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BR112016027884B1 - Variante de uma xilanase da família 11 de gh genitora, polinucleotídeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos de produção de uma variante de xilanase da família 11 de gh e de degradação de um material contendo xilana - Google Patents

Variante de uma xilanase da família 11 de gh genitora, polinucleotídeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos de produção de uma variante de xilanase da família 11 de gh e de degradação de um material contendo xilana Download PDF

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BR112016027884B1
BR112016027884B1 BR112016027884-4A BR112016027884A BR112016027884B1 BR 112016027884 B1 BR112016027884 B1 BR 112016027884B1 BR 112016027884 A BR112016027884 A BR 112016027884A BR 112016027884 B1 BR112016027884 B1 BR 112016027884B1
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xylanase
amino acid
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Inventor
James Lavigne
Brian R. Scott
Daniel Sebastian Kolczynski
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Novozymes A/S
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Publication date
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Abstract

VARIANTE DE XILANASE DA FAMÍLIA II DE GH, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA VARIANTE DE XILANASE DA FAMÍLIA II DE GH E DE DEGRADAÇÃO DE UM MATERIAL. A presente invenção refere-se a variantes de xilanase da Família 11 de GH. A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam as variantes; a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e a métodos de uso das variantes.

Description

Referência a uma Listagem de Sequências
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências em suporte informático legível, que é incorporada aqui por referência.
Fundamentos da Invenção Campo da Invenção
[002] A presente invenção se refere a variantes de xilanases da Família 11 de GH, a polinucleotídeos que codificam as variantes, a métodos de produção das variantes, e a métodos de uso das variantes.
Descrição da Técnica Relacionada
[003] A xilana, um componente principal da hemicelulose de plantas, é um polímero de D-xilose ligada por ligações beta-1,4-xilosídicas. A xilana pode ser degradada em xilose e xilo-oligômeros por hidrólise ácida ou enzimática. A hidrólise enzimática da xilana produz açúcares livres sem os subprodutos formados com ácido (por exemplo, furanos).
[004] As xilanases podem ser usadas em várias aplicações tais como na quebra enzimática de resíduos agrícolas para a produção de combustíveis alcoólicos, no tratamento enzimático de rações para animais para liberar açúcares livres, no tratamento enzimático para dissolver polpa na preparação de celulose e no tratamento enzimático durante o biobranqueamento de polpa. Em particular, a xilanase é útil na indústria de papel e polpa para aumentar o brilho de polpa branqueada, melhorar a qualidade da polpa, diminuir a quantidade de cloro usada nas etapas de branqueamento químico da polpa e para soltar a polpa em processos de reciclagem de papel.
[005] Dumon et al., 2008, Journal of Biological Chemistry 283:22557-22564, descrevem a manipulação para conseguir hipertermoestabilidade em uma xilanase GH11. Wang e Tao, 2008, Biotechnology Letters 30: 937-944, divulgam o aumento da atividade e estabilidade em pH alcalino da xilanase A de Thermobifida fusca por evolução direcionada.
[006] As patentes U.S N.°s 5.759.840, 7.510.860 e 7.695.947 divulgam modificações de xilanases da Família 11 para melhorar a termofilicidade, alcalofilicidade e termoestabilidade. A patente U.S N.° 7.060.482 divulga xilanases modificadas compreendendo um aminoácido básico na posição 162 correspondendo à sequência de aminoácidos da xilanase de Trichoderma reesei (TrX) , ou na posição equivalente em outras moléculas de xilanase, pelo menos uma ponte dissulfeto ou uma combinação destes. A patente U.S N.° 7.314.743 divulga uma xilanase modificada que tem pelo menos um resíduo de aminoácido substituído numa posição que corresponde à sequência de aminoácidos da xilanase II de Trichoderma reesei. A WO 2007/115391 divulga uma enzima xilanase da Família 11 modificada compreendendo resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 correspondendo à sequência de aminoácidos da xilanase II de Trichoderma reesei para formar uma ponte dissulfeto intramolecular.
[007] A presente invenção proporciona variantes de uma xilanase com propriedades melhoradas em comparação com a enzima genitora.
Sumário da Invenção
[008] A presente invenção se refere a variantes de uma xilanase da Família 11 de GH, compreendendo substituições de aminoácidos em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, em que as variantes têm termoestabilidade, termoatividade e/ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados.
[009] A presente invenção se refere a variantes de uma xilanase da Família 11 de GH, compreendendo substituições de aminoácidos em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 49, 55, 79, 82, 105, 155 e 215 de SEQ ID NO: 8, em que as variantes têm termoestabilidade, termoatividade e/ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados.
[0010] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam as variantes; a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e a métodos de produção das variantes.
[0011] A presente invenção se refere adicionalmente a métodos de degradação de material contendo xilana compreendendo tratar o material com uma tal variante.
[0012] A presente invenção se refere também a métodos de tratamento de uma polpa, compreendendo colocar a polpa em contato com uma tal variante.
[0013] A presente invenção se refere adicionalmente a métodos de produção de xilose, compreendendo colocar um material contendo xilana em contato com uma tal variante.
Breve Descrição das Figuras
[0014] A Figura 1 mostra o mapa do vetor YEp352/PGKxylss- HTX47A usado para expressar as variantes de xilanase GH11 de Saccharomyces cerevisiae e realizar a mutagênese aleatória.
[0015] A Figura 2 mostra os dados de termoatividade de um ciclo completo de rastreamento. A atividade de xilanase à temperatura elevada (79 °C) está representada graficamente no eixo y e a atividade de xilanase à temperatura baixa (65 °C) está representada graficamente no eixo x tanto para as variantes de xilanase GH11 como para os controles de xilanase genitora.
[0016] A Figura 3 mostra os perfis de termoatividade para uma xilanase GH11 genitora (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+Q125A+I129E+T131N) e uma variante de xilanase GH11 (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105Y+ Y118C+Q125A+I129E+T131N). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
[0017] A Figura 4 mostra os perfis de termoatividade para uma xilanase GH11 genitora (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+Q125A+I129E+T131N) e uma variante de xilanase GH11 (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+Q125A+I129E+T131N+Q162H). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
[0018] A Figura 5 mostra os perfis de termoatividade para uma xilanase GH11 genitora (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+Q125A+I129E+T131N) e uma variante de xilanase GH11 (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+T120S+Q125A+I129E+T131N). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
[0019] A Figura 6 mostra os perfis de termoatividade para uma xilanase GH11 genitora (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+T120S+Q125A+I129E+T131N+Q162H+F180Y) e uma variante de xilanase GH11 (TrXyn2+N10D+N11D+G24C+ Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+Y118C+T120S+Q125A+I 129E+T131N+Q162H+F180Y). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
[0020] A Figura 7 mostra os perfis de termoatividade para uma xilanase GH11 genitora (TrXyn2+N10D+N11D+G24C+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L 105H+Y118C+T120S+Q125A+I129E+T131N+Q162H+F180Y) e uma variante de xilanase GH11 (TrXyn2+N10D+N11D+ Y17F+G24C+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+Y118C+T1 20S+Q125A+I129E+T131N+Q162H+F180Y). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
[0021] A Figura 8 mostra os perfis de termoatividade para uma xilanase GH11 do tipo selvagem (xynII de T. reesei, "wt"), uma xilanase GH11 genitora (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105H+ Y118C+Q125A+I129E+T131N) e duas variantes da xilanase GH11 (TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L+S40R+K58R+S75A+S99C+L105Y+ Y118C+T120S+Q125A+I129E+T131N e TrXyn2+N10D+N11D+Y27M+N29L +S40R+K58R+S75A+S99C+L105Y+Y118C+T120S+Q125A+I129E+T131N +Q162H+F180Y). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
[0022] A Figura 9 mostra os dados de perfil de atividade alterado em relação ao pH de um ciclo completo de rastreamento. A atividade de xilanase ao pH baixo (pH 3) está representada graficamente no eixo y e a atividade de xilanase ao pH alto (pH 5) está representada graficamente no eixo x tanto para as variantes de xilanase GH11 como para os controles de xilanase genitora.
[0023] A Figura 10 mostra os perfis de atividade em relação ao pH para uma xilanase GH11 genitora (HTX47A) e três variantes de xilanase da Família 11 de GH (TS004, TS011 e TS012). A atividade relativa foi calculada por divisão da atividade a cada temperatura pela atividade máxima.
Definições
[0024] Xilanase: O termo "xilanase" significa uma 1,4-beta-D-xilana- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanas. A atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e fosfato de sódio 200 mM com pH alterado a pH 6 a 37 °C, e uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μ mol de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio 200 mM pH 6. Os Exemplos 6 e 8 descrevem um ensaio de xilanase que mede a liberação de açúcares redutores de arabinoxilana de trigo.
[0025] A hidrólise de polissacarídeos pode ser também monitorada por métodos cromatográficos que separam e quantificam mono-, di- e oligossacarídeos solúveis liberados pela enzima. Um método adicional envolve determinação da mudança na viscosidade com o tempo à medida que a enzima atua no substrato. Adicionalmente, substratos colorimétricos solúveis podem ser incorporados em meio com ágar no qual um micróbio hospedeiro expressando e secretando uma xilanase da Família 11 de GH genitora ou variante é cultivado. Em um tal ensaio em placa de ágar, a atividade da xilanase é detectada como um halo colorido ou incolor em torno da colônia microbiana individual expressando e secretando uma xilanase ativa. A atividade específica de uma xilanase da Família 11 de GH é determinada por medição da atividade da enzima, tipicamente em unidades de quantidade de xilose ou açúcar redutor liberada por unidade de tempo dividida pelo peso da enzima. Por exemplo, a atividade específica pode ser determinada em unidades de micromols de xilose produzida por minuto por miligrama de enzima.
[0026] Xilanase da Família 11 de GH: Como usado aqui, o termo "xilanase da Família 11" ou "xilanase GH11" engloba uma xilanase que contém um domínio catalítico da Família 11 de glico-hidrolases (GH). Todos os domínios catalíticos de xilanases da Família 11 de fontes bacterianas e fúngicas possuem a mesma estrutura molecular geral compreendendo principalmente beta-folhas, voltas e uma única alfa-hélice. O alinhamento das sequências de aminoácidos de 82 xilanases da Família 11 variando em comprimento de 173 a 220 aminoácidos e abrangendo uma faixa ampla de pontos isoelétricos (pI 3,5 a 10,25), pH ótimo (2,0 a 8,0) e temperatura ótima (45 °C a 75 °C) identificou sequências características altamente conservadas nas fitas beta B5, B6 e B8, bem como na alfa-hélice (Sapag et al., 2002). Ademais, a estrutura secundária das xilanases da Família 11 é altamente conservada. Comparações pareadas dos átomos de C alfa de dez xilanases da Família 11 exibindo 31 a 97% de identidade nas sequências de aminoácidos usando coordenadas estruturais do banco de dados de proteínas, Protein Data Bank (PDB), mostraram que o desvio da raiz média quadrada (rmsd, do inglês "root-mean-square deviation") variou de 0,6 a 1,4 (Hakulinen et al. 2003; aqui incorporada por referência). Ademais, todas as xilanases da Família 11 contêm dois resíduos de glutamato conservados nas posições 86 e 177 (baseadas na numeração de aminoácidos da xilanase II de Trichoderma reesei (TrX II ou Tr2)), que estão localizados nas fitas beta B4 e B5 (Torronen e Rouvinen, 1995; Sapag et al., 2002, que são aqui incorporadas, cada uma, por referência).
[0027] Dada a estrutura altamente conservada entre as xilanases da Família 11, um perito na técnica pode aplicar métodos conhecidos, incluindo as abordagens delineadas no presente documento, para aumentar a termoatividade e/ou termoestabilidade, ou alterar o perfil de atividade em relação ao pH, de qualquer xilanase da Família 11. Exemplos não limitativos de xilanases da Família 11 são apresentados em Sapag et al. (2002) e Hakulinen et al. (2003) e revelados no URL: cazy.org/fam/GH11.html, os quais são aqui incorporados, cada um, por referência.
[0028] Material contendo xilana: O termo "material contendo xilana" significa qualquer material compreendendo um polissacarídeo da parede celular de plantas contendo uma estrutura principal de resíduos de xilose beta-(1-4) ligados. As xilanas de plantas terrestres são heteropolímeros possuindo uma cadeia principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias curtas de carboidratos. Compreendem ácido D- glucurônico ou seu éter 4-O-metílico, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos, compostos por D-xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose, e D-glicose. Os polissacarídeos do tipo xilana podem ser divididos em homoxilanas e heteroxilanas, que incluem glucuronoxilanas, (arabino)glucuronoxilanas, (glucurono)arabinoxilanas, arabinoxilanas e heteroxilanas complexas. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.
[0029] Nos processos da presente invenção pode ser usado qualquer material contendo xilana. Em um aspecto preferencial, o material contendo xilana é lignocelulose.
[0030] Atividade de degradação de xilana ou atividade xilanolítica: O termo "atividade de degradação de xilana" ou "atividade xilanolítica" significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilana. As duas abordagens básicas para medição da atividade xilanolítica incluem: (1) medição da atividade xilanolítica total, e (2) medição das atividades xilanolíticas individuais (por exemplo, endoxilanases, beta- xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetilxilana esterases, feruloil esterases e alfa-glucuronil esterases). O progresso recente em ensaios de enzimas xilanolíticas foi resumido em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86 (11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, FEBS Letters 580 (19): 4597-4601; Herrmann et al., 1997, Biochemical Journal 321: 375-381.
[0031] A atividade de degradação total de xilana pode ser medida por determinação dos açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilana, incluindo, por exemplo, xilanas de espelta aveia, madeira de faia, madeira de bétula e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilana corada liberados de várias xilanas covalentemente coradas. O ensaio mais comum de atividade xilanolítica total é baseado na produção de açúcares redutores a partir de 4-O-metil glucuronoxilana polimérica como descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de degradação de xilana é preferencialmente determinada por medição do aumento na hidrólise de xilana de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, EUA) por enzima(s) de degradação de xilana sob as seguintes condições típicas: Reações de 1 ml, 5 mg/ml de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio a 50 mM pH 5, 50 °C, 24 horas, análise de açúcares usando ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279.
[0032] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0033] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de RNAm madura, processada por splicing, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntrons que possam estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de RNAm que é processado através de uma série de passos, incluindo splicing (encadeamento), antes de aparecer como RNAm maduro processado.
[0034] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. Os limites da sequência codificante são geralmente determinados por uma fase de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser RNA, RNA mensageiro ou RNAm, DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma combinação destes.
[0035] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa do (ou seja, do mesmo gene) ou estranha (ou seja, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, terminador transcricional e sinais de terminação translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo que codifica uma variante.
[0036] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.
[0037] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.
[0038] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de xilanase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 185 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 1 a 185 ou 6 a 190 de SEQ ID NO: 2), pelo menos 180 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 6 a 185 ou 1 a 180 ou 10 a 190 de SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 170 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 10 a 180 de SEQ ID NO: 2).
[0039] Condições de alta estringência: O termo "condições de alta estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 65 °C.
[0040] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares, com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[0041] Propriedade melhorada: O termo "propriedade melhorada" significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação com o genitor. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, atividade térmica, termoestabilidade, estabilidade sob condições de armazenamento, atividade específica, ligação ao substrato, clivagem do substrato, especificidade do substrato, eficiência catalítica, taxa catalítica, atividade de pH, estabilidade de pH, estabilidade do substrato, propriedades da superfície, estabilidade química e estabilidade de oxidação.
[0042] Isolado(a): O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante de enzima, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância; enriquecimento da substância dentro de uma composição). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
[0043] Condições de baixa estringência: O termo "condições de baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 50 °C.
[0044] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 1 a 190 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 34 a 223 de SEQ ID NO: 3, conforme determinado por sequenciamento N-terminal da proteína Xyn2 de T. reesei purificada (Saaraleinen et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 241: 497-503). A análise da sequência de aminoácidos de comprimento total de SEQ ID NO: 3 usando um programa que prevê peptídeos sinal, por exemplo, SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), prevê um sítio de clivagem por peptidase sinal entre os aminoácidos 19 e 20 de SEQ ID NO: 3. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.
[0045] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro consiste nos nucleotídeos 100 a 272 e 381 a 777 de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 contém um íntron consistindo nos nucleotídeos 273 a 380. Evidência experimental (Saaraleinen et al., 1993,) determinou que os nucleotídeos 1 a 99 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em outro aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro consiste nos nucleotídeos 84 a 693 de SEQ ID NO: 7.
[0046] Condições de média estringência: O termo "condições de média estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 55 °C.
[0047] Condições de estringência média-elevada: O termo "condições de estringência média-elevada" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 60 °C.
[0048] Mutante: O termo "mutante" ou "mutado" se refere a um polinucleotídeo que codifica uma variante.
[0049] Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outro modo não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.
[0050] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.
[0051] Xilanase genitora ou parental: O termo "genitor", "xilanase genitora" ou "xilanase parental" significa uma xilanase na qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O genitor pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente (tipo selvagem) ou uma variante ou um fragmento deste. Em um aspecto, a xilanase genitora é uma xilanase de Trichoderma reesei da Família 11 de GH. Em outro aspecto, a xilanase genitora de Trichoderma reesei da Família 11 de GH é uma xilanase II que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a xilanase genitora de Trichoderma reesei da Família 11 de GH é uma xilanase II variante que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, contendo as seguintes substituições de aminoácidos N10H + Y27M + N29L + S75A + L105H + Q125A + I129E + N11D + S40R + K58R + S99C + Y118C + T131N. Em outro aspecto, a xilanase genitora compreende os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8. Outras xilanases genitoras da Família 11 de GH incluem, mas não estão limitadas a, as xilanases da Família 11 de GH conhecidas mostradas na Tabela 1.Tabela 1: Exemplos de xilanases conhecidas da Família 11
Figure img0001
[0052] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrita pelo parâmetro "identidade de sequências".
[0053] Para os propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)
[0054] Para os propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências desoxirribonucleotídicas é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento).
[0055] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo com um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento que tem atividade de enzima. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 555 nucleotídeos (por exemplo, os nucleotídeos 100 a 272 e 381 a 762 ou os nucleotídeos 115 a 272 e 381 a 777 de SEQ ID NO: 1), pelo menos 540 nucleotídeos (por exemplo, os nucleotídeos 100 a 272 e 381 a 747, ou os nucleotídeos 115 a 272 e 381 a 762, ou os nucleotídeos 130 a 272 e 381 a 777 de SEQ ID NO: 1), ou pelo menos 510 nucleotídeos (por exemplo, os nucleotídeos 130 a 272 e 381 a 747 de SEQ ID NO: 1).
[0056] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade de xilanase compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa a substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa a adição de um aminoácido adjacente e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de xilanase do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0057] Condições de muito alta estringência: O termo "condições de muito alta estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 70 °C.
[0058] Condições de muito baixa estringência: O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 45 °C.
[0059] Xilanase de tipo selvagem: O termo xilanase de "tipo selvagem" significa uma xilanase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza.
Convenções para Designação de Variantes
[0060] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2 (Xyn2 ou TrXyn2 de T. reesei) é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra xilanase da Família 11 de GH. A sequência de aminoácidos de outra xilanase da Família 11 de GH é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2 e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).
[0061] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra xilanase da Família 11 de GH pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.
[0062] Quando a outra xilanase da Família 11 de GH divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 tal que a comparação tradicional à base de sequências não consiga detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequências pareadas. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê o dobramento estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.
[0063] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
[0064] Ao descrever as variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC aceite.
[0065] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Assim, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como "Thr26Ala" ou "T26A". Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Gly20Arg + Ser41Phe" ou "G20R + S41F", representando substituições nas posições 20 e 41 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.
[0066] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Assim, a deleção de glicina na posição 175 é designada como "Gly175*" ou "G175*". Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Gly175* + Ser41*" ou "G175* + S41*".
[0067] Inserções. Para uma inserção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Assim, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada "Gly175GlyLys" ou "G175GK". Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 175 é indicada como "Gly175GlyLysAla" ou "G175GKA".
[0068] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria então:
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[0069] Substituições múltiplas de aminoácidos. Variantes compreendendo substituições múltiplas de aminoácidos são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr+Gly175Glu” ou “R170Y+G175E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 175 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.
[0070] Substituições diferentes de aminoácidos. Onde substituições diferentes de aminoácidos podem ser introduzidas em uma posição, as substituições diferentes de aminoácidos são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa as seguintes variantes: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" e "Tyr167Ala+Arg170Ala".
Descrição Detalhada da Invenção
[0071] A presente invenção se refere a variantes de xilanases da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de xilanase.
Variantes
[0072] A presente invenção proporciona variantes de xilanases da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase.
[0073] Em uma modalidade, a variante tem identidade de sequências de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência de aminoácidos da xilanase genitora.
[0074] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[0075] Em um aspecto, o número de substituições de aminoácidos nas variantes da presente invenção é 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições de aminoácidos.
[0076] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições de aminoácidos conservativas ou inserções que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1 a 20 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tais como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epitopo antigênico ou um domínio de ligação.
[0077] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.
[0078] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a termoestabilidade e/ou atividade térmica do polipeptídeo, mudar o perfil de atividade em relação ao pH, e similares. Por exemplo, as variantes podem compreender uma substituição de Thr por Ser na posição 120 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma substituição de Tyr por Phe na posição 17 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma substituição de Gly por Cys na posição 24 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma substituição de Val por Ile na posição 46 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma substituição de Lys por Met ou Lys por Glu na posição 49 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma substituição de Asn por Asp na posição 69, e uma substituição de Phe por Tyr na posição 180 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0079] Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácidos em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácidos em duas posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácidos em três posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácidos em quatro posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácidos em cinco posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácidos em seis posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, uma variante compreende uma substituição de aminoácido em cada posição correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2.
[0080] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 120 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 120 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ser. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição T120S de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0081] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 17 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 17 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ile. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição Y17F de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0082] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 24 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 24 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Cys. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição G24C de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0083] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 46 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 46 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr, preferencialmente por Ile. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição V46I de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0084] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 49 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 49 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Met ou Glu. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição K49M de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em ainda outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição K49E de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0085] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 69 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 69 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Asp. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição N69D de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0086] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 180 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 180 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Tyr. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição F180Y de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[0087] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 10 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 10 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Gln, Tyr ou Arg. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição N10Q, N10Y ou N10R de SEQ ID NO: 2.
[0088] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 105 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 105 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Tyr. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição L105Y de SEQ ID NO: 2.
[0089] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120 e 17 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0090] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120 e 24 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0091] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0092] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0093] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0094] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0095] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17 e 24 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0096] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0097] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0098] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[0099] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00100] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00101] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00102] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00103] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00104] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 46 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00105] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 46 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00106] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 46 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00107] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00108] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00109] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00110] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17 e 24 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00111] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00112] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00113] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00114] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00115] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00116] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00117] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00118] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00119] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 46 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00120] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 46 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00121] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 46 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00122] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00123] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00124] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00125] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00126] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00127] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00128] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00129] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 46 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00130] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 46 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00131] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 46 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00132] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00133] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00134] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00135] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 46 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00136] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 46 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00137] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 46 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00138] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00139] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00140] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00141] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 46, 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00142] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 46, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00143] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17, 24 e 46 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00144] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17, 24 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00145] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17, 24 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00146] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 17, 24 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00147] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24, 46 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00148] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24, 46 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00149] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 24, 46 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00150] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 46, 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00151] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 46, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00152] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 120, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00153] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24, 46 e 49 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00154] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24, 46 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00155] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 24, 46 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00156] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 46,49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00157] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 46, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00158] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 17, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00159] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 46, 49 e 69 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00160] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 46, 49 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00161] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 24, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, tais como aquelas descritas acima.
[00162] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em adicionalmente substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 10, 27 e 29 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 10 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Val, preferencialmente por His; o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 27 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Val, preferencialmente por Met; e o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 29 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Leu. Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende as ou consiste nas substituições N10H, Y27M e N29L de SEQ ID NO: 2.
[00163] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 75, 125 e 129 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 75 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ala; o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 125 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ala; e o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 129 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Glu. Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende as ou consiste nas substituições S75A, Q125A e I129E de SEQ ID NO: 2.
[00164] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em substituições de aminoácidos em posições correspondendo às posições 11, 40 e 58 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 11 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Asp; o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 40 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Arg; e o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 58 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Arg. Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende as ou consiste nas substituições N11D, S40R e K58R do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[00165] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma das ou ambas as posições correspondendo às posições 99 e 118 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma das ou ambas as posições correspondendo às posições 99 e 118 é substituído por Ala. Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende as ou consiste nas substituições S99C e Y118C de SEQ ID NO: 2.
[00166] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 131 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 131 é substituído por Asn. Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende a ou consiste na substituição T131N de SEQ ID NO: 2.
[00167] Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende ou consiste em uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 162 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 162 é substituído por His. Em outro aspecto, a variante adicionalmente compreende a ou consiste na substituição Q162H de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00168] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma ou mais (por exemplo, várias) substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y.
[00169] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00170] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições G24C + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade em pH mais baixo melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00171] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições V46I + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00172] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições K49M + T120S ou K49E + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00173] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N69D + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00174] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições T120S + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00175] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + V46I do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00176] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições G24C + V46I do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00177] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00178] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + V46I + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00179] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições G24C + V46I + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00180] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00181] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00182] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00183] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00184] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + K49M + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00185] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + K49E + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00186] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + K49M + N69D + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00187] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + K49E + N69D + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00188] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + K49M + N69D + L105Y + T120S + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00189] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições Y17F + G24C + V46I + K49E + N69D + L105Y + T120S + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00190] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + Y17F + Y27M + N29L + G24C + V46I + K49M + N69D + L105Y + T120S + F180Y + do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00191] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + Y17F + G24C + Y27M + N29L + V46I + K49E + N69D + L105Y + T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00192] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + Y17F + G24C + Y27M + N29L + V46I + K49M + N69D + S75A + L105Y + T120S + Q125A + I129E + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00193] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + Y17F + G24C + Y27M + N29L + V46I + K49E + N69D + S75A + L105Y + T120S + Q125A + I129E + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00194] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49M + K58R + N69D + S75A + L105Y + T120S + Q125A + I129E + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00195] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49E + K58R + N69D + S75A + L105Y + T120S + Q125A + I129E + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00196] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49M + K58R + N69D + S75A + S99C + L105Y + Y118C + T120S + Q125A + I129E + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00197] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49E + K58R + N69D + S75A + S99C + L105Y + Y118C + T120S + Q125A + I129E + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00198] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49M + K58R + N69D + S75A + S99C + L105Y + Y118C + T120S + Q125A + I129E + T131N + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00199] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49E + K58R + N69D +S75A + S99C + L105Y + Y118C + T120S + Q125A + I129E + T131N + F180Y + do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00200] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49M + K58R + N69D + S75A + S99C + L105Y + Y118C + T120S + Q125A + I129E + T131N + Q162H + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00201] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições N10H + N11D + Y17F + G24C + Y27M + N29L + S40R + V46I + K49E + K58R + N69D + S75A + S99C + L105Y + Y118C + T120S + Q125A + I129E + T131N + Q162H + F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e exibe pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 e atividade de xilanase, e adicionalmente a variante tem termoestabilidade, atividade térmica ou perfil de atividade alterado em relação ao pH melhorados em comparação com a xilanase GH11 de SEQ ID NO: 2.
[00202] Mutações adicionais, sem serem aquelas descritas acima, podem ser introduzidas na xilanase da Família 11 de GH, contanto que tais mutações não comprometam significativamente a estrutura e função da enzima. Como seria apreciado por aqueles com perícia ordinária na técnica, mas sem ser de modo algum limitante, podem ser introduzidas mutações adicionais em regiões de baixa conservação de sequências entre xilanases da Família 11 de GH, as quais podem ser identificadas por alinhamento das sequências de aminoácidos de xilanases da Família 11 de GH. A informação obtida do alinhamento de sequências de aminoácidos pode ser usada como guia por aqueles com perícia ordinária na técnica ao introduzirem uma mutação(ões) adicional(ais) em posições diferentes de 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 incluindo, mas não limitadas a, posições correspondendo às posições 10, 11, 27, 29, 40, 58, 99, 105, 118, 125, 129, 131 e 162 de SEQ ID NO: 2.
[00203] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085. Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de enzima para se identificarem resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica podem ser também determinados por análise física da estrutura, tal como determinados por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado. Aminoácidos essenciais na xilanase II de T. reesei (Xyn2, Xyn II ou Xyn 11B) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 incluem os resíduos de ácido glutâmico catalíticos nas posições 86 e 177, E86 e E177 (Saaraleinen et al 1993). Outros aminoácidos na xilanase II de T. reesei (Xyn2, Xyn II ou Xyn 11B) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que são altamente conservados entre xilanases da Família 11 incluem, mas não são limitados a, triptofano na posição 39 (W39), glicina na posição 50 (G50), tirosina-glicina-triptofano (YGW) nas posições 77 a 79, tirosina-tirosina-isoleucina-valina (YYIV) nas posições 87 a 90, tirosina na posição 115 (Y115), prolina na posição 126 (P126), serina na posição 127 (S127), fenilalanina na posição 134 (F134), glutamina na posição 136 (Q136), serina-valina-arginina nas posições 139 a 141, histidina na posição 155 (H155), triptofano na posição 159 (W159) e glicina na posição 163 (G163).
[00204] As variantes podem consistir em 170 a 190 aminoácidos, por exemplo, 180 a 190 e 185 a 190 aminoácidos, ou qualquer número de aminoácidos entre eles.
[00205] Em uma modalidade, a variante tem atividade térmica melhorada em comparação com a xilanase genitora. A atividade térmica melhorada da variante em comparação com a xilanase genitora pode ser determinada usando o método descrito no Exemplo 7. Em outra modalidade, a variante tem termoestabilidade melhorada em comparação com a xilanase genitora.
[00206] Em outras modalidades, a variante pode ser adicionalmente melhorada em comparação com a xilanase genitora em uma ou mais das seguintes propriedades: estabilidade sob condições de armazenamento, atividade específica, ligação ao substrato, clivagem do substrato, especificidade do substrato, eficiência catalítica, taxa catalítica, atividade de pH, estabilidade de pH, estabilidade do substrato, propriedades da superfície, estabilidade química ou estabilidade de oxidação melhoradas.
Xilanases da Família 11 de GH genitoras
[00207] A xilanase genitora pode ser (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza, sob condições de baixa estringência, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7.
[00208] Em um aspecto, o genitor tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, e que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 20 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[00209] Em outro aspecto, o genitor compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o genitor compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto, o genitor compreende os ou consiste nos aminoácidos 28 a 213 de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto, o genitor compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto, o genitor compreende os ou consiste nos aminoácidos 23 a 418 de SEQ ID NO: 3.
[00210] Em outro aspecto, o genitor é um fragmento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 213 de SEQ ID NO: 8 contendo pelo menos 170 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 180 ou pelo menos 185 resíduos de aminoácidos.
[00211] Em outra modalidade, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 213 de SEQ ID NO: 8.
[00212] Em outro aspecto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-alta estringência, condições de alta estringência ou condições de muito alta estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).
[00213] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 213 de SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica um genitor a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente menores do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos ou pelo menos 500 nucleotídeos. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.
[00214] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras cepas pode ser rastreada quanto a DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro tipo de DNA de tais outras cepas pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibridiza com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou uma subsequência dessas, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.
[00215] Para propósitos da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza com uma sonda marcada de ácido nucleico correspondendo a (i) SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7; (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7; (iii) a sua sequência de cDNA; (iv) o seu complemento de comprimento total; ou (v) uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito alta estringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.
[00216] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico compreende os nucleotídeos 100 a 272 e 381 a 777 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento desse; o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou um fragmento desse; ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ou um fragmento desse. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA.
[00217] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico compreende os nucleotídeos 82 a 683 de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8 ou um fragmento desse; o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou um fragmento desse; ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ou um fragmento desse. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico consiste nos nucleotídeos 82 a 683 de SEQ ID NO: 7 ou na sua sequência de cDNA.
[00218] Em outra modalidade, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.
[00219] Em outra modalidade, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequências com os nucleotídeos 82 a 683 de SEQ ID NO: 7 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.
[00220] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.
[00221] O genitor pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de modo a que fiquem em fase de leitura e a que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
[00222] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, sítios divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
[00223] A xilanase genitora pode ser obtida a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte significará que a xilanase genitora codificada por um polinucleotídeo é produzida pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, a xilanase genitora é secretada extracelularmente.
[00224] O genitor pode ser uma xilanase da Família 11 de GH bacteriana. Por exemplo, o genitor pode ser um polipeptídeo bacteriano tal como uma xilanase da Família 11 de GH de Bacillus, Cellulomonas, Cellvibrio, Clostridium, Dictyoglomus, Fibrobacter, Geobacillus, Lactococcus, Micromonospora, Norcardiopsis, Paenibacillus, Pseudobutyrivibrio, Ruminococus, Sorangium, Streptococcus, Streptomyces, Thermobacillus, Thermobifida, Thermobispora ou Thermopolyspora.
[00225] Em um aspecto, o genitor é uma xilanase da Família 11 de GH de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus lichenformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Cellulomonas fimi, Cellulomonas flavigena, Cellvibrio japonicuus, Clostridium acetobutylicum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellovorans, Clostridium clariflavum, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium thermocellum, Dictyoglomus thermophilum, Fibrobacter succinogenes, Geobacillus stearothermophilus, Lactococcus lactis, Micromonospora aurantiaca, Norcardiopsis dassonvillei, Paenibacillus polymyxa, Pseudobutyrivibrio xylanivorans, Ruminococus albus, Ruminococus flavifaciens, Sorangium cellulosum, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Thermobacillus composti, Thermobifida fusca, Thermobispora bispora ou Thermopolyspora flexuosa.
[00226] O genitor pode ser uma xilanase da Família 11 de GH fúngica. Por exemplo, o genitor pode ser uma xilanase da Família 11 de GH de levedura, tal como uma xilanase da Família 11 de GH de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou uma xilanase da Família 11 de GH de fungo filamentoso, tal como uma xilanase da Família 11 de GH de Aspergillus, Aureobasidium, Botryotinia, Botrytis, Chaetomium, Chrysosporium, Claviceps, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryptococcus, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Hypocrea, Lentinula, Leptosphaeria, Magnaporthe, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Orpinomyces, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piriformospora, Piromyces, Podospora, Pyrenophora, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Sclerotinia, Scytalidium, Talaromyces, Thermomyces, Thielavia, Trichoderma ou Verticillium.
[00227] Em outro aspecto, o genitor é uma xilanase da Família 11 de GH de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aureobasidium pullulans, Botryotinia fuckeliana, Botrytis cinerea, Chaetomium thermophilum, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Claviceps purpurea, Coprinopsis cinerea, Coptotermes formosanus,Cryptococcus flavis, Fusarium bactridioides, Fusarium fujikuroi, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium oxysporum, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Hypocrea jecorina, Hyprocrea orientalis, Magnaporthe grisea, Myceliophthora thermophila, Neocallimastix frontalis, Neocallimastix patriciarum, Neurospora crassa, Orpinomyces sp., Penicillium canescens, Penicillium chrysogenum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Piriformospora indica, Piromyces communis, Podospora anserina, Pyrenophora teres, Rhizopus oryzae, Schizophyllum commune, Sclerotinia sclerotiorum, Scytalidium acidophilum, Scytalidium thermophilum, Talaromyces cellulolyticus, Talaromyces emersonni, Talaromyces funiculosus, Thermomyces lanuginosus, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride ou Verticillium dahliae.
[00228] Em outro aspecto, a xilanase genitora é uma xilanase da Família 11 de GH de Trichoderma reesei, por exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ou o polipeptídeo dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[00229] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica prontamente reconhecerão a identidade de equivalentes apropriados.
[00230] Cepas dessas espécies estão prontamente acessíveis ao público em várias coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[00231] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para o isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica um genitor pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo que codifica um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Preparação de Variantes
[00232] A presente invenção se refere também a métodos de obtenção de uma variante que tem atividade de xilanase, compreendendo: (a) introduzir em uma xilanase genitora uma substituição de aminoácido em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de xilanase; e (b) recuperar a variante.
[00233] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção sintética de genes, construção semissintética de genes, mutagênese aleatória, rearranjo, etc.
[00234] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (por exemplo, várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo que codifica o genitor.
[00235] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores oligonucleotídicos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo que codifica o genitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Normalmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e do inserto se liguem umas às outras. Ver, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.
[00236] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente dos E.U.A. N.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.
[00237] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio- dirigida na presente invenção. Há muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.
[00238] A construção gênica sintética implica a síntese in vitro de uma molécula polinucleotídica desenhada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando várias técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip de multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.
[00239] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou rearranjo, seguidos de um procedimento de rastreamento relevante, tal como os divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente dos E.U.A. N.° 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese região-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[00240] Podem ser combinados métodos de mutagênese/rearranjo com métodos de rastreamento automatizados, de elevada capacidade, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.
[00241] A construção gênica semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção gênica sintética e/ou mutagênese sítio- dirigida e/ou mutagênese aleatória e/ou rearranjo. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos polinucleotídicos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio-específicos, enquanto ainda outras regiões podem estar sujeitas a amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. Subsequências polinucleotídicas podem ser depois rearranjadas.
Polinucleotídeos
[00242] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam uma variante de xilanase da Família 11 de GH da presente invenção.
Construções de Ácidos Nucleicos
[00243] A presente invenção se refere também a construções de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante de xilanase da Família 11 de GH da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
[00244] O polinucleotídeo pode ser manipulado de várias formas de modo a proporcionar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.
[00245] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle da transcrição que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.
[00246] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansacarase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.
[00247] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos.
[00248] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[00249] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.
[00250] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.
[00251] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[00252] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes de enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.
[00253] A sequência de controle também pode ser uma região estabilizadora de RNAm a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.
[00254] Exemplos de regiões estabilizadoras de RNAm adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.
[00255] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
[00256] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[00257] A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência codificante da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.
[00258] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[00259] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[00260] A sequência de controle pode ser também uma região de codificação de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretória da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante de peptídeo sinal naturalmente ligada em fase de leitura translacional com o segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante de peptídeo sinal estranha pode ser requerida quando a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante de peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto, pode ser usada qualquer sequência codificante de peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretória de uma célula hospedeira.
[00261] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[00262] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, betaglucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobiodrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei e beta-xilosidase de Trichoderma reesei.
[00263] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes de peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[00264] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[00265] Onde estiverem presentes sequências de peptídeo sinal e pró- peptídeo, a sequência de pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N da variante e a sequência de peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência de pró-peptídeo.
[00266] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor da glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor da TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae, o promotor da glucoamilase de Aspergillus oryzae, o promotor da betaglucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei e da beta-xilosidase de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, essas sequências reguladoras incluem o gene da di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotídeo que codifica a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.
Vetores de Expressão
[00267] A presente invenção se refere também a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As várias sequências nucleotídicas e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica a variante em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.
[00268] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.
[00269] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Além disso, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.
[00270] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores de seleção que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.
[00271] Exemplos de marcadores de seleção bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tais como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Marcadores de seleção para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Para utilização em uma célula de Aspergillus são preferenciais os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.
[00272] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.
[00273] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo que codifica a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) específico(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local específico, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
[00274] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador plasmidial que medeie a replicação autônoma e que funcione em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador plasmidial" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.
[00275] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permitem replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl que permitem replicação em Bacillus.
[00276] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.
[00277] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.
[00278] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador de seleção amplificável com o polinucleotídeo, onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador de seleção, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente de seleção apropriado.
[00279] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Células Hospedeiras
[00280] A presente invenção se refere também a células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Uma construção ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que a construção ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica a variante e sua fonte.
[00281] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.
[00282] A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.
[00283] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.
[00284] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
[00285] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.
[00286] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.
[00287] A célula hospedeira pode ser também um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, de inseto, vegetal ou fúngica.
[00288] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definidos por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).
[00289] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usado no presente documento inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura será definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N.° 9, 1980).
[00290] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica.
[00291] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
[00292] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis,Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.
[00293] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.
[00294] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. As células fúngicas podem ser também transformadas por um processo biolístico envolvendo introdução de péletes de ouro ou tungstênio revestidos com um ou mais polinucleotídeos em esporos fúngicos usando uma pistola de partículas. Métodos adequados para transformação biolística de células hospedeiras de Trichoderma são descritos na Publicação dos E.U.A. N.° 2013/0052694.
[00295] A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de Produção
[00296] A presente invenção se refere também a métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperar a variante.
[00297] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo é realizado em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados são disponibilizados por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada, pode ser recuperada de lisados celulares.
[00298] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto enzimático, ou desaparecimento de um substrato enzimático. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade da variante.
[00299] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.
[00300] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.
[00301] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante.
Composições
[00302] A presente invenção se refere também a composições compreendendo uma variante da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em uma tal variante. O termo "enriquecidas" significa que a atividade de xilanase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de 1,1.
[00303] A composição pode compreender uma variante como o maior componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta- xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase. A(s) enzima(s) adicional(ais) podem ser produzidas, por exemplo, por um microrganismo pertencendo ao gênero Aspergillus, por exemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae; Fusarium, por exemplo, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum; Humicola, por exemplo, Humicola insolens ou Humicola grisea; Hypocrea, por exemplo, Hypocrea jecorina, Myceliophthora, por exemplo, Myceliophthora thermophila,Penicillium, por exemplo, Penicillium funiculosum ou Trichoderma, por exemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.
[00304] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um granulado ou microgranulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[00305] As composições podem ser uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, como descritas no presente documento. Consequentemente, a presente invenção se refere também a formulações de caldo de fermentação e composições de células compreendendo um polipeptídeo que tem atividade de xilanase da presente invenção. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou restos celulares, e meio de cultura.
[00306] O termo "caldo de fermentação" como usado no presente documento se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que passa por nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção de proteínas para o meio de cultura celular. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados ao final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.
[00307] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s), e opcionalmente contém adicionalmente células mortas e/ou restos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou restos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que está isenta destes componentes.
[00308] As formulações de caldo de fermentação ou composições celulares podem compreender adicionalmente um conservante e/ou agente antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.
[00309] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode compreender adicionalmente uma ou mais atividades enzimáticas, tais como celobioidrolase, endoglucanase, beta-glucosidase, endo-beta-1,3(4)-glucanase, glicoidrolase, xiloglucanase, xilanase, xilosidase, arabinofuranosidase, alfa- glucuronidase, acetil xilana esterase, mananase, manosidase, alfa- galactosidase, manana acetil esterase, galactanase, arabinanase, pectato liase, pectinase liase, pectato liase, poligalacturonase, pectina acetil esterase, pectina metil esterase, beta-galactosidase, galactanase, arabinanase, alfa- arabinofuranosidase, ramnogalacturonase, ácido ferrúlico esterases, ramnogalacturonana liase, ramnogalacturonana acetil esterase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, ramnogalacturonana liase, lignina peroxidases, peroxidases dependentes de manganês, peroxidases híbridas, com propriedades combinadas de lignina peroxidases e peroxidases dependentes de manganês, glucoamilase, amilase, protease e lacase.
[00310] Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas inclui enzimas celulolíticas incluindo, mas não limitadas a, (i) endoglucanases (EG) ou 1,4-D-glucana-4-glucanoidrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanases, incluindo 1,4-D-glucana glucanoidrolases (também conhecidas como celodextrinases) (EC 3.2.1.74) e 1,4-D-glucana celobioidrolases (exo-celobioidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91) e (iii) betaglucosidase (BG) ou beta-glucosídeo glucoidrolases (EC 3.2.1.21).
[00311] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados ao final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) crescerem até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzima(s) celulase e/ou glucosidase). Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.
[00312] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito no presente documento é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, restos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.
[00313] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.
[00314] São dados abaixo exemplos de usos preferenciais das composições da invenção. A dosagem da composição da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.
Usos
[00315] Uma variante da presente invenção pode ser usada em várias aplicações para degradar ou converter um material contendo xilana, compreendendo tratar o material com a variante (ver, por exemplo, WO 02/18561). Uma variante da presente invenção pode ser usada para aumentar o brilho de polpa, para melhorar a qualidade de papel, para diminuir a quantidade de agentes químicos de branqueamento tais como cloro usados nos estágios de branqueamento de polpa, e para tratar a polpa com outra finalidade, sem causar quaisquer danos à celulose na polpa.
[00316] As variantes podem ser usadas em métodos de tratamento de polpa, por exemplo, polpa kraft, de acordo com a patente dos E.U.A. N.° 5.658.765. A polpa é um material fibroso seco preparado por separação química ou mecânica de fibras de madeira, culturas de fibras ou papel residual. A polpa de madeira é o material mais comum usado para produzir papel. As fontes de madeira usadas para produzir a polpa de madeira são chamadas de madeira para polpa. A polpa de madeira é preparada a partir de árvores de madeira macia tais como espruce, pinheiro, abeto, lariço e cicuta, e madeiras duras tais como eucalipto, choupo e bétula. As variantes podem ser usadas no branqueamento de polpa para reduzir o uso de produtos químicos tóxicos contendo cloro. Ademais, é desejável que as xilanases usadas para o biobranqueamento sejam estáveis e ativas sob condições alcalinas a temperaturas elevadas. Em uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere a métodos de tratamento de uma polpa, compreendendo colocar a polpa em contato com a variante.
[00317] No tratamento de polpa de acordo com a presente invenção, as condições enzimáticas para o tratamento da polpa, tais como temperatura, pH, pressão, período de tempo, etc., podem ser adequadamente selecionadas de modo que a ação enzimática desejada seja exibida para alcançar os efeitos desejados tais como um aumento do brilho. Por exemplo, a temperatura pode estar situada no intervalo de 10 a 90 °C, por exemplo, 25 a 85 °C, 30 a 85 °C, 40 a 85 °C, 50 a 85 °C, 60 a 80 °C, 70 a 80 °C, ou pode ser qualquer outra temperatura apropriada. O pH pode estar situado no intervalo de 3 a 11, por exemplo, 4 a 10, 5 a 10, 6 a 10, 7 a 10, 7 a 9,5, 8 a 9,5, ou pode ser qualquer outro pH apropriado. A polpa é tratada com uma variante na quantidade de 0,1 a 25 mg/kg de polpa seca, por exemplo, 0,25 a 20, 0,5 a 10, 0,75 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5 mg/kg de polpa seca, ou qualquer outra quantidade apropriada.
[00318] A pressão pode ser aplicada sob uma pressão convencionalmente usada para o branqueamento de polpa ou outras etapas comuns de tratamento de polpa; não há nenhuma restrição particular, mas prefere-se a pressão normal de um ponto de vista econômico. O período de tempo dos tratamentos pode estar situado no intervalo de 10 minutos a 50 horas, por exemplo, 0,5 hora a 24 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 12 horas, 1 hora a 5 horas, por exemplo, 2 horas, ou pode ser qualquer outro período de tempo apropriado.
[00319] No caso em que é desejável aumentar o brilho, a quantidade de agente químico de branqueamento usado após o tratamento enzimático pode ser bastante reduzida. O tratamento de polpa da presente invenção é suficiente como substituto de pelo menos parte do processo atual de branqueamento usando agentes de branqueamento contendo cloro.
[00320] O método da presente invenção para o tratamento de polpa é aplicável a uma ampla variedade de polpas derivadas de uma árvore latifoliada, uma árvore de folhas aciculiformes ou um material não derivado de árvores, tais como polpa kraft, polpa sulfite, polpa semiquímica, polpa de madeira moída, polpa de madeira moída de refinador, polpa termo-mecânica, etc. Ao aplicar o método de tratamento de polpa da presente invenção a essas polpas, a quantidade de lignina que permanece na polpa pode ser reduzida para alcançar efeitos tais como aumento do brilho das polpas, melhora da qualidade e diminuição da quantidade de agente químico de branqueamento.O método de tratamento de polpa da presente invenção pode ser também aplicado às etapas de branqueamento dessas polpas por oxigênio ou similar, antes de ou após o branqueamento.
[00321] Após o tratamento da polpa usando uma variante da presente invenção, pode ser realizada também uma extração para remover efetivamente a lignina dissolvida ou suscetível a ser dissolvida da polpa. A extração pode ser realizada usando, por exemplo, hidróxido de sódio. Nesse caso, condições típicas para a extração são apresentadas para ter uma concentração de polpa de 0,3 a 20%, uma concentração de hidróxido de sódio de 0,5 a 5% com base no peso de polpa seca, uma faixa de temperatura de 40 a 80 °C e um período de tempo de 30 minutos a 3 horas, por exemplo, 1 a 2 horas. No entanto, pode ser usada qualquer extração apropriada conhecida na técnica.
[00322] Após a polpa ser tratada de acordo com o método da presente invenção, um agente químico de branqueamento pode ser também usado para aumentar ainda mais o brilho da polpa. Nesse caso, mesmo se a quantidade de agente químico de branqueamento for bastante diminuída em comparação com o caso de branqueamento de polpa com apenas o agente químico de branqueamento, pode-se obter melhor brilho. Quando dióxido de cloro é usado como um agente químico de branqueamento, a quantidade de dióxido de cloro pode ser reduzida em 23 a 43% ou até mais.
[00323] Quando papel é produzido a partir da polpa tratada de acordo com o método da presente invenção, o papel tem excelentes propriedades, tais como menor teor de compostos fenólicos clorados, em comparação com papel preparado a partir de polpa branqueada convencional.
[00324] As variantes podem ser também usadas em processos de produção de xilose ou xilo-oligossacarídeos de acordo com a patente dos E.U.A. N.° 5.658.765. Em outra modalidade preferencial, a presente invenção refere-se a métodos de produção de xilose, compreendendo colocar um material contendo xilana em contato com a variante. Em um aspecto, o método compreende adicionalmente a recuperação da xilose.
[00325] As variantes podem ser também usadas como enzimas melhoradoras de ração que melhoram a digestibilidade da ração para aumentar a eficácia da sua utilização de acordo com a patente dos E.U.A. N.° 6.245.546.
[00326] As variantes podem ser também usadas em processos de panificação de acordo com a patente dos E.U.A. N.° 5.693.518.
[00327] As variantes podem ser adicionalmente usadas na produção de cerveja de acordo com WO 02/24926.
Plantas
[00328] A presente invenção se refere também a plantas, por exemplo, uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem a variante em quantidades recuperáveis. A variante pode ser recuperada da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo a variante pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhoria do valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.
[00329] A planta transgênica pode ser uma dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e maís (milho).
[00330] Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza e o organismo modelo estreitamente relacionado Arabidopsis thaliana.
[00331] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo essas partes, por exemplo, epiderme, mesofilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células vegetais, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além disso, qualquer célula vegetal, independentemente do tecido de origem, é considerada uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção também são consideradas partes de plantas, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e tegumentos de sementes.
[00332] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas e células vegetais.
[00333] A planta ou célula de planta transgênica expressando a variante pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de uma ou mais construções de expressão que codificam uma variante no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.
[00334] A construção de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica uma variante operacionalmente ligado a sequências reguladoras apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além do mais, a construção de expressão pode compreender um marcador de seleção útil para identificação de células de plantas nas quais foi integrada a construção de expressão e sequências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).
[00335] A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como é desejado que a variante seja expressa. Por exemplo, a expressão do gene que codifica uma variante pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica quanto ao desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto gênico pode ser direcionado para um tecido ou parte de planta específico tal como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
[00336] Para expressão constitutiva pode ser usado o promotor de 35S- CaMV, ubiquitina 1 de milho, ou actina 1 de arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos para órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos dreno de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutos (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos dreno metabólicos tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico para sementes tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene da proteína de semente desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo oleaginoso de sementes (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor da proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para sementes conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico para folhas tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus de clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida tal como o promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). De igual modo, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos tais como temperatura, seca ou substituições de aminoácidos na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios vegetais tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico, e metais pesados.
[00337] Um elemento intensificador de promotores pode ser também usado para obter maior expressão de uma variante na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotores pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica uma variante. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 de arroz para aumentar a expressão.
[00338] O gene marcador de seleção e quaisquer outras partes da construção de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.
[00339] A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partículas, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
[00340] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método de geração de dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para a transformação de monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação possam ser usados para essas plantas. Um método de geração de monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento com partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas é baseado em transformação de protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionais de transformação incluem aqueles descritos nas patentes dos E.U.A. N.°s 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).
[00341] Após transformação, os transformantes tendo incorporado a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é projetado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso, por exemplo, de cotransformação com duas construções separadas de T-DNA ou excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.
[00342] Adicionalmente à transformação direta de um genótipo particular de planta com uma construção da presente invenção, podem ser feitas plantas transgênicas por cruzamento de uma planta tendo a construção com uma segunda planta que não possui a construção. Por exemplo, uma construção que codifica uma variante pode ser introduzida em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade de transformação direta de uma planta dessa dada variedade. Portanto, a presente invenção engloba não só uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a descendência de tais plantas. Como usado aqui, descendência pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta genitora preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir uma construção de DNA preparada de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta na introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora. Exemplos não limitantes de tais etapas são descritos na patente dos E.U.A. N.° 7.151.204.
[00343] Podem ser geradas plantas através de um processo de conversão por retrocruzamento. Por exemplo, plantas incluem plantas referidas como genótipo, linhagem, planta endogâmica ou híbrido convertido por retrocruzamento.
[00344] Podem ser usados marcadores genéticos para auxiliar a ingressão de um ou mais transgenes da invenção de um fundo genético para outro. A seleção auxiliada por marcadores oferece vantagens em relação ao melhoramento convencional na medida em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, marcadores genéticos podem fornecer dados sobre o grau relativo de germoplasma de elite na descendência individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, mas que tem um fundo genético agronomicamente não desejável, é cruzada com uma genitora de elite, podem ser usados marcadores genéticos para selecionar uma descendência que não apenas possui a característica de interesse, mas que tem também uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para ingressar uma ou mais características em um fundo genético particular é minimizado.
[00345] A presente invenção se refere também a métodos de produção de uma variante da presente invenção compreendendo: (a) cultivar uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo que codifica a variante sob condições conducentes à produção da variante; e (b) recuperar a variante.
[00346] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.
EXEMPLOS
[00347] O Exemplo 1 descreve as cepas e os vetores usados nos exemplos subsequentes. Os Exemplos 2 e 3 descrevem a geração de bibliotecas de mutagênese aleatória de xilanases da Família 11 de GH genitoras. O Exemplo 4 descreve a construção de variantes de xilanase da Família 11 de GH contendo múltiplas substituições de aminoácidos. Os Exemplos 5 e 6 descrevem a expressão de variantes de xilanase da Família 11 de GH a partir de microcultura e o rastreamento de elevada produtividade para se identificarem variantes de xilanase da Família 11 de GH com termoatividade e/ou termoestabilidade aumentadas. O Exemplo 7 descreve métodos de determinação dos perfis de temperatura de variantes de xilanase da Família 11 de GH termoativas. O Exemplo 8 descreve o rastreamento de elevada produtividade para identificar variantes de xilanase da Família 11 de GH com perfil de atividade em pH mais baixo. O Exemplo 9 descreve métodos de determinação dos perfis de pH de variantes de xilanase da Família 11 de GH.
Exemplo 1: Cepas e vetores
[00348] A cepa de Saccharomyces cerevisiae YNL219C BY4742 [11993] (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Δalg9) foi obtida da ATCC (N.° de cat. 4011993). A cepa de Escherichia coli DH5α (F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relAl À.-) foi obtida da Invitrogen (N.° de cat. 18265-017).
[00349] O vetor YEp352/PGKxylss-HTX47a foi construído por substituição da sequência da Cel5A de T. reesei em YEp352/PGKxylss- Cel5A, descrito na publicação dos E.U.A. N.° 2013/0095554, por um polinucleotídeo que codifica a variante de xilanase HTX47A operacionalmente ligado à sequência sinal de secreção da xilanase II (XynII ss). Um mapa do vetor YEp352/PGKxylss-HTX47a é mostrado na Figura 1.
Exemplo 2: Mutagênese aleatória da xilanase genitora HTX47A
[00350] HTX47A é uma variante da xilanase II de T. reesei contendo as mutações N10H + N11D + Y27M + N29L + S40R + K58R + S75A + S99C + L105H + Y118C + Q125A + I129E + T131N (WO 2007/115407). Foram construídas quatro bibliotecas de mutagênese aleatória do polinucleotídeo que codifica a xilanase HTX47A como se segue: Foi realizada PCR para 20 ciclos de amplificação usando 0,2, 2,0 e 20 fmol de YEp352/PGKxylss-HTX47A como molde com os iniciadores DK510 e PGKterm. Esse fragmento de vetor e cada amplicon final foram transformados simultaneamente e clonados por recombinação in vivo na cepa de levedura YNL219C BY4742 [11993] (Butler et al., 2003).
[00351] DK510 5' TGG CTG TGG AGA AGC GC (SEQ ID NO: 5) PGK-term 5' GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID NO: 6) Exemplo 3: Mutagênese aleatória da xilanase genitora HTX47A + H105Y + T120S +Q162H + F180Y ("HTX47A (TS004)")
[00352] Foi construída uma biblioteca de mutagênese aleatória do polinucleotídeo que codifica a xilanase genitora HTX47A(TS004) como se segue: Foi realizada PCR para 20 ciclos de amplificação usando 0,2, 2,0 e 20 fmol de YEp352/PGKxylss-HTX47A como molde com os iniciadores DK510 e PGKterm. Esse fragmento de vetor e cada amplicon final foram transformados simultaneamente e clonados por recombinação in vivo na cepa de levedura YNL219C BY4742 [11993] (Butler et al., 2003).
[00353] DK510 5' TGG CTG TGG AGA AGC GC (SEQ ID NO: 5) PGK-term 5' GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID NO: 6) Exemplo 4: Construção de variantes de xilanase da Família 11 de GH contendo múltiplas substituições de aminoácidos
[00354] Polinucleotídeos que codificam as variantes de xilanase da Família 11 de GH TS003, TS004 e TS005 - cada uma contendo múltiplas substituições de aminoácidos identificadas nos Exemplos 2 e 3 (mostradas na Tabela 2, abaixo) - foram sintetizados de novo por GenScript para incluírem os sítios de restrição flanqueadores NheI 5' e KpnI 3'; esses foram recebidos no vetor pUC57. Os polinucleotídeos foram excisados usando uma digestão dupla NheI/KpnI e ligados em um vetor YEp-PGK-xyn2ss-HTX47 correspondentemente linearizado.Tabela 2: Mutações nas variantes de xilanase da Família 11 de GH TS003, TS004, TS005, TS011 e TS012 vs. a xilanse HTX47A genitora (contendo as mutações N10H + Y27M + N29L + S75A + L105H+Q125A + I129E + N11D + S40R + K58R + S99C + Y118C + T131N)
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Exemplo 5: Expressão e isolamento de variantes de xilanase da Família 11 de GH a partir de culturas de levedura em microplacas
[00355] Este exemplo descreve a seleção e expressão de variantes de xilanase da Família 11 de Saccharomyces cerevisiae para uso em um ensaio de rastreamento de elevada produtividade.
[00356] Transformantes de Saccharomyces cerevisiae das bibliotecas descritas nos Exemplos 2, 3 e 4 foram cultivadas em placas contendo meio completo sintético (SC: ágar a 2% p/v, base de nitrogênio de levedura a 0,17% p/v, suplemento Ura drop-out a 0,078% p/v, glucose a 2% p/v, casaminoácidos a 2% p/v, sulfato de amônio a 0,5% p/v, pH 5,5) e Azo-WAX a 0,12% (Megazyme) durante 3 dias a 30 °C.
[00357] As colônias mostrando halos clarificados visíveis foram selecionadas para culturas de meio líquido por inoculação com palitos de 1 ml de meio completo sintético (SC: base de nitrogênio de levedura a 0,17% p/v, suplemento Ura drop-out a 0,078% p/v, glicose a 2% p/v, casaminoácidos a 2% p/v, sulfato de amônio a 0,5% p/v, pH 5,5) em microplacas com 96 poços profundos. As culturas foram cultivadas durante 3 dias a 30 °C e 250 rpm com controle da umidade. Estoques em glicerol foram feitos combinando 100 μl de cultura com 100 μl de glicerol a 30% e armazenados a -80 °C. As placas de cultura com poços profundos foram depois centrifugadas a 3000 rpm durante 5 minutos para peletizar as células e o sobrenadante foi aspirado para ensaios de rastreamento.
Exemplo 6: Rastreamento de bibliotecas de HTX47A de T. REESEI quanto a variantes de xilanase da Família 11 de GH com termoatividade aumentada
[00358] Este exemplo descreve o rastreamento de variantes de xilanase HTX47A quanto a termoatividade melhorada em relação à HTX47A genitora que havia sido clonada em Saccharomyces cerevisiae.
[00359] Uma alíquota de sobrenadante (50 μl) de cada microcultura genitora e variante, produzida como no Exemplo 5, foi adicionada a 50 μl de arabinoxilana de trigo a 1,0% (Megazyme; viscosidade média) tamponada com fosfato de citrato 50 mM a pH 5,0 e incubada a 65 °C durante 1 hora. Um ensaio idêntico foi realizado a 79 °C. Os sobrenadantes de microcultura para o ensaio a 65 °C foram diluídos 1 em 5 enquanto os sobrenadantes para o ensaio a 79 °C foram diluídos 1 em 2. Ambos os ensaios foram realizados em uma placa de PCR e as incubações foram realizadas em um termociclador Tetrad. Seis controles de HTX47A genitora usados para comparação estavam contidos em cada placa de PCR de 96 poços. Os ensaios foram realizados em duplicata. Após cada incubação, 80 μl de ácido dinitrossalicíclico foram adicionados e as placas foram aquecidas até 95 °C durante 5 min. Uma alíquota de 135 μl da solução foi transferida para uma microplaca e a absorbância a 560 nm foi medida.
[00360] A absorbância no caso dos dados relacionados com as placas incubadas a 65 °C e 79 °C foi multiplicada por 5 e 2 (fator de diluição do sobrenadante), respectivamente, para todas as variantes e controles genitores. Uma razão de atividade a temperatura elevada/baixa foi então calculada por divisão da absorbância corrigida a 65 °C pela absorbância corrigida a 79 °C para cada um dos seis controles genitores e uma média e o desvio padrão foram calculados. Uma razão de atividade a temperatura elevada/baixa foi também calculada para cada variante de TrXyn2. Os positivos foram depois selecionados mais do que 2 desvios padrão acima do controle genitor médio. Todas as TrXyn2s modificadas positivas foram novamente rastreadas para se reduzir o número de falsos positivos. Os dados de rastreamento de um ciclo completo de rastreamento podem ser encontrados na Figura 2.
Exemplo 7: Determinação do perfil de temperatura para variantes de xilanase HTX47A selecionadas
[00361] Uma alíquota de sobrenadante (50 μl; diluído 5 vezes) de microculturas selecionadas foi adicionada a 50 μl de arabinoxilana de trigo a 1,0% (Megazyme; viscosidade média) tamponada com citrato de sódio 50 mM a pH 5,0 e incubada a várias temperaturas durante 1 hora. Estes ensaios foram realizados em uma placa de PCR e as incubações foram realizadas em um termociclador Tetrad. Os ensaios foram realizados em duplicata. Após cada incubação, 80 μl de ácido dinitrossalicíclico foram adicionados e as placas foram aquecidas até 95 °C durante 5 min. Uma alíquota de 135 μl da solução foi transferida para uma microplaca e a absorbância a 560 nm foi medida. Os perfis de temperatura para variantes de TrXyn2 selecionadas e controles genitores podem ser encontrados nas Figuras 3 a 8.
Exemplo 8: Rastreamento da biblioteca de Xyn2 de TRICHODERMA REESEI quanto a xilanases da Família 11 modificadas com atividade aumentada a pH mais baixo
[00362] Este exemplo descreve o rastreamento de xilanases Xyn2 de Trichoderma reesei modificadas quanto a atividade melhorada a pH mais baixo em relação à TrXyn2 genitora que havia sido clonada em Saccharomyces cerevisiae.
[00363] Uma alíquota de sobrenadante (50 μl) de cada microcultura genitora e variante foi adicionada a 50 μl de arabinoxilana de trigo a 1,0% (Megazyme; viscosidade média) tamponada com citrato de sódio 50 mM a pH 5 e incubada a 65 °C durante 1 hora. Um ensaio idêntico foi realizado a pH 3. Os sobrenadantes de microcultura para o ensaio a pH 5 foram diluídos 1 em 5 enquanto os sobrenadantes para o ensaio a pH 3 foram diluídos 1 em 3. Ambos os ensaios foram realizados em uma placa de PCR e as incubações foram realizadas em um termociclador Tetrad. Seis controles de TrXyn2 genitora usados para comparação estavam contidos em cada placa de PCR de 96 poços. Os ensaios foram realizados em duplicata. Após cada incubação, 80 μl de ácido dinitrossalicíclico foram adicionados e as placas foram aquecidas a 95 °C durante 5 min. Uma alíquota de 135 μl da solução foi transferida para uma microplaca e a absorbância a 560 nm foi medida.
[00364] A absorbância no caso dos dados relacionados com as placas incubadas a pH 5 e pH 3 foi multiplicada por 5 e 3 (fator de diluição do sobrenadante), respectivamente, para todas as variantes e controles genitores. Uma razão de atividade a pH baixo/elevado foi então calculada por divisão da absorbância corrigida a pH 3 pela absorbância corrigida a pH 5 para cada um dos seis controles genitores e uma média e o desvio padrão foram calculados. Uma razão de atividade a pH baixo/elevado foi também calculada para cada variante de TrXyn2. Os positivos foram depois selecionados mais do que 2 desvios padrão acima do controle genitor médio. Todas as TrXyn2s modificadas positivas foram novamente rastreadas para se reduzir o número de falsos positivos. Os dados de rastreamento de um ciclo completo de rastreamento podem ser encontrados na Figura 9.
Exemplo 9: Determinação do perfil de pH para variantes de xilanase da Família 11 de GH selecionadas
[00365] Uma alíquota de sobrenadante (50 μl; diluído 5 vezes) de microculturas selecionadas foi adicionada a 50 μl de arabinoxilana de trigo a 1,0% (Megazyme; viscosidade média) tamponada com citrato/fosfato 50 mM a vários pHs e incubada a 65 °C durante 1 hora. Estes ensaios foram realizados em uma placa de PCR e as incubações foram realizadas em um termociclador Tetrad. Os ensaios foram realizados em duplicata. Após cada incubação, 80 μl de ácido dinitrossalicíclico foram adicionados e as placas foram aquecidas até 95 °C durante 5 min. Uma alíquota de 135 μl da solução foi transferida para uma microplaca e a absorbância a 560 nm foi medida.
[00366] A invenção é adicionalmente definida pelos seguintes parágrafos:
[00367] Parágrafo 1. Uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase.
[00368] Parágrafo 2. Uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase e em que a variante tem identidade de sequências de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos %, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência de aminoácidos da xilanase genitora.
[00369] Parágrafo 3. Uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase e em que a variante tem identidade de sequências de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência de aminoácidos da xilanase genitora de SEQ ID NO:2 ou com os aminoácidos 34 a 223 de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
[00370] Parágrafo 4. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, que é uma variante de uma xilanase da Família 11 de GH genitora selecionada do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8; b. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos baixa estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); c. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou a sua sequência de cDNA; e d. um fragmento de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8, que tem atividade de xilanase.
[00371] Parágrafo 5. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 4 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO:2, os aminoácidos 34 a 223 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[00372] Parágrafo 6. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 5 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos baixa estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).
[00373] Parágrafo 7. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 5 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos média estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).
[00374] Parágrafo 8. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 5 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).
[00375] Parágrafo 9. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 5 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos muito alta estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).
[00376] Parágrafo 10. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 5 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou a sua sequência de cDNA.
[00377] Parágrafo 11. A variante de qualquer um dos parágrafos 2 a 5 em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um fragmento de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8 tendo atividade de xilanase.
[00378] Parágrafo 12. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8 compreende ou consiste em pelo menos 170 resíduos de aminoácidos.
[00379] Parágrafo 13. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8 compreende ou consiste em pelo menos 180 resíduos de aminoácidos.
[00380] Parágrafo 14. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou dos aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8 compreende ou consiste em pelo menos 185 resíduos de aminoácidos.
[00381] Parágrafo 15. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 185 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00382] Parágrafo 16. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreende os ou consiste nos aminoácidos 5 a 190 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00383] Parágrafo 17. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreende os ou consiste nos aminoácidos 10 a 190 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00384] Parágrafo 18. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreende os ou consiste nos aminoácidos 5 a 185 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00385] Parágrafo 19. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreende os ou consiste nos aminoácidos 10 a 180 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00386] Parágrafo 20. A variante do parágrafo 11, em que o fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 170 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00387] Parágrafo 21. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, em que o número de substituições de aminoácidos é 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, substituições de aminoácidos.
[00388] Parágrafo 22. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo uma substituição de aminoácido em duas posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00389] Parágrafo 23. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo uma substituição de aminoácido em três posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00390] Parágrafo 24. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo uma substituição de aminoácido em quatro posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00391] Parágrafo 25. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo uma substituição de aminoácido em cinco posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00392] Parágrafo 26. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo uma substituição de aminoácido em seis posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00393] Parágrafo 27. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo uma substituição de aminoácido em cada uma das posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00394] Parágrafo 28. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 120 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ser.
[00395] Parágrafo 29. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição T120S do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00396] Parágrafo 30. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 17 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Phe.
[00397] Parágrafo 31. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição Y17F do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00398] Parágrafo 32. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 24 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Cys.
[00399] Parágrafo 33. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição G24C do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00400] Parágrafo 34. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 46 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ile.
[00401] Parágrafo 35. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição V46I do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00402] Parágrafo 36. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido na posição correspondente à posição 49 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Met ou Glu.
[00403] Parágrafo 37. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição K49E ou K49M do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00404] Parágrafo 38. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 69 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Asp.
[00405] Parágrafo 39. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição N69D do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00406] Parágrafo 40. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 180 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Tyr.
[00407] Parágrafo 41. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende a ou consiste na substituição F180Y do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00408] Parágrafo 42. A variante do parágrafo 22, em que as duas posições são selecionadas do grupo consistindo em: 120 e 17; 120 e 24; 120 e 46; 120 e 49; 120 e 69; 120 e 180; 17 e 24; 17 e 46; 17 e 49; 17 e 69; 17 e 180; 24 e 46; 24 e 49; 24 e 69; 24 e 180; 46 e 49; 46 e 69; 46 e 180; 49 e 69; 49 e 180; 69 e 180.
[00409] Parágrafo 43. A variante do parágrafo 23, em que as três posições são selecionadas do grupo consistindo em: 120, 17 e 24; 120, 17 e 46; 120, 17 e 49; 120, 17 e 69; 120, 17 e 180; 120, 24 e 46; 120, 24 e 49; 120, 24 e 69; 120, 24 e 180; 120, 46 e 49; 120, 46 e 69; 120, 46 e 180; 120, 49 e 69; 120, 49 e 180; 120, 69 e 180; 17, 24 e 46; 17, 24 e 49; 17, 24 e 69; 17, 24 e 180; 17, 46 e 49; 17, 46 e 69; 17, 46 e 180; 17, 49 e 69; 17, 49 e 180; 17, 69 e 180; 24, 46 e 49; 24, 46 e 69; 24, 46 e 180; 24, 49 e 69; 24, 49 e 180; 24, 69 e 180; 46, 49 e 69; 46, 49 e 180; 46, 69 e 180; 49, 69 e 180.
[00410] Parágrafo 44. A variante do parágrafo 24, em que as quatro posições são selecionadas do grupo consistindo em: 120, 17, 24 e 46; 120, 17, 24 e 49; 120, 17, 24 e 69; 120, 17, 24 e 180; 120, 17, 46 e 49; 120, 17, 46 e 69; 120, 17, 46 e 180; 120, 17, 49 e 69; 120, 17, 49 e 180; 120, 17, 69 e 180; 120, 24, 46 e 49; 120, 24, 46 e 69; 120, 24, 46 e 180; 120, 24, 49 e 69; 120, 24, 49 e 180; 120, 24, 69 e 180; 120, 46, 49 e 69; 120, 46, 49 e 180; 120, 46, 69 e 180; 120, 49, 69 e 180; 17, 24, 46 e 49; 17, 24, 46 e 69; 17, 24, 46 e 180; 17, 24, 49 e 69; 17, 24, 49 e 180; 17, 24, 69 e 180; 17, 46, 49 e 69; 17, 46, 49 e 180; 17, 46, 69 e 180; 17, 49, 69 e 180; 24, 46, 49 e 69; 24, 46, 49 e 180; 24, 46, 69 e 180; 24, 49, 69 e 180; 46, 49, 69 e 180.
[00411] Parágrafo 45. A variante do parágrafo 25, em que as cinco posições são selecionadas do grupo consistindo em: 120, 17, 24, 46 e 49; 120, 17, 24, 46 e 69; 120, 17, 24, 46 e 180; 120, 17, 24, 49 e 69; 120, 17, 24, 49 e 180; 120, 17, 24, 69 e 180; 120, 17, 46, 49 e 69; 120, 17, 46, 49 e 180; 120, 17, 46, 69 e 180; 120, 17, 49, 69 e 180; 120, 24, 46, 49 e 69; 120, 24, 46, 49 e 180; 120, 24, 46, 69 e 180; 120, 24, 49, 69 e 180; 120, 46, 49, 69 e 180; 17, 24, 46, 49 e 69; 17, 24, 46, 49 e 180; 17, 24, 46, 69 e 180; 17, 24, 49, 69 e 180; 17, 46, 49, 69 e 180; 24, 46, 49, 69 e 180.
[00412] Parágrafo 46. A variante do parágrafo 26, em que as seis posições são selecionadas do grupo consistindo em: 120, 17, 24, 46, 49 e 69; 120, 17, 24, 46, 49 e 180; 120, 17, 24, 46, 69 e 180; 120, 17, 24, 49, 69 e 180; 120, 17, 46, 49, 69 e 180; 120, 24, 46, 49, 69 e 180; 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00413] Parágrafo 47. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00414] Parágrafo 48. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende duas ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00415] Parágrafo 49. A variante do parágrafo 49, em que as duas substituições são selecionadas do grupo consistindo em: T120S e Y17F; T120S e G24C; T120S e V46I; T120S e K49M ou K49E; T120S e N69D; T120S e F180Y; Y17F e G24C; Y17F e V46I; Y17F e K49M ou K49E; Y17F e N69D; Y17F e F180Y; G24C e V46I; G24C e K49M ou K49E; G24C e N69D; G24C e F180Y; V46I e K49M ou K49E; V46I e N69D; V46I e F180Y; K49M ou K49E e N69D; K49M ou K49E e F180Y; N69D e F180Y.
[00416] Parágrafo 50. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende três ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00417] Parágrafo 51. A variante do parágrafo 51, em que as três substituições são selecionadas do grupo consistindo em: T120S, Y17F e G24C; T120S, Y17F e V46I; T120S, Y17F e K49M ou K49E; T120S, Y17F e N69D; T120S, Y17F e F180Y; T120S, G24C e V46I; T120S, G24C e K49M ou K49E; T120S, G24C e N69D; T120S, G24C e F180Y; T120S, V46I e K49M ou K49E; T120S, V46I e N69D; T120S, V46I e F180Y; T120S, K49M ou K49E e N69D; T120S, K49M ou K49E e F180Y; T120S, N69D e F180Y; Y17F, G24C e V46I; Y17F, G24C e K49M ou K49E; Y17F, G24C e N69D; Y17F, G24C e F180Y; Y17F, V46I e K49M ou K49E; Y17F, V46I e N69D; Y17F, V46I e F180Y; Y17F, K49M ou K49E e N69D; Y17F, K49M ou K49E e F180Y; Y17F, N69D e F180Y; G24C, V46I e K49M ou K49E; G24C, V46I e N69D; G24C, V46I e F180Y; G24C, K49M ou K49E e N69D; G24C, K49M ou K49E e F180Y; G24C, N69D e F180Y; V46I, K49M ou K49E e N69D; V46I, K49M ou K49E e F180Y; V46I, N69D e F180Y; K49M ou K49E, N69D e F180Y.
[00418] Parágrafo 52. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende quatro ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00419] Parágrafo 53. A variante do parágrafo 53, em que as quatro substituições são selecionadas do grupo consistindo em: T120S, Y17F, G24C e V46I; T120S, Y17F, G24C e K49M ou K49E; T120S, Y17F, G24C e N69D; T120S, Y17F, G24C e F180Y; T120S, Y17F, V46I e K49M ou K49E; T120S, Y17F, V46I e N69D; T120S, Y17F, V46I e F180Y; T120S, Y17F, K49M ou K49E e N69D; T120S, Y17F, K49M ou K49E e F180Y; T120S, Y17F, N69D e F180Y; T120S, G24C, V46I e K49M ou K49E; T120S, G24C, V46I e N69D; T120S, G24C, V46I e F180Y; T120S, G24C, K49M ou K49E e N69D; T120S, G24C, K49M ou K49E e F180Y; T120S, G24C, N69D e F180Y; T120S, V46I, K49M ou K49E e N69D; T120S, V46I, K49M ou K49E e F180Y; T120S, V46I, N69D e F180Y; T120S, K49M ou K49E, N69D e F180Y; Y17F, G24C, V46I e K49M ou K49E; Y17F, G24C, V46I e N69D; Y17F, G24C, V46I e F180Y; Y17F, G24C, K49M ou K49E e N69D; Y17F, G24C, K49M ou K49E e F180Y; Y17F, G24C, N69D e F180Y; Y17F, V46I, K49M ou K49E e N69D; Y17F, V46I, K49M ou K49E e F180Y; Y17F, V46I, N69D e F180Y; Y17F, K49M ou K49E, N69D e F180Y; G24C, V46I, K49M ou K49E e N69D; G24C, V46I, K49M ou K49E e F180Y; G24C, V46I, N69D e F180Y; G24C, K49M ou K49E, N69D e F180Y; V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y.
[00420] Parágrafo 54. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende cinco ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00421] Parágrafo 55. A variante do parágrafo 55, em que as cinco substituições são selecionadas do grupo consistindo em: T120S, Y17F, G24C, V46I e K49M ou K49E; T120S, Y17F, G24C, V46I e N69D; T120S, Y17F, G24C, V46I e F180Y; T120S, Y17F, G24C, K49M ou K49E e N69D; T120S, Y17F, G24C, K49M ou K49E e F180Y; T120S, Y17F, G24C, N69D e F180Y; T120S, Y17F, V46I, K49M ou K49E e N69D; T120S, Y17F, V46I, K49M ou K49E e F180Y; T120S, Y17F, V46I, N69D e F180Y; T120S, Y17F, K49M ou K49E, N69D e F180Y; T120S, G24C, V46I, K49M ou K49E e N69D; T120S, G24C, V46I, K49M ou K49E e F180Y; T120S, G24C, V46I, N69D e F180Y; T120S, G24C, K49M ou K49E, N69D e F180Y; T120S, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y; Y17F, G24C, V46I, K49M ou K49E e N69D; Y17F, G24C, V46I, K49M ou K49E e F180Y; Y17F, G24C, V46I, N69D e F180Y; Y17F, G24C, K49M ou K49E, N69D e F180Y; Y17F, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y; G24C, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y.
[00422] Parágrafo 56. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende seis ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00423] Parágrafo 57. A variante do parágrafo 57, em que as seis substituições são selecionadas do grupo consistindo em: T120S, Y17F, G24C,V46I, K49M ou K49E e N69D; T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M ou K49E e F180Y; T120S, Y17F, G24C, V46I, N69D e F180Y; T120S, Y17F, G24C, K49M ou K49E, N69D e F180Y; T120S, Y17F, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y; T120S, G24C, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y; Y17F, G24C, V46I, K49M ou K49E, N69D e F180Y.
[00424] Parágrafo 58. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, que compreende as substituições de aminoácidos T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00425] Parágrafo 59. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 10 de SEQ ID NO: 2.
[00426] Parágrafo 60. A variante do parágrafo 58, em que o aminoácido da substituição em uma posição correspondendo à posição 10 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Gln, Tyr ou Arg.
[00427] Parágrafo 61. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 105 de SEQ ID NO: 2.
[00428] Parágrafo 62. A variante do parágrafo 61, em que o aminoácido da substituição em uma posição correspondendo à posição 105 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Tyr ou His.
[00429] Parágrafo 63. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido nas posições correspondendo às posições 10, 27 e 29 de SEQ ID NO: 2.
[00430] Parágrafo 64. A variante do parágrafo 63, em que o aminoácido da substituição em uma posição correspondendo à posição 10 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Val, preferencialmente por His; o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 27 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Val, preferencialmente por Met; e o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 29 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Leu.
[00431] Parágrafo 65. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido nas posições correspondendo às posições 75, 125 e 129 de SEQ ID NO: 2.
[00432] Parágrafo 66. A variante do parágrafo 65, em que o aminoácido da substituição em uma posição correspondendo à posição 75 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ala; o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 125 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ala; e o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 129 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Glu.
[00433] Parágrafo 67. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido nas posições correspondendo às posições 11, 40 e 58 de SEQ ID NO: 2.
[00434] Parágrafo 68. A variante do parágrafo 67, em que o aminoácido da substituição em uma posição correspondendo à posição 11 é substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Asp; o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 40 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Arg; e o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 58 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Arg.
[00435] Parágrafo 69. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido em uma das ou ambas as posições correspondendo às posições 99 e 118 de SEQ ID NO: 2.
[00436] Parágrafo 70. A variante do parágrafo 69, em que o aminoácido da substituição em uma das ou ambas as posições correspondendo às posições 99 e 118 é substituído por Cys.
[00437] Parágrafo 71. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 131 de SEQ ID NO: 2.
[00438] Parágrafo 72. A variante do parágrafo 71, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 131 é substituído por Asn.
[00439] Parágrafo 73. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, compreendendo adicionalmente uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo à posição 162 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00440] Parágrafo 74. A variante do parágrafo 73, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 73 é substituído por His.
[00441] Parágrafo 75. A variante de qualquer um dos parágrafos 47 a 58, que compreende adicionalmente as substituições de aminoácidos N10H, Y27M e N29L.
[00442] Parágrafo 76. A variante do parágrafo 75, que compreende adicionalmente as substituições de aminoácidos S75A, Q125A e I129E.
[00443] Parágrafo 77. A variante do parágrafo 76, que compreende adicionalmente as substituições de aminoácidos N11D, S40R e K58R.
[00444] Parágrafo 78. A variante do parágrafo 77, que compreende adicionalmente as substituições de aminoácidos S99C e Y118C.
[00445] Parágrafo 79. A variante do parágrafo 78, que compreende adicionalmente a substituição de aminoácido T131N.
[00446] Parágrafo 80. A variante do parágrafo 79, que compreende adicionalmente a substituição de aminoácido Q162H.
[00447] Parágrafo 81. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 80, que possui uma atividade térmica melhorada em relação a uma xilanase da Família 11 de GH genitora a partir da qual é derivada a variante.
[00448] Parágrafo 82. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 80, que possui uma termoestabilidade melhorada em relação a uma xilanase da Família 11 de GH genitora a partir da qual é derivada a variante.
[00449] Parágrafo 83. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 80, que possui atividade térmica e termoestabilidade melhoradas em relação a uma xilanase da Família 11 de GH genitora a partir da qual é derivada a variante.
[00450] Parágrafo 84. A variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 80, que possui um perfil de atividade em pH mais baixo em comparação com uma xilanase da Família 11 de GH genitora a partir da qual é derivada a variante.
[00451] Parágrafo 85. Um polinucleotídeo que codifica a variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 84.
[00452] Parágrafo 86. Uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 85.
[00453] Parágrafo 87. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 86.
[00454] Parágrafo 88. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 85.
[00455] Parágrafo 89. Um método de produção de uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo: a. cultivar a célula hospedeira do parágrafo 88 sob condições adequadas para expressão da variante; e b. recuperar a variante.
[00456] Parágrafo 90. Uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica transformada com o polinucleotídeo do parágrafo 85.
[00457] Parágrafo 91. Um método de obtenção de uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo introduzir em uma xilanase da Família 11 de GH genitora uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 29 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase; e recuperar a variante.
[00458] Parágrafo 92. Uma composição compreendendo a variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 84.
[00459] Parágrafo 93. A composição do parágrafo 92, compreendendo adicionalmente uma ou mais atividades enzimáticas, tais como celobioidrolase, endoglucanase, beta-glucosidase, endo-beta-1,3(4)- glucanase, glicoidrolase, xiloglucanase, xilanase, xilosidase, arabinofuranosidase, alfa-glucuronidase, acetil xilana esterase, mananase, manosidase, alfa-galactosidase, manana acetil esterase, galactanase, arabinanase, pectato liase, pectinase liase, pectato liase, poligalacturonase, pectina acetil esterase, pectina metil esterase, beta-galactosidase, galactanase, arabinanase, alfa-arabinofuranosidase, ramnogalacturonase, ácido ferrúlico esterases, ramnogalacturonana liase, ramnogalacturonana acetil esterase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, ramnogalacturonana liase, lignina peroxidases, peroxidases dependentes de manganês, peroxidases híbridas, com propriedades combinadas de lignina peroxidases e peroxidases dependentes de manganês, glucoamilase, amilase, protease e lacase.
[00460] Parágrafo 94. A composição do parágrafo 92 ou 93, em que a composição está na forma de uma composição líquida ou seca.
[00461] Parágrafo 95. A composição de qualquer um dos parágrafos 92 a 94, em que a composição é uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células.
[00462] Parágrafo 96. A composição de qualquer um dos parágrafos 92 a 95 compreendendo adicionalmente um conservante e/ou um agente antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático).
[00463] Parágrafo 97. Um método de degradação de um material contendo xilana por tratamento do material com uma variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 84.
[00464] Parágrafo 98. Um método de degradação de um material contendo xilana por tratamento do material com uma composição de qualquer um dos parágrafos 92 a 96.
[00465] Parágrafo 99. Um método de tratamento de uma polpa, compreendendo colocar a polpa em contato com uma variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 84.
[00466] Parágrafo 100. Um método de tratamento de uma polpa, compreendendo colocar a polpa em contato com uma composição de qualquer um dos parágrafos 92 a 96.
[00467] Parágrafo 101. O método do parágrafo 99 ou 100, em que o tratamento da polpa com a variante aumenta o brilho da polpa em pelo menos 1,05 vezes, por exemplo, pelo menos 1,1 vez, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes em comparação com o tratamento com o genitor.
[00468] Parágrafo 102. Um método de produção de xilose, compreendendo colocar um material contendo xilana em contato com uma variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 84.
[00469] Parágrafo 103. Um método de produção de xilose, compreendendo colocar um material contendo xilana em contato com uma composição de qualquer um dos parágrafos 92 a 96.
[00470] Parágrafo 104. Uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase e em que a variante tem identidade de sequências de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos %, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[00471] Parágrafo 105. Uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições correspondendo às posições 49, 55, 79, 82, 105, 155 e 215 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8, em que a variante tem atividade de xilanase e em que a variante tem identidade de sequências de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos %, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[00472] Parágrafo 106. A variante do parágrafo 105, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 49 de SEQ ID NO: 8 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Phe.
[00473] Parágrafo 107. A variante de qualquer um dos parágrafos 105 a 106, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 55 de SEQ ID NO: 8 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Cys.
[00474] Parágrafo 108. A variante de qualquer um dos parágrafos 105 a 107, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 79 de SEQ ID NO: 8 está substituído porAla, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Ile.
[00475] Parágrafo 109. A variante de qualquer um dos parágrafos 105 a 108, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 82 de SEQ ID NO: 8 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Met ou Glu.
[00476] Parágrafo 110. A variante de qualquer um dos parágrafos 105 a 109, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 105 de SEQ ID NO: 8 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Asp.
[00477] Parágrafo 111. A variante de qualquer um dos parágrafos 105 a 110, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 155 de SEQ ID NO: 8 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ser.
[00478] Parágrafo 112. A variante de qualquer um dos parágrafos 105 a 111, em que o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 215 de SEQ ID NO: 8 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Tyr.
[00479] Em uma modalidade adicional, a invenção é caracterizada pelo conjunto de itens aqui abaixo.
[00480] 1. Uma variante de xilanase da Família 11 de GH,compreendendo uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase, e em que a variante tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
[00481] 2. A variante do item 1, que é uma variante de uma xilanase da Família 11 de GH genitora selecionada do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; b. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos média estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); c. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; e d. um fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, que tem atividade de xilanase.
[00482] 3. A variante do item 2, em que a xilanase da Família 11 de GH genitora tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00483] 4. A variante do item 2 ou 3, em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-alta estringência, condições de alta estringência ou condições de muito alta estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou (ii) o complemento de comprimento total de (i).
[00484] 5. A variante de qualquer um dos itens 2 a 4, em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA.
[00485] 6. A variante de qualquer um dos itens 2 a 5, em que a xilanase da Família 11 de GH genitora compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2.
[00486] 7. A variante de qualquer um dos itens 2 a 5, em que a xilanase da Família 11 de GH genitora compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4.
[00487] 8. A variante de qualquer um dos itens 2 a 7, em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é um fragmento de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que o fragmento tem atividade de xilanase.
[00488] 9. A variante de qualquer um dos itens 2 a 8, que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da xilanase da Família 11 de GH genitora.
[00489] 10. A variante de qualquer um dos itens 1 a 9, em que a variante consiste em 170 a 190, por exemplo, 180 a 190, ou 185 a 190, aminoácidos.
[00490] 11. A variante de qualquer um dos itens 1 a 10, em que o número de substituições de aminoácidos é 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, substituições de aminoácidos.
[00491] 12. A variante de qualquer um dos itens 1 a 11, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 120.
[00492] 13. A variante do item 12, em que a alteração é uma substituição com Ser.
[00493] 14. A variante de qualquer um dos itens 1 a 13, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 17.
[00494] 15. A variante do item 14, em que a alteração é uma substituição com Phe.
[00495] 16. A variante de qualquer um dos itens 1 a 15, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 24.
[00496] 17. A variante do item 16, em que a alteração é uma substituição com Cys.
[00497] 18. A variante de qualquer um dos itens 1 a 17, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 46.
[00498] 19. A variante do item 18, em que a alteração é uma substituição com Ile.
[00499] 20. A variante de qualquer um dos itens 1 a 19, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 49.
[00500] 21. A variante do item 20, em que a alteração é uma substituição com Met ou Glu.
[00501] 22. A variante de qualquer um dos itens 1 a 21, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 69.
[00502] 23. A variante do item 22, em que a alteração é uma substituição com Asp.
[00503] 24. A variante de qualquer um dos itens 1 a 23, que compreende uma alteração em uma posição correspondendo à posição 180.
[00504] 25. A variante do item 24, em que a alteração é uma substituição com Tyr.
[00505] 26. A variante de qualquer um dos itens 1 a 25, que compreende uma alteração em duas posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00506] 27. A variante de qualquer um dos itens 1 a 25, que compreende uma alteração em três posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00507] 28. A variante de qualquer um dos itens 1 a 25, que compreende uma alteração em quatro posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00508] 29. A variante de qualquer um dos itens 1 a 25, que compreende uma alteração em cinco posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00509] 30. A variante de qualquer um dos itens 1 a 25, que compreende uma alteração em seis posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00510] 31. A variante de qualquer um dos itens 1 a 25, que compreende uma alteração em cada posição correspondendo a qualquer uma as posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
[00511] 32. A variante de qualquer um dos itens 1 a 31, que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y.
[00512] 33. A variante do item 32 que compreende T120S.
[00513] 34. A variante do item 32 que compreende adicionalmente uma ou mais de N10Q, L105H, L105Y ou Q162H.
[00514] 35. A variante do item 34 que compreende T120S e L105Y.
[00515] 36. A variante do item 34 que compreende T120S, L105Y,Q162H e F180Y.
[00516] 37. A variante do item 34 que compreende T120S, N10Q, K49E, H105Y, Q162H e F180Y.
[00517] 38. A variante do item 34 que compreende T120S, G24C, L105Y, Q162H e F180Y.
[00518] 39. A variante de qualquer um dos itens 1 a 38, que tem atividade térmica, termoestabilidade ou ambas melhoradas em relação a uma xilanase GH11 genitora a partir da qual é derivada a variante.
[00519] 40. A variante de qualquer um dos itens 1 a 38, que tem um perfil de atividade em pH mais baixo em comparação com uma xilanase GH11 genitora a partir da qual é derivada a variante.
[00520] 41. Um polinucleotídeo que codifica a variante de qualquer um dos itens 1 a 40.
[00521] 42. Uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo do item 41.
[00522] 43. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do item 41.
[00523] 44. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo do item 41.
[00524] 45. Um método de produção de uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo: a. cultivar a célula hospedeira do item 44 sob condições adequadas para expressão da variante; e b. recuperar a variante.
[00525] 46. Uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica transformada com o polinucleotídeo do item 41.
[00526] 47. Um método de produção de uma variante de qualquer um dos itens 1 a 40, compreendendo: a. cultivar uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo que codifica a variante sob condições conducentes à produção da variante; e b. recuperar a variante.
[00527] 48. Um método de obtenção de uma variante de xilanase da Família 11 de GH, compreendendo introduzir em uma xilanase da Família 11 de GH genitora uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase; e recuperar a variante.
[00528] 49. Uma composição compreendendo a variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 40.
[00529] 50. A composição do item 49, compreendendo adicionalmente uma ou mais atividades enzimáticas selecionadas do grupo consistindo em: celobioidrolase, endoglucanase, beta-glucosidase, endo-beta-1,3(4)-glucanase, glicoidrolase, xiloglucanase, xilanase, xilosidase, arabinofuranosidase, alfa- glucuronidase, acetil xilana esterase, mananase, manosidase, alfa- galactosidase, manana acetil esterase, galactanase, arabinanase, pectato liase, pectinase liase, pectato liase, poligalacturonase, pectina acetil esterase, pectina metil esterase, beta-galactosidase, galactanase, arabinanase, alfa- arabinofuranosidase, ramnogalacturonase, ácido ferrúlico esterases, ramnogalacturonana liase, ramnogalacturonana acetil esterase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, ramnogalacturonana liase, lignina peroxidases, peroxidases dependentes de manganês, peroxidases híbridas, com propriedades combinadas de lignina peroxidases e peroxidases dependentes de manganês, glucoamilase, amilase, protease e lacase.
[00530] 51. A composição do item 49 ou 50, em que a composição está na forma de uma composição líquida ou seca.
[00531] 52. A composição de qualquer um dos itens 49 a 51, em que a composição é uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células.
[00532] 53. A composição de qualquer um dos itens 49 a 52 compreendendo adicionalmente um conservante e/ou um agente antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático).
[00533] 54. Um método de degradação de um material contendo xilana por tratamento do material com uma variante de qualquer um dos itens 1 a 40.
[00534] 55. Um método de degradação de um material contendo xilana por tratamento do material com uma composição de qualquer um dos itens 49 a 52.
[00535] 56. Um método de tratamento de uma polpa, compreendendo colocar a polpa em contato com uma variante de qualquer um dos itens 1 a 40.
[00536] 57. Um método de tratamento de uma polpa, compreendendo colocar a polpa em contato com uma composição de qualquer um dos itens 49 a 52.
[00537] 58. Um método de produção de xilose, compreendendo colocar um material contendo xilana em contato com uma variante de qualquer um dos itens 1 a 40.
[00538] 59. Um método de produção de xilose, compreendendo colocar um material contendo xilana em contato com uma composição de qualquer um dos itens 49 a 52.

Claims (14)

1. Variante de uma xilanase da Família 11 de GH genitora, caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido em três ou mais posições correspondendo a T120S, Y17F, G24C, V46I, K49M, K49E, N69D e F180Y de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a variante tem atividade de xilanase, e em que a xilanase da Família 11 de GH genitora é SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou aminoácidos 28 a 231 de SEQ ID NO: 8.
2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma variante de uma xilanase da Família 11 de GH genitora que é um polipeptídeo codificado pelos nucleotídeos 100-272 e 381777 da SEQ ID NO: 1, ou nucleotídeos 84-693 da SEQ ID NO: 7.
3. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante consiste em 170 a 190 aminoácidos.
4. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o número de substituições de aminoácidos é 3 a 7 substituições de aminoácidos.
5. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma alteração em quatro posições correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
6. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma alteração em cada posição correspondendo a quaisquer das posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
7. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem atividade térmica, termoestabilidade ou ambas melhoradas em relação a uma xilanase GH11 genitora tendo a mesma sequência de aminoácido da variante exceto pela substituição em três ou mais posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
8. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem um perfil de atividade em pH mais baixo em comparação com uma xilanase GH11 genitora tendo a mesma sequência de aminoácido da variante exceto pela substituição em três ou mais posições correspondendo às posições 120, 17, 24, 46, 49, 69 e 180.
9. Polinucleotídeo que codifica a variante como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência codificante da xilanase da Família 11 de GH genitora é nucleotídeos 100-272 e 381-777 de SEQ ID NO: 1, ou nucleotídeos 84-693 de SEQ ID NO: 7.
10. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 9.
11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 9.
12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 9, que é uma célula hospedeira bacteriana ou fúngica.
13. Método de produção de uma variante de xilanase da Família 11 de GH, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 12, sob condições adequadas para expressão da variante; e b. recuperar a variante.
14. Método de degradação de um material contendo xilana, caracterizado pelo fato de que é por tratamento do material com uma variante como definida na reivindicação 1.
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