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BR112017019790B1 - Uso de um inibidor bruton tirosina quinase (btk) - Google Patents

Uso de um inibidor bruton tirosina quinase (btk) Download PDF

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BR112017019790B1
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Zhejiang Dtrm Biopharma Co. Ltd
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Abstract

é fornecida uma série de novos compostos de pirazolopirimidina polifluoro-substituídos ou sais. os compostos são inibidores da tirosina quinase de bruton (btk). os compostos têm uma melhor seletividade de inibição de quinase e propriedades farmacocinéticas. também é fornecido um método de preparação para os compostos. também é fornecida uma terapia combinada que inclui os compostos em combinação com outra composição de fármaco alvo ou outro fármaco. a terapia combinada otimizada tem um efeito cooperativo, inibindo a existência de um tumor melhor do que um único fármaco alvo e faz com que determinados tumores desapareçam completamente. a tera-pia combinada otimizada trata a resistência a fármacos e recorrência de câncer de um tumor melhor do que um único fármaco alvo e o ciclo de tratamento é mais curto. a presente invenção refere-se também a um composto combinado e uma preparação farmacêutica em que o dito composto combinado atua como um ingrediente ativo, a dita pre-paração farmacêutica sendo mais segura em uma dosagem menor e tendo uma eficácia de efeito cooperativo. também é fornecido um mé-todo de uso dos compostos e uma preparação do mesmo para trata-mento e inibição de uma doença ou enfermidade autoimune, uma do-ença ou enfermidade autoimune heterogêneo, uma doença inflamató-ria, um câncer ou uma enfermidade.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A invenção refere-se a uma nova série de compostos de pi- razolopirimidina multifluoro-substituídos e aos métodos de síntese, bem como composições farmacêuticas que compreendem os compostos descritos aqui como ingredientes ativos e métodos de inibição da atividade da tirosina quinase de Bruton. A invenção refere-se também a combinações otimizadas de vários fármacos para a inibição in vitro de viabilidade de células tumorais e tumores in vivo. As combinações otimizadas têm um efeito sinérgico, o que poderia inibir a sobrevida do tumor de forma mais eficaz do que os agentes com um único alvo e fazer com que determinados tumores desapareçam completamente. Comparado com agentes com um único alvo, as combinações otimizadas podem evitar a resistência ao fármaco e a recorrência de câncer. As combinações otimizadas são mais seguras em virtude de uma menor dose e podem reduzir os ciclos de tratamento em virtude dos melhores efeitos terapêuticos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] O tratamento anticâncer foi desenvolvido a partir de quimioterapia tóxica para quimioterapia combinada (por exemplo, CHOP), anticorpos (por exemplo, Rituximabe), combinação de quimioterapia e terapia com anticorpos (R-CHOP) e a imunoterapia imune anticâncer excitatória (anticorpo à PD-1 e PD-L1) e uma terapia com células T de receptor antigênico quimérico (CAR-T). A vida e a qualidade de vida do paciente foram melhoradas, no entanto, em virtude da complexidade do câncer, mutações em uma única via ou vias de sinalização podem levar ao tratamento ineficaz ou recorrência da doença. A terapia dirigida a pequenas moléculas requer administração diária a longo prazo e, se a administração do fármaco for interrompida, pode ocorrer reincidência ou recorrência de câncer. Os métodos de distribuição de anticorpos e quimioterapia são complexos. A combinação de anticorpos e quimioterapia pode ter efeitos aditivos ou sinérgicos, mas raramente resulta em cura do câncer. As terapias combinadas de terapia direcionada com imunoterapia contra o câncer ou imunoterapia com células T de receptor antigênico quimérico (CAR-T) estão em desenvolvimento, mas podem ter preocupações em relação à segurança. A terapia oral tem muitas vantagens, por exemplo, podemos parar imediatamente a administração se ocorrerem efeitos colaterais graves. Para terapia com anticorpos e células, é difícil controlar os efeitos colaterais graves. Atualmente, a terapia de um único alvo ou terapia combinada que tem como alvo duas vias tem algumas limitações e, portanto, a eficácia clínica de tratamento do câncer (taxa de resposta global, ORR - Overall Response Rate) é principalmente uma resposta parcial (Partial Response - PR) ou doença estável (Stable Disease - SD) e raramente resposta completa (Complete Response - CR). Estes tratamentos geralmente prolongam a vida de um paciente por apenas alguns meses. Além disso, a terapia celular complexa ou a combinação de anticorpos com quimioterapia podem ter problemas de segurança. Além disso, estes tratamentos estão limitados ao ambiente hospitalar. Essas desvantagens mencionadas acima não apenas levam a altos custos para o tratamento de câncer, mas também afetam os desejos do paciente quanto ao tratamento, bem como a adesão ao tratamento, e são um obstáculo para expandir o tratamento de câncer para a maioria dos pacientes. Além disso, o preço da terapia dirigida a uma única via é de US $ 100.000-200.000 por paciente e o preço das terapias combinadas será duplicado ou mesmo maior. O desenvolvimento destes tratamentos caros é insustentável. Portanto, tanto os pacientes como o mercado têm uma necessidade clara de buscar uma melhor combinação terapêutica. Espera-se que a nova terapia combinada seja mais eficaz, com menos efeitos colaterais e um ciclo de tratamento mais curto. Com o auxílio de um diagnóstico complementar adequado, a terapia combinada otimizada (medicamento personalizado ou medicamento preciso) pode curar subtipos de câncer ou permitir um melhor controle da resistência aos fármacos.
[0003] O Ibrutinibe, o primeiro inibidor da tirosina quinase de Bruton (Bruton's Tyrosine Kinase - BTK), foi aprovado pela Food and Drug Administration nos Estados Unidos para o tratamento de linfoma de células do manto (Mantle Cell Lymphoma - MCL) e leucemia linfocítica crônica (Chronic Lymphocytic Leukemia - CLL) e apresentou bom efeito, mas o tratamento clínico produziu C481s e outras mutações que causam resistência aos fármacos (Furman et al.: Ibrutinib Resistance In Chronic Lymphocytic Leukemia, N Engl J Med, 2014, 2352). Além disso, a farma- cocinética do Ibrutinibe varia amplamente entre os pacientes (Marostica et al., Population Harmacokinetic [Sic] Model of Ibrutinib, A Bruton Tyrosine Kinase Inhibitor, In Patients With B Cell Malignancies, Cancer Che- mother Pharmacol (2015) 75: 111-121), Um estudo toxicocinético descobriu que a AUC em ratos e cães é baixa, 1000 h*ng/mL (ratos machos, 40 mg/kg) e 3300 h*ng/mL (ratos fêmeas, 40 mg/kg) e 1780 h*ng/mL (cães machos, 24 mg/kg) e 1850 h*ng/mL (cães fêmeas, 24 mg/kg) (Número de Pedido NDA do FDA 205552Orig1s000_pharmacological review). A BTK desempenha um papel crucial na via de sinalização das células B que liga o receptor de células B (BCR) na superfície celular às respostas intracelulares a jusante. A BTK é um regulador chave do desenvolvimento, ativação, proliferação e sobrevivência das células B.
[0004] O Everolimus, um alvo em mamíferos do inibidor de qui- nase rapamicina (mammalian Target Of Rapamycin - mTOR), foi aprovado pela Food and Drug Administration nos Estados Unidos para o tratamento de câncer de mama, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, angiomiolipoma renal e esclerose tuberosa. O mecanismo da proteína mTOR foi claramente elucidado. A mTOR é um regulador chave do crescimento, proliferação, metabolismo e apoptose celular em vias de sinalização complexas. Além disso, o Everolimus é usado para tratar rejeição a transplante de órgãos em doses baixas, pois o transplante de órgãos também ativa a mTOR.
[0005] A pomalidomida, um fármaco imunomodulador (IMiD), foi aprovada pela Food and Drug Administration nos Estados Unidos em 2013 para o tratamento do mieloma múltiplo (MM). A pomalidomida e seus IMiDs análogos inibem os fatores celulares TNF-α, IL-β, IL-6, IL- 12 e GM-CSF. Os IMiDs possuem propriedades antiangiogênicas, an- tiproliferativas e pró-apoptóticas e também estimulam os linfócitos T para induzir à proliferação de células T, produção de citocinas de células T e citotoxicidade de células T, assim, aumentando a atividade an- ticâncer das células T.
[0006] O Venetoclax ou ABT-199 é um inibidor novo e específico de linfoma-2 de células B (Bcl-2) em estudos clínicos. A proteína Bcl-2 desempenha um papel fundamental na apoptose. O ABT-199 desencadeou a síndrome de lise tumoral (Tumor Lysis Syndrome - TLS) e resultou na morte de um paciente em ensaios clínicos.
[0007] O metotrexato (MTX) é um fármaco antineoplásico antifola- to e fármaco para artrite reumatoide, principalmente através de inibição da di-hidrofolato redutase para bloquear a síntese celular e inibir o crescimento e a proliferação celular.
[0008] A BTK é um membro da família Tec de proteínas tirosina quinase. A BTK consiste em um domínio N-terminal exclusivo, isto é, homologia com a pleckstrina (Pleckstrin Homology - PH), região de homologia Tec (TH), domínios de homologia 3 Src (SH3), domínios de homologia 2 Src (SH2) e um domínio catalítico e um domínio de tirosi- na quinase ou homologia 1 Src (TK ou SH1) dos domínios de quinases (Akinleye et al.: Ibrutinib and Novel BTK Inhibitors In Clinical Development, Journal of Hematology & Oncology 2013, 6: 59). No desenvolvimento normal de linfócitos B, a expressão correta do gene de BTK em diferentes regiões desempenha um papel fundamental na função das células B e várias vias de transdução de sinal.
[0009] A BTK funciona a jusante de múltiplos receptores, incluindo fatores de crescimento, antígenos de células B, quimiocinas e receptores imunes inatos e, assim, inicia uma ampla variedade de processos celulares, tais como proliferação celular, sobrevivência, diferenciação, motilidade, angiogênese, produção de citocinas e apresentação de an- tígeno. Portanto, a BTK desempenha um papel importante em muitas vias de sinalização de células hematopoiéticas e também é crucial na ativação, desenvolvimento, sobrevivência e transdução de sinal de células B (Kurosaki, Molecular Mechanisms In B Cell Antigen Receptor Signaling. Curr Op. Immun., 1997, 9(3): 309-18).
[0010] Há evidências para provar que as células B têm efeitos re- gulatórios imunes sobre suas respostas imunes e respostas inflamatórias. Por exemplo, o anticorpo CD20 rituximabe (Rituxan) é um agente de tratamento com base na proteína pelo consumo de células B e usado como tratamento de doenças autoimunes, tal como leucemia linfocíti- ca crônica, e doenças inflamatórias, tal como artrite reumatoide. Portanto, a proteína quinase, a qual desempenha um papel fundamental na ativação das células B, será útil para doenças relacionadas às células B.
[0011] A evidência do papel da BTK em doenças autoimunes foi fornecida por camundongos com deficiência de BTK e pelo modelo de BTK em camundongos (Kil L.P. et al.: Bruton’s Tyrosine Kinase Mediated Signaling Enhances Leukemogenesis In A Mouse Model For Chronic Lymphocytic Leukemia. Am J Blood Res 2013, 3(1): 71-83). Em um modelo de leucemia linfocítica crônica (CLL) em camundongos, a leucemia linfocítica crônica nos camundongos com deficiência de BTK foi completamente interrompida, a expressão excessiva de BTK acelerou a leucemia, aumentando a mortalidade.
[0012] A seletividade do inibidor de BTK conhecido não é ideal: ele inibe não apenas a BTK, mas também outras quinases (tais como ETK, EGF, BLK, FGR, HCK, YES, BRK e JAK3, etc.), o que pode causar mais efeitos colaterais. Inibidores seletivos melhores podem resultar em menos efeitos colaterais.
[0013] Os inibidores de BTK conhecidos produzem uma variedade de derivados, os quais também afetam a eficácia e causam efeitos colaterais. Sabe-se também que a farmacocinética dos inibidores de BTK pode ser melhorada.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0014] A invenção refere-se aos métodos terapêuticos que incluem inibidores de BTK para tratar ou inibir doenças autoimunes, doenças de hipersensibilidade, doenças inflamatórias e câncer. As doses eficazes para pacientes descritas aqui incluem compostos que têm uma estrutura de Fórmula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb) ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos. em que: R1 é flúor; n é 1, 2, 3 ou 4; R2 é flúor; m é 1 ou 2; R3 é hidrogênio ou deutério.
[0015] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais formados com um ácido ou uma base incluindo, porém sem limitações, (a) sais de adição de ácido: ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e outros ácidos orgânicos) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tânico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutâmico e ácido salicílico); (b) sais de adição de bases formados com cátions metálicos, tais como zinco, cálcio, sódio, potássio, etc.
Esquema de Síntese
[0016] A presente invenção exemplifica exemplos e modalidades descritos aqui. A modalidade particular da presente invenção é selecionada a partir do grupo das modalidades descritas e sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos e seus diastereômeros individuais ou sais dos mesmos.
[0017] A invenção dos métodos de síntese foi ativamente explorada. Um novo método para a síntese de compostos de pirazolopirimidi- na foi desenvolvido com sucesso (vide Esquemas 1-2 e o exemplo de reação específico).
[0018] Salvo indicação em contrário, nos esquemas de reação e discussão a seguir, R1, R2, R3, m, n têm o mesmo significado definido acima.Esquema 1
[0019] O material de iniciação fluoro-substituído A1 foi tratado com fenol B1 substituído para gerar o intermediário C1 sob condições básicas (por exemplo, carbonato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, DMF). O intermediário C1, então, reagiu com bis (pina- colato)diboro para proporcionar o intermediário D1 com um catalisador adequado (por exemplo, [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaládio (II)) sob condições básicas (por exemplo, acetato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano). Iodação de 1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-4-amina com NIS formou o intermediário F1, seguido de reação de Mitsunobu ou reação de deslocamento para fornecer o intermediário G1. O intermediário G1 foi tratado com o composto D1 obtido acima para proporcionar o intermediário H1 com um catalisador adequado (por exemplo, Pd-118) sob condições básicas (por exemplo, fosfato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano). Proteção De-Boc do intermediário H1 proporcionou a amina I1 sob condição ácida. O intermediário I1 reagiu com um reagente eletrofílico para formar a amida J1. Se J1 é racêmica, os compostos opticamente ativos K1 e L1 podem ser obtidos por meio de decomposição quiral SFC.Esquema 2
[0020] 3-fluoro-4-bromofenol reagiu com 1-fluoro-3-nitrobenzeno para gerar o intermediário C2 com uma base (por exemplo, carbonato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, DMF). O composto nitro C2 obtido foi reduzido à amina D2 com reagentes redutores apropriados (por exemplo, pó de ferro e cloreto de amônio) em solventes apropriados (por exemplo, etanol e água), seguido de tratamento com nitrito de sódio e fluoreto de hidrogênio e piridina para gerar o intermediário E2 fluoro-substituído. O intermediário E2, então, reagiu com bis(pinacolato)diboro para proporcionar o intermediário F2 com um catalisador adequado (por exemplo, [1,1'-bis(difenilfosfino) ferroce- no]dicloropaládio (II)) sob condições básicas (por exemplo, acetato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano). O intermediário H1 foi tratado com o composto F2 obtido acima para proporcionar o intermediário G2 com um catalisador adequado (por exemplo, Pd-118) sob uma condição básica (por exemplo, fosfato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano). Proteção De-Boc do intermediário G2 proporcionou a amina H2 sob condição ácida. O intermediário H2 reagiu com um reagente eletrofílico para formar a amida I2. Se I2 é racêmica, os compostos opticamente ativos J2 e K2 podem ser obtidos por meio de decomposição quiral SFC.Esquema 3
[0021] 3-fluoro-4-bromofenol reagiu com ácido 3-fluorofenilborô- nico para gerar o intermediário B3 com um catalisador apropriado (por exemplo, acetato de cobre). O intermediário B3, então, reagiu com bis (pinacolato)diboro para proporcionar o intermediário C3 com um catalisador adequado (por exemplo, [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno] diclo- ropaládio (II)). O intermediário G1 foi tratado com o composto C3 obtido acima para proporcionar o intermediário D3 com um catalisador apropriado (por exemplo, [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloropalá- dio (II)) sob uma condição básica (por exemplo, acetato de potássio) em um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano). Proteção De- Boc do intermediário D3 proporcionou a amina E3 sob condição ácida. O Intermediário E3 foi reagido com um reagente eletrofílico para formar a amida F3. Se F3 é racêmica, os compostos opticamente ativos H3 e I3 podem ser obtidos por meio de decomposição quiral SFC.Esquema 4
[0022] O composto de amina I1 pode ser reagido com ácido 2- butinoico para proporcionar o composto II. Se o composto II é racêmi- co, os compostos opticamente ativos IIa e IIb podem ser obtidos por meio de decomposição quiral SFC.Esquema 5
[0023] Um intermediário A5 opticamente ativo foi formado a partir do intermediário F1 por meio de reação de Mitsunobu ou reação de substituição. Na presença de uma base adequada, por exemplo, fosfato de potássio, e um catalisador adequado (por exemplo, Pd-118), o intermediário A5 pode ser reagido com éster de boronato D1 em um solvente adequado, por exemplo, 1,4-dioxano e água, para produzir o intermediário B5. Proteção De-Boc do intermediário B5 em condição ácida proporcionou o composto de amina C5. O composto de amina A5 pode ser reagido com um reagente eletrofílico para proporcionar o composto Ia.Esquema 6
[0024] O composto de amina C5 pode ser reagido com ácido 2- butinoico para proporcionar o composto IIa.
[0025] A presente invenção fornece compostos que têm uma estrutura mostrada na Fórmula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb) e enantiôme- ros dos mesmos, diastereômeros dos mesmos ou sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos.
[0026] Os compostos de Fórmula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb) da presente invenção compreendem um ou mais isótopos estáveis ou isótopos de rádio, em que os isótopos incluem, porém sem limitações, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18S e assim por diante.
[0027] A presente invenção é o primeiro caso a introduzir 2H, o qual é um isótopo de 1H, em inibidores de BTK.
[0028] 1H, o qual está na extremidade da ligação dupla do grupo vinila nos compostos de Fórmula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb), pode ser substituído por 2H para reduzir a inativação do fármaco causada pela oxidação/redução da ligação dupla.
[0029] A presente invenção fornece métodos para a preparação dos compostos representados pelas fórmulas (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb), enantiômeros dos mesmos e diastereômeros dos mesmos.
[0030] A invenção fornece métodos para regular a atividade de BTK e tratamento ou inibição de doenças associadas à atividade de BTK. Foi confirmado que os compostos aqui inibem a atividade de BTK. A presente invenção fornece compostos de Fórmula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb) como ingredientes farmacêuticos ativos para o tratamento e/ou prevenção das doenças a seguir, em que estas doenças são causadas por sinalização de citocinas desfavoráveis, incluindo, porém sem limitações: (1) doenças autoimunes, tais como tiroidite linfocítica crônica, hipertiroidismo, diabetes mellitus dependente de insulina, miastenia grave, colite ulcerativa crônica, anemia perniciosa associada à gastrite atrófica crônica, síndrome de Goodpasture, pênfigo vulgar, penfigoide, cirrose biliar primária, esclerose cefalorraquidiana múltipla, neurite idi- opática aguda, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, psoría- se, vasculite sistêmica, esclerodermia, pênfigo, doença mista do tecido conjuntivo, anemia hemolítica autoimune, doença tiroidiana autoimune, colite ulcerativa, etc.; (2) distúrbios imunes, tais como doenças do sono, asma, ri- nite alérgica, alergia a medicamentos, etc.; (3) doenças inflamatórias, tais como queratite, rinite, esto- matite, caxumba, faringite, amigdalite, traqueíte, bronquite, pneumonia, miocardite, gastrite, gastroenterite, colecistite, apendicite, etc.; (4) câncer incluindo, porém sem limitações, várias malignidades de células B (incluindo linfoma linfocítico pequeno (Small Lymphocytic Lymphoma - SLL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de células B grandes (Diffuse Large B-Cell Lymphoma - DLBCL), macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma folicular, linfoma de células do manto (MCL)) e outras doenças que se beneficiariam com a inibição da atividade de BTK.
[0031] Outras doenças que se beneficiariam com a inibição da atividade de BTK incluem, porém sem limitações: tumores cerebrais, câncer de bexiga, câncer de estômago, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer cervical, câncer de endométrio, câncer colorretal, câncer de rim, câncer de esôfago, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncer de osso, câncer de pele, câncer de cólon, tumores do trato reprodutivo feminino, linfomas, mieloma múltiplo (MM), câncer testicular e assim por diante.
[0032] O método aqui inclui administração, a um paciente que precisa, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto selecionado a partir das Reivindicações 1-2.
[0033] De acordo com a prática farmacêutica padrão, os compostos (inibidores de BTK) da invenção podem ser usados individualmente em uma formulação farmacêutica ou com um ou mais fármacos adicionais em uma combinação farmacêutica, em que a formulação farmacêutica que compreende inibidores de BTK e fármacos adicionais podem ter a mesma ou uma via de administração diferente e o mesmo ou um tempo de administração diferente. Os fármacos adicionais aqui incluem (porém sem limitações):
[0034] inibidores de tirosina quinase (por exemplo, Axitinibe, Dasa- tinibe, Icotinibe);
[0035] inibidores de topoisomerase (por exemplo, topotecano);
[0036] inibidores de proteína quinase C (por exemplo, AEB-071);
[0037] agonistas do receptor de esfingosina-1-fosfato (por exemplo, Fingolimode, KRP-203);
[0038] imunoglobulina anti-células T (por exemplo, AtGam);
[0039] anticorpos anti-receptor de IL-2 (por exemplo, daclizuma- be);
[0040] amidas (CTX), ifosfamida (IFO), adriamicina (ADM), dau- norrubicina (DNR), vincristina (VCR), vinblastina (VBL), etoposídeo (VP16), vermeer (Vumon), carboplatina (CBP) e metotrexato (MTX), ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, everolimus, azatioprina, brequi- nar, leflunomida, LEA-29Y, anticorpo anti-CD3 (por exemplo, 0KT3), aspirina;
[0041] moléculas de bloqueio de B7-CD28 (por exemplo, belata- cepte, abatacepte);
[0042] moléculas de bloqueio de CD40-CD154 (anticorpos anti- CD40);
[0043] acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno, piroxicame e este- roides anti-inflamatórios (por exemplo, prednisolona ou dexametaso- na).
[0044] Os inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK) incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: Ibrutinibe, Composto 3, Composto 5, ACP-196 (Acerta Pharma), BGB-3111 (BeiGene), AVL- 292 (Celgene), ONO-4059 (One Pharmaceutical), HM71224 (Hanmi Pharmaceutical), RN486 (Roche), CNX-774, CGI-11746 e assim por diante.
[0045] Os inibidores de mTOR incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: everolimus, rapamicina, XL388, GDC-0349, AZD2014, AZD8055, GSK105965, MLN0128, Ridaforlimus e assim por diante.
[0046] Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: Talidomida, Revlimide, Pomalido- mida, CC-122 e CC-220.
[0047] Os inibidores de quinase PI3K incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: BTG226, PF-05212384 (Gedatolisibe), GDC-0980 (Apitolisibe), GSK2126458, BEZ235, IPI-145 (Duvelisibe), CAL-101 (Idelalisibe) e assim por diante.
[0048] Os inibidores de Bcl-2 incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: ABT-199 (Venetoclax), BI-97C1 (Sabutoclax) e assim por diante.
[0049] Os inibidores de TOPK incluem todos os conhecidos, po-rém sem limitações: OTS964 (Oncotherapy Science).
[0050] Os inibidores de quinase JAK3 incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: Tofactinibe.
[0051] Os inibidores de quinase JAK1/2 incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: Ruxolitinibe.
[0052] Os inibidores de quinase ALK incluem todos os conhecidos, porém sem limitações: Crizotinibe, Ceritinibe e CH5424802 (Alectini- be).
[0053] A presente invenção refere-se também à otimização e triagem de várias composições farmacêuticas específicas in vitro e em modelos de tumores animais in vivo. O composto ou composição farmacêutica, a qual pode matar células tumorais, não é necessariamente eficaz em modelos de tumor animal em virtude de problemas de farmacocinética do fármaco. Portanto, sem dados de inibição de tumores animais, os dados de inibição in vitro em si podem não demonstrar a capacidade de formulação em fármaco de um composto ou uma composição farmacêutica. A presente invenção usa a administração por sonda oral (em vez de injeção intraperitoneal ou injeção intravenosa) para evitar as incertezas da farmacocinética, otimizar e exibir vários compostos e composições farmacêuticas em uma variedade de modelos de tumor animal para obter uma avaliação da capacidade de formulação em fármaco.
[0054] A tecnologia existente reivindica que inibidor da ALK e inibidores de BTK tem efeito sinérgico sobre a inibição de células tumo- rais in vitro, enquanto que a presente invenção mostra o resultado oposto: ALK inibidor (Ceritinib) e BTK inibidor Ibrutinib não têm efeito sinérgico.
[0055] A tecnologia existente também afirma que os inibidores de JAK2 e BTK têm efeito sinérgico sobre a inibição de células tumorais in vitro, enquanto que a presente invenção mostra o resultado oposto: inibidores de JAK1/2 (ruxolitinibe) e inibidores de BTK, ou inibidores de mTOR, ou fármacos imunomoduladores não apenas não têm efeito sinérgico, mas também não têm qualquer inibição de células tumorais TMD-8.
[0056] A presente invenção descreve combinações farmacêuticas "dois em um" e "três em um" (composições farmacêuticas ou combinações farmacêuticas), as quais são superiores aos fármacos com um único alvo. As combinações farmacêuticas "dois em um" e "três em um" têm efeitos sinérgicos em doses mais baixas. As formulações da combinação farmacêutica na presente invenção não estão limitadas à proporção específica descrita aqui para ensaios in vitro e in vivo.
[0057] A invenção refere-se também à otimização da combinação farmacêutica com base em múltiplas vias de sinalização chave, as quais controlam o crescimento, proliferação, sobrevivência e apoptose celular. A terapia dirigida única frequentemente leva à resistência a fármacos causada por mutações genéticas, o que resulta em uma redução da eficácia do fármaco e leva à recorrência da doença. As combinações farmacêuticas podem superar a resistência a fármacos e obter um efeito terapêutico melhor ou curar a doença. A presente invenção mostra que as combinações farmacêuticas têm um efeito sinérgico e uma capacidade letal sintética em células tumorais. A atividade das combinações farmacêuticas é 100 vezes maior do que aquela dos fármacos direcionados. Em comparação com fármacos específicos, as combinações farmacêuticas também mostram efeitos notáveis em vários modelos de xenoenxerto por meio de administração através de sonda oral, em doses muito mais baixas (por exemplo: 1/18 Composto 3 (inibidor de BTK) + 1/6 Everolimus (inibidor de mTOR) + 1/6 Pomali- domida (IMiD)) e possuem efeitos terapêuticos muito melhores do que fármacos direcionados. As combinações farmacêuticas "dois em um" resultam em regressão completa do tumor em um ciclo de tratamento de 15 dias, enquanto que as combinações farmacêuticas "três em um" resultam em regressão completa do tumor em um ciclo de tratamento mais curto (9 dias). Além disso, o tumor não se recuperou no prazo de 12 dias após a interrupção da administração, o que foi significativamente melhor do que a terapia com um único alvo. A terapia com um único alvo requer não apenas tratamento a longo prazo, mas também é acompanhada de recuperação de tumores, resistência a fármacos e recorrência de câncer. As combinações farmacêuticas otimizadas têm melhor segurança e uma janela terapêutica mais ampla do que fárma- cos direcionados, pois as doses das combinações são muito menores do que cada fármaco individual e, ao mesmo tempo, as combinações mostram um efeito mais notável. As propriedades únicas das combinações farmacêuticas acima na presente invenção podem trazer novas esperanças para os pacientes com câncer refratário.
[0058] Na presente invenção, as combinações farmacêuticas "três em um" onde a concentração de inibidor de BTK era tão baixa como 10 nM inibiram tanto quanto 95% de viabilidade de células tumorais. Isto foi inesperado e não pode ser inferido ou orientado pela invenção existente. A inibição da viabilidade celular foi testada após incubação de 48 horas. Se o tempo de incubação é aumentado para 72-96 h, as composições farmacêuticas exibiam uma inibição muito mais forte da viabilidade celular. A presente invenção mostrou que a inibição de viabilidade celular in vitro se correlacionava com aquela do tumor in vivo. A inibição da viabilidade celular in vitro pode prever inibição do tumor in vivo. Uma inibição eficiente da viabilidade celular in vitro pode levar à regressão do tumor ou desaparecimento completo na menor concentração (por exemplo, 10 nM). As composições farmacêuticas descritas aqui podem inibir e matar células tumorais de forma eficiente em concentrações tão baixas como 10 nM, o que assegura que a invenção tenha aplicações clínicas muito significativas. No tratamento de paci- entes, as concentrações de fármaco da combinação nas células tumo- rais podem chegar facilmente a 10-100 nM, assim, resultando em um melhor efeito terapêutico. No momento, a terapia com um único alvo ou terapia combinada de duas vias é eficaz na inibição do crescimento de células tumorais em uma concentração do composto de 1000 nM. Por exemplo, o ABT-199 inibiu a viabilidade das células TMD-8 a 1000 nM, 100 nM e 10 nM em 37,6%, 18,8% e 11,1%, respectivamente. As composições de "dois em um" de ABT-199 e inibidor de BTK (Composto 3) inibiram a viabilidade das células TMD-8 em 85,97%, 79,99% e 65,36%, respectivamente. As composições "três em um" de ABT-199, inibidor de BTK (Composto 3) e inibidor de PI3K inibiram a viabilidade das células TMD-8 em 95,56%, 95,30% e 94,62%, respectivamente. A composição farmacêutica "três em um", a qual compreende ABT-199, Composto 3 (um inibidor de BTK) e inibidor de mTOR Everolimus também inibiram eficientemente a viabilidade das células TMD-8 em 93,44%, 94,73% e 94,65%, respectivamente. O efeito sinérgico superior na presente invenção não é inferido ou orientado pela tecnologia existente.
[0059] A presente invenção afirma que (1) a combinação "três em um" de inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de quinase mTOR e fármacos imunomoduladores (IMiDs) é uma das melhores combinações; as outras duas melhores combinações "três em um" são: (2) inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de quinase mTOR e inibidores de Bcl-2; (3) inibidores de tirosina qui- nase de Bruton (BTK), inibidores de PI3K e inibidores de Bcl-2. As segundas melhores combinações farmacêuticas são combinações farmacêuticas "dois em um" que compreendem inibidores de tirosina qui- nase de Bruton (BTK) e inibidor de quinase mTOR, combinações farmacêuticas "dois em um" que compreendem inibidores de tirosina qui- nase de Bruton (BTK) e pomalidomida (IMiDs), combinações farma- cêuticas "dois em um" que compreendem inibidores de tirosina qui- nase de Bruton (BTK) e inibidores de TOPK, combinações farmacêuticas "dois em um" que compreendem inibidores de TOPK e inibidores de PI3K e combinações farmacêuticas "dois em um" que compreendem inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK) e inibidores de PI3K.
[0060] A presente invenção mostra que algumas combinações têm um efeito de inibição sinérgico e algumas não têm efeito sinérgico e podem ser contraproducentes. As vias de sinalização são excessivas, se cruzam e são complexas. As combinações, as quais podem inibir simultaneamente múltiplos vias de sinalização, são muito mais complexas. Portanto, os efeitos sinérgicos superiores das três melhores combinações "três em um" da presente invenção não são inferidos ou orientados pela tecnologia existente.
[0061] A presente invenção fornece um método para otimização de inibição da viabilidade celular in vitro, inibição tumoral in vivo e uma variedade de modelos de tumor e resolve o problema de avaliação da capacidade de formulação em fármaco de combinações farmacêuticas.
[0062] A presente invenção mostra que, em modelos de tumor de animais por meio de administração através de sonda oral, apenas composições farmacêuticas "três em um" (inibidor de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidor de quinase mTOR e fármacos imunomodula- dores (IMiD)) e "dois em um" (inibidor de tirosina quinase de Bruton (BTK) e inibidores de quinase mTOR) podem levar ao desaparecimento completo do tumor e, após interrupção da administração, recuperação do tumor não foi observada. Outras combinações apenas inibem o crescimento tumoral e devem ser administradas continuamente para inibir o crescimento tumoral. A monoterapia com Everolimus pode fazer com que os tumores desapareçam completamente em altas doses, mas os tumores se recuperaram rapidamente após administração, o que é um defeito da terapia com um único alvo. A presente invenção resolve este problema e espera-se que cure o câncer em casos individuais.
[0063] A invenção não apenas verifica o excelente efeito de inibição das combinações farmacêuticas no modelo de tumor TMD-8 sensível, mas também prova o bom efeito de inibição em modelos de tumores insensíveis DoHH2 e em modelos de tumor WSU-DLCL resistentes e refratários, respectivamente. A eficácia das combinações farmacêuticas "três em um" ainda é a melhor, embora os tumores não tenham desaparecido completamente nos dois últimos modelos. Por exemplo, o composto EZ-6438 (inibidor de histona metiltransferase EZH2) pode conseguir um efeito similar ao modelo de tumor WSU- DLCL através de uma sonda oral em camundongos em doses muito elevadas (480 mg/kg/dia) de acordo com o relatório da Epizyme, enquanto que na combinação "três em um" da invenção é de apenas 21 mg/kg/dia.
[0064] A presente invenção demonstra, pela primeira vez, que a terapia combinada com múltiplos alvos tem um efeito melhor e reduz a dose de um único fármaco. Portanto, ela pode reduzir ainda mais os efeitos colaterais de cada fármaco e tornar o tratamento combinado muito mais seguro e mais eficaz.
[0065] A terapia combinada com múltiplos alvos da presente invenção pode ser usada para tratar linfoma maligno e leucemia causada por células B, bem como câncer e tumores sólidos causados por células T.
[0066] A combinação com múltiplos alvos da presente invenção também pode ser usada para tratar artrite reumatoide e outras doenças autoimunes.
[0067] A presente invenção também fornece composições farma- cêuticas que compreendem inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de mTOR e imunomoduladores (IMiDs) como ingredientes ativos.
[0068] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de mTOR e inibidores da Bcl-2 como ingredientes ativos.
[0069] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem inibidores de quinase de Bruton tirosina (BTK), inibidores de PI3K e inibidores da Bcl-2 como ingredientes ativos.
[0070] A presente invenção também fornece o uso de compostos de fórmulas (I), (II), (Ia), (Ib) e (IIb) para a preparação de medicamentos que regulam a atividade de BTK, bem como parar tratar ou inibir doenças associadas à atividade de BTK.
[0071] A presente invenção também fornece o uso de compostos de fórmulas (I), (II), (Ia), (Ib) e (IIb), inibidores de quinase mTOR e/ou imunomoduladores (IMiDs) para a preparação de medicamentos que regulam atividade de BTK, bem como parar tratar ou inibir doenças associadas à atividade de BTK.
[0072] A presente invenção também fornece o uso de composições que compreendem dois ou três compostos selecionados a partir de inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de qui- nase mTOR e imunomoduladores (IMiDs) para a preparação de medicamentos que regulam a atividade de BTK, tratam ou inibem doenças associadas à atividade de BTK.
[0073] A presente invenção também fornece o uso de composições que compreendem inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de quinase mTOR e inibidores de Bcl-2 para a preparação de medicamentos que regulam a atividade de BTK, tratam ou inibem doenças associadas à atividade de BTK.
[0074] A presente invenção também fornece o uso de composições que compreendem inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de quinase PI3K e inibidores de Bcl-2 para a preparação de medicamentos que regulam a atividade de BTK, tratam ou inibem doenças associadas à atividade de BTK.
[0075] Veículos, excipientes e outros aditivos comumente usados para preparações farmacêuticas podem ser usados para preparar composições farmacêuticas que contêm um ou dois ou mais compostos de fórmulas (I) (II), (Ia), (Ib) e (IIb) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos como ingredientes ativos.
[0076] As formas de administração podem ser formas de dosagem orais, tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, grânulos, pós, emulsões, xaropes, suspensões, preparados líquidos, ou formas de dosagem não orais, tais como injeção intravenosa ou injeção intramuscular, supositório, agente subcutâneo, agente transdérmico, agente nasal, inalação. Os sintomas, idade, sexo, etc., do paciente individual devem ser considerados a fim de determinar corretamente a dose de um composto. De modo geral, no caso de administração oral, as doses diárias do composto para pacientes adultos são cerca de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg, uma dose única ou dividida em 2 a 4 vezes ao dia. No caso de administração intravenosa de acordo com os sintomas do paciente, de modo geral, as doses diárias para pacientes adultos são 0,0001 mg/kg a 10 mg/kg, uma vez a mais vezes por dia. Além disso, no caso de uso de administração por inalação, de modo geral, as doses diárias para pacientes adultos são 0,0001 mg/kg a 1 mg/kg, uma ou mais vezes por dia.
[0077] Na presente invenção, composições sólidas para administração oral podem ser comprimidos, pós, grânulos e assim por diante. Em tais composições sólidas, uma ou mais substâncias ativas foram misturadas com pelo menos um excipiente inerte (por exemplo, lactose, manitol, glicose, hidroxipropilcelulose, celulose microcristalina, amido, polivinilpirrolidona, silicato de alumínio e magnésio, etc.). De acordo com um método convencional, a composição pode conter aditivos inertes, tais como lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio), agentes desintegrantes (por exemplo, carboximetil amido de sódio) e auxiliares de dissolução. Se necessário, os comprimidos ou pílulas podem ser revestidos com um revestimento de açúcar ou um agente de revestimento gástrico ou entérico.
[0078] As composições líquidas para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes, elixires farmaceuticamente aceitáveis e diluentes inertes comumente usados (por exemplo, água purificada, etanol). Além do diluente inerte, a composição também pode conter aditivos, tais como agentes de solubilização, agentes de umedecimento, agentes de suspensão e adoçantes, agentes flavori- zantes, agentes aromatizantes e conservantes.
[0079] As injeções para administração parentérica incluem preparados estéreis aquosos ou não aquosos líquidos, suspensões e emulsões. Uma solução diluente aquosa pode ser usada (por exemplo) e inclui água destilada para injeção e solução salina fisiológica. Uma solução diluente não aquosa pode ser usada (por exemplo) e inclui propi- leno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais (tal como azeite), álcoois (por exemplo, etanol) e polissorbato 80. Tais composições podem conter ainda agentes isotônicos, tais como conservantes, agentes umec- tantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, agentes estabili- zantes, auxiliares de dissolução e outros aditivos. Elas podem ser em-pregadas por meio de filtração através de um filtro que retém bactérias, adicionando agentes bactericidas ou irradiação com luz como um método de esterilização da composição. Além disso, estas composições podem ser transformadas em composições sólidas estéreis antes de uso e, então, água estéril ou um solvente estéril adicionado para injeção antes de uso como um líquido dissolvido ou suspenso.
[0080] Agentes transmucosais, tais como inalações e agentes nasais e assim por diante, podem estar o estado de uso sólido, líquido ou semissólido e podem estar de acordo com os métodos conhecidos convencionalmente usados para preparar estes agentes transmuco- sais. Por exemplo, um excipiente pode ser adicionado conforme necessário (por exemplo, lactose e amido), um agente para ajuste de pH, um conservante IJ, tensoativos, lubrificantes, agentes estabilizantes IJ e agentes espessantes e assim por diante. Um dispositivo de inalação ou insuflação adequado pode ser usado para administração. Por exemplo, os dispositivos inaladores de dose medida podem ser usados com um dispositivo ou pulverizador conhecido, o composto pode ser usado individualmente ou como uma mistura após a formulação em pó ser administrada. Além disso, após o composto ser combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, ele pode ser administrado como uma solução ou suspensão. Um inalador de pó seco ou similar pode ser usado para uma única dose ou doses múltiplas e pode usar um pó seco ou uma cápsula que contém pó. Além disso, um pulverizador de aerossol pressurizado também pode ser usado na forma a ser administrada através do uso de um propelente adequado (por exemplo, clorofluoroalcano, hidrofluoroalcano ou um gás adequado, tal como dióxido de carbono). Tabela 1. Compostos representativos para inibidores de BTK
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0081] Figura 1-A: Efeito antitumor de múltiplas doses de Compostos 1 e 3 sobre o volume do tumor no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em camundongos SCID.
[0082] Figura 1-B: Efeito antitumor dos Compostos 1 e 3 sobre o peso do tumor no modelo de xenoenxerto de linfoma TMD-8 em camundongos SCID.
[0083] Figura 2: Efeito antitumor dos Compostos 3, 15 e sua combinação no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em camundongos SCID.
[0084] Figura 3: Efeito antitumor dos Compostos 3, 8, 15 e sua combinação no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em ca-mundongos SCID.
[0085] Figura 4: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 16 e sua combinação no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em ca-mundongos SCID.
[0086] Figura 5: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 15 e sua combinação no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em ca-mundongos SCID.
[0087] Figura 6: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 15 e sua combinação no modelo de xenoenxerto de linfoma DoHH-2 em ca-mundongos SCID.
[0088] Figura 7: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 15 e sua combinação no modelo de xenotransplante de linfoma DoHH-2 em camundongos SCID.
[0089] Figura 8: Efeito antitumor dos Compostos 3 e 9 no modelo resistente ESU-DLCL2 em camundongos.
[0090] Figura 9: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 15 e sua combinação no modelo resistente ESU-DLCL2 em camundongos.
[0091] Figura 10: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 15 e sua combinação "3 em 1" no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em camundongos.
[0092] Figura 11: Efeito antitumor dos Compostos 3, 14, 15 e Compostos 9, 14, 15 e sua combinação "3 em 1" no modelo de xeno- transplante de linfoma DoHH-2 em camundongos.
[0093] Figura 12: Efeito antitumor dos Compostos 3, 8, 12 e a suas combinações "2 em 1" e "3 em 1" no modelo de xenotransplante de linfoma TMD-8 em camundongos.
[0094] Figura 13: Volume do pé - artrite induzida por adjuvante.
[0095] Figura 14: Histopatologia - artrite induzida por adjuvante.
[0096] Figura 15: Avaliação clínica - artrite induzida por colágeno.
[0097] Figura 16: Histopatologia - artrite induzida por colágeno. Exemplo 1 Composto 1 e Composto 2 [(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-trifluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona 1-[(S)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-trifluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona Etapa A: 3-(4-bromo-3-fluorofenóxi)-1,2,4,5-tetrafluorobenzeno Procedimento:
[0098] Carbonato de potássio (68,0 g, 492,1 mmol, 2,0 eq.) e o composto 1,2,3,4,5-pentafluorofenila (49,6 g, 295,3 mmol, 1,2 eq.) foram adicionados a uma solução de 3-fluoro-4-bromofenol (47,0 g, 246,1 mmol, 1,0 eq.) em DMF (500 mL). A reação foi agitada a 100°C durante 12 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila (300 mL), lavado com água (100 mL) e salmoura (100 mL). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para fornecer o composto do título (78 g, rendimento: 93%).Etapa B: [2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano Procedimento:
[0099] (4-bromo-3-fluorofenóxi)-1,2,4,5-tetrafluorobenzeno (73 g, 215,3 mmol, 1,0 eq.), Bis pinacolato-boronato (65,6 g, 258,4 mmol, 1,2 eq.), acetato de potássio (31,6 g, 322,9 mmol, 1,5 eq.) e (dppf) PdCl2 (9,4 g, 12,8 mmol, 0,06 eq.) foram adicionados a 1,4-dioxano (1 L). A mistura resultante foi agitada a 80°C durante 14 horas sob nitrogênio. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura de reação foi filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo) para fornecer o composto do título (60 g, rendimento: 72%). Etapa C: 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina Procedimento:
[0100] NIS (250 g, 1,11 mol, 1,5 eq.) foi adicionado a uma solução de 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (100 g, 0,74 mol, 1,0 eq.) em DMF (800 mL). A reação foi agitada a 80 - 85°C durante 16 horas sob nitrogênio. A mistura de reação foi filtrada. O bolo do filtro foi lavado com etanol (1000 ml x 3) para fornecer o composto do título (184 g, rendimento: 95%).Etapa D:3-(metilsulfonilóxi)piperidina-1-carboxilato de terc-butila Procedimento:
[0101] Trietilamina (15 g, 150 mmol, 3,0 eq.) e cloreto de meta- nossulfonila (6,3 g, 55 mmol, 1,1 eq.) foram adicionados sequencialmente gota a gota a uma solução de 3-hidroxi-piperidina-1-carboxilato (10,0 g, 50 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (100 mL) a 0°C . A reação foi agitada a 20°C durante 1 hora e, então, dissipada com solução sa- turada de NaHCO3 (100 mL). A mistura resultante foi extraída com di- clorometano (200 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (13 g, rendimento: 95%).Etapa E:3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidina-1-carboxi- lato de terc-butilaProcedimento:
[0102] Carbonato de césio (20,2 g, 62 mmol, 2,0 eq.) e 3-(metil- sulfonilóxi)piperidina-1-carboxilato (13 g, 46,5 mmol, 1,5 eq.) foram adicionados a uma solução de 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]-pirimidin-4- amina (8,1 g, 31 mmol, 1,0 eq.) em DMF (50 mL) a 0°C . A reação foi agitada a 80°C durante a noite. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada através de Celite e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: acetato de etila) para fornecer o composto do título (5 g, rendimento: 25 %).Etapa F:3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]piperidina-1-carboxilato de terc-butila Procedimento:
[0103] 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidina- 1-carboxilato de terc-butila (7,6 g, 17,1 mmol, 1,0 eq.), 2-[2-fluoro-4- (2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (8,6 g, 22,3 mmol, 1,3 eq.), fosfato de potássio (7,3 g, 34,2 mmol, 2,0 eq.) e PD-118 (0,56 g, 0,855 mmol, 0,05 eq.) foram adicionados a uma mistura de 1,4-dioxano/água (5/1, v/v, 240 mL). A reação foi agitada a 60°C durante 12 horas sob uma atmosfera de nitrogênio. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura de reação foi vertida em água gelada (300 mL) e depois extraída com acetato de etila (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado através de separação por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: acetato de etila) para fornecer o composto do título (6,8 g, rendimento: 69%).Etapa G:3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-(piperidin-3-il)-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-4-amina Procedimento:
[0104] HCl/AE (20 mL, 4 mol/L) foram adicionados a uma solução de 3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil-terc-butil]-1H -pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidina-1-carboxilato (6,8 g, 11,8 mmol) em acetato de etila (50 mL) a 0°C . A reação foi agitada em temperatu- ra ambiente durante 1 hora e, então, concentrada para fornecer o clo- ridrato do composto do título (5,2 g, rendimento: 86%).Etapa H:1-(3-(4-amino-3-(2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil)-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il) piperidin-1-il)prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0105] Trietilamina (887 mg, 8,7 mmol, 3,0 eq.) e cloreto de acriloí- la (0,26 g, 2,9 mmol, 1,0 eq.) foram adicionados sequencialmente gota a gota a uma solução de 3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1- (piperidin-3-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (1,5 g, 2,9 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (10 mL). A reação foi agitada a 0°C durante 1 hora, dissipada com água (5 ml), diluída com diclorometano (50 mL) e lavada com água (30 mL x 2) e salmoura saturada (30 ml). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica gel para fornecer o composto do título (eluente: éter de petróleo: acetato de etila = 1: 0 - 1: 1) (0,94 g, rendimento: 64%).Dados espectroscópicos:
[0106] LC/MS (método: UFLC): TR = 3,130 min; m/z = 531,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0107] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,22 (s, 1H), 8,00-7,91 (m,1H), 7,55-7,46 (m, 1H), 7,27 (dd, J = 2,4, 10,8 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1H), 6,88-6,65 (m, 1H), 6,13-6,02 (m, 1H), 5,70-5,56 (m, 1H), 4,71-4,65 (m, 1H), 4,54-4,51 (m, 0,5H), 4,20-4,17 (m, 1H), 4,074,04 (m, 0,5H), 3,67-3,60 (m, 0,5H), 3,17-3,12 (m, 1H), 2.98- 2,94 (m, 0,5H), 2,26-2,21 (m, 1H), 2,11-2,06 (m, 1H), 1,92-1,89 (m, 1H), 1,581,54 (m, 1H).Etapa I:1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona1-[(S)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0108] 1-[3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona (750 mg) foi separada por meio decomposição quiral SFC (CO2: C2H5OH (DEA a 0,2%), v/v, 200 mL/min) para fornecer o Composto 1, 1-[(R)-3-[4-ami- no-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimi- din-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona (280 mg, ee: 100%) e Composto 2, 1-[(S)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona (330 mg, ee: 98%). Dados espectroscópicos: Composto 1:
[0109] LC/MS (método: UFLC): TR = 3,002 min; m/z = 531,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0110] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,36 (s, 1H), 7,58 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,09-7,04 (m, 1H), 6,94-6,88 (m, 2H), 6,62-6,54 (m, 1H), 6,326,25 (m, 1H), 5,73-5,63 (m, 1H), 5,56-5,51 (m, 1H), 4.904.85 (m, 1,5H), 4,59-4,56 (m, 0,5 H), 4,21-4,17 (m, 0,5H), 4,04-4,01 (m, 0,5H), 3,763,71 (m, 0,5H), 3,40-3,35 (m, 0,5H), 3,22-3,15 (m, 0,5 H), 2,93-2,87 (m, 0,5H), 2,39-2,27 (m, 2H), 2,04-1,68 (m, 2H). Composto 2:
[0111] LC/MS (método: UFLC): TR = 3,006 min; m/z = 531,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0112] 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,24 (s, 1H), 7,62 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,50-7,45 (m, 1H), 7,09-7,01 (m, 2H), 6.85- 6,63 (m, 1H), 6,21-6,09 (m, 1H), 5,77-5,61 (m, 1H), 4,63-4,59 (m, 1H), 4,23 (m, 1,5H), 3,90-3,85 (m, 0,5H), 3,51-3,45 (m, 0,5H), 3,34-3,17 (m, 1,5H), 2,40-2,23 (m, 2H), 2,08-2,05 ( m, 1H), 1,75-1,71 (m, 1H).Exemplo 2 Composto 31-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira-zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1-ona Método 1: Etapa A:3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)pirrolidina-1-carboxi- lato de (R)-terc-butila Procedimento:
[0113] DIAD (27,6 g, 137,5 mmol, 1,5 eq.) foi adicionado gota a gota a uma mistura de 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (24 g, 92 mmol, 1,0 eq.), 3-hidroxipirrolidina-1-carboxilato de (R)-terc-butila (26 g, 137,5 mmol, 1,5 eq.) e PPh3 (36 g, 137,5 mmol, 1,5 eq.) em te- tra-hidrofurano (720 mL) a 0°C e sob uma atmosfera de nitrogênio. A reação foi agitada a 0°C durante 1 hora, depois agitada durante a noite em temperatura ambiente. Após remoção do solvente sob pressão reduzida, acetonitrila (200 mL) foi adicionada ao resíduo. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas e filtrada. O bolo do filtro foi lavado com acetonitrila (20 mL) e seco para fornecer o composto do título (25 g, rendimento: 63%).Etapa B:3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidina-1-carboxilato de (3R)-terc-butila Procedimento:
[0114] 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)pirrolidina- 1-carboxilato de (R)-terc-butila (25 g, 58 mmol, 1,0 eq.), 2-[2-fluoro-4- (2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (30 g, 75,4 mmol, 1,3 eq.), fosfato de potássio (25 g, 116 mmol, 2,0 eq.) e Pd-118 (750 mg, 1,16 mmol, 0,02 eq.) foram adicionados a uma mistura de 1,4-dioxano/água (5/1, v/v, 600 mL). A reação foi agitada a 60°C durante a noite sob uma atmosfera de nitrogênio. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Água (300 ml) foi adicionada ao resíduo, então, extraída com acetato de etila (300 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o composto do título (60 g, bruto).Etapa C:3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-((R)-pirrolidin-3-il)-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina Procedimento:
[0115] HCl/AE (100 mL, 4 mol/L) foram adicionados a uma solução de 3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6- tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidina-1-carboxilato de (3R)-terc-butila (60 g, bruto) em acetato de etila (100 mL) a 0°C. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora e concentrada até secagem para fornecer o sal cloridrato do composto do título. Água (500 mL) foi adi- cionada ao frasco de reação, extraída com acetato de etila (300 mL x 3). A fase aquosa foi ajustada para um pH = 9 e, então, extraída com acetato de etila (300 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (24 g, rendimento de dois etapas: 90%).Etapa D:1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0116] NaOH (10%, 94 mL) foi adicionado a uma solução de 3-[2- fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-[(R)-pirrolidin-3-il]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-4-amina (23,5 g, 50,75 mmol, 1,0 eq.) em tetra-hidro- furano (470 mL) a -5°C e, então, cloreto de acriloíla (5,97 g, 66 mmol, 1,3 eq.) foi adicionado gota a gota. A reação foi agitada a -5°C durante 1 hora, dissipada com uma solução salina saturada (100 mL) e extraída com acetato de etila (200 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo: acetato de etila = 1:3 - 1:1). O produto obtido foi dissolvido em metanol (500 mL) e filtrado. Água (1500 mL) foi adicionada ao filtrado, agitada durante 2 horas e filtrada. O bolo no filtro foi seco sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (16,5 g, rendimento: 63%).Dados espectroscópicos:
[0117] LC/MS (método: UFLC): TR = 3,764 min; m/z = 517,0 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0118] 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,45 (s, 1H), 7,70 (t, 7- 8,4 Hz, 1H), 7,55-7,46 (m, 1H), 7,12-7,05 (m, 2H), 6,70-6,55 ( m, 1H), 6,33-6,26 (m, 1H), 5,81-5,75 (m, 1H), 4,23-3,83 (m, 5H), 2,68-2,55 (m, 2H).Método 2: Procedimento:
[0119] NaOH (216 mg, 5,40 mmol, 2,5 eq.) foi adicionado a uma solução de 3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-[(R)-pirrolidin 3-il]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (1,0 g, 2,16 mmol, 1,0 eq.) em tetra-hidrofurano (50 mL) e água (10 mL) a 0°C e, e ntão, uma solução de cloreto de cloropropionila (288 mg, 2,27 mmol, 1,05 eq.) em tetra- hidrofurano (10 mL) foi adicionada gota a gota. A reação foi agitada a 0°C durante 1 hora, depois a 60 °C durante 12 horas . Após esfriar para a temperatura ambiente, salmoura saturada (10 ml) foi adicionada e depois extraída com acetato de etila (50 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de croma- tografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo: acetato de etila = 1:3 - 1:1) para fornecer o Composto 3 (0,8 g, rendimento: 71%). Método 3:Procedimento:
[0120] (R)-[3-(-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il 4-amino-3) pir- rolidin-1-il]prop-2-en-1-ona (100 g, 0,26 mmol, 1,0 eq.), 2-[2-fluoro-4- (2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (120 mg, 0,31 mmol, 1,2 eq.), carbonato de sódio (55 mg, 0,52 mmol, 2,0 eq.) e Pd(PPh3)4 (30 mg, 0,026 mmol, 0,01 eq.) foram adicionados a uma mistura de 1,4-dioxano/água (5 ml, 1/1, v/v). A reação foi agitada sob irradiação de micro-ondas a 80 °C durante 30 minutos. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura de reação foi filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado através de separação por HPLC em uma coluna C18 (fase móvel: acetonitrila/água/HCl a 0,5%, gradiente de eluente de 10% a 100% (proporção em volume)). Após remoção do solvente volátil, a fração desejada foi liofilizada para fornecer o composto do título (38 mg, rendimento: 28%). Método 4: Composto 3 e Composto 41-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1-ona1-[(S)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira-zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1-ona Etapa A:3-(metilsulfonilóxi)pirrolidina-1-carboxilato de terc-butila Procedimento:
[0121] Trietilamina (35 g, 346 mmol, 2,1 eq.) foi adicionada a uma solução de 3-hidroxi-pirrolidina-1-carboxilato (30,0 g, 163 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (200 mL) a 0°C e, então, cloreto de metila (36,6 g, 321 mmol, 1,9 eq.) foi adicionado gota a gota. A reação foi agitada a 0°C durante 3 horas, dissipada com água (20 mL), lavada com água (100 mL x 2) e salmoura saturada (100 mL). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para fornecer o composto do título (45,6 g, rendimento: 100%).Etapa B:3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)pirrolidina-1-carboxi- lato de terc-butila Procedimento:
[0122] Carbonato de césio (37 g, 115 mmol, 3,0 eq.) e o composto 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (10 g, 38 mmol, 1,0 eq.) foram adicionados a uma solução de 3-(metilsulfonilóxi)pirrolidina-1- carboxilato de terc-butila (35 g, 134 mmol, 3,5 eq.) em DMF (300 mL). A reação foi agitada a 85°C durante 12 h. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo: acetato de etila = 1:1) para fornecer o composto do título (7,0 g, rendimento: 44%).Etapa C:3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidina-1-carboxilato de terc-butila Procedimento:
[0123] 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)pirrolidina- 1-carboxilato de terc-butila (8 g, 18 mmol, 1,0 eq.), 2-[2-fluoro-4-(2,3,5, 6-tetrafluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (10,7 g, 27 mmol, 1,5 eq.), fosfato de potássio (7,6 g, 36 mmol, 2,0 eq.) e PD- 118 (1,2 g, 1,8 mmol, 0,1 eq.) foram adicionados a uma mistura de 1,4- dioxano/água (180 mL, 5/1, v/v). A reação foi colocada sob atmosfera de nitrogênio e agitada a 60 °C durante 14 horas. A pós esfriar para a temperatura ambiente, a mistura de reação foi vertida em água gelada (50 mL) e extraída com acetato de etila (100 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromato- grafia em coluna de sílica-gel (eluente: acetato de etila: éter de petróleo = 1:1) para fornecer o composto do título (2,5 g, rendimento: 25%).Etapa D:3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-(pirrolidin-3-il)-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina Procedimento:
[0124] HCl/AE (20 mL, 4 mol/L) foram adicionados a uma solução de 3-[2-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidina-1-carboxilato de terc-butila (2,5 g, 4,4 mmol) em diclorometano (20 mL) a 0°C. A reação foi agitada durante 1 hora em temperatura ambiente e, então, concentrada sob pressão para proporcionar o cloridrato do composto do título (2,2 g, rendimento: 100%).Etapa E:1-[3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0125] Trietilamina (1,4 g, 12,8 mmol, 3,0 eq.) foi adicionada a uma solução de 3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-(pirrolidin-3- il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (2,2 g, 4,4 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (50 mL), então, cloreto de acriloíla (0,38 g, 4,2 mmol, 0,95 eq.) foi adicionado gota a gota a 0°C. A reaçã o foi agitada a 0°C durante 1 hora e dissipada com água (30 mL). A fase aquosa foi extraída com cloreto de metileno (30 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatogra- fia em coluna de sílica-gel (eluente: acetato de etila) para fornecer o composto do título (1,0 g, rendimento: 45%). Dados espectroscópicos:
[0126] LC/MS (método: UFLC): TR = 2,810 min; m/z = 517,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min. Etapa F:1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin -1-il]prop-2-en-1-ona1-[(S)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin -1-il]prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0127] Racemato de 1-[3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluoro- fenóxi)fenil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1- ona foi separado por meio de decomposição quiral SFC para fornecer o Composto 3 (270 mg) e Composto 4 (320 mg).Dados espectroscópicos:
[0128] LC/MS (método: UFLC): TR = 2,808 min; m/z = 517,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min. Exemplo 3 Composto 51-[(R)-3-[4-amino-3-[4--2-fluoro(3-fluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]prop-2-en-1-ona Etapa A:1-(3-fluoro-4-bromo-bromo-fenóxi)-3-benzeno Procedimento:
[0129] 1-fluoro-3-nitrobenzeno (29,6 g, 210 mmol, 1,0 eq.) e carbonato de potássio (58 g, 420 mmol, 2,0 eq.) foram adicionados a uma solução de 3-fluoro-4-bromofenol (40 g, 210 mmol, 1,0 eq.) em DMF (400 mL). A reação foi agitada a 90°C durante 12 ho ras sob uma atmosfera de nitrogênio. Após remoção do solvente sob pressão reduzida, a água (300 ml) foi adicionada ao resíduo e depois extraída com acetato de etila (300 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o composto do título (65 g, rendimento: 100%). Etapa B:3-(3-fluoro-4-bromo-fenóxi)benzenamina Procedimento:
[0130] Cloreto de amônio (28 g, 525 mmol, 2,5 eq.) e pó de ferro (58,8 g, 1,05 mol, 5,0 eq.) foram adicionados a uma solução de 1- bromo-2-fluoro-4-(3-nitrofenóxi)benzeno ( 65 g, 210 mmol, 1,0 eq.) em etanol (300 mL) e água (60 mL). A solução de reação foi submetida a refluxo durante 12 horas sob nitrogênio. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de HPLC C18 de fase inversa (fase móvel: acetonitrila/água/NH4HCO3 a 0,7%, gradiente de eluente de 10 % - 100 % (proporção em volume)). Após remoção do solvente volátil, a fração desejada foi liofilizada para fornecer o composto do título (19 g, rendimento: 23%).Etapa C:1-bromo-2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)benzeno Procedimento:
[0131] 3-(3-fluoro-4-bromo-fenóxi)benzenamina (9 g, 32 mmol, 1,0 eq.) foi adicionada à solução de piridina-ácido fluorídrico (30 mL), aos poucos, a -10°C. A mistura de reação resultante foi agitada a 0°C durante 30 minutos, esfriada para -10°C e, então, nit rito de sódio (2,42 g, 35 mmol, 1,1 eq.) foi adicionado aos poucos. A reação foi agitada a 20°C durante 30 minutos, então, a 60°C durante 14 h oras. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi vertida em etanol gelado (50 mL), diluída com uma solução saturada de NaHCO3 (50 mL) e de- pois extraída com acetato de etila (50 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de croma- tografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo) para fornecer o composto do título (5,8 g, rendimento: 64%).Etapa D:2-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano Procedimento:
[0132] 1-bromo-2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)benzeno (5,8 g, 20 mmol, 1,0 eq.), bis pinacolato-boronato (6,1 g, 24 mmol, 1,2 eq.), acetato de potássio (3,9 g, 40 mmol, 2,0 eq.) e [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloropaládio (0,89 g, 1,2 mmol, 0,06 eq.) foram dissolvidos em 1,4- dioxano (100 mL). A mistura de reação foi agitada a 85°C durante 14 horas sob uma atmosfera de nitrogênio. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo) para fornecer o composto do título (6,5 g, rendimento: 100%).Etapa E:3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimi- din-1-il]pirrolidina-1-carboxilato de (3R)-terc-butila Procedimento:
[0133] 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) pirrolidina -1-carboxilato de (R)-terc-butila (6,5 g, 15,0 mmol, 1,0 eq.), 2-[2-fluoro- 4-(3-fluorofenóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (6,5 g, 19,6 mmol, 1,3 eq.), fosfato de potássio ( 6,4 g, 30,1 mmol, 2,0 eq.) e PD-118 (0,25 g, 0,39 mmol, 0,01 eq.) foram adicionados a uma mistura de 1,4-dioxano/água (16 mL, 1/1, v/v). A mistura resultante foi agitada a 85°C durante 12 horas sob uma atmosfera de nitrogênio. Após esfriar para a temperatura ambiente, a mistura de reação foi diluída com água (50 mL) e depois extraída com acetato de etila (100 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente: acetato de eti- la) para fornecer o composto do título (4,2 g, rendimento: 55%).Etapa F:3-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-1-[(R)-pirrolidin-3-il]-1H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-4-amina Procedimento:
[0134] HCl/AE (10 ml, 4 mol/L) foram adicionados a uma solução de 3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-1H pirazolo[3,4-d]pirimidin- 1-il)pirrolidina-1-carboxilato de (3R)-terc-butila (4,2 g, 8,27 mmol) em diclorometano (15 mL) a 0°C. A reação foi agitada d urante 1 hora em temperatura ambiente e, então, concentrada sob pressão reduzida pa- ra fornecer o cloridrato do composto do título (3,7 g, rendimento: 92%).Etapa G:1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-1-il)pirrolidin -1-il)prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0135] Hidróxido de sódio (10%, 15,3 ml) e cloreto de acriloíla (0,67 g, 7,44 mmol, 0,9 eq.) foram adicionados sequencialmente gota a gota a uma solução de 3-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-1-[(R)- pirrolidin-3-il]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (3,7 g, 8,27 mmol, 1,0 eq.) em tetra-hidrofurano (20 mL) a 0°C . A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos, dissipada com NaHCO3 (20 mL) e extraída com diclorometano (30 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado por meio de croma- tografia em coluna de sílica-gel (eluente: éter de petróleo: acetato de etila = 1:0 a 1:1) para fornecer o composto do título (2,5 g, rendimento: 65%).Dados espectroscópicos:
[0136] LC/MS (método: UFLC): TR = 3,178 min; m/z = 463,0 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0137] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,36 (s, 1H), 7,53-7,49 (m,1H), 7,40-7,35 (m, 1H), 6,95-6,81 (m, 4H), 6,41-6,39 (m, 2H), 5,69-5,55 (m, 3H), 4,14-3,98 (m, 3H), 3,78-3,72 (m, 1H), 2,71-2,54 (m, 2H). Exemplo 4 Composto 6(E)-1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(3-fluorophenoxy)fenil]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]-3-deutério-prop-2-en-1-ona Etapa A:Ácido (E)-3-bromoacrílico Procedimento:
[0138] Uma mistura de ácido propiólico (1 g, 14,28 mmol, 1,0 eq.) e HBr (solução aquosa a 40%, 1,7 mL, 0,88 eq.) foi agitada durante a noite a 140°C . O solvente foi removido por meio de destilação sob pressão reduzida. O produto bruto obtido foi cristalizado a partir de água (4 x 3 mL) para fornecer o composto do título (0,76 g, rendimento: 35%).Dados espectroscópicos:
[0139] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,76 (d, 7- 14 Hz, 1H), 6,55 (d, 7 = 14 Hz, 1H). Etapa B:Ácido (E)-3-deutério-acrílico Procedimento:
[0140] Na-Hg (6 g, 49,67 mmol, 2,5 eq.) foi adicionado a uma solução de ácido (E)-3-bromoacrílico (3 g, 19,87 mmol, 1,0 eq.) em D2O (30 mL) a 0 - 5 o C. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 36 horas. A fase aquosa foi ajustada para um pH = 5 com ácido clorídrico a 1 M e depois extraída com dietil éter (20 mL x 5). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (0,52 g, rendimento: 36%).Dados espectroscópicos:
[0141] 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 7,76 (d, 7- 17,2 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 17,2 Hz, 1H).Etapa C:(E)-1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]-3-deutério-prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0142] Ácido (E)-3-deutério-acrílico (76 mg, 1,08 mmol, 1,0 eq.), HATU (530 mg, 1,40 mmol, 1,3 eq.) e N,N-di-isopropiletilamina (419 mg, 3,24 mmol, 3,0 eq.) foram adicionados a uma solução de 3-[2- fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-[(R)-pirrolidin-3-il]-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-4-amina (500 mg, 1,08 mmol, 1,0 eq.) em diclorometa- no (50 mL). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 12 horas e concentrada para fornecer o produto bruto, o qual foi purifica- do através de separação por meio de HPLC em uma coluna de fase inversa C18 (instrumento: 8A LC & Gilson 215, coluna coletora de fração: Synergi Max-RP 150 * 30mm * 4 μ , fase móvel A: água (HCl a 0,5%), fase móvel B: acetonitrila, taxa de fluxo: 30 mL/min, gradiente de B: 36% - 37%, 0-17 minutos). Após remoção do solvente volátil, a fração desejada foi liofilizada para fornecer o cloridrato do composto do título (76 mg, rendimento: 13%).Dados espectroscópicos:
[0143] LC/MS (método: UFLC): TR = 2,765 min; m/z = 518,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0144] 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,41 (s, 1H), 7,66 (t, J = 8,4Hz, 1H), 7,51-7,44 (m, 1H), 7,09-7,01 (m, 2H), 6,66-6,56 (m, 1H), 6,286,23 (m, 1H), 5,75-5,66 (m, 1H), 4,19-4,16 (m, 1H), 4,06-4.02 (m, 1,5H), 3,89-3,85 ( m, 1H), 3,78-3,72 (m, 0,5H), 2,63-2,49 (m, 2H). Exemplo 5 Composto 7(Z)-1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]-3-deutério-prop-2-en-1-ona Etapa A:Ácido (Z)-3-bromoacrílico Procedimento:
[0145] Uma mistura de ácido propiólico (1 g, 14,28 mmol, 1,0 eq.) e HBr (solução aquosa a 40%, 1,7 mL, 0,88 eq.) foi agitada durante a noite a 55°C . O solvente foi removido por meio de destilação sob pressão reduzida. O produto bruto obtido foi cristalizado a partir de éter de petróleo (4 x 3 mL) para fornecer o composto do título (0,3 g, rendimento: 14%).Dados espectroscópicos:
[0146] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,16 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 8,4 Hz, 1H) Etapa B:Ácido (Z)-3- deutério-acrílico Procedimento:
[0147] Na-Hg (6 g, 49,67 mmol, 2,5 eq.) foi adicionado a uma solução de ácido (Z)-3-bromoacrílico (3 g, 19,87 mmol, 1,0 eq.) em D2O (30 mL) a 0 - 5 o C. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 36 horas. A fase aquosa foi ajustada para um pH = 5 com ácido clorídrico a 1 M e depois extraída com dietil éter (20 mL x 5). As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (0,34 g, rendimento: 23%).Dados espectroscópicos:
[0148] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,14 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 5,96 (d, J = 10,4 Hz, 1H).Etapa C: (Z)-1-[(R)-3-[4-amino-3-[4--2-fluoro (2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]pirrolidin-1-il]-3-deutério-prop-2-en-1-ona Procedimento:
[0149] Ácido (Z)-3-deutério-acrílico (151 mg, 2,16 mmol, 1,0 eq.), HATU (1,06 g, 2,80 mmol, 1,3 eq.) e N,N-di-isopropiletilamina (838 mg, 6,48 mmol, 3,0 eq.) foram adicionados a uma solução de 3-[2-fluoro-4- (2,3,5,6-tetrafluorofenóxi)fenil]-1-[(R)-pirrolidin-3-il]-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-4-amina (1,0 g, 2,16 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (50 mL). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 12 horas e concentrada para fornecer o produto bruto, o qual foi purificado através de separação por HPLC em uma coluna C18 de fase reversa (instrumento: LC 8A & Gilson 215, coluna coletora de frações: Synergi Max- RP 150 * 30 mm, 4 μ , fase móvel A: água (HCl a 0,5%), fase móvel B: acetonitrila, taxa de fluxo: 30 mL/min, gradiente de B: 36% - 37%, 0 - 17 minutos). Após remoção do solvente volátil, a fração desejada foi liofilizada para fornecer o cloridrato do composto do título (228 mg; rendimento: 20%).Dados espectroscópicos:
[0150] LC/MS (método: UFLC): TR = 2,775 min; m/z = 518,1 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0151] 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,45 (s, 1H), 7,70 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,52-7,46 (m, 1 H), 7,13-7,05 (m, 2H), 6,71-6,61 (m, 1H), 5,80-5,73 (m, 2H), 4,23-4,20 (m, 1H), 4,09-4,04 (m, 1,5H), 3,93 3,90 (m, 1H), 3,80-3,75 (m, 0,5H ), 2,67-2,56 (m, 2H). Exemplo 6 Composto 7x1-[(R)-3-[4-amino-3-[2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil]-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-1-il]pirrolidin- 1-il]-butil-2-in-1-ona Procedimento:
[0152] Ácido 2-butinoico (41,17 mg, 489,72 μ mol, 1,00 eq.), HATU (93,10 g, 244,86 μ mol, 0,50 eq.) e DIPEA (75,95 mg, 587,66 pmol, 102,64 μ L, 1,20 eq.) foram adicionados em sequência a uma solução de 3-(2-fluoro-4-(3-fluorofenóxi)fenil)-1-((R)-pirrolidin-3-il)-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-4-amina (200,00 g, 489,72 μ mol, 1,00 eq.) em dicloro- metano (5,0 mL). A reação foi agitada em uma temperatura de 1518°C durante 2 horas e, então, concentrada e seca em um secador rotativo para se obter um produto bruto, o qual foi purificado por meio de HPLC em uma coluna C18 de fase reversa (fase móvel: acetonitri- la/HCl a 0,5%/água, gradiente de eluição de 22% a 52% (proporção em volume)). Após remoção dos componentes voláteis por meio de evaporação sob pressão reduzida, a fração desejada foi liofilizada para fornecer o cloridrato do composto do título (82 mg, rendimento: 33%). Dados espectroscópicos:
[0153] LC/MS (método: UFLC): TR = 3,057 min; m/z = 475,0 [M + H]+; tempo total de operação = 7 min.
[0154] 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 9,92 (s, 1H), 8,34 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,56 (br, 1H), 7,41-7,36 (m, 1H), 7,00-6,86 (m, 5H), 6,58 (br, 1H), 5,62-5,58 (m, 1H), 4,22-3,74 (m, 4H), 2,65-2,50 (m, 2H), 2,02-1,96 (m, 3H).
Ensaios In Vitro Ensaio de Inibição da Atividade de Quinase BTK:
[0155] A mistura de reação enzimática do ensaio HTRF padrão de BTK de tipo selvagem continha BTK de tipo selvagem a 1 nM, peptí- deo de biotina-TK1 a 1 μ M, ATP a 30 μ M de ATP e HEPES a 50 mM em um tampão. As reações enzimáticas foram realizadas em temperatura ambiente durante 60 minutos. 5 μ l de EDTA a 0,2 M foram adicionados para interromper a reação e, então, os inibidores (5 L) foram adicionados em concentrações finais de anticorpo XL665 de 2 nM e 62,5 nM. As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 60 minutos e, então, lidas no leitor de placas Envision. As leituras foram transformadas em taxa de inibição % por meio da equação (Proporção Min)/(Max-Min) * 100%. Assim, os dados de IC50 dos compostos de teste foram gerados usando ajuste de curva de quatro parâmetros.
Ensaio de Inibição de Atividade de Célula Tumoral:
[0156] Células tumorais (TMD-8, DoHH2 e WSU-DLCL2) foram transferidas e ligadas a placas com 96 cavidades. Depois de uma noite, tampão sem compostos e concentrações selecionadas (0,01 nM – 100 uM) da solução do composto de teste foram adicionadas. Após 48 horas de incubação, CellTiter-Go foi adicionado para submeter as célula à lise. Registros do sinal luminescente e alculus da inibição percentual de viabilidade das células foram feitos.
Ensaio In Vivo
[0157] Estudo Farmacocinético em Ratos SD Machos: Ratos SD machos para o estudo farmacocinético dentro 24 horas foram divididos em dois grupos: administração intravenosa e administração oral. Cada grupo tem três animais. Para o grupo com administração intravenosa, amostras de sangue foram coletadas antes da dose, a 0,0833, 0,167, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24 h pós-dose; para o grupo com administração oral, as amostras de sangue foram coletadas antes da dose, a 0,167, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24 h pós-dose. Após coleta de sangue, HPLC-MS/MS foi aplicada para determinar as concentrações plasmáticas de composto. Os parâmetros farmacocinéticos calculados para o grupo com administração intravenosa incluem clearance plasmática média (CLp), volume aparente médio da distribuição em estado estacionário (Vdss), área sob a curva (AUC) em 0-24 h, tempo médio de residência (MRT) em 0-24 h, meia-vida (T1/2). Os parâmetros farmacocinéticos calculados para o grupo com administração oral incluem concentração média máxima (Cmax), área sob a curva (AUC) em 0-24 h, tempo médio de residência (MRT) em 0-24 h; biodisponibilidade média relativa para o estudo.
[0158] Estudo Farmacocinético em Cães Beagle: Cães Beagle para o estudo farmacocinético dentro de 24 horas foram divididos em dois grupos: administração intravenosa (1 mg por kg) e administração oral (3 mg por kg). Cada grupo tem três animais. Para o grupo com administração intravenosa, amostras de sangue foram coletadas antes da dose, a 0,033, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 3, 6, 9, 24 h pós-dose; para o grupo com administração oral, as amostras de sangue foram coletadas antes da dose, a 0,083, 0,25, 0,5, 1, 3, 6, 9, 24 h pós-dose. Após coleta de sangue, HPLC-MS/MS foi aplicada para determinar as concentrações plasmáticas de composto. Os parâmetros farmacocinéticos calculados para o grupo com administração intravenosa incluem clearance plasmática média (CLp), volume aparente médio da distribuição em estado estacionário (Vdss), área sob a curva (AUC) em 0-24 h, tempo médio de residência (MRT) em 0-24 h, meia-vida (T1/2). Os parâmetros farmacocinéticos calculados para o grupo com administração oral incluem concentração média máxima (Cmax), área sob a curva (AUC) em 0-24 h, tempo médio de residência (MRT) em 0-24 h; bio- disponibilidade média relativa para o estudo.
Monoterapia e Terapia Combinada de Inibição de Modelo de Tumor TMD-8, DoHH2 ou WSU-DLCL2 em Animais:
[0159] Os resultados experimentais mostram que a eficácia de co- administração de um efeito sinérgico sobre os modelos de tumor sensível (modelo de tumor TMD-8), refratário (DoHH-2), bem como resistente a múltiplos fármacos (WSU-DLCL2) se mostrou melhor do que um efeito inibidor individual para o fármaco.
[0160] Um camundongo fêmea CB-17SCID foi usado em uma avaliação em modelo de xenoenxerto (compostos 3, 9, 14 e outros compostos listados na tabela) e o efeito antitumor conjunto da medicação foi avaliado. As células tumorais TMD-8, DoHH2, WSU- DLCL2 foram semeadas em meio RPMI-1640 a 10% que contém soro fetal de vitelo termicamente inativado e cultivadas sob condições de 37°C, 5% de CO2. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. Quando as células cresceram até a fase de crescimento exponencial, elas foram coletadas e contadas para inoculação do tumor. O lado direito de cada célula tumoral de camundongo foi inoculado por via subcutânea com 0,2 ml de suspensão de PBS (10 x 106) e Matrigel (1/1). O volume médio do tumor era de aproximadamente 100-200mm3 no início da administração. Cada grupo consistia em uma composição de 6-10 camundongos apenas. O grupo de teste (incluindo o grupo de controle, grupo com um único fármaco, grupo com coadministração) recebeu a dose predeterminada administrada por via oral, a qual foi administrada continuamente durante 14 dias ou 21 dias. Durante o experimento, o volume do tumor e peso corporal dos camundongos foram medidos a cada dois ou três dias.
Modelo de Artrite Induzida Por Colágeno:
[0161] Camundongos machos DBA/1 foram usados para o modelo de artrite induzida por colágeno in vivo para avaliar o efeito inibidor da terapia combinada de Composto 3 e Composto 14. Os camundongos foram divididos em oito grupos, incluindo um grupo de controle, um grupo de controle com solvente e cinco grupos de tratamento. Todos os camundongos (exceto o grupo normal) receberam 200 μ g de colá- geno bovino (tipo II) a 0 e 21 dias. Sete dias após imunização de reforço (28 dias), os animais começaram a mostrar sintomas da doença, com uma pontuação clínica média de cerca de 1. No mesmo dia, os camundongos imunizados foram divididos aleatoriamente em sete grupos: Composto 3 (1,5 mpk) e Composto 14 (0,15 mpk) coadminis- trados duas vezes por dia; Composto 3 (4,5 mpk) e Composto 14 (0,45 mpk) administrados em combinação dia duas vezes; Composto 14 (0,15 mpk) coadministrado com Composto 3 (1,5 mpk); monoterapia com Composto 3, uma vez por dia (1,5 mpk), monoterapia com Composto 14, uma vez por dia (1,5 mpk); grupo de controle positivo (0,2 mg/kg de dexametasona) e a administração iniciada. Realizar administração oral durante duas semanas, registrar o peso e pontuação clínica. Ao final do estudo, os animais foram sacrificados e os membros traseiros foram coletados para análise histopatológica.
Modelo de Artrite Induzida Por Adjuvante:
[0162] Ratos Lewis fêmeas foram usados para o modelo de artrite induzida por adjuvante para avaliar o efeito inibidor da terapia combinada de Composto 3 e Composto 14 in vivo . Todos os ratos (com exceção do grupo de controle) receberam, no dia 0, uma injeção no membro posterior esquerdo de adjuvante completo de Freund (CFA) para imunização. 6 dias após imunização, alguns dos ratos começa- ram a mostrar sintomas clínicos de artrite, tais como vermelhidão e inchaço. Aos 13 dias, os animais foram novamente imunizados com uma combinação de sete grupos: grupo de controle com solvente, Composto 3 (5 mpk) e Composto 14 (0,5 mpk) coadministrados duas vezes por dia; Composto 3 (15 mpk) e Composto 14 (1,5 mpk) co- dministrados duas vezes por dia; Composto 14 (3 mpk) coadministrado com Composto 3 (30 mpk) uma vez por dia; monoterapia com Composto 3 (5 mpk), duas vezes por dia; monoterapia com Composto 14 (0,5 mpk) duas vezes por dia; grupo de controle positivo (Composto 11, 3 mpk, duas vezes por dia) e a administração iniciada. Realizar administração oral durante três semanas, registrar o peso a cada dois dias, pontuação clínica e volume da pata. Ao final do estudo, os animais foram sacrificados para coleta do membro direito traseiro para coloração HE para análise histopatológica. Tabela 2. Dados de inibição de atividade de BTK pelos compostos nos exemplos da presente invenção Tabela 3. Inibição de composto individual na linhagem de células TMD-8 (Inib. %) Nota: Os compostos 3, 6, 7, 8-19 nesta tabela correspondem aos res- pectivos "nomes de compostos em Chinês ou Inglês" conforme indicado, em que os compostos 3, 6 e 7 referem-se aos compostos nos exemplos da presente invenção, enquanto que os compostos 8-19 re- ferem-se aos compostos correspondentes no estado da técnica. Por uma questão de conveniência para escrita, um número identificador foi fornecido a um composto correspondente. Portanto, os números de identificador dos compostos também terão o mesmo significado daqui em diante. Tabela 4. Inibição de composição de "dois em um" sobre a linhagem de células TMD-8 (Inib. %)
[0163] Pode ser visto a partir da Tabela 4 que as combinações farmacêuticas "dois em um" demonstraram uma inibição significativa da viabilidade de células tumorais. Dentre elas, as combinações far-macêuticas de composto 8 mais composto 13, composto 14 mais composto 13, composto 15 mais composto 13 e composto 3 mais composto 13 demonstraram inibição altamente eficaz da viabilidade de células TMD-8.Tabela 5. Inibição da composição "três em um" na linhagem de células TMD-8 (Inib. %)
[0164] Pode ser visto a partir da Tabela 5 que as combinações farmacêuticas "três em um" demonstraram efeito inibidor significativo sobre a viabilidade da célula tumoral. Dentre elas, a combinação far-macêutica de composto 3 mais composto 14 mais composto 12 e a combinação farmacêutica de composto 3 mais composto 8 mais composto 12 demonstrou um efeito inibidor elevado de até 95% sobre a viabilidade das células tumorais, mesmo quando a concentração de inibidor de BTK era tão baixa quanto 10 nM.Tabela 6. Inibição de composto individual e composição "três em um" sobre a linhagem de células resistente WSU-DLC2 (Inib. %)
[0165] Pode ser visto a partir da Tabela 6 que a combinação far- macêutica "três em um" de composto 3 mais composto 15 mais composto 14 demonstrou um excelente efeito inibidor da viabilidade celular de células WSU-DLCL2 resistentes a múltiplos fármacos e foi significa-tivamente melhor do que cada fármaco dirigido a um único alvo.Tabela 7. Inibição de composto individual e a composição "três em um" sobre a linhagem de células DoHH-2 (Inh%)
[0166] Pode ser visto a partir da Tabela 7 que a composição far- macêutica "três em um" de composto 3 mais composto 15 mais composto 14 demonstrou excelente efeito inibidor de viabilidade celular de células resistentes DoHH-2 e foi significativamente melhor do que cada fármaco dirigido a um único alvo.Tabela 8. Inibição de composições com diferentes proporções sobre a linhagem de células TMD-8 (Inib. %)
[0167] Pode ser visto a partir da Tabela 8, que as combinações farmacêuticas "três em um" em várias proporções demonstraram efeito inibidor significativo sobre a viabilidade celular de células TMD-8.Tabela 9. Parâmetros PK de composto 3 em ratos Tabela 10. Parâmetros PK de composto 3 em cães Tabela 11. Parâmetros PK de composto 3 em ratos Tabela 12. Parâmetros PK de composto 3 em cães Tabela 13: Efeito inibidor de administração de um fármaco individual e combinações farmacêuticas sobre células tumorais em um modelo animal de tumor
[0168] Pode ser visto a partir da Tabela 13 que a administração do fármaco em combinação teve efeito sinérgico e aditivo sobre a capacidade letal em células tumorais. O efeito terapêutico de administração combinada foi muito melhor do que cada fármaco dirigido a um único alvo. Por exemplo, a administração da combinação "dois em um" do composto 3 mais composto 14 pode resultar no desaparecimento completo de células tumorais em um período de tratamento de 15 dias. Enquanto isso, a administração da combinação "três em um" de composto 3 mais composto 14 mais composto 15 pode resultar em desa- parecimento completo de células tumorais em um período de tratamento mais curto (9 dias) e nenhuma recuperação de crescimento do tumor foi observada em 12 dia após a administração ser interrompida, o que indica um efeito terapêutico significativamente melhor do que os fármacos dirigidos a um único alvo.Tabela 14. Influência da administração de combinações farmacêuticas sobre o peso corporal em modelo de tumor animal
[0169] Pode ser visto a partir da Tabela 14 que os animais em diferentes grupos não mostraram diferença significativa no peso corporal, indicando que era seguro administrar as combinações de fármacos em doses baixas.Tabela 15. Influência da administração de uma combinação farmacêutica 3/14/15 sobre o peso corporal em um modelo de tumor animal
[0170] Pode ser visto a partir da Tabela 15 que animais em dife- rentes grupos não mostraram diferença significativa peso corporal, in-dicando que era seguro administrar as combinações de fármacos em doses baixas.Tabela 16. Volume do pé - artrite induzida por adjuvante
[0171] Pode ser visto a partir da Tabela 16 que a combinação far macêutica "dois em um" foi mais eficaz do que os fármacos individuais.Tabela 17. Pontuação patológica - artrite induzida por adjuvante
[0172] Pode ser visto a partir da Tabela 17 que a combinação far- macêutica "dois em um" foi mais eficaz do que os fármacos individuais.
[0173] Tabela 18. Pontuação média de avaliação clínica a partir do dia 21 após imunização inicial - artrite induzida por colágeno
[0174] Pode ser visto a partir da Tabela 18 que as combinações farmacêuticas "dois em um" são mais eficazes do que os fármacos in-dividuais. Tabela 19. Pontuação patológica- artrite induzida por colágeno
[0175] Pode ser visto a partir da Tabela 19 que as combinações farmacêuticas "dois em um" são mais eficazes do que os fármacos in-dividuais.

Claims (21)

1. Uso de um inibidor Bruton tirosina quinase (BTK), carac-terizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de linfoma, em que o inibidor BTK é usado em combinação com um inibidor de quinase alvo de rapamicina em mamíferos (mTOR) e um fármaco imunomodulador (IMiD).
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é um composto representado pela Fórmula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb): em que: R1 é F; n é 1, 2, 3 ou 4; R2 é F; m é 1 ou 2; R3 é H ou D, ou ou um enantiômero, diastereômero ou sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é selecionado do grupo que consiste em Composto 1, Composto 2, Composto 3, Composto 4, Composto 5, Com-posto 6, Composto 7 e Composto 7x como demonstrado na Tabela 1, ou um enantiômero, diastereômero ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é ibrutinibe ou um sal farmaceuticamente do mesmo.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o inibidor de quinase mTOR é everoli- mus ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o inibidor de quinase mTOR é rapami- cina ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o IMiD é talidomida, lenalidomida, pomalidomida, CC-122 ou CC-220 ou um sal farmaceuticamente acei-tável do mesmo.
8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é o Composto 3 como demonstrado na Tabela 1, ou um enantiômero, diastereômero ou sais farmaceuticamente acei-táveis dos mesmos; o inibidor de quinase mTOR é everolimus ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e o IMiD é pomalidomida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o medicamento ainda compreende o inibidor de quinase mTOR, ou o IMiD ou ambos.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende: (i) ibrutinibe, Composto 3 ou Composto 5; (ii) everolimus ou rapamicina; e (iii) talidomida, lenalidomida ou pomalidomida.
11. Uso de um inibidor Bruton tirosina quinase (BTK), carac-terizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um linfoma, em que o inibidor BTK é usado em combi-nação com um alvo de mamífero de inibidor de quinase rapamicina (mTOR) e um inibidor de um linfoma 2 de célula B (Bcl-2).
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é um composto representado pela Fór-mula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) e (IIb): em que: R1 é F; n é 1, 2, 3 ou 4; R2 é F; m é 1 ou 2; R3 é H ou D, ou ou um enantiômero, diastereômero ou sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos.
13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é selecionado do grupo que consiste em Composto 1, Composto 2, Composto 3, Composto 4, Composto 5, Com-posto 6, Composto 7 e Composto 7x como demonstrado na Tabela 1, ou um enantiômero, diastereômero ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é ibrutinibe ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o inibidor de quinase mTOR é eve- rolimus ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o inibidor de quinase mTOR rapa- micina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que o inibidor Bcl-2 é venetoclax ou sabutoclax, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
18. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor BTK é o Composto 3 como demonstrado na Tabela 1, ou um enantiômero, diastereômero ou sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos; o inibidor de quinase mTOR é everoli- mus ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e o inibidor Bcl- 2 é venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que o medicamento ainda compreende o inibidor de quinase mTOR, ou o inibidor Bcl-2 ou ambos.
20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende: (i) ibrutinib, Composto 3, Composto 5; (ii) everolimus ou rapamicina; e (iii) venetoclax ou sabutoclax.
21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o linfoma é selecionada do grupo que consiste em incluindo linfoma difuso de célula B grande (DLBCL), lin- foma linfocítico de células pequenas (SLL), linfoma folicular, leucemia linfocítica crônica (CLL), macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma das células do manto (MCL) e mieloma múltiplo (MM).
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