos podem ser usados para tratar cânceres cerebrais recém-diagnosticados e podem também ser usados para tratar glioblastoma recorrente; por exemplo, em pacientes previamente tratados com terapia padrão de tratamento. Desse modo, em certos aspectos, o indivíduo pode ser um

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49/88 indivíduo com glioblastoma (GBM) recentemente diagnosticado ou um indivíduo com glioblastoma (GBM) recorrente. O indivíduo é de preferência um que não tenha sido previamente tratado com quaisquer abordagens terapêuticas que sejam imunossupressoras. Em aspectos particulares, os indivíduos elegíveis têm mais de 18 anos de idade e apresentam uma pontuação de Karnofsky de 60 ou acima. Opcionalmente, os indivíduos não apresentam doença bi-hemisférica e/ou não apresentam doença autoimune.

[00116] Opcionalmente, um indivíduo que é um candidato para tratamento pode ser identificado por meio de realização de uma biópsia do tumor no indivíduo. Em algumas modalidades, os tumores do indivíduo são analisados quanto à presença de monócitos. Em certos aspectos, os monócitos incluem, mas não se limitam a, monócitos CD11 b+, CD14+, CD15+, CD23+, CD64+, CD68+, CD163+, CD204+ ou CD206+. A presença de monócitos nos tumores pode ensaiada utilizando imuno-histoquímica. Em certas modalidades, um indivíduo que é candidato ao tratamento apresenta células CD163+ M2 superiores a cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, ou cerca de 50% dos indivíduos de células totais mononucleares do sangue periférico (CMSPs). Em certos aspectos, o indivíduo apresenta células CD163+ M2 superiores a cerca de 20% das células mononucleares totais do sangue periférico (CMSPs) do indivíduo.

[00117] Em ainda outras modalidades, um indivíduo que é um candidato para tratamento é identificado pela presença de uma ou mais citocinas no soro do indivíduo. Essas citocinas incluem, sem se limitar as mesmas, CXCL5, CXCL6 e CXCL7, IL6, IL7, IL8, IL10, IL11, IFN-γ e HSP-70.

[00118] Em ainda outras modalidades, um indivíduo que é um candidato para tratamento é identificado pela presença de um ou mais

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50/88 fatores de crescimento no soro do indivíduo. Esses fatores de crescimento incluem, sem limitação, FGF-2, G-CSF, GM-CSF e M-CSF. [00119] Em algumas modalidades, um indivíduo que é um candidato para tratamento com a câmara de biodifusão é identificado por meio de medição dos níveis de um conjunto específico de citocinas. Em algumas modalidades, o indivíduo apresenta níveis elevados dessas citocinas em comparação com um indivíduo saudável. Conforme utilizado neste relatório, o termo indivíduo saudável refere-se a um indivíduo que não sofre de câncer ou qualquer outra doença e não necessita de tratamento com a câmara de biodifusão.

[00120] Em modalidades particulares, as citocinas podem ser adicionadas à câmara para aumentar a resposta imune antitumoral. Por exemplo, as citocinas adicionadas à câmara podem ser selecionadas do grupo que consiste em CCL19, CCL20, CCL21 e CXCL12 e combinações das mesmas.

[00121] Em certas modalidades, os monócitos circulantes CD14⁺apresentam um nível elevado de CD163 em comparação com um indivíduo saudável. Em alguns aspectos, os níveis de CD163 nos monócitos circulantes CD14⁺ são elevados em pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 60 vezes, pelo menos cerca de 70 vezes, pelo menos cerca de 80 vezes, pelo menos cerca de 90 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com um indivíduo saudável. Em modalidades particulares, os níveis de CD163 nos monócitos circulantes CD14⁺ são elevados em cerca de 2 vezes em comparação com um indivíduo saudável.

[00122] Em outras modalidades, um indivíduo que é um candidato para tratamento apresenta soro que polariza monócitos indiferenciados

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51/88 em relação às células M2. Em certos aspectos, incubação dos soros do indivíduo com monócitos indiferenciados induz a expressão de um ou mais marcadores de superfície celular nos monócitos, incluindo, mas não se limitam aos mesmos, CD11 b, CD14, CD15, CD23, CD64, CD68, CD163, CD204 e/ou CD206. Em outros aspectos, a incubação dos soros do indivíduo com monócitos indiferenciados eleva a expressão de um ou mais marcadores de superfície celular nos monócitos em comparação com monócitos não incubados com os soros do indivíduo. Em certos aspectos, os marcadores da superfície celular incluem, mas não se limitam aos mesmos, CD11 b, CD14, CD15, CD23, CD64, CD68, CD163, CD204 e/ou CD206. Em alguns aspectos, os níveis de um ou mais marcadores de superfície são elevados em pelo menos cerca de 1,3 vezes, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 1,8 vezes, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 60 vezes, pelo menos cerca de 70 vezes, pelo menos cerca de 80 vezes, pelo menos cerca de 90 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com monócitos indiferenciados não incubados com os soros do indivíduo. Em modalidades particulares, os níveis de um ou mais marcadores de superfície são elevados em cerca de duas vezes em comparação com monócitos indiferenciados não incubados com os soros do indivíduo. Monócitos polarizados por soros de um indivíduo podem ser medidos utilizando FACS.

Células-Alvo [00123] Sem estar ligado por teoria, pensa-se que o ODN AS reduz as células M2 dos indivíduos e/ou inibe polarização de células em células M2 por meio de inibição da expressão de R1-FCI. Em algumas

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52/88 modalidades, a expressão de R1-FCI em células M2 é inibida em pelo menos cerca de 1 %, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% em comparação com células não tratadas com o antissenso. A expressão de R1-FCI em células M2 pode ser medida por RT-RCP quantitativa. [00124] Em algumas modalidades, expressão de R1-FCI em células M2 permanece inibida no indivíduo em pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 6 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 3 semanas, pelo menos cerca de 4 semanas, pelo menos cerca de 5 semanas, ou pelo menos cerca de 6 semanas após receber uma dose do antissenso.

[00125] Em alguns aspectos, a inibição de expressão de R1-FCI em células M2 provoca uma redução seletiva de células M2 em um indivíduo, em comparação com as células que não expressam R1-FCI. Em certas modalidades, as células M2 em um indivíduo são reduzidas em pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% em comparação com um indivíduo não tratado com o antissenso. Em outras modalidades, a população de células M2 é eliminada. Por exemplo, após implantação da câmara de biodifusão, a população de células M2

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53/88 pode ser de cerca de 1 %, cerca de 2%, cerca de 5% ou cerca de 10% da população antes de implantação da câmara de biodifusão. Células M2 em um indivíduo podem ser medidas usando FACS. Em certos aspectos, após tratamento, as células M2 são eliminadas; isto é, indetectável por FACS. Em outros aspectos, a redução em células M2 pode ser medida usando um ensaio de procuração; por exemplo, soro do indivíduo pode ser obtido antes e após tratamento para avaliar sua capacidade de polarizar células M2. Seguindo o tratamento com métodos descritos neste relatório, a capacidade do soro polarizar as células M2 é reduzida em cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 20% a cerca de 60%, ou cerca de 10% a cerca de 50%.

[00126] Em algumas modalidades, direcionamento da expressão de R1-FCI em células M2 faz com que as células M2 sofram morte celular. Em certas modalidades, a morte celular é necrose. Em outras modalidades, a morte celular é apoptose. Apoptose, para fins desta invenção, é definida como morte celular programada e inclui, mas não se limita a mesma, regressão de tumores primários e metastáticos. A apoptose é uma morte celular programada que é um fenômeno generalizado que desempenha um papel crucial na miríade de processos fisiológicos e patológicos. Necrose, ao contrário, é uma morte celular acidental que é a resposta da célula a uma variedade de condições prejudiciais e substâncias tóxicas. Em ainda outras modalidades, direcionamento da expressão de R1-FCI em células M2 faz com que as células M2 sofram detenção do ciclo celular.

KITS [00127] Preparação de uma câmara completada requer múltiplos componentes e múltiplas etapas. Em outros aspectos da invenção kits contendo componentes para prática dos métodos descritos neste relatório são proporcionados. Em certos aspectos, os kits compreendem o corpo da câmara, que pode estar presente em uma porção ou em duas

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54/88 metades. Itens para selar a câmara podem também ser incluídos, incluindo, uma ou mais membranas, colas e solventes (por exemplo, um álcool ou 2-dicloroetano). Opcionalmente, a membrana pode ser soldada sonicamente na câmara para criar uma vedação. Os kits incluem o ODN antissenso. Opcionalmente, o ODN pode ser dividido em duas porções. Uma primeira porção para tratar as células após remoção cirúrgica do indivíduo, e uma segunda porção para combinar com as células quando introduzidas no indivíduo. Outros itens opcionais do kit incluem meios para cultivar as células, e antibióticos para prevenir o crescimento bacteriano nos meios.

[00128] Opcionalmente, as câmaras no kit podem ser préconectadas (por exemplo, por sutura) umas às outras utilizando um orifício ou outro dispositivo ligado à câmara e adaptado para receber o material de ligação. Vantajosamente, pré-conectando múltiplas câmaras, o número desejado de câmaras pode ser prontamente introduzido e removido pelo cirurgião.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Vacinação com Células Tumorais Autólogas e ODN AS de R1-FCI em Pacientes com Glioblastoma Recorrente

Critérios e Objetivo do Estudo [00129] Doze (12) pacientes foram inscritos para tratamento após falha de terapia padrão. Cada paciente preenchia os seguintes critérios: idade > 18 anos, escore de desempenho de Karnofsky \gua\ ou superior a 60, e sem comorbidades que impediríam a re-resseção cirúrgica eletiva. Os pacientes foram tratados por 24 horas de implantação na bainha retal de dez câmaras de biodifusão contendo células tumorais autólogas irradiadas e ODN AS de R1-FCI com o objetivo de estimular imunidade do tumor. Os pacientes foram monitorados quanto à segurança, respostas clínicas, radiográficas, bem como, imunológicas.

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Os objetivos do estudo incluíram a avaliação de respostas de segurança e radiográficas, bem como, objetivos exploratórios que analisam a função imunológica e resposta.

TABELA 1. Sumário de Pacientes inscritos

Indivíduo	Idade	KPS	Tempo entre cirurgias (semanas)	Câmaras (N°.)	Contagem original de linfócitos (células/mm²)	Contagem de linfócitos em recrutamento (células/mm²)	Tratamento prévio	Mutação de IDH-1&IDH2/metilação de MGMT
TJ01	39	70	177	10	N/A	400	S.RT + TMZ, Bev	-/ NA
TJ02	57	80	90	9	N/A	1570	S, RT + TMZ	-/metilado
TJ03	75	70	32	7	700	300	S, RT + TMZ	-/NA
TJ06/R¹	66	80	54	8	2000	1300	S, RT + TMZ	-/NA
TJ07	43	80	215	10	500	430	S, RT + TMZ, Bev; RTOG 0525	+/metilado
TJ08	55	80	52	8	1000	500	S, RT + TMZ	-/TNS
TJ09	57	80	61	7	1400	300	S, RT + TMZ, RTOG 0929	- /não metilado
TJ10	47	60	376	7	N/A	1800	S, RT + TMZ, Bev	- /metilado
TJ11	39	70	32	11*	2400	200	S, RT + TMZ	-/TNS
TJ12	60	80	74	7	1100	600	S, RT + TMZ, Panobinostat	-/TNS
TJ13	64	80	182	11	N/A	2100	S, RT + TMZ	- /metilado
TJ14/R	77	90	30	9/11	1800	1100	S, RT + TMZ	- não metilado

¹retratamento compassivo; *Alteração do protocolo para incluir câmara de controle preenchida com solução salina tamponada com fosfato; S: cirurgia; RT: terapia de radiação; TMZ: quimioterapia com temozolamida; Bev: quimioterapia com bevacizumab; IDH-1: isocitrato desidrogenase-1; NA: não disponível; TNS: tecido não suficiente.

Protocolo Experimental [00130] O tecido tumoral foi removido cirurgicamente de pacientes utilizando um aspirador de tecido (NICO Myriad®) e colocado em coletores estéreis de tecido. Os coletores estéreis de tecidos foram

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56/88 transferidos para uma instalação designada BSL-2, onde o tecido tumoral foi processado e colocado em câmaras de biodifusão. As câmaras de biodifusão foram irradiadas antes de implantação.

[00131] No dia seguinte à cirurgia para remover tecido tumoral, dez câmaras de biodifusão irradiadas foram implantadas na bainha retal dos indivíduos. Após 24 horas, foram removidas.

[00132] As câmaras de biodifusão continham células autólogas tumorais removidas em cirurgia. Antes de serem adicionadas às câmaras de biodifusão, as células foram pretratadas durante a noite (cerca de. 1218 horas) com uma primeira quantidade (4 mg/ml) de um ODN AS de R1 FCI de 18-meros com a sequência 5'- TCCTCCGGAGCCAGACTT-3' (NOBEL). Com base nos dados mostrando que o ODN AS apresenta propriedades imunomoduladoras, adicionou-se uma segunda quantidade (2 pg) de antissenso NOBEL exógeno às câmaras (C-v), e as câmaras foram subsequentemente irradiadas. Dez câmaras foram implantadas em cada paciente. Uma décima primeira câmara de controle contendo PBS (C-p) foi também implantada.

Avaliações Radiológicas [00133] Avaliações de imagens em série foram realizadas em scanners de ressonância magnética de 1.5T e 3T da Philips e em um scanner de ressonância magnética 1.5T da GE. Características anatômicas da ressonância magnética de rotina foram classificadas por dois neurorradiologistas em todos os 12 pacientes. Técnicas fisiológicas de ressonância magnética (RM) de perfusão de RM ponderada dinâmica de susceptibilidade (DSC) e tensor de difusão de 15 direções (DTI) foram também utilizadas. Perfusão de RM e pós-processamento de DTI foi realizada na estação de trabalho Nordic Ice (v.2.3.14). A rCBV foi calculada em relação à substância branca normal contralateral. Coeficiente de difusão média (difusividade média) foi calculado a partir dos dados de DTI.

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Avaliações Imunológicas [00134] Leucoferese plasmática foi realizada uma semana antes de cirurgia para avaliação inicial da função imune. Sangue foi obtido no pós-operatório nos dias 7, 14, 28, 42, 56 e a cada 3 meses após vacinação. Soro e frações celulares foram separados por meio de centrifugação e as células foram tratadas com tampão de lise de glóbulos vermelhos. Os glóbulos brancos foram quantificados por citometria de fluxo ou armazenados em DMSO sob -80°C. Amostras de soro foram também armazenadas a -80°C. A citometria de fluxo foi realizada utilizando um EasyCyte 8HT (Millipore) e um mAb fluorescentemente conjugado específico para CD4, CD8, CD11 b, CD14, CD16, CD20, CD45, CD56, CD80, CD83 e CD86 (todos de BD Biosciences), e CD163 (R&D Systems). Análise pós-coleta foi realizada com software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR). Fatores de citocina no soro foram quantificados utilizando ensaios de contas Luminex (painéis de citocinas/quimiocinas humanas I, II e III de Millipore) e ensaio multiplex de Câncer HCMBMAG/MILLIPLEX Mag (emdmillipore.com). Isto incluiu 6 marcadores séricos para glioma relacionados com a função das células estaminais, incluindo, DKK-1, NSE, Osteonectina, Periostina, YKL-40 e TWEAK. Níveis de nitrato no soro foram ensaiados de acordo com o método de Greiss (Green L.C., e outros, 1982, Anal. Biochem. 126:131-8). A estimulação de células T foi realizada com 12-miristato de forbol, 13-acetato (PMA) e ionomicina como descrito anteriormente (Verbrugge, I., e outros, 2012, Cancer Res., 72: 3163-74).

[00135] Níveis de citocina/quimiocina no sobrenadante de células tumorais (SN) e os teores da câmara explantada foram analisados por meio de kits Luminex como designado acima. Membranas de vacinas emparelhadas e câmaras de controle foram embebidas em parafina para exame imuno-histopatológico padrão.

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58/88 [00136] Seções de tecido tumoral foram avaliadas por imunohistoquímica para GFAP (proteína ácida fibrilar glial), R1-FCI, CD163, CD14, FVW (Fator de Von Willebrand), CD4 e CD8 ou fluorescência imuno-histoquímica, adaptando o método descrito em Emoto, K. e outros, 2005, Histochem. Cytochem. 53:1311-21). Células imunopositivas foram contadas quantitativamente com Aperio ou qualitativamente por um neuropatologista experiente (LCK) utilizando uma escala ordinal de 0 (sem coloração) a 6 (coloração forte difusa) com intensidade de coloração classificada como baixa, moderada e forte e padrões de coloração descritos como focais ou difusos. Autópsia post-mortem foi limitada ao exame do cérebro e os achados foram comparados com os blocos de parafina de arquivo de glioblastomas previamente tratados ou não tratados diagnosticados na autópsia. Tanto a polarização canônica in vitro de monócitos virgens (naive) quanto experimentos de mistura envolvendo monócitos virgens coincubados com soro derivado de indivíduos de ensaio no recrutamento foram realizados como previamente descritos (Harshyne, LA, e outros, 2015, Neuro. Oncol. 18(2): 206-15; Solinas, G., e outros, 2010, J. Immunol. 185:642-52).

Análise Estatística [00137] Determinou-se o nível de significância estatística entre medidas quantitativas em diferentes amostras por meio de um teste t não-pareado bicaudal ou teste t de pares combinados com p < 0,05. Análise de sobrevivência foi realizada por análise de Kaplan-Meier e significância estabelecida por comparações de log-rank. Toda a análise estatística, incluindo, análise de mistura discriminante foi realizada com o software JMP v. 11 (SAS, Carolina do Norte).

Avaliação de Segurança e Curso Clínico [00138] Apenas um evento adverso grave (EAG) foi relatado ao protocolo (trombose da veia femoral após leucoferese). Nove pacientes

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59/88 sucumbiram à progressão do tumor, enquanto três pacientes morreram de outras causas. Cinco autópsias foram realizadas.

[00139] Sobrevivência global mediana de diagnóstico inicial foi de

91,4 semanas ((Figura 2a) a qual foi comparada favoravelmente com outros ensaios recorrentes de imunoterapia de glioma. Duas coortes de sobrevivência de protocolo significativamente diferente de 48,2 e 10 semanas foram identificadas como coortes de sobrevivência mais longas e mais curtas, respectivamente ((Figura 2b). Excluindo um valor atípico (outlier) (Paciente TJ03), documentamos uma correlação significativa entre sobrevivência do protocolo e grau de linfopenia no momento da inclusão ((Figura 2c). Comparação de valores de CBC (hemograma) no diagnóstico inicial e no recrutamento de protocolo indicou que a contagem média de linfócitos havia caído significativamente (65%) após terapia padrão (N = 8, p = 0,012, teste ípareado).

Respostas Radiográficas [00140] Características de rotina de ressonância magnética (MRI) foram avaliadas e classificadas por dois neurorradiologistas (K.S.T. e A.E.F.). Na coorte mais longa, tamanho reduzido de intensificação e envelope de FLAIR no sítio do tumor primário foram observados, juntamente, com uma progressão mais lenta. Exemplos de respostas anatômicas em ambas as coortes são mostrados nas Figuras 3a e 3b. Medições fisiológicas de ressonância magnética (MRI) aumentaram essas observações anatômicas. Perfusão sequencial de RM do DSC foi realizada em 7 pacientes, incluindo, 3 sobreviventes de longo prazo (Pacientes TJ03, TJ06 e TJ09) que tiveram um aumento paradoxal no Volume de Sangue Cerebral relativo (VSCr) enquanto melhoram clinicamente; entretanto, esse efeito foi transitório e houve uma redução mais sustentada em VSCr. Dados sequenciais de 15 direções de DTI incluíram dois sobreviventes de longo prazo (Pacientes TJ03 e TJ06) que mostraram valores de coeficiente de difusão aparente (ADC)

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60/88 aumentando no hemisfério afetado, refletindo perda de celularidade do tumor associada à regressão da doença. Observamos uma alta correlação entre a resposta paradoxal do VSCr e o aumento do ADC não observado na coorte curta (Figuras 3c e 3d). Níveis correspondentes de nitrato sérico na coorte mais longa refletiam a probabilidade de que uma resposta inflamatória tivesse sido iniciada (dados não mostrados).

Examinação de câmaras explantadas versus soro perioperatório por coorte de sobrevivência [00141] Câmaras explantadas estavam estruturalmente intactas, sem células viáveis. Superfícies externas das membranas das câmaras tanto de C-p quanto de C-v foram revestidas com células CD15+ e CD163+, mas com números dramaticamente elevados nas membranas C-v ((Figura 4a).

[00142] Para toda a coorte do estudo, análise dos teores solúveis da câmara revelou elevações significativas de vários fatores de crescimento e citocinas/quimiocinas em relação aos níveis séricos perioperatórios combinados, muitos dos quais são bem documentados no microambiente tumoral (MAT) do glioma. Trinta e duas das 78 citocinas/quimiocinas testadas foram significativamente elevadas em relação à análise dos pares de soro e emparelhados revelaram elevações significativas de citocinas, como observado na Tabela 2 abaixo.

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TABELA 2: Valores da câmara por Coorte de Sobrevivência

Citocinas/quimiocinas presentes em câmaras explantadas
citocina	mais longa	curta	Valor de P	Dobra
VEGF	4382	1207	,001	3,63
PDGF-AA	272	90	,02	3,02
IL-11	1096	181	,002	6,06
CCL7/MCP-3	3293	1581	,001	2,08
CCL5/ RANTES	1484	169	,003	8,78
CCL22/MDC	385	1847	,02	0,208
I-309	4,47	11,5	,02	0,389
MIP-1d	311	182	,002	1,71
Câmaras: Pares com	binados (câmara versus soro)
citocina	mais longa	Valor de P	curta	Valor de P
VEGF	4028/81	,02	1178/80	,24
PDGF-AA	236/1803	,06	80/1431	,0011
IL-11	958/54	,11	181/25	,047
CCL7/MCP-3	3276/29	,005	1581/18	,0004
CCL5/ RANTES	1194/5571	,004	175/6201	<,001
CCL22/MDC	412/366	,8	1847/348	,09
MIP-1d	294/523	,02	182/473	,0095
Marcadores de câncer presentes em câmaras explantadas
marcador	mais longa	curta	Valor de P	Dobra
DKK1	629	1389	,02	0,452
NSE	7304	11712	,03	0,624
osteonectina	1022	1729	,02	0,591
periostina	286	224	,10	1,27
TRAP5	1421	2441	,007	0,582
OPG	481	1409	,002	0,341
YKL40	8615	12889	,13	0,668
TWEAK	190	171	,87	1,11
Câmaras: Pares com	binados (câmaras versus soro)
Marcador	mais longa	Valor de P	curta	Valor de P
DKK1	214/539	,16	457/1389	,01
NSE	6263/2182	,30	11723/1902	,01
osteonectina	886/953	,70	1729/956	,04
periostina	249/532	,03	224/421	,004
TRAP5	998/1915	,13	2442/1940	,15
OPG	419/205	,48	1409/168	,01
YKL40	7300/12559	,19	12191/5574	,03
TWEAK	142/310	,15	324/217	,53

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62/88 [00143] Essas elevações foram interpretadas como citocinas/quimiocinas produzidas pelas células tumorais encapsuladas ou fatores produzidos pela resposta imune inata local que se difundiram nas câmaras.

[00144] Análise de fatores em câmaras entre coortes de sobrevivência revelou elevações significativas de câmara de VEGF, PDGF-α, IL-11, CCL5, MCP-3 e MIP-1d na coorte mais longa, enquanto vários marcadores de câncer solúvel foram significativamente elevados na coorte curta, incluindo, NSE, osteonectina e YKL40. Análise de mistura discriminante identificou, independentemente, essas diferenças de coorte ((Figura 4b).

[00145] Para ambas as coortes, tanto níveis de Periostina quanto de CCL2 foram significativamente menores nas câmaras (C-v) do que os valores séricos ou SN, sugerindo eliminação de células que produzem essas quimiocinas nas câmaras ((Figura 4c).

Citocinas/quimiocinas e PBMC no soro após vacinação por coorte de sobrevivência [00146] Níveis de 24 das 78 citocinas/quimiocinas avaliados foram significativamente maiores em soro a partir da coorte mais longa comparada com a coorte curta, conforme mostrado na Tabela 3 abaixo.

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TABELA 3: Valores Séricos por Coorte

Valores séricos de citocina/quimiocina (coorte longa versus coorte curta)
citocina	longa	curta	Valor de P
CCL21	279	148	,0007
CTACK	1313	1009	,01
Flt-3L	28	10,6	,02
Fractal kine	102	73	,004
I-309	10,2	6,7	,02
IL-1RA	59	36	,001
IL-10	15	5	,003
IL-12-p40	41	3	,001
IL-13	8,6	3,1	,005
IL-15	11,4	4,6	,0005
IL-1 a	41	3,6	,003
IL-1 b	6,04	2,46	,003
IL-2	7,18	2,87	,006
IL-3	5,06	3,13	,007
IL-5	2,8	1,35	< ,0001
IL-9	5,61	3,07	,005
MCP-3	28	17	,002
MIP-3b	826	304	,005
MIP-1b	33	24	,01
SCF	11,8	3,6	,007
CXCL12	516	3,6	,008
TGF-a	2,91	1,93	,005
TNF-a	10,8	5,9	< ,0001
TPO	110	55	,02

[00147] Um pico em CCL2 sérico ocorreu após cirurgia, mas esteve ausente em reoperação em dois pacientes. Os níveis de CCL2 permaneceram significativamente mais elevados durante todo o período pós-operatório na coorte curta. Esses picos pós-operatórios foram altamente correlacionados com picos de TNF-α (Figuras 5 e 6).

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64/88 [00148] Contagens de células T CD4 e CD8 reais, bem como, contagens de células dendríticas (CD) foram significativamente maiores na coorte mais longa e contagens CD14+ 16 perioperatórias foram significativamente inferiores em comparação com a coorte curta. Houve uma correlação significativa entre as células CD4 e CD e entre CD4 e CXCL12 apenas na coorte mais longa. 14 dias de PBMC dos indivíduos de sobrevivência mais longa manifestaram produção de citocinas Th-1 significativamente maiores, incluindo, IFN-γ após estimulação com PMA e ionomicina do que a coorte curta (dados não mostrados). Alterações coordenadas entre níveis circulantes de células T, monócitos e quimiocinas/citocinas pró-inflamatórias após vacinação foram observadas em três de quatro indivíduos. A correlação mais alta foi observada entre a contagem total de monócitos e os níveis de monócitos CD14+16 (Figuras 5b e 5d). Uma relação inversa entre números de células T circulantes e monócitos também foi observada na coorte mais longa ((Figura 5), sem diferenças significativas na coorte curta ((Figura 6). Relações previsíveis e recíprocas entre as populações de células imunossupressoras e pró-inflamatórias, bem como, relações de monócitos-quimiocinas, sugeriram maior capacidade imunológica na coorte mais longa.

Exame de seções de Parafina [00149] Seções de parafina a partir de intervenções cirúrgicas através de autópsias foram disponíveis para análise em quatro casos, permitindo-nos olhar no ETM pós-vacinação. Foram comparadas autópsias do ensaio com autópsias de pacientes com GBM não tratados e reoperados ((Figura 7). Imunocolorações revelaram uma redução significativa nas células positivas para R1-FCI após vacinação em pares combinados que foi corroborada por imuno-histoquímica de fluorescência (Figuras 7a e 7g). Comparações qualitativas com autópsias de glioma recorrentes ou não tratadas revelaram TAMs

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CD163 e R1-FCI+ abundantes em ambas, diminuindo qualquer preocupação com perda celular como artefato de autópsia ((Figura 7g). [00150] TAMs CD163 atingiram o pico sob recorrência em comparações combinadas tanto para cirurgia inicial quanto autópsia (Figuras 7c e 7g). Os pacientes TJ06 e TJ10 suportaram essas tendências com amostras avaliáveis em todas as fases de tratamento (Figura 7b e 7d). No caso de TJ06, as células CD163 diminuíram após a segunda vacinação e persistiram por meio de autópsia. Essa redução correlacionou-se inversamente com os valores de rCBV e ADC, bem como, os níveis de nitrato no soro, todos aumentados após cada vacina (ver (Figura 7f).

[00151] Explorando uma associação com monócitos periféricos, observou-se uma forte correlação entre monócitos CD163+ periféricos e TAMs CD163 ((Figura 7e) na coorte curta não observada na coorte mais longa ((Figura 7f).

[00152] Foram observados a emergência de populações de células T no MAT após vacinação em cada coorte.

Coincubação de soro do indivíduo com monócitos indiferenciados [00153] Para explorar a gênese dos monócitos CD163+ circulantes nos pacientes, primeiramente, polarizamos monócitos virgens com as citocinas M1 e M2 canônicas, IFN-γ e IL-4, respectivamente. Observamos indução (upregulation) de R1-FCI apenas com polarização de M2 ((Figura 8a). A população de CD163+ polarizada de M2 foi seletivamente eliminada (knocked down) quando incubada com ODN AS do R1-FCI ((Figura 8b).

[00154] Subsequentemente, aquele versado no estado da técnica coincubaram monócitos virgens com soro obtido de todos os indivíduos do estudo e documentaram a emergência de células CD163+ que coexpressavam R1-FCI e PDL-1 ((Figura 8c). Quando tratadas com

ODN AS de R1-FCI, as células expressando R1-FCI, PD-L1 e CD163

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66/88 foram significativamente eliminadas de uma maneira paralela e dependente da dose ((Figura 8c) resumida na (Figura 8d).

Discussão [00155] O ensaio revisado de vacinação multiforme de glioblastoma (GBM) à base de célula autóloga/câmara não aumentou quaisquer preocupações de segurança.

[00156] Identificaram duas coortes de sobrevivência significativamente diferentes com respostas diferentes para esse paradigma de vacina. Ver, Figuras 5 e 6. Indivíduos de coorte mais longa tipicamente exibiram níveis elevados de isotipos de anticorpos específicos aos tumores e citocinas/quimiocinas comumente associados à imunidade Th1, incluindo, lgG1, lgG3, IL12, CXCL10, CXCL12, CCL7, CCL19 e CCL21 após cirurgia e vacinação. Níveis elevados dessas citocinas/quimiocinas não foram observados na coorte curta. Consequentemente, os níveis de citocinas/quimiocinas comumente associados à imunidade Th1 (por exemplo, lgG1, lgG3, IL12, CXCL10, CXCL12, CCL7, CCL19, CCL21) podem ser avaliados após cirurgia/vacinação para prever a sobrevivência e para informar estratégias de tratamento adicionais. De interesse, CCL21 e CXCL12 sinergizam-se com adjuvantes de CpG e intensificam a capacidade migratória e estimuladora de células T de CDs em um paradigma de vacinação. Também, elevações observadas de GM-CSF, IL-6, Flt-3L e SCF na coorte mais longa podiam intensificar proliferação de CD e podem ter contribuído para o aumento significativo de 76% em pDCs após vacinação. As elevações significativas de células CD4, bem como, as correlações entre as células CD4, pDC e a citocina CXCL12, também sugerem a indução bem-sucedida de proliferação de células T facilitada por CXCL12 durante sinapse imune.

[00157] Pacientes na coorte de sobrevivência curta foram tipicamente submetidos a um curso de tratamento mais longo antes de

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67/88 vacinação, levando à linfopenia. Consequentemente, vacinação é mais eficaz quando administrada a pacientes com níveis normais de linfócitos, isto é, pacientes não linfopênicos. A linfopenia induzida por tratamento e a menor razão de CD4:CD8 também podiam ser atribuídas à temozolamida. (Padrão de tratamento incluiu radiação conformacional com temozolamida concomitante, seguida por manutenção da temozolamida iniciada em 6 semanas pós-cirurgia). Uma consequência de sobrevivência total mais longa incluiría exposição crônica a antigenos tumorais e sinais inibitórios de glioma em progresso, levando à exaustão de células T. Similarmente, monócitos/macrófagos apresentaram uma falta aparente de capacidade de resposta apenas com flutuações modestas após vacinação, mas uma correlação distinta entre as células CD14+16 periféricas e TAMs. Os TAMs foram associados à produção de CCL2 e essa correlação podia refletir uma amplificação de circuito fechado que promove o crescimento do tumor. Suportando isso, níveis séricos elevados de CCL2 verificados na coorte curta foram associados ao perfil de expressão gênica mesenquimal e prognóstico fraco em pacientes com glioma.

[00158] As câmaras explantadas proporcionaram um instantâneo único do MAT encapsulada e seu comércio com a resposta imune inicial. Elevações de citocinas nas câmaras de coorte mais longa indicaram coletivamente que as vacinações induziram uma resposta de Th1, e o soro dessa coorte continha isotipos de anticorpos específicos aos tumores associados à imunidade de Th1. Análise discriminante de mistura estabeleceu associações com à produção de IFN-γ, TNF-α e IL12.

[00159] Em contraste, as câmaras de coorte curta apresentaram maiores elevações de marcadores de câncer refletindo o surgimento de resistência associada às células estaminais de glioma (GSC) após terapia padrão. Uma exceção conspícua foi níveis de periostina que eram drasticamente menores em todas as câmaras em comparação

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68/88 com os valores séricos emparelhados. Populações de células promotoras de tumor no glioma incluem TAMs e GSC, o primeiro suportando o último no mesmo nicho perivascular (Zhou, W., e outros, 2015, Nat. Cell. Biol. 17: 170-82) e ambos representando alvos estratégicos para o tratamento. Os macrófagos M2 recrutados por periostina secretada por GSC desempenham um papel crítico no crescimento tumoral e sua eliminação teria vantagem terapêutica. A redução nos níveis de periostina em câmaras contendo células tumorais tratadas sugere que as GSCs que secretam esse fator são as mesmas um alvo para ODN AS de R1-FCI.

[00160] Notavelmente, apesar da imunossupressão pré-existente (devido ao tratamento prévio de acordo com o padrão de cuidados), documentamos melhorias radiográficas e clínicas suportadas por uma resposta pró-inflamatória após vacinação em 4 de 12 pacientes. Esses pacientes também apresentaram uma vantagem significativa de sobrevivência no protocolo. Explorando essa diferença de sobrevivência adicional, observamos um nível superior de imunidade na coorte mais longa.

[00161] Redução de R1-FCI após vacinação associou-se à maior sobrevivência do protocolo em alguns indivíduos. Sem estar ligado a qualquer teoria particular, é possível que as populações de células de R1-FCI+ sejam eliminadas como consequência de mecanismos imunológicos do tipo 1 promovidos nesses indivíduos pelo paradigma da vacinação.

[00162] Como foi observado in vitro, ODN AS de R1-FCI, inativa as células CD163⁺ contidas na preparação de vacina, eliminando, desse modo, seus fatores imunomoduladores e promovendo imunidade de tipo

1. Além disso, qualquer ODN AS de R1-FCI que se difunde para fora da câmara de vacina apresenta um efeito similar em macrófagos M2 que este atinge. Isso representa uma nova plataforma em que células que

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69/88 expressam uma variedade de ligantes e fatores promotores de tumor, incluindo, PDL-1, outros fatores imunomoduladores, fatores angiogênicos, suporte de nutrientes e invasividade tumoral, são direcionadas.

[00163] Diferenças nas observações radiográficas entre as coortes de pacientes com sobrevivência mais longa e curta proporcionam suporte adicional para o conceito de que o paradigma de vacinação apresenta um impacto sobre o glioma mais amplo no MAT. Valores superiores de rCBV são tipicamente associados à progressão do tumor, e perfusão de RM apresentou apenas aumentos transitórios na coorte mais longa, um achado não descrito anteriormente. Medições de ADC diferenciaram progressão do tumor (valores inferiores) a partir das quais interpretamos como perda celular (valores superiores). Uma vez que esse paradigma de vacinação se associa à perda de populações de células R1-FCI e TAM CD163+, é possível que valores crescentes de ADC sejam um reflexo disso.

[00164] Em suma, estabeleceram o perfil de segurança de uma combinação aperfeiçoada de produto de vacina contra o glioma e documentamos alterações em parâmetros imunológicos associados às melhorias clínicas e radiográficas. Com a promessa de eliminação das populações de células de monócitos específicos que promovem o crescimento do tumor (por exemplo, células CD163+ que coexpressam R1-FCI), esse paradigma oferece um esquema de tratamento que não resulta em comprometimento imunológico.

Sumário de Resultados [00165] Não houve toxicidades de Grau 3 relacionadas ao tratamento de protocolo e a sobrevivência total mediana do diagnóstico inicial foi de

91,4 semanas ((Figura 2a). Duas coortes de sobrevivência de protocolo com sobrevivência mediana de 48,2 (longa) e 10 semanas (curta) foram identificadas ((Figura 2b). Indivíduos com sobrevivência mais longa

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70/88 apresentaram achados de imagem, incluindo, elevações transitórias no volume sanguíneo cerebral (VSCr) e elevações sustentadas de valores do coeficiente de difusão aparente (CDA) interpretados como hiperemia transitória e perda celular. Terapia com vacinas resultou na perda sustentada de populações de células CD163+ M2 e R1-FCI+ promotoras de tumores a partir do microambiente tumoral (MAT). Foram realizados experimentos in vitro para explorar a origem de células T CD163+, e esses experimentos confirmaram que soro dos indivíduos diferenciava monócitos imaturos em células CD163+ com indução tanto de R1-FCI quanto de PDL-1. Incubação subsequente com ODN AS do R1-FCI, resultou em uma eliminação (knockdown) dependente da dose dessa população M2 que apresenta implicações para a imunogenicidade do microambiente tumoral (MAT) encapsulado tratado com ODN AS do R1FCI na câmara de vacina. O paradigma da vacina foi bem tolerado com uma sobrevivência mediana favorável.

Exemplo 2

Vacinação de Indivíduos recentemente diagnosticados com Glioblastoma [00166] Demonstraram eficácia biológica do protocolo de vacina envolvendo uma vacina autóloga de célula transferida como parte de um produto de combinação formulado envolvendo câmaras de biodifusão implantadas em pacientes com gliomas malignos recorrentes que falharam no tratamento padrão.

[00167] Exemplo 2 descreve respostas para administração da vacina a pacientes com glioma recentemente diagnosticados, incluindo, implantação de 20 câmaras durante 24 ou 48 horas e 10 câmaras por 24 ou 48 horas. Em cada caso, 2 pg de NOBEL foram adicionados à câmara antes de irradiação em cada caso. Quando comparado com o padrão de cuidados na primeira análise interina, houve melhorias significativas na sobrevivência livre de progressão e na sobrevivência

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71/88 global ((Figura 9). Isso foi mais notavelmente devido ao desempenho das coortes de doses mais altas após vacinação. Observamos, primeiramente, níveis de pico e média de interferon-gama significativamente maiores após vacinação nos pacientes recentemente diagnosticados, em comparação com o paciente tratado sob recorrência. No ensaio de recrutamento de pacientes com glioma recentemente diagnosticados, observamos aumentos surpreendentes e significativos em IFN-γ com cada escalonamento da dose de vacina ao medir as medições de soro agregado. Os níveis mais altos de interferon-gama com implantação mais longa correlacionaram-se cerca de com a taxa na qual o antissenso se difunde para fora da câmara de biodifusão.

[00168] Esses dados, resumidos na (Figura 10, ilustram que a vacina autóloga de câmara induz respostas antitumorais em pacientes com glioblastoma recentemente diagnosticados. Observamos ainda que níveis elevados IFN-γ pode representar respostas do paciente para antígenos tumorais e, se for o caso, ser um preditor de imunidade antitumoral e resultados aperfeiçoados. Finalmente, a resposta mais robusta obtida em pacientes recentemente diagnosticados com GBM versus pacientes recorrentes, ilustra o impacto do sistema imunológico do paciente e suporta vacinação de pacientes como uma terapia de primeira linha.

Exemplo 3

Câmaras Totalmente Formuladas apresentam maior adjuvanticidade [00169] A câmara totalmente formulada inclui as células tumorais autólogas e outras células incluídas no microambiente do tumor (MAT) tratadas 6 horas antes de implantação com 4 mg/ml de ODN AS do R1FCI. O MAT tratado é então encapsulado com adição exógena de pelo menos 2 pg de ODN AS do R1-FCI e a câmara é em seguida irradiada com 5 Gy de irradiação gama.

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72/88 [00170] Aumentou-se o número de câmaras, o que significa que a dose de ODN AS do R1-FCI recebida por cada paciente aumentou em comparação com estudos anteriores. Por exemplo, o dobro do número de câmaras implantadas resultou em duas vezes a quantidade do antissenso implantado e capaz de se difundir para fora da câmara, significando que a dose de ODN AS foi de cerca de 40 g, dividida entre 20 câmaras.

[00171] A sequência antissenso, particularmente, seu motivo CpG palindrômico, e a mistura direta com células de glioma in situ, efetivamente, iniciam a imunidade antitumoral. Notavelmente, a sequência de senso com o mesmo motivo CpG palindrômico, é ineficaz no paradigma da vacina. Adicionalmente, a sequência antissenso deve ser diretamente misturada com o inóculo do tumor a fim de ver uma resposta satisfatória. A dose do ODN AS do R1-FCI que inibiría polarização de monócitos M2 é pelo menos uma ordem de grandeza inferior à dose necessária para reprimir negativamente a expressão de R1-FCI.

[00172] No modelo de animais pré-clínicos avaliamos a eficácia de várias preparações de antígenos na re-estimulação de células T CD4 produtoras de IFN-γ terapêutico de camundongos C57 B6 que rejeitaram células gliomatosas GL261 singênicas implantadas em seu córtex cerebral após vacinação. As células T CD4 foram isoladas dos baços desses animais utilizando abordagens convencionais e adicionadas às células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos virgens de antígeno que foram incubados com várias preparações de antígeno GL261. Os antígenos recuperados da fração solúvel de uma câmara de vacina totalmente formulada, incluindo, células tumorais autólogas, antissenso exógeno e irradiação provocaram um número significativamente maior de células T CD4 produtoras de IFN-γ do que as formulações incompletas.

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73/88 [00173] Análise de câmaras contendo diferentes preparações de GL261 implantadas nos flancos de camundongos C57BL/6 durante 24 horas também proporciona evidência de que a câmara totalmente formulada é mais imunogênica. Enquanto ODN AS do R1-FCI e a irradiação isoladamente causam elevações de citocinas acima de um controle de PBS, 16 de 32 citocinas estavam significativamente elevadas em relação a todas as outras variáveis, incluindo, irradiação isolada, quando combinadas com ODN AS do R1 -FCI. Entre essas, pelo menos 11 citocinas são associadas a uma resposta inflamatória, incluindo, IL-1 β, IL-6 e TNF-α, as quais são comumente produzidas por uma rede de citocinas pró-inflamatórias induzida por radiação.

[00174] Uma resposta pró-inflamatória para as câmaras totalmente formuladas foi validada em nosso segundo ensaio clínico humano de Fase 1 para pacientes com glioblastoma recorrente. Observamos duas coortes de sobrevivência distintamente diferentes após vacinação e estabelecemos associações entre capacidade imunológica, uma resposta pró-inflamatória após vacinação e sobrevivência mais longa (observações não publicadas). Em particular, observamos uma razão de CD4:CD8 elevada após vacinação na coorte mais longa que foi interpretada como ativação local de TLR9 DO direcionando as células CD4+ no senso de um fenótipo Th1, talvez aumentada adicionalmente pela irradiação de células tumorais na câmara.

Exemplo 4

Câmara Totalmente Formulada em Camundongos Virgens [00175] Em camundongos virgens C57B6, implantação de uma câmara de vacina totalmente formulada foi significativamente mais eficaz em desencadear uma resposta imune inicial do que as câmaras parcialmente formuladas. Os camundongos foram vacinados no flanco com uma câmara durante 24 horas. Teores da câmara variaram de nenhum teor (PBS), câmaras parcialmente formuladas (células de glioma

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GL261 isoladas, GL261 com ODN AS ou GL261 e 5Gy de irradiação) e câmaras totalmente formuladas (GL261, ODN AS e irradiação).

[00176] Conforme mostrado na Figura 11, houve uma maior produção de citocinas pró-inflamatórias em camundongos implantados com uma câmara de vacina totalmente formulada em comparação com camundongos implantados com câmaras de vacina parcialmente formuladas (isto é, câmaras de vacina contendo células tumorais, mas sem moléculas antissensos).

Exemplo 5

Ativação de Células Dendríticas dependente de dose em amostras normais por ODN AS do R1-FCI [00177] Utilizou-se PBMC a partir de duas fontes de doadores normais para avaliar à ativação de CD dependente de dose por antissenso NOBEL, bem como, a sequência utilizada anteriormente (DWA, dois códons de 18 meros a montante da sequência de NOBEL e descritos em Andrews e outros (2001) Resultados de um estudo piloto envolvendo o uso de um oligodesoxinucleotídeo antissenso direcionado contra o receptor do fator de crescimento tipo I semelhante à insulina em astrocitomas malignos (Results of a pilot study involving the use of an antisense oligodeoxynucleotide directed against the insulin-like growth factor type I receptor in malignant astrocytomas) J. Clin. Oncol. 19: 2189-2200).

[00178] lncubou-se PBMC durante a noite com as sequências antisensos, juntamente com a sequência de senso para o antissenso NOBEL, em seguida analisado por citometria de fluxo, permutando (gating) de uma população de CD ativada por CD123+, CD68+. Como mostrado na Figura 12, o antissenso NOBEL produziu uma ativação de CD dependente de dose que foi significativamente diferente de controlos não estimulados ou sequência de senso NOBEL, e mais eficaz do que a sequência DWA. Esses dados ilustram que, mesmo

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75/88 em comparação com outros IGF-1 AS, a sequência de NOBEL é especialmente eficaz.

Exemplo 6 Resposta de Células T in vitro a partir de teores de câmara totalmente formulada utilizando células T derivadas de Camundongos vacinados [00179] Levantou-se a hipótese de que, determinado o pequeno tamanho de poro da câmara de difusão (100 nm), os exossomas eram a provável fonte de difusão do antígeno tumoral através da membrana da câmara durante a implantação. Camundongos C57B6 vacinados com uma injeção no flanco que incluiu células de glioma GL261 e ODN AS do R1-FCI foram totalmente protegidos contra um desafio subsequente de tumor intraparenquimatoso cerebral. Avaliou-se a imunorreatividade vacinai de células T terapêutica para tumores derivada desses camundongos aos teores da câmara totalmente formulada com ensaios Elispotpara IFN-γ usando as seguintes fontes de antigenos: 1/Sobrenadantes centrifugados de câmaras carregadas com células GL261 e ODN AS do R1-FCI irradiados e implantados no flanco do camundongo por 24 horas; 2/Sobrenadantes centrifugados a partir de câmaras similarmente preparadas, incubadas em meio de PBS isotônico durante a noite a 37°C; 3/Exossomas preparados a partir de células GL261. Essas preparações de antígeno foram adicionadas às células dendriticas de camundongos virgens de antígeno tumoral e em seguida adicionadas às células T CD4 isoladas a partir dos baços de camundongos imunes GL261 ou incubadas da noite para o dia antes de adição às células T para permitir processamento e apresentação do antígeno. Após cocultura de 24 horas do antígeno das células T e das células dendriticas, o número de células T CD4 produtoras de IFN-γ foi quantificado em um ensaio Elispot. Teores da câmara foram comparados aos exossomas GL261 em várias diluições. Os resultados

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76/88 do ensaio Elispot revelaram uma resposta robusta de IFN-γ apenas com teores da câmara recuperados a partir de incubação de 24 horas de PBS ensaiada com apresentação de antígeno. Nem as câmaras implantadas nem os ensaios de controle Elispot, nos quais as células dendríticas foram incluídas sem pré-incubação produziram diferenças significativas de exossomas. Esses dados revelam que os antígenos derivados do MAT não são exossômicos na natureza, são mais abundantemente produzidos em câmaras irradiadas contendo as células tumorais e ODN AS do R1-FCI, que são despendidas durante implantação, e que exigem apresentação de antígeno por CDs. Os resultados são resumidos na Figura 13.

Exemplo 7

Resposta de dose bifásica para Polarização de Monócito M2/Macrófago [00180] Para determinar a dose ótima de ODN AS do R1-FCI de NOBEL para inibir polarização de M2 in vivo, camundongos C57BL/6 foram injetados no flanco com 10⁶ células GL261. 20 dias mais tarde, os camundongos receberam uma dose única de 0,75 ou 0,075 mg de ODN AS do R1 -FCI de NOBEL por via intraperitoneal. Os camundongos foram então seguidos em relação ao desenvolvimento do tumor.

[00181] As titulações de dose do antissenso NOBEL na geração de M2 in vivo produziram uma resposta bifásica paradoxal. Enquanto doses em qualquer dos extremos de uma titulação de busca de dose resultaram em eliminação de monócito M2, doses intermediárias realmente estimularam geração de monócito M2. Em EU 2017/0056430, demonstrou-se que uma dose única de 4 mg é altamente eficaz em experimentos similares. No presente experimento, uma dose única de 0,075 mg foi altamente eficaz, visto que uma dose intermediária de 0,75 mg foi inesperadamente menos eficaz. (Figura 17). Sem ser limitado, mantido ou vinculado a qualquer teoria ou mecanismo de ação

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77/88 particular, levantou-se a hipótese de que o efeito bifásico pode ser uma consequência dos atributos imunoestimuladores da sequência de

NOBEL.

[00182] A dose eficaz para inibição de polarização de monócitos por ODN AS é consideravelmente menor que a dose necessária para inibir a tradução de R1-FCI de acordo com as regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick. Notavelmente, doses in vitro equivalentes à dose de 0,075 mg por camundongo não apresentam efeito em células que já expressam R1-FCI. Experimentos de titulação in vitro com monócitos humanos revelam uma diferença substancial na capacidade do tratamento com ODN AS do R1-FCI para impedir polarização em oposição ao impacto do fenótipo ou função de monócitos M2 polarizados.

[00183] Conforme mostrado na Figura 14, a dose mais baixa alcança a mesma eficácia quanto a dose mais alta que sugere uma dinâmica de complexo entre o antissenso NOBEL e geração de M2. Com base na resposta monofásica à ativação de CD, a dose ideal da câmara seria o ponto de ativação máxima de CD.

Exemplo 8

Curva Resposta de dose para inibição de polarização do monócito por NOBEL [00184] Realizou-se uma titulação de antissenso NOBEL para níveis na faixa agregada de concentrações que difundiría viavelmente em local fora das câmaras implantadas.

[00185] Conforme mostrado na Figura 15, monócitos alogênicos virgens a partir de três coleções normais de PBMC foram incubados da noite para o dia com seis soros diferentes obtidos de pacientes com glioblastoma, na presença ou ausência de diferentes concentrações de ODN AS, específico ao R1-FCI (NOBEL). Cada ponto colorido representa soro de um paciente individual com glioblastoma. Expressão

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78/88 de marcadores, incluindo, CD163 foi avaliada por citometria de fluxo. Os níveis de expressão de CD163 são apresentados como o índice de fluorescência médio de células coradas com anticorpos CD163 conjugados fluorescentes.

[00186] Cada soro do paciente causou diferenciação de monócitos MO em fenótipo M2 CD163 com indução de R1-FCI e PDL-1. Células MO cultivadas sem soro de paciente (controle) mantiveram níveis muito baixos de CD163, enquanto incubação durante a noite em soros induziram fortemente expressão desse marcador M2 (não tratado). A adição de ODN AS, específico ao R1-FCI aos meios de cultura inibiu polarização de M0-M2 como indicado pela expressão elevada de CD163 de um modo dependente da dose. Observamos uma tendência decrescente partindo de 100 pg e atingindo um nível significativo de inibição em 1 pg. Esses dados confirmam que antissenso em excesso difundindo fora da câmara pode facilitar à iniciação de uma resposta de Th1 nos estágios iniciais de imunidade inata.

Exemplo 9

Prevenção do aparecimento de monócitos M2 anti-inflamatórios em camundongos implantados com células gliomatosas CL261 [00187] Camundongos C57BL/6 implantados com células de glioma GL261 desenvolvem tumores em paralelo com números elevados de monócitos M2 que expressam CD163 circulante. Levantou-se a hipótese de que as células do glioma produzem fatores que causam recrutamento de monócitos e polarização para M2. Essas células então infiltram tecidos tumorais em que seus produtos promovem a progressão tumoral. Tratamento sistêmico com ODN AS de R1-FCI pode impedir o aparecimento de células M2 e, desse modo, inibir formação de tumores.

[00188] Camundongos C57BL/6 foram implantados no flanco com

10⁶ células GL261 e fornecidos com uma dose única de 4 mg de ODN

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AS de R1-FCI de NOBEL por via intraperitoneal ou intravenosa 20 dias posteriores. Posteriormente a 14 dias, obteve-se sangue periférico dos animais e monócitos circulantes avaliados por citometria de fluxo em relação à expressão de CD163. Figura 18 mostra um histograma de números de células que expressam CD163 (pico do lado direito), em que a linha marcada com veículo representa camundongos implantados tratados com veículo PBS e a linha marcada com ODN AS representa camundongos implantados tratados com o ODN AS. Os dados mostram que as células CD163+ declinam-se significativamente. O aparecimento de células expressando CD204 ou CD206 foi inibido similarmente (dados não mostrados). O sangue periférico de camundongos normais, não implantados não continha células com níveis elevados de CD163, CD204 ou CD206 (dados não mostrados).

Exemplo 10

Tratamento sistêmico com ODN AS do R1-FCI de camundongos implantados no flanco com células gliomatosas impede o desenvolvimento de tumores.

[00189] Camundongos C57BL/6 foram implantados no flanco com 10⁶ células GL261 e fornecidos com uma dose única de 4 mg de ODN AS, específico ao R1-FCI de NOBEL por via intraperitoneal ou intravenosamente 20 dias posteriores, antes do aparecimento de monócitos circulantes positivos a CD163. Outro grupo de camundongos C57BL/6 foi injetado com PBS como controle. Ambos os grupos de camundongos foram em seguida, seguidos em relação ao desenvolvimento do tumor. Como mostrado na Figura 19, a incidência de tumores entre os grupos tratados e não tratados foi significativamente diferente (* = p < 0,05) com os camundongos tratados com NOBEL muito mais semelhante a permanecerem livres de tumor.

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Exemplo 11

Inibição sistêmica de ODN AS do R1-FCI de crescimento tumoral de glioma no flanco é independente de imunidade antitumoral.

[00190] Tbet é um fator de transcrição associado a células T, e camundongos deficientes em Tbet faltam a capacidade de aumentar imunidade antiglioma. Para testar se a inibição de ODN AS específico a R1-FCI de crescimento do tumor de glioma no flanco é independente de imunidade antitumoral, camundongos deficientes em Tbet em uma base de C57BL/6 foram implantados no flanco com 10⁶ células GL261 e fornecidos com uma dose única de 4 mg de ODN AS do R1-FCI de NOBEL por via intraperitoneal ou intravenosa 20 dias posteriores. Os camundongos foram então seguidos em relação ao desenvolvimento do tumor.

[00191] Conforme mostrado na Figura 20, incidência de tumor entre camundongos tratados com PBS e camundongos tratados com ODN AS, específico ao R1 -FCI de NOBEL foi significativamente diferente (* = p < 0,05) apesar da incapacidade de camundongo deficiente em Tbet aumentar imunidade terapêutica antiglioma.

Exemplo 12

Direcionamento de Nestina + células-tronco na câmara com NOBEL.

[00192] Mostrou-se que nestina + células estaminais podem ser eliminadas de uma forma dependente de dose pelo antissenso NOBEL in vitro e adicionalmente que essas células são eliminadas do MAT após a vacina de células autólogas (ensaio 14379-101, observações não publicadas). Como as células-tronco que fazem parte do microambiente tumoral (MAT) do glioma, eliminá-las seletivamente apresenta benefício terapêutico claro. Com uma morfologia que suporta uma célula glial radial embrionária, essas células por seu modelo e longos processos podiam servir como estrutura (scaffolding), permitindo a implantação de

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81/88 células gliomatosas em todo o cérebro. Removê-las juntamente com TAMs CD163 podia reverter a natureza invasiva desses tumores, bem como, o próprio crescimento do tumor. Como uma célula direcionável na câmara, antígenos dessas células podiam ser muito imunogênicos e específicos ao tumor, uma vez que seriam de origem embrionária. Nestina é principalmente expressa em progenitor neural/células estaminais e é localizado no citoplasma como um filamento intermediário de tipo VI. Identificou-se também como uma proteína de superfície e um biomarcador para células-tronco de glioma. Seria, portanto, possível selecionar contas e enriquecer essa população, aumentando, desse modo, o título pró-inflamatório da câmara. Ver, Jin e outros, Superfície celular de Nestina é um biomarcador de célulastronco com glioma (Cell surface Nestin is a biomarker for glioma stem cells”), Biochem. Biophys. Res. Commun. 19 de abril de 2013; 433 (4): 496-501.

Exemplo 13

O Impacto de Irradiação na Formulação da Câmara.

[00193] Durante preparação da câmara totalmente formulada, células tumorais autólogas (isto é, tecido de tumor recentemente ressecado) são plaqueadas em cultura livre de soro, opcionalmente tratadas com uma primeira quantidade de ODN AS do R1-FCI, e posteriormente, tratadas com irradiação ex vivo. (Figura 1f e 1g). Uma segunda quantidade de ODN AS do R1-FCI, é adicionada à câmara antes de irradiação.

[00194] Uma vez que a vacinação autóloga inclui irradiação do produto de combinação antes de implantação em um sítio distante do tumor e os dados suportam uma resposta imune com regressão do tumor, esses dados suportam um novo efeito abscopal. Tipicamente, os efeitos abscopais são atribuídos à ativação de imunidade antitumoral após radiação in situ de um tumor direcionado, o que leva à regressão

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82/88 do tumor em sítios distantes da radiação. Nesta formulação particular, mostrou-se que a adição de antissenso exógeno com um motivo CpG à câmara e subsequente tratamento com irradiação gama induzem os genes envolvidos na ativação, proliferação e sobrevivência de células T da memória. Tal formulação também impede a ativação de genes envolvidos na geração de Tregs e a indução de tolerância imune. Adicionalmente, repressão do R1-FCI radiossensibiliza as células que estão superexpressando este receptor de superfície. Coincubação com ODN AS do R1-FCI, também promove apoptose de células tumorais direcionadas (apenas in vivo) e macrófagos M2 associados aos tumores. A irradiação com 5 Gy leva à morte de todas as células encapsuladas e causa a liberação de sinais de perigo endógenos conhecidos como padrões moleculares associados ao perigo/dano (ou DAMPS) que aumentam a apresentação de antigenos tumorais liberados de células tumorais mortas.

Exemplo 14

A Câmara explantada como um Meio de identificação de Agentes pró-inflamatórios para formulações futuras da câmara.

[00195] A câmara de biodifusão explantada, recuperada após sua aplicação como um dispositivo de antígeno de depósito, também serve como repositório documentando a resposta imune inicial corroborada em um modelo de camundongo pré-clínico e em um teste em humanos. Caracterização dos teores da câmara, com um controle de câmara de PBS (fictício) apropriado, proporciona percepção tanto para a resposta imune do hospedeiro (em difusão de citocinas/quimiocinas acima do controle fictício), bem como, produção de citocinas/quimiocinas/DAMPS por células dentro da câmara (indetectável na câmara fictícia). Presença consistente de um ensaio de citocinas informa adições exógenas dessas citocinas a futuras formulações. Como exemplos, CCL21 e CXCL, são ambos elevados nas câmaras de vacina sobre câmaras de

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PBS, sinergizam-se com adjuvantes de CpG e acentuam a capacidade migratória e estimuladora de células T de CDs nem um paradigma de vacinação. Ver Figuras 16 e 17. A adição exógena dessas citocinas à formulação da câmara podia acentuar a resposta inicial de Th-1.

Exemplo 15

Razão ótima de células com ODN AS do R1-FCI na câmara leva a valores superiores de citocina [00196] Pacientes foram vacinados com 20 câmaras, cada uma contendo células tumorais irradiadas e ODN AS NOBEL (2 pg) durante 48 horas. Em cada caso, os pacientes também receberam terapia mandatária de Padrão de Cuidados (Standard of Care (SOC)) de Thomas Jefferson University Hospital (TJUH). Os pacientes foram seguidos para determinar sobrevivência livre de progressão (P-FS) (isto é, aqueles pacientes vivos e não apresentando desenvolvimento de câncer ou remissão) e sobrevivência global (SG) em determinados momentos. Figuras 21a-c ilustram respostas em certos pontos de tempo. Figuras 24-27 ilustram resultados dos pacientes e comparam esses pacientes tratados (vacinados) versus o padrão histórico de cuidados (SOC). Para determinar a razão ótima de células para ODN AS do R1-FCI nas câmaras, mediu-se níveis de citocinas próinflamatórias em soro de paciente após vacinação e comparou-se esses níveis de citocinas com o número de células do tecido tumoral removido de cada paciente.

[00197] Inicialmente, conforme mostrado nas Figuras 21a-c, observou-se um aumento significativo dependente de dose em citocinas pró-inflamatórias em soro de paciente. Níveis totais de IFN-γ foram elevados bastante significativamente em relação à coorte mais alta de dose. Os níveis de 11-12 e TNF-α foram também elevados nessa coorte.

[00198] Cada um dos três valores de citocina a partir dos dias 14-42

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84/88 para cada paciente foi reunido e traçado contra os valores médios de

IFN-γ, IL-12 e TNF-α. Dois gráficos polinomiais com ajustes de grau similares de 4 e 5 revelaram valores de pico de citocinas próinflamatórias (Figuras 21 d-f).

[00199] Figuras 24a e 24b mostram curvas de Kaplan-Meier ilustrando sobrevivência livre de progressão e sobrevivência global na intenção de tratar o grupo como um todo. Em pacientes vacinados, mais de cerca de 35% estavam vivos e estavam livres de progressão em 20 meses. Em contraste, menos de 10% dos pacientes tratados com SOC mostraram sobrevivência livre de progressão em 20 meses. Sobrevivência global foi similarmente muito melhorada com cerca de 40% dos pacientes sobrevivendo além de 25 meses, visto que tratamento com SOC mostra sobrevivência em torno de 5% nesse período de tempo, Figura 24b.

[00200] Figuras 25a e 25b mostram dados de sobrevivência para pacientes com uma idade média de 61,5 anos e combinados de tal modo que os números de mulheres/homens sejam de 12/18 em ambos os grupos. Novamente, os dados ilustram a sobrevivência significativamente aperfeiçoada sob vários pontos de tempos.

[00201 ] Durante o ensaio, alguns pacientes se retiraram do protocolo e outros morreram de causas não relacionadas. Figuras 26a e 26b ilustram dados de sobrevivência, dados ausentes de pacientes a partir daqueles pacientes retirados ou em que as mortes foram de outras causas. Novamente, os pacientes vacinados apresentam desempenho significativamente melhor. Alguns pacientes foram incapazes de completar o padrão de cuidados. Dados que excluem esses pacientes são mostrados nas Figuras 27a e 27b. Esses dados confirmam que a abordagem de vacinação é eficaz quando protocolo de padrão de cuidados não é seguido.

[00202] Figuras 28a e 28b ilustram o efeito de dosagem do número

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85/88 de células na resposta do paciente. Os níveis de IFN-γ correspondem à resposta do indivíduo. Níveis maiores de IFN-γ são associados a uma melhor resposta imune do paciente e, portanto, à resposta antitumoral. Aqui, otimizou-se essa resposta determinando a titulação correta de células. A resposta de pico é em torno da marca de 20, ou seja, 20 milhões de células, divididas entre 20 câmaras. Desse modo, o pico de resposta é de cerca de 1 milhão de células/câmara, enquanto uma excelente resposta é obtida com cerca de 15 a 25 milhões de células, cada uma dividida e implantada em 20 câmaras; isto é, uma faixa de 750.000 células para 1.250.000 células por câmara. Esses dados demonstram a eficácia do protocolo de vacinação otimizado.

Exemplo 16

Resposta acentuada antitumoral mediada por vacinação com população celular enriquecida de expressão de nestina [00203] A produção de antigenos por meio de células gliomatosas tratadas com R1-FCI em câmaras foi testada ex-vivo usando células T imunes a glioma isoladas de camundongos C57BL/6 imunizados utilizando o paradigma de câmara e desafiados intracranialmente com células GL261 congênitas para detectar a presença de antígeno. Camundongos que servem como doadores de células T imunes foram imunizados como segue: foram implantadas câmaras totalmente formuladas preenchidas com células GL261 e antissenso durante 24 horas no flanco. Câmaras com apenas células e sem antissenso foram também implantadas como controles em relação à atividade antissenso. Os camundongos foram sangrados em todo o experimento e os soros foram testados quanto à reatividade de anticorpos para células GL261 (Figuras 30c, 30d). Em 35 dias pós-implantação da câmara, os camundongos foram desafiados intracranialmente com células GL261 estereotaxicamente. Sobrevivência e sinais clínicos de doença para os grupos separados de camundongos foram monitorados por pelo menos

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86/88 dias após o desafio. Classificações de sobrevivência e doença clínica são mostradas na Figura 30a e 30b, respectivamente.

[00204] Células T CD4+ foram isoladas a partir dos baços de camundongos imunizados utilizando contas magnéticas. Células dendriticas virgens (CD), que foram usadas para apresentar os antigenos a células T CD4 imunes, foram isoladas da medula óssea de camundongos C57BL/6 autólogos, não imunes. As CD foram pulsadas por meio de cultura da noite para o dia com antigenos GL261 recuperados de células GL261 cultivadas em câmaras durante a noite sob diferentes condições, espelhando, desse modo, o que está acontecendo em relação à produção de antígeno quando câmaras similares são implantadas em um indivíduo. As câmaras continham células GL261 isoladas ou GL261 com 3 doses diferentes de antissenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O antissenso sob as diferentes doses foi adicionado às preparações de antígeno a partir de células G261 cultivadas sem antissenso para determinar se o teor de antissenso ou o efeito de antis-senso nas câmaras é responsável por produção ótima de antígeno. Produção de IFN-γ, que se acredita ser a medida-chave de imunidade celular antitumoral, foi utilizada para avaliar os efeitos estimuladores das várias preparações de antígeno na ativação de células T, com o número específico de células respondidas quantificado pelo ensaio ELISPOT, como representado na Figura 29a.

[00205] Para estimular a produção do antígeno, seguiu-se o paradigma de câmara clínica in vivo. Cerca de 1 milhão de células tumorais GL261 ex vivo foram injetados nas câmaras isoladas ou com concentrações antissenso indicadas e incubadas durante a noite na câmara que foi colocada em PBS). No dia seguinte, o teor da câmara foi extraído e usado para pulsar células dendriticas virgens. O teor da câmara que não foi tratado durante a noite com antissenso foi

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87/88 adicionado às células dendriticas com as quantidades indicadas de NOBEL. As células dendriticas foram também deixadas virgens para controle. Após um pulso durante a noite com antígeno, as células dendriticas foram coletadas e incubadas durante a noite com células T de animais imunizados em uma placa de cultura de células revestida com um anticorpo de detecção ELIPSPOT para a citocina IFN-γ. Após incubação durante a noite, a placa revestida foi processada e desenvolvida para enumerar o número de células T produtoras de IFNγ que responderam a cada respectivo antígeno.

[00206] Conforme mostrado na Figura 29b, antigenos de tumor foram detectados em materiais recuperados de câmaras contendo células GL261 mais antissenso, mas não materiais de câmaras cultivadas com células isoladas, mesmo se o antissenso fosse adicionado ao material quando as CD eram pulsadas. Isso mostra que a presença de antissenso em câmaras com as células com glioma é necessária para produzir antígeno tumoral imunoestimulador.

[00207] Para testar o impacto de tratamento de um dia para outro com antissenso, incubou-se também células da noite para o dia com 4 mg de antissenso antes de adição das células às câmaras. As células GL261 foram plaqueadas em placas de Petri e tratadas durante a noite com 4 mg de NOBEL por 1 milhão de células ou foram deixadas sem tratamento. As células foram em seguida coletadas e colocadas em câmaras sob 1 milhão de células e 2 pg de NOBEL por câmara. As câmaras foram então incubadas da noite para o dia em PBS e o teor foi extraído no dia seguinte. As células dendriticas foram então pulsadas com o teor da câmara e secreção de IFN-γ foi medida como descrita acima.

[00208] Conforme mostrado na Figura 29c tratamento de um dia para outro de células GL261 com antissenso acentua a quantidade de antígeno produzido por essas células como detectado por um aumento

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88/88 nos números de células T imunes a tumor produzindo IFN-γ quando as

CD foram pulsadas com células GL261 tratadas com 4 mg de antissenso durante a noite.

[00209] Para determinar se o subconjunto de células tumorais de glioma que expressa nestina associa-se à imunogenicidade acentuada, camundongos foram imunizados com câmaras com ou sem células GL261 contendo IMV-001 antissenso (NOBEL) crescidas sob condições que resultaram em níveis superiores versus inferiores da proteína nestina. Avaliou-se a proteção a longo prazo contra a implantação subsequente intracraniana de células de glioma GL261 (Figuras 30a, 30b), bem como, a produção de anticorpo GL261 (Figuras 30c, 30d) pelos camundongos.

[00210] Câmaras contendo células GL261 com altos níveis de nestina e antissenso induziram proteção imune consideravelmente melhor do que as câmaras com células similares sem antissenso ou câmaras com GL261 de baixa nestina, independentemente, se ou não antissenso fosse incluído. As células GL261 da câmara expressando níveis elevados de nestina foram também superiores na indução da produção de anticorpos específicos de GL261 nos camundongos do que aquelas contendo baixos níveis de nestina. Entretanto, em relação à produção de anticorpos, a inclusão de antissenso apresentou impacto mínimo.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [00211] Todas as patentes e publicações referenciadas neste relatório são aqui incorporadas como referência em suas totalidades.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de vacinação de um indivíduo apresentando um câncer cerebral, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) obter tecido tumoral morcelizado viável do indivíduo;

(ii) coletar o tecido morcelizado em um coletor estéril;

(iii) colher células aderentes do tecido morcelizado;

(iv) encapsular as células colhidas em uma câmara de biodifusão juntamente com oligodesoxinucleotídeo antissenso do receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (ODN AS do R1-FCI) apresentando a sequência de SEQ ID N^Q: 1;

(v) irradiar a câmara, e (vi) implantar a câmara no indivíduo, em que uma resposta imune contra o câncer cerebral é obtida.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de tratamento das células aderentes com ODN AS do R1-FCI por até 18 horas antes de encapsulação.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é vacinado com 20 câmaras por cerca de 48 horas.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara contém cerca de 1 x 10⁴ a cerca de 5 x 10⁶células tumorais.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a câmara compreende de cerca de 1 x 10⁵ a cerca de

1,5 x 10⁶ células tumorais.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a câmara contém cerca de 10⁶ células tumorais.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

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2/4 pelo fato de que a câmara contém cerca de 1 pg a cerca de 5 pg do ODN AS do R1-FCI.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a câmara contém cerca de 4 pg do ODN AS do R1 -FCI.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células tumorais não são expostas a temperaturas acima da temperatura corporal.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer cerebral é selecionado de um astrocitoma de grau II, astrocitoma de grau Alll, astrocitoma de grau Alll-G e astrocitoma de grau IV (glioblastoma multiforme).
11. Câmara de biodifusão para implantação em um indivíduo que apresenta câncer cerebral, caracterizada pelo fato de que compreende:

(a) células tumorais irradiadas, em que as células tumorais compreendem células aderentes obtidas do tecido tumoral do indivíduo utilizando um morcelador de tecidos; e (b) ODN AS do R1 -FCI irradiado, em que o ODN AS do R1 FCI apresenta a sequência de SEQ ID N^Q: 1.
12. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as células tumorais são pré-incubadas com oligodesoxinucleotídeo antissenso do receptor 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (ODN AS do R1-FCI) antes de encapsulação na câmara.
13. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a câmara contém cerca de 1 pg a cerca de 5 pg do ODN AS do R1-FCI.
14. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a câmara contém cerca de 4 pg do ODN AS do R1-FCI.

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3/4
15. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as células tumorais na câmara são enriquecidas de células positivas a Nestina comparadas com o tecido tumoral obtido do indivíduo.
16. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o morcelador de tecido compreende uma cânula interna alternativa de alta velocidade em uma cânula externa estacionária.
17. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o morcelador de tecido não produz calor direcionado ao tecido tumoral quando o tecido é obtido do indivíduo.
18. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que contém cerca de 1 x 10⁴ a cerca de 5 x 10⁶ células tumorais.
19. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que contém de cerca de 1 x 10⁵ a cerca de

1,5 x 10⁶ células tumorais.
20. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que contém cerca de 10⁶ células tumorais.
21. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que uma razão de células tumorais para ODN AS na câmara é de cerca de 5,0 x 10⁵ células: pg.
22. Câmara de biodifusão, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a cânula externa compreende uma abertura lateral, e adicionalmente, em que as células tumorais são arrastadas para a abertura lateral por meio de sucção variável eletronicamente controlada.
23. Uso de uma câmara de biodifusão, como definida em

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4/4 qualquer uma das reivindicações 11 a 22, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica e/ou vacina para tratamento de um indivíduo apresentando um câncer cerebral.