BR102022013522A2

BR102022013522A2 - USE OF A DYNAMIC METHOD FOR SENSING DISSOLVED O2 IN BLOOD

Info

Publication number: BR102022013522A2
Application number: BR102022013522-3A
Authority: BR
Inventors: Tatiana Duque Martins Ertner De Almeida; Diéricon Sousa Cordeiro; Igor Lafaete De Freitas Pereira Morais
Original assignee: Universidade Federal De Goiás
Priority date: 2022-07-07
Filing date: 2022-07-07
Publication date: 2024-02-27

Abstract

A presente invenção trata do uso de um método de sensoriamento para determinar quantidades distintas do gás oxigênio dissolvido (O2) em amostras de sangue. que utiliza um sistema fluorescente composto por nanoestruturas auto-organizadas de peptídeos, preferencialmente derivados da difenilalanina, dopados com um corante fluorescente derivado da cumarina, sorvidos em um substrato transparente. A presente invenção opera por meio do monitoramento da variação do comportamento fotofísico do sistema de sensoriamento quando na presença de oxigênio dissolvido em sangue, de modo que o que se usa como parâmetro são os tempos de vida de fluorescência e suas alterçãoes dinâmicas, ocasionadas pelas interação específica com o oxigênio molecular. O método da presente invenção utiliza o sistema de sensoriamento em fase líquida ou sorvido em um substrato transparente. A interação do analito com o sistema causa uma alteração na resposta dinâmica do sistema que é correlacionada a variações mínimas de concentração de oxigênio, podendo detectar quantidades de O2 no sangue da ordem de frações de nanomoles. A resposta é registrada por um microscópio de imageamento por tempo de vida de fluorescência (FLIM) que esteja disponível e que permite também mapeamento local das variações da concentração do analito de interesse.The present invention deals with the use of a sensing method to determine distinct amounts of dissolved oxygen gas (O2) in blood samples. which uses a fluorescent system composed of self-organized peptide nanostructures, preferably derived from diphenylalanine, doped with a fluorescent dye derived from coumarin, adsorbed on a transparent substrate. The present invention operates by monitoring the variation in the photophysical behavior of the sensing system when in the presence of oxygen dissolved in blood, so that what is used as a parameter are the fluorescence lifetimes and their dynamic changes, caused by the interactions specific with molecular oxygen. The method of the present invention uses the sensing system in liquid phase or sorbed on a transparent substrate. The interaction of the analyte with the system causes a change in the dynamic response of the system that is correlated to minimal variations in oxygen concentration, being able to detect amounts of O2 in the blood in the order of fractions of nanomoles. The response is recorded by a fluorescence lifetime imaging microscope (FLIM) that is available and which also allows local mapping of variations in the concentration of the analyte of interest.

Description

FIELD OF INVENTION

[001] A presente invenção trata de um método de sensoriamento sensível a quantidades distintas do gás oxigênio dissolvido em sangue, que utiliza um sistema fluorescente composto por nanoestruturas auto-organizadas de peptídeos dopados com um corante fluorescente derivado da cumarina, sorvidos em um substrato transparente. A presente invenção opera por meio do monitoramento da variação do comportamento fotofísico do sistema de sensoriamento quando na presença de oxigênio (O2) dissolvido em sangue, de modo que o que se usa como parâmetro são os tempos de vida de fluorescência e suas alterçãoes dinâmicas, ocasionadas pelas interação específica com o oxigênio molecular.[001] The present invention deals with a sensing method sensitive to different amounts of oxygen gas dissolved in blood, which uses a fluorescent system composed of self-organized nanostructures of peptides doped with a fluorescent dye derived from coumarin, sorbed on a transparent substrate . The present invention operates by monitoring the variation in the photophysical behavior of the sensing system when in the presence of oxygen (O2) dissolved in blood, so that what is used as a parameter are the fluorescence lifetimes and their dynamic changes, caused by specific interaction with molecular oxygen.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[002] No estado da técnica foram encontradas patentes que relatam sensores ou sistemas dedicados a sensoriamento que fossem construídos a partir de modificações químicas de nanotubos de carbono, filmes poliméricos, clusters inorgânicos ou nanoestruturas metálicas, contendo corantes fluorescentes e até derivados de cumarina. No entanto, não se encontram, além dos pedidos de patentes relacionados ao desenvolvimento da presente invenção, patentes descrevendo sistemas luminescentes que empreguem nanoestruturas de peptídeos combinadas a fluoróforos orgânicos para sensoriamento ou qualquer outro uso. Especialmente, não se encontra no estado da técnica, documentos ou provas de métodos ou dispositivos que analisem as respostas dinâmicas da fluorescência quando na presença do gás oxigênio, da forma como a presente invenção analisa. Para o funcionamento da presente invenção, o sistema de sensoriamento desenvolvido, se utiliza da conhecida propriedade da molécula de oxigênio de interagir principalmente com moléculas orgânicas quando essas se encontram no estado eletrônico excitado, ou seja, após essas moléculas terem sido estimuladas a ter seus elétrons de valência realocados temporariamente do estado eletrônico fundamental (S0), aquele em que os elétrons passam a maior parte do tempo, a estados eletrônicos excitados (Sn, com n *0). Dessa interação, mudanças nas propriedades fotofísicas das moléculas orgânicas podem ser identificadas e acompanhadas e, portanto, relacionadas com características moleculares que são inerentes da molécula de modo que a intensidade e a frequência da mudança podem ser interpretadas para identificação e quantificação da presença do oxigênio presente na amostra, uma vez que tais mudanças de comportamento só diretamente dependentes da quantidade de oxigênio capaz de interagir com o composto orgânico. O uso da fluorescência de diversos tipos de compostos como forma de detecção de uma diversidade de analitos é descrito no estado da técnica. Em especial, sensores ópticos e fluorescentes de diferentes composições, que tem seu funcionamento baseado na resposta fluorescente fotoestacionária, ou seja, na observação da emissão de luz do sensor e qualquer alteração nela causada pela presença do analito de interesse, são descritos no estado técnica. Portanto, sabe-se que existem diversos sensores e sistemas para sensoriamento que fazem uso de alterações nas respostas ópticas dos mateiais que os compõem, como variações de intensidade de emissão ou absorção de luz e isso dá origem a diversos sensores que se baseiam na ocorrência do fenômeno da fluorescência ou fosforescência e a medida está relaxionada com a potência (intensidade) da luz que advém do sistema analítico. Essa intensidade ou potência é que informa sobre concentrações dos analitos. Na presente invenção, no entanto, não é se utiliza a alteração da intensidade da luz proveniente de processos fotofísicos do sistema de sensoriamento para correlacionar com a concentraçaão do analito. Na presente invenção, acompanha-se o processo de população e despopulação do estado eletrônico excitado, que são alterados pela interação, molécula a molécula, com o oxigênio presente na amostra, que pode ser um fluido complexo como sangue ou cerveja. Avalia-se a dinâmica da desativação do estado eletrônico excitado, tendo como parâmetros os valores de tempos de vida de fluorescência, a equação que descreve a curva de decaimento e os fatores pré-exponenciais que se obtêm, de modo a relacionar as mudanças de comportamento a quantidade de oxigênio presente na amostra e que foi capaz de causar tal alteração. Em um aspecto da presente invenção, ela foi testada frente amostras de sangue, sendo capaz de identificar quantidades diferentes de oxigênio em amostra distintas. No entanto, no estado da técnica não há sensores ou sistemas para sensoriamento que se utilizem unicamente das alterações fotofísicas que ocorrem no estado excitado do sistema como forma de relacionar com quantidades de um analito. Até o momento, as mudanças de comportamento dos estados eletrônicos excitados não foram aproveitadas para sensoriamento, o que consiste na grande inovação dessa invenção e o seu principal diferencial está no fato de ser utilizado para detectar quantitativamente oxigênio dissolvido no sangue. Ainda, esse sistema tem como vantagens o fato de ser de fácil obtenção, por meio de interação física entre um composto biológico auto-organizado com um corante orgânico, ambos biocompatíveis e que resultam em um material com propriedades fotofísicas distintas, bastante sensível à presença de oxigênio, em especial, quando dissolvido no sangue.[002] In the prior art, patents were found that report sensors or systems dedicated to sensing that were built from chemical modifications of carbon nanotubes, polymeric films, inorganic clusters or metallic nanostructures, containing fluorescent dyes and even coumarin derivatives. However, in addition to patent applications related to the development of the present invention, there are no patents describing luminescent systems that employ peptide nanostructures combined with organic fluorophores for sensing or any other use. In particular, there are no documents or proof of methods or devices in the prior art that analyze the dynamic responses of fluorescence when in the presence of oxygen gas, in the way that the present invention analyzes. For the operation of the present invention, the developed sensing system uses the well-known property of the oxygen molecule to interact mainly with organic molecules when they are in the excited electronic state, that is, after these molecules have been stimulated to have their electrons of valence temporarily relocated from the ground electronic state (S0), the one in which electrons spend most of their time, to excited electronic states (Sn, with n *0). From this interaction, changes in the photophysical properties of organic molecules can be identified and monitored and, therefore, related to molecular characteristics that are inherent to the molecule so that the intensity and frequency of the change can be interpreted to identify and quantify the presence of oxygen present. in the sample, since such changes in behavior only directly depend on the amount of oxygen capable of interacting with the organic compound. The use of fluorescence from different types of compounds as a means of detecting a variety of analytes is described in the prior art. In particular, optical and fluorescent sensors of different compositions, which operate based on the photostationary fluorescent response, that is, on the observation of the sensor's light emission and any change in it caused by the presence of the analyte of interest, are described in the technical specification. Therefore, it is known that there are several sensors and sensing systems that make use of changes in the optical responses of the materials that compose them, such as variations in the intensity of emission or absorption of light and this gives rise to several sensors that are based on the occurrence of the phenomenon of fluorescence or phosphorescence and the measurement is relaxed with the power (intensity) of the light that comes from the analytical system. This intensity or power is what informs about concentrations of the analytes. In the present invention, however, the change in light intensity from photophysical processes of the sensing system is not used to correlate with the concentration of the analyte. In the present invention, the process of population and depopulation of the excited electronic state is monitored, which are altered by the interaction, molecule by molecule, with the oxygen present in the sample, which can be a complex fluid such as blood or beer. The dynamics of the deactivation of the excited electronic state are evaluated, using as parameters the fluorescence lifetime values, the equation that describes the decay curve and the pre-exponential factors that are obtained, in order to relate the changes in behavior the amount of oxygen present in the sample and which was capable of causing such a change. In one aspect of the present invention, it was tested against blood samples, being able to identify different amounts of oxygen in different samples. However, in the state of the art there are no sensors or sensing systems that use solely the photophysical changes that occur in the excited state of the system as a way of relating quantities of an analyte. To date, changes in the behavior of excited electronic states have not been used for sensing, which is the great innovation of this invention and its main difference is the fact that it is used to quantitatively detect oxygen dissolved in blood. Furthermore, this system has the advantages of being easy to obtain, through physical interaction between a self-organized biological compound and an organic dye, both biocompatible and resulting in a material with distinct photophysical properties, quite sensitive to the presence of oxygen, especially when dissolved in the blood.

[003] No estado da técnica, encontra-se o sistema para detecção desenvolvido por estes mesmos inventores da presente invenção, constituído da combinação de peptídeo com composto orgânico fluorescente, mas para gerar um sensor óptico fotoestacionário, em que a análise se baseia na necessidade de detectar a luz que seja emitida pela amostra, a chamada fluorescência fotoestacionária. Esse é o contexto de funcionamento da patente BR1020150206658, que diz respeito ao sistema orgânico testado para registrar a resposta fluorescente fotoestacionária quando na presença de gás oxigênio e que é o estudo precursor da presente invenção. Portanto, o sensor da referida patente se baseia na resposta visual, no registro da intensidade da luz verde -azulada emitida pelo sensor, com sua variação sendo correspondente à concentração do analito O2 presente a amostra de água, conforme melhor concretização da referida patente. Ou seja, se trata de um sensor colorimétrico, o que não é o caso da presente invenção. Apesar de ela se referir a um sistema também de peptideo contendo cumarina, no entanto, de construção distinta, o tipo de sinal que se obtém é também bastante diferente. Além disso, há uma melhoria significativa nos termos de sensibilidade ao utilizar-se do meio de detecção da presente invenção, comparado à detecção colorimétrica. A presente invenção difere, portanto, da descrita no documento BR1020150206658 por se basear em técnica bastante distinta das empregadas em um sensor óptico, por se utilizar de fundamento conceitual bastante distinto e por ser usada para a determinação de O2 em amostras de sangue, o que torna, entre outros aspectos, até o mercado- alvo bastante distinto.[003] In the state of the art, there is the detection system developed by these same inventors of the present invention, consisting of the combination of a peptide with a fluorescent organic compound, but to generate a photostationary optical sensor, in which the analysis is based on the need to detect the light emitted by the sample, the so-called photostationary fluorescence. This is the operating context of patent BR1020150206658, which concerns the organic system tested to record the photostationary fluorescent response when in the presence of oxygen gas and which is the precursor study of the present invention. Therefore, the sensor of the aforementioned patent is based on the visual response, on the recording of the intensity of the blue-green light emitted by the sensor, with its variation corresponding to the concentration of the analyte O2 present in the water sample, according to the best embodiment of the aforementioned patent. In other words, it is a colorimetric sensor, which is not the case with the present invention. Although it refers to a peptide system containing coumarin, however, with a different construction, the type of signal obtained is also quite different. Furthermore, there is a significant improvement in terms of sensitivity when using the detection means of the present invention, compared to colorimetric detection. The present invention therefore differs from that described in document BR1020150206658 because it is based on a technique that is quite different from that used in an optical sensor, because it uses a very different conceptual basis and because it is used to determine O2 in blood samples, which makes, among other aspects, even the target market quite distinct.

[004] Esse sensor usa de técnicas de avaliação dos estados excitados que são mais avançadas e que estão dominando a área da espectroscopia de fluorescência. Foi possível verificar que este sensor é mais eficiente e sensível que sensores ópticos usuais por se basear no monitoramento da resposta dinâmica das alterações que a interação do sistema com o analito causa nas propriedades dos estados eletrônicos excitados do sistema, ou seja, antes da desativação dos estados excitados do sistema e antes que qualquer emissão luminescente possa ocorrer a partir do sistema, o que permite ter informações sobre os fenômenos que ocorrem no estado eletrônico excitado. Deste modo, o sensor pode ser empregado em processos cuja quantidade de O2 no meio seja bastante pequena, da ordem de 10-6 a 10-10 g/mL. Técnica similar de detecção foi desenvolvida por este grupo de pesquisas quando do desenvolvimento do sistema apresentado no documento de patente BR102019014824-1 e o sistema foi testado para amostras de água contendo O2 dissolvido. No entanto, um novo sistema, capaz de rejeitar interferentes existentes em amostras de sangue necessitou ser desenvolvido, de modo que as variações de O2 dissolvido no sangue pudessem ser adequadamente medidas no fluido Para o sucesso da proposição sensível unicamente ao O2 dissovlido e livre no sangue, determinou-se, por meio da preparação de diversas amostras de proporções distintas, a proporção ideal em que o peptídeo dopado com o composto luminescente pudesse ainda promover uma troca energética entre o oxigênio do sangue e o sistema no estado eletrônico excitado, de modo que todo o oxigênio em contato com o sistema de sensoriamento pudesse receber a energia necessária para gerar oxigênio singlete. Dessa forma, mesmo o que peptídeo constituinte do sistema ora desenvolvido tenha afinidade por outros componentes do sangue, as medidas que realizamos são caracerísticas da formação de O2 singlete e não podem ser produzidos sinais similares por qualquer outro componente. Supreendentemente, na presente invenção, a detecção de O2 singlete produzido pelo O2 molecular dissolvido em sangue foi possível por meio de um método de sensoriamento que se utiliza por espectroscopia de fluorescência com resolução temporal que se mostrou altamente sensível e seletivo a O2, permitindo que o sistema pudesse ser aplicado diretamente sobre amostras coletadas de sangue, sem pré-tratamento, a não ser a adição de EDTA, comumente realizada no momento da coleta de sangue em laboratórios clínicos para previnir aglutiação e coagulação do sangue, ou eliminação de qualquer componente do sangue, tornando possível criar um sistema de sensoriamento imediato, sensível e seletivo, com amplas perspectivas de uso que hoje não são possíveis que os sensores de O2 ópticos convencionais encontrados no mercado. Devido à sua seletividade à O2, esse sistema de sensoriamento também pode ser usado em outros fluidos complexos, como cerveja.[004] This sensor uses techniques for evaluating excited states that are more advanced and are dominating the area of fluorescence spectroscopy. It was possible to verify that this sensor is more efficient and sensitive than usual optical sensors because it is based on monitoring the dynamic response of the changes that the interaction of the system with the analyte causes in the properties of the system's excited electronic states, that is, before the deactivation of the excited states of the system and before any luminescent emission can occur from the system, which allows information about the phenomena occurring in the excited electronic state. Therefore, the sensor can be used in processes where the amount of O2 in the medium is quite small, on the order of 10-6 to 10-10 g/mL. A similar detection technique was developed by this research group when developing the system presented in patent document BR102019014824-1 and the system was tested for water samples containing dissolved O2. However, a new system capable of rejecting existing interferents in blood samples needed to be developed, so that variations in dissolved O2 in the blood could be adequately measured in the fluid. For the success of the proposition sensitive solely to dissolved and free O2 in the blood , it was determined, through the preparation of several samples of different proportions, the ideal proportion in which the peptide doped with the luminescent compound could still promote an energetic exchange between the blood oxygen and the system in the excited electronic state, so that all oxygen in contact with the sensing system could receive the energy necessary to generate singlet oxygen. Therefore, even though the peptide constituent of the system now developed has affinity for other blood components, the measurements we carried out are characteristic of the formation of singlet O2 and similar signals cannot be produced by any other component. Surprisingly, in the present invention, the detection of singlet O2 produced by molecular O2 dissolved in blood was possible through a sensing method that uses time-resolved fluorescence spectroscopy that proved to be highly sensitive and selective to O2, allowing the system could be applied directly to collected blood samples, without pre-treatment, other than the addition of EDTA, commonly performed at the time of blood collection in clinical laboratories to prevent agglutination and blood clotting, or elimination of any blood component , making it possible to create an immediate, sensitive and selective sensing system, with broad perspectives of use that are currently not possible than conventional optical O2 sensors found on the market. Due to its O2 selectivity, this sensing system can also be used in other complex fluids, such as beer.

[005] É conhecimento do estado da técnica que o tempo de vida do estado eletrônico é capaz de informar sobre as interações que ocorrem em moléculas ou sistemas orgânicos e híbridos, podendo ser usados para monitoramentos diversos. É também conhecido que novas tecnologias de monitoramento são desenvolvidas ano a ano, baseadas nessas informações e há nas bases de patentes um grande número de documentos que mostram técnicas espectroscópicas resolvidas no tempo como forma de quantificar ou identificar produtos e processos em meios biológicos. Por exemplo, há diversas aplicações de medidas de transferência de energia ressonante (FRET) para monitoramentos em sistemas biológicos. No entanto, esses desenvolvimentos se referem a explorações em sítios pré-determinados, tendo um marcador como fonte de informação, para examinar um alvo (target) específico. Esse não é o caso da presente invenção, uma vez que o sistema não é alterado e nenhum tipo de marcador é necessário: a detecção se dá pelo processo sofrido pelo próprio analito de interesse.[005] It is known in the art that the lifetime of the electronic state is capable of informing about the interactions that occur in molecules or organic and hybrid systems, and can be used for various monitoring. It is also known that new monitoring technologies are developed year after year, based on this information and there are a large number of documents in the patent databases that show time-resolved spectroscopic techniques as a way of quantifying or identifying products and processes in biological media. For example, there are several applications of resonant energy transfer (FRET) measurements for monitoring biological systems. However, these developments refer to explorations at pre-determined sites, with a marker as a source of information, to examine a specific target. This is not the case with the present invention, since the system is not altered and no type of marker is necessary: detection takes place through the process undergone by the analyte of interest itself.

[006] Alguns exemplos mais relevantes de tecnologias relacionadas ao sensoriamento são encontrados no estado da técnica, no entanto, não foi encontrado no estado da técnica informação ou desenvolvimento tecnológico que antecipem as inovações apresentadas pela presente invenção.[006] Some more relevant examples of technologies related to sensing are found in the prior art, however, no information or technological development that anticipates the innovations presented by the present invention was found in the prior art.

[007] O documento científico intitulado: Development of multi-well-based electrochemical dissolved oxygen sensor array.( https://doi.Org/10.1016/j.snb.2019.127465) apresenta um sensor eletroquímico capaz de medir oxigênio dissolvido baseado em vários canais (24 canais) (sensor ECDO de canais) em um substrato de vidro, usando Naflon como um eletrólito polimérico sólido, no entanto, não se utiliza nem de material similar, nem de técnica de detecção ou de preparação do sistema de sensoriamento que antecipem o realizado na presente invenção. O documento científico intitulado: Combined amperometric-potentiometric oxygen sensor (Doi: https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.127999) descreve os resultados do desempenho e da avaliação de um sensor eletroquímico de oxigênio, que combina dados amperométrico-potenciométrico. O sensor consiste de uma célula eletroquímica e outra célula potenciométrica. Ambas as células do sensor de oxigênio são baseadas no mesmo eletrólito sólido, tendo 0,91ZrO2 + 0,09 Y2O3 na composição e portanto, difere grandemente dos princípios científicos utilizados para o desenvolvimento da presente invenção. O documento científico intitulado: Electrochemical laser induced graphene-based oxygen sensor ( https://doi.org/10.1016/jjelechem.2021.115690) descreve um sensor de oxigênio dissolvido (DO) totalmente integrado, que usou em sua fabricação grafeno induzido por laser, técnica e material, portanto, distinto dos utilizados e desensolvidos na presente invenção, não permitindo antecipar o que foi nela realizado. Nesse documento em discussão, a área de detecção foi isolada em uma membrana permeável ao gás oxigênio para detecção seletiva de DO, ou seja, diferentemente da presente invenção, um meio de separar o analito da amostra necessitou ser utilizado, enquanto na presente invenção, a análise é realizada na amostra in natura, sem qualquer alteração ou remoção de componentes. O desempenho do sensor doreferido documento oferece uma grande promessa para a detecção de oxigênio dissolvido em sistemas de cultura de células para aplicações biomédicas e ambientais, mas não faz essa análise. O documento científico intitulado: Electrochemical Biosensors Capable of Detecting Biomarkers in Human Serum with Unique Long-Term Antifouling Abilities Based on Designed Multifunctional Peptides ( https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00738) descreve um biosensor eletroquímico para detecção de biomarcadores em amostras complexas de soro, com base em peptídeos multifuncionais projetados contendo ancoragem e dopagem. Difere, portanto da presente invenção tanto na constituição, mesmo utilizando peptídeos multifuncionais, mas não se tratando de estruturas complexas autoorganizadas, como na presente invenção e por se basear em detecção de sinal eletroquímico e não em sinal de fluorescência resolvida no tempo. Portnato, esse documento não pode antecipar o que é realizado na presente invenção. O documento científico intitulado Quantum Dot- Peptide Nanoassembly on Mesoporous Silica Nanoparticle for Biosensing ( doi:10.4028/www.scientific.net/NHC.19.55) descreve um biosensor a base de pontos quânticos conjugados com um corante não fluorescente. O biosensor tem como base medições de fotoluminescência de estado estacionário e resolvidas no tempo, mas as medidas com resolução temporal não são utilizadas como meio de informação de detecção e sim como forma de avaliar o biosensor. Portanto, não se utiliza de conceito ou técnica de detecção similar ao realizado na presente invenção. Interessante mencionar o documento científico intitulado: Live cell biosensors based on the fluorescence lifetime of environment-sensing dyes, publicado em 2022 (https://doi.Org/10.1101 /2022.02.08.479035) que descreve biossensores baseados em corantes sensíveis ao ambiente como merocianina e utiliza também a técnica de FLIM para explorar alterações induzidas pelo ambiente, fotoestabilidade, e em comprimentos de onda adequados para imagens de células vivas. No entanto, é importante salientar que a técnica do FLIM é muito diversificada, permitindo um uso e formas de análise também bstante variadas. Nessa abordagem, a forma de detecção e de tratamento de dados em nada se parece com a utilizada pela presente invenção, além do que se presta a detecção de composto muito diferente que O2 e mesmo em se tratando de detecção por FLIM, não é possível, nem pelo conceitual, nem pelos dados apresentados nesse trabalho, antecipar a presenten invenção. No referido documento, portanto, o corante merocianina é ligado a uma proteína e a mudança de conformação que essa ligação causa é a responsável pelo sinal de tempo de vida de fluorscência que coletam. Eles, então, utiliam a técnica de phasor do tempo de vida para avaliar as mudanças que possam encontrar quando o analito de interesse está presente ou ausente no meio. Utiliza tamvém uma relação matemática que relaciona a concentração com a fração de corante ligado, para então fornecer a concentração de analito.É, portanto, um experimento comparativo, que necessita de um sinal modelo e de uma equação para relacionar o sinal obtido com uma provável concentração de analito (Cdc42mutant). Em nosso sensor, não há a necessidade de se medir a amostra na ausência do analito para se ter parâmetro para a medida de concentração, pois o sinal só pode ser obtido dependente da presença do O2 e a em quê quantidade ele se encontra, e é isso que determinará a curva de decaimento de fluorescência que se obterá do sistema em análise. Portanto, nem a forma de análise do sinal, nem o analito a que se destina, nem o meio em que é aplicado, nem a forma de obtenção do sensor que são objeto da presente invenção, são antecipados por esse documento. O documento científico intitulado: Dual-lifetime luminescent probe for time-resolved ratiometric oxygen sensing and imaging (10.1039/D2DT00467D) descreve um sensor baseado em Polímeros fluorescentes/fosforescentes de dupla emissão. A razão fosforescência/fluorescência é usada como um indicador quantitativo de oxigênio em amostras biológicas. Baseia-se, portanto, no sinal luminoso de fosforência e de fluorescência para ter sinal que possa ser tratado, o que difere do que é realizado na presente invenção.O documento cientifico intitulado: Stimuli-Responsive Thermally Activated Delayed Fluorescence in Polymer Nanoparticles and Thin Films: Applications in Chemical Sensing and Imaging, publicado em 2020( https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00229) descreve o uso de nanopartículas poliméricas e filmes finos que apresentam fluorescência atrasada ativada termicamente como sondas de detecção e imagem. A extinção de tripleto pode ser usada para medir a concentração de oxigênio, oque é uma medida indireta do oxigênio. Aqui, portanto, nem a técnica, nem a informação que é útil para a determinação de O2 antecipam o que é apresentado pela presente invenção. Sobre o uso de peptídeos em sistemas de sensoriamento, há o documento científico intitulado: Peptide Nanotube Encapsulated Enzyme Biosensor for Vapor Phase Detection of Malathion, an Organophosphorus Compound, publicado em 2019 (https://doi.org/10.3390/s19183856) e que traz informações sobre encapsulamento de enzimas em nanotubos de Phe-Phe para detecção de inseticida e compostos orgafosforados. Portanto, o uso e a forma de manipular as estruturas peptídicas utilizadas na presente invenção não são antecipadas por esse documento.[007] The scientific document entitled: Development of multi-well-based electrochemical dissolved oxygen sensor array.(https://doi.Org/10.1016/j.snb.2019.127465) presents an electrochemical sensor capable of measuring dissolved oxygen based on several channels (24 channels) (channel ECDO sensor) on a glass substrate, using Naflon as a solid polymeric electrolyte, however, neither a similar material nor a detection technique or preparation of the sensing system is used that anticipate carried out in the present invention. The scientific document entitled: Combined amperometric-potentiometric oxygen sensor (Doi: https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.127999) describes the performance and evaluation results of an electrochemical oxygen sensor, which combines amperometric-potentiometric oxygen sensor potentiometric. The sensor consists of an electrochemical cell and another potentiometric cell. Both oxygen sensor cells are based on the same solid electrolyte, having 0.91ZrO2 + 0.09 Y2O3 in the composition and therefore differ greatly from the scientific principles used to develop the present invention. The scientific document entitled: Electrochemical laser induced graphene-based oxygen sensor ( https://doi.org/10.1016/jjelechem.2021.115690) describes a fully integrated dissolved oxygen (DO) sensor, which used laser-induced graphene in its manufacture, technique and material, therefore, different from those used and developed in the present invention, not allowing to anticipate what was accomplished in it. In this document under discussion, the detection area was isolated in a membrane permeable to oxygen gas for selective detection of DO, that is, unlike the present invention, a means of separating the analyte from the sample needed to be used, while in the present invention, the analysis is performed on the fresh sample, without any alteration or removal of components. The sensor performance of the aforementioned document offers great promise for the detection of dissolved oxygen in cell culture systems for biomedical and environmental applications, but does not perform such analysis. The scientific document entitled: Electrochemical Biosensors Capable of Detecting Biomarkers in Human Serum with Unique Long-Term Antifouling Abilities Based on Designed Multifunctional Peptides (https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00738) describes an electrochemical biosensor for detection of biomarkers in complex serum samples, based on engineered multifunctional peptides containing anchoring and doping. It therefore differs from the present invention both in its constitution, even using multifunctional peptides, but not in the case of complex self-organized structures, as in the present invention and because it is based on electrochemical signal detection and not on time-resolved fluorescence signal. Therefore, this document cannot anticipate what is accomplished in the present invention. The scientific document entitled Quantum Dot- Peptide Nanoassembly on Mesoporous Silica Nanoparticle for Biosensing ( doi:10.4028/www.scientific.net/NHC.19.55) describes a biosensor based on quantum dots conjugated with a non-fluorescent dye. The biosensor is based on steady-state and time-resolved photoluminescence measurements, but time-resolved measurements are not used as a means of detecting information but rather as a way to evaluate the biosensor. Therefore, no concept or detection technique similar to that carried out in the present invention is used. It is interesting to mention the scientific document entitled: Live cell biosensors based on the fluorescence lifetime of environmental-sensing dyes, published in 2022 (https://doi.Org/10.1101 /2022.02.08.479035) which describes biosensors based on environmentally sensitive dyes such as merocyanine and also uses the FLIM technique to explore environmentally induced changes, photostability, and at wavelengths suitable for live cell imaging. However, it is important to highlight that the FLIM technique is very diverse, allowing for very varied uses and forms of analysis. In this approach, the method of detection and data processing is in no way similar to that used by the present invention, in addition to being suitable for detecting a compound very different from O2 and even in the case of detection by FLIM, it is not possible, Neither by conceptual nor by the data presented in this work, anticipate the present invention. In that document, therefore, the merocyanine dye is linked to a protein and the conformational change that this binding causes is responsible for the fluorescence lifetime signal that they collect. They then use the lifetime phasor technique to evaluate the changes they may find when the analyte of interest is present or absent in the medium. It also uses a mathematical relationship that relates the concentration to the fraction of bound dye, to then provide the analyte concentration. It is, therefore, a comparative experiment, which requires a model signal and an equation to relate the signal obtained with a probable analyte concentration (Cdc42mutant). In our sensor, there is no need to measure the sample in the absence of the analyte to have a parameter for measuring concentration, as the signal can only be obtained depending on the presence of O2 and the quantity in which it is found, and it is This will determine the fluorescence decay curve that will be obtained from the system under analysis. Therefore, neither the way of analyzing the signal, nor the analyte to which it is intended, nor the medium in which it is applied, nor the way of obtaining the sensor that are the object of the present invention, are anticipated by this document. The scientific document entitled: Dual-lifetime luminescent probe for time-resolved ratiometric oxygen sensing and imaging (10.1039/D2DT00467D) describes a sensor based on dual-emission fluorescent/phosphorescent polymers. The phosphorescence/fluorescence ratio is used as a quantitative indicator of oxygen in biological samples. It is therefore based on the light signal of phosphorance and fluorescence to have a signal that can be treated, which differs from what is carried out in the present invention. The scientific document entitled: Stimuli-Responsive Thermally Activated Delayed Fluorescence in Polymer Nanoparticles and Thin Films: Applications in Chemical Sensing and Imaging, published in 2020 (https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00229) describes the use of polymeric nanoparticles and thin films that exhibit thermally activated delayed fluorescence as detection and imaging probes. Triplet extinction can be used to measure oxygen concentration, which is an indirect measurement of oxygen. Here, therefore, neither the technique nor the information that is useful for determining O2 anticipates what is presented by the present invention. Regarding the use of peptides in sensing systems, there is the scientific document entitled: Peptide Nanotube Encapsulated Enzyme Biosensor for Vapor Phase Detection of Malathion, an Organophosphorus Compound, published in 2019 (https://doi.org/10.3390/s19183856) and which provides information on the encapsulation of enzymes in Phe-Phe nanotubes for the detection of insecticides and organophosphorus compounds. Therefore, the use and way of manipulating the peptide structures used in the present invention are not anticipated by this document.

[008] O do documento de patente WO2012002886-A1, descreve o uso do FLIM para acompanhamento de interações proteína-proteína e para mapear parâmetros de cela, como pH, concentração de íons e de oxigênio. No entanto, o imageamento é apenas usado para proporcionar uma análise mais rápida, e os valores de tempo de vida não são os dados que são efetivamente utilizados no sensoriamento.[008] Patent document WO2012002886-A1 describes the use of FLIM to monitor protein-protein interactions and to map cell parameters, such as pH, ion and oxygen concentration. However, imaging is only used to provide faster analysis, and lifetime values are not the data that is actually used in sensing.

[009] O documento WO2011101628-A1 trata de um sensor para glicose no sangue, em que a detecção se dá por meio da técnica time-correlated single photon counting (TCSPC), mas ele difere do que é executado na presente inveção porque seu funcionamento não está relacionado com as características do estado eletrônico excitado e sim com o tipo de detecção, que se baseia num pulso de corrente que ocorre com a chegada do primeiro fóton emitido pelo sistema.[009] Document WO2011101628-A1 deals with a sensor for blood glucose, in which detection takes place using the time-correlated single photon counting (TCSPC) technique, but it differs from what is performed in the present invention because its operation It is not related to the characteristics of the excited electronic state but to the type of detection, which is based on a current pulse that occurs with the arrival of the first photon emitted by the system.

[010] O estado da técnica, portanto, ensina que processos que tem sua natureza explicada pelos efeitos que causam sobre o estado eletrônico excitado podem ser usados para sensoriamento, mas não apresenta métodos de sensoriamento em que o tempo de vida de fluorescência em si e sua participação na curva de decaimento total é o dado de interesse e que informa sobre concentração, não por um meio direto, apenas por métodos indiretos. Principalment, também não demonstra como o sinal de tempo de vida de fluorexcência poderia ser usado para dar medida direta de concentração de O2 dissolvido em sangue, o que é a característica surpeendente da presente invenção.[010] The state of the art, therefore, teaches that processes that have their nature explained by the effects they cause on the excited electronic state can be used for sensing, but it does not present sensing methods in which the fluorescence lifetime itself and its participation in the total decay curve is the data of interest and which informs about concentration, not by direct means, only by indirect methods. Mainly, it also does not demonstrate how the fluorescence lifetime signal could be used to give direct measurement of dissolved O2 concentration in blood, which is the surprising feature of the present invention.

[011] Apesar de nossos estudos anteriores que resultaram inclusive em pedidos de patentes anteriores, terem apresentado o sistema de nanoestrutura de peptídeo/ corante fluorescente e evidenciado que há uma interação entre eles que resultam em propriedades surpreeendentes com fundamentação na formação de um complexo de carga que cria estados eletrônicos excitados intermediários não observados em seu estado anterior, que podem interagir com a molécula de oxigênio, de modo a possibilitar sua análise quantitativa por meio da fluorescência fotoestacionária, como descrito pelo sensor do documento BR BR1020150206658, e que as curvas de decaimento de fluorescência também podem informar sobre quantidades do gás dissolvido em água, como o descrito no documento de patente BR102019014824-1 surpreendentemente, os inventores verificaram que o O2 dissolvido em sangue pode ser detectado e mensurado acuradamente se a medida de tempo de vida de fluorescência se der pela técnica do Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) e pelo mapeamento de sinal que ele permite que seja executado. Graças à possibilidade de se pedir o tempo de vida de fluorescência localmente, em distâncias que são menores de 20 nm, a obtenção das curvas de decaimento de fluorescência permite distinguir varações mesmo quando a quantidade de O2 dissolvido é tão baixa quanto 10-12 g de O2/mL de sangue. Dessa forma, um sensor foi construído e testado frente a O2 dissolvido em amostras de sangue obtendo-se sinais de tempo de vida de fluorescência reprodutíveis, sensíveis e que não requer quantidades grandes de amostra de sangue, sendo efetivos com volumes de amostra tão pequenas quanto 10 μL, ou seja, a fração de uma gota de sangue, como será apresentado nos exemplos que instruem o presente documento.[011] Although our previous studies, which even resulted in previous patent applications, presented the peptide/fluorescent dye nanostructure system and showed that there is an interaction between them that results in surprising properties based on the formation of a charge complex which creates intermediate excited electronic states not observed in its previous state, which can interact with the oxygen molecule, in order to enable its quantitative analysis through photostationary fluorescence, as described by the sensor in document BR BR1020150206658, and which the decay curves fluorescence can also inform about amounts of gas dissolved in water, such as that described in patent document BR102019014824-1 surprisingly, the inventors found that O2 dissolved in blood can be detected and measured accurately if the measurement of fluorescence lifetime is der by the Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) technique and the signal mapping that it allows to be performed. Thanks to the possibility of ordering the fluorescence lifetime locally, at distances that are less than 20 nm, obtaining fluorescence decay curves allows distinguishing variations even when the amount of dissolved O2 is as low as 10-12 g of O2/mL of blood. In this way, a sensor was built and tested against O2 dissolved in blood samples, obtaining reproducible, sensitive fluorescence lifetime signals that do not require large amounts of blood samples, being effective with sample volumes as small as 10 μL, that is, the fraction of a drop of blood, as will be presented in the examples that guide this document.

BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[012] Logo, a presente invenção trata um método de sensoriamento dinâmico de oxigênio dissolvido em amostras de sangue, que se baseia na detecção do tempo de vida de fluorescência do sistema de sensoriamento constituído por estruturas autoorganizadas de pepetídeo combinados a um composto fluorescente biocompatível em que se detectam curvas de decaimento de fluorescência por meio da técnica do FLIM, utilizando-se do mapeamento local amostral, em que os tempos de vida de fluorescência são relacionados a quantidades de O2 dissolvido no sangue por causarem mudanças de comportamento das curvas de decaimento, que são correlacionadas com quantidades de analito presente na região amostral, sendo um método de alta sensibilidade[012] Therefore, the present invention deals with a method for dynamic sensing of dissolved oxygen in blood samples, which is based on the detection of the fluorescence lifetime of the sensing system consisting of self-organized peptide structures combined with a biocompatible fluorescent compound in that fluorescence decay curves are detected using the FLIM technique, using local sampling mapping, in which fluorescence lifetimes are related to amounts of O2 dissolved in the blood by causing changes in the behavior of the decay curves, which are correlated with amounts of analyte present in the sampling region, being a highly sensitive method

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[013] Em um primeiro aspecto, a presente invenção trata do uso em amostras de sangue de um método de sensoriamento dinâmico que explora o efeito da interação da molécula de oxigênio presente no sangue com o sistema fluorescente constituído para o método de sensoriamento, que resulta em variações do comportamento dinâmico dos estados eletrônicos excitados do sistema, que podem ser observados por meio da medida do tempo de vida de fluorescência, obtidos pela técnica de FLIM, que permite o mapeamento local da amostra de sangue.[013] In a first aspect, the present invention deals with the use in blood samples of a dynamic sensing method that exploits the effect of the interaction of the oxygen molecule present in the blood with the fluorescent system constituted for the sensing method, which results in variations in the dynamic behavior of the system's excited electronic states, which can be observed by measuring the fluorescence lifetime, obtained using the FLIM technique, which allows local mapping of the blood sample.

[014] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere ao uso do FLIM como método de aquisição de dados para serem interpretados para a determinação da quantidade de O2 presente em amostras de sangue tão pequenas quanto a fração de uma gota de sangue.[014] In a second aspect, the present invention refers to the use of FLIM as a method of acquiring data to be interpreted to determine the amount of O2 present in blood samples as small as the fraction of a drop of blood.

[015] Preferencialmente, o presente sistema é constituído de nanotubos de peptídeo auto-organizado, que tem adicionados a ele os corantes da presente invenção pode estar sorvido em um substrato transparente, resultando em um dispositivo para sensoriamento dinâmico, destinado principalmente para a determinação de quantidades de gás oxigênio dissolvido em sangue.[015] Preferably, the present system consists of self-organized peptide nanotubes, which have added to them the dyes of the present invention that can be sorbed on a transparent substrate, resulting in a device for dynamic sensing, intended mainly for the determination of amounts of oxygen gas dissolved in blood.

[016] O presente método de sensoriamento dinâmico mais detalhadamente, se caracteriza por se basear na medida do tempo de decaimento de fluorescência do sistema formado pelos peptídeos autoorganizados e dopados com o corante fluorescente, obtidas utilizando-se a técnica do FLIM, em que a amostra é colocada sob o aumento de uma objetiva que faz uma imagem da amostra para que uma seleção local de pontos a serem inspecionados seja feita. Em seguida, a iluminação de excitação por laser ou LED pulsado é executada e desligada, de modo que fótons únicos, provenientes da fluorescência emitida pela região da amostra iluminada, sejam detectados e curvas de decaimento de fluorescência sejam adquiridas. A investigação ocorre então na próxima região delimitada e mais curvas de decaimento sejam adquiridas. Esse conjunto de curvas, obtidas em regiões delimitadas, são analisadas e fornecem dados de tempo de vida de fluorescência e contribuições desses tempos de vida para cada curva de decaimento, que tem significado físico. Quando na presença do analito, preferencialmente o oxigênio dissolvido em sangue, ocorre a perturbação do sistema do nanotubo contendo fluoróforo com a excitação de seus elétrons de valência, promovidos a estados eletrônicos excitados de maior energia. Durante o tempo em que permanece no estado eletrônico excitado (entre pico (10-12 s) e nanossegundos (10-9 s)), muitos processos de desativação ocorrem com transferência de pequenas quantidades de energia, sem resultar em luminescência, e ocorrem em situações únicas, como quando formam-se complexos de transferência de carga. Na presença do analito, essas desativações ocorrem com divergências do esperado para o sistema, e elas podem ser detectadas, gerando uma curva de decaimento exponencial de fluorescência, que podem ser monoexpenenciais, biexponenciais ou multiexponenciais. De fato, não só a característica da desativação, mas também os valores dos tempos de vida de fluorescência são afetados, de modo reprodutível e dependente da proporção de analito-sistema. O presente sistema, na presença de O2, sofre diversas desativações do estado eletrônico excitado, e explora, em especial, a característica do O2 de interagir com sistemas excitados para passar de O2 triplete, a molécula na configuração eletrônica comumente encontrada na atmosfera e dissolvida em sangue, para O2 singlete Essa mudança do resulta em variações do comportamento da desativação do estado eletrônico excitado do sistema e depdendentemente da quantidade de O2 presente. Quanto menor for o obturador selecionado para a passagem do feixe de excitação, menor é a região iluminada da amostra e maior é a sensibilidade do método. Na presente invenção, a menor obturação selecionada para os testes foi de 0.200 nm, o que resulta em uma região de iluminação de 20 nm2 e uma sensibilidade de 10-10g/mL.[016] The present dynamic sensing method in more detail is characterized by being based on measuring the fluorescence decay time of the system formed by self-organized peptides and doped with the fluorescent dye, obtained using the FLIM technique, in which the The sample is placed under the magnification of an objective that makes an image of the sample so that a local selection of points to be inspected is made. Then, laser or pulsed LED excitation illumination is performed and turned off, so that single photons, originating from the fluorescence emitted by the illuminated sample region, are detected and fluorescence decay curves are acquired. The investigation then takes place in the next delimited region and more decay curves are acquired. This set of curves, obtained in delimited regions, are analyzed and provide fluorescence lifetime data and contributions of these lifetimes to each decay curve, which has physical meaning. When in the presence of the analyte, preferably oxygen dissolved in blood, the nanotube system containing the fluorophore is disturbed with the excitation of its valence electrons, promoted to higher energy excited electronic states. During the time it remains in the excited electronic state (between peak (10-12 s) and nanoseconds (10-9 s)), many deactivation processes occur with transfer of small amounts of energy, without resulting in luminescence, and occur in unique situations, such as when charge transfer complexes are formed. In the presence of the analyte, these deactivations occur with divergences from what is expected for the system, and they can be detected, generating an exponential fluorescence decay curve, which can be monoexponential, biexponential or multiexponential. In fact, not only the deactivation characteristic, but also the fluorescence lifetime values are affected, in a reproducible way and dependent on the analyte-system ratio. The present system, in the presence of O2, undergoes several deactivations of the excited electronic state, and exploits, in particular, the characteristic of O2 to interact with excited systems to go from triplet O2, the molecule in the electronic configuration commonly found in the atmosphere and dissolved in blood, to singlet O2 This change results in variations in the deactivation behavior of the system's excited electronic state and depends on the amount of O2 present. The smaller the shutter selected to pass the excitation beam, the smaller the illuminated region of the sample and the greater the sensitivity of the method. In the present invention, the smallest obturation selected for the tests was 0.200 nm, which results in an illumination region of 20 nm2 and a sensitivity of 10-10g/mL.

[017] A análise das curvas de decaimento de fluorescência que se obtêm da forma descrita ma presente invenção é realizada utilizando o método dos mínimos quadrados de Levenberg- Marquardt (Marquardt, D.W. An Algorithm for Least-Squares Estimation of Nonlinear Parameters. Journal of the Society for Industrial and Applied Mathematics, 11(2), 431-441. https://doi.org/10.1137/0111030), dá a informação de quantitativa do oxigênio que interagiu com o sensor e, portanto, sua proporção no meio. A resposta do dispositivo, portanto, é relacionada à quantidade de O2 existente na amostra de sangue. O surpreendente desse sistema é que, isoladamente, o corante não apresenta grande sensibilidade ao O2, não havendo variação nas curvas de decaimento de fluorescência para soluções do corante, no entanto, a composição com os nanotubos de peptídeos favorece a formação de um complexo de carga que cria novos estados eletrônicos excitados que são utilizados por moléculas de O2 do meio. Além disso, o sistema se mostrou altamente seletivo ao O2 e mesmo o sangue sendo um sistema bastante complexo, não houve necessidade de qualquer tratamento prévio para remoção de qualquer componente sanguíneo, a não ser o tratamento que típicamente se realiza no momento da coleta das amostras, em que o sangue e recolhido em frascos contendo anticoagulante, para evitar a rápida aglomeração celular que dificulta qualquer teste. No entanto, pela resosta que se obtém do sistema de sensoriamento ora proposto se dar imediatamente, é possível realizar medidas in loko, coletando-se apenas uma gota de sangue e posicionando-a no aparelho na presenta do sistema de sensoriamento, se houver o equipamento FLIM à disposição.[017] The analysis of the fluorescence decay curves obtained in the manner described in the present invention is carried out using the Levenberg-Marquardt least squares method (Marquardt, D.W. An Algorithm for Least-Squares Estimation of Nonlinear Parameters. Journal of the Society for Industrial and Applied Mathematics, 11(2), 431-441. https://doi.org/10.1137/0111030), gives quantitative information on the oxygen that interacted with the sensor and, therefore, its proportion in the medium. The device's response, therefore, is related to the amount of O2 in the blood sample. The surprising thing about this system is that, in isolation, the dye does not show great sensitivity to O2, with no variation in the fluorescence decay curves for dye solutions. However, the composition with peptide nanotubes favors the formation of a charge complex which creates new excited electronic states that are used by O2 molecules in the medium. Furthermore, the system proved to be highly selective to O2 and even though blood is a very complex system, there was no need for any prior treatment to remove any blood component, other than the treatment that typically takes place at the time of sample collection. , in which the blood is collected in vials containing anticoagulant, to avoid rapid cell agglomeration that makes any test difficult. However, due to the response obtained from the proposed sensing system occurring immediately, it is possible to carry out measurements in situ, collecting just one drop of blood and positioning it in the device in the presence of the sensing system, if the equipment is available. FLIM available.

[018] O presente método de sensoriamento utiliza um sistema fluorescente que se caracteriza por ser constituído de um peptídeo auto-organizado selecionado do grupo constituído de aminoácidos aromáticos como fenilalanina, tirosina, triptofano e composições (dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos) com quaisquer aminoácidos essenciais como valina, prolina, leucina, isoleucina, metionina, glicina, alanina, treonina, glutanina, asparagina, cisteína, arginina, serina, lisina, histidina, ácido aspárgico e ácido glutâmico, sortidos ou sequências repetitivas, desde que contenham ao menos um aminoácido aromático. Preferencialmente, o peptídeo é caracterizado por ser a difenilalanina.[018] The present sensing method uses a fluorescent system characterized by being made up of a self-organized peptide selected from the group consisting of aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan and compositions (dipeptides, tripeptides, oligopeptides) with any essential amino acids such as valine, proline, leucine, isoleucine, methionine, glycine, alanine, threonine, glutanine, asparagine, cysteine, arginine, serine, lysine, histidine, asparagic acid and glutamic acid, sets or repetitive sequences, as long as they contain at least one aromatic amino acid . Preferably, the peptide is characterized by being diphenylalanine.

[019] O corante fluorescente usado para constrtuir o sistema da presente invenção é selecionado do grupo compreendido por derivados de benzopirona (cumarina). Preferencialmente, utiliza-se aminocumarinas com grupos amino na posição 7 e grupos doadores na posição 3, uma vez que apresentam baixo rendimento de população dos estados eletrônicos triplete, sendo preferencialmente cumarina-6. Sua estrutura está representada na figura 1.[019] The fluorescent dye used to construct the system of the present invention is selected from the group comprising benzopyrone (coumarin) derivatives. Preferably, aminocoumarins with amino groups in position 7 and donor groups in position 3 are used, since they have a low population yield of triplet electronic states, preferably coumarin-6. Its structure is represented in figure 1.

[020] Para ser usado, esse sistema pode ser ou apenas combinado à amostra de sangue, em um frasco ependorf, depositado na forma líquida em uma lâmina de análise em microscópio e levado ao FLIM ou pode ser usado na forma sólida, com remoção do solvente de preparo do sistema e deposição em um substrato transparente que receberá posteriormente a amostra de sangue para análise.[020] To be used, this system can be either just combined with the blood sample, in an ependorf bottle, deposited in liquid form on a microscope analysis slide and taken to FLIM or it can be used in solid form, with removal of the solvent for system preparation and deposition on a transparent substrate that will later receive the blood sample for analysis.

[021] Os exemplos apresentados a seguir visam à demonstração não limitante da melhor forma de realização da presente invenção, bem como a demonstração de suas propriedades ora mencionadas.[021] The examples presented below aim to non-limitingly demonstrate the best form of carrying out the present invention, as well as demonstrating its properties mentioned herein.

Example 1. Method of preparing the sensing system of the present invention.

[022] Para a detecção de O2 no sangue, o sistema sensível ao O2 foi preparado pela combinação de estruturas auto-organizadas de peptídeo e o corante cumarina-6. A formação das estruturas ocorre na forma de nanotubos que se aglomeram, gerando microtubos dispersos em solventes polares como água e etanol. Solução do dipeptídeo difenilalanina em 1,1,1,3,3,3-hexafluor-pronanol na concentração 2 g L-1é preparada para habilitar o processo de autoorganização. Uma solução do corante cumarina-6 preparada em etanol na concentração de 1 x 10-6 mol L-1 foi preparada. Para combinação e formação do sistema, alíquotas de igual volume dessas soluções são misturadas e um volume semelhante de água deionizada é adicionada ao sistema. Essa combinação final gera o sistema sensível ao O2.[022] For the detection of O2 in blood, the O2-sensitive system was prepared by combining self-organized peptide structures and the dye coumarin-6. The formation of structures occurs in the form of nanotubes that agglomerate, generating microtubes dispersed in polar solvents such as water and ethanol. Diphenylalanine dipeptide solution in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-pronanol at a concentration of 2 g L-1 is prepared to enable the self-organization process. A solution of coumarin-6 dye prepared in ethanol at a concentration of 1 x 10-6 mol L-1 was prepared. To combine and form the system, aliquots of equal volume of these solutions are mixed and a similar volume of deionized water is added to the system. This final combination generates the O2-sensitive system.

Example 2. Use of the sensing system to detect O2 dissolved in blood, according to the present invention.

[023] Para o sensoriamento de O2 em amostra de sangue, uma alíquota de 10 uL de sangue previamente oxigenado foi combinado com 10 μL do sistema de sensoriamento. Após a combinação, 10 μL da mistura final foi depositada sobre uma lâmina de microscopia com dimensão 26 x 76 mm e espessura entre 1,0 a 1,2 mm. Em seguida uma lamínula com dimensão 22 x 22 mm é depositada sobre a amostra como indicado na Figura 2. Após o preparo do sistema o mesmo é colocado no suporte de análise de microscopia do Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) equipado com acessórios de TCSPC e DeltaDiode de excitação pulsada da HORIBA Instruments para prosseguir com as medidas de tempo de vida da amostra. No FLIM, é possível realizar o experimento single point decay fluorescence, experimento que permite determinar um ponto específico na amostra e determinar o tempo de vida de fluorescência em um único ponto. Para efeitos de comparação é realizada a medida do tempo de vida em duas regiões: sobre a hemácia e sobre o plasma sanguíneo como mostra a Figura 2. Com esses dados que são utilizados para guia da informação que se busca, executa-se o experimento de mapeamento da amostra.[023] For O2 sensing in a blood sample, an aliquot of 10 uL of previously oxygenated blood was combined with 10 μL of the sensing system. After combining, 10 μL of the final mixture was deposited on a microscope slide measuring 26 x 76 mm and with a thickness between 1.0 and 1.2 mm. Then a coverslip measuring 22 x 22 mm is placed on the sample as indicated in Figure 2. After preparing the system, it is placed on the microscopy analysis support of the Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) equipped with TCSPC accessories and Pulsed excitation DeltaDiode from HORIBA Instruments to proceed with sample lifetime measurements. In FLIM, it is possible to perform the single point decay fluorescence experiment, an experiment that allows you to determine a specific point in the sample and determine the fluorescence lifetime at a single point. For comparison purposes, life time is measured in two regions: on the red blood cell and on the blood plasma, as shown in Figure 2. With these data, which are used to guide the information sought, the experiment is carried out. sample mapping.

[024] A curvas de decaimento de tempo de vida de fluorescência obtidas para a amostra estão apresentadas na Figura 3.[024] The fluorescence lifetime decay curves obtained for the sample are shown in Figure 3.

[025] Os gráficos comparando os tempos de vida obtidos para a amostra estão apresentados na Figura 4.[025] The graphs comparing the lifetimes obtained for the sample are shown in Figure 4.

[026] A tabela 1 apresenta os dados de tempo de vida de fluorescência registrados para o sistema em questão, conforme obtidos do tratamento das curvas de decaimento de fluorescência. Tabela 1. Tempos de vida de fluorescência e parâmetros dos sistemas analisados experimentalmente. [026] Table 1 presents the fluorescence lifetime data recorded for the system in question, as obtained from the treatment of fluorescence decay curves. Table 1. Fluorescence lifetimes and parameters of the experimentally analyzed systems.

[027] O comprimento de onda do laser de luz pulsada utilizado nesses experimentos foi de 373 nm, com monitoramento no comprimento de onda de 450 nm. Observou-se que o comportamento é multi-exponencial em todos os experimentos realizados. No entanto, o comportamento dos tempos de vida se mostra distinto quando analisados na hemácia e no plasma.[027] The wavelength of the pulsed light laser used in these experiments was 373 nm, with monitoring at a wavelength of 450 nm. It was observed that the behavior is multi-exponential in all experiments carried out. However, the behavior of lifespans appears to be different when analyzed in red blood cells and plasma.

[028] O comportamento observado nos sistemas contendo hemácia mostra que os tempos de vida de fluorescência do sistema composto somente pela hemácia apresenta tempos de vida bastante inferiores ao sistema formando somente pelo sensor, mas ao combinar com o sensor, o tempo de vida do sistema formado pela hemácia e o sensor apresentam um aumento nos três tempos de vida do sistema. No entanto, ao oxigenar a hemácia e combinar com o sensor os tempos de vida passam a ter comportamento semelhante ao da hemácia isolada.[028] The behavior observed in systems containing red blood cells shows that the fluorescence lifetimes of the system composed only of red blood cells have lifetimes that are much lower than the system formed only by the sensor, but when combined with the sensor, the lifetime of the system formed by the red blood cell and the sensor show an increase in the three lifetimes of the system. However, when oxygenating the red blood cell and combining it with the sensor, the lifetimes begin to behave similar to that of the isolated red blood cell.

[029] Nos sistemas contendo plasma, observa-se que, no sistema contendo somente o plasma os tempos de vida de fluorescência apresentam um pequeno aumento nos tempos de vida mais curtos e uma significativa redução no tempo de vida mais longo. À medida que se combina com o sensor, e seguida o plasma oxigenado com o sensor, pode-se observar o aumento dos tempos de vida de fluorescência. Descrição Das Figuras A figura 1 apresenta a estrutura do derivado de benzopirona (cumarina) com grupos amino na posição 7 e grupos doadores na posição 3 utilizado na presente invenção. A figura 2 apresenta a forma de deposição da amostra sobre o susbtrato transparente para a realização da análise no FLIM. 1- lâmina ; 2- Lamínula ; 3- sistema detector/Sangue/O2 A figura 3 apresenta a imagem microscópica da região amostral para a seleção da região de interesse para a análise no FLIM, partindo do single point de cada sistema contendo a hemácia e o plasma. A figura 4 apresenta as curvas de decaimentos de fluorescência A) do sensor isolado, B) dos sistemas formados pela hemácia e C) dos sistemas formados pelo plasma. A figura 5 apresenta os gráficos com os tempos de vida obtidos pelos tratamentos das curvas da figura 4.A) Hemácias e B) Plasma.[029] In systems containing plasma, it is observed that, in the system containing only plasma, fluorescence lifetimes show a small increase in the shorter lifetimes and a significant reduction in the longer lifetimes. As it combines with the sensor, and then the oxygenated plasma with the sensor, increased fluorescence lifetimes can be observed. Description of the Figures Figure 1 shows the structure of the benzopyrone derivative (coumarin) with amino groups in position 7 and donor groups in position 3 used in the present invention. Figure 2 shows how the sample is deposited on the transparent substrate to carry out the analysis in FLIM. 1- blade; 2- Coverslip; 3- detector system/Blood/O2 Figure 3 presents the microscopic image of the sample region for selecting the region of interest for FLIM analysis, starting from the single point of each system containing the red blood cell and plasma. Figure 4 shows the fluorescence decay curves of A) the isolated sensor, B) the systems formed by red blood cells and C) the systems formed by plasma. Figure 5 presents the graphs with the lifetimes obtained by treating the curves in figure 4. A) Red blood cells and B) Plasma.

Claims

1. Dynamic sensing method characterized by operating through the detection of the fluorescence lifetime of the system on which it is based;

2. Method according to claim 1, characterized by producing mappable fluorescence decay signal;

3. Method according to claim 1, characterized in that it is for detecting dissolved oxygen gas through a photochemical reaction and photophysical changes;

4. Method according to claims 1 to 3, characterized in that it is sensitive up to ng L-1;

5. Use of the system according to claims 1 to 3, characterized in that it is for detecting oxygen dissolved in blood;

6. Use of the system according to claims 1 to 5, characterized by using microliter quantities of blood and sensor;

7. Use of the system according to claims 1 to 6, characterized in that it is minimally invasive;

8. Use of the system according to claims 1 to 7, characterized in that it is reusable;

9. Use of system according to claims 1 to 8, characterized in that it is for detection in beer.