BR112017019978B1

BR112017019978B1 - ANTIBODY OR AN ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CONJUGATE, ANTIGEN RECEPTOR, POLYNUCLEOTIDE, VECTOR, EX VIVO TRANSGENIC MICROBIAL CELL, METHOD FOR PRODUCING AN EX VIVO TRANSGENIC CELL, METHOD FOR PRODUCING AN ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE OF THE ANTIBODY

Info

Publication number: BR112017019978B1
Application number: BR112017019978-5A
Authority: BR
Inventors: David Spriggs; Alberto FERNANDEZ-TEJADA; Dharmarao Thapi
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2025-09-02

Abstract

ANTICORPO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO COM ANTÍGENO, CONJUGADO, RECEPTOR DE ANTÍGENO, CADEIA, CONJUGADO DE CADEIA, PROTEÍNA DE FUSÃO, CÉLULA T, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA EX VIVO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CADEIA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE CÂNCER, GLICOPEPTÍDEO, MÉTODO PARA GERAR UM ANTICORPO. Trata-se de composições, métodos e usos que envolvem anticorpos que ligam imunoespecificamente formas glicosiladas de MUC16, uma proteína de mucina aglutinada. Também são fornecidos no presente documento usos e métodos para gerir, tratar ou prevenir distúrbios, tais como câncer.ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF, CONJUGATE, ANTIGEN RECEPTOR, CHAIN, CHAIN CONJUGATE, FUSION PROTEIN, T CELL, POLYNUCLEOTIDE, VECTOR, EX VIVO CELL, METHOD FOR PRODUCING A CHAIN, METHOD FOR PRODUCING AN ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHOD FOR TREATING CANCER, GLYCOPEPTIDE, METHOD FOR GENERATING AN ANTIBODY. These are compositions, methods, and uses involving antibodies that immunospecifically bind glycosylated forms of MUC16, a clumped mucin protein. Also provided herein are uses and methods for managing, treating, or preventing disorders such as cancer.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório no U.S. 62/134.402, depositado em 17 de março de 2015, que está incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade.[001] This application claims the benefit of U.S. Provisional Application No. 62/134,402, filed March 17, 2015, which is incorporated by reference herein in its entirety.

[002] Este pedido incorpora a título de referência uma Listagem de Sequências apresentada com este pedido como um arquivo de texto intitulado “Sequence_Listing_13542-016- 228.txt” criado em 14 de março de 2016 e que tem um tamanho de 375 Kbytes.[002] This application incorporates by reference a Sequence Listing filed with this application as a text file titled “Sequence_Listing_13542-016-228.txt” created on March 14, 2016, and having a size of 375 Kbytes.

1. Field

[003] São fornecidos no presente documento composições, métodos e usos que envolvem anticorpos que se ligam imunoespecificamente com MUC16, uma proteína de mucina aglutinada, e modulam a expressão e/ou a atividade de MUC16 para gerir, tratar ou prevenir distúrbios, tal como câncer.[003] Provided herein are compositions, methods, and uses involving antibodies that immunospecifically bind to MUC16, a mucin-binding protein, and modulate the expression and/or activity of MUC16 to manage, treat, or prevent disorders, such as cancer.

2. Background

[004] As mucinas são biomoléculas importantes para homeostase celular e a proteção de superfícies epiteliais. As alterações à expressão de mucinas em câncer de ovário podem ser exploradas no diagnóstico, no prognóstico e no tratamento (Singh AP, et al. Lancet Oncol 2008;9(11):1.076 a 1.085). MUC16 é uma tal mucina que é superexpressa na maioria dos carcinomas de ovário e é um marcador sérico substituto estabelecido (CA-125) para a detecção e a progressão de cânceres de ovário (Badgwell D, et al., Dis Markers 2007;23(5-6):397410; Bast RC, Jr, et al., Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274 a 281; Fritsche HA, et al., Clin Chem 1998;44(7):1.379 a 1.380; e Krivak TC, et al., Gynecol Oncol 2009;115(1):81 a 85). A MUC16 é uma mucina altamente glicosilada composta por um grande domínio clivado e liberado, denominado CA-125, que consiste em múltiplas sequências de repetição, e um domínio mantido (MUC-CD) que inclui um fragmento extracelular de não repetição residual, um domínio transmembranar e uma cauda citoplasmática (O’Brien TJ, et al. Tumour Biol 2001;22(6):348 a 366). Visto que o antígeno é apenas expresso de outro modo em baixos níveis no útero, no endométrio, nas trompas de falópio, nos ovários e na serosa das cavidades abdominal e torácica, a MUC16 é um alvo potencialmente atrativopara terapias com base imune.[004] Mucins are important biomolecules for cellular homeostasis and the protection of epithelial surfaces. Alterations in mucin expression in ovarian cancer can be exploited in diagnosis, prognosis, and treatment (Singh AP, et al. Lancet Oncol 2008;9(11):1,076 to 1,085). MUC16 is one such mucin that is overexpressed in most ovarian carcinomas and is an established surrogate serum marker (CA-125) for the detection and progression of ovarian cancers (Badgwell D, et al., Dis Markers 2007;23(5-6):397410; Bast RC, Jr, et al., Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274 to 281; Fritsche HA, et al., Clin Chem 1998;44(7):1379 to 1380; and Krivak TC, et al., Gynecol Oncol 2009;115(1):81 to 85). MUC16 is a highly glycosylated mucin composed of a large cleaved and released domain, termed CA-125, which consists of multiple repeat sequences, and a retained domain (MUC-CD) that includes a residual nonrepeat extracellular fragment, a transmembrane domain, and a cytoplasmic tail (O’Brien TJ, et al. Tumor Biol 2001;22(6):348–366). Because the antigen is otherwise only expressed at low levels in the uterus, endometrium, fallopian tubes, ovaries, and the serosa of the abdominal and thoracic cavities, MUC16 is a potentially attractive target for immune-based therapies.

[005] Entretanto, o fato de que a maior parte do domínioextracelular de MUC16 é clivada e secretada limita a utilidade de MUC16 como um antígeno alvo em carcinomas de ovário. De fato, até a presente data, a maior parte dos anticorpos monoclonais de MUC16 relatados se ligam com epítopos presentes na grande fração de CA-125 secretada da glicoproteína, sem nenhuma ligação conhecida com a fração extracelular mantida (MUC-CD) do antígeno (Bellone S, Am J Obstet Gynecol 2009;200(1):75 el-10, Berek JS.Expert Opin Biol Ther 2004;4(7):1.159 a 1.165; O’Brien TJ, et al. Int J Biol Markers 1998;13(4):188 a 195). Assim, a geração de novos anticorpos para a região não removida de MUC16 é necessária para abordagens diagnósticas e terapêuticas.[005] However, the fact that most of the extracellular domain of MUC16 is cleaved and secreted limits the usefulness of MUC16 as a target antigen in ovarian carcinomas. Indeed, to date, most reported MUC16 monoclonal antibodies bind to epitopes present in the large secreted CA-125 fraction of the glycoprotein, with no known binding to the retained extracellular fraction (MUC-CD) of the antigen (Bellone S, Am J Obstet Gynecol 2009;200(1):75 el-10, Berek JS. Expert Opin Biol Ther 2004;4(7):1159–1165; O’Brien TJ, et al. Int J Biol Markers 1998;13(4):188–195). Thus, the generation of new antibodies to the unremoved region of MUC16 is necessary for diagnostic and therapeutic approaches.

3. Summary

[006] São fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos e polipeptídeos, incluindo tais anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno, tais como proteínas de fusão, conjugados e/ou receptores de antígeno quiméricos, assim como células que expressam os mesmos. Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno estão aqueles que especificamente se ligam com epítopos de uma proteína MUC16. Tais anticorpos são denominados no presente documento como “Anticorpos de Glicosilação de MUC16”. Tais epítopos sãotipicamente epítopos dentro ou substancialmente dentro de uma porção extracelular de uma molécula de MUC16, de modo geral, uma forma não removida de MUC16; em algumas modalidades, o epítoponão está dentro de, ou o anticorpo ou fragmento não está ligado com, uma região de repetição em tandem de MUC16 e/ou uma formasecretada de MUC16. Em algumas modalidades, o epítopo está dentroou inclui resíduos dentro de MUC16c114 e tipicamente inclui umou mais resíduos glicosilados ou locais de glicosilação no mesmo. Em algumas modalidades, o epítopo inclui um ou mais locais de glicosilação, tais como locais para N-glicosilação. Em alguns aspectos, o epítopo inclui um resíduo de asparagina correspondente a Asn1806 ou Asn1800 da sequência de MUC16 apresentada na SEQ ID NO: 150 (e/ou uma forma (ou formas)glicosilada da mesma); em alguns aspectos, o epítopo inclui um resíduo de asparagina correspondente a Asn1806 da SEQ ID NO: 150, mas não inclui um resíduo de asparagina correspondente aAsn1800 da SEQ ID NO: 150; em alguns aspectos, o epítopo incluium resíduo de asparagina correspondente a Asn1800 da SEQ ID NO:150, mas não inclui um resíduo de asparagina correspondente aAsn1806 da SEQ ID NO: 150. Em algumas de qualquer uma de tais modalidades, tal uma ou mais asparaginas são glicosiladas, talcomo N-glicosiladas. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno se liga com um epítopo dentroou que inclui resíduos dentro da SEQ ID NO: 131; se liga com um epítopo dentro ou que inclui resíduos dentro da SEQ ID NO: 130,ou uma combinação dos mesmos; em algumas modalidades, o anticorpoou fragmento não se liga imunoespecificamente dentro de uma região de MUC16 correspondente à SEQ ID NO: 168 ou dentro dos resíduos 2 a 19 da SEQ ID NO: 168.[006] Provided are antibodies and antigen-binding fragments thereof and polypeptides, including such antibodies or antigen-binding fragments, such as fusion proteins, conjugates, and/or chimeric antigen receptors, as well as cells expressing the same. Among the antibodies and antigen-binding fragments are those that specifically bind to epitopes of a MUC16 protein. Such antibodies are referred to herein as "MUC16 Glycosylation Antibodies." Such epitopes are typically epitopes within or substantially within an extracellular portion of a MUC16 molecule, generally an unremoved form of MUC16; in some embodiments, the epitope is not within, or the antibody or fragment is not bound to, a tandem repeat region of MUC16 and/or a secreted form of MUC16. In some embodiments, the epitope is within or includes residues within MUC16c114 and typically includes one or more glycosylated residues or glycosylation sites therein. In some embodiments, the epitope includes one or more glycosylation sites, such as sites for N-glycosylation. In some aspects, the epitope includes an asparagine residue corresponding to Asn1806 or Asn1800 of the MUC16 sequence set forth in SEQ ID NO: 150 (and/or a glycosylated form(s) thereof); in some aspects, the epitope includes an asparagine residue corresponding to Asn1806 of SEQ ID NO: 150, but does not include an asparagine residue corresponding to Asn1800 of SEQ ID NO: 150; In some aspects, the epitope includes an asparagine residue corresponding to Asn1800 of SEQ ID NO:150, but does not include an asparagine residue corresponding to Asn1806 of SEQ ID NO:150. In some of any such embodiments, such one or more asparagines are glycosylated, such as N-glycosylated. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment binds to an epitope within or that includes residues within SEQ ID NO:131; binds to an epitope within or that includes residues within SEQ ID NO:130, or a combination thereof; in some embodiments, the antibody or fragment does not immunospecifically bind within a region of MUC16 corresponding to SEQ ID NO:168 or within residues 2 to 19 of SEQ ID NO:168.

[007] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos incluem uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) correspondentes às CDRs da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de uma sequência de anticorpo, tal como uma sequência de anticorpo direcionada ao local de glicosilação de MUC16 descrita no presente documento, tal como do anticorpo designado 18C6, do anticorpo designado 10C6 e/ou do anticorpo designado 19C11. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento tem uma cadeia pesada CDR3 (HCDR3) que tem uma sequência correspondente a uma HCDR3 de uma das sequências de cadeia pesada fornecidas no presente documento, tais como das sequências de cadeia pesada do anticorpo designado 18C6, do anticorpo designado 10C6, do anticorpo designado 19C11 e/ou do anticorpo designado 7B12. Em alguns aspectos, a HCDR3 tem uma sequência selecionada dentre IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105), GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 65; e SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 31, 51, 71 e 91; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 77; e SEQ ID NO: 97.[007] In some embodiments, the provided antibodies or antigen-binding fragments include one or more complementarity determining regions (CDRs) corresponding to the CDRs of the heavy chain and/or the light chain of an antibody sequence, such as an antibody sequence directed to the MUC16 glycosylation site described herein, such as of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, and/or the antibody designated 19C11. In some embodiments, the antibody or fragment has a heavy chain CDR3 (HCDR3) that has a sequence corresponding to a HCDR3 of one of the heavy chain sequences provided herein, such as of the heavy chain sequences of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, the antibody designated 19C11, and/or the antibody designated 7B12. In some aspects, HCDR3 has a sequence selected from IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105), GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), where X18 is T, A, or S; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 65; and SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 31, 51, 71, and 91; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 77; and SEQ ID NO: 97.

[008] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos incluem uma cadeia pesada CDR1 (HCDR1) que tem uma sequência correspondente a uma HCDR1 de uma das sequências de cadeia pesada fornecidas no presente documento, tais como das sequências de cadeia pesada do anticorpo designado 18C6, do anticorpo designado 10C6, do anticorpo designado 19C11 e/ou do anticorpo designado 7B12. Em alguns aspectos, a HCDR1 tem uma sequência selecionada dentre TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V, a sequência GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V, GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e X16 é V ou L, e a sequência apresentada como SEQ ID NO: 3; e a sequência apresentada como SEQ ID NO: 9; e a sequência apresentada como SEQ ID NO: 15; e a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 23, 43, 63, 83; e a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 49, 69 e 89; e a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35, 55, 75 e 95.[008] In some embodiments, the provided antibodies or antigen-binding fragments include a heavy chain CDR1 (HCDR1) that has a sequence corresponding to a HCDR1 of one of the heavy chain sequences provided herein, such as the heavy chain sequences of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, the antibody designated 19C11, and/or the antibody designated 7B12. In some aspects, the HCDR1 has a sequence selected from TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V, the sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V, GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and X16 is V or L, and the sequence set forth as SEQ ID NO: 3; and the sequence set forth as SEQ ID NO: 9; and the sequence set forth as SEQ ID NO: 15; and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 23, 43, 63, 83; and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 29, 49, 69, and 89; and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 35, 55, 75, and 95.

[009] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos incluem uma cadeia pesada CDR2 (HCDR2) que tem uma sequência correspondente a uma HCDR2 de uma das sequências de cadeia pesada fornecidas no presente documento, tais como das sequências de cadeia pesada do anticorpo designado 18C6, do anticorpo designado 10C6, do anticorpo designado 19C11 e/ou do anticorpo designado 7B12. Em alguns aspectos, a HCDR2 tem uma sequência selecionada dentre HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é E ou ausente,e X3 é Y ou N; WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; a sequência apresentada como SEQ ID NO: 4; a sequência apresentada como SEQ ID NO: 10; e a sequência apresentada como SEQ ID NO: 16; e a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 24, 44,64, 84; e a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ IDNOs: 30, 50, 70, 90; e a sequência apresentada em qualquer umadas SEQ ID NOs: 36, 56, 76, 96.[009] In some embodiments, the provided antibodies or antigen-binding fragments include a heavy chain CDR2 (HCDR2) that has a sequence corresponding to a HCDR2 of one of the heavy chain sequences provided herein, such as the heavy chain sequences of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, the antibody designated 19C11, and/or the antibody designated 7B12. In some aspects, the HCDR2 has a sequence selected from HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent, and X3 is Y or N; WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; the sequence set forth as SEQ ID NO: 4; the sequence set forth as SEQ ID NO: 10; and the sequence set forth as SEQ ID NO: 16; and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 24, 44, 64, 84; and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 30, 50, 70, 90; and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 36, 56, 76, 96.

[010] Em algumas modalidades, incluindo qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente, os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos incluem, por exemplo, incluem adicionalmente, uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3)que tem uma sequência correspondente a uma LCDR3 de uma das sequências de cadeia leve fornecidas no presente documento, taiscomo das sequências de cadeia leve do anticorpo designado 18C6,do anticorpo designado 10C6, do anticorpo designado 19C11 e/oudo anticorpo designado 7B12. Em alguns aspectos, a LCDR3 tem umasequência selecionada dentre MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em queX6 é G ou S, e em que X7 é H ou Y; X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), emque X13 é G ou S, e em que X14 é H ou Y; e MQSLEYPLT (SEQ ID NO:120); uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 8, 28, 48,68 e 88; uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 14, 34,54, 74 e 94; e uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs:20, 4, 60, 80 e 100.[010] In some embodiments, including any of the aforementioned embodiments, the provided antibodies or antigen-binding fragments include, for example, further include, a light chain CDR3 (LCDR3) that has a sequence corresponding to an LCDR3 of one of the light chain sequences provided herein, such as the light chain sequences of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, the antibody designated 19C11, and/or the antibody designated 7B12. In some aspects, the LCDR3 has a sequence selected from MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S, and wherein X7 is H or Y; X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and wherein X14 is H or Y; and MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120); a sequence selected from SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68 and 88; a sequence selected from SEQ ID NOs: 14, 34, 54, 74 and 94; and a sequence selected from SEQ ID NOs: 20, 4, 60, 80 and 100.

[011] Em algumas modalidades, incluindo qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente, os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos incluem, por exemplo, incluem adicionalmente, uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) que tem uma sequência correspondente a uma LCDR1 de uma das sequências de cadeia leve fornecidas no presente documento, tais como das sequências de cadeia leve do anticorpo designado 18C6, do anticorpo designado 10C6, do anticorpo designado 19C11 e/ou do anticorpo designado 7B12. Em alguns aspectos, a LCDR1 tem uma sequência selecionada dentre RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106); SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e em que X12 é H ou K; KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e em que X20 é H ou K; uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 6, 26, 46, 66 e 86; uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 12, 32, 52, 72 e 92; e uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 18, 38, 58, 78 e 98.[011] In some embodiments, including any of the aforementioned embodiments, the provided antibodies or antigen-binding fragments include, for example, further include, a light chain CDR1 (LCDR1) that has a sequence corresponding to an LCDR1 of one of the light chain sequences provided herein, such as of the light chain sequences of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, the antibody designated 19C11, and/or the antibody designated 7B12. In some aspects, the LCDR1 has a sequence selected from RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106); SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and wherein X12 is H or K; KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and wherein X20 is H or K; a sequence selected from SEQ ID NOs: 6, 26, 46, 66 and 86; a sequence selected from SEQ ID NOs: 12, 32, 52, 72 and 92; and a sequence selected from SEQ ID NOs: 18, 38, 58, 78 and 98.

[012] Em algumas modalidades, incluindo qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente, os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos incluem, por exemplo, incluem adicionalmente, uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) que tem uma sequência correspondente a uma LCDR2 de uma das sequências de cadeia leve fornecidas no presente documento, tais como das sequências de cadeia leve do anticorpo designado 18C6, do anticorpo designado 10C6, do anticorpo designado 19C11 e/ou do anticorpo designado 7B12. Em alguns aspectos, a LCDR2 tem uma sequência selecionada dentre YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); YMS (SEQ ID NO: 113); e a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 27, 47, 67, 87; 13, 33, 53, 73, 93, 19, 39, 59, 79, 99, 119.[012] In some embodiments, including any of the aforementioned embodiments, the provided antibodies or antigen-binding fragments include, for example, further include, a light chain CDR2 (LCDR2) that has a sequence corresponding to an LCDR2 of one of the light chain sequences provided herein, such as the light chain sequences of the antibody designated 18C6, the antibody designated 10C6, the antibody designated 19C11, and/or the antibody designated 7B12. In some aspects, the LCDR2 has a sequence selected from YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); YMS (SEQ ID NO: 113); and the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 7, 27, 47, 67, 87; 13, 33, 53, 73, 93, 19, 39, 59, 79, 99, 119.

[013] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm (a) uma região que determina complementaridade (CDR)1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é E ou ausente, e X3 é Y ou N; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105).[013] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having (a) a VH complementarity determining region (CDR)1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent, and X3 is Y or N; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105).

[014] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111).[014] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111).

[015] Entre as modalidades e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e X16 é V ou L; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S.[015] Among the embodiments and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and X16 is V or L; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S.

[016] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45; uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:83, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85; uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:89, uma CDR2 de VH quecompreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma CDR3de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91; uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97.[016] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45; a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:57; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:65; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:71; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:77; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:85; a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91; a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:97.

[017] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), em que X4 é R ou L, e X5 é K ou H; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em que X6 é G ou S, e X7 é H ou Y.[017] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), wherein X4 is R or L, and X5 is K or H; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S, and X7 is H or Y.

[018] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e X12 é H ou K; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 113); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), em que X13 é G ou S, e X14 é H ou Y.[018] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and X12 is H or K; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 113); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and X14 is H or Y.

[019] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e X20 é Hou K; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 119); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).[019] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having a VL CDR1 comprising the amino acid sequence KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and X20 is H or K; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 119); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).

[020] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:87 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:94; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74; ou uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80.[020] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:47, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:60; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:99, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:100; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:67, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:68; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74; or a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:79, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:80.

[021] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm (a) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V; uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é E ou ausente, e X3 é Y ou N; e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), em que X4 é R ou L, e X5 é K ou H; uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em que X6 é G ou S, e X7 é H ou Y; ou (b) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V; uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e X12 é H ou K; uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 113); e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), em que X13 é G ou S, e X14 é H ou Y; ou (c) (i) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e X16 é V ou L; uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e X20 é H ou K; uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 119); e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120); ou (d) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; ou (e) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34; ou (f) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40; ou (g) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48; ou (h) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, a CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54; ou (i) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, a CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60; ou (j) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:83, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:87 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88; ou (k) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:89, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:94; ou (l) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97 e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100; ou (m) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8; ou (n) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; ou (o) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; ou (p) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68; ou (q) (i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74; ou (r)(i) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, uma CDR2 de VH quecompreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76 e uma CDR3de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77; e (ii) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, uma CDR2 de VL quecompreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma CDR3de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80.[021] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having (a) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V; a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent, and X3 is Y or N; and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), wherein X4 is R or L, and X5 is K or H; a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S, and X7 is H or Y; or (b) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V; a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and X12 is H or K; a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 113); and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and X14 is H or Y; or (c) (i) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and X16 is V or L; a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and X20 is H or K; a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 119); and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120); or (d) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34; or (f) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:40; or (g) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:47, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48; or (h) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54; or (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:57; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:60; or (j) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:85; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88; or (k) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94; or (i) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:97, and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:99, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:100; or (m) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8; or (n) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; or (o) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; or (p) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:65; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:67, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:68; or (q) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:71; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74; or (r)(i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:77; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:79, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:80.

[022] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno de qualquer uma das modalidades estão aqueles que têm: (a) (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos deQVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 éI ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é P ou S, X27é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ou D, X31 é Tou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35 é T, S ouA; e (ii) uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMS NLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), em que X36 é I ou V, X37 é P ou S, X38 é R ou L,X39 é K ou H, X40 é R ou K, X41 é E ou G, X42 é S ou G, e X43 é You H; ou (b) (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda SEQ ID NO: 1; e (ii) uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; ou (c) (i) uma VH que compreende asequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; e (ii) uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; ou (d) (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:41; e (ii) uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42; ou (e) (i) uma VH que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:61; e (ii) uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:62; ou (f) (i) uma VH quecompreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81; e (ii) uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82.[022] Among the antibodies and antigen-binding fragments of any of the embodiments are those having: (a) (i) a VH comprising the amino acid sequence of QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27is E or absent, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is T or S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I, or S, and X35 is T, S, or A; and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), wherein X36 is I or V, X37 is P or S, X38 is R or L, X39 is K or H, X40 is R or K, X41 is E or G, X42 is S or G, and X43 is Y or H; or (b) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; or (c) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; or (d) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42; or (e) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; or (f) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81; and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82.

[023] Também entre os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno fornecidos estão aqueles que têm pelo menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com a sequência (ousequências) de VH e/ou VL de quaisquer tais anticorpos e/ou de qualquer um dos anticorpos apresentados nas Tabelas 1 e 2. Também entre os anticorpos e fragmentos dos mesmos fornecidos estão aqueles que competem pela ligação a MUC16 e/ou um epítopo do mesmo com qualquer um de tais anticorpos.[023] Also among the antibodies or antigen-binding fragments provided are those that have at least 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% identity to the VH and/or VL sequence(s) of any such antibodies and/or any of the antibodies set forth in Tables 1 and 2. Also among the antibodies and fragments thereof provided are those that compete for binding to MUC16 and/or an epitope thereof with any such antibodies.

[024] São também fornecidas proteínas de fusão, tais como moléculas quiméricas, e/ou conjugados que compreendem qualquer um dos anticorpos, tais como receptores de antígeno quiméricos (CARs) que contêm tais anticorpos ou fragmentos, e células que expressam tais moléculas. São também fornecidas versões humanizadas de quaisquer tais anticorpos.[024] Also provided are fusion proteins, such as chimeric molecules, and/or conjugates comprising any of the antibodies, such as chimeric antigen receptors (CARs) containing such antibodies or fragments, and cells expressing such molecules. Also provided are humanized versions of any such antibodies.

[025] Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um anticorpo ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo, em que o anticorpo (a) imunoespecificamente se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, em que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (b) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, em que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (c) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16. Em certas modalidades, (i) a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é uma célula SKOV3; (ii) a célula que expressa de maneira recombinante a segunda forma de MUC16 é uma célula SKOV3; e (iii) as células na etapa (c) são células SKOV3. Em uma modalidade específica, o anticorpo carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16, em que a terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é SEQ ID NO: 139. Em certas modalidades, (i) a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é uma célula SKOV3; (ii) a célula que expressa de maneira recombinante a segunda forma de MUC16 é uma célula SKOV3; e (iii) as células na etapa (c) são células SKOV3. Em certas modalidades, (i) a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é uma célula SKOV3; (ii) a célula que expressa de maneira recombinante a segunda forma de MUC16 é uma célula SKOV3; (iii) a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 é uma célula SKOV3; e (iv) as células na etapa (c) são células SKOV3.[025] In some embodiments, provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody (a) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (b) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (c) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16. In certain embodiments, (i) the cell recombinantly expressing the first form of MUC16 is a SKOV3 cell; (ii) the cell recombinantly expressing the second form of MUC16 is a SKOV3 cell; and (iii) the cells in step (c) are SKOV3 cells. In a specific embodiment, the antibody lacks immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, wherein the third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139. In certain embodiments, (i) the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16 is a SKOV3 cell; (ii) the cell that recombinantly expresses the second form of MUC16 is a SKOV3 cell; and (iii) the cells in step (c) are SKOV3 cells. In certain embodiments, (i) the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16 is a SKOV3 cell; (ii) the cell that recombinantly expresses the second form of MUC16 is a SKOV3 cell; (iii) the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16 is a SKOV3 cell; and (iv) the cells in step (c) are SKOV3 cells.

[026] É também fornecido no presente documento um anticorpo ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo, em que o anticorpo (a) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, em que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (b) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, em que a terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (c) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16. Em certas modalidades, (i) a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é uma célula SKOV3; (ii) a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 é uma célula SKOV3; e (iii) as células na etapa (c) são células SKOV3.[026] Also provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody (a) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (b) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a third form of MUC16, wherein the third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (c) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16. In certain embodiments, (i) the cell recombinantly expressing the first form of MUC16 is a SKOV3 cell; (ii) the cell recombinantly expressing the third form of MUC16 is a SKOV3 cell; and (iii) the cells in step (c) are SKOV3 cells.

[027] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo se liga imunoespecificamente com um epítopo que compreende asparagina N-glicosilada 1806 da SEQ ID NO: 150.[027] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof immunospecifically binds to an epitope comprising N-glycosylated asparagine 1806 of SEQ ID NO: 150.

[028] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo se liga imunoespecificamente com a sequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 130), em que o resíduo de aminoácido número 4 (N4) e o resíduo de aminoácido número 10 (N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 130) são glicosilados. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo se liga imunoespecificamente com a sequência de aminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 131), em que o resíduo de aminoácido número 7 (N7) de CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 131) é glicosilado. Em certas modalidades, a glicosilação consiste em uma chitobiose N-ligada.[028] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof immunospecifically binds to the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 130) are glycosylated. In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof immunospecifically binds to the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 131) is glycosylated. In certain embodiments, the glycosylation consists of an N-linked chitobiose.

[029] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é internalizado em uma célula que expressa a primeira forma de MUC16 mediante contato da célula com o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno. Em certas modalidades, a célula é uma célula SKOV3 que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16.[029] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is internalized into a cell expressing the first form of MUC16 upon contacting the cell with the antibody or antigen-binding fragment. In certain embodiments, the cell is a SKOV3 cell recombinantly expressing the first form of MUC16.

[030] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo inibe o crescimento de um tumor que expressa uma forma glicosilada de MUC16.[030] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof inhibits the growth of a tumor expressing a glycosylated form of MUC16.

[031] Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.[031] In certain embodiments, the antibody is a monoclonal antibody.

[032] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH), que compreende (a) uma região que determina complementaridade (CDR)1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é E ou ausente, e X3 é Y ou N; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105).[032] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain (VH) variable region, comprising (a) a VH complementarity determining region (CDR)1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent, and X3 is Y or N; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105).

[033] Em certas modalidades, a anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111).[033] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111).

[034] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e X16 é V ou L; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S.[034] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and X16 is V or L; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S.

[035] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.[035] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5.

[036] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11.[036] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11.

[037] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17.[037] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17.

[038] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25.[038] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.

[039] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31.[039] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31.

[040] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37.[040] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37.

[041] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45.[041] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45.

[042] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51.[042] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51.

[043] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57.[043] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:57.

[044] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65.[044] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:65.

[045] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71.[045] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:71.

[046] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77.[046] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:77.

[047] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:83, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85.[047] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:85.

[048] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:89, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91.[048] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91.

[049] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97.[049] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:97.

[050] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos deQVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 éI ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é P ou S, X27é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ou D, X31 é Tou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35 é T, S ouA.[050] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27is E or absent, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is Tou S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I or S, and X35 is T, S or A.

[051] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.[051] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

[052] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21.[052] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.

[053] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.[053] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.

[054] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreendea sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61.[054] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61.

[055] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento deligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreendea sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81.[055] In certain embodiments, the antibody or antigen-deleting fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81.

[056] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento deligação com antígeno do mesmo compreende uma região variável decadeia leve (VL), que compreende (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), em que X4 é R ou L, e X5 é K ou H; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em que X6 é G ou S, e X7 é H ou Y.[056] In certain embodiments, the antibody or antigen-killing fragment thereof comprises a variable region light chain (VL), comprising (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), wherein X4 is R or L, and X5 is K or H; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S, and X7 is H or Y.

[057] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e X12 é H ou K; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 113); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), em que X13 é G ou S, e X14 é H ou Y.[057] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and X12 is H or K; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 113); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and X14 is H or Y.

[058] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e X20 é H ou K; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 119); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).[058] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and X20 is H or K; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 119); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).

[059] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.[059] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[060] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34.[060] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34.

[061] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40.[061] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:40.

[062] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48.[062] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:47, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48.

[063] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54.[063] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54.

[064] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60.[064] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:60.

[065] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:87 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88.[065] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88.

[066] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:94.[066] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94.

[067] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100.[067] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:99, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:100.

[068] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8.[068] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8.

[069] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14.[069] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14.

[070] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20.[070] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.

[071] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68.[071] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:67, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:68.

[072] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74.[072] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74.

[073] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80.[073] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:79, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:80.

[074] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos deDIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMS NLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), em que X36 é I ou V, X37 é P ou S, X38 é R ou L,X39 é K ou H, X40 é R ou K, X41 é E ou G, X42 é S ou G, e X43 é You H.[074] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), wherein X36 is I or V, X37 is P or S, X38 is R or L, X39 is K or H, X40 is R or K, X41 is E or G, X42 is S or G, and X43 is Y or H.

[075] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.[075] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

[076] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42.[076] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

[077] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82.[077] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82.

[078] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.[078] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[079] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62.[079] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62.

[080] Em certas modalidades, o anticorpo compreende regiões constantes de cadeia leve e pesada derivadas de ser humano. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada tem um isótopo selecionado a partir do grupo que consiste em gama1, gama2, gama3 e gama4. Em certas modalidades, a região constante de cadeia leve tem um isótopo selecionado a partir do grupo que consiste em kappa e lambda.[080] In certain embodiments, the antibody comprises human-derived light and heavy chain constant regions. In certain embodiments, the heavy chain constant region has an isotope selected from the group consisting of gamma1, gamma2, gamma3, and gamma4. In certain embodiments, the light chain constant region has an isotope selected from the group consisting of kappa and lambda.

[081] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é humanizado. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é uma forma humanizada de um anticorpo de roedor.[081] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is humanized. In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a humanized form of a rodent antibody.

[082] Em certas modalidades, o anticorpo é uma imunoglobulina que compreende duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Em certas modalidades, a imunoglobulina é uma IgG.[082] In certain embodiments, the antibody is an immunoglobulin comprising two identical heavy chains and two identical light chains. In certain embodiments, the immunoglobulin is an IgG.

[083] É também fornecido no presente documento um conjugado de anticorpo que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento conjugado com um agente. Em certas modalidades, o agente é um agente de imagem ou um agente citotóxico.[083] Also provided herein is an antibody conjugate comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein conjugated to an agent. In certain embodiments, the agent is an imaging agent or a cytotoxic agent.

[084] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga imunoespecificamente com CD3. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende uma imunoglobulina que se liga imunoespecificamente com MUC16, em que a cadeia leve da imunoglobulina é conjugada por meio de um ligante peptídico a um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga imunoespecificamente com CD3. É também fornecido no presente documento um conjugado de anticorpo biespecífico que compreende um anticorpo biespecífico fornecido no presente documento conjugado com um agente. Em certas modalidades, o agente é um agente de imagem ou um agente citotóxico.[084] In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a bispecific antibody. In certain embodiments, the bispecific antibody immunospecifically binds to CD3. In certain embodiments, the bispecific antibody comprises an immunoglobulin that immunospecifically binds to MUC16, wherein the light chain of the immunoglobulin is conjugated via a peptide linker to a single-chain variable fragment (scFv) that immunospecifically binds to CD3. Also provided herein is a bispecific antibody conjugate comprising a bispecific antibody provided herein conjugated to an agent. In certain embodiments, the agent is an imaging agent or a cytotoxic agent.

[085] Em certas modalidades, o fragmento de ligação com antígeno do mesmo é um fragmento variável de cadeia única (scFv). É também fornecido no presente documento um conjugado de scFv que compreende um scFv fornecido no presente documento conjugado com um agente. Em certas modalidades, o agente é um agente de imagem ou um agente citotóxico.[085] In certain embodiments, the antigen-binding fragment thereof is a single chain variable fragment (scFv). Also provided herein is a scFv conjugate comprising a scFv provided herein conjugated to an agent. In certain embodiments, the agent is an imaging agent or a cytotoxic agent.

[086] São também fornecidas no presente documento proteínas de fusão, moléculas quiméricas e conjugados que compreendem os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno. São fornecidos receptores de antígeno quiméricos (CARs) que incluem um ou mais de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos, tal como um CAR que compreende qualquer um dos scFvs fornecidos no presente documento ou um conjugado de scFv fornecido no presente documento; e/ou CARs que compreendem domínios de ligação com antígeno que competem com os mesmos pela ligação com MUC16.[086] Also provided herein are fusion proteins, chimeric molecules, and conjugates comprising the antibodies and antigen-binding fragments. Provided are chimeric antigen receptors (CARs) that include one or more of any of the antibodies or antigen-binding fragments thereof provided, such as a CAR comprising any of the scFvs provided herein or an scFv conjugate provided herein; and/or CARs that comprise antigen-binding domains that compete with them for binding to MUC16.

[087] É fornecido também no presente documento uma cadeia pesada de anticorpo ou uma porção de ligação com antígeno da mesma. Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos estão aqueles que têm cadeias pesadas e/ou porções de ligação com antígeno das mesmas, tais como regiões de VH das mesmas; são também fornecidas tais cadeias pesadas e porções de ligação com antígeno das mesmas. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é E ou ausente, e X3 é Y ou N; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[087] Also provided herein is an antibody heavy chain or an antigen-binding portion thereof. Among the provided antibodies and antigen-binding fragments thereof are those that have heavy chains and/or antigen-binding portions thereof, such as VH regions thereof; such heavy chains and antigen-binding portions thereof are also provided. In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent, and X3 is Y or N; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[088] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e X9 L ou V; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligaçãoimunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[088] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and X9 is L or V; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[089] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e X16 V ou L; (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117); em que X18 é T, A ou S; em que,opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porçãode ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamentecom uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[089] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and X16 is V or L; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117); wherein X18 is T, A, or S; wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[090] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[090] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[091] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[091] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[092] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porções de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[092] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portions thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[093] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[093] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[094] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[094] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[095] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[095] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[096] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[096] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[097] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[097] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[098] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[098] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:57, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[099] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[099] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:65, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[100] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[100] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:71, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[101] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[101] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:77, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[102] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:83, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[102] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:85, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[103] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:89, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[103] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[104] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[104] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:97, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[105] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos deQVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 éI ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é P ou S, X27é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ou D, X31 é Tou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35 é T, S ouA, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligaçãoimunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[105] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27 is E or absent, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is T or S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I, or S, and X35 is T, S, or A, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[106] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que,opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[106] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[107] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[107] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[108] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[108] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[109] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[109] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[110] Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[110] In some embodiments, the heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits matrigel invasion in vitro of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[111] Em certas modalidades, a cadeia pesada de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma região constante de cadeia pesada derivada de ser humano. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada tem um isótoposelecionado a partir do grupo que consiste em gama1, gama2, gama3 e gama4. Em certas modalidades, a cadeia pesada de anticorpo éhumanizada. Em certas modalidades, a cadeia pesada de anticorpo é a forma humanizada de uma cadeia pesada de roedor.[111] In certain embodiments, the antibody heavy chain or antigen-binding portion thereof comprises a human-derived heavy chain constant region. In certain embodiments, the heavy chain constant region has an isotope selected from the group consisting of gamma1, gamma2, gamma3, and gamma4. In certain embodiments, the antibody heavy chain is humanized. In certain embodiments, the antibody heavy chain is the humanized form of a rodent heavy chain.

[112] É também fornecido no presente documento um conjugado de cadeia pesada de anticorpo que compreende uma cadeia pesada de anticorpo fornecida no presente documento, em que a dita cadeia pesada de anticorpo é conjugada a um agente. Em certas modalidades, o agente é um agente de imagem ou um agente citotóxico.[112] Also provided herein is an antibody heavy chain conjugate comprising an antibody heavy chain provided herein, wherein said antibody heavy chain is conjugated to an agent. In certain embodiments, the agent is an imaging agent or a cytotoxic agent.

[113] Entre os anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos estão aqueles que têm cadeias leves e/ou porções das mesmas, tais como regiões de VL das mesmas; são também fornecidas tais cadeias leves e porções deligação com antígeno das mesmas. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende umaVL que compreende (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), em que X4 éR ou L, e X5 é K ou H; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em que X6 é G ou S, e X7 é H ou Y, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[113] Among the provided antibodies and antigen-binding fragments thereof are those that have light chains and/or portions thereof, such as VL regions thereof; such light chains and antigen-binding portions thereof are also provided. In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), wherein X4 is R or L, and X5 is K or H; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S, and X7 is H or Y, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[114] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e X12 é H ou K; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 113); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), em que X13 é G ou S, e X14 é H ou Y, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação comantígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequênciade aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[114] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and X12 is H or K; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 113); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and X14 is H or Y, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[115] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e X20 é H ou K; (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 119); e (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120) , em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[115] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and X20 is H or K; (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 119); and (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120), wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[116] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[116] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[117] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[117] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[118] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[118] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[119] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[119] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[120] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[120] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[121] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[121] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:40, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[122] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[122] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:47, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[123] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[123] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[124] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[124] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:60, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[125] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[125] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:67, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:68, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[126] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[126] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[127] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[127] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:79, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:80, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[128] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:87 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[128] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[129] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:94, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[129] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[130] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo quecompreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação comantígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[130] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:99, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:100, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO:133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[131] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos deDIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMS NLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), em que X36 é I ou V, X37 é P ou S, X38 é R ou L,X39 é K ou H, X40 é R ou K, X41 é E ou G, X42 é S ou G, e X43 é You H, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligaçãoimunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[131] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), wherein X36 is I or V, X37 is P or S, X38 is R or L, X39 is K or H, X40 is R or K, X41 is E or G, X42 is S or G, and X43 is Y or H, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell expressing recombinantly a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits the in vitro invasion of matrigel of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[132] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[132] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[133] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[133] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[134] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[134] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[135] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[135] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[136] Em algumas modalidades, a cadeia leve ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82, em que, opcionalmente, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16.[136] In some embodiments, the light chain or antigen-binding portion thereof comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82, wherein, optionally, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the antibody light chain or antigen-binding portion thereof (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16.

[137] Em certas modalidades, a cadeia leve de anticorpo ou porção de ligação com antígeno da mesma compreende uma região constante de cadeia leve derivada de ser humano. Em certas modalidades, a região constante de cadeia leve tem um isótopo selecionado a partir do grupo que consiste em kappa e lambda. Em certas modalidades, a cadeia leve de anticorpo é humanizada. Em certas modalidades, a cadeia leve de anticorpo é uma forma humanizada de um anticorpo de roedor.[137] In certain embodiments, the antibody light chain or antigen-binding portion thereof comprises a human-derived light chain constant region. In certain embodiments, the light chain constant region has an isotope selected from the group consisting of kappa and lambda. In certain embodiments, the antibody light chain is humanized. In certain embodiments, the antibody light chain is a humanized form of a rodent antibody.

[138] É também fornecido no presente documento um conjugado de cadeia leve de anticorpo que compreende uma cadeia leve de anticorpo fornecida no presente documento conjugada a um agente. Em certas modalidades, o agente é um agente de imagem ou um agente citotóxico.[138] Also provided herein is an antibody light chain conjugate comprising an antibody light chain provided herein conjugated to an agent. In certain embodiments, the agent is an imaging agent or a cytotoxic agent.

[139] É também fornecida no presente documento uma proteína de fusão que compreende uma cadeia leve de anticorpo fornecida no presente documento conjugada por meio de um ligante peptídico a um scFv. Em certas modalidades, o scFv se liga com CD3.[139] Also provided herein is a fusion protein comprising an antibody light chain provided herein conjugated via a peptide linker to a scFv. In certain embodiments, the scFv binds with CD3.

[140] É também fornecida no presente documento uma célula, tal como uma célula imune, tal como uma célula T, que expressa de maneira recombinante uma ou mais das moléculas fornecidas no presente documento, tal como um CAR fornecido no presente documento.[140] Also provided herein is a cell, such as an immune cell, such as a T cell, that recombinantly expresses one or more of the molecules provided herein, such as a CAR provided herein.

[141] É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam um scFv fornecido no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam um scFv, ou conjugado do mesmo, fornecido no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam um CAR fornecido no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam uma cadeia pesada de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, fornecida no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam um conjugado de cadeia pesada de anticorpo fornecido no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam uma cadeia leve de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, fornecida no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam um conjugado de cadeia leve de anticorpo fornecido no presente documento. É também fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam a proteína de fusão fornecida no presente documento. Um polinucleotídeo que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam (a) uma cadeia pesada de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, fornecida no presente documento ou um conjugado de cadeia pesada de anticorpo fornecido no presente documento; e (b) uma cadeia leve de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, fornecida no presente documento, um conjugado de cadeia leve de anticorpo fornecido no presente documento ou uma proteína de fusão fornecida no presente documento.[141] Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding an scFv provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding an scFv, or conjugate thereof, provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding a CAR provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding an antibody heavy chain, or antigen-binding portion thereof, provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding an antibody heavy chain conjugate provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding an antibody light chain, or antigen-binding portion thereof, provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding an antibody light chain conjugate provided herein. Also provided herein is a polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding the fusion protein provided herein. A polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding (a) an antibody heavy chain, or antigen-binding portion thereof, provided herein or an antibody heavy chain conjugate provided herein; and (b) an antibody light chain, or antigen-binding portion thereof, provided herein, an antibody light chain conjugate provided herein, or a fusion protein provided herein.

[142] É também fornecido no presente documento um vetor que compreende um polinucleotídeo fornecido no presente documento ligado operacionalmente com um promotor. É também fornecido no presente documento um vetor que compreende (a) um primeiro polinucleotídeo fornecido no presente documento ligado operacionalmente com um primeiro promotor; e (b) um segundo polinucleotídeo fornecido no presente documento ligado operacionalmente com um segundo promotor.[142] Also provided herein is a vector comprising a polynucleotide provided herein operatively linked with a promoter. Also provided herein is a vector comprising (a) a first polynucleotide provided herein operatively linked with a first promoter; and (b) a second polynucleotide provided herein operatively linked with a second promoter.

[143] É também fornecida no presente documento uma célula ex vivo que compreende um polinucleotídeo fornecido no presente documento ligado operacionalmente com um promotor. É também fornecida no presente documento uma célula ex vivo que compreende um polinucleotídeo fornecido no presente documento ligado operacionalmente com um promotor. É também fornecida no presente documento uma célula ex vivo que compreende um vetor fornecido no presente documento. É também fornecida no presente documento uma célula ex vivo que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento ligado operacionalmente com um promotor.[143] Also provided herein is an ex vivo cell comprising a polynucleotide provided herein operatively linked with a promoter. Also provided herein is an ex vivo cell comprising a polynucleotide provided herein operatively linked with a promoter. Also provided herein is an ex vivo cell comprising a vector provided herein. Also provided herein is an ex vivo cell comprising one or more polynucleotides encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein operatively linked with a promoter.

[144] É também fornecido no presente documento um método para produzir uma cadeia pesada de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, que compreende cultivar uma célula fornecida no presente documento sob condições de modo que um polinucleotídeo seja expresso pela célula para produzir uma cadeia pesada de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, ou um conjugado de cadeia pesada de anticorpo codificado pelo polinucleotídeo.[144] Also provided herein is a method for producing an antibody heavy chain, or antigen-binding portion thereof, comprising culturing a cell provided herein under conditions such that a polynucleotide is expressed by the cell to produce an antibody heavy chain, or antigen-binding portion thereof, or an antibody heavy chain conjugate encoded by the polynucleotide.

[145] É também fornecido no presente documento um método para produzir uma cadeia leve de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, que compreende cultivar uma célula fornecida no presente documento sob condições de modo que um polinucleotídeo seja expresso pela célula para produzir a cadeia leve de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, o conjugado de cadeia leve de anticorpo ou a proteína de fusão codificada pelo polinucleotídeo.[145] Also provided herein is a method for producing an antibody light chain, or antigen-binding portion thereof, comprising culturing a cell provided herein under conditions such that a polynucleotide is expressed by the cell to produce the antibody light chain, or antigen-binding portion thereof, the antibody light chain conjugate, or the fusion protein encoded by the polynucleotide.

[146] É também fornecido no presente documento um método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende cultivar uma célula ex vivo fornecida no presente documento sob condições de modo que um polinucleotídeo operacionalmente ligado com um primeiro promotor e um polinucleotídeo operacionalmente ligado com um segundo promotor sejam expressos pela célula para produzir (i) uma cadeia pesada de anticorpo ou um conjugado de cadeia pesada de anticorpo codificado pelo polinucleotídeo; e (ii) uma cadeia leve de anticorpo, um conjugado de cadeia leve de anticorpo ou uma proteína de fusão codificada pelo polinucleotídeo.[146] Also provided herein is a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising culturing a cell ex vivo provided herein under conditions such that a polynucleotide operatively linked with a first promoter and a polynucleotide operatively linked with a second promoter are expressed by the cell to produce (i) an antibody heavy chain or an antibody heavy chain conjugate encoded by the polynucleotide; and (ii) an antibody light chain, an antibody light chain conjugate, or a fusion protein encoded by the polynucleotide.

[147] É também fornecido no presente documento uma composição farmacêutica que compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento, um conjugado de anticorpo fornecido no presente documento, um anticorpo biespecífico fornecido no presente documento, um conjugado de anticorpo biespecífico fornecido no presente documento, um scFv, um conjugado de scFv fornecido no presente documento, um CAR fornecido no presente documento, uma cadeia pesada de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, fornecida no presente documento, um conjugado de cadeia pesada de anticorpo fornecido no presente documento, uma cadeia leve de anticorpo, ou porção de ligação com antígeno da mesma, fornecida no presente documento, um conjugado de cadeia leve de anticorpo fornecido no presente documento, uma proteína de fusão fornecida no presente documento ou uma célula T fornecida no presente documento; e um carreador farmaceuticamente aceitável.[147] Also provided herein is a pharmaceutical composition comprising: a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein, an antibody conjugate provided herein, a bispecific antibody provided herein, a bispecific antibody conjugate provided herein, a scFv, a scFv conjugate provided herein, a CAR provided herein, an antibody heavy chain, or antigen-binding portion thereof, provided herein, an antibody heavy chain conjugate provided herein, an antibody light chain, or antigen-binding portion thereof, provided herein, an antibody light chain conjugate provided herein, a fusion protein provided herein, or a T cell provided herein; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[148] É também fornecido no presente documento um método para tratamento de câncer em um paciente que necessita do mesmo que compreende administrar ao dito paciente a composição farmacêutica fornecida no presente documento. Em certas modalidades, o câncer é um câncer do pulmão, do pâncreas, da mama, do útero, da trompa de falópio ou do peritônio primário. Em certas modalidades, o câncer é um câncer do ovário. Em certas modalidades, o paciente é um paciente humano. Em modalidades específicas, o método é um método de terapia de combinação que compreende adicionalmente administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional ao paciente.[148] Also provided herein is a method for treating cancer in a patient in need thereof comprising administering to said patient the pharmaceutical composition provided herein. In certain embodiments, the cancer is a cancer of the lung, pancreas, breast, uterus, fallopian tube, or primary peritoneum. In certain embodiments, the cancer is an ovarian cancer. In certain embodiments, the patient is a human patient. In specific embodiments, the method is a combination therapy method further comprising administering a therapeutically effective amount of an additional therapeutic agent to the patient.

[149] Em uma modalidade específica do método de terapia de combinação, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um primeiro anticorpo que é um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1806 N-glicosilado da SEQ ID NO: 150, mas não compreende Asn1800 N-glicosilado da SEQ ID NO: 150, em que o agente terapêutico adicional é um segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, em que o segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1806 N-glicosilado da SEQ ID NO: 150 e também compreende Asn1800 N-glicosilado da SEQ ID NO: 150. Em uma modalidade específica, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma de MUC16 é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) sua carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, sendo que a terceira forma é glicosilada, em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, sendo que a quarta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é a SEQ ID NO: 152, e em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma de MUC16 são do mesmo tipo de célula, e em que o segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; e (ii) sua carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma quinta forma de MUC16, sendo que a quinta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quinta forma é a SEQ ID NO: 172, em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é o mesmo tipo de célula que a célula que expressa de maneira recombinante a quinta forma de MUC16.[149] In a specific embodiment of the combination therapy method, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a first antibody that is an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1806 of SEQ ID NO: 150 but does not comprise N-glycosylated Asn1800 of SEQ ID NO: 150, wherein the additional therapeutic agent is a second antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1806 of SEQ ID NO: 150 and also comprises N-glycosylated Asn1800 of SEQ ID NO: 150. In a specific embodiment, the first antibody or antigen-binding fragment thereof is identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form of MUC16 is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a third form of MUC16, wherein the third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a fourth form of MUC16, wherein the fourth form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152, and wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16, the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, and the cell that recombinantly expresses the fourth form of MUC16 are of the same cell type, and wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof is identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; and (ii) its lack of immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a fifth form of MUC16, wherein the fifth form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fifth form is SEQ ID NO: 172, wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16 is the same cell type as the cell that recombinantly expresses the fifth form of MUC16.

[150] Em uma modalidade específica do método de terapia de combinação, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que é um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1806 N- glicosilado da SEQ ID NO: 150, mas não compreende Asn1800 N- glicosilado da SEQ ID NO: 150, em que o agente terapêutico adicional é uma quantidade terapeuticamente eficaz de um segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, em que o segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1800 N- glicosilado da SEQ ID NO: 150, mas não compreende Asn1806 N- glicosilado da SEQ ID NO: 150. Em uma modalidade específica, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma de MUC16 é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) sua carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, sendo que a terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, sendo que a quarta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é a SEQ ID NO: 152, em que a célula que expressade maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula queexpressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma deMUC16 são do mesmo tipo de célula, e em que o segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é identificado por(i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, sendo que a terceira forma de MUC16 é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) sua carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é a SEQ ID NO: 152; e em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma de MUC16 são do mesmo tipo de célula.[150] In a specific embodiment of the combination therapy method, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a first antibody or antigen-binding fragment thereof that is an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1806 of SEQ ID NO: 150, but does not comprise N-glycosylated Asn1800 of SEQ ID NO: 150, wherein the additional therapeutic agent is a therapeutically effective amount of a second antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1800 of SEQ ID NO: 150, but does not comprise N-glycosylated Asn1806 of SEQ ID NO: 150. In a specific embodiment, the first antibody or antigen-binding fragment thereof is identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, wherein the first form of MUC16 is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its lack of immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a third form of MUC16, wherein the third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a fourth form of MUC16, wherein the fourth form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152, wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16, the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, and the cell that recombinantly expresses the fourth form of MUC16 are of the same cell type, and wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof is identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a third form of MUC16, wherein the third form of MUC16 is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its lack of immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a fourth form of MUC16, wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152; and wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16, the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, and the cell that recombinantly expresses the fourth form of MUC16 are of the same cell type.

[151] É também fornecido no presente documento um glicopeptídeo imunogênico que compreende um ou mais locais de glicosilação, em que (i) o glicopeptídeo imunogênico tem 10 a 60 resíduos de aminoácido, 10 a 30 resíduos de aminoácido, 15 a 25 resíduos de aminoácido, 15 a 20 resíduos de aminoácido ou 15 a 18 resíduos de aminoácido em comprimento, e (ii) pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação é ligado com um carboidrato. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um, dois ou três locais de glicosilação. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado com um carboidrato. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com um carboidrato. Em certas modalidades, o carboidrato é um carboidrato ligado com N ou O. Em certas modalidades, o carboidrato é um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um tetrassacarídeo ou um pentassacarídeo. Em certas modalidades, o carboidrato é um dissacarídeo. Em certas modalidades, o dissacarídeo é uma chitobiose.[151] Also provided herein is an immunogenic glycopeptide comprising one or more glycosylation sites, wherein (i) the immunogenic glycopeptide is 10 to 60 amino acid residues, 10 to 30 amino acid residues, 15 to 25 amino acid residues, 15 to 20 amino acid residues, or 15 to 18 amino acid residues in length, and (ii) at least one of the one or more glycosylation sites is linked with a carbohydrate. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises one, two, or three glycosylation sites. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises one glycosylation site that is linked with a carbohydrate. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked with a carbohydrate. In certain embodiments, the carbohydrate is an N- or O-linked carbohydrate. In certain embodiments, the carbohydrate is a monosaccharide, a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, or a pentasaccharide. In certain embodiments, the carbohydrate is a disaccharide. In certain embodiments, the disaccharide is a chitobiose.

[152] Em certas modalidades, a terminação N do glicopeptídeo imunogênico é acetilada. Em certas modalidades, a terminação C do glicopeptídeo está na forma de um derivado de N- metilcarboxamida. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico é conjugado com uma proteína de carreador imunogênico. Em certas modalidades, a proteína de carreador imunogênico é hemocianina do molusco keyhole limpet.[152] In certain embodiments, the N-terminus of the immunogenic glycopeptide is acetylated. In certain embodiments, the C-terminus of the glycopeptide is in the form of an N-methylcarboxamide derivative. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is conjugated to an immunogenic carrier protein. In certain embodiments, the immunogenic carrier protein is keyhole limpet hemocyanin.

[153] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 18 resíduos de aminoácido em comprimento. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado com uma chitobiose. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com uma chitobiose.[153] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 to 18 amino acid residues in length. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises one glycosylation site that is linked with a chitobiose. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked with a chitobiose.

[154] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 18 resíduos de aminoácido em comprimento. Em certas modalidades, os glicopeptídeos imunogênicos compreendem dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com uma chitobiose.[154] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is 18 amino acid residues in length. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptides comprise two glycosylation sites that are each linked with a chitobiose.

[155] Em certas modalidades, os glicopeptídeos imunogênicos têm 15 resíduos de aminoácido em comprimento. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado com uma chitobiose.[155] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptides are 15 amino acid residues in length. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site that is linked with a chitobiose.

[156] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende pelo menos uma porção de 10 aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 150, em que pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação está na dita porção da sequência de aminoácidos.[156] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises at least a 10 amino acid portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150, wherein at least one of the one or more glycosylation sites is in said portion of the amino acid sequence.

[157] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129.[157] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129.

[158] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação no 30o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 129 que está ligado com uma chitobiose.[158] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site at the 30th residue (Asn) of SEQ ID NO: 129 that is linked with a chitobiose.

[159] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação no 30o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 129 que está ligado com uma porção química de Man3GlcNAc2.[159] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site at the 30th residue (Asn) of SEQ ID NO: 129 that is linked with a Man3GlcNAc2 moiety.

[160] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130. Em certas modalidades, os glicopeptídeos imunogênicos compreendem dois locais de glicosilação no 4o resíduo (Asn) e no 10o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 130 que estão, cada um, ligados com uma chitobiose.[160] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptides comprises two glycosylation sites at the 4th residue (Asn) and the 10th residue (Asn) of SEQ ID NO: 130 that are each linked with a chitobiose.

[161] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131. Em certas modalidades, os glicopeptídeos imunogênicos compreendem um local de glicosilação no 7o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 131que está ligado com uma chitobiose.[161] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptides comprises a glycosylation site at the 7th residue (Asn) of SEQ ID NO: 131 that is linked with a chitobiose.

[162] É também fornecido no presente documento um método para gerar um anticorpo ou um fragmento de ligação com antígenodo mesmo que se liga especificamente com uma glicol-proteína que compreende imunizar um indivíduo com um glicopeptídeo imunogênico que compreende um ou mais locais de glicosilação, em que (i) o glicopeptídeo imunogênico tem 10 a 60 resíduos de aminoácido, 10 a 30 resíduos de aminoácido, 15 a 25 resíduos de aminoácido, 15 a 20 resíduos de aminoácido ou 15 a 18 resíduosde aminoácido em comprimento, (ii) o glicopeptídeo imunogênico compreende pelo menos uma porção de 10 aminoácidos da sequênciade aminoácidos da glicoproteína, (iii) pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação está ligado com um carboidrato e (iv) pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação está na dita porção da sequência de aminoácidos. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno domesmo carece de ligação específica com uma forma não glicosiladada glicoproteína. Em certas modalidades, o indivíduo é uma cabra, uma ovelha, um burro, uma galinha, um porquinho-da-índia, um rato, um coelho ou um camundongo. Em certas modalidades, o indivíduo é um rato, um coelho ou um camundongo. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um camundongo. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um, dois ou três locais de glicosilação. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 190 a 195, em que o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que está ligado com um carboidrato. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com um carboidrato. Em certas modalidades, o carboidrato é um carboidrato ligado com N ou O. Em certas modalidades, o carboidrato é um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um tetrassacarídeo ou um pentassacarídeo. Em certas modalidades, o carboidrato é um dissacarídeo. Em certas modalidades, o dissacarídeo é uma chitobiose. Em certas modalidades, a terminação N do glicopeptídeo imunogênico é acetilada. Em certas modalidades, a terminação C do glicopeptídeo está na forma de um derivado de N- metilcarboxamida. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico é conjugado com uma proteína de carreador imunogênico. Em certas modalidades, a proteína de carreador imunogênico é hemocianina do molusco keyhole limpet. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 18 resíduos de aminoácido em comprimento. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado com uma chitobiose. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com uma chitobiose. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 18 resíduos de aminoácido em comprimento. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com uma chitobiose. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 resíduos de aminoácido em comprimento. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado com uma chitobiose. Em certas modalidades, a glicoproteína compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 150. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação no 30o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 129 que está ligado com uma chitobiose. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação no 30o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 129 que está ligado com uma porção química de Man3GlcNAc2. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130. Em certas modalidades, o glicopeptídeoimunogênico compreende dois locais de glicosilação no 4o resíduo (Asn) e no 10o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 130 que estão, cada um, ligados com uma chitobiose. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131. Em certas modalidades, o glicopeptídeoimunogênico compreende um local de glicosilação no 7o resíduo (Asn) da SEQ ID NO: 131 que está ligado com uma chitobiose.[162] Also provided herein is a method for generating an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a glycoprotein comprising immunizing a subject with an immunogenic glycopeptide comprising one or more glycosylation sites, wherein (i) the immunogenic glycopeptide is 10 to 60 amino acid residues, 10 to 30 amino acid residues, 15 to 25 amino acid residues, 15 to 20 amino acid residues, or 15 to 18 amino acid residues in length, (ii) the immunogenic glycopeptide comprises at least a 10 amino acid portion of the amino acid sequence of the glycoprotein, (iii) at least one of the one or more glycosylation sites is linked with a carbohydrate, and (iv) at least one of the one or more glycosylation sites is in said portion of the amino acid sequence. In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof lacks specific binding to a non-glycosylated form of the glycoprotein. In certain embodiments, the individual is a goat, a sheep, a donkey, a chicken, a guinea pig, a rat, a rabbit, or a mouse. In certain embodiments, the individual is a rat, a rabbit, or a mouse. In certain embodiments, the individual is a mouse. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises one, two, or three glycosylation sites. The method of any one of claims 190 to 195, wherein the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site that is linked to a carbohydrate. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked to a carbohydrate. In certain embodiments, the carbohydrate is an N- or O-linked carbohydrate. In certain embodiments, the carbohydrate is a monosaccharide, a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, or a pentasaccharide. In certain embodiments, the carbohydrate is a disaccharide. In certain embodiments, the disaccharide is a chitobiose. In certain embodiments, the N-terminus of the immunogenic glycopeptide is acetylated. In certain embodiments, the C-terminus of the glycopeptide is in the form of an N-methylcarboxamide derivative. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is conjugated to an immunogenic carrier protein. In certain embodiments, the immunogenic carrier protein is hemocyanin from the keyhole limpet mollusk. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 to 18 amino acid residues in length. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site that is linked to a chitobiose. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked to a chitobiose. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is 18 amino acid residues in length. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked to a chitobiose. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 amino acid residues in length. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site that is linked to a chitobiose. In certain embodiments, the glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site at the 30th residue (Asn) of SEQ ID NO: 129 that is linked with a chitobiose. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site at the 30th residue (Asn) of SEQ ID NO: 129 that is linked with a Man3GlcNAc2 moiety. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites at the 4th residue (Asn) and the 10th residue (Asn) of SEQ ID NO: 130 that are each linked with a chitobiose. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site at the 7th residue (Asn) of SEQ ID NO: 131 that is linked with a chitobiose.

[163] São também fornecidos no presente documento anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos que se ligam imunoespecificamente com MUC16 e que têm sequências de VH, VL, CDR de VH e/ou CDR de VL de um anticorpo descrito no presente documento (por exemplo, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6), assimcomo conjugados (por exemplo, para agentes de imagem ou citotóxicos) do mesmo.[163] Also provided herein are antibodies and antigen-binding fragments thereof that immunospecifically bind to MUC16 and that have VH, VL, VH CDR, and/or VL CDR sequences of an antibody described herein (e.g., 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6), as well as conjugates (e.g., to imaging or cytotoxic agents) thereof.

4. BRIEF DESCRIPTIONS OF THE FIGURES

[164] Figura 1A à Figura 1I. Construtos de MUC16. Figura 1A: Ilustração esquemática de MUC16. Figura 1B: Parte Superior:Ilustração esquemática de MUC16c344. Parte inferior:Representação linear do construto de MUC16c344 truncado. A sequência de aminoácidos da terminação N da primeira repetiçãoem tandem é conforme apresentado na SEQ ID NO: 155. A sequênciade aminoácidos da terminação C da primeira repetição em tandem é conforme apresentado na SEQ ID NO: 156. A sequência deaminoácidos da terminação N do ectodomínio é conforme apresentado na SEQ ID NO: 157. A sequência de aminoácidos da terminação C do ectodomínio é conforme apresentado na SEQ ID NO: 158. Figura 1C: Parte Superior: Ilustração esquemática deMUC16c114. Parte inferior: Representação linear de MUC16c114. A sequência de aminoácidos do ectodomínio é conforme apresentado na SEQ ID NO: 161. A sequência de aminoácidos da transmembrana é conforme apresentado na SEQ ID NO: 159. A sequência de aminoácidos para a cauda citoplasmática é conforme apresentado na SEQ ID NO: 160. Figura 1D: Parte Superior: Ilustração esquemática de MUC16c80. Parte inferior: Representação linear da MUC16c80. A sequência de aminoácidos do ectodomínio é conforme apresentado na SEQ ID NO: 162. A sequência de aminoácidos da transmembrana é conforme apresentado na SEQ ID NO: 159. A sequência de aminoácidos da cauda citoplasmática é conforme apresentado na SEQ ID NO: 159. Figura 1E: Parte Superior:Ilustração esquemática de MUC16c86. Parte inferior: Representação linear da MUC16c86. A sequência de aminoácidos do ectodomínio é conforme apresentado na SEQ ID NO: 163. A sequência de aminoácidos do domínio transmembranar é conforme apresentado na SEQ NO: 164. A sequência de aminoácidos do domínio citoplasmático é a SEQ ID NO: 165. Figura 1F: Representação linear da MUC16c114- N123. A sequência de aminoácidos de Ectodomínio 3(N^A)Mutado 58 aa é conforme apresentado na SEQ ID NO: 166. A sequência de aminoácidos do domínio transmembranar é conforme apresentado na SEQ ID NO: 159. A sequência de aminoácidos do domíniocitoplasmático é conforme apresentado na SEQ ID NO: 160. A Figura 1G, a Figura 1H e a Figura 1I representam a porcentagem decélulas detectadas por 4H11 por meio de análise FACS, em que as linhagens celulares expressam os construtos de MUC16 indicados.[164] Figure 1A to Figure 1I. MUC16 Constructs. Figure 1A: Schematic illustration of MUC16. Figure 1B: Top: Schematic illustration of MUC16c344. Bottom: Linear representation of the truncated MUC16c344 construct. The amino acid sequence of the N-terminus of the first tandem repeat is as shown in SEQ ID NO: 155. The amino acid sequence of the C-terminus of the first tandem repeat is as shown in SEQ ID NO: 156. The amino acid sequence of the N-terminus of the ectodomain is as shown in SEQ ID NO: 157. The amino acid sequence of the C-terminus of the ectodomain is as shown in SEQ ID NO: 158. Figure 1C: Top: Schematic illustration of MUC16c114. Bottom: Linear representation of MUC16c114. The amino acid sequence of the ectodomain is as shown in SEQ ID NO: 161. The amino acid sequence of the transmembrane is as shown in SEQ ID NO: 159. The amino acid sequence for the cytoplasmic tail is as shown in SEQ ID NO: 160. Figure 1D: Top: Schematic illustration of MUC16c80. Bottom: Linear representation of MUC16c80. The amino acid sequence of the ectodomain is as shown in SEQ ID NO: 162. The amino acid sequence of the transmembrane is as shown in SEQ ID NO: 159. The amino acid sequence of the cytoplasmic tail is as shown in SEQ ID NO: 159. Figure 1E: Top: Schematic illustration of MUC16c86. Bottom: Linear representation of MUC16c86. The amino acid sequence of the ectodomain is as shown in SEQ ID NO: 163. The amino acid sequence of the transmembrane domain is as shown in SEQ NO: 164. The amino acid sequence of the cytoplasmic domain is SEQ ID NO: 165. Figure 1F: Linear representation of MUC16c114-N123. The amino acid sequence of Mutated Ectodomain 3(N^A) 58 aa is as shown in SEQ ID NO: 166. The amino acid sequence of the transmembrane domain is as shown in SEQ ID NO: 159. The amino acid sequence of the cytoplasmic domain is as shown in SEQ ID NO: 160. Figure 1G, Figure 1H, and Figure 1I represent the percentage of cells detected by 4H11 via FACS analysis in which the cell lines express the indicated MUC16 constructs.

[165] Figura 2A à Figura 2C. Curvas de crescimento in vitropara transfectantes de MUC16. A Figura 2A representa curvas decrescimento in vitro para linhagens celulares de MUC16c114 eMUC16c344, em comparação com a linhagem celular de controle(phrGFP), em células 3T3. A Figura 2B representa curvas decrescimento in vitro para linhagens celulares de MUC16c114 eMUC16c344, em comparação com a linhagem celular de controle(phrGFP), em células A2780. A Figura 2C representa curvas de crescimento in vitro para linhagens celulares de MUC16c114, MUC16c80 e MUC16c86, em comparação com a linhagem celular de controle (phrGFP), em células 3T3.[165] Figure 2A to Figure 2C. In vitro growth curves for MUC16 transfectants. Figure 2A represents in vitro growth curves for MUC16c114 and MUC16c344 cell lines compared with the control cell line (phrGFP) in 3T3 cells. Figure 2B represents in vitro growth curves for MUC16c114 and MUC16c344 cell lines compared with the control cell line (phrGFP) in A2780 cells. Figure 2C represents in vitro growth curves for MUC16c114, MUC16c80, and MUC16c86 cell lines compared with the control cell line (phrGFP) in 3T3 cells.

[166] Figura 3A à Figura 3E. Efeito de MUC16 em células 3T3. A Figura 3A representa o crescimento em ágar macio de transfectantes de 3T3 em placas de 60 mm. Após 14 dias, as colônias foram contadas e plotadas. Os dados mostrados na tabela representam um de três experimentos similares (*** p < 0,0001) em comparação com crescimento em ágar macio de células que expressam o vetor de controle de phrGFP. A Figura 3B representa o ensaio de invasão de matrigel para linhagens de células 3T3 após transfecções estáveis com vetor de controle phrGFP ou com construtos de terminação carbóxi de MUC16c114 ou MUC16c344. Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata e contado manualmente. Ambas as linhagens celulares de MUC16c114 e MUC16c344 foram significativamente mais invasivas (*** p < 0,0001) emcomparação com a invasão de células que expressam o controle de vetor phrGFP e os resultados com a linhagem celular de MUC16c344 foram significativamente diferentes dos resultados com a linhagem celular de MUC16c114 ((# p=0,0354). A Figura 3Crepresenta a expressão de genes de metástase e invasão induzidos por expressão de MUC16c114 e MUC16c344. Um painel SuperArray de 80 transcritos de gene de invasão/metástase foi examinado para linhagens celulares positivas para construto de MUC16 e apenas de vetor. A expressão de transcritos quimiotáticos, de adesão ede invasão selecionados foi medida em linhagens celulares de 3T3 MUC16c114 ou 3T3-MUC16c344 (cada uma das três triplicatas foiexaminada em duplicata e comparada com os controles apenas de vetor phr por teste de qui-quadrado). O valor de p para cada transcrito, ajustado para medidas repetidas, é mostrado natabela. Todos os genes com alterações no p < 0,05 ou nível abaixoestão incluídos. Figura 3D: Células 3T3 transfectadas foramexaminadas quanto à ativação das trajetórias de sinalização de ERK/AKT em comparação com os controles apenas de vetor. A fosforilação de ERK1/2 (pT202/Y204) e AKT (S473) foi aumentada após a expressão dos construtos de MUC16c114 e MUC16c344, em comparação com a expressão do vetor phr. A ativação de ambas as trajetórias foi vista em cada uma das linhagens celulares. Os valores de quantificação por densitometria normalizados de B- actina são mostrados abaixo de cada western blot na figura. A Figura 3E representa o crescimento tumoral positivo para construto de MUC16 em camundongos nude atímicos. Dois milhões de células tumorais foram introduzidos no flanco de 15 camundongos nu/nu, e os camundongos foram observados quanto à formação de tumor. Os tumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. As diferenças em volume tumoral médio foram significativamente maiores para camundongos que portam tumores positivos para construto de MUC16 (ambas as linhagens p < 0,0001 em comparação com células que expressam o vetor de controle phrGFP).[166] Figure 3A to Figure 3E. Effect of MUC16 on 3T3 cells. Figure 3A represents soft agar growth of 3T3 transfectants in 60 mm dishes. After 14 days, colonies were counted and plotted. The data shown in the table represent one of three similar experiments (***p < 0.0001) compared to soft agar growth of cells expressing the phrGFP control vector. Figure 3B represents the matrigel invasion assay for 3T3 cell lines after stable transfections with phrGFP control vector or with carboxy-terminal constructs of MUC16c114 or MUC16c344. Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. Both MUC16c114 and MUC16c344 cell lines were significantly more invasive (***p < 0.0001) compared to the invasion of cells expressing the phrGFP vector control, and the results with the MUC16c344 cell line were significantly different from the results with the MUC16c114 cell line (#p = 0.0354). Figure 3C represents the expression of metastasis and invasion genes induced by MUC16c114 and MUC16c344 expression. A SuperArray panel of 80 invasion/metastasis gene transcripts was examined for MUC16 construct-positive and vector-only cell lines. Expression of selected chemotactic, adhesion, and invasion transcripts was measured in 3T3 MUC16c114 or 3T3-MUC16c344 cell lines (each One of the three triplicates was examined in duplicate and compared with the phr vector-only controls by chi-square test). The p-value for each transcript, adjusted for repeated measures, is shown in the table. All genes with fold changes at p < 0.05 or below are included. Figure 3D: Transfected 3T3 cells were examined for activation of the ERK/AKT signaling pathways compared with the vector-only controls. Phosphorylation of ERK1/2 (pT202/Y204) and AKT (S473) was increased following expression of the MUC16c114 and MUC16c344 constructs, compared with phr vector expression. Activation of both pathways was seen in each of the cell lines. Normalized densitometry quantification values of β-actin are shown below each western blot in the figure. Figure 3E depicts tumor growth positive for MUC16 construct in athymic nude mice. Two million tumor cells were introduced into the flanks of 15 nu/nu mice, and the mice were observed for tumor formation. Tumors were measured with calipers twice a week. Differences in mean tumor volume were significantly greater for mice bearing MUC16 construct-positive tumors (both lines p < 0.0001 compared with cells expressing the phrGFP control vector).

[167] Figura 4A à Figura 4C. Propriedades oncogênicas de fragmentos de MUC16. A Figura 4A representa o ensaio de invasão de matrigel para linhagens celulares A2780 transfectadas com vetor de controle phrGFP ou com vetores de expressão de terminação carbóxi de MUC16, MUC16c114 ou MUC16c344. Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata e contado manualmente. Os resultados foram comparados com invasão de matrigel de células que expressam vetor de controle phrGFP ou MUC16c114. As linhagens celulares de MUC16c114 ou MUC16c34 mostraram invasão de matrigel significativa em relação ao controle de vetor phrGFP, e os resultados com a linhagem celular de MUC16c344 foram significativamente diferentes dos resultados com a linhagem celular MUC16c114 (##p=0,0018). A Figura 4B representa o efeito de expressão de MUC16 sobre a sinalização de ERK/AKT. As células A2780 foram examinadas quanto à ativação das trajetórias de sinalização de ERK/AKT. A fosforilação de ERK1/2 (pT202/Y204) e AKT (S473) foi aumentada após a expressão de cada um dos construtos de expressão de MUC16. Ambas as trajetórias foram ativadas em cada uma das linhagens celulares. Os valores de quantificação por densitometria normalizados de β-actina são mostrados abaixo de cada western blot na figura. A Figura 4C representa o crescimento tumoral positivo para construto de MUC16 em camundongos nude atímicos. Dois milhões de células tumorais foram introduzidos no flanco de 15 camundongos nu/nu, e os camundongos foram observados quanto à formação de tumor. Os tumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. As diferenças em volume tumoral médio foram significativamente maiores para camundongos que portam qualquer um dos tumores positivos para MUC16c114 ou MUC16c344 no dia 28, conforme indicado na figura.[167] Figure 4A to Figure 4C. Oncogenic properties of MUC16 fragments. Figure 4A depicts the matrigel invasion assay for A2780 cell lines transfected with phrGFP control vector or with carboxy-terminal expression vectors of MUC16, MUC16c114, or MUC16c344. Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. The results were compared with matrigel invasion of cells expressing phrGFP control vector or MUC16c114. The MUC16c114 or MUC16c34 cell lines showed significant matrigel invasion relative to the phrGFP vector control, and the results with the MUC16c344 cell line were significantly different from the results with the MUC16c114 cell line (##p=0.0018). Figure 4B depicts the effect of MUC16 expression on ERK/AKT signaling. A2780 cells were examined for activation of the ERK/AKT signaling pathways. Phosphorylation of ERK1/2 (pT202/Y204) and AKT (S473) was increased following expression of each of the MUC16 expression constructs. Both pathways were activated in each of the cell lines. Normalized densitometry quantification values of β-actin are shown below each Western blot in the figure. Figure 4C depicts MUC16 construct-positive tumor growth in athymic nude mice. Two million tumor cells were introduced into the flank of 15 nu/nu mice, and the mice were observed for tumor formation. Tumors were measured by calipers twice a week. Differences in mean tumor volume were significantly greater for mice bearing either MUC16c114- or MUC16c344-positive tumors at day 28, as indicated in the figure.

[168] Figura 5A à Figura 5D: Efeitos de variantes de MUC16c114 truncadas. Figura 5A: Crescimento em ágar macio. Os transfectantes de 3T3 que expressam porções de domínio interno ou externo de MUC16c114 foram colocados em camadas em ágar macio, conforme descrito na Seção 6.1.2. As colônias foram contadas e plotadas. Os dados mostrados representam um de três experimentos. As taxas de crescimento em ágar macio para MUC16c80 e MUC16c86 foram significativamente diferentes em comparação com a taxa de crescimento para MUC16c114 (# p =0,0111 e ## p=0,0258, respectivamente), enquanto um nível mais alto de significância foi visto com a taxa de crescimento para transfectante de MUC1680 em comparação com a taxa de crescimento para transfectante de MUC16c86 (### p < 0,0001). A Figura 5B representa o ensaio de invasão de matrigel para linhagens celulares 3T3 transfectadas com vetor de controle phrGFP ou com construtos de terminação carbóxi de MUC16. Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata e contado manualmente. A invasão das células transfectantes de MUC16c80 foi significativa (# p=0,0172) em comparação com a invasão da linhagem celular de MUC16c114. A Figura 5C representa o efeito de expressão de MUC16 sobre a sinalização de ERK/AKT. As células 3T3 transfectadas foram examinadas para ativação das trajetórias de sinalização de ERK/AKT. A fosforilação de ERK1/2 (pT202/Y204) e AKT (S473) foi aumentada após MUC16c114; no entanto, os sinais foram mais baixos em células transfectadas com construtos de MUC16c80 ou MUC16c86. Os valores de quantificação por densitometria normalizados de β- actina são mostrados abaixo de cada western blot na figura. A Figura 5D representa o crescimento tumoral positivo para construto de MUC16 em camundongos nude atímicos. Dois milhões de células tumorais foram introduzidos no flanco de 20 camundongos nu/nu, e os camundongos foram observados quanto à formação de tumor. Os tumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. As diferenças em volume tumoral médio foram significativamente maiores para camundongos que portam tumores MUC16+. Os transfectantes de 3T3 MUC16c114 e 3T3 MUC16c86 foram significativamente diferentes em comparação com ostransfectantes de MUC16c80 (### p < 0,0001).[168] Figure 5A to Figure 5D: Effects of truncated MUC16c114 variants. Figure 5A: Growth in soft agar. 3T3 transfectants expressing either internal or external domain portions of MUC16c114 were layered on soft agar as described in Section 6.1.2. Colonies were counted and plotted. Data shown represent one of three experiments. Growth rates in soft agar for MUC16c80 and MUC16c86 were significantly different compared to the growth rate for MUC16c114 (# p = 0.0111 and ## p = 0.0258, respectively), while a higher level of significance was seen with the growth rate for MUC1680 transfectant compared to the growth rate for MUC16c86 transfectant (### p < 0.0001). Figure 5B depicts the matrigel invasion assay for 3T3 cell lines transfected with phrGFP control vector or MUC16 carboxy-terminal constructs. Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. The invasion of the MUC16c80 transfectant cells was significant (# p=0.0172) compared to the invasion of the MUC16c114 cell line. Figure 5C depicts the effect of MUC16 expression on ERK/AKT signaling. Transfected 3T3 cells were examined for activation of ERK/AKT signaling pathways. Phosphorylation of ERK1/2 (pT202/Y204) and AKT (S473) was increased after MUC16c114; however, the signals were lower in cells transfected with MUC16c80 or MUC16c86 constructs. Normalized β-actin densitometry quantification values are shown below each Western blot in the figure. Figure 5D depicts MUC16 construct-positive tumor growth in athymic nude mice. Two million tumor cells were introduced into the flanks of 20 nu/nu mice, and the mice were observed for tumor formation. Tumors were measured by calipers twice weekly. Differences in mean tumor volume were significantly greater for mice bearing MUC16+ tumors. 3T3 MUC16c114 and 3T3 MUC16c86 transfectants were significantly different compared to MUC16c80 transfectants (### p < 0.0001).

[169] Figura 6A à Figura 6B. Sequência de aminoácidos para MUC16c114 (resíduos de aminoácido 1.777 a 1.890 (SEQ ID NO: 133), Figura 6A) e MUC16c344 (resíduos de aminoácido 1.547 a 1.890 (SEQ ID NO: 132), Figura 6B). Os locais de N- e O-glicosilação são destacados e o domínio transmembranar (resíduos de aminoácido 1.835 a 1.859) é sublinhado e identificado como “DomínioTransmembranar”. Os resíduos de aminoácido 1.857 a 1.884representam a deleção de domínio interno de 28 aminoácidos presente no construto de MUC16c86 (consultar a Figura 1). Osresíduos de aminoácido 1.798 a 1.831 representam a deleção de ectodomínio de 34 aminoácidos presente no construto de MUC16c80 (consultar a Figura 1).[169] Figure 6A to Figure 6B. Amino acid sequence for MUC16c114 (amino acid residues 1777 to 1890 (SEQ ID NO: 133), Figure 6A) and MUC16c344 (amino acid residues 1547 to 1890 (SEQ ID NO: 132), Figure 6B). The N- and O-glycosylation sites are highlighted and the transmembrane domain (amino acid residues 1835 to 1859) is underlined and labeled “TransmembraneDomain”. Amino acid residues 1857 to 1884 represent the 28-amino acid internal domain deletion present in the MUC16c86 construct (see Figure 1). Amino acid residues 1,798 to 1,831 represent the 34-amino acid ectodomain deletion present in the MUC16c80 construct (see Figure 1).

[170] Figura 7A à Figura 7H. Efeito de N-glicosilação sobre a transformação de MUC16. A Figura 7A representa o ensaio de invasão de matrigel para linhagens celulares 3T3 transfectadas com vetor de controle phrGFP ou MUC16c114 ou MUC16c114-N123 e MUC16c114 tratado com 0,1 μg/ml de Tunicamicina. Os resultados com alinhagem celular de MUC16c114 foram significativamente diferentes (### p < 0,0001) dos resultados com a linhagem celular decontrole de vetor phrGFP. Os resultados com a linhagem celular de MUC16c114-N123 foram significativamente diferentes (** p=0,007) em comparação com os resultados com a linhagem celular de controle de vetor phrGFP. O tratamento com o inibidor de N-glicosilação Tunicamicina inibiu significativamente a invasão de matrigel em comparação com o MUC16c114 não tratado (p=0,004). AFigura 7B representa o ensaio de invasão de matrigel para linhagens celulares transfectadas 3T3 em comparação com o vetor de controle phrGFP. As células 3T3 transfectadas com MUC16c114 foram tratadas com meio apenas ou tratadas com 5 μg/ml de proteína de fusão pFUSE hIgG1-Fc2 de controle, ou com 5 μg/ml de proteína de fusão MUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2 ou com 5 μg/ml de proteína de fusão 117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 conforme detalhado na Figura 8. A linhagem celular de MUC16c114 foi muito mais invasiva do que as células de controle 3T3 (*** p < 0,0001) queexpressam o controle de vetor phrGFP e a mesma não foi afetada pela exposição à proteína de apenas vetor pFUSE. Em contraste, a linhagem celular de MUC16c114 tratada com proteína de fusão MUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2 ou proteína de fusão 117-244LGALS3- pFUSE hIgG1-Fc2 demonstrou inibição significativa de invasão de matrigel em comparação com células de controle de MUC16c114. A Figura 7C representa o efeito de expressão de MUC16 sobre a sinalização de ERK/AKT. As células 3T3 transfectadas foram também examinadas para ativação das trajetórias de sinalização de ERK/AKT. A fosforilação de ERK1/2 (pT202/Y204) e AKT (S473) foi aumentada na 3T3 transfectada com MUC16c114; no entanto, o efeito foi diminuído em células 3T3 transfectadas com o vetor MUC16c114-N123 (“MUC16c114-N123” e “MUC163(N-->A)c114” são usados nopresente documento de forma intercambiável). A despeito das mutações, as 3 mutações de asparagina em alanina, western blot com um anticorpo anti-MUC16 (4H11 mAb) mostrou um sinal mais alto que o controle de vetor phrGFP ou as células transfectadas com MUC16c114 nativas, indicando que os altos níveis de proteína MUC163(N-->A)c114 são expressos nas células 3T3 transfectadas. Conforme usado no presente documento, “4H11” se refere aoanticorpo monoclonal anti-MUC16 designado como 4H11 em Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462 a 472 ena Publicação de Patente Internacional no WO 2011/119979. AFigura 7D representa o crescimento tumoral positivo paraconstruto de MUC16 em camundongos nude atímicos. Dois milhões de células tumorais foram introduzidos no flanco de 20 camundongos nu/nu, e os camundongos foram observados quanto à formação de tumor. Os tumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. As diferenças em volume tumoral médio foram significativamente maiores para camundongos que portam tumores MUC16c114 (p < 0,0001). Os resultados com o transfectante de 3T3- MUC16c114 foram altamente significativos em comparação com osresultados com a linhagem celular de vetor de controle phrGFP (*** p < 0,0001). Entretanto, os transfectantes de MUC16c114-N1233T3 não mostraram qualquer significância em relação às células 3T3 de controle de vetor phrGFP, indicando que as mutações de N- glicosilação diminuíram drasticamente o crescimento e invasão de tumor. A Figura 7E apresenta a representação linear do construto MUC16c57-114-pFUSE-human-IgG1-Fc2. A sequência de aminoácidos do ectodomínio é conforme apresentado na SEQ ID NO: 161. A Figura 7F representa os níveis proteicos de construto MUC16c57-114-pFUSE- humano-IgG1-Fc2 determinados pelos anticorpos indicados. AFigura 7G apresenta a representação linear do construto 117-244LGALS3-pFUSE-humano-IgG1-Fc2. A sequência de aminoácidos do domínio de ligação de açúcar é conforme apresentado na SEQ ID NO: 167. A Figura 7H representa os níveis proteicos de construto 17-244LGALS3-pFUSE-humano-IgG1-Fc2 determinados pelos anticorpos indicados.[170] Figure 7A to Figure 7H. Effect of N-glycosylation on MUC16 transformation. Figure 7A depicts the matrigel invasion assay for 3T3 cell lines transfected with phrGFP vector control or MUC16c114 or MUC16c114-N123 and MUC16c114 treated with 0.1 μg/ml Tunicamycin. The results with the MUC16c114 cell line were significantly different (### p < 0.0001) from the results with the phrGFP vector control cell line. The results with the MUC16c114-N123 cell line were significantly different (** p = 0.007) compared to the results with the phrGFP vector control cell line. Treatment with the N-glycosylation inhibitor Tunicamycin significantly inhibited matrigel invasion compared to untreated MUC16c114 (p=0.004). Figure 7B depicts the matrigel invasion assay for transfected 3T3 cell lines compared to the phrGFP control vector. MUC16c114-transfected 3T3 cells were treated with medium alone or treated with 5 μg/ml control pFUSE hIgG1-Fc2 fusion protein, or with 5 μg/ml MUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2 fusion protein, or with 5 μg/ml 117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 fusion protein as detailed in Figure 8. The MUC16c114 cell line was significantly more invasive than control 3T3 cells (***p < 0.0001) expressing the phrGFP vector control and was unaffected by exposure to pFUSE vector protein alone. In contrast, the MUC16c114 cell line treated with MUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2 fusion protein or 117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 fusion protein demonstrated significant inhibition of matrigel invasion compared with MUC16c114 control cells. Figure 7C depicts the effect of MUC16 expression on ERK/AKT signaling. Transfected 3T3 cells were also examined for activation of ERK/AKT signaling pathways. Phosphorylation of ERK1/2 (pT202/Y204) and AKT (S473) was increased in MUC16c114-transfected 3T3; however, the effect was diminished in 3T3 cells transfected with the MUC16c114-N123 vector (“MUC16c114-N123” and “MUC163(N-->A)c114” are used herein interchangeably). Despite the mutations, for the 3 asparagine to alanine mutations, western blot with an anti-MUC16 antibody (4H11 mAb) showed a higher signal than the phrGFP vector control or the native MUC16c114-transfected cells, indicating that high levels of MUC163(N-->A)c114 protein are expressed in the transfected 3T3 cells. As used herein, “4H11” refers to the anti-MUC16 monoclonal antibody designated as 4H11 in Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462–472 and in International Patent Publication No. WO 2011/119979. Figure 7D depicts MUC16 construct-positive tumor growth in athymic nude mice. Two million tumor cells were introduced into the flank of 20 nu/nu mice, and the mice were observed for tumor formation. Tumors were measured by calipers twice weekly. Differences in mean tumor volume were significantly greater for mice bearing MUC16c114 tumors (p < 0.0001). The results with the 3T3-MUC16c114 transfectant were highly significant compared with the results with the phrGFP vector control cell line (*** p < 0.0001). However, MUC16c114-N1233T3 transfectants did not show any significance relative to phrGFP vector control 3T3 cells, indicating that the N-glycosylation mutations dramatically decreased tumor growth and invasion. Figure 7E shows the linear representation of the MUC16c57-114-pFUSE-human-IgG1-Fc2 construct. The amino acid sequence of the ectodomain is as shown in SEQ ID NO: 161. Figure 7F depicts the protein levels of MUC16c57-114-pFUSE-human-IgG1-Fc2 construct determined by the indicated antibodies. Figure 7G shows the linear representation of the 117-244LGALS3-pFUSE-human-IgG1-Fc2 construct. The amino acid sequence of the sugar-binding domain is as shown in SEQ ID NO: 167. Figure 7H depicts the protein levels of construct 17-244LGALS3-pFUSE-human-IgG1-Fc2 determined by the indicated antibodies.

[171] Figura 8. Sequência para a sequência de aminoácidos de ectodomínio-MUC16c57->c114 (SEQ ID NO: 161; resíduos de aminoácido 1.777 a 1.834 de MUC16) inserida no vetor pFUSE-hIgG1-Fc2 para construir o MUC16c57-c114pFUSE como um receptor simulado e a sequência de aminoácidos de 117-244LGALS3 (SEQ ID NO: 167) inserida em pFUSE-hIgG1-Fc2, resultando no vetor 117-244LGALS3pFUSE.[171] Figure 8. Sequence for the amino acid sequence of ectodomain-MUC16c57->c114 (SEQ ID NO: 161; amino acid residues 1,777 to 1,834 of MUC16) inserted into the pFUSE-hIgG1-Fc2 vector to construct MUC16c57-c114pFUSE as a mimic receptor and the amino acid sequence of 117-244LGALS3 (SEQ ID NO: 167) inserted into pFUSE-hIgG1-Fc2, resulting in the 117-244LGALS3pFUSE vector.

[172] Figura 9A à Figura 9E. Camundongo transgênico MUC16c354. A Figura 9A representa a estratégia para o construto condicional MUC16c354. Um intensificador precoce de CMV mais o promotor de β actina de galinha (CAG) foram usados para acionar a transcrição de hrGFP entre dois loxPs e a sequência de MUC16c354 a jusante. Figura 9B: Southern blot mostra 12 candidatos de fundadores positivos de MUC16c354 entre 99 animais após o procedimento de microinjeção. Figura 9C: Western blot comanticorpo anti-MUC16, 4H11, foi usado para identificar fundadores 9 (~50 cópias) e 36 (~10 cópias) para desenvolvimento de colônia de camundongo de MUC16c354; A5 é um controle positivo de um SKOV3 transfectado estável com MUC16c354. Figura 9D: Análises histológicas de tumores de camundongos transgênicos duplos MUC16c354:p53+/-. Múltiplos sarcomas e linfomas foram identificados nos camundongos transgênicos duplosMUC16c354:p53+/-. As seções foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&E). Os tumores incluem sarcoma histocítico no útero (I, Barra de escala:100 μm), fígado (II, Barra de escala:50 μm), ovário (III, Barra de escala:50 μm) e medula óssea (IV, Barra de escala:50 μm) assim como linfoma em ovário (V, Barra de escala:50 μm), rim (VI, Barra de escala:50 μm) e pulmão (VII, Barra de escala:50 μm) com carcinoma no pulmão (VIII, Barra de escala:50 μm). Figura 9E: Curvas de Sobrevida de Kaplan-Meier específicas para câncer de camundongo transgênico: os camundongos MUC16c354 não mostraram desenvolvimento tumoral espontâneo durante os primeiros 18 meses, similarmente ao tipo selvagem (WT). Entretanto, quando camundongos MUC16c354 foram cruzados com camundongos p53+/-, os camundongos transgênicos duplos MUC16c354:p53+/- mostraram uma sobrevida globalsignificativamente pior devido ao desenvolvimento tumoral espontâneo em comparação com os camundongos p53+/- (p < 0,014)ou os camundongos MUC16c354.[172] Figure 9A to Figure 9E. MUC16c354 transgenic mouse. Figure 9A represents the strategy for the MUC16c354 conditional construct. A CMV early enhancer plus the chicken β actin (CAG) promoter were used to drive hrGFP transcription between two loxPs and the downstream MUC16c354 sequence. Figure 9B: Southern blot shows 12 candidate MUC16c354 positive founders among 99 animals after the microinjection procedure. Figure 9C: Western blot with anti-MUC16 antibody, 4H11, was used to identify founders 9 (~50 copies) and 36 (~10 copies) for MUC16c354 mouse colony development; A5 is a positive control of a MUC16c354 stably transfected SKOV3. Figure 9D: Histological analyses of tumors from MUC16c354:p53+/- double transgenic mice. Multiple sarcomas and lymphomas were identified in the MUC16c354:p53+/- double transgenic mice. Sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E). The tumors included histocytic sarcoma in the uterus (I, Scale bar: 100 μm), liver (II, Scale bar: 50 μm), ovary (III, Scale bar: 50 μm), and bone marrow (IV, Scale bar: 50 μm) as well as lymphoma in the ovary (V, Scale bar: 50 μm), kidney (VI, Scale bar: 50 μm), and lung (VII, Scale bar: 50 μm) with carcinoma in the lung (VIII, Scale bar: 50 μm). Figure 9E: Transgenic mouse cancer-specific Kaplan-Meier survival curves: MUC16c354 mice showed no spontaneous tumor development during the first 18 months, similarly to wild type (WT). However, when MUC16c354 mice were crossed with p53+/- mice, the MUC16c354:p53+/- double transgenic mice showed significantly worse overall survival due to spontaneous tumor development compared to either the p53+/- mice (p < 0.014) or the MUC16c354 mice.

[173] Figura 10. Histologia de tecido representativa de camundongos transgênicos MUC16c354 machos e fêmeas com 12 meses de vida. Seções de tecido foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&E, Barra de escala: 50 μm). Hiperplasia endometrial uterina foi observada com incidência e gravidade similares em ambos os genótipos (aqui apenas mostrados em animal transgênico). O ovário, o pulmão, o cólon e o fígado de animais transgênicos (Tg) foram similares à linhagem original (tipo selvagem, WT).[173] Figure 10. Representative tissue histology from 12-month-old male and female MUC16c354 transgenic mice. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E, Scale bar: 50 μm). Uterine endometrial hyperplasia was observed with similar incidence and severity in both genotypes (here only shown in transgenic animal). The ovary, lung, colon, and liver of transgenic (Tg) animals were similar to the original strain (wild type, WT).

[174] Figura 11A à Figura 11C. Impacto de MUC16 em câncer de ovário humano. A Figura 11A representa os números de transcrito de MUC16. Figura 11B: O quartil de pacientes com a expressão deMUC16 mais alta, combinado com os 18 pacientes com mutações deMUC16 identificadas, teve uma sobrevida significativamente pior (p = 0,02117) em comparação com os pacientes com expressão deMUC16 mais baixa em uma análise de Kaplan-Meier. A Figura 11Crepresenta a relação de alterações genéticas de MUC16 com eventos mutacionais de PI3K em câncer de ovário.[174] Figure 11A to Figure 11C. Impact of MUC16 in human ovarian cancer. Figure 11A represents the MUC16 transcript numbers. Figure 11B: The quartile of patients with the highest MUC16 expression, combined with the 18 patients with identified MUC16 mutations, had significantly worse survival (p = 0.02117) compared to the patients with the lowest MUC16 expression in a Kaplan-Meier analysis. Figure 11C represents the relationship of MUC16 genetic alterations with PI3K mutational events in ovarian cancer.

[175] Figura 12A à Figura 12C. Requisitos de glicosilação para invasão de matrigel de MUC16. A Figura 12A representa o ensaio de invasão de matrigel para linhagens de células transfectadas SKOV3. phrGFP se refere a células SKOV3 que expressam um vetor de controle. MUC16c114 se refere a célulasSKOV3 que expressam MUC16c114. N3 se refere a células SKOV3 queexpressam MUC16c114-N3. N1-2 se refere a células SKOV3 queexpressam MUC16c114-N12. N1-2-3 se refere a células SKOV3 queexpressam MUC16c114-N123. MUC16c114-shControl se refere a células SKOV-3 que expressam MUC16c114 e um shRNA de controle. A população de phrGFP shRNA MGAT no 4 se refere a células SKOV3 que expressam um vetor de controle e shRNA contra MGAT5. A população de phrGFP shRNA LGALS3 no 15 se refere a células SKOV3 que expressam um vetor de controle e shRNA contra LGALS3. MUC16c114-shMGAT5 se refere a células SKOV3 que expressam MUC16c114 e um shRNA contra MGAT5. MUC16c114-shLGALS3 se refere a células SKOV3 que expressam MUC16c114 e um shRNA contra LGALS3. A Figura 12B representa o ensaio de invasão de matrigel para células 3T3 que expressam o vetor de controle, phrGFP, ou os construtos de MUC16c114 indicados. A Figura 12C representa o crescimento tumoral, conforme determinado por volume tumoral, em camundongos nude atímicos com implante de células SKOV3 que expressam os construtos indicados.[175] Figure 12A to Figure 12C. Glycosylation requirements for matrigel invasion of MUC16. Figure 12A depicts the matrigel invasion assay for SKOV3 transfected cell lines. phrGFP refers to SKOV3 cells expressing a control vector. MUC16c114 refers to SKOV3 cells expressing MUC16c114. N3 refers to SKOV3 cells expressing MUC16c114-N3. N1-2 refers to SKOV3 cells expressing MUC16c114-N12. N1-2-3 refers to SKOV3 cells expressing MUC16c114-N123. MUC16c114-shControl refers to SKOV-3 cells expressing MUC16c114 and a control shRNA. phrGFP shRNA MGAT population #4 refers to SKOV3 cells expressing a control vector and shRNA against MGAT5. phrGFP shRNA LGALS3 population #15 refers to SKOV3 cells expressing a control vector and shRNA against LGALS3. MUC16c114-shMGAT5 refers to SKOV3 cells expressing MUC16c114 and a shRNA against MGAT5. MUC16c114-shLGALS3 refers to SKOV3 cells expressing MUC16c114 and a shRNA against LGALS3. Figure 12B depicts the matrigel invasion assay for 3T3 cells expressing the control vector, phrGFP, or the indicated MUC16c114 constructs. Figure 12C depicts tumor growth, as determined by tumor volume, in athymic nude mice implanted with SKOV3 cells expressing the indicated constructs.

[176] Figura 13A à Figura 13D. Padrões de glicosilação de MUC16 e peptídeos. A Figura 13A representa a perfilagem N-ligada de células SKOV3 que expressam MUC16c114-N12. Os triângulos representam fucose. Os quadrados representam N- acetilglucosamina. Os círculos cinzas representam manose. Os círculos brancos representam galactose. Os losangos representam ácido N-acetilneurâmico. A Figura 13B representa o imunógeno de 55 mer (SEQ ID NO: 129). A Figura 13C representa o imunógeno de 15 mer (SEQ ID NO: 131). A Figura 13D representa o imunógeno de 18 mer (SEQ ID NO: 130).[176] Figure 13A to Figure 13D. Glycosylation patterns of MUC16 and peptides. Figure 13A represents the N-linked profiling of SKOV3 cells expressing MUC16c114-N12. Triangles represent fucose. Squares represent N-acetylglucosamine. Gray circles represent mannose. White circles represent galactose. Diamonds represent N-acetylneuramic acid. Figure 13B represents the 55-mer immunogen (SEQ ID NO: 129). Figure 13C represents the 15-mer immunogen (SEQ ID NO: 131). Figure 13D represents the 18-mer immunogen (SEQ ID NO: 130).

[177] A Figura 14 fornece uma análise ELISA detalhada da reatividade relativa de sobrenadantes biorreativos que compreendem Anticorpos de Glicosilação de MUC16 com antígenos glicosilados e não glicosilados tanto para o 15 mer como o 18 mer usados como imunógenos e alvos de antígeno de triagem.[177] Figure 14 provides a detailed ELISA analysis of the relative reactivity of bioreactive supernatants comprising MUC16 Glycosylation Antibodies with glycosylated and non-glycosylated antigens for both the 15 mer and 18 mer used as immunogens and screening antigen targets.

[178] Figura 15A à Figura 15B. Anticorpos de Glicosilação de MUC16 inibem a invasão de matrigel. A Figura 15A representa a invasão de matrigel de células SKOV3 que expressam o vetor de controle phrGFP ou MUC16c114 na presença ou ausência de sobrenadantes biorreativos a partir da geração de Anticorpos de Glicosilação de MUC16. A linha é uma linha de referência para o número relativo de 200. A Figura 15B representa a invasão de matrigel de células SKOV3 que expressam o vetor de controle phrGFP ou MUC16c114 na presença ou ausência de Anticorpos de Glicosilação de MUC16 purificados. A linha é uma linha de referência para o número relativo de 90.[178] Figure 15A to Figure 15B. MUC16 Glycosylation Antibodies inhibit matrigel invasion. Figure 15A depicts matrigel invasion of SKOV3 cells expressing phrGFP or MUC16c114 control vector in the presence or absence of bioreactive supernatants from the generation of MUC16 Glycosylation Antibodies. The line is a reference line for the relative number of 200. Figure 15B depicts matrigel invasion of SKOV3 cells expressing phrGFP or MUC16c114 control vector in the presence or absence of purified MUC16 Glycosylation Antibodies. The line is a reference line for the relative number of 90.

[179] Figura 16A à Figura 16E. Anticorpos de Glicosilação de MUC16 inibem a invasão de matrigel. A Figura 16A representa a invasão de matrigel de células SKOV3 que expressam o vetor de controle phrGFP ou os construtos de MUC16c114 indicados napresença de (i) anticorpo de controle; (ii) 4H11; ou (iii) clone de Anticorpo de Glicosilação de MUC16 10C6.E4. A Figura 16Brepresenta a invasão de matrigel de células SKOV3 que expressam estavelmente o vetor de controle phrGFP ou os construtos deMUC16c344 indicados após uma terceira classificação por FACs com o uso de 4H11, na presença de (i) anticorpo de controle; (ii) 4H11; ou (iii) clone de Anticorpo de Glicosilação de MUC16 10C6.E4. A Figura 16C representa a invasão de matrigel de células 3T3 que expressam o vetor de controle phrGFP ou os construtos de MUC16c114 indicados na presença de (i) anticorpo de controle; (ii) 4H11; ou (iii) clone de Anticorpo de Glicosilação de MUC16 clone 10C6.E4. A Figura 16D representa o crescimento tumoral, conforme indicado por volume tumoral, em camundongos nude atímicos com implante de células SKOV3 que expressam MUC16c344 e tratados com simulado (MUC16c344) ou tratados com o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 10C6.E4(MUC16c344 +10C6.E4). As setas indicam os dias em que 100 μg do Anticorpo de Glicosilação de MUC16 foram administrados. A Figura 16E representa o manchamento de amostras de tumor de ovário humano com os anticorpos indicados.[179] Figure 16A to Figure 16E. MUC16 Glycosylation Antibodies inhibit matrigel invasion. Figure 16A depicts matrigel invasion of SKOV3 cells expressing the phrGFP control vector or the indicated MUC16c114 constructs in the presence of (i) control antibody; (ii) 4H11; or (iii) MUC16 Glycosylation Antibody clone 10C6.E4. Figure 16B depicts matrigel invasion of SKOV3 cells stably expressing the phrGFP control vector or the indicated MUC16c344 constructs after a third FACs sort using 4H11, in the presence of (i) control antibody; (ii) 4H11; or (iii) MUC16 Glycosylation Antibody clone 10C6.E4. Figure 16C depicts matrigel invasion of 3T3 cells expressing the phrGFP control vector or the indicated MUC16c114 constructs in the presence of (i) control antibody; (ii) 4H11; or (iii) MUC16 Glycosylation Antibody clone 10C6.E4. Figure 16D depicts tumor growth, as indicated by tumor volume, in athymic nude mice implanted with SKOV3 cells expressing MUC16c344 and either mock-treated (MUC16c344) or treated with the MUC16 Glycosylation Antibody 10C6.E4 (MUC16c344 + 10C6.E4). Arrows indicate the days when 100 μg of the MUC16 Glycosylation Antibody was administered. Figure 16E depicts staining of human ovarian tumor samples with the indicated antibodies.

[180] A Figura 17 representa a porcentagem de células em que o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 identificado é internalizado na temperatura e nos pontos no tempo indicados.[180] Figure 17 depicts the percentage of cells in which the identified MUC16 Glycosylation Antibody is internalized at the indicated temperature and time points.

[181] A Figura 18A representa as curvas de crescimento in vitro para transfectantes de MUC16. 1.000 células SKOV3/cavidade em placas de fundo plano de 96 cavidades foram cultivadas com controle de vetor phrGFP, sendo que o vetor phrGFP expressaMUC16c114 (SEQ ID NO: 133) ou o vetor phrGFP expressa MUC16c344(SEQ ID NO: 132), e incubadas a 37 °C em CO2 a 5% por 5 dias. A cada dia, uma placa foi manchada com Alamar Blue e incubada a 37 °C em CO2 a 5% por 4 horas. As placas foram lidas em um leitor de placa fluorescente CytoFluor. Nenhuma diferença estatística foi vista entre as curvas. A Figura 18B representa o ensaio de invasão de matrigel para células SKOV3 phrGFP, células SKOV3 MUC16c114-GFP ou células SKOV3-MUC16c344-GFP. Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata e contado manualmente. Os resultados são expressos como o número relativo de células invasivas. c114 e c344 foram estatisticamente significativos em comparação com phrGFP. A Figura 18C representa o crescimento tumoral de transfectante SKOV3 em camundongos nude fêmeasatímicos. Dois milhões de células tumorais foram introduzidos no flanco de 10 camundongos nu/nu, e os camundongos foram observados quanto à formação de tumor. Os tumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. As diferenças em volume tumoral médio foram maiores de modo estatisticamente significativo para camundongos que portam tumores MUC16c344 (p < 0,0001) e tumores MUC16c114 (p = 0,002) em comparação com tumores phrGFP. Abreviações para a Figura 18A à Figura 18C: “SKOV3phrGFP” e “phrGFP” se referem a células SKOV3 que expressam o vetor phrGFP de controle; “SKOV3 MUC16c114-GFP” e “c114” sereferem a células SKOV3 que expressam MUC16c114 (SEQ ID NO: 133); “SKOV3 MUC16c344-GFP” e “c344” se referem a células SKOV3 que expressam MUC16c344 (SEQ ID NO: 132).[181] Figure 18A depicts the in vitro growth curves for MUC16 transfectants. 1,000 SKOV3 cells/well in 96-well flat-bottom plates were cultured with phrGFP vector control, either the phrGFP vector expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) or the phrGFP vector expressing MUC16c344 (SEQ ID NO: 132), and incubated at 37 °C in 5% CO2 for 5 days. Each day, a plate was stained with Alamar Blue and incubated at 37 °C in 5% CO2 for 4 hours. Plates were read on a CytoFluor fluorescent plate reader. No statistical differences were seen between the curves. Figure 18B depicts the matrigel invasion assay for SKOV3 phrGFP cells, SKOV3 MUC16c114-GFP cells, or SKOV3-MUC16c344-GFP cells. Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. Results are expressed as the relative number of invasive cells. c114 and c344 were statistically significant compared to phrGFP. Figure 18C depicts tumor growth of SKOV3 transfectant in athymic female nude mice. Two million tumor cells were introduced into the flank of 10 nu/nu mice, and the mice were observed for tumor formation. Tumors were measured by calipers twice a week. Differences in mean tumor volume were statistically significantly greater for mice bearing MUC16c344 tumors (p < 0.0001) and MUC16c114 tumors (p = 0.002) compared to phrGFP tumors. Abbreviations for Figure 18A to Figure 18C: “SKOV3phrGFP” and “phrGFP” refer to SKOV3 cells expressing the control phrGFP vector; “SKOV3 MUC16c114-GFP” and “c114” refer to SKOV3 cells expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133); “SKOV3 MUC16c344-GFP” and “c344” refer to SKOV3 cells expressing MUC16c344 (SEQ ID NO: 132).

[182] A Figura 19A à Figura 19F representam o efeito de expressão de MUC16 sobre células de câncer de ovário SKOV3. A Figura 19A representa um ensaio de invasão de matrigel para células SKOV3 que expressam o vetor de controle phrGFP (“phrGFP”) ou o vetor phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “c114”)tratado com ou sem o seguinte: (1) 5 μg/ml de tunicamicina; (2)5 μg/ml de proteína pFUSE de controle; (3) 5 μg/ml de proteínade fusão MUC16c57-114-pFUSE; ou (4) 5 μg/ml de proteína de fusão117-244LGALS3-pFUSE. Os resultados são expressos como número de células invasivas 48 horas após o tratamento. As células c114 foram mais invasivas que as células phrGFP (p < 0,0001). Aspropriedades invasivas das células c114 não foram afetadas pelo tratamento com a proteína apenas de vetor pFUSE. O tratamento com tunicamicina (um inibidor de N-glicosilação) diminuiu aspropriedades invasivas das células c114. O tratamento com proteína de fusão MUC16c57-114-pFUSE ou 117-244LGALS3-pFUSE diminuiu as propriedades invasivas das células c114 (p < 0,0001). A Figura 19B representa um ensaio de invasão de matrigel para células SKOV3 transfectadas com o controle de vetor phrGFP (“phrGFP”) ou vetor phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) (“c114”) napresença ou ausência de shRNA de controle de lamelli, shRNA específico para MGAT5 ou shRNA específico para LGALS3. As células c114 tratadas com shRNA específico para MGAT5 ou shRNA específico para LGALS3 tiveram invasão diminuída em comparação com células phrGFP tratadas com os shRNAs. O shRNA de controle não teve impacto sobre a invasão da célula c114. Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata e contado manualmente. A Figura 19C representa a dependência de glicosilação de invasão de matrigel de SKOV3-MUC16c114. As células SKOV3 foram transfectadas com vetor de controle phrGFP ou vetor phrGFP que expressa os seguintes mutantes de MUC16: c114 (SEQ ID NO: 133), N1 mut c114 (SEQ ID NO: 151), N24 muc c114 (SEQ ID NO: 152), N30 mut c114 (SEQ ID NO: 139), N1-N24 mut c114 (SEQ ID NO: 153), N1-N24-N30 mut c114 (SEQ ID NO: 154). As células que expressam c114 exibiram invasão aumentada em comparação com as células phrGFP de controle. A propriedade invasiva aumentada das células que expressam c114 foi dependente de N-glicosilação das asparaginas nas posições de aminoácido 24 e 30 de MUC16c114 (SEQ ID NO: 133). Embora ambos os locais N24 e N30 sejam importantes, a posição N30 parece ser mais crucial que o local N24 para esse efeito.Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata econtado manualmente. Os resultados são expressos como % em comparação com o controle de vetor phrGFP. A Figura 19D representa a dependência de glicosilação de invasão de matrigelde SKOV3-MUC16c344. As células SKOV3 foram transfectadas com vetor de controle phrGFP ou vetor phrGFP que expressa os seguintesmutantes de MUC16: c344 (SEQ ID NO: 132), N24 mut c344 (SEQ IDNO: 173), N30 mut c344 (SEQ ID NO: 174) ou N24-N30 mut c344 (SEQID NO: 175). As células que expressam c344 exibiram invasão aumentada em comparação com as células phrGFP de controle. Apropriedade invasiva aumentada das células que expressam c344 foi dependente de N-glicosilação das asparaginas correspondentes às posições de aminoácido 24 e 30 de MUC16c114 (SEQ ID NO: 133). Cada ensaio foi realizado duas ou mais vezes em triplicata e contado manualmente. A Figura 19E representa o efeito de expressão de MUC16 sobre as trajetórias de sinalização selecionadas. As células SKOV3 transfectadas com MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) foram tratadas com ou sem shRNA de controle(“shLamelli”) ou shRNA contra MGAT5 (“shMGAT5”) ou LGALS3 (“shLGALLS3”) e comparadas às células SKOV3 transfectadas com controle de vetor phrGFP (“phrGFP”) ou vetor phrGFP que expressa MUC16c114-N30mut (SEQ ID NO: 139) (“N30 mut”), e as células foramexaminadas quanto à ativação das trajetórias de sinalização doreceptor de pAKT, pERK1/2, pSRC e pEGF (pEGFR). A fosforilaçãode AKT (S473) e ERK1/2 (pT202/Y204) foi aumentada nas células MUC16c114. O knockdown de MGAT5 (shMGAT5), o knockdown de Galectina-3 (shLGALLS3) e a mutação de N30A, cada um, reduzirama ativação de oncogene induzida por MUC16c114 nas linhagens decélulas SKOV3. A Figura 19F representa o crescimento tumoral de transfectante SKOV3 em camundongos nude fêmeas atímicos. Dois milhões de células tumorais (descrito abaixo) foram introduzidos no flanco de 10 camundongos nu/nu para cada condição, e oscamundongos foram observados quanto à formação de tumor. Ostumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. O crescimento in vivo de células tumorais c114 foi muito mais agressivo (p < 0,0001) em comparação com células tumorais phrGFP. As células tumorais N1-N24-N30-mut c114, c114-sh-MGAT5 e c114-sh-LGALS3 não exibiram intensificação de crescimento emcomparação com as células tumorais phrGFP. Descrição de células tumorais: “phrGFP” se refere a células SKOV3 transfectadas com controle de vetor phrGFP; “c114” se refere a células SKOV3 transfectadas com vetor phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133); “N1-N24-N30-mut c114” se refere a células SKOV3transfectadas com vetor phrGFP que expressa MUC16c114-N1-N24-N30-mut (SEQ ID NO: 154); “c114-sh-MGAT5” se refere a células SKOV3transfectadas com vetor phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) e tratadas com shRNA contra MGAT5; e “c114-sh-LGALS3” se refere a células SKOV3 transfectadas com vetor phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) e tratadas com shRNA contra LGALS3.[182] Figure 19A through Figure 19F depict the effect of MUC16 expression on SKOV3 ovarian cancer cells. Figure 19A depicts a matrigel invasion assay for SKOV3 cells expressing the phrGFP control vector (“phrGFP”) or the phrGFP vector expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “c114”) treated with or without the following: (1) 5 μg/ml tunicamycin; (2) 5 μg/ml control pFUSE protein; (3) 5 μg/ml MUC16c57-114-pFUSE fusion protein; or (4) 5 μg/ml 117-244LGALS3-pFUSE fusion protein. Results are expressed as the number of invasive cells 48 hours after treatment. c114 cells were more invasive than phrGFP cells (p < 0.0001). The invasive properties of c114 cells were not affected by treatment with the pFUSE vector protein alone. Treatment with tunicamycin (an N-glycosylation inhibitor) decreased the invasive properties of c114 cells. Treatment with the MUC16c57-114-pFUSE or 117-244LGALS3-pFUSE fusion protein decreased the invasive properties of c114 cells (p < 0.0001). Figure 19B depicts a matrigel invasion assay for SKOV3 cells transfected with phrGFP vector control (“phrGFP”) or phrGFP vector expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) (“c114”) in the presence or absence of lamelli control shRNA, MGAT5-specific shRNA, or LGALS3-specific shRNA. c114 cells treated with MGAT5-specific shRNA or LGALS3-specific shRNA had decreased invasion compared to phrGFP cells treated with the shRNAs. The control shRNA had no impact on c114 cell invasion. Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. Figure 19C depicts the glycosylation dependence of SKOV3-MUC16c114 matrigel invasion. SKOV3 cells were transfected with phrGFP control vector or phrGFP vector expressing the following MUC16 mutants: c114 (SEQ ID NO: 133), N1 mut c114 (SEQ ID NO: 151), N24 muc c114 (SEQ ID NO: 152), N30 mut c114 (SEQ ID NO: 139), N1-N24 mut c114 (SEQ ID NO: 153), N1-N24-N30 mut c114 (SEQ ID NO: 154). Cells expressing c114 exhibited increased invasion compared to control phrGFP cells. The increased invasive property of cells expressing c114 was dependent on N-glycosylation of the asparagines at amino acid positions 24 and 30 of MUC16c114 (SEQ ID NO: 133). Although both N24 and N30 sites are important, the N30 position appears to be more crucial than the N24 site for this effect. Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. Results are expressed as % compared to the phrGFP vector control. Figure 19D depicts the glycosylation dependence of SKOV3-MUC16c344 matrigel invasion. SKOV3 cells were transfected with phrGFP control vector or phrGFP vector expressing the following MUC16 mutants: c344 (SEQ ID NO: 132), N24 mut c344 (SEQ ID NO: 173), N30 mut c344 (SEQ ID NO: 174), or N24-N30 mut c344 (SEQ ID NO: 175). Cells expressing c344 exhibited increased invasion compared to the control phrGFP cells. The increased invasiveness of c344-expressing cells was dependent on N-glycosylation of the asparagines corresponding to amino acid positions 24 and 30 of MUC16c114 (SEQ ID NO: 133). Each assay was performed two or more times in triplicate and counted manually. Figure 19E depicts the effect of MUC16 expression on the selected signaling pathways. SKOV3 cells transfected with MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) were treated with or without control shRNA (“shLamelli”) or shRNA against MGAT5 (“shMGAT5”) or LGALS3 (“shLGALLS3”) and compared to SKOV3 cells transfected with phrGFP vector control (“phrGFP”) or phrGFP vector expressing MUC16c114-N30mut (SEQ ID NO: 139) (“N30 mut”), and the cells were examined for activation of pAKT, pERK1/2, pSRC, and pEGF receptor (pEGFR) signaling pathways. Phosphorylation of AKT (S473) and ERK1/2 (pT202/Y204) was increased in MUC16c114 cells. MGAT5 knockdown (shMGAT5), Galectin-3 knockdown (shLGALLS3), and N30A mutation each reduced MUC16c114-induced oncogene activation in SKOV3 cell lines. Figure 19F depicts tumor growth of SKOV3 transfectant in athymic female nude mice. Two million tumor cells (described below) were introduced into the flank of 10 nu/nu mice for each condition, and mice were observed for tumor formation. Tumors were measured by calipers twice weekly. In vivo growth of c114 tumor cells was much more aggressive (p < 0.0001) compared with phrGFP tumor cells. N1-N24-N30-mut c114, c114-sh-MGAT5, and c114-sh-LGALS3 tumor cells did not exhibit growth enhancement compared with phrGFP tumor cells. Description of tumor cells: “phrGFP” refers to SKOV3 cells transfected with phrGFP vector control; “c114” refers to SKOV3 cells transfected with phrGFP vector expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133); “N1-N24-N30-mut c114” refers to SKOV3 cells transfected with phrGFP vector expressing MUC16c114-N1-N24-N30-mut (SEQ ID NO: 154); “c114-sh-MGAT5” refers to SKOV3 cells transfected with phrGFP vector expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) and treated with shRNA against MGAT5; and “c114-sh-LGALS3” refers to SKOV3 cells transfected with phrGFP vector expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) and treated with shRNA against LGALS3.

[183] A Figura 20A representa o efeito de expressão de MUC16 sobre a expressão de superfície de EGFR. Os transfectantes SKOV3- phrGFP e SKOV3-MUC16c114 foram examinados na presença ou ausência de tratamento com ciclo-heximida (CHX) por 24 horas. A fluorescência média geométrica de expressão de EGFR e MUC16 em níveis basais e após tratamento com CHX é mostrada. EGFR em amostras de SKOV3-phrGFP foi reduzido até 58% de níveis não tratados após 24 horas de tratamento com CHX. Nenhuma expressão de MUC16 significativa estava presente nessas células. Em contraste, nas células SKOV3-MUC16c114, houve aproximadamente um aumento de 25% em fluorescência média geométrico de EGFR, que diminuiu até 83% daquela do controle após exposição a CHX. A fluorescência média de MUC16c114 não foi significativamente reduzida por CHX. A Figura 20B representa a densitometria da razão EGFR/β-actina a partir de western blots de EGFR celular total e ilustra que houve uma perda constante de EGFR ao longo do tempo em células SKOV3-phrGFP tratadas com CHX. Em contraste, o nível total de EGFR em células SKOV3-MUC16c114 foi mantido, mostrando estabilização de EGFR em comparação com a linhagem celular de controle MUC16(-) (“phrGFP (-)”). A Figura 20C representa um ensaio de invasão de matrigel para células SKOV3 transfectadas com vetor de controle phrGFP (“phrGFP estável”), linhagens celulares induzíveis por tetraciclina de SKOV3- MUC16c114 e SKOV3-MUC16c114(tet), expressas como uma fração da invasão da célula de controle. A indução por tetraciclina de células SKOV3-MUC16c114(tet) resultou em um fenótipo invasivo similar ao SKOV3-MUC16c114 estável (SKOV3c114), enquanto célulasnão induzidas se correlacionaram às células de controle MUC16- phrGFP. Esse aumento induzido por MUC16 em invasão de matrigel foi completamente dependente de EGFR. Quando um knockdown de RNA em forma de grampo de EGFR (shEGFR) foi introduzido em célulasSKOV3, a tetraciclina induziu a expressão de MUC16 (proteína positiva para 4H11 em western blot), mas não aumentou a invasão de matrigel. Cada ensaio foi realizado em triplicata e contado manualmente. Figura 20D: Estabilidade de EGFR em célulasMUC16c114(+) e MUC16c114(-). Os extratos celulares de linhagens celulares SKOV3-MUC16c114(tet) induzidas por tetraciclina ou não induzidas tratadas com CHX por 24 horas e sondadas quanto ao EGFR celular total são expressos como razões de densitometria e normalizados com β-Actina. O coeficiente angular do declínio de EGFR em células SKOV3-MUC16c114 induzidas por tetraciclina replica o efeito de estabilização de EGFR de expressão de MUC16c114 em comparação com a linhagem MUC16c114(-). O resultado é similar ao efeito de transfecção estável mostrado abaixo na Figura 20B).[183] Figure 20A depicts the effect of MUC16 expression on EGFR surface expression. SKOV3-phrGFP and SKOV3-MUC16c114 transfectants were examined in the presence or absence of cycloheximide (CHX) treatment for 24 hours. The geometric mean fluorescence of EGFR and MUC16 expression at basal levels and after CHX treatment is shown. EGFR in SKOV3-phrGFP samples was reduced to 58% of untreated levels after 24 hours of CHX treatment. No significant MUC16 expression was present in these cells. In contrast, in SKOV3-MUC16c114 cells, there was approximately a 25% increase in EGFR geometric mean fluorescence, which decreased to 83% of that of the control after CHX exposure. The mean fluorescence of MUC16c114 was not significantly reduced by CHX. Figure 20B represents densitometry of the EGFR/β-actin ratio from western blots of total cellular EGFR and illustrates that there was a steady loss of EGFR over time in CHX-treated SKOV3-phrGFP cells. In contrast, the total EGFR level in SKOV3-MUC16c114 cells was maintained, showing EGFR stabilization compared to the MUC16(-) control cell line (“phrGFP(-)”). Figure 20C represents a matrigel invasion assay for SKOV3 cells transfected with phrGFP control vector (“phrGFP stable”), tetracycline-inducible cell lines of SKOV3-MUC16c114 and SKOV3-MUC16c114(tet), expressed as a fraction of the control cell invasion. Tetracycline induction of SKOV3-MUC16c114(tet) cells resulted in an invasive phenotype similar to stable SKOV3-MUC16c114 (SKOV3c114), while uninduced cells correlated with MUC16-phrGFP control cells. This MUC16-induced increase in matrigel invasion was completely EGFR-dependent. When a hairpin RNA knockdown of EGFR (shEGFR) was introduced into SKOV3 cells, tetracycline induced MUC16 expression (4H11-positive protein on western blot) but did not increase matrigel invasion. Each assay was performed in triplicate and counted manually. Figure 20D: EGFR stability in MUC16c114(+) and MUC16c114(-) cells. Cell extracts from tetracycline-induced or uninduced SKOV3-MUC16c114(tet) cell lines treated with CHX for 24 hours and probed for total cellular EGFR are expressed as densitometry ratios and normalized to β-Actin. The slope of EGFR decline in tetracycline-induced SKOV3-MUC16c114 cells replicates the EGFR stabilizing effect of MUC16c114 expression compared to the MUC16c114(-) cell line. The result is similar to the stable transfection effect shown below in Figure 20B).

[184] A Figura 21 representa a densitometria para análise por western blot de extratos celulares de linhagens celulares SKOV3c114 não induzidas ou induzidas por tetraciclina (“MUC16c114 Não induzida” e “MUC16c114 induzida por Tet”, respectivamente) tratadas com ciclo-heximida por 24 horas. Os western blots foram sondados quanto a pEGFR e os níveis de proteína foram normalizados aos níveis de β-Actina. Os coeficientes angulares do sinal de SKOV3c114 pEGFR induzido por tetraciclina mostraram pEGFR estabilizado em comparação com a linhagem de células SKOV3c114 não induzida.[184] Figure 21 depicts densitometry for western blot analysis of cell extracts from non-induced or tetracycline-induced SKOV3c114 cell lines (“MUC16c114 Non-induced” and “MUC16c114 Tet-induced”, respectively) treated with cycloheximide for 24 hours. Western blots were probed for pEGFR, and protein levels were normalized to β-Actin levels. The slopes of the tetracycline-induced SKOV3c114 pEGFR signal showed stabilized pEGFR compared to the non-induced SKOV3c114 cell line.

[185] A Figura 22A à Figura 22C representam a identificação e a síntese química de espécies N-glicosiladas de ectodomínio de MUC16. Figura 22A: Perfilagem de N-glicano de células SKOV3 transfectadas com phrGFP que expressa MUC16c114 com mutação em N1 a N24 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 153). Os glicanos foram detectados e caracterizados por mapeamento total de íons no Centro de Pesquisa de Carboidrato Complexo, Universidade de Geórgia. Triângulos: fucose; quadrados: N-acetilglucosamina; círculos, preenchimento escuro: manose; círculos, preenchimento claro: galactose; losangos: ácido N-acetilneuramínico. A Figura 22B representa a estrutura esquemática de um antígeno MUC16 de 55 mer com um glicano de chitobiose única (GlcNAc2) na posição N30. Esse antígeno de N-glicopeptídeo foi usado para imunizar os camundongos para elevar os anticorpos. A sequência de aminoácidos é conforme apresentada na SEQ ID NO: 129. Osquadrados representam N-acetilglucosamina; os círculosrepresentam manose. A Figura 22C representa a estruturaesquemática de um antígeno de MUC16 de 15 mer conjugado a KLH, mono-glicosilado com chitobiose na posição N30, e antígeno de MUC16 de 18-mer conjugado com KLH, bis-glicosilado com duas unidades de chitobiose nas posições N24 e N30, respectivamente. Esses construtos de N-glicopeptídeo-KLH foram subsequentemente usados para imunizar camundongos para elevar os anticorpos monoclonais contra o epítopo de GlcNAc2-peptídeo dentro do ectodomínio de MUC16. As sequências dos glicopeptídeos não relacionados a MUC16 e o peptídeo de MUC16 não glicosilado 2 para produzir o anticorpo monoclonal de 4H11 estão incluídas também. A sequência de aminoácidos para KLH-15- mer(chitobiose)[C-G25-V38] é conforme apresentado na SEQ ID NO: 131. A sequência de aminoácidos para KLH-18-mer(chitobiose)2[C- T22-V38] é conforme apresentado na SEQ ID NO: 130. A sequência de aminoácidos para peptídeo 2 não glicosilado de MUC16 é conforme apresentado na SEQ ID NO: 168. A sequência de aminoácidos para peptídeo não relacionado a MUC16 18 mer e peptídeo não relacionado a MUC16 18 mer + GlcNAc2 é conforme apresentado na SEQ ID NO: 169. Os quadrados representam N- acetilglucosamina.[185] Figure 22A to Figure 22C depict the identification and chemical synthesis of MUC16 ectodomain N-glycosylated species. Figure 22A: N-glycan profiling of SKOV3 cells transfected with phrGFP expressing MUC16c114 mutated at N1 to N24 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 153). Glycans were detected and characterized by total ion mapping at the Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia. Triangles: fucose; squares: N-acetylglucosamine; circles, dark fill: mannose; circles, light fill: galactose; diamonds: N-acetylneuraminic acid. Figure 22B depicts the schematic structure of a 55-mer MUC16 antigen with a single chitobiose glycan (GlcNAc2) at position N30. This N-glycopeptide antigen was used to immunize mice to raise antibodies. The amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 129. Squares represent N-acetylglucosamine; circles represent mannose. Figure 22C depicts the schematic structure of a KLH-conjugated 15-mer MUC16 antigen monoglycosylated with chitobiose at position N30 and a KLH-conjugated 18-mer MUC16 antigen bisglycosylated with two chitobiose units at positions N24 and N30, respectively. These N-glycopeptide-KLH constructs were subsequently used to immunize mice to raise monoclonal antibodies against the GlcNAc2-peptide epitope within the MUC16 ectodomain. The sequences of the MUC16-unrelated glycopeptides and non-glycosylated MUC16 peptide 2 to produce monoclonal antibody 4H11 are also included. The amino acid sequence for KLH-15-mer(chitobiose)[C-G25-V38] is as shown in SEQ ID NO: 131. The amino acid sequence for KLH-18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38] is as shown in SEQ ID NO: 130. The amino acid sequence for MUC16-unrelated peptide 2 is as shown in SEQ ID NO: 168. The amino acid sequence for MUC16-unrelated peptide 18 mer and non-MUC16-related peptide 18 mer + GlcNAc2 is as shown in SEQ ID NO: 169. Squares represent N-acetylglucosamine.

[186] A Figura 23A à Figura 23H representam a caracterização de Anticorpo de Glicosilação de MUC16. A Figura 23A representa a reatividade de 4H11 e quatro anticorpos monoclonais de ectodomínio de GlcNAc2-MUC16 principais (Anticorpos de Glicosilação de MUC16) a vários peptídeos de MUC16 e GlcNAc2- glicosilados por ELISA em sanduíche. Nenhuma reatividade cruzada de ectodomínio de glicano-MUC16 foi vista com o peptídeo 2 de MUC16 não glicosilado (SEQ ID NO: 168), ou qualquer um dos peptídeos não relacionados (SEQ ID NO: 169). Similarmente, 4H11 não teve essencialmente nenhuma afinidade ao GlcNAc2-MUC16 15- mer (SEQ ID NO: 131) ou (GlcNAc2)2-18-mer (SEQ ID NO: 130) N- glicopeptídeos. Os quadrados representam N-acetilglusoamina; os triângulos representam fucose; os círculos representam manose. A Figura 23B, a Figura 23C e a Figura 23D representam o efeito de Anticorpos de Glicosilação de MUC16 sobre a invasão de matrigel intensificada por MUC16. Os resultados são expressos como % em comparação com controle. O ensaio de matrigel de células SKOV3 transfectadas com phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) (Figura 23B), células CAOV3 (Figura 23C) e células OVCA-433 (Figura 23D) com ou sem (controle) 4H11 purificado ou os quatro anticorpos de glicano-MUC16-ectodomínio 18C6, 10C6,19C22 ou 7B12 a 5 μg/ml. Cada um dos quatro anticorpos anti- glicano-MUC16-ectodomínio (Anticorpos de Glicosilação de MUC16) inibiu a invasão de três linhagens celulares de câncer de ovário MUC16(+) diferentes (CAOV3 e OVCA-433), enquanto 4H11 teve menos efeito sobre a inibição de invasão das células SKOV3-MUC16c114. A Figura 23E representa a inibição de estabilização de EGFR por anticorpo monoclonal Anticorpo de Glicosilação de MUC16 (“MAB”) 10C6. A densitometria de análise por western blot de extratos celulares de linhagens celulares SKOV3-MUC16c114(tet) não induzida, SKOV3-MUC16c114(tet)induzida por tetraciclina ou tratada comAnticorpo de Glicosilação de MUC16 monoclonal 10C6, SKOV3-MUC16c114(tet) induzida por tetraciclina tratadas com CHX e, então, sondadas quanto a EGFR total nas horas indicadas (h) após o tratamento com ciclo-hexaminda. Conforme visto na Figura 20A, os coeficientes angulares das curvas de densitometria indicaram que a presença de MUC16c114 na superfície celular estabilizou o EGFR. O Anticorpo de Glicosilação de MUC16 10C6 anulou a estabilização de MUC16c114 de proteína EGFR total, tornando a mesma similar ao controle não induzido MUC16(-). A Figura 23F representa microarranjos de tecido de ovário humano manchados com 4H11, OC125 (comercial) ou Anticorpos de Glicosilação de MUC16 monoclonal (10C6 e 19C11). A expressão de MUC16 no câncer de ovário seroso foi consistente e sobreposta com OC125 e 4H11. A Figura 23G e a Figura 23H representam o efeito de Anticorpos de Glicosilação de MUC16 sobre o crescimento tumoral em camundongos nude fêmeas atímicos. Dois milhões de células tumorais (células SKOV3 transfectadas com vetor phrGFP (“phrGFP”) ou vetor phrGFP que expressa MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “c344”)) foramintroduzidos no flanco de 20 camundongos nu/nu. Dez camundongos foram tratados por via intravenosa a partir do dia 0 comAnticorpo de Glicosilação de MUC16 monoclonal purificado 10C6 a 100 μg/camundongo duas vezes por semana por 4 semanas. Todos os camundongos foram observados quanto à formação de tumor. Os tumores foram medidos por calibradores duas vezes por semana. A Figura 23G mostra o ensaio de invasão de matrigel com as mesmas células realizado na presença e ausência de Anticorpo de Glicosilação de MUC16 monoclonal purificado 10C6 a 10 μg/ml. A Figura 23H demonstra que as diferenças em volume tumoral média foram significativamente diminuídas (p=0,0004) com camundongos tratados com Anticorpo de Glicosilação de MUC16 monoclonal 10C6 que portam tumores MUC16c344 em comparação com tumores MUC16c344 não tratados, indicando a proteção contra o efeito de MUC16 sobre o crescimento do tumor.[186] Figure 23A through Figure 23H depict the characterization of MUC16 Glycosylation Antibody. Figure 23A depicts the reactivity of 4H11 and four major MUC16 GlcNAc2-ectodomain monoclonal antibodies (MUC16 Glycosylation Antibodies) to various MUC16 and GlcNAc2-glycosylated peptides by sandwich ELISA. No MUC16 glycan ectodomain cross-reactivity was seen with non-glycosylated MUC16 peptide 2 (SEQ ID NO: 168), or any of the unrelated peptides (SEQ ID NO: 169). Similarly, 4H11 had essentially no affinity to the GlcNAc2-MUC16 15-mer (SEQ ID NO: 131) or (GlcNAc2)2-18-mer (SEQ ID NO: 130) N-glycopeptides. Squares represent N-acetylglusoamine; triangles represent fucose; circles represent mannose. Figure 23B, Figure 23C, and Figure 23D depict the effect of MUC16 glycosylation antibodies on MUC16-enhanced matrigel invasion. Results are expressed as % compared to control. Matrigel assay of SKOV3 cells transfected with phrGFP expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133) (Figure 23B), CAOV3 cells (Figure 23C), and OVCA-433 cells (Figure 23D) with or without (control) purified 4H11 or the four glycan-MUC16-ectodomain antibodies 18C6, 10C6, 19C22, or 7B12 at 5 μg/ml. Each of the four anti-glycan-MUC16-ectodomain antibodies (MUC16 Glycosylation Antibodies) inhibited the invasion of three different MUC16(+) ovarian cancer cell lines (CAOV3 and OVCA-433), while 4H11 had less effect on the inhibition of invasion of SKOV3-MUC16c114 cells. Figure 23E depicts the inhibition of EGFR stabilization by monoclonal antibody MUC16 Glycosylation Antibody (“MAB”) 10C6. Western blot densitometry analysis of cell extracts from uninduced SKOV3-MUC16c114(tet), tetracycline-induced SKOV3-MUC16c114(tet) or tetracycline-induced SKOV3-MUC16c114(tet) cell lines treated with CHX and then probed for total EGFR at the indicated hours (h) after cyclohexaminde treatment. As seen in Figure 20A, the slopes of the densitometry curves indicated that the presence of MUC16c114 on the cell surface stabilized EGFR. MUC16 Glycosylation Antibody 10C6 abrogated MUC16c114 stabilization of total EGFR protein, making it similar to the uninduced control MUC16(-). Figure 23F depicts human ovarian tissue microarrays stained with 4H11, OC125 (commercial), or monoclonal MUC16 Glycosylation Antibodies (10C6 and 19C11). MUC16 expression in serous ovarian cancer was consistent and overlapping with OC125 and 4H11. Figure 23G and Figure 23H depict the effect of MUC16 Glycosylation Antibodies on tumor growth in athymic female nude mice. Two million tumor cells (SKOV3 cells transfected with phrGFP vector (“phrGFP”) or phrGFP vector expressing MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “c344”)) were introduced into the flank of 20 nu/nu mice. Ten mice were treated intravenously from day 0 with purified monoclonal MUC16 Glycosylation Antibody 10C6 at 100 μg/mouse twice weekly for 4 weeks. All mice were observed for tumor formation. Tumors were measured by calipers twice weekly. Figure 23G shows the matrigel invasion assay with the same cells performed in the presence and absence of purified monoclonal MUC16 Glycosylation Antibody 10C6 at 10 μg/ml. Figure 23H demonstrates that differences in mean tumor volume were significantly decreased (p=0.0004) with monoclonal MUC16 Glycosylation Antibody 10C6-treated mice bearing MUC16c344 tumors compared with untreated MUC16c344 tumors, indicating protection from the effect of MUC16 on tumor growth.

[187] A Figura 24A à Figura 24D representam interações entre proteína e proteína MUC16 mediadas por galectina. A Figura 24A representa imunoblot (IB) e imunoprecipitação (IP) de três proteínas glicosiladas (EGFR DDK-His; MUC16c57-114-pFUSE; e LGALS3Myc-DDK). A proteína glicosilada MUC16c57-114-pFUSE foicombinada com proteína LGALS3 (0,13 μg) e EGFR (0,13 μg) e,então, girada a 4 °C por 1 hora. Microesferas de proteína A/G PLUS Agarose pré-bloqueadas foram adicionadas e foram giradas a 4 °C de um dia para o outro. Os péletes de IP foram lavados extensivamente, fervidos em tampão de carregamento e separados por eletroforese em gel SDS-PAGE a 10%, então, transferidos para membrana de nitrocelulose. A membrana foi sondada com anticorpos anti-EGFR-v3, anti-4H11-HRP ou anti-LGALS3 policlonal. Conforme mostrado, a ligação de 4H11 mostrou que MUC16c57-114-pFUSE estava consistentemente presente. LGALS3 ligado na faixa positiva para MUC16c57-114-pFUSE, mas EGFR foi apenas detectado quando tanto LGALS3 como MUC16c57-114-pFUSE estavam presentes. A presença do Anticorpo de Glicosilação de MUC16 monoclonal 18C6 impediu a formação desses complexos proteicos de LGALS3, EGFR e MUC16 (faixas da direita). A Figura 24B representa a colocalização da proteína MUC16 e EGFR. O manchamento por imunofluorescência de células OVCAR3 do tipo selvagem ou células SKOV3 transfectadas com phrGFP que expressa MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “SKOV3c344”) ou com phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “SKOV3c114”) com EGFR-A647 e 4H11-PE para MUC16, ou uma combinação de ambos os reagentes EGFR-A647 e 4H11-PE para MUC16. As imagens microscópicas (escala de 50 μm) indicaram a colocalização de EGFR e MUC16c114 em todas as três linhagens celulares (consultar as setas). A Figura 24C representa imunoblot (IB) e imunoprecipitação (IP) de três proteínas glicosiladas (Integrina β1Myc-DDK; MUC16c57-114-pFUSE e LGALS3Myc-DDK). De modo geral, os mesmos métodos da Figura 24A foram usados. A análise por western blot de imunoblot e todas as amostras imunoprecipitadas foi executada em gel SDS-PAGE a 10%, transferida para membrana de nitrocelulose e sondada com anti-4C5-DDK para Integrina β1 ou anti-4H11-HRP ou anti-4C5-DDK para anticorpos de LGALS3. Como com EGFR, todas as três proteínas foram necessárias para coprecipitar a proteína Integrina β1. O Anticorpo de Glicosilação de MUC16 18C6 também bloqueou a combinação de MUC16, LGALS3 e Integrina β1, conforme mostrado nas três faixas da direita. A Figura 24D representa a colocalização das proteínas MUC16 e Integrina β1. O manchamento por imunofluorescência de células OVCAR3 do tipo selvagem ou células SKOV3 transfectadas com phrGFP que expressa MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “SKOV3c344”) ou com phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “SKOV3c114”) com Integrina β1-A647 ou 4H11-PE para MUC16 ou uma combinação de ambos os reagentes Integrina β1-A647 ou 4H11-PE para MUC16. As imagens microscópicas (escala de 50 μm) indicaram a colocalização da Integrina β1 e MUC16 nas células OVCAR3, SKOV3c344 e SKOV3c114 (consultar as setas).[187] Figure 24A to Figure 24D depict galectin-mediated MUC16 protein-protein interactions. Figure 24A depicts immunoblot (IB) and immunoprecipitation (IP) of three glycosylated proteins (EGFR DDK-His; MUC16c57-114-pFUSE; and LGALS3Myc-DDK). The glycosylated MUC16c57-114-pFUSE protein was combined with LGALS3 (0.13 μg) and EGFR (0.13 μg) protein and then rotated at 4 °C for 1 hour. Pre-blocked Protein A/G PLUS Agarose microspheres were added and rotated at 4 °C overnight. The IP pellets were washed extensively, boiled in loading buffer, and separated by 10% SDS-PAGE gel electrophoresis, then transferred to nitrocellulose membrane. The membrane was probed with polyclonal anti-EGFR-v3, anti-4H11-HRP, or anti-LGALS3 antibodies. As shown, 4H11 binding showed that MUC16c57-114-pFUSE was consistently present. LGALS3 bound in the lane positive for MUC16c57-114-pFUSE, but EGFR was only detected when both LGALS3 and MUC16c57-114-pFUSE were present. The presence of the monoclonal MUC16 Glycosylation Antibody 18C6 prevented the formation of these protein complexes of LGALS3, EGFR, and MUC16 (right lanes). Figure 24B depicts the colocalization of MUC16 and EGFR protein. Immunofluorescence staining of wild-type OVCAR3 cells or SKOV3 cells transfected with phrGFP expressing MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “SKOV3c344”) or with phrGFP expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “SKOV3c114”) with EGFR-A647 and 4H11-PE for MUC16, or a combination of both EGFR-A647 and 4H11-PE reagents for MUC16. Microscopic images (50 μm scale) indicated colocalization of EGFR and MUC16c114 in all three cell lines (see arrows). Figure 24C represents immunoblot (IB) and immunoprecipitation (IP) of three glycosylated proteins (Integrin β1Myc-DDK; MUC16c57-114-pFUSE; and LGALS3Myc-DDK). In general, the same methods as in Figure 24A were used. Western blot analysis of immunoblot and all immunoprecipitated samples was performed on a 10% SDS-PAGE gel, transferred to nitrocellulose membrane, and probed with anti-4C5-DDK for Integrin β1 or anti-4H11-HRP or anti-4C5-DDK for LGALS3 antibodies. As with EGFR, all three proteins were required to coprecipitate the Integrin β1 protein. MUC16 Glycosylation Antibody 18C6 also blocked the combination of MUC16, LGALS3, and Integrin β1 as shown in the right three lanes. Figure 24D depicts the colocalization of MUC16 and Integrin β1 proteins. Immunofluorescence staining of wild-type OVCAR3 cells or SKOV3 cells transfected with phrGFP expressing MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “SKOV3c344”) or with phrGFP expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “SKOV3c114”) with Integrin β1-A647 or 4H11-PE for MUC16 or a combination of both reagents Integrin β1-A647 or 4H11-PE for MUC16. Microscopic images (50 μm scale) indicated colocalization of Integrin β1 and MUC16 in OVCAR3, SKOV3c344, and SKOV3c114 cells (see arrows).

[188] A Figura 25A representa o manchamento por imunofluorescência de células OVCAR3 do tipo selvagem ou células SKOV3 transfectadas com phrGFP que expressa MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “SKOV3c344”) ou com phrGFP que expressa MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “SKOV3c114”) ou linhagens celulares SKOV3c344 ou SKOV3c114 com EGFR-A647 ou 4H11-PE para MUC16 ou uma combinação de ambos os reagentes. As imagens microscópicas (escala 100 μm) indicaram claramente a colocalização de EGFR e MUC16 (consultar as setas). Figura 25 B: O manchamento por imunofluorescência de OVCAR3 ou SKOV3c344 do tipo selvagem ou linhagens celulares com Integrina β1-A647 ou 4H11-PE para MUC16 ou uma combinação de ambos os reagentes. As imagens microscópicas (escala 100 μm) indicaram claramente a colocalização de Integrina β1 e MUC16 (consultar as setas).[188] Figure 25A depicts immunofluorescence staining of wild-type OVCAR3 cells or SKOV3 cells transfected with phrGFP expressing MUC16c344 (SEQ ID NO: 132; “SKOV3c344”) or with phrGFP expressing MUC16c114 (SEQ ID NO: 133; “SKOV3c114”) or SKOV3c344 or SKOV3c114 cell lines with EGFR-A647 or 4H11-PE for MUC16 or a combination of both reagents. Microscopic images (100 μm scale) clearly indicated colocalization of EGFR and MUC16 (see arrows). Figure 25B: Immunofluorescence staining of wild-type OVCAR3 or SKOV3c344 cell lines with Integrin β1-A647 or 4H11-PE for MUC16 or a combination of both reagents. Microscopic images (100 μm scale) clearly indicated colocalization of Integrin β1 and MUC16 (see arrows).

[189] A Figura 26A à Figura 26D representam um modelo de Promoção de Tumor MUC16. A Figura 26A representa uma ilustração de relações de EGFR-LGALS3-MUC16 e LGALS3-Integrina β1-MUC16. A transdução de sinal de SRC/ERK/AKT por EGFR ou de SRC/FAK por Integrina β1 dependeu da interação de MUC16 e molécula desinalização com parâmetros de LGALS3. A Figura 26B representa um modelo para perda de glicosilação: em linhagens celularestransfectadas com shMGAT5, a N-glicosilação nos locais em MUC16, EGFR e Integrina β1 foi reduzida pela perda das estruturas tetra- antenárias, resultando em nenhuma ligação com LGALS3. A Figura 26C representa um modelo para perda de galectina-3: em linhagens celulares transfectadas por shLGALS3, embora os locais de N- glicosilação em MUC16 estivessem presentes, a ausência de ligação com LGALS3 resultou em uma perda de associação de MUC16/EGFR ou MUC16/Integrina β1 e redução de sinais de dentro para fora. A Figura 26D representa um modelo para inibidores potenciais para interações de MUC16/LGALS3. As células MUC16(+) expostas a Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou receptores simulados “falsos” (anti-MUC16c57-114pFUSE ou 117-244LGALS3-pFUSE)falharam em se ligar com géis de LGALS3 e subsequentemente também com EGFR ou Integrina β1.[189] Figure 26A to Figure 26D depict a model of MUC16 tumor promotion. Figure 26A depicts an illustration of EGFR-LGALS3-MUC16 and LGALS3-Integrin β1-MUC16 relationships. Signal transduction of SRC/ERK/AKT by EGFR or of SRC/FAK by Integrin β1 depended on the interaction of MUC16 and designaling molecule parameters of LGALS3. Figure 26B depicts a model for loss of glycosylation: in cell lines transfected with shMGAT5, N-glycosylation at sites on MUC16, EGFR, and Integrin β1 was reduced by the loss of the tetra-antennary structures, resulting in no binding to LGALS3. Figure 26C depicts a model for galectin-3 loss: in shLGALS3-transfected cell lines, although N-glycosylation sites on MUC16 were present, the absence of binding to LGALS3 resulted in a loss of MUC16/EGFR or MUC16/Integrin β1 association and reduced inside-out signals. Figure 26D depicts a model for potential inhibitors for MUC16/LGALS3 interactions. MUC16(+) cells exposed to MUC16 Glycosylation Antibody or mock “mock” receptors (anti-MUC16c57-114pFUSE or 117-244LGALS3-pFUSE) failed to bind to LGALS3 gels and subsequently also to EGFR or Integrin β1.

[190] A Figura 27A representa a amida peptídica de 55-mer N- acetilada protegida por cadeia lateral (SEQ ID NO: 129). A Figura 27B representa os resíduos de ESI-MS e UV da análise por UPLC para glicopeptídeo p55-mer[N1-S55]. Calculado paraC486H760N84O111S8, 9.812,25 (isótopos médios) [M+5H]5+ m/z 1.963,45,encontrou 1.963,20; [M+6H]6+ m/z 1.636,38, encontrou 1.636,24;[M+7H]7+ m/z 1.402,75, encontrou 1.402,74. Coluna BEH C4, gradiente: 80 a 99% de acetonitrila/água durante 6 minutos a uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min.[190] Figure 27A depicts the side chain-protected N-acetylated 55-mer peptide amide (SEQ ID NO: 129). Figure 27B depicts ESI-MS and UV residues from UPLC analysis for glycopeptide p55-mer[N1-S55]. Calculated for C486H760N84O111S8, 9812.25 (average isotopes) [M+5H]5+ m/z 1963.45, found 1963.20; [M+6H]6+ m/z 1636.38, found 1636.24; [M+7H]7+ m/z 1402.75, found 1402.74. BEH C4 column, gradient: 80 to 99% acetonitrile/water for 6 minutes at a flow rate of 0.3 ml/min.

[191] A Figura 28A representa o glicopeptídeo de 55-mer que porta chitobiose: “55-mer(chitobiose)[N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer) (SEQ ID NO: 129). A Figura 28B representa os resíduos de ESI-MS e UV da análise por UPLC para glicopeptídeo “55 mer(chitobiose) [N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer). Calculado para C291H463N87O97S,6.764,38 (isótopos médios) [M+4H]4+ m/z 1.692,10, encontrou 1.692,01; [M+5H]5+ m/z 1.353,88, encontrou 1.353,86; [M+6H]6+ m/z1.128,40, encontrou 1.128,41; [M+7H]7+ m/z 967,34, encontrou 967,45; [M+8H]8+ m/z 846,55, encontrou 846,27. Coluna BEH C4,gradiente: 20 a 40% de acetonitrila/água durante 6 minutos a uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min.[191] Figure 28A depicts the 55-mer glycopeptide bearing chitobiose: “55-mer(chitobiose)[N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer) (SEQ ID NO: 129). Figure 28B depicts the ESI-MS and UV residues from UPLC analysis for glycopeptide “55 mer(chitobiose)[N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer). Calculated for C291H463N87O97S,6764.38 (mid isotopes) [M+4H]4+ m/z 1692.10, found 1692.01; [M+5H]5+ m/z 1353.88, found 1353.86; [M+6H]6+ m/z1128.40, found 1128.41; [M+7H]7+ m/z 967.34, found 967.45; [M+8H]8+ m/z 846.55, found 846.27. BEH C4 column, gradient: 20 to 40% acetonitrile/water for 6 minutes at a flow rate of 0.3 ml/min.

[192] A Figura 29A representa o glicopeptídeo de 55-mer que porta Man3GlcNAc2: “55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55- mer) (SEQ ID NO: 129). A Figura 29B representa os resíduos de ESI-MS e UV de análise por HPLC analítica para glicopeptídeo “55 mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer). Calculado paraC309H493N87O112S, 7.250,80 (isótopos médios) [M+4H]4+ m/z 1.813,70, encontrou 1.813,52; [M+5H]5+ m/z 1.451,16, encontrou 1.451,02;[M+6H]6+ m/z 1.209,47, encontrou 1.209,33; [M+7H]7+ m/z 1.036,83,encontrou 1.036,74. Coluna Waters X-Bridge C18, gradiente: 25 a 35% de acetonitrila/água durante 30 minutos a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min.[192] Figure 29A depicts the 55-mer glycopeptide bearing Man3GlcNAc2: “55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer) (SEQ ID NO: 129). Figure 29B depicts the ESI-MS and UV residues from analytical HPLC analysis for glycopeptide “55 mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer). Calculated for C309H493N87O112S, 7250.80 (average isotopes) [M+4H]4+ m/z 1813.70, found 1813.52; [M+5H]5+ m/z 1451.16, found 1451.02; [M+6H]6+ m/z 1209.47, found 1209.33; [M+7H]7+ m/z 1036.83, found 1036.74. Waters X-Bridge C18 column, gradient: 25 to 35% acetonitrile/water for 30 min at a flow rate of 0.2 ml/min.

[193] A Figura 30A representa o peptídeo de 15-mer protegido com cadeia lateral (p15-mer[C-G25-V38]) (SEQ ID NO: 131). AFigura 30B representa o glicopeptídeo de 15-mer monoglicosilado com chitobiose: 15-mer(chitobiose)[C-G25-V38] (GlcNAc2-15-mer)(SEQ ID NO: 132). A Figura 30C representa resíduos de ESI-MS e UV de análise por HPLC analítica para glicopeptídeo “15 mer(chitobiose)[C-G25-V38]” (GlcNAc2-15-mer). Calculado para C87H142N24O35S, 2.116,26 (isótopos médios) [2M+3H]3+ m/z 1.411,84, encontrou 1.412,02; [M+2H]2+ m/z 1.059,13, encontrou 1.059,15;[M+3H]3+ m/z 706,42, encontrou 706,46. Coluna Varian Microsorb 300-5 C18, gradiente: 15 a 30% de acetonitrila/água durante 30minutos a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min.[193] Figure 30A depicts the side chain protected 15-mer peptide (p15-mer[C-G25-V38]) (SEQ ID NO: 131). Figure 30B depicts the chitobiose monoglycosylated 15-mer glycopeptide: 15-mer(chitobiose)[C-G25-V38] (GlcNAc2-15-mer) (SEQ ID NO: 132). Figure 30C depicts ESI-MS and UV residues from analytical HPLC analysis for glycopeptide “15mer(chitobiose)[C-G25-V38]” (GlcNAc2-15-mer). Calculated for C87H142N24O35S, 2116.26 (average isotopes) [2M+3H]3+ m/z 1411.84, found 1412.02; [M+2H]2+ m/z 1059.13, found 1059.15;[M+3H]3+ m/z 706.42, found 706.46. Varian Microsorb 300-5 C18 column, gradient: 15 to 30% acetonitrile/water over 30 minutes at a flow rate of 0.2 ml/min.

[194] A Figura 31A representa o peptídeo de 18-mer protegido por cadeia lateral (p18-mer[C-G22-V38]) (AF-I-165) (SEQ ID NO: 130). A Figura 31B representa o glicopeptídeo de 18-mer biglicosilado com chitobiose: “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer] (SEQ ID NO: 130). A Figura 31C representa os resíduos de ESI-MS e UV de análise por HPLC analítica para glicopeptídeo “18 mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer]. Calculado para C117H193N33O50S, 2894,04 (isótopos médios)[2M+3H]3+ m/z 1930,36, encontrou 1930,22; [M+2H]2+ m/z 1448,02,encontrou 1447,65; [M+3H]3+ m/z 965,68, encontrou 965,25. ColunaVarian Microsorb 300-5 C8, gradiente: 15 a 30% deacetonitrila/água durante 30 minutos a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min.[194] Figure 31A depicts the side chain protected 18-mer peptide (p18-mer[C-G22-V38]) (AF-I-165) (SEQ ID NO: 130). Figure 31B depicts the chitobiose biglycosylated 18-mer glycopeptide: “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer] (SEQ ID NO: 130). Figure 31C depicts the ESI-MS and UV residues from analytical HPLC analysis for glycopeptide “18mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer]. Calculated for C117H193N33O50S, 2894.04 (middle isotopes)[2M+3H]3+ m/z 1930.36, found 1930.22; [M+2H]2+ m/z 1448.02, found 1447.65; [M+3H]3+ m/z 965.68, found 965.25. Varian Microsorb 300-5 C8 column, gradient: 15 to 30% deacetonitrile/water over 30 min at a flow rate of 0.2 ml/min.

[195] A Figura 32A representa glicopeptídeo “15- mer(chitobiose)[C-G25-V38]”, conjugado com KLH (SEQ ID NO: 131). A Figura 32B representa glicopeptídeo “18-mer(chitobiose)2[C- T22-V38]” conjugado com KLH (SEQ ID NO: 130).[195] Figure 32A represents glycopeptide “15-mer(chitobiose)[C-G25-V38]”, conjugated with KLH (SEQ ID NO: 131). Figure 32B represents glycopeptide “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” conjugated with KLH (SEQ ID NO: 130).

5. Detailed description

[196] São fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos e polipeptídeos, incluindo tais anticorpos ou fragmentos, tais como proteínas de fusão, conjugados e/ou receptores de antígeno quiméricos, assim como células que expressam os mesmos. Entre os anticorpos e fragmentos estão aqueles que especificamente se ligam com epítopos de uma proteína MUC16. Tais anticorpos são denominados no presente documento como “Anticorpos de Glicosilação de MUC16”. Tais epítopos são tipicamente epítopos dentro ou substancialmente dentro de uma porção extracelular de uma molécula de MUC16, de modo geral, uma forma não removida de MUC16; em algumas modalidades, o epítoponão está dentro de, ou o anticorpo ou fragmento não está ligado com, uma região de repetição em tandem de MUC16 e/ou uma formasecretada de MUC16. Em algumas modalidades, o epítopo está dentroou inclui resíduos dentro de MUC16c114 e tipicamente inclui umou mais resíduos glicosilados ou locais de glicosilação no mesmo. Em algumas modalidades, o epítopo inclui um ou mais locais de glicosilação, tais como locais para N-glicosilação. Em alguns aspectos, o epítopo inclui um resíduo de asparagina correspondente a Asn1806 ou Asn1800 da sequência de MUC16 apresentada na SEQ ID NO: 150 (e/ou uma forma (ou formas)glicosilada da mesma); em alguns aspectos, o epítopo inclui um resíduo de asparagina correspondente a Asn1806 da SEQ ID NO: 150, mas não inclui um resíduo de asparagina correspondente aAsn1800 da SEQ ID NO: 150; em alguns aspectos, o epítopo incluium resíduo de asparagina correspondente a Asn1800 da SEQ ID NO:150, mas não inclui um resíduo de asparagina correspondente aAsn1806 da SEQ ID NO: 150. Em algumas de qualquer uma de tais modalidades, tal uma ou mais asparaginas são glicosiladas, tal como N-glicosilada. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento se liga com um epítopo dentro ou que inclui resíduos dentro da SEQ ID NO: 131; se liga com um epítopo dentro ou queinclui resíduos dentro da SEQ ID NO: 130, ou uma combinação dosmesmos; em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento não seliga imunoespecificamente dentro de uma região de MUC16 correspondente à SEQ ID NO: 168 ou dentro dos resíduos 2 a 19 daSEQ ID NO: 168.[196] Provided are antibodies and antigen-binding fragments thereof and polypeptides, including such antibodies or fragments, such as fusion proteins, conjugates, and/or chimeric antigen receptors, as well as cells expressing the same. Among the antibodies and fragments are those that specifically bind with epitopes of a MUC16 protein. Such antibodies are referred to herein as “MUC16 Glycosylation Antibodies.” Such epitopes are typically epitopes within or substantially within an extracellular portion of a MUC16 molecule, generally an unremoved form of MUC16; in some embodiments, the epitope is not within, or the antibody or fragment is not bound with, a tandem repeat region of MUC16 and/or a secreted form of MUC16. In some embodiments, the epitope is within or includes residues within MUC16c114 and typically includes one or more glycosylated residues or glycosylation sites therein. In some embodiments, the epitope includes one or more glycosylation sites, such as sites for N-glycosylation. In some aspects, the epitope includes an asparagine residue corresponding to Asn1806 or Asn1800 of the MUC16 sequence set forth in SEQ ID NO: 150 (and/or a glycosylated form(s) thereof); in some aspects, the epitope includes an asparagine residue corresponding to Asn1806 of SEQ ID NO: 150, but does not include an asparagine residue corresponding to Asn1800 of SEQ ID NO: 150; In some aspects, the epitope includes an asparagine residue corresponding to Asn1800 of SEQ ID NO:150, but does not include an asparagine residue corresponding to Asn1806 of SEQ ID NO:150. In some of any such embodiments, such one or more asparagines are glycosylated, such as N-glycosylated. In some embodiments, the antibody or fragment binds to an epitope within or that includes residues within SEQ ID NO:131; binds to an epitope within or that includes residues within SEQ ID NO:130, or a combination thereof; in some embodiments, the antibody or fragment does not immunospecifically bind within a region of MUC16 corresponding to SEQ ID NO:168 or within residues 2 to 19 of SEQ ID NO:168.

[197] Em um aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais), e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que (i) se ligam imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) carecem de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) inibem a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16. Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais), e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que (i) se ligam imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) carecem de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, sendo que a terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) inibem a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16. Em uma modalidade preferencial, os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento se ligam imunoespecificamente com um epítopo que compreende o resíduo de aminoácido 1806 (Asn1806) da SEQ ID NO: 150, em que Asn1806 é N-glicosilado (denominado no presente documento como “Glicosilação de Asn1806”). Conforme mostrado nos exemplos da Seção 0 no presente documento, a Glicosilação de Asn1806 é essencial para a invasão mediada por MUC16 e o crescimento de células tumorais. Assim, os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento têm capacidade para bloquear por ligação tal invasão e crescimento de células tumorais.[197] In one aspect, provided herein are antibodies (e.g., monoclonal antibodies), and antigen-binding fragments thereof, that (i) immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lack immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibit matrigel invasion in vitro of cells recombinantly expressing said first form of MUC16. In another aspect, provided herein are antibodies (e.g., monoclonal antibodies), and antigen-binding fragments thereof, that (i) immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lack immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a third form of MUC16, wherein the third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibit matrigel invasion in vitro of cells recombinantly expressing said first form of MUC16. In a preferred embodiment, the MUC16 Glycosylation Antibodies and antigen-binding fragments thereof described herein immunospecifically bind to an epitope comprising amino acid residue 1806 (Asn1806) of SEQ ID NO: 150, wherein Asn1806 is N-glycosylated (referred to herein as “Asn1806 Glycosylation”). As shown in the examples in Section 0 herein, Asn1806 Glycosylation is essential for MUC16-mediated invasion and growth of tumor cells. Thus, the MUC16 Glycosylation Antibodies and antigen-binding fragments thereof described herein are capable of blocking such invasion and growth of tumor cells by binding.

[198] Em uma modalidade, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo exige um Asn1800 N-glicosilado além de um Asn1806 N-glicosilado para ligação com MUC16 (isto é, ambos os locais N-glicosilados são parte do epítopo reconhecido pelo Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo). “Asn1800” se refere ao resíduo de aminoácido 1800 da SEQ ID NO: 150. Tal Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; e (ii) sua carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma quinta forma de MUC16, sendo que a quinta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quinta forma é a SEQ ID NO: 172, em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é o mesmo tipo de célula que a célula que expressa de maneira recombinante a quinta forma de MUC16.[198] In one embodiment, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof requires an N-glycosylated Asn1800 in addition to an N-glycosylated Asn1806 for binding to MUC16 (i.e., both N-glycosylated sites are part of the epitope recognized by the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof). “Asn1800” refers to amino acid residue 1800 of SEQ ID NO: 150. Such a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof can be identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; and (ii) its lack of immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a fifth form of MUC16, wherein the fifth form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fifth form is SEQ ID NO: 172, wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16 is the same cell type as the cell that recombinantly expresses the fifth form of MUC16.

[199] Em uma modalidade, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo exige um Asn1806 N-glicosilado, mas não exige um Asn1800 N-glicosilado para ligação com MUC16 (isto é, Asn1806 N-glicosilado é parte do epítopo reconhecido pelo Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, mas Asn1800 N- glicosilado não é parte do epítopo reconhecido pelo Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo). Tal Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) sua carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, sendo que a terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quinta forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, sendo que a quarta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é a SEQ ID NO: 152; e (iii) em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma de MUC16 são do mesmo tipo de célula.[199] In one embodiment, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof requires an N-glycosylated Asn1806, but does not require an N-glycosylated Asn1800 for binding to MUC16 (i.e., N-glycosylated Asn1806 is part of the epitope recognized by the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof, but N-glycosylated Asn1800 is not part of the epitope recognized by the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof). Such a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof can be identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a third form of MUC16, wherein the third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fifth form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its ability to immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a fourth form of MUC16, wherein the fourth form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152; and (iii) wherein the cell recombinantly expressing the first form of MUC16, the cell recombinantly expressing the third form of MUC16, and the cell recombinantly expressing the fourth form of MUC16 are of the same cell type.

[200] A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 é também denominada no presente documento MUC16c114 e consiste nos 114 resíduos de aminoácido C-terminais de MUC16 madura (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 madura). MUC16c114 tem capacidade para ser N-glicosilada nos resíduos deaminoácido asparagina nas posições 1, 24 e 30 da SEQ ID NO: 133(correspondentes às posições de aminoácidos Asn1777, Asn1800 eAsn1806 da SEQ ID NO: 150).[200] The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 is also referred to herein as MUC16c114 and consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16). MUC16c114 is capable of being N-glycosylated at the asparagine amino acid residues at positions 1, 24, and 30 of SEQ ID NO: 133 (corresponding to amino acid positions Asn1777, Asn1800, and Asn1806 of SEQ ID NO: 150).

[201] A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 139 é também denominada no presente documento MUC16c114- N3. MUC16c114-N3 consiste nos 114 resíduos de aminoácido C-terminais de MUC16 madura (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 madura), exceto pelo fato de que a asparagina na posição de aminoácido 30 (correspondente à posição de aminoácido 1806 da SEQ ID NO: 150) sofreu mutação em uma alanina. Assim, MUC16c114- N3 não tem capacidade para ser N-glicosilado na posição deaminoácido 30 da SEQ ID NO: 139 (correspondente à posição de aminoácido Asn1806 da SEQ ID NO: 150).[201] The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139 is also referred to herein as MUC16c114-N3. MUC16c114-N3 consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16), except that the asparagine at amino acid position 30 (corresponding to amino acid position 1806 of SEQ ID NO: 150) has been mutated to an alanine. Thus, MUC16c114-N3 is incapable of being N-glycosylated at amino acid position 30 of SEQ ID NO: 139 (corresponding to amino acid position Asn1806 of SEQ ID NO: 150).

[202] A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 152 é também denominada no presente documento MUC16c114-N2. MUC16c114-N2 consiste nos 114 resíduos de aminoácido C-terminais de MUC16 madura (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 madura), exceto pelo fato de que a asparagina na posição de aminoácido 24 (correspondente à posição de aminoácido Asn1800 da SEQ ID NO: 150) sofreu mutação em uma alanina. Assim, MUC16c114- N2 não tem capacidade para ser N-glicosilado na posição deaminoácido 24 da SEQ ID NO: 152 (correspondente à posição de aminoácido Asn1800 da SEQ ID NO: 150).[202] The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152 is also referred to herein as MUC16c114-N2. MUC16c114-N2 consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16), except that the asparagine at amino acid position 24 (corresponding to amino acid position Asn1800 of SEQ ID NO: 150) has been mutated to an alanine. Thus, MUC16c114-N2 is incapable of being N-glycosylated at amino acid position 24 of SEQ ID NO: 152 (corresponding to amino acid position Asn1800 of SEQ ID NO: 150).

[203] A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 172 é também denominada no presente documento MUC16c114- N23. MUC16c114-N23 consiste nos 114 resíduos de aminoácido C- terminais de MUC16 madura (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 madura), exceto pelo fato de que as asparaginas nas posições de aminoácido 24 e 30 (correspondentes às posições de aminoácido Asn1800 e Asn1806 da SEQ ID NO: 150) sofreram mutação em alaninas. Assim, MUC16c114-N23 não tem capacidade para ser N-glicosilado nas posições de aminoácido 24 e 30 da SEQ ID NO: 157 (correspondentes às posições de aminoácidos Asn1800 e Asn1806 da SEQ ID NO: 150).[203] The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 172 is also referred to herein as MUC16c114-N23. MUC16c114-N23 consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16), except that the asparagines at amino acid positions 24 and 30 (corresponding to amino acid positions Asn1800 and Asn1806 of SEQ ID NO: 150) have been mutated to alanines. Thus, MUC16c114-N23 is incapable of being N-glycosylated at amino acid positions 24 and 30 of SEQ ID NO: 157 (corresponding to amino acid positions Asn1800 and Asn1806 of SEQ ID NO: 150).

[204] São também fornecidas no presente documento cadeias pesadas e cadeias leves, em que um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as ditas cadeias pesadas e leves (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligaçãoimunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16. São também fornecidos no presente documento polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos isolados) que compreendem sequências de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA complementar (cDNA)), que codificam tais anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, cadeias pesadas ou cadeias leves. São fornecidos adicionalmente vetores (por exemplo, vetores de expressão) e células (por exemplo, células isoladas ou células ex vivo) que compreendem polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos isolados) que compreendem sequências de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA complementar (cDNA)), que codificam tais anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, cadeias pesadas ou cadeias leves. São também fornecidos métodos para produzir tais anticorpos, fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, cadeias pesadas, cadeias leves, vetores e células. Em outros aspectos, são fornecidos no presente documento métodos e usos para atividade de MUC16 e/ou crescimento tumoral acionado porMUC16 ou tratar ou gerir certas afecções ou distúrbios descritosno presente documento, tal como tratar ou gerir câncer. São também fornecidas composições (por exemplo, composições farmacêuticas), kits e métodos de diagnóstico relacionados.[204] Also provided herein are heavy chains and light chains, wherein a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising said heavy and light chains (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16. Also provided herein are polynucleotides (e.g., isolated polynucleotides) comprising nucleic acid sequences (e.g., complementary DNA (cDNA)) encoding such antibodies, and antigen-binding fragments thereof, heavy chains, or light chains. Further provided are vectors (e.g., expression vectors) and cells (e.g., isolated cells or ex vivo cells) comprising polynucleotides (e.g., isolated polynucleotides) comprising nucleic acid sequences (e.g., complementary DNA (cDNA)) encoding such antibodies, and antigen-binding fragments thereof, heavy chains, or light chains. Also provided are methods for producing such antibodies, antigen-binding fragments thereof, heavy chains, light chains, vectors, and cells. In other aspects, provided herein are methods and uses for inhibiting MUC16 activity and/or MUC16-driven tumor growth, or treating or managing certain conditions or disorders described herein, such as treating or managing cancer. Compositions (e.g., pharmaceutical compositions), kits, and related diagnostic methods are also provided.

[205] Conforme usado no presente documento, o termo “MUC16”ou “polipeptídeo de MUC16” ou “peptídeo de MUC16” se refere àproteína de mucina aglutinada MUC16 conforme descrito em Yin BWe Lloyd KO, 2001, J Biol Chem. 276(29):27.371 a 27.375. O númerode acesso ao GenBank™ NM_024690.2 (SEQ ID NO: 137) fornece umasequência de ácidos nucleicos de MUC16 humana exemplificativa. O número de acesso ao GenBank™ NP_078966.2 (SEQ ID NO: 136)fornece uma sequência de aminoácidos de MUC16 humana exemplificativa. A MUC16 nativa compreende um domínio intracelular, um domínio transmembranar, um ectodomínio proximal ao local de clivagem putativo e uma grande região altamente glicosilada de 12 a 20 repetições, cada uma com 156 aminoácidos de comprimento (Figura 1A). MUC16 “imatura” se refere à SEQ ID NO: 136, que compreende a sequência de sinalização de MUC16(resíduos de aminoácido 1 a 60 da SEQ ID NO: 136). “MUC16 madura” se refere à MUC16 nativa conforme expressa na superfície celular, isto é, em que a sequência de sinalização foi removida por processamento celular, por exemplo, a SEQ ID NO: 150, em que os primeiros 60 resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 136 foram removidos (isto é, a SEQ ID NO: 136 é a forma “imatura” de MUC16).[205] As used herein, the term “MUC16” or “MUC16 polypeptide” or “MUC16 peptide” refers to the clumped mucin protein MUC16 as described in Yin BW and Lloyd KO, 2001, J Biol Chem. 276(29):27371-27375. GenBank™ accession number NM_024690.2 (SEQ ID NO: 137) provides an exemplary human MUC16 nucleic acid sequence. GenBank™ accession number NP_078966.2 (SEQ ID NO: 136) provides an exemplary human MUC16 amino acid sequence. Native MUC16 comprises an intracellular domain, a transmembrane domain, an ectodomain proximal to the putative cleavage site, and a large, highly glycosylated region of 12 to 20 repeats, each 156 amino acids in length (Figure 1A). “Immature” MUC16 refers to SEQ ID NO: 136, which comprises the MUC16 signal sequence (amino acid residues 1 to 60 of SEQ ID NO: 136). “Mature MUC16” refers to native MUC16 as expressed on the cell surface, i.e., in which the signal sequence has been removed by cellular processing, e.g., SEQ ID NO: 150, in which the first 60 amino acid residues of SEQ ID NO: 136 have been removed (i.e., SEQ ID NO: 136 is the “immature” form of MUC16).

[206] Em relação aos nomes do anticorpo, (i) 18C6 e 18C6.D12são usados de forma intercambiável, (ii) 10C6 e 10C6.E4 são usados de forma intercambiável, (iii) 19C11 e 19C11.H6 são usados de forma intercambiável e (iv) 7B12 e 7B12.B3 são usados de forma intercambiável. Os subclones do anticorpo (isto é, 18C6.D12, 10C6.E4, 19C11.H6 e 7B12.B3) foram usados nos experimentosdescritos na Seção 0.5.1 Anticorpos[206] Regarding the antibody names, (i) 18C6 and 18C6.D12 are used interchangeably, (ii) 10C6 and 10C6.E4 are used interchangeably, (iii) 19C11 and 19C11.H6 are used interchangeably, and (iv) 7B12 and 7B12.B3 are used interchangeably. The antibody subclones (i.e., 18C6.D12, 10C6.E4, 19C11.H6, and 7B12.B3) were used in the experiments described in Section 0.5.1 Antibodies

[207] Os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos podem incluir, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos produzidos de maneira recombinante, anticorpos monoespecíficos, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorposbiespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, imunoglobulinas, anticorpos sintéticos, anticorpos tetraméricos que compreendem duas moléculas de cadeia pesada e duas de cadeia leve, um monômero de cadeia leve de anticorpo, um monômero de cadeia pesada de anticorpo, um dímero de cadeia leve de anticorpo, um dímero de cadeia pesada de anticorpo, um par de cadeia leve de anticorpo e cadeia pesada de anticorpo, anticorpos intracelulares, anticorpos de domínio único, anticorpos monovalentes, anticorpos de cadeia única ou fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), anticorpos camelizados, affybodies e Fvs ligados por dissulfeto (dsFv) ou fragmentos dos mesmos. Tais anticorpos podem ser produzidos por métodos conhecidos na técnica.[207] MUC16 Glycosylation Antibodies or antigen-binding fragments thereof may include, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinantly produced antibodies, monospecific antibodies, multispecific antibodies (including bispecific antibodies), human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, immunoglobulins, synthetic antibodies, tetrameric antibodies comprising two heavy and two light chain molecules, an antibody light chain monomer, an antibody heavy chain monomer, an antibody light chain dimer, an antibody heavy chain dimer, an antibody light chain and antibody heavy chain pair, intracellular antibodies, single domain antibodies, monovalent antibodies, single chain antibodies or single chain variable fragments (scFv), camelized antibodies, affybodies, and disulfide-linked Fvs (dsFv) or fragments thereof. Such antibodies may be produced by methods known in the art.

[208] Um anticorpo multiespecífico ou fragmento do mesmo se refere a um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga simultaneamente com pelo menos dois alvos que são de estrutura diferente, por exemplo, dois antígenos diferentes, dois epítopos diferentes no mesmo antígeno ou um hapteno e um antígeno ou epítopo. Uma especificidade poderia ser, por exemplo, para um antígeno ou epítopo de célula B, célula T, mieloide, plasmática ou mastócito, tal como, por exemplo, CD3. Outra especificidade poderia ser para um antígeno diferente em um tipo de célula igual ou diferente, tal como, por exemplo, MUC16. Anticorpos multivalentes, multiespecíficos são construtos que têm mais de um local de ligação, e os locais de ligação são de especificidade diferente, por exemplo, um diacorpo biespecífico, em que um local de ligação reage com um antígeno e o outro com outro antígeno.[208] A multispecific antibody or fragment thereof refers to an antibody or fragment thereof that binds simultaneously to at least two targets that are of different structure, for example, two different antigens, two different epitopes on the same antigen, or a hapten and an antigen or epitope. One specificity could be, for example, for a B cell, T cell, myeloid, plasma, or mast cell antigen or epitope, such as, for example, CD3. Another specificity could be for a different antigen on the same or different cell type, such as, for example, MUC16. Multivalent, multispecific antibodies are constructs that have more than one binding site, and the binding sites are of different specificity, for example, a bispecific diabody, in which one binding site reacts with one antigen and the other with another antigen.

[209] Um anticorpo biespecífico é um anticorpo que pode se ligar simultaneamente com dois alvos que são de estrutura diferente. Os anticorpos biespecíficos (bsAb) e fragmentos de anticorpo biespecífico (bsFab) têm pelo menos um braço que se liga imunoespecificamente com um primeiro alvo, por exemplo, MUC16, e pelo menos um outro braço que se liga imunoespecificamente com um segundo alvo, tal como, por exemplo, CD3. Uma variedade de proteínas de fusão biesfecíficas pode ser produzida com o uso de engenharia molecular. Em uma forma, a proteína de fusão biespecífica é divalente, consistindo em, por exemplo, (i) um scFv com um local de ligação único para um antígeno e (ii) um anticorpo ou um fragmento Fab com um local de ligação único para um segundo antígeno. Em outra forma, a proteína de fusão biespecífica é tetravalente, consistindo em, por exemplo, uma IgG com dois locais de ligação para um antígeno e dois scFv idênticos para um segundo antígeno. Consultar, por exemplo, a Publicação Internacional no WO 2011/1160119, que está incorporada a título de referência em sua totalidade ao presente documento.[209] A bispecific antibody is an antibody that can simultaneously bind two targets that are structurally different. Bispecific antibodies (bsAb) and bispecific antibody fragments (bsFab) have at least one arm that immunospecifically binds a first target, e.g., MUC16, and at least one other arm that immunospecifically binds a second target, e.g., CD3. A variety of bispecific fusion proteins can be produced using molecular engineering. In one form, the bispecific fusion protein is divalent, consisting of, e.g., (i) an scFv with a single binding site for one antigen and (ii) an antibody or a Fab fragment with a single binding site for a second antigen. In another form, the bispecific fusion protein is tetravalent, consisting of, e.g., an IgG with two binding sites for one antigen and two identical scFvs for a second antigen. See, for example, International Publication No. WO 2011/1160119, which is incorporated by reference in its entirety herein.

[210] Os métodos recentes para produzir anticorpos monoclonais biespecíficos incluem o uso de anticorpos monoclonais recombinantes modificados geneticamente que têm resíduos de cisteína adicionais de modo que os mesmos se reticulem mais fortemente do que os isotipos de imunoglobulina mais comuns. Consultar, por exemplo, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1.221 a 1.225, 1997. Outra abordagem é modicar geneticamente proteínas de fusão recombinantes que ligam dois ou mais segmentos de anticorpo de cadeia única ou fragmento de anticorpo diferentes com as especificidades duplas necessárias. Consultar, por exemplo, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159 a 163, 1997. Uma variedade de proteínas de fusão biesfecíficas pode ser produzida com o uso de engenharia molecular.[210] Recent methods for producing bispecific monoclonal antibodies include the use of genetically modified recombinant monoclonal antibodies that have additional cysteine residues so that they cross-link more tightly than more common immunoglobulin isotypes. See, for example, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221–1225, 1997. Another approach is to genetically modify recombinant fusion proteins that link two or more different single-chain antibody segments or antibody fragments with the required dual specificities. See, for example, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159–163, 1997. A variety of bispecific fusion proteins can be produced using molecular engineering.

[211] As proteínas de fusão biespecíficas que ligam dois ou mais anticorpos de cadeia única ou fragmentos de anticorpo diferentes podem ser produzidas de maneira similar. Os métodos recombinantes podem ser usados para produzir uma variedade de proteínas de fusão. Em certos aspectos, um ligante flexível conecta um scFv (por exemplo, um scFv que direciona CD3) com a região constante da cadeia leve de um anticorpo monoclonal (por exemplo, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 descrito no presente documento; consultar a Seção 5.1). As sequências ligantes adequadas necessárias para a conexão em estrutura do Fc de cadeia pesada com o scFv são introduzidas nos domínios de VL e Vkappa através de reações PCR. O fragmento de DNA que codifica o scFv é, então, ligado em um vetor de preparação contendo uma sequência de DNA que codifica o domínio de CHI. O construto resultante é extirpado e ligado em um vetor contendo uma sequência de DNA que codifica a região de VH do anticorpo (por exemplo, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16). O vetor resultante pode ser usado para transfectar uma célula hospedeira adequada, tal como uma célula de mamífero para a expressão da proteína de fusão biespecífica.[211] Bispecific fusion proteins that link two or more different single-chain antibodies or antibody fragments can be produced in a similar manner. Recombinant methods can be used to produce a variety of fusion proteins. In certain aspects, a flexible linker connects an scFv (e.g., an scFv targeting CD3) with the constant region of the light chain of a monoclonal antibody (e.g., a MUC16 Glycosylation Antibody described herein; see Section 5.1). The appropriate linker sequences required for in-frame connection of the heavy chain Fc to the scFv are introduced into the VL and Vkappa domains through PCR reactions. The DNA fragment encoding the scFv is then ligated into a preparation vector containing a DNA sequence encoding the CHI domain. The resulting construct is excised and ligated into a vector containing a DNA sequence encoding the VH region of the antibody (e.g., the MUC16 Glycosylation Antibody). The resulting vector can be used to transfect a suitable host cell, such as a mammalian cell, for expression of the bispecific fusion protein.

[212] Os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 descritos no presente documento (consultar a Seção 5.1) e fragmentos dos mesmos em certas modalidades podem ser também usados para preparar anticorpos de cadeia única biespecíficos funcionais (bscAb), também chamados diacorpos, e podem ser produzidos em células de mamífero com o uso de métodos recombinantes. Consultar, por exemplo, Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7.021 a 7.025, 1995, incorporado ao presente documento a títulode referência. Por exemplo, o bscAb pode ser produzido unindose dois fragmentos Fv de cadeia única por meio de um ligante deglicina-serina com o uso de métodos recombinantes. Os domíniosde VL e VH de dois anticorpos de interesse são isolados com o uso de métodos de PCR padrão conhecidos na técnica. Os anticorpos de cadeia única biespecíficos e as proteínas de fusão biespecíficas estão incluídos no escopo da presente invenção.[212] The MUC16 Glycosylation Antibodies described herein (see Section 5.1) and fragments thereof in certain embodiments can also be used to prepare functional bispecific single chain antibodies (bscAbs), also called diabodies, and can be produced in mammalian cells using recombinant methods. See, e.g., Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025, 1995, incorporated herein by reference. For example, bscAb can be produced by joining two single chain Fv fragments via a glycine-serine linker using recombinant methods. The VL and VH domains of two antibodies of interest are isolated using standard PCR methods known in the art. Bispecific single chain antibodies and bispecific fusion proteins are included within the scope of the present invention.

[213] Em certas modalidades, os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento se referem a scFvs. Um scFv é umtermo reconhecido na técnica. Um scFv compreende uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL)de uma imunoglobulina, em que a proteína de fusão mantém a mesma especificidade de antígeno que a imunoglobulina inteira. A VH éfundida à VL por meio de um ligante peptídico. Em certas modalidades, o ligante peptídico tem entre 5 e 25, 5 e 15, 10 e20, 10 e 15 ou 15 e 25 resíduos de aminoácido em comprimento. Emcertas modalidades, o ligante peptídico de scFv exibe uma ou mais características adequadas para um ligante peptídico conhecido por aquele de habilidade comum na técnica. Em certasmodalidades, o ligante peptídico de scFv compreende aminoácidos que permitem a solubilidade de ligante peptídico de scFv, talcomo, por exemplo, serina e treonina. Em certas modalidades, o ligante peptídico de scFv compreende aminoácidos que permitem a flexibilidade de ligante peptídico de scFv, tal como, por exemplo, glicina. Em certas modalidades, o ligante peptídico de scFv conecta a terminação N da VH com a terminação C da VL. Em certas modalidades, o ligante peptídico de scFv pode conectar a terminação C da VH com a terminação N da VL.[213] In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein refer to scFvs. An scFv is an art-recognized term. An scFv comprises a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light (VL) chains of an immunoglobulin, wherein the fusion protein maintains the same antigen specificity as the full-length immunoglobulin. The VH is fused to the VL via a peptide linker. In certain embodiments, the peptide linker is between 5 and 25, 5 and 15, 10 and 20, 10 and 15, or 15 and 25 amino acid residues in length. In certain embodiments, the scFv peptide linker exhibits one or more characteristics suitable for a peptide linker known to one of ordinary skill in the art. In certain embodiments, the scFv peptide linker comprises amino acids that enable scFv peptide linker solubility, such as, for example, serine and threonine. In certain embodiments, the scFv peptide linker comprises amino acids that enable scFv peptide linker flexibility, such as, for example, glycine. In certain embodiments, the scFv peptide linker connects the N-terminus of the VH to the C-terminus of the VL. In certain embodiments, the scFv peptide linker can connect the C-terminus of the VH to the N-terminus of the VL.

[214] Em certas modalidades, os Anticorpos de Glicosilaçãode MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento se referem a receptores de antígeno quiméricos (CARs). Um CAR é um termo reconhecido na técnica. Um CAR pode ser direcionado a um antígeno associado a tumor (por exemplo, MUC16). Os CARs conforme fornecidos no presente documento tipicamente são compostos por um scFv derivado de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16, um domínio transmembranar que, em algumas modalidades, é um domínio transmembranar derivado de molécula coestimulatória de célula T(por exemplo, um domínio transmembranar derivado de CD28, CD8, CD38, OX-40 ou 4-1BB) e um domínio de sinalização primário, talcomo o domínio de sinalização citoplasmática de cadeia zeta (Z) de receptor de célula T (TCR). Em algumas modalidades, o CAR inclui adicionalmente uma ou mais regiões ou domínios adicionais, tal como um ou mais espaçadores ou ligantes, incluindo um espaçador extracelular, tal como um derivado de um anticorpo ou outra molécula da superfície celular, tal como um espaçador que contém um ou mais dentre um anticorpo CH2, CH3 e/ou regiões de dobradiça, ou um espaçador derivado de uma molécula de CD28 ou uma molécula de CD8, ou outro espaçador. São também fornecidas no presente documento células, tais como células T geneticamente modificadas para expressar tais CARs, tais como aquelas que expressam de maneira recombinante tal CAR. Uma célula T que expressa CAR, mediante reconhecimento de um tumor que expressa MUC16, de preferência, induz a ativação, a proliferação e/ou a lise de célula T de uma célula de tal tumor.[214] In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein refer to chimeric antigen receptors (CARs). A CAR is an art-recognized term. A CAR can be directed to a tumor-associated antigen (e.g., MUC16). CARs as provided herein are typically composed of an scFv derived from a MUC16 Glycosylation Antibody, a transmembrane domain, which in some embodiments is a T-cell costimulatory molecule-derived transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain derived from CD28, CD8, CD38, OX-40, or 4-1BB), and a primary signaling domain, such as the T-cell receptor (TCR) zeta (Z) chain cytoplasmic signaling domain. In some embodiments, the CAR further includes one or more additional regions or domains, such as one or more spacers or linkers, including an extracellular spacer, such as one derived from an antibody or other cell surface molecule, such as a spacer containing one or more of an antibody CH2, CH3, and/or hinge regions, or a spacer derived from a CD28 molecule or a CD8 molecule, or other spacer. Also provided herein are cells, such as T cells genetically engineered to express such CARs, such as those recombinantly expressing such CAR. A CAR-expressing T cell, upon recognition of a tumor expressing MUC16, preferably induces T cell activation, proliferation, and/or lysis of a cell from such a tumor.

[215] Os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY), qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a ou IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Em certas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento são anticorpos de IgG, ou uma classe ou subclasse dos mesmos. Em certas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento são anticorpos de IgG1. Em certas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento são anticorpos de IgG2. Em certas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento são anticorpos de IgG2a. Em certas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento são anticorpos de IgG2b. Em certas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento são uma mistura de anticorpos de IgG2a e IgG2b. Em uma modalidade específica, o anticorpo é uma forma humanizada de um anticorpo monoclonal de roedor.[215] MUC16 Glycosylation Antibodies can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY), any class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, or IgA2), or any subclass (e.g., IgG2a or IgG2b) of immunoglobulin molecule. In certain embodiments, the antibodies described herein are IgG antibodies, or a class or subclass thereof. In certain embodiments, the antibodies described herein are IgG1 antibodies. In certain embodiments, the antibodies described herein are IgG2 antibodies. In certain embodiments, the antibodies described herein are IgG2a antibodies. In certain embodiments, the antibodies described herein are IgG2b antibodies. In certain embodiments, the antibodies described herein are a mixture of IgG2a and IgG2b antibodies. In a specific embodiment, the antibody is a humanized form of a rodent monoclonal antibody.

[216] Em uma modalidade específica, o antígeno ao qual o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo se liga é uma forma de MUC16 que é glicosilada, por exemplo, em que a sequência de aminoácidos da forma de MUC16 é a SEQ ID NO: 133. A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 é também denominada no presente documento MUC16c114 e consiste nos 114 resíduos de aminoácido C- terminais de MUC16 madura. MUC16c114 tem capacidade para ser N- glicosilada nos aminoácidos asparagina das posições 1, 24 e 30 da SEQ ID NO: 133 (correspondentes às posições de aminoácidos Asn1777, Asn1800 e Asn1806 da SEQ ID NO: 150). MUC16 madura (SEQ ID NO: 150) se refere à MUC16 de comprimento completo em que a sequência de sinalização foi removida, e em que a sequência de sinalização consiste nos primeiros 60 resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 136 (isto é, a SEQ ID NO: 136 é a forma “imatura” da MUC16).[216] In a specific embodiment, the antigen to which the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof binds is a form of MUC16 that is glycosylated, e.g., wherein the amino acid sequence of the form of MUC16 is SEQ ID NO: 133. The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 is also referred to herein as MUC16c114 and consists of the 114 C-terminal amino acid residues of mature MUC16. MUC16c114 is capable of being N-glycosylated at the amino acid asparagine positions 1, 24, and 30 of SEQ ID NO: 133 (corresponding to amino acid positions Asn1777, Asn1800, and Asn1806 of SEQ ID NO: 150). Mature MUC16 (SEQ ID NO: 150) refers to full-length MUC16 in which the signal sequence has been removed, and in which the signal sequence consists of the first 60 amino acid residues of SEQ ID NO: 136 (i.e., SEQ ID NO: 136 is the “immature” form of MUC16).

[217] Os fragmentos de ligação com antígeno de Anticorpos de Glicosilação de MUC16 podem ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2 ou uma porção de Anticorpo de Glicosilação de MUC16 que compreende os resíduos de aminoácido que conferem ao Anticorpo de Glicosilação de MUC16 sua especificidade para o antígeno (por exemplo, as regiões que determinam complementaridade (CDR)). O Anticorpo de Glicosilação de MUC16 pode ser derivado de qualquer espécie de animal, tal como roedores (por exemplo, camundongo, rato ou hamster) e seres humanos.[217] Antigen-binding fragments of MUC16 Glycosylation Antibodies may be Fab fragments, F(ab’)2 fragments, or a portion of MUC16 Glycosylation Antibody comprising the amino acid residues that confer the MUC16 Glycosylation Antibody its antigen specificity (e.g., the complementarity-determining regions (CDRs)). The MUC16 Glycosylation Antibody may be derived from any animal species, such as rodents (e.g., mouse, rat, or hamster) and humans.

[218] Conforme usado no presente documento, os termos “região variável” ou “domínio variável” são usados de forma intercambiável e são comuns na técnica. A região variável tipicamente se refere a uma porção de um anticorpo, de modo geral, uma porção de uma cadeia leve ou pesada, tipicamente cercados 110 a 120 aminoácidos amino-terminais em uma cadeia pesadamadura e cerca dos 90 a 100 aminoácidos amino-terminais em umacadeia leve madura, que difere extensivamente em sequência entreos anticorpos e é usada na ligação e especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular. A variabilidade na sequência é concentrada naquelas regiões chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) enquanto as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são chamadas de regiões de armação (FR). As CDRs são flanqueadas por FRs. De modo geral, a orientação espacial de CDRs e FRs são conforme segue, em uma direção N-terminal a C- terminal: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Sem o desejo de sevincular a qualquer mecanismo ou teoria particular, se acredita que as CDRs das cadeias leves e pesadas são principalmente responsáveis pela interação e especificidade do anticorpo com antígeno. Em certas modalidades, a região variável é uma regiãovariável de roedor (por exemplo, camundongo ou rato). Em certas modalidades, a região variável é uma região variável humana. Emcertas modalidades, a região variável compreende CDRs de roedor (por exemplo, camundongo ou rato) e regiões de arcabouço humanas (FRs). Em modalidades particulares, a região variável é uma região variável de primata (por exemplo, primata não humano). Em certas modalidades, a região variável compreende CDRs de roedor ou murinas e regiões de arcabouço de primata (por exemplo, primata não humano) (FRs).[218] As used herein, the terms “variable region” or “variable domain” are used interchangeably and are common in the art. The variable region typically refers to a portion of an antibody, generally a portion of a light or heavy chain, typically around the amino-terminal 110 to 120 amino acids in a mature heavy chain and around the amino-terminal 90 to 100 amino acids in a mature light chain, that differs extensively in sequence among antibodies and is used in the binding and specificity of a particular antibody for its particular antigen. Sequence variability is concentrated in those regions called complementarity-determining regions (CDRs), while the more highly conserved regions in the variable domain are called framework regions (FRs). CDRs are flanked by FRs. In general, the spatial orientation of CDRs and FRs is as follows, in an N-terminal to C-terminal direction: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Without wishing to be bound by any particular mechanism or theory, it is believed that the CDRs of the light and heavy chains are primarily responsible for antibody interaction and specificity with antigen. In certain embodiments, the variable region is a rodent (e.g., mouse or rat) variable region. In certain embodiments, the variable region is a human variable region. In certain embodiments, the variable region comprises rodent (e.g., mouse or rat) CDRs and human framework regions (FRs). In particular embodiments, the variable region is a primate (e.g., non-human primate) variable region. In certain embodiments, the variable region comprises rodent or murine CDRs and primate (e.g., non-human primate) framework regions (FRs).

[219] As CDRs são definidas de várias maneiras na técnica, incluindo as definições de Kabat, Chothia e IMGT e Exemplificativas. A definição de Kabat é baseada em variabilidade de sequência (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Em relação ao sistema de numeração de Kabat, (i) a CDR1 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 31 a 35 da cadeia pesada, que podem opcionalmente incluir um ou dois aminoácidos adicionais após a posição de aminoácido 35 (denominados no esquema de numeração de Kabat 35A e 35B); (ii) a CDR2 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 50 a 65 da cadeia pesada; e (iii) a CDR2 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 95 a 102 da cadeia pesada (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Em relação ao sistema de numeração de Kabat, (i) a CDR1 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 24 a 34 da cadeia leve; (ii) a CDR2 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 50 a 56 da cadeia leve; e (iii) a CDR3 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 89 a 97 da cadeia leve (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Conforme é bem conhecido por aqueles que são versados na técnica, com o uso do sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real do domínio variável de anticorpo pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais devido a um encurtamento ou alongamento de uma FR e/ou CDR e, como tal, um número de Kabat do aminoácido não é necessariamente o mesmo que seu número de aminoácido linear.[219] CDRs are defined in various ways in the art, including the Kabat, Chothia, and IMGT definitions, and Exemplary ones. The Kabat definition is based on sequence variability (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). With respect to the Kabat numbering system, (i) the VH CDR1 is typically present at amino acid positions 31 to 35 of the heavy chain, which may optionally include one or two additional amino acids after amino acid position 35 (designated in the Kabat numbering scheme 35A and 35B); (ii) the VH CDR2 is typically present at amino acid positions 50 to 65 of the heavy chain; and (iii) the VH CDR2 is typically present at amino acid positions 95 to 102 of the heavy chain (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Regarding the Kabat numbering system, (i) the VL CDR1 is typically present at amino acid positions 24 to 34 of the light chain; (ii) the VL CDR2 is typically present at amino acid positions 50 to 56 of the light chain; and (iii) the VL CDR3 is typically present at amino acid positions 89 to 97 of the light chain (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). As is well known to those skilled in the art, using the Kabat numbering system, the actual linear amino acid sequence of the antibody variable domain may contain fewer amino acids or additional amino acids due to a shortening or lengthening of a FR and/or CDR, and as such, an amino acid's Kabat number is not necessarily the same as its linear amino acid number.

[220] A definição de Chothia é baseada na localização das regiões de laço estrutural (Chothia et al., (1987) J Mol Biol196: 901 a 917; e a Patente no U.S. 7.709.226). O termo “CDRs deChothia” e termos similares são reconhecidos na técnica e se referem a sequências de CDR de anticorpo conforme determinado deacordo com o método de Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901 a 917, que serão denominadas no presente documento como “CDRs de Chothia” (consultar também, por exemplo, a Patente noU.S. 7.709.226 e Martin, A., “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”, em Antibody Engineering, Kontermann e Dübel, eds., Capítulo 31, páginas 422 a 439, Springer-Verlag, Berlin (2001)). Em relação ao sistema de numeração de Chothia, com o uso do sistema de numeração de Kabat para numerar resíduos de aminoácido na região de VH, (i) a CDR1 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 26 a 32 da cadeia pesada; (ii) a CDR2 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 53 a 55 da cadeia pesada; e (iii) a CDR3 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido96 a 101 da cadeia pesada. Em uma modalidade específica, em relação ao sistema de numeração de Chothia, com o uso do sistemade numeração de Kabat para numerar resíduos de aminoácido na região de VH, (i) a CDR1 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 26 a 32 ou 34 da cadeia pesada; (ii) a CDR2 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido52 a 56 (em uma modalidade, a CDR2 está nas posições 52A a 56, em que 52A segue a posição 52) da cadeia pesada; e (iii) a CDR3de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 95 a102 da cadeia pesada (em uma modalidade, não há aminoácido nasposições numeradas de 96 a 100). Em relação ao sistema de numeração de Chothia, com o uso do sistema de numeração de Kabat para numerar resíduos de aminoácido na região de VL, (i) a CDR1 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 26 a 33 da cadeia leve; (ii) a CDR2 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 50 a 52 da cadeia pesada; e (iii) a CDR3 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 91 a 96 da cadeia leve. Em uma modalidade específica, em relação ao sistema de numeração de Chothia, com o uso do sistema de numeração de Kabat para numerar resíduos de aminoácido na região de VL, (i) a CDR1 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 24 a 34 da cadeia leve; (ii) a CDR2 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 50 a 56 da cadeia leve; e (iii) a CDR3 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 89 a 97 da cadeia leve (em uma modalidade, não há aminoácido nas posições numeradas de 96 a 100). Essas posições de CDR de Chothia podem variar dependendo do anticorpo e podem ser determinadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica.[220] Chothia's definition is based on the location of the structural loop regions (Chothia et al., (1987) J Mol Biol196:901–917; and U.S. Patent 7,709,226). The term “Chothia CDRs” and similar terms are art-recognized and refer to antibody CDR sequences as determined according to the method of Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917, which will be referred to herein as “Chothia CDRs” (see also, e.g., U.S. Patent No. 7,709,226 and Martin, A., “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” in Antibody Engineering, Kontermann and Dübel, eds., Chapter 31, pages 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)). With respect to the Chothia numbering system, using the Kabat numbering system to number amino acid residues in the VH region, (i) the VH CDR1 is typically present at amino acid positions 26 to 32 of the heavy chain; (ii) the VH CDR2 is typically present at amino acid positions 53 to 55 of the heavy chain; and (iii) the VH CDR3 is typically present at amino acid positions 96 to 101 of the heavy chain. In a specific embodiment, with respect to the Chothia numbering system, using the Kabat numbering system to number amino acid residues in the VH region, (i) the VH CDR1 is typically present at amino acid positions 26 to 32 or 34 of the heavy chain; (ii) the VH CDR2 is typically present at amino acid positions 52-56 (in one embodiment, the CDR2 is at positions 52A-56, where 52A follows position 52) of the heavy chain; and (iii) the VH CDR3 is typically present at amino acid positions 95-102 of the heavy chain (in one embodiment, there is no amino acid at positions numbered 96-100). Relative to the Chothia numbering system, using the Kabat numbering system to number amino acid residues in the VL region, (i) the VL CDR1 is typically present at amino acid positions 26-33 of the light chain; (ii) the VL CDR2 is typically present at amino acid positions 50-52 of the heavy chain; and (iii) the VL CDR3 is typically present at amino acid positions 91-96 of the light chain. In a specific embodiment, relative to the Chothia numbering system, using the Kabat numbering system to number amino acid residues in the VL region, (i) the VL CDR1 is typically present at amino acid positions 24-34 of the light chain; (ii) the VL CDR2 is typically present at amino acid positions 50-56 of the light chain; and (iii) the VL CDR3 is typically present at amino acid positions 89-97 of the light chain (in one embodiment, there is no amino acid at positions numbered 96-100). These Chothia CDR positions may vary depending on the antibody and may be determined according to methods known in the art.

[221] A definição de IMGT é da IMGT ("IMGT®, o international ImMunoGeneTics information system® website imgt.org, fundador e diretor: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, França; consultar, por exemplo, Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132 a 136 e Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209 a 212, ambos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Em relação ao sistema de numeração de IMGT, (i) a CDR1 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 25 a 35 da cadeia pesada; (ii) a CDR2 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 51 a 57 da cadeia pesada; e (iii) a CDR2 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácido 93 a 102 da cadeia pesada. Em relação ao sistema de numeração de IMGT, (i) a CDR1 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 27 a 32 da cadeia leve; (ii) a CDR2 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 50 a 52 da cadeia leve; e (iii) a CDR3 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácido 89 a 97 da cadeia leve.5.1.1 Sequências e estruturas[221] The definition of IMGT is from IMGT (“IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® website imgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France; see, e.g., Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132–136 and Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209–212, both of which are incorporated herein by reference in their entirety). Regarding the IMGT numbering system, (i) the VH CDR1 is typically present at amino acid positions 25–35 of the heavy chain; (ii) the VH CDR2 is typically present at amino acid positions 51–57 of the heavy chain; and (iii) the VH CDR2 is typically present at amino acid positions 93 to 102 of the heavy chain. Regarding the IMGT numbering system, (i) the VL CDR1 is typically present at amino acid positions 27 to 32 of the light chain; (ii) the VL CDR2 is typically present at amino acid positions 50 to 52 of the light chain; and (iii) the VL CDR3 is typically present at amino acid positions 89 to 97 of the light chain.5.1.1 Sequences and Structures

[222] Em certas modalidades, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende CDRs de VH de qualquer um dos Anticorpos de Glicosilação de MUC16 fornecidos no presente documento, por exemplo, conforme apresentado nas Tabelas 1, 3 e 5. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende a CDR1 de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 1, 3 ou 5. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende a CDR2 de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 1, 3 ou 5. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende a CDR3 de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 1, 3 ou 5. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma, duas ou todas as CDRs de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 1, 3 ou 5 (por exemplo, as CDRs de VL na linha dois da Tabela 1, por exemplo, todas as CDRs de VH para o anticorpo 10C6[222] In certain embodiments, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising VH CDRs of any of the MUC16 Glycosylation Antibodies provided herein, e.g., as set forth in Tables 1, 3, and 5. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR1 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 1, 3, or 5. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR2 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 1, 3, or 5. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof A MUC16 Glycosylation Antibody provided herein comprises the VH CDR3 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 1, 3, or 5. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises one, two, or all of the VH CDRs of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 1, 3, or 5 (e.g., the VL CDRs in row two of Table 1; e.g., all of the VH CDRs for the 10C6 antibody).

)[223] Em certas modalidades, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRs de VL de qualquer um dos anticorpos anti-MUC16 fornecidos no presente documento, por exemplo, conforme apresentado nas Tabelas 2, 4 e 6. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende a CDR1 de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 2, 4 ou 6. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende a CDR2 de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 2, 4 ou 6. Em certas modalidades, um anticorpo anti-MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende a CDR3 de VH de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 conforme apresentado na Tabela 2, 4 ou 6. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma, duas ou todas as CDRs de VL de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 na Tabela 2, 4 ou 6 (por exemplo, as CDRs de VL na linha dois da Tabela 2, por exemplo, todas as CDRs de VH para o anticorpo 10C6)Tabela 1. Sequências de aminoácidos de CDR de VH (Kabat). Tabela 2. Sequências de aminoácidos de CDR de VL (Kabat).Tabela 3. Sequências de aminoácidos de CDR de VH (Chothia). Tabela 4. Sequências de aminoácidos de CDR de VL (Chothia).Tabela 5. Sequências de aminoácidos de CDR de VH (Imgt).Tabela 6. Sequências de aminoácidos de CDR de VL (Imgt). )[223] In certain embodiments, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the VL CDRs of any of the anti-MUC16 antibodies provided herein, e.g., as set forth in Tables 2, 4, and 6. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR1 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR2 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. In certain embodiments, an anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR3 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. In certain embodiments, an anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR4 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. In certain embodiments, an anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR5 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. In certain embodiments, an anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises the VH CDR6 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. VH CDR3 of a MUC16 Glycosylation Antibody as set forth in Table 2, 4, or 6. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises one, two, or all of the VL CDRs of a MUC16 Glycosylation Antibody in Table 2, 4, or 6 (e.g., the VL CDRs in row two of Table 2; e.g., all of the VH CDRs for the 10C6 antibody). Table 1. VH CDR Amino Acid Sequences (Kabat). Table 2. Amino acid sequences of VL (Kabat) CDRs. Table 3. Amino acid sequences of VH CDR (Chothia). Table 4. Amino acid sequences of VL (Chothia) CDRs. Table 5. VH CDR amino acid sequences (Imgt). Table 6. Amino acid sequences of VL CDRs (Imgt).

[224] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende:[224] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising:

[225] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V;[225] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V;

[226] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é Eou ausente, e X3 é Y ou N; e[226] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent, and X3 is Y or N; and

[227] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105).[227] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105).

[228] Em uma particular modalidade, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende:[228] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising:

[229] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e X9 é L ou V;[229] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and X9 is L or V;

[230] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e[230] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and

[231] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111).[231] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111).

[232] Em uma particular modalidade, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende:[232] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising:

[233] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e X16 é V ou L;[233] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and X16 is V or L;

[234] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e[234] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and

[235] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S.[235] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S.

[236] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17.[236] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17.

[237] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37.[237] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37.

[238] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57.[238] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:57.

[239] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77.[239] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:65. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:71. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:77.

[240] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:83, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:89, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97.[240] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:85. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:97.

[241] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende:[241] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising:

[242] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), em que X4 é R ou L, e X5 é K ou H;[242] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), wherein X4 is R or L, and X5 is K or H;

[243] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); e[243] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); and

[244] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em que X6 é G ou S, e X7 é H ou Y.[244] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S, and X7 is H or Y.

[245] Em uma particular modalidade, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende:[245] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising:

[246] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e X12 é H ou K;[246] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and X12 is H or K;

[247] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos YMS (SEQ ID NO: 113); e[247] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 113); and

[248] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), em que X13 é G ou S, e X14 é H ou Y.[248] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and X14 is H or Y.

[249] Em uma particular modalidade, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende:[249] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising:

[250] (a) uma região que determina complementaridade (CDR) de VL 1 que compreende a sequência de aminoácidos KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e X20 é H ou K;[250] (a) a complementarity determining region (CDR) of VL 1 comprising the amino acid sequence KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and X20 is H or K;

[251] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMS (SEQ ID NO: 119); e[251] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 119); and

[252] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).[252] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).

[253] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20.[253] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.

[254] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40.[254] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:40.

[255] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60.[255] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:47, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:60.

[256] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80.[256] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:67, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:68. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:79, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:80.

[257] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:87 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:94. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100.[257] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:87, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:99, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:100.

[258] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende:[258] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises:

[259] (i) uma VH que compreende:[259] (i) a VH comprising:

[260] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V;[260] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V;

[261] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é E ou ausente e em que X3 é Y ou N; e[261] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent and wherein X3 is Y or N; and

[262] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); e[262] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); and

[263] (ii) uma VL que compreende:[263] (ii) a VL comprising:

[264] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), em que X4 é R ou L, e em que X5 é K ou H;[264] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence RSSKSLX4X5SNGNTYLY (SEQ ID NO: 106), wherein X4 is R or L, and wherein X5 is K or H;

[265] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); e[265] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMSNLAS (SEQ ID NO: 107); and

[266] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), em que X6 é G ou S e em que X7 é H ou Y.[266] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQX6LEX7PLT (SEQ ID NO: 108), wherein X6 is G or S and wherein X7 is H or Y.

[267] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[267] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[268] (i) uma VH que compreende:[268] (i) a VH comprising:

[269] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V;[269] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V;

[270] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e[270] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and

[271] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); e[271] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); and

[272] (ii) uma VL que compreende:[272] (ii) a VL comprising:

[273] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), em que X11 é L ou R, e em que X12 é H ou K;[273] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SKSLX11X12SNGNTY (SEQ ID NO: 112), wherein X11 is L or R, and wherein X12 is H or K;

[274] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos YMS (SEQ ID NO: 113); e[274] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 113); and

[275] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), em que X13 é G ou S, e em que X14 é H ou Y.[275] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence X13LEX14PL (SEQ ID NO: 114), wherein X13 is G or S, and wherein X14 is H or Y.

[276] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[276] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[277] (i) uma VH que compreende:[277] (i) a VH comprising:

[278] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e em que X16 é V ou L;[278] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and wherein X16 is V or L;

[279] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e[279] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and

[280] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S; e[280] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S; and

[281] (ii) uma VL que compreende:[281] (ii) a VL comprising:

[282] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), em que X19 é V ou L, e em que X20 é H ou K;[282] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence KSLX19X20SNGNTY (SEQ ID NO: 118), wherein X19 is V or L, and wherein X20 is H or K;

[283] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos YMS (SEQ ID NO: 119); e[283] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence YMS (SEQ ID NO: 119); and

[284] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).[284] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence MQSLEYPLT (SEQ ID NO: 120).

[285] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende:[285] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises:

[286] (i) uma VH que compreende:[286] (i) a VH comprising:

[287] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V;[287] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V;

[288] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é Eou ausente e em que X3 é Y ou N; e[288] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent and wherein X3 is Y or N; and

[289] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); e[289] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); and

[290] (ii) uma VL que compreende:[290] (ii) a VL comprising:

[291] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SEQ ID NO:6;[291] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO:6;

[292] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:7; e[292] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7; and

[293] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:8.[293] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8.

[294] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[294] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[295] (i) uma VH que compreende:[295] (i) a VH comprising:

[296] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V;[296] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V;

[297] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e[297] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and

[298] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); e[298] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); and

[299] (ii) uma VL que compreende:[299] (ii) a VL comprising:

[300] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SEQ ID NO:12;[300] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO:12;

[301] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:13; e[301] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13; and

[302] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:14.[302] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14.

[303] Em uma particular modalidade, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende:[303] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising:

[304] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e em que X16 é V ou L;[304] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and wherein X16 is V or L;

[305] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e[305] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and

[306] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S; e[306] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S; and

[307] (ii) uma VL que compreende:[307] (ii) a VL comprising:

[308] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SEQ ID NO:18;[308] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO:18;

[309] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:19; e[309] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19; and

[310] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:20.[310] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.

[311] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[311] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[312] (i) uma VH que compreende:[312] (i) a VH comprising:

[313] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), em que X1 é L ou V;[313] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence TX1GMGVG (SEQ ID NO: 103), wherein X1 is L or V;

[314] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), em que X2 é Eou ausente e em que X3 é Y ou N; e[314] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence HIWWDDX2DKYYX3PALKS (SEQ ID NO: 104), wherein X2 is E or absent and wherein X3 is Y or N; and

[315] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); e[315] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence IGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 105); and

[316] (ii) uma VL que compreende:[316] (ii) a VL comprising:

[317] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SEQ ID NO:26;[317] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO:26;

[318] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:27; e[318] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27; and

[319] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:28.[319] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28.

[320] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende:[320] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises:

[321] (i) uma VH que compreende:[321] (i) a VH comprising:

[322] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), em que X8 é N ou S, e em que X9 é L ou V;[322] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX8TX9GM (SEQ ID NO: 109), wherein X8 is N or S, and wherein X9 is L or V;

[323] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos WDDX10 (SEQ ID NO: 110), em que X10 é E ou ausente; e[323] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence WDDX10 (SEQ ID NO: 110), wherein X10 is E or absent; and

[324] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); e[324] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence GTAQATDALD (SEQ ID NO: 111); and

[325] (ii) uma VL que compreende:[325] (ii) a VL comprising:

[326] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SEQ ID NO:32;[326] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO:32;

[327] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:33; e[327] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33; and

[328] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:34.[328] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34.

[329] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende:[329] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises:

[330] (i) uma VH que compreende:[330] (i) a VH comprising:

[331] (a) uma CDR1 de VH que compreende a sequência deaminoácidos GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), em que X15 é N ou S, e em que X16 é V ou L;[331] (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence GFSLX15TX16GMG (SEQ ID NO: 115), wherein X15 is N or S, and wherein X16 is V or L;

[332] (b) uma CDR2 de VH que compreende a sequência deaminoácidos IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), em que X17 é E ou ausente; e[332] (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence IWWDDX17DK (SEQ ID NO: 116), wherein X17 is E or absent; and

[333] (c) uma CDR3 de VH que compreende a sequência deaminoácidos X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), em que X18 é T, A ou S; e[333] (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence X18RIGTAQATDALDY (SEQ ID NO: 117), wherein X18 is T, A, or S; and

[334] (ii) uma VL que compreende:[334] (ii) a VL comprising:

[335] (a) uma CDR1 de VL que compreende a sequência deaminoácidos SEQ ID NO:38;[335] (a) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO:38;

[336] (b) uma CDR2 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:39; e[336] (b) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39; and

[337] (c) uma CDR3 de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO:40.[337] (c) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:40.

[338] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e uma CDR3 de VH quecompreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5; e (b) umaVL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma CDR3 de VL quecompreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8. Em umamodalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11; e (b) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; e (b) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20.[338] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11; and (b) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17; and (b) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.

[339] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37; e (b) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40.[339] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37; and (b) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:40.

[340] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60.[340] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:45; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:47, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:48. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:51; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:54. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:57; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:60.

[341] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80.[341] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:65; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:67, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:68. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:71; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:73, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:74. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:77; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:79, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:80.

[342] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:83, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:87 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:89, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:94. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99 e uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100.Tabela 7. Sequências de aminoácidos de domínio de VH Tabela 8. Sequências de aminoácidos de domínio de VL [342] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:85; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:91; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:94. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:97; and (b) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:99, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:100. Table 7. VH Domain Amino Acid Sequences Table 8. VL domain amino acid sequences

[343] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma região de VH que compreendeQVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 é I ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é P ou S, X27 é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ou D, X31 é T ou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35 é T, S ou A.[343] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH region comprising QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIW WDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTA QATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27 is E or absent, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is T or S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I, or S, and X35 is T, S, or A.

[344] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma região de VL que compreendeDIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMS NLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), em que X36 é I ou V, X37 é P ou S, X38 é R ou L, X39 é K ou H, X40 é R ou K, X41 é E ou G, X42 é S ou G, e X43 é Y ou H.[344] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL region comprising DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMS NLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), wherein X36 is I or V, X37 is P or S, X38 is R or L, X39 is K or H, X40 is R or K, X41 is E or G, X42 is S or G, and X43 is Y or H.

[345] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[345] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[346] (a) região de VH que compreende[346] (a) VH region comprising

[347] QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGK GLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYY CX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 é I ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é P ou S, X27 é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ou D, X31 é T ou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35 é T, S ou A; e[347] QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGK GLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYY CX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101) wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27 is E or missing, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is T or S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I or S, and X35 is T, S or A; and

[348] (b) uma região de VL que compreende[348] (b) a VL region comprising

[349] DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQ SPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFG GGTKLEIK (SEQ ID NO: 102), em que X36 é I ou V, X37 é P ou S, X38 é R ou L, X39 é K ou H, X40 é R ou K, X41 é E ou G, X42 é S ou G, e X43 é Y ou H.[349] DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQ SPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFG GGTKLEIK (SEQ ID NO: 102) where X36 is I or V, X37 is P or S, X38 is R or L, X39 is K or H, X40 is R or K, X41 is E or G, X42 is S or G, and X43 is Y or H.

[350] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[350] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[351] (a) região de VH que compreende[351] (a) VH region comprising

[352] QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGK GLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYY CX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 é I ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é Pou S, X27 é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ouD, X31 é T ou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35é T, S ou A; e[352] QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGK GLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYY CX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101) wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27 is E or missing, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is T or S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I or S, and X35 is T, S or A; and

[353] (b) uma região de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO: 2.[353] (b) a VL region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[354] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende[354] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises

[355] (a) região de VH que compreende[355] (a) VH region comprising

[356] QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGK GLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYY CX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101), em que X21 é T ou N, X22 é I ou K, X23 é N ou S, X24 é V ou L, X25 é S ou I, X26 é Pou S, X27 é E ou ausente, X28 é N ou Y, X29 é K ou R, X30 é A ouD, X31 é T ou S, X32 é V ou A, X33 é G ou D, X34 é T, I ou S, e X35é T, S ou A; e[356] QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGK GLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYY CX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101) wherein X21 is T or N, X22 is I or K, X23 is N or S, X24 is V or L, X25 is S or I, X26 is P or S, X27 is E or missing, X28 is N or Y, X29 is K or R, X30 is A or D, X31 is T or S, X32 is V or A, X33 is G or D, X34 is T, I or S, and X35 is T, S or A; and

[357] (b) uma região de VL que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO: 62.[357] (b) a VL region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62.

[358] Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na Tabela 7. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 10C6). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 7B12). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 19C11). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 16C5). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 18C6).[358] In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH comprising an amino acid sequence as set forth in Table 7. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 10C6). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 7B12). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 19C11). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 16C5). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 18C6).

[359] Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na Tabela 8. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 10C6). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 7B12). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 19C11). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 16C5). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 18C6).[359] In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VL comprising an amino acid sequence as set forth in Table 8. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 10C6). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 7B12). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 19C11). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 16C5). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 18C6).

[360] Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na Tabela 7; e (b) uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na Tabela 8. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma região variável de cadeia pesada sequência que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 10C6); e (b) uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 10C6). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma região variável de cadeia pesada sequência que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 7B12); e (b) uma sequência de região variável de cadeialeve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22(Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 7B12). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presentedocumento compreende (a) uma região variável de cadeia pesada sequência que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 19C11); e (b) uma sequência de região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 19C11). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende (a) uma região variável de cadeia pesada sequência que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 16C5); e (b) uma sequência de regiãovariável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 (Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 16C5). Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo descrito no presente documento compreende (a) uma região variável de cadeia pesada sequência que compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (Tabela 7) (por exemplo, a VH do anticorpo 18C6); e (b) uma sequência de região variável de cadeialeve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82(Tabela 8) (por exemplo, a VL do anticorpo 18C6).[360] In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a VH comprising an amino acid sequence as set forth in Table 7; and (b) a VL comprising an amino acid sequence as set forth in Table 8. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 10C6); and (b) a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 10C6). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 7B12); and (b) a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 7B12). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 19C11); and (b) a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 19C11). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 16C5); and (b) a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 16C5). In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises (a) a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 (Table 7) (e.g., the VH of antibody 18C6); and (b) a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82 (Table 8) (e.g., the VL of antibody 18C6).

[361] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende CDRs de VH (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 1, 3 ou 5) de uma VH que compreende a sequência de aminoácidos conforme apresentado na Tabela 7 e CDRs de VL (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 2, 4 ou 6) de uma VL que compreende a sequência de aminoácidos conforme apresentado na Tabela 8.[361] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises VH CDRs (e.g., as set forth in Table 1, 3, or 5) of a VH comprising the amino acid sequence as set forth in Table 7 and VL CDRs (e.g., as set forth in Table 2, 4, or 6) of a VL comprising the amino acid sequence as set forth in Table 8.

[362] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento pode ser descrito por seu domínio de VH sozinho, ou seu domínio de VL sozinho, ou por suas três CDRs de VH sozinhas, ou por suas três CDRs de VL sozinhas. Consultar, por exemplo, Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8.910 a 8.915, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, que descreve a humanização do anticorpo anti- αvβ3 de camundongo identificando-se uma cadeia leve ou cadeia pesada complementar, respectivamente, de uma biblioteca de cadeia leve ou cadeia pesada humana, resultando em variantes de anticorpo humanizado que têm afinidades tão altas ou mais altas que a afinidade do anticorpo original. Consultar também Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624 a 628, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, que descreve métodos para produzir anticorpos que se ligam com um antígeno específico com o uso de um domínio de VH específico (ou domínio de VL) e tria uma biblioteca para os domínios variáveis complementares. Consultar também Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572 a 577, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, que descreve métodos para produzir anticorpos que se ligam com um antígeno específico com o uso de um domínio de VH específico e tria uma biblioteca (por exemplo, biblioteca de VL humana) para domínios de VL complementares; os domínios de VL selecionados por sua vez poderiam ser usados para guiar a seleção de domínios de VH complementares adicionais (por exemplo, humanos).[362] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be described by its VH domain alone, or its VL domain alone, or by its three VH CDRs alone, or by its three VL CDRs alone. See, e.g., Rader C et al., (1998) PNAS 95:8910-8915, which is incorporated herein by reference in its entirety, which describes humanization of mouse anti-αvβ3 antibody by identifying a complementary light chain or heavy chain, respectively, from a human light chain or heavy chain library, resulting in humanized antibody variants that have affinities as high as or higher than the affinity of the parent antibody. See also Clackson T et al., (1991) Nature 352:624-628, which is incorporated herein by reference in its entirety, which describes methods for producing antibodies that bind a specific antigen using a specific VH domain (or VL domain) and screening a library for complementary variable domains. See also Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45:572-577, which is incorporated herein by reference in its entirety, which describes methods for producing antibodies that bind a specific antigen using a specific VH domain and screening a library (e.g., human VL library) for complementary VL domains; the selected VL domains could in turn be used to guide the selection of additional complementary (e.g., human) VH domains.

[363] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo, uma forma humanizada de um anticorpo de roedor. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos com o uso de uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, porém, sem limitação, enxertia de CDR (Patente Europeia no EP 239.400;Publicação internacional no WO 91/09967; e Patentes nos U.S.5.225.539, U.S. 5.530.101 e U.S. 5.585.089), embaralhamento de cadeia (U.S. Patente no 5.565.332), laminação ou recobrimento (Patentes Europeias nos EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991,Molecular Immunology 28(4/5):489 a 498; Studnicka et al., 1994,Protein Engineering 7(6):805 a 814; e Roguska et al., 1994, PNAS91:969 a 973), e técnicas reveladas, por exemplo, na Patente no6.407.213, Patente no 5.766.886, WO 9317105, Sandhu JS, Gene 150(2):409 a 410 (1994), Pedersen et al., J. Mol. Biol.235(3):959 a 973 (1994), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1.717a 1.722 (1995), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904(1996), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10.678 a 10.684 (1997), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s a 5977s(1995), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353 a 360 (2000), Moreaet al., Methods 20(3):267 79 (2000), e Tan et al., J. Immunol.169:1119 25 (2002). Consultar também a Publicação de Patente noU.S. 2005/0042664 A1 (24 de fevereiro de 2005), cada um dos quais está incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade.[363] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be a humanized antibody, e.g., a humanized form of a rodent antibody. Humanized antibodies can be produced using a variety of techniques known in the art, including, but not limited to, CDR grafting (European Patent EP 239,400; International Publication No. WO 91/09967; and U.S. Patents 5,225,539, U.S. Patent 5,530,101, and U.S. Patent 5,585,089), chain shuffling (U.S. Patent 5,565,332), lamination or coating (European Patents EP 592,106 and EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; and Roguska et al., 1994, PNAS91:969 to 973), and techniques disclosed, for example, in Patent no. 6,407,213, Patent no. 5,766,886, WO 9317105, Sandhu JS, Gene 150(2):409 to 410 (1994), Pedersen et al., J. Mol. Biol.235(3):959 to 973 (1994), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1,717a 1,722 (1995), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904(1996), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678−10684 (1997), Couto et al., Cancer Res. 55(23 Supp):5973s−5977s(1995), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353−360 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267−79 (2000), and Tan et al., J. Immunol. 169:1119−25 (2002). See also U.S. Patent Publication No. 2005/0042664 A1 (February 24, 2005), each of which is incorporated by reference herein in its entirety.

[364] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento pode ser um anticorpo humano compósito. Um anticorpo humano compósito pode ser gerado, por exemplo, projetando-se sequências de região variável a partir de fragmentos de múltiplas sequências de região variável de anticorpo humanas de uma maneira que evite epítopos de célula T, minimizando, assim, a imunogenicidade do anticorpo resultante (consultar, por exemplo, Baker et al., 2010, Self Nonself., 1(4):314 a 322; Bryson et al., 2010, BioDrugs, 24(1):1 a 8; e Jones et al., 2009, Methods Mol Biol., 525:405 a 423). Tais anticorpos podem compreender sequências de região constante humanas, por exemplo, regiões constantes de cadeia leve e/ou cadeia pesada humanas.[364] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be a composite human antibody. A composite human antibody can be generated, for example, by engineering variable region sequences from fragments of multiple human antibody variable region sequences in a manner that avoids T cell epitopes, thereby minimizing the immunogenicity of the resulting antibody (see, for example, Baker et al., 2010, Self Nonself., 1(4):314-322; Bryson et al., 2010, BioDrugs, 24(1):1-8; and Jones et al., 2009, Methods Mol Biol., 525:405-423). Such antibodies can comprise human constant region sequences, for example, human light chain and/or heavy chain constant regions.

[365] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento pode ser um anticorpo desimunizado. Um anticorpo desimunizado é um anticorpo em que os epítopos de célula T foram removidos. Os métodos para produzir anticorpos desimunizados foram descritos. Consultar, por exemplo, Jones et al., Methods Mol Biol. 2009;525:405 a 423, xiv, e De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148 a 153(2006)).[365] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be a deimmunized antibody. A deimmunized antibody is an antibody in which T cell epitopes have been removed. Methods for producing deimmunized antibodies have been described. See, e.g., Jones et al., Methods Mol Biol. 2009;525:405-423, xiv, and De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006)).

[366] Em modalidades específicas, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é uma imunoglobulina humanizada que compreende as 3 CDRs de VH e as 3 CDRs de VL (isto é, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL) de qualquer um dos anticorpos na Tabela 1, na Tabela 2, e na Tabela 3, e na Tabela 4, na Tabela 5 e na Tabela 6, respectivamente, regiões de arcabouço derivadas de ser humano e regiões constantes derivadas de ser humano. Os exemplos não limitantes de regiões de arcabouço humanas são descritos na técnica, por exemplo, consultar Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH n° 91 a 3.242). Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende regiões de arcabouço (por exemplo, regiões de arcabouço do domínio de VL e/ou do domínio de VH) que são regiões de arcabouço humanas ou regiões de arcabouço derivadas de ser humano. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende regiões de arcabouço (por exemplo, regiões de arcabouço do domínio de VL e/ou do domínio de VH) que são regiões de arcabouço de primata (por exemplo, primata não humano) ou regiões de arcabouço derivadas de primata (por exemplo, primata não humano). Por exemplo, as CDRs de anticorpos não humanos específicos para antígeno, tipicamente de origem em roedor (por exemplo, camundongo ou rato), são enxertadas em ser humano ou primata não humano homólogo (por exemplo, símios do Velho Mundo, por exemplo, Pan troglodytes, Pan paniscus ou Gorilla gorilla, Pan troglodytes, macacos do Velho Mundo, por exemplo, do gênero Macaca, ou o macaco cinomolgo Macaca cynomolgus). As sequências de arcabouço de primata não humano são descritas no Pedido dePatente no US 2005/0208625.[366] In specific embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is a humanized immunoglobulin comprising the 3 VH CDRs and the 3 VL CDRs (i.e., VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3) of any of the antibodies in Table 1, Table 2, and Table 3, and Table 4, Table 5, and Table 6, respectively, human-derived framework regions, and human-derived constant regions. Non-limiting examples of human framework regions are described in the art, e.g., see Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises framework regions (e.g., framework regions of the VL domain and/or the VH domain) that are human framework regions or human-derived framework regions. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises framework regions (e.g., framework regions of the VL domain and/or the VH domain) that are primate (e.g., non-human primate) framework regions or primate-derived framework regions (e.g., non-human primate). For example, the CDRs of antigen-specific non-human antibodies, typically of rodent (e.g., mouse or rat) origin, are grafted into human or non-human primate homologues (e.g., Old World apes, e.g., Pan troglodytes, Pan paniscus, or Gorilla gorilla, Pan troglodytes, Old World monkeys, e.g., the genus Macaca, or the cynomolgus macaque Macaca cynomolgus). The non-human primate framework sequences are described in US Patent Application No. 2005/0208625.

[367] Em uma modalidade específica, a posição de CDR1 de VH,CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH na região de VH e/ou a posição deCDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR2 de VL na região de VL de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação comantígeno do mesmo descrito no presente documento podem variar em 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais posições de aminoácido desde que (i) aligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 seja mantida; (ii) a carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos dasegunda forma é a SEQ ID NO: 139 seja mantida; e (iii) a inibiçãode invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16 seja mantida (por exemplo, substancialmente mantida, por exemplo, pelo menos50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%). Em outra modalidade específica, o comprimento de CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH na regiãode VH e/ou o comprimento de CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR2 deVL na região de VL de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presentedocumento podem variar (por exemplo, ser mais curtos ou mais longos) em 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos desde que (i) aligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 seja mantida; (ii) a carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139 seja mantida; e (iii) a inibição de invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16 seja mantida(por exemplo, substancialmente mantida, por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%). Em outra modalidade, a terminação amino e/ou a terminação carbóxi de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, umaCDR3 de VH, uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VLdescrita no presente documento pode ser estendida ou encurtada em 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos em comparação com uma oumais das CDRs descritas no presente documento desde que (i) a ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 seja mantida; (ii) a carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139 seja mantida; e (iii) a inibição de invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16 seja mantida(por exemplo, substancialmente mantida, por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%). Conforme usado no presente documento, os termos “se liga imunoespecificamente”, “reconheceimunoespecificamente”, “se liga especificamente”, e “reconhece especificamente” são termos análogos no contexto de anticorpos e se referem a anticorpos e fragmentos de ligação com antígenodos mesmos que se ligam com um antígeno (por exemplo, epítopo oucomplexo imune) por meio dos locais de ligação com antígeno conforme entendido por aquele que é versado na técnica, e não exclui a reatividade cruzada do anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno com outros antígenos. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para avaliar se (i) a ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 é mantida; (ii) a carência de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139 é mantida; e (iii) a inibiçãode invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16 é mantida,por exemplo, ensaios de ligação ELISA ou análise FACs, conforme descrito na Seção 0, abaixo.[367] In a specific embodiment, the position of VH CDR1, VH CDR2, and/or VH CDR3 in the VH region and/or the position of VL CDR1, VL CDR2, and/or VL CDR2 in the VL region of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may vary by 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more amino acid positions provided that (i) immunospecific binding with a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 is maintained; (ii) the lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139 is maintained; and (iii) the inhibition of in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16 is maintained (e.g., substantially maintained, e.g., at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another specific embodiment, the length of VH CDR1, VH CDR2, and/or VH CDR3 in the VH region and/or the length of VL CDR1, VL CDR2, and/or VL CDR2 in the VL region of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may vary (e.g., be shorter or longer) by 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more amino acids provided that (i) immunospecific binding with a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 is maintained; (ii) the lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139 is maintained; and (iii) the inhibition of in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16 is maintained (e.g., substantially maintained, e.g., at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another embodiment, the amino terminus and/or the carboxy terminus of a VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, a VL CDR1, a VL CDR2, and/or a VL CDR3 described herein can be extended or shortened by 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more amino acids compared to one or more of the CDRs described herein provided that (i) immunospecific binding with a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 is maintained; (ii) lack of immunospecific binding with a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139 is maintained; and (iii) the inhibition of in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16 is maintained (e.g., substantially maintained, e.g., at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). As used herein, the terms “immunospecifically binds,” “immunospecifically recognizes,” “specifically binds,” and “specifically recognizes” are analogous terms in the context of antibodies and refer to antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to an antigen (e.g., epitope or immune complex) through antigen-binding sites as understood by one of skill in the art, and do not exclude cross-reactivity of the antibody or antigen-binding fragment with other antigens. Any method known in the art may be used to assess whether (i) immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 is maintained; (ii) lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139 is maintained; and (iii) inhibition of in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16 is maintained, e.g., ELISA binding assays or FACs analysis as described in Section 0 below.

[368] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada de anticorpo e/ou cadeia leve, por exemplo, uma cadeia pesada sozinha, uma cadeia leve sozinha, ou tanto uma cadeia pesada como uma cadeia leve. Em relação à cadeia pesada, em uma modalidade específica, a cadeia pesada de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento pode ser uma cadeia pesada alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) ou mu (μ). Em outra modalidade específica, a cadeia pesada de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo descrito pode compreender uma cadeia pesada humana alfa(α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) ou mu (μ).[368] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising an antibody heavy chain and/or light chain, e.g., a heavy chain alone, a light chain alone, or both a heavy chain and a light chain. With respect to the heavy chain, in a specific embodiment, the heavy chain of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be an alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (y), or mu (μ) heavy chain. In another specific embodiment, the heavy chain of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can comprise an alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (y), or mu (μ) human heavy chain.

[369] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, sendo que (i) se liga imunoespecificamente com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133; (ii) carece de ligaçãoimunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139; e (iii) inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante a dita primeira forma de MUC16, compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH que tem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, da SEQ ID NO: 104 e da SEQ ID NO: 105,respectivamente, da SEQ ID NO: 109, da SEQ ID NO: 110 e da SEQ ID NO: 111, respectivamente, ou da SEQ ID NO: 115, da SEQ ID NO: 116 e da SEQ ID NO: 117, respectivamente, e em que a região constante da cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada humana alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) ou mu (μ). Conforme usado no presente documento, o termo “região constante” ou “domínio constante” é intercambiável e tem seu significado comum na técnica. A região constante é uma porção de anticorpo, por exemplo, uma porção de terminal carboxila de uma cadeia leve e/ou pesada que não está diretamente envolvida na ligação de um anticorpo com antígeno, mas que pode exibir várias funções efetoras, tal como interação com o receptor de Fc. A região constante de uma molécula de imunoglobulina, de modo geral, tem uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação a um domínio variável de imunoglobulina. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de anticorpo 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aqueleslistados na Tabela 1, na Tabela 3 ou na Tabela 5) e em que a região constante da cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada humana alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) ou mu (μ).[369] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, wherein (i) immunospecifically binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139; and (iii) inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing said first form of MUC16, comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain comprises a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, and SEQ ID NO: 105, respectively, of SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, and SEQ ID NO: 111, respectively, or of SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, and SEQ ID NO: 117, respectively, and wherein the heavy chain constant region is an alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (y), or mu (μ) human heavy chain constant region. As used herein, the terms "constant region" or "constant domain" are interchangeable and have their common meaning in the art. The constant region is a portion of an antibody, e.g., a carboxyl-terminal portion of a light and/or heavy chain, that is not directly involved in the binding of an antibody to antigen but may exhibit various effector functions, such as interaction with the Fc receptor. The constant region of an immunoglobulin molecule generally has a more conserved amino acid sequence than an immunoglobulin variable domain. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain comprises a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of antibody 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 1, Table 3, or Table 5), and wherein the constant region of the heavy chain is a human alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (y), or mu (μ) heavy chain constant region.

[370] Em outra modalidade particular, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região variável dacadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ IDNO: 101, e em que a região constante da cadeia pesada é umaregião constante de cadeia pesada humana alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) ou mu (μ). Em outra modalidade particular,um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação comantígeno do mesmo descrito no presente documento compreende umacadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidosda SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:61 ou SEQ ID NO:81, e em que a região constante da cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada humana alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) ou mu (μ).[370] In another particular embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ IDNO: 101, and wherein the constant region of the heavy chain is a human alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (y), or mu (μ) heavy chain constant region. In another particular embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:61, or SEQ ID NO:81, and wherein the heavy chain constant region is a human alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (y), or mu (μ) heavy chain constant region.

[371] Em uma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada emque a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 deVH que tem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, da SEQ ID NO: 104 e da SEQ ID NO: 105, respectivamente, ou da SEQ ID NO: 109, da SEQ ID NO: 110; ou da SEQ ID NO: 111,respectivamente, ou da SEQ ID NO: 115, da SEQ ID NO: 116 ou da SEQ ID NO: 117, respectivamente, e em que a região constante dacadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada humana. Emuma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH dequalquer uma das CDRs de VH de anticorpos 10C6, 7B12, 19C11,16C5 ou 18C6 (isto é, aqueles listados na Tabela 1, na Tabela 3e na Tabela 5), e em que a região constante da cadeia pesada éuma região constante de cadeia pesada humana. Em uma modalidadeespecífica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento deligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidosda região variável da cadeia pesada compreende a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO: 101, e em que a região constante da cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada humana. Emuma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH de anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é,aqueles listados na Tabela 7), e em que a região constante da cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada humana. Os exemplos não limitantes de sequências de região constante humanas foram descritos na técnica, por exemplo, consultar Kabat EA et al., (1991) supra.[371] In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain comprises a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, and SEQ ID NO: 105, respectively, or of SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110; or SEQ ID NO: 111, respectively, or of SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, or SEQ ID NO: 117, respectively, and wherein the constant region of the heavy chain is a human heavy chain constant region. In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region comprises a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 from any one of the VH CDRs of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 1, Table 3, and Table 5), and wherein the heavy chain constant region is a human heavy chain constant region. In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, and wherein the heavy chain constant region is a human heavy chain constant region. In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of any one of the VH CDRs of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 7), and wherein the constant region of the heavy chain is a human heavy chain constant region. Non-limiting examples of human constant region sequences have been described in the art, e.g., see Kabat EA et al., (1991) supra.

[372] Em relação à cadeia leve, em uma modalidade específica, a cadeia leve de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é uma cadeia leve kappa. Em outra modalidade específica, a cadeia leve de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é uma cadeia leve lambda. Em ainda outramodalidade específica, a cadeia leve de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno domesmo descrito no presente documento é uma cadeia leve kappa humana ou uma cadeia leve lambda humana.[372] Regarding the light chain, in a specific embodiment, the light chain of a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein is a kappa light chain. In another specific embodiment, the light chain of a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein is a lambda light chain. In yet another specific embodiment, the light chain of a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein is a human kappa light chain or a human lambda light chain.

[373] Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL que tem as sequências aminoácidos de anticorpo SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108, respectivamente, ou SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 114, respectivamente, ou SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 120, respectivamente, eem que a região constante da cadeia leve é uma região constantede cadeia leve kappa ou lambda. Em uma modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de anticorpo 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6(isto é, aqueles listados na Tabela 2, na Tabela 4 ou na Tabela6) e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve kappa ou lambda.[373] In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the light chain comprises a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 having the antibody amino acid sequences SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, and SEQ ID NO: 108, respectively, or SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 114, respectively, or SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, and SEQ ID NO: 120, respectively, and wherein the light chain constant region is a kappa or lambda light chain constant region. In a particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the light chain comprises a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 of antibody 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 2, Table 4, or Table 6), and wherein the constant region of the light chain is a kappa or lambda light chain constant region.

[374] Em outra modalidade particular, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102, e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve kappa ou lambda. Em outra modalidade particular, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, da SEQ ID NO: 22, da SEQ ID NO:42, da SEQ ID NO:62 ou da SEQ ID NO:82, e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve kappa ou lambda.[374] In another particular embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, and wherein the light chain constant region is a kappa or lambda light chain constant region. In another particular embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 62, or SEQ ID NO: 82, and wherein the light chain constant region is a kappa or lambda light chain constant region.

[375] Em uma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL que tem as sequências aminoácidos de SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108, respectivamente, ou SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 114, respectivamente, ou SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 120, respectivamente, e em que a região constante da cadeia leve compreende o aminoácido de uma região constante de cadeia leve humana. Em uma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL que tem as sequências de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL de anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aquelas listadas na Tabela 2, na Tabela 4 e na Tabela 6), e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve humana. Em uma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102, e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve humana. Em uma modalidade específica, um Anticorpo Glicosilado de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL de anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6(isto é, aqueles listados na Tabela 8), e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve humana. Os exemplos não limitantes de sequências de região constante humanas foram descritos na técnica, por exemplo, consultar Kabat EA et al., (1991) supra.[375] In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the light chain variable region comprises a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, and SEQ ID NO: 108, respectively, or SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 114, respectively, or SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, and SEQ ID NO: 120, respectively, and wherein the light chain constant region comprises the amino acid of a human light chain constant region. In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the light chain variable region comprises a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 having the amino acid sequences of any of the VL CDRs of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 2, Table 4, and Table 6), and wherein the light chain constant region is a human light chain constant region. In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, and wherein the light chain constant region is a human light chain constant region. In a specific embodiment, a Glycosylated MUC16 Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a light chain wherein the amino acid sequence of the variable region of the light chain comprises the amino acid sequence of any one of the VL CDRs of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 8), and wherein the constant region of the light chain is a human light chain constant region. Non-limiting examples of human constant region sequences have been described in the art, e.g., see Kabat EA et al., (1991) supra.

[376] Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo descrito no presente documento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma cadeia leve região variável(VL) conforme descrito no presente documento, e em que as regiões constantes são do tipo encontrado em uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY, ou uma molécula de imunoglobulina humana IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY. Em outramodalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presentedocumento compreende uma VH e a VL que compreende quaisquer sequências de aminoácidos descritas no presente documento, e em que as regiões constantes são do tipo encontrado em uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY, qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquersubclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Em uma modalidade particular, as regiões constantes são do tipo encontrado em uma molécula de imunoglobulina humana IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY, qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina.[376] In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) as described herein, and wherein the constant regions are of the type found in an IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY immunoglobulin molecule, or a human IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY immunoglobulin molecule. In another specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a VH and VL comprising any amino acid sequences described herein, and wherein the constant regions are of the type found in an IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY immunoglobulin molecule, any class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), or any subclass (e.g., IgG2a and IgG2b) of immunoglobulin molecule. In a particular embodiment, the constant regions are of the type found in a human IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY immunoglobulin molecule, any class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), or any subclass (e.g., IgG2a and IgG2b) of immunoglobulin molecule.

[377] Em outra modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que (i) a cadeia pesada compreende (a) uma região variável que compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH que tem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, da SEQ ID NO: 104 e da SEQ ID NO: 105, respectivamente, da SEQ ID NO: 109, da SEQ ID NO: 110 e da SEQ ID NO: 111, respectivamente, ou da SEQ ID NO: 115, da SEQ ID NO: 116 e da SEQ ID NO: 117, respectivamente, e (b) compreende um domínio de cadeia pesada constante que é o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG humana; e/ou (ii) a cadeia leve compreende (a) uma região variável que compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL que tem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 106, da SEQ ID NO: 107 e da SEQ ID NO: 108, respectivamente, ou da SEQ ID NO: 112, da SEQ ID NO: 113 e da SEQ ID NO: 114, respectivamente, ou da SEQ ID NO: 118, da SEQ ID NO: 119 e da SEQ ID NO: 120, respectivamente, e (b) um domínio de cadeia leve constante que é o domínio constante de uma IgG humana. Em outra modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que (i) a cadeia pesada compreende (a) uma região variável que compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH que tem as sequências de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH de anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aquelas listadas na Tabela 1, na Tabela 3 e na Tabela 5), e (b) compreende um domínio de cadeia pesada constante que é o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG humana; e/ou (ii) a cadeia leve compreende (a) uma região variável que compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL que tem as sequências de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL de anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6(isto é, aquelas listadas na Tabela 2, na Tabela 4 e na Tabela 6), e (b) um domínio de cadeia leve constante que é o domínio constante de uma IgG humana.[377] In another particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain and/or a light chain, wherein (i) the heavy chain comprises (a) a variable region comprising a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, and SEQ ID NO: 105, respectively, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, and SEQ ID NO: 111, respectively, or SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, and SEQ ID NO: 117, respectively, and (b) comprises a constant heavy chain domain that is the constant domain of a human IgG heavy chain; and/or (ii) the light chain comprises (a) a variable region comprising a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, and SEQ ID NO: 108, respectively, or of SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 114, respectively, or of SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, and SEQ ID NO: 120, respectively, and (b) a constant light chain domain that is the constant domain of a human IgG. In another particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain and/or a light chain, wherein (i) the heavy chain comprises (a) a variable region comprising a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 having the amino acid sequences of any of the VH CDRs of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 1, Table 3, and Table 5), and (b) comprises a constant heavy chain domain that is the constant domain of a human IgG heavy chain; and/or (ii) the light chain comprises (a) a variable region comprising a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 that has the amino acid sequences of any of the VL CDRs of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 2, Table 4, and Table 6), and (b) a constant light chain domain that is the constant domain of a human IgG.

[378] Em outra modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que (i) a cadeia pesada compreende (a) uma região variável que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101, e (b) um domínio de cadeia pesada constante que é o domínio constante de uma IgG humana; e/ou (ii) a cadeia leve compreende (a) uma região variável que compreendea sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102, e (b) um domínio de cadeia leve constante é o domínio constante de uma cadeialeve kappa humana. Em outra modalidade particular, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que (i) a cadeia pesada compreende (a) uma região variável que compreende a sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12,19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aqueles listados na Tabela 7), e(b) um domínio de cadeia pesada constante que é o domínio constante de uma IgG humana; e/ou (ii) a cadeia leve compreende (a) uma região variável que compreende a sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou18C6 (isto é, aqueles listados na Tabela 8), e (b) um domínio de cadeia leve constante é o domínio constante de uma cadeia leve kappa humana.[378] In another particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain and/or a light chain, wherein (i) the heavy chain comprises (a) a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, and (b) a constant heavy chain domain that is the constant domain of a human IgG; and/or (ii) the light chain comprises (a) a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, and (b) a constant light chain domain is the constant domain of a human kappa light chain. In another particular embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein comprises a heavy chain and/or a light chain, wherein (i) the heavy chain comprises (a) a variable region comprising the amino acid sequence of the VH of any one of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 7), and (b) a constant heavy chain domain that is the constant domain of a human IgG; and/or (ii) the light chain comprises (a) a variable region comprising the amino acid sequence of the VL of any one of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 8), and (b) a constant light chain domain is the constant domain of a human kappa light chain.

[379] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende sequências de aminoácidos com a identidade percentual descrita abaixo em relação a qualquer uma das SEQ ID Nos:1 a 100. Algoritmos matemáticos podem ser utilizados para determinar a identidade percentual entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos). Um exemplo não limitador preferencial de algoritmo matemático utilizado para a comparação entre duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2.264 a 2.268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5.873 a 5.877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com os parâmetros de programa de nucleotídeo NBLAST definidos, por exemplo, para pontuação =100, comprimento de palavra =12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com os parâmetros de programa XBLAST definidos, por exemplo, para pontuação 50, comprimento de palavras =3 para obter as sequências de aminoácidos homólogas a uma molécula de proteína descrita no presente documento. BLAST com intervalo pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402, para obter alinhamentos com intervalo para propósitos de comparação. Alternativamente, uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas pode ser realizada por PSI BLAST (Id.). Os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) podem ser usados (consultar, por exemplo, Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) na rede mundial de computadores, ncbi.nlm.nih.gov) ao utilizar os programas BLAST, BLAST com intervalo e PSI Blast. Um outro exemplo não limitante preferencial de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:11 a 17. Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequências GCG. Mediante a utilização do programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade por lacuna de 4 podem ser usados. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada com o uso de técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem a permissão de lacunas. Tipicamente, apenas correlações exatas são contadas ao calcular a identidade percentual.[379] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein or an antigen-binding fragment thereof comprises amino acid sequences having the percent identity described below to any of SEQ ID Nos:1 to 100. Mathematical algorithms can be used to determine the percent identity between two sequences (e.g., amino acid sequences or nucleic acid sequences). A preferred non-limiting example of a mathematical algorithm used for comparison between two sequences is the algorithm of Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877. Such an algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs of Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Nucleotide BLAST searches can be performed with the NBLAST nucleotide program parameters set, for example, to score = 100, word length = 12, to obtain nucleotide sequences homologous to nucleic acid molecules described herein. Protein BLAST searches can be performed with XBLAST program parameters set, for example, to score = 50, word length = 3, to obtain amino acid sequences homologous to a protein molecule described herein. Gap BLAST can be used as described in Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389–3402, to obtain gap alignments for comparison purposes. Alternatively, an iterated search that detects distant relationships between molecules can be performed using PSI BLAST (Id.). The default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST and NBLAST) can be used (see, for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI) on the World Wide Web, ncbi.nlm.nih.gov) when using the BLAST, gap BLAST, and PSI Blast programs. Another preferred non-limiting example of a mathematical algorithm used for sequence comparison is the algorithm of Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11–17. This algorithm is incorporated in the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, a residue weight table of PAM120, a gap length penalty of 12, and a gap penalty of 4 can be used. Additionally, the percent identity between two sequences can be determined using techniques similar to those described above, with or without allowing gaps. Typically, only exact correlations are counted when calculating percent identity.

[380] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101. Em certasmodalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmentode ligação com antígeno do mesmo compreende uma VH que tem pelomenos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12,19C11, 16C5 ou 1B5 (isto é, aqueles listados na Tabela 7). Emcertas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende um domíniode VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101, em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno compreende CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) que são idênticas às CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) apresentadas na Tabela 1, na Tabela 2, na Tabela 3, na Tabela 4, na Tabela 5 ou na Tabela 6. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende um domínio de VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aqueleslistados na Tabela 7), em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno compreende CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) que são idênticas às CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) apresentadas na Tabela 1, na Tabela 2, Tabela 3, na Tabela 4, na Tabela 5 ou na Tabela 6.[380] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 1B5 (i.e., those listed in Table 7). In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) that are identical to the CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) set forth in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4, Table 5, or Table 6. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 7), wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) that are identical to the CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) set forth in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4, Table 5, or Table 6.

[381] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102. Em certasmodalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmentode ligação com antígeno do mesmo compreende uma VL que tem pelomenos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12,19C11, 16C5 ou 1B5 (isto é, aqueles listados na Tabela 8). Emcertas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende um domíniode VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102, em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno compreende CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) que são idênticas às CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) apresentadas na Tabela 1, na Tabela 2, na Tabela 3, na Tabela 4, na Tabela 5 ou na Tabela 6. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende um domínio de VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VL de qualquer umdos anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aqueleslistados na Tabela 7), em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno compreende CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) que são idênticas às CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) apresentadas na Tabela 1, na Tabela 2, Tabela 3, na Tabela 4, na Tabela 5 ou na Tabela 6.[381] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 1B5 (i.e., those listed in Table 8). In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VL domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) that are identical to the CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) set forth in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4, Table 5, or Table 6. .... 95% or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 7), wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) that are identical to the CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) set forth in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4, Table 5, or Table 6.

[382] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende: (i) um domínio de VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% de identidadede sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101;e (ii) um domínio de VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%,pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% de identidadede sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102.Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende: (i) umdomínio de VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VH de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aqueleslistados na Tabela 8); e (ii) um domínio de VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VL de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6(isto é, aqueles listados na Tabela 7), respectivamente. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende: (i) umdomínio de VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101; e (ii) um domínio de VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102, em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno compreende CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) que são idênticas às CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) apresentadas na Tabela 1, na Tabela 2, na Tabela 3, na Tabela 4, na Tabela 5 ou na Tabela 6. Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo compreende: (i) um domínio de VH que tem pelo menos 80%, pelomenos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% deidentidade de sequência com a sequência de aminoácidos da VH dequalquer um dos anticorpos 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 18C6 (istoé, aqueles listados na Tabela 8); e (ii) um domínio de VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequênciade aminoácidos da VL de qualquer um dos anticorpos 10C6, 7B12,19C11, 16C5 ou 18C6 (isto é, aqueles listados na Tabela 7),respectivamente, em que o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno compreende CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) que são idênticas às CDRs (por exemplo, CDRs de VH e/ou CDRs de VL) apresentadas na Tabela 1, na Tabela 2, na Tabela 3, na Tabela 4, na Tabela 5 ou na Tabela 6.[382] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: (i) a VH domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; and (ii) a VL domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: (i) a VH domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; amino acid sequence of the VH of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 8); and (ii) a VL domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 7), respectively. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: (i) a VH domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; and (ii) a VL domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) that are identical to the CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) set forth in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4, Table 5, or Table 6. In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: (i) a VH ... of amino acids from the VH of any of the antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 or 18C6 (i.e., those listed in Table 8); and (ii) a VL domain that has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL of any of antibodies 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 18C6 (i.e., those listed in Table 7), respectively, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) that are identical to the CDRs (e.g., VH CDRs and/or VL CDRs) set forth in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4, Table 5, or Table 6.

[383] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos que se ligam a um epítopo igual ou sobreposto de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (por exemplo, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 e/ou 16C5). Conforme usado no presentedocumento, um “epítopo” é um termo na técnica e pode se referir a uma região localizada de um antígeno com o qual um anticorpo pode se ligar imunoespecificamente. Um epítopo pode ser, por exemplo, aminoácidos contíguos de um polipeptídeo (epítopo linear ou contíguo) ou um epítopo pode, por exemplo, estar junto a duas ou mais regiões não contíguas de um polipeptídeo ou polipeptídeos (epítopo conformacional, não linear, descontínuo ou não contíguo). Em certas modalidades, o epítopo de um anticorpo pode ser determinado, por exemplo, por espectroscopia de RMN, estudos de cristalografia por difração de raios X, ensaios ELISA, troca de hidrogênio/deutério acoplada à espectrometria de massa (por exemplo, espectrometria de massa por MALDI), ensaios de varredura de oligopeptídeo com base em arranjo e/ou mapeamento de mutagênese (por exemplo, mapeamento de mutagênese sítio-dirigida). Para cristalografia de raios X, a cristalização pode ser realizada com o uso de qualquer um dos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339 a 350;McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1 a 23; Chayen NE (1997)Structure 5: 1.269 a 1.274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251:6.300 a 6.303). Os cristais de anticorpo:antígeno podem ser estudados com o uso de técnicas de difração de raios X bem conhecidas e podem ser refinados com o uso de software de computador, tal como X-PLOR (Universidade de Yale, 1992, distribuído pela Molecular Simulations, Inc.; consultar, por exemplo, Meth Enzymol (1985) volumes 114 e 115, eds Wyckoff HW et al.,; Pedido de Patente no U.S. 2004/0014194), e BUSTER(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37 a 60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361 a 423, edCarter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1.316 a 1.323). Os estudos de mapeamentode mutagênese podem ser realizados com o uso de qualquer método conhecidos por aquele versado na técnica. Consultar, por exemplo, Champe M et al., (1995) e Cunningham BC & Wells JA (1989) para uma descrição de técnicas de mutagênese, incluindo técnicas de mutagênese por varredura de alanina. Adicionalmente, os anticorpos que reconhecem e se ligam a epítopos iguais ou sobrepostos podem ser identificados com o uso de técnicas de rotina, tal como um imunoensaio, por exemplo, mostrando-se a habilidade de um anticorpo em bloquear a ligação de outro anticorpo com um antígeno alvo, isto é, um ensaio de ligação competitiva. Os ensaios de ligação competitiva também podem ser usados para determinar se dois anticorpos têm especificidade de ligação similar para um epítopo. A ligação competitiva pode ser determinada em um ensaio em que a imunoglobulina sob teste inibe a ligação imunoespecífica de um anticorpo de referência com um antígeno comum. Inúmeros tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (consultar Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242 a 253); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (consultar Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3.614 a 3.619); ensaio identificado direto de fase sólida, ensaio de sanduíche identificado direto de fase sólida (consultar Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de identificação direto de fase sólida com o uso de identificação com I-125 (consultar Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7 a 15); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546 a 552); e RIA identificado direto. (Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77 a 82). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que portam qualquer um desse, uma imunoglobulina de teste não identificada e uma imunoglobulina de referência identificada. A inibição competitiva pode ser medida determinando-se a quantidade de identificação ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Usualmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Usualmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, o mesmo inibirá a ligação imunoespecífica de um anticorpo de referência com um antígeno comum em pelo menos 50 a 55%, 55 a60%, 60 a 65%, 65 a 70% 70 a 75% ou mais. Um ensaio de ligaçãocompetitiva pode ser configurado em um grande número de formatos com o uso de antígeno identificado ou anticorpo identificado. Em uma versão comum desse ensaio, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 cavidades. A habilidade de anticorpos não identificados em bloquear a ligação de anticorpos identificados com o antígeno é, então, medida com o uso de identificações radioativas ou enzimáticas. Para mais detalhes consultar, por exemplo, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2.308 a 2.315;Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269 a 274; KurokiM et al., (1990) Cancer Res 50: 4.872 a 4.879; Kuroki M et al.,(1992) Immunol Invest 21: 523 a 538; Kuroki M et al., (1992)Hybridoma 11: 391 a 407 e Antibodies: A Laboratory Manual, EdHarlow E & Lane D editors supra, páginas 386 a 389.[383] In another aspect, provided herein are antibodies that bind to a same or overlapping epitope of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, and/or 16C5). As used herein, an “epitope” is a term in the art and may refer to a localized region of an antigen to which an antibody can immunospecifically bind. An epitope may be, for example, contiguous amino acids of a polypeptide (linear or contiguous epitope), or an epitope may, for example, be along two or more non-contiguous regions of a polypeptide or polypeptides (conformational, non-linear, discontinuous, or non-contiguous epitope). In certain embodiments, the epitope of an antibody can be determined, for example, by NMR spectroscopy, X-ray diffraction crystallography studies, ELISA assays, hydrogen/deuterium exchange coupled to mass spectrometry (e.g., MALDI mass spectrometry), array-based oligopeptide scanning assays, and/or mutagenesis mapping (e.g., site-directed mutagenesis mapping). For X-ray crystallography, crystallization may be accomplished using any of the methods known in the art (e.g., Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339–350;McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1–23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1,269–1,274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6,300–6,303). Antibody:antigen crystals can be studied using well-known X-ray diffraction techniques and can be refined using computer software such as X-PLOR (Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; see, for example, Meth Enzymol (1985) volumes 114 and 115, eds. Wyckoff HW et al.; U.S. Patent Application No. 2004/0014194), and BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37–60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A:361–423, ed. Carter CW; Roversi P et al. (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1,316 to 1,323). Mutagenesis mapping studies can be performed using any method known to one skilled in the art. See, for example, Champe M et al., (1995) and Cunningham BC & Wells JA (1989) for a description of mutagenesis techniques, including alanine scanning mutagenesis techniques. Additionally, antibodies that recognize and bind to the same or overlapping epitopes can be identified using routine techniques, such as an immunoassay, for example, by showing the ability of one antibody to block the binding of another antibody to a target antigen, i.e., a competitive binding assay. Competitive binding assays can also be used to determine whether two antibodies have similar binding specificity for an epitope. Competitive binding can be determined in an assay in which the test immunoglobulin inhibits the immunospecific binding of a reference antibody to a common antigen. Numerous types of competitive binding assays are known, for example: direct or indirect solid-phase radioimmunoassay (RIA), direct or indirect solid-phase enzyme immunoassay (EIA), sandwich competition assay (see Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242–253); direct solid-phase biotin-avidin EIA (see Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614–3619); direct solid-phase labeled assay, direct solid-phase labeled sandwich assay (see Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direct solid-phase labeled RIA using I-125 labeling (see Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7–15); Direct solid-phase biotin-avidin EIA (Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546–552); and direct labeled RIA (Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77–82). Typically, such an assay involves the use of purified antigen bound to a solid surface or cells bearing either of these, an unidentified test immunoglobulin, and a identified reference immunoglobulin. Competitive inhibition can be measured by determining the amount of label bound to the solid surface or cells in the presence of the test immunoglobulin. Usually, the test immunoglobulin is present in excess. Usually, when a competitive antibody is present in excess, it will inhibit the immunospecific binding of a reference antibody to a common antigen by at least 50 to 55%, 55 to 60%, 60 to 65%, 65 to 70%, or 70 to 75% or more. A competitive binding assay can be configured in a large number of formats using either identified antigen or identified antibody. In a common version of this assay, the antigen is immobilized in a 96-well plate. The ability of unidentified antibodies to block the binding of identified antibodies to the antigen is then measured using radioactive or enzymatic identification. For further details, see, for example, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308 to 2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269 to 274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4,872 to 4,879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523 to 538; Kuroki M et al., (1992)Hybridoma 11: 391 to 407 and Antibodies: A Laboratory Manual, EdHarlow E & Lane D editors supra, pages 386 to 389.

[384] Em certos aspectos, ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se um anticorpo é competitivamente bloqueado, por exemplo, de uma forma dependente de dose, por outro anticorpo, por exemplo, um anticorpo se liga essencialmente com o mesmo epítopo, ou epítopos sobrepostos, como um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos em ensaios de ligação competitiva, tal como ensaios ELISA por competição, que podem ser configurados em diversos formatos diferentes, com o uso de antígeno identificado ou anticorpo identificado. Em uma modalidade particular, um anticorpo pode ser testado em ensaios de ligação competitiva com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo de IgG murino contendo a região variável de 10C6, 7B12, 19C11,16C5 ou 16C5).[384] In certain aspects, competitive binding assays can be used to determine whether an antibody is competitively blocked, e.g., in a dose-dependent manner, by another antibody, e.g., an antibody binds to essentially the same epitope, or overlapping epitopes, as a reference antibody, when the two antibodies recognize identical or sterically overlapping epitopes in competitive binding assays, such as competition ELISA assays, which can be configured in several different formats, using identified antigen or identified antibody. In a particular embodiment, an antibody can be tested in competitive binding assays with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., a murine IgG antibody containing the variable region of 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 16C5).

[385] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos que competem (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo de IgG murino contendo a região variável de 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 16C5), conforme determinado com o uso de ensaios conhecidos por um versado na técnica ou descrito no presente documento (por exemplo, ELISA). Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos que inibem competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) que um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo de IgG murino contendo a região variável de 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 ou 16C5) se ligue com MUC16, conforme determinado com o uso de ensaios conhecidos por um versado na técnica ou descrito no presente documento (por exemplo, ELISA).[385] In another aspect, provided herein are antibodies that compete (e.g., in a dose-dependent manner) for binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., a murine IgG antibody containing the variable region of 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 16C5), as determined using assays known to one of skill in the art or described herein (e.g., ELISA). In another aspect, provided herein are antibodies that competitively inhibit (e.g., in a dose-dependent manner) a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., a murine IgG antibody containing the variable region of 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, or 16C5) from binding to MUC16, as determined using assays known to one of skill in the art or described herein (e.g., ELISA).

[386] Em certas modalidades, é fornecido no presente documento um anticorpo que compete com um anticorpo descrito no presente documento para ligação até o mesmo ponto que um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento autocompete pela ligação com MUC16. Em certas modalidades, é fornecido no presente documento um primeiro anticorpo que compete com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento para ligação com MUC16, em que a competição é exibida como ligação reduzida do primeiro anticorpo como o epítopo em mais de 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95%, ou 98% ou entre 80% a 85%, 80% a 90%, 85% a 90% ou 85% a 95%).[386] In certain embodiments, provided herein is an antibody that competes with an antibody described herein for binding to the same extent that a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein self-competes for binding to MUC16. In certain embodiments, provided herein is a first antibody that competes with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein for binding to MUC16, wherein the competition is exhibited as reduced binding of the first antibody to the epitope by greater than 80% (e.g., 85%, 90%, 95%, or 98%, or between 80% to 85%, 80% to 90%, 85% to 90%, or 85% to 95%).

[387] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16, com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH que compreende sequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 1, na Tabela 3 ou na Tabela 5. Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo deGlicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo que compreende as CDRS de VH de 10C6 (consultar a Tabela1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete(por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VH de 7B12 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VH de 19C11 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VH de 16C5 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VH de 18C6 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5).[387] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH comprising a VH CDR1, a VH CDR2, and/or a VH CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 1, Table 3, or Table 5. In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the VH CDRs of 10C6 (see Table 1, Table 3 and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the 7B12 VH CDRS (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the 19C11 VH CDRS (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the 16C5 VH CDRS (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the 18C6 VH CDRS (see Table 1, Table 3, and Table 5).

[388] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16, com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL que compreende sequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 2, na Tabela 4 ou na Tabela 6. Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo deGlicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo que compreende as CDRS de VL de 10C6 (consultar a Tabela2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete(por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VL de 7B12 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VL de 19C11 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VL de 16C5 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VL de 18C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6).[388] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL comprising a VL CDR1, a VL CDR2, and/or a VL CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 2, Table 4, or Table 6. In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the VL CDRs of 10C6 (see Table 2, Table 4 and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the VL CDRS of 7B12 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the VL CDRS of 19C11 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the VL CDRS of 16C5 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the VL CDRS of 18C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6).

[389] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma forma dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH que compreende sequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 1, na Tabela 3 ou na Tabela 5; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL que compreende sequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 2, na Tabela 4 ou na Tabela 6. Em uma modalidade particular, é fornecido presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) as CDRS de VH de 10C6 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 10C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) as CDRS de VH de 7B12 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 7B12 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) as CDRS de VH de 19C11 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 19C11 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) as CDRS de VH de 16C5 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 16C5 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) as CDRS de VH de 18C6 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 18C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6).[389] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) a VH comprising a VH CDR1, a VH CDR2, and/or a VH CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 1, Table 3, or Table 5; and (b) a VL comprising a VL CDR1, a VL CDR2, and/or a VL CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 2, Table 4, or Table 6. In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) the VH CDRS of 10C6 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 10C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) the VH CDRS of 7B12 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 7B12 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) the VH CDRS of 19C11 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 19C11 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) the VH CDRS of 16C5 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 16C5 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) the VH CDRS of 18C6 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 18C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6).

[390] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VH que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 7. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:41. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81.[390] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH domain having an amino acid sequence as described in Table 7. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:21. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:41. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:61. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:81.

[391] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VL que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 8. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:62. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82.[391] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL domain having an amino acid sequence as described in Table 8. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:22. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:42. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:62. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:82.

[392] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica comMUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) um domínio de VH que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 7; e (b) um domínio de VL que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 8. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82.[392] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) a VH domain having an amino acid sequence as described in Table 7; and (b) a VL domain having an amino acid sequence as described in Table 8. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82.

[393] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igualou sobreposto do anticorpo que compreende uma VH que compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH que compreendesequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 1, na Tabela 3 ou na Tabela 5. Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se ligacom um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VH de 10C6 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igualou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VH de 7B12 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidadeparticular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente de dose) pela ligação imunoespecífica com MUC16 com um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende as CDRS de VH de 19C11 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se ligacom um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VH de 16C5 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VH de 18C6 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5).[393] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH comprising a VH CDR1, a VH CDR2, and/or a VH CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 1, Table 3, or Table 5. In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VH CDRs of 10C6 (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a matched or overlapping epitope of the antibody comprising the 7B12 VH CDRS (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for immunospecific binding to MUC16 with a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the 19C11 VH CDRS (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VH CDRS of 16C5 (see Table 1, Table 3, and Table 5). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VH CDRS of 18C6 (see Table 1, Table 3, and Table 5).

[394] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igualou sobreposto do anticorpo que compreende uma VL que compreende uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL que compreendesequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 2, na Tabela 4 ou na Tabela 6. Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se ligacom um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VL de 10C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igualou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VL de 7B12 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidadeparticular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igual ou sobreposto do anticorpoque compreende as CDRS de VL de 19C11 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com umepítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VL de 16C5 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documentoum Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende as CDRS de VL de 18C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6).[394] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds with a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL comprising a VL CDR1, a VL CDR2, and/or a VL CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 2, Table 4, or Table 6. In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds with a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VL CDRs of 10C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VL CDRS of 7B12 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VL CDRS of 19C11 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VL CDRS of 16C5 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising the VL CDRS of 18C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6).

[395] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento deligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ousobreposto do anticorpo que compreende (a) uma VH que compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH que compreendesequências de aminoácidos conforme descrito na Tabela 1, na Tabela 3 ou na Tabela 5; e (b) uma VL que compreende uma CDR1 deVL, uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL que compreende sequênciasde aminoácidos conforme descrito na Tabela 2, na Tabela 4 ou naTabela 6. Em uma modalidade particular, é fornecido no presentedocumento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento deligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ousobreposto do anticorpo que compreende (a) as CDRS de VH de 10C6(consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 10C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documentoum Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) as CDRS de VH de 7B12 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 7B12 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documentoum Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) as CDRS de VH de 19C11 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 19C11 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documentoum Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) as CDRS de VH de 16C5 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 16C5 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6). Em uma modalidade particular, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) as CDRS de VH de 18C6 (consultar a Tabela 1, a Tabela 3 e a Tabela 5); e (b) as CDRS de VL de 18C6 (consultar a Tabela 2, a Tabela 4 e a Tabela 6).[395] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH comprising a VH CDR1, a VH CDR2, and/or a VH CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 1, Table 3, or Table 5; and (b) a VL comprising a VL CDR1, a VL CDR2, and/or a VL CDR3 comprising amino acid sequences as described in Table 2, Table 4, or Table 6. In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) the VH CDRS of 10C6 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 10C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) the VH CDRS of 7B12 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 7B12 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) the VH CDRS of 19C11 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 19C11 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) the VH CDRS of 16C5 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 16C5 (see Table 2, Table 4, and Table 6). In a particular embodiment, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) the VH CDRS of 18C6 (see Table 1, Table 3, and Table 5); and (b) the VL CDRS of 18C6 (see Table 2, Table 4, and Table 6).

[396] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VH que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 7. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:41. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81.[396] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH domain having an amino acid sequence as described in Table 7. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:21. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:41. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:61. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:81.

[397] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VL que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 8. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:62. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82.[397] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL domain having an amino acid sequence as described in Table 8. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:22. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:42. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:62. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO:82.

[398] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) um domínio de VH que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 7; e (b) um domínio de VL que tem uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela 8. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se ligacom um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende(a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 1; e (b) um domínio de VL que tem a sequência deaminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com umepítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em aspectos específicos, é fornecido no presentedocumento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento deligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igualou sobreposto do anticorpo que compreende (a) um domínio de VHque tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligaçãocom antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) um domínio de VH quetem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62. Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga com um epítopo igual ou sobreposto do anticorpo que compreende (a) um domínio de VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81; e (b) um domínio de VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82.[398] In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds with a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH domain having an amino acid sequence as described in Table 7; and (b) a VL domain having an amino acid sequence as described in Table 8. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds with a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQID NO: 1; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds with a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. In specific aspects, provided herein is a MUC16 Glycosylating Antibody or antigen-binding fragment thereof that binds with a same or overlapping epitope of the antibody comprising (a) a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81; and (b) a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82.

[399] Ensaios conhecidos por um versado na técnica ou descritos no presente documento (por exemplo, cristalografia por raios X, ensaios ELISA, etc.) podem ser usados para determinar se dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo. A afinidade pode ser medida e/ou expressa de diversas formas conhecidas na técnica, incluindo, porém, sem limitação, constante de dissociação em equilíbrio (KD) e constante de associação em equilíbrio (KA). A KD pode ser determinada por técnicas conhecidas por aquele de habilidade comum na arte, tal como interferometria de biocamada.[399] Assays known to one of ordinary skill in the art or described herein (e.g., X-ray crystallography, ELISA assays, etc.) can be used to determine whether two antibodies bind to the same epitope. Affinity can be measured and/or expressed in various ways known in the art, including, but not limited to, equilibrium dissociation constant (KD) and equilibrium association constant (KA). KD can be determined by techniques known to one of ordinary skill in the art, such as biolayer interferometry.

[400] Em certas modalidades, o epítopo de um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é usado como um imunógeno para produzir anticorpos. Consultar, por exemplo, a Seção 0 e a Seção 0 para métodos para produzir anticorpos.5.1.2 Características funcionais[400] In certain embodiments, the epitope of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is used as an immunogen to produce antibodies. See, for example, Section 0 and Section 0 for methods of producing antibodies. 5.1.2 Functional Characteristics

[401] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd menor que 0,5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1,5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2,5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10- 4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s ou 8 x 10-4/s. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 0,5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1,5 x 10- 3/s, 2 x 10-3/s, 2,5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10- 4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10-4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s ou 8 x 10-4/s. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 0,5 x 10-3/s a 8 x 10-4/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 1 x 10-3/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 1,5 x 10-3/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 2 x 10-3/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 2 x 10-4/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma kd de cerca de 7 x 10-4/s.[401] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a kd of less than 0.5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1.5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2.5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10- 4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s or 8 x 10-4/s. In some embodiments, a MUC16 Glycosylating Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a k of about 0.5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1.5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2.5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10-4/s, 6 × 10-4/s, 7 × 10-4/s, or 8 × 10-4/s. In some embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a kd of about 0.5 × 10-3/s to 8 × 10-4/s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a kd of about 1 × 10-3/s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a kd of about 1.5 × 10-3/s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a kd of about 2 x 10-3/s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a kd of about 2 x 10-4/s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a kd of about 7 x 10-4/s.

[402] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma ka de pelo menos 2,5 x 104/s, 3 x 104/s, 3,5 x 104/s, 4 x 104/s, 4,5 x 104/s, 5 x 104/s, 5,5 x 104/s, 6 x 104/s, 6,5 x 104/s, 7 x 104/s, 7,5 x 104/s, 8 x 104/s, 9 x 104/s ou 9 x 105/s. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma ka de cerca de 2,5 x 104/s, 3 x 104/s, 3,5 x 104/s, 4 x 104/s, 4,5 x 104/s, 5 x 104/s, 5,5 x 104/s, 6 x 104/s, 6,5 x 104/s, 7 x 104/s, 7,5 x 104/s, 8 x 104/s, 9 x 104/s ou 9 x 105/s. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma ka de cerca de 4 x 104/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma ka de cerca de 6 x 104/s. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma ka de cerca de 7,5 x 104/s.[402] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a ka of at least 2.5 x 10 4 /s, 3 x 10 4 /s, 3.5 x 10 4 /s, 4 x 10 4 /s, 4.5 x 10 4 /s, 5 x 10 4 /s, 5.5 x 10 4 /s, 6 x 10 4 /s, 6.5 x 10 4 /s, 7 x 10 4 /s, 7.5 x 10 4 /s, 8 x 10 4 /s, 9 x 10 4 /s, or 9 x 10 5 /s. In some embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a ka of about 2.5 x 10 4 /s, 3 x 10 4 /s, 3.5 x 10 4 /s, 4 x 10 4 /s, 4.5 x 10 4 /s, 5 x 10 4 /s, 5.5 x 10 4 /s, 6 x 10 4 /s, 6.5 x 10 4 /s, 7 x 10 4 /s, 7.5 x 10 4 /s, 8 x 10 4 /s, 9 x 10 4 /s, or 9 x 10 5 /s. In some embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a ka of about 4 x 10 4 /s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a ka of about 6 x 10 4 /s. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a ka of about 7.5 x 10 4 /s.

[403] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD menor que 1.000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM ou 0,05 nM. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 1.000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM ou 0,05 nM. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 500 nM a 1.000 nM. Em algumas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 5 nM a 75 nM. Em uma modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 7 nM. Em outra modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 10 pM. Em outra modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 15 pM. Em outra modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 20 pM. Em outra modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 25 pM. Em outra modalidade específica, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com MUC16 com uma KD de cerca de 65 pM. Conforme usado no presente documento, os termos “cerca de”, quando usado para modificar um valor numérico ou uma faixa numérica, indicam que desvios de 5% a 10% acima e 5% a 10% abaixo do valor ou faixa permanecem dentro do significado destinado do valor ou faixa mencionada.[403] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds to MUC16 with a KD of less than 1,000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, or 0.05 nM. In some embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a K of about 1,000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, or 0.05 nM. In some embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a K of about 500 nM to 1,000 nM. In some embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 5 nM to 75 nM. In a specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 7 nM. In another specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 10 pM. In another specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 15 pM. In another specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 20 pM. In another specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 25 pM. In another specific embodiment, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds MUC16 with a KD of about 65 pM. As used herein, the terms “about,” when used to modify a numerical value or numerical range, indicate that deviations of 5% to 10% above and 5% to 10% below the value or range remain within the intended meaning of the stated value or range.

[404] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133. Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer (por exemplo, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer de pulmão, uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer de mama, uma célula de câncer de trompa de falópio, uma célula de câncer de útero (por exemplo, endometrial) ou um câncer de célula de peritônio primário). Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer de ovário. Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer de pulmão. Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer pancreático. Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer de mama. Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer de útero (por exemplo, endometrial). Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer de trompa de falópio. Em certas modalidades, a célula é uma célula de câncer de peritônio primário. Em certas modalidades, a célula é uma célula SKOV3. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 pelo menos 10, 20, 30, 40,50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500 ou 1.000 vezes mais que umanticorpo de controle de isótopo se liga com as células. Um anticorpo de controle de isótopo é um termo reconhecido na técnica. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 cerca de 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 100, 250, 500 ou 1.000 vezes mais que um anticorpo de controle de isótopo se liga com a célula. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, sendo que a primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é a SEQ ID NO: 133 entre 10 e 50, 50 e 100, 100 e 250, 250 e 500 ou 500 e 1.000 vezes mais que um anticorpo de controle de isótopo se liga com a célula.[404] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133. In certain embodiments, the cell is a cancer cell (e.g., an ovarian cancer cell, a lung cancer cell, a pancreatic cancer cell, a breast cancer cell, a fallopian tube cancer cell, a uterine (e.g., endometrial) cancer cell, or a primary peritoneal cancer cell). In certain embodiments, the cell is an ovarian cancer cell. In certain embodiments, the cell is a lung cancer cell. In certain embodiments, the cell is a pancreatic cancer cell. In certain embodiments, the cell is a breast cancer cell. In certain embodiments, the cell is a uterine (e.g., endometrial) cancer cell. In certain embodiments, the cell is a fallopian tube cancer cell. In certain embodiments, the cell is a primary peritoneal cancer cell. In certain embodiments, the cell is a SKOV3 cell. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, or 1,000-fold more than an isotope control antibody binds to the cells. An isotope control antibody is an art-recognized term. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 about 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, or 1,000-fold more than an isotope control antibody binds to the cell. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein the first form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133 between 10 and 50, 50 and 100, 100 and 250, 250 and 500, or 500 and 1,000 times more than an isotope control antibody binds to the cell.

[405] A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 é também denominada no presente documento MUC16c114 e consiste nos 114 resíduos de aminoácido C-terminais de MUC16 madura (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 madura). MUC16c114 tem capacidade para ser N-glicosilada nos aminoácidosasparagina das posições 1, 24 e 30 da SEQ ID NO: 133(correspondentes às posições de aminoácidos Asn1777, Asn1800 eAsn1806 da SEQ ID NO: 150).[405] The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 is also referred to herein as MUC16c114 and consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16). MUC16c114 is capable of being N-glycosylated at amino acid asparagine positions 1, 24, and 30 of SEQ ID NO: 133 (corresponding to amino acid positions Asn1777, Asn1800, and Asn1806 of SEQ ID NO: 150).

[406] Em certas modalidades, um Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento carece de ligação imunoespecífica com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139. Em certas modalidades, as células são células de câncer de ovário. Em certas modalidades, as células são células de câncer de pulmão. Em certas modalidades, as células são células de câncer pancreático. Em certas modalidades, as células são células de câncer de mama. Em certas modalidades, as células são células de câncer de útero (por exemplo, endometrial). Em certas modalidades, as células são células de câncer de trompa de falópio. Em certas modalidades, as células são células de câncer de peritônio primário. Em certas modalidades, as células são células SKOV3. Em certas modalidades, a segunda forma de MUC16 é fundida com uma proteína detectável, tal como, por exemplo, proteína verde fluorescente ou proteína vermelho fluorescente. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139, no máximo 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4 ou 5 vezes mais que um anticorpo de controle de isótopo se liga com as células. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139, cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4 ou 5 vezes mais que um anticorpo de controle de isótopo se liga com as células. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139, entre 0 e 1,1, 1,1 e 1,5, 1,5 e 3 ou 3 e 5 vezes mais que um anticorpo de controle de isótopo se liga com as células.[406] In certain embodiments, a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein lacks immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139. In certain embodiments, the cells are ovarian cancer cells. In certain embodiments, the cells are lung cancer cells. In certain embodiments, the cells are pancreatic cancer cells. In certain embodiments, the cells are breast cancer cells. In certain embodiments, the cells are uterine (e.g., endometrial) cancer cells. In certain embodiments, the cells are fallopian tube cancer cells. In certain embodiments, the cells are primary peritoneal cancer cells. In certain embodiments, the cells are SKOV3 cells. In certain embodiments, the second form of MUC16 is fused to a detectable protein, such as, for example, green fluorescent protein or red fluorescent protein. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139, at most 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, or 5 times more than an isotope control antibody binds to the cells. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139, about 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, or 5 times more than an isotope control antibody binds to the cells. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139, between 0 and 1.1, 1.1 and 1.5, 1.5 and 3, or 3 and 5 times more than an isotope control antibody binds to the cells.

[407] A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 139 é também denominada no presente documento MUC16c114- N3. MUC16c114-N3 consiste nos 114 resíduos de aminoácido C- terminais de MUC16 madura (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 madura), exceto pelo fato de que a asparagina na posição de aminoácido 30 (correspondente à posição de aminoácido 1806 da SEQ ID NO: 150) sofreu mutação em uma alanina. Assim, MUC16c114- N3 não tem capacidade para ser N-glicosilado na posição de aminoácido 30 da SEQ ID NO: 139 (correspondente à posição de aminoácido Asn1806 da SEQ ID NO: 150).[407] The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139 is also referred to herein as MUC16c114-N3. MUC16c114-N3 consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16), except that the asparagine at amino acid position 30 (corresponding to amino acid position 1806 of SEQ ID NO: 150) has been mutated to an alanine. Thus, MUC16c114-N3 is incapable of being N-glycosylated at amino acid position 30 of SEQ ID NO: 139 (corresponding to amino acid position Asn1806 of SEQ ID NO: 150).

[408] Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30 ou 40 vezes menos que 4H11 se liga com as células. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139, cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30 ou 40 vezes menos que 4H11 se liga com as células. Em certas modalidades, o Anticorpo de Glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga com uma célula que expressa de maneira recombinante uma segunda forma de MUC16, sendo que a segunda forma é não glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da segunda forma é a SEQ ID NO: 139,entre 3 e 5, 5 e 10, 10 e 20 ou 20 e 40 vezes menos que 4H11 seliga com a célula.[408] In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, or 40-fold less than 4H11 binds to the cells. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell recombinantly expressing a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139, about 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 20-, 30-, or 40-fold less than 4H11 binds to the cells. In certain embodiments, the MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to a cell that recombinantly expresses a second form of MUC16, wherein the second form is non-glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the second form is SEQ ID NO: 139, between 3 and 5, 5 and 10, 10 and 20, or 20 and 40 times less than 4H11 and binds to the cell.

[409] Ensaios para determinar a ligação de um Anticorpo deGlicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno domesmo descrito no presente documento com uma célula, tal como, por exemplo, FACs, são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Consultar, por exemplo, os métodos descritos na Seção 6.2.[409] Assays for determining the binding of a MUC16 Glycosylation Antibody or antigen-binding fragment thereof described herein to a cell, such as, for example, FACs, are known to one of skill in the art. See, for example, the methods described in Section 6.2.

[410] Para uso na presente invenção, “4H11” se refere ao anticorpo anti-MUC16 monoclonal designado como 4H11 em Rao et al. (PCT) Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462 a 472 ena publicação de pedido de patente internacional n° WO 2011/119979.[410] As used herein, “4H11” refers to the monoclonal anti-MUC16 antibody designated as 4H11 in Rao et al. (PCT) Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-472 and in International Patent Application Publication No. WO 2011/119979.

[411] Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descritono presente documento, se liga a um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), emque o resíduo de aminoácido número 4 (N4) e o resíduo deaminoácido número 10 (N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130)são glicosilados. Em certas modalidades, o peptídeo consiste nasequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), emque o resíduo de aminoácido número 4 (N4) e o resíduo deaminoácido número 10 (N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130)são glicosilados. Em certas modalidades, a glicosilação consisteem uma chitobiose N-ligada. Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígenodo mesmo se liga a um peptídeo que compreende a sequência deaminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), em que o resíduo deaminoácido número 7 (N7) de CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) églicosilado. Em certas modalidades, o peptídeo consiste na sequência de aminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), em queo resíduo de aminoácido número 7 (N7) de CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) é glicosilado. Em certas modalidades, a glicosilação consiste em uma chitobiose N-ligada. Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo se liga a uma mistura de peptídeos, em que a mistura de peptídeos compreende (a) um primeiro peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), em que o resíduo de aminoácido número 4 (N4) e o resíduode aminoácido número 10 (N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ IDNO:130) são glicosilados, e (b) um segundo peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), em que o resíduo de aminoácido número 7 (N7) deCGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) é glicosilado. Em certas modalidades, o primeiro peptídeo consiste na sequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), em que o resíduo de aminoácido número 4 (N4) e o resíduo de aminoácido número 10(N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) são glicosilados. Emcertas modalidades, o segundo peptídeo consiste na sequência de aminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), em que o resíduo deaminoácido número 7 (N7) de CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) églicosilado. Em certas modalidades, a glicosilação consiste em uma chitobiose N-ligada.[411] In certain embodiments, a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein binds to a peptide comprising the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) are glycosylated. In certain embodiments, the peptide consists of the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) are glycosylated. In certain embodiments, the glycosylation consists of an N-linked chitobiose. In certain embodiments, a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof binds to a peptide comprising the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) is glycosylated. In certain embodiments, the peptide consists of the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) is glycosylated. In certain embodiments, the glycosylation consists of an N-linked chitobiose. In certain embodiments, a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof binds to a mixture of peptides, wherein the mixture of peptides comprises (a) a first peptide comprising the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) are glycosylated, and (b) a second peptide comprising the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) is glycosylated. In certain embodiments, the first peptide consists of the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) are glycosylated. In certain embodiments, the second peptide consists of the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) is glycosylated. In certain embodiments, the glycosylation consists of an N-linked chitobiose.

[412] Os ensaios para determinar a ligação de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento a uma célula, tal como, por exemplo, ELISA, são conhecidos por um versado na técnica. Consulte, por exemplo, os métodos descritos na Seção 6.2. Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presentedocumento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) pelo menos 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 30vezes mais que a ligação de anticorpo monoclonal anti-MUC16 4H11 ao peptídeo. Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilaçãode MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) em cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 30 vezes mais que a ligação do anticorpo monoclonal anti-MUC16 4H11 ao peptídeo.[412] Assays for determining the binding of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein to a cell, such as, for example, ELISA, are known to one of skill in the art. See, for example, the methods described in Section 6.2. In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) at least 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, or 30-fold greater than the binding of anti-MUC16 monoclonal antibody 4H11 to the peptide. In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) at about 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, or 30-fold greater than the binding of the anti-MUC16 monoclonal antibody 4H11 to the peptide.

[413] Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um kd menor que 0,5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1,5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2,5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10- 3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10-4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s ou 8 x 10-4/s. Em algumas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um kd de cerca de 0,5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1,5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2,5 x 10- 3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10- 4/s, 5 x 10-4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s ou 8 x 10-4/s. Em algumas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um kd de cerca de 0,5 x 10-3/s a 8 x 10-4/s.[413] In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a kd of less than 0.5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1.5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2.5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10-4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s or 8 x 10-4/s. In some embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a kd of about 0.5 x 10-3/s, 1 x 10-3/s, 1.5 x 10-3/s, 2 x 10-3/s, 2.5 x 10-3/s, 3 x 10-3/s, 4 x 10-3/s, 5 x 10-3/s, 6 x 10-3/s, 7 x 10-3/s, 8 x 10-3/s, 9 x 10-3/s, 1 x 10-4/s, 2 x 10-4/s, 3 x 10-4/s, 4 x 10-4/s, 5 x 10-4/s, 6 x 10-4/s, 7 x 10-4/s, or 8 x 10-4/s. In some embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a kd of about 0.5 x 10-3/s to 8 x 10-4/s.

[414] Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um ka de pelo menos 2,5 x 104/s, 3 x 104/s, 3,5 x 104/s, 4 x 104/s, 4,5 x 104/s, 5 x 104/s, 5,5 x 104/s, 6 x 104/s, 6,5 x 104/s, 7 x 104/s, 7,5 x 104/s, 8 x 104/s, 9 x 104/s ou 9 x 105/s. Em algumas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um ka de cerca de 2,5 x 104/s, 3 x 104/s, 3,5 x 104/s, 4 x 104/s, 4,5 x 104/s, 5 x 104/s, 5,5 x 104/s, 6 x 104/s, 6,5 x 104/s, 7 x 104/s, 7,5 x 104/s, 8 x 104/s, 9 x 104/s ou 9 x 105/s. Em algumas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um ka de cerca de 2,5 x 104/s a 9 x 105/s.[414] In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a ka of at least 2.5 x 104/s, 3 x 104/s, 3.5 x 104/s, 4 x 104/s, 4.5 x 104/s, 5 x 104/s, 5.5 x 104/s, 6 x 104/s, 6.5 x 104/s, 7 x 104/s, 7.5 x 104/s, 8 x 104/s, 9 x 104/s, or 9 x 105/s. In some embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a ka of about 2.5 x 10 4 /s, 3 x 10 4 /s, 3.5 x 10 4 /s, 4 x 10 4 /s, 4.5 x 10 4 /s, 5 x 10 4 /s, 5.5 x 10 4 /s, 6 x 10 4 /s, 6.5 x 10 4 /s, 7 x 10 4 /s, 7.5 x 10 4 /s, 8 x 10 4 /s, 9 x 10 4 /s, or 9 x 10 5 /s. In some embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a ka of about 2.5 x 104/s to 9 x 105/s.

[415] Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (ou peptídeos) com um KD menor que 1.000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM ou 0,05 nM.Em algumas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presentedocumento se liga ao peptídeo (peptídeos) com um KD de cerca de 1.000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM ou 0,05 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento se liga ao peptídeo (peptídeos) com um KD de cerca de 500 nM a 1.000 nM.[415] In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to peptide(s) with a KD of less than 1,000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, or 0.05 nM. In some embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to peptide(s) with a KD of about 1,000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, or 0.05 nM. nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, or 0.05 nM. In some embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to the peptide(s) with a K of about 500 nM to 1,000 nM.

[416] Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno carece de ligação imunoespecífica à sequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), em que o resíduo de aminoácido número 4 (N4) eo resíduo de aminoácido número 10 (N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV(SEQ ID NO:130) não são glicosilados. Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo carece de ligação imunoespecífica à sequência de aminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), em que o resíduo de aminoácido número 7 (N7) de CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ IDNO:131) é glicosilado. Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, carece de ligação imunoespecífica a uma mistura de peptídeos, em que a mistura de peptídeos compreende (a) um primeiro peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), em que o resíduo de aminoácido número 4 (N4) e o resíduo deaminoácido número 10 (N10) de CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130)são glicosilados e (b) um segundo peptídeo que consiste nasequência de aminoácidos CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), em que o resíduo de aminoácido número 7 (N7) de CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) é glicosilado.[416] In certain embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof lacks immunospecific binding to the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) are not glycosylated. In certain embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof lacks immunospecific binding to the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) is glycosylated. In certain embodiments, a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein lacks immunospecific binding to a mixture of peptides, wherein the mixture of peptides comprises (a) a first peptide consisting of the amino acid sequence CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130), wherein amino acid residue number 4 (N4) and amino acid residue number 10 (N10) of CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:130) are glycosylated, and (b) a second peptide consisting of the amino acid sequence CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131), wherein amino acid residue number 7 (N7) of CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO:131) is glycosylated.

[417] Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento inibe a invasão de matrigel in vitro de células que expressam de maneira recombinante uma forma de MUC16 que é glicosilada e em que a sequência de aminoácidos da forma de MUC16 é SEQ ID NO:133 (MUC16c114). Em certas modalidades, as células que expressam de maneira recombinante MUC16c114 glicosilado são células SKOV3. Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada. Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada no resíduo de aminoácido Asn30 (que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO:150)). Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada nos resíduos de aminoácido Asn 24 e Asn30 (que corresponde a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16 maduro (SEQ ID NO:150)). Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada nos resíduos de aminoácido Asn1, Asn24 e Asn30 (que corresponde a Asn1777, Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16 maduro (SEQ ID NO:150)). Em certas modalidades, a glicosilação compreende chitobiose N-ligada. Em certas modalidades, a glicosilação consiste em uma chitobiose N-ligada. Em certas modalidades, a invasão de matrigel é inibida em pelo menos 1,25, 1,5, 1,75, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes em comparação com a invasão de matrigel in vitro das células, em que as células são tratadas com um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo que não direciona MUC16) ou com 4H11. Em certas modalidades, a invasão de matrigel é inibida em cerca de 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes em comparação com a invasão de matrigel in vitro das células, em que as células são tratadas com um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo que não direciona MUC16) ou com 4H11.[417] In certain embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein inhibits in vitro matrigel invasion of cells recombinantly expressing a form of MUC16 that is glycosylated and wherein the amino acid sequence of the form of MUC16 is SEQ ID NO:133 (MUC16c114). In certain embodiments, the cells recombinantly expressing glycosylated MUC16c114 are SKOV3 cells. In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated. In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated at amino acid residue Asn30 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO:150)). In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated at amino acid residues Asn24 and Asn30 (which corresponds to Asn1800 and Asn1806, respectively, of mature MUC16 (SEQ ID NO:150)). In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated at amino acid residues Asn1, Asn24, and Asn30 (which corresponds to Asn1777, Asn1800, and Asn1806, respectively, of mature MUC16 (SEQ ID NO:150)). In certain embodiments, the glycosylation comprises N-linked chitobiose. In certain embodiments, the glycosylation consists of an N-linked chitobiose. In certain embodiments, matrigel invasion is inhibited by at least 1.25-, 1.5-, 1.75-, 2.3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, or 10-fold compared to in vitro matrigel invasion of cells, wherein the cells are treated with a control antibody (e.g., an antibody that does not target MUC16) or with 4H11. In certain embodiments, matrigel invasion is inhibited by about 1.25-, 1.5-, 1.75-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, or 10-fold compared to in vitro matrigel invasion of cells, wherein the cells are treated with a control antibody (e.g., an antibody that does not target MUC16) or with 4H11.

[418] Os ensaios para determinar a inibição mediada por anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno da invasão de matrigel são conhecidos por um versado na técnica. Consulte, por exemplo, os métodos descritos na Seção 6.2. Por exemplo, as câmaras ou elementos de inserção de invasão BD BioCoat™ Matrigel™ (número de catálogo 354480 em placa de 24 poços) e elementos de inserção de controle (número de catálogo 354578 em placa de 24 poços) podem ser adquiridos junto à BD Biosciences, MA. O ensaio de invasão de matrigel pode ser realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, as câmaras de matrigel em placas de 24 poços (armazenadas a -20 °C) e elementos de inserção de controle (armazenados a 4 °C) são deixadas atingir a temperatura ambiente. Ambos os elementos de inserção são reidratados com 0,5 ml de meio sem soro no elemento de inserção, bem como no poço externo da placa de 24 poços, durante 2 horas no incubador umidificado a 37 oC, 5% de CO2. As células SKOV3 cultivadas são tripsinizadas e lavadas com meio de cultura. Um milhão de células é separado em um outro tubo de centrífuga e lavado 3 vezes com meio sem soro. Essas células são posteriormente ajustadas para gerar 5.000 células em 0,5 ml de meio sem soro. O meio nos elementos de inserção reidratados é removido e o elemento de inserção foi transferido para uma nova placa de 24 poços que contém 0,75 ml de meio de cultura que contém soro bovino fetal a 10% (FBS) no poço que serve como um quimioatraente. Imediatamente, 0,5 ml das células (5.000 células) em meio sem soro é adicionado ao elemento de inserção. É tomado cuidado adequado para observar que não há bolha de ar capturada no elemento de inserção e no poço externo. A placa de 24 poços é incubada no incubador umidificado a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h. Após a incubação, as células não invasoras são removidas da superfície superior da membrana por meio de “esfregação” mediante a inserção de uma haste com ponta de algodão no matrigel ou elemento de inserção de controle e aplicou-se pressão delicadamente mediante o movimento da ponta da haste sobre a superfície da membrana. A esfregação é repetida com uma segunda haste umedecida com meio. Então, os elementos de inserção são manchados em uma nova placa de 24 poços que contém 0,5 ml de tinta violeta de cristal a 0,5% em água destilada durante 30 minutos. Após a coloração, os elementos de inserção são enxaguados em 3 béqueres de água destilada para remover o excesso de tinta. Os elementos de inserção são secos ao ar em uma nova placa de 24 poços. As células invadidas são contadas manualmente sob um microscópio invertido em ampliação de 200 X. Vários campos de membranas em triplicata foram contados e registrados na figura.[418] Assays to determine antibody-mediated inhibition of MUC16 glycosylation or antigen-binding fragment of matrigel invasion are known to one of skill in the art. See, for example, the methods described in Section 6.2. For example, BD BioCoat™ Matrigel™ invasion chambers or inserts (catalog number 354480 in 24-well plate) and control inserts (catalog number 354578 in 24-well plate) can be purchased from BD Biosciences, MA. The matrigel invasion assay can be performed according to the manufacturer's protocol. Briefly, matrigel chambers in 24-well plates (stored at -20°C) and control inserts (stored at 4°C) are allowed to reach room temperature. Both inserts are rehydrated with 0.5 ml of serum-free medium in the insert and in the outer well of the 24-well plate for 2 hours in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2. The cultured SKOV3 cells are trypsinized and washed with culture medium. One million cells are separated into another centrifuge tube and washed three times with serum-free medium. These cells are then adjusted to yield 5,000 cells in 0.5 ml of serum-free medium. The medium on the rehydrated inserts is removed, and the insert is transferred to a new 24-well plate containing 0.75 ml of culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in the well, which serves as a chemoattractant. Immediately, 0.5 ml of the cells (5,000 cells) in serum-free medium is added to the insert. Care is taken to ensure that no air bubbles are trapped in the insert or outer well. The 24-well plate is incubated in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2 for 48 h. After incubation, non-invasive cells are removed from the upper surface of the membrane by "swabbing" by inserting a cotton swab into the Matrigel or control insert and gently applying pressure by moving the swab tip over the membrane surface. The scrubbing is repeated with a second swab moistened with medium. The inserts are then stained in a new 24-well plate containing 0.5 ml of 0.5% crystal violet dye in distilled water for 30 minutes. After staining, the inserts are rinsed in 3 beakers of distilled water to remove excess dye. The inserts are air-dried in a new 24-well plate. Invaded cells are counted manually under an inverted microscope at 200X magnification. Multiple membrane fields in triplicate were counted and recorded in the figure.

[419] Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento tem capacidade para inibir ou reduzir metástase, inibir crescimento de tumor ou induzir regressão de tumor em estudos de modelo de camundongo. Por exemplo, as linhagens de células tumorais podem ser introduzidas em camundongos nude atímicos e os camundongos atímicos podem ser administrados com anticorpos de glicosilação de MUC16 descritos no presente documento, uma ou mais vezes, e a progressão do tumor das células tumorais injetadas pode ser monitorada durante um período de semanas e/ou meses. Em alguns casos, a administração dos anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígenos do mesmo aos camundongos nude atímicos pode ocorrer antes da introdução das linhagens de células tumorais. Em uma certa modalidade, as células SKOV3 que expressam MUC16c114 são utilizadas para os modelos de xenoenxerto de camundongo descritos no presente documento. Consulte, por exemplo, Seção 0 e Seção 0.[419] In certain embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein has the ability to inhibit or reduce metastasis, inhibit tumor growth, or induce tumor regression in mouse model studies. For example, tumor cell lines can be introduced into athymic nude mice, and the athymic mice can be administered with MUC16 glycosylation antibodies described herein one or more times, and tumor progression of the injected tumor cells can be monitored over a period of weeks and/or months. In some cases, administration of the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragment thereof to the athymic nude mice can occur prior to the introduction of the tumor cell lines. In a certain embodiment, SKOV3 cells expressing MUC16c114 are used for the mouse xenograft models described herein. See, for example, Section 0 and Section 0.

[420] Em modalidades específicas, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento inibem o crescimento de tumor ou induzem a regressão de tumor em um modelo de camundongo em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%, conforme avaliado por métodos descritos no presente documento ou conhecidos por um versado na técnica, em comparação com os camundongos com tratamento simulado. Em modalidades específicas, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento inibem o crescimento de tumor ou induzem a regressão de tumor em um modelo de camundongo em pelo menos cerca de 25% ou 35%, opcionalmente a cerca de 75%, conforme avaliado por métodos descritos no presente documento ou conhecidos por um versado na técnica, em comparação com os camundongos com tratamento simulado. Em modalidades específicas, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento inibem o crescimento de tumor ou induzem a regressão de tumor em um modelo de camundongo em pelo menos cerca de 1 vez, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou 100 vezes, conforme avaliado por métodos descritos no presente documento ou conhecidos por um versado na técnica, em comparação com os camundongos com tratamento simulado. Os camundongos com tratamento simulado podem ser, por exemplo, tratados com solução salina tamponada com fosfato ou um controle (por exemplo, anticorpo anti-IgG).[420] In specific embodiments, the MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein inhibit tumor growth or induce tumor regression in a mouse model by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or 100%, as assessed by methods described herein or known to one of skill in the art, compared to sham-treated mice. In specific embodiments, the MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein inhibit tumor growth or induce tumor regression in a mouse model by at least about 25% or 35%, optionally at least about 75%, as assessed by methods described herein or known to one of skill in the art, compared to sham-treated mice. In specific embodiments, the MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein inhibit tumor growth or induce tumor regression in a mouse model by at least about 1-fold, 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold, 4-fold, 4.5-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or 100-fold, as assessed by methods described herein or known to one of skill in the art, compared to sham-treated mice. Sham-treated mice can be, for example, treated with phosphate-buffered saline or a control (e.g., anti-IgG antibody).

[421] A determinação da inibição do crescimento de tumor ou regressão de tumor pode ser avaliada, por exemplo, mediante o monitoramento do tamanho de tumor durante um período de tempo, tal como por medição física de tumores palpáveis ou outros métodos de detecção visual. Por exemplo, as linhagens de células tumorais podem ser geradas para expressar de maneira recombinante um agente de visualização, tal como proteína verde fluorescente (GFP) ou luciferase, então, a visualização in vivo de GFP pode ser realizada por microscopia, e a visualização in vivo de luciferase pode ser realizada por meio da administração de substrato de luciferase aos camundongos de xenoenxerto e da detecção de luminescência devido à enzima de luciferase que processa o substrato de luciferase. O grau ou nível de detecção de GFP ou luciferase se correlaciona ao tamanho do tumor nos camundongos de xenoenxerto.[421] Determination of tumor growth inhibition or tumor regression can be assessed, for example, by monitoring tumor size over a period of time, such as by physical measurement of palpable tumors or other visual detection methods. For example, tumor cell lines can be generated to recombinantly express a visualization agent, such as green fluorescent protein (GFP) or luciferase, then in vivo visualization of GFP can be performed by microscopy, and in vivo visualization of luciferase can be performed by administering luciferase substrate to the xenograft mice and detecting luminescence due to the luciferase enzyme processing the luciferase substrate. The degree or level of GFP or luciferase detection correlates with tumor size in the xenograft mice.

[422] Em certas modalidades, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento podem aumentar a sobrevivência de animais em modelos de xenoenxerto de tumor em comparação com camundongos com tratamento simulado. Em modalidades específicas, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento aumentam a sobrevivência de camundongos em modelos de xenoenxerto de tumor em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, conforme avaliado por métodos descritos no presente documento ou conhecidos por um versado na técnica, em comparação com os camundongos com tratamento simulado. Em modalidades específicas, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento aumentam a sobrevivência de camundongos em modelos de xenoenxerto de tumor em pelo menos cerca de 25% ou 35%, opcionalmente a cerca de 75%, conforme avaliado por métodos descritos no presente documento ou conhecidos por um versado na técnica, em comparação com os camundongos com tratamento simulado em modelos de xenoenxerto de tumor. Em modalidades específicas, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento aumentam a sobrevivência de camundongos em modelos de xenoenxerto de tumor em pelo menos cerca de 1 vez, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou 100 vezes, conforme avaliado por métodos descritos no presente documento ou conhecidos por um versado na técnica, em comparação com os camundongos com tratamento simulado em modelos de xenoenxerto de tumor. A sobrevivência pode ser, por exemplo, determinada por meio da plotagem de uma curva de sobrevivência de número de camundongos sobreviventes em relação ao tempo (por exemplo, dias ou semanas) após a injeção de linhagem de células tumorais. Os camundongos com tratamento simulado podem ser, por exemplo, tratados com solução salina tamponada com fosfato ou um controle (por exemplo, anticorpo anti-IgG).[422] In certain embodiments, the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can increase the survival of animals in tumor xenograft models compared to sham-treated mice. In specific embodiments, the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein increase the survival of mice in tumor xenograft models by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%, as assessed by methods described herein or known to one of skill in the art, compared to sham-treated mice. In specific embodiments, the MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein increase the survival of mice in tumor xenograft models by at least about 25% or 35%, optionally to about 75%, as assessed by methods described herein or known to one of skill in the art, compared to sham-treated mice in tumor xenograft models. In specific embodiments, the MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein increase the survival of mice in tumor xenograft models by at least about 1-fold, 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold, 4-fold, 4.5-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or 100-fold, as assessed by methods described herein or known to one of skill in the art, compared to mock-treated mice in tumor xenograft models. Survival can be determined, for example, by plotting a survival curve of the number of surviving mice versus time (e.g., days or weeks) after tumor cell line injection. Mock-treated mice can be treated, for example, with phosphate-buffered saline or a control (e.g., anti-IgG antibody).

[423] Em certas modalidades, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é internalizado em uma célula que expressa uma forma de MUC16, que é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da forma de MUC16 é SEQ ID NO:133 (MUC16c114) mediante o contato da célula com o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. “Internalizado” ou “internalização”, quando com referência a uma molécula que é internalizada por uma célula, se refere à passagem da molécula que está em contato com a superfície extracelular de uma membrana celular através da membrana celular até a superfície intracelular da membrana celular e/ou no citoplasma celular. Em certas modalidades, as células que expressam de maneira recombinante MUC16c114 glicosilado são células SKOV3. Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada. Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N- glicosilada no resíduo de aminoácido Asn30 (que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO:150)). Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada nos resíduos de aminoácido Asn 24 e Asn30 (que corresponde a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16 maduro (SEQ ID NO:150)). Em certas modalidades, a forma glicosilada de MUC16c114 é N-glicosilada nos resíduos de aminoácido Asn1, Asn24 e Asn30 (que corresponde a Asn1777, Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16 maduro(SEQ ID NO:150)). Em certas modalidades, a glicosilaçãocompreende chitobiose N-ligada. Em certas modalidades, aglicosilação consiste em uma chitobiose N-ligada.[423] In certain embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is internalized into a cell expressing a form of MUC16 that is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the MUC16 form is SEQ ID NO:133 (MUC16c114) upon contact of the cell with the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof. “Internalized” or “internalization,” when referring to a molecule that is internalized by a cell, refers to the passage of the molecule that is in contact with the extracellular surface of a cell membrane through the cell membrane to the intracellular surface of the cell membrane and/or into the cell cytoplasm. In certain embodiments, the cells that recombinantly express glycosylated MUC16c114 are SKOV3 cells. In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated. In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated at amino acid residue Asn30 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO:150)). In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated at amino acid residues Asn24 and Asn30 (which corresponds to Asn1800 and Asn1806, respectively, of mature MUC16 (SEQ ID NO:150)). In certain embodiments, the glycosylated form of MUC16c114 is N-glycosylated at amino acid residues Asn1, Asn24, and Asn30 (which corresponds to Asn1777, Asn1800, and Asn1806, respectively, of mature MUC16 (SEQ ID NO:150)). In certain embodiments, glycosylation comprises N-linked chitobiose. In certain embodiments, glycosylation consists of an N-linked chitobiose.

[424] Os ensaios para determinar a internalização de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento a uma célula, tal como, por exemplo, com o uso de anticorpos radiomarcados, são conhecidos por um versado na técnica. Consulte, por exemplo, os métodos descritos na Seção 6.2. Por exemplo, a internalização de anticorpo marcado com 89Zr pode ser investigada em células SKOV3 que expressam MUC16c114. Brevemente, aproximadamente 1 x 105 células são semeadas em uma placa de 12 poços e incubadas de um dia para o outro no incubador a 37 °C e 5% de CO2. Um volume de proteína radiomarcada é adicionado a cada poço e as placas são incubadas a 37 °C e 4 °C durante 1, 5, 12 e 24 horas. Após cada período de incubação, o meio é coletado e as células são enxaguadas com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A atividade ligada à superfície é coletada lavando-se as células em 1 ml de ácido acético a 100 mM com glicina a 100 mM (1:1, pH 3,5) a 4 °C. As células aderentes são, então, lisadas com 1 ml de NaOH a 1 M. Cada lavagem é coletada e contada acerca da atividade. A razão entre a atividade da lavagem final e a atividade total de todas as lavagens é usada para determinar a % internalizada. Em certas modalidades, o ensaio é realizado a 37 °C. Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é internalizado em pelo menos 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 por cento das células incubadas com o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é internalizado em cerca de 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 por cento de células incubadas com o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é internalizado dentro de 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20 ou 24 horas do contato das células com o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo.5.2 Cconjugados de anticorpo[424] Assays for determining internalization of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein into a cell, such as, for example, using radiolabeled antibodies, are known to one of skill in the art. See, for example, the methods described in Section 6.2. For example, internalization of 89Zr-labeled antibody can be investigated in SKOV3 cells expressing MUC16c114. Briefly, approximately 1 x 105 cells are seeded into a 12-well plate and incubated overnight in the incubator at 37 °C and 5% CO2. A volume of radiolabeled protein is added to each well, and the plates are incubated at 37 °C and 4 °C for 1, 5, 12, and 24 hours. After each incubation period, the medium is collected and the cells are rinsed with 1 ml of phosphate-buffered saline (PBS). Surface-bound activity is collected by washing the cells in 1 ml of 100 mM acetic acid with 100 mM glycine (1:1, pH 3.5) at 4 °C. Adherent cells are then lysed with 1 ml of 1 M NaOH. Each wash is collected and counted for activity. The ratio of the activity of the final wash to the total activity of all washes is used to determine the % internalized. In certain embodiments, the assay is performed at 37 °C. In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof is internalized in at least 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 percent of cells incubated with the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof. In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof is internalized in about 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 percent of cells incubated with the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof. In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof is internalized within 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20, or 24 hours of contacting the cells with the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof.5.2 Antibody Conjugates

[425] Em modalidades preferenciais, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0) fornecido no presente documento não é conjugado a qualquer outra molécula, tal como uma molécula orgânica, uma identificação detectável ou um isótopo. Em modalidades alternativas, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0) fornecido no presente documento é conjugado em uma ou mais moléculas orgânicas. Em modalidades alternativas, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento é conjugado em uma ou mais identificações detectáveis. Em modalidades alternativas, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento é conjugado em um ou mais isótopos. 5.2.1 IDENTIFICAÇÕES DETECTÁVEIS E ISÓTOPOS[425] In preferred embodiments, a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0) provided herein is not conjugated to any other molecule, such as an organic molecule, a detectable identifier, or an isotope. In alternative embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0) provided herein is conjugated to one or more organic molecules. In alternative embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein is conjugated to one or more detectable identifiers. In alternative embodiments, the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein is conjugated to one or more isotopes. 5.2.1 DETECTABLE IDENTIFICATIONS AND ISOTOPES

[426] Em certas modalidades, são fornecidos no presente documento conjugados de anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno dos mesmos (consulte, Seção 0), em que o dito anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é conjugado a um ou mais agentes, por exemplo, um agente de imagem ou um agente citotóxico. Também são fornecidos no presente documento conjugados de anticorpo biespecífico, em que o dito anticorpo biespecífico é conjugado a um ou mais agente, por exemplo, um agente de imagem ou um agente citotóxico. Também são fornecidos no presente documento conjugados de cadeia pesada de anticorpo, em que a dita cadeia pesada de anticorpo é conjugada em um ou mais agente, por exemplo, um agente de imagem ou um agente citotóxico. Também são fornecidos no presente documento conjugados de cadeia leve de anticorpo, em que a dita cadeia leve de anticorpo é conjugada em um ou mais agente, por exemplo, um agente de imagem ou um agente citotóxico. Também são fornecidos no presente documento conjugados de proteína de fusão, em que a dita proteína de fusão é conjugada a um agente, por exemplo, um agente de imagem ou um agente citotóxico. Em certas modalidades, o agente é conjugado de modo covalente ou não covalente.[426] In certain embodiments, provided herein are MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof conjugates (see, Section 0), wherein said MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof is conjugated to one or more agents, e.g., an imaging agent or a cytotoxic agent. Also provided herein are bispecific antibody conjugates, wherein said bispecific antibody is conjugated to one or more agents, e.g., an imaging agent or a cytotoxic agent. Also provided herein are antibody heavy chain conjugates, wherein said antibody heavy chain is conjugated to one or more agents, e.g., an imaging agent or a cytotoxic agent. Also provided herein are antibody light chain conjugates, wherein said antibody light chain is conjugated to one or more agents, e.g., an imaging agent or a cytotoxic agent. Also provided herein are fusion protein conjugates, wherein said fusion protein is conjugated to an agent, e.g., an imaging agent or a cytotoxic agent. In certain embodiments, the agent is conjugated covalently or non-covalently.

[427] Em certas modalidades, o agente de imagem é uma identificação detectável, tal como, uma identificação cromogênica, enzimática, radioisotópica, isotópica, fluorescente, tóxica, quemiluminescente, agente de contraste de ressonância magnética nuclear ou outra identificação.[427] In certain embodiments, the imaging agent is a detectable label, such as a chromogenic, enzymatic, radioisotopic, isotopic, fluorescent, toxic, chemiluminescent, nuclear magnetic resonance contrast agent, or other label.

[428] Os exemplos não limitadores de identificações cromogênicas adequadas incluem diaminobenzidina e ácido 4- hidroxiazo-benzeno-2-carboxílico.[428] Non-limiting examples of suitable chromogenic identifiers include diaminobenzidine and 4-hydroxyazo-benzene-2-carboxylic acid.

[429] Os exemplos não limitadores de identificações de enzima adequadas incluem malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteroide isomerase, álcooldesidrogenase de levedura, alfa-glicerol fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase,ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfatodesidrogenase, glucoamilase e acetilcolina esterase.[429] Non-limiting examples of suitable enzyme identifications include malate dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta-5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydrogenase, alpha-glycerol phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and acetylcholine esterase.

[430] Os exemplos não limitadores de identificações radioisotópicas adequadas incluem 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 223Ra, 223Ra, 89Zr, 177Lu e 109Pd. Em certas modalidades, 111In é um isótopo preferencial para o imageamento in vivo, à medida que evita o problema de desalogenação de anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos marcados com 125I ou 131I no fígado. Além disso, 111In tem uma energia de emissão gama mais favorável para o imageamento (Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296 a 301 (1985);Carasquillo et ah, J. Nucl. Med. 25:281 a 287 (1987)). Porexemplo, 111In acoplado a anticorpos monoclonais com 1-(P- isotiocianatobenzil)-DPTA tem mostrado pouca absorção em tecidos não tumorais, particularmente no fígado e, portanto, intensifica a especificidade de localização de tumor (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861 a 870 (1987)).[430] Non-limiting examples of suitable radioisotopic labels include H, In, I, I, P, S, C, Cr, To, Co, Fe, Se, Eu, Y, Cu, Ci, At, Pb, Sc, Ra, Ra, Zr, Lu, and Pd. In certain embodiments, In is a preferred isotope for in vivo imaging as it avoids the problem of dehalogenation of I- or I-labeled MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof in the liver. Furthermore, 111In has a gamma emission energy more favorable for imaging (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)). For example, 111In coupled to monoclonal antibodies with 1-(P-isothiocyanatobenzyl)-DPTA has shown poor uptake in nontumor tissues, particularly in the liver, and therefore enhances tumor localization specificity (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).

[431] Os exemplos não limitadores de identificações isotópicas não radioativas adequadas incluem 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr e 56Fe.[431] Non-limiting examples of suitable non-radioactive isotopic identifications include 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, and 56Fe.

[432] Os exemplos não limitadores de identificações fluorescentes adequadas incluem uma identificação de 152Eu, uma identificação de fluoresceína, uma identificação deisotiocianato, uma identificação de rodamina, uma identificação de ficoeritrina, uma identificação de ficocianina, uma identificação de aloficocianina, uma identificação de proteína verde fluorescente (GFP), uma identificação de o-ftaldeído e uma identificação de fluorescamina.[432] Non-limiting examples of suitable fluorescent tags include a 152Eu tag, a fluorescein tag, a deisothiocyanate tag, a rhodamine tag, a phycoerythrin tag, a phycocyanin tag, an allophycocyanin tag, a green fluorescent protein (GFP) tag, an o-phthaldehyde tag, and a fluorescamine tag.

[433] Os exemplos não limitadores de identificações quemiluminescentes incluem uma identificação de luminol, uma identificação de isoluminol, uma identificação de éster de acridínio aromático, uma identificação de imidazol, uma identificação de sal de acridínio, uma identificação de éster de oxalato, uma identificação de luciferina, uma identificação de luciferase e uma identificação de aequorina.[433] Non-limiting examples of chemiluminescent labels include a luminol label, an isoluminol label, an aromatic acridinium ester label, an imidazole label, an acridinium salt label, an oxalate ester label, a luciferin label, a luciferase label, and an aequorin label.

[434] Os exemplos não limitadores de agentes de contraste de ressonância magnética nuclear incluem núcleos de metal pesado, tais como Gd, Mn e ferro.[434] Non-limiting examples of nuclear magnetic resonance contrast agents include heavy metal nuclei such as Gd, Mn, and iron.

[435] Os procedimentos conhecidos por um versado na técnica para a conjugação das identificações descritas acima nos ditos anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpo, cadeias leves de anticorpo e proteínas de fusão são descritos, por exemplo, em Kennedy et at., Clin. CMm. Acta 70:1 a 31 (1976) e Schurs et al, Clin. CMm. Acta 81:1 a 40 (1977). As técnicas de acoplamento mencionadas anteriormente são o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida, o método de éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxi- succinimida, dos quais todos os métodos estão incorporados ao presente documento a título de referência.[435] Procedures known to one skilled in the art for conjugating the above-described labels to said MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof, bispecific antibodies, antibody heavy chains, antibody light chains, and fusion proteins are described, for example, in Kennedy et al., Clin. CMm. Acta 70:1-31 (1976) and Schurs et al., Clin. CMm. Acta 81:1-40 (1977). The aforementioned coupling techniques are the glutaraldehyde method, the periodate method, the dimaleimide method, the m-maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide ester method, all of which methods are incorporated herein by reference.

[436] Os exemplos não limitadores de agentes citotóxicos incluem um agente citostático ou citocida, um íon metálico radioativo, por exemplo, alfa-emissores, e toxinas, por exemplo, endotoxina de pseudomonas, abrina, toxina de cólera, ricina A e toxina de difteria.[436] Non-limiting examples of cytotoxic agents include a cytostatic or cytocidal agent, a radioactive metal ion, e.g., alpha-emitters, and toxins, e.g., pseudomonas endotoxin, abrin, cholera toxin, ricin A, and diphtheria toxin.

[437] Em certas modalidades, o agente é um agente diagnóstico. Um agente diagnóstico é um agente útil no diagnóstico ou detecção de uma doença por meio da localização das células que contêm o antígeno. Os agentes diagnósticos úteis incluem, porém sem limitação, radioisótopos, corantes (tais como com o complexo de biotina-estreptavidina), agentes de contraste, moléculas ou compostos fluorescentes e agentes acentuadores (por exemplo, íons paramagnéticos) para imageamento por ressonância magnética (IRM). A patente n° U.S. 6.331.175 descreve a técnica de IRM e a preparação de anticorpos conjugados em um agente acentuador de IRM e está incorporada em sua totalidade, a título de referência. De preferência, os agentes diagnósticos são selecionados a partir do grupo que consiste em radioisótopos, agentes acentuadores para uso em imageamento por ressonância magnética e compostos fluorescentes. Com a finalidade de carregar um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo com metais radioativos ou íons paramagnéticos, pode ser necessário reagir o mesmo com um reagente que tem uma cauda longa a qual é fixada uma multiplicidade de grupos de quelação para a ligação dos íons. Tal cauda pode ser um polímero, tal como uma polilisina, polissacarídeo ou outra cadeia derivada ou derivável que tem grupos pendentes aos quais podem ser ligados os grupos de quelação, tais como, por exemplo, ácido etilenodiaminotetra- acético (EDTA), ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA), porfirinas, poliaminas, éteres de coroa, bis-tiosemicarbazonas, polioximas e grupos similares conhecidos como úteis para esse propósito. Os quelatos são acoplados aos anticorpos com o uso de químicas padrão. O quelato é normalmente ligado ao anticorpo por um grupo que possibilita a formação de uma ligação à molécula com perda mínima de imunorreatividade e agregação mínima e/ou reticulação interna e outros métodos e reagentes mais incomuns para a conjugação de quelatos em anticorpos são revelados na patente n° U.S. 4.824.659 a Hawthorne, intitulada "Antibody Conjugates", concedida em 25 de abril de 1989, cuja revelação está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade. As combinações de metal-quelato particularmente úteis incluem 2- benzil-DTPA e seus análogos de monometila e ciclo-hexila, usadas com isótopos de diagnóstico para radio-imagem. Os mesmos quelatos, quando complexados com metais não radioativos, tais como manganês, ferro e gadolínio são úteis para IRM, quando usados juntamente com um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento. Os quelatos macrocíclicos, tais como NOTA, DOTA e TETA, são de uso com uma variedade de metais e radiometais, mais particularmente com radionuclídeos de gálio, ítrio e cobre, respectivamente. Tais complexos de metal-quelato podem ser feitos muito estáveis mediante a adaptação do tamanho de anel ao metal de interesse. Outros quelatos do tipo anel, tais como poliéteres macrocíclicos, que são de interesse para ligar estavelmente nuclídeos, tais como 223Ra para RAIT são abrangidos no presente documento.[437] In certain embodiments, the agent is a diagnostic agent. A diagnostic agent is an agent useful in diagnosing or detecting a disease by locating antigen-bearing cells. Useful diagnostic agents include, but are not limited to, radioisotopes, dyes (such as biotin-streptavidin complex), contrast agents, fluorescent molecules or compounds, and enhancing agents (e.g., paramagnetic ions) for magnetic resonance imaging (MRI). U.S. Patent No. 6,331,175 describes the MRI technique and the preparation of antibodies conjugated to an MRI enhancing agent and is incorporated in its entirety by reference. Preferably, the diagnostic agents are selected from the group consisting of radioisotopes, enhancing agents for use in magnetic resonance imaging, and fluorescent compounds. To load a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof with radioactive metals or paramagnetic ions, it may be necessary to react it with a reagent having a long tail to which a plurality of chelating groups are attached for binding the ions. Such a tail may be a polymer, such as polylysine, a polysaccharide, or another derivative or derivable chain that has pendant groups to which chelating groups can be attached, such as, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), porphyrins, polyamines, crown ethers, bis-thiosemicarbazones, polyoximes, and similar groups known to be useful for this purpose. Chelates are coupled to antibodies using standard chemistries. The chelate is typically linked to the antibody by a group that allows for the formation of a bond to the molecule with minimal loss of immunoreactivity and minimal aggregation and/or internal cross-linking. Other, more unusual methods and reagents for conjugating chelates to antibodies are disclosed in U.S. Patent No. 4,824,659 to Hawthorne, entitled "Antibody Conjugates," issued April 25, 1989, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Particularly useful metal-chelate combinations include 2-benzyl-DTPA and its monomethyl and cyclohexyl analogs, used with diagnostic isotopes for radioimaging. The same chelates, when complexed with non-radioactive metals such as manganese, iron, and gadolinium, are useful for MRI when used in conjunction with a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein. Macrocyclic chelates, such as NOTA, DOTA, and TETA, are useful with a variety of metals and radiometals, most notably gallium, yttrium, and copper radionuclides, respectively. Such metal-chelate complexes can be made very stable by adapting the ring size to the metal of interest. Other ring-type chelates, such as macrocyclic polyethers, which are of interest for stably binding nuclides such as 223Ra for RAIT are covered in this document.

[438] Em certas modalidades, o agente é um agente orgânico. Tais agentes orgânicos podem produzir um conjugado com propriedades farmacocinéticas aperfeiçoadas (por exemplo, meia- vida de soro in vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico, grupo de ácido graxo ou grupo de éster de ácido graxo. Para uso na presente invenção, o termo "ácido graxo" abrange ácidos monocarboxílicos e ácidos dicarboxílicos. Para uso na presente invenção, um "grupo polimérico hidrofílico" se refere a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano, por exemplo, polilisina. Os polímeros hidrofílicos adequados para a modificação de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, polietileno glicol, (PEG), monometoxi- polietileno glicol e polipropileno glicol), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos e polissacarídeos), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina e poliaspartato), óxidos de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno e óxido de polipropileno) e polivinil pirrolidona. Em certas modalidades, o polímero hidrofílico que modifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, um anticorpo biespecífico, uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo ou uma proteína de fusão fornecidos no presente documento tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Daltons como uma entidade molecular separada. Por exemplo, PEG5000 e PEG20,000, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Daltons, podem ser usados. O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído por um a cerca de seis grupos alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Os polímeros hidrofílicos que são substituídos por um grupo de ácido graxo ou éster de ácido graxo podem ser preparados empregando- se métodos adequados. Por exemplo, um polímero que compreende um grupo amina pode ser acoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com N,N-carbonil diimidazol) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero.[438] In certain embodiments, the agent is an organic agent. Such organic agents can produce a conjugate with improved pharmacokinetic properties (e.g., increased in vivo serum half-life). The organic moiety can be a hydrophilic polymeric group, fatty acid group, or fatty acid ester group. As used herein, the term "fatty acid" encompasses both monocarboxylic acids and dicarboxylic acids. As used herein, a "hydrophilic polymeric group" refers to an organic polymer that is more soluble in water than in octane, e.g., polylysine. Suitable hydrophilic polymers for modifying a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein may be linear or branched and include, for example, polyalkane glycols (e.g., polyethylene glycol, (PEG), monomethoxypolyethylene glycol, and polypropylene glycol), carbohydrates (e.g., dextran, cellulose, oligosaccharides, and polysaccharides), hydrophilic amino acid polymers (e.g., polylysine, polyarginine, and polyaspartate), polyalkane oxides (e.g., polyethylene oxide and polypropylene oxide), and polyvinyl pyrrolidone. In certain embodiments, the hydrophilic polymer that modifies a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, a bispecific antibody, an antibody heavy chain, an antibody light chain, or a fusion protein provided herein has a molecular weight of about 800 to about 150,000 Daltons as a separate molecular entity. For example, PEG5000 and PEG20,000, where the subscript is the average molecular weight of the polymer in Daltons, can be used. The hydrophilic polymer group can be substituted with one to about six alkyl, fatty acid, or fatty acid ester groups. Hydrophilic polymers that are substituted with a fatty acid or fatty acid ester group can be prepared using suitable methods. For example, a polymer comprising an amine group can be coupled to a carboxylate of the fatty acid or fatty acid ester, and an activated carboxylate (e.g., activated with N,N-carbonyl diimidazole) in a fatty acid or fatty acid ester can be coupled to a hydroxyl group in a polymer.

[439] Os ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para a modificação de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, um anticorpo biespecífico, uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo ou uma proteína de fusão fornecidos no presente documento podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Os ácidos graxos que são adequados para a modificação de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, um anticorpo biespecífico, uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo ou uma proteína de fusão fornecidos no presente documento incluem, por exemplo, n-dodecanoato, n-tetradecanoato, n-octadecanoato, n-eicosanoato, n-docosanoato, n- triacontanoato, n-tetracontanoato, cis-delta-9-octadecanoato, todos dentre cis-delta-5,8,11,14-eicosatetraenoato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico e similares. Os ésteres de ácidos graxos adequados incluem monoésteres de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior linear ou ramificado. O grupo alquila inferior pode compreender a partir de um a cerca de doze, de preferência, um a cerca de seis átomos de carbono.[439] Fatty acids and fatty acid esters suitable for modifying a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, a bispecific antibody, an antibody heavy chain, an antibody light chain, or a fusion protein provided herein may be saturated or may contain one or more units of unsaturation. Fatty acids that are suitable for modifying a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, a bispecific antibody, an antibody heavy chain, an antibody light chain, or a fusion protein provided herein include, for example, n-dodecanoate, n-tetradecanoate, n-octadecanoate, n-eicosanoate, n-docosanoate, n-triacontanoate, n-tetracontanoate, cis-delta-9-octadecanoate, all of cis-delta-5,8,11,14-eicosatetraenoate, octanedioic acid, tetradecanedioic acid, octadecanedioic acid, docosanedioic acid, and the like. Suitable fatty acid esters include monoesters of dicarboxylic acids comprising a linear or branched lower alkyl group. The lower alkyl group may comprise from one to about twelve, preferably one to about six, carbon atoms.

[440] Os conjugados fornecidos no presente documento podem ser preparados com o uso de métodos adequados, tais como pela reação com um ou mais agentes de modificação. Para uso na presente invenção, um "grupo de ativação" é uma porção químicaou grupo funcional que pode, sob condições adequadas, reagir comum segundo grupo químico formando assim uma ligação covalente entre o agente de modificação e o segundo grupo químico. Por exemplo, os grupos de ativação reativos a amina incluem grupos eletrofílicos, tais como, por exemplo, tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), N-hidroxisuccinimidil ésteres (NHS) e similares. Os grupos de ativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodoacetila, acrilolila, dissulfetos de piridila, ácido 5-tiol-2-nitrobenzoico tiol (TNB- thiol) e similares. Um grupo funcional de aldeído pode ser acoplado a moléculas que contêm amina ou hidrazida, e um grupoazida pode reagir com um grupo fosforoso trivalente para formarligações de fosforamidato ou fosforimida. Os métodos adequadospara introduzir grupos de ativação em moléculas são conhecidosna técnica (consulte, por exemplo, Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif.(1996)). Um grupo de ativação pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo) ou através de uma porção química de ligante, por exemplo, um grupo C1-C12 divalente, em que um ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo, tal como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. As porções químicas de ligante adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, (CH2)3 e NH. Os agentes de modificação que compreendem uma porção química de ligante podem ser produzidos, por exemplo, por meioda reação de uma mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc- etilenodiamina ou mono-Boc-diaminohexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar uma ligação de amida entre a amina livre e o carboxilato de ácido graxo. O grupo protetor Boc pode ser removido do produto por meio do tratamento com ácido trifluoro- acético (TFA) para expor uma amina primária que pode ser acoplada a um outro carboxilato conforme descrito ou pode ser reagida com anidrido maleico e o produto resultante ciclizado para produzir um derivado de maleimido ativado do ácido graxo. (Consulte, por exemplo, Thompson, et al., WO 92/16221, do qual as instruções integrais estão incorporadas ao presente documento a título de referência.)[440] The conjugates provided herein may be prepared using suitable methods, such as by reaction with one or more modifying agents. As used herein, an "activating group" is a chemical moiety or functional group that can, under suitable conditions, react with a second chemical group, thereby forming a covalent bond between the modifying agent and the second chemical group. For example, amine-reactive activating groups include electrophilic groups such as, for example, tosylate, mesylate, halo (chloro, bromo, fluoro, iodo), N-hydroxysuccinimidyl esters (NHS), and the like. Activating groups that can react with thiols include, for example, maleimide, iodoacetyl, acrylolyl, pyridyl disulfides, 5-thiol-2-nitrobenzoic acid thiol (TNB-thiol), and the like. An aldehyde functional group can be attached to amine- or hydrazide-containing molecules, and an azide group can react with a trivalent phosphorus group to form phosphoramidate or phosphorimide bonds. Suitable methods for introducing activating groups into molecules are known in the art (see, e.g., Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)). An activating group can be attached directly to the organic group (e.g., hydrophilic polymer, fatty acid, fatty acid ester) or through a linker moiety, e.g., a divalent C1-C12 group, in which one or more carbon atoms can be replaced by a heteroatom, such as oxygen, nitrogen, or sulfur. Suitable linker moieties include, e.g., tetraethylene glycol, (CH2)3, and NH. Modifying agents comprising a linker moiety can be produced, for example, by reacting a mono-Boc-alkyldiamine (e.g., mono-Boc-ethylenediamine or mono-Boc-diaminohexane) with a fatty acid in the presence of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) to form an amide bond between the free amine and the fatty acid carboxylate. The Boc-protecting group can be removed from the product by treatment with trifluoroacetic acid (TFA) to expose a primary amine that can be coupled to another carboxylate as described, or can be reacted with maleic anhydride and the resulting product cyclized to produce an activated maleimido derivative of the fatty acid. (See, for example, Thompson, et al., WO 92/16221, the full instructions of which are incorporated herein by reference.)

[441] Um "agente de modificação" pode se referir a um grupo orgânico adequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo e um éster de ácido graxo) que compreende um grupo de ativação. Por exemplo, as porções químicas orgânicas podem ser ligadas ao anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento deligação com antígeno do mesmo de uma maneira não específica delocal empregando-se um agente de modificação reativo a amina, por exemplo, um éster de N-hidroxissuccinimida de PEG. O anticorpo de glicosilação de MUC16 modificado ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo também pode ser preparado por meio da redução de ligações de dissulfeto (por exemplo, ligações de dissulfeto intracadeia) do anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, anticorpo biespecífico, cadeia pesada de anticorpo, cadeia leve de anticorpo ou proteína de fusão. O anticorpo de glicosilação de MUC16 reduzido ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, anticorpo biespecífico, cadeia pesada de anticorpo, cadeia leve de anticorpo ou proteína de fusão pode ser, então, reagido com um agente de modificação reativo a tiol para produzir os conjugados fornecidos no presente documento. Os conjugados que compreendem uma porção química orgânica que é ligada a locais específicos de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento podem ser preparados com o uso de métodos adequados, tais como proteolise reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147 a 153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411 a 417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2.233 a 2.241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59 a 68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456 a 463 (1997)) e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996).5.3 Produção de anticorpos5.3.1 Produção e triagem de anticorpos[441] A "modifying agent" may refer to a suitable organic group (e.g., hydrophilic polymer, a fatty acid, and a fatty acid ester) that comprises an activating group. For example, organic chemical moieties may be attached to the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof in a non-site-specific manner using an amine-reactive modifying agent, e.g., an N-hydroxysuccinimide ester of PEG. The modified MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof may also be prepared by reducing disulfide bonds (e.g., intrachain disulfide bonds) of the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof, bispecific antibody, antibody heavy chain, antibody light chain, or fusion protein. The reduced MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof, bispecific antibody, antibody heavy chain, antibody light chain, or fusion protein can then be reacted with a thiol-reactive modifying agent to produce the conjugates provided herein. Conjugates comprising an organic chemical moiety that is linked to specific sites of a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein can be prepared using suitable methods, such as reverse proteolysis (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1):59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)) and the methods described in Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996).5.3 Antibody Production5.3.1 Antibody Production and Screening

[442] Em um outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos de produção de anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos (consulte, Seção 0 e Seção 0).[442] In another aspect, provided herein are methods of producing MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof (see, Section 0 and Section 0).

[443] Os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, por exemplo, por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante. Os métodos descritos no presente documento empregam, exceto onde indicado em contrário, técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia, análise genética, DNA recombinante, química orgânica, bioquímica, PCR, modificação e síntese de oligonucleotídeo, hibridização de ácido nucleico e campos relacionados dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são descritas, por exemplo, nas referências citadas no presente documento e são explicadas de forma mais completa na literatura. Consulte, por exemplo, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais) Gait (ed.) (1984) OligonucleotideSynthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.)(1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.[443] The antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can be produced by any method known in the art for the synthesis of antibodies, for example, by chemical synthesis or by recombinant expression techniques. The methods described herein employ, except where otherwise indicated, conventional techniques in molecular biology, microbiology, genetic analysis, recombinant DNA, organic chemistry, biochemistry, PCR, oligonucleotide synthesis and modification, nucleic acid hybridization, and related fields within the skill of the art. These techniques are described, for example, in the references cited herein and are more fully explained in the literature. See, for example, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) OligonucleotideSynthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.)(1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[444] Em uma modalidade específica, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é um anticorpo (por exemplo, anticorpo recombinante) preparado, expresso, criado ou isolado por quaisquer meios que envolvem criação, por exemplo, através de síntese, engenharia genética de sequências de DNA. Em certas modalidades, tal anticorpo compreende sequências que são codificadas por sequências de DNA que não existem naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa de anticorpo de um animal ou mamífero (por exemplo, ser humano) in vivo. Em uma modalidade específica, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é produzido por um método que compreende o uso de uma forma glicosilada de SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130 e/ou SEQ ID NO:131. Em uma modalidade específica, a forma glicosilada de SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130 e/ou SEQ ID NO:131 é glicosilada com uma ou mais chitobiose. Consulte, por exemplo, Seção 0, Seção 0 e Seção 0 para uma descrição detalhada de como produzir anticorpos descritos no presente documento.[444] In a specific embodiment, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is an antibody (e.g., recombinant antibody) prepared, expressed, created, or isolated by any means involving creation, e.g., through synthesis, genetic engineering, of DNA sequences. In certain embodiments, such an antibody comprises sequences that are encoded by DNA sequences that do not naturally exist within the germline antibody repertoire of an animal or mammal (e.g., human) in vivo. In a specific embodiment, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is produced by a method comprising using a glycosylated form of SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, and/or SEQ ID NO:131. In a specific embodiment, the glycosylated form of SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, and/or SEQ ID NO:131 is glycosylated with one or more chitobioses. See, for example, Section 0, Section 0, and Section 0 for a detailed description of how to produce antibodies described herein.

[445] Em um certo aspecto, é fornecido no presente documento um glicopeptídeo imunogênico que compreende um ou mais locais de glicosilação, em que (i) o glicopeptídeo imunogênico tem 10 a 60 resíduos de aminoácido, 10 a 30 resíduos de aminoácido, 15 a 25 resíduos de aminoácido, 15 a 20 resíduos de aminoácido ou 15 a 18 resíduos de aminoácido de comprimento, e (ii) pelo menos um dentre um ou mais locais de glicosilação é ligado com um carboidrato.[445] In one aspect, provided herein is an immunogenic glycopeptide comprising one or more glycosylation sites, wherein (i) the immunogenic glycopeptide is 10 to 60 amino acid residues, 10 to 30 amino acid residues, 15 to 25 amino acid residues, 15 to 20 amino acid residues, or 15 to 18 amino acid residues in length, and (ii) at least one of the one or more glycosylation sites is linked with a carbohydrate.

[446] Em algumas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende um, dois ou três locais de glicosilação. Em uma modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação. Em uma outra modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação.[446] In some embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises one, two, or three glycosylation sites. In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide comprises one glycosylation site. In another specific embodiment, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites.

[447] Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado com um carboidrato. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados com um carboidrato.[447] In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises one glycosylation site that is linked with a carbohydrate. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked with a carbohydrate.

[448] O carboidrato ligado como um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico pode ser um carboidrato ligado com N, um carboidrato ligado com O ou um carboidrato ligado com C. O carboidrato ligado com N é fixado a um resíduo de asparagina e é a forma mais comum encontrada na natureza. A maior parte dos carboidratos ligados com N é ligada a peptídeos na forma de GlcNAc-β-Asn. O carboidrato ligado com O é fixado a uma cadeia lateral de hidroxila de aminoácido (normalmente a partir de serina ou treonina). A maior parte dos carboidratos ligados com O é ligada a peptídeos na forma de GlcNAc-β-Ser/Thr ou GlcNAc-α-Ser/Thr. O carboidrato ligado com C se refere a uma manose fixada a um resíduo de triptofano, e é a forma menos comum encontrada na natureza. Em uma modalidade, o carboidrato no glicopeptídeo imunogênico é um carboidrato ligado com N ou O. Em uma modalidade específica, o carboidrato no glicopeptídeo imunogênico é um carboidrato ligado com N.[448] The carbohydrate attached as one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide can be an N-linked carbohydrate, an O-linked carbohydrate, or a C-linked carbohydrate. The N-linked carbohydrate is attached to an asparagine residue and is the most common form found in nature. Most N-linked carbohydrates are attached to peptides in the form GlcNAc-β-Asn. The O-linked carbohydrate is attached to an amino acid hydroxyl side chain (usually from serine or threonine). Most O-linked carbohydrates are attached to peptides in the form GlcNAc-β-Ser/Thr or GlcNAc-α-Ser/Thr. The C-linked carbohydrate refers to a mannose attached to a tryptophan residue and is the least common form found in nature. In one embodiment, the carbohydrate in the immunogenic glycopeptide is an N- or O-linked carbohydrate. In a specific embodiment, the carbohydrate in the immunogenic glycopeptide is an N-linked carbohydrate.

[449] O carboidrato ligado ao um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico pode ser um monossacarídeo, um dissacarídeo, um oligossacarídeo (por exemplo, um trissacarídeo, um tetrassacarídeo ou um pentassacarídeo) ou um polissacarídeo. Em certas modalidades, o carboidrato é um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um tetrassacarídeo ou um pentassacarídeo. Em uma modalidade específica, o carboidrato é um dissacarídeo. Em uma modalidade particular, o dissacarídeo é uma chitobiose. Em uma outra modalidade específica, o carboidrato é Man3GlcNAc2. Em modalidades específicas, a terminação N do glicopeptídeo imunogênico é acetilada. Em modalidades específicas, a terminação C do glicopeptídeo imunogênico é sob a forma de um derivado de N-metilcarboxamida.[449] The carbohydrate attached to the one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide can be a monosaccharide, a disaccharide, an oligosaccharide (e.g., a trisaccharide, a tetrasaccharide, or a pentasaccharide), or a polysaccharide. In certain embodiments, the carbohydrate is a monosaccharide, a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, or a pentasaccharide. In a specific embodiment, the carbohydrate is a disaccharide. In a particular embodiment, the disaccharide is a chitobiose. In another specific embodiment, the carbohydrate is Man3GlcNAc2. In specific embodiments, the N-terminus of the immunogenic glycopeptide is acetylated. In specific embodiments, the C-terminus of the immunogenic glycopeptide is in the form of an N-methylcarboxamide derivative.

[450] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico é conjugado a uma proteína de carreador imunogênico. Na maioria dos casos, os antígenos pequenos (por exemplo, peptídeos curtos ou haptenos pequenos) não são suficientemente complexos para suscitar a produção de anticorpos. As proteínas de carreador imunogênico, devido ao seu tamanho grande e estrutura complexa, podem conferir imunogenicidade a antígenos pequenos conjugados, resultando em anticorpos que são produzidos contra epítopos nos antígenos pequenos e nas proteínas de carreador imunogênico. Portanto, os antígenos pequenos são sempre quimicamente conjugados com proteínas de carreador imunogênico para intensificar a resposta imunológica para a produção bem-sucedida de anticorpos. As proteínas de carreador imunogênico comumente usadas incluem, porém sem limitação, hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH), hemocianina do molusco concholepas concholepas (CCH), albumina sérica bovina (BSA) e ovalbumina (OVA). Em uma modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico é conjugado a KLH. KLH é um polipeptídeo que contém cobre que pertence a um grupo de proteínas não heme chamadas de hemocianinas, que são encontradas em artrópodes e moluscos. KLH é isolado de moluscos keyhole limpet (Megathura crenulata). Devido a sua distância evolutiva dos mamíferos, à estrutura complexa com alto peso molecular e uma superfície grande que contém várias centenas de grupos lisina que fornecem aminas primárias como alvos para a conjugação, KLH é uma proteína de carreador extremamente imunogênica e eficaz em mamíferos.[450] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is conjugated to an immunogenic carrier protein. In most cases, small antigens (e.g., short peptides or small haptens) are not sufficiently complex to elicit antibody production. Immunogenic carrier proteins, due to their large size and complex structure, can confer immunogenicity to conjugated small antigens, resulting in antibodies that are produced against epitopes on both the small antigens and the immunogenic carrier proteins. Therefore, small antigens are always chemically conjugated to immunogenic carrier proteins to enhance the immune response for successful antibody production. Commonly used immunogenic carrier proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin (KLH), concholepas concholepas hemocyanin (CCH), bovine serum albumin (BSA), and ovalbumin (OVA). In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is conjugated to KLH. KLH is a copper-containing polypeptide that belongs to a group of non-heme proteins called hemocyanins, which are found in arthropods and mollusks. KLH is isolated from the keyhole limpet mollusk (Megathura crenulata). Due to its evolutionary distance from mammals, its complex structure with high molecular weight, and a large surface area containing several hundred lysine groups that provide primary amines as targets for conjugation, KLH is an extremely immunogenic and effective carrier protein in mammals.

[451] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 10 a 60 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 10 a 30 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 25 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 20 resíduos de aminoácido de comprimento. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 18 resíduos de aminoácido de comprimento. Em um aspecto particular de tais modalidades específicas, em que o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 18 resíduos de aminoácido de comprimento, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado a uma chitobiose. Em um outro aspecto particular de tais modalidades específicas, em que o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 18 resíduos de aminoácido de comprimento, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados a uma chitobiose. Em uma modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico tem 55 resíduos de aminoácido de comprimento. Em um aspecto particular de tal modalidade específica, em que o glicopeptídeo imunogênico tem 55 resíduos de aminoácido de comprimento, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado a uma chitobiose. Em uma modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico tem 18 resíduos de aminoácido de comprimento. Em um aspecto particular de tal modalidade específica, em que o glicopeptídeo imunogênico tem 18 resíduos de aminoácido de comprimento, o glicopeptídeo imunogênico compreende dois locais de glicosilação que são, cada um, ligados a uma chitobiose. Em uma outra modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 resíduos de aminoácido de comprimento. Em um aspecto particular de tal modalidade específica, em que o glicopeptídeo imunogênico tem 15 resíduos de aminoácido de comprimento, o glicopeptídeo imunogênico compreende um local de glicosilação que é ligado a uma chitobiose.[451] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide is 10 to 60 amino acid residues in length. In some embodiments, the immunogenic glycopeptide is 10 to 30 amino acid residues in length. In some embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 to 25 amino acid residues in length. In some embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 to 20 amino acid residues in length. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 to 18 amino acid residues in length. In a particular aspect of such specific embodiments, wherein the immunogenic glycopeptide is 15 to 18 amino acid residues in length, the immunogenic glycopeptide comprises one glycosylation site that is linked to a chitobiose. In a further particular aspect of such specific embodiments, wherein the immunogenic glycopeptide is 15 to 18 amino acid residues in length, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each linked to a chitobiose. In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is 55 amino acid residues in length. In a particular aspect of such a specific embodiment, wherein the immunogenic glycopeptide is 55 amino acid residues in length, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site that is attached to a chitobiose. In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is 18 amino acid residues in length. In a particular aspect of such a specific embodiment, wherein the immunogenic glycopeptide is 18 amino acid residues in length, the immunogenic glycopeptide comprises two glycosylation sites that are each attached to a chitobiose. In another specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is 15 amino acid residues in length. In a particular aspect of such a specific embodiment, wherein the immunogenic glycopeptide is 15 amino acid residues in length, the immunogenic glycopeptide comprises a glycosylation site that is attached to a chitobiose.

[452] Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende pelo menos uma porção de 10 aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:150, e pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico está na dita porção da sequência de amino. Em certas outras modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende pelo menos uma porção de 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:150, e pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico está na dita porção da sequência de amino. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 a 18 resíduos de aminoácido de comprimento. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico tem 55 resíduos de aminoácido de comprimento. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129. Em uma modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico tem 55 resíduos de aminoácido de comprimento e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129. Em uma modalidade particular, o glicopeptídeo imunogênico que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129 compreende um local de glicosilação no 30o resíduo (Asn) que é ligado a uma chitobiose. Em uma outra modalidade particular, o glicopeptídeo imunogênico que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129 compreende um local de glicosilação no 30o resíduo (Asn) de SEQ ID NO: 129 que é ligado a uma porção química Man3GlcNAc2. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico tem 18 resíduos de aminoácido de comprimento. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:130. Em uma modalidade específica, o glicopeptídeo imunogênico tem 18 resíduos de aminoácido de comprimento e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:130. Em uma modalidade particular, o glicopeptídeo imunogênico que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:130 compreende os dois locais de glicosilação no 4o resíduo (Asn) e no 10o resíduo (Asn) que são, cada um, ligados a uma chitobiose. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico tem 15 resíduos de aminoácido de comprimento. Em modalidades específicas, o glicopeptídeo imunogênico compreende a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO:131. Em uma modalidade específica,o glicopeptídeo imunogênico tem 15 resíduos de aminoácido de comprimento e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:131. Em uma modalidade particular, o glicopeptídeo imunogênico que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:131 compreende um local de glicosilação no 7o resíduo (Asn) que é ligado a uma chitobiose.[452] In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises at least a 10 amino acid portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO:150, and at least one of the one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide is in said amino sequence portion. In certain other embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises at least a 15, 20, 25, or 30 amino acid portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO:150, and at least one of the one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide is in said amino sequence portion. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 to 18 amino acid residues in length. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide is 55 amino acid residues in length. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:129. In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is 55 amino acid residues in length and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:129. In a particular embodiment, the immunogenic glycopeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:129 comprises a glycosylation site at the 30th residue (Asn) that is linked to a chitobiose. In another particular embodiment, the immunogenic glycopeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:129 comprises a glycosylation site at the 30th residue (Asn) of SEQ ID NO:129 that is linked to a Man3GlcNAc2 moiety. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide is 18 amino acid residues in length. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:130. In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is 18 amino acid residues in length and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:130. In a particular embodiment, the immunogenic glycopeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:130 comprises two glycosylation sites at the 4th residue (Asn) and at the 10th residue (Asn) that are each linked to a chitobiose. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide is 15 amino acid residues in length. In specific embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:131. In a specific embodiment, the immunogenic glycopeptide is 15 amino acid residues in length and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:131. In a particular embodiment, the immunogenic glycopeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:131 comprises a glycosylation site at the 7th residue (Asn) that is linked to a chitobiose.

[453] Em um outro aspecto, é fornecido no presente documento um método para gerar um anticorpo ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma glicoproteína, que compreende imunizar um indivíduo com um glicopeptídeo imunogênico que compreende um ou mais locais de glicosilação conforme descrito acima. Em certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende pelo menos uma porção de 10 aminoácidos da sequência de aminoácidos da glicoproteína, e pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico está na dita porção da sequência de aminoácidos. Em outras certas modalidades, o glicopeptídeo imunogênico compreende pelo menos uma porção de 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos da sequência de aminoácidos da glicoproteína, e pelo menos um dentre o um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico está na dita porção da sequência de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a glicoproteína compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo carece de ligação específica a uma forma não glicosilada da glicoproteína. O indivíduo imunizado de acordo com os métodos descritos no presente documento pode ser, porém sem limitação, uma cabra, uma ovelha, um burro, uma galinha, um porquinho-da-índia, um rato, um coelho ou um camundongo. Em algumas modalidades, o indivíduo imunizado de acordo com os métodos descritos no presente documento é um rato, um coelho ou um camundongo. Em uma modalidade específica, o indivíduo imunizado de acordo com os métodos descritos no presente documento é um camundongo. A imunização do indivíduo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por meio da administração do glicopeptídeo imunogênico e um adjuvante ao indivíduo, conforme descrito no Exemplo 2 e Exemplo 3 (consulte, Seção 0 e Seção 0).[453] In another aspect, provided herein is a method for generating an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a glycoprotein, comprising immunizing a subject with an immunogenic glycopeptide comprising one or more glycosylation sites as described above. In certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises at least a 10 amino acid portion of the amino acid sequence of the glycoprotein, and at least one of the one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide is in said amino acid sequence portion. In other certain embodiments, the immunogenic glycopeptide comprises at least a 15, 20, 25, or 30 amino acid portion of the amino acid sequence of the glycoprotein, and at least one of the one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide is in said amino acid sequence portion. In a particular embodiment, the glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150. In a specific embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof lacks specific binding to a non-glycosylated form of the glycoprotein. The subject immunized according to the methods described herein can be, but is not limited to, a goat, a sheep, a donkey, a chicken, a guinea pig, a rat, a rabbit, or a mouse. In some embodiments, the subject immunized according to the methods described herein is a rat, a rabbit, or a mouse. In a specific embodiment, the subject immunized according to the methods described herein is a mouse. Immunization of the subject can be accomplished by any method known in the art, for example, by administering the immunogenic glycopeptide and an adjuvant to the subject as described in Example 2 and Example 3 (see, Section 0 and Section 0).

[454] Em um outro aspecto, também é fornecido no presente documento um método para preparar um glicopeptídeo imunogênico descrito no presente documento. Em certas modalidades, o método para preparar o glicopeptídeo imunogênico compreende ligar um ou mais locais de glicosilação do glicopeptídeo imunogênico descrito no presente documento a um carboidrato (por exemplo, uma chitobiose). Em certas modalidades, o método para preparar o glicopeptídeo imunogênico também compreende sintetizar a porção química de peptídeo. A porção química de peptídeo do glicopeptídeo imunogênico pode ser sintetizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por síntese de peptídeo de fase sólida Fmoc, conforme descrito no Exemplo 2 (consulte, Seção 6.2). Em certas modalidades, o aminoácido (por exemplo, asparagina) no um ou mais locais de glicosilação é protegido por um grupo protetor durante a síntese do glicopeptídeo imunogênico. Em uma modalidade específica, apenas um resíduo de asparagina da porção química de peptídeo é ligado a um carboidrato (por exemplo, uma chitobiose), e o grupo protetor na asparagina é um grupo alila. Em uma outra modalidade específica, mais de um (por exemplo, dois) resíduo de asparagina da porção química de peptídeo é ligado a um carboidrato (por exemplo, uma chitobiose), e o grupo protetor nos resíduos de asparagina é O- 2-fenilisopropil éster (O-2-Phi Pr, OPp). A etapa de ligação pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade preferencial, a porção química de carboidrato é ligada à porção química de peptídeo com o uso de um procedimento de aspatilação/desproteção em um frasco, conforme descrito no Exemplo 2 (consulte Seção 6.2.2.1).[454] In another aspect, also provided herein is a method for preparing an immunogenic glycopeptide described herein. In certain embodiments, the method for preparing the immunogenic glycopeptide comprises attaching one or more glycosylation sites of the immunogenic glycopeptide described herein to a carbohydrate (e.g., a chitobiose). In certain embodiments, the method for preparing the immunogenic glycopeptide also comprises synthesizing the peptide moiety. The peptide moiety of the immunogenic glycopeptide can be synthesized by any method known in the art, for example, by Fmoc solid-phase peptide synthesis as described in Example 2 (see, Section 6.2). In certain embodiments, the amino acid (e.g., asparagine) at the one or more glycosylation sites is protected by a protecting group during synthesis of the immunogenic glycopeptide. In a specific embodiment, only one asparagine residue of the peptide moiety is attached to a carbohydrate (e.g., a chitobiose), and the protecting group on the asparagine is an allyl group. In another specific embodiment, more than one (e.g., two) asparagine residues of the peptide moiety are attached to a carbohydrate (e.g., a chitobiose), and the protecting group on the asparagine residues is O-2-phenylisopropyl ester (O-2-Phi Pr, OPp). The attachment step can be performed by any method known in the art. In a preferred embodiment, the carbohydrate moiety is attached to the peptide moiety using a one-vial asparatylation/deprotection procedure as described in Example 2 (see Section 6.2.2.1).

[455] Os métodos para produzir anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento são conhecidos por um técnico no assunto, por exemplo, por síntese química, por purificação a partir de fontes biológicas ou por técnicas de expressão recombinante, incluindo, por exemplo, a partir de célula de mamífero ou preparações transgênicas. Os métodos descritos no presente documento empregam, exceto onde indicado em contrário, técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia, análise genética, DNA recombinante, química orgânica, bioquímica, PCR, modificação e síntese de oligonucleotídeo, hibridização de ácido nucleico, e campos relacionados dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são descritas, por exemplo, nas referências citadas no presente documento e são explicadas de forma mais completa na literatura. Consulte, por exemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A PracticalApproach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides andAnalogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.[455] Methods for producing MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein are known to one skilled in the art, for example, by chemical synthesis, by purification from biological sources, or by recombinant expression techniques, including, for example, from mammalian cell or transgenic preparations. The methods described herein employ, except where otherwise indicated, conventional techniques in molecular biology, microbiology, genetic analysis, recombinant DNA, organic chemistry, biochemistry, PCR, oligonucleotide synthesis and modification, nucleic acid hybridization, and related fields within the skill of the art. These techniques are described, for example, in the references cited herein and are explained more fully in the literature. See, for example, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A PracticalApproach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides andAnalogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[456] Existe uma variedade de métodos na técnica para a produção de anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0). Por exemplo, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser produzido por métodos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na patente n° U.S. no U.S. 4.816.567. Oum ou mais DNAs que codificam um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido nopresente documento podem ser prontamente isolados e sequenciados com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeo que têm capacidade para se ligarem especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos ou tais cadeias a partir de fontes humanas, humanizadas ou outras fontes). Uma vez isolado, o DNA pode sercolocado em vetores de expressão, que são, então, transformados em células hospedeiras, tais como células NS0, células COS símias, células do ovário de hamster chinês (CHO), células de levedura, células de algas, células de ovos e mieloma que não produzem de outro modo proteína de imunoglobulina, para obter asíntese do anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento deligação com antígeno do mesmo nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, por meio da substituição de domínios constantes de cadeia pesada e leve de uma espécie desejada pela sequência de codificação no lugar das sequências humanas homólogas (patente n° U.S. 4.816.567; Morrison et al, supra) ou mediante a junção de forma covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo de não imunoglobulina. Tal polipeptídeo de não imunoglobulina pode ser usado no lugar dos domínios constantes de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento. Em certas modalidades, o DNA é conforme descrito na Seção 5.3.2.[456] There are a variety of methods in the art for producing MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein (see, Section 0 and Section 0). For example, the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof can be produced by recombinant DNA methods, such as those described in U.S. Patent No. 4,816,567. One or more DNAs encoding a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein can be readily isolated and sequenced using standard procedures (e.g., using oligonucleotide probes that are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies or such chains from human, humanized, or other sources). Once isolated, the DNA can be placed into expression vectors, which are then transformed into host cells, such as NS0 cells, simian COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, yeast cells, algal cells, egg cells, and myeloma cells that do not otherwise produce immunoglobulin protein, to achieve synthesis of the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof in the recombinant host cells. The DNA can also be modified, for example, by substituting the coding sequence for heavy and light chain constant domains of a desired species in place of the homologous human sequences (U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al., supra), or by covalently joining to the immunoglobulin coding sequence all or part of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide. Such a non-immunoglobulin polypeptide may be used in place of the constant domains of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein. In certain embodiments, the DNA is as described in Section 5.3.2.

[457] Os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos no presente documento também podem ser preparados com o uso de pelo menos um polinucleotídeo que codifica anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo para fornecer mamíferos ou animais transgênicos, tais como cabras, vacas, cavalos, ovelha e similares, que produzem tais anticorpos em seu leite. Tais animais podem ser fornecidos com o uso de métodos conhecidos. Consulte, por exemplo, porém sem limitação, patente n° U.S. 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616. 5.565.362; 5.304.489, e similares, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.[457] The MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof provided herein may also be prepared using at least one polynucleotide encoding a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof to provide transgenic mammals or animals, such as goats, cows, horses, sheep, and the like, that produce such antibodies in their milk. Such animals may be provided using known methods. See, for example, but without limitation, U.S. Patent Nos. 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489, and the like, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[458] Em certas modalidades, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos no presente documento podem ser adicionalmente preparados com o uso de pelo menos um polinucleotídeo que codifica anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento para fornecer plantas transgênicas e células de planta cultivadas (por exemplo, porém sem limitação, tabaco e maís) que produzem tais anticorpos, porções especificadas ou variantes nas partes de planta ou em células cultivadas a partir das mesmas. Como um exemplo não limitador, as folhas de tabaco transgênico que expressam proteínas recombinantes têm sido usadas com sucesso para fornecer grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo, com o uso de um promotor induzível. Consulte, por exemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95 a 118 (1999) e referências citadas no mesmo. Além disso, o maís transgênico tem sido usado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentes àquelas produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificados a partir de fontes naturais. Consulte, por exemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127 a 147 (1999) e referências citadas no mesmo. Os anticorpos também têm sido produzidos em grandes quantidades a partir de sementes de planta transgênica incluindo fragmentos de anticorpo, tais como scFvs, incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Consulte, por exemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101 a 109 (1998) e referências citadas no mesmo. Dessa forma, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos também podem ser produzidos com o uso de plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos. Consulte também, por exemplo, Fischer et al., Biotechnol. (PCT) Biochem. 30:99 a 108 (outubro de 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522 a 527 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341 a 346 (1995); Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22:940 a 944 (1994); e referências citadas nos mesmos. Cada uma das referências acima está integralmente incorporada ao presente documento a título de referência.[458] In certain embodiments, the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof provided herein can be further prepared using at least one polynucleotide encoding a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein to provide transgenic plants and cultivated plant cells (e.g., but not limited to, tobacco and maize) that produce such antibodies, specified portions, or variants thereof in the plant parts or in cells cultured therefrom. As a non-limiting example, transgenic tobacco leaves expressing recombinant proteins have been successfully used to provide large quantities of recombinant proteins, e.g., with the use of an inducible promoter. See, e.g., Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) and references cited therein. Furthermore, transgenic maize has been used to express mammalian proteins at commercial production levels, with biological activities equivalent to those produced in other recombinant systems or purified from natural sources. See, for example, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127–147 (1999) and references cited therein. Antibodies have also been produced in large quantities from transgenic plant seeds including antibody fragments such as scFvs, including tobacco seeds and potato tubers. See, for example, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101–109 (1998) and references cited therein. Thus, MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof can also be produced using transgenic plants according to known methods. See also, for example, Fischer et al., Biotechnol. (PCT) Biochem. 30:99-108 (October 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-527 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-346 (1995); Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994); and references cited therein. Each of the above references is incorporated herein in its entirety by reference.

[459] Em certas modalidades, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos no presente documento podem ser preparados com o uso de pelo menos um polinucleotídeo que codifica anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento para fornecer bactérias que produzem tais anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno. Como um exemplo não limitador, E. coli que expressa proteínas recombinantes tem sido usado com sucesso para fornecer grandes quantidades de proteínas recombinantes. Consulte, por exemplo, Verma et al., 1998, 216(1-2): 165 a 181 e referências citadas no mesmo.[459] In certain embodiments, the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof provided herein can be prepared using at least one polynucleotide encoding the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein to provide bacteria that produce such MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments. As a non-limiting example, E. coli expressing recombinant proteins has been successfully used to provide large quantities of recombinant proteins. See, e.g., Verma et al., 1998, 216(1-2): 165-181 and references cited therein.

[460] Os métodos para a fabricação de anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) foram descritos, consulte, por exemplo, patentes nos U.S. 7.951.917; 7.183.076; 8.227.577; 5.837.242; 5.989.830; 5.869.620; 6.132.992e 8.586.713.[460] Methods for making multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) have been described, see, e.g., U.S. Patents 7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 6,132,992, and 8,586,713.

[461] Em certas modalidades, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos fornecidos no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) são utilizados na geração de anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por meio da fusão de dois hibridomas para criar moléculas de imunoglobulina híbridas com dois locais de ligação. Os anticorpos biespecíficosnão apenas subjugam os tumores às células T; os mesmos reticulam CD3 em células T e iniciam a cascata de ativação. Dessa forma,a citotoxicidade à base de receptor de célula T é redirecionadaa alvos de tumor desejados ignorando restrições de MHC. A açãode armar células T ativadas de forma policlonal (ATC) com uma molécula de ligação biespecífica anti-CD3-anti-MUC16 combina a especificidade de direcionamento do anticorpo de glicosilação de MUC16 com a citotoxicidade mediada por perforina/granzima não restrita por MHC de células T. As moléculas de ligação biespecífica BsAb ou BiTE podem armar células T ativadas expandidas ex vivo antes da infusão em um paciente. Essa estratégia converte cada ATC em um CTL específico (Thakur e Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340 a 349; Grabert et al., 2006,Clin Cancer Res 12, 569 a 576).[461] In certain embodiments, the MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof provided herein (see, Section 0 and Section 0) are used in the generation of bispecific antibodies. Bispecific antibodies can be produced by fusing two hybridomas to create hybrid immunoglobulin molecules with two binding sites. The bispecific antibodies not only subjugate tumors to T cells; they cross-link CD3 on T cells and initiate the activation cascade. In this way, T cell receptor-based cytotoxicity is redirected to desired tumor targets bypassing MHC constraints. Polyclonal arming of activated T cells (ATCs) with an anti-CD3-anti-MUC16 bispecific binding molecule combines the targeting specificity of the MUC16 glycosylation antibody with the non-MHC-restricted perforin/granzyme-mediated cytotoxicity of T cells. BsAb or BiTE bispecific binding molecules can arm ex vivo expanded activated T cells prior to infusion into a patient. This strategy converts each ATC into a specific CTL (Thakur and Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340–349; Grabert et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 569–576).

[462] As moléculas de ligação biespecíficas podem ser compreendidas de um anticorpo de glicosilação de MUC16, em que o anticorpo de glicosilação de MUC16 é uma imunoglobulina, em que cada cadeia leve da imunoglobulina é uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão é a cadeia leve de imunoglobulina ligada através de um ligante peptídico a um CD3 de direcionamento de scFv. Uma mutação N297A no domínio CH2 resulta em uma glicosilação que leva a nenhuma ligação de FcR ou Clq.[462] Bispecific binding molecules may be comprised of a MUC16 glycosylating antibody, wherein the MUC16 glycosylating antibody is an immunoglobulin, wherein each immunoglobulin light chain is a fusion protein, wherein the fusion protein is the immunoglobulin light chain linked via a peptide linker to a scFv targeting CD3. An N297A mutation in the CH2 domain results in a glycosylation that leads to no FcR or Clq binding.

[463] Um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser usado para gerar um CAR. CARs são mais comumente compostos de um anticorpo de comprimento de fragmento de cadeia variável única (scFv), tal como um derivado de um anticorpo monoclonal que direciona um determinado antígeno associado a tumor e/ou variante do mesmo, um domínio transmembranar (por exemplo, um domínio transmembranar derivado de uma molécula de superfície de célula T, tal como uma molécula coestimulatória, tal como CD8, CD28, OX-40 e 4-1BB), uma porção de sinalização de um complexo de TCR, tal como um domínio intracelular e/ou porção (ou porções) adicional de uma cadeia de TCR zeta (Z), tal como um domínio de sinalização citoplasmática dos mesmos. Em uma modalidade específica, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de glicosilação de MUC16 monoclonal descrito no presente documento são isoladas a partir de uma linhagem de células de hibridoma que gera um anticorpo de glicosilação de MUC16 monoclonal. Por exemplo, RNA é extraído da linhagem de células de hibridoma e cDNA é gerado a partir do RNA por PCR de transcrição reversa. As regiões variáveis de cadeia de VH e VL são clonadas por PCR padrão com o uso de iniciadores específicos para tais regiões variáveis. Os fragmentos de VH e VL resultantes são subclonados em um vetor bifuncional, tal como, por exemplo, vetor de clonagem TopoTA PCR 2.1 (Invitrogen) se sequenciados. Os fragmentos de VH e VL são subsequentemente ligados a um domínio de espaçador (Gly4Ser)3, gerando um anticorpo de glicosilação de MUC16 scFv e fundidos ao peptídeo líder CD8 humano (CD8L) (anticorpo de glicosilação de CD8L-MUC16 scFv) por PCR de sobreposição (consulte, por exemplo, Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70 a 75; e Gong MC et al., Neoplasia 1999;1(2):123 a 127). A região de codificação do anticorpo de glicosilação de CD8L-MUC16 scFv é fundida à dobradiça de CD8 humana e domínios transmembranares ou alternativamente aos domínios de sinalização citoplasmáticos e transmembranares de CD28, fundida ao domínio de sinalização CD3- Z de receptor de célula T (consulte, por exemplo, Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70 a 75; Brentjens RJ, et al. Nat Med 2003;9(3):279 a 286; e Brentjens RJ, et al., Clin Cancer Res 2007;13(18 Pt 1):5.426 a 5.435).[463] A MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof can be used to generate a CAR. CARs are most commonly composed of a single variable chain fragment length (scFv) antibody, such as one derived from a monoclonal antibody that targets a particular tumor-associated antigen and/or variant thereof, a transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain derived from a T-cell surface molecule, such as a costimulatory molecule, such as CD8, CD28, OX-40, and 4-1BB), a signaling portion of a TCR complex, such as an intracellular domain, and/or an additional portion (or portions) of a TCR zeta (Z) chain, such as a cytoplasmic signaling domain thereof. In a specific embodiment, the light and heavy chain variable regions of a monoclonal MUC16 glycosylation antibody described herein are isolated from a hybridoma cell line that generates a monoclonal MUC16 glycosylation antibody. For example, RNA is extracted from the hybridoma cell line and cDNA is generated from the RNA by reverse transcription-PCR. The VH and VL chain variable regions are cloned by standard PCR using primers specific for such variable regions. The resulting VH and VL fragments are subcloned into a bifunctional vector, such as, for example, TopoTA PCR 2.1 cloning vector (Invitrogen) if sequenced. The VH and VL fragments are subsequently ligated to a spacer domain (Gly4Ser)3, generating a MUC16 glycosylation antibody scFv, and fused to the human CD8 (CD8L) leader peptide (CD8L-MUC16 glycosylation antibody scFv) by overlap PCR (see, e.g., Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70–75; and Gong MC et al., Neoplasia 1999;1(2):123–127). The glycosylation antibody coding region of CD8L-MUC16 scFv is fused to the human CD8 hinge and transmembrane domains or alternatively to the cytoplasmic and transmembrane signaling domains of CD28, fused to the T-cell receptor CD3-Z signaling domain (see, e.g., Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70-75; Brentjens RJ, et al. Nat Med 2003;9(3):279-286; and Brentjens RJ, et al., Clin Cancer Res 2007;13(18 Pt 1):5426-5435).

[464] Também é fornecida no presente documento uma célula T que expressa um CAR descrito no presente documento. Os métodos para a geração de uma célula T que expressa um CAR são conhecidos na técnica. Por exemplo, um construto de CAR pode ser subclonado em um vetor retroviral MMLV modificado SFG (consulte, por exemplo, Riviere I, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(15):6.733 a 6.737) ou outros vetores retrovirais adequados. Em algumas modalidades, o vetor retroviral é um vetor lentiviral, por exemplo, um vetor à base de HIV. Os sobrenadantesretrovirais pseudotipados por VSV-G derivados de fibroblastosgpg29 transduzidos podem ser usados para construir linhagens de células de produção retroviral pseudotipadas por envelope de vírus da leucemia do macaco gibão PG13 estável (GaLV)(consulte, por exemplo, Gong MC, et al. Neoplasia 1999;1(2):123 a 127). As células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) de doador saudável isoladas podem ser ativadas com fitoemaglutinina (PHA) em 2 μg/ml (Sigma. St. Louis, MO) e transduzidas de maneira retroviral em placas de cultura de não tecido revestidas com retronectina (Quintas-Cardama A, et al., Hum Gene Ther 2007;18(12):1.253 a 1.260) para gerar a célula T que expressa de maneira recombinante o CAR. A transferência de gene do CAR nacélula T pode ser avaliada por FACS.[464] Also provided herein is a T cell expressing a CAR described herein. Methods for generating a T cell expressing a CAR are known in the art. For example, a CAR construct can be subcloned into a modified MMLV retroviral vector SFG (see, e.g., Riviere I, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(15):6733-6737) or other suitable retroviral vectors. In some embodiments, the retroviral vector is a lentiviral vector, e.g., an HIV-based vector. VSV-G-pseudotyped retroviral supernatants derived from gpg29-transduced fibroblasts can be used to construct stable PG13 gibbon ape leukemia virus (GaLV) envelope-pseudotyped retroviral production cell lines (see, e.g., Gong MC, et al. Neoplasia 1999;1(2):123–127). Isolated healthy donor peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) can be activated with phytohemagglutinin (PHA) at 2 μg/ml (Sigma. St. Louis, MO) and retrovirally transduced on retronectin-coated non-tissue culture plates (Quintas-Cardama A, et al., Hum Gene Ther 2007;18(12):1253–1260) to generate the T cell recombinantly expressing the CAR. CAR gene transfer into T cells can be assessed by FACS.

[465] Os anticorpos de domínio único, por exemplo, anticorpos que carecem das cadeias leves, podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica. Consulte Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25 a 38; Nuttall SD et al.,(2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253 a 263; Muyldermans S,(2001) J Biotechnol 74(4): 277 a 302; patente n° U.S. 6.005.079;e publicação internacional nos WO 94/04678, WO 94/25591 e WO 01/44301.[465] Single domain antibodies, e.g., antibodies lacking light chains, can be produced by methods well known in the art. See Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; U.S. Patent No. 6,005,079; and International Publication Nos. WO 94/04678, WO 94/25591, and WO 01/44301.

[466] Em modalidades particulares, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, que se liga ao mesmo ou um epítopo de sobreposição como um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento, é um anticorpo de glicosilação de MUC16 humano ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Em modalidades particulares, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, que bloqueia de maneira competitiva (por exemplo, de maneira dose-dependente) qualquer um dos anticorpos descritos no presente documento, da ligação a MUC16, é um anticorpo de glicosilação de MUC16 humano ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Os anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, os camundongos transgênicos que não têm capacidade para expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana, podem ser usados. Em particular, os complexos de genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve humana podem ser introduzidos de maneira aleatória ou por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo. Alternativamente, a região variável, região constante e região de diversidade humana podem ser introduzidas em células-tronco embrionárias de camundongo adicionalmente aos genes de cadeia pesada e leve humanos. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de camundongo podem ser tornados não funcionais de maneira separada ou simultânea com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, a deleção de homozigoto da região JH impede a produção de anticorpos endógenos. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são, então, criados para produzir descendentes homozigotos que expressam anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados no modo normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção de um antígeno. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos a partir dos camundongos transgênicos imunizados com o uso de tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humanos contidos nos camundongos transgênicos se rearranjam durante a diferenciação de célula B e subsequentemente se submetem à comutação de classe e mutação somática. Dessa forma, com o uso de tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral dessa tecnologia para a produção de anticorpos humanos consulte, por exemplo, Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65 a 93. Para uma discussão detalhada dessa tecnologia para a produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção de tais anticorpos consulte, por exemplo, as publicações internacionais nos WO 98/24893, WO 96/34096 e WO 96/33735; patentes nos U.S. 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 e 5.939.598. Os exemplos de camundongos com capacidade para produzir anticorpos humanos incluem o XenomouseTM (Abgenix, Inc.; patentes nos U.S. 6.075.181 e 6.150.184), o HuAb-MouseTM (Mederex, Inc./Gen Pharm; patentes nos U.S. 5.545.806 e 5.569.825), o Trans Chromo Mouse™ (Kirin) e o KM MouseTM (Medarex/Kirin).[466] In particular embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein that binds to the same or an overlapping epitope as a MUC16 glycosylation antibody described herein is a human MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof. In particular embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein that competitively (e.g., dose-dependently) blocks any of the antibodies described herein from binding to MUC16 is a human MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof. Human antibodies can be produced using any method known in the art. For example, transgenic mice that lack the ability to express functional endogenous immunoglobulins but can express human immunoglobulin genes can be used. In particular, human immunoglobulin heavy and light chain gene complexes can be introduced randomly or by homologous recombination into mouse embryonic stem cells. Alternatively, the human variable region, constant region, and diversity region can be introduced into mouse embryonic stem cells in addition to the human heavy and light chain genes. The mouse immunoglobulin heavy and light chain genes can be rendered nonfunctional separately or simultaneously with the introduction of human immunoglobulin loci by homologous recombination. In particular, homozygous deletion of the JH region prevents the production of endogenous antibodies. The modified embryonic stem cells are expanded and microinjected into blastocysts to produce chimeric mice. The chimeric mice are then bred to produce homozygous offspring that express human antibodies. The transgenic mice are immunized in the normal manner with a selected antigen, for example, all or a portion of an antigen. Monoclonal antibodies directed against the antigen can be obtained from immunized transgenic mice using conventional hybridoma technology. The human immunoglobulin transgenes contained in the transgenic mice rearrange during B cell differentiation and subsequently undergo class switching and somatic mutation. Thus, using this technique, it is possible to produce therapeutically useful IgG, IgA, IgM, and IgE antibodies. For an overview of this technology for the production of human antibodies, see, for example, Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65–93. For a detailed discussion of this technology for the production of human antibodies and human monoclonal antibodies, and protocols for the production of such antibodies, see, for example, international publications WO 98/24893, WO 96/34096, and WO 96/33735; U.S. patents 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318, and 5,939,598. Examples of mice capable of producing human antibodies include the Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; U.S. patents 6,075,181 and 6,150,184), the HuAb-Mouse™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; U.S. patents 5,545,806 and 5,569,825), the Trans Chromo Mouse™ (Kirin), and the KM Mouse™ (Medarex/Kirin).

[467] Os anticorpos humanos que se ligam imunoespecificamente a MUC16 podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de exibição de bacteriofago descritos acima, com o uso de bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Consulte também as patentes nos U.S. 4.444.887, 4.716.111 e 5.885.793; e publicações internacionais nos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741.[467] Human antibodies that immunospecifically bind to MUC16 can be produced by a variety of methods known in the art including bacteriophage display methods described above using antibody libraries derived from human immunoglobulin sequences. See also U.S. Patents 4,444,887, 4,716,111, and 5,885,793; and international publications WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, and WO 91/10741.

[468] Em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de hibridomas de camundongo-ser humano. Por exemplo, os linfócitos de sangue periférico humano transformados com o vírus Epstein-Barr (EBV) podem ser fundidos com células de mieloma de camundongo para produzir hibridomas de camundongo-ser humano que secretam anticorpos monoclonais humanos, e esses hibridomas de camundongo-ser humano podem ser submetidos à triagem para determinar aqueles que secretam anticorpos monoclonais humanos que se ligam imunoespecificamente a um antígeno alvo. Tais métodos são conhecidos e são descritos na técnica, consulte, por exemplo, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19 a 23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27 a 31.[468] In some embodiments, human antibodies can be produced using mouse-human hybridomas. For example, human peripheral blood lymphocytes transformed with Epstein-Barr virus (EBV) can be fused with mouse myeloma cells to produce mouse-human hybridomas that secrete human monoclonal antibodies, and these mouse-human hybridomas can be screened to determine those that secrete human monoclonal antibodies that immunospecifically bind to a target antigen. Such methods are known and are described in the art, see, e.g., Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.

[469] Em modalidades específicas, os métodos para a produção de anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos que se ligam imunoespecificamente a MUC16 são conforme descrito na Seção 6.2, infra.[469] In specific embodiments, methods for producing antibodies or antigen-binding fragments thereof that immunospecifically bind to MUC16 are as described in Section 6.2, infra.

[470] Em modalidades específicas, os métodos para a triagem e seleção de anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos que se ligam imunoespecificamente a MUC16 são conforme descrito na Seção 6.2, infra.[470] In specific embodiments, methods for screening and selecting antibodies or antigen-binding fragments thereof that immunospecifically bind to MUC16 are as described in Section 6.2, infra.

[471] Uma vez que um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento foi produzido, o mesmo pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após proteína A, e cromatografia de coluna de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Adicionalmente, os anticorpos descritos no presente documento podem ser fundidos a sequências de polipeptídeos heterólogos descritas no presente documento ou de outro modo conhecidas na técnica para facilitar a purificação.[471] Once a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein has been produced, it can be purified by any method known in the art for purifying an immunoglobulin molecule, for example, by chromatography (e.g., ion exchange, affinity, particularly by affinity for the specific antigen following protein A, and size column chromatography), centrifugation, differential solubility, or by any other standard technique for protein purification. Additionally, the antibodies described herein can be fused to heterologous polypeptide sequences described herein or otherwise known in the art to facilitate purification.

[472] Em modalidades específicas, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é isolado ou purificado. Em geral, um anticorpo isolado é aquele que é substancialmente isento de outros anticorpos com especificidades antigênicas diferentes do anticorpo isolado. Por exemplo, em uma modalidade particular, uma preparação de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento é substancialmente isenta de material celular e/ou precursores químicos. A linguagem “substancialmente isento de material celular” inclui as preparações de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo em que o anticorpo é separado dos componentes celulares das células a partir das quais é isolado ou produzido de maneira recombinante. Dessa forma, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de anticorpo que tem menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% (em peso seco) de proteína heteróloga (também mencionada no presente documento como uma “proteína de contaminação”) e/ou variantes de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, por exemplo, formas modificadas pós-tradução diferentes de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo ou outras versões diferentes de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (por exemplo, fragmentos de anticorpo). Quando o anticorpo é produzido de maneira recombinante, o mesmo também é, em geral, substancialmente isento de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos que cerca de 20%, 10%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% do volume da preparação de proteína. Quando o anticorpo é produzido por síntese química, é, em geral, substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos, isto é, é separado de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Consequentemente, tais preparações do anticorpo têm menos que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de precursores químicos ou compostos diferentes do anticorpo de interesse. Em uma modalidade específica, os anticorpos descritos no presente documento são isolados ou purificados.5.3.2 Polinucleotídeos[472] In specific embodiments, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is isolated or purified. In general, an isolated antibody is one that is substantially free of other antibodies with different antigenic specificities than the isolated antibody. For example, in a particular embodiment, a preparation of a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is substantially free of cellular material and/or chemical precursors. The language “substantially free of cellular material” includes preparations of a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof in which the antibody is separated from the cellular components of the cells from which it is isolated or recombinantly produced. Thus, a MUC16-glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof that is substantially free of cellular material includes antibody preparations that have less than about 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, or 0.1% (by dry weight) heterologous protein (also referred to herein as a “contaminating protein”) and/or variants of a MUC16-glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof, e.g., different post-translationally modified forms of a MUC16-glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof, or other different versions of a MUC16-glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., antibody fragments). When the antibody is produced recombinantly, it is also generally substantially free of culture medium, i.e., the culture medium represents less than about 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, or 0.1% of the volume of the protein preparation. When the antibody is produced by chemical synthesis, it is generally substantially free of chemical precursors or other chemicals, i.e., it is separated from chemical precursors or other chemicals that are involved in the synthesis of the protein. Consequently, such antibody preparations have less than about 30%, 20%, 10%, or 5% (by dry weight) of chemical precursors or compounds other than the antibody of interest. In a specific embodiment, the antibodies described herein are isolated or purified. 5.3.2 Polynucleotides

[473] Em certas modalidades, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0 e Seção 0). Também são fornecidos no presente documento vetores que compreendem tais polinucleotídeos (consulte, Seção 0). Também são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que codificam antígenos do anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0). Também são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que hibridizam sob condições de hibridização de estringência inferior ou estringentes em polinucleotídeos que codificam um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento.[473] In certain embodiments, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0 and Section 0). Also provided herein are vectors comprising such polynucleotides (see, Section 0). Also provided herein are polynucleotides encoding antigens of the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0). Also provided herein are polynucleotides that hybridize under lower stringency or stringent hybridization conditions to polynucleotides encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein.

[474] A linguagem “purificado” inclui preparações de polinucleotídeo ou ácido nucleico que têm menos que cerca de 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% (em particular, menos quecerca de 10%) de outro material, por exemplo, material celular, meio de cultura, outras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos e/ou outros produtos químicos. Em uma modalidade específica, uma molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) é isolada ou purificada.[474] The language “purified” includes polynucleotide or nucleic acid preparations that have less than about 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, or 0.1% (in particular, less than about 10%) of other material, e.g., cellular material, culture medium, other nucleic acid molecules, chemical precursors, and/or other chemicals. In a specific embodiment, a nucleic acid molecule(s) encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) is isolated or purified.

[475] As moléculas de ácido nucleico fornecidas no presente documento podem ser sob a forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma ou sob a forma de DNA, incluindo, porém sem limitação, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente ou quaisquer combinações dos mesmos. O DNA pode ser de fita tripla, fita dupla ou fita simples ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos uma fita do DNA ou RNA pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita senso ou pode ser a fita de não codificação, também mencionada como a fita antissenso.[475] The nucleic acid molecules provided herein may be in the form of RNA, such as mRNA, hnRNA, tRNA, or any other form, or in the form of DNA, including, but not limited to, cDNA and genomic DNA obtained by cloning or produced synthetically, or any combinations thereof. The DNA may be triple-stranded, double-stranded, or single-stranded, or any combination thereof. Any portion of at least one strand of the DNA or RNA may be the coding strand, also known as the sense strand, or may be the non-coding strand, also referred to as the antisense strand.

[476] Em certas modalidades, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0).[476] In certain embodiments, provided herein is a polynucleotide comprising nucleotide sequences encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0).

[477] Em aspectos particulares, também são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos (consulte, Seção 0 e Seção 0), que se ligam imunoespecificamente a MUC16, e compreendem uma sequência de aminoácidos conforme descrito no presente documento, bem como anticorpos que competem com tal anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo para a ligação a MUC16 ou que se liga ao mesmo epítopo que aquele de tais anticorpos.[477] In particular aspects, also provided herein are polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof (see, Section 0 and Section 0), that immunospecifically bind to MUC16, and comprise an amino acid sequence as described herein, as well as antibodies that compete with such MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof for binding to MUC16 or that bind to the same epitope as that of such antibodies.

[478] Os polinucleotídeos fornecidos no presente documento podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0 e Seção 0) descrito no presente documento for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, conforme descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, brevemente, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição que contêm porções da sequência que codifica o anticorpo, anelamento e ligação daqueles oligonucleotídeos e, então, amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.[478] The polynucleotides provided herein may be obtained by any method known in the art. For example, if the nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0 and Section 0) described herein is known, a polynucleotide encoding the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof may be assembled from chemically synthesized oligonucleotides (e.g., as described in Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), which, briefly, involves synthesizing overlapping oligonucleotides that contain portions of the antibody-coding sequence, annealing and ligating those oligonucleotides, and then amplifying the ligated oligonucleotides by PCR.

[479] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0 e Seção 0) pode ser gerado a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone que contém um ácido nucleico que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 particular ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo não estiver disponível, mas a sequência do anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser quimicamente sintetizado ou obtidos a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácido nucleico, de preferência, poli A+ RNA, isolada de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecido no presente documento) por meio de amplificação por PCR com o uso de iniciadores sintéticos que hibridizam nas extremidades 3' e 5' da sequência ou por meio da clonagem com o uso de uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência de genes particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser, então, clonados em vetores de clonagem replicáveis com o uso de qualquer método bem conhecido na técnica (consulte, por exemplo, Seção 0).[479] Alternatively, a polynucleotide encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0 and Section 0) can be generated from nucleic acid of a suitable source. If a clone containing a nucleic acid encoding a particular MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof is not available, but the sequence of the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof is known, a nucleic acid encoding the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof can be chemically synthesized or obtained from a suitable source (e.g., an antibody cDNA library or a cDNA library generated from, or nucleic acid, preferably poly A+ RNA, isolated from, any tissue or cells expressing the antibody, such as hybridoma cells selected to express a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein) by PCR amplification using synthetic primers that hybridize to the 3' and 5' ends of the sequence or by cloning using an oligonucleotide probe specific for the gene sequence. particular to identify, for example, a cDNA clone from a cDNA library encoding the antibody. The amplified nucleic acids generated by PCR can then be cloned into replicable cloning vectors using any method well known in the art (see, for example, Section 0).

[480] Em tais modalidades, um polinucleotídeo que codifica tal anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser manipulado com o uso de métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleotídeos, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese sítio-dirigida, PCR, etc. (consulte, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., que estão ambos incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades), para gerar anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos que têm uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos. Por exemplo, tais manipulações podem ser realizadas para tornar o aminoácido codificado glicosilado ou para destruir a capacidade do anticorpo para se ligar a C1q, receptor Fc ou para ativar o sistema complementar.[480] In such embodiments, a polynucleotide encoding such a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof can be manipulated using methods well known in the art for manipulating nucleotide sequences, e.g., recombinant DNA techniques, site-directed mutagenesis, PCR, etc. (see, e.g., the techniques described in Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., which are both incorporated herein by reference in their entireties), to generate MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof that have a different amino acid sequence, e.g., to create amino acid substitutions, deletions, and/or insertions. For example, such manipulations can be performed to render the encoded amino acid glycosylated or to destroy the ability of the antibody to bind to C1q, the Fc receptor, or to activate the complement system.

[481] As moléculas de ácido nucleico isoladas fornecidas no presente documento podem incluir moléculas de ácido nucleico que compreendem um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, porém sem limitação, pelo menos uma porção especificada de pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR), como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de pelo menos uma cadeia pesada ou cadeia leve; moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de codificação para um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou região variável; e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeos substancialmente diferente daquelas descritas acima, mas que, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento.[481] The isolated nucleic acid molecules provided herein may include nucleic acid molecules comprising an open reading frame (ORF), optionally with one or more introns, for example, but not limited to, at least a specified portion of at least one complementarity determining region (CDR), such as CDR1, CDR2, and/or CDR3 of at least one heavy chain or light chain; nucleic acid molecules comprising the coding sequence for a MUC16 glycosylating antibody or variable region; and nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence substantially different from those described above, but which, due to the degeneracy of the genetic code, still encode at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, as described herein.

[482] Também são fornecidos no presente documento ácidos nucleicos isolados que hibridizam sob condições de hibridização seletiva em um polinucleotídeo revelado no presente documento. Dessa forma, os polinucleotídeos dessa modalidade podem ser usados para o isolamento, detecção e/ou quantificação de ácidos nucleicos que compreendem tais polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos fornecidos no presente documento podem ser usados para identificar, isolar ou amplificar os clones parciais ou de comprimento total em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são sequências de cDNA ou genômicos isolados ou de outro modo complementares a um cDNA a partir de uma biblioteca de ácidos nucleicos de mamífero ou ser humano.[482] Also provided herein are isolated nucleic acids that hybridize under selective hybridization conditions to a polynucleotide disclosed herein. Thus, polynucleotides of this embodiment can be used for the isolation, detection, and/or quantification of nucleic acids comprising such polynucleotides. For example, polynucleotides provided herein can be used to identify, isolate, or amplify partial or full-length clones in a deposited library. In some embodiments, the polynucleotides are cDNA or genomic sequences isolated or otherwise complementary to a cDNA from a mammalian or human nucleic acid library.

[483] Os ácidos nucleicos podem compreender de maneira conveniente sequências adicionalmente a um polinucleotídeo fornecido no presente documento. Por exemplo, um local de multiclonagem que compreende um ou mais locais de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Além disso, as sequências traduzíveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo traduzido fornecido no presente documento. Por exemplo, uma sequência de marcador de hexa-histidina fornece um meio conveniente para purificar os polipeptídeos fornecidos no presente documento. O ácido nucleico fornecido no presente documento—excluindo a sequência de codificação—é opcionalmente um vetor, adaptador ou ligante para a clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo fornecido no presente documento.[483] Nucleic acids may conveniently comprise sequences in addition to a polynucleotide provided herein. For example, a multicloning site comprising one or more restriction endonuclease sites may be inserted into the nucleic acid to aid in the isolation of the polynucleotide. In addition, translatable sequences may be inserted to aid in the isolation of the translated polynucleotide provided herein. For example, a hexahistidine tag sequence provides a convenient means for purifying the polypeptides provided herein. The nucleic acid provided herein—excluding the coding sequence—is optionally a vector, adapter, or linker for the cloning and/or expression of a polynucleotide provided herein.

[484] Sequências adicionais também podem ser adicionadas a tais sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo ou para aperfeiçoar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores e ligantes é bem conhecido na técnica. (Consulte, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).[484] Additional sequences may also be added to such cloning and/or expression sequences to optimize their function in cloning and/or expression, to aid in isolation of the polynucleotide, or to enhance introduction of the polynucleotide into a cell. The use of cloning vectors, expression vectors, adapters, and linkers is well known in the art. (See, e.g., Ausubel, supra; or Sambrook, supra.)

[485] Em uma modalidade específica, com o uso de técnicas deDNA recombinante de rotina, uma ou mais dentre as CDRs de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação comantígeno do mesmo descrito no presente documento podem ser inseridas em regiões de estrutura conhecidas. As regiões de estrutura podem ser de ocorrência natural ou regiões de estrutura consenso e, de preferência, regiões de estrutura humanas (consulte, por exemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457a 479 (1998) para uma listagem de regiões de estrutura humanas).De preferência, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura e CDRs codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que seliga imunoespecificamente a MUC16. Uma ou mais substituições deaminoácido podem ser feitas dentro das regiões de estrutura e, de preferência, as substituições de aminoácido aperfeiçoam a ligação do anticorpo a seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazer substituições ou deleções de aminoácido de um ou mais resíduos de cisteína de região variável que participam de uma ligação de dissulfeto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo que carecem de uma ou mais ligações de dissulfeto intracadeia. Outras alterações para os polinucleotídeos são fornecidas no presente documento e são abrangidas pelo âmbito da prática da técnica.[485] In a specific embodiment, using routine recombinant DNA techniques, one or more of the CDRs of a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be inserted into known framework regions. The framework regions can be naturally occurring or consensus framework regions, and preferably, human framework regions (see, e.g., Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457a-479 (1998) for a listing of human framework regions). Preferably, the polynucleotide generated by combining the framework regions and CDRs encodes a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof that immunospecifically binds to MUC16. One or more amino acid substitutions can be made within the framework regions, and preferably, the amino acid substitutions improve binding of the antibody to its antigen. Additionally, such methods can be used to make amino acid substitutions or deletions of one or more variable region cysteine residues that participate in an intrachain disulfide bond to generate antibody molecules that lack one or more intrachain disulfide bonds. Other modifications to polynucleotides are provided herein and are within the scope of the art.

[486] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico isolada ou purificada ou fragmento da mesma, mediante a ligação com uma outra molécula de ácido nucleico, pode codificar uma proteína de fusão. A geração de proteínas de fusão é abrangida pela habilidade comum na técnica e pode envolver o uso de enzima de restrição ou técnicas de clonagem de recombinação (consulte, por exemplo, Gateway.TM.. (Invitrogen)). Consulte, também, patente n° U.S. no U.S. 5.314.995.[486] In certain embodiments, the isolated or purified nucleic acid molecule or fragment thereof, upon ligation with another nucleic acid molecule, may encode a fusion protein. The generation of fusion proteins is within ordinary skill in the art and may involve the use of restriction enzyme or recombination cloning techniques (see, e.g., Gateway™ (Invitrogen)). See also, U.S. Patent No. 5,314,995.

[487] Em certas modalidades, um polinucleotídeo fornecido no presente documento é sob a forma de um vetor (por exemplo, vetor de expressão) conforme descrito na Seção 0.[487] In certain embodiments, a polynucleotide provided herein is in the form of a vector (e.g., expression vector) as described in Section 0.

[488] Em certos aspectos, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo (por exemplo, uma região de cadeia leve variável e/ou região de cadeia pesada variável) que se liga imunoespecificamente a MUC16, e vetores, por exemplo, vetores que compreendem tais polinucleotídeos para sua expressão eficaz em células hospedeiras (por exemplo, E. coli e células de mamífero). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo é isolado ou purificado.[488] In certain aspects, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or an antigen-binding fragment thereof (e.g., a variable light chain region and/or variable heavy chain region) that immunospecifically binds to MUC16, and vectors, e.g., vectors comprising such polynucleotides for their efficient expression in host cells (e.g., E. coli and mammalian cells). In some embodiments, a polynucleotide is isolated or purified.

[489] Para uso na presente invenção, uma molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo “isolada” é aquela que é separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural (por exemplo, em um camundongo ou um ser humano) da molécula de ácido nucleico. Ademais, uma molécula de ácido nucleico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente isenta de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizada. Por exemplo, a linguagem “substancialmente isenta” inclui preparações de molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo que têm menos que cerca de 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de outro material, por exemplo, material celular, meio de cultura, outras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos e/ou outros produtos químicos.[489] As used herein, an “isolated” nucleic acid or polynucleotide molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source (e.g., a mouse or a human) of the nucleic acid molecule. Furthermore, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, may be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. For example, the language “substantially free” includes nucleic acid or polynucleotide molecule preparations that have less than about 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, or 0.1% of other material, e.g., cellular material, culture medium, other nucleic acid molecules, chemical precursors, and/or other chemicals.

[490] Em aspectos particulares, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos e compreendem uma sequência de aminoácidos conforme descrito no presente documento, bem como anticorpos que competem com tais anticorpos para a ligação a MUC16 (por exemplo, de uma maneira dose- dependente) ou que se liga ao mesmo ou um epítopo de sobreposição que aquele de tais anticorpos.[490] In particular aspects, provided herein are polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof and comprising an amino acid sequence as described herein, as well as antibodies that compete with such antibodies for binding to MUC16 (e.g., in a dose-dependent manner) or that bind to the same or an overlapping epitope as that of such antibodies.

[491] Em certos aspectos, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento. Os polinucleotídeos podem compreender sequências de nucleotídeos que codificam uma cadeia pesada que compreende as CDRs de VH descritas no presente documento (consulte, por exemplo, Tabela 1, Tabela 3 e Tabela 5). Os polinucleotídeos podem compreender sequências de nucleotídeos que codificam uma cadeia leve que compreende as CDRs de VL descritas no presente documento (consulte, por exemplo, Tabela 2, Tabela 4 e Tabela 6).[491] In certain aspects, provided herein are polynucleotides comprising a nucleic acid sequence encoding the light chain or heavy chain of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein. The polynucleotides may comprise nucleotide sequences encoding a heavy chain comprising the VH CDRs described herein (see, e.g., Table 1, Table 3, and Table 5). The polynucleotides may comprise nucleotide sequences encoding a light chain comprising the VL CDRs described herein (see, e.g., Table 2, Table 4, and Table 6).

[492] Em modalidades particulares, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 que compreende três CDRs de VH, por exemplo, que contêm CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH conforme descrito na Tabela 1, Tabela 3 ou Tabela 5. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH das CDRs de VH consenso 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 e 18C6 (isto é, SEQID NO:103, SEQ ID NO:104 e SEQ ID NO:105, respectivamente ou SEQID NO:109, SEQ ID NO:110 e SEQ ID NO:111, respectivamente ou SEQID NO:115, SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:117). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 10C6(isto é, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, respectivamenteou SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11, respectivamente ouSEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17, respectivamente). Emmodalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 7B12 (isto é, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente ou SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:31,respectivamente ou SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 e SEQ ID NO:37,respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 19C11 (isto é, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 e SEQ ID NO:45, respectivamente ou SEQ ID NO:49, SEQ IDNO:50 e SEQ ID NO:51, respectivamente ou SEQ ID NO:55, SEQ IDNO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 16C5 (isto é, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:65, respectivamente ou SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70 e SEQ ID NO:71,respectivamente ou SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77,respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 18C6 (isto é, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:84 e SEQ ID NO:85, respectivamente ou SEQ ID NO:89, SEQ IDNO:90 e SEQ ID NO:91, respectivamente ou SEQ ID NO:95, SEQ IDNO:96 e SEQ ID NO:97, respectivamente).[492] In particular embodiments, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody comprising three VH CDRs, e.g., containing VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 as described in Table 1, Table 3, or Table 5. In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 from the consensus VH CDRs 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, and 18C6 (i.e., SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, and SEQ ID NO:105, respectively, or SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, and SEQ ID NO:111, respectively, or SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:220, and SEQ ID NO:221, respectively). ID NO:116 and SEQ ID NO:117). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 10C6 (i.e., SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5, respectively, or SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, and SEQ ID NO:11, respectively, or SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, and SEQ ID NO:17, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 7B12 (i.e., SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, and SEQ ID NO:25, respectively, or SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, and SEQ ID NO:31, respectively, or SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, and SEQ ID NO:37, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 19C11 (i.e., SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, and SEQ ID NO:45, respectively, or SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, and SEQ ID NO:51, respectively, or SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, and SEQ ID NO:57, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 16C5 (i.e., SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, and SEQ ID NO:65, respectively, or SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, and SEQ ID NO:71, respectively, or SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, and SEQ ID NO:77, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 18C6 (i.e., SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:84, and SEQ ID NO:85, respectively, or SEQ ID NO:89, SEQ IDNO:90, and SEQ ID NO:91, respectively, or SEQ ID NO:95, SEQ IDNO:96, and SEQ ID NO:97, respectively).

[493] Em modalidades específicas, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica anticorpo de glicosilação de MUC16 que compreende (a) três CDRs de VH, por exemplo, que contêm CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH, conforme descrito na Tabela 1, Tabela 3 ou Tabela 5, e (b) três CDRs de cadeia VL, por exemplo, que contêm CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL, conforme descrito na Tabela 2, Tabela 4 ou Tabela 6. Em modalidades específicas,um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH das CDRs de VHconsenso 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 e 18C6 (isto é, SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104 e SEQ ID NO:105, respectivamente ou SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110 e SEQ ID NO:111, respectivamente ou SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:117), e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL das CDRs de VL consenso 10C6, 7B12, 19C11,16C5 e 18C6 (isto é, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107 e SEQ ID NO:108, respectivamente ou SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113 e SEQ IDNO:114, respectivamente ou SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119 e SEQ IDNO:120). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 10C6 (isto é, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, respectivamente ou SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 e SEQID NO:11, respectivamente ou SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ IDNO:17, respectivamente) e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de 10C6 (isto é, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, respectivamente ou SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente ou SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20, respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 7B12 (isto é, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente ou SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:31, respectivamente ou SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 e SEQ ID NO:37, respectivamente) e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de 7B12 (isto é, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28, respectivamente ou SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:34, respectivamente ou SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:40, respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 19C11 (isto é, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 e SEQ ID NO:45, respectivamente ou SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:51, respectivamente ou SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente) e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de 19C11 (isto é, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:48, respectivamente ou SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:54, respectivamente ou SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 e SEQ ID NO:60, respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 16C5 (isto é, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:65, respectivamente ou SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70 e SEQ ID NO:71, respectivamente ou SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente) e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de 16C5 (isto é, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:68, respectivamente ou SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:74, respectivamente ou SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79 e SEQ ID NO:80, respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de 18C6 (isto é, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84 e SEQ ID NO:85, respectivamente ou SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90 e SEQ ID NO:91, respectivamente ou SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 e SEQ ID NO:97, respectivamente) e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de 18C6 (isto é, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87 e SEQ ID NO:88, respectivamente ou SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 e SEQ ID NO:94, respectivamente ou SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99 e SEQ ID NO:100, respectivamente).[493] In specific embodiments, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody comprising (a) three VH CDRs, e.g., containing VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, as described in Table 1, Table 3, or Table 5, and (b) three VL chain CDRs, e.g., containing VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3, as described in Table 2, Table 4, or Table 6. In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes (a) a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 from the consensus VH CDRs 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, and 18C6 (i.e., SEQ ID NO: 494). NO:103,SEQ ID NO:104 and SEQ ID NO:105, respectively or SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110 and SEQ ID NO:111, respectively or SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116 and SEQ ID NO:117), and (b) a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3 of the consensus VL CDRs 10C6, 7B12, 19C11,16C5 and 18C6 (i.e. SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107 and SEQ ID NO:108, respectively or SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113 and SEQ IDNO:114, respectively or SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119 and SEQ IDNO:120). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes (a) a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 10C6 (i.e., SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5, respectively, or SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, and SEQ ID NO:11, respectively, or SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, and SEQ ID NO:17, respectively), and (b) a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 of 10C6 (i.e., SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, and SEQ ID NO:8, respectively, or SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, and SEQ ID NO:14, respectively, or SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, and SEQ ID NO:20, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes (a) a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 7B12 (i.e., SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, and SEQ ID NO:25, respectively, or SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, and SEQ ID NO:31, respectively, or SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, and SEQ ID NO:37, respectively), and (b) a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 of 7B12 (i.e., SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, and SEQ ID NO:28, respectively, or SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, and SEQ ID NO:34, respectively, or SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, and SEQ ID NO:40, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes (a) a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 19C11 (i.e., SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, and SEQ ID NO:45, respectively, or SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, and SEQ ID NO:51, respectively, or SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, and SEQ ID NO:57, respectively), and (b) a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 of 19C11 (i.e., SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, and SEQ ID NO:48, respectively, or SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, and SEQ ID NO:54, respectively, or SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, and SEQ ID NO:60, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes (a) a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 16C5 (i.e., SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, and SEQ ID NO:65, respectively, or SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, and SEQ ID NO:71, respectively, or SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, and SEQ ID NO:77, respectively), and (b) a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 of 16C5 (i.e., SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, and SEQ ID NO:68, respectively, or SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, and SEQ ID NO:74, respectively, or SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, and SEQ ID NO:80, respectively). In specific embodiments, a polynucleotide described herein encodes (a) a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 of 18C6 (i.e., SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, and SEQ ID NO:85, respectively, or SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, and SEQ ID NO:91, respectively, or SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, and SEQ ID NO:97, respectively), and (b) a VL CDR1, a VL CDR2, and a VL CDR3 of 18C6 (i.e., SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, and SEQ ID NO:88, respectively, or SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, and SEQ ID NO:94, respectively, or SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, and SEQ ID NO:100, respectively).

[494] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos descrita no presente documento (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:81 ou SEQ ID NO:101), em que o anticorpo se liga imunoespecificamente a MUC16.[494] In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described herein (e.g., SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:81, or SEQ ID NO:101), wherein the antibody immunospecifically binds to MUC16.

[495] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos descrita no presente documento (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:82 ou SEQ ID NO:102), em que o anticorpo se liga imunoespecificamente a MUC16.[495] In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence described herein (e.g., SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:82, or SEQ ID NO:102), wherein the antibody immunospecifically binds to MUC16.

[496] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:101 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:102. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:101 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:101 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:21 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:41 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:62. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:81 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:82.[496] In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:101 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:102. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:101 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:101 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:22. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:41 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:61 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:62. In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody described herein that comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:81 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:82.

[497] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VH que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146 ou SEQ ID NO:148. Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VL que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147 ou SEQ ID NO:149. Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VH que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:140 e uma VL que compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:141 (por exemplo, 10C6). Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VH que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:142 e uma VL que compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:143 (por exemplo, 7B12). Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VH que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:144 e uma VL que compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:145 (por exemplo, 19C11). Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VH que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:146 e uma VL que compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:147 (por exemplo, 16C5). Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma VH que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:148 e uma VL que compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:149 (por exemplo, 18C6).[497] In certain embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VH comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, or SEQ ID NO:148. In certain embodiments, a polynucleotide described herein encodes a VL comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, or SEQ ID NO:149. In a specific embodiment, a polynucleotide described herein encodes a VH comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:140 and a VL comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:141 (e.g., 10C6). In a specific embodiment, a polynucleotide described herein encodes a VH comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:142 and a VL comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:143 (e.g., 7B12). In a specific embodiment, a polynucleotide described herein encodes a VH comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:144 and a VL comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:145 (e.g., 19C11). In a specific embodiment, a polynucleotide described herein encodes a VH comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:146 and a VL comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:147 (e.g., 16C5). In a specific embodiment, a polynucleotide described herein encodes a VH comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:148 and a VL comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:149 (e.g., 18C6).

[498] Em aspectos específicos, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, por exemplo, uma cadeia leve e cadeia pesada separadas. Em relação à cadeia pesada, em uma modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada gama (por exemplo, gama1, gama2, gama3 ou gama4). Em uma modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada pode compreender qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:81 ou SEQ ID NO:101 e em que a região constante da cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada gama humana.[498] In specific aspects, provided herein is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain and a heavy chain, e.g., a separate light chain and heavy chain. With respect to the heavy chain, in a specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a gamma heavy chain (e.g., gamma1, gamma2, gamma3, or gamma4). In a particular embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, wherein the antibody comprises a heavy chain and wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region can comprise any amino acid sequence of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:81, or SEQ ID NO:101 and wherein the heavy chain constant region is a human gamma heavy chain constant region.

[499] Em relação à cadeia leve, em uma modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve kappa. Em uma outra modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve lambda. Em ainda outra modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento que compreende uma cadeia leve kappa humana ou uma cadeia leve lambda humana. Em uma modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento deligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, emque o anticorpo compreende uma cadeia leve e em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve pode compreender qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:82 ou SEQ ID NO:102 e em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de cadeia leve kappa humana. Em uma outra modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento que compreende uma cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve pode compreender qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, SEQ IDNO:82 ou SEQ ID NO:102 e em que a região constante da cadeialeve é uma região constante de cadeia leve lambda humana.[499] With respect to the light chain, in a specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a kappa light chain. In another specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a lambda light chain. In yet another specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein that comprises a human kappa light chain or a human lambda light chain. In a particular embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-deleting fragment thereof described herein, wherein the antibody comprises a light chain and wherein the amino acid sequence of the light chain variable region can comprise any amino acid sequence of SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:82, or SEQ ID NO:102 and wherein the light chain constant region is a human kappa light chain constant region. In another particular embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein that comprises a light chain, wherein the amino acid sequence of the light chain variable region can comprise any amino acid sequence of SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:82, or SEQ ID NO:102, and wherein the light chain constant region is a human lambda light chain constant region.

[500] Para um exemplo detalhado para a geração de anticorpos de glicosilação de MUC16 descritos no presente documento, consulte, Seção 0 e Seção 0.5.3.3 Células e vetores[500] For a detailed example for the generation of MUC16 glycosylating antibodies described herein, see, Section 0 and Section 0.5.3.3 Cells and Vectors

[501] Em certas modalidades, são fornecidas no presente documento células (por exemplo, células ex vivo) que expressam (por exemplo, de maneira recombinante) um ou mais anticorpos deglicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dosmesmos (consulte, Seção 0 e Seção 0). Também são fornecidos no presente documento vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem sequências de nucleotídeos (consulte, por exemplo, Seção 0) que codificam um anticorpo de glicosilação deMUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito nopresente documento para a expressão recombinante em células hospedeiras, de preferência, em células de mamífero. Também são fornecidas no presente documento células (por exemplo, células ex vivo) que compreendem tais vetores ou sequências de nucleotídeos para expressar de maneira recombinante um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo aqui descrito. Também são fornecidos no presente documento métodos para a produção de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, que compreende expressar tal anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo a partir de uma célula (por exemplo, célula ex vivo). Em uma modalidade preferencial, a célula é uma célula ex vivo.[501] In certain embodiments, provided herein are cells (e.g., ex vivo cells) that express (e.g., recombinantly) one or more MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof (see, Section 0 and Section 0). Also provided herein are vectors (e.g., expression vectors) comprising nucleotide sequences (see, e.g., Section 0) encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein for recombinant expression in host cells, preferably in mammalian cells. Also provided herein are cells (e.g., ex vivo cells) comprising such vectors or nucleotide sequences for recombinantly expressing a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein. Also provided herein are methods for producing a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, comprising expressing such MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof from a cell (e.g., an ex vivo cell). In a preferred embodiment, the cell is an ex vivo cell.

[502] Um vetor (por exemplo, vetor de expressão) é uma molécula de DNA que compreende um gene que é expresso em uma célula (por exemplo, célula ex vivo). Tipicamente, a expressão de genes é colocada sob o controle de certos elementos reguladores, incluindo promotores induzíveis ou constitutivos, elementos reguladores específicos quanto a tecido e intensificadores. Acredita-se que tal gene seja "ligado operacionalmente" aos elementos reguladores, por exemplo, um promotor. Um hospedeiro recombinante pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica que contém um vetor de clonagem ou vetor de expressão. O termo inclui também aquelas células procarióticas ou eucarióticas, bem como um animal transgênico, que foram geneticamente modificadas para conter o gene (ou genes) clonado no cromossomo ou genoma da célula hospedeira ou célulasdas células hospedeiras (por exemplo, células ex vivo). Em uma modalidade, o promotor é o promotor CMV.[502] A vector (e.g., expression vector) is a DNA molecule comprising a gene that is expressed in a cell (e.g., an ex vivo cell). Typically, gene expression is placed under the control of certain regulatory elements, including inducible or constitutive promoters, tissue-specific regulatory elements, and enhancers. Such a gene is believed to be "operably linked" to the regulatory elements, e.g., a promoter. A recombinant host can be any prokaryotic or eukaryotic cell that contains a cloning vector or expression vector. The term also includes those prokaryotic or eukaryotic cells, as well as a transgenic animal, that have been genetically modified to contain the cloned gene(s) in the chromosome or genome of the host cell or cells of the host cells (e.g., ex vivo cells). In one embodiment, the promoter is the CMV promoter.

[503] Em certas modalidades, é fornecido no presente documento um vetor que compreende um ou mais polinucleotídeos conforme descrito na Seção 0. Em certas modalidades, um polinucleotídeo conforme descrito na Seção 0 pode ser clonado em um vetor adequado e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Os vetores e métodos para construir tais vetores são conhecidos por um versado na técnica e são descritos em referências técnicas gerais (consulte, em geral, "Recombinant DNA Part D", Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu e Grossman, eds., Academic Press (1987)). Em certas modalidades, o vetor compreende sequências reguladoras, tais como códons de terminação e iniciação de transcrição e tradução, que são específicos para o tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo, planta, inseto ou mamífero) no qual o vetor deve ser introduzido, conforme for adequado e levando em consideração se o vetor é DNA ou RNA. Em certas modalidades, o vetor compreende sequências reguladoras que são específicas para o gênero do hospedeiro. Em certas modalidades, o vetor compreende sequências reguladoras que são específicas para a espécie do hospedeiro.[503] In certain embodiments, provided herein is a vector comprising one or more polynucleotides as described in Section 0. In certain embodiments, a polynucleotide as described in Section 0 can be cloned into a suitable vector and can be used to transform or transfect any suitable host. Vectors and methods for constructing such vectors are known to one of skill in the art and are described in general technical references (see, generally, "Recombinant DNA Part D", Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)). In certain embodiments, the vector comprises regulatory sequences, such as transcription and translation initiation and termination codons, that are specific to the type of host (e.g., bacterium, fungus, plant, insect, or mammal) into which the vector is to be introduced, as appropriate and taking into account whether the vector is DNA or RNA. In certain embodiments, the vector comprises regulatory sequences that are specific to the genus of the host. In certain embodiments, the vector comprises regulatory sequences that are specific to the host species.

[504] Em certas modalidades, o vetor compreende um ou mais genes marcadores, que permitem a seleção de hospedeiros transformados ou transfectados. Os exemplos não limitadores de genes marcadores incluem resistência a biocida, por exemplo, resistência a antibióticos, metais pesados, etc., complementação em um hospedeiro auxotrófico para fornecer prototrofia e similares. Em uma modalidade preferencial, o vetor compreende marcadores selecionáveis de higromicina e ampicilina.[504] In certain embodiments, the vector comprises one or more marker genes, which allow for selection of transformed or transfected hosts. Non-limiting examples of marker genes include biocide resistance, e.g., resistance to antibiotics, heavy metals, etc., complementation in an auxotrophic host to provide prototrophy, and the like. In a preferred embodiment, the vector comprises hygromycin and ampicillin selectable markers.

[505] Em certas modalidades, um vetor de expressão pode compreender um promotor nativo ou normativo ligado operacionalmente a um polinucleotídeo, conforme descrito na Seção 0. A seleção de promotores, por exemplo, forte, fraco, induzível, específico quanto a tecido e específico quanto a desenvolvimento, está dentro da habilidade na técnica. De modo similar, a combinação de uma molécula de ácido nucleico ou fragmento do mesmo, conforme descrito acima, com um promotor também está dentro da habilidade na técnica.[505] In certain embodiments, an expression vector may comprise a native or normative promoter operably linked to a polynucleotide as described in Section 0. Selection of promoters, e.g., strong, weak, inducible, tissue-specific, and development-specific, is within the skill in the art. Similarly, combining a nucleic acid molecule or fragment thereof as described above with a promoter is also within the skill in the art.

[506] Os exemplos não limitadores de vetores adequados incluem aqueles designados para a propagação e expansão ou para expressão, ou ambas. Por exemplo, um vetor de clonagem pode ser selecionado do grupo que consiste na série pUC, na série pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), na série pET (Novagen, Madison, Wis.), na série pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) e na série pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). Os vetores de bacteriófago, tais como lamda-GT10, lamda-GT11, lamda-ZapII (Stratagene), lamda-EMBL4 e lamda-NM1149, também podem ser usados. Os exemplos não limitadores de vetores de expressão de planta incluem pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Os exemplos não limitadores de vetores de expressão de animal incluem pEUK-C1, pMAM e pMAMneo (Clontech). O sistema de clonagem TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) também pode ser usado de acordo com as recomendações do fabricante.[506] Non-limiting examples of suitable vectors include those designed for propagation and expansion or for expression, or both. For example, a cloning vector can be selected from the group consisting of the pUC series, the pBluescript series (Stratagene, LaJolla, Calif.), the pET series (Novagen, Madison, Wis.), the pGEX series (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), and the pEX series (Clontech, Palo Alto, Calif.). Bacteriophage vectors such as lamda-GT10, lamda-GT11, lamda-ZapII (Stratagene), lamda-EMBL4, and lamda-NM1149 can also be used. Non-limiting examples of plant expression vectors include pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121, and pBIN19 (Clontech). Non-limiting examples of animal expression vectors include pEUK-C1, pMAM, and pMAMneo (Clontech). The TOPO cloning system (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) may also be used according to the manufacturer's recommendations.

[507] Em certas modalidades, o vetor é um vetor de mamífero. Em certas modalidades, o vetor de mamífero contém pelo menos um elemento promotor, que media a iniciação da transcrição de mRNA, da sequência de codificação de anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo e sinais exigidos para a terminação da transcrição e poliadenilação da transcrição. Em certas modalidades, o vetor de mamífero contém elementos adicionais, tais como, por exemplo, intensificadores, sequências Kozak e sequências intervenientes flanqueadas por locais de doador e aceitador para splicing de RNA. Em certas modalidades, a transcrição altamente eficaz pode ser alcançada com, por exemplo, os promotores precoces e tardios a partir de SV40, as repetições terminais longas (LTRS) a partir de retrovírus, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor precoce do citomegalovírus (CMV). Entretanto, os elementos celulares também podem ser usados (por exemplo, o promotor de actina humana). Os exemplos não limitadores de vetores de expressão de mamífero incluem os vetores, tais como pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN ou pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, Calif.), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) ou pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL e PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suécia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109). Os exemplo não limitadores de células hospedeiras de mamífero que podem ser usadas em combinação com tais vetores de mamífero incluem células humanas Hela 293, H9 e Jurkat, células de camundongo NIH3T3 e C127, células Cos 1, Cos 7 e CV 1, células de cordoniz QC1-3, células L de camundongo e células de ovário de hamster chinês (CHO).[507] In certain embodiments, the vector is a mammalian vector. In certain embodiments, the mammalian vector contains at least one promoter element, which mediates initiation of mRNA transcription, the MUC16 glycosylation antibody-coding sequence or antigen-binding fragment thereof, and signals required for transcription termination and transcript polyadenylation. In certain embodiments, the mammalian vector contains additional elements, such as, for example, enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanked by donor and acceptor sites for RNA splicing. In certain embodiments, highly efficient transcription can be achieved with, for example, the early and late promoters from SV40, the long terminal repeats (LTRS) from retroviruses, e.g., RSV, HTLVI, HIVI, and the cytomegalovirus (CMV) early promoter. However, cellular elements can also be used (e.g., the human actin promoter). Non-limiting examples of mammalian expression vectors include vectors such as pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, or pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, Calif.), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-), or pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL and PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), and pBC12MI (ATCC 67109). Non-limiting examples of mammalian host cells that may be used in combination with such mammalian vectors include human Hela 293, H9, and Jurkat cells, mouse NIH3T3 and C127 cells, Cos 1, Cos 7, and CV 1 cells, QC1-3 cordon cells, mouse L cells, and Chinese hamster ovary (CHO) cells.

[508] Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral, por exemplo, vetores retrovirais, vetores à base de parvovírus, por exemplo, vetores à base de vírus adenoassociado (AAV), vetores quiméricos adenovirais AAV e vetores à base de adenovírus e vetores lentivirais, tais como vetores à base de Herpes simplex (HSV). Em certas modalidades, o vetor viral é manipulado para tornar a replicação de vírus deficiente. Em certas modalidades, o vetor viral é manipulado para eliminar a toxicidade para o hospedeiro. Esses vetores virais podem ser preparados com o uso de técnicas de DNA recombinante padrão descritas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994).[508] In certain embodiments, the vector is a viral vector, e.g., retroviral vectors, parvovirus-based vectors, e.g., adeno-associated virus (AAV)-based vectors, chimeric AAV-adenoviral vectors and adenovirus-based vectors, and lentiviral vectors, such as Herpes simplex virus (HSV)-based vectors. In certain embodiments, the viral vector is engineered to render the virus replication defective. In certain embodiments, the viral vector is engineered to eliminate toxicity to the host. Such viral vectors can be prepared using standard recombinant DNA techniques described, e.g., in Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994).

[509] Em certas modalidades, um vetor ou polinucleotídeo descrito no presente documento pode ser transferido para uma célula (por exemplo, uma célula ex vivo) por meio de técnicas convencionais e a célula resultante pode ser cultivada por técnicas convencionais para produzir um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento. Consequentemente, são fornecidas no presente documento células que compreendem um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, uma cadeia pesada ou leve do mesmo ou um polipeptídeo de fusão de cadeia leve do mesmo, ligado operacionalmente a um promotor para a expressão de tais sequências na célula hospedeira. Em certas modalidades, um vetor que codifica a cadeia pesada ligada operacionalmente a um promotor e um vetor que codifica a cadeia leve ligada operacionalmente a um promotor podem ser coexpressos na célula para a expressão de todo o anticorpo de glicosilação de MUC16. Em certas modalidades, um vetor que codifica uma cadeia pesada ligada operacionalmente a um promotor e um vetor que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia leve ligado operacionalmente a um promotor podem ser coexpressos na célula para a expressão de toda a molécula de ligação biespecífica. Em certas modalidades, uma célula compreende um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica tanto a cadeia pesada como o polipeptídeo de cadeia leve de um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento ligado operacionalmente a um promotor. Em certas modalidades, uma célula compreende um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica tanto a cadeia pesada como o polipeptídeo de cadeia leve de uma molécula de ligação biespecífica descrita no presente documento ligada operacionalmente a um promotor. Em certas modalidades, uma célula compreende dois vetores diferentes, um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ligada operacionalmente a um promotor e um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de cadeia leve ligado operacionalmente a um promotor. Em certas modalidades, uma célula compreende dois vetores diferentes, um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ligada operacionalmente a um promotor e um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia leve ligado operacionalmente a um promotor. Em certas modalidades, uma primeira célula compreende um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento e uma segunda célula compreende um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de cadeia leve de um anticorpo de glicosilação de MUC16 descrito no presente documento. Em certas modalidades, é fornecida no presente documento uma mistura de células que compreende tal primeira célula e tal segunda célula. Em certas modalidades, uma primeira célula compreende um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de uma molécula de ligação biespecífica descrita no presente documento e uma segunda célula compreende um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia leve de uma molécula de ligação biespecífica descrita no presente documento. Em certas modalidades, é fornecida no presente documento uma mistura de células que compreende tal primeira célula e tal segunda célula. Em uma modalidade preferencial, a célula expressa o vetor ou vetores de modo que o oligonucleotídeo seja tanto transcrito como traduzido de modo eficaz pela célula.[509] In certain embodiments, a vector or polynucleotide described herein can be transferred into a cell (e.g., an ex vivo cell) by conventional techniques, and the resulting cell can be cultured by conventional techniques to produce a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein. Accordingly, provided herein are cells comprising a polynucleotide encoding a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, a heavy or light chain thereof, or a light chain fusion polypeptide thereof, operably linked to a promoter for the expression of such sequences in the host cell. In certain embodiments, a vector encoding the heavy chain operably linked to a promoter and a vector encoding the light chain operably linked to a promoter can be co-expressed in the cell for the expression of the entire MUC16 glycosylating antibody. In certain embodiments, a vector encoding a heavy chain operatively linked to a promoter and a vector encoding a light chain fusion polypeptide operatively linked to a promoter can be co-expressed in the cell for expression of the entire bispecific binding molecule. In certain embodiments, a cell comprises a vector comprising a polynucleotide encoding both the heavy chain and the light chain polypeptide of a MUC16 glycosylating antibody described herein operatively linked to a promoter. In certain embodiments, a cell comprises a vector comprising a polynucleotide encoding both the heavy chain and the light chain polypeptide of a bispecific binding molecule described herein operatively linked to a promoter. In certain embodiments, a cell comprises two different vectors, a first vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain operatively linked to a promoter and a second vector comprising a polynucleotide encoding a light chain polypeptide operatively linked to a promoter. In certain embodiments, a cell comprises two different vectors, a first vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain operatively linked to a promoter and a second vector comprising a polynucleotide encoding a light chain fusion polypeptide operatively linked to a promoter. In certain embodiments, a first cell comprises a first vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain of a MUC16 glycosylating antibody described herein, and a second cell comprises a second vector comprising a polynucleotide encoding a light chain polypeptide of a MUC16 glycosylating antibody described herein. In certain embodiments, provided herein is a mixture of cells comprising such a first cell and such a second cell. In certain embodiments, a first cell comprises a first vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain of a bispecific binding molecule described herein, and a second cell comprises a second vector comprising a polynucleotide encoding a light chain fusion polypeptide of a bispecific binding molecule described herein. In certain embodiments, a mixture of cells comprising such a first cell and such a second cell is provided herein. In a preferred embodiment, the cell expresses the vector or vectors such that the oligonucleotide is both transcribed and translated efficiently by the cell.

[510] Na modalidade, a célula expressa o vetor de modo que o oligonucleotídeo ou fragmento do mesmo seja tanto transcrito como traduzido de modo eficaz pela célula.[510] In the embodiment, the cell expresses the vector such that the oligonucleotide or fragment thereof is both transcribed and translated efficiently by the cell.

[511] Em certas modalidades, a célula está presente em um hospedeiro que pode ser um animal, tal como um mamífero. Os exemplos de células incluem, porém sem limitação, uma célula humana, uma linhagem de células humanas, E. coli (por exemplo, E. coli TB-1, TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene), SA2821 e Y1090), B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa, células de inseto (por exemplo, Sf9, Ea4) e outras apresentadas doravante. Em uma modalidade preferencial, a célula é uma célula CHO. Em uma modalidade especialmente preferencial, a célula é uma célula CHO-S.[511] In certain embodiments, the cell is present in a host which may be an animal, such as a mammal. Examples of cells include, but are not limited to, a human cell, a human cell line, E. coli (e.g., E. coli TB-1, TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene), SA2821, and Y1090), B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa, insect cells (e.g., Sf9, Ea4), and others set forth herein. In a preferred embodiment, the cell is a CHO cell. In an especially preferred embodiment, the cell is a CHO-S cell.

[512] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento pode ser expresso em uma linhagem de células estável que compreende o polinucleotídeo integrado em um cromossomo mediante a introdução do polinucleotídeo na célula. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é introduzido na célula por meio, por exemplo, de eletroporação. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é introduzido na célula por meio, por exemplo, de transfecção de um vetor que compreende o polinucleotídeo na célula. Em certas modalidades, o vetor é cotransfectado com um marcador selecionável, tal como DHFR, GPT, neomicina ou higromicina para permitir a identificação e isolamento das células transfectadas. Em certas modalidades, o polinucleotídeo transfectado também pode ser amplificado para expressar quantidades grandes do anticorpo de glicosilação de MUC16 codificado ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Por exemplo, o marcador DHFR (di-hidrofolato redutase) pode ser usado para desenvolver linhagens de células que carregam várias centenas ou até vários milhares de cópias do polinucleotídeo de interesse. Um outro exemplo de um marcador selecionável é a enzima glutamina sintase (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227:277 a 279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169 a 175 (1992)). Com o uso desses marcadores, as células são cultivadas em meio seletivo e as células com a resistência maior são selecionadas. Essas linhagens de células contêm o gene (ou genes) amplificado integrado em um cromossomo. As células de ovário de hamster chinês (CHO) e NSO são muitas vezes usadas para a produção de anticorpos.[512] In certain embodiments, a polynucleotide described herein can be expressed in a stable cell line comprising the polynucleotide integrated into a chromosome by introducing the polynucleotide into the cell. In certain embodiments, the polynucleotide is introduced into the cell by, for example, electroporation. In certain embodiments, the polynucleotide is introduced into the cell by, for example, transfecting a vector comprising the polynucleotide into the cell. In certain embodiments, the vector is cotransfected with a selectable marker, such as DHFR, GPT, neomycin, or hygromycin to allow for identification and isolation of the transfected cells. In certain embodiments, the transfected polynucleotide can also be amplified to express large amounts of the encoded MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof. For example, the DHFR (dihydrofolate reductase) marker can be used to develop cell lines that carry several hundred or even several thousand copies of the polynucleotide of interest. Another example of a selectable marker is the enzyme glutamine synthase (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227:277–279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169–175 (1992)). Using these markers, cells are grown in selective media, and cells with the highest resistance are selected. These cell lines contain the amplified gene(s) integrated into a chromosome. Chinese hamster ovary (CHO) and NSO cells are often used for antibody production.

[513] Em uma modalidade, o vetor compreende (i) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina que se liga a MUC16, ligada operacionalmente a um primeiro promotor e (ii) um segundo polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina que se liga a MUC16, ligada operacionalmente a um segundo promotor. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral.[513] In one embodiment, the vector comprises (i) a first polynucleotide sequence encoding an immunoglobulin light chain that binds MUC16, operably linked to a first promoter, and (ii) a second polynucleotide encoding an immunoglobulin heavy chain that binds MUC16, operably linked to a second promoter. In certain embodiments, the vector is a viral vector.

[514] Em uma modalidade, o vetor compreende (i) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia leve que compreende uma cadeia leve de imunoglobulina fundida a um scFv, através de um ligante peptídico, em que a cadeia leve se liga a MUC16 e em que o scFv se liga a CD3, ligado operacionalmente a um primeiro promotor e (ii) um segundo polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina que se liga a MUC16 ligada operacionalmente a um segundo promotor. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral.5.4 Composições farmacêuticas[514] In one embodiment, the vector comprises (i) a first polynucleotide sequence encoding a light chain fusion polypeptide comprising an immunoglobulin light chain fused to a scFv, via a peptide linker, wherein the light chain binds MUC16 and wherein the scFv binds CD3, operably linked to a first promoter, and (ii) a second polynucleotide encoding an immunoglobulin heavy chain that binds MUC16 operably linked to a second promoter. In certain embodiments, the vector is a viral vector. 5.4 Pharmaceutical Compositions

[515] Em certas modalidades, são fornecidas no presente documento composições (por exemplo, composições farmacêuticas) e kits que compreendem uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos (consulte, Seção 0 e Seção 0). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem células imunes, por exemplo, células T, que expressam de maneira recombinante um anticorpo, fragmento de ligação com antígeno do mesmo e/ou CAR descrito no presente documento. As composições podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitária únicas e individuais. As composições fornecidas no presente documento podem ser formuladas para administração parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intra-Ommaya, intraocular, intravítrea, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdio, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretina, intraespinhal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, intratecal, intraventricular no cérebro, intraparênquima no cérebro ou transdérmica. Em uma modalidade preferencial, a composição é formulada para a administração parenteral. Em uma modalidade especialmente preferencial, a composição é formulada para administração intravenosa. Em uma modalidade preferencial, a composição é formulada para a administração intraperitoneal. Em uma modalidade específica, a composição é formulada para a administração intraperitoneal para tratar metástases peritoneais. Em uma modalidade preferencial, a composição é formulada para administração intratecal. Em uma modalidade específica, a composição é formulada para administração intratecal para tratar metástases de cérebro. Consulte, por exemplo, Kramer et al, 2010, 97: 409 a 418. Em uma modalidade preferencial, a composição é formulada para administração intraventricular no cérebro. Em uma modalidade específica, a composição é formulada para administração intraventricular para tratar metástases de cérebro. Consulte, por exemplo, Kramer et al, 2010, 97: 409 a 418. Em uma modalidade preferencial, a composição é formulada para administração intraparênquima no cérebro. Em uma modalidade específica, a composição é formulada para administração intraparênquima para tratar um tumor de cérebro ou metástases de tumor de cérebro. Consulte, por exemplo, Luther et al., 2014, Neuro Oncol, 16: 800 a 806 e Clinical Trial ID NO NCT01502917.[515] In certain embodiments, provided herein are compositions (e.g., pharmaceutical compositions) and kits comprising a pharmaceutically effective amount of one or more MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof (see, Section 0 and Section 0). In certain embodiments, the pharmaceutical compositions comprise immune cells, e.g., T cells, that recombinantly express an antibody, antigen-binding fragment thereof, and/or CAR described herein. The compositions can be used in the preparation of single, individual unit dosage forms. The compositions provided herein may be formulated for parenteral, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intrarticular, intrabronchial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginous, intracavitary, intracelial, intracerebellar, intracerebroventricular, intraocular, intravitreal, intracolic, intracervical, intragastric, intrahepatic, intramyocardial, intraosteal, intrapelvic, intrapericardial, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatic, intrapulmonary, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraspinal, intrasynovial, intrathoracic, intrauterine, intravesical, bolus, vaginal, rectal, buccal, sublingual, intranasal, intrathecal, intraventricular brain, intraparenchymal brain, or transdermal administration. In a preferred embodiment, the composition is formulated for parenteral administration. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intravenous administration. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intraperitoneal administration. In a specific embodiment, the composition is formulated for intraperitoneal administration to treat peritoneal metastases. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intrathecal administration. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intrathecal administration to treat brain metastases. See, e.g., Kramer et al., 2010, 97: 409-418. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intraventricular administration to the brain. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intraventricular administration to treat brain metastases. See, e.g., Kramer et al., 2010, 97: 409-418. In a particularly preferred embodiment, the composition is formulated for intraparenchymal administration to the brain. In a specific embodiment, the composition is formulated for intraparenchymal administration to treat a brain tumor or brain tumor metastases. See, e.g., Luther et al., 2014, Neuro Oncol, 16:800-806 and Clinical Trial ID NO NCT01502917.

[516] Em uma modalidade específica, a composição é formulada para administração intraperitoneal para metástases peritoneais.[516] In a specific embodiment, the composition is formulated for intraperitoneal administration for peritoneal metastases.

[517] Em certas modalidades, é fornecida no presente documento uma composição que compreende um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento. Em certas modalidades, é fornecida no presente documento uma composição que compreende uma célula, em que a célula compreende uma ou mais polinucleotídeos que compreende sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento. Em certas modalidades, é fornecida no presente documento uma composição que compreende um vetor, em que o vetor compreende um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento. Em certasmodalidades, é fornecida no presente documento uma composiçãoque compreende uma célula, em que a célula compreende um vetor,em que o vetor compreende um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento.[517] In certain embodiments, provided herein is a composition comprising one or more polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding a MUC16 glycosylating antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein. In certain embodiments, provided herein is a composition comprising a cell, wherein the cell comprises one or more polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding a MUC16 glycosylating antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein. In certain embodiments, provided herein is a composition comprising a vector, wherein the vector comprises one or more polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding a MUC16 glycosylating antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein. In certain embodiments, provided herein is a composition comprising a cell, wherein the cell comprises a vector, wherein the vector comprises one or more polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding a MUC16 glycosylating antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein.

[518] Em certas modalidades, uma composição descrita no presente documento é uma formulação estável ou conservada. Em certas modalidades, a formulação estável compreende um tampão de fosfato com solução salina ou um sal escolhido. Em certas modalidades, uma composição descrita é uma formulação conservada de multiuso adequada para o uso veterinário ou farmacêutico. Em certas modalidades, uma composição descrita no presente documento compreende um conservante. Os conservantes são conhecidos pelo versado na técnica. Os exemplos não limitadores de conservantes incluem fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico,fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexa-hidrato), alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio e desidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Qualquer concentração ou misturaadequada pode ser usada conforme conhecido na técnica, tal como0,001 a 5% ou qualquer faixa ou valor na mesma, tal como, porém sem limitação, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 ou qualquer faixa ou valor na mesma. Os exemplos não limitadores incluem, nenhum conservante, 0,1 a 2% de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1 a 3% de álcool benzílico (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001 a 0,5% de timerosal (por exemplo, 0,005, 0,01), 0,001 a 2,0% de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005 a 1,0% de alquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) e similares.[518] In certain embodiments, a composition described herein is a stable or preserved formulation. In certain embodiments, the stable formulation comprises a phosphate buffer with saline or a chosen salt. In certain embodiments, a composition described is a multipurpose preserved formulation suitable for veterinary or pharmaceutical use. In certain embodiments, a composition described herein comprises a preservative. Preservatives are known to one of skill in the art. Non-limiting examples of preservatives include phenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, chlorocresol, benzyl alcohol, phenylmercuric nitrite, phenoxyethanol, formaldehyde, chlorobutanol, magnesium chloride (e.g., hexahydrate), alkylparaben (methyl, ethyl, propyl, butyl, and the like), benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and sodium dehydroacetate and thimerosal or mixtures thereof in an aqueous diluent. Any suitable concentration or mixture may be used as known in the art, such as 0.001 to 5% or any range or value therein, such as, but not limited to, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 or any range or value therein. Non-limiting examples include, no preservative, 0.1 to 2% m-cresol (e.g., 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1 to 3% benzyl alcohol (e.g., 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001 to 0.5% thimerosal (e.g., 0.005, 0.01), 0.001 to 2.0% phenol (e.g., 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005 to 1.0% alkylparaben(s) (e.g., 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) and the like.

[519] Às vezes pode ser desejável entregar as composições fornecidas no presente documento a um indivíduo durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, durante períodos de uma semana a um ano ou mais a partir de uma administração única. Diversas formas de dosagem implante ou depot de liberação lenta podem ser usadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que tem um baixo grau de solubilidade em fluidos corporais, por exemplo, (a) um sal de adição ácido com um ácido polibásico, tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftaleno mono ou dissulfônicos, ácido poligalacturônico e similares; (b) um sal com um cátion de metal polivalente, tal como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e similares ou com um cátion orgânico formado a partir de por exemplo, N,N'-dibenzil- etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b) por exemplo, um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, uma composição fornecida no presente documento, de preferência, um sal relativamente insolúvel, tal como aqueles já descritos, pode ser formulada em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo, óleo de gergelim, adequado para injeção. Os sais particularmente preferenciais são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato e similares. Um outro tipo de formulação depot de liberação lenta para injeção iria conter o composto ou sal disperso ou encapsulado em um polímero não-antigênico, não tóxico de degradação lenta, tal como um polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por exemplo, conforme descrito na patente n° U.S. no U.S. 3.773.919. Os compostos ou, de preferência, sais relativamente insolúveis, tais como aqueles descritos acima, também podem ser formulados em péletes silásticos de matriz de colesterol, particularmente para o uso em animais. As composições de implante ou depot de liberação lenta adicionais, por exemplo, lipossomas líquidos ou em gás, são conhecidas na literatura (patente n° U.S. 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).[519] It may sometimes be desirable to deliver the compositions provided herein to an individual over extended periods of time, e.g., over periods of a week to a year or more from a single administration. Various slow-release implant or depot dosage forms may be used. For example, a dosage form may contain a non-toxic pharmaceutically acceptable salt of the compounds that has a low degree of solubility in body fluids, e.g., (a) an acid addition salt with a polybasic acid, such as phosphoric acid, sulfuric acid, citric acid, tartaric acid, tannic acid, pamoic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalene mono- or disulfonic acids, polygalacturonic acid, and the like; (b) a salt with a polyvalent metal cation such as zinc, calcium, bismuth, barium, magnesium, aluminum, copper, cobalt, nickel, cadmium, and the like, or with an organic cation formed from, for example, N,N'-dibenzylethylenediamine or ethylenediamine; or (c) combinations of (a) and (b), for example, a zinc tannate salt. Additionally, a composition provided herein, preferably a relatively insoluble salt such as those already described, may be formulated into a gel, for example, an aluminum monostearate gel with, for example, sesame oil, suitable for injection. Particularly preferred salts are zinc salts, zinc tannate salts, pamoate salts, and the like. Another type of slow-release depot formulation for injection would contain the compound or salt dispersed or encapsulated in a non-antigenic, non-toxic, slowly degrading polymer, such as a polylactic acid/polyglycolic acid polymer, for example, as described in U.S. Patent No. 3,773,919. The compounds, or preferably relatively insoluble salts, such as those described above, may also be formulated in silastic cholesterol matrix pellets, particularly for use in animals. Additional slow-release implant or depot compositions, for example, liquid or gaseous liposomes, are known in the literature (U.S. Patent No. 5,770,222 and "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems," J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

[520] A faixa de pelo menos uma composição de anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo fornecida no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) inclui quantidades que rendem mediante a reconstituição, se em um sistema úmido/seco, concentrações a partir de cerca de 1,0 micrograma/ml a cerca de 1.000 mg/ml, embora concentrações mais baixas e mais altas sejam operacionais e sejam dependentes do veículo de entrega pretendido, por exemplo, formulações de solução irão se diferir de emplastro transdérmico, métodos de microbomba, osmóticos, transmucosa ou pulmonares.[520] The range of at least one MUC16 glycosylating antibody composition or antigen-binding fragment thereof provided herein (see, Section 0 and Section 0) includes amounts that yield upon reconstitution, if in a wet/dry system, concentrations from about 1.0 microgram/ml to about 1,000 mg/ml, although lower and higher concentrations are operational and are dependent on the intended delivery vehicle, e.g., solution formulations will differ from transdermal patch, micropump, osmotic, transmucosal, or pulmonary methods.

[521] Em certas modalidades, as composições fornecidas no presente documento compreendem pelo menos um dentre qualquer auxiliar adequado, tal como, porém sem limitação, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou similares. Em certas modalidades, os auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são preferenciais. Os exemplos não limitadores de e métodos para preparar tais soluções estéreis são bem conhecidos na técnica,tal como, porém sem limitação, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Mack Publishing Co. (Easton,Pa.) 1990. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser aqueles selecionados de maneira habitual que são adequados para o modo de administração, solubilidade e/ou estabilidade do anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento.[521] In certain embodiments, the compositions provided herein comprise at least one of any suitable auxiliary, such as, but not limited to, diluent, binder, stabilizer, buffers, salts, lipophilic solvents, preservative, adjuvant, or the like. In certain embodiments, pharmaceutically acceptable auxiliaries are preferred. Non-limiting examples of and methods for preparing such sterile solutions are well known in the art, such as, but not limited to, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Pharmaceutically acceptable carriers can be those selected in a customary manner that are suitable for the mode of administration, solubility, and/or stability of the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein.

[522] Em certas modalidades, as composições fornecidas no presente documento contêm um ou mais excipientes e/ou aditivos farmacêuticos. Os exemplos não limitadores de aditivos e excipientes farmacêuticos são proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivados, tais como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e similares; e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presente individualmente ou em combinação, que compreende isoladamente ou em combinação 1 a 99,99% em peso ou volume. Os exemplos não limitadores de excipientes de proteína incluem albumina sérica, tal como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e similares. Os exemplos não limitadores de componentes de aminoácido/anticorpo, que também podem funcionar em uma capacidade de tamponagem, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo e similares. Em certas modalidades, o aminoácido é glicina. Os exemplos não limitadores de excipientes de carboidrato incluem monossacarídeos, tais comofrutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e similares; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e similares; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e similares; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e similares. Em certas modalidades, o excipiente de carboidrato é manitol, trealose ou rafinose.[522] In certain embodiments, the compositions provided herein contain one or more pharmaceutical excipients and/or additives. Non-limiting examples of pharmaceutical additives and excipients are proteins, peptides, amino acids, lipids, and carbohydrates (e.g., sugars, including monosaccharides, di-, tri-, tetra-, and oligosaccharides; derived sugars, such as alditols, aldonic acids, esterified sugars, and the like; and polysaccharides or sugar polymers), which may be present individually or in combination, comprising alone or in combination 1 to 99.99% by weight or volume. Non-limiting examples of protein excipients include serum albumin, such as human serum albumin (HSA), recombinant human albumin (rHA), gelatin, casein, and the like. Non-limiting examples of amino acid/antibody components that may also function in a buffering capacity include alanine, glycine, arginine, betaine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, cysteine, lysine, leucine, isoleucine, valine, methionine, phenylalanine, aspartame, and the like. In certain embodiments, the amino acid is glycine. Non-limiting examples of carbohydrate excipients include monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose, and the like; disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, cellobiose, and the like; polysaccharides such as raffinose, melezitose, maltodextrins, dextrans, starches, and the like; and alditols, such as mannitol, xylitol, maltitol, lactitol, xylitol sorbitol (glucitol), myoinositol, and the like. In certain embodiments, the carbohydrate excipient is mannitol, trehalose, or raffinose.

[523] Em certas modalidades, uma composição fornecida no presente documento inclui um ou mais tampões ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de uma base ou ácido orgânico. Os exemplos não limitadores de tampões incluem sais de ácido orgânico, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glicônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Em certas modalidades, o tampão é um sal de ácido orgânico, tal como citrato. Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tampões, antioxidantes, conservantes, intensificadores, podem ser opcionalmente e de preferência adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é, de preferência, adicionado para fornecer controle de pH aperfeiçoado. As composições podem cobrir uma ampla gama de pHs, tal como a partir de cerca de pH 4 a cerca de pH 10 e faixas preferenciais de cerca de pH 5 a cerca de pH 9 e uma faixa da máxima preferência de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. De preferência, as composições fornecidas no presente documento têm pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. Os tampões preferenciais incluem tampões de fosfato, com a máxima preferência, fosfato de sódio, particularmente solução salina tamponada com fosfato (PBS).[523] In certain embodiments, a composition provided herein includes one or more buffers or a pH adjusting agent; typically, the buffer is a salt prepared from an organic acid or base. Non-limiting examples of buffers include organic acid salts, such as salts of citric acid, ascorbic acid, gluconic acid, carbonic acid, tartaric acid, succinic acid, acetic acid, or phthalic acid; Tris, tromethamine hydrochloride, or phosphate buffers. In certain embodiments, the buffer is an organic acid salt, such as citrate. Other excipients, e.g., isotonicity agents, buffers, antioxidants, preservatives, enhancers, may optionally and preferably be added to the diluent. An isotonicity agent, such as glycerin, is commonly used at known concentrations. A physiologically tolerated buffer is preferably added to provide improved pH control. The compositions can cover a wide range of pHs, such as from about pH 4 to about pH 10, and preferred ranges from about pH 5 to about pH 9, and a most preferred range from about 6.0 to about 8.0. Preferably, the compositions provided herein have a pH between about 6.8 and about 7.8. Preferred buffers include phosphate buffers, most preferably sodium phosphate, particularly phosphate-buffered saline (PBS).

[524] Em certas modalidades, uma composição fornecida no presente documento inclui um ou mais excipientes/aditivos poliméricos, tais como, por exemplo, polivinil pirrolidonas, ficolls (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil-.beta.- ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes flavorizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antistáticos, tensoativos (por exemplo, polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (por exemplo, fosfolipídios, ácidos graxos), esteroides (por exemplo, colesterol) e/ou agentes quelantes (por exemplo, EDTA).[524] In certain embodiments, a composition provided herein includes one or more polymeric excipients/additives, such as, for example, polyvinyl pyrrolidones, ficolls (a polymeric sugar), dextrates (e.g., cyclodextrins, such as 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin), polyethylene glycols, flavoring agents, antimicrobial agents, sweeteners, antioxidants, antistatic agents, surfactants (e.g., polysorbates, such as "TWEEN 20" and "TWEEN 80"), lipids (e.g., phospholipids, fatty acids), steroids (e.g., cholesterol), and/or chelating agents (e.g., EDTA).

[525] Outros aditivos, tais como um solubilizante farmaceuticamente aceitável como Tween 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxietileno (20) sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno) e PEG (polietileno glicol) ou tensoativos não iônicos, tais como polissorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, Pluronic.RTM. polióis, outros copolímeros de bloco e quelantes, tais como EDTA e EGTA, podem ser opcionalmente adicionados às composições para reduzir a agregação. Esses aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico for usado para administrar a composição. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável atenua a propensão para a proteína se agregar.[525] Other additives, such as a pharmaceutically acceptable solubilizer such as Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate), Tween 80 (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate), Pluronic F68 (block copolymers of polyoxyethylene and polyoxypropylene) and PEG (polyethylene glycol), or nonionic surfactants such as polysorbate 20 or 80 or poloxamer 184 or 188, Pluronic.RTM. polyols, other block copolymers, and chelators such as EDTA and EGTA, may optionally be added to the compositions to reduce aggregation. These additives are particularly useful if a pump or plastic container is used to administer the composition. The presence of a pharmaceutically acceptable surfactant attenuates the propensity for the protein to aggregate.

[526] Excipientes e/ou aditivos farmacêuticos adicionais adequados para o uso em uma composição fornecida no presente documento são conhecidos por aqueles versados na técnica e são mencionados, por exemplo, em "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a edição, Williams & Williams, (1995), e na "Physician's Desk Reference", 52a edição, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), que estão incorporados ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. Em certas modalidades preferenciais, os materiais de excipiente ou carreador são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos.[526] Additional pharmaceutical excipients and/or additives suitable for use in a composition provided herein are known to those skilled in the art and are mentioned, for example, in "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th edition, Williams & Williams, (1995), and in the "Physician's Desk Reference", 52nd edition, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), which are incorporated herein by reference in their entirety. In certain preferred embodiments, the excipient or carrier materials are carbohydrates (e.g., saccharides and alditols) and buffers (e.g., citrate) or polymeric agents.

[527] De preferência, o diluente aquoso compreende, ainda, opcionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Os conservantes preferenciais incluem aqueles selecionados a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos. A concentração de conservante usado na composição é uma concentração suficiente para render um efeito antimicrobiano. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são prontamente determinadas pelo versado na técnica.[527] Preferably, the aqueous diluent optionally further comprises a pharmaceutically acceptable preservative. Preferred preservatives include those selected from the group consisting of phenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, chlorocresol, benzyl alcohol, alkylparaben (methyl, ethyl, propyl, butyl, and the like), benzalkonium chloride, benzethonium chloride, sodium dehydroacetate, and thimerosal, or mixtures thereof. The concentration of preservative used in the composition is a concentration sufficient to render an antimicrobial effect. Such concentrations are dependent on the preservative selected and are readily determined by one skilled in the art.

[528] As composições fornecidas no presente documento podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) e um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno, (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. A mistura do pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento e conservante em um diluente aquoso é realizada com o uso de procedimentos de mistura e dissolução convencionais. Para preparar uma composição adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento em solução tamponada é combinada com o conservante desejado em uma solução tamponada em quantidades suficientes para fornecer o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento e conservante nas concentrações desejadas. As composições fornecidas no presente documento podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presentedocumento e um tampão selecionado, de preferência, um tampão de fosfato que contém solução salina ou um sal escolhido. A mistura do pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento e tampão em um diluente aquoso é realizada com o uso de procedimentos de mistura e dissolução convencionais. Para preparar uma composição adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento em água ou tampão é combinada com o agente tampão desejado em água em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o tampão nas concentrações desejadas. As variações desses processos seriam reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem que os componentes são adicionados, se forem usados aditivos adicionais, a temperatura e pH nos quais a composição é preparada, são, todos, fatores que podem ser otimizados para a concentração e meio de administração usado. 5.4.1 Formulações parenterais[528] The compositions provided herein may be prepared by a process comprising mixing at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) and a preservative selected from the group consisting of phenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, chlorocresol, benzyl alcohol, alkylparaben, (methyl, ethyl, propyl, butyl, and the like), benzalkonium chloride, benzethonium chloride, sodium dehydroacetate, and thimerosal, or mixtures thereof in an aqueous diluent. Mixing the at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein and preservative in an aqueous diluent is accomplished using conventional mixing and dissolution procedures. To prepare a suitable composition, for example, a measured amount of at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein in buffered solution is combined with the desired preservative in a buffered solution in quantities sufficient to provide the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein and preservative at the desired concentrations. The compositions provided herein can be prepared by a process comprising mixing at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein and a selected buffer, preferably a phosphate buffer containing saline or a selected salt. Mixing the at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein and buffer in an aqueous diluent is accomplished using conventional mixing and dissolution procedures. To prepare a suitable composition, for example, a measured amount of at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein in water or buffer is combined with the desired buffering agent in water in quantities sufficient to provide the protein and buffer at the desired concentrations. Variations in these processes would be recognized by those skilled in the art. For example, the order in which the components are added, whether additional additives are used, and the temperature and pH at which the composition is prepared are all factors that can be optimized for the concentration and administration medium used. 5.4.1 Parenteral Formulations

[529] Em certas modalidades, uma composição fornecida no presente documento é formulada para a administração parenteral injetável. Para uso na presente invenção, o termo “parenteral” inclui intravenoso, intravascular, intramuscular, intradérmico, subcutâneo e intraocular. Para administração parenteral, a composição pode ser formulada como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação, ou separadamente fornecida com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Os exemplos não limitadores de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, glicerol, etanol e albumina sérica humana a 1 a 10%. Os lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixos, também podem ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas adequadas ou conhecidas.[529] In certain embodiments, a composition provided herein is formulated for injectable parenteral administration. As used herein, the term “parenteral” includes intravenous, intravascular, intramuscular, intradermal, subcutaneous, and intraocular. For parenteral administration, the composition may be formulated as a solution, suspension, emulsion, or lyophilized powder in association with, or separately provided with, a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle. Non-limiting examples of such vehicles are water, saline, Ringer's solution, dextrose solution, glycerol, ethanol, and 1-10% human serum albumin. Liposomes and non-aqueous vehicles, such as fixed oils, may also be used. The vehicle or lyophilized powder may contain additives that maintain isotonicity (e.g., sodium chloride, mannitol) and chemical stability (e.g., buffers and preservatives). The formulation is sterilized by suitable or known techniques.

[530] Os carreadores farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences,A. Osol, um texto de referência padrão nesse campo.[530] Suitable pharmaceutical carriers are described in the most recent edition of Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, a standard reference text in this field.

[531] As formulações para administração parenteral podem conter como excipientes comuns água estéril ou solução salina, polialquileno glicóis, tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e similares. As suspensões oleosas ou aquosas para injeção podem ser preparadas com o uso de um emulsificante ou umidificador adequado e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Os agentes para a injeção podem ser um agente diluente administrável de maneira não oral e não tóxico, tal como solução aquosa ou uma suspensão ou solução injetável estéril em um solvente. Como o veículo ou solvente utilizável, a água, solução de Ringer, solução salina isotônica, etc. são permitidos; como um solvente comum, ou solvente de suspensão, o óleo não volátil estéril podeser usado. Para esses propósitos, qualquer tipo de óleo não volátil e ácido graxo pode ser usado, incluindo ácidos graxos ouóleos graxos naturais, sintéticos ou semissintéticos; mono, di ou triglicerídeos naturais, sintéticos ou semissintéticos. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, porém sem limitação, meios convencionais de injeções, um dispositivode injeção sem agulha pressurizado a gás, conforme descrito napatente n° U.S. 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser conforme descrito na patente n° U.S. 5.839.446 incorporadas em sua totalidade ao presente documento, a título de referência. 5.4.2 Formulações pulmonares[531] Formulations for parenteral administration may contain as common excipients sterile water or saline solution, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, vegetable oils, hydrogenated naphthalenes, and the like. Oily or aqueous suspensions for injection may be prepared using a suitable emulsifier or wetting agent and a suspending agent, according to known methods. The agents for injection may be a non-orally administrable and non-toxic diluent, such as an aqueous solution, or a sterile injectable suspension or solution in a solvent. Water, Ringer's solution, isotonic saline, etc., are permitted as the usable vehicle or solvent; sterile non-volatile oil may be used as a common solvent or suspension solvent. For these purposes, any type of non-volatile oil and fatty acid may be used, including natural, synthetic, or semi-synthetic fatty acids or fatty oils; natural, synthetic, or semi-synthetic mono-, di-, or triglycerides. Parenteral administration is known in the art and includes, but is not limited to, conventional means of injection, a gas-pressurized needleless injection device as described in U.S. Patent No. 5,851,198, and a laser piercing device as described in U.S. Patent No. 5,839,446, which are incorporated in their entirety herein by reference. 5.4.2 Pulmonary Formulations

[532] Em certas modalidades, uma composição que compreendeum anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) é formulada para administração pulmonar. Para administração pulmonar, a composição é entregue em um tamanho de partícula eficaz para alcançar as vias aéreas inferiores do pulmão ou seios paranasais. As composições para administração pulmonar podem ser entregues por qualquer um dentre uma variedade de dispositivos nasais ou de inalação conhecidos na técnica para a administração de um agente terapêutico por inalação. Esses dispositivos com capacidade para depositar formulações aerossolizadas na cavidade do seio paranasal ou alvéolos de um paciente incluem inalador de dosagem medida, nebulizadores, geradores de pó seco, aspersores e similares. Outros dispositivos adequados para direcionar a administração pulmonar ou nasal de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documentotambém são conhecidos na técnica. Todos tais dispositivos usamformulações adequadas para a administração para a dispensação de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento em um aerossol. Tais aerossóis podem ser compreendidos de soluções (tanto aquosas como não aquosas) ou partículas sólidas. Os inaladores de dosagem medida como o inalador de dosagem medida Ventolin®, tipicamente usam um gás propelente e exigem a atuação durante a inspiração (Consulte, por exemplo, os documentos sob os nos WO 94/16970, WO 98/35888). Os inaladores de pó seco comoTurbuhaler™ (Astra), Rotahaler®. (Glaxo), Diskus® (Glaxo),dispositivos comercializados pela Inhale Therapeutics, para citar alguns, usam atuação por sopro/sucção de um pó misturado (patente n° U.S. 4.668.218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, patente n° U.S. 5.458.135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, incorporados ao presente documento a título de referência, em sua totalidade). Os nebulizadores como o nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt) e o nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (patente n° U.S. 5.404.871 Aradigm, WO 97/22376), as referências acima integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência, produzem aerossóis a partir de soluções, enquanto os inaladores de dosagem medida, inaladores de pó seco, etc. geram aerossóis de partícula pequena. Tais exemplos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis são exemplos não limitadores não destinados a serem limitadores em escopo.[532] In certain embodiments, a composition comprising a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) is formulated for pulmonary administration. For pulmonary administration, the composition is delivered in a particle size effective to reach the lower airways of the lung or paranasal sinuses. Compositions for pulmonary administration can be delivered by any of a variety of nasal or inhalation devices known in the art for administering a therapeutic agent by inhalation. Such devices capable of depositing aerosolized formulations into the paranasal sinus cavity or alveoli of a patient include metered dose inhalers, nebulizers, dry powder generators, sprayers, and the like. Other devices suitable for directing pulmonary or nasal administration of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein are also known in the art. All such devices use formulations suitable for administration for the delivery of a MUC16 glycosylating antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein in an aerosol. Such aerosols may be comprised of solutions (both aqueous and non-aqueous) or solid particles. Metered dose inhalers such as the Ventolin® metered dose inhaler typically use a propellant gas and require actuation during inspiration (See, for example, documents under nos. WO 94/16970, WO 98/35888). Dry powder inhalers such as Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler®. (Glaxo), Diskus® (Glaxo), devices marketed by Inhale Therapeutics, to name a few, use actuation by blowing/sucking a mixed powder (U.S. Patent No. 4,668,218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, U.S. Patent No. 5,458,135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, incorporated herein by reference in their entirety). Nebulizers such as the Ultravent® nebulizer (Mallinckrodt) and the Acorn II® nebulizer (Marquest Medical Products) (U.S. Patent No. 5,404,871 Aradigm, WO 97/22376), the above references fully incorporated herein by reference, produce aerosols from solutions, while metered dose inhalers, dry powder inhalers, etc. generate small particle aerosols. Such examples of commercially available inhalation devices are non-limiting examples and are not intended to be limiting in scope.

[533] Em certas modalidades, uma aspersão que compreende um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) pode ser produzida forçando-se uma suspensão ou solução de pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento através de um bocal sob pressão. O tamanho e configuração do bocal, a pressão aplicada e a taxa de alimentação de líquido podem ser escolhidas para obter saída e tamanho de partícula desejados. Uma eletroaspersão pode ser produzida, por exemplo, por um campo magnético em conjunto com uma alimentação por bocal ou capilar. Vantajosamente, as partículas de uma composição que compreende pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento entregue por um aspersor têm um tamanho de partícula menor que cerca de 10 um, de preferência, na faixa de cerca de 1 um a cerca de 5 um e, com amáxima preferência, cerca de 2 um a cerca de 3 um.[533] In certain embodiments, a spray comprising a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) can be produced by forcing a suspension or solution of at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein through a nozzle under pressure. The size and configuration of the nozzle, the applied pressure, and the liquid feed rate can be chosen to achieve desired output and particle size. An electrospray can be produced, for example, by a magnetic field in conjunction with a nozzle or capillary feed. Advantageously, particles of a composition comprising at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein delivered by a sprayer have a particle size of less than about 10 µm, preferably in the range of about 1 µm to about 5 µm, and most preferably about 2 µm to about 3 µm.

[534] As formulações de uma composição que compreende pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) adequadas para o uso com um aspersor incluem tipicamente o pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento em uma solução aquosa a uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg por ml de solução ou mg/gm, ou qualquer faixa ou valor na mesma, por exemplo, porém sem limitação, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/ml ou mg/gm. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para estabilização da composição de anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteína de volume ou um carboidrato. As proteínas de volume úteis na formulação de tal composição incluem albumina, protamina ou similares. Os carboidratos típicos úteis na formulação de proteínas de composição de anticorpo incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similares. A composição também pode incluir um tensoativo, que pode reduzir ou impedir a agregação induzida por superfície da composição causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Diversos tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como álcoois e ésteres de ácido graxo de polioxietileno e ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitol. As quantidades irão se situar, em geral, na faixa entre 0,001 e 14% em peso da formulação. Os tensoativos preferenciais são monooleato de polioxietileno sorbitano, polissorbato 80, polissorbato 20 ou similares.[534] Formulations of a composition comprising at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) suitable for use with a sparger typically include the at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein in an aqueous solution at a concentration of about 0.1 mg to about 100 mg per ml of solution or mg/gm, or any range or value therein, for example, but not limited to, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 mg/ml or mg/gm. The formulation may include agents such as an excipient, a buffer, an isotonicity agent, a preservative, a surfactant, and preferably zinc. The formulation may also include an excipient or agent for stabilizing the MUC16 glycosylating antibody composition or antigen-binding fragment thereof, such as a buffer, a reducing agent, a bulking protein, or a carbohydrate. Bulking proteins useful in formulating such a composition include albumin, protamine, or the like. Typical carbohydrates useful in formulating antibody composition proteins include sucrose, mannitol, lactose, trehalose, glucose, or the like. The composition may also include a surfactant, which can reduce or prevent surface-induced aggregation of the composition caused by atomization of the solution to form an aerosol. Various conventional surfactants may be used, such as polyoxyethylene fatty acid alcohols and esters, and polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters. The amounts will generally range from 0.001 to 14% by weight of the formulation. Preferred surfactants are polyoxyethylene sorbitan monooleate, polysorbate 80, polysorbate 20, or similar.

[535] Em certas modalidades, a composição é administrada por meio de um nebulizador, tal como nebulizador a jato ou um nebulizador ultrassônico. Tipicamente, em um nebulizador a jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar em alta velocidade através de um orifício. À medida que o gás se expande atrás do bocal, é criada uma região de baixa pressão que retira uma solução de proteína de composição de anticorpo composição através de um tubo capilar até um reservatório para líquidos. O fluxo de líquido a partir do tubo capilar é submetido ao cisalhamento em gotículas e filamentos instáveis à medida que o mesmo sai do tubo, criando o aerossol. Uma faixa de configurações, taxas de fluxo e tipos de defletor pode ser empregada para alcançar as características de desempenho desejadas a partir de um determinado nebulizador a jato. Em um nebulizador ultrassônico, a energia elétrica de alta frequência é usada para criar energia mecânica vibratória, empregando tipicamente um transdutor piezelétrico. Essa energia é transmitida para a formulação de proteína de composição de anticorpo diretamente ou através de um fluido de acoplamento, criando um aerossol que inclui a proteína de composição de anticorpo. Vantajosamente, as partículas da proteína de composição de anticorpo entregues por um nebulizador têm um tamanho de partícula menor que cerca de 10 um, de preferência, na faixa de cerca de 1 um a cerca de 5 um e, com a máxima preferência, cerca de 2 um a cerca de 3 um.[535] In certain embodiments, the composition is administered via a nebulizer, such as a jet nebulizer or an ultrasonic nebulizer. Typically, in a jet nebulizer, a compressed air source is used to create a high-velocity jet of air through an orifice. As the gas expands behind the nozzle, a low-pressure region is created that draws a solution of the antibody composition protein through a capillary tube into a liquid reservoir. The liquid stream from the capillary tube is sheared into unstable droplets and filaments as it exits the tube, creating the aerosol. A range of settings, flow rates, and baffle types can be employed to achieve the desired performance characteristics from a given jet nebulizer. In an ultrasonic nebulizer, high-frequency electrical energy is used to create vibratory mechanical energy, typically employing a piezoelectric transducer. This energy is transmitted to the antibody composition protein formulation directly or through a coupling fluid, creating an aerosol containing the antibody composition protein. Advantageously, the antibody composition protein particles delivered by a nebulizer have a particle size of less than about 10 μm, preferably in the range of about 1 μm to about 5 μm, and most preferably about 2 μm to about 3 μm.

[536] Em certas modalidades, a composição é administrada por meio de um inalador de dosagem medida (MDI), em que um propelente, pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0), e quaisquer excipientes ou outros aditivos são contidos em uma lata como uma mistura que inclui um gás comprimido liquefeito. A atuação da válvula de medição libera a mistura matriz como um aerossol, de preferência, que contém partículas na faixa de tamanho menor que cerca de 10 um, de preferência, cerca de 1 um a cerca de 5 um e, com a máxima preferência, cerca de 2 um a cerca de 3 um. O tamanho de partícula de aerossol desejado pode ser obtido empregando-se uma formulação de proteína de composição de anticorpo produzida por diversos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo moagem a jato, secagem por aspersão, condensação de ponto crítico ou similares. Os inaladores de dosagem medida preferenciais incluem aqueles fabricados pela 3M ou Glaxo e que empregam um propelente à base de hidrofluorocarboneto.[536] In certain embodiments, the composition is administered via a metered dose inhaler (MDI), wherein a propellant, at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0), and any excipients or other additives are contained in a canister as a mixture that includes a liquefied compressed gas. Actuation of the metering valve releases the matrix mixture as an aerosol, preferably containing particles in the size range of less than about 10 µm, preferably about 1 µm to about 5 µm, and most preferably about 2 µm to about 3 µm. The desired aerosol particle size can be achieved by employing an antibody composition protein formulation produced by various methods known to those of skill in the art, including jet milling, spray drying, critical point condensation, or the like. Preferred metered-dose inhalers include those manufactured by 3M or Glaxo and employing a hydrofluorocarbon-based propellant.

[537] As formulações de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) para o uso com um dispositivo de inalador de dosagem medida irá, em geral, incluir um pó finamente dividido que contém pelo menos um anticorpo Anti-IL-6 como uma suspensão em um meio não aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para esse propósito, tal como clorofluorocarboneto, um hidroclorofluorocarboneto, um hidrofluorocarboneto ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano,diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2- tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227) ou similares. De preferência, o propelente é um hidrofluorocarboneto. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar o pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento como uma suspensão no propelente, para proteger o agente ativo contra degradação química e similares. Os tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ácido oleico ou similares. Emalguns casos, os aerossóis de solução são preferenciais com ouso de solventes, tais como etanol. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína também podem ser incluídos na formulação.5.4.3 Formulações orais[537] Formulations of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see Section 0 and Section 0) for use with a metered dose inhaler device will generally include a finely divided powder containing at least one Anti-IL-6 antibody as a suspension in a non-aqueous medium, e.g., suspended in a propellant with the aid of a surfactant. The propellant may be any conventional material employed for this purpose, such as a chlorofluorocarbon, a hydrochlorofluorocarbon, a hydrofluorocarbon, or a hydrocarbon, including trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethanol, and 1,1,1,2-tetrafluoroethane, HFA-134a (hydrofluoroalkane-134a), HFA-227 (hydrofluoroalkane-227), or the like. Preferably, the propellant is a hydrofluorocarbon. The surfactant may be chosen to stabilize the at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein as a suspension in the propellant, to protect the active agent from chemical degradation and the like. Suitable surfactants include sorbitan trioleate, soy lecithin, oleic acid, or the like. In some cases, solution aerosols are preferred using solvents such as ethanol. Additional agents known in the art for protein formulation may also be included in the formulation. 5.4.3 Oral Formulations

[538] Em certas modalidades, uma composição fornecida no presente documento é formulada para a administração oral. Em certas modalidades, para a administração oral, as composições e métodos para administrar pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento dependem da coadministração de adjuvantes, tais como, por exemplo, resorcinóis e tensoativos não iônicos, tais como éter oleílico de polioxietileno e n- hexadecilpolietileno éter, pra aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como a coadministração de inibidores enzimáticos, tais como, por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) e trasilol, para inibir a degradação enzimática. O composto constituinte ativo da forma de dosagem do tipo sólida para administração oral pode ser misturado com pelo menos um aditivo, incluindo sacarose, lactose, celulose, manitol, trealose, rafinose, maltitol, dextrano, amidos, ágar, alginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semissintético e glicerídeo. Essas formas de dosagem também podem conter outro tipo (ou tipos) de aditivos, tais como, por exemplo, agente diluente inativo, lubrificante, tal como estearato de magnésio, parabeno, agente conservante, tal como ácido sórbico, ácido ascórbico ou alfa-tocoferol, antioxidante, tal como cisteína, desintegrante, aglutinante, espessante, agente tampão, agente adoçante, agente flavorizante, agente perfumante, etc.[538] In certain embodiments, a composition provided herein is formulated for oral administration. In certain embodiments, for oral administration, the compositions and methods for administering at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein rely on the co-administration of adjuvants, such as, for example, resorcinols and nonionic surfactants, such as polyoxyethylene oleyl ether and n-hexadecylpolyethylene ether, to artificially increase the permeability of the intestinal walls, as well as the co-administration of enzyme inhibitors, such as, for example, pancreatic trypsin inhibitors, diisopropylfluorophosphate (DFF), and trasylol, to inhibit enzymatic degradation. The active constituent compound of the solid dosage form for oral administration may be mixed with at least one additive, including sucrose, lactose, cellulose, mannitol, trehalose, raffinose, maltitol, dextran, starches, agar, alginates, chitins, chitosans, pectins, gum tragacanth, gum arabic, gelatin, collagen, casein, albumin, synthetic or semi-synthetic polymer, and glyceride. These dosage forms may also contain other types of additives, such as, for example, an inactive diluent, a lubricant such as magnesium stearate, a paraben, a preservative such as sorbic acid, ascorbic acid, or alpha-tocopherol, an antioxidant such as cysteine, a disintegrant, a binder, a thickener, a buffering agent, a sweetening agent, a flavoring agent, a perfuming agent, etc.

[539] Em certas modalidades, os comprimidos e pílulas para administração oral podem ser adicionalmente processados em preparações com revestimento entérico. Em certas modalidades, as preparações líquidas para administração oral incluem, por exemplo, emulsão, xarope, elixir, suspensão e preparações de solução permissíveis para uso médico. Essas preparações podem conter agentes diluentes inativos normalmente usados no dito campo, por exemplo, água. As preparações de lipossoma podem ser usadas para preparações de administração oral, por exemplo, conforme descrito para insulina e heparina (patente n° U.S. 4.239.754). Adicionalmente, as microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos misturados (proteinoides) podem ser usadas na administração oral de produtos farmacêuticos, por exemplo, conforme descrito na patente n° U.S. 4.925.673. Adicionalmente, os compostos carreadores, tais como aqueles descritos na patente n° U.S. 5.879.681 e patente n° U.S. 5.871.753, são usados na administração oral de agentes biologicamente ativos.5.4.4 Formulações para mucosa[539] In certain embodiments, tablets and pills for oral administration may be further processed into enteric-coated preparations. In certain embodiments, liquid preparations for oral administration include, for example, emulsion, syrup, elixir, suspension, and solution preparations permissible for medical use. Such preparations may contain inactive diluent agents commonly used in said field, for example, water. Liposome preparations may be used for oral administration preparations, for example, as described for insulin and heparin (U.S. Patent No. 4,239,754). Additionally, microspheres of artificial polymers of mixed amino acids (proteinoids) may be used in the oral administration of pharmaceuticals, for example, as described in U.S. Patent No. 4,925,673. Additionally, carrier compounds, such as those described in U.S. Patent No. 5,879,681 and U.S. Patent No. 5,871,753, are used in the oral administration of biologically active agents.5.4.4 Mucosal Formulations

[540] Em certas modalidades, uma composição fornecida no presente documento é formulada para absorção através de superfícies mucosas. Em certas modalidades, para absorção através de membranas mucosas, as composições e métodos para administrar pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 oufragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presentedocumento (consulte, Seção 0 e Seção 0) incluem uma emulsão que compreende uma pluralidade de partículas em submícrons, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo e uma fase contínua aquosa, que promove a absorção através de superfícies mucosas alcançando-se a mucoadesão das partículas de emulsão (patente n° U.S. 5.514.670). As superfícies mucosas adequadas para aplicação das emulsões fornecidas no presente documento podem incluir, por exemplo, vias de administração por córnea, conjuntiva, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. As formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquileno glicóis, vaselina, manteiga de cacau e similares. As formulações para administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose ou podem ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Para administração bucal, os excipientes incluem, por exemplo, açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado e similares (patente n° U.S. 5.849.695).5.4.5 Formulações transdérmicas[540] In certain embodiments, a composition provided herein is formulated for absorption through mucosal surfaces. In certain embodiments, for absorption through mucous membranes, the compositions and methods for administering at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) include an emulsion comprising a plurality of submicron particles, a mucoadhesive macromolecule, a bioactive peptide, and an aqueous continuous phase, which promotes absorption through mucosal surfaces by achieving mucoadhesion of the emulsion particles (U.S. Patent No. 5,514,670). Suitable mucosal surfaces for application of the emulsions provided herein can include, for example, corneal, conjunctival, buccal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonary, stomach, intestinal, and rectal routes of administration. Formulations for vaginal or rectal administration, e.g., suppositories, may contain excipients such as polyalkylene glycols, petrolatum, cocoa butter, and the like. Formulations for intranasal administration may be solid and contain excipients such as lactose, or may be aqueous or oily solutions of nasal drops. For buccal administration, excipients include, e.g., sugars, calcium stearate, magnesium stearate, pregelatinized starch, and the like (U.S. Patent No. 5,849,695). 5.4.5 Transdermal Formulations

[541] Em certas modalidades, uma composição fornecida no presente documento é formulada para administração transdérmica. Em certas modalidades, para administração transdérmica, a composição compreende pelo menos um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) encapsulado em um dispositivo de entrega, tal como, por exemplo, um lipossoma ou nanopartículas poliméricas, micropartícula, microcápsula ou microesferas (mencionada coletivamente como micropartículas, exceto onde mencionado em contrário). Vários dispositivos adequados são conhecidos para a administração transdérmica, incluindo micropartículas produzidas a partir de polímeros sintéticos, tais como poli-hidroxi ácidos, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico e copolímeros dos mesmos, poliortoésteres, polianidridos e polifosfazenos, e polímeros naturais, tais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos, e combinações dos mesmos (patente n° U.S. 5.814.599).5.4.6 Kits[541] In certain embodiments, a composition provided herein is formulated for transdermal administration. In certain embodiments, for transdermal administration, the composition comprises at least one MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) encapsulated in a delivery device, such as, for example, a liposome or polymeric nanoparticle, microparticle, microcapsule, or microsphere (collectively referred to as microparticles, except where otherwise mentioned). Various suitable devices are known for transdermal administration, including microparticles produced from synthetic polymers such as polyhydroxy acids such as polylactic acid, polyglycolic acid and copolymers thereof, polyorthoesters, polyanhydrides, and polyphosphazenes, and natural polymers such as collagen, polyamino acids, albumin and other proteins, alginate and other polysaccharides, and combinations thereof (U.S. Patent No. 5,814,599).5.4.6 Kits

[542] Também são fornecidos no presente documento kits que compreendem um ou mais anticorpos descritos no presente documento, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade específica, é fornecido no presente documento um kit ou embalagem farmacêutica que compreende um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais ingredientes das composições farmacêuticas descritas no presente documento, tais como um ou mais anticorpos ou um fragmento de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, os kits contêm uma composição farmacêutica descrita no presente documento e um agente terapêutico ou profilático.[542] Also provided herein are kits comprising one or more antibodies described herein, or antigen-binding fragments thereof, or conjugates thereof. In a specific embodiment, provided herein is a pharmaceutical kit or package comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions described herein, such as one or more antibodies or an antigen-binding fragment thereof described herein. In some embodiments, the kits contain a pharmaceutical composition described herein and a therapeutic or prophylactic agent.

[543] Um aviso pode ser opcionalmente associado a tal recipiente (ou recipientes), na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou produtos biológicos, uma forma de dosagem e/ou instruções para o uso dos mesmos. Em certas modalidades, as instruções incluídas com o kit fornecem orientação em relação às quantidades de dosagem e/ou regimes de dosagem para administração da composição (ou composições) farmacêutica.[543] A warning may optionally be associated with such container(s), in the form prescribed by a government agency regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, a dosage form, and/or instructions for use thereof. In certain embodiments, the instructions included with the kit provide guidance regarding dosage amounts and/or dosage regimens for administration of the pharmaceutical composition(s).

[544] Os exemplos de materiais para embalagem farmacêutica incluem, porém sem limitação, blisters, garrafas, pacotes, sachês, tubos, inaladores, bombas, sacolas, frascos, recipientes, seringas e qualquer material para embalagem adequado para uma composição farmacêutica selecionada e modo pretendido de administração e tratamento.[544] Examples of pharmaceutical packaging materials include, but are not limited to, blisters, bottles, packets, sachets, tubes, inhalers, pumps, bags, vials, containers, syringes, and any packaging material suitable for a selected pharmaceutical composition and intended mode of administration and treatment.

[545] Os kits fornecidos no presente documento podem incluir adicionalmente dispositivos que são usados para administrar os ingredientes ativos. Os exemplos de tais dispositivos incluem, porém sem limitação, seringas, injetores sem agulha, bolsas para gotejamento, emplastros e inaladores.[545] The kits provided herein may additionally include devices that are used to administer the active ingredients. Examples of such devices include, but are not limited to, syringes, needle-free injectors, drip bags, patches, and inhalers.

[546] Os kits fornecidos no presente documento podem incluir adicionalmente veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados para administrar os ingredientes. Por exemplo, se um ingrediente for fornecido em uma forma sólida que precisa ser reconstituída para administração parenteral, o kit pode compreender um recipiente vedado de um veículo adequado em que o ingrediente pode ser dissolvido para formar uma solução estéril isenta de particulado que é adequada para administração parenteral ou pode ser reconstituída como uma suspensão para administração oral. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação: veículos aquosos incluindo, porém sem limitação, água para injeção USP, injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose, injeção de dextrose e cloreto de sódio e injeção de Ringer lactada; veículos miscíveis em água incluindo, porém sem limitação, álcool etílico, polietileno glicol e polipropileno glicol; e veículos não aquosos incluindo, porém sem limitação, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila e benzoato de benzila.5.5 Usos e métodos5.5.1 Métodos e usos terapêuticos[546] The kits provided herein may additionally include pharmaceutically acceptable carriers that may be used to administer the ingredients. For example, if an ingredient is provided in a solid form that needs to be reconstituted for parenteral administration, the kit may comprise a sealed container of a suitable carrier in which the ingredient may be dissolved to form a sterile, particulate-free solution that is suitable for parenteral administration or may be reconstituted as a suspension for oral administration. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to: aqueous vehicles including, but not limited to, Water for Injection USP, Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Dextrose Injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection, and Lactated Ringer's Injection; water-miscible carriers including, but not limited to, ethyl alcohol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol; and non-aqueous vehicles including, but not limited to, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzyl benzoate.5.5 Uses and Methods5.5.1 Therapeutic Uses and Methods

[547] Em certas modalidades, são fornecidos no presente documento métodos para o tratamento de um câncer em um indivíduo, em particular, um câncer positivo para MUC16 em um indivíduo, que compreende administrar, ao indivíduo que necessite desse tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0 e Seção 0). Em uma modalidade específica, o indivíduo é um indivíduo conforme descrito na Seção 0. Em uma modalidade específica, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é administrado em uma dose conforme descrito na Seção 0. Em uma modalidade específica, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é administrado de acordo com um método conforme descrito na Seção 0. Em uma modalidade específica, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é administrado em combinação com um ou mais agentes farmaceuticamente ativos adicionais conforme descrito na Seção 0.[547] In certain embodiments, provided herein are methods for treating a cancer in a subject, in particular, a MUC16-positive cancer in a subject, comprising administering to the subject in need of such treatment a therapeutically effective amount of a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0 and Section 0). In a specific embodiment, the subject is a subject as described in Section 0. In a specific embodiment, the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof is administered in a dose as described in Section 0. In a specific embodiment, the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof is administered according to a method as described in Section 0. In a specific embodiment, the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof is administered in combination with one or more additional pharmaceutically active agents as described in Section 0.

[548] Para uso de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento do mesmo em um indivíduo de uma espécie particular, é usado um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento do mesmo que se liga a MUC16 daquela espécie particular. Por exemplo, para tratar um ser humano, é usado um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que se liga a MUC16 humano. Em uma modalidade específica, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo é uma imunoglobulina.[548] For use of a MUC16 glycosylation antibody or fragment thereof in an individual of a particular species, a MUC16 glycosylation antibody or fragment thereof that binds to MUC16 of that particular species is used. For example, to treat a human, a MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to human MUC16 is used. In a specific embodiment, the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof is an immunoglobulin.

[549] Além disso, para uso de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento do mesmo em um indivíduo de uma espécie particular, o anticorpo de glicosilação de MUC16, de preferência, a região constante de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é derivado a partir daquela espécie particular. Por exemplo, para tratar um ser humano, o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento do mesmo pode compreender um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que é uma imunoglobulina, em que a imunoglobulina compreende uma região constante humana. Em uma modalidade específica, o indivíduo é um ser humano.[549] Furthermore, for use of a MUC16 glycosylating antibody or fragment thereof in an individual of a particular species, the MUC16 glycosylating antibody, preferably the constant region of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, is derived from that particular species. For example, for treating a human, the MUC16 glycosylating antibody or fragment thereof may comprise a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof that is an immunoglobulin, wherein the immunoglobulin comprises a human constant region. In a specific embodiment, the individual is a human.

[550] Em uma modalidade específica, o câncer positivo para MUC16 é câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de trompa de falópio, câncer uterino (por exemplo, endometrial), câncer de peritônio primário ou câncer de qualquer outro tecido que expressa o receptor de MUC16.[550] In a specific embodiment, the MUC16-positive cancer is ovarian cancer, lung cancer, pancreatic cancer, breast cancer, fallopian tube cancer, uterine (e.g., endometrial) cancer, primary peritoneal cancer, or cancer of any other tissue that expresses the MUC16 receptor.

[551] Em modalidades específicas, o tratamento pode ser para obter resultados clínicos desejados ou benéficos incluindo, porém sem limitação, alívio de um sintoma, diminuição da extensão de uma doença, estabilização (isto é, não piora) do estado de uma doença, retardamento ou desaceleração da progressão de doença, melhora ou paliação do estado doentio e remissão (parcial ou total), se detectável ou indetectável. Em uma modalidade específica, "tratamento" também pode ser para prolongar a sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada mediante o não recebimento de tratamento. Em modalidades específicas, a administração de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento, ou uma composição farmacêutica descrita no presente documento, a um indivíduo com câncer (por exemplo, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de trompa de falópio, câncer uterino (por exemplo, endometrial) ou câncer de peritônio primário, ou câncerde qualquer outro tecido que expressa o receptor de MUC16) obtém pelo menos um, dois, três, quatro ou mais dentre os seguintes efeitos: (i) a redução ou melhora da gravidade de um ou maissintomas de câncer; (ii) a redução na duração de um ou mais sintomas associados ao câncer; (iii) a prevenção na recorrênciade um sintoma associado ao câncer; (iv) a redução na hospitalização de um indivíduo; (v) uma redução na duração dehospitalização; (vi) o aumento na sobrevivência de um indivíduo; (vii) a otimização ou aperfeiçoamento do efeito terapêutico de uma outra terapia; (viii) a inibição do desenvolvimento ou início de um ou mais sintomas associados ao câncer; (ix) a redução no número de sintomas associados ao câncer; (x) aperfeiçoamento na qualidade de vida conforme avaliado por métodos bem conhecidos na técnica; (x) inibição da recorrência de um tumor; (xi) a regressão de tumores e/ou um ou mais sintomas associados aos mesmos; (xii) a inibição da progressão de tumores e/ou um ou mais sintomas associados aos mesmos; (xiii) uma redução no crescimento de um tumor; (xiv) uma diminuição no tamanho do tumor (por exemplo, volume ou diâmetro); (xv) uma redução na formação de um tumor recém-formado; (xvi) prevenção, erradicação, remoção ou controle de tumores primários, regionais e/ou metastáticos; (xvii) uma diminuição no número ou tamanho de metástases; (xviii) uma redução em mortalidade; (xix) um aumento em sobrevivência isenta de recidiva; (xx) o tamanho do tumor é mantido e não aumenta ou aumenta menos que o aumento de um tumor após a administração de uma terapia padrão, conforme medido por métodos convencionais disponíveis para um versado na técnica, tal como imageamento por ressonância magnética (IRM), IRM otimizada por contraste dinâmico (DCE-MRI), raio X, e varredura por tomografia computadorizada (CT), ou uma varredura por tomografia de emissão de pósitrons (PET); e/ou (xxi) um aumento na duração da remissão em pacientes. O tratamento pode ser para obter um ou mais dentre os mencionados anteriormente.5.5.2 Usos para diagnóstico[551] In specific embodiments, treatment may be to achieve desired or beneficial clinical outcomes including, but not limited to, alleviating a symptom, decreasing the extent of a disease, stabilizing (i.e., not worsening) a disease state, slowing or decelerating disease progression, improving or palliating the disease state, and remission (partial or complete), whether detectable or undetectable. In a specific embodiment, "treatment" may also be to prolong survival compared to the survival expected from receiving no treatment. In specific embodiments, administration of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or a pharmaceutical composition described herein, to a subject with cancer (e.g., ovarian cancer, lung cancer, pancreatic cancer, breast cancer, fallopian tube cancer, uterine (e.g., endometrial) cancer, or primary peritoneal cancer, or cancer of any other tissue expressing the MUC16 receptor) achieves at least one, two, three, four, or more of the following effects: (i) reducing or ameliorating the severity of one or more cancer symptoms; (ii) reducing the duration of one or more cancer-associated symptoms; (iii) preventing the recurrence of a cancer-associated symptom; (iv) reducing the hospitalization of a subject; (v) reducing the duration of hospitalization; (vi) increasing the survival of a subject; (vii) optimizing or improving the therapeutic effect of another therapy; (viii) the inhibition of the development or onset of one or more cancer-associated symptoms; (ix) the reduction in the number of cancer-associated symptoms; (x) improvement in quality of life as assessed by methods well known in the art; (x) inhibition of tumor recurrence; (xi) the regression of tumors and/or one or more symptoms associated therewith; (xii) the inhibition of tumor progression and/or one or more symptoms associated therewith; (xiii) a reduction in tumor growth; (xiv) a decrease in tumor size (e.g., volume or diameter); (xv) a reduction in the formation of a newly formed tumor; (xvi) prevention, eradication, removal, or control of primary, regional, and/or metastatic tumors; (xvii) a decrease in the number or size of metastases; (xviii) a reduction in mortality; (xix) an increase in relapse-free survival; (xx) the tumor size is maintained and does not increase or increases less than the increase in tumor size after administration of standard therapy, as measured by conventional methods available to one of skill in the art, such as magnetic resonance imaging (MRI), dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI), X-ray, and computed tomography (CT) scan, or a positron emission tomography (PET) scan; and/or (xxi) an increase in the duration of remission in patients. Treatment may be to obtain one or more of the foregoing.5.5.2 Diagnostic Uses

[552] Em certas modalidades, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos (consulte, Seção 0 e Seção 0) descritos no presente documento podem ser usados para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar uma condição descrita no presente documento (por exemplo, uma condição que envolve células de câncer positivas para MUC16). Em certas modalidades, os anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno do mesmo para uso em propósitos de diagnóstico são identificados conforme descrito na Seção 0.[552] In certain embodiments, the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof (see, Section 0 and Section 0) described herein can be used for diagnostic purposes to detect, diagnose, or monitor a condition described herein (e.g., a condition involving MUC16-positive cancer cells). In certain embodiments, the MUC16 glycosylation antibodies or antigen-binding fragments thereof for use in diagnostic purposes are identified as described in Section 0.

[553] Em certas modalidades, são fornecidos no presente documento métodos para a detecção de uma condição descrita no presente documento que compreende (a) avaliar a expressão de MUC16 ou um fragmento do mesmo em células ou uma amostra de tecido de um indivíduo com o uso de um ou mais anticorpos de glicosilação de MUC16 ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos descritos no presente documento; e (b) comparar o nível de expressão de MUC16 ou do fragmento do mesmo com um nível de controle, por exemplo, níveis em amostras de tecido normal (por exemplo, a partir de um indivíduo que não tem uma condição descrita no presente documento, ou a partir do mesmo paciente antes do início da condição), de modo que um aumento ou diminuição no nível avaliado da expressão de MUC16 ou do fragmento do mesmo em comparação com o nível de controle de expressão de MUC16 ou do fragmento do mesmo seja indicativo de uma condição descrita no presente documento.[553] In certain embodiments, provided herein are methods for detecting a condition described herein comprising (a) assessing the expression of MUC16 or a fragment thereof in cells or a tissue sample from a subject using one or more MUC16 glycosylating antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein; and (b) comparing the level of expression of MUC16 or the fragment thereof to a control level, e.g., levels in normal tissue samples (e.g., from a subject who does not have a condition described herein, or from the same patient prior to the onset of the condition), such that an increase or decrease in the assessed level of expression of MUC16 or the fragment thereof compared to the control level of expression of MUC16 or the fragment thereof is indicative of a condition described herein.

[554] Os anticorpos descritos no presente documento podem ser usados para avaliar os níveis de MUC16 ou um fragmento domesmo em uma amostra biológica com o uso de métodosimunoistológicos clássicos conforme descrito no presente documento ou conforme conhecido por aqueles elementos versados na técnica (por exemplo, consulte Jalkanen et al., 1985, J. Cell.Biol. 101:976 a 985; e Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol.105:3.087 a 3.096). Outros métodos à base de anticorpo úteis para detectar a expressão de genes de proteína incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). As identificações de ensaio de anticorpo adequadas são conhecidas na técnica e incluem identificações de enzima, tais como, glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (121In) e tecnécio (99Tc); identificações luminescentes, tais como luminol; e identificaçõesfluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.[554] The antibodies described herein can be used to assess the levels of MUC16 or a fragment thereof in a biological sample using classical immunohistological methods as described herein or as known to those skilled in the art (e.g., see Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; and Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Other antibody-based methods useful for detecting protein gene expression include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). Suitable antibody assay labels are known in the art and include enzyme labels such as glucose oxidase; radioisotopes, such as iodine (125I, 121I), carbon (14C), sulfur (35S), tritium (3H), indium (121In), and technetium (99Tc); luminescent labels, such as luminol; and fluorescent labels, such as fluorescein and rhodamine, and biotin.

[555] Em certas modalidades, o monitoramento de uma condição descrita no presente documento (por exemplo, um câncer positivo para MUC16), é realizado mediante a repetição do método para diagnosticar durante um período de tempo após o diagnóstico inicial.[555] In certain embodiments, monitoring for a condition described herein (e.g., a MUC16-positive cancer) is accomplished by repeating the method to diagnose over a period of time after the initial diagnosis.

[556] A presença da molécula identificada pode ser detectada no indivíduo com o uso de métodos conhecidos na técnica para varredura in vivo. Os elementos versados na técnica terão capacidade para determinar o método adequado para detectar uma identificação particular. Os métodos e dispositivos que podem ser usados nos métodos de diagnóstico da invenção incluem, porém sem limitação, tomografia computadorizada (CT), varredura de corpo inteiro, tal como tomografia de emissão de pósitrons (PET), imageamento por ressonância magnética (IRM) e sonografia.5.5.3 Doses e regimes[556] The presence of the identified molecule can be detected in the individual using methods known in the art for in vivo scanning. Those skilled in the art will be able to determine the appropriate method for detecting a particular identification. Methods and devices that can be used in the diagnostic methods of the invention include, but are not limited to, computed tomography (CT), whole-body scanning such as positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI), and sonography. 5.5.3 Doses and Regimens

[557] Um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (consulte, Seção 0 e Seção 0), ou composição (consulte, Seção 0), ou células que expressam os anticorpos, ou fragmentos de ligação com antígeno do mesmo, descritos no presente documento podem ser entregues a um indivíduo por uma variedade de vias. Essas incluem, porém sem limitação, via parenteral, intranasal, intratraqueia, oral, intradérmica, tópica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa, intratumoral, conjuntiva e subcutânea. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, com o uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de aerossolização para o uso como uma aspersão. Em uma modalidade, um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou uma composição descrita no presente documento é administrado de maneira parenteral a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo conforme descrito na Seção 0). Em uma modalidade específica, a dita administração parenteral é intravenosa, intramuscular ou subcutânea.[557] A MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof (see, Section 0 and Section 0), or composition (see, Section 0), or cells expressing the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, described herein can be delivered to a subject by a variety of routes. These include, but are not limited to, parenteral, intranasal, intratracheal, oral, intradermal, topical, intramuscular, intraperitoneal, transdermal, intravenous, intratumoral, conjunctival, and subcutaneous routes. Pulmonary administration can also be employed, for example, with the use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent for use as a spray. In one embodiment, a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, or a composition described herein is administered parenterally to a subject (e.g., a subject as described in Section 0). In a specific modality, said parenteral administration is intravenous, intramuscular or subcutaneous.

[558] A quantidade de um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou composição que será eficaz no tratamento e/ou prevenção de uma condição dependerá da natureza da doença e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.[558] The amount of a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, or composition that will be effective in treating and/or preventing a condition will depend on the nature of the disease and can be determined by standard clinical techniques.

[559] A dose precisa a ser empregada em uma composição também dependerá da via de administração, e do tipo de câncer, e deve ser decidida de acordo com o discernimento do profissional e circunstâncias de cada indivíduo. Por exemplo, as doses eficazes também podem variar dependendo do meio de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente (incluindo idade, peso corporal e saúde), se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados ou se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são tituladas de maneira ideal para otimizar a segurança e eficácia.[559] The precise dose to be employed in a composition will also depend on the route of administration and the type of cancer, and should be decided according to the practitioner's judgment and each individual's circumstances. For example, effective doses may also vary depending on the route of administration, target site, the patient's physiological status (including age, body weight, and health), whether the patient is human or animal, other medications administered, or whether the treatment is prophylactic or therapeutic. Treatment dosages are optimally titrated to optimize safety and efficacy.

[560] Em certas modalidades, um ensaio in vitro é empregado para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste de modelo in vitro ou animal.[560] In certain embodiments, an in vitro assay is employed to help identify optimal dosage ranges. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.

[561] Para um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, a dosagem pode se situar na faixa a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais normalmente 0,01 a 15 mg/kg, do peso corporal do paciente. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg ou, em outras palavras, 70 mg ou 700 mg ou dentro da faixa de 70 a 700 mg, respectivamente, para um paciente de 70 kg. Em geral, os anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos a partir de outras espécies devido à resposta imunológica aos polipeptídeos estranhos. Dessa forma, as dosagens menores de anticorpos humanos e administração menos frequente são muitas vezes possíveis.[561] For a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof, the dosage may be in the range of about 0.0001 to 100 mg/kg, and more typically 0.01 to 15 mg/kg, of the patient's body weight. For example, dosages may be 1 mg/kg of body weight, 10 mg/kg of body weight, or within the range of 1 to 10 mg/kg, or in other words, 70 mg or 700 mg, or within the range of 70 to 700 mg, respectively, for a 70 kg patient. In general, human antibodies have a longer half-life within the human body than antibodies from other species due to the immune response to foreign polypeptides. Thus, lower dosages of human antibodies and less frequent administration are often possible.

[562] Em certas modalidades, tais como na administração de células manipuladas que expressam os anticorpos ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, ou CARs, um indivíduo é administrado a uma faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células, tais como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhões de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dentre os valores mencionados anteriormente), tais como cerca de 10 milhões a cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhõesde células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhõesde células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dentre osvalores mencionados anteriormente), e, em alguns casos, cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhõesde células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 milhõesde células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhõesde células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhõesde células) ou qualquer valor entre essas faixas. Em algumas modalidades, a dose de células totais e/ou dose de subpopulações individuais de células se situa em uma faixa entre ou cerca de 104 e em ou cerca de 109 células/quilogramas (kg) de peso corporal, tal como entre 105 e 106 células/kg de peso corporal, por exemplo, em ou cerca de 1 x 105 células/kg, 1,5 x 105 células/kg, 2 x 105 células/kg, ou 1 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg ou 10 x 106 células/kg de peso corporal. Por exemplo, em algumas modalidades, as células são administradas em ou dentro de uma determinada faixa de erro de, entre ou cerca de 104 e em ou cerca de 109 células T/quilogramas (kg) de peso corporal, tal como entre 105 e 107 células T/kg de peso corporal.[562] In certain embodiments, such as in the administration of engineered cells expressing the antibodies or antigen-binding fragments thereof, or CARs, a subject is administered a range of from about one million to about 100 billion cells, such as, for example, 1 million to about 50 billion cells (e.g., about 5 million cells, about 25 million cells, about 500 million cells, about 1 billion cells, about 5 billion cells, about 20 billion cells, about 30 billion cells, about 40 billion cells, or a range defined by any two of the foregoing values), such as about 10 million to about 100 billion cells (e.g., about 20 million cells, about 30 million cells, about 40 million cells, about 60 million cells, about 70 million cells, about 80 million cells, about about 90 million cells, about 10 billion cells, about 25 billion cells, about 50 billion cells, about 75 billion cells, about 90 billion cells, or a range defined by any two of the foregoing values), and in some cases, about 100 million cells to about 50 billion cells (e.g., about 120 million cells, about 250 million cells, about 350 million cells, about 450 million cells, about 650 million cells, about 800 million cells, about 900 million cells, about 3 billion cells, about 30 billion cells, about 45 billion cells), or any value in between. In some embodiments, the dose of total cells and/or dose of individual subpopulations of cells is in a range between or about 104 and at or about 109 cells/kilograms (kg) of body weight, such as between 105 and 106 cells/kg of body weight, for example, at or about 1 x 105 cells/kg, 1.5 x 105 cells/kg, 2 x 105 cells/kg, or 1 x 106 cells/kg, 2 x 106 cells/kg, 5 x 106 cells/kg, or 10 x 106 cells/kg of body weight. For example, in some embodiments, the cells are administered at or within a certain error range of between or about 104 and at or about 109 T cells/kilograms (kg) of body weight, such as between 105 and 107 T cells/kg of body weight.

[563] Um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano ou 2 anos.5.5.4 Terapias de combinação[563] A MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof may be administered on multiple occasions. Intervals between single doses may be 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 6 months, 1 year, or 2 years.5.5.4 Combination therapies

[564] Em uma modalidade específica, os métodos fornecidos no presente documento para o tratamento de câncer (por exemplo, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de trompa de falópio, câncer uterino (por exemplo, endometrial) ou câncer de peritônio primário) em um indivíduo, que compreende administrar, a um indivíduo que necessite desse tratamento, uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0), compreendem adicionalmente administrar ao indivíduo um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em uma modalidade específica, o agente terapêutico adicional é para o tratamento do câncer no indivíduo (por exemplo, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de trompa de falópio, câncer uterino (porexemplo, endometrial) e câncer de peritônio primário). Em uma modalidade específica, o agente terapêutico adicional é para otratamento de quaisquer efeitos colaterais de tratamento com um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0).[564] In a specific embodiment, the methods provided herein for treating cancer (e.g., ovarian cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, fallopian tube cancer, uterine (e.g., endometrial) cancer, or primary peritoneal cancer) in a subject, comprising administering to a subject in need of such treatment a pharmaceutical composition comprising a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0), further comprise administering to the subject one or more additional therapeutic agents. In a specific embodiment, the additional therapeutic agent is for treating the cancer in the subject (e.g., ovarian cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, fallopian tube cancer, uterine (e.g., endometrial) cancer, and primary peritoneal cancer). In a specific embodiment, the additional therapeutic agent is for the treatment of any side effects of treatment with a MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment described herein (see, Section 0 and Section 0).

[565] Em uma modalidade, é administrado um primeiro anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1806 N-glicosilado, mas não compreende Asn1800 N- glicosilado (isto é, exige Asn1806 N-glicosilado, mas nãoAsn1800 N-glicosilado, para ligação a MUC16) em combinação com um segundo anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1806 N-glicosilado e também compreende Asn1800 N-glicosilado (isto é, ambos os locais N-glicosilados são parte do epítopo reconhecido pelo anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo). Tal primeiro anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser identificado por (i) sua habilidade em ligar imunoespecificamente a célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, tal primeira forma de MUC16 é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) sua falta de ligação imunoespecífica a uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, tal terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) sua habilidade em ligar imunoespecificamente uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, tal quarta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é SEQ ID NO: 152, em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma de MUC16 são do mesmo tipo de célula. Tal segundo anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente a uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, tal primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; e (ii) sua falta de ligação imunoespecífica a uma célula que expressa de maneira recombinante uma quinta forma de MUC16, tal quinta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quinta forma é SEQ ID NO: 172, em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16 é o mesmo tipo de célula que a célula que expressa de maneira recombinante a quinta forma de MUC16. A proteína codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 172 também é mencionada no presente documento como MUC16c114-N23. MUC16c114-N23 consiste nos 114 resíduos de aminoácido C-terminal de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150 que é a sequência de MUC16 maduro), exceto pelo fato de que as asparaginas nas posições de aminoácidos 24 e 30 (que correspondem a posições de aminoácidos Asn1800 e Asn1806 da SEQ ID NO: 150) foram submetidas à mutação em alaninas. Dessa forma, MUC16c114-N23 não tem capacidade para ser N-glicosilado nas posições de aminoácido 24 e 30 da SEQ ID NO: 172 (que corresponde às posições de aminoácidos Asn1800 e Asn1806 da SEQ ID NO: 150).[565] In one embodiment, a first MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1806 but does not comprise N-glycosylated Asn1800 (i.e., requires N-glycosylated Asn1806, but not N-glycosylated Asn1800, for binding to MUC16) is administered in combination with a second MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1806 and also comprises N-glycosylated Asn1800 (i.e., both N-glycosylated sites are part of the epitope recognized by the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof). Such a first MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof can be identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein such first form of MUC16 is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a third form of MUC16, wherein such third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its ability to immunospecifically bind a cell that recombinantly expresses a fourth form of MUC16, such fourth form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152, wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16, the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, and the cell that recombinantly expresses the fourth form of MUC16 are of the same cell type. Such a second MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof can be identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, such first form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; and (ii) its lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a fifth form of MUC16, such fifth form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fifth form is SEQ ID NO: 172, wherein the cell recombinantly expressing the first form of MUC16 is the same cell type as the cell recombinantly expressing the fifth form of MUC16. The protein encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 172 is also referred to herein as MUC16c114-N23. MUC16c114-N23 consists of the C-terminal 114 amino acid residues of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150 which is the sequence of mature MUC16), except that the asparagines at amino acid positions 24 and 30 (which correspond to amino acid positions Asn1800 and Asn1806 of SEQ ID NO: 150) have been mutated to alanines. Therefore, MUC16c114-N23 is incapable of being N-glycosylated at amino acid positions 24 and 30 of SEQ ID NO: 172 (which correspond to amino acid positions Asn1800 and Asn1806 of SEQ ID NO: 150).

[566] Em uma modalidade, é administrado um primeiro anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1806 N-glicosilado, mas não compreende Asn1800 N- glicosilado (isto é, exige Asn1806 N-glicosilado, mas não Asn1800 N-glicosilado, para ligação a MUC16) em combinação com um segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo que reconhece um epítopo em MUC16 que compreende Asn1800 N-glicosilado, mas não compreende Asn1806 N-glicosilado (isto é, exige Asn1800 N-glicosilado, mas não Asn1806 N-glicosilado, para ligação a MUC16). Tal primeiro anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser identificado por (i) sua habilidade em ligar imunoespecificamente a célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, tal primeira forma de MUC16 é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) sua falta de ligação imunoespecífica a uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, tal terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) sua habilidade em ligar imunoespecificamente uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, tal quarta forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é SEQ ID NO: 152, em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma de MUC16 são do mesmo tipo de célula. Tal segundo anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo pode ser identificado por (i) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente a uma célula que expressa de maneira recombinante uma primeira forma de MUC16, tal primeira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da primeira forma é SEQ ID NO: 133; (ii) sua habilidade em se ligar imunoespecificamente a uma célula que expressa de maneira recombinante uma terceira forma de MUC16, tal terceira forma é glicosilada, e em que a sequência de aminoácidos da terceira forma é SEQ ID NO: 139; e (iii) sua falta de ligação imunoespecífica a uma célula que expressa de maneira recombinante uma quarta forma de MUC16, tal quarta forma é glicosilada, em que a sequência de aminoácidos da quarta forma é SEQ ID NO: 152, em que a célula que expressa de maneira recombinante a primeira forma de MUC16, a célula que expressa de maneira recombinante a terceira forma de MUC16 e a célula que expressa de maneira recombinante a quarta forma de MUC16 são do mesmo tipo de célula.[566] In one embodiment, a first MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1806 but does not comprise N-glycosylated Asn1800 (i.e., requires N-glycosylated Asn1806, but not N-glycosylated Asn1800, for binding to MUC16) is administered in combination with a second antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes an epitope on MUC16 that comprises N-glycosylated Asn1800 but does not comprise N-glycosylated Asn1806 (i.e., requires N-glycosylated Asn1800, but not N-glycosylated Asn1806, for binding to MUC16). Such a first MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof can be identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell recombinantly expressing a first form of MUC16, wherein such first form of MUC16 is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its lack of immunospecific binding to a cell recombinantly expressing a third form of MUC16, wherein such third form is glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its ability to immunospecifically bind a cell that recombinantly expresses a fourth form of MUC16, such fourth form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152, wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16, the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, and the cell that recombinantly expresses the fourth form of MUC16 are of the same cell type. Such a second antibody or antigen-binding fragment thereof can be identified by (i) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a first form of MUC16, such first form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the first form is SEQ ID NO: 133; (ii) its ability to immunospecifically bind to a cell that recombinantly expresses a third form of MUC16, such third form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the third form is SEQ ID NO: 139; and (iii) its lack of immunospecific binding to a cell that recombinantly expresses a fourth form of MUC16, such fourth form being glycosylated, and wherein the amino acid sequence of the fourth form is SEQ ID NO: 152, wherein the cell that recombinantly expresses the first form of MUC16, the cell that recombinantly expresses the third form of MUC16, and the cell that recombinantly expresses the fourth form of MUC16 are of the same cell type.

[567] Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer de ovário. Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer pancreático. Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer de pulmão. Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer de mama. Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer de trompa de falópio. Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer uterino (por exemplo, endometrial). Em modalidades específicas, o agente adicional é um agente usado para tratar câncer de peritônio primário.[567] In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat ovarian cancer. In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat pancreatic cancer. In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat lung cancer. In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat breast cancer. In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat fallopian tube cancer. In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat uterine (e.g., endometrial) cancer. In specific embodiments, the additional agent is an agent used to treat primary peritoneal cancer.

[568] Um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) descrito no presente documento pode ser administrado com um agente terapêutico adicional concomitante ou sequencialmente (antes e/ou depois). O anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo e o agente terapêutico adicional pode ser administrado nas composições iguais ou diferentes e pelas vias de administração iguais ou diferentes. Uma primeira terapia (que é um anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0), ou o agente terapêutico adicional) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), de maneira concomitante com ou subsequente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas,8 semanas, ou 12 semanas depois da) administração da segunda terapia (o anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) descrita no presente documento, ouo agente terapêutico adicional) a um indivíduo com câncer (por exemplo, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de pulmão,câncer de mama, câncer de trompa de falópio, câncer uterino (por exemplo, endometrial) e câncer de peritônio primário). Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional administrado a um indivíduo em combinação com anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) é administrado na mesma composição (composição farmacêutica). Em outras modalidades, um agente terapêutico adicional administrado em combinação com anticorpo de glicosilação de MUC16 ou um fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) é administrado a um indivíduo em uma composição diferente do anticorpo de glicosilação de MUC16 ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo descrito no presente documento (consulte, Seção 0 e Seção 0) (por exemplo, duas ou mais composições farmacêuticas são usadas).5.5.5 POPULAÇÃO DE PACIENTE[568] A MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) described herein may be administered with an additional therapeutic agent concomitantly or sequentially (before and/or after). The antibody or antigen-binding fragment thereof and the additional therapeutic agent may be administered in the same or different compositions and by the same or different routes of administration. A first therapy (which is a MUC16 glycosylating antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0), or the additional therapeutic agent) may be administered prior to (e.g., 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks prior to), concomitantly with, or subsequent to (e.g., 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks prior to), or concomitantly with or subsequent to (e.g., 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks prior to), or concomitantly with, ... weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks after) administration of the second therapy (the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) described herein, or the additional therapeutic agent) to a subject with cancer (e.g., ovarian cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, fallopian tube cancer, uterine (e.g., endometrial) cancer, and primary peritoneal cancer). In certain embodiments, an additional therapeutic agent administered to a subject in combination with the MUC16 glycosylation antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) is administered in the same composition (pharmaceutical composition). In other embodiments, an additional therapeutic agent administered in combination with the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) is administered to a subject in a composition different from the MUC16 glycosylating antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (see, Section 0 and Section 0) (e.g., two or more pharmaceutical compositions are used).5.5.5 PATIENT POPULATION

[569] Um indivíduo tratado de acordo com os métodos fornecidos no presente documento pode ser qualquer mamífero, tal como um roedor, um gato, um canino, um cavalo, uma vaca, um porco, um macaco, um primata ou um ser humano, etc. Em uma modalidade preferencial, o indivíduo é um ser humano. Em uma outra modalidade preferencial, o indivíduo é um canino. Para uso no presente documento, os termos “indivíduo” e “paciente” são usados de forma intercambiável.[569] A subject treated according to the methods provided herein may be any mammal, such as a rodent, a cat, a canine, a horse, a cow, a pig, a monkey, a primate, or a human, etc. In a preferred embodiment, the subject is a human. In another preferred embodiment, the subject is a canine. For use herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably.

[570] Em certas modalidades, um indivíduo tratado de acordo com os métodos fornecidos no presente documento foi diagnosticado com um câncer positivo para MUC16, incluindo, porém sem limitação, câncer de ovário, pulmão, pâncreas, mama, uterino, de trompa de falópio ou peritônio primário ou câncer de qualquer outro tecido que expressa o MUC16.[570] In certain embodiments, a subject treated according to the methods provided herein has been diagnosed with a MUC16-positive cancer, including, but not limited to, ovarian, lung, pancreatic, breast, uterine, fallopian tube, or primary peritoneal cancer, or cancer of any other tissue that expresses MUC16.

[571] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação.[571] The following examples are offered by way of illustration and not by way of limitation.

6. Examples 6.1 Example 1: Expression of the carboxy-terminal portion of MUC16/CA125 induces tumor transformation and invasion 6.1.1 Introduction

[572] O antígeno CA125 sérico, um fragmento antigênico de MUC16, tem sido uma base do gerenciamento e avaliação de câncer de ovário desde o início da década de 1980, mas sua biologia econtribuição para as manifestações de câncer de ovário não têmsido entendidas de maneira satisfatória (consulte, Referências 1 a 3 conforme citado na Seção 0, abaixo). A clonagem de CA125, obtida em 2001, primeiro identificou MUC16 como uma mucina presa com um pequeno domínio intracelular, um domínio transmembranar, um ectodomínio próximo ao local de clivagem putativo, e uma região grande bastante glicosilada de 12 a 20 repetições em tandem, cada uma com 156 aminoácidos de comprimento (Figura 1A)(consulte, Referências 4 a 6 conforme citado na Seção 0, abaixo).Os cânceres serosos do ovário, trompa de falópio e útero muitas vezes expressam grandes quantidades de MUC16, e a expressão de MUC16 anormal pode ser encontrada em várias outras malignidades, incluindo cânceres do pulmão, pâncreas e mama. A expressão de outras mucinas presas é uma característica comum de órgãos epiteliais e são muitas vezes superexpressos em malignidade. Dois exemplos proeminentes são MUC1, que é superexpresso em muitos cânceres de ovário e mama, e MUC4, que é caracteristicamente abundante em cânceres pancreáticos e gastrointestinais (consulte, Referência 7 conforme citado na Seção 0, abaixo). Ambas dessas mucinas foram identificadas como tendo propriedades de transformação (consulte, Referências 8 e 9 conforme citado na Seção 0, abaixo). Os mecanismos de transformação são diferentes e compreendidos de maneira incompleta. MUC1 tem uma região de homologia de beta-cateninaque foi mostrada como translocando para o núcleo e agindo comoum fator de transcrição (consulte, Referências 10 e 11 conforme citado na Seção 0, abaixo). Em contraste, MUC4 tem domínios de ligação a HER dentro de sua região transmembranar e age, pelo menos em parte, através das quinases da família HER (consulte, Referências 12 e 13 conforme citado na Seção 0, abaixo). MUC16 carece de regiões homólogas a qualquer um desses domínios e parece ter evoluído de maneira independente (consulte, Referência 12 conforme citado na Seção 0, abaixo). Em comparação tanto com MUC1 como com MUC4, a expressão de MUC16 é mais restrita e é normalmente expressa, quase exclusivamente, no trato müllerianos e no epitélio ocular (consulte, Referências 14a 16 conforme citado na Seção 0, abaixo). As regiões de repetição em tandem da molécula de MUC16 parecem funcionar como proteínas de interação principais com mesotelina e outras proteínas estromais (consulte, Referência 17 conforme citado na Seção 0, abaixo). Essas interações são provavelmente responsáveis pelos padrões clássicos de espalhamento seroso por cânceres de ovário. Em ambientes clínicos, os altos níveis dos elementos circulantes a partir de MUC16, que codificam o antígeno CA125, estãoassociados a um resultado clínico adverso, independente doestágio, grau e outros fatores clínicos tradicionais (consulte, Referência 18 conforme citado na Seção 0, abaixo). Outros têm identificado o C-terminal de MUC16 como importante na invasão e crescimento, mas as regiões específicas da sequência de MUC16 proximal responsáveis pela transformação não foram descritas (consulte, por exemplo, Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434 a 443 e Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91 a 98). A amplificação de regiões genômicas que codificam MUC16 em DNA de câncer de ovário e superexpressão de mRNA de MUC16 tem sido observada no projeto de câncer de ovário do The Cancer Genome Atlas (TCGA) e está associada ao pior resultado (consulte, Referência 19 conforme citado na Seção 0, abaixo). A perda de MUC16 no camundongo não está associada a um fenótipo distinto, mas o efeito da expressão de MUC16 anormal oupersistente não é conhecido (consulte, Referência 20 conforme citado na Seção 0, abaixo). Os dados nesse exemplo mostram que a expressão dos 114 resíduos de aminoácido C-terminal de MUC16 (MUC16c114, SEQ ID NO: 133) e, em particular, a glicosilação deresíduo Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1806 de MUC16maduro (SEQ ID NO: 150)) está associada a alterações específicas de transdução de sinal, expressão de gene e comportamentobiológico agressivo.6.1.2 Materiais e métodos6.1.2.1 Síntese de terminação carbóxi de MUC16 (MUC16C114) e construtos de DNA de domínio de MUC16-CA125 (MUC16C344) e proteína de fusão glicosilada[572] Serum CA125 antigen, an antigenic fragment of MUC16, has been a cornerstone of ovarian cancer management and evaluation since the early 1980s, but its biology and contribution to ovarian cancer manifestations have not been satisfactorily understood (see References 1 to 3 as cited in Section 0, below). Cloning of CA125 in 2001 first identified MUC16 as a tethered mucin with a small intracellular domain, a transmembrane domain, an ectodomain near the putative cleavage site, and a large, heavily glycosylated region of 12 to 20 tandem repeats, each 156 amino acids long (Figure 1A) (see References 4–6 as cited in Section 0, below). Serous cancers of the ovary, fallopian tube, and uterus often express large amounts of MUC16, and abnormal MUC16 expression can be found in several other malignancies, including cancers of the lung, pancreas, and breast. Expression of other tethered mucins is a common feature of epithelial organs and are often overexpressed in malignancy. Two prominent examples are MUC1, which is overexpressed in many ovarian and breast cancers, and MUC4, which is characteristically abundant in pancreatic and gastrointestinal cancers (see Reference 7 as cited in Section 0, below). Both of these mucins have been identified as having transforming properties (see References 8 and 9 as cited in Section 0, below). The mechanisms of transformation are different and incompletely understood. MUC1 has a beta-catenin homology region that has been shown to translocate to the nucleus and act as a transcription factor (see References 10 and 11 as cited in Section 0, below). In contrast, MUC4 has HER-binding domains within its transmembrane region and acts, at least in part, through HER family kinases (see References 12 and 13 as cited in Section 0, below). MUC16 lacks regions homologous to any of these domains and appears to have evolved independently (see Reference 12 as cited in Section 0 below). Compared to both MUC1 and MUC4, MUC16 expression is more restricted and is normally expressed almost exclusively in the Müllerian tract and ocular epithelium (see References 14–16 as cited in Section 0 below). The tandem repeat regions of the MUC16 molecule appear to function as major interacting proteins with mesothelin and other stromal proteins (see Reference 17 as cited in Section 0 below). These interactions are likely responsible for the classic patterns of serosal spread from ovarian cancers. In clinical settings, high levels of circulating elements from MUC16, which encode the CA125 antigen, are associated with adverse clinical outcome, independent of stage, grade, and other traditional clinical factors (see Reference 18 as cited in Section 0 below). Others have identified the C-terminus of MUC16 as important in invasion and growth, but the specific regions of the proximal MUC16 sequence responsible for transformation have not been described (see, for example, Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434–443 and Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91–98). Amplification of genomic regions encoding MUC16 in ovarian cancer DNA and overexpression of MUC16 mRNA has been observed in The Cancer Genome Atlas (TCGA) ovarian cancer project and is associated with worse outcome (see, Reference 19 as cited in Section 0, below). Loss of MUC16 in the mouse is not associated with a distinct phenotype, but the effect of abnormal or persistent MUC16 expression is not known (see, Reference 20 as cited in Section 0, below). The data in this example show that expression of the C-terminal 114 amino acid residues of MUC16 (MUC16c114, SEQ ID NO: 133) and, in particular, glycosylation of residue Asn30 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)) is associated with specific alterations of signal transduction, gene expression, and aggressive biological behavior. 6.1.2 Materials and Methods 6.1.2.1 Synthesis of MUC16 Carboxy-Terminus (MUC16C114) and MUC16-CA125 Domain (MUC16C344) DNA Constructs and Glycosylated Fusion Protein

[573] Os construtos de DNA que codificam formas truncadas de MUC16 (designadas MUC16c344, MUC16c114, MUC16c80 e MUC16c86; Figura 1B e Figura 1C) foram gerados. Os locais de clonagem múltipla EcoRV e NotI do vetor phrGFP II-C (phrGFP) (Stratagene, LaJolla, CA) foram usados para incorporar DNAs de MUC16c114, MUC16c80,MUC16c86 e MUC16c344 para gerar construtos de fusão GFP foram obtidos com a proteína GFP presente na terminação carbóxi da proteína de fusão de MUC16 truncada. Os produtos de PCR para os fragmentos de MUC16 (MUC16c344, MUC16c114, MUC16c80 e MUC16c86) foram criados com o uso de DNA de pBK-CMV-MUC16-B53 como um modelo (Yin BWT, et al., International Journal of Cancer, 2002, 98(5):737 a 740), e os produtos de PCR foram purificados em um gel de agarose a 1%, sequenciados e inseridos nos locais declonagem múltipla EcoRV e NotI do vetor phrGFP II-C (phrGFP). O vetor pFUSE-hIgG1-Fc2 foi adquirido junto à InvivoGen (SanDiego, CA). Os iniciadores de reação em cadeia de polimerase(PCR) foram projetados para o ectodomínio MUC16c57-114 (da posição 1777 para 1834 da SEQ ID NO: 150) ou o domínio de ligação deaçúcar de sequências de DNA de 117-244LGALS3 foram sintetizados (Sigma-Genosys, The Woodlands, TX) com o sítio de enzima de restrição EcoRV como o iniciador direto e o sítio de enzima de restrição NcoI como o iniciador inverso. Os produtos de PCR para o fragmento de MUC16c57-114 foram criados com o uso de DNA de pBK- CMV-MUC16-B53 como um modelo e o clone de cDNA de LGALS3 (MGC:2058 IMAGE:3050135 GenBank: AAH01120.1; acesso ao DBSourceBC001120.2), que foi obtido junto à ATCC (Manassas, VA) foi usado como o modelo de DNA para sintetizar o domínio de ligação de açúcar do produto de PCR de LGALS3. Os produtos de PCR foram purificados em um gel de agarose a 1%, sequenciados e inseridos no vetor pFUSE-hIgG1-Fc2.6.1.2.2 Iniciadores e PCR[573] DNA constructs encoding truncated forms of MUC16 (designated MUC16c344, MUC16c114, MUC16c80, and MUC16c86; Figure 1B and Figure 1C) were generated. The EcoRV and NotI multiple cloning sites from the phrGFP II-C (phrGFP) vector (Stratagene, LaJolla, CA) were used to incorporate MUC16c114, MUC16c80, MUC16c86, and MUC16c344 DNAs to generate GFP fusion constructs. GFP protein was obtained with the GFP protein present at the carboxy terminus of the truncated MUC16 fusion protein. PCR products for MUC16 fragments (MUC16c344, MUC16c114, MUC16c80, and MUC16c86) were generated using pBK-CMV-MUC16-B53 DNA as a template (Yin BWT, et al., International Journal of Cancer, 2002, 98(5):737-740), and the PCR products were purified on a 1% agarose gel, sequenced, and inserted into the EcoRV and NotI multiple cloning sites of the phrGFP II-C vector (phrGFP). The pFUSE-hIgG1-Fc2 vector was purchased from InvivoGen (SanDiego, CA). Polymerase chain reaction (PCR) primers designed for the MUC16c57-114 ectodomain (from position 1777 to 1834 of SEQ ID NO: 150) or the sugar-binding domain of 117-244LGALS3 DNA sequences were synthesized (Sigma-Genosys, The Woodlands, TX) with the EcoRV restriction enzyme site as the forward primer and the NcoI restriction enzyme site as the reverse primer. PCR products for the MUC16c57-114 fragment were generated using pBK-CMV-MUC16-B53 DNA as a template, and the LGALS3 cDNA clone (MGC:2058 IMAGE:3050135 GenBank: AAH01120.1; DBSource accession BC001120.2), which was obtained from the ATCC (Manassas, VA), was used as the DNA template to synthesize the sugar-binding domain of the LGALS3 PCR product. The PCR products were purified on a 1% agarose gel, sequenced, and inserted into the pFUSE-hIgG1-Fc2 vector. 6.1.2.2 Primers and PCR

[574] Os iniciadores direto e inverso para domínio citoplasmático de MUC16 (MUC16c114, terminação carbóxi 114 aa) (5’-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGAACTTCTCGCCACTGGCT-3’ e 5’- TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3’, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122, respectivamente). MUC16c344 (uma repetição em tandem que tem apenas um laço de cisteína, 344 aa) (5’- CCATGCGATATCGCCACCATGGTGACAGGCCCTGGGCTGGACAGA-3’ e 5’- TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3’, SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 124, respectivamente) com EcoRV e KOZAK no iniciador direto e NotI no iniciador inverso. O construto de DNA de MUC16c114-GFP foi usado para criar construtos de MUC16c80 e MUC16c86 por iniciadores de mudança rápida. Os iniciadores direto e inverso para o vetor pFUSE-hIgG1-Fc2 de MUC16c57-114 (5'- CCATGCGATATCAAACTTCTCGCCACTGGCT-3’ e 5’- AGATCTAACCATGGGAAGGTCAGAATTCCCAGT-3’, SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126, respectivamente) e iniciadores direto e inverso para o domínio de ligação de açúcar de 117-244LGALS3 para o vetor pFUSE- hIgG1-Fc2 (5’-CATGCGATATCACCTTATAACCTGCCTTTG-3’e 5’- AGATCTAACCATGGTATATGAAGCACTGGT-3’, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 128, respectivamente) com EcoRV no iniciador direto e NcoI no iniciador inverso. Todos os iniciadores acima foram sintetizados por Sigma Genosys, The Woodlands, TX.[574] Forward and reverse primers for cytoplasmic domain of MUC16 (MUC16c114, carboxy-terminal 114 aa) (5’-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGAACTTCTCGCCACTGGCT-3’ and 5’-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3’, SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 122, respectively). MUC16c344 (a tandem repeat having only one cysteine loop, 344 aa) (5′-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGACAGGCCCTGGGCTGGACAGA-3′ and 5′-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3′, SEQ ID NO: 123 and SEQ ID NO: 124, respectively) with EcoRV and KOZAK in the forward primer and NotI in the reverse primer. The MUC16c114-GFP DNA construct was used to create MUC16c80 and MUC16c86 constructs by quick-change primers. The forward and reverse primers for MUC16c57-114 pFUSE-hIgG1-Fc2 vector (5′-CCATGCGATATCAAACTTCTCGCCACTGGCT-3′ and 5′-AGATCTAACCATGGGAAGGTCAGAATTCCCAGT-3′, SEQ ID NO: 125 and SEQ ID NO: 126, respectively) and forward and reverse primers for the sugar-binding domain of 117-244LGALS3 for pFUSE-hIgG1-Fc2 vector (5′-CATGCGATATCACCTTATAACCTGCCTTTG-3′ and 5′-AGATCTAACCATGGTATATGAAGCACTGGT-3′, SEQ ID NO: 127 and SEQ ID NO: 128, respectively) with EcoRV in the forward primer and NcoI in the reverse primer. All primers above were synthesized by Sigma Genosys, The Woodlands, TX.

[575] As condições de PCR foram alcançadas pelos processos a seguir: DNA foi fundido a 95 °C durante 5 minutos a fim de alcançar a desnaturação. Foram conduzidos trinta ciclos de repetição de aquecimento a 97 °C durante 30 segundos, anelamento a 60 °C durante 1 minuto e extensão a 72 °C durante 1 minuto. Isso foi seguido de uma extensão do filamento de produto de PCR gerado a 72 °C durante 5 minutos e, então, resfriado a 4 °C de um dia para o outro.[575] PCR conditions were achieved by the following processes: DNA was melted at 95 °C for 5 minutes to achieve denaturation. Thirty repeat cycles of heating at 97 °C for 30 seconds, annealing at 60 °C for 1 minute, and extension at 72 °C for 1 minute were conducted. This was followed by strand extension of the generated PCR product at 72 °C for 5 minutes and then cooling at 4 °C overnight.

[576] O DNA de vetor phrGFP II-C, DNAs purificados em gel de MUC16c114, MUC16c80, MUC16c86, MUC16c344 e MUC16c678 individualmente digeridos de um dia para o outro em banho de água a 37 °C com enzimas de restrição EcoRV e NotI (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA de vetor pFUSE-hIgG1-Fc2, DNAs purificados em gel de MUC16c57-114 e 117-244LGALS3 individualmente digeridos de um dia para o outro em banho de água a 37 °C com enzimas de restrição EcoRV e NcoI (New England Biolabs, Beverly, MA). Os DNAs digeridos por restrição de MUC16c114 e phrGFP; MUC16c344 e phrGFP; ou MUC16c678 e phrGFP foram purificados em gel e ligados de um dia para o outro com o uso de T4 Ligase (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). De modo similar, Os DNAs digeridos por restrição de MUC16c57-114 e pFUSE-hIgG1-Fc2; 117-244LGALS3 e pFUSE- hIgG1-Fc2 foram purificados em gel e ligados de um dia para o outro com o uso de T4 Ligase (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). O DNA ligado foi transformado em células super competentes XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) seguindo oprotocolo do fabricante e colocou-se as mesmas em placas de ágar com meio LB que contém canamicina (50 μg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para vetores phrGFP ou em placas de ágar com meio LB que contém 25 μg/ml de Zeocina (Invitrogen, CA). Os clonesforam selecionados no dia seguinte e Miniprep DNA foi extraído com o uso do sistema de purificação Wizard Plus Miniprep DNA (Promega Corporation, Madison, WI). O DNA de clones selecionados foi sequenciado na instalação central de sequenciamento de DNA do MSKCC com o uso de iniciadores direto e inverso de MUC16 e phrGFP para confirmar a presença de MUC16 e phrGFP nas sequências como construtos fundidos ou MUC16c57-114 e pFUSE-hIgG1-Fc2 ou 117- 244LGALS3 e pFUSE-hIgG1-Fc2. Megaprep DNA a partir de clones foi feito com o uso do sistema de purificação Wizard Plus Megaprep DNA (Promega Corporation, Madison, WI) que também foi confirmado acerca da presença de MUC16 e phrGFP ou MUC16c57-114 e pFUSE-hIgG1- Fc2 ou 117-244LGALS3 e pFUSE-hIgG1-Fc2 em suas sequências como construtos fundidos.6.1.2.3 Seleção de células ativadas por fluorescência (FACS)[576] The phrGFP II-C vector DNA, gel-purified DNAs of MUC16c114, MUC16c80, MUC16c86, MUC16c344, and MUC16c678 individually digested overnight in a 37°C water bath with restriction enzymes EcoRV and NotI (New England Biolabs, Beverly, MA). pFUSE-hIgG1-Fc2 vector DNA, gel-purified DNAs of MUC16c57-114 and 117-244LGALS3 individually digested overnight in a 37°C water bath with restriction enzymes EcoRV and NcoI (New England Biolabs, Beverly, MA). The restriction-digested DNAs of MUC16c114 and phrGFP; MUC16c344 and phrGFP; or MUC16c678 and phrGFP were gel purified and ligated overnight using T4 Ligase (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Similarly, restriction-digested DNAs of MUC16c57-114 and pFUSE-hIgG1-Fc2; 117-244LGALS3 and pFUSE-hIgG1-Fc2 were gel purified and ligated overnight using T4 Ligase (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). The ligated DNA was transformed into XL-1 Blue supercompetent cells (Stratagene, La Jolla, CA) following the manufacturer's protocol and plated on LB agar plates containing kanamycin (50 μg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) for phrGFP vectors or on LB agar plates containing 25 μg/ml Zeocin (Invitrogen, CA). Clones were selected the next day and Miniprep DNA was extracted using the Wizard Plus Miniprep DNA purification system (Promega Corporation, Madison, WI). DNA from selected clones was sequenced at the MSKCC DNA sequencing core facility using MUC16 and phrGFP forward and reverse primers to confirm the presence of MUC16 and phrGFP in the sequences as fused constructs or MUC16c57-114 and pFUSE-hIgG1-Fc2 or 117-244LGALS3 and pFUSE-hIgG1-Fc2. Megaprep DNA from clones was made using the Wizard Plus Megaprep DNA purification system (Promega Corporation, Madison, WI) which was also confirmed for the presence of MUC16 and phrGFP or MUC16c57-114 and pFUSE-hIgG1-Fc2 or 117-244LGALS3 and pFUSE-hIgG1-Fc2 in their sequences as fused constructs.6.1.2.3 Fluorescence-activated cell sorting (FACS)

[577] As células transfectadas foram tripsinizadas, lavadas e contadas por hemocitômetro. As células foram distribuídas em múltiplos tubos eppendorf com pelo menos 0,5 a 1 X 106/tubo. As células foram lavadas com PBS que contém 1% de FCS e 0,025% de azida de sódio (tampão de FACS). Para a coloração de FACS de superfície, as células foram incubadas sem (para o segundocontrole de anticorpo) ou com 1 μg/tubo de sobrenadantes biorreativos de monoclonais de terminação carbóxi de MUC16(4H11.2.5), camundongo anti-OC125 humano (M3519)(DakoCytomation, Dako North America Inc., Carpinteria, CA)durante 30 minutos no gelo. As células em tubos eppendorf também foram manchadas em superfície com 1 μg/tubo de anticorpos de camundongo de controle correlacionados a isótopo não específico (13C4 para IgG1 e 4E11 para monoclonais IgG2b obtidos a partir da instalação central monoclonal do MSKCC)(dados não mostrados) e incubadas em gelo durante 30 minutos. Todas as células foram lavadas 3 vezes com tampão de FACS. As células foram incubadas com 1 μg/tubo de segundo anticorpo de cabra anti-IgG1-PE ou IgG2b-PE de camundongo durante 30 minutos em gelo e, então, lavadas 3 vezes com tampão de FACS. As células foram analisadas por FACS Calibur. 6.1.2.4 Culturas celulares[577] Transfected cells were trypsinized, washed, and counted by hemocytometer. Cells were distributed into multiple eppendorf tubes with at least 0.5 to 1 X 106/tube. Cells were washed with PBS containing 1% FCS and 0.025% sodium azide (FACS buffer). For surface FACS staining, cells were incubated without (for the second antibody control) or with 1 μg/tube of bioreactive supernatants of MUC16 carboxy-terminal monoclonal antibodies (4H11.2.5), mouse anti-human OC125 (M3519) (DakoCytomation, Dako North America Inc., Carpinteria, CA) for 30 minutes on ice. Cells in Eppendorf tubes were also surface-stained with 1 μg/tube of nonspecific isotope-matched control mouse antibodies (13C4 for IgG1 and 4E11 for IgG2b monoclonals obtained from the MSKCC monoclonal core facility) (data not shown) and incubated on ice for 30 minutes. All cells were washed 3 times with FACS buffer. Cells were incubated with 1 μg/tube of goat anti-mouse IgG1-PE or IgG2b-PE second antibody for 30 minutes on ice and then washed 3 times with FACS buffer. Cells were analyzed by FACS Calibur. 6.1.2.4 Cell cultures

[578] As células NIH/3T3 (3T3) (fibroblastos) foram obtidas através da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), e as células A2780 são uma linhagem de células de carcinoma de ovário humano (consulte, Referência 28 conforme citado na Seção 0, abaixo). Ambas as linhagens de células foram mantidas de acordo com as condições publicadas. As linhagens de células positivas para MUC16 estáveis foram criadas pela transfecção de vetores de expressão de MUC16 (phrGFP-MUC16c344, phrGFP-MUC16c114, phrGFP-MUC16c80, e phrGFP-MUC16c86) e selecionadas com o uso de geneticina (G418, Invitrogen, Grand Island, NY) em seu respectivo meio de cultura e isoladas com base na expressão de proteína verde fluorescente (GFP). Os transfectantes de MUC16c114 têm expressão de superfície celular de proteína de MUC16 a partir do local de clivagem putativo para a terminação carbóxi (aminoácidos 1777 a 1890 da SEQ ID NO: 150) (consulte, Referência5 conforme citado na Seção 0, abaixo). As linhagens de células com fragmentos de MUC16 mais longos foram preparadas de uma maneira similar, incluindo linhagens com expressão de vetor de MUC16c344-GFP que têm expressão de superfície celular de proteína de MUC16 como um fragmento de aminoácido 344 que se estende até a terminação carbóxi de MUC16 (aminoácidos 1547 a 1890) (consulte, Referência 5 conforme citado na Seção 0, abaixo).6.1.2.5 Transfecção[578] NIH/3T3 (3T3) cells (fibroblasts) were obtained through the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), and A2780 cells are a human ovarian carcinoma cell line (see, Reference 28 as cited in Section 0, below). Both cell lines were maintained according to published conditions. Stable MUC16-positive cell lines were created by transfection of MUC16 expression vectors (phrGFP-MUC16c344, phrGFP-MUC16c114, phrGFP-MUC16c80, and phrGFP-MUC16c86) and selected using geneticin (G418, Invitrogen, Grand Island, NY) in their respective culture medium and isolated based on green fluorescent protein (GFP) expression. MUC16c114 transfectants have cell surface expression of MUC16 protein from the putative cleavage site to the carboxy terminus (amino acids 1777 to 1890 of SEQ ID NO: 150) (see, Reference 5 as cited in Section 0, below). Cell lines with longer MUC16 fragments were prepared in a similar manner, including lines with MUC16c344-GFP vector expression that have cell surface expression of MUC16 protein as a 344 amino acid fragment extending to the carboxy terminus of MUC16 (amino acids 1547 to 1890) (see, Reference 5 as cited in Section 0, below). 6.1.2.5 Transfection

[579] Todos os construtos foram introduzidos em células NIH/3T3 (3T3) e A2780 com o uso de DOTAP (Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN) seguindo o protocolo do fabricante. Os transfectantes estáveis foram selecionados com 400 μg/ml de G418 para células 3T3 e A2780 em seus respectivos meios de cultura. Os mesmos foram selecionados por célula duas vezes acerca da expressão de GFP na instalação central de citometria de fluxo do MSKCC (FCCF), e as células selecionadas foram cultivadas como linhagens por até 15 passagens. O monitoramento de rotina por meio de análise FACS foi feito para confirmar a positividade para GFP dessas linhagens. Os extratos de proteína dessas linhagens foram analisados por western blot com o uso de anticorpos monoclonais anti-hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA) e anti-terminação carbóxi de MUC16 (consulte, Referências 5 e 14 conforme citado na Seção 0, abaixo).6.1.2.6 Curvas de crescimento[579] All constructs were introduced into NIH/3T3 (3T3) and A2780 cells using DOTAP (Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN) following the manufacturer's protocol. Stable transfectants were selected with 400 μg/ml G418 for 3T3 and A2780 cells in their respective culture media. They were cell-selected twice for GFP expression at the MSKCC flow cytometry core facility (FCCF), and the selected cells were cultured as lines for up to 15 passages. Routine monitoring by FACS analysis was performed to confirm GFP positivity of these lines. Protein extracts from these lines were analyzed by western blot using anti-hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA) and anti-MUC16 carboxy terminus monoclonal antibodies (see References 5 and 14 as cited in Section 0, below).6.1.2.6 Growth Curves

[580] Mil células transfectadas estáveis/poço foram semeadas em 200 μl de meio de cultura/poço em múltiplas placas de fundo plano de 96 poços e incubadas a 37 °C e 5% de CO2 durante 5 dias. Todos os dias, placas cultivadas em triplicata foram desenvolvidas com 25 μl/poço de Alamar Blue (ABD Serotec Co. UK) e incubadas a 37 °C e 5% de CO2 durante 4 horas. As placas foram lidas no leitor de placa PerSeptive Biosystems CytoFluorMultiwell Fluorescent modelo no 4000 com excitação a 530 nM e emissão a 620 nM. As curvas de crescimento durante 4 dias foram registradas e os valores médios das placas em triplicata foram plotados consequentemente.6.1.2.7 Ensaio de ágar macio[580] One thousand stable transfected cells/well were seeded in 200 μl of culture medium/well in multiple 96-well flat-bottom plates and incubated at 37°C and 5% CO2 for 5 days. Every day, triplicate cultured plates were developed with 25 μl/well of Alamar Blue (ABD Serotec Co. UK) and incubated at 37°C and 5% CO2 for 4 hours. Plates were read on a PerSeptive Biosystems CytoFluorMultiwell Fluorescent plate reader model no. 4000 with excitation at 530 nM and emission at 620 nM. Growth curves for 4 days were recorded, and mean values of triplicate plates were plotted accordingly.6.1.2.7 Soft agar assay

[581] As células transfectadas estáveis foram colocadas em uma suspensão de agarose e colocadas em placas sobre uma camada de agarose fina e analisadas acerca de sua habilidade para formar colônias independentes de ancoragem. Um a cinco milhões de células em 10 ml de suspensão de meio-agarose foram colocadas em placas por prato e incubadas a 37 °C e 5% de CO2. As placas foram monitoradas acerca da formação de colônia. O meio de cultura adicional foi sobreposto a cada 4 a 5 dias. Após 11 a 14 dias de cultura, as colônias foram enumeradas e as imagens das colônias foram tomadas.6.1.2.8 Transfecção em vetores de expressão eucarióticos[581] Stably transfected cells were plated in an agarose suspension and plated on a thin agarose layer and analyzed for their ability to form anchorage-independent colonies. One to five million cells in 10 ml of agarose medium suspension were plated per dish and incubated at 37 °C and 5% CO2. Plates were monitored for colony formation. Additional culture medium was overlaid every 4 to 5 days. After 11 to 14 days of culture, colonies were enumerated and colony images were taken. 6.1.2.8 Transfection into eukaryotic expression vectors

[582] Os construtos MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2 e 117- 244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 foram transfectados separadamente em células 293F FreeStyle de rim embrionário humano (HEK) (Invitrogen, CA) que expressam e secretam proteínas de fusão em meios sem soro. Três géis de SDS-PAGE a 10% foram executados com 5 μg/faixa de sobrenadantes de proteína de fusão a partir de células HEK 293F transfectadas transitórias com vetor vazio de controle pFUSE- hIgG1-Fc2, vetor MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2 e vetor LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2. Um gel foi diretamente manchado com reagente Gelcode, de acordo com o protocolo do fabricante. As proteínas a partir de dois géis foram transferidas em duas membranas de nitrocelulose que foram bloqueadas com solução salina tamponada com fosfato de leite desnatado a 5% que contém 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente em um agitador. As membranas foram sondadas com anti-IgG1-Fc-HRP humano (específico de cadeia Y1) (Southern Biotech Inc., CA) em diluição de 1:5.000 em PBST de leite desnatado a 5%; 4H11- HRPmAb em diluição de 1:2.000 (consulte, Referência 14 conforme citado na Seção 0, abaixo) em PBST de leite desnatado a 5% e anti-GAL3 mAb humano (Santa Cruz Biotechnology, CA) em 1:200 diluição em PBST de leite desnatado a 5% de um dia para o outro a 4 °C em um agitador. A membrana de GAL3 foi lavada três vezes com PBST e identificada com o segundo anticorpo anti-IgG-HRP de camundongo em diluição de 1:3.000 em PBST de leite desnatado a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente em um agitador. As membranas foram lavadas três vezes com PBST e, então, foram tratadas com substrato de quimiluminescência de reagente ECL (Perkin Elmer, NY) durante 5 minutos, e os sinais iluminados foram capturados em filmes para raios X.6.1.2.9 Invasão[582] The MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2 and 117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 constructs were separately transfected into human embryonic kidney (HEK) 293F FreeStyle cells (Invitrogen, CA) that express and secrete fusion proteins in serum-free media. Three 10% SDS-PAGE gels were run with 5 μg/lane fusion protein supernatants from HEK 293F cells transiently transfected with control empty vector pFUSE-hIgG1-Fc2, MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2 vector, and LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 vector. A gel was directly stained with Gelcode reagent according to the manufacturer's protocol. Proteins from two gels were transferred onto two nitrocellulose membranes that were blocked with 5% nonfat milk phosphate-buffered saline containing 0.1% Tween-20 (PBST) for 1 hour at room temperature on a shaker. The membranes were probed with anti-human IgG1-Fc-HRP (Y1 chain-specific) (Southern Biotech Inc., CA) at a 1:5,000 dilution in 5% nonfat milk PBST; 4H11-HRP mAb at a 1:2,000 dilution (see Reference 14 as cited in Section 0, below) in 5% skim milk PBST and anti-human GAL3 mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA) at a 1:200 dilution in 5% skim milk PBST overnight at 4 °C on a shaker. The GAL3 membrane was washed three times with PBST and identified with the second mouse anti-IgG-HRP antibody at a 1:3,000 dilution in 5% skim milk PBST for 1 hour at room temperature on a shaker. The membranes were washed three times with PBST and then treated with ECL reagent chemiluminescence substrate (Perkin Elmer, NY) for 5 minutes, and the illuminated signals were captured on X-ray films. 6.1.2.9 Invasion

[583] A invasão de membrana basal foi determinada em câmaras de invasão de matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). A migração de matrigel foi medida em 48 horas em poços em triplicata e comparada com os controles de vetor phrGFP e expressa como % deinvasão de matrigel de controle de phrGFP. A migração de matrigel de linhagem de células estável tratada com 0,1 μg/ml deTunicamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis MO no de catálogo T7765) ou 5 μg/ml de MUC16c57-c114-pFUSE-hIgG1- Fc2 ou 5 μg/ml de proteína de fusão de 117-244LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2 após 48 horas foi medida e expressa como % de invasão de matrigel de controle de phrGFP.[583] Basement membrane invasion was determined in matrigel invasion chambers (BD Biosciences, Bedford, MA). Matrigel migration was measured at 48 hours in triplicate wells and compared to phrGFP vector controls and expressed as % phrGFP control matrigel invasion. Matrigel migration of stable cell lines treated with 0.1 μg/ml tunicamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis MO catalog no. T7765) or 5 μg/ml MUC16c57-c114-pFUSE-hIgG1-Fc2 or 5 μg/ml 117-244LGALS3 fusion protein pFUSE-hIgG1-Fc2 after 48 hours was measured and expressed as % phrGFP control matrigel invasion.

[584] As câmaras ou elementos de inserção de invasão BD BioCoat™ Matrigel™ (número de catálogo 354480 em placa de 24 poços) e elementos de inserção de controle (número de catálogo 354578 em placa de 24 poços) foram adquiridos junto à BD Biosciences, MA. O ensaio de invasão de matrigel foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, as câmaras de matrigel em placas de 24 poços (armazenadas a -20 °C) e elementos de inserção de controle (armazenados a 4 °C) foram deixados atingir a temperatura ambiente. Ambos os elementos de inserção foram reidratados com 0,5 ml de meio sem soro no elemento de inserção, bem como no poço externo da placa de 24 poços, durante 2 h no incubador umidificado a 37 °C, 5% de CO2. As células 3T3 ou A2780 cultivadas foram tripsinizadas e lavadas com meio de cultura. Um milhão de células foi separado em um outro tubo de centrífuga e lavado 3 vezes com meio sem soro. Essas células foram posteriormente ajustadas para gerar 10.000 células em 0,5 ml de meio sem soro. O meio nos elementos de inserção reidratados foi removido e o elemento de inserção foitransferido para uma nova placa de 24 poços que contém 0,75 mlde meio de cultura que contém soro bovino fetal a 10% (FBS) no poço que serve como um quimioatraente. Imediatamente, 0,5 ml das células (10.000 células) em meio sem soro foi adicionado ao elemento de inserção. Foi tomado cuidado adequado para observar que não há bolha de ar capturada no elemento de inserção e no poço externo. A placa de 24 poços foi incubada no incubador umidificado a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h. Após a incubação,as células não invasoras foram removidas da superfície superior da membrana por meio de “esfregação” mediante a inserção de uma haste com ponta de algodão no matrigel ou elemento de inserção de controle e aplicou-se pressão delicadamente mediante o movimento da ponta da haste sobre a superfície da membrana. A esfregação foi repetida com uma segunda haste umedecida com meio. Então, os elementos de inserção foram manchados em uma nova placa de 24 poços que contém 0,5 ml de tinta violeta de cristal a 0,5% em água destilada durante 30 minutos. Após a coloração, os elementos de inserção foram enxaguados em 3 béqueres de água destilada para remover o excesso de tinta. Os elementos de inserção foram secos ao ar em uma nova placa de 24 poços. As células invadidas foram contadas manualmente sob um microscópio invertido em ampliação de 200 X. Vários campos de membranas em triplicata foram contados e registrados na figura.6.1.2.10 Reação em cadeia de polimerase em tempo real[584] BD BioCoat™ Matrigel™ invasion chambers or inserts (catalog number 354480 in 24-well plate) and control inserts (catalog number 354578 in 24-well plate) were purchased from BD Biosciences, MA. The matrigel invasion assay was performed according to the manufacturer's protocol. Briefly, matrigel chambers in 24-well plates (stored at -20°C) and control inserts (stored at 4°C) were allowed to reach room temperature. Both inserts were rehydrated with 0.5 ml of serum-free medium on the insert as well as in the outer well of the 24-well plate for 2 h in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2. The cultured 3T3 or A2780 cells were trypsinized and washed with culture medium. One million cells were separated into a separate centrifuge tube and washed three times with serum-free medium. These cells were further adjusted to yield 10,000 cells in 0.5 ml of serum-free medium. The medium on the rehydrated inserts was removed, and the insert was transferred to a new 24-well plate containing 0.75 ml of culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in the well, which serves as a chemoattractant. Immediately, 0.5 ml of the cells (10,000 cells) in serum-free medium was added to the insert. Adequate care was taken to ensure that no air bubbles were trapped in the insert and the outer well. The 24-well plate was incubated in a humidified incubator at 37 °C, 5% CO2 for 48 h. After incubation, non-invading cells were removed from the upper surface of the membrane by "swabbing" by inserting a cotton-tipped swab into the Matrigel or control insert and gently applying pressure by moving the swab tip over the membrane surface. The scrubbing was repeated with a second swab moistened with medium. The inserts were then stained in a new 24-well plate containing 0.5 ml of 0.5% crystal violet dye in distilled water for 30 minutes. After staining, the inserts were rinsed in 3 beakers of distilled water to remove excess dye. The inserts were air-dried in a new 24-well plate. Invaded cells were counted manually under an inverted microscope at 200X magnification. Multiple membrane fields in triplicate were counted and recorded in the figure. 6.1.2.10 Real-Time Polymerase Chain Reaction

[585] O isolamento de RNA foi preparado seguindo-se o protocolo do kit RiboPure (Ambion, Austin, TX). RT PCR para um painel de genes de proteína de matriz extracelular e metástase foi realizada com o uso do sistema de arranjo de PCR RT2 Profiler (Super Array, Frederick, MD), conforme anteriormente descrito (consulte, Referência 29 conforme citado na Seção 0, abaixo).6.1.2.11 Crescimento de tumor em camundongos nude atímicos[585] RNA isolation was prepared following the RiboPure kit protocol (Ambion, Austin, TX). RT PCR for a panel of extracellular matrix protein and metastasis genes was performed using the RT2 Profiler PCR array system (Super Array, Frederick, MD) as previously described (see Reference 29 as cited in Section 0, below).6.1.2.11 Tumor Growth in Athymic Nude Mice

[586] As linhagens de células transfectadas e linhagens decélulas de controle adequadas foram introduzidas no flanco ou cavidade peritoneal de camundongos nude atímicos, e o cuidado deanimais de rotina foi fornecido pela instalação central de avaliação antitumor do MSKCC. Para os experimentos de avaliação de crescimento de tumor, 2 milhões de células a partir de cada linhagem de tumor foram implantadas em cada um dentre 5 a 15 camundongos nude atímicos. As medições de tumor foram tomadasduas vezes por semana e o crescimento de tumor foi registrado a um tamanho máximo de 1.500 mm3 por diretivas RARC do MSKCC.6.1.2.12 Análise western blot[586] The transfected cell lines and appropriate control cell lines were introduced into the flank or peritoneal cavity of athymic nude mice, and routine animal care was provided by the MSKCC Antitumor Evaluation Core Facility. For tumor growth evaluation experiments, 2 million cells from each tumor line were implanted into each of 5 to 15 athymic nude mice. Tumor measurements were taken twice weekly, and tumor growth was recorded to a maximum size of 1,500 mm3 per MSKCC RARC guidelines. 6.1.2.12 Western blot analysis

[587] As linhagens de células estáveis foram cultivadas empratos de 10 cm em seus respectivos meios de cultura e incubadasa 37 °C e 5% de CO2 durante 3 dias. As mesmas foram, então, lavadas duas vezes com PBS gelado e raspadas com 1 a 2 ml de PBSgelado e centrifugadas. As células peletizadas foram lisadas com 0,2 ml de tampão de lise Ripa modificado (Tris-HCL a 20 mM, pH 7,4; NaCl a 150 mM; NP-40 a 1%; Na3VO4 a 1 mM; PMSF a 1 mM; DTT a 1 mM; com coquetéis de inibidores de protease e fosfatase (no de catálogo 11836170001 da Roche Diagnostics, IN)) durante 30 min em gelo e centrifugadas a 4 °C durante 10 min. A concentração de proteína do sobrenadante foi medida com o uso do ensaio de proteína Bio-Rad (BioRaD Laboratories, Hercules, CA). Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de acrilamida SDS-Poly (SDS-PAGE) e transferidas para membrana PVDF com o uso do aparelho de transferência BioRad a 4 °C. As membranas foram bloqueadas com albumina sérica bovina a 3% (BSA) ou leite desnatado em PBS a 5% com 0,1% de Tween-20 (PBST) a 4 °C de um dia para o outro. As membranas foram desenvolvidas com uma variedade de anticorpos primários (Cell Signaling, MA: Akt no de catálogo 9272; Phospho-Akt(Ser473)(193H12) no de catálogo 4058; p44/43 MAPK (Erk1/2) no decatálogo 9102; Phospho- p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) no de catálogo 9101); (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO: β-Actin no de catálogo A5441); (Southern BioTech, Birmingham, AL: Anti-Fc-IgG1-HRP humano no de catálogo 9054-05 e Abgent, San Diego,CA: anticorpo policlonal LGALS3 no de catálogo AP11938b) a 4 °C de um dia para o outro. As membranas foram lavadas três timescom PBST, e desenvolvidas com anticorpo anti-camundongo ou anticoelho conjugado a HRP (GE Healthcare, UK) (diluição de 1:5.000) durante 1 hora à temperatura ambiente. As membranas foram, então, lavadas três times com PBS-T e desenvolvidas com um reagente de quimiluminescência Western Lightning (ECL, Perkin Elmer) durante 1 a 5 minutos à temperatura ambiente e os sinais foram desenvolvidos em filme HyBlot CL (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ).6.1.2.13 Análise de expressão de TCGA de MUC16[587] Stable cell lines were grown in 10 cm dishes in their respective culture media and incubated at 37 °C and 5% CO2 for 3 days. They were then washed twice with ice-cold PBS and scraped with 1 to 2 ml of ice-cold PBS and centrifuged. The pelleted cells were lysed with 0.2 ml of modified Ripa lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1 mM Na3VO4; 1 mM PMSF; 1 mM DTT; with protease and phosphatase inhibitor cocktails (catalog no. 11836170001 from Roche Diagnostics, IN)) for 30 min on ice and centrifuged at 4 °C for 10 min. The protein concentration of the supernatant was measured using the Bio-Rad protein assay (BioRaD Laboratories, Hercules, CA). Equal amounts of protein were separated by SDS-Poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to PVDF membrane using the BioRad transfer apparatus at 4 °C. The membranes were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) or 5% skim milk in PBS with 0.1% Tween-20 (PBST) at 4 °C overnight. Membranes were developed with a variety of primary antibodies (Cell Signaling, MA: Akt catalog no. 9272; Phospho-Akt(Ser473)(193H12) catalog no. 4058; p44/43 MAPK (Erk1/2) catalog no. 9102; Phospho-p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) catalog no. 9101); (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO: β-Actin catalog no. A5441); (Southern BioTech, Birmingham, AL: Anti-human Fc-IgG1-HRP catalog no. 9054-05 and Abgent, San Diego, CA: LGALS3 polyclonal antibody catalog no. AP11938b) at 4 °C overnight. The membranes were washed three times with PBST and developed with HRP-conjugated anti-mouse or anti-rabbit antibody (GE Healthcare, UK) (1:5,000 dilution) for 1 hour at room temperature. The membranes were then washed three times with PBS-T and developed with Western Lightning chemiluminescence reagent (ECL, Perkin Elmer) for 1 to 5 minutes at room temperature, and the signals were developed on HyBlot CL film (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ). 6.1.2.13 TCGA expression analysis of MUC16

[588] Os dados genômicos abrangentes ficaram disponíveis para 316 amostras de câncer de ovário seroso como parte do projeto TCGA (tcga.cancer.gov). As solicitações de número de cópia de DNA a nível de gene foram derivadas a partir de dados de micromatriz Agilent 1M segmentada em CBS com o uso de GISTIC. A expressão de mRNA de MUC16 foi medida com o uso de três plataformas diferentes (matriz de expressão de genoma total Agilent 244K, Affymetrix HT-HG-U133A, e matrizes Affymetrix Exon 1.0), e os valores de expressão de genes foram derivados conforme descrito anteriormente (consulte, Referência 30 conforme citado na Seção 0, abaixo). As mutações somáticas em MUC16 foram identificadas mediante captura do exoma total seguido do sequenciamento de próxima geração (SOLiD ou Illumina). Todos os dados de TCGA foram transferidos por download a partir do portal cBio Cancer Genomics (www.cbioportal.org). Os valores de expressão de mRNA foram, então, correlacionados com as categorias de número de cópia de DNA correspondentes (deleção de homozigoto, deleção de hemizigoto, diploide, ganho, amplificação de alto nível) e as mutações somáticas foram sobrepostas através de todas as amostras e plotadas como um boxplot com o uso da estrutura estatística R (www.R-project.org), conforme descrito anteriormente (consulte, Referência 31 conforme citado na Seção 0, abaixo). Os dados clínicos foram obtidos a partir do portal de dados de TCGA (tcga-data.nci.nih.gov/tcga/).6.1.2.14 Camundongos transgênicos MUC16C354[588] Comprehensive genomic data were available for 316 serous ovarian cancer samples as part of the TCGA project (tcga.cancer.gov). Gene-level DNA copy number requests were derived from CBS-segmented Agilent 1M microarray data using GISTIC. MUC16 mRNA expression was measured using three different platforms (Agilent 244K whole-genome expression array, Affymetrix HT-HG-U133A, and Affymetrix Exon 1.0 arrays), and gene expression values were derived as previously described (see Reference 30 as cited in Section 0 below). Somatic mutations in MUC16 were identified using whole-exome capture followed by next-generation sequencing (SOLiD or Illumina). All TCGA data were downloaded from the cBio Cancer Genomics portal (www.cbioportal.org). mRNA expression values were then correlated with the corresponding DNA copy number categories (homozygous deletion, hemizygous deletion, diploid, gain, high-level amplification), and somatic mutations were overlaid across all samples and plotted as a boxplot using the R statistical framework (www.R-project.org) as described previously (see Reference 31 as cited in Section 0 below). Clinical data were obtained from the TCGA data portal (tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). 6.1.2.14 MUC16C354 Transgenic Mice

[589] O construto transgênico de 354 aminoácidos de terminação carbóxi condicionais (MUC16c354) foi produzido com o uso do vetor phrGFP II-C (Stratagene, La Jolla, CA), e o promotor CMV foi substituído pelo promotor CAG a partir do vetor pCAG- CreERT2 (Addgene, Cambridge, MA). O fragmento de MUC16c354 foi amplificado por PCR a partir do construto B53 que foi produzido por Yin BW et al (consulte, Referências 5 e 6 conforme citado na Seção 0, abaixo). O construto condicional MUC16c354 contém as seguintes unidades: pCAG, 5’ loxP, hrGFP, BGHpA, 3’ loxP, MUC16c354, HA e SV40pA.[589] The conditional carboxy-terminal 354 amino acid transgenic construct (MUC16c354) was produced using the phrGFP II-C vector (Stratagene, La Jolla, CA), and the CMV promoter was replaced with the CAG promoter from the pCAG-CreERT2 vector (Addgene, Cambridge, MA). The MUC16c354 fragment was PCR amplified from the B53 construct that was produced by Yin BW et al (see, References 5 and 6 as cited in Section 0, below). The conditional MUC16c354 construct contains the following units: pCAG, 5′ loxP, hrGFP, BGHpA, 3′ loxP, MUC16c354, HA, and SV40pA.

[590] Com o uso do construto transgênico condicional MUC16c354 acima, a instalação central de genética de camundongo do MSKCC realizou o procedimento de microinjeção em camundongos B6CBAF1/J. Doze camundongos transgênicos condicionais MUC16c354 foram identificados a partir de 99 camundongos por Southern Blot. Todos os 12 pró-fundadores foram cruzados com camundongos B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) para remover hrGFP, que foi localizado entre dois loxPs. Os camundongos do sexo feminino positivo para MUC16c354 PCR para cada pró-fundador foram dissecados. Os órgãos (cérebro, cólon, coração, rim, fígado, ovário e baço) a partir desses camundongos dissecados foram picados e homogeneizados. As amostras de proteína foram analisadas por western blot para identificar os fundadores que expressam altamente MUC16c354. Os camundongos transgênicos resultantes foram mantidos em um contexto misturado.[590] Using the above MUC16c354 conditional transgenic construct, the MSKCC Mouse Genetics Core Facility performed the microinjection procedure in B6CBAF1/J mice. Twelve MUC16c354 conditional transgenic mice were identified from 99 mice by Southern blot. All 12 pro-founders were crossed to B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J mice (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) to remove hrGFP, which was located between two loxPs. The MUC16c354 PCR-positive female mice for each pro-founder were dissected. The organs (brain, colon, heart, kidney, liver, ovary, and spleen) from these dissected mice were minced and homogenized. Protein samples were analyzed by western blot to identify founders highly expressing MUC16c354. The resulting transgenic mice were maintained on a mixed background.

[591] Dois fundadores de camundongos de MUC16c354transgênicos foram cruzados com p53 camundongos heterozigotos (B6.129S2- Trp53tm1Tyj/J) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) para criar MUC16c354:p53+/- transgênico duplo. Os camundongos transgênicos resultantes foram mantidos em um contexto misturado. Todos os camundongos foram genotipados por PCR com o uso de DNA de cauda ou dedo extraído. Todos os animais experimentais foram mantidos de acordo com as diretivas aprovadas pelo MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee e Research Animal Resource Center e o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.6.1.2.15 Análise histológica[591] Two MUC16c354 transgenic mouse founders were crossed with p53 heterozygous mice (B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) to create MUC16c354:p53+/- double transgenic mice. The resulting transgenic mice were maintained on an admixed background. All mice were genotyped by PCR using extracted tail or finger DNA. All experimental animals were maintained in accordance with the guidelines approved by the MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee and Research Animal Resource Center and the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 6.1.2.15 Histological Analysis

[592] Os camundongos com 12 meses de idade foram sacrificados e submetidos à necrópsia. Após o exame macroscópico, as amostras de tecido dissecadas foram fixas durante 24 horas em formalina tamponada neutra a 10%, então, processadas em álcool e xileno, impregnada em parafina, secionadas em 5 μm de espessura e manchadas com hematoxilina e eosina (H&E). Os tecidos foram examinados por um patologista veterinário (SM), e as lesões neoplásicas e não neoplásicas foram diagnosticadas de acordo com as diretivas publicadas na nomenclatura de patologia de roedores.6.1.2.16 Análise estatística[592] Twelve-month-old mice were euthanized and necropsied. After gross examination, dissected tissue samples were fixed for 24 hours in 10% neutral buffered formalin, then processed in alcohol and xylene, embedded in paraffin, sectioned at 5 μm thickness, and stained with hematoxylin and eosin (H&E). Tissues were examined by a veterinary pathologist (SM), and neoplastic and non-neoplastic lesions were diagnosed according to published guidelines in the nomenclature of rodent pathology.6.1.2.16 Statistical analysis

[593] O teste t emparelhado bilateral de Student foi usado para comparar grupos de estudos de crescimento in vitro, invasão e potencial de crescimento em ágar macio. O testar de qui- quadrado foi usado para analisar os dados de RT-PCR acerca da importância, de acordo com o software fornecido (SuperArray). As comparações dos volumes de tumor foram feitas com o uso das avaliações de área sob a curva para o volume de tumor total ao longo do tempo em cada animal. A avaliação do volume de tumor foi feita com base no último dia que todos os animais estavam vivos em ambos os grupos. Um teste não paramétrico para classificações (teste de duas amostras Wilcoxon) foi usado para testar uma diferença em distribuições entre os grupos. Nos estudos de sobrevivência animal, uma análise de tempo em relaçãoao evento foi realizada, com o evento definido como o tempo parao volume de tumor ultrapassar 1.500 mm3 ou ulceração. Os animais com volume de tumor menor que 1.500 mm3 foram acompanhadosdurante até 60 dias e, então, censurados. O método de Kaplan- Meier foi usado para estimar a distribuição de sobrevivência (consulte, Referência 32 conforme citado na Seção 0, abaixo).6.1.3 Resultados[593] Student's two-sided paired t-test was used to compare study groups for in vitro growth, invasion, and soft agar growth potential. The chi-square test was used to analyze RT-PCR data for significance, according to the provided software (SuperArray). Tumor volume comparisons were made using area under the curve assessments for total tumor volume over time in each animal. Tumor volume assessment was based on the last day all animals were alive in both groups. A nonparametric test for ranks (Wilcoxon two-sample test) was used to test for a difference in distributions between groups. In animal survival studies, a time-to-event analysis was performed, with event defined as the time for tumor volume to exceed 1,500 mm3 or ulceration. Animals with tumor volume less than 1,500 mm3 were followed for up to 60 days and then censored. The Kaplan-Meier method was used to estimate the survival distribution (see, Reference 32 as cited in Section 0, below).6.1.3 Results

[594] Após a clivagem evidente e liberação da região de repetição em tandem da proteína de MUC16, acredita-se que aproximadamente 114 aminoácidos da terminação carbóxi (c114) da proteína permanecem sobre a superfície celular, e as funções potenciais dessa parte da molécula não são conhecidas. A função dessa parte mais proximal da proteína de MUC16 no comportamento e transformação maligna em fibroblastos 3T3 e linhagens de células de câncer de ovário foi analisada. Para testar o efeito do elemento de aminoácido c114 residual próximo ao local de clivagem, dois vetores foram designados: (1) vetor MUC16c114-GFP e (2) o vetor MUC16c344-GFP truncado (Figura 1) e esses vetores e o vetor de controle de phrGFP foram independentemente transfectados em células de fibroblasto 3T3. As linhagens de células que expressam MUC16c114- e MUC16c344 foram selecionadas e mantidas com G418, e a expressão estável de MUC16c114 e MUC16c344 foi confirmada pela análise FACS com o uso de anticorpos monoclonais que reconhecem sequências de aminoácidos exclusivas da terminação carbóxi de MUC16 (consulte, Referência 14 conforme citado na Seção 0, abaixo). As linhagens de células que expressam 344 aminoácidos a partir da proteína de MUC16 (SEQ ID NO: 132) (linhagens de MUC16c344-GFP) contêm o epítopo CA125 clássico, que é reconhecido pelo anticorpo OC125 sobre a superfície celular por meio da análise FACS, e o CA125 é liberado no sobrenadante da cultura celular. OC125 não reconhece células de MUC16c114-GFP. Entretanto, todas as linhagens transfectadas foram positivas em superfície celular para as sequências extracelulares de MUC16c114 (SEQ ID NO: 133), próximo ao local de clivagem putativo ereconhecidas pelo anticorpo 4H11 específico de ectodomínio de MUC16 (consulte, Referência 14 conforme citado na Seção 0,abaixo; Figura 1).6.1.3.1 Células 3T3[594] After gross cleavage and release of the tandem repeat region of the MUC16 protein, approximately 114 amino acids from the carboxy terminus (c114) of the protein are believed to remain on the cell surface, and the potential functions of this part of the molecule are not known. The role of this more proximal part of the MUC16 protein in the behavior and malignant transformation in 3T3 fibroblasts and ovarian cancer cell lines was analyzed. To test the effect of the residual c114 amino acid element near the cleavage site, two vectors were designed: (1) MUC16c114-GFP vector and (2) the truncated MUC16c344-GFP vector (Figure 1), and these vectors and the phrGFP control vector were independently transfected into 3T3 fibroblast cells. MUC16c114- and MUC16c344-expressing cell lines were selected and maintained with G418, and stable expression of MUC16c114 and MUC16c344 was confirmed by FACS analysis using monoclonal antibodies that recognize amino acid sequences unique to the carboxy terminus of MUC16 (see Reference 14 as cited in Section 0, below). Cell lines expressing 344 amino acids from the MUC16 protein (SEQ ID NO: 132) (MUC16c344-GFP lines) contain the classical CA125 epitope, which is recognized by the OC125 antibody on the cell surface by FACS analysis, and CA125 is released into the cell culture supernatant. OC125 does not recognize MUC16c114-GFP cells. However, all transfected lines were positive on the cell surface for the extracellular sequences of MUC16c114 (SEQ ID NO: 133), close to the putative cleavage site and recognized by the MUC16 ectodomain-specific antibody 4H11 (see Reference 14 as cited in Section 0 below; Figure 1).6.1.3.1 3T3 Cells

[595] Para investigar as propriedades de transformação conferidas pelos elementos pós-clivagem residuais de MUC16, as características das linhagens de células 3T3 MUC16c114-GFP e 3T3 MUC16c344-GFP foram analisadas e os efeitos desses dois elementos de MUC16 mínimos foram comparados com os controles de vetor. A expressão dos 114 aminoácidos mais proximais (MUC16c114) ou dos 344 aminoácidos mais proximais (MUC16c344) da sequência de MUC16 não teve efeito significativo nas taxas de crescimento in vitro para qualquer uma das linhagens de células transfectadas, quando comparado com aquele da linhagem parental da Figura 2A. Entretanto, a expressão dos mesmos elementos da proteína de MUC16 alterou substancialmente o crescimento dependente de ancoragem de 3T3 em clonagem em ágar macio. Tanto o fragmento c114 mínimo como o fragmento c344 aumentaram significativamente o número de colônias em ágar macio em comparação com os controles apenas de vetor (Figura 3A). As porções proximais da expressão de proteína de MUC16 também intensificaram a migração (p<0,0001) de células MUC16 + 3T3 em ensaios de invasão de matrigel clássica, em comparação com as células 3T3 transfectadas com controles de vetor phrGFP (Figura 3B). Quando as células 3T3 que expressam diversos fragmentos de proteína de MUC16 foram examinadas acerca da expressão de transcrições de gene de invasão e metástase selecionadas, existiram múltiplos genes de invasão regulados de maneira ascendente, incluindo ligante de quimioquina 12 (CXCL12), caderina 11 (CDH11) e as metaloproteinases de matrizMMP2 e MMP9 (Figura 3C). Outras transcrições que incluem Fibronectina (FN1) e Neurofibromina (NF2) são consistentemente diminuídas. MUC16 poderia agir através de vias de sinalização canônicas em maneira similares aos efeitos de MUC1 e MUC4, uma vez que MUC16 altera o crescimento de tumor in vivo e aumenta as propriedades invasoras de células que contêm a proteína de MUC16. As vias de ERK e AKT de interação foram identificadas anteriormente como mecanismos de sinalização importantes em cânceres de ovário e reguladores da invasão de célula tumoral (consulte, Referências 21 e 22 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo). Conforme mostrado na Figura 3D, houve ativação de ambas as vias conforme evidenciado pelos aumentos em pAKT(S473) e pERK (T202/Y204).[595] To investigate the transforming properties conferred by residual MUC16 post-cleavage elements, the characteristics of the 3T3 MUC16c114-GFP and 3T3 MUC16c344-GFP cell lines were analyzed, and the effects of these two minimal MUC16 elements were compared with vector controls. Expression of either the most proximal 114 amino acids (MUC16c114) or the most proximal 344 amino acids (MUC16c344) of the MUC16 sequence had no significant effect on in vitro growth rates for either transfected cell line compared with that of the parental cell line in Figure 2A. However, expression of the same MUC16 protein elements substantially altered the anchorage-dependent growth of 3T3 in soft agar cloning. Both the minimal c114 fragment and the c344 fragment significantly increased colony numbers in soft agar compared to vector-only controls (Figure 3A). Proximal portions of MUC16 protein expression also enhanced migration (p<0.0001) of MUC16+ 3T3 cells in classical matrigel invasion assays compared to 3T3 cells transfected with phrGFP vector controls (Figure 3B). When 3T3 cells expressing various MUC16 protein fragments were examined for the expression of selected invasion and metastasis gene transcripts, there were multiple upregulated invasion genes, including chemokine ligand 12 (CXCL12), cadherin 11 (CDH11), and the matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9 (Figure 3C). Other transcripts including Fibronectin (FN1) and Neurofibromin (NF2) are consistently decreased. MUC16 could act through canonical signaling pathways in a manner similar to the effects of MUC1 and MUC4, since MUC16 alters tumor growth in vivo and increases the invasive properties of cells containing the MUC16 protein. The interacting ERK and AKT pathways have previously been identified as important signaling mechanisms in ovarian cancers and regulators of tumor cell invasion (see References 21 and 22 as cited in Section 6.1.5, below). As shown in Figure 3D, there was activation of both pathways as evidenced by increases in pAKT(S473) and pERK(T202/Y204).

[596] A marca mais inequívoca da transformação oncogênica é a capacidade para promover o crescimento em camundongos imunodeficientes. Com a finalidade de medir os efeitos de MUC16 na taxa de crescimento de tumor, um modelo de tumor de flanco foi usado para facilitar as medições de tumor regulares. Conforme mostrado na Figura 3E, quando as linhagens de células 3T3 que expressam MUC16 (vetor phrGFP, MUC16c114-GFP e MUC16c344-GFP) foram implantadas nos flancos de camundongos nude atímicos, tanto o MUC16c114-GFP como o MUC16c344-GFP formaram tumores maiores em comparação com os controles apenas de vetor em 4 semanas. Não houve uma diferença estatística entre a linhagem de células que expressa as proteínas de MUC16c114-GFP e MUC16c344-GFP (Figura 3E), sugerindo que os efeitos oncogênicos da expressão de MUC16 estão ligados às partes mais proximais da molécula. Esse aumento em taxa de crescimento de tumor foi observado ao longo de todo o período de crescimento de tumor e é consistente com a ligação clínica entre altos níveis de expressão de MUC16 (como CA125 sérico) e sobrevivência insatisfatória (consulte, Referência 18 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo).6.1.3.2 Células de câncer de ovário humano A2780[596] The most unequivocal hallmark of oncogenic transformation is the ability to promote growth in immunodeficient mice. In order to measure the effects of MUC16 on tumor growth rate, a flank tumor model was used to facilitate regular tumor measurements. As shown in Figure 3E, when MUC16-expressing 3T3 cell lines (phrGFP vector, MUC16c114-GFP, and MUC16c344-GFP) were implanted into the flanks of athymic nude mice, both MUC16c114-GFP and MUC16c344-GFP formed larger tumors compared to vector-only controls within 4 weeks. There was no statistical difference between the cell line expressing MUC16c114-GFP and MUC16c344-GFP proteins (Figure 3E), suggesting that the oncogenic effects of MUC16 expression are linked to the more proximal parts of the molecule. This increase in tumor growth rate was observed throughout the entire tumor growth period and is consistent with the clinical link between high levels of MUC16 expression (as serum CA125) and poor survival (see Reference 18 as cited in Section 6.1.5, below). 6.1.3.2 A2780 Human Ovarian Cancer Cells

[597] Embora a expressão de proteína de MUC16 em células 3T3 fosse claramente ligada a marcas de transformação, algumas linhagens de células de câncer de ovário completamente transformadas carecem de expressão de MUC16 quando cultivadas. Com a finalidade de explorar a contribuição de MUC16 para o comportamento de células de câncer de ovário humano, as células A2780 (uma linhagem de células de carcinoma de ovário humano que não expressa MUC16) foram transfectadas com MUC16c114-GFP ou MUC16c344-GFP. As células que expressam MUC16 foram selecionadas por G418 e submetidas a FACS acerca da expressão de MUC16 e GFP. Uma vez que essas células cresceram bem em ágar macio na ausência da expressão de MUC16, o efeito de MUC16c344 e MUC16c114 na invasão de matrigel foi analisado. Conforme mostrado na Figura 4A, a expressão de MUC16c114 e MUC16c344 promoveu claramente a invasão de matrigel em células A2780. De modo semelhante, o efeito de MUC16c114 e MUC16c344 na ativação das vias de ERK e AKT é similar àquele observado nas células 3T3, aumentando os níveis basais tanto de pAKT(S473) como de pERK (T202/Y204) (Figura 4B). Dessa forma, mesmo nas linhagens de células de ovário malignas, a expressão aumentada de elementos de terminação carbóxi de MUC16 está ligada à invasão aumentada e ativação de oncogene. Além disso, o crescimento de tumor in vivo de linhagens de A2780 transfectadas com MUC16c114 e MUC16c344 foi analisado (Figura 4C). Em ambos os cenários, a linhagem de células de MUC16c114 e a linhagem de células de MUC16c344 cresceram mais rapidamente do que os controles de apenas vetor. Nesse modelo de câncer humano, os controles de vetor cresceram a uma taxa suficiente para exterminar eventualmente os animais.6.1.3.3 Estudos de glicosilação[597] Although MUC16 protein expression in 3T3 cells was clearly linked to transformation hallmarks, some fully transformed ovarian cancer cell lines lack MUC16 expression when cultured. To explore the contribution of MUC16 to human ovarian cancer cell behavior, A2780 cells (a human ovarian carcinoma cell line that does not express MUC16) were transfected with MUC16c114-GFP or MUC16c344-GFP. MUC16-expressing cells were sorted by G418 and FACS-screened for MUC16 and GFP expression. Since these cells grew well in soft agar in the absence of MUC16 expression, the effect of MUC16c344 and MUC16c114 on matrigel invasion was analyzed. As shown in Figure 4A, expression of MUC16c114 and MUC16c344 clearly promoted matrigel invasion in A2780 cells. Similarly, the effect of MUC16c114 and MUC16c344 on the activation of the ERK and AKT pathways is similar to that observed in 3T3 cells, increasing basal levels of both pAKT(S473) and pERK(T202/Y204) (Figure 4B). Thus, even in malignant ovarian cell lines, increased expression of MUC16 carboxy-terminal elements is linked to increased invasion and oncogene activation. Furthermore, in vivo tumor growth of A2780 cell lines transfected with MUC16c114 and MUC16c344 was analyzed (Figure 4C). In both scenarios, the MUC16c114 cell line and the MUC16c344 cell line grew more rapidly than the vector-only controls. In this human cancer model, the vector controls grew at a rate sufficient to eventually kill the animals. 6.1.3.3 Glycosylation Studies

[598] Para determinar a parte específica de MUC16c114 responsável pela transformação, dois fragmentos de MUC16 adicionais foram construídos: (1) MUC16c80, em que uma sequência de 34 aminoácidos a partir do ectodomínio de MUC16c114 (da posição 1798 a 1831, conforme numerado na publicação original) foi deletada (Figura 1D; SEQ ID NO: 135) (consulte, Referência 5conforme citado na Seção 0, abaixo); e (2) MUC16c86, em que oconstruto MUC16c114 reteve todo o ectodomínio de MUC16, masremoveu uma sequência de 28 aminoácidos do domínio Ezrin putativo do domínio citoplasmático, os locais de fosforilação de tirosina potenciais e o domínio SH2 (da posição 1857 a 1884) (Figura 1D;SEQ ID NO: 134). Esses construtos foram introduzidos em células 3T3 e selecionados por FACS acerca da expressão de superfície celular das sequências de MUC16c80 e MUCc86 restantes. Essas duas populações de células adicionais foram, então, examinadas acerca de mudanças dependentes de MUC16c80 e MUCc86. O construto MUC16c86 (construto com o ectodomínio intato) reteve uma capacidade muito maior para formação de colônia em ágar macio do que o construto MUC16c80 (construto com domínio citoplasmático intato) (Figura 5A). Isso também foi verdadeiro para a capacidade de invasão de matrigel (Figura 5B). As células 3T3 que expressam MUC16c80 tiveram uma taxa de invasão que não foi estatisticamente diferente daquela do controle de vetor phrGFP. Em contraste, as células 3T3 que expressam MUC16c86 retiveram um fenótipo mais invasor, similar às células intatas de MUC16c114 e MUC16c344.Quando a ativação de vias de AKT e ERK foi examinada, osresultados foram consistentes com os estudos de invasão dematrigel e colônia em ágar macio (Figura 5C). A expressão dofragmento de MUC16c80 (sem o ectodomínio intato completo) nãoativou ERK e AKT e foi similar ao controle de vetor phrGFP, emcontrapartida, as células 3T3 que expressam MUC16c86 (com o ectodomínio intato) foram similares às células 3T3 que expressam MUC16c114 total na ativação de ERK e AKT. Finalmente, a importância do ectodomínio intato foi confirmada nos modelos de tumor de xenoenxerto.[598] To determine the specific part of MUC16c114 responsible for transformation, two additional MUC16 fragments were constructed: (1) MUC16c80, in which a 34-amino acid sequence from the ectodomain of MUC16c114 (from position 1798 to 1831, as numbered in the original publication) was deleted (Figure 1D; SEQ ID NO: 135) (see, Reference 5 as cited in Section 0, below); and (2) MUC16c86, in which the MUC16c114 construct retained the entire ectodomain of MUC16, but removed a 28-amino acid sequence from the putative Ezrin domain of the cytoplasmic domain, the potential tyrosine phosphorylation sites, and the SH2 domain (from position 1857 to 1884) (Figure 1D; SEQ ID NO: 134). These constructs were introduced into 3T3 cells and FACS-selected for cell surface expression of the remaining MUC16c80 and MUCc86 sequences. These two additional cell populations were then examined for MUC16c80- and MUCc86-dependent changes. The MUC16c86 construct (construct with the intact ectodomain) retained a much greater capacity for colony formation in soft agar than the MUC16c80 construct (construct with the intact cytoplasmic domain) (Figure 5A). This was also true for matrigel invasion capacity (Figure 5B). 3T3 cells expressing MUC16c80 had an invasion rate that was not statistically different from that of the phrGFP vector control. In contrast, 3T3 cells expressing MUC16c86 retained a more invasive phenotype, similar to intact MUC16c114 and MUC16c344 cells. When activation of AKT and ERK pathways was examined, the results were consistent with matrigel and soft agar colony invasion studies (Figure 5C). Expression of the MUC16c80 fragment (lacking the complete intact ectodomain) did not activate ERK and AKT and was similar to the phrGFP vector control; in contrast, 3T3 cells expressing MUC16c86 (with the intact ectodomain) were similar to 3T3 cells expressing full-length MUC16c114 in activating ERK and AKT. Finally, the importance of the intact ectodomain was confirmed in xenograft tumor models.

[599] A perda do ectodomínio de MUC16 intato (3T3 MUC16c80) resultou em uma perda de intensificação de crescimento de 3T3 dependente de MUC16c114 em comparação com o controle de MUC16c114, enquanto as células 3T3 que expressam MUC16c86 tiveram um atraso de crescimento modesto, mas tiveram um efeito geral similar às células 3T3 que expressam MUC16c114 (Figura 5D). Dessa forma, a parte extracelular do fragmento de MUC16c114 foi responsável pelos efeitos transformadores de MUC16 em células 3T3. Para investigar adicionalmente a função do fragmento extracelular de MUC16c114, os estudos de coprecipitação foram realizados com a célula 3T3 que expressa MUC16c114, com o uso de um painel de anticorpos de direcionamento de MUC16 (consulte, Referência 14 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo). Nenhuma faixa individual de coprecipitação foi identificada por coloração com prata, e os western blots específicos para EGFR, integrinas e HER3 foram negativos. Entretanto, a análise da sequência de MUC16c114 sugeriu que os três locais de N-glicosilação (Asn1777, Asn1800 e Asn1806(Figura 6, SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 133)) no ectodomínio poderiam desempenhar uma função. A função desses locais de N- glicosilação foi analisada. Com o uso de mutação pontualespecífica de sítio, todas as três asparaginas foram alteradas para alaninas. Esse construto MUC16c114 modificado, designado MUC16c114-N123, foi introduzido em células 3T3, e as células que expressam MUC16c114-N123 foram isoladas por FACS e anticorpos de ectodomínio 4H11. Conforme mostrado na Figura 7A, essas mutações de asparagina para alanina anularam completamente a intensificação induzida por MUC16c114 da invasão de matrigelobservada com o vetor de expressão de MUC16c114 parental emcélulas 3T3. Para confirmar a função de N-glicosilação, ascélulas 3T3 foram tratadas com o inibidor de glicosilaçãoTunicamicina (0,1 μg/ml), e uma diminuição significativa em invasão de matrigel foi observada. Dois inibidores de proteína sintética também foram testados para explorar ainda mais a função da sequência extracelular de MUC16c114. A sequência externa de MUC16 (da posição 1777 a 1834 conforme numerado na Referência 5 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo) foi fixada a uma cadeia principal Fc humana pFUSE (MUC16c57-c114 pFUSE) para fornecer um receptor “simulado”. Esse construto foi comparado tanto com a invasão de MUC16c114 como com um controle de vetor pFUSE. Conforme mostrado na Figura 7B, o construto de receptor “simulado” diminui o efeito total do vetor de expressão de MUC16c114 na invasão de matrigel (Figura 7). Presumindo que as lectinas foram ligadas ao efeito da proteína de MUC16c114 glicosilada, um segundo inibidor foi construído a partir do domínio de ligação de açúcar de LGALS3 (aminoácidos 117 a 244; Figura 7 e Figura 8) (consulte, Referência 23 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo) fixado à mesma cadeia principal de pFUSE (117-244LGALS3pFUSE). Semelhante a Tunicamicina, ambos desses inibidores de proteína interferiram com a interação de MUC16c114 com outras proteínas de superfície celular, enquanto o vetor pFUSE não teve efeito (Figura 7B). Conforme com outras intervenções, o efeito na expressão de pAKT e pERK foi diminuído em paralelo com a perda de invasão de matrigel quando os locais de N-glicosilação foram removidos, conforme mostrado na Figura 7C. Entretanto, o construto MUC16c114- N123 teve altos níveis de expressão da proteína de MUC16c114-N123, conforme demonstrado pela ligação de 4H11 (específica de ectodomínio de MUC16). O impacto da perda de N-glicosilação foi de modo semelhante confirmado na redução do crescimento nascélulas 3T3 transfectadas em camundongos nu/nu, conforme mostrado na Figura 7D.6.1.3.4 CAmundongo transgênico[599] Loss of the intact MUC16 ectodomain (3T3 MUC16c80) resulted in a loss of MUC16c114-dependent 3T3 growth enhancement compared to the MUC16c114 control, while 3T3 cells expressing MUC16c86 had a modest growth delay but had an overall effect similar to 3T3 cells expressing MUC16c114 (Figure 5D). Thus, the extracellular part of the MUC16c114 fragment was responsible for the transforming effects of MUC16 in 3T3 cells. To further investigate the function of the extracellular fragment of MUC16c114, coprecipitation studies were performed with the MUC16c114-expressing 3T3 cell using a panel of MUC16-targeting antibodies (see Reference 14 as cited in Section 6.1.5, below). No individual coprecipitation bands were identified by silver staining, and Western blots specific for EGFR, integrins, and HER3 were negative. However, sequence analysis of MUC16c114 suggested that the three N-glycosylation sites (Asn1777, Asn1800, and Asn1806 (Figure 6, SEQ ID NO: 132 and SEQ ID NO: 133)) in the ectodomain could play a role. The function of these N-glycosylation sites was analyzed. Using site-specific point mutation, all three asparagines were changed to alanines. This modified MUC16c114 construct, designated MUC16c114-N123, was introduced into 3T3 cells, and cells expressing MUC16c114-N123 were isolated by FACS and 4H11 ectodomain antibodies. As shown in Figure 7A, these asparagine-to-alanine mutations completely abrogated the MUC16c114-induced enhancement of matrigel invasion observed with the parental MUC16c114 expression vector in 3T3 cells. To confirm the function of N-glycosylation, 3T3 cells were treated with the glycosylation inhibitor tunicamycin (0.1 μg/ml), and a significant decrease in matrigel invasion was observed. Two synthetic protein inhibitors were also tested to further explore the function of the MUC16c114 extracellular sequence. The external sequence of MUC16 (from position 1777 to 1834 as numbered in Reference 5 as cited in Section 6.1.5, below) was attached to a pFUSE human Fc backbone (MUC16c57-c114 pFUSE) to provide a “mock” receptor. This construct was compared to both MUC16c114 invasion and a pFUSE vector control. As shown in Figure 7B, the “mock” receptor construct decreased the overall effect of the MUC16c114 expression vector on matrigel invasion (Figure 7). Assuming that the lectins were linked to the effect of glycosylated MUC16c114 protein, a second inhibitor was constructed from the sugar-binding domain of LGALS3 (amino acids 117 to 244; Figure 7 and Figure 8) (see, Reference 23 as cited in Section 6.1.5, below) attached to the same pFUSE backbone (117-244LGALS3pFUSE). Similar to Tunicamycin, both of these protein inhibitors interfered with the interaction of MUC16c114 with other cell surface proteins, whereas the pFUSE vector had no effect (Figure 7B). Consistent with other interventions, the effect on pAKT and pERK expression was diminished in parallel with the loss of matrigel invasion when the N-glycosylation sites were removed, as shown in Figure 7C. However, the MUC16c114-N123 construct had high levels of MUC16c114-N123 protein expression, as demonstrated by 4H11 binding (MUC16 ectodomain-specific). The impact of loss of N-glycosylation was similarly confirmed in the reduction of growth in 3T3 cells transfected in nu/nu mice, as shown in Figure 7D. 6.1.3.4 Transgenic Mouse

[600] O efeito da expressão dos elementos de MUC16 carbóxi- terminal em camundongos transgênicos e a taxa de formação de tumor espontânea foi examinado. Os camundongos transgênicos condicionais que expressam MUC16c354 (a sequência c114 completa e a repetição em tandem que contém CA125 mais proximal) foram gerados. O intensificador precoce de CMV mais promotor de β actina de galinha (CAG) foi usado para forçar a expressão de MUC16c354 substancial em todos os tecidos murinos. Essa estratégia foi escolhida devido ao fato de que a fisiologia do ovário humano é muito diferente do sistema reprodutor murino, e os promotores de ovário específicos quanto a tecido enfraqueceram e são relativamente difíceis de usar em sistemas transgênicos. A estratégia para esses camundongos é mostrada na Figura 9A.[600] The effect of expression of MUC16 carboxy-terminal elements in transgenic mice and the rate of spontaneous tumor formation was examined. Conditional transgenic mice expressing MUC16c354 (the complete c114 sequence and the more proximal CA125-containing tandem repeat) were generated. The CMV early enhancer plus chicken β-actin (CAG) promoter was used to force substantial MUC16c354 expression in all murine tissues. This strategy was chosen because the physiology of the human ovary is very different from the murine reproductive system, and tissue-specific ovarian promoters have weakened and are relatively difficult to use in transgenic systems. The strategy for these mice is shown in Figure 9A.

[601] Os animais transgênicos condicionais foram selecionados por southern blot, conforme mostrado na Figura 9B, e cruzados com camundongos EIIa-Cre para produzir fundadores transgênicos de MUC16c354. Conforme mostrado na Figura 9C, dois fundadores foram escolhidos e uma colônia de camundongos transgênicos de MUC16c354 foi criada. Os dois fundadores expressam altamente MUC16c354 em muitos órgãos, por exemplo, cérebro, cólon, coração, rim, fígado, pulmão, ovário e baço. Esses camundongos não têm efeito a partir da expressão ectópica difundida de MUC16c354, com razões normais de progênie macho:fêmea, taxas normais de fertilidade e tempo de vida aparentemente normal, que ultrapassa 2 anos. A necrópsia de dois animais aparentemente saudáveis (um macho e uma fêmea) a partir da população de controle e dos camundongos transgênicos de MUC16c354, em intervalos de 3 meses até 1 ano, foi apenas considerável para a hiperplasia endometrial uterina branda/moderada em camundongos do sexo feminino mais velhos, mas a incidência e gravidade não foram significativamente diferentes dos controles do tipo selvagem. Os tecidos selecionados são mostrados na Figura 10. Apenas um tumor de tecido mole espontâneo (sarcoma) foi observado na colônia de mais de 100 animais observados durante 2 anos ou mais.[601] Conditional transgenic animals were selected by southern blot, as shown in Figure 9B, and crossed with EIIa-Cre mice to produce MUC16c354 transgenic founders. As shown in Figure 9C, two founders were chosen, and a colony of MUC16c354 transgenic mice was created. The two founders highly express MUC16c354 in many organs, e.g., brain, colon, heart, kidney, liver, lung, ovary, and spleen. These mice have no effect from widespread ectopic expression of MUC16c354, with normal male:female progeny ratios, normal fertility rates, and apparently normal lifespans exceeding 2 years. Necropsy of two apparently healthy animals (one male and one female) from the control population and the MUC16c354 transgenic mice, at 3-month intervals for up to 1 year, revealed only mild to moderate uterine endometrial hyperplasia in older female mice, but the incidence and severity were not significantly different from wild-type controls. Selected tissues are shown in Figure 10. Only one spontaneous soft tissue tumor (sarcoma) was observed in the colony of over 100 animals observed for 2 or more years.

[602] Com base nesse resultado, acredita-se na hipótese de que um “segundo acerto” seria potencialmente necessário. É notável que os modelos murinos de mutação BRCA1 também exigem um segundo acerto, e a perda de p53 aumentou significativamente a frequência de tumores. Os camundongos MUC16c354 foram cruzados com camundongos p53+/- a partir do Jackson Laboratory. Houve efeito precoce limitado. Entretanto, após aproximadamente 6 meses, os camundongos MUC16c354 com p53+/- começaram a desenvolver tumores sarcomatosos espontâneos do tecido mole e linfoma a uma taxa maior que aquela de animais de controle normais. Os tumores selecionados são mostrados nas inserções de painel da Figura 9D. A sobrevivência de Kaplan-Meier para esses camundongos é mostrada na Figura 9E. Os camundongos MUC16c354:p53+/- mostraram uma sobrevivência geral significativamente pior devido ao desenvolvimento de tumor espontâneo (p <0,014). O número total de tumores observados em cada grupo foi: camundongos p53 +/-,20/107 camundongos; camundongos MUC16c354 e p53 +/-, 34/91camundongos; camundongos MUC16c354, 1/72 camundongos; camundongosdo tipo selvagem, 0/91 camundongos. Quando 8 tumores coletados foram examinados acerca do sequenciamento genômico p53, todos os tumores espontâneos tinham perda do alelo normal de p53, indicando que o desenvolvimento de tumor dependente de MUC16 também exige perda de função de p53 normal.6.1.3.5 TCGA de ovário[602] Based on this result, it is hypothesized that a “second hit” would potentially be necessary. It is notable that murine models of BRCA1 mutation also require a second hit, and loss of p53 significantly increased tumor frequency. MUC16c354 mice were crossed with p53+/- mice from the Jackson Laboratory. There was limited early effect. However, after approximately 6 months, MUC16c354 mice with p53+/- began to develop spontaneous sarcomatous soft tissue tumors and lymphoma at a higher rate than that of normal control animals. Selected tumors are shown in the panel insets of Figure 9D. Kaplan-Meier survival for these mice is shown in Figure 9E. MUC16c354:p53+/- mice showed significantly worse overall survival due to spontaneous tumor development (p < 0.014). The total number of tumors observed in each group was: p53 +/- mice, 20/107 mice; MUC16c354 and p53 +/- mice, 34/91 mice; MUC16c354 mice, 1/72 mice; wild-type mice, 0/91 mice. When 8 harvested tumors were examined for p53 genomic sequencing, all spontaneous tumors had loss of the normal p53 allele, indicating that MUC16-dependent tumor development also requires loss of normal p53 function. 6.1.3.5 Ovarian TCGA

[603] Com base nos fragmentos de MUC16 na transformação e agressividade de tumor nos modelos experimentais, a ligação entre as alterações genéticas em MUC16 e os resultados em câncer de ovário foi examinada. O projeto de câncer de ovário TCGA é uma coleção bem estudada que contém 316 cânceres de ovário serosos com dados completos, incluindo dados de resultadoclínico. Uma vez que a expressão de proteína de MUC16 é um condutor importante do comportamento do câncer, o impacto donúmero de cópia de MUC16 na expressão de mRNA de MUC16 foianalisado. A expressão de transcrição de MUC16 foi, em geral, relacionada ao número de cópia de gene de MUC16, embora houvesse uma ampla variação em expressão de transcrição de MUC16 em todos os grupos examinados (exceto, certamente, a deleção de homozigoto raro de MUC16). Na maioria dos casos, a expressão de mRNA de MUC16 foi aglomerada em números de transcrição maiores que as amostras de trompa de falópio normal incluídas como controles. O número de cópia de gene é aquele de várias variáveis que irão potencialmente alterar a expressão da proteína de MUC16, mas é evidente que a expressão de mRNA de MUC16 (e proteína de MUC16, certamente) é muitas vezes aumentada em câncer de ovário seroso. O impacto combinado da mutação ou superexpressão de MUC16 em resultados clínicos no conjunto de dados de TCGA também foi examinado. Quando o conjunto de dados de TCGA é dividido em quintis de expressão de MUC16, os 20% dos pacientes com expressão de MUC16 maior tiveram uma sobrevivência significativamente pior em relação aos pacientes com expressão de MUC16 menor (p=0,02969). Essa relação foi adicional fortalecida quando os 18 pacientes com mutações de MUC16 foram incluídos no grupo de expressão de MUC16 alta (p=0,02117), conforme mostrado na Figura 11A. Em conjunto, essa análise demonstra que a expressão de MUC16 tem um impacto adverso na sobrevivência de pacientes com câncer de ovário e confirma os efeitos biológicos negativos da expressão de MUC16 identificados nos presentes modelos pré-clínicos.[603] Based on MUC16 fragments in tumor transformation and aggressiveness in experimental models, the link between genetic alterations in MUC16 and outcomes in ovarian cancer was examined. The TCGA Ovarian Cancer Project is a well-studied collection containing 316 serous ovarian cancers with complete data, including clinical outcome data. Since MUC16 protein expression is an important driver of cancer behavior, the impact of MUC16 copy number on MUC16 mRNA expression was analyzed. MUC16 transcript expression was generally related to MUC16 gene copy number, although there was wide variation in MUC16 transcript expression across all groups examined (except, of course, the rare homozygous MUC16 deletion). In most cases, MUC16 mRNA expression was clustered at higher transcript numbers than the normal fallopian tube samples included as controls. Gene copy number is one of several variables that will potentially alter MUC16 protein expression, but it is clear that MUC16 mRNA expression (and indeed MUC16 protein) is often increased in serous ovarian cancer. The combined impact of MUC16 mutation or overexpression on clinical outcomes in the TCGA dataset was also examined. When the TCGA dataset is divided into quintiles of MUC16 expression, the 20% of patients with the highest MUC16 expression had significantly worse survival than those with the lowest MUC16 expression (p=0.02969). This relationship was further strengthened when the 18 patients with MUC16 mutations were included in the high MUC16 expression group (p=0.02117), as shown in Figure 11A. Taken together, this analysis demonstrates that MUC16 expression has an adverse impact on the survival of ovarian cancer patients and confirms the negative biological effects of MUC16 expression identified in the present preclinical models.

[604] Os cânceres de ovário demonstram muitas vezes a ativação da via PI3K. Essas ativações ocorrem principalmente através da amplificação e superexpressão em vez de eventos de mutação pontual, à medida que o câncer de ovário é, em geral, caracterizado por alterações no número de cópia. Com base na ativação da via PI3K/AKT nos presentes modelos de linhagem decélulas, a relação entre MUC16 e outras alterações genéticas deativação na via PI3K foi examinada. Conforme mostrado na Figura 11B, os eventos de mutação e superexpressão associados a MUC16são, em geral, complementares a outros eventos de via como perda de PTEN, amplificação de AKT1, AKT2 ou PI3KCA. O mecanismo dessa ativação de AKT conduzida por MUC16 permanece desconhecido. Adicionalmente, a função da ativação de ERK foi examinada, mas nenhuma ligação entre a expressão de MUC16 e mutações de via de ERK foi identificada.6.1.4 DiscussãoOvarian cancers often demonstrate activation of the PI3K pathway. These activations occur primarily through amplification and overexpression rather than point mutation events, as ovarian cancer is generally characterized by copy number alterations. Based on the activation of the PI3K/AKT pathway in the present cell line models, the relationship between MUC16 and other activating genetic alterations in the PI3K pathway was examined. As shown in Figure 11B, the mutation and overexpression events associated with MUC16 are generally complementary to other pathway events such as PTEN loss, amplification of AKT1, AKT2, or PI3KCA. The mechanism of this MUC16-driven AKT activation remains unknown. Additionally, the role of ERK activation has been examined, but no link between MUC16 expression and ERK pathway mutations has been identified. 6.1.4 Discussion

[605] MUC16, que codifica o antígeno CA125, circula no plasma de muitos pacientes com câncer de ovário (consulte, Referência 1 conforme citado na Seção 0, abaixo). MUC16 é exclusivo entre as mucinas presas por sua expressão limitada fora de tecidos mullerianos (consulte, Referências 2 e 14 conforme citado na Seção 0, abaixo). Embora cada vez mais visto como um fator de prognóstico adverso independente do volume de tumor, o mecanismo biológico para seu impacto negativo não foi bem entendido (consulte, Referência 18 conforme citado na Seção 0, abaixo). Aporção NH2 da molécula contém múltiplas repetições em tandem quecodificam o antígeno CA125 e parecem servir como parceiros de adesão importantes para mesotelina e algumas galectinas (Figura 1A) (consulte, Referências 5, 17 e 24 a 26 conforme citado naSeção 0, abaixo). Embora essas funções de adesão tenham sido sugeridas como críticas no resultado adverso relacionado a MUC16, esses estudos não explicam todas as alterações observadas em comportamento de célula de câncer de ovário. A clonagem da glicoproteína de MUC16 tem fornecido informações estruturais básicas sobre o produto de gene de MUC16 (consulte, Referências4 e 5 conforme citado na Seção 0, abaixo). Os dados apresentados nesse exemplo são os primeiros dados para indicar que MUC16 pode mediar a sinalização a partir do ambiente na célula de câncer, em particular, os dados apresentados nesse exemplo identificam o ectodomínio de MUC16 glicosilado como crítico para as alterações de MUC16 no comportamento de célula de câncer.[605] MUC16, which encodes the CA125 antigen, circulates in the plasma of many ovarian cancer patients (see, Reference 1 as cited in Section 0, below). MUC16 is unique among trapped mucins by its limited expression outside of Mullerian tissues (see, References 2 and 14 as cited in Section 0, below). Although increasingly viewed as an adverse prognostic factor independent of tumor volume, the biological mechanism for its negative impact has not been well understood (see, Reference 18 as cited in Section 0, below). The NH2 portion of the molecule contains multiple tandem repeats that encode the CA125 antigen and appear to serve as important adhesion partners for mesothelin and some galectins (Figure 1A) (see, References 5, 17, and 24 to 26 as cited in Section 0, below). Although these adhesion functions have been suggested as critical in MUC16-related adverse outcome, these studies do not explain all of the observed alterations in ovarian cancer cell behavior. The cloning of the MUC16 glycoprotein has provided basic structural information about the MUC16 gene product (see References 4 and 5 as cited in Section 0 below). The data presented in this example are the first data to indicate that MUC16 can mediate signaling from the environment into the cancer cell; in particular, the data presented in this example identify the glycosylated MUC16 ectodomain as critical for MUC16 alterations in cancer cell behavior.

[606] Esse exemplo demonstra que 114 aminoácidos a partir da terminação carbóxi de MUC16 são suficientes para transformar células NIH/3T3 (3T3), suportando tanto o crescimento em ágar macio aumento como a invasividade de matrigel aumentada. Embora outros tenham identificado a porção C-terminal mais proximal à membrana de MUC16 como os elementos críticos em comportamentos induzidos por MUC16, os mesmos ligam esses comportamentos aos locais de N-glicosilação no ectodomínio de MUC16 retido. Essas alterações estão associadas a um perfil de expressão de genes alterado e expressão aumentada de genes de invasão críticos, tais como MMP2, MMP9, CXCL12 e CDH11. Embora os elementos mais longos possam induzir um comportamento mais virulento, até os 114 aminoácidos residuais proximais ao local de clivagem putativo são suficientes em células 3T3 para induzir as mesmas alterações na expressão de genes de invasão. Ademais, a glicosilação de Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150) foi essencial para as propriedades oncogênicas de MUC16c114. Sem se ater à qualquer teoria particular, essas constatações são mais consistentes com uma transdução de sinal “de fora para dentro” pelas porções mais proximais da proteína, incluindo um domínio extracelular residual juntamente com o domínio transmembranar e cauda citoplasmática. Em contraste com os resultados de Theriault(Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434 a 443) eGiannakouros (Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91 a 98), a perda do domínio citoplasmático intracelular teve menos impacto do que a perda do ectodomínio glicosilado. Essas diferenças podem refletir as mutações específicas escolhidas e a metodologia para reduzir a expressão. O sinal “de dentro para fora” parece ativar uma transcrição de um programa de gene que facilita a implantação e crescimento de células que expressam MUC16 em camundongos nude e ágar macio. Quando as célulastransfectadas são examinadas acerca da ativação de vias oncogênicas comuns, tanto as vias AKT como ERK parecem serativadas pela expressão constitutiva de MUC16. O mecanismo pelo qual MUC16 aumenta a fosforilação de AKT/ERK não é claro e exigirá estudos adicionais. A ausência de receptores de coprecipitação sugere que outros mecanismos também podem estar envolvidos. Embora as sequências de MUC16 sejam muito diferentes, outras mucinas presas, incluindo tanto MUC1 como MUC4, têm sido mostradas agindo como oncogenes de geração de sinal em células 3T3 e fibroblastos de rato (consulte, Referências 8 e 9 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo). É provável que a função de mucinas na superfície de célula de câncer desempenhe funções importantes através de mecanismos que ainda estão sendo definidos.[606] This example demonstrates that 114 amino acids from the carboxy terminus of MUC16 are sufficient to transform NIH/3T3 (3T3) cells, supporting both increased soft agar growth and increased matrigel invasiveness. Although others have identified the more membrane-proximal C-terminal portion of MUC16 as the critical elements in MUC16-induced behaviors, they link these behaviors to N-glycosylation sites on the retained MUC16 ectodomain. These changes are associated with an altered gene expression profile and increased expression of critical invasion genes such as MMP2, MMP9, CXCL12, and CDH11. Although longer elements can induce more virulent behavior, even the residual 114 amino acids proximal to the putative cleavage site are sufficient in 3T3 cells to induce the same changes in invasion gene expression. Furthermore, glycosylation of Asn30 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)) was essential for the oncogenic properties of MUC16c114. Without being bound by any particular theory, these findings are most consistent with an “outside-in” signal transduction by the more proximal portions of the protein, including a residual extracellular domain along with the transmembrane domain and cytoplasmic tail. In contrast to the results of Theriault (Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434–443) and Giannakouros (Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91–98), the loss of the intracellular cytoplasmic domain had less impact than the loss of the glycosylated ectodomain. These differences may reflect the specific mutations chosen and the methodology for reducing expression. The “inside-out” signal appears to activate transcription of a gene program that facilitates the implantation and growth of MUC16-expressing cells in nude and soft agar mice. When transfected cells are examined for activation of common oncogenic pathways, both the AKT and ERK pathways appear to be activated by constitutive MUC16 expression. The mechanism by which MUC16 increases AKT/ERK phosphorylation is unclear and will require further study. The absence of coprecipitating receptors suggests that other mechanisms may also be involved. Although the sequences of MUC16 are very different, other trapped mucins, including both MUC1 and MUC4, have been shown to act as signal-generating oncogenes in 3T3 cells and mouse fibroblasts (see References 8 and 9 as cited in Section 6.1.5, below). It is likely that the function of mucins on the cancer cell surface important functions through mechanisms that are still being defined.

[607] Com base nas constatações em células 3T3, os resultados do experimento de camundongo transgênico de MUC16 são altamente favoráveis. Por si mesma, a mesma sequência 354 proximal de MUC16 poderia ser prontamente expressa em quase todos os tecidos murinos com nenhum efeito adverso no camundongo transgênico. A taxa de formação de tumor espontâneo foi muita baixa naqueles camundongos e a função reprodutora pareceu inalterada. Entretanto, como outros modelos de câncer de ovário de murino, a perda da função de p53 parece desempenhar uma função permissiva forte na formação de tumor dependente de MUC16 (consulte, Referência 27 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo). Esses resultados certamente são consistentes com a inativação de p53 uniforme, que caracteriza o câncer de ovário no conjunto de dados de TCGA.[607] Based on the findings in 3T3 cells, the results of the MUC16 transgenic mouse experiment are highly favorable. By itself, the same 354-proximal sequence of MUC16 could be readily expressed in almost all murine tissues with no adverse effects in the transgenic mouse. The rate of spontaneous tumor formation was very low in those mice, and reproductive function appeared unchanged. However, like other murine ovarian cancer models, loss of p53 function appears to play a strong permissive role in MUC16-dependent tumor formation (see Reference 27 as cited in Section 6.1.5, below). These results are certainly consistent with the uniform p53 inactivation that characterizes ovarian cancer in the TCGA dataset.

[608] Essas constatações descrevem as alterações ligadas a MUC16 no comportamento celular e transcrição de gene. Os modelos in vitro e in vivo são consistentes com os efeitos adversos de níveis de expressão de MUC16 em câncer de ovário seroso e promovem o entendimento de MUC16 como um colaborador patogênico para os comportamentos de câncer de ovário. O impacto adverso da expressão de CA125 crescente é consistente com o crescimento de tumor in vivo aumentado e letalidade de transfectantes MUC16 (+) 3T3 (consulte, Referência 18 conforme citado na Seção 6.1.5, abaixo).6.1.5 Referências citadas no Exemplo 1[608] These findings describe MUC16-linked alterations in cellular behavior and gene transcription. In vitro and in vivo models are consistent with the adverse effects of MUC16 expression levels in serous ovarian cancer and advance the understanding of MUC16 as a pathogenic contributor to ovarian cancer behaviors. The adverse impact of increasing CA125 expression is consistent with the increased in vivo tumor growth and lethality of MUC16(+) 3T3 transfectants (see Reference 18 as cited in Section 6.1.5, below).6.1.5 References cited in Example 1

[609] 1. Bast RC Jr, Klug TL, St John E, Jenison E, Niloff JM, et al. (1983) A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Engl J Med 309: 883 a 887.[609] 1. Bast RC Jr, Klug TL, St John E, Jenison E, Niloff JM, et al. (1983) A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Engl J Med 309: 883 to 887.

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[640] 32. Heller G, Vendatraman E (1996) Resamplingprocedures to compare two survival distributions in the presence of right censored data. Biometrics 52: 1.204 a 1.213.6.2 Exemplo 2: Anticorpos de glicosilação de MUC166.2.1 Introdução[640] 32. Heller G, Vendatraman E (1996) Resampling procedures to compare two survival distributions in the presence of right-censored data. Biometrics 52: 1204–1213. 6.2 Example 2: MUC166 glycosylation antibodies. 2.1 Introduction

[641] O antígeno CA125, reconhecido pelo anticorpo OC125 (consulte, Referência 1 conforme citado na Seção 0, abaixo) é umantígeno bastante glicosilado expresso nos domínios de repetiçãoem tandem a partir da porção extracelular da glicoproteína deMUC16 (consulte, Referências 2 e 3 conforme citado na Seção 0,abaixo). Esse antígeno em circulação é predominantemente derivado de tecidos mullerianos benignos ou malignos e é aprovado pela FDA como um marcador tumoral para câncer de ovário humano,mas sua função e papel na carcinogênese não são conhecidos (consulte, Referências 4-6 conforme citado na Seção 0, abaixo).MUC16 pertence a uma família de mucinas presas complexas e consiste em um domínio extracelular bastante glicosilado grande, um ectodomínio pequeno entre a membrana e o local de clivagem putativo, uma região transmembranar hidrofóbica e uma cauda intracelular curta (Figura 1) (consulte, Referências 7 e 8 conforme citado na Seção 0, abaixo). A maior parte da proteína de MUC16 é liberada no espaço circundante após a clivagem e o ectodomínio permanece sobre a superfície celular. OC125 e a maioria dos outros anticorpos monoclonais reativos a MUC16 (mAb) reagem com antígenos na região de repetição em tandem presente exclusivamente na porção clivada da molécula. Uma vez que esses epítopos são propensos a serem encontrados na circulação, o mAbs existente não pode ser usado para rastrear o destino do fragmento de proteína de MUC16 restante, e podem não refletir com exatidão a verdadeira distribuição da expressão de MUC16 (consulte, Referência 9 conforme citado na Seção 0, abaixo). Outros têm mostrado que as proteínas de superfície de glicosilação podem regular a proliferação e diferenciação celular através de interações à base de galectina 3 com os locais de N-glicosilação de receptores de tirosina quinase como EGFR, PDGFR e outros (KS Lau Cell 129:123, 2007). Conforme demonstrado no Exemplo 1(consulte, Seção 0), as partes proximais de MUC16 (apenas 114 aminoácidos) podem transformar células 3T3 imortalizadas e esseefeito parece ser anulado pela Tunicamicina.[641] The CA125 antigen, recognized by the OC125 antibody (see, Reference 1 as cited in Section 0, below) is a heavily glycosylated antigen expressed in the tandem repeat domains from the extracellular portion of the MUC16 glycoprotein (see, References 2 and 3 as cited in Section 0, below). This circulating antigen is predominantly derived from benign or malignant Mullerian tissues and is FDA-approved as a tumor marker for human ovarian cancer, but its function and role in carcinogenesis are not known (see, References 4-6 as cited in Section 0, below). MUC16 belongs to a family of complex mucin traps and consists of a large heavily glycosylated extracellular domain, a small ectodomain between the membrane and the putative cleavage site, a hydrophobic transmembrane region, and a short intracellular tail (Figure 1) (see, References 7 and 8 as cited in Section 0, below). Most of the MUC16 protein is released into the surrounding space after cleavage, and the ectodomain remains on the cell surface. OC125 and most other MUC16-reactive monoclonal antibodies (mAbs) react with antigens in the tandem repeat region present exclusively in the cleaved portion of the molecule. Because these epitopes are likely to be found in the circulation, existing mAbs cannot be used to track the fate of the remaining MUC16 protein fragment and may not accurately reflect the true distribution of MUC16 expression (see Reference 9 as cited in Section 0 below). Others have shown that surface glycosylation proteins can regulate cell proliferation and differentiation through galectin-3-based interactions with the N-glycosylation sites of receptor tyrosine kinases such as EGFR, PDGFR, and others (KS Lau Cell 129:123, 2007). As demonstrated in Example 1 (see Section 0), the proximal parts of MUC16 (only 114 amino acids) can transform immortalized 3T3 cells, and this effect appears to be abrogated by Tunicamycin.

[642] Esse exemplo demonstra os locais de glicosilação precisos que mediam esses efeitos e a função obrigatória de Galectina 3 em transformação dependente de MUC16. Dessa forma, os anticorpos com capacidade para se ligar à sequência de peptídeos proximal (por exemplo, MUC16c114) em uma maneira específica de glicosilação foram desenvolvidos para inibir as funções principais de câncer mediadas por MUC16, tais como adesão e invasão. Os anticorpos monoclonais dirigidos no local de N- glicosilação crucial dentro do ectodomínio de MUC16 foram gerados com o uso de antígenos de N-glicopeptídeo sintéticos definidos como imitações de epítopo principais. Esses anticorpos inibiram a biologia oncogênica de MUC16 mediante a diminuição de invasão de matrigel conduzida por MUC16, ativação de oncogene e crescimento de tumor em contraste com outros mAbs dirigidos para proteína não glicosilados que não tiveram efeito. Esses anticorpos demonstraram um mecanismo para a transformação de mucina e fornecem uma ferramenta útil para o uso diagnóstico e terapêutico em tumores positivos para MUC16.6.2.2 Materiais e métodos6.2.2.1 Síntese de glicopeptídeos[642] This example demonstrates the precise glycosylation sites that mediate these effects and the obligatory role of Galectin 3 in MUC16-dependent transformation. Therefore, antibodies capable of binding to the proximal peptide sequence (e.g., MUC16c114) in a glycosylation-specific manner were developed to inhibit key MUC16-mediated cancer functions, such as adhesion and invasion. Monoclonal antibodies directed at the crucial N-glycosylation site within the MUC16 ectodomain were generated using synthetic N-glycopeptide antigens defined as major epitope mimics. These antibodies inhibited the oncogenic biology of MUC16 by decreasing MUC16-driven matrigel invasion, oncogene activation, and tumor growth in contrast to other mAbs directed to non-glycosylated proteins that had no effect. These antibodies demonstrated a mechanism for mucin transformation and provide a useful tool for diagnostic and therapeutic use in MUC16-positive tumors.6.2.2 Materials and methods6.2.2.1 Glycopeptide synthesis

[643] Os anticorpos específicos para o terceiro local de glicosilação (Asn30, análogo a Asn1806 de MUC16) de uma sequência de 55 aminoácidos de MUC16 (MUC16c55:NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNS (SEQ ID NO: 129) foram gerados com o uso de glicopeptídeos sintéticoscomo imitações de epítopo principal que incorporam uma chitobiose bem definida (GlcNAc2) em Asn30 de MUC16c55 (SEQ ID NO: 129, FIG. 13). A síntese do N-glicopeptídeo homogêneo foialtamente convergente e envolveu um acoplamento entre o peptídeo de comprimento total parcialmente protegido (MUC16c55; SEQ ID NO: 129) e a chitobiose amina sob condições de aspartilação de Lansbury (consulte, Referência 11 conforme citado na Seção 0, abaixo). MUC16c55 (SEQ ID NO: 129) foi obtido por síntese de peptídeo de fase sólida Fmoc assistida por micro-ondas (SPPS), seguido de N-acetilação em resina (Ac2O, DIEA), desalilação de Asp30 (Pd(PPh3)4, PhSiH3) e clivagem subsequente fora da resina (1 a 2% de TFA/CH2Cl2). Com o uso de um procedimento de aspartilação/desproteção em um frasco (conforme descrito na Referência 12 conforme citado na Seção 0, abaixo), a cadeia lateral de ácido carboxílico livre na posição Asn30 foi acoplada com chitobiose amina (consulte, Referência 13 conforme citado na Seção 0, abaixo), seguido de tratamento de TFA (Coquetel R: 90% de TFA, 5% de tioanisol, 3% de etanoditiol, 2% de anisol) para fornecer glicopeptídeo GlcNAc2-55-mer. A presença de motivos de pseudoprolina serviu para mitigar a formação de aspartimida indesejada durante a aspartilação.[643] Antibodies specific for the third glycosylation site (Asn30, analogous to Asn1806 of MUC16) of a 55-amino acid sequence of MUC16 (MUC16c55:NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNS (SEQ ID NO: 129) were generated using synthetic glycopeptides as major epitope mimics that incorporate a well-defined chitobiose (GlcNAc2) at Asn30 of MUC16c55 (SEQ ID NO: 129, FIG. 13). The synthesis of the homogeneous N-glycopeptide was highly convergent and involved a coupling between the partially protected full-length peptide (MUC16c55; SEQ ID NO: 129) and the chitobiose amine under Lansbury aspartylation conditions (see, Reference 11 as cited in Section 0, below). MUC16c55 (SEQ ID NO: 129) was obtained by microwave-assisted Fmoc solid-phase peptide synthesis (SPPS), followed by on-resin N-acetylation (Ac2O, DIEA), Asp30 de-allylation (Pd(PPh3)4, PhSiH3), and subsequent off-resin cleavage (1–2% TFA/CH2Cl2). Using a one-vial aspartylation/deprotection procedure (as described in Reference 12 as cited in Section 0, below), the free carboxylic acid side chain at position Asn30 was coupled with chitobiose amine (see, Reference 13 as cited in Section 0, below), followed by TFA treatment (Cocktail R: 90% TFA, 5% thioanisole, 3% ethanedithiol, 2% anisole) to furnish glycopeptide GlcNAc2-55-mer. The presence of pseudoproline motifs served to mitigate the formation of unwanted aspartimide during aspartylation.

[644] Além disso, o peptídeo que contém Man3GlcNAc2 foi preparado em uma sequência de um frasco similar.[644] Furthermore, the Man3GlcNAc2-containing peptide was prepared in a similar one-vial sequence.

[645] Os glicopeptídeos mais curtos que abrangem Asn30 e Asn24 (análogos a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16) de MUC16c55 (SEQ ID NO: 129) foram preparados (1) 18-mer:CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 130) e (2) 15-mer:CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 131). Os glicopeptídeos 18-mer e 15- mer foram conjugados em hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH). O 15-mer (SEQ ID NO: 131) incorporou chitobiose em Asn7 (análogo a Asn1806 de MUC16). Os glicopeptídeos 15-mer foram sintetizados de uma maneira análoga à síntese dos glicopeptídeos 55mer.[645] Shorter glycopeptides spanning Asn30 and Asn24 (analogous to Asn1800 and Asn1806, respectively, of MUC16) of MUC16c55 (SEQ ID NO: 129) were prepared (1) 18-mer:CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 130) and (2) 15-mer:CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID NO: 131). The 18-mer and 15-mer glycopeptides were conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH). The 15-mer (SEQ ID NO: 131) incorporated chitobiose at Asn7 (analogous to Asn1806 of MUC16). The 15-mer glycopeptides were synthesized in a manner analogous to the synthesis of 55-mer glycopeptides.

[646] O 18-mer (SEQ ID NO: 130) incorporou chitobiose em Asn4 e Asn10 (análogo a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16). A proteção de alila de Asn4 e Asn10 do 18-mer (análogo a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16) resultou na formação de aspartimida significativa. Dessa forma, o O-2- fenilisopropil éster mais impedido (O-2-PhiPr, OPp) foi usado na SPPS para fornecer, após a N-acetilação, e clivagem de resina/remoção de OPp simultânea (1 a 2% de TFA/CH2Cl2), o peptídeo parcialmente protegido com cadeias laterais de Asn4 e Asn10 livres do 18-mer (análogo a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16). A instalação altamente convergente de duas unidades de chitobiose através de uma aspartilação de Lansbury dupla, seguido de desproteção de ácido global foi realizada para gerar o peptídeo 18-mer bis-glicosilado (27% após a purificação de HPLC).[646] The 18-mer (SEQ ID NO: 130) incorporated chitobiose at Asn4 and Asn10 (analogous to Asn1800 and Asn1806, respectively, of MUC16). Allyl protection of Asn4 and Asn10 of the 18-mer (analogous to Asn1800 and Asn1806, respectively, of MUC16) resulted in significant aspartimide formation. Therefore, the more hindered O-2-phenylisopropyl ester (O-2-PhiPr, OPp) was used in SPPS to provide, after N-acetylation and simultaneous resin cleavage/OPp removal (1-2% TFA/CH2Cl2), the partially protected peptide with free Asn4 and Asn10 side chains of the 18-mer (analogous to Asn1800 and Asn1806, respectively, of MUC16). Highly convergent installation of two chitobiose units via a double Lansbury aspartylation followed by global acid deprotection was performed to generate the bis-glycosylated 18-mer peptide (27% after HPLC purification).

[647] O acoplamento final dos resíduos de cisteína N- terminais dos glicopeptídeos 18-mer e 15-mer com a proteína de carreador derivada de maleimida forneceu os construtos conjugados a KLH para a vacinação de camundongo.6.2.2.2 Protocolo de imunização de camundongo[647] Final coupling of the N-terminal cysteine residues of the 18-mer and 15-mer glycopeptides with the maleimide-derived carrier protein provided the KLH-conjugated constructs for mouse vaccination.6.2.2.2 Mouse Immunization Protocol

[648] Cinco camundongos BALB/c e cinco camundongos Swiss Webster foram imunizados com o glicopeptídeo 55-mer (consulte, Seção 0) três vezes a cada três semanas na presença de 25 μl de adjuvante Titermax para imunizar os camundongos. Três semanas depois, os camundongos foram imunizados com uma mistura de construtos conjugados a KLH 15-mer monoglicosilados (SEQ ID NO: 131) e 18-mer bis-glicosilados (SEQ ID NO: 130). Os soros foram analisados acerca da reatividade contra 55-mer GlcNAc2- glicosilado e os glicopeptídeos mais curtos não conjugados a KLH. Os peptídeos 55-mer, 15-mer e 18-mer não glicosilados, juntamente com dois peptídeos que contêm chitobiose não relacionada a MUC16 foram usados como controles negativos para triagem. Os camundongos foram adicionalmente imunizados com os conjugados a KLH 15-mer e 18-mer duas vezes mais a cada três semanas e as respostas foram analisadas por ELISA após cada imunização.6.2.2.3 Invasão[648] Five BALB/c mice and five Swiss Webster mice were immunized with the 55-mer glycopeptide (see, Section 0) three times every three weeks in the presence of 25 μL of Titermax adjuvant to immunize the mice. Three weeks later, the mice were immunized with a mixture of monoglycosylated 15-mer (SEQ ID NO: 131) and bis-glycosylated 18-mer (SEQ ID NO: 130) KLH-conjugated constructs. Sera were analyzed for reactivity against the GlcNAc2-glycosylated 55-mer and the shorter non-KLH-conjugated glycopeptides. The non-glycosylated 55-mer, 15-mer, and 18-mer peptides, along with two chitobiose-containing peptides unrelated to MUC16, were used as negative controls for screening. Mice were additionally immunized with the 15-mer and 18-mer KLH conjugates twice more every three weeks and responses were analyzed by ELISA after each immunization.6.2.2.3 Invasion

[649] Consulte, Seção 0. Para os experimentos de shRNA, as câmaras ou elementos de inserção de invasão BD BioCoat™ Matrigel™ (número de catálogo 354480 em placa de 24 poços) e elementos de inserção de controle (número de catálogo 354578 em placa de 24 poços) foram adquiridos junto à BD Biosciences, MA. O ensaio de invasão de matrigel foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, as câmaras de matrigel em placas de 24 poços (armazenadas a -20 °C) e elementos de inserção de controle(armazenados a 4 °C) foram deixados atingir a temperaturaambiente. Ambos os elementos de inserção foram reidratados com 0,5 ml de meio sem soro no elemento de inserção, bem como no poço externo da placa de 24 poços, durante 2 horas no incubador umidificado a 37 °C, 5% de CO2. As células SKOV3 cultivadas foramtripsinizadas e lavadas com meio de cultura. Um milhão de célulasfoi separado em um outro tubo de centrífuga e lavado 3 vezes commeio sem soro. Essas células foram posteriormente ajustadas para gerar 5.000 células em 0,5 ml de meio sem soro. O meio nos elementos de inserção reidratados foi removido e o elemento deinserção foi transferido para uma nova placa de 24 poços quecontém 0,75 ml de meio de cultura que contém soro bovino fetal a 10% (FBS) no poço que serve como um quimioatraente. Imediatamente, 0,5 ml das células (5.000 células) em meio sem soro foi adicionado ao elemento de inserção. Foi tomado cuidadoadequado para observar que não há bolha de ar capturada no elemento de inserção e no poço externo. A placa de 24 poços foi incubada no incubador umidificado a 37 °C, 5% de CO2 durante 48h. Após a incubação, as células não invasoras são removidas da superfície superior da membrana por meio de “esfregação” mediante a inserção de uma haste com ponta de algodão no matrigel ou elemento de inserção de controle e aplicou-se pressão delicadamente mediante o movimento da ponta da haste sobre a superfície da membrana. A esfregação foi repetida com uma segunda haste umedecida com meio. Então, os elementos de inserção foram manchados em uma nova placa de 24 poços que contém 0,5 ml detinta violeta de cristal a 0,5% em água destilada durante 30minutos. Após a coloração, os elementos de inserção foram enxaguados em 3 béqueres de água destilada para remover o excesso de tinta. Os elementos de inserção foram secos ao ar em uma nova placa de 24 poços. As células invadidas foram contadas manualmente sob um microscópio invertido em ampliação de 200 X. Vários campos de membranas em triplicata foram contados e registrados na figura.6.2.2.4 Crescimento de tumor em camundongos nude atímicos[649] See Section 0. For shRNA experiments, BD BioCoat™ Matrigel™ invasion chambers or inserts (catalog number 354480 in 24-well plate) and control inserts (catalog number 354578 in 24-well plate) were purchased from BD Biosciences, MA. The matrigel invasion assay was performed according to the manufacturer's protocol. Briefly, matrigel chambers in 24-well plates (stored at -20°C) and control inserts (stored at 4°C) were allowed to reach room temperature. Both inserts were rehydrated with 0.5 ml of serum-free medium on the insert, as well as in the outer well of the 24-well plate, for 2 hours in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2. The cultured SKOV3 cells were trypsinized and washed with culture medium. One million cells were separated into a separate centrifuge tube and washed three times with serum-free medium. These cells were then adjusted to yield 5,000 cells in 0.5 ml of serum-free medium. The medium in the rehydrated inserts was removed, and the insert was transferred to a new 24-well plate containing 0.75 ml of culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in the well, which serves as a chemoattractant. Immediately, 0.5 ml of the cells (5,000 cells) in serum-free medium was added to the insert. Adequate care was taken to ensure that no air bubbles were trapped in the insert or in the outer well. The 24-well plate was incubated in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2 for 48 h. After incubation, non-invasive cells were removed from the upper membrane surface by "swabbing" by inserting a cotton-tipped swab into the Matrigel or control insert and gently applying pressure by moving the swab tip over the membrane surface. The scrubbing was repeated with a second swab moistened with medium. The inserts were then stained in a new 24-well plate containing 0.5 ml of 0.5% crystal violet dye in distilled water for 30 minutes. After staining, the inserts were rinsed in 3 beakers of distilled water to remove excess dye. The inserts were air-dried in a new 24-well plate. Invaded cells were counted manually under an inverted microscope at 200X magnification. Multiple membrane fields in triplicate were counted and recorded in the figure. 6.2.2.4 Tumor growth in athymic nude mice

[650] Consulte, Seção 0.6.2.2.5 Ensaio de ligação de glicopeptídeos biotinilados[650] See Section 0.6.2.2.5 Biotinylated Glycopeptide Binding Assay

[651] A afinidade de ligação foi determinada com o uso de ForeBio Octet QK. 5 μg/ml de glicopeptídeo 18-mer conjugado a chitobiose biotinilada foram carregados em um biossensor de estreptavidina. Após a remoção por lavagem do excesso de antígeno, os anticorpos de camundongo foram testados a 10 μg/ml para as etapas de associação e dissociação, respectivamente. Os parâmetros de ligação foram calculados com o uso do ajuste parcial de modelo de sítio de ligação 1:1.6.2.2.6 Imunoistoquímica de micromatriz de tecido[651] Binding affinity was determined using ForeBio Octet QK. 5 μg/ml of 18-mer glycopeptide conjugated to biotinylated chitobiose was loaded onto a streptavidin biosensor. After washing away excess antigen, mouse antibodies were tested at 10 μg/ml for the association and dissociation steps, respectively. Binding parameters were calculated using a 1:1 partial binding site model fit.6.2.2.6 Tissue Microarray Immunohistochemistry

[652] As biópsias de agulha nuclear de tecido impregnado em parafina pré-existente foram obtidas a partir dos chamados blocos de doador e, então, deslocadas para um bloco "principal" com matriz de parafina receptor com o uso das técnicas de Kononen et al. (consulte, Kononen J, et al. Nat Med 1998;4(7):8447) e subsequentemente modificadas por Hedvat et al (consulte, Hedvat CV et al. Hum Pathol 2002;33(10):968 a 974). Um Tissue Arrayer MTA-1 operado manualmente disponível junto à Beecher Instruments Inc. (Sun Prairie, WI) foi usado para produzir pontos circulares de amostra (núcleos) que mediram 0,6 a 1,0 mm de diâmetro. Os núcleos foram dispostos em matriz 0,3 a 0,4 mm separados um do outro. Uma camada de tecidos de controle foi estrategicamente disposta ao redor das micromatrizes de tecido real a fim de evitar efeitos periféricos. A composição específica de cada micromatriz de tecido é descrita abaixo. As lâminas de micromatrizes de tecido para câncer de ovário ou tecido de controle foram preparadas cortando-se seções de 4 um a partir do tecido impregnado em parafina fixo com formalina.[652] Core needle biopsies of preexisting paraffin-embedded tissue were obtained from so-called donor blocks and then shifted into a recipient paraffin matrix "master" block using the techniques of Kononen et al. (see, Kononen J, et al. Nat Med 1998;4(7):8447) and subsequently modified by Hedvat et al (see, Hedvat CV et al. Hum Pathol 2002;33(10):968–974). A manually operated MTA-1 Tissue Arrayer available from Beecher Instruments Inc. (Sun Prairie, WI) was used to produce circular sample spots (cores) that measured 0.6 to 1.0 mm in diameter. The cores were arrayed 0.3 to 0.4 mm apart. A layer of control tissues was strategically placed around the real tissue microarrays to avoid peripheral effects. The specific composition of each tissue microarray is described below. Tissue microarray slides for ovarian cancer or control tissue were prepared by cutting 4 µm sections from formalin-fixed paraffin-embedded tissue.

[653] A imunoistoquímica foi realizada nas micromatrizes de tecido padrão OC125 (Ventana, Tuscon, AZ), 4H11 (consulte, Rao et al. (PCT) Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462 a 72) e no anticorpo monoclonal 19C11. As seções das micromatrizes de tecido foram cortadas em 4 mícrons, colocadas em lâminas para microscópio Superfrost/Plus (marca Fisher) e assadas em um forno de 60 ° durante pelo menos 60 minutos. As lâminas foram, então, desparafinadas e hidratadas em água destilada, embebidas em tampão de citrato em pH 6,00 durante 30 minutos a 97 °C, lavadas em água corrente durante 2 a 5 minutos, incubadas durante 5 minutos em peróxido de hidrogênio a 3% diluído em água destilada. As lâminas foram lavadas em água destilada durante 1 minuto, transferidas para um banho de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, para duas alterações de 5 minutos cada e colocadas em BSA a 0,05% diluído em PBS durante um mínimo de 1 minuto. Após a secagem ao redor das seções de tecido, o soro normal foi aplicado em uma diluição de 1:20 em BSA/PBS a 2% e incubado durante um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente em uma câmara de atmosfera úmida. O soro foi, então, removido por sucção sem deixar as seções secarem, e aproximadamente 150 lambda de novo anticorpo em uma diluição de 1:1.000 foram colocadas sobre o tecido. A lâmina foi incubada de um dia para o outro (aproximadamente 15 a 18 horas) a 4 °C em uma câmara de atmosfera úmida. O anticorpo primário foi removido por lavagem com o uso de três alterações de PBS durante 10 minutos cada. O anticorpo secundário, α-camundongo biotinilado disponível junto à Vector laboratories (Burlingame, Ca), foi aplicado em diluição de 1:500 em um BSA/PBS a 1% e incubado durante 45 a 60 minutos à temperatura ambiente em câmara de atmosfera úmida. O anticorpo foi removido por lavagem novamente com o uso de três alterações de PBS conforme acima. As lâminas foram, então, transferidas para um banho de diaminobenzidina (DAB), diluído em PBS durante 5 a 15 minutos. As lâminas foram, então, lavadas em água de torneira durante 1 minuto, contracoloridas com o uso de hematoxilina modificada por Harris (Fisher), descoloridas com 1% de álcool ácido e azul em água amoníaca, desidratadas com 3 alterações cada de etanol a 95%, etanol a 100% e xileno durante 2 minutos cada e cobertas com lamela com meio de montagem permanente.6.2.2.7 Ensaio de internalização[653] Immunohistochemistry was performed on standard tissue microarrays OC125 (Ventana, Tuscon, AZ), 4H11 (see, Rao et al. (PCT) Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462–72), and the monoclonal antibody 19C11. Tissue microarray sections were cut at 4 microns, placed on Superfrost/Plus microscope slides (Fisher brand), and baked in a 60° oven for at least 60 minutes. The slides were then deparaffinized and hydrated in distilled water, embedded in citrate buffer at pH 6.00 for 30 minutes at 97°C, washed in running tap water for 2–5 minutes, incubated for 5 minutes in 3% hydrogen peroxide diluted in distilled water. The slides were washed in distilled water for 1 minute, transferred to a bath of phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, for two changes of 5 minutes each, and placed in 0.05% BSA diluted in PBS for a minimum of 1 minute. After drying around the tissue sections, normal serum was applied at a 1:20 dilution in 2% BSA/PBS and incubated for a minimum of 10 minutes at room temperature in a humidified atmosphere chamber. The serum was then removed by suction without allowing the sections to dry, and approximately 150 lambda of new antibody at a 1:1,000 dilution was spotted onto the tissue. The slide was incubated overnight (approximately 15–18 hours) at 4°C in a humidified atmosphere chamber. The primary antibody was removed by washing with three changes of PBS for 10 minutes each. The secondary antibody, biotinylated α-mouse, available from Vector Laboratories (Burlingame, CA), was applied at a 1:500 dilution in 1% BSA/PBS and incubated for 45 to 60 minutes at room temperature in a humidified atmosphere chamber. The antibody was washed again with three changes of PBS as above. The slides were then transferred to a diaminobenzidine (DAB) bath diluted in PBS for 5 to 15 minutes. The slides were then washed in tap water for 1 minute, counterstained with Harris-modified hematoxylin (Fisher), destained with 1% acid-base and blue ammonia, dehydrated with three changes each of 95% ethanol, 100% ethanol, and xylene for 2 minutes each, and coverslipped with permanent mounting medium. 6.2.2.7 Internalization Assay

[654] A internalização de 89Zr-19C11 foi investigada em células SKOV3 que expressam MUC16c114. Aproximadamente 1 x 105 células foram semeadas em uma placa de 12 poços e incubadas de um dia para o outro no incubador a 37 °C e 5% de CO2. Um volumede proteína radiomarcada foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 37 °C e 4 °C durante 1, 5, 12 e 24 horas. Apóscada período de incubação, o meio foi coletado e as células foram enxaguadas com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A atividade ligada à superfície foi coletada lavando-seas células em 1 ml de ácido acético a 100 mM com glicina a 100mM (1:1, pH 3,5) a 4 °C. As células aderentes foram, então,lisadas com 1 ml de NaOH a 1 M. Cada lavagem foi coletada e contada acerca da atividade. A razão entre a atividade da lavagem final e a atividade total de todas as lavagens foi usada para determinar a % internalizada.6.2.3 Resultados6.2.3.1 PAtobiologia de MUC16 é dependente da N-glicosilação de ectodomínio de MUC16 C-terminal.[654] Internalization of 89Zr-19C11 was investigated in SKOV3 cells expressing MUC16c114. Approximately 1 × 105 cells were seeded in a 12-well plate and incubated overnight in the incubator at 37 °C and 5% CO2. A volume of radiolabeled protein was added to each well and the plates were incubated at 37 °C and 4 °C for 1, 5, 12, and 24 hours. After each incubation period, the medium was collected and the cells were rinsed with 1 ml of phosphate-buffered saline (PBS). Surface-bound activity was collected by washing the cells in 1 ml of 100 mM acetic acid with 100 mM glycine (1:1, pH 3.5) at 4 °C. Adherent cells were then lysed with 1 ml of 1 M NaOH. Each wash was collected and counted for activity. The ratio of the activity of the final wash to the total activity of all washes was used to determine the % internalized.6.2.3 Results6.2.3.1 PAthobiology of MUC16 is dependent on N-glycosylation of the MUC16 C-terminal ectodomain.

[655] O Exemplo 1 (consulte, Seção 0) demonstrou que aexpressão de MUC16c114 resultou em um comportamento in vitro / in vivo mais agressivo de fibroblastos de camundongo 3T3, resultando em aumento significativo em invasão de matrigel conduzida por MUC16c114 e um crescimento de tumor mais rápido in vivo. Dessa forma, a linhagem de células SKOV-3 (uma linhagem de células de ovário humano que carece da expressão de MUC16), foi examinada acerca do efeito de propriedades dependentes de MUC16c114. A expressão de MUC16c114 levou à expressão de superfície celular e um aumento de quase 3 vezes na invasão de matrigel (comparar faixas 1 e 2 da Figura 12A). Esse aumento em invasão foi dependente da N-glicosilação de asparagina na posição de aminoácido 1 (Asn1), 24 (Asn24) e 30 (Asn 30) de MUC16c114 (quecorresponde a Asn1777, Asn1800 e Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ IDNO: 150), respectivamente; MUC16c114-N123), como mutação de Asn30em alanina (MUC16c114-N3, Figura 12A, faixa 3), mutação de Asn1 e Asn24 em alanina (MUC16c114-N12, Figura 12A, faixa 4) e mutação de Asn1, Asn24 e Asn30 em alanina (MUC16c114-N123, Figura 12A, faixa 4), invasão de matrigel anulada. Consulte, também a Figura 12B. Ademais, a invasão de matrigel aumentada induzida por MUC16c114 foi dependente de MGAT5 (a primeira enzima envolvida na reação de N-glicosilação) e/ou LGALS3 (uma enzima amplificada em muitos cânceres serosos de alto grau), à medida que experimentos deknockdown shRNA que reduziram a expressão de MGAT5 ou LGALS3 tiveram um efeito similar à mutação de MUC16c114 nos locais de N- glicosilação e invasão reduzida a níveis quase basais (Figura 12A, faixas 6 a 10).[655] Example 1 (see, Section 0) demonstrated that expression of MUC16c114 resulted in more aggressive in vitro/in vivo behavior of 3T3 mouse fibroblasts, resulting in a significant increase in MUC16c114-driven matrigel invasion and faster tumor growth in vivo. Therefore, the SKOV-3 cell line (a human ovarian cell line that lacks MUC16 expression) was examined for the effect of MUC16c114-dependent properties. Expression of MUC16c114 led to cell surface expression and a nearly 3-fold increase in matrigel invasion (compare lanes 1 and 2 of Figure 12A). This increase in invasion was dependent on N-glycosylation of asparagine at amino acid position 1 (Asn1), 24 (Asn24), and 30 (Asn 30) of MUC16c114 (which corresponds to Asn1777, Asn1800, and Asn1806 of mature MUC16 (SEQ IDNO: 150), respectively; MUC16c114-N123), as mutation of Asn30 to alanine (MUC16c114-N3, Figure 12A, lane 3), mutation of Asn1 and Asn24 to alanine (MUC16c114-N12, Figure 12A, lane 4), and mutation of Asn1, Asn24, and Asn30 to alanine (MUC16c114-N123, Figure 12A, lane 4), abrogated matrigel invasion. See also Figure 12B. Furthermore, MUC16c114-induced increased matrigel invasion was dependent on MGAT5 (the first enzyme involved in the N-glycosylation reaction) and/or LGALS3 (an enzyme amplified in many high-grade serous cancers), as shRNA knockdown experiments that reduced MGAT5 or LGALS3 expression had a similar effect as mutating MUC16c114 at the N-glycosylation sites and reduced invasion to near-basal levels (Figure 12A, lanes 6–10).

[656] A marca mais inequívoca da transformação oncogênica é a capacidade para promover o crescimento em camundongos imunodeficientes. Com a finalidade de medir os efeitos de N- glicosilação de MUC16, MGAT5, e LGALS2 na taxa de crescimento de tumor, um modelo de tumor de flanco foi usado para facilitar as medições de tumor regulares. Conforme mostrado na Figura 12C, quando as linhagens de células 3T3 que expressam vetor (phrGFP), MUC16c114, MUC16c114-N123, MUC16c114 e um shRNA anti-MGAT5 (MUC16c114- shMGAT5), ou MUC16c114 e um shRNA anti-LGALS3 (MUC16c114-shLGALS3) foram implantadas nos flancos de camundongos nude atímicos, apenas as células 3T3 de MUC16c114 formaram tumores maiores em comparação com os controles apenas de vetor em 24 dias. Esses dados corroboram as análises in vitro que indica que N- glicosilação de MUC16, MGAT5 e LGALS3 são necessários para o crescimento de tumor.6.2.3.2 Síntese de N-glicopeptídeos homogêneos como imitações de epítopo principal para o desenvolvimento de mAb[656] The most unequivocal hallmark of oncogenic transformation is the ability to promote growth in immunodeficient mice. In order to measure the effects of N-glycosylation of MUC16, MGAT5, and LGALS2 on tumor growth rate, a flank tumor model was used to facilitate regular tumor measurements. As shown in Figure 12C, when 3T3 cell lines expressing vector (phrGFP), MUC16c114, MUC16c114-N123, MUC16c114 and an anti-MGAT5 shRNA (MUC16c114-shMGAT5), or MUC16c114 and an anti-LGALS3 shRNA (MUC16c114-shLGALS3) were implanted into the flanks of athymic nude mice, MUC16c114-only 3T3 cells formed larger tumors compared with vector-only controls at 24 days. These data corroborate in vitro analyses indicating that N-glycosylation of MUC16, MGAT5, and LGALS3 are required for tumor growth.6.2.3.2 Synthesis of homogeneous N-glycopeptides as core epitope mimics for mAb development

[657] Uma vez que a N-glicosilação no sítio de Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn 1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150); MUC16c114-N3) foi determinada como um requisito central para a ação oncogênica de MUC16, a perfilagem de glicano de MUC16c114- N12 expresso em células SKOV3 foi realizada, à medida que MUC16c114- N12 retém a capacidade para ser N-glicosilado em Asn30 (que corresponde a Asn 1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)). A análise de glicoma mostrou um padrão de N-glicosilação altamente diverso para esse fragmento de MUC16 C-terminal, com a haste de chitobiose crítica (GlcNAc2) como a unidade de repetição mínima a qual diversas porções químicas de manose são fixadas (Figura 13A).[657] Since N-glycosylation at the Asn30 site of MUC16c114 (which corresponds to Asn 1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150); MUC16c114-N3) was determined to be a central requirement for the oncogenic action of MUC16, glycan profiling of MUC16c114-N12 expressed in SKOV3 cells was performed, as MUC16c114-N12 retains the ability to be N-glycosylated at Asn30 (which corresponds to Asn 1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)). Glycoma analysis showed a highly diverse N-glycosylation pattern for this C-terminal MUC16 fragment, with the critical chitobiose stalk (GlcNAc2) as the minimal repeating unit to which several mannose moieties are attached (Figure 13A).

[658] Dessa forma, foram gerados mAbs dirigidos para glicosilação em um esforço para inibir os efeitos dependentes de glicosilação de MUC16 em metástase e invasão. Esses anticorpos foram projetados para direcionarem epítopos de N-glicopeptídeo que contêm o terceiro local de glicosilação crucial (Asn30 de MUC16c114) em uma sequência de 55 aminoácidos mais curta dentro do ectodomínio de MUC16 (MUC16C55; SEQ ID NO: 129). Consulte, Seção 6.2.2.1 e Figura 13B, Figura 13C e Figura 13D para uma descrição da síntese dos glicopeptídeos usados como imunógenos. Consulte, Seção 6.2.2.2 para uma descrição do processo de imunização.[658] Therefore, glycosylation-directed mAbs were generated in an effort to inhibit the glycosylation-dependent effects of MUC16 on metastasis and invasion. These antibodies were designed to target N-glycopeptide epitopes that contain the crucial third glycosylation site (Asn30 of MUC16c114) in a shorter 55 amino acid sequence within the ectodomain of MUC16 (MUC16C55; SEQ ID NO: 129). See, Section 6.2.2.1 and Figure 13B, Figure 13C, and Figure 13D for a description of the synthesis of the glycopeptides used as immunogens. See, Section 6.2.2.2 for a description of the immunization process.

[659] Os anticorpos foram gerados por meio da imunização com glicopeptídeos de MUC16 curtos (55-mer, 18-mer e 15-mer) que compreendem chitobiose nos resíduos de aminoácido que correspondem a Asn24 e/ou Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)). Adicionalmente a ser o motivo menor comum para N glicanos maiores, a chitobiose também possibilitaria uma exposição melhor do peptídeo derivado de MUC16 subjacente para induzir anticorpos que não apenas mostram dependência do glicano, mas também especificidade de peptídeo. Essa hipoglicosilação é uma característica distintiva frequente em glicoproteínas de mucina sobre a superfície de células tumorais em comparação com células normais.6.2.3.3 Vacinação de camundongo com glicopeptídeos/glicoconjugados sintéticos e ensaios sorológicos[659] Antibodies were generated by immunization with short MUC16 glycopeptides (55-mer, 18-mer, and 15-mer) comprising chitobiose at the amino acid residues corresponding to Asn24 and/or Asn30 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1800 and Asn1806, respectively, of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)). In addition to being the common minor motif for larger N-glycans, chitobiose would also enable better exposure of the underlying MUC16-derived peptide to induce antibodies that not only show glycan dependence but also peptide specificity. This hypoglycosylation is a frequent distinguishing feature in mucin glycoproteins on the surface of tumor cells compared to normal cells. 6.2.3.3 Mouse Vaccination with Synthetic Glycopeptides/Glycoconjugates and Serological Assays

[660] A vacinação de camundongo e coleta de soros foi realizada de acordo com o protocolo descrito na Seção 0. Após três imunizações com GlcNAc2-55-mer (Figura 13B), os camundongos foram adicionalmente imunizados com uma mistura de construtos conjugados a KLH (mono-glicosilado 15-mer (SEQ ID NO: 131; Figura 13C) e bis-glicosilado 18-mer (SEQ ID NO: 130; Figura 13D)), dois dentre dez camundongos mostraram sinais de ELISA positivos para ambos 55-mers (com e sem GlcNAc2), mas a resposta foi em geral fraca, sugerindo que os camundongos não sensibilizaram completamente com as imunizações de 55-mer. Duas imunizações adicionais com conjugados de KLH (GlcNAc2-15-mer (Figura 13C) e (GlcNAc2)2-18-mer (Figura 13D)), resultaram em respostas imunológicas de IgG intensificadas contra os glicopeptídeos 15-mer e 18-mer mais curtos, particularmente em dois camundongos (Camundongo 7 e Camundongo 8). Entretanto, esses anticorpos nãomostraram qualquer reatividade detectável por ELISA com os glicopeptídeos 55-mer, que sugere que, nesse ensaio particular, o epítopo nesse fragmento grande é inacessível ou conformacionalmente diferente. O Camundongo 5, que respondeu a ambos os 55-mers (que contém chitobiose e/ou peptídeo não glicosilado) foi negativo para 55-mer derivado de Man3GlcNAc2. De forma não surpreendente, o 4H11 mAb (Rao et al. (PCT) Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462 a 72), que édirigido à cadeia principal de peptídeo não glicosilado, não mostrou ligação aos glicopeptídeos 15/18-mer não conjugados, indicando que pode haver algumas diferenças em epítopos disponíveis. Consulte, Figura 14.6.2.3.4 Desenvolvimento de anticorpo monoclonal dependente de glicosilação e ensaios biológicos in vitro - invasão de matrigel conduzida por MUC16[660] Mouse vaccination and sera collection was performed according to the protocol described in Section 0. After three immunizations with GlcNAc2-55-mer (Figure 13B), mice were further immunized with a mixture of KLH-conjugated constructs (mono-glycosylated 15-mer (SEQ ID NO: 131; Figure 13C) and bis-glycosylated 18-mer (SEQ ID NO: 130; Figure 13D)), two out of ten mice showed positive ELISA signals to both 55-mers (with and without GlcNAc2), but the response was generally weak, suggesting that the mice did not fully sensitize to the 55-mer immunizations. Two additional immunizations with KLH conjugates (GlcNAc2-15-mer (Figure 13C) and (GlcNAc2)2-18-mer (Figure 13D)) resulted in enhanced IgG immune responses against the shorter 15-mer and 18-mer glycopeptides, particularly in two mice (Mouse 7 and Mouse 8). However, these antibodies did not show any detectable reactivity by ELISA with the 55-mer glycopeptides, which suggests that, in this particular assay, the epitope on this large fragment is inaccessible or conformationally different. Mouse 5, which responded to both 55-mers (containing chitobiose and/or unglycosylated peptide) was negative for the Man3GlcNAc2-derived 55-mer. Not surprisingly, the 4H11 mAb (Rao et al. (PCT) Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462–72), which is directed to the non-glycosylated peptide backbone, showed no binding to the unconjugated 15/18-mer glycopeptides, indicating that there may be some differences in available epitopes. See, Figure 14.6.2.3.4 Glycosylation-dependent monoclonal antibody development and in vitro biological assays—MUC16-driven matrigel invasion

[661] Um dentre dez camundongos (Camundongo 7) foi selecionado, cujo soro mostrou a razão de reatividade maior para os glicopeptídeos curtos versus aqueles não glicosilados e, portanto, mostrou alguma preferência para a presença do açúcar. O baço do camundongo 7 foi coletado e a tecnologia de cultura de hibridoma padrão forneceu linhagens de células de hibridoma de produção de IgG. Os esplenócitos foram fundidos com o parceiro de fusão de hibridoma gerando uma eficiência de fusão extraordinariamente alta (>5,5 colônias/poço em média, com > 30.000 hibridomas). Os sobrenadantes foram selecionados e submetidos à triagem acerca da reatividade por ELISA contra os glicopeptídeos individuais. A análise de ELISA preliminar para a placa de teste de fusão contra peptídeo 15mer-chitobiose e peptídeo 18mer-chitobiose (combinados no mesmo poço) mostrou alguns sinais positivos, que aponta para a presença de anticorpos anti-peptídeo, apesar de sua dependência de glicosilação não puder ser completamente avaliada nesse ponto. Consulte, Figura 14. Entretanto, foi observada uma razão maior de anticorpos com positividade favorecida e, portanto, mais específicos, para os antígenos glicosilados a chitobiose em comparação com aqueles não glicosilados. Mediante a diluição de cultura, um único clone que se desenvolve em cada poço (razão de 1:1 acima) foi obtido e a triagem primária revelou que os anticorpos produzidos por esses hibridomas não reconhecem o epítopo 4H11, que se encontra próximo ao 15-/18-mer não glicosilado. Consulte, Figura 14. Após a conclusão da triagem de anticorpo monoclonal em diluição maior, os anticorpos que mostram preferência para o epítopo de glicopeptídeo foram obtidos. Dessa forma, esse processo produziu 36 mAbs primários dependentes de chitobiose que foram testados acerca da reatividade contra MUC16. Dentre esses, 15 mAbs foram avaliados (em paralelo a 4H11) acerca de seu efeito na invasão por ensaio de matrigel com transfectante SKOV3-MUC16c114 (Figura 15A). Os anticorpos de glicosilação de MUC16 1B5, 10C6, 13A7, 18C6, 19C11, 16C5, 6H10, 21F8, 7B12 mostraram a inibição de invasão de matrigel, enquanto 4H11 não teve efeito nessa propriedade, indicando que os anticorpos dirigidos para Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)) inibem a biologia de MUC16. Os anticorpos de glicosilação de MUC16 foram subsequentemente subclonados e purificados. Os parâmetros de ligação para certos anticorpos glicosilados de MUC16 foram determinados (consulte, Tabela 9).TABELA 9. Parâmetros de ligação de anticorpos glicosilados de MUC16 *= Confiança de cálculo baixa; nenhum ajuste para fora de taxa**= ka é baixo demais para determinação de taxa de associação[661] One of ten mice (Mouse 7) was selected whose serum showed the highest reactivity ratio for the short glycopeptides versus the non-glycosylated ones and therefore showed some preference for the presence of the sugar. The spleen of Mouse 7 was harvested, and standard hybridoma culture technology provided IgG-producing hybridoma cell lines. Splenocytes were fused with the hybridoma fusion partner, generating an extraordinarily high fusion efficiency (>5.5 colonies/well on average, with >30,000 hybridomas). Supernatants were selected and screened for reactivity by ELISA against the individual glycopeptides. Preliminary ELISA analysis for the fusion test plate against 15mer-chitobiose peptide and 18mer-chitobiose peptide (combined in the same well) showed some positive signals, indicating the presence of anti-peptide antibodies, although their glycosylation dependence could not be fully assessed at this point. See Figure 14. However, a higher ratio of antibodies favoring positivity, and therefore more specificity, was observed for the glycosylated chitobiose antigens compared to the non-glycosylated ones. Upon culture dilution, a single clone growing in each well (1:1 ratio above) was obtained, and primary screening revealed that the antibodies produced by these hybridomas do not recognize the 4H11 epitope, which is located near the non-glycosylated 15-/18-mer. See Figure 14. After completing the monoclonal antibody screening at higher dilution, antibodies showing preference for the glycopeptide epitope were obtained. Thus, this process produced 36 chitobiose-dependent primary mAbs that were tested for reactivity against MUC16. Among these, 15 mAbs were evaluated (in parallel to 4H11) for their effect on invasion by matrigel assay with SKOV3-MUC16c114 transfectant (Figure 15A). The MUC16 glycosylation antibodies 1B5, 10C6, 13A7, 18C6, 19C11, 16C5, 6H10, 21F8, 7B12 showed inhibition of matrigel invasion, while 4H11 had no effect on this property, indicating that antibodies directed to Asn30 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)) inhibit MUC16 biology. MUC16 glycosylation antibodies were subsequently subcloned and purified. Binding parameters for certain MUC16 glycosylated antibodies were determined (see Table 9).TABLE 9. Binding parameters of MUC16 glycosylated antibodies *= Low calculation confidence; no adjustment for out-of-rate**= ka is too low for association rate determination

[662] Finalmente, a imunoistoquímica de amostras de tecido de ovário humano realizada com o anticorpo de glicosilação de MUC16 10C6 exibiu detecção aperfeiçoada de MUC16 em comparação com a imunoistoquímica realizada com 4H11 ou OC125 (Figura 16E). 6.2.3.5 Anticorpos de glicosilação de MUC16 são específicos para glicosilação de MUC16.[662] Finally, immunohistochemistry of human ovarian tissue samples performed with the MUC16 glycosylation antibody 10C6 exhibited improved detection of MUC16 compared to immunohistochemistry performed with 4H11 or OC125 (Figure 16E). 6.2.3.5 MUC16 glycosylation antibodies are specific for MUC16 glycosylation.

[663] Para investigar a especificidade dos anticorpos deglicosilação de MUC16, as análises de FACs foram realizadas em (i) células que expressam MUC13 nativo (maduro) (células OVCA- 433), (ii) células SKOV3, que carecem da expressão de MUC16, que expressam um vetor de controle (células SKOV3 phrGFP), (iii) células SKOV3 que expressam MUC16c114 (SKOV3 MUC16c114), (iv) células SKOV3 que expressam MUC16c114-N1 (SKOV3 MUC16c114-N1), (v)células SKOV3 que expressam MUC16c114-N3 SKOV3 MUC16c114-N3), ou (vi) células SKOV3 que expressam SKOV3 MUC16c114-N123 (SKOV3 MUC16c114- N123), na presença ou ausência de anticorpo de glicosilação de MUC16 (18C6, 19C11, 10C6, 1B5 ou 13A7) ou do anticorpo anti-MUC16 monoclonal, 4H11 (Tabela 10). Os anticorpos 4H11, 18C6,19C11, 10C6, 1B5 e 13A7 demonstraram ligação a células OVCA-433(Tabela 10; comparar ID NOs: 3 a 8 com controles negativos, ID NOs: 1 e 2). Em contrapartida, conforme esperado com base noprojeto dos estudos e geração dos anticorpos, nenhum dosanticorpos 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5 e 13A7 se ligou a célulasSKOV3 phrGFP (Tabela 10, ID NOs: 11 a 16 em comparação com os controles negativos, ID NOs: 9 e 10). Os anticorpos 4H11, 18C6,19C11, 10C6, 1B5 e 13A7 se ligaram a SKOV3 MUC16c114 (Tabela 10,ID NOs: 19 a 24 em comparação com os controles negativos, ID NOs: 17 e 18). A mutação de Asn1 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1777 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)) não inibiram a ligação de anticorpo a células SKOV3 MUC16c114-N1 (Tabela 10, ID NOs: 27 a 32 em comparação com controles negativos, ID NOs: 25 e 26).Entretanto, a mutação de Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)) anulou a ligação de anticorpos glicosilados de MUC16 18C6, 19C11, 10C6, 1B5 e 13A7 (Tabela 10, ID NOs: 36 a 40, em comparação com controlesnegativos, ID NOs: 33 e 34). Ademais, a mutação de Asn30 de MUC16c114 (que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)) não anulou a ligação do anticorpo 4H11, que não é um anticorpo glicosilado de MUC16 (Tabela 10, ID NO: 35, emcomparação com controles negativos, ID NOs: 33 e 34). Além disso, as mutações de asparagina para alanina em Asn1, Asn24 e Asn30 (que corresponde a Asn1777, Asn1800 e Asn1806, respectivamente,de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)), anularam a ligação deanticorpos glicosilados de MUC16 18C6, 19C11, 10C6 e 1B5 (Tabela10, ID NOs: 44 a 47, em comparação com controles negativos, ID NOs: 41 e 42), enquanto a ligação de 4H11 não foi anulada. Éobservado que 13A7 manteve a ligação às células SKOV3 MUC16c114- N123. Esses dados demonstram que os anticorpos de glicosilação de MUC16 se ligam a MUC16c114 em um modo dependente de glicosilação. TABELA 10. Análise FACS de anticorpos de glicosilação de MUC16 com células transfectantes SKOV3 ou OVCA-433. * Indica que nenhuma ligação é considerada como sendo observada.6.2.3.6 Anticorpos de glicosilação de MUC16 inibem invasão de matrigel.[663] To investigate the specificity of the MUC16 deglycosylation antibodies, FACs analyses were performed on (i) cells expressing native (mature) MUC13 (OVCA-433 cells), (ii) SKOV3 cells, which lack MUC16 expression, expressing a control vector (SKOV3 phrGFP cells), (iii) SKOV3 cells expressing MUC16c114 (SKOV3 MUC16c114), (iv) SKOV3 cells expressing MUC16c114-N1 (SKOV3 MUC16c114-N1), (v) SKOV3 cells expressing MUC16c114-N3 (SKOV3 MUC16c114-N3), or (vi) SKOV3 cells expressing SKOV3 MUC16c114-N1 (SKOV3 MUC16c114-N123), in the presence or absence of MUC16 glycosylation antibody (18C6, 19C11, 10C6, 1B5, or 13A7) or the anti-MUC16 monoclonal antibody, 4H11 (Table 10). Antibodies 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, and 13A7 demonstrated binding to OVCA-433 cells (Table 10; compare ID NOs: 3 to 8 with negative controls, ID NOs: 1 and 2). In contrast, as expected based on the study design and antibody generation, none of the 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, and 13A7 antibodies bound to SKOV3 phrGFP cells (Table 10, ID NOs: 11 to 16 compared with the negative controls, ID NOs: 9 and 10). Antibodies 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, and 13A7 bound to SKOV3 MUC16c114 (Table 10, ID NOs: 19 to 24 compared with the negative controls, ID NOs: 17 and 18). Mutation of Asn1 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1777 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)) did not inhibit antibody binding to SKOV3 MUC16c114-N1 cells (Table 10, ID NOs: 27 to 32 compared with negative controls, ID NOs: 25 and 26). However, mutation of Asn30 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)) abrogated the binding of glycosylated MUC16 antibodies 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, and 13A7 (Table 10, ID NOs: 36 to 40 compared with negative controls, ID NOs: 33 and 34). Furthermore, mutation of Asn30 of MUC16c114 (which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)) did not abrogate the binding of the 4H11 antibody, which is not a glycosylated MUC16 antibody (Table 10, ID NO: 35, compared with negative controls, ID NOs: 33 and 34). Furthermore, asparagine-to-alanine mutations at Asn1, Asn24, and Asn30 (which corresponds to Asn1777, Asn1800, and Asn1806, respectively, of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)), abrogated the binding of MUC16 glycosylated antibodies 18C6, 19C11, 10C6, and 1B5 (Table 10, ID NOs: 44 to 47, compared with negative controls, ID NOs: 41 and 42), while 4H11 binding was not abrogated. It is observed that 13A7 maintained binding to SKOV3 MUC16c114-N123 cells. These data demonstrate that MUC16 glycosylation antibodies bind to MUC16c114 in a glycosylation-dependent manner. TABLE 10. FACS analysis of MUC16 glycosylation antibodies with SKOV3 or OVCA-433 transfectant cells. * Indicates that no binding is considered to be observed.6.2.3.6 MUC16 glycosylation antibodies inhibit matrigel invasion.

[664] Dada a especificidade de glicosilação de anticorpos de glicosilação de MUC16 (Tabela 9), a habilidade dos sobrenadantesbiorreativos de anticorpo de glicosilação de MUC16 para inibir a invasão de matrigel em uma maneira específica de glicosilaçãofoi avaliada. Dessa forma, os ensaios de invasão de matrigel foram realizados com linhagens de células estáveis de câncer deovário SKOV3 que expressam phrGFP (Figura 15A, faixa 1) ou phr-GFP-MUC16c114 (MUC16c114; Figura 15A, faixas 2 a 18) na presença (Figura 15A, faixas 3 a 18) ou ausência (Figura 15A, faixas 1 e2) de sobrenadantes biorreativos de anticorpo de glicosilação de MUC16. O anticorpo monoclonal de MUC16 4H11 (Figura 15A, faixa3) foi usado como um controle para os sobrenadantes biorreativos de anticorpo de glicosilação de MUC16 (Figura 15A, faixas 4 a 18) para avaliar a dependência de glicosilação na invasão de matrigel. A expressão de MUC16c114, sozinho na presença de 4H11 (Figura 15A, faixas 2 e 3, respectivamente), resultou em um aumento na atividade de invasão de matrigel. Em contrapartida, a incubação com anticorpos de glicosilação de MUC16 (Figura 15A, faixas 4 a 18) diminuiu a invasão de matrigel das células de câncer de ovário que expressam MUC16c114.[664] Given the glycosylation specificity of MUC16 glycosylation antibodies (Table 9), the ability of MUC16 glycosylation antibody bioreactive supernatants to inhibit matrigel invasion in a glycosylation-specific manner was evaluated. Therefore, matrigel invasion assays were performed with SKOV3 stable ovarian cancer cell lines expressing phrGFP (Figure 15A, lane 1) or phr-GFP-MUC16c114 (MUC16c114; Figure 15A, lanes 2-18) in the presence (Figure 15A, lanes 3-18) or absence (Figure 15A, lanes 1 and 2) of MUC16 glycosylation antibody bioreactive supernatants. The MUC16 monoclonal antibody 4H11 (Figure 15A, lane 3) was used as a control for the MUC16 glycosylation antibody bioreactive supernatants (Figure 15A, lanes 4–18) to assess glycosylation dependence on matrigel invasion. Expression of MUC16c114 alone in the presence of 4H11 (Figure 15A, lanes 2 and 3, respectively) resulted in an increase in matrigel invasion activity. In contrast, incubation with MUC16 glycosylation antibodies (Figure 15A, lanes 4–18) decreased matrigel invasion of MUC16c114-expressing ovarian cancer cells.

[665] Em seguida, a habilidade de anticorpos glicosilados de MUC16 purificados para inibir a invasão de matrigel foi avaliada. Para essa finalidade, as células SKOV3 que expressam MUC16c114 foram incubadas na presença e ausência do anticorpo de MUC16 4H11 ou anticorpos glicosilados de MUC16 purificados (Figura15B). Os anticorpos glicosilados de MUC16 7B12, 19C11, 18C6 e10C6 inibiram a invasão de matrigel induzida por MUC16c114 (Figura 15B, comparar faixas 3 a 6 com o controle negativo, faixa 2). Em contrapartida, o anticorpo anti-MUC16 monoclonal 4H11 não inibiu a invasão de matrigel induzida por MUC16c114 (Figura 15B, comparar faixa 2 com o controle negativo, faixa 1). Esses dados demonstram que, em contraste com o anticorpo monoclonal 4H11, os anticorpos de glicosilação de MUC16 (por exemplo, 7B12, 19C11, 18C6 e 10C6)bloqueiam a invasão de matrigel.[665] Next, the ability of purified glycosylated MUC16 antibodies to inhibit matrigel invasion was evaluated. For this purpose, SKOV3 cells expressing MUC16c114 were incubated in the presence and absence of the MUC16 antibody 4H11 or purified glycosylated MUC16 antibodies (Figure 15B). The glycosylated MUC16 antibodies 7B12, 19C11, 18C6, and 10C6 inhibited MUC16c114-induced matrigel invasion (Figure 15B, compare lanes 3-6 with the negative control, lane 2). In contrast, the monoclonal anti-MUC16 antibody 4H11 did not inhibit MUC16c114-induced matrigel invasion (Figure 15B, compare lane 2 with the negative control, lane 1). These data demonstrate that, in contrast to the monoclonal antibody 4H11, MUC16 glycosylation antibodies (e.g., 7B12, 19C11, 18C6, and 10C6) block matrigel invasion.

[666] A habilidade dos anticorpos de glicosilação de MUC16 para inibir a invasão de matrigel foi avaliada no contexto de mutantes de N-glicosilação de MUC16c114 (Figura 16A). Com essa finalidade, os ensaios de invasão de matrigel foram realizados em células SKOV3 phrGFP, células SKOV3 MUC16c114, células SKOV3MUC16c114-N1, células SKOV3 MUC16c114-N2 ou células SKOV3 MUC16c114-N3 (Figura 16A, faixas 1 a 5, respectivamente), na presença de (i) um anticorpo de controle; (ii) anticorpo 4H11; ou (iii) oanticorpo de glicosilação de MUC16 10C6. A invasão de matrigel induzida por MUC16c114 foi inibida em células SKOV3 MUC16c114-N3, à medida que Asn30 de MUC16c114 é necessário para a invasão de matrigel de MUC16c114. Ademais, a invasão de matrigel foi induzida em células SKOV3 MUC16c114, células SKOV3 MUC16c114-N1 e células SKOV3 MUC16c114-N2 na presença e ausência do anticorpo monoclonal de MUC16 4H11. Em contrapartida, a incubação dessas células com o anticorpo de glicosilação de MUC16 10C6 anulou a invasão de matrigel (Figura 16A). Esses dados também foram corroborados na Figura 16B e em células 3T3 que expressam mutantes de MUC16c344 (Figura 16C).[666] The ability of MUC16 glycosylation antibodies to inhibit matrigel invasion was evaluated in the context of MUC16c114 N-glycosylation mutants (Figure 16A). For this purpose, matrigel invasion assays were performed in SKOV3 phrGFP cells, SKOV3 MUC16c114 cells, SKOV3 MUC16c114-N1 cells, SKOV3 MUC16c114-N2 cells, or SKOV3 MUC16c114-N3 cells (Figure 16A, lanes 1-5, respectively), in the presence of (i) a control antibody; (ii) antibody 4H11; or (iii) the MUC16 glycosylation antibody 10C6. MUC16c114-induced matrigel invasion was inhibited in SKOV3 MUC16c114-N3 cells, as Asn30 of MUC16c114 is required for MUC16c114 matrigel invasion. Furthermore, matrigel invasion was induced in SKOV3 MUC16c114 cells, SKOV3 MUC16c114-N1 cells, and SKOV3 MUC16c114-N2 cells in the presence and absence of the MUC16 monoclonal antibody 4H11. In contrast, incubation of these cells with the MUC16 glycosylation antibody 10C6 abrogated matrigel invasion (Figure 16A). These data were also corroborated in Figure 16B and in 3T3 cells expressing MUC16c344 mutants (Figure 16C).

[667] Tomados em conjunto, esses dados indicam que os anticorpos de glicosilação de MUC16, em contraste com o anticorpo anti-MUC16 monoclonal 4H11, têm capacidade para inibir a invasão de matrigel de uma maneira dependente de glicosilação.6.2.3.7 O anticorpo de glicosilação de MUC16 19C11 é internalizado.[667] Taken together, these data indicate that MUC16 glycosylating antibodies, in contrast to the monoclonal anti-MUC16 antibody 4H11, have the ability to inhibit matrigel invasion in a glycosylation-dependent manner.6.2.3.7 The MUC16 glycosylating antibody 19C11 is internalized.

[668] Finalmente, foi avaliada a habilidade de um anticorpo de glicosilação de MUC16 que direciona Asn30 de MUC16c114 para ser internalizado. As células SKOV3 que expressam MUC16c114 foram incubadas com anticorpo 19C11 identificado com 89Zr-DFO e a internalização foi determinada por meio de Radiotracer (Figura 17). Esses dados demonstram que o anticorpo 19C11 identificado foi internalizado quando incubado com células SKOV3 que expressam MUC16c114 incubadas a 37 °C já 1 hora após o tratamento com o anticorpo. A absorção celular do anticorpo identificado foi diminuída a 4 °C.6.2.4 Discussão[668] Finally, the ability of a MUC16 glycosylation antibody targeting Asn30 of MUC16c114 to be internalized was assessed. SKOV3 cells expressing MUC16c114 were incubated with 89Zr-DFO-labeled 19C11 antibody, and internalization was determined using Radiotracer (Figure 17). These data demonstrate that the labeled 19C11 antibody was internalized when incubated with SKOV3 cells expressing MUC16c114 incubated at 37 °C as early as 1 hour after antibody treatment. Cellular uptake of the labeled antibody was decreased at 4 °C. 6.2.4 Discussion

[669] O antígeno de MUC16/CA125, um membro da família de mucina com homologia substancial a MUC1, tem sido há muito tempo associado a malignidades ginecológicas (consulte, Referência 4 conforme citado na Seção 0, abaixo). Apesar de não ser suficientemente sensível ou específica como uma ferramenta de triagem geral, a medição de CA125 é regularmente usada para monitorar pacientes com câncer de ovário através de métodos de detecção à base de anticorpo. A grande maioria dos anticorpos reativos a MUC16, tais como OC125, é dirigida contra epítopos dependentes de glicosilação encontrados na fração clivada da molécula, e não é útil como ferramentas de triagem para detectara porção proximal de MUC16 após a clivagem. Como consequência,faltam estudos biológicos do fragmento de proteína de MUC16 restante. Os dados no Exemplo 1 (Seção 0) demonstraram que uma sequência de 114 aminoácidos da região de MUC16 proximal (MUC16C114) é suficiente para aumentar a invasão e crescimento de tumor em várias linhagens de células de câncer de ovário. A constatação surpreendente no presente documento que a N-glicosilação desse ectodomínio C-terminal, em particular no terceiro sítio de Asn (Asn30, que corresponde a Asn1806 de MUC16 maduro (SEQ ID NO: 150)), é crucial para os efeitos oncogênicos de MUC16 sugere novas funções para MUC16, que poderia ser, então, considerado não apenas um marcador passivo de doença, mas também uma molécula patogênica. Com base nessa premissa, o desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra essas porções retidas de MUC16 aparece como uma ferramenta poderosa para explorar a pato-biologia dessa mucina e criar produtos terapêuticos direcionados a MUC16.[669] The MUC16/CA125 antigen, a member of the mucin family with substantial homology to MUC1, has long been associated with gynecologic malignancies (see Reference 4 as cited in Section 0, below). Although not sufficiently sensitive or specific as a general screening tool, CA125 measurement is regularly used to monitor patients with ovarian cancer through antibody-based detection methods. The vast majority of MUC16-reactive antibodies, such as CA125, are directed against glycosylation-dependent epitopes found on the cleaved portion of the molecule and are not useful as screening tools for detecting the proximal portion of MUC16 after cleavage. As a consequence, biological studies of the remaining MUC16 protein fragment are lacking. The data in Example 1 (Section 0) demonstrated that a 114-amino acid sequence from the proximal MUC16 region (MUC16C114) is sufficient to enhance invasion and tumor growth in several ovarian cancer cell lines. The surprising finding in the present paper that N-glycosylation of this C-terminal ectodomain, in particular at the third Asn site (Asn30, which corresponds to Asn1806 of mature MUC16 (SEQ ID NO: 150)), is crucial for the oncogenic effects of MUC16 suggests novel functions for MUC16, which could then be considered not only a passive marker of disease but also a pathogenic molecule. Based on this premise, the development of monoclonal antibodies against these retained portions of MUC16 appears as a powerful tool to explore the pathobiology of this mucin and create MUC16-targeted therapeutics.

[670] Os estudos anteriores identificaram mAbs contra a região C-terminal não clivada de MUC16, embora em contraste com os anticorpos anteriores, os mesmos foram dirigidos na cadeia principal de peptídeo não glicosilado em vez de em epítopos de glicoproteína complexos. Em particular, 4H11 mostrou ligação de alta afinidade ao ectodomínio de MUC16, e internalizou por células de câncer de ovário de modo mais eficaz que OC125, devido ao local próximo do epítopo. Essa conclusão sugeriu que a região proximal da glicoproteína tem uma biologia independente da porção removida de MUC16 distal ao local de clivagem putativo. Entretanto, uma vez que 4H11 não reconhece os locais de glicosilação cruciais dentro do ectodomínio que são necessários para a ação patogênica de MUC16, seu potencial para estudos futuros em terapia direcionada é limitado.[670] Previous studies identified mAbs against the uncleaved C-terminal region of MUC16, although in contrast to previous antibodies, these were directed at the unglycosylated peptide backbone rather than complex glycoprotein epitopes. In particular, 4H11 showed high-affinity binding to the MUC16 ectodomain and was internalized by ovarian cancer cells more effectively than OC125 due to its proximity to the epitope. This finding suggested that the proximal region of the glycoprotein has a biology independent of the removed portion of MUC16 distal to the putative cleavage site. However, since 4H11 does not recognize crucial glycosylation sites within the ectodomain that are required for the pathogenic action of MUC16, its potential for future studies in targeted therapy is limited.

[671] Um painel de anticorpos monoclonais dependentes de glicosilação dirigidos aos epítopos de glicopeptídeo principais no ectodomínio de MUC16 foram desenvolvidos com o uso de imitações de glicopeptídeo sintético conjugado a KLHem combinação com tecnologia de hibridoma. Essa metodologia é preferencial sobre a geração de anticorpo policlonal, à medida que no estágio policlonal, a especificidade de glicopeptídeo não foi completa e também foi detectada alguma ligação a fragmentos de peptídeo de MUC16 não glicosilados. Para obter os anticorpos de glicosilação de MUC16, uma seleção primária para a geração de anticorpo monoclonal foi baseada em uma razão maior da dependência de glicosilação na cultura multiclonal associada a algum grau de preferência pela presença do açúcar. A potência dos novos anticorpos monoclonais e sua especificidade maior para o epítopo de glicopeptídeo tem sido demonstrada pelo estudo de seu efeito em invasão de matrigel conduzida por MUC16. Esses anticorpos de glicosilação de MUC16 tiveram capacidade para inibir a invasão em um ensaio de matrigel, enquanto o 4H11 não dirigido à glicosilação não teve capacidade. Com base na conclusão de que a N-glicosilação em Asn30 é essencial para a ação de MUC16, esses resultados confirmam que os anticorpos recém-gerados direcionam especificamente o epítopo de glicopeptídeo principal do ectodomínio de MUC16, que resulta na inibição da pato-biologia de MUC16. De forma importante, o anticorpo de glicosilação de MUC16 10C6 retardousignificativamente o crescimento de tumor positivo para MUC16 em um modelo de camundongo nude atímico implantado com células de câncer de ovário que expressam MUC16c114, demonstrando o potencial desses anticorpos monoclonais para emergir como uma ferramenta promissora para seu uso terapêutico em aplicações clínicas otimizadas.6.2.5 Referências citadas[671] A panel of glycosylation-dependent monoclonal antibodies directed to major glycopeptide epitopes in the MUC16 ectodomain were developed using KLH-conjugated synthetic glycopeptide mimics in combination with hybridoma technology. This methodology is preferred over polyclonal antibody generation, as at the polyclonal stage, glycopeptide specificity was not complete and some binding to non-glycosylated MUC16 peptide fragments was also detected. To obtain MUC16 glycosylation antibodies, a primary selection for monoclonal antibody generation was based on a higher ratio of glycosylation dependence in the multiclonal culture associated with some degree of preference for the presence of the sugar. The potency of the new monoclonal antibodies and their higher specificity for the glycopeptide epitope has been demonstrated by studying their effect on MUC16-driven matrigel invasion. These MUC16 glycosylation antibodies were able to inhibit invasion in a matrigel assay, whereas the non-glycosylation-targeting 4H11 was unable to do so. Based on the conclusion that N-glycosylation at Asn30 is essential for MUC16 action, these results confirm that the newly generated antibodies specifically target the major glycopeptide epitope of the MUC16 ectodomain, resulting in inhibition of MUC16 pathobiology. Importantly, the MUC16 glycosylation antibody 10C6 significantly delayed MUC16-positive tumor growth in an athymic nude mouse model implanted with MUC16c114-expressing ovarian cancer cells, demonstrating the potential of these monoclonal antibodies to emerge as a promising tool for therapeutic use in optimized clinical applications. 6.2.5 References Cited

[672] 1. Bast, R. C. Jr. et al. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J. Clin. Invest. 68, 1.331 a 1.337 (1981).[672] 1. Bast, R. C. Jr. et al. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J. Clin. Invest. 68, 1331 to 1337 (1981).

[673] 2. Yin, B. W. & Lloyd, K. O. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J. Biol. Chem. 276, 27.371 a 27.375 (2001).[673] 2. Yin, B. W. & Lloyd, K. O. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J. Biol. Chem. 276, 27,371 to 27,375 (2001).

[674] 3. O'Brien, T. J. et al. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumor Biol. 22, 348 a 366 (2001).[674] 3. O'Brien, T. J. et al. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumor Biol. 22, 348 to 366 (2001).

[675] 4. Bast, R. C. Jr., et al. CA125: the past and the future. Int. J. Biol. Markers 13, 17987 (1998).[675] 4. Bast, R. C. Jr., et al. CA125: the past and the future. Int. J. Biol. Markers 13, 17987 (1998).

[676] 5. Rustin, G. J. S. Use of CA-125 in clinical trial evaluation of new therapeutic drugs for ovarian cancer. Clin. Cancer Res. 10, 3.919 a 3.926 (2004).[676] 5. Rustin, G. J. S. Use of CA-125 in clinical trial evaluation of new therapeutic drugs for ovarian cancer. Clinic. Cancer Res. 10, 3919 to 3926 (2004).

[677] 6. Scholler, N. & Urban, N. CA125 in ovarian cancer. Biomark. Med. 1, 513 a 523 (2007).[677] 6. Scholler, N. & Urban, N. CA125 in ovarian cancer. Biomark. Med. 1, 513 to 523 (2007).

[678] 7. Yin, B. W., Dnistrian, A. & Lloyd, K. O. Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int. J. Cancer 2002, 98, 737 a 740.[678] 7. Yin, B. W., Dnistrian, A. & Lloyd, K. O. Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int. J. Cancer 2002, 98, 737 to 740.

[679] 8. O'Brien, T. J., Beard, J. B., Underwood, L. J. & Shigemasa, K. The CA 125 gene: a newly discovered extension of the glycosylated N-terminal domain doubles the size of this extracellular superstructure. Tumor Biol. 23, 154 a 169 (2002).[679] 8. O'Brien, T. J., Beard, J. B., Underwood, L. J. & Shigemasa, K. The CA 125 gene: a newly discovered extension of the glycosylated N-terminal domain doubles the size of this extracellular superstructure. Tumor Biol. 23, 154 to 169 (2002).

[680] 9. Nap, M. et al. Immunohistochemical characterization of 22 monoclonal antibodies against the CA125 antigen: 2nd report from the ISOBM TD-1 workshop. Tumor Biol. 17, 325 a 331 (1996).[680] 9. Nap, M. et al. Immunohistochemical characterization of 22 monoclonal antibodies against the CA125 antigen: 2nd report from the ISOBM TD-1 workshop. Tumor Biol. 17, 325 to 331 (1996).

[681] 10. Rao, T. D. et al. Novel monoclonal antibodies against the proximal (carboxy-terminal) portions of MUC16. (PCT) Immunohistochem. Mol. Morphol. 18, 462 a 472 (2010).[681] 10. Rao, T. D. et al. Novel monoclonal antibodies against the proximal (carboxy-terminal) portions of MUC16. (PCT) Immunohistochem. Mol. Morphol. 18, 462 to 472 (2010).

[682] 11. Cohen-Anisfeld, S. T., Lansbury, P. T. A practical, convergent method for glycopeptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 115, 10.531 a 10.537 (1993).[682] 11. Cohen-Anisfeld, S. T., Lansbury, P. T. A practical, convergent method for glycopeptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 115, 10,531 to 10,537 (1993).

[683] 12. Wang, P., Aussedat, B., Vohra, Y. & Danishefsky, S. J. An advance in the chemical synthesis of homogeneous N- linked glycopolypeptides by convergent aspartylation. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11.571 a 11.575 (2012).[683] 12. Wang, P., Aussedat, B., Vohra, Y. & Danishefsky, S. J. An advance in the chemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergent aspartylation. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11,571 to 11,575 (2012).

[684] 13. Likhosherstov, L. M., Novikova, O. S., Derevitskaja, V. & Kochetkov, N. K. A new simple synthesis of amino sugar β-d-glycosylamines. Carbohydr. Res. 146, C1-C5 (1986).[684] 13. Likhosherstov, L. M., Novikova, O. S., Derevitskaja, V. & Kochetkov, N. K. A new simple synthesis of amino sugar β-d-glycosylamines. Carbohydr. Res. 146, C1-C5 (1986).

[685] 14. Nakada, H. et al. Epitopic structure of Tn glycophorin A for an anti-Tn antibody (MLS 128). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2.495 a 2.499 (1993).[685] 14. Nakada, H. et al. Epitopic structure of Tn glycophorin A for an anti-Tn antibody (MLS 128). Proc. Natl. Academic. Sci. USA 90, 2495 to 2499 (1993).

[686] 15. Osinaga, E. et al. Analysis of the fine specificity of Tn-binding proteins using synthetic glycopeptide epitopes and a biosensor based on surface plasmon resonance spectroscopy. FEBS Lett. 469, 24 a 28 (2000).[686] 15. Osinaga, E. et al. Analysis of the fine specificity of Tn-binding proteins using synthetic glycopeptide epitopes and a biosensor based on surface plasmon resonance spectroscopy. FEBS Lett. 469, 24 to 28 (2000).

[687] 16. Mazal, D. et al. Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns on human cancer cells. Implications for effective immuno-targeting of cancer. Cancer Immunol. Immunother. 62, 1.107 a 1.122 (2013).[687] 16. Mazal, D. et al. Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns on human cancer cells. Implications for effective immuno-targeting of cancer. Cancer Immunol. Immunother. 62, 1,107 to 1,122 (2013).

[688] 17. Rosen, D.G. et al. Potential markers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 99, 267 a 277 (2005).[688] 17. Rosen, D.G. et al. Potential markers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 99, 267 to 277 (2005).

[689] 18. Moore, R.G., Maclaughlan, S. & Bast, R.C. Jr. Current state of biomarker development for clinical application in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 116, 240 a 245 (2010).6.3 EXEMPLO 3: Efeitos de promoção de tumor de MUC16 exigem interação com galectina-3 e receptores de superfície celular[689] 18. Moore, R. G., Maclaughlan, S. & Bast, R. C. Jr. Current state of biomarker development for clinical application in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 116, 240–245 (2010). 6.3 EXAMPLE 3: Tumor-promoting effects of MUC16 require interaction with galectin-3 and cell surface receptors

[690] Esse exemplo fornece (a) uma descrição mais detalhada de certos experimentos descritos no Exemplo 2 (Seção 0); e (b) experimentos adicionais em comparação com o Exemplo 2 (Seção 0). 6.3.1 Introdução[690] This example provides (a) a more detailed description of certain experiments described in Example 2 (Section 0); and (b) additional experiments compared to Example 2 (Section 0). 6.3.1 Introduction

[691] A superexpressão de MUC16 / CA125 é comum em câncer de ovário seroso e os níveis séricos de CA125 elevados estão associados à sobrevivência diminuída. O antígeno CA125, reconhecido pelo anticorpo OC125, é um antígeno bastante glicosilado expresso dentro dos domínios de repetição em tandema partir da porção extracelular da glicoproteína de MUC16 (consulte Referências 3 e 22 na Seção 0, abaixo). Esse antígenoé predominantemente expresso por tecidos mullerianos benignos ou malignos, mas sua função e papel na carcinogênese não são atualmente compreendidos de forma completa (consulte Referência 4 na Seção 0, abaixo). MUC16 é uma mucina presa altamente complexa que consiste em um grande domínio extracelular glicosilado de maneira heterogênea, um ectodomínio de 58 aminoácidos entre a membrana celular e o local de clivagem putativo, uma região transmembranar hidrofóbica e uma cauda intracelular curta (consulte Referência 21 na Seção 0, abaixo). OC125 e a maior parte dos outros anticorpos monoclonais reativos a MUC16 (mAbs) reconhecem a região de repetição em tandem de 156 aminoácidos imunogênica presente na porção clivada da molécula. Os anticorpos específicos de ectodomínio mais novos (por exemplo, 4H11 e 4A5) reconhecem um epítopo de peptídeo na porção retida pós-clivagem de MUC16 (consulte Referência 6 na Seção 0, abaixo). A parte C-terminal de MUC16 (MUC16c114) tem sido demonstrada como transformando células 3T3 imortalizadas, conforme medido pelo crescimento independente de ancoragem aumentado, ativação das vias de AKT e ERK, invasão de matrigelaumentada e crescimento intensificado em xenoenxertos de camundongo careca (consulte Seção 0 e Referência 19 na Seção 0,abaixo). Esses efeitos foram dependentes do ectodomínio de MUC16, enquanto a perda da cauda citoplasmática de 31 aminoácidos teve pouco efeito naquelas propriedades. Os mecanismos por meio dos quais o ectodomínio promove comportamentos oncogênicos não são completamente compreendidos (consulte Referência 19 na Seção 0, abaixo). Embora não existam domínios de ligação a proteína consenso presentes, a sequência de 58 aminoácidos do ectodomínio de MUC16 inclui três locais de N-glicosilação que representam locais de interação/reguladores potenciais para MUC16 com outras moléculas da superfície celular.[691] MUC16/CA125 overexpression is common in serous ovarian cancer, and elevated serum CA125 levels are associated with decreased survival. The CA125 antigen, recognized by the OC125 antibody, is a heavily glycosylated antigen expressed within the tandem repeat domains from the extracellular portion of the MUC16 glycoprotein (see References 3 and 22 in Section 0 below). This antigen is predominantly expressed by benign or malignant Mullerian tissues, but its function and role in carcinogenesis are currently incompletely understood (see Reference 4 in Section 0 below). MUC16 is a highly complex mucin trap consisting of a large, heterogeneously glycosylated extracellular domain, a 58-amino-acid ectodomain between the cell membrane and the putative cleavage site, a hydrophobic transmembrane region, and a short intracellular tail (see Reference 21 in Section 0 below). OC125 and most other MUC16-reactive monoclonal antibodies (mAbs) recognize the immunogenic 156-amino acid tandem repeat region present in the cleaved portion of the molecule. Newer ectodomain-specific antibodies (e.g., 4H11 and 4A5) recognize a peptide epitope in the post-cleavage retained portion of MUC16 (see Reference 6 in Section 0, below). The C-terminal part of MUC16 (MUC16c114) has been shown to transform immortalized 3T3 cells, as measured by increased anchorage-independent growth, activation of the AKT and ERK pathways, increased matriline invasion, and enhanced growth in nude mouse xenografts (see Section 0 and Reference 19 in Section 0, below). These effects were dependent on the MUC16 ectodomain, whereas loss of the 31-amino acid cytoplasmic tail had little effect on those properties. The mechanisms by which the ectodomain promotes oncogenic behaviors are not completely understood (see Reference 19 in Section 0, below). Although no consensus protein-binding domains are present, the 58-amino-acid sequence of the MUC16 ectodomain includes three N-glycosylation sites that represent potential regulatory/interaction sites for MUC16 with other cell surface molecules.

[692] Os locais de N-glicosilação de receptores de tirosinaquinase, tais como o receptor de fator de crescimento epidérmico(EGFR), receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR) e outros parecem interagir com as lectinas celulares, tais como Galectina-3, para regular a residência de superfície,intensidade de sinalização e comportamento celular (consulte Referência 12 na Seção 0, abaixo). Os efeitos de N-glicosilaçãodependem do número de locais de N-glicosilação em receptores deintensificação de crescimento e da afinidade de Galectina-3 paraespécies N-glicosiladas complexas. Existem menos locais de N glicosilação nos sinais inibitórios compensatórios a partir de moléculas da superfície celular, tais como receptores de fator de crescimento de transformação beta (TGF-β). Esses receptores são sensíveis a fluxos com alto teor de nutrientes relacionados a fator de crescimento e fornecem uma função moderadora em circunstâncias normais. Entretanto, os mecanismos de interações de glicoproteína associadas a câncer com tirosina quinases de receptor clássicas não são conhecidos. MUC1, MUC4 e MUC16 são todas glicoproteínas presas bastante glicosiladas caracterizadas pela presença de domínios transmembranares e superexpressas em cânceres epiteliais (consulte Referência 10 na Seção 0, abaixo).[692] The N-glycosylation sites of tyrosine kinase receptors such as epidermal growth factor receptor (EGFR), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), and others appear to interact with cellular lectins such as Galectin-3 to regulate surface residence, signaling intensity, and cell behavior (see Reference 12 in Section 0, below). The effects of N-glycosylation depend on the number of N-glycosylation sites on growth-enhancing receptors and the affinity of Galectin-3 for complex N-glycosylated species. Fewer N-glycosylation sites exist on compensatory inhibitory signals from cell surface molecules such as transforming growth factor-beta (TGF-β) receptors. These receptors are sensitive to high-nutrient fluxes of growth factor-related nutrients and provide a moderating function under normal circumstances. However, the mechanisms of cancer-associated glycoprotein interactions with classical receptor tyrosine kinases are not known. MUC1, MUC4, and MUC16 are all heavily glycosylated prey glycoproteins characterized by the presence of transmembrane domains and overexpressed in epithelial cancers (see Reference 10 in Section 0, below).

[693] Esse exemplo (Seção 0) demonstra que a glicosilação de MUC16 desempenha uma função principal em transformação relacionada à mucina por meio da mediação de interações de superfície celular complexas.[693] This example (Section 0) demonstrates that MUC16 glycosylation plays a major role in mucin-related transformation by mediating complex cell surface interactions.

[694] A porção C-terminal de MUC16 promoveu ativação de oncogene, invasão de matrigel e crescimento de tumor. Esses efeitos foram dependentes da glicosilação dependente de MGAT5 de dois locais de N glicosilação proximais no ectodomínio de MUC16 retido a 58 aminoácidos. Nem os locais de N- e nem de O- glicosilação na região de repetição em tandem de MUC16 mais distal poderiam substituir de maneira funcional aqueles dois locais. Os padrões de glicosilação de MUC16 foram diversos, mas uma haste de chitobiose caracterizou a base de todas as espécies de N-glicosilação. Os anticorpos contra glicopeptídeos de MUC16 que contêm chitobiose proximal bloquearam a ligação mediada por Galectina 3 a receptores de sinalização de superfície celular e inibiram os efeitos de promoção de tumor de MUC16.[694] The C-terminal portion of MUC16 promoted oncogene activation, matrigel invasion, and tumor growth. These effects were dependent on MGAT5-dependent glycosylation of two proximal N-glycosylation sites in the 58-amino-acid-retained MUC16 ectodomain. Neither N- nor O-glycosylation sites in the more distal MUC16 tandem repeat region could functionally replace those two sites. MUC16 glycosylation patterns were diverse, but a chitobiose stalk characterized the basis of all N-glycosylation species. Antibodies against MUC16 glycopeptides containing proximal chitobiose blocked Galectin 3-mediated binding to cell surface signaling receptors and inhibited the tumor-promoting effects of MUC16.

[695] As alterações sistemáticas em glicopeptídeos de MUC16 foram empregadas para interrogar diretamente a relação entre a estrutura de glicano e os efeitos de promoção de tumor exercidos pela expressão de MUC16. Esses efeitos, incluindo a colocalização, ativação de oncogene, invasão de matrigel e crescimento de xenoenxerto de tumor, foram exercidos pela ligação mediada por Galectina-3 entre uma sequência N- glicosilada na porção não circulante retida de MUC16 e moléculas de superfície celular, tais como receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e Integrina β1. A promoção de tumor conduzida por mucina extracelular é um mecanismo suportado pelas conclusões e dados apresentados no presente documento que pode ser direcionada com sucesso pelos anticorpos dirigidos ao local de N-glicosilação.[695] Systematic alterations in MUC16 glycopeptides were employed to directly interrogate the relationship between glycan structure and the tumor-promoting effects exerted by MUC16 expression. These effects, including colocalization, oncogene activation, matrigel invasion, and tumor xenograft growth, were exerted by Galectin-3-mediated binding between an N-glycosylated sequence in the retained non-circulating portion of MUC16 and cell surface molecules such as epidermal growth factor receptor (EGFR) and Integrin β1. Extracellular mucin-driven tumor promotion is a mechanism supported by the findings and data presented herein that can be successfully targeted by N-glycosylation site-directed antibodies.

[696] Conforme mostrado nesse Exemplo: (1) o estado de glicosilação extracelular de MUC16 conduziu o comportamento de câncer de ovário seroso; (2) invasão e crescimento de xenoenxerto de MUC16+ dependem de locais de N-glicosilação de MUC16 específicos; (3) MUC16 formou complexos heterodiméricos com Galectina-3 e EGFR ou Integrina β1; e (4) anticorpos anti-local de glicosilação bloquearam a promoção de tumor de MUC16 extracelular.6.3.2 Materiais e métodos6.3.2.1 Síntese de terminação carbóxi de MUC16 (MUC16C114), domínio de MUC16-CA125 (MUC16C344) e construtos de DNA de proteína de fusão glicosilada[696] As shown in this Example: (1) the extracellular glycosylation state of MUC16 drove serous ovarian cancer behavior; (2) MUC16+ xenograft invasion and growth depended on specific MUC16 N-glycosylation sites; (3) MUC16 formed heterodimeric complexes with Galectin-3 and EGFR or Integrin β1; and (4) anti-glycosylation site antibodies blocked tumor promotion of extracellular MUC16. 6.3.2 Materials and Methods 6.3.2.1 Synthesis of MUC16 Carboxy-Terminus (MUC16C114), MUC16-CA125 Domain (MUC16C344), and Glycosylated Fusion Protein DNA Constructs

[697] Consulte as Seções 0 e 0, e Referência 19 na Seção 0,abaixo, para uma descrição de construtos C-terminal de MUC16. O vetor pFUSE-IgG1 humana-Fc2 (pFUSE) foi adquirido junto àInvivoGen (San Diego, CA), e a construção das proteínasquiméricas MUC16c57-114-pFUSE e 117-244LGALS3-pFUSE também é descrita nas Seções 0 e 0, e Referência 19 na Seção 0 abaixo.6.3.2.2 Cultura celular, transfecção e caracterização de linhagem de células[697] See Sections 0 and 0, and Reference 19 in Section 0, below, for a description of MUC16 C-terminal constructs. The pFUSE-human IgG1-Fc2 (pFUSE) vector was purchased from InvivoGen (San Diego, CA), and the construction of the chimeric proteins MUC16c57-114-pFUSE and 117-244LGALS3-pFUSE is also described in Sections 0 and 0, and Reference 19 in Section 0 below. 6.3.2.2 Cell Culture, Transfection, and Cell Line Characterization

[698] As linhagens de células SKOV3, CAOV3 e OVCAR3 foram obtidas e mantidas conforme descrito nas Seções 0 e 0, e Referência 19 na Seção 0 abaixo. Consulte a Seção 0 para detalhes.6.3.2.3 Síntese de glicopeptídeos[698] The SKOV3, CAOV3, and OVCAR3 cell lines were obtained and maintained as described in Sections 0 and 0, and Reference 19 in Section 0 below. See Section 0 for details.6.3.2.3 Glycopeptide Synthesis

[699] Consulte a Seção 0 para uma descrição da síntese detalhada dos glicopeptídeos de MUC16.6.3.2.4 Invasão de matrigel[699] See Section 0 for a description of the detailed synthesis of MUC glycopeptides.6.3.2.4 Matrigel Invasion

[700] A invasão de membrana basal foi determinada em câmaras de invasão de matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Aslinhagens de células estáveis foram tratadas com 5 μg/ml detunicamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis MO número de catálogo T7765) ou 5 μg/ml de MUC16c57-c114-pFUSE, ou com 5 μg/ml de proteína de fusão 117-244LGALS3-pFUSE; a migração de matrigel foi, então, medida após 48 horas em poços em triplicata e comparada com o controle de vetor phrGFP e transfectantes de MUC16c114. Consulte, também as Seções 0 e 0, e Referência 19 na Seção 0 abaixo. 6.3.2.5 Crescimento de tumor em camundongos nude atímicosBasement membrane invasion was determined in matrigel invasion chambers (BD Biosciences, Bedford, MA). Stable cell lines were treated with 5 μg/ml tunicamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO catalog number T7765) or 5 μg/ml MUC16c57-c114-pFUSE, or with 5 μg/ml fusion protein 117-244LGALS3-pFUSE; matrigel migration was then measured after 48 hours in triplicate wells and compared with phrGFP vector control and MUC16c114 transfectants. See also Sections 0 and 0, and Reference 19 in Section 0 below. 6.3.2.5 Tumor growth in athymic nude mice

[701] As linhagens de células transfectadas e linhagens de células de controle adequadas foram introduzidas no flanco de camundongos nude atímicos do sexo feminino, e o cuidado de animais de rotina foi fornecido pela instalação central de avaliação antitumor do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. As medições de tumor foram tomadas duas vezes por semana e o crescimento de tumor foi registrado a um tamanho máximo de 1.500 mm3 por diretivas do Research Animal Resource Center do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Consulte, também as Seções 0 e 0, e Referência 19 na Seção 0 abaixo.6.3.2.6 Preparação de anticorpo monoclonal; protocolo de imunização de camundongo[701] The transfected cell lines and appropriate control cell lines were introduced into the flank of female athymic nude mice, and routine animal care was provided by the Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitumor Evaluation Core Facility. Tumor measurements were taken twice weekly, and tumor growth was recorded to a maximum size of 1,500 mm per directives of the Memorial Sloan Kettering Cancer Center Research Animal Resource Center. See also Sections 0 and 0, and Reference 19 in Section 0 below. 6.3.2.6 Monoclonal Antibody Preparation; Mouse Immunization Protocol

[702] O protocolo de imunização começou com o glicopeptídeo de MUC16 55-mer que contém chitobiose (GlcNAc2-55-mer; SEQ ID NO: 129), que foi administrado a cinco camundongos BALB/c e cinco camundongo Swiss Webster três vezes a cada 3 semanas na presença de um adjuvante. A quarta imunização foi realizada com uma mistura de construtos de MUC16 15-mer mono-glicosilado conjugado a KLH (GlcNAc2-15-mer-KLH; SEQ ID NO: 131) e 18-mer bis-glicosilado ([GlcNAc2]2-18-mer-KLH; SEQ ID NO: 130). Os soros foram analisados acerca da reatividade contra o GlcNAc2-55-mer (SEQ ID NO: 129) e os glicopeptídeos 15/18-mer que contêmchitobiose não conjugados (SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 130, respectivamente). Além disso, os peptídeos não glicosilados 55- mer (SEQ ID NO: 129), 15-mer (SEQ ID NO: 131) e 18-mer (SEQ ID NO: 130), juntamente com dois peptídeos que contêm chitobiosenão relacionados a MUC16 foram usados como controles negativos para a triagem (SEQ ID NOs: 168 e 169). Os camundongos foram adicionalmente imunizados com os conjugados de KLH mais curtos(SEQ ID NO: 130 e SEQ ID NO: 131) duas vezes adicionais a cada 3 semanas e as respostas foram analisadas por ELISA após cadaimunização. Consulte também a Seção 0.6.3.2.7 ELISA[702] The immunization protocol began with the chitobiose-containing MUC16 55-mer glycopeptide (GlcNAc2-55-mer; SEQ ID NO: 129), which was administered to five BALB/c mice and five Swiss Webster mice three times every 3 weeks in the presence of an adjuvant. The fourth immunization was performed with a mixture of KLH-conjugated mono-glycosylated 15-mer (GlcNAc2-15-mer-KLH; SEQ ID NO: 131) and bis-glycosylated 18-mer ([GlcNAc2]2-18-mer-KLH; SEQ ID NO: 130) MUC16 constructs. Sera were analyzed for reactivity against the GlcNAc2-55-mer (SEQ ID NO: 129) and the unconjugated chitobiose-containing 15/18-mer glycopeptides (SEQ ID NO: 131 and SEQ ID NO: 130, respectively). Additionally, the unglycosylated 55-mer (SEQ ID NO: 129), 15-mer (SEQ ID NO: 131), and 18-mer (SEQ ID NO: 130) peptides, along with two chitobiose-containing peptides unrelated to MUC16, were used as negative controls for screening (SEQ ID NOs: 168 and 169). Mice were further immunized with the shorter KLH conjugates (SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 131) two additional times every 3 weeks, and responses were analyzed by ELISA after each immunization. See also Section 0.6.3.2.7 ELISA

[703] ELISA em sanduíche foi realizada para avaliar a positividade dos anticorpos a (glicol)peptídeos individuais seguindo o protocolo de instalação central de rotina para ensaio ELISA. Consulte também a Seção 0.6.3.2.8 Análise western blot[703] Sandwich ELISA was performed to assess antibody positivity to individual (glycol)peptides following the routine central facility protocol for ELISA assay. See also Section 0.6.3.2.8 Western blot analysis

[704] Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de acrilamida SDS-Poly (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose com o uso do aparelho de transferência BioRad a 4 °C. As membranas foram bloqueadas com albumina séricabovina a 3% (BSA) ou leite desnatado em PBS a 5% com 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente. As membranas foram desenvolvidas com uma variedade de anticorpos primários (Cell Signaling, MA: Akt número de catálogo 9272; Phospho-Akt (Ser473)(193H12) número de catálogo 4058; p44/43MAPK (Erk1/2) número de catálogo 9102; Phospho-p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) número de catálogo 9101; Src número de catálogo 2109S; Phospho-Src número de catálogo 2101L; EGFR número de catálogo 2237L; Phospho-EGFR (Y1068)(D7A5) XP(R) número de catálogo 3777S]; (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO: beta-actina número de catálogo A5441); (Southern BioTech, Birmingham, AL: anti-human-Fc-IgG1-HRP número de catálogo 905405); (Abgent, San Diego, CA: anticorpo LGALS3 policlonal número de catálogo AP11938b); e (Origene, Rockville, MD: mousemonoclonal anti-EGFR v3 clone OTI3H2 número de catálogo TA506224; mouse monoclonal anti-DDK clone 4C5 número de catálogo TA50011-100) a 4 °C de um dia para o outro. As membranas foram lavadas três times com PBS-T e desenvolvidas com anticorpo anti- camundongo ou anti-coelho conjugado a HRP (GE Healthcare, UK) (diluição de 1:5.000) durante 1 hora à temperatura ambiente. As membranas foram, então, lavadas três times com PBS-T e desenvolvidas com um reagente de quimiluminescência Western Lightning (ECL, Perkin Elmer) durante 1 a 5 minutos à temperatura ambiente e os sinais foram desenvolvidos em filme HyBlot CL (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ).[704] Equal amounts of protein were separated by SDS-Poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) or nitrocellulose membranes using the BioRad transfer apparatus at 4 °C. The membranes were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) or 5% nonfat milk in PBS with 0.1% Tween-20 (PBST) for 1 hour at room temperature. Membranes were developed with a variety of primary antibodies (Cell Signaling, MA: Akt catalog number 9272; Phospho-Akt (Ser473)(193H12) catalog number 4058; p44/43MAPK (Erk1/2) catalog number 9102; Phospho-p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) catalog number 9101; Src catalog number 2109S; Phospho-Src catalog number 2101L; EGFR catalog number 2237L; Phospho-EGFR (Y1068)(D7A5) XP(R) catalog number 3777S]; (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO: beta-actin catalog number A5441); (Southern BioTech, Birmingham, AL: anti-human-Fc-IgG1-HRP catalog number 905405); (Abgent, San Diego, CA: polyclonal LGALS3 antibody catalog number AP11938b); and (Origene, Rockville, MD: mouse monoclonal anti-EGFR v3 clone OTI3H2 catalog number TA506224; mouse monoclonal anti-DDK clone 4C5 catalog number TA50011-100) at 4 °C overnight. The membranes were washed three times with PBS-T and developed with HRP-conjugated anti-mouse or anti-rabbit antibody (GE Healthcare, UK) (1:5,000 dilution) for 1 hour at room temperature. The membranes were then washed three times with PBS-T and developed with a Western Lightning chemiluminescence reagent (ECL, Perkin Elmer) for 1 to 5 minutes at room temperature, and the signals were developed in HyBlot CL film (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ).

[705] Consulte também as Seções 0 e 0, e Referência 6 na Seção 0 abaixo, para descrições de protocolos de análise western blot.6.3.3 Imunoistoquímica de micromatriz de tecido (TMA)[705] See also Sections 0 and 0, and Reference 6 in Section 0 below, for descriptions of western blot analysis protocols.6.3.3 Tissue Microarray Immunohistochemistry (TMA)

[706] A imunoistoquímica de triagem de TMA humana foi realizada conforme anteriormente descrito (consulte Referência 6 na Seção 0, abaixo).6.3.4 Coloração de imunofluorescência de OVCAR3, SKOV3-MUC16C344 e SKOV3-MUC16C114[706] Human TMA screening immunohistochemistry was performed as previously described (see Reference 6 in Section 0, below).6.3.4 Immunofluorescence Staining of OVCAR3, SKOV3-MUC16C344, and SKOV3-MUC16C114

[707] 50.000 células foram semeadas em pratos de 0,17 mm Delta TPG separadamente e cultivadas em seus respectivos meios a 37 °C em 5% de CO2 de um dia para o outro. As células aderidas foram lavadas duas vezes com PBS que contém soro fetal de bezerro a 1% (FCS) e azida de sódio a 0,025% (tampão FACS). As células foram manchadas em diluição de 1:50 com EGFR(R-1)-Alexa Fluor 647 nm (Santa Cruz Biotechnology, CA, número de catálogo sc-101 AF647) e 4H11 ou Integrina β1(4B7R)-Alexa Fluor 647 nm (Santa Cruz Biotechnology, CA, número de catálogo sc-9970 AF647) e 4H11 durante 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas com tampão de FACS três vezes e, então, identificadas com cabra anti-IgG2b- PE de camundongo (Santa Cruz Biotechnology, CA, número de catálogo sc-3766-PE) durante 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas com tampão de FACS três vezes, e foram tomadas imagens em um Zeiss Axio Observer Z1 com lentes objetivas a ar 20x/0,8 NA e a óleo 63x/1,4 NA com o uso do software de aquisição ZEN2. 6.3.5 Análise estatística[707] 50,000 cells were seeded onto 0.17 mm Delta TPG dishes separately and grown in their respective media at 37 °C in 5% CO2 overnight. Adhered cells were washed twice with PBS containing 1% fetal calf serum (FCS) and 0.025% sodium azide (FACS buffer). Cells were stained at 1:50 dilution with EGFR(R-1)-Alexa Fluor 647 nm (Santa Cruz Biotechnology, CA, catalog number sc-101 AF647) and 4H11 or Integrin β1(4B7R)-Alexa Fluor 647 nm (Santa Cruz Biotechnology, CA, catalog number sc-9970 AF647) and 4H11 for 30 minutes at 4 °C. Cells were washed with FACS buffer three times and then stained with goat anti-mouse IgG2b-PE (Santa Cruz Biotechnology, CA, catalog number sc-3766-PE) for 30 minutes at 4 °C. Cells were washed with FACS buffer three times, and images were taken on a Zeiss Axio Observer Z1 with 20x/0.8 NA air and 63x/1.4 NA oil objective lenses using ZEN2 acquisition software. 6.3.5 Statistical analysis

[708] Para comparar grupos avaliados nos estudos in vitro e in vivo de crescimento e invasão, os dados foram analisados quanto à significância estatística com o uso do teste t de Student de duas caudas com o software GraphPad Prism (San Diego, CA).6.3.6 Cultura celular, transfecção e caracterização de linhagem de células[708] To compare groups evaluated in the in vitro and in vivo growth and invasion studies, data were analyzed for statistical significance using a two-tailed Student's t-test with GraphPad Prism software (San Diego, CA).6.3.6 Cell culture, transfection, and cell line characterization

[709] Consultar a Referência 3 na Seção 0 em relação à linhagem de células OVCA-433. O sistema induzível por tetraciclina pLenti foi adquirido junto à Invitrogen, CA (número de catálogo K4925-00) e foi usado para criar pLenti-SKOV3c114. Knockout em forma de grampo de shRNA para plasmídeos virais que expressam EGFR foram obtidos pela Instalação Nuclear de Triagem de Alto Rendimento (HTS) do Centro de Câncer Memorial SloanKettering; as células HEK293 transfectadas e os sobrenadantes virais foram coletados das células HEK293 para infectarlinhagens celulares pLenti-SKOV3c114-shEGFR. Os transfectantes MUC16c114 tiveram expressão em superfície celular de proteína MUC16 do local de clivagem putativo até a terminação carbóxi (aminoácidos 1.777 a 1.890 da SEQ ID NO: 150) (consultar aReferência 21 na Seção 0, abaixo). As linhagens celulares com fragmentos de MUC16 mais longos foram preparadas de uma maneira similar, incluindo linhagens com expressão de vetor MUC16c344-GFP que tiveram expressão em superfície celular de proteína MUC16 como um fragmento de 344 aminoácidos que se estende até aterminação carbóxi de MUC16 (aminoácidos 1.547 a 1.890 da SEQ ID NO: 150) (consultar as Referências 19 e 22 na Seção 0, abaixo). 6.3.7 Transfecção[709] See Reference 3 in Section 0 regarding the OVCA-433 cell line. The pLenti tetracycline-inducible system was purchased from Invitrogen, CA (catalog number K4925-00) and was used to create pLenti-SKOV3c114. Hairpin shRNA knockout for EGFR-expressing viral plasmids were obtained from the Memorial SloanKettering Cancer Center High Throughput Screening (HTS) Core Facility; transfected HEK293 cells and viral supernatants were harvested from HEK293 cells to infect pLenti-SKOV3c114-shEGFR cell lines. MUC16c114 transfectants had cell surface expression of MUC16 protein from the putative cleavage site to the carboxy terminus (amino acids 1777 to 1890 of SEQ ID NO: 150) (see Reference 21 in Section 0, below). Cell lines with longer MUC16 fragments were prepared in a similar manner, including MUC16c344-GFP vector-expressing lines that had cell surface expression of MUC16 protein as a 344-amino acid fragment extending to the carboxy terminus of MUC16 (amino acids 1547 to 1890 of SEQ ID NO: 150) (see References 19 and 22 in Section 0, below). 6.3.7 Transfection

[710] Construtos de DNA foram introduzidos nas células SKOV3 com o uso de DOTAP (Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN) seguindo o protocolo do fabricante. Os transfectantes estáveis foram selecionados com 800 μg/ml de G418 para células SKOV3 em seus meios de cultura. Os mesmos foram classificados por célula duas vezes quanto à expressão de GFP, e as células selecionadas foram cultivadas como linhagens de até 15passagens. O monitoramento de rotina de análise FACS foi feito para confirmar a positividade para GFP dessas linhagens. Os extratos de proteína dessas linhagens foram analisados porWestern blot com o uso de anticorpos monoclonais anti-hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA) e anti-terminação carbóxi de MUC16 (consultar a Referência na Seção 0, abaixo). Conforme descrito na Seção 0, os construtos MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2 e 117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 foram transfectados separadamente em células FreeStyle 293F (Invitrogen, CA) de rim embrionário humano (HEK) que expressam e secretam proteínas de fusão em meio sem soro, de acordo com o protocolo do fabricante (consultar a Seção 0 e a Referência 19 na Seção 0, abaixo). As proteínas de fusão secretadas foram purificadas e caracterizadas por análise Western blot com o uso de IgG1-Fc-HRP anti-humana (específica para cadeia Y1) (Southern Biotech Inc., Birmingham, AL) ou 4H11- HRP ou anticorpo LGALS3 anti-humano policlonal (Abgent, San Diego, CA). As proteínas purificadas EGFRDDK-HIS (número de catálogo TP700043), LGALS3Myc-DDK (número de catálogo TP308785) e Integrina-β1Myc-DDK (número de catálogo TP303818) expressas em células HEK293 foram adquiridas junto à Origene, Rockville, MD. 6.3.8 Coloração com imunofluorescência por análise FACS[710] DNA constructs were introduced into SKOV3 cells using DOTAP (Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN) following the manufacturer's protocol. Stable transfectants were selected with 800 μg/ml G418 for SKOV3 cells in their culture media. They were cell-sorted twice for GFP expression, and the selected cells were grown as lines for up to 15 passages. Routine FACS analysis monitoring was performed to confirm GFP positivity of these lines. Protein extracts from these lines were analyzed by Western blot using anti-hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA) and anti-MUC16 carboxy-terminus monoclonal antibodies (see Reference in Section 0, below). As described in Section 0, the MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2 and 117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 constructs were separately transfected into human embryonic kidney (HEK) FreeStyle 293F cells (Invitrogen, CA) expressing and secreting fusion proteins in serum-free medium according to the manufacturer's protocol (see Section 0 and Reference 19 in Section 0, below). The secreted fusion proteins were purified and characterized by Western blot analysis using anti-human IgG1-Fc-HRP (specific for Y1 chain) (Southern Biotech Inc., Birmingham, AL) or 4H11-HRP or polyclonal anti-human LGALS3 antibody (Abgent, San Diego, CA). Purified proteins EGFRDDK-HIS (catalog number TP700043), LGALS3Myc-DDK (catalog number TP308785), and Integrin-β1Myc-DDK (catalog number TP303818) expressed in HEK293 cells were purchased from Origene, Rockville, MD. 6.3.8 Immunofluorescence staining by FACS analysis

[711] A análise FACS de expressão de MUC16 foi realizada conforme descrito na Seção 0 e na Referência 6 na Seção 0 abaixo. 6.3.9 Curvas de crescimento[711] FACS analysis of MUC16 expression was performed as described in Section 0 and Reference 6 in Section 0 below. 6.3.9 Growth Curves

[712] As curvas de crescimento foram realizadas conforme descrito nas Seções 0 e 0 e nas Referências 18 e 19 na Seção 0 abaixo.6.3.10 Nomenclatura[712] Growth curves were performed as described in Sections 0 and 0 and in References 18 and 19 in Section 0 below.6.3.10 Nomenclature

[713] Conforme usado no Exemplo 3 (Seção 0), “N1” se refere à asparagina na posição 1.777 da SEQ ID NO: 150, também denominada “Asn1777”. Conforme usado no Exemplo 3 (Seção 0), “N24” se refere à asparagina na posição 1.800 da SEQ ID NO: 150, também denominada “Asn1800”. Conforme usado no Exemplo 3 (Seção 0), “N30” se refere à asparagina na posição 1.806 da SEQ ID NO: 150, também denominada “Asn1806”.6.3.11 Resultados6.3.11.1 A patobiologia de MUC16 é dependente da N-glicosilação de ectodomínio de MUC16 C-terminal[713] As used in Example 3 (Section 0), “N1” refers to the asparagine at position 1,777 of SEQ ID NO: 150, also referred to as “Asn1777”. As used in Example 3 (Section 0), “N24” refers to the asparagine at position 1,800 of SEQ ID NO: 150, also referred to as “Asn1800”. As used in Example 3 (Section 0), “N30” refers to the asparagine at position 1,806 of SEQ ID NO: 150, also referred to as “Asn1806”. 6.3.11 Results 6.3.11.1 The pathobiology of MUC16 is dependent on N-glycosylation of the MUC16 C-terminal ectodomain

[714] A expressão dos 114 aminoácidos mais proximais do ectodomínio de MUC16 C-terminal (MUC16c114) levou ao comportamento in vitro/in vivo mais agressivo de fibroblastos de camundongo 3T3, incluindo um aumento significativo em invasão de matrigel acionada por MUC16 e crescimento tumoral mais rápido in vivo (consultar a Seção 0 e a Referência 19 na Seção 0 abaixo). Para examinar o papel de MUC16 e seus efeitos de glicosilação em células de ovário humano, a linhagem de células de ovário humano SKOV3 negativa para MUC16 foi examinada quanto ao impacto da expressão de MUC16 (Figuras 18A a 18C). A transfecção de células SKOV3 com um vetor de expressão estável de MUC16c114 levou a altos níveis de expressão de MUC16 em superfície celular e um aumento mais que duas vezes em invasão de matrigel, conforme mostrado na Figura 19A. A exposição por vinte e quatro horas das células ao inibidor de N-glicosilação tunicamicina diminuiu profundamente as propriedades invasivas de células SKOV3-MUC16c114, mas teve pouco efeito sobre a invasão de matrigel de células transfectadas apenas com vetor SKOV3-phrGFP (Figura 19A).[714] Expression of the most proximal 114 amino acids of the MUC16 C-terminal ectodomain (MUC16c114) led to more aggressive in vitro/in vivo behavior of 3T3 mouse fibroblasts, including a significant increase in MUC16-driven matrigel invasion and faster tumor growth in vivo (see Section 0 and Reference 19 in Section 0 below). To examine the role of MUC16 and its glycosylation effects in human ovarian cells, the MUC16-negative SKOV3 human ovarian cell line was examined for the impact of MUC16 expression (Figures 18A to 18C). Transfection of SKOV3 cells with a stable MUC16c114 expression vector led to high levels of cell surface MUC16 expression and a more than two-fold increase in matrigel invasion, as shown in Figure 19A. Twenty-four-hour exposure of cells to the N-glycosylation inhibitor tunicamycin profoundly decreased the invasive properties of SKOV3-MUC16c114 cells, but had little effect on the matrigel invasion of cells transfected with SKOV3-phrGFP vector alone (Figure 19A).

[715] As lecitinas foram anteriormente implicadas na mediação de efeitos de glicosilação (consultar a Referência 17 na Seção 0, abaixo), e devido ao fato de que a Galectina-3 é frequentemente superexpressa em cânceres de ovário humanos, um construto de bloqueio de lecitina foi criado combinando-se o domínio de ligação com açúcar de Galectina-3 (117-244LGALS3) com uma sequência IgG1-Fc2 pFUSE-humana (pFUSE) que carece de um domínio de ligação variável (“117-244LGALS3-pFUSE”) (consultar a Referência 1 na Seção 0, abaixo). Essa molécula quimérica se liga com ligantes de Galectina-3, mas carece da habilidade de formar pentâmeros de Galectina-3. Conforme mostrado na Figura 19A, quando esse construto de bloqueio de galectina foi introduzido nas células, teve pouco efeito sobre a invasão de matrigel por células SKOV3-phrGFP de controle, mas reduziram significativamente a invasão de SKOV3-MUC16c114. O vetor pFUSE de controle que carece de domínio de ligação com açúcar de Galectina-3 não teve nenhum efeito. Um ectodomínio de MUC16 solúvel, construído por ligação do mesmo vetor pFUSE com os 58 aminoácidos do ectodomínio de MUC16, foi também gerado (“MUC16c57- 114-pFUSE”). Como com o construto de bloqueio Galectina-3-pFUSE (117-244LGALS3-pFUSE), o construto MUC16c57-114-pFUSE também diminuiu significativamente a invasão para as células SKOV3- MUC16c114, mas não para as células SKOV3-phrGFP. MGAT5 é a enzima de glicosilação que catalisa a formação dos N-glicanos tetra- antenários com a afinidade mais alta para ligação de Galectina- 3 (consultar a Referência 9 na Seção 0, abaixo). Os camundongos com knockout de MGAT5 são resistentes ao crescimento tumoral (consultar a Referência 8 na Seção 0, abaixo). Sem se ater a qualquer teoria particular, se supôs que os efeitos de MUC16 poderiam depender da expressão tanto de Galectina-3 como de MGAT5. Conforme mostrado na Figura 19B, os shRNAs que reduzem MGAT5 ou Galectina-3 (LGALS3) diminuíram notavelmente a invasão de SKOV3-MUC16c114, enquanto um shRNA de controle negativo que realizar knockdown de Lamelli não teve efeito.[715] Lecithins have previously been implicated in mediating glycosylation effects (see Reference 17 in Section 0, below), and because Galectin-3 is frequently overexpressed in human ovarian cancers, a lecithin-blocking construct was created by combining the sugar-binding domain of Galectin-3 (117-244LGALS3) with a pFUSE-human IgG1-Fc2 sequence (pFUSE) that lacks a variable binding domain (“117-244LGALS3-pFUSE”) (see Reference 1 in Section 0, below). This chimeric molecule binds with Galectin-3 ligands but lacks the ability to form Galectin-3 pentamers. As shown in Figure 19A, when this galectin-blocking construct was introduced into cells, it had little effect on matrigel invasion by control SKOV3-phrGFP cells but significantly reduced the invasion of SKOV3-MUC16c114. The control pFUSE vector lacking the Galectin-3 sugar-binding domain had no effect. A soluble MUC16 ectodomain, constructed by ligating the same pFUSE vector with the 58 amino acids of the MUC16 ectodomain, was also generated (“MUC16c57-114-pFUSE”). As with the Galectin-3-pFUSE blocking construct (117-244LGALS3-pFUSE), the MUC16c57-114-pFUSE construct also significantly decreased invasion for SKOV3-MUC16c114 cells but not for SKOV3-phrGFP cells. MGAT5 is the glycosylation enzyme that catalyzes the formation of tetraantennary N-glycans with the highest affinity for Galectin-3 binding (see Reference 9 in Section 0, below). MGAT5 knockout mice are resistant to tumor growth (see Reference 8 in Section 0, below). Without being bound by any particular theory, it was hypothesized that the effects of MUC16 might depend on the expression of both Galectin-3 and MGAT5. As shown in Figure 19B, shRNAs that reduce either MGAT5 or Galectin-3 (LGALS3) markedly decreased the invasion of SKOV3-MUC16c114, while a negative control shRNA that knocked down Lamelli had no effect.

[716] A introdução de mutações aos locais de N-glicosilação de ectodomínio de MUC16 (resíduos de asparagina nas posições N1, N24 e N30 do ectodomínio de MUC16c114) reduziu as alterações dependentes de glicosilação de MUC16 observadas. Conforme mostrado na Figura 19C, a mutação de asparagina em alanina da asparagina mais distal (N1), adjacente o local de clivagem, não teve nenhum efeito negativo sobre a invasão. Em contraste, as mutações de asparagina em alanina de qualquer uma das asparaginas mais proximais (N24 ou N30) afetou negativamente a invasão. Em particular, a conservação da asparagina mais próxima à superfície da membrana (N30) foi a mais essencial para a intensificação da invasão, e esse efeito não foi materialmente aumentado por mutações adicionais de asparagina em alanina dos outros resíduos de asparagina. Um construto de MUC16 maior com 344 aminoácidos a partir da terminação C de MUC16 (MUC16c344) foi também examinado. Quando os vetores de expressão que portam mutações de MUC16 em N30 de MUC16c344 ou N24 e N30 de MUC16c344 foram transfectados na linhagem de células SKOV3, a invasão de matrigel foi reduzida significativamente (Figura 19D). Embora esse construto maior tenha sete locais de N-glicosilação adicionais ao local de clivagem, a mutação dos locais N24 e N30 proximais essenciais ainda diminuiu a invasão de matrigel, conforme mostrado na Figura 19D, assim como aquelas mutações alteraram a invasão com SKOV3-MUC16c114.[716] Introducing mutations to the MUC16 ectodomain N-glycosylation sites (asparagine residues at positions N1, N24, and N30 of the MUC16c114 ectodomain) reduced the observed MUC16 glycosylation-dependent changes. As shown in Figure 19C, asparagine-to-alanine mutation of the most distal asparagine (N1), adjacent to the cleavage site, had no negative effect on invasion. In contrast, asparagine-to-alanine mutations of either of the more proximal asparagines (N24 or N30) negatively affected invasion. In particular, conservation of the asparagine closest to the membrane surface (N30) was most essential for enhancing invasion, and this effect was not materially enhanced by additional asparagine-to-alanine mutations of the other asparagine residues. A larger MUC16 construct with 344 amino acids from the C-terminus of MUC16 (MUC16c344) was also examined. When expression vectors carrying MUC16 mutations at N30 of MUC16c344 or N24 and N30 of MUC16c344 were transfected into the SKOV3 cell line, matrigel invasion was significantly reduced (Figure 19D). Although this larger construct has seven additional N-glycosylation sites beyond the cleavage site, mutation of the essential proximal N24 and N30 sites still decreased matrigel invasion, as shown in Figure 19D, just as those mutations altered invasion with SKOV3-MUC16c114.

[717] A ativação a jusante de ambas as trajetórias de ERK e PI3K/AKT em transformação MUC16c114 de células 3T3 foi demonstrada (consultar a Seção 0 e a Referência 19 na Seção 0 abaixo). Na Figura 19E, pode ser visto que a transfecção de células SKOV3 com MUC16c114 ativou uma variedade de oncogenes, incluindo pERK1/2, pSRC e a fosforilação de EGFR. A Figura 19E demonstra que cada uma das condições a seguir prejudica a ativação de oncogene induzida por MUC16c114: knockdown de MGAT5 (shMGAT5), knockdown de Galectina-3 (shLGALS3) e a mutação de asparagina em alanina de N30. Esses dados são consistentes com as diminuições observadas na invasão de matrigel relacionada à expressão de MUC16c114.[717] Downstream activation of both ERK and PI3K/AKT pathways in MUC16c114 transformation of 3T3 cells was demonstrated (see Section 0 and Reference 19 in Section 0 below). In Figure 19E, it can be seen that transfection of SKOV3 cells with MUC16c114 activated a variety of oncogenes, including pERK1/2, pSRC, and EGFR phosphorylation. Figure 19E demonstrates that each of the following conditions impairs MUC16c114-induced oncogene activation: MGAT5 knockdown (shMGAT5), Galectin-3 knockdown (shLGALS3), and the asparagine to alanine mutation of N30. These data are consistent with the observed decreases in matrigel invasion related to MUC16c114 expression.

[718] Os efeitos de knockdown de MGAT5 ou LGALS3 ou mutação dos locais de N-glicosilação de ectodomínio de MUC16c114 são examinados em crescimento tumoral de xenoenxerto em camundongos nude. Conforme mostrado na Figura 19F, houve uma anulação completa do crescimento tumoral induzido por MUC16c114 com qualquer uma dessas intervenções direcionadas por N- glicosilação. O efeito de MUC16c114 sobre a estabilidade do receptor foi também examinada. A presença tanto de N- glicosilação como ligação à retícula de galectina foi associada à estabilização de EGFR na superfície celular (consultar a Referência 11 na Seção 0 abaixo). Sem se ater a qualquer teoria particular, foi fundamentado que a presença aumentada de MUC16 estabiliza uma retícula de galectina de superfície celular, estabilizando, assim, o EGFR na superfície celular. Conforme mostrado na Figura 20A, a presença de EGFR na superfície celular de células SKOV3 foi aumentada quando transfectantes SKOV3- MUC16c114 estáveis foram comparados com os controles apenas de vetor com o uso de análise FACS. Além disso, a expressão de MUC16c114 quase dobrou o EGFR na superfície celular após tratamento com ciclo-heximida (CHX) para inibir a nova síntese de EGFR, em comparação com controles de vetor phrGFP. A estabilidade do ectodomínio de MUC16c114 (positivo para 4H11) foi inalterada por CHX. O EGFR total ao longo do tempo foi comparado em células SKOV3-MUC16c114 e SKOV3-phrGFP estáveis tratadas com CHX por 24 horas por Western blot, e o EGFR foi comparado com β- Actina. As curvas de densitometria (Figura 20B) indicaram que a presença de MUC16c114 na superfície celular estabilizou o EGFR em comparação com o controle de vetor phrGFP. Para excluir a possibilidade de que esse efeito estivesse relacionado à seleção de clones de MUC16c114 estáveis em SKOV3, um sistema de MUC16c114 induzível por tetraciclina foi utilizado. Conforme mostrado na Figura 20C, a exposição à tetraciclina por 24 horas não teve efeito sobre a invasão de matrigel para células de controle SKOV3 transfectadas com o vetor phrGFP vazio ou o vetor de expressão de MUC16c114 acionado por CMV estável. No sistema induzível por tetraciclina de MUC16c114, a exposição à tetraciclina induziu a invasão de matrigel dependente de MUC16c114 similarmente aos transfectantes estáveis, tanto controle como MUC16c114. O requisito de EGFR foi examinado por meio de expressão estável de um construto de shRNA (shEGFR) introduzido nas células SKOV3 que reduziu a expressão de EGFR. Ambos os clones de célula única para as células transfectadas com shEGFR mostraram invasão de matrigel notavelmente diminuída. A expressão induzida por tetraciclina de MUC16c114 nessas duas linhagens celulares shEGFR teve efeito mínimo sobre a invasão de matrigel em comparação com as linhagens celulares SKOV3-MUC16c114, confirmando que a invasão de matrigel induzida por SKOV3-MUC16c114 foi codependente da expressão de EGFR. A estabilidade de EGFR em SKOV3-MUC16c114 induzida por tetraciclina tratada com CHX foi estudada por western blot e comparada com β-actina. Conforme mostrado na Figura 20D, a exposição a CHX durante 24 horas resultou no declínio constante de proteína EGFR total nas células SKOV3 MUC16(-) não induzidas. Quando o mesmo experimento foi realizado após indução por tetraciclina de células SKOV3-MUC16c114(tet), a taxa induzida por CHX de perda de EGFR foi reduzida. A MUC16 não apenas estabilizou o teor de EGFR das células, mas também estabilizou os níveis de expressão de pEGFR nas células SKOV3- MUC16c114(tet) induzidas por tetraciclina em comparação com as células SKOV3-MUC16c114(tet) não induzidas (Figura 21).6.3.11.2 Síntese de N-glicopeptídeos homogêneos como imitações de epítopo para desenvolvimento de anticorpo Monoclonal (mAb)[718] The effects of knockdown of MGAT5 or LGALS3 or mutation of the ectodomain N-glycosylation sites of MUC16c114 are examined on xenograft tumor growth in nude mice. As shown in Figure 19F, there was a complete abrogation of MUC16c114-induced tumor growth with either of these N-glycosylation-targeted interventions. The effect of MUC16c114 on receptor stability was also examined. The presence of both N-glycosylation and galectin cross-linking was associated with stabilization of EGFR on the cell surface (see Reference 11 in Section 0 below). Without being bound by any particular theory, it was reasoned that the increased presence of MUC16 stabilizes a cell surface galectin cross-link, thereby stabilizing EGFR on the cell surface. As shown in Figure 20A, the presence of EGFR on the cell surface of SKOV3 cells was increased when stable SKOV3-MUC16c114 transfectants were compared to vector-only controls using FACS analysis. Furthermore, MUC16c114 expression nearly doubled that of EGFR on the cell surface after cycloheximide (CHX) treatment to inhibit new EGFR synthesis, compared to phrGFP vector controls. The stability of the MUC16c114 ectodomain (4H11-positive) was unchanged by CHX. Total EGFR over time was compared in stable SKOV3-MUC16c114 and SKOV3-phrGFP cells treated with CHX for 24 hours by Western blot, and EGFR was compared to β-Actin. Densitometry curves (Figure 20B) indicated that the presence of MUC16c114 on the cell surface stabilized EGFR compared to the phrGFP vector control. To exclude the possibility that this effect was related to the selection of stable MUC16c114 clones in SKOV3, a tetracycline-inducible MUC16c114 system was used. As shown in Figure 20C, tetracycline exposure for 24 hours had no effect on matrigel invasion for SKOV3 control cells transfected with the empty phrGFP vector or the stable CMV-driven MUC16c114 expression vector. In the tetracycline-inducible MUC16c114 system, tetracycline exposure induced MUC16c114-dependent matrigel invasion similarly to both control and MUC16c114 stable transfectants. The requirement for EGFR was examined through stable expression of an shRNA construct (shEGFR) introduced into SKOV3 cells that reduced EGFR expression. Both single-cell clones for the shEGFR-transfected cells showed remarkably decreased matrigel invasion. Tetracycline-induced expression of MUC16c114 in these two shEGFR cell lines had minimal effect on matrigel invasion compared with SKOV3-MUC16c114 cell lines, confirming that SKOV3-MUC16c114-induced matrigel invasion was codependent on EGFR expression. EGFR stability in CHX-treated tetracycline-induced SKOV3-MUC16c114 was studied by western blot and compared with β-actin. As shown in Figure 20D, CHX exposure for 24 hours resulted in the steady decline of total EGFR protein in the uninduced SKOV3 MUC16(-) cells. When the same experiment was performed after tetracycline induction of SKOV3-MUC16c114(tet) cells, the CHX-induced rate of EGFR loss was reduced. MUC16 not only stabilized the EGFR content of the cells but also stabilized the expression levels of pEGFR in the tetracycline-induced SKOV3-MUC16c114(tet) cells compared to the uninduced SKOV3-MUC16c114(tet) cells (Figure 21). 6.3.11.2 Synthesis of Homogeneous N-Glycopeptides as Epitope Mimics for Monoclonal Antibody (mAb) Development

[719] Com a N-glicosilação identificada nos locais N24 e N30 de MUC16c114 como um requisito central para a ação de MUC16, o perfil de glicano de um glicopeptídeo com mutação de MUC16c114 que contém mutações de alanina para asparagina em N1 e N24, purificadas a partir da linhagem de células SKOV3-MUC16c114, foianalisado (Figura 22). Esse glicopeptídeo purificado continha, dessa forma, um único resíduo de asparagina (N30) para N-glicosilação. A análise de glicoma do glicopeptídeo purificado é mostrada na Figura 22A. Foi caracterizado por um padrão de N- glicosilação diverso que consiste em grande parte em espécies glicosiladas truncadas que compartilharam o dissacarídeo de chitobiose proximal comum (GlcNAc2) como a unidade de repetição mínima a qual fucose e diversos resíduos de manose são fixados (Figura 22A).[719] With N-glycosylation at the N24 and N30 sites of MUC16c114 identified as a central requirement for MUC16 action, the glycan profile of a MUC16c114-mutated glycopeptide containing alanine to asparagine mutations at N1 and N24, purified from the SKOV3-MUC16c114 cell line, was analyzed (Figure 22). This purified glycopeptide thus contained a single asparagine residue (N30) for N-glycosylation. Glycome analysis of the purified glycopeptide is shown in Figure 22A. It was characterized by a diverse N-glycosylation pattern consisting largely of truncated glycosylated species that shared the common proximal chitobiose disaccharide (GlcNAc2) as the minimal repeating unit to which fucose and several mannose residues are attached (Figure 22A).

[720] Acreditou-se na hipótese de que os anticorpos dirigidos contra um epítopo de ectodomínio de MUC-16 que abrange o local de glicosilação N30 crucial poderiam inibir a interação de MUC16 com a retícula de galectina, diminuindo os efeitos adversos da expressão de MUC16, incluindo crescimento de tumor e invasão. Dessa forma, os antígenos de peptídeo sintéticos de diversos comprimentos (isto é, 55, 18 e 15 aminoácidos de comprimento; SEQ ID NOs: 129, 131 e 130, respectivamente) dentro do ectodomínio de MUC16, glicosilados com chitobiose nesse local N30, foram projetados. Apesar de ser o motivo mínimo comum a N- glicanos maiores e mais complexos, o dissacarídeo de chitobiose também deveriam possibilitar uma exposição melhor do peptídeo subjacente para suscitar anticorpos dirigidos a glicano que retêm especificidade de peptídeo.[720] It was hypothesized that antibodies directed against a MUC-16 ectodomain epitope encompassing the crucial N30 glycosylation site could inhibit the interaction of MUC16 with the galectin cross-linker, decreasing the adverse effects of MUC16 expression, including tumor growth and invasion. Therefore, synthetic peptide antigens of various lengths (i.e., 55, 18, and 15 amino acids in length; SEQ ID NOs: 129, 131, and 130, respectively) within the MUC16 ectodomain, glycosylated with chitobiose at this N30 site, were designed. Although it is the minimal motif common to larger and more complex N-glycans, the chitobiose disaccharide should also enable better exposure of the underlying peptide to elicit glycan-directed antibodies that retain peptide specificity.

[721] A síntese do N-glicopeptídeo de ectodomínio de MUC16 55-mer (GlcNAc2-55-mer; SEQ ID NO: 129) foi altamente convergente e envolveu um acoplamento entre o peptídeo de comprimento completo convenientemente protegido (55-mer) e chitobiose amina, seguido da desproteção global ácida com o uso do presente procedimento de aspartilação/desproteção em um frasco (consulte Seções 0 e 0 e referências 7 e 20 na Seção 0 abaixo). Seguindo uma abordagem similar, o glicopeptídeo Man3GlcNAc2-55-mer mais elaborado que contém uma trimanose glicano terminal também pode preparado por aspartilação convergente.[721] The synthesis of the MUC16 ectodomain N-glycopeptide 55-mer (GlcNAc2-55-mer; SEQ ID NO: 129) was highly convergent and involved a coupling between the suitably protected full-length peptide (55-mer) and chitobiose amine, followed by global acidic deprotection using the present one-vial aspartylation/deprotection procedure (see Sections 0 and 0 and references 7 and 20 in Section 0 below). Following a similar approach, the more elaborate glycopeptide Man3GlcNAc2-55-mer containing a terminal trimannose glycan could also be prepared by convergent aspartylation.

[722] A fim de focar a resposta imunológica contra um epítopo de tamanho menor em torno do local de glicosilação relevante, os glicopeptídeos 15 e 18-mer mais curtos que portam um (N30) e dois glicanos de chitobiose (N24 e N30) respectivamente foram também sintetizados (Figura 22C; SEQ ID NOs: 131 e 130, respectivamente), o último por analogia à apresentação em aglomeração do antígeno Tn (GalNAc-α-O-Ser/Thr), que mostrou ser necessária para ligação com alguns mAbs (consultar as Seções 0 e 0 e as referências 14 a 16 na Seção 0 abaixo). Esses glicopeptídeos foram, então, conjugados com a proteína carreadora KLH por meio de uma cisteína N-terminal para gerar os imunógenos correspondentes para vacinação de camundongo.6.3.11.3 Vacinação de camundongo com glicopeptídeos/glicoconjugados sintéticos e ensaios sorológicos[722] In order to focus the immune response against a smaller sized epitope around the relevant glycosylation site, shorter 15- and 18-mer glycopeptides bearing one (N30) and two chitobiose glycans (N24 and N30) respectively were also synthesized (Figure 22C; SEQ ID NOs: 131 and 130, respectively), the latter by analogy to the cluster presentation of the Tn antigen (GalNAc-α-O-Ser/Thr), which has been shown to be required for binding with some mAbs (see Sections 0 and 0 and references 14 to 16 in Section 0 below). These glycopeptides were then conjugated to the carrier protein KLH via an N-terminal cysteine to generate the corresponding immunogens for mouse vaccination. 6.3.11.3 Mouse vaccination with synthetic glycopeptides/glycoconjugates and serological assays

[723] A vacinação de camundongo e a coleta de soro foram realizadas de acordo com o protocolo descrito nas Seções 0 e 0. Após 3 imunizações com o glicopeptídeo GlcNAc2-55-mer (SEQ ID NO: 129, Figura 22B) seguidas por uma imunização com uma mistura igual dos construtos conjugados a KLH que portam chitobiose (mono-glicosilados 15-mer (SEQ ID NO: 131) e bis-glicosilados 18-mer(SEQ ID NO: 130)), apenas 2 de 10 camundongos mostraram sinais de ELISA fracamente positivos para ambos os 55-mers (com e sem GlcNAc2 (SEQ ID NO: 129)), sugerindo que os camundongos tiveram resposta imunológica limitada às imunizações com 55-mer. Mais duas imunizações de reforço com ambos os conjugados de KLH (GlcNAc2-15-mer (SEQ ID NO: 131) e (GlcNAc2)2-18-mer (SEQ ID NO: 130)) resultaram em respostas imunológicas intensificadas (tipo de IgG) contra os glicopeptídeos mais curtos, particularmente em dois camundongos (camundongo 7 e camundongo 8). O mAb de 4H11, direcionado em uma porção não glicosilada diferente da cadeia principal de peptídeo MUC16, não mostrou ligação com os glicopeptídeos 15-mer/18-mer, indicando um epítopo reconhecido distinto separado da positividade de soro de camundongo.[723] Mouse vaccination and serum collection were performed according to the protocol described in Sections 0 and 0. After 3 immunizations with the glycopeptide GlcNAc2-55-mer (SEQ ID NO: 129, Figure 22B) followed by an immunization with an equal mixture of the KLH-conjugated constructs bearing chitobiose (mono-glycosylated 15-mer (SEQ ID NO: 131) and bis-glycosylated 18-mer (SEQ ID NO: 130)), only 2 of 10 mice showed weakly positive ELISA signals for both 55-mers (with and without GlcNAc2 (SEQ ID NO: 129)), suggesting that the mice had limited immune response to the 55-mer immunizations. Two further booster immunizations with both KLH conjugates (GlcNAc2-15-mer (SEQ ID NO: 131) and (GlcNAc2)2-18-mer (SEQ ID NO: 130)) resulted in enhanced immune responses (IgG-like) against the shorter glycopeptides, particularly in two mice (mouse 7 and mouse 8). The 4H11 mAb, targeting a different non-glycosylated portion of the MUC16 peptide backbone, showed no binding to the 15-mer/18-mer glycopeptides, indicating a distinct recognized epitope separate from the mouse serum positivity.

[724] O soro policlonal do camundongo 7 foi adicionalmente caracterizado por ELISA e triado por FACS em diversas linhagens celulares com e sem expressão de MUC16c114. Esses estudos de classificação de célula confirmaram sinais positivos tanto para células SKOV3-MUC16c114 como para células OVCAR3, similarmente ao controle de anticorpo de 4H11 anti-MUC16 (consultar a Referência 6 na Seção 0, abaixo). As células de controle SKOV3-phrGFP que carecem de MUC16 foram negativas para ligação com soro de camundongo 7.6.3.11.4 Seleção de mab direcionada por glicosilação[724] Mouse polyclonal serum 7 was further characterized by ELISA and FACS sorted into several cell lines with and without MUC16c114 expression. These cell sorting studies confirmed positive signals for both SKOV3-MUC16c114 and OVCAR3 cells, similarly to the 4H11 anti-MUC16 antibody control (see Reference 6 in Section 0, below). SKOV3-phrGFP control cells lacking MUC16 were negative for binding with mouse serum 7.6.3.11.4 Glycosylation-Directed Mab Selection

[725] O baço de camundongo 7 foi coletado e os esplenócitos foram fundidos com parceiro de fusão de hibridoma com alta eficácia de fusão. Os sobrenadantes foram selecionados e triados quanto à reatividade por ELISA contra glicopeptídeos individuais (Figura 22C). Embora múltiplos sobrenadantes tenham sido reativos com os glicopeptídeos GlcNAc2-15-mer e (GlcNAc2)2-18- mer, nenhum dos sobrenadantes de hibridoma triados demonstrou um alto grau de seletividade para os peptídeos glicosilados em relação aos não glicosilados em triagem por ELISA. A especificidade de MUC16 foi mantida e nenhum sobrenadante positivo foi reativo com peptídeos irrelevantes glicosilados com chitobiose. Nenhuma sobreposição foi vista com a sequência de peptídeos reconhecida pelo mAb de 4H11.[725] Mouse spleen 7 were harvested and splenocytes were fused with a hybridoma fusion partner with high fusion efficiency. Supernatants were selected and screened for reactivity by ELISA against individual glycopeptides (Figure 22C). Although multiple supernatants were reactive with the GlcNAc2-15-mer and (GlcNAc2)2-18-mer glycopeptides, none of the screened hybridoma supernatants demonstrated a high degree of selectivity for the glycosylated over the non-glycosylated peptides in ELISA screening. MUC16 specificity was maintained and no positive supernatants were reactive with irrelevant chitobiose-glycosylated peptides. No overlap was seen with the peptide sequence recognized by the 4H11 mAb.

[726] Após a subclonagem em série, o processo proporcionou múltiplos mAbs primários direcionados por chitobiose que foram reativos com epítopos glicosilados por MUC16 e as sequências não glicosiladas homólogas, mas não com peptídeos irrelevantes que portam chitobiose que servem como controle negativo. Desse agrupamento, quatro anticorpos de alta afinidade foram selecionados e adicionalmente purificados para caracterização. 6.3.11.5 Caracterização de mAbs direcionados/dirigidos para glicosilação de N30 ANTI-MUC16[726] After serial subcloning, the process afforded multiple chitobiose-targeted primary mAbs that were reactive with MUC16-glycosylated epitopes and the homologous non-glycosylated sequences, but not with irrelevant chitobiose-bearing peptides serving as negative controls. From this pool, four high-affinity antibodies were selected and further purified for characterization. 6.3.11.5 Characterization of N30 ANTI-MUC16 Glycosylation-Targeted/Directed mAbs

[727] Os resultados dos estudos de caracterização confirmatória para quatro anticorpos representativos são mostrados por ELISA na Figura 23A. A ligação dos anticorpos candidatos com os vários peptídeos sintéticos foi avaliada e comparada com a ligação do anticorpo de 4H11, que reconhece a cadeia principal de ectodomínio de MUC16. Os peptídeos ligados com chitobiose não relacionados não exibiram nenhuma ligação significativa por qualquer um dos anticorpos anti-glicano-MUC16 selecionados. Todos os anticorpos candidatos mostraram afinidades de ligação similares para ambos os 15-mers derivados de MUC16 (isto é, o peptídeo não glicosilado e o glicopeptídeo de chitobiose correspondente). Os glicopeptídeos sintéticos adicionais que portam porções químicas de açúcar alternativas, incluindo um único GlcNAc, uma trimanose-chitobiose terminal (Man3GlcNAc2), e uma chitobiose fucosilada (GlcNAc2Fuc), não alteraram substancialmente a reatividade do anticorpo aos peptídeos de MUC16 ligados com chitobiose usados para imunização.[727] The results of confirmatory characterization studies for four representative antibodies are shown by ELISA in Figure 23A. The binding of the candidate antibodies to the various synthetic peptides was evaluated and compared with the binding of the 4H11 antibody, which recognizes the ectodomain backbone of MUC16. The unrelated chitobiose-linked peptides exhibited no significant binding by any of the selected anti-glycan-MUC16 antibodies. All candidate antibodies showed similar binding affinities for both MUC16-derived 15-mers (i.e., the non-glycosylated peptide and the corresponding chitobiose glycopeptide). Additional synthetic glycopeptides bearing alternative sugar moieties, including a single GlcNAc, a terminal trimannose-chitobiose (Man3GlcNAc2), and a fucosylated chitobiose (GlcNAc2Fuc), did not substantially alter antibody reactivity to the chitobiose-linked MUC16 peptides used for immunization.

[728] Cada anticorpo foi também testado para especificidades de glicano-MUC16c114 e glicano-MUC16c344 em um painel estendido de linhagens celulares que expressam peptídeos de MUC16 diferentemente glicosilado (Tabela 11). Nesses estudos, os transfectantes SKOV3-phrGFP foram comparados com a SKOV3- MUC16c114 (N-glicosilação completa), mutantes de SKOV3-MUC16N24c114(nenhum local de glicosilação N24), SKOV3-MUC16N30c114 (nenhum local de glicosilação N30) e SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114 (nenhum localde glicosilação N1, N24 ou N30). SKOV3-MUC16c114 se refere acélulas SKOV3 que expressam uma forma truncada de MUC16 que tem capacidade para ser N-glicosilada em N1, N24 e N30. SKOV3-MUC16N24c114 se refere a células SKOV3 que expressam uma forma de mutante truncado de MUC16, em que a posição de aminoácido correspondente a Asn1800 da SEQ ID NO: 150 compreende uma mutação de asparagina em alanina, e, assim, não tem capacidade para ser N-glicosilada nessa posição. SKOV3-MUC16N30c114 se refere a células SKOV3 que expressam uma forma de mutante truncado de MUC16, emque a posição de aminoácido correspondente a Asn1806 da SEQ IDNO: 150 compreende uma mutação de asparagina em alanina, e,assim, não tem capacidade para ser N-glicosilada nessa posição.SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114 se refere a células SKOV3 que expressam uma forma de mutante truncado de MUC16, em que as posições de aminoácido correspondentes a Asn1777, Asn1800 e Asn1806 da SEQID NO: 150 compreendem mutações de asparagina em alanina, e, assim, não têm capacidade para ser N-glicosilada nessasposições. Como com os dados de ELISA, os resultados indicaram que direcionamento específico para MUC16 estava presente.[728] Each antibody was also tested for glycan-MUC16c114 and glycan-MUC16c344 specificities in an extended panel of cell lines expressing differently glycosylated MUC16 peptides (Table 11). In these studies, SKOV3-phrGFP transfectants were compared to SKOV3-MUC16c114 (full N-glycosylation), mutants of SKOV3-MUC16N24c114 (no N24 glycosylation site), SKOV3-MUC16N30c114 (no N30 glycosylation site), and SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114 (no N1, N24, or N30 glycosylation site). SKOV3-MUC16c114 refers to SKOV3 cells that express a truncated form of MUC16 that is capable of being N-glycosylated at N1, N24, and N30. SKOV3-MUC16N24c114 refers to SKOV3 cells that express a truncated mutant form of MUC16 in which the amino acid position corresponding to Asn1800 of SEQ ID NO: 150 comprises an asparagine to alanine mutation, and thus is incapable of being N-glycosylated at that position. SKOV3-MUC16N30c114 refers to SKOV3 cells that express a truncated mutant form of MUC16, in which the amino acid position corresponding to Asn1806 of SEQ ID NO: 150 comprises an asparagine to alanine mutation, and thus is incapable of being N-glycosylated at that position. SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114 refers to SKOV3 cells that express a truncated mutant form of MUC16, in which the amino acid positions corresponding to Asn1777, Asn1800, and Asn1806 of SEQ ID NO: 150 comprise asparagine to alanine mutations, and thus is incapable of being N-glycosylated at those positions. As with the ELISA data, the results indicated that specific targeting of MUC16 was present.

[729] Entretanto, em contraste aos dados de ELISA, a perda de ambos os locais de glicosilação N24 e N30 no ectodomínio de MUC16 reduziu a reatividade de anticorpo direcionada para glicosilação, enquanto a reatividade ao anticorpo de 4H11 foi mantida, confirmando, assim, a presença de SKOV3-MUC16c114 de superfície celular. As células que portam cadeia C-terminal de MUC16 estendida a 344 aminoácidos (por exemplo, SKOV3-MUC16c344) tiveram também uma necessidade similar de glicosilação em N24 ou N30 (Tabela 11). Ademais, a reatividade com os anticorpos contra o ectodomínio de glicano-MUC16 não foi diminuída por regulação decrescente de MGAT5 (Tabela 11), confirmando que uma chitobiose nos locais N24/N30 contribui para a ligação de anticorpo com células inteiras, a despeito de ramificação mais complexa.Tabela 11. A Tabela 11 fornece a fluorescência de ficoeritrina (PE) em média geométrica de 4H11 e quatro anticorpos monoclonais de ectodomínio de GlcNAc2-MUC16 em transfecções de SKOV3-MUC16 com modificações de local de N-glicosilação. 4H11 manteve a ligação com todas as linhagens celulares (exceto pela linhagem SKOV3-phrGFP, que não expressa MUC16) a despeito da modificação de glicosilação, confirmando, assim, a proteína MUC16 na superfície celular. Quando ambos os locais N24 e N30 de glicosilação foram perdidos, há uma redução de ligação de anticorpo de glicano-MUC16 para ambos os transfectantes MUC16c114 e MUC16c344. A perda limitada de reatividade para a linhagem celular com knockdown de MGAT5 confirmou que a chitobiose é essencial para cada anticorpo de ectodomínio de GlcNAc2-MUC16, enquanto uma ramificação mais extensiva teve efeito limitado. “G anti M” se refere a cabra anti-camundongo. “PE” se referea ficoeritrina.[729] However, in contrast to the ELISA data, loss of both the N24 and N30 glycosylation sites in the MUC16 ectodomain reduced antibody reactivity directed toward glycosylation, while reactivity to the 4H11 antibody was maintained, thus confirming the presence of cell surface SKOV3-MUC16c114. Cells bearing the C-terminal chain of MUC16 extended to 344 amino acids (e.g., SKOV3-MUC16c344) also had a similar requirement for glycosylation at N24 or N30 (Table 11). Furthermore, reactivity with antibodies against the MUC16 glycan ectodomain was not diminished by MGAT5 downregulation (Table 11), confirming that a chitobiose at the N24/N30 sites contributes to antibody binding to whole cells despite more complex branching. Table 11. Table 11 provides the geometric mean phycoerythrin (PE) fluorescence of 4H11 and four MUC16 GlcNAc2 ectodomain monoclonal antibodies in SKOV3-MUC16 transfections with N-glycosylation site modifications. 4H11 maintained binding to all cell lines (except the SKOV3-phrGFP cell line, which does not express MUC16) despite the glycosylation modification, thus confirming MUC16 protein on the cell surface. When both the N24 and N30 glycosylation sites were lost, there was a reduction in glycan-MUC16 antibody binding for both MUC16c114 and MUC16c344 transfectants. The limited loss of reactivity for the MGAT5 knockdown cell line confirmed that chitobiose is essential for each GlcNAc2-MUC16 ectodomain antibody, while more extensive branching had limited effect. “G anti M” refers to goat anti-mouse. “PE” refers to phycoerythrin.

[730] Os quatro Anticorpos de Glicosilação de MUC16 representativos (18C6, 10C6, 19C11, 7B12) caracterizados foram avaliados em conjunto com 4H11 para afinidade de ligação (Tabela 12) e seu efeito sobre a invasão por ensaio de matrigel com os transfectantes SKOV3-MUC16c114. Conforme mostrado nas Figuras 23B a 23D, os anticorpos recém-desenvolvidos mostraram inibição ampla de invasão de matrigel, enquanto 4H11 foi distinguido por sua incapacidade para bloquear a invasão mediada por SKOV3- MUC16c114, indicando que esses anticorpos que direcionam epítopos de peptídeo glicosilados no ectodomínio de MUC16 inibiram algumas das propriedades biológicas cruciais de MUC16 melhor do que anticorpos que direcionam epítopos proximamente adjacentes. Todos os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 foram inibitórios em células de câncer de ovário que expressam MUC16 de comprimento completo nativa, tais como células CAOV3 e OVCA-433. Isso sugere que os locais de glicosilação N24/N30 foram essenciais para as propriedades invasivas intensificadas de MUC16, enquanto a presença de outros locais de N e O-glicosilação de MUC16 foram insuficientes para superar o bloqueio de Anticorpo de Glicosilação de MUC16 desse epítopo essencial. Sem se ater a qualquer teoria particular, a inibição de anticorpo da ligação em N24/30 de Galectina-3 com MUC16 poderia ser prevista para conferir estabilização de superfície celular de EGFR também. As Figuras 23B a 23D demonstram que um desses anticorpos (10C6) foi introduzido na cultura celular, o efeito estabilizante de EGFR de SKOV3-MUC16c114(tet) induzida por tetraciclina foi superado, e a taxa de perda de EGFR em células expostas a CHX foi similar àquela das linhagens celulares SKOV3-MUC16c114(tet) não induzidas sem expressão de MUC16c114. A coloração por imunoistoquímica com os anticorpos foi também examinado em microarranjos de tecido de câncer de ovário. Conforme mostrado na Figura 23E, cada um dos anticorpos de ectodomínio de MUC16 direcionado por glicano ligados a células de câncer de ovário serosas em tecido fixado em parafina com interação limitada com outro tecido estromal, similar ao comportamento de 4H11. Finalmente, o efeito do anticorpo 10C6 sobre o crescimento de SKOV3-MUC16344 em camundongos imunodeprimidos foi testado. As células SKOV3- MUC16c344 foram utilizadas em vez das células SKOV3-MUC16c114 como um teste mais estringente do efeito do anticorpo em células tumorais positivas para MUC16 com múltiplos locais de N e O- glicosilação. O anticorpo 10C6 diminuiu a invasão de matrigel por células MUC16c344 (Figura 23F) e reduziu significativamente o crescimento de células tumorais SKOV3-MUC16c344 no flanco do camundongo quando administradas a camundongos que portam tumor duas vezes por semana (Figura 23G).Tabela 12.* baixa confiança de cálculo, sem ajuste para taxa dedissociação** ka é muito baixa para determinação da taxa de associação 6.3.11.6 Colocalização dependente de galectina de MUC16 e outras proteínas de superfície celular[730] The four representative MUC16 Glycosylation Antibodies (18C6, 10C6, 19C11, 7B12) characterized were evaluated together with 4H11 for binding affinity (Table 12) and their effect on invasion by matrigel assay with the SKOV3-MUC16c114 transfectants. As shown in Figures 23B to 23D, the newly developed antibodies showed broad inhibition of matrigel invasion, while 4H11 was distinguished by its inability to block SKOV3-MUC16c114-mediated invasion, indicating that these antibodies targeting glycosylated peptide epitopes in the MUC16 ectodomain inhibited some of the crucial biological properties of MUC16 better than antibodies targeting closely adjacent epitopes. All MUC16 Glycosylation Antibodies were inhibitory in ovarian cancer cells expressing native full-length MUC16, such as CAOV3 and OVCA-433 cells. This suggests that the N24/N30 glycosylation sites were essential for the enhanced invasive properties of MUC16, while the presence of other N- and O-glycosylation sites on MUC16 were insufficient to overcome MUC16 Glycosylation Antibody blockade of this essential epitope. Without being bound to any particular theory, antibody inhibition of N24/30 binding of Galectin-3 to MUC16 could be predicted to confer cell surface stabilization of EGFR as well. Figures 23B to 23D demonstrate that when one of these antibodies (10C6) was introduced into cell culture, the tetracycline-induced EGFR-stabilizing effect of SKOV3-MUC16c114(tet) was overcome, and the rate of EGFR loss in CHX-exposed cells was similar to that of uninduced SKOV3-MUC16c114(tet) cell lines lacking MUC16c114 expression. Immunohistochemical staining with the antibodies was also examined on ovarian cancer tissue microarrays. As shown in Figure 23E, each of the glycan-targeted MUC16 ectodomain antibodies bound to serous ovarian cancer cells in paraffin-embedded tissue with limited interaction with other stromal tissue, similar to the behavior of 4H11. Finally, the effect of the 10C6 antibody on the growth of SKOV3-MUC16344 in immunocompromised mice was tested. SKOV3-MUC16c344 cells were used instead of SKOV3-MUC16c114 cells as a more stringent test of the antibody’s effect on MUC16-positive tumor cells with multiple N- and O-glycosylation sites. The 10C6 antibody decreased matrigel invasion by MUC16c344 cells (Figure 23F) and significantly reduced the growth of SKOV3-MUC16c344 tumor cells in the mouse flank when administered to tumor-bearing mice twice weekly (Figure 23G). Table 12. * low confidence of calculation, without adjustment for dissociation rate** ka is too low for determination of association rate 6.3.11.6 Galectin-dependent colocalization of MUC16 and other cell surface proteins

[731] EGFR estabilizado por MUC16 parece ser um acionador importante de invasão de célula de câncer de ovário, e essa interação depende de EGFR, ectodomínio de proteína MUC16 adequadamente N-glicosilada, e a presença de Galectina-3. Essa interação foi avaliada com proteínas purificadas para estabelecer a interação em três vias necessária/suficiente entre essas três proteínas. Para esse propósito, as proteínas MUC16c57- 114-pFUSE purificada (produzida em células 293F FreeStyle de rim embrionário humano [HEK]) (como a parte MUC16 da interação), EGFR purificado (produzido por células HEK293) e Galectina-3 purificada (LGALS3; produzido por células HEK293) foram utilizadas. Devido ao fato de que essas proteínas foram produzidas em células humanas, esperava-se que as mesmas portassem espécies glicosiladas nativas típicas. Sem se ater a qualquer teoria particular, pode-se supor que as três proteínas poderiam formar heterômeros que poderiam ser identificados por imunocoprecipitação. A Figura 24A ilustra os resultados dessa imunocoprecipitação, em que cada uma das três proteínas detectadas é mostrada no imunoblot direto nas três faixas da esquerda. Com o uso de microesferas de Proteína A/G de Agarose, pode-se ver que a proteína MUC16c57-114-pFUSE se ligou com as microesferas conjugadas a Proteína A/G PLUS e estava presente no eluído quando separada do gel SDS-PAGE. EGFR estava apenas presente no eluído combinado com MUC16c57-114-pFUSE quando a Galectina-3 (LGALS3) também estava presente. O anticorpo 18C6 eliminou a interação de EGFR-MUC16 bloqueando o local de ligação de N-glicosilação de Galectina-3 (consultar a Figura 24A). Imageamento por imunofluorescência dupla molecular direta foi usada para confirmar a colocalização do EGFR e MUC16 em células vivas. Conforme mostrado na Figura 24B e Figura 25A, EGFR e MUC16 estavam firmemente colocalizados em células OVCAR3, SKOV3- MUC16c344 e SKOV3-MUC16c114 (consultar as setas nas Figuras 24B e 25A). Esses estudos confirmam fortemente que MUC16 se combinou com Galectina-3 para se associar com EGFR na superfície de células de câncer de ovário positivas para MUC16. Sem se ater a qualquer teoria particular, visto que muitos receptores de intensificação de crescimento são glicosilados, foi fundamentado que os efeitos de superfície celular de MUC16 dependente de lecitina podem incluir outras proteínas N-glicosiladas e não estar restritos a EGFR. The integrin proteins are often altered in câncer e participate in the “outside-in” signaling initiated by stromal-epithelial interactions triggering SRC phosphorylation e other downstream effects. A Figura 24C representa as interações de MUC16 com Integrina β1, um componente de integrina frequentemente associado com o desenvolvimento e a progressão de câncer. Como no caso de EGFR, MUC16c57-114-pFUSE purificada se ligou com a Integrina β1 de uma maneira dependente de Galectina-3, e essa interação heterotrimérica exigiu todas as 3 proteínas. Como com EGFR, a interação foi completamente bloqueada por um anticorpo de bloqueio de local de glicosilação anti-MUC16c114, 18C6. A colocalização de MUC16 e Integrina β1 foi também confirmada por imunofluorescência dupla em diversas linhagens celulares de câncer de ovário (Figura 24D e Figura 25B). Assim, a N-glicosilação nesses locais chave em epítopos de peptídeo de ectodomínio de MUC16 mediou a interação com receptores de proteína de superfície celular de uma maneira específica para lecitina para gerar as características de comportamento maligno, incluindo invasão de matrigel, ativação das trajetórias de PI3K/ERK e SRC, assim como crescimento tumoral positivo para MUC16 intensificado em camundongos imunodeprimidos.[731] EGFR stabilized by MUC16 appears to be an important driver of ovarian cancer cell invasion, and this interaction depends on EGFR, properly N-glycosylated MUC16 protein ectodomain, and the presence of Galectin-3. This interaction was evaluated with purified proteins to establish the necessary/sufficient three-way interaction between these three proteins. For this purpose, the proteins purified MUC16c57-114-pFUSE (produced in human embryonic kidney [HEK] 293F FreeStyle cells) (as the MUC16 part of the interaction), purified EGFR (produced by HEK293 cells), and purified Galectin-3 (LGALS3; produced by HEK293 cells) were used. Because these proteins were produced in human cells, they were expected to carry typical native glycosylated species. Without being bound by any particular theory, it can be hypothesized that the three proteins could form heteromers that could be identified by immunocoprecipitation. Figure 24A illustrates the results of this immunocoprecipitation, where each of the three detected proteins is shown in the direct immunoblot in the three lanes on the left. Using Protein A/G Agarose microspheres, it can be seen that the MUC16c57-114-pFUSE protein bound to the Protein A/G PLUS-conjugated microspheres and was present in the eluate when separated from the SDS-PAGE gel. EGFR was only present in the eluate combined with MUC16c57-114-pFUSE when Galectin-3 (LGALS3) was also present. The 18C6 antibody eliminated the EGFR-MUC16 interaction by blocking the Galectin-3 N-glycosylation binding site (see Figure 24A). Direct double molecular immunofluorescence imaging was used to confirm the colocalization of EGFR and MUC16 in living cells. As shown in Figure 24B and Figure 25A, EGFR and MUC16 were tightly colocalized in OVCAR3, SKOV3-MUC16c344, and SKOV3-MUC16c114 cells (see arrows in Figures 24B and 25A). These studies strongly confirm that MUC16 combined with Galectin-3 to associate with EGFR on the surface of MUC16-positive ovarian cancer cells. Without being bound by any particular theory, since many growth enhancement receptors are glycosylated, it was reasoned that the cell surface effects of lecithin-dependent MUC16 may include other N-glycosylated proteins and not be restricted to EGFR. Integrin proteins are often altered in cancer and participate in the “outside-in” signaling initiated by stromal-epithelial interactions, triggering SRC phosphorylation and other downstream effects. Figure 24C depicts the interactions of MUC16 with integrin β1, an integrin component often associated with cancer development and progression. As in the case of EGFR, purified MUC16c57-114-pFUSE bound to integrin β1 in a Galectin-3-dependent manner, and this heterotrimeric interaction required all three proteins. As with EGFR, the interaction was completely blocked by an anti-MUC16c114 glycosylation site-blocking antibody, 18C6. The colocalization of MUC16 and integrin β1 was also confirmed by double immunofluorescence in several ovarian cancer cell lines (Figure 24D and Figure 25B). Thus, N-glycosylation at these key sites in MUC16 ectodomain peptide epitopes mediated interaction with cell surface protein receptors in a lecithin-specific manner to generate the hallmarks of malignant behavior, including matrigel invasion, activation of the PI3K/ERK and SRC pathways, as well as enhanced MUC16-positive tumor growth in immunocompromised mice.

[732] Sem se ater a qualquer mecanismo particular, o modelo mecanicista para a mucina relacionada a câncer, MUC16, e seu efeito sobre o comportamento de célula de câncer de ovário é mostrado na Figura 26. Na Figura 26A, MUC16 se liga com EGFR e Integrina β1 através de Galectina-3 para intensificar a estabilidade e os sinais “de dentro para fora” que promovem o crescimento e a invasão. Quando os locais de N-glicosilação de ectodomínio de MUC16 sofrem mutação ou a atividade de MGAT5 é suprimida (Figura 26B), a ligação é impedida e os sinais de EGFR/Integrina são reduzidos. Similarmente, se a expressão de proteína Galectina-3 for suprimida (Figura 26C), a associação molecular é perdida, e os sinais e a invasão são reduzidos. Finalmente, quando anticorpos de ectodomínio de MUC16 ou moléculas LGALS3 “TRAP” quiméricas impedem a interação molecular, a célula de câncer carece de qualquer uma das propriedades promotoras de tumor MUC16 observadas (Figura 26D). 6.3.12 Discussão[732] Without being beholden to any particular mechanism, the mechanistic model for the cancer-related mucin, MUC16, and its effect on ovarian cancer cell behavior is shown in Figure 26. In Figure 26A, MUC16 binds with EGFR and Integrin β1 through Galectin-3 to enhance stability and “inside-out” signals that promote growth and invasion. When the ectodomain N-glycosylation sites of MUC16 are mutated or MGAT5 activity is suppressed (Figure 26B), binding is prevented and EGFR/Integrin signals are reduced. Similarly, if Galectin-3 protein expression is suppressed (Figure 26C), the molecular association is lost, and signals and invasion are reduced. Finally, when MUC16 ectodomain antibodies or chimeric LGALS3 “TRAP” molecules prevent the molecular interaction, the cancer cell lacks any of the observed MUC16 tumor-promoting properties (Figure 26D). 6.3.12 Discussion

[733] MUC16 e outras mucinas aglutinadas, tal como MUC1 e MUC4, podem transformar células 3T3 e estão associadas a resultados adversos. Os mecanismos de mucinas anormalmente expressas em câncer são complexos e diversos. É bem descrito que padrões de N-glicosilação exercem papéis importantes emcrescimento celular em resposta ao ambiente local. A diversidade de padrões de glicoproteína é influenciada por fluxo de hexosamina ambientalmente dependente através de glicosilação baseada em Golgi. Os receptores de fator de crescimento comuns, tais como EGFR, receptor de fator de crescimento semelhante a insulina (IGF1R) e PDGFR, são, de preferência, glicosilados primeiro de uma maneira dependente de nutriente, e aqueles receptores fortemente glicosilados são, de preferência, entregues à superfície celular. Em contraste, receptores inibitórios, tal como TGF-β, têm menos locais de N-glicosilação e são apresentados na superfície celular posteriormente, com inibição consequente do programa de crescimento (consultar a Referência 12 na Seção 0 abaixo). Em câncer de ovário, a expressão de EGFR foi ligada com comportamento invasivos e a sinalização de EGFR é dependente do estado de glicosilação dos receptores e da afinidade das espécies N-glicosiladas para lectinas (consultar a Referência 2 na Seção 0 abaixo). A enzima MGAT5 parece ser crucial para a síntese de N-glicanos ramificados tetra-antenários que têm a afinidade mais alta para Galectina- 3, uma lecitina importante superexpressa em células de câncer (consultar a Referência 17 na Seção 0 abaixo).[733] MUC16 and other clumped mucins, such as MUC1 and MUC4, can transform 3T3 cells and are associated with adverse outcomes. The mechanisms of abnormally expressed mucins in cancer are complex and diverse. It is well described that N-glycosylation patterns play important roles in cell growth in response to the local environment. The diversity of glycoprotein patterns is influenced by environmentally dependent hexosamine flux through Golgi-based glycosylation. Common growth factor receptors, such as EGFR, insulin-like growth factor receptor (IGF1R), and PDGFR, are preferentially glycosylated first in a nutrient-dependent manner, and those heavily glycosylated receptors are preferentially delivered to the cell surface. In contrast, inhibitory receptors, such as TGF-β, have fewer N-glycosylation sites and are presented on the cell surface later, with consequent inhibition of the growth program (see Reference 12 in Section 0 below). In ovarian cancer, EGFR expression has been linked with invasive behavior, and EGFR signaling is dependent on the glycosylation state of the receptors and the affinity of the N-glycosylated species for lectins (see Reference 2 in Section 0 below). The enzyme MGAT5 appears to be crucial for the synthesis of tetra-antennary branched N-glycans that have the highest affinity for Galectin-3, a major lecithin overexpressed in cancer cells (see Reference 17 in Section 0 below).

[734] Esse Exemplo forneceu evidência de que os comportamentos associados com expressão de MUC16 são mediadosatravés desses processos em locais de N-glicosilação específicos na região de ectodomínio mais proximal de MUC16 em relação àsuperfície celular. Os padrões dependentes de MGAT5 de N-glicosilação foram exigidos para interação de alta afinidade com Galectina-3 e proteínas de superfície celular para promover a invasão, a ativação de oncogene e o crescimento de tumor aumentado em camundongos imunodeprimidos. Em particular, a N- glicosilação nos locais mais proximais no ectodomínio retido de MUC16 após a clivagem foi essencialmente importante para essa interação. Todas as intervenções que removeram esses locais de N-glicosilação, bloquearam os locais com receptores falsos ou interferiram em sua N-glicosilação prejudicaram os efeitos transformadores de MUC16. Esses efeitos transformadores parecerem depender, não apenas em MUC16 apenas, mas também na interação de MUC16 N-glicosilada com Galectina-3 e outras proteínas de superfície celular nos locais de N-glicosilação proximais. A expressão de ectodomínio de MUC16 mostrou estabilizar o EGFR, um mediador de crescimento e invasão, e prologou sua permanência na superfície celular de SKOV3-MUC16c114, em comparação com as células SKOV3phrGFP originais. Mesmo em um modelo de glicopeptídeo de MUC16 simplificado que mantém apenas um local de N-glicosilação, a natureza estocástica da glicosilação resultou na presença de uma variedade de N-glicanos que foram todos ligados com a cadeia principal da proteína MUC16 através de um tronco de chitobiose compartilhado. Assim, anticorpos foram preparados contra p epítopo de glicano-peptídeo de MUC16c114 ligado com chitobiose (nos locais N24/N30) do ectodomínio e MUC16. Esses novos anticorpos (Anticorpos de Glicosilação de MUC16) bloquearam a invasão intensificada de MUC16, a ativação de oncogene e o crescimento tumoral in vivo. De modo importante, esses Anticorpos de Glicosilação de MUC16 inibiram as propriedades relacionadas a MUC16 em células com expressam de MUC16 de comprimento completo assim como construtos truncados de teste com expressão C-terminal de MUC16 mais curta. Os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 interferiram na estabilização de EGFR da superfície de células de câncer de ovário na presença de CHX e prejudicaram o crescimento transplantado em camundongos nude. Adicionalmente, o efeito dos Anticorpos de Glicosilação de MUC16 também impediu a interação de MUC16 purificada com EGFR ou Integrina β1 purificados na presença de Galectina-3 recombinante.[734] This Example provided evidence that the behaviors associated with MUC16 expression are mediated through these processes at specific N-glycosylation sites in the most proximal ectodomain region of MUC16 relative to the cell surface. MGAT5-dependent patterns of N-glycosylation were required for high-affinity interaction with Galectin-3 and cell surface proteins to promote invasion, oncogene activation, and increased tumor growth in immunocompromised mice. In particular, N-glycosylation at the most proximal sites in the retained ectodomain of MUC16 after cleavage was critically important for this interaction. All interventions that removed these N-glycosylation sites, blocked the sites with false receptors, or interfered with their N-glycosylation impaired the transforming effects of MUC16. These transformative effects appear to depend not only on MUC16 alone, but also on the interaction of N-glycosylated MUC16 with Galectin-3 and other cell surface proteins at proximal N-glycosylation sites. Expression of the MUC16 ectodomain was shown to stabilize EGFR, a mediator of growth and invasion, and prolonged its presence on the cell surface of SKOV3-MUC16c114 compared with the original SKOV3phrGFP cells. Even in a simplified MUC16 glycopeptide model that maintains only one N-glycosylation site, the stochastic nature of glycosylation resulted in the presence of a variety of N-glycans that were all linked to the MUC16 protein backbone through a shared chitobiose stem. Therefore, antibodies were prepared against the chitobiose-linked peptide-glycan epitope of MUC16c114 (at the N24/N30 sites) of the ectodomain and MUC16. These novel antibodies (MUC16 Glycosylation Antibodies) blocked MUC16-enhanced invasion, oncogene activation, and tumor growth in vivo. Importantly, these MUC16 Glycosylation Antibodies inhibited MUC16-related properties in cells expressing full-length MUC16 as well as truncated test constructs expressing the shorter C-terminal MUC16. MUC16 Glycosylation Antibodies interfered with the stabilization of EGFR on the surface of ovarian cancer cells in the presence of CHX and impaired transplant growth in nude mice. Additionally, the effect of MUC16 Glycosylation Antibodies also prevented the interaction of purified MUC16 with purified EGFR or β1 Integrin in the presence of recombinant Galectin-3.

[735] Esse Exemplo revela compreensões sobre o papel da superexpressão de mucina em câncer. Através da formação de complexos multimoleculares de baixa afinidade mediados por lecitina, a MUC16 teve capacidade para intensificar a transdução de sinal “de fora para dentro” de uma maneira dependente de glicosilação. Os locais de N-glicosilação específicosresponsáveis pelo efeito máximo foram exclusivos e estavam próximos à superfície celular, enquanto outros locais de N-glicosilação mais distais podem ter sido menos importantes. Há inibidores de Galectina-3 em desenvolvimento clínico, mas um construto “Galectina-3-TRAP” de receptor falso ou moléculas de “MUC16-TRAP” truncadas teve um efeito similar nos modelos in vitro desse Exemplo. Os Anticorpos de Glicosilação de MUC16 identificados nesse Exemplo inibiram os efeitos transformadores de MUC16.6.3.13 Referências[735] This Example reveals insights into the role of mucin overexpression in cancer. Through the formation of lecithin-mediated low-affinity multimolecular complexes, MUC16 was able to enhance “outside-in” signal transduction in a glycosylation-dependent manner. The specific N-glycosylation sites responsible for the maximal effect were unique and close to the cell surface, while other, more distal N-glycosylation sites may have been less important. Galectin-3 inhibitors are in clinical development, but a mock receptor “Galectin-3-TRAP” construct or truncated “MUC16-TRAP” molecules had a similar effect in the in vitro models of this Example. The MUC16 Glycosylation Antibodies identified in this Example inhibited the transforming effects of MUC16.6.3.13 References

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[754] 19. Strausberg, R. L., Feingold, E. A., Grouse, L. H.,Derge, J. G., Klausner, R. D., Collins, F. S., Wagner, L., Shenmen, C. M., Schuler, G. D., Altschul, S. F., et al. (2002).Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 99, 16.899a 16.903.[754] 19. Strausberg, R. L., Feingold, E. A., Grouse, L. H., Derge, J. G., Klausner, R. D., Collins, F. S., Wagner, L., Shenmen, C. M., Schuler, G. D., Altschul, S. F., et al. (2002).Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 99, 16,899a 16,903.

[755] 20. Wang, P., Aussedat, B., Vohra, Y., e Danishefsky,5. J. (2012). An advance in the chemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergent aspartylation. Angew Chem Int Edit 51, 11.571 a 11.575.[755] 20. Wang, P., Aussedat, B., Vohra, Y., and Danishefsky,5. J. (2012). An advance in the chemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergent aspartylation. Angew Chem Int Edit 51, 11,571 to 11,575.

[756] 21. Yin, B. W., Dnistrian, A., e Lloyd, K. O. (2002).Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer 98, 737 a 740.[756] 21. Yin, B. W., Dnistrian, A., and Lloyd, K. O. (2002). Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer 98, 737 to 740.

[757] 22. Yin, B. W., e Lloyd, K. O. (2001). Molecularcloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem 276, 27.371 a 27.375.6.4 Exemplo 4: Informações de química suplementar[757] 22. Yin, B. W., and Lloyd, K. O. (2001). Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem 276, 27371–27375.6.4 Example 4: Supplemental chemistry information

[758] Esse exemplo fornece (a) uma descrição mais detalhada de certos métodos usados e experimentos descritos nos Exemplos 2 e 3 (Seções 0 e 0); e (b) informações adicionais em comparação com os Exemplos 2 e 3 (Seções 0 e 0).6.4.1 Materiais e métodos gerais[758] This example provides (a) a more detailed description of certain methods used and experiments described in Examples 2 and 3 (Sections 0 and 0); and (b) additional information compared to Examples 2 and 3 (Sections 0 and 0).6.4.1 General materials and methods

[759] Todos os materiais disponíveis comercialmente(Aldrich, Fluka, Novabiochem) foram usados sem purificação adicional. Aminoácidos protegidos por N-α-Fmoc, dipeptídeos de pseudoprolina, Oxima Pura e resina NovaSyn TG Sieber foram adquiridos junto à Novabiochem. Hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b]piridínio (HATU) foi adquirido junto à Genscript.Hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfônio (PyAOP) foi adquirido junto à Oakwood Products, Inc. Octa-acetato de chitobiose foi adquirido junto à Carbosynth Limited. Solução de TCEP (0,5 M, pH neutro) e ligante heterobifuncional sulfo-GMBS foi adquirido junto à Pierce, ThermoScientific. Todos os outros reagentes, incluindo Hemocianina de Keyhole Limpet (KLH), foram adquiridos junto à Aldrich. Todos os solventes foram de grau de reagente ou grau de HPLC (Fisher Scientific). Tetra-hidrofurano anidro, éter dietílico, diclorometano, tolueno e benzeno foram obtidos a partir de um sistema de solvente seco (passado através de uma coluna de alumina neutra sob uma atmosfera de argônio) e usados sem secagem adicional.[759] All commercially available materials (Aldrich, Fluka, Novabiochem) were used without further purification. N-α-Fmoc-protected amino acids, pseudoproline dipeptides, Pura Oxime, and NovaSyn TG Sieber resin were purchased from Novabiochem. 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b ]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate (HATU) was purchased from Genscript. (7-Azabenzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyAOP) was purchased from Oakwood Products, Inc. Chitobiose octaacetate was purchased from Carbosynth Limited. TCEP solution (0.5 M, neutral pH) and heterobifunctional ligand sulfo-GMBS were purchased from Pierce, ThermoScientific. All other reagents, including Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), were purchased from Aldrich. All solvents were reagent-grade or HPLC-grade (Fisher Scientific). Anhydrous tetrahydrofuran, diethyl ether, dichloromethane, toluene, and benzene were obtained from a dry solvent system (passed through a neutral alumina column under an argon atmosphere) and used without further drying.

[760] As reações foram realizadas sob uma atmosfera de argônio seco pré-purificado. Os líquidos e soluções sensíveis ao ar ou à umidade foram transferidos por meio de seringa. Os reagentes de carboidrato adequados foram secos por meio de remoção azeotrópica de água com tolueno. As peneiras moleculares foram ativadas a 350 °C e foram esmagadas imediatamente antes do uso, então, secas por chama sob vácuo. Os solventes orgânicos foram concentrados sob pressão reduzida por evaporação rotativa abaixo de 30 °C. Os espectros de RMN (1H e 13C) foram registrados em um espectrômetro Bruker Advance DRX-600 MHz e referentes a TMS ou solvente residual. Análises espectrais de massa de baixa resolução foram realizadas com um espectrômetro de massa JOEL JMS-DX-303-HF ou espectrômetro de massa Waters Micromass ZQ. TLC analítica foi realizada em placas F254 de gel 60 de sílica E. Merck e visualizada sob luz UV (254 nm) ou por coloração com molibdato de amônio e cério (CAM) ou 5% de ácido sulfúrico em metanol. Cromatografia de coluna rápida de sílica foi realizada em gel 60 de sílica E. Merck 230 a 400.6.4.1.1 Análises por UPLC/LC-MS e purificação por RP-HPLC.[760] Reactions were carried out under a pre-purified dry argon atmosphere. Air- or moisture-sensitive liquids and solutions were transferred via syringe. Suitable carbohydrate reagents were dried by azeotropic removal of water with toluene. Molecular sieves were activated at 350 °C and crushed immediately before use, then flame-dried under vacuum. Organic solvents were concentrated under reduced pressure by rotary evaporation below 30 °C. NMR spectra (1H and 13C) were recorded on a Bruker Advance DRX-600 MHz spectrometer and referenced to TMS or residual solvent. Low-resolution mass spectral analyses were performed with a JOEL JMS-DX-303-HF mass spectrometer or Waters Micromass ZQ mass spectrometer. Analytical TLC was performed on E. Merck silica gel 60 F254 plates and visualized under UV light (254 nm) or by staining with cerium ammonium molybdate (CAM) or 5% sulfuric acid in methanol. Fast silica column chromatography was performed on E. Merck silica gel 60 230 to 400.6.4.1.1 UPLC/LC-MS analysis and RP-HPLC purification.

[761] Todas as separações cromatográficas de fase reversa envolveram uma fase móvel que consistiu em 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) (v/v) em água e 0,04% de TFA em acetonitrila. O progresso da reação foi monitorado por análise por UPLC-MS em um sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho Waters AcquityTM com um detector de fotodiodo e detector de massa de quadrupolo único, equipado com colunas C18/C8/C4 Acquity UPLC BEH (1,7 μm, 2,1 x 100 mm), a uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min. Análises por LC-MS analítica foram realizadas em um Módulo de Separações Waters 2695 equipado com um Detector de Arranjo de Fotodiodos Waters 2996, com o uso de uma coluna C18 Varian Microsorb (150 x 2,0 mm), uma coluna C8/C4 Varian Microsorb (250 x 2,0 mm) ou uma coluna C18 Waters X- Bridge (150 x 2,1 mm), a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min. Purificação por HPLC de escala preparatória foi executada em um sistema de entrega de solvente de HPLC Ranin equipado com um detector de UV-1 Rainin, com o uso de uma coluna C18/C8/C4 Microsorb de HPLC de fase reversa Agilent Dynamax (250 x 21,4 mm) ou uma coluna C18 Waters X-Bridge (150 x 19,0 mm), a uma taxa de fluxo de 16,0 ml/min.6.4.2 Procedimentos experimentais6.4.2.1 Síntese de peptídeo de fase sólida baseada em FMOC (SPPS)[761] All reversed-phase chromatographic separations involved a mobile phase consisting of 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) (v/v) in water and 0.04% TFA in acetonitrile. Reaction progress was monitored by UPLC-MS analysis on a Waters Acquity™ Ultra Performance Liquid Chromatography system with a photodiode array detector and single quadrupole mass detector, equipped with Acquity UPLC BEH C18/C8/C4 columns (1.7 μm, 2.1 x 100 mm), at a flow rate of 0.3 ml/min. Analytical LC-MS analyses were performed on a Waters 2695 Separations Module equipped with a Waters 2996 Photodiode Array Detector, using a Varian Microsorb C18 column (150 x 2.0 mm), a Varian Microsorb C8/C4 column (250 x 2.0 mm) or a Waters X-Bridge C18 column (150 x 2.1 mm), at a flow rate of 0.2 ml/min. Preparatory-scale HPLC purification was performed on a Ranin HPLC solvent delivery system equipped with a Rainin UV-1 detector, using an Agilent Dynamax reversed-phase HPLC C18/C8/C4 Microsorb column (250 x 21.4 mm) or a Waters X-Bridge C18 column (150 x 19.0 mm), at a flow rate of 16.0 ml/min.6.4.2 Experimental Procedures6.4.2.1 FMOC-Based Solid-Phase Peptide Synthesis (SPPS)

[762] A síntese de peptídeo automatizada foi realizada em um Sintetizador de Peptídeo de Micro-ondas CEM Liberty. Os peptídeos foram sintetizados sob protocolos de Fmoc padrão em resina NovaSyn TG Sieber. A mistura de desbloqueio consistiu em uma solução de uma Oxima Pura (0,1 M) em 20% de piperidina/DMF. Os aminoácidos de Fmoc a seguir da Novabiochem foram usados: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Dmcp)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Asp(OPp)-OH, Fmoc-Asp(OAllyl)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Dmcp)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro- OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH. Os dipeptídeos Dmb (2,4-dimetoxibenzil) e pseudoprolina (Novabiochem) a seguir foram usados: Fmoc-Asp(O t Bu)-(Dmb)Gly-OH, Fmoc—Gly-Thr(^Me'MePro)-OH, Fmoc-Phe-Thr(^Me'MePro)-OH, Fmoc-Ser( tBu) -Ser(^Me'MePro)—OH.6.4.2.2 Acetilação N-terminal da resina peptídica[762] Automated peptide synthesis was performed on a CEM Liberty Microwave Peptide Synthesizer. Peptides were synthesized under standard Fmoc protocols on NovaSyn TG Sieber resin. The deblocking mixture consisted of a solution of a Pure Oxime (0.1 M) in 20% piperidine/DMF. The following Fmoc amino acids from Novabiochem were used: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Dmcp)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Asp(OPp)-OH, Fmoc-Asp(OAllyl)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Dmcp)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro- OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH. The following dipeptides Dmb (2,4-dimethoxybenzyl) and pseudoproline (Novabiochem) were used: Fmoc-Asp(O t Bu)-(Dmb)Gly-OH, Fmoc—Gly-Thr(^Me'MePro)-OH, Fmoc-Phe-Thr(^Me'MePro)-OH, Fmoc-Ser( t Bu)-Ser(^Me'MePro)—OH.6.4.2.2 N-terminal acetylation of the peptide resin

[763] Mediante conclusão da síntese automatizada em uma escala de 0,1 mmol, a resina peptídica foi lavada com DMF (2 ml)em um vaso de síntese de peptídeo e tratada com anidrido acético(188 μl, 2 mmoles) e DIEA (384 μl, 2,2 mmoles) em DMF (2 ml). A mistura foi agitada por borbulhamento de nitrogênio moderado por 1 hora e, então, lavada com DMF e CH2Cl2, antes de ser submetida a desalilação.6.4.2.3 Desalilação em resina de cadeia lateral de ácido aspártico, ASP(OALILA)[763] Upon completion of the automated synthesis on a 0.1 mmol scale, the peptide resin was washed with DMF (2 ml) in a peptide synthesis vessel and treated with acetic anhydride (188 μl, 2 mmol) and DIEA (384 μl, 2.2 mmol) in DMF (2 ml). The mixture was stirred by bubbling moderate nitrogen for 1 hour and then washed with DMF and CH2Cl2 before undergoing deallylation.6.4.2.3 On-resin deallylation of aspartic acid side chain, ASP(OALLYL)

[764] O peptídeo ligado com resina N-acetilado (0,1 mol) foi tratado com Pd(PPh3)4 (7,5 mg, 6,5 μmoles) e fenilsilano (75 μl,0,6 mmol) em DMF/CH2Cl2 (4 ml, 1:1). Após 20 minutos deborbulhamento de nitrogênio moderado, o tratamento com Pd(PPh3)4/fenilsilano foi repetido duas vezes. A resina peptídica foi, então, lavada com DMF, CH2Cl2 e metanol e seco a vácuo.6.4.2.3 Clivagem da resina [e desproteção de cadeia lateral de ASP(O-2-PHIPR) simultânea, quando for aplicável][764] The N-acetylated resin-bound peptide (0.1 mol) was treated with Pd(PPh3)4 (7.5 mg, 6.5 μmol) and phenylsilane (75 μl, 0.6 mmol) in DMF/CH2Cl2 (4 ml, 1:1). After 20 min of mild nitrogen bubbling, the Pd(PPh3)4/phenylsilane treatment was repeated twice. The peptide-resin was then washed with DMF, CH2Cl2, and methanol and dried under vacuum.6.4.2.3 Resin cleavage [and simultaneous ASP(O-2-PHIPR) side chain deprotection, where applicable]

[765] Após secagem, a resina peptídica foi submetida a umcoquetel de clivagem (1% de TFA/CH2Cl2, 4 ml) 5 ciclos x 5 min, e esse processo foi repetido quatro vezes. As sequências de clivagem adicionais incluíram tratamento com 1,5% de TFA/CH2Cl2 (4 ml 5 ciclos x 5 min) e 2% de TFA/CH2Cl2 (4 ml 5 ciclos x 5min). As respectivas porções de solução de clivagem foram individualmente agrupadas em Et2O gelado e concentradas. Os resíduos oleosos correspondentes foram ressuspensos em uma quantidade mínima de trifluoroetanol e precipitados com água. As misturas resultantes foram imediatamente liofilizadas para geraros peptídeos protegidos crus que portam uma amida C-terminal.6.4.2.5 Acoplamento de peptídeo de comprimento completo parcialmente protegido (55-MER) com amina de glicano por meio de aspartilação de lansbury seguida por remoção de grupos protetores lábeis a ácido com coquetel[765] After drying, the peptide resin was subjected to a cleavage cocktail (1% TFA/CH2Cl2, 4 ml) 5 cycles x 5 min, and this process was repeated four times. Additional cleavage sequences included treatment with 1.5% TFA/CH2Cl2 (4 ml 5 cycles x 5 min) and 2% TFA/CH2Cl2 (4 ml 5 cycles x 5 min). The respective portions of cleavage solution were individually pooled in ice-cold Et2O and concentrated. The corresponding oily residues were resuspended in a minimal amount of trifluoroethanol and precipitated with water. The resulting mixtures were immediately lyophilized to generate the crude protected peptides bearing a C-terminal amide. 6.4.2.5 Coupling of partially protected full-length peptide (55-MER) with glycan amine via Lansbury aspartylation followed by removal of acid-labile protecting groups with cocktail

[766] Peptídeo de comprimento completo parcialmente protegido (1,0 equiv) e amina de glicano (chitobiose: 4,0 equiv; Man3GlcNAc2 1,6 equiv) foram combinados e dissolvidos em DMSO anidro. A essa mistura, uma solução recém-preparada de PyAOP (4,0 equiv) em DMSO foi adicionada, seguida por DIEA (6,0 equiv).A mistura de reação foi agitada por 3 horas e bruscamente arrefecida por adição de 1 ml de água gelada (0,05% de TFA). O precipitado formado foi isolado por centrifugação, ressuspenso em água/CH3CN (1:1, 0,05% de TFA) e imediatamente liofilizado.[766] Partially protected full-length peptide (1.0 equiv) and glycan amine (chitobiose: 4.0 equiv; Man3GlcNAc2 1.6 equiv) were combined and dissolved in anhydrous DMSO. To this mixture, a freshly prepared solution of PyAOP (4.0 equiv) in DMSO was added, followed by DIEA (6.0 equiv). The reaction mixture was stirred for 3 hours and quenched by addition of 1 ml of ice-cold water (0.05% TFA). The precipitate formed was isolated by centrifugation, resuspended in water/CH3CN (1:1, 0.05% TFA), and immediately lyophilized.

[767] O glicopeptídeo protegido foi, então, submetido à desproteção ácida global por tratamento com coquetel R (90% de TFA, 5% de tioanisol, 3% de etanoditiol, 2% de anisol) (1 ml) por 2 horas. O resíduo foi precipitado com Et2O gelado (12 ml), e a suspensão resultante foi centrifugada para gerar um pélete branco. O sobrenadante foi decantado, e o pélete foi triturado com éter dietílico gelado (12 ml). Esse processo foi repetido três vezes no total, e o precipitado resultante foi solubilizado em água/CH3CN (1:1, 0,05% de TFA) e liofilizado. O glicopeptídeo cru correspondente foi purificado por RP-HPLC.6.4.2.6 Acoplamento de peptídeos de tamanho pequeno parcialmente protegidos (15 e 18-MERS) com chitobiose amina por meio de aspartilação de Lansbury/Lansbury dupla seguida por remoção de grupos protetores lábeis a ácido[767] The protected glycopeptide was then subjected to global acid deprotection by treatment with cocktail R (90% TFA, 5% thioanisole, 3% ethanedithiol, 2% anisole) (1 ml) for 2 h. The residue was precipitated with ice-cold Et2O (12 ml), and the resulting suspension was centrifuged to generate a white pellet. The supernatant was decanted, and the pellet was triturated with ice-cold diethyl ether (12 ml). This process was repeated three times in total, and the resulting precipitate was solubilized in water/CH3CN (1:1, 0.05% TFA) and lyophilized. The corresponding crude glycopeptide was purified by RP-HPLC.6.4.2.6 Coupling of partially protected small-sized peptides (15- and 18-MERS) with chitobiose amine via Lansbury/double Lansbury aspartylation followed by removal of acid-labile protecting groups

[768] Peptídeo parcialmente protegido (1,0 equiv) e amina de chitobiose (3,0 equiv / 7,0 equiv para a aspartilação de Lansbury dupla) foram combinados e dissolvidos em DMSO anidro. À essa mistura, uma solução recém-preparada de PyAOP (4 equiv / 6 equiv no último caso) em DMSO foi adicionada, seguida por DIEA (6 equiv / 8 equiv, respectivamente). A mistura de reação foi agitada por2,5 horas e bruscamente arrefecida por adição de 1 ml de água gelada (0,05% de TFA). O precipitado formado foi isolado por centrifugação, ressuspenso em água/CH3CN (1:1, 0,05% de TFA) eimediatamente liofilizado.[768] Partially protected peptide (1.0 equiv) and chitobiose amine (3.0 equiv/7.0 equiv for double Lansbury aspartylation) were combined and dissolved in anhydrous DMSO. To this mixture, a freshly prepared solution of PyAOP (4 equiv/6 equiv in the latter case) in DMSO was added, followed by DIEA (6 equiv/8 equiv, respectively). The reaction mixture was stirred for 2.5 hours and quenched by addition of 1 ml of ice-cold water (0.05% TFA). The precipitate formed was isolated by centrifugation, resuspended in water/CH3CN (1:1, 0.05% TFA), and immediately lyophilized.

[769] O glicopeptídeo protegido foi, então, submetido à desproteção ácida global por tratamento com um coquetel de TFA (94% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5% de EDT, 1% de TIPSH) (1 ml) por 2 horas. O resíduo foi precipitado com Et2O gelado (12 ml), e a suspensão foi centrifugada para gerar um pélete branco. O sobrenadante foi decantado, e o pélete foi triturado com éter dietílico gelado (12 ml). Esse processo foi repetido três vezes no total, e o precipitado resultante foi dissolvido em água/CH3CN (1:1, 0,05% de TFA) e liofilizado. O glicopeptídeo crucorrespondente foi purificado por RP-HPLC.6.4.2.7 Conjugação com KLH de glicopeptídeos 15/18-MER[769] The protected glycopeptide was then subjected to global acid deprotection by treatment with a TFA cocktail (94% TFA, 2.5% H2O, 2.5% EDT, 1% TIPSH) (1 ml) for 2 h. The residue was precipitated with ice-cold Et2O (12 ml), and the suspension was centrifuged to generate a white pellet. The supernatant was decanted, and the pellet was triturated with ice-cold diethyl ether (12 ml). This process was repeated three times in total, and the resulting precipitate was dissolved in water/CH3CN (1:1, 0.05% TFA) and lyophilized. The corresponding crude glycopeptide was purified by RP-HPLC.6.4.2.7 KLH conjugation of 15/18-MER glycopeptides.

[770] KLH foi primeiro incubado com o reticulador heterobifuncional (sulfo-GMBS) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) de pH 7 por 2 horas. O reticulador não conjugado foi removido por cromatografia de exclusão de tamanho (passagem por coluna fina Bio-Gel P-10, respectivamente), e KLH ativado por maleimida foi, então, obtido. Os (glico)peptídeos recém- desprotegidos que portam uma funcionalidade de tiol terminal foram misturados com KLH contendo maleimida em PBS de pH 7 e incubados à temperatura ambiente por 6 horas. Após esse tempo, o (glico)peptídeo não reagido foi removido com o uso de um filtro de centrífuga Amicon Ultra-4 (peso molecular de corte 50.000). Finalmente, os conjugados de KLH correspondentes foram obtidos como uma solução de PBS.6.4.3 Síntese de glicopeptídeos de MUC16 de comprimento completo (55-MERS)6.4.3.1 Síntese de glicopeptídeo de comprimento completo que porta chitobiose[770] KLH was first incubated with the heterobifunctional cross-linker (sulfo-GMBS) in phosphate-buffered saline (PBS) pH 7 for 2 hours. The unconjugated cross-linker was removed by size exclusion chromatography (Bio-Gel P-10 fine column passage, respectively), and maleimide-activated KLH was then obtained. The newly deprotected (glyco)peptides bearing a terminal thiol functionality were mixed with maleimide-containing KLH in PBS pH 7 and incubated at room temperature for 6 hours. After this time, the unreacted (glyco)peptide was removed using an Amicon Ultra-4 centrifuge filter (molecular weight cutoff 50,000). Finally, the corresponding KLH conjugates were obtained as a PBS solution.6.4.3 Synthesis of full-length MUC16 glycopeptides (55-MERS)6.4.3.1 Synthesis of full-length glycopeptide bearing chitobiose

[771] Mediante a conclusão da síntese automatizada de acordo com os métodos da Seção 0, a resina peptídica foi submetida a N- acetilação e desalilação (consultar a Seção 0 e a Seção 0, respectivamente) para fornecer após a clivagem da resina (consultar a Seção 0) o peptídeo parcialmente protegido p55- mer[N1-S55] que porta o ácido carboxílico livre na cadeia lateral de Asp30. Uma fração desse peptídeo cru foi purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica eluída com 5^12% de MeOH/CH2Cl2 para gerar o peptídeo p55-mer[N1-S55] (70 mg) comoum sólido branco mediante liofilização. A Figura 27A representa a amida do peptídeo 55-mer N-acetilada protegida de cadeia lateral. A Figura 27B representa os resíduos de ESI-MS e UV da análise por UPLC par glicopeptídeo p55-mer[N1-S55].[771] Upon completion of the automated synthesis according to the methods in Section 0, the peptide resin was subjected to N-acetylation and deallylation (see Section 0 and Section 0, respectively) to afford after resin cleavage (see Section 0) the partially protected peptide p55-mer[N1-S55] bearing the free carboxylic acid in the side chain of Asp30. A fraction of this crude peptide was purified by silica gel column chromatography eluted with 5^12% MeOH/CH2Cl2 to afford the peptide p55-mer[N1-S55] (70 mg) as a white solid upon lyophilization. Figure 27A depicts the side chain protected N-acetylated 55-mer peptide amide. Figure 27B represents the ESI-MS and UV residues from the UPLC analysis of the glycopeptide p55-mer[N1-S55].

[772] De acordo com a Seção 0, o peptídeo p55-mer[N1-S55] (20 mg, 2,0 μmoles) e a amina anomérica da chitobiose (GlcNAc2) (3,5 mg, 8,1 μmoles) foram combinados e dissolvidos em DMSO anidro (100 μl). Uma solução de PyAOP (4,3 mg, 8,1 μmoles) em DMSO (30 μl) foi, então, adicionada, seguida por DIEA (2,0 μl, 12,2 μmoles). A mistura amarelo ouro foi agitada por 3 horas, bruscamente arrefecida por adição de 1 ml de água gelada (0,05% de TFA), congelada e liofilizada.[772] According to Section 0, the p55-mer[N1-S55] peptide (20 mg, 2.0 μmoles) and chitobiose anomeric amine (GlcNAc2) (3.5 mg, 8.1 μmoles) were combined and dissolved in anhydrous DMSO (100 μl). A solution of PyAOP (4.3 mg, 8.1 μmoles) in DMSO (30 μl) was then added, followed by DIEA (2.0 μl, 12.2 μmoles). The golden yellow mixture was stirred for 3 h, quenched by addition of 1 ml of ice-cold water (0.05% TFA), frozen, and lyophilized.

[773] O glicopeptídeo protegido foi, então, submetido ao coquetel R (1,0 ml) por 2 horas, precipitado com Et2O gelado, centrifugado, ressuspenso e liofilizado conforme descrito na Seção 0. O peptídeo cru foi dissolvido em 25% de acetonitrila/água (0,05% de TFA) (2 ml) e purificado por HPLC em uma coluna C18 X-Bridge, com o uso de um gradiente linear de 25 a 35% de acetonitrila em água (0,05% de TFA) durante 30 minutos. As frações contendo o produto desejado, que eluiu a 20 minutos, foram coletadas e liofilizadas para fornecer o glicopeptídeo “55-mer(chitobiose)[N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer) (3,0 mg, 22% derendimento) como um sólido branco (Figura 28A). A Figura 28B fornece os resíduos de ESI-MS e UV da análise por UPLC para glicopeptídeo “55 mer(chitobiose) [N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer). 6.4.3.2 Síntese de glicopeptídeo de comprimento completo que porta pentassaccarídeo[773] The protected glycopeptide was then subjected to cocktail R (1.0 ml) for 2 h, precipitated with ice-cold Et2O, centrifuged, resuspended, and lyophilized as described in Section 0. The crude peptide was dissolved in 25% acetonitrile/water (0.05% TFA) (2 ml) and purified by HPLC on a C18 X-Bridge column using a linear gradient of 25 to 35% acetonitrile in water (0.05% TFA) over 30 min. Fractions containing the desired product, which eluted at 20 min, were collected and lyophilized to afford the glycopeptide “55-mer(chitobiose)[N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer) (3.0 mg, 22% yield) as a white solid (Figure 28A). Figure 28B provides the ESI-MS and UV residues from UPLC analysis for glycopeptide “55 mer(chitobiose)[N1-S55]” (GlcNAc2-55-mer). 6.4.3.2 Synthesis of Full-Length Glycopeptide Bearing Pentasaccharide

[774] De acordo com a Seção 0, o peptídeo p55-mer[N1-S55] (10 mg, 1,0 μmol) e a amina anomérica do pentassacarídeo Man3GlcNAc2 (1,5 mg, 1,6 μmol) foram combinados e dissolvidos em DMSO anidro (30 μl). Uma solução de PyAOP (2,1 mg, 4,1 μmoles) em DMSO (5 μl) foi, então, adicionada, seguida por DIEA (1,0 μl, 6,1 μmoles). A mistura amarelo ouro foi agitada por 3 horas, bruscamente arrefecida por adição de 1 ml de água gelada (0,05% de TFA), congelada e liofilizada.[774] According to Section 0, the p55-mer[N1-S55] peptide (10 mg, 1.0 μmol) and the anomeric amine of the pentasaccharide Man3GlcNAc2 (1.5 mg, 1.6 μmol) were combined and dissolved in anhydrous DMSO (30 μl). A solution of PyAOP (2.1 mg, 4.1 μmol) in DMSO (5 μl) was then added, followed by DIEA (1.0 μl, 6.1 μmol). The golden yellow mixture was stirred for 3 h, quenched by addition of 1 ml of ice-cold water (0.05% TFA), frozen, and lyophilized.

[775] O glicopeptídeo protegido foi, então, submetido ao coquetel R (1,0 ml) por 2 horas, precipitado com Et2O gelado, centrifugado, ressuspenso e liofilizado conforme descrito na Seção 0. O peptídeo cru foi dissolvido em 25% de acetonitrila/água (0,05% de TFA) (2 ml) e purificado por HPLC em uma coluna C18 X-Bridge, com o uso de um gradiente linear de 25 a 35% de acetonitrila em água (0,05% de TFA) durante 30 minutos.As frações contendo o produto desejado, que eluiu em 18 minutos,foram coletadas e liofilizadas para fornecer o glicopeptídeo “55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer) (1,5 mg, 20%de rendimento) como um sólido branco. A Figura 29A representa glicopeptídeo de 55-mer que porta Man3GlcNAc2: “55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer). A Figura 29B representa os resíduos de ESI-MS e UV de análise por HPLC analítica para glicopeptídeo “55 mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer).6.4.4 Síntese de glicopeptídeos de tamanho menor (15-MER e 18- MER)6.4.4.1 Síntese de 15-MER monoglicosilado por chitobiose[775] The protected glycopeptide was then subjected to cocktail R (1.0 ml) for 2 h, precipitated with ice-cold Et2O, centrifuged, resuspended, and lyophilized as described in Section 0. The crude peptide was dissolved in 25% acetonitrile/water (0.05% TFA) (2 ml) and purified by HPLC on a C18 X-Bridge column using a linear gradient of 25 to 35% acetonitrile in water (0.05% TFA) over 30 min. Fractions containing the desired product, which eluted within 18 min, were collected and lyophilized to afford the glycopeptide “55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer) (1.5 mg, 20% yield) as a white solid. Figure 29A represents 55-mer glycopeptide bearing Man3GlcNAc2: “55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer). Figure 29B represents the ESI-MS and UV residues from analytical HPLC analysis for glycopeptide “55 mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]” (Man3GlcNAc2-55-mer). 6.4.4 Synthesis of Smaller-Sized Glycopeptides (15-MER and 18-MER) 6.4.4.1 Synthesis of Monoglycosylated 15-MER by Chitobiose

[776] Mediante conclusão da síntese automatizada de acordo com a Seção 0, a resina peptídica foi submetida à N-acetilaçãoe à desaliação (consultar a Seção 0 e a Seção 0, respectivamente)para fornecer após a clivagem da resina (consultar a Seção 0) opeptídeo parcialmente protegido p15-mer[C-G25-V38] que porta o ácido carboxílico livre na cadeia lateral de Asp30 (correspondente a Asn1806 da SEQ ID NO: 150). A Figura 30A. Esse peptídeo foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional.[776] Upon completion of the automated synthesis according to Section 0, the peptide resin was subjected to N-acetylation and dealylation (see Section 0 and Section 0, respectively) to provide after resin cleavage (see Section 0) the partially protected peptide p15-mer[C-G25-V38] bearing the free carboxylic acid in the side chain of Asp30 (corresponding to Asn1806 of SEQ ID NO: 150). Figure 30A. This peptide was used in the next step without further purification.

[777] Peptídeo p15-mer[C-G25-V38] (10 mg, 3,8 μmoles) e amina anomérica da chitobiose (GlcNAc2) (4,8 mg, 11,3 μmoles)foram combinados e dissolvidos em DMSO anidro (80 μl). Uma solução de PyAOP (5,9 mg, 11,3 μmoles) em DMSO (20 μl) foi adicionada, seguida por DIEA (2,6 μl, 15 μmoles), e a mistura amarelo ouro foi agitada por 2,5 horas, congelada e liofilizada. O glicopeptídeo protegido foi, então, submetido a um coquetel deTFA (1 ml) por 2 horas, precipitado com éter dietílico gelado, centrifugado, ressuspenso e liofilizado de acordo com a Seção 0.O peptídeo cru foi dissolvido em 15% de acetonitrila/água (0,05% de TFA) (2 ml) e purificado por HPLC em uma coluna C18, com o uso de um gradiente linear de 15 a 35% de acetonitrila em água(0,05% de TFA) durante 30 minutos. As frações contendo o produto desejado, que eluiu a 17 minutos, foram coletadas e liofilizadas para fornecer o glicopeptídeo “15-mer(chitobiose)[C-G25-V38]” (GlcNAc2-15-mer) (2,0 mg, 25% de rendimento) como um sólido branco. Consultar a Figura 30B para glicopeptídeo de 15-mer monoglicosilado com chitobiose: 15-mer(chitobiose)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer). A Figura 30C representa os resíduos de ESI-MS e UV de análise por HPLC analítica para glicopeptídeo “15 mer(chitobiose)[C-G25-V38]” (GlcNAc2-15-mer).6.4.4.2 Síntese de 18-MER bisglicosilado por chitobiose[777] Peptide p15-mer[C-G25-V38] (10 mg, 3.8 μmoles) and chitobiose anomeric amine (GlcNAc2) (4.8 mg, 11.3 μmoles) were combined and dissolved in anhydrous DMSO (80 μl). A solution of PyAOP (5.9 mg, 11.3 μmoles) in DMSO (20 μl) was added, followed by DIEA (2.6 μl, 15 μmoles), and the golden yellow mixture was stirred for 2.5 h, frozen, and lyophilized. The protected glycopeptide was then subjected to TFA cocktail (1 ml) for 2 h, precipitated with ice-cold diethyl ether, centrifuged, resuspended, and lyophilized according to Section 0. The crude peptide was dissolved in 15% acetonitrile/water (0.05% TFA) (2 ml) and purified by HPLC on a C18 column using a linear gradient from 15 to 35% acetonitrile in water (0.05% TFA) over 30 min. Fractions containing the desired product, which eluted at 17 min, were collected and lyophilized to afford the glycopeptide “15-mer(chitobiose)[C-G25-V38]” (GlcNAc2-15-mer) (2.0 mg, 25% yield) as a white solid. See Figure 30B for chitobiose-monoglycosylated 15-mer glycopeptide: 15-mer(chitobiose)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer). Figure 30C depicts the ESI-MS and UV residues from analytical HPLC analysis for glycopeptide “15 mer(chitobiose)[C-G25-V38]” (GlcNAc2-15-mer). 6.4.4.2 Synthesis of chitobiose-bisglycosylated 18-MER

[778] Mediante conclusão da síntese automatizada de acordo com a Seção 0, a resina peptídica foi submetida à N-acetilação (consultar 0). Então, a clivagem da resina e a remoção concomitante dos grupos protetores OPp foi efetuada após os métodos apresentados na Seção 0 para proporcionar o peptídeo parcialmente protegido p18-mer[C-T22-V38] que porta o ácido carboxílico livre em ambas as cadeias laterais de Asp24 e Asp30 (correspondentes a Asn1800 e Asn1806, respectivamente, da SEQ ID NO: 150). Esse peptídeo foi usado na etapa seguinte sempurificação adicional. Consulte Figura 32A.[778] Upon completion of the automated synthesis according to Section 0, the peptide resin was subjected to N-acetylation (see 0). Then, cleavage of the resin and concomitant removal of the OPp protecting groups was performed following the methods presented in Section 0 to afford the partially protected peptide p18-mer[C-T22-V38] bearing the free carboxylic acid on both side chains of Asp24 and Asp30 (corresponding to Asn1800 and Asn1806, respectively, of SEQ ID NO: 150). This peptide was used in the next step without further purification. See Figure 32A.

[779] Peptídeo p18-mer[C-T22-V38] (30 mg, 9,1 μmoles) eamina anomérica da chitobiose (GlcNAc2) (27 mg, 63,4 μmoles) foram combinados e dissolvidos em DMSO anidro (150 μl). PyAOP (28,5 mg, 54,6 μmoles) foi, então, adicionado em DMSO (50 μl) seguido por DIEA (2,6 μl, 15 μmoles), e a mistura amarelo ouro foi agitada por 2,5 horas, congelada e liofilizada. O glicopeptídeo protegido foi, então, submetido a um coquetel de TFA (1 ml) por 2 horas, precipitado com éter dietílico gelado, centrifugado, ressuspenso e liofilizado de acordo com a Seção 0.O peptídeo cru foi dissolvido em 15% de acetonitrila/água (0,05%de TFA) (6 ml) e purificado por HPLC em uma coluna C8, com o usode um gradiente linear de 15 a 27% de acetonitrila em água (0,05% de TFA) durante 30 minutos. As frações que contêm o produto desejado, que eluíram em 15 minutos, foram coletadas e liofilizadas para fornecer o glicopeptídeo “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer] (6,5 mg,rendimento de 25%) como um sólido branco. Consulte Figura 32B. A Figura 32C representa ESI-MS e traços de UV a partir da análise por HPLC analítica acerca do glicopeptídeo “18mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer].6.5 Conjugação de KLH de glicopeptídeos de MUC16 15-MER e 18- MER[779] Peptide p18-mer[C-T22-V38] (30 mg, 9.1 μmoles) and chitobiose anomeric amine (GlcNAc2) (27 mg, 63.4 μmoles) were combined and dissolved in anhydrous DMSO (150 μl). PyAOP (28.5 mg, 54.6 μmoles) was then added in DMSO (50 μl) followed by DIEA (2.6 μl, 15 μmoles), and the golden yellow mixture was stirred for 2.5 h, frozen, and lyophilized. The protected glycopeptide was then subjected to TFA cocktail (1 ml) for 2 h, precipitated with ice-cold diethyl ether, centrifuged, resuspended, and lyophilized according to Section 0. The crude peptide was dissolved in 15% acetonitrile/water (0.05% TFA) (6 ml) and purified by HPLC on a C8 column using a linear gradient from 15 to 27% acetonitrile in water (0.05% TFA) over 30 min. Fractions containing the desired product, which eluted within 15 min, were collected and lyophilized to afford the glycopeptide “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer] (6.5 mg, 25% yield) as a white solid. See Figure 32B. Figure 32C depicts ESI-MS and UV traces from analytical HPLC analysis of the glycopeptide “18mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” [(GlcNAc2)2-18-mer]. 6.5 KLH Conjugation of 15-MER and 18-MER MUC16 Glycopeptides

[780] Os glicopeptídeos “15-mer(chitobiose)[C-G25-V38]” e “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” foram conjugados a KLH seguindo o procedimento apresentado na Seção 0 para produzir os conjugados de KLH correspondentes, GlcNAc2-15-mer-KLH e (GlcNAc2)2-18-mer- KLH, respectivamente. Consulte Figura 33A e Figura 33B.7. Tabela de sequênciasTabela 13. Tabela de sequências. [780] The glycopeptides “15-mer(chitobiose)[C-G25-V38]” and “18-mer(chitobiose)2[C-T22-V38]” were conjugated to KLH following the procedure presented in Section 0 to produce the corresponding KLH conjugates, GlcNAc2-15-mer-KLH and (GlcNAc2)2-18-mer-KLH, respectively. See Figure 33A and Figure 33B.7. Sequence TableTable 13. Sequence Table.

8. Equivalents

[781] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo estão aqui incorporados, a título de referência, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado a título de referência. Embora a invenção tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para os propósitos de clareza de entendimento, será prontamente evidente para os versados na técnica à luz das instruções desta invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas sem que se desvie do espírito ou escopo das reivindicações anexas.[781] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are incorporated herein by reference as if each individual publication or patent application were specifically and individually indicated as being incorporated by reference. Although the invention has been described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, it will be readily apparent to those skilled in the art in light of the instructions of this invention that certain changes and modifications may be made without departing from the spirit or scope of the appended claims.

Claims

1. An anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof immunospecifically bound to MUC16, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises: (I) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88;(II) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94; (III) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (IV) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; (V) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; (VI) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (VII) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (VIII) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (IX) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;(X) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; (XI) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54; (XII) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; (XIII) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68; (XIV) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; or (XV) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80.

2. The anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises: (I) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88; (II) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94; or (III) (i) a VH comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97; and (ii) a VL comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100.

3. The anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises: (a) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81, and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; (b) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (c) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; or (d) (i) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, and (ii) a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

4. The anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the antibody or antigen-binding fragment is humanized.

5. The anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the antibody is a bispecific antibody and wherein, optionally, the bispecific antibody is immunospecifically bound to CD3; and wherein, more optionally, the bispecific antibody comprises an immunoglobulin that is immunospecifically bound to MUC16, wherein the light chain of the immunoglobulin is conjugated by a peptide coupled to a single chain variable fragment (scFv) that is immunospecifically bound to CD3.

6. The anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody is a monoclonal antibody.

7. The anti-MUC16 antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, characterized in that it is a scFv.

8. A conjugate comprising the anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof as defined in any one of claims 1 to 7 conjugated to an agent, and wherein optionally the agent is an imaging agent or a cytotoxic agent, wherein the imaging agent is a detectable label, such as a chromogenic, enzymatic, radioisotopic, isotopic, fluorescent, chemiluminescent, nuclear magnetic resonance contrast agent, or wherein the cytotoxic agent is a radioactive metal ion (e.g., alpha-emitters) or a toxin (e.g., pseudomonas exotoxin, abrin, cholera toxin, ricin A, and diphtheria toxin).

9. A chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) the anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof as defined in any one of claims 1 to 7, wherein, optionally, the antibody or antigen-binding fragment is a scFv; or the conjugate as defined in claim 8; (b) a transmembrane domain; and (c) a signaling portion of a TCR complex.

10. A polynucleotide comprising nucleic acid sequences encoding the anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof as defined in claim 3, wherein the polynucleotide comprises one or more of SEQ ID NOs: 140 and 141, SEQ ID NOs: 142 and 143, SEQ ID NOs: 144 and 145, SEQ ID NOs: 146 and 147, and SEQ ID NOs: 148 and 149.

11. Vector, characterized by the fact that it comprises the polynucleotide, as defined in claim 10, operatively linked to a promoter.

12. An ex vivo transgenic microbial cell comprising the polynucleotide as defined in claim 10 operatively linked to a promoter, or the vector as defined in claim 11.

13. The ex vivo transgenic microbial cell of claim 12, wherein the ex vivo cell is a bacterial or fungal transgenic microbial cell.

14. A method for producing a transgenic cell ex vivo, comprising: (a) transforming a cell ex vivo with the vector as defined in claim 11; and (b) culturing said transformed ex vivo cell under ex vivo cell growth conditions.

15. A method for producing an anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising culturing the cell as defined in claim 12 or 13.

16. Pharmaceutical composition, characterized by the fact that it comprises: the anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof, as defined in any one of claims 1 to 7, the conjugate, as defined in claim 8, or the CAR, as defined in claim 9; and a pharmaceutically acceptable carrier.

17. Use of the anti-MUC16 antibody or antigen-binding fragment thereof, as defined in any one of claims 1 to 7, of the conjugate, as defined in claim 8, or of the CAR, as defined in claim 9, characterized in that it is for the preparation of a medicament for the treatment of cancer in a patient in need thereof.

18. Use according to claim 17, characterized in that said cancer is a cancer of the lung, pancreas, breast, uterine, fallopian tube, primary peritoneum, or ovary.

19. Use according to claim 17, characterized in that said patient is a human patient.