BR112017028602B1

BR112017028602B1 - METHOD FOR PRODUCING ISOLATED PARTIALLY MATURE AND ACTIVATED HUMAN DENDRITIC CELLS, AND USE OF A PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING PARTIALLY MATURE AND ACTIVATED HUMAN DENDRITIC CELLS

Info

Publication number: BR112017028602B1
Application number: BR112017028602-5A
Authority: BR
Inventors: Marnix L. Bosch
Original assignee: Northwest Biotherapeutics, Inc
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2024-12-10

Abstract

CÉLULAS DENDRÍTICAS DEVIDAMENTE ATIVADAS QUE INDUZEM UMA RESPOSTA IMUNE ANTITUMORAL APERFEIÇOADA OU AUMENTADA. A presente invenção proporciona populações de células que compreendem células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas que podem ser usadas para administração a indivíduos com um câncer e/ou tumor. Células dendríticas parcialmente maduras, as quais foram postas em contato com um agente de maturação de célula dendrítica durante cerca de 10 a cerca de 19 horas, após a administração levantam e processam, de forma eficiente, os antígenos de tumores na área do local do tumor, maturação completa, e podem posteriormente migrar para os glânglios linfáticos de um indivíduo tratado. Uma vez que em um glânglio linfático, o antígeno completamente maduro apresentando células dendríticas segrega as citocinas apropriadas (por exemplo, TNFalfa, IL-6, IL-8, e/ou IL-12) e células T de contato induzindo uma clínica substancial e ótima e/ou resposta imune antitumoral.PROPERLY ACTIVATED DENDRITIC CELLS THAT INDUCE AN ENHANCED OR ENHANCED ANTI-TUMORAL IMMUNE RESPONSE. The present invention provides cell populations comprising partially mature and properly activated dendritic cells that can be used for administration to subjects having a cancer and/or tumor. Partially mature dendritic cells, which have been contacted with a dendritic cell maturation agent for about 10 to about 19 hours after administration efficiently pick up and process tumor antigens in the area of the tumor site, complete maturation, and can subsequently migrate to the lymph nodes of a treated subject. Once in a lymph node, fully mature antigen presenting dendritic cells secrete the appropriate cytokines (e.g., TNFalpha, IL-6, IL-8, and/or IL-12) and contact T cells inducing a substantial and optimal clinical and/or antitumor immune response.

Description

BASIS

[001] As células apresentadoras de antígenos (APCs) são importantes na obtenção de uma resposta imune eficaz. As mesmas não apenas apresentam antígenos para células T com receptores de células T específicas de antígenos, mas também fornecem os sinais necessários para a ativação de células T. A capacidade das APCs para ambos os antígenos presentes e a distribuição de sinais para ativação de células T é comumente referida a como uma função de célula acessória. Embora os monócitos e as células B tenham demonstrado ser APCs competentes, suas capacidades apresentadoras de antígenos in vitro parecem estar limitadas à reativação de células T previamente sensibilizadas. Portanto, os monócitos e as células B não são capazes de ativar diretamente as populações de células T funcionalmente nativas ou não-primadas. As mesmas também não são capazes de distribuir sinais que podem polarizar uma resposta imune induzida, ou uma resposta imune à medida que é induzida.[001] Antigen-presenting cells (APCs) are important in eliciting an effective immune response. They not only present antigen to T cells bearing antigen-specific T cell receptors, but also provide the signals necessary for T cell activation. The ability of APCs to both present antigen and deliver signals for T cell activation is commonly referred to as an accessory cell function. Although monocytes and B cells have been shown to be competent APCs, their antigen-presenting capabilities in vitro appear to be limited to the reactivation of previously primed T cells. Therefore, monocytes and B cells are not capable of directly activating functionally native or unprimed T cell populations. They are also not capable of delivering signals that can polarize an induced immune response, or an immune response as it is induced.

[002] As células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras de antígenos profissionais do sistema imune que são acreditadas serem capazes de ativar células T nativas e de memória. As células dendríticas são cada vez mais preparadas ex vivo para uso em imunoterapia, particularmente a imunoterapia do câncer. A preparação de células dendríticas com propriedades imunoestimuladoras ideais requer uma compreensão e exploração da biologia dessas células para cultura ex vivo. Vários protocolos para a cultura dessas células foram descritos, com várias vantagens descritas a cada protocolo.[002] Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the immune system that are believed to be capable of activating both native and memory T cells. Dendritic cells are increasingly prepared ex vivo for use in immunotherapy, particularly cancer immunotherapy. Preparation of dendritic cells with optimal immunostimulatory properties requires an understanding and exploration of the biology of these cells for ex vivo culture. Several protocols for culturing these cells have been described, with several advantages described with each protocol.

[003] A ativação de células dendríticas inicia o processo que converte DCs imaturas, que são fenotipicamente similares às células Langerhans da pele, às células apresentadoras de antígenos maduras que podem migrar para os gânglios linfáticos. Este processo resulta na perda gradual e progressiva da poderosa capacidade de captação de antígeno que caracteriza a célula dendrítica imatura, e na regulação da expressão de moléculas de superfície de célula coestimuladoras e várias citocinas. Vários estímulos podem iniciar a maturação de DCs. Este processo é complexo e, pelo menos, maturação completa in vitro de células dendríticas monocíticas, dependendo do agente de maturação de células dendríticas utilizado, pode levar até 48 horas para completar. Uma outra consequência da maturação é uma alteração nas propriedades migratórias in vivo das células. Por exemplo, a indução da maturação de células dendríticas imaturas induz vários receptores de quimiocinas, incluindo CCR7, que direcionam as células para as regiões de células T de drenagem de gânglios linfáticos, onde as DCs maduras ativam células T contra os antígenos apresentados sobre a superfície DC no contexto das moléculas de MHC de classe I e classe II. Os termos "ativação" e "maturação", e "ativado/a" e "maduro/a" descrevem o processo de induzir e completar a transição de uma DC imatura (parcialmente caracterizada pela capacidade de absorver o antígeno) para uma DC madura (parcialmente caracterizada pela capacidade de estimular eficazmente as respostas de células T de novo). Os termos tipicamente são utilizados de forma intercambiável na técnica.[003] Activation of dendritic cells initiates the process that converts immature DCs, which are phenotypically similar to Langerhans cells of the skin, into mature antigen-presenting cells that can migrate to lymph nodes. This process results in the gradual and progressive loss of the powerful antigen uptake capacity that characterizes the immature dendritic cell, and in the downregulation of the expression of costimulatory cell surface molecules and various cytokines. Various stimuli can initiate DC maturation. This process is complex and, at least, complete in vitro maturation of monocytic dendritic cells, depending on the dendritic cell maturation agent used, can take up to 48 hours to complete. Another consequence of maturation is an alteration in the in vivo migratory properties of the cells. For example, induction of maturation of immature dendritic cells induces several chemokine receptors, including CCR7, that direct the cells to the T cell regions of draining lymph nodes, where mature DCs activate T cells against antigens presented on the DC surface in the context of MHC class I and class II molecules. The terms "activation" and "maturation", and "activated" and "mature" describe the process of inducing and completing the transition of an immature DC (partially characterized by the ability to take up antigen) to a mature DC (partially characterized by the ability to effectively stimulate de novo T cell responses). The terms are typically used interchangeably in the art.

[004] Os protocolos de maturação conhecidos são com base no ambiente in vivo que acredita-se que DCs se encontrem durante ou após a exposição a antígenos. Um exemplo inicial desta abordagem é o uso de meios condicionados de monócitos (MCM) como um meio de cultura de célula. O MCM é gerado in vitro cultivando monócitos e utilizado como uma fonte de fatores de maturação. (Ver, por exemplo, U.S. 2002/0160430, aqui incorporado por referência). Os principais componentes do MCM responsável pela maturação são descritos como as citocinas (pró-inflamatórias) de Interleucina 1 beta (IL- lβ), Interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα).[004] Known maturation protocols are based on the in vivo environment that DCs are believed to encounter during or after exposure to antigen. An early example of this approach is the use of monocyte conditioned media (MCM) as a cell culture medium. MCM is generated in vitro by culturing monocytes and used as a source of maturation factors. (See, e.g., U.S. 2002/0160430, incorporated herein by reference.) The major components of MCM responsible for maturation are described as the (pro-inflammatory) cytokines Interleukin 1 beta (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6), and tumor necrosis factor alpha (TNFα).

[005] A maturação de DCs pode, portanto, ser desencadeada ou iniciada por uma multiplicidade de fatores diferentes que atuam através de um hospedeiro de caminhos de transdução de sinal. Consequentemente, não existe uma única via de maturação ou resultado, mas existe de fato um universo de estágios DC maduros, cada um com suas próprias características funcionais distintas. Conceitualmente, isso faz sentido porque as várias ameaças ao corpo, as quais o sistema imune deve responder, são múltiplas, exigindo diferentes estratégias de ataque. Como um exemplo, enquanto a infecção bacteriana é melhor removida por macrófagos ativados suplementados com anticorpos específicos, uma infecção viral é melhor atacada através de células T citotóxicas que efetivamente matam células infectadas por vírus. A morte de células cancerosas geralmente envolve uma combinação de células T citotóxicas, células de morte naturais e anticorpos.[005] DC maturation can therefore be triggered or initiated by a multitude of different factors acting through a host of signal transduction pathways. Consequently, there is no single maturation pathway or outcome, but rather a universe of mature DC stages, each with its own distinct functional characteristics. Conceptually, this makes sense because the various threats to the body to which the immune system must respond are multiple, requiring different strategies of attack. As an example, while a bacterial infection is best removed by activated macrophages supplemented with specific antibodies, a viral infection is best attacked by cytotoxic T cells that effectively kill virus-infected cells. The killing of cancer cells usually involves a combination of cytotoxic T cells, natural killer cells, and antibodies.

[006] A maturação in vitro de DCs pode, portanto, ser projetada para induzir o sistema imune a favorecer um tipo de resposta imune em relação a outro, isto é, polarizar a resposta imune. A maturação direcional de DCs descreve a noção de que o resultado do processo de maturação determina o tipo de resposta imune que resulta a partir do tratamento com as DCs maduras. Na sua forma mais simples, a maturação direcional resulta em uma população de DC que produz citocinas que direcionam uma resposta de célula T polarizada para uma resposta imune de tipo Th1 ou Th2. As DCs expressam até nove receptores do tipo Toll diferentes (TLR1 através de TLR9), cada um dos quais pode ser usado para desencadear a maturação. Não surpreendentemente, a interação de produtos bacterianos com TLR2 e TLR4 resulta em maturação direcional de DCs, resultando em uma resposta polarizada mais apropriada para lidar com infecções bacterianas. Por outro lado, a maturação desencadeada através de TLR7 ou TLR9 parece resultar mais em uma resposta de tipo antiviral. Como um exemplo adicional, a adição de interferon gama (IFN-Y) à maioria dos protocolos de maturação resulta na produção de interleucina 12 pelos DCs maduros, que dita uma resposta imune do tipo Th1. Por outro lado, a inclusão de prostaglandina E2 tem o efeito oposto.[006] In vitro maturation of DCs can therefore be engineered to induce the immune system to favor one type of immune response over another, i.e., to polarize the immune response. Directional maturation of DCs describes the notion that the outcome of the maturation process determines the type of immune response that results from treatment with the mature DCs. In its simplest form, directional maturation results in a DC population that produces cytokines that direct a polarized T cell response toward a Th1 or Th2 type immune response. DCs express up to nine different Toll-like receptors (TLR1 through TLR9), each of which can be used to trigger maturation. Not surprisingly, the interaction of bacterial products with TLR2 and TLR4 results in directional maturation of DCs, resulting in a polarized response more appropriate to deal with bacterial infections. In contrast, maturation triggered through TLR7 or TLR9 appears to result more in an antiviral type response. As an additional example, the addition of interferon gamma (IFN-Y) to most maturation protocols results in the production of interleukin 12 by mature DCs, which dictates a Th1-type immune response. Conversely, the inclusion of prostaglandin E2 has the opposite effect.

[007] As células dendríticas completamente maduras diferem qualitativa e quantitativamente a partir de DCs imaturas. Uma vez completamente maduras, as DCs expressam níveis mais elevados de antígenos de MHC de classe I e classe II, e níveis mais altos de moléculas coestimuladoras de células T, tais como CD80 e CD86. Essas mudanças aumentam a capacidade das células dendríticas para ativar as células T porque aumentam a densidade do antígeno sobre a superfície de célula, bem como a magnitude do sinal de ativação das células T através das contrapartes das moléculas coestimuladoras sobre as células T, por exemplo, CD28 e similares. Além disso, as DCs maduras produzem grandes quantidades de citocinas, as quais estimulam e polarizam a resposta das células T. Estas citocinas incluem interleucina 12 associada a uma resposta imune de tipo Th1 e interleucina- 10 e interleucina-4 associadas a uma resposta imune do tipo Th2.[007] Fully mature dendritic cells differ qualitatively and quantitatively from immature DCs. Once fully mature, DCs express higher levels of MHC class I and class II antigens, and higher levels of T cell costimulatory molecules such as CD80 and CD86. These changes enhance the ability of dendritic cells to activate T cells because they increase the density of antigen on the cell surface as well as the magnitude of the T cell activation signal through the counterparts of the costimulatory molecules on T cells, e.g., CD28 and the like. In addition, mature DCs produce large amounts of cytokines, which stimulate and polarize the T cell response. These cytokines include interleukin-12 associated with a Th1-type immune response and interleukin-10 and interleukin-4 associated with a Th2-type immune response.

[008] Geralmente, os métodos para a geração de DC ex vivo compreendem a obtenção de uma população de célula enriquecida para células precursoras de DC a partir de um indivíduo e, em seguida, diferenciam as células precursoras de DC in vitro em DCs completamente maduras antes da introdução de volta para o indivíduo. Normalmente, durante este processo, as DCs em amadurecimento são colocadas em contato com antígeno para serem aceitas e processadas à medida que as DCs se tornam maduras. Acredita-se que as DCs devem ser diferenciadas terminalmente, ou as mesmas serão desdiferenciadas de volta para os monócitos/macrófagos e perderão grande parte de sua capacidade de potencialização imune. A maturação ex vivo de DCs geradas a partir de monócitos foi realizada com sucesso com métodos e agentes bem conhecidos na técnica.[008] Generally, methods for generating DCs ex vivo comprise obtaining a cell population enriched for DC precursor cells from an individual and then differentiating the DC precursor cells in vitro into fully mature DCs prior to introduction back into the individual. Typically, during this process, the maturing DCs are contacted with antigen to be taken up and processed as the DCs become mature. It is believed that DCs must be terminally differentiated, or they will dedifferentiate back to monocytes/macrophages and lose much of their immune potentiating capacity. Ex vivo maturation of DCs generated from monocytes has been successfully accomplished with methods and agents well known in the art.

[009] As células dendríticas (DCs) são reconhecidas como o veículo de escolha para a imunoterapia ativa do câncer. As experiências com animais demonstraram o potencial da imunoterapia com base em DC em ambos os camundongos protetores a partir da formação de tumor e eliminaram os tumores estabelecidos. Esses sucessos foram, pelo menos, parcialmente duplicados em seres humanos em pequenos ensaios clínicos. A transição a partir de pequenos ensaios de segurança ou prova de conceito para ensaios maiores, em que a atividade ou a eficácia pode ser demonstrada foi dificultada pela natureza laboriosa e pesada da preparação DC como descrito acima. Como uma consequência, poucas empresas estiveram interessadas em desenvolver vacinas contra câncer com base em DC, apesar do grande potencial devalor terapêutico de tais produtos.[009] Dendritic cells (DCs) are recognized as the vehicle of choice for active cancer immunotherapy. Animal experiments have demonstrated the potential of DC-based immunotherapy in both protecting mice from tumor formation and eliminating established tumors. These successes have been at least partially replicated in humans in small clinical trials. The transition from small safety or proof-of-concept trials to larger trials in which activity or efficacy can be demonstrated has been hampered by the laborious and cumbersome nature of DC preparation as described above. As a consequence, few companies have been interested in developing DC-based cancer vaccines, despite the great potential therapeutic value of such products.

[0010] A injeção intratumoral (IT) de DCs é uma forma especial de imunoterapia com base em DC. Após a injeção, asDCs adotam o antígeno in vivo de, por exemplo, células tumorais apoptóticas ou mortas, e apresentam os antígenos às células T após a migração para os gânglios linfáticos. Defato, verificou-se que a eficácia de tais tratamentos em modelos animais se correlaciona com o grau de apoptose notumor (Candido et al., Cancer Res. 61: 228-236, 2001), o quesugere que essa abordagem é totalmente compatível com tratamento de tumores com agentes quimioterapêuticos ou de radiação antes da injeção de DCs. Além disso, vários grupos demonstraram que tal terapia de combinação é particularmente eficaz contra tumores estabelecidos (Nikitina et al., Int. J. Cancer 94: 825-833,2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer101: 265-269, 2002; Tong et al., Cancer Res. 61: 7530-7535,2001).[0010] Intratumoral (IT) injection of DCs is a special form of DC-based immunotherapy. After injection, DCs adopt antigen in vivo from, for example, apoptotic or dead tumor cells, and present the antigens to T cells after migration to the lymph nodes. Indeed, the efficacy of such treatments in animal models has been found to correlate with the degree of apoptosis in the tumor (Candido et al., Cancer Res. 61: 228-236, 2001), suggesting that this approach is fully compatible with treating tumors with chemotherapeutic agents or radiation prior to DC injection. Furthermore, several groups have demonstrated that such combination therapy is particularly effective against established tumors (Nikitina et al., Int. J. Cancer 94:825-833,2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer101:265-269, 2002; Tong et al., Cancer Res. 61:7530-7535,2001).

[0011] Uma vez que as células tumorais in vivo são a fonte do antígeno, a injeção de IT renuncia à necessidade para a seleção e fabricação de antígenos tumorais, pois as mesmas são atualmente utilizadas na maioria das abordagens de terapia com base em DC in vitro. A seleção de um antígeno tumoral é, muitas vezes, motivada pela necessidade das empresas terem uma posição proprietária e os poucos antígenos tumorais identificados até o momento ainda não foram provados para fornecer benefícios clínicos significativos. Além disso, o uso de tais antígenos tumorais geralmente resulta em uma vacina monovalente, o que pode perder sua eficácia se as células tumorais reduzem a expressão do antígeno usado na imunização. Naturalmente, a necessidade de fabricar o antígeno tumoral sob as condições exigidas nas Boas Práticas de Fabricação (GMP) aumenta o custo adicional para os métodos de imunização clássicos com base em DC.[0011] Since tumor cells in vivo are the source of the antigen, IT injection obviates the need for tumor antigen selection and manufacturing, as these are currently used in most in vitro DC-based therapy approaches. The selection of a tumor antigen is often driven by the need for companies to have a proprietary position, and the few tumor antigens identified to date have not yet been proven to provide significant clinical benefit. Furthermore, the use of such tumor antigens usually results in a monovalent vaccine, which may lose its efficacy if the tumor cells reduce the expression of the antigen used for immunization. Naturally, the need to manufacture the tumor antigen under the conditions required by Good Manufacturing Practices (GMP) adds additional cost to classical DC-based immunization methods.

[0012] A injeção de IT de DCs submete as células dendríticas a um ambiente tumoral imunossupressor. É sabido que os tumores produzem citocinas que inativam as DCs ou que têm a capacidade de diminuir a resposta das células T parauma resposta imune do tipo Th2 menos eficaz. Vários gruposusaram a modificação genética de DCs para tentar superar esses efeitos supressivos, especialmente através da produção da citocina de Interleucina 12 (IL-12; Nishioka et al.,Cancer Res. 59: 4035-4041, 1999; Melero et al., Gene Therapy 6: 1779-1784, 1999) ou a expressão do ligando CD40 (Kikuchiet al., Blood 96: 91-99, 2000). Os resultados de incentivodescritos por esses grupos demonstram ainda a viabilidade da injeção de IT de DCs como abordagem terapêutica.[0012] IT injection of DCs subjects dendritic cells to an immunosuppressive tumor environment. It is known that tumors produce cytokines that inactivate DCs or that have the ability to downregulate T cell responses to a less effective Th2-type immune response. Several groups have used genetic modification of DCs to attempt to overcome these suppressive effects, notably through production of the cytokine Interleukin 12 (IL-12; Nishioka et al., Cancer Res. 59: 4035-4041, 1999; Melero et al., Gene Therapy 6: 1779-1784, 1999) or expression of the CD40 ligand (Kikuchi et al., Blood 96: 91-99, 2000). The encouraging results described by these groups further demonstrate the feasibility of IT injection of DCs as a therapeutic approach.

[0013] Triozzi et al. (Cancer 89: 2647-2654, 2000)descrevem a injeção de IT de DCs em pacientes com melanoma metastático ou câncer de mama. Os mesmos obtiveram regressão tumoral em 4 pacientes com melanoma e em dois pacientes comcarcinoma de mama. As biópsias das lesões regredidas demonstraram células T infiltrantes, sugerindo que a DC efetivamente ativou uma resposta imune contra as células tumorais. Em geral, esses dados demonstraram que a injeção de IT de DCs era viável em seres humanos, e poderia fornecer benefício clínico significativo. No entanto, observou-se uma regulação descendente significativa dos antígenos da classe II de MHC e da molécula coestimuladora B7-2 em DCs injetadas. A regulação negativa destas moléculas críticas deveria reduzir o potencial imunoestimulante das DCs.[0013] Triozzi et al. (Cancer 89: 2647-2654, 2000) describe IT injection of DCs into patients with metastatic melanoma or breast cancer. They achieved tumor regression in 4 patients with melanoma and in 2 patients with breast carcinoma. Biopsies of the regressed lesions demonstrated infiltrating T cells, suggesting that the DC effectively activated an immune response against the tumor cells. Overall, these data demonstrated that IT injection of DCs was feasible in humans and could provide significant clinical benefit. However, significant downregulation of MHC class II antigens and the costimulatory molecule B7-2 was observed in injected DCs. Downregulation of these critical molecules should reduce the immunostimulatory potential of DCs.

[0014] Um método para superar esta regulação decrescentefoi descrito no documento WO 2004/053072 (aqui incorporado por referência) onde se verificou que a regulação decrescentepode ser evitada através da maturação parcial das DCs antes da administração. Neste método, os precursores de células dendríticas (células de medula óssea após lise de células vermelhas ou precursores de células dendríticas monocíticas) foram induzidos in vitro a se diferenciar em células dendríticas imaturas e as células dendríticas imaturas foram induzidas a iniciar a maturação cultivando as células com um agente de maturação de células dendríticas, tais como BCG e IFNY, lipopolissacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral α (TNFα), um composto de imidazoquinolina, umpolitribonucleotídeo de filamento duplo sintético, um agonista de um receptor do tipo Toll (TLR), uma sequência de ácidos nucléicos contendo motivos CpG não-metilado conhecidos para induzir a maturação de DC, ou qualquer combinação dos mesmos. As células dendríticas imaturas foram permitidas para continuar a maturação durante um período detempo menor que o anteriormente foi determinado para que ascélulas dendríticas imaturas se amadureçam completamente. Se as células dendríticas fossem completamente maduras in vitro, as células seriam incapazes de absorver e processar o antígeno subsequente à administração ao paciente. Os inventores descreveram que as células dendríticas deveriam ser amadurecidas durante 1 a cerca de 10 horas para uma ativação ótima antes do isolamento das células dendríticas parcialmente maduras e formulação para administração a um paciente.[0014] A method to overcome this down-regulation was described in WO 2004/053072 (incorporated herein by reference) where it was found that down-regulation can be avoided by partially maturing the DCs prior to administration. In this method, dendritic cell precursors (bone marrow cells after red blood cell lysis or monocytic dendritic cell precursors) were induced in vitro to differentiate into immature dendritic cells, and the immature dendritic cells were induced to initiate maturation by culturing the cells with a dendritic cell maturation agent such as BCG and IFNY, lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor α (TNFα), an imidazoquinoline compound, a synthetic double-stranded polytribonucleotide, a Toll-like receptor (TLR) agonist, a nucleic acid sequence containing unmethylated CpG motifs known to induce DC maturation, or any combination thereof. The immature dendritic cells were allowed to continue maturation for a shorter period of time than previously determined for the immature dendritic cells to fully mature. If the dendritic cells were allowed to fully mature in vitro, the cells would be unable to take up and process antigen subsequent to administration to the patient. The inventors disclosed that the dendritic cells should be matured for 1 to about 10 hours for optimal activation prior to isolation of the partially mature dendritic cells and formulation for administration to a patient.

[0015] Inesperadamente, verificou-se que as células dendríticas imaturas colocadas em contato com um agente dematuração de células dendríticas (por exemplo, BCG e IFNy)durante cerca de 10 a cerca de 19 horas são ativadas de formaóptima para a captação e processamento de antígeno in vivoe a subsequente indução de uma resposta antitumoral em um indivíduo.[0015] Unexpectedly, it has been found that immature dendritic cells contacted with a dendritic cell maturing agent (e.g., BCG and IFNγ) for about 10 to about 19 hours are optimally activated for antigen uptake and processing in vivo and the subsequent induction of an antitumor response in a subject.

SUMMARY

[0016] A presente invenção proporciona um método para produzir células dendríticas humanas ativadas isoladas, compreendendo: i) isolar uma população de célulacompreendendo PBMCs humanas a partir de sangue periférico; ii) enriquecer a população de célula compreendendo PBMCs humanas para precursores de células dendríticas monocíticas humanas; iii) cultivar a população de célula enriquecida para precursores de células dendríticas monocíticas humanas com um meio de cultura de tecido suplementado com uma quantidade eficaz de um agente de diferenciação de células dendríticas durante um período de tempo suficiente para diferenciar os precursores de células dendríticas monocíticas humanas em células dendríticas humanas imaturas; iv) cultivar a população de célula enriquecida para células dendríticas humanas imaturas com uma quantidade eficaz de um agente de maturação de células dendríticas para ativar as células dendríticas humanas imaturas durante cerca de 10 a cerca de 19 horas; e v) isolar e lavar as células dendríticas humanas ativadas.[0016] The present invention provides a method for producing isolated activated human dendritic cells, comprising: i) isolating a cell population comprising human PBMCs from peripheral blood; ii) enriching the cell population comprising human PBMCs for human monocytic dendritic cell precursors; iii) culturing the cell population enriched for human monocytic dendritic cell precursors with a tissue culture medium supplemented with an effective amount of a dendritic cell differentiating agent for a period of time sufficient to differentiate the human monocytic dendritic cell precursors into immature human dendritic cells; iv) culturing the cell population enriched for immature human dendritic cells with an effective amount of a dendritic cell maturation agent to activate the immature human dendritic cells for about 10 to about 19 hours; and v) isolate and wash activated human dendritic cells.

[0017] Em uma modalidade adicional, um método para produzir células dendríticas humanas ativadas isoladas é proporcionado, em que o método compreende as etapas de: i) isolar uma população de célula compreendendo precursores de células dendríticas monocíticas humanas; ii) cultivar a população de célula enriquecida para precursores de células dendríticas monocíticas humanas com um meio de cultura de tecido suplementado com uma quantidade eficaz de um agente de diferenciação de células dendríticas durante um período de tempo suficiente para diferenciar os precursores de células dendríticas monocíticas humanas em células dendríticas humanas imaturas; iii) cultivar a população de célula enriquecida para células dendríticas humanas imaturas com uma quantidade eficaz de um agente de maturação de células dendríticas para ativar as células dendríticas humanas imaturas durante cerca de 10 a cerca de 19 horas; e iv) isolar e lavar as células dendríticas humanas ativadas.[0017] In a further embodiment, a method for producing isolated activated human dendritic cells is provided, wherein the method comprises the steps of: i) isolating a cell population comprising human monocytic dendritic cell precursors; ii) culturing the cell population enriched for human monocytic dendritic cell precursors with a tissue culture medium supplemented with an effective amount of a dendritic cell differentiating agent for a period of time sufficient to differentiate the human monocytic dendritic cell precursors into immature human dendritic cells; iii) culturing the cell population enriched for immature human dendritic cells with an effective amount of a dendritic cell maturation agent to activate the immature human dendritic cells for about 10 to about 19 hours; and iv) isolating and washing the activated human dendritic cells.

[0018] Os métodos podem usar precursores de células dendríticas monocíticas que são obtidos a partir da pele, baço, medula óssea, timo, glânglios linfáticos, sangue do cordão umbilical, ou sangue periférico. Além disso, os precursores de células dendríticas monocíticas são obtidos a partir do indivíduo a ser tratado ou a partir de um indivíduo saudável compatível com HLA ao indivíduo a ser tratado.[0018] The methods may use monocytic dendritic cell precursors that are obtained from the skin, spleen, bone marrow, thymus, lymph nodes, umbilical cord blood, or peripheral blood. In addition, the monocytic dendritic cell precursors are obtained from the individual to be treated or from a healthy individual HLA-matched to the individual to be treated.

[0019] Nos métodos acima, o agente de diferenciação de células dendríticas pode ser GM-CSF sozinho sem outras citocinas ou GM-CSF em combinação com Interleucina 4 (IL-4).Interleucina 7 (IL-7), Interleucina 13 (IL-13) ouInterleucina 15 (IL-15) e similares. Em uma modalidade típicaem que o GM-CSF é utilizado sozinho, precursores de células dendríticas monocíticas não-ativadas são utilizados e o meio de cultura de tecido também é suplementado com, pelo menos, 1% de proteína humana ou animal para evitar a adesão dos precursores de células dendríticas monocíticas não-ativadas ao substrato de cultura de tecido. A proteína humana ou animal pode ser uma albumina, soro, plasma, gelatina, um ácido de poliamino, e similares.[0019] In the above methods, the dendritic cell differentiating agent may be GM-CSF alone without other cytokines or GM-CSF in combination with Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 7 (IL-7), Interleukin 13 (IL-13) or Interleukin 15 (IL-15) and the like. In a typical embodiment in which GM-CSF is used alone, non-activated monocytic dendritic cell precursors are used and the tissue culture medium is also supplemented with at least 1% human or animal protein to prevent adhesion of the non-activated monocytic dendritic cell precursors to the tissue culture substrate. The human or animal protein may be an albumin, serum, plasma, gelatin, a polyamino acid, and the like.

[0020] Nos métodos, o agente de maturação de células dendríticas pode ser inativado por Bacillus Calmette-Guerin (BCG), interferon y (IFNY), lipopolissacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral α (TNFα), um composto de imidazoquinolina,um polirribonucleotídeo de filamento duplo sintético, por exemplo, poli [I]: poli [C(12)U], um agonista de um receptor do tipo Toll (TLR), uma sequência de ácidos nucléicos contendo motivos CpG não-metilados, conhecidos por induzira maturação de células dendríticas, ou qualquer combinaçãodos mesmos. O BCG inativado pode compreender BCG inteiro, constituintes de parede celular de BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG, ou componentes BCG e o BCG inativado podeser inativado pelo calor, tratado com formalina, inativado pelo calor e tratado com formalina, e similares.[0020] In the methods, the dendritic cell maturation agent can be inactivated by Bacillus Calmette-Guerin (BCG), interferon γ (IFNY), lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor α (TNFα), an imidazoquinoline compound, a synthetic double-stranded polyribonucleotide, e.g., poly[I]:poly[C(12)U], a Toll-like receptor (TLR) agonist, a nucleic acid sequence containing unmethylated CpG motifs known to induce dendritic cell maturation, or any combination thereof. The inactivated BCG can comprise whole BCG, BCG cell wall constituents, BCG-derived lipoarabidomannans, or BCG components, and the inactivated BCG can be heat-inactivated, formalin-treated, heat-inactivated and formalin-treated, and the like.

[0021] Quando usado em um dos métodos acima, a quantidadeeficaz de BCG é de cerca de 105 a cerca de 107 cfu por mililitro de meio de cultura de tecido e a quantidadeeficaz de IFNY é de cerca de 100 a cerca de 1.000 unidades por mililitro de meio de cultura de tecido. Quando o método acima utiliza um composto de imidazoquinolina, o composto pode ser um composto de imidazoquinolina-4-amina, por exemplo, 4-amino-2-etoximetil-α,α-dimetil-1H-imidazol [4,5-c] quinolin-1-5 etanol ou 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina, ou um derivado do mesmo.[0021] When used in one of the above methods, the effective amount of BCG is about 105 to about 107 cfu per milliliter of tissue culture medium and the effective amount of IFNY is about 100 to about 1,000 units per milliliter of tissue culture medium. When the above method utilizes an imidazoquinoline compound, the compound may be an imidazoquinoline-4-amine compound, for example, 4-amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-5ethanol or 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine, or a derivative thereof.

[0022] Uma composição compreendendo as células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas pode ser administrada diretamente no tumor; em um leito de tumor subsequente à remoção cirúrgica ou resseção do tumor; em uma área de tecido que envolve um tumor; em um glânglio linfático diretamente drenando uma área de tumor; diretamente para um vaso ou duto circulatório que distribui sangue ou linfa ao tumor ou um órgão afligido pelo tumor; ou no sistema circulatório, de modo que as células sejam distribuídas ao tumor ou órgão afligido pelo tumor.[0022] A composition comprising the partially mature and properly activated dendritic cells can be administered directly into the tumor; into a tumor bed subsequent to surgical removal or resection of the tumor; into an area of tissue surrounding a tumor; into a lymph node directly draining an area of tumor; directly into a circulatory vessel or duct delivering blood or lymph to the tumor or an organ afflicted by the tumor; or into the circulatory system such that the cells are delivered to the tumor or organ afflicted by the tumor.

[0023] As células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas produzidas por qualquer um dos métodos acima podem ser administradas como um adjuvante para terapia de radiação, quimioterapia ou uma combinação do mesmo. Por exemplo, as células dendríticas parcialmente maduras devidamente ativadas podem ser administradas antes, de forma simultânea com, ou subsequente à terapia de radiação, quimioterapia, ou uma combinação da mesma.[0023] The partially mature and properly activated dendritic cells produced by any of the above methods can be administered as an adjuvant to radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof. For example, the partially mature, properly activated dendritic cells can be administered prior to, concurrently with, or subsequent to radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof.

[0024] Em outra modalidade, um método é proporcionado para produzir uma resposta imune antitumoral e/ou resposta clínica compreendendo a administração de uma composição compreendendo uma população de célula enriquecida para células dendríticas humanas que foram parcialmente maduras e ativadas in vitro com um agente de maturação de células dendríticas humanas durante cerca de 10 a cerca de 19 horas e um veículo farmaceuticamente aceitável; em que a composição é administrada em um tumor, em um leito de tumor ou em uma área de tecido que envolve um tumor em um indivíduo que necessita de tal tratamento.[0024] In another embodiment, a method is provided for producing an anti-tumor immune response and/or clinical response comprising administering a composition comprising a cell population enriched for human dendritic cells that have been partially matured and activated in vitro with a human dendritic cell maturation agent for about 10 to about 19 hours and a pharmaceutically acceptable carrier; wherein the composition is administered to a tumor, a tumor bed, or an area of tissue surrounding a tumor in a subject in need of such treatment.

[0025] Ainda em outra modalidade, uma composição é proporcionada compreendendo células dendríticas humanas parcialmente maduras e devidamente ativadas, induzidas para amadurecer por cultura com um agente de maturação de células dendríticas humanas durante cerca de 10 a cerca de 19 horas, em que as células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas produzem citocinas associadas com uma resposta inflamatória. Por exemplo, as citocinas podem incluir o fator de necrose tumoral α (TNFα), interleucina 6 (IL-6), e/ou interleucina 8 (IL-8).[0025] In yet another embodiment, a composition is provided comprising partially mature and properly activated human dendritic cells induced to mature by culturing with a human dendritic cell maturation agent for about 10 to about 19 hours, wherein the partially mature and properly activated dendritic cells produce cytokines associated with an inflammatory response. For example, the cytokines can include tumor necrosis factor α (TNFα), interleukin 6 (IL-6), and/or interleukin 8 (IL-8).

DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0026] Os aspectos precedentes e muitas das vantagens que acompanham os métodos e composições aqui descritos tornar- se-ão mais facilmente apreciados à medida que os mesmos se entenderem melhor por referência à seguinte descrição detalhada, quando tomada em conjunto com o desenho que acompanha, em que:A Figura 1 representa parcelas de sobrevivência para cada método de tratamento. Os pontos de dados representam a proporção de indivíduos que permanecem vivos em vários períodos de tempo medidos em meses.[0026] The foregoing aspects and many of the advantages accompanying the methods and compositions described herein will become more readily appreciated as the same are better understood by reference to the following detailed description, when taken in conjunction with the accompanying drawing, in which: Figure 1 depicts survival plots for each treatment method. The data points represent the proportion of subjects remaining alive at various time periods measured in months.

DETAILED DESCRIPTION

[0027] As células dendríticas são uma população diversificada de células apresentadoras de antígeno encontradas em uma variedade de tecidos linfóides e não- linfóides. (Ver Liu, Cell 106: 259-262 (2001), Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296 (1991)). As células dendríticas incluem células dendríticas linfóides do baço, células de Langerhans da epiderme, e células veladas na circulação sanguínea. Coletivamente, as células dendríticas são classificadas como um grupo com base em sua morfologia, altos níveis de expressão superficial de classe II de MHC, e ausência de certos outros marcadores de superfície expressos em células T, células B, monócitos, e células mortas naturais. Em particular, as células dendríticas derivadas de monócitos (também referidas como células dendríticas monocíticas) geralmente expressam CD11c, CD80, CD86, e são HLA-DR+, mas são CD14-.[0027] Dendritic cells are a diverse population of antigen-presenting cells found in a variety of lymphoid and non-lymphoid tissues. (See Liu, Cell 106: 259-262 (2001), Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296 (1991)). Dendritic cells include lymphoid dendritic cells of the spleen, Langerhans cells of the epidermis, and veiled cells in the bloodstream. Collectively, dendritic cells are classified as a group based on their morphology, high levels of surface expression of class II MHC, and absence of certain other surface markers expressed on T cells, B cells, monocytes, and naturally occurring dead cells. In particular, monocyte-derived dendritic cells (also referred to as monocytic dendritic cells) typically express CD11c, CD80, CD86, and are HLA-DR+, but are CD14-.

[0028] Em contraste, os precursores de células dendríticas monocíticas (normalmente monócitos) são geralmente CD14+. Os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser obtidos a partir de qualquer tecido em que residam, particularmente tecidos linfóides, tais como o baço, a medula óssea, os gânglios linfáticos e o timo. Os precursores de células dendríticas monocíticas também podem ser isolados a partir do sistema circulatório.[0028] In contrast, monocytic dendritic cell precursors (usually monocytes) are generally CD14+. Monocytic dendritic cell precursors can be obtained from any tissue in which they reside, particularly lymphoid tissues such as the spleen, bone marrow, lymph nodes, and thymus. Monocytic dendritic cell precursors can also be isolated from the circulatory system.

[0029] O sangue periférico é uma fonte facilmente acessível de precursores de células dendríticas monocíticas. O sangue do cordão umbilical é outra fonte de precursores de células dendríticas monocíticas. Os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser isolados a partir de uma variedade de organismos, em que uma resposta imune pode ser provocada. Tais organismos incluem animais, por exemplo, incluindo seres humanos, e animais não-humanos, tais como primatas, mamíferos (incluindo cães, gatos, camundongos, e ratos), aves (incluindo galinhas), bem como espécies transgênicas dos mesmos.[0029] Peripheral blood is a readily accessible source of monocytic dendritic cell precursors. Umbilical cord blood is another source of monocytic dendritic cell precursors. Monocytic dendritic cell precursors can be isolated from a variety of organisms in which an immune response can be elicited. Such organisms include animals, for example, including humans, and non-human animals, such as primates, mammals (including dogs, cats, mice, and rats), birds (including chickens), as well as transgenic species thereof.

[0030] Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas e/ou células dendríticas imaturas podem ser isolados a partir de um indivíduo saudável ou a partir de um indivíduo com necessidade de imunoestimulação, tal como, por exemplo, um paciente com câncer ou outro indivíduo para o qual a imunoestimulação celular pode ser benéfica ou desejada (isto é, um indivíduo com uma infecção bacteriana ou viral, ou uma condição hiperplástica, e similares). Os precursores de células dendríticas e/ou células dendríticas imaturas também podem ser obtidos a partir de um indivíduo saudável compatível com HLA para a ativação parcial e administração para um indivíduo compatível com HLA que necessite de imunoestimulação.[0030] In certain embodiments, monocytic dendritic cell precursors and/or immature dendritic cells can be isolated from a healthy individual or from an individual in need of immunostimulation, such as, for example, a cancer patient or other individual for whom cellular immunostimulation may be beneficial or desired (i.e., an individual with a bacterial or viral infection, or a hyperplastic condition, and the like). Dendritic cell precursors and/or immature dendritic cells can also be obtained from an HLA-matched healthy individual for partial activation and administration to an HLA-matched individual in need of immunostimulation.

Dendritic Cell Precursors and Immature Dendritic Cells

[0031] Os métodos para isolar populações de células enriquecidas para precursores de células dendríticas, tais como precursores de células dendríticas não-ativadas, e células dendríticas imaturas a partir de várias fontes, incluindo sangue e medula óssea, são conhecidos na técnica. Por exemplo, os precursores de células dendríticas e as células dendríticas imaturas podem ser isolados por coleta de sangue heparinizado, por aférese ou leucoferese, por preparação de revestimentos inflamatórios, rosetar, centrifugação, centrifugação por gradiente de densidade (por exemplo, usando Ficoll® (tal como, FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (partículas de sílica coloidal (15-30 nm de diâmetro) revestidos com polivinilpirrolidona não-dialisável (PVP)), sacarose, e similares), lise diferencial de células, filtração, e similares. Em certas modalidades, uma população de leucócitos pode ser preparada, tal como, por exemplo, coletando sangue a partir de um indivíduo, desfibrilando para remover as plaquetas e lise das células de glóbulos vermelhos. Os precursores de células dendríticas e as células dendríticas imaturas podem opcionalmente ser enriquecidos para precursores de células dendríticas monocíticas, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL®, anel de anticorpos, e similares. O termo "enriquecido", tal como aqui utilizado, significa que os precursores de células dendríticas monocíticas, células dendríticas imaturas, ou células dendríticas parcialmente maduras na população de célula compreendem, pelo menos 25% do número total de células na população, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos até 90% do número total de células na população de célula. Tipicamente, as células enriquecidas compreenderão, pelo menos, cerca de 50% do número total de células na população. Em certas modalidades, as células enriquecidas compreenderão, pelo menos, cerca de 90% e até cerca de 100% do número total de células na população de células.[0031] Methods for isolating cell populations enriched for dendritic cell precursors, such as non-activated dendritic cell precursors, and immature dendritic cells from various sources, including blood and bone marrow, are known in the art. For example, dendritic cell precursors and immature dendritic cells can be isolated by collection of heparinized blood, by apheresis or leukapheresis, by preparation of blob coatings, rosetting, centrifugation, density gradient centrifugation (e.g., using Ficoll® (such as FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (colloidal silica particles (15-30 nm in diameter) coated with non-dialyzable polyvinylpyrrolidone (PVP)), sucrose, and the like), differential cell lysis, filtration, and the like. In certain embodiments, a leukocyte population can be prepared, such as by collecting blood from a subject, defibrillating to remove platelets, and lysing the red blood cells. The dendritic cell precursors and immature dendritic cells can optionally be enriched for monocytic dendritic cell precursors, for example, by centrifugation through a PERCOLL® gradient, antibody ring, and the like. The term "enriched" as used herein means that the monocytic dendritic cell precursors, immature dendritic cells, or partially mature dendritic cells in the cell population comprise at least 25% of the total number of cells in the population, at least 30%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least up to 90% of the total number of cells in the cell population. Typically, the enriched cells will comprise at least about 50% of the total number of cells in the population. In certain embodiments, the enriched cells will comprise at least about 90% and up to about 100% of the total number of cells in the cell population.

[0032] Os precursores de células dendríticas e as células dendríticas imaturas podem opcionalmente ser preparados em um sistema asséptico, fechado. Tal como aqui utilizado, os termos "sistema asséptico, fechado" ou "sistema fechado" referem-se a um sistema no qual a exposição ao ar não- estéril, ambiente, ou circulante ou outras condições não- estéreis é minimizada ou eliminada. Os sistemas fechados para isolar os precursores de células dendríticas e as células dendríticas imaturas geralmente excluem a centrifugação do gradiente de densidade em tubos superiores abertos, a transferência de células ao ar livre, a cultura de células em placas de cultura de tecido ou frascos não- selados, e similares. Em uma modalidade típica, o sistema fechado permite a transferência asséptica dos precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas a partir de um vaso de coleta inicial para um vaso de cultura de tecido selável sem exposição ao ar não-estéril.[0032] Dendritic cell precursors and immature dendritic cells may optionally be prepared in an aseptic, closed system. As used herein, the terms "aseptic, closed system" or "closed system" refer to a system in which exposure to non-sterile, ambient, or circulating air or other non-sterile conditions is minimized or eliminated. Closed systems for isolating dendritic cell precursors and immature dendritic cells generally exclude density gradient centrifugation in open top tubes, transfer of cells to open air, culturing of cells in unsealed tissue culture plates or flasks, and the like. In a typical embodiment, the closed system allows aseptic transfer of dendritic cell precursors and immature dendritic cells from an initial collection vessel to a sealable tissue culture vessel without exposure to non-sterile air.

[0033] Outro método relatado para isolar precursores de células dendríticas é usar um substrato plástico comercialmente tratado (por exemplo, esferas ou esferas magnéticas) para remover seletivamente monócitos aderentes e outros "precursores de células não-dendríticas". (Ver, por exemplo, Patentes U.S. de Números 5,994,126 e 5,851,756). Os monócitos aderentes e os precursores de células não- dendríticas são descartados, enquanto as células não- aderentes são retidas para cultura e maturação ex vivo. Em outro método, as células de aférese foram cultivadas em sacos de cultura plástica para os quais plástico, isto é, poliestireno ou estireno, esferas de microveículo foram adicionadas para aumentar a área de superfície do saco.[0033] Another reported method for isolating dendritic cell precursors is to use a commercially treated plastic substrate (e.g., magnetic beads or beads) to selectively remove adherent monocytes and other "non-dendritic cell precursors." (See, e.g., U.S. Patent Nos. 5,994,126 and 5,851,756.) Adherent monocytes and non-dendritic cell precursors are discarded, while non-adherent cells are retained for ex vivo culture and maturation. In another method, apheresis cells were cultured in plastic culture bags to which plastic, i.e., polystyrene or styrene, microcarrier beads were added to increase the surface area of the bag.

[0034] As células foram cultivadas durante um período de tempo suficiente para que certas células aderissem às esferas e as células não-aderentes foram lavadas do saco. (Maffei, et al., Transfusion 40: 1419-1420 (2000); WO 02/44338, aquiincorporado por referência). Em certas outras modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas são isolados por aderência solta a um substrato de ligação a monócitos, como descrito no documento WO 03/010292, cuja descrição é aqui incorporada por referência. Por exemplo, uma população de leucócitos (por exemplo, isolada por leucoferese) pode ser colocada em contato com um substrato aderente de precursor de células dendríticas monocíticas. Quando a população de leucócitos é colocada em contato com o substrato, os precursores de células dendríticas monocíticas na população de leucócitos aderem, de preferência, ao substrato mas não são ativados para se diferenciar ou amadurecer. Outros leucócitos (incluindo outros precursores de células dendríticas potenciais) apresentam afinidade de ligação reduzida ao substrato, permitindo assim que os precursores de células dendríticas monocíticas sejam enriquecidos, de preferência, sobre a superfície do substrato.[0034] The cells were cultured for a period of time sufficient for certain cells to adhere to the beads, and non-adherent cells were washed from the bag. (Maffei, et al., Transfusion 40:1419-1420 (2000); WO 02/44338, incorporated herein by reference). In certain other embodiments, monocytic dendritic cell precursors are isolated by loose adherence to a monocyte-binding substrate, as described in WO 03/010292, the disclosure of which is incorporated herein by reference. For example, a population of leukocytes (e.g., isolated by leukapheresis) can be contacted with an adherent substrate of monocytic dendritic cell precursors. When the leukocyte population is brought into contact with the substrate, the monocytic dendritic cell precursors in the leukocyte population preferentially adhere to the substrate but are not activated to differentiate or mature. Other leukocytes (including other potential dendritic cell precursors) have reduced binding affinity to the substrate, thus allowing monocytic dendritic cell precursors to be preferentially enriched on the substrate surface.

[0035] Os substratos adequados incluem, por exemplo, aqueles com uma grande relação de superfície de área/volume. O substrato pode ser, por exemplo, um substrato particulado ou fibroso. Os substratos em partículas adequados incluem, por exemplo, partículas de vidro, partículas de plástico, partículas de plástico revestidas de vidro, partículas de poliestireno revestidas com vidro, e outras esferas adequadas para a absorção de proteínas. Os substratos fibrosos adequados para uso nos presentes métodos incluem tubos microcapilares e membranas microvilosas, e similares. O substrato particulado ou fibroso tipicamente permite que os precursores de células dendríticas monocíticas aderentes sejam eluídos sem reduzir substancialmente a viabilidade das células aderidas. Um substrato particulado ou fibroso pode ser substancialmente não-poroso para facilitar a eluição de precursores de células dendríticas monocíticas ou células dendríticas a partir do substrato. Um substrato "substancialmente não-poroso" é um substrato em que, pelo menos, a maioria dos poros presentes no substrato é menor do que as células para minimizar as células de aprisionamento no substrato.[0035] Suitable substrates include, for example, those with a large surface area/volume ratio. The substrate can be, for example, a particulate or fibrous substrate. Suitable particulate substrates include, for example, glass particles, plastic particles, glass-coated plastic particles, glass-coated polystyrene particles, and other beads suitable for protein adsorption. Fibrous substrates suitable for use in the present methods include microcapillary tubes and microvillous membranes, and the like. The particulate or fibrous substrate typically allows adherent monocytic dendritic cell precursors to be eluted without substantially reducing the viability of the adhered cells. A particulate or fibrous substrate can be substantially nonporous to facilitate elution of monocytic dendritic cell precursors or dendritic cells from the substrate. A "substantially non-porous" substrate is a substrate in which at least the majority of the pores present in the substrate are smaller than the cells to minimize cell entrapment in the substrate.

[0036] A aderência dos precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato pode opcionalmente ser melhorada pela adição de um meio de ligação. Os meios de ligação adequados incluem, por exemplo, meios de cultura de precursor de células dendríticas monocíticas (por exemplo, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, XVIVO 15®, e similares) suplementados, individualmente ou em qualquer combinação, por exemplo, com citocinas (por exemplo, Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos/Macrófagos (GM-CSF), ou GM-CSF em combinação com Interleucina 4 (IL-4), Interleucina 15 (IL-15), ou Interleucina 13 (IL-13)), plasma sanguíneo, soro (por exemplo, soro humano, tais como soros autólogos ou alogênicos), proteínas purificadas, tais como albumina de soro, cátions divalentes (por exemplo, íons de cálcio e/ou magnésio) e outras moléculas que auxiliam na aderência específica de precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato, ou que impedem a aderência de precursores de células dendríticas não-monocíticas ao substrato. Em certas modalidades, o plasma sanguíneo ou soro pode ser inativado pelo calor. O plasma inativado pelo calor pode ser autólogo ou heterólogo para os leucócitos.[0036] Adhesion of the monocytic dendritic cell precursors to the substrate may optionally be improved by the addition of a binding medium. Suitable attachment media include, for example, monocytic dendritic cell precursor culture media (e.g., AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, XVIVO 15®, and the like) supplemented, individually or in any combination, for example, with cytokines (e.g., Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF), or GM-CSF in combination with Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 15 (IL-15), or Interleukin 13 (IL-13)), blood plasma, serum (e.g., human serum, such as autologous or allogeneic sera), purified proteins such as serum albumin, divalent cations (e.g., calcium and/or magnesium ions), and other molecules that aid in the specific adherence of monocytic dendritic cell precursors to the substrate, or that prevent adhesion of monocytic dendritic cell precursors. non-monocytic dendritic cells to the substrate. In certain embodiments, blood plasma or serum can be heat inactivated. The heat inactivated plasma can be autologous or heterologous to the leukocytes.

[0037] Após a aderência dos precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato, os leucócitos não- aderentes são separados a partir dos complexos de precursor/substrato de células dendríticas monocíticas. Qualquer meio adequado pode ser usado para separar as células não-aderentes a partir dos complexos. Por exemplo, a mistura dos leucócitos não-aderentes e dos complexos pode ser deixada sedimentar, e os leucócitos e meios não-aderentes são decantados ou drenados. Alternativamente, a mistura pode ser centrifugada, e o sobrenadante contendo os leucócitos não- aderentes decantados ou drenados a partir dos complexos peletizados. Deve notar-se que a aderência dos precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato não induz os precursores de células dendríticas monocíticas a se ativarem e se diferenciam ou amadurecem em células dendríticas imaturas, células dendríticas maduras ou macrófagos sem estimulação adicional.[0037] After adherence of the monocytic dendritic cell precursors to the substrate, the non-adherent leukocytes are separated from the monocytic dendritic cell precursor/substrate complexes. Any suitable means may be used to separate the non-adherent cells from the complexes. For example, the mixture of non-adherent leukocytes and complexes may be allowed to sediment, and the non-adherent leukocytes and media are decanted or drained. Alternatively, the mixture may be centrifuged, and the supernatant containing the non-adherent leukocytes decanted or drained from the pelleted complexes. It should be noted that adherence of monocytic dendritic cell precursors to the substrate does not induce monocytic dendritic cell precursors to activate and differentiate or mature into immature dendritic cells, mature dendritic cells, or macrophages without additional stimulation.

[0038] Em outro método, os precursores de células dendríticas monocíticas não-ativadas podem ser isolados a partir de uma população de célula enriquecida em leucócitos preparados pelo uso de um dispositivo de filtração de fluxo tangencial como descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 2004/000444, depositada em 19 de Junho, 2003, agora a Patente U.S. de N° 7,695,627, ambos aqui incorporados por referência. Um dispositivo de filtração de fluxo tangencial útil para o isolamento de uma população de célula enriquecida em precursores de células dendríticas monocíticas pode compreender uma unidade de remoção com uma câmara de fluxo transversal, uma câmara de filtrado e um filtro disposto entre os mesmos. O filtro está em comunicação fluida de um lado, a superfície do retentado, com a câmara de fluxo transversal, e do outro lado, a superfície do filtrado, com a câmara do filtrado. A câmara de fluxo transversal tem uma entrada adaptada para introduzir uma amostra de constituintes sanguíneos que compreende leucócitos na câmara de fluxo transversal e paralela à superfície retentada do filtro. Também é proporcionada uma saída na câmara de fluxo transversal disposta centralmente em uma porção da câmara oposta à superfície retentada do filtro. O filtro adequado para uso no dispositivo de filtração de fluxo tangencial tem tipicamente um tamanho de poro médio variando de cerca de 1 a cerca de 10 microns. O filtro pode ter um tamanho de poro médio de cerca de 3 a cerca de 7 microns. Um meio para proporcionar uma taxa de entrada predeterminada da amostra na entrada da câmara de fluxo transversal e um meio para controlar uma taxa de filtração de filtrado através do filtro e dentro da câmara de filtrado também podem ser incluídos. O meio de controle da taxa de filtração limita a taxa de filtração menos do que a taxa de filtração sem oposição para o filtro. A amostra que compreende os constituintes sanguíneos pode ser proporcionada por um dispositivo de origem, tal como um dispositivo de leucoferese ou um recipiente que compreende uma amostra recolhida a partir de um dispositivo de leucoferese.[0038] In another method, non-activated monocytic dendritic cell precursors can be isolated from a leukocyte-enriched cell population prepared by use of a tangential flow filtration device as described in International Patent Application Publication No. WO 2004/000444, filed June 19, 2003, now U.S. Patent No. 7,695,627, both incorporated herein by reference. A tangential flow filtration device useful for isolating a cell population enriched in monocytic dendritic cell precursors can comprise a removal unit having a cross-flow chamber, a filtrate chamber, and a filter disposed therebetween. The filter is in fluid communication on one side, the retentate surface, with the cross-flow chamber, and on the other side, the filtrate surface, with the filtrate chamber. The cross flow chamber has an inlet adapted to introduce a sample of blood constituents comprising leukocytes into the cross flow chamber and parallel to the retentate surface of the filter. An outlet is also provided in the cross flow chamber centrally disposed in a portion of the chamber opposite the retentate surface of the filter. The filter suitable for use in the tangential flow filtration device typically has an average pore size ranging from about 1 to about 10 microns. The filter may have an average pore size of about 3 to about 7 microns. A means for providing a predetermined inflow rate of the sample into the inlet of the cross flow chamber and a means for controlling a rate of filtration of filtrate through the filter and into the filtrate chamber may also be included. The filtration rate control means limits the filtration rate to less than the unopposed filtration rate for the filter. The sample comprising blood constituents may be provided by a source device, such as a leukapheresis device, or a container comprising a sample collected from a leukapheresis device.

[0039] Os precursores de células dendríticas monocíticas e as populações de células enriquecidas para os precursores podem ser cultivados ex vivo ou in vitro para diferenciação e maturação e/ou expansão parcial. Tal como aqui utilizado, "células dendríticas imaturas isoladas", "precursores de células dendríticas", e outras "células", referem-se a células que, por mão humana, existem independentemente a partir do seu ambiente nativo e, portanto, não são um produto da natureza. As células isoladas podem existir na forma purificada, na forma semipurificada, e/ou em um ambiente não-nativo. Resumidamente, a diferenciação de células dendríticas in vitro e/ou ex vivo tipicamente envolve a cultura de precursores de células dendríticas monocíticas, ou populações de células com precursores de células dendríticas, na presença de um ou mais agentes de diferenciação de células dendríticas. Os agentes de diferenciação adequados podem incluir, por exemplo, fatores de crescimento celular (por exemplo, citocinas, tais como (GM-CSF), ou uma combinação de GM-CSF e Interleucina 4 (IL- 4), Interleucina 13 (IL-13), ou Interleucina 15 (IL-15), ou Interleucina 7 (IL-7)). Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas são diferenciados para formar células dendríticas imaturas derivadas de monócitos.[0039] Monocytic dendritic cell precursors and cell populations enriched for the precursors can be cultured ex vivo or in vitro for differentiation and maturation and/or partial expansion. As used herein, "isolated immature dendritic cells", "dendritic cell precursors", and other "cells" refer to cells that, by human hand, exist independently of their native environment and are therefore not a product of nature. Isolated cells may exist in purified form, semi-purified form, and/or in a non-native environment. Briefly, in vitro and/or ex vivo dendritic cell differentiation typically involves culturing monocytic dendritic cell precursors, or cell populations containing dendritic cell precursors, in the presence of one or more dendritic cell differentiation agents. Suitable differentiating agents may include, for example, cell growth factors (e.g., cytokines such as (GM-CSF), or a combination of GM-CSF and Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 13 (IL-13), or Interleukin 15 (IL-15), or Interleukin 7 (IL-7)). In certain embodiments, monocytic dendritic cell precursors are differentiated to form immature monocyte-derived dendritic cells.

[0040] Os precursores de células dendríticas podem ser cultivados e diferenciados em condições de cultura in vitro adequadas. Os meios de cultura de tecidos de células dendríticas adequados incluem, mas não são limitados a, AIM- V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, e similares. Os meios de cultura de tecidos podem ser suplementados com soro, plasma, aminoácidos, vitaminas, citocinas, tais como GM-CSF e/ou IL- 4, IL-7, IL-13, IL-15, Cátions divalentes, e similares, para promover a diferenciação das células. Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas podem ser cultivados em meio livre de soro. As condições de cultura podem excluir opcionalmente quaisquer produtos derivados de animais. Uma combinação de citocina típica utilizada com o meio de cultura de células dendríticas compreende cerca de 500 unidades/ml cada de GM-CSF e IL-4, IL-7, IL-15 ou IL-13. Em uma modalidade típica, em que precursores de células dendríticas não-ativadas são utilizados, um meio de cultura de tecido de células dendríticas típicas pode ser suplementado com GM-CSF sem qualquer outra citocina sob certas condições. Por exemplo, quando GM-CSF é utilizado sozinho, o meio de cultura de tecido também é tipicamente suplementado com uma alta concentração de proteína humana ou animal para evitar a adesão do precursor de células dendríticas monocíticas não- ativadas ao substrato de cultura de tecido, ativando assim a maturação do precursor de células dendríticas. Tipicamente, a proteína humana ou animal é adicionada a uma concentração superior a 1% e tipicamente é utilizada a uma concentração de 10% ou menos. A proteína humana ou animal pode ser uma albumina, tais como albumina de soro humano, soro, plasma, gelatina, um poli-aminoácido, e similares.[0040] Dendritic cell precursors can be cultured and differentiated under suitable in vitro culture conditions. Suitable dendritic cell tissue culture media include, but are not limited to, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, and the like. The tissue culture media can be supplemented with serum, plasma, amino acids, vitamins, cytokines such as GM-CSF and/or IL-4, IL-7, IL-13, IL-15, divalent cations, and the like, to promote differentiation of the cells. In certain embodiments, dendritic cell precursors can be cultured in serum-free medium. The culture conditions can optionally exclude any animal-derived products. A typical cytokine combination used with the dendritic cell culture medium comprises about 500 units/ml each of GM-CSF and IL-4, IL-7, IL-15, or IL-13. In a typical embodiment, in which non-activated dendritic cell precursors are used, a typical dendritic cell tissue culture medium may be supplemented with GM-CSF without any other cytokine under certain conditions. For example, when GM-CSF is used alone, the tissue culture medium is also typically supplemented with a high concentration of human or animal protein to prevent adhesion of the non-activated monocytic dendritic cell precursor to the tissue culture substrate, thereby activating dendritic cell precursor maturation. Typically, the human or animal protein is added at a concentration greater than 1% and is typically used at a concentration of 10% or less. The human or animal protein may be an albumin, such as human serum albumin, serum, plasma, gelatin, a polyamino acid, and the like.

[0041] Os precursores de células dendríticas, quando diferenciados para formar células dendríticas imaturas, são fenotipicamente similares às células Langerhans da pele. As células dendríticas imaturas normalmente são CD14- e CD11c+, expressam baixos níveis de CD86 e CD83, e são capazes de capturar antígenos solúveis via endocitose especializada.[0041] Dendritic cell precursors, when differentiated to form immature dendritic cells, are phenotypically similar to Langerhans cells of the skin. Immature dendritic cells are typically CD14- and CD11c+, express low levels of CD86 and CD83, and are capable of capturing soluble antigen via specialized endocytosis.

[0042] Os agentes de maturação de células dendríticas podem incluir, por exemplo, mas não são limitados a, BCG, IFNY, LPS, TNFα, um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto de imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil-α,α-dimetil-1H-imidazol [4,5- c]quinolin-1-etanol (designado R848) ou 1-(2-metilpropil)- 1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina, e seus derivados (Ver, por exemplo, documento WO2000/47719, aqui incorporado por referência na sua totalidade), um polirribonucleotídeo de filamento duplo sintético, por exemplo, poli [I]: poli[C(12)U], e similares, agonistas de um receptor do tipo Toll (TLR), tais como TLR-3, TLR-4, TLR-7 e/ou TLR-9, uma sequência de ácidos nucléicos contendo motivos CpG não- metilados, conhecidos por induzir a maturação de DC, e similares, ou qualquer combinação dos mesmos. As quantidades eficazes de BCG tipicamente variam de um equivalente a cerca de 105 a 107 ufc por mililitro de meios de cultura de tecidoantes da desativação. As quantidades eficazes de IFNY variam tipicamente de cerca de 100 a cerca de 1000 U por mililitrode meios de cultura de tecido.[0042] Dendritic cell maturation agents may include, for example, but are not limited to, BCG, IFNY, LPS, TNFα, an imidazoquinoline compound, for example, an imidazoquinoline-4-amine compound such as 4-amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-ethanol (designated R848) or 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine, and derivatives thereof (See, for example, WO2000/47719, incorporated herein by reference in its entirety), a synthetic double-stranded polyribonucleotide, for example, poly[I]:poly[C(12)U], and the like, agonists of a Toll-like receptor (TLR) such as TLR-3, TLR-4, TLR-7 and/or TLR-9, a nucleic acid sequence containing unmethylated CpG motifs known to induce DC maturation, and the like, or any combination thereof. Effective amounts of BCG typically range from an equivalent of about 105 to 107 cfu per milliliter of tissue culture media prior to inactivation. Effective amounts of IFNY typically range from about 100 to about 1000 U per milliliter of tissue culture media.

[0043] Bacillus Calmette-Guerin (BCG) é uma cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Tal como aqui utilizado, o BCG refere-se a BCG inteiro, bem como, os constituintes de parede celular, lipoarabidomananos derivados de BCG, e outros componentes de BCG. BCG é opcionalmente inativado,tal como BCG inativado por calor, BCG tratado com formalina, ou por combinações de calor e outros métodos de inativação,e similares. Uma quantidade eficaz de um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto deimidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil- α,α-dimetil-1H-imidazol [4,5-c] quinolin-1-etanol(designado R848) pode ser de cerca de 1 a cerca de 50 μg/mlde meio de cultura, mais tipicamente 5 a cerca de 10 μg/mlde meio de cultura são utilizados. O composto de imidazoquinolina pode ser utilizado sozinho ou pode ser combinado com, por exemplo, BCG e/ou IFN, ou um agonista de TLR adicional.[0043] Bacillus Calmette-Guerin (BCG) is an avirulent strain of Mycobacterium bovis. As used herein, BCG refers to whole BCG, as well as the cell wall constituents, BCG-derived lipoarabidomannans, and other components of BCG. BCG is optionally inactivated, such as heat-inactivated BCG, formalin-treated BCG, or by combinations of heat and other inactivation methods, and the like. An effective amount of an imidazoquinoline compound, for example, an imidazoquinoline-4-amine compound such as 4-amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-ethanol (designated R848) can be from about 1 to about 50 μg/ml of culture medium, more typically 5 to about 10 μg/ml of culture medium are used. The imidazoquinoline compound can be used alone or can be combined with, for example, BCG and/or IFN, or an additional TLR agonist.

[0044] As DCs imaturas são tipicamente colocadas em contato com quantidades eficazes do agente de maturação de células dendríticas, tais como BCG e IFNY, durante cerca de 10 horas a cerca de 19 horas para induzir a maturação e para ativar devidamente, mas não madurarem completamente as células dendríticas. Normalmente, é necessário pelo menos um período de incubação de 24 horas para a maturação completa quando BCG e IFNY são utilizados para células dendríticas maduras e, dependendo do agente de maturação de células dendríticas utilizado, um período de incubação típico de cerca de 48 a cerca de 72 horas pode ser necessário para uma maturação completa. Em certas modalidades, o período de tempo pode ser cerca de 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, e até cerca de 19 horas. Em uma modalidade mais típica, o período de tempo para maturação parcial e ativação ótima das células dendríticas pode ser de cerca de 15 a cerca de 18 horas, cerca de 15 a cerca de 17 horas, ou em uma modalidade particular cerca de 16 horas. As células dendríticas imaturas podem ser cultivadas e, parcialmente amadurecidas e devidamente ativadas em condições de cultura de maturação adequadas. Os meios de cultura de tecidos adequados incluem, mas não são limitados a, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, e similares. Os meios de cultura de tecido podem ser suplementados com aminoácidos; vitaminas; citocinas, tais como GM-CSF sozinho (Ver, por exemplo, a Patente U.S. de N° 8,389,278, aqui incorporada por referência na sua totalidade, ou GM-CSF em combinação com IL-4, IL-7, IL-13 ou IL-15; cátions divalentes; e similares promovendo a indução da maturação das células. Uma citocina típica pode ser GM- CSF sozinha com uma alta concentração de proteína humana ou animal ou GM-CSF quando utilizada em combinação é utilizada em uma concentração de cerca de 500 unidades/ml a cerca de 1000 unidades/ml de GM-CSF e 100 ng/ml de IL-4, IL-13 ou IL- 15 são utilizadas.[0044] Immature DCs are typically contacted with effective amounts of the dendritic cell maturation agent, such as BCG and IFNY, for about 10 hours to about 19 hours to induce maturation and to properly activate, but not fully mature, the dendritic cells. Typically, at least a 24-hour incubation period is required for full maturation when BCG and IFNY are used to mature dendritic cells, and depending on the dendritic cell maturation agent used, a typical incubation period of about 48 to about 72 hours may be required for full maturation. In certain embodiments, the time period may be about 10 hours, 11 hours, 12 hours, 13 hours, 14 hours, 15 hours, 16 hours, 17 hours, 18 hours, and up to about 19 hours. In a more typical embodiment, the period of time for partial maturation and optimal activation of the dendritic cells can be about 15 to about 18 hours, about 15 to about 17 hours, or in a particular embodiment about 16 hours. The immature dendritic cells can be cultured and partially matured and properly activated under suitable maturation culture conditions. Suitable tissue culture media include, but are not limited to, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, and the like. The tissue culture media can be supplemented with amino acids; vitamins; cytokines, such as GM-CSF alone (See, e.g., U.S. Patent No. 8,389,278, herein incorporated by reference in its entirety, or GM-CSF in combination with IL-4, IL-7, IL-13, or IL-15; divalent cations; and the like promoting the induction of cell maturation. A typical cytokine may be GM-CSF alone with a high concentration of human or animal protein or GM-CSF when used in combination is used at a concentration of about 500 units/ml to about 1000 units/ml of GM-CSF and 100 ng/ml of IL-4, IL-13, or IL-15 is used.

[0045] A maturação parcial e a ativação ótima de células dendríticas imaturas podem ser monitoradas por métodos conhecidos na técnica para células dendríticas. Os marcadores de superfície celular podem ser detectados em ensaios familiares à técnica, tais como citometria de fluxo, imuno-histoquímica, e similares. As células também podem ser monitoradas para a produção de citocina (por exemplo, por ELISA, outro ensaio imune, ou por uso de um ensaio de oligonucleotídeo). Em DCs cultivadas e parcialmente amadurecidas e devidamente ativadas, de acordo com a presente invenção, na presença de um agente de maturação de células dendríticas, tais como por exemplo, mas não limitado a, BCG e INFY, um nível aumentado de JAK2 fosforilado (quinase ativada janus 2) em comparação com células dendríticas imaturas podem ser medidos para indicar o início da maturação por métodos bem conhecidos na técnica. A indução da expressão de marcadores de superfície celular e citocinas, bem como, a fosforilação de moléculas de sinalização, por exemplo, jak2, também são conhecidas como um indicador de que as células dendríticas são condicionadas para a absorção do antígeno in vivo e a indução de uma resposta imune, uma vez que as células dendríticas foram administradas a um indivíduo.[0045] Partial maturation and optimal activation of immature dendritic cells can be monitored by methods known in the art for dendritic cells. Cell surface markers can be detected in assays familiar in the art, such as flow cytometry, immunohistochemistry, and the like. Cells can also be monitored for cytokine production (e.g., by ELISA, other immune assay, or by use of an oligonucleotide assay). In cultured and partially matured and properly activated DCs according to the present invention in the presence of a dendritic cell maturation agent, such as for example, but not limited to, BCG and INFY, an increased level of phosphorylated JAK2 (Janus activated kinase 2) compared to immature dendritic cells can be measured to indicate the onset of maturation by methods well known in the art. The induction of the expression of cell surface markers and cytokines, as well as the phosphorylation of signaling molecules, e.g., jak2, are also known as an indicator that dendritic cells are primed for antigen uptake in vivo and the induction of an immune response, once dendritic cells have been administered to an individual.

[0046] O presente método compreende submeter células dendríticas imaturas a condições de maturação apenas por um período de tempo necessário para iniciar a maturação das células dendríticas imaturas e para maturar parcialmente e ativar devidamente as células dendríticas. Um período de tempo de cerca de 10 a 19 horas de incubação com uma quantidade eficaz de BCG e uma quantidade eficaz de IFNY revelou-se amadurecer parcialmente e ativar devidamente as células dendríticas para uso como uma composição quando combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável para administração a um indivíduo. As DCs totalmente maduras perdem a capacidade de absorver o antígeno e exibem uma expressão regulada ascendente de moléculas de superfície celular coestimuladoras e várias citocinas. Especificamente, as DCs maduras expressam níveis mais elevados de antígenos de classes I e II de MHC do que as células dendríticas imaturas, e as células dendríticas maduras são geralmente identificadas como sendo CD80+, CD83+, CD86+, e CD14-. A maior expressão de MHC leva a um aumento da densidade de antígeno sobre a superfície de DC, enquanto a regulação ascendente de moléculas coestimuladoras CD80 e CD86 fortalece o sinal de ativação de células T através das contrapartes das moléculas coestimuladoras, tal como CD28 sobre as células T. As células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas, tais como utilizadas na presente invenção tipicamente, compreendem as células dendríticas que uma vez expostas a um agente de maturação de células dendríticas demonstram uma regulação ascendente na expressão de uma molécula coestimuladora sobre a superfície celular em comparação com células dendríticas imaturas. Essas moléculas coestimuladoras incluem, mas não são limitadas a, CD80, CD86 e/ou CD54. As células podem ou não expressar CD83, mas as células mantêm a capacidade de absorver e processar o antígeno para apresentação sobre a superfície da célula dendrítica. Em uma modalidade dos métodos do presente pedido, as células dendríticas parcialmente maduras são expostas ao antígeno subsequente à administração. Além disso, as células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas podem produzir uma ou mais de TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 e/ou IL-12 que não são tipicamente produzidas em quantidades significativas por células dendríticas imaturas. Em uma modalidade particular, células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas colocadas em contato durante cerca de 16 horas com uma concentração eficaz tanto de BCG como de IFNY produziram 149 ng/1 milhão de células dendríticas em um período de 24 horas. As células dendríticas imaturas colocadas em contato com as mesmas concentrações de BCG e IFNy produziram apenas 50 ng/1 milhão de células em 24 horas.[0046] The present method comprises subjecting immature dendritic cells to maturation conditions only for a period of time necessary to initiate maturation of the immature dendritic cells and to partially mature and properly activate the dendritic cells. A period of time of about 10 to 19 hours of incubation with an effective amount of BCG and an effective amount of IFNY has been shown to partially mature and properly activate the dendritic cells for use as a composition when combined with a pharmaceutically acceptable carrier for administration to a subject. The fully mature DCs lose the ability to take up antigen and exhibit an upregulated expression of costimulatory cell surface molecules and various cytokines. Specifically, mature DCs express higher levels of MHC class I and II antigens than immature dendritic cells, and mature dendritic cells are generally identified as being CD80+, CD83+, CD86+, and CD14-. Increased MHC expression leads to an increased antigen density on the DC surface, while upregulation of costimulatory molecules CD80 and CD86 strengthens the T cell activation signal through counterparts of costimulatory molecules such as CD28 on T cells. Partially mature and properly activated dendritic cells, as used in the present invention typically comprise dendritic cells that upon exposure to a dendritic cell maturation agent demonstrate an upregulation in the expression of a costimulatory molecule on the cell surface compared to immature dendritic cells. Such costimulatory molecules include, but are not limited to, CD80, CD86, and/or CD54. The cells may or may not express CD83, but the cells retain the ability to take up and process antigen for presentation on the dendritic cell surface. In one embodiment of the methods of the present application, partially mature dendritic cells are exposed to antigen subsequent to administration. In addition, the partially mature and properly activated dendritic cells can produce one or more of TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, and/or IL-12 that are not typically produced in significant amounts by immature dendritic cells. In a particular embodiment, partially mature and properly activated dendritic cells contacted for about 16 hours with an effective concentration of both BCG and IFNY produced 149 ng/1 million dendritic cells in a 24 hour period. Immature dendritic cells placed in contact with the same concentrations of BCG and IFNy produced only 50 ng/1 million cells in 24 hours.

[0047] As células dendríticas totalmente maduras não são preferidas para os presentes métodos e composições porque, uma vez que estão completamente maduras, as células não processam de maneira eficiente o antígeno. Além disso, as células dendríticas imaturas como usadas em métodos anteriores que não foram induzidos a iniciar a maturação não são desejadas porque o ambiente imunossupressor tipicamente encontrado dentro de um tumor, ou no tecido que envolve um tumor, inclui concentrações substanciais de citocinas conhecidas por prevenir o processamento de antígeno por células dendríticas imaturas. Na presente invenção, a maturação parcial e a ativação ótima das células dendríticas imaturas regulam os receptores de citocinas sobre a superfície da célula, tornando-os menos sensíveis ou sensíveis a quaisquer efeitos imunossupressores das citocinas presentes no espaço intratumoral, ou no tecido circundante, e prevêem células que podem absorver e processar eficientemente antígenos presentes dentro do espaço intratumoral ou tecido circundante. As células dendríticas absorvem e processam quantidades substanciais de antígeno tumoral a partir de células tumorais apoptóticas e mortas encontradas dentro do espaço intratumoral ou no tecido circundante. Uma vez que as células dendríticas administradas parcialmente maduras e devidamente ativadas amadureceram efetivamente dentro do espaço intratumoral conforme medido por, por exemplo, a expressão do receptor de quimiocina CCR7, as células dendríticas migram para os gânglios linfáticos onde as células dendríticas agora apresentam antígeno que entrará em contato com T células, particularmente células T nativas, para regular a resposta imune a qualquer antígeno tumoral apresentado pelas células dendríticas.[0047] Fully mature dendritic cells are not preferred for the present methods and compositions because, once fully mature, the cells do not efficiently process antigen. Furthermore, immature dendritic cells as used in prior methods that have not been induced to initiate maturation are not desired because the immunosuppressive environment typically found within a tumor, or in the tissue surrounding a tumor, includes substantial concentrations of cytokines known to prevent antigen processing by immature dendritic cells. In the present invention, partial maturation and optimal activation of immature dendritic cells upregulates cytokine receptors on the cell surface, rendering them less sensitive or responsive to any immunosuppressive effects of cytokines present in the intratumoral space, or in the surrounding tissue, and provides for cells that can efficiently take up and process antigens present within the intratumoral space or surrounding tissue. Dendritic cells take up and process substantial amounts of tumor antigen from apoptotic and dead tumor cells found within the intratumoral space or in the surrounding tissue. Once the partially mature and properly activated administered dendritic cells have effectively matured within the intratumoral space as measured by, for example, the expression of the chemokine receptor CCR7, the dendritic cells migrate to the lymph nodes where the dendritic cells now present antigen that will contact T cells, particularly native T cells, to regulate the immune response to any tumor antigen presented by the dendritic cells.

[0048] De acordo com ainda outro aspecto da descrição, as várias DCs da invenção podem ser preservadas, por exemplo, por criopreservação como precursores de células dendríticas monocíticas, células dendríticas imaturas antes da maturação, ou após maturação parcial, quer em combinação com ou sem um veículo farmaceuticamente aceitável. Os agentes de criopreservação que podem ser utilizados incluem, mas não são limitados a, sulfóxido de dimetil (DMSO), glicerol, polivinilpirrolidona, polietileno glicol, albumina, dextrano, sacarose, etileno glicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol, D-sorbitol, inositol, D-lactose, cloreto de colina, aminoácidos, metanol, acetamida, monoacetato de glicerol, e sais inorgânicos. Uma taxa de resfriamento lenta controlada pode ser crítica. Diferentes agentes crioprotetores e diferentes tipos de células tipicamente têm diferentes taxas de resfriamento ótimas.[0048] According to yet another aspect of the disclosure, the various DCs of the invention can be preserved, for example, by cryopreservation as monocytic dendritic cell precursors, immature dendritic cells prior to maturation, or after partial maturation, either in combination with or without a pharmaceutically acceptable carrier. Cryopreservation agents that can be used include, but are not limited to, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, albumin, dextran, sucrose, ethylene glycol, i-erythritol, D-ribitol, D-mannitol, D-sorbitol, inositol, D-lactose, choline chloride, amino acids, methanol, acetamide, glycerol monoacetate, and inorganic salts. A slow, controlled cooling rate can be critical. Different cryoprotective agents and different cell types typically have different optimal cooling rates.

[0049] O calor da fase de fusão onde a água se transforma em gelo tipicamente deve ser mínimo. O procedimento de resfriamento pode ser realizado através do uso, por exemplo, de um dispositivo de congelamento programável ou um procedimento de banho de metanol. Os aparelhos de congelamento programáveis permitem a determinação de taxas de resfriamento ótimas e facilitam o resfriamento reprodutível padrão. Os congeladores de taxa controlada programáveis, tal como Cryomed® ou Planar®, permitem o ajuste do regime de congelamento à curva de taxa de resfriamento desejada.[0049] The heat of the fusion phase where water turns into ice should typically be minimal. The cooling procedure can be carried out by using, for example, a programmable freezing device or a methanol bath procedure. Programmable freezing devices allow the determination of optimum cooling rates and facilitate standard reproducible cooling. Programmable controlled rate freezers, such as Cryomed® or Planar®, allow the adjustment of the freezing regime to the desired cooling rate curve.

[0050] Após congelamento completo, células precursoras monocíticas, DCs imaturas ou DCs parcialmente maduras com ou sem um veículo farmaceuticamente aceitável podem ser rapidamente transferidas para um vaso de armazenamento criogênico de longo prazo. Em uma modalidade típica, as amostras podem ser armazenadas criogenicamente em nitrogênio líquido (-196 °C) ou seu vapor (-165 °C). Considerações e procedimentos para a manipulação, criopreservação, e armazenamento a longo prazo de células estaminais hematopoiéticas, particularmente da medula óssea ou sangue periférico, são largamente aplicáveis às células da descrição. Tal discussão pode ser encontrada, por exemplo, nas seguintes referências, aqui incorporadas por referência: Taylor et al., Cryobiology 27: 269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15: 19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, Julho 2226, 1968, Internacional Atomic Energy Agency, Viena,páginas 107-186.[0050] After complete freezing, monocytic precursor cells, immature DCs, or partially mature DCs with or without a pharmaceutically acceptable carrier can be rapidly transferred to a long-term cryogenic storage vessel. In a typical embodiment, samples can be stored cryogenically in liquid nitrogen (-196 °C) or its vapor (-165 °C). Considerations and procedures for the handling, cryopreservation, and long-term storage of hematopoietic stem cells, particularly from bone marrow or peripheral blood, are broadly applicable to the cells of the disclosure. Such discussion can be found, for example, in the following references, incorporated herein by reference: Taylor et al., Cryobiology 27: 269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15: 19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, July 2226, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pages 107-186.

[0051] As células congeladas são, de preferência, descongeladas rapidamente (por exemplo, em um banho de água mantido a 37 °C-41 °C) e arrefecidas imediatamente após odescongelamento. Pode ser desejável tratar as células para evitar o aglomerado celular após o descongelamento. Para evitar o aglomerado, vários procedimentos podem ser utilizados, incluindo, mas não limitados à adição antes e/ouapós o congelamento da DNase (Spitzer et al., Cancer 45:3075-85 (1980)), dextrano e citrato de baixo peso molecular,amido de hidroxietil (Stiff et al., Cryobiology 20: 17-24(1983)), e similares. O agente crioprotetor, se tóxico em seres humanos, deve ser removido antes do uso terapêutico das DCs parcialmente maduras descongeladas. Uma maneira pela qual remover o agente crioprotetor é por diluição a uma concentração insignificante. Uma vez que os precursores de células dendríticas monocíticas congeladas, células dendríticas imaturas, ou DCs parcialmente maduras foram descongelados e recuperados, os mesmos podem, em seguida, ser usados em outros métodos para produzir um produto farmacêutico formulado. As células dendríticas formuladas parcialmente maduras e devidamente ativadas podem ser administradas como aqui descrito, em relação às DCs não- congeladas parcialmente maduras e devidamente ativadas.[0051] Frozen cells are preferably thawed rapidly (e.g., in a water bath maintained at 37°C-41°C) and cooled immediately after thawing. It may be desirable to treat the cells to prevent cell clumping after thawing. To prevent clumping, several procedures can be used, including but not limited to the addition before and/or after freezing of DNase (Spitzer et al., Cancer 45:3075-85 (1980)), low molecular weight dextran and citrate, hydroxyethyl starch (Stiff et al., Cryobiology 20:17-24 (1983)), and the like. The cryoprotectant, if toxic in humans, should be removed prior to therapeutic use of the thawed partially mature DCs. One way to remove the cryoprotectant is by dilution to a negligible concentration. Once the frozen monocytic dendritic cell precursors, immature dendritic cells, or partially mature DCs have been thawed and recovered, they can then be used in other methods to produce a formulated pharmaceutical product. The partially mature and properly activated formulated dendritic cells can be administered as described herein, relative to the partially mature and properly activated non-frozen DCs.

In Vivo Administration of Partially Mature Dendritic Cells

[0052] Métodos e composições são fornecidos para a administração de células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas, ou uma população de célula enriquecida e contendo tais células, para um indivíduo que tem, por exemplo, um câncer ou um tumor. Em certas modalidades, tais métodos são realizados obtendo precursores de células dendríticas ou células dendríticas imaturas, diferenciando e amadurecendo parcialmente essas células na presença de um agente de maturação de células dendríticas, tais como BCG e IFNy, ou qualquer outro agente de maturação de células dendríticas, tais como aqueles listado acima. As células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas podem ser formuladas com veículos, excipientes, tampões e/ou diluentes fisiologicamente aceitáveis utilizando métodos e composições bem conhecidos dos versados na técnica. As células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas podem ser administradas diretamente a um indivíduo que necessite de imunoestimulação. Tipicamente, cerca de 102 a cerca de 1010 células são suspensas em um veículo farmaceuticamente aceitável. As células são injetadas no tumor diretamente ou em uma região próxima a, adjacente a, ou em contato circulatório ou linfático com o tumor ou leito de tumor para garantir que as células tenham acesso ao câncer ou antígeno tumoral.[0052] Methods and compositions are provided for administering partially mature and properly activated dendritic cells, or a cell population enriched for and containing such cells, to a subject having, for example, a cancer or a tumor. In certain embodiments, such methods are carried out by obtaining dendritic cell precursors or immature dendritic cells, differentiating and partially maturing such cells in the presence of a dendritic cell maturation agent, such as BCG and IFNγ, or any other dendritic cell maturation agent, such as those listed above. The partially mature and properly activated dendritic cells can be formulated with physiologically acceptable carriers, excipients, buffers and/or diluents using methods and compositions well known to those of skill in the art. The partially mature and properly activated dendritic cells can be administered directly to a subject in need of immunostimulation. Typically, about 102 to about 1010 cells are suspended in a pharmaceutically acceptable vehicle. The cells are injected into the tumor directly or into a region close to, adjacent to, or in circulatory or lymphatic contact with the tumor or tumor bed to ensure that the cells have access to the cancer or tumor antigen.

[0053] Por exemplo, mas não por limitação, as células podem ser administradas diretamente em um tumor, no leito de tumor subsequente à remoção cirúrgica ou resseção do tumor, em um espaço peritumoral, em um glânglio linfático drenante em contato direto com o tumor, em um vaso sanguíneo ou duto linfático que conduz em, ou a alimentação de um tumor ou órgão afligido pelo tumor, por exemplo, a veia porta ou uma veia ou artéria pulmonar, e similares. A administração das células dendríticas parcialmente maduras e devidamente ativadas da invenção pode ser simultânea ou subsequente a outros tratamentos para o tumor, tal como quimioterapia ou terapia por radiação. Além disso, as células dendríticas parcialmente maduras da invenção podem ser co-administradas com outro agente, o qual o agente atua como um adjuvante para a maturação da célula dendrítica e/ou o processamento do antígeno dentro do tumor ou região próximo ou adjacente ao tumor. Além disso, as células dendríticas também podem ser formuladas ou compostas em uma matriz de liberação lenta para implantação em uma região em ou ao redor do tumor ou leito de tumor, de modo que as células sejam lentamente liberadas para o tumor, ou leito de tumor, para colocar em contato com os antígenos tumorais.[0053] For example, but not by limitation, the cells may be administered directly into a tumor, into the tumor bed subsequent to surgical removal or resection of the tumor, into a peritumoral space, into a draining lymph node in direct contact with the tumor, into a blood vessel or lymphatic duct leading into or feeding a tumor or tumor-afflicted organ, e.g., the portal vein or a pulmonary vein or artery, and the like. Administration of the partially mature and properly activated dendritic cells of the invention may be simultaneous with or subsequent to other treatments for the tumor, such as chemotherapy or radiation therapy. Furthermore, the partially mature dendritic cells of the invention may be co-administered with another agent, which agent acts as an adjuvant to dendritic cell maturation and/or antigen processing within the tumor or a region near or adjacent to the tumor. Additionally, dendritic cells can also be formulated or compounded into a slow-release matrix for implantation into a region in or around the tumor or tumor bed, such that the cells are slowly released into the tumor, or tumor bed, to bring into contact with tumor antigens.

[0054] Um tumor, tal como utilizado na presente invenção, inclui tumores sólidos, tais como, por exemplo, e não uma limitação, um sarcoma; um tumor pancreático; um tumor colorretal; um melanoma; um tumor pulmonar; um tumor de mama; um tumor de ovário; um tumor de cabeça ou pescoço; um tumor estomacal; um tumor de próstata; um tumor esofágico; um tumor cervical ou vaginal; um tumor cerebral, tais como, por exemplo, um glioblastoma, um astrocitoma, um meningioma, ou um meduloblastoma; e similares. Tumores sólidos adicionais também são submetidos ao tratamento usando uma composição ou método aqui descrito.[0054] A tumor, as used herein, includes solid tumors such as, for example, and not as a limitation, a sarcoma; a pancreatic tumor; a colorectal tumor; a melanoma; a lung tumor; a breast tumor; an ovarian tumor; a head or neck tumor; a stomach tumor; a prostate tumor; an esophageal tumor; a cervical or vaginal tumor; a brain tumor, such as, for example, a glioblastoma, an astrocytoma, a meningioma, or a medulloblastoma; and the like. Additional solid tumors are also subject to treatment using a composition or method described herein.

[0055] As células dendríticas parcialmente maduras ou devidamente ativadas da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio apropriado para a formulação e modo de administração. Por exemplo, as células podem ser combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável e administradas com uma seringa, um cateter, uma cânula, e similares. Como acima, as células podem ser formuladas em uma matriz de liberação lenta. Quando administrada desta forma, a formulação pode ser administrada por um meio apropriado para a matriz utilizada. Outros métodos e modos de administração aplicáveis à presente invenção são bem conhecidos do versado na técnica.[0055] The partially mature or properly activated dendritic cells of the present invention may be administered by any means appropriate to the formulation and mode of administration. For example, the cells may be combined with a pharmaceutically acceptable carrier and administered with a syringe, catheter, cannula, and the like. As above, the cells may be formulated in a slow-release matrix. When administered in this manner, the formulation may be administered by a means appropriate to the matrix utilized. Other methods and modes of administration applicable to the present invention are well known to those skilled in the art.

[0056] As composições da presente invenção podem ser usadas por si mesmas no tratamento de um indivíduo. Alémdisso, as composições podem ser usadas em combinação com qualquer outro método para tratar um câncer ou um tumor. Porexemplo, os métodos da presente invenção podem ser usados em combinação com resseção cirúrgica de um tumor, quimioterapia (drogas citotóxicas, agentes apoptóticos, anticorpos, e similares), terapia de radiação, crioterapia, braquiterapia, terapia imune (administração de células dendríticas ativadas maduras específicas de antígenos, células NK, anticorpos específicos para uma célula cancerosa ou um antígeno tumoral, etc.), e similares. Qualquer e todos esses métodos também podem ser usados em qualquer combinação. Os tratamentos combinados podem ser concorrentes ou sequenciais e podem ser administrados em qualquer ordem determinada pelo médico assistente.[0056] The compositions of the present invention may be used by themselves in the treatment of a subject. In addition, the compositions may be used in combination with any other method for treating a cancer or tumor. For example, the methods of the present invention may be used in combination with surgical resection of a tumor, chemotherapy (cytotoxic drugs, apoptotic agents, antibodies, and the like), radiation therapy, cryotherapy, brachytherapy, immune therapy (administration of antigen-specific mature activated dendritic cells, NK cells, antibodies specific to a cancer cell or a tumor antigen, etc.), and the like. Any and all of these methods may also be used in any combination. The combination treatments may be concurrent or sequential and may be administered in any order determined by the attending physician.

[0057] Em outra modalidade, as células dendríticas e o indivíduo receptor têm o mesmo haplotipo MHC (HLA). Os métodos para determinar o haplotipo HLA de um indivíduo são conhecidos na técnica. Em uma modalidade relacionada, as células dendríticas parcialmente maduras são alogênicas para o indivíduo receptor. As células alogênicas são tipicamente combinadas para, pelo menos, um alelo de MHC (por exemplo, partilhando pelo menos um, mas não todos os alelos de MHC). Em uma modalidade menos típica, as células dendríticas e o indivíduo receptor são todos alogênicos em relação uns aos outros, mas todos têm pelo menos um alelo de MHC em comum.[0057] In another embodiment, the dendritic cells and the recipient individual have the same MHC (HLA) haplotype. Methods for determining an individual's HLA haplotype are known in the art. In a related embodiment, the partially mature dendritic cells are allogeneic to the recipient individual. The allogeneic cells are typically matched for at least one MHC allele (e.g., sharing at least one, but not all, MHC alleles). In a less typical embodiment, the dendritic cells and the recipient individual are all allogeneic with respect to each other, but all have at least one MHC allele in common.

[0058] Uma resposta imune antitumoral pode ser medida por qualquer um ou mais métodos bem conhecidos. Por exemplo, uma resposta antitumoral pode ser medida por uma redução no tamanho de um tumor, a indução de morte de células tumorais ou necrose de células tumorais, uma redução na proliferação de células tumorais, ou por infiltração de células T específicas de antígeno tumoral (TILs), e similares.[0058] An antitumor immune response can be measured by any one or more well-known methods. For example, an antitumor response can be measured by a reduction in the size of a tumor, the induction of tumor cell death or tumor cell necrosis, a reduction in tumor cell proliferation, or by infiltration of tumor antigen-specific T cells (TILs), and the like.

Example

[0059] O seguinte exemplo é fornecido meramente como ilustrativo de vários aspectos da presente invenção e não deve ser interpretado como limitando os métodos e a composição aqui descritos de qualquer maneira. Embora uma modalidade preferida do método e/ou método tenha sido ilustrada e descrita, será apreciado que várias mudanças podem ser feitas aqui sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.[0059] The following example is provided merely as illustrative of various aspects of the present invention and should not be construed as limiting the methods and composition described herein in any manner. While a preferred embodiment of the method and/or method has been illustrated and described, it will be appreciated that various changes may be made herein without departing from the spirit and scope of the present invention.

[0060] Neste exemplo, células dendríticas imaturas obtidas a partir de uma amostra de sangue isolada a partir de um paciente com câncer, por exemplo, e não-limitadas, um tumor que é um tumor de tecido sólido, tais como um sarcoma, um tumor pancreático, um tumor colorretal, um melanoma, um tumor de mama; um tumor pulmonar; e um tumor de ovário, e similares, e as células dendríticas imaturas foram cultivadas em meio de cultura de células dendríticas suplementadas com GM-CSF sozinhas, foram induzidas para amadurecer com BCG e IFNY inativados durante 16 ou 20 horas antes de serem coletadas e preparadas para administração a um paciente. Verificou-se que as células dendríticas que foram parcialmente maduras e ativadas durante cerca de 16 horas induziram uma resposta clínica substancialmente melhor em um paciente do que as células dendríticas colocadas em contato com BCG e IFNY durante cerca de 20 horas.[0060] In this example, immature dendritic cells obtained from a blood sample isolated from a patient with cancer, for example, and not limited to, a tumor that is a solid tissue tumor, such as a sarcoma, a pancreatic tumor, a colorectal tumor, a melanoma, a breast tumor; a lung tumor; and an ovarian tumor, and the like, and the immature dendritic cells were cultured in dendritic cell culture medium supplemented with GM-CSF alone, were induced to mature with inactivated BCG and IFNY for 16 or 20 hours before being collected and prepared for administration to a patient. It was found that dendritic cells that were partially matured and activated for about 16 hours induced a substantially better clinical response in a patient than dendritic cells contacted with BCG and IFNY for about 20 hours.

[0061] Os pacientes foram submetidos à leucoferese e aproximadamente 10 litros ou dois volumes de sangue foram processados durante a coleta. As taxas de plasma foram ajustadas para obter um hematócrito alvo de aproximadamente 2% para o produto de leucoferese. O produto de leucoferese foi processado para o isolamento e purificação de monócitos por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF). A amostra de leucoferese, tipicamente uma bolsa de sangue, foi conectada ao aparelho de TFF e a amostra foi processada e um produto precursor de células dendríticas monocíticas enriquecidas em suspensão em meio de cultura (RPMI-1640 vermelho livre de fenol) foi obtido em um saco de cultura de tecido.[0061] Patients underwent leukapheresis and approximately 10 liters or two volumes of blood were processed during collection. Plasma ratios were adjusted to achieve a target hematocrit of approximately 2% for the leukapheresis product. The leukapheresis product was processed for isolation and purification of monocytes by Tangential Flow Filtration (TFF). The leukapheresis sample, typically a blood bag, was connected to the TFF apparatus and the sample was processed and a precursor product of enriched monocytic dendritic cells suspended in culture medium (phenol red-free RPMI-1640) was obtained in a tissue culture bag.

[0062] O meio de cultura suplementado com GM-CSF humano recombinante (500 U/ml) foi adicionado ao produto precursor de células dendríticas monocíticas não-ativadas enriquecidas e as células foram colocadas em uma incubadora durante 5 dias de cultura. Durante os 5 dias de cultura, os precursores de células dendríticas monocíticas convertidos em células dendríticas imaturas. Após esta incubação, BCG morto pelo calor (diluição 1:300 v/v ou aproximadamente uma (1) partícula de BCG por célula dendrítica viva) e Interferon y(500 a 1.000 U/ml) foram adicionados às células dendríticas imaturas e o saco foi devolvido à incubadora por mais 16 a20 horas para ativação de células dendríticas. Este período de tempo não foi suficiente para converter completamente as células dendríticas imaturas em células dendríticas maduras.[0062] Culture medium supplemented with recombinant human GM-CSF (500 U/ml) was added to the enriched non-activated monocytic dendritic cell precursor product and the cells were placed in an incubator for 5 days of culture. During the 5 days of culture, the monocytic dendritic cell precursors converted to immature dendritic cells. Following this incubation, heat-killed BCG (1:300 v/v dilution or approximately one (1) BCG particle per live dendritic cell) and Interferon γ (500 to 1,000 U/ml) were added to the immature dendritic cells and the bag was returned to the incubator for an additional 16 to 20 hours for dendritic cell activation. This period of time was not sufficient to completely convert the immature dendritic cells to mature dendritic cells.

[0063] Após a ativação da célula dendrítica, o saco de cultura de tecido foi agitado e o conteúdo foi drenado em tubos de centrífuga cônicos de 250 ml. O dPBS frio foi adicionado ao saco e todas as células aderentes restantes foram desalojadas por massagem manual do saco. Esta lavagem foi reunida com a suspensão celular inicial e as células foram peletizadas por centrifugação a 550 x g. As células dendríticas ativadas foram ressuspensas em um pequeno volume de RPMI-1640, 40% de albumina de soro humano e 10% de DMSO. As células dendríticas ativadas foram congeladas em alíquotas de 3 x 106, 8 x 106, 17 x 106 de células/frascos dendríticos viáveis em 1,0 ml/frasco. O volume de injeção por lote foi ajustado para, se necessário, distribuir um total de 2, 6 ou 15 milhões de células dendríticas viáveis por injeção. Para preparar uma alíquota para injeção, um frasco foi removido a partir do armazenamento de nitrogênio líquido em fase de vapor e colocado a 20 °C a 25 °C durante 5 a 10 minutos. Este é o tempo suficiente para o descongelamento completo dos conteúdos. O frasco foi aberto e 1 ml de produto foi removido assepticamente usando uma seringa. O ar foi empurrado para dentro da seringa para garantir que a agulha estivesse vazia e, em seguida, a agulha removida. A agulha de injeção apropriada foi, em seguida, anexada à seringa. O produto foi empurrado de volta para a agulha de injeção. O tumor foi, em seguida, acessado em ecografia em tempo real ou orientação intermitente (MRI ou CT, ou usando uma combinação multimodal). Durante a administração do produto, uma única agulha foi guiada sob imagem para estar na periferia do tumor. Uma vez que a colocação foi confirmada, a primeira injeção do volume predeterminado, por exemplo, 0,2 ml de cada injeção foram injetados dentro do tumor se quatro injeções foram utilizadas.[0063] Following dendritic cell activation, the tissue culture bag was shaken and the contents were drained into 250 ml conical centrifuge tubes. Cold dPBS was added to the bag and any remaining adherent cells were dislodged by manual massaging of the bag. This wash was pooled with the initial cell suspension and the cells were pelleted by centrifugation at 550 x g. Activated dendritic cells were resuspended in a small volume of RPMI-1640, 40% human serum albumin, and 10% DMSO. Activated dendritic cells were frozen in aliquots of 3 x 106, 8 x 106, 17 x 106 viable dendritic cells/vial in 1.0 ml/vial. The injection volume per batch was adjusted to deliver a total of 2, 6, or 15 million viable dendritic cells per injection, if necessary. To prepare an aliquot for injection, a vial was removed from vapor-phase liquid nitrogen storage and placed at 20°C to 25°C for 5 to 10 minutes. This is sufficient time for complete thawing of the contents. The vial was opened and 1 mL of product was aseptically withdrawn using a syringe. Air was pushed into the syringe to ensure the needle was empty, and then the needle was removed. The appropriate injection needle was then attached to the syringe. The product was drawn back into the injection needle. The tumor was then imaged under real-time ultrasound or intermittent guidance (MRI or CT, or using a multimodal combination). During product administration, a single needle was guided under imaging to be at the periphery of the tumor. Once placement was confirmed, the first injection of the predetermined volume, e.g., 0.2 ml of each injection was injected into the tumor if four injections were used.

[0064] Quarenta pacientes foram matriculados no presente estudo. A maioria dos pacientes entrou em falha em outras terapias, por exemplo, com câncer ativamente progredindo. Os pacientes foram observados para toxicidade aguda durante duas horas seguindo cada administração e para sinais clínicos e laboratoriais de toxicidade e autoimunidade durante 30 dias após a última imunização. Foram realizadas avaliações imunológicas in vitro para avaliar respostas imunes. A progressão da doença foi medida por medições de exames físicos, meios radiográficos e biópsias de tumores para avaliar a resposta e a recorrência do tumor. Como tal, a estabilização do crescimento tumoral foi considerado um resultado positivo.[0064] Forty patients were enrolled in the present study. Most patients had failed other therapies, i.e., with actively progressing cancer. Patients were observed for acute toxicity for two hours following each administration and for clinical and laboratory signs of toxicity and autoimmunity for 30 days after the last immunization. In vitro immunological assessments were performed to evaluate immune responses. Disease progression was measured by physical examination measurements, radiographic means, and tumor biopsies to assess tumor response and recurrence. As such, stabilization of tumor growth was considered a positive outcome.

[0065] A primeira imunização foi administrada aproximadamente 3 a 4 semanas após a leucoferese. As primeiras três injeções foram determinada, 1 semana de intervalo (isto é, Dia 0, Semana 1, Semana 2), em seguida, nas semanas 8, 16 e 32, ou enquanto o produto estiver disponível e enquanto a massa tumoral injetável estiver presente no mesmo local. Se houvesse insuficiência de massa tumoral no local de injeção original, uma massa tumoral em um local diferente foi utilizada. Os pacientes receberam células dendríticas que foram ativadas por 16 horas (Método B) ou por 20 horas (Método A). Um único tumor foi injetado em cada visita e os pacientes foram monitorados quanto ao crescimento do tumor, sobrevivência, morte da célula tumoral (necrose) e infiltração de células imunes. A proporção de indivíduos vivos em cada ponto do tempo é fornecida na figura. O crescimento tumoral foi medido usando técnicas de imagem padrão (CT ou MRI).Tabela 1. Medida do Crescimento Tumoral1) SD: doença estável[0065] The first immunization was administered approximately 3 to 4 weeks after leukapheresis. The first three injections were given 1 week apart (i.e., Day 0, Week 1, Week 2), then at Weeks 8, 16, and 32, or as long as product was available and as long as injectable tumor mass was present at the same site. If there was insufficient tumor mass at the original injection site, a tumor mass at a different site was used. Patients received dendritic cells that were activated for 16 hours (Method B) or 20 hours (Method A). A single tumor was injected at each visit, and patients were monitored for tumor growth, survival, tumor cell death (necrosis), and immune cell infiltration. The proportion of subjects alive at each time point is provided in the figure. Tumor growth was measured using standard imaging techniques (CT or MRI). Table 1. Measurement of Tumor Growth 1) SD: stable disease

[0066] O número de pacientes não corresponde a 40 porfalta de dados.[0066] The number of patients does not correspond to 40 due to lack of data.

[0067] A estabilização da doença é um bom resultado nessapopulação.Tabela 2. Medida de Sobrevivência [0067] Disease stabilization is a good outcome in this population.Table 2. Survival Measure

[0068] O câncer do estágio 4 é uma condição que ameaça a vida, e a sobrevivência é um ponto final importante.Tabela 3. Número de Pacientes que demonstram Necrose Tumoral [0068] Stage 4 cancer is a life-threatening condition, and survival is an important endpoint.Table 3. Number of Patients Demonstrating Tumor Necrosis

[0069] A necrose tumoral foi avaliada em biópsias de tumores, utilizando coloração de hematoxilina/eosina padrão.[0069] Tumor necrosis was assessed in tumor biopsies using standard hematoxylin/eosin staining.

[0070] As células dendríticas preparadas pelo Método B (tratamento de 16 horas) produzem mais TNFα do que as células dendríticas preparadas com um método menos otimizado: média de 149 ng/1 milhão de DC/24 horas versus 50 ng/1 milhão de DC/24 horas. O TNFα está, por sua vez, associado com doença estável (SD) na semana 8 (ver, Tabela 1 acima), que é um preditor para uma melhor sobrevivência (ver, Tabela 2 acima).[0070] Dendritic cells prepared by Method B (16-hour treatment) produce more TNFα than dendritic cells prepared with a less optimized method: average of 149 ng/1 million DC/24 hours versus 50 ng/1 million DC/24 hours. TNFα is, in turn, associated with stable disease (SD) at week 8 (see, Table 1 above), which is a predictor for better survival (see, Table 2 above).

[0071] Os dados demonstram que um tratamento de 16 horas (Método B) é ideal para a ativação de DCs parcialmente maduras para injeção intratumoral em imunoterapia de câncer.[0071] The data demonstrate that a 16-hour treatment (Method B) is optimal for activation of partially mature DCs for intratumoral injection in cancer immunotherapy.

Claims

1. A method for producing partially mature and activated isolated human dendritic cells for use in inducing tumor growth inhibition in a patient suffering from a solid tumor, comprising: i) enriching a cell population comprising human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for human monocytic dendritic cell precursors; wherein the cell population comprising human PBMCs is isolated from peripheral blood; ii) culturing the cell population enriched for human monocytic dendritic cell precursors with a tissue culture medium supplemented with a dendritic cell differentiation agent, wherein the dendritic cell differentiation agent is GM-CSF alone without other cytokines, or GM-CSF in combination with IL-4, IL-7, IL-13, or IL-15, to differentiate the human monocytic dendritic cell precursors into immature human dendritic cells; iii) culturing the cell population enriched for immature human dendritic cells with a dendritic cell maturation agent to activate the immature human dendritic cells for 16 hours without antigen contact, wherein the dendritic cell maturation agent is a combination of 105 to 107 cfu per milliliter of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) tissue culture medium and 100 to 1000 U per milliliter of tissue culture medium of interferon y (IFNY) and the capture of activated partially mature dendritic cells and antigen processing;iv) isolate and wash the activated partially mature human dendritic cells.

2. A method for producing partially mature and activated isolated human dendritic cells comprising: i) culturing a cell population comprising human monocytic dendritic cell precursors with a tissue culture medium supplemented with a dendritic cell differentiation agent, wherein the dendritic cell differentiation agent is GM-CSF alone without other cytokines, or GM-CSF in combination with IL-4, IL-7, IL-13, or IL-15, to differentiate the human monocytic dendritic cell precursors into immature human dendritic cells; wherein the cell population comprising human monocytic dendritic cell precursors is isolated; ii) culturing the cell population enriched for immature human dendritic cells with a dendritic cell maturation agent to activate the immature human dendritic cells for 16 hours without antigen contact; wherein the dendritic cell maturation agent comprises 105 to 107 cfu per milliliter of tissue culture medium of BCG and 100 to 1000 U per milliliter of tissue culture medium of interferon γ; andiii) isolating and washing the partially mature and activated human dendritic cells.

3. The method of claim 2, wherein the monocytic dendritic cell precursors are obtained from skin, spleen, bone marrow, thymus, lymph nodes, umbilical cord blood, or peripheral blood.

4. The method of any one of claims 1 to 3, wherein the monocytic dendritic cell precursor cells are non-activated monocytic dendritic cell precursors.

5. Method according to any one of claims 1 to 4, CHARACTERIZED by the fact that the monocytic dendritic cell precursors are obtained from the individual to be treated.

6. The method of any one of claims 1 to 4, wherein the monocytic dendritic cell precursors are obtained from a healthy individual HLA-compatible with the individual to be treated.

7. The method of claim 1, wherein the BCG comprises whole BCG, BCG cell wall constituents, BCG-derived lipoarabidomannans, or BCG components, or the BCG comprises inactivated whole BCG, BCG cell wall constituents, BCG-derived lipoarabidomannans, or BCG components.

8. The method of claim 7, wherein the inactivated BCG is heat-inactivated BCG, formalin-treated BCG, or formalin-treated and heat-inactivated BCG.

9. Use of a pharmaceutical composition comprising partially mature and activated human dendritic cells as defined in any one of claims 1 to 8, CHARACTERIZED by being in the manufacture of a medicament for treating a solid tumor, in which the composition is administered into a tumor, into a tumor bed or into an area of tissue surrounding a tumor.

10. Use according to claim 9, CHARACTERIZED by the fact that the population of partially mature and activated human dendritic cells produces an average of 149 ng of TNFα/1 million cells/24 hours.

11. Use according to claim 9 or 10, CHARACTERIZED by the fact that the partially mature and activated human dendritic cells were cryopreserved.

12. Use according to claim 11, CHARACTERIZED by the fact that the partially mature and activated human dendritic cells were cryopreserved in aliquots of 3 x 106, 8 x 106 and 17 x 106 of partially mature and activated human dendritic cells per vial.