BR102020016759A2

BR102020016759A2 - Identification and validation process of an autochthonous probiotic of the species Enterococcus faecium and its use as an alternative treatment for the prevention/control of tilapia bacteriosis

Info

Publication number: BR102020016759A2
Application number: BR102020016759-6A
Authority: BR
Inventors: Vanessa Gomes Da Silva; Felipe Pinheiro De Souza; Roberta Torres Chiderole; Leonardo Mantovani Favero; Admilton Gonçalves De Oliveira Junior; Suelen Aparecida Suphoronski; Ulisses De Pádua Pereira
Original assignee: Universidade Estadual De Londrina
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2022-05-24

Abstract

A invenção trata-se de um probiótico autóctone composto por Enterococcus faecium LAC7.2 e aos processos de sua identificação e validação, como também sua aplicação na alimentação de tilápias, na água de criação para tilápias e na alimentação e na água de tilápias. O uso desta invenção nos processos descritos é eficaz na redução da mortalidade por franciselose e estreptococose, aumento no ganho de peso e melhora de alguns parâmetros imunológicos de tilápias do Nilo. O uso de um probiótico autóctone, isolado de peixes brasileiros, permite uma melhor adaptação e tempo de ação no trato digestório de tilápias do Nilo resultando em risco mínimo/nulo dos animais terem alguma reação adversa ao tratamento e ainda um menor impacto no microbioma dos ambientes onde esses animais são criados.

The invention is an autochthonous probiotic composed of Enterococcus faecium LAC7.2 and the processes of its identification and validation, as well as its application in tilapia feeding, in tilapia rearing water and in tilapia food and water. The use of this invention in the described processes is effective in reducing mortality from francisellosis and streptococcosis, increasing weight gain and improving some immunological parameters of Nile tilapia. The use of an autochthonous probiotic, isolated from Brazilian fish, allows a better adaptation and action time in the digestive tract of Nile tilapia, resulting in minimal/no risk of the animals having some adverse reaction to the treatment and even a smaller impact on the microbiome of the environments. where these animals are raised.

Description

PROCESS OF IDENTIFICATION AND VALIDATION OF AUTOCTONE PROBIOTIC FROM THE SPECIES ENTEROCOCCUS FAECIUM AND USE AS ALTERNATIVE TREATMENT FOR THE PREVENTION/CONTROL OF BACTERIOSIS IN TILAPIA

FIELD OF INVENTION

[001] Esta invenção é destinada à aplicação na tilapicultura brasileira. Mesmo enfrentando adversidades, a partir de investimento em tecnologias e intensificação da produção, a piscicultura em cativeiro no Brasil conseguiu crescer 4,5% de 2017 para 2018. De toda a piscicultura de cultivo brasileira, a tilápia contribui com o principal montante, representando 55,4% e levando o país à 4a posição no ranking mundial de maiores produtores da espécie. Apesar das vantagens econômicas da intensificação da produção, o estresse decorrente disto aumenta a susceptibilidade dos peixes a doenças causadas por bactérias, parasitas, fungos e deficiências nutricionais. A redução do uso de quimioterápicos para o controle dessas enfermidades é mandatória e de caráter urgente. O uso de probióticos é uma alternativa de grande valia e de eficácia aqui comprovada para tilápias do Nilo. Um probiótico autóctone traz consigo as vantagens de melhor adaptação à espécie receptora e de menores impactos no microbioma ambiental onde será utilizado.[001] This invention is intended for application in Brazilian tilapia farming. Even facing adversities, from investment in technologies and production intensification, captive fish farming in Brazil managed to grow 4.5% from 2017 to 2018. Of all Brazilian farmed fish farming, tilapia contributes the main amount, representing 55 .4% and taking the country to the 4th position in the world ranking of the largest producers of the species. Despite the economic advantages of intensifying production, the resulting stress increases the susceptibility of fish to diseases caused by bacteria, parasites, fungi and nutritional deficiencies. Reducing the use of chemotherapy drugs to control these diseases is mandatory and urgent. The use of probiotics is an alternative of great value and effectiveness proven here for Nile tilapia. An autochthonous probiotic brings with it the advantages of better adaptation to the recipient species and lower impacts on the environmental microbiome where it will be used.

[002] A franciselose e a estreptococose são as principais bacterioses da tilapicultura intensiva e podem levar a grande mortalidade e prejuízos. O controle destas enfermidades pode ser difícil, considerando que há apenas vacinas disponíveis comercialmente para a estreptococose. Em busca de frear a crescente pressão seletiva pelo uso indiscriminado de antimicrobianos e a consequente disseminação de genes de resistência na população bacteriana, o uso profilático destes quimioterápicos vem sendo desestimulado e até proibido em alguns países e/ou situações. Os probióticos, então, foram inseridos como uma alternativa valiosa na produção animal. Diversos estudos mostram seus efeitos positivos na imunomodulação frente a enfermidades e no ganho de peso de diversas espécies animais.[002] Franchisellosis and streptococcosis are the main bacterial diseases of intensive tilapia farming and can lead to high mortality and losses. Controlling these diseases can be difficult, considering that there are only commercially available vaccines for streptococcosis. In order to stop the growing selective pressure for the indiscriminate use of antimicrobials and the consequent dissemination of resistance genes in the bacterial population, the prophylactic use of these chemotherapeutics has been discouraged and even banned in some countries and/or situations. Probiotics, then, were introduced as a valuable alternative in animal production. Several studies show its positive effects on immunomodulation against diseases and weight gain in several animal species.

[003] Dito isto, a maioria dos estudos avaliando probióticos utilizam linhagens de microrganismos isolados de outras fontes que não a espécie que irá receber o produto, de outras regiões geográficas ou ainda de fontes ambientais. O uso de probióticos autóctones, isolados da mesma região onde será utilizado e da mesma espécie que irá recebê-lo, é favorável visto que a linhagem já é adaptada ao trato gastrintestinal do animal, e seu impacto no microbioma local/ambiental será menor. Além disso, o conhecimento do genoma completo da linhagem utilizada como probiótico permite empregar ferramentas de bioinformática que auxiliam na predição de características importantes para um bom probiótico, como metabólitos, adesinas, fatores de virulência, e presença ou não de genes de resistência aos antibacterianos.[003] That said, most studies evaluating probiotics use strains of microorganisms isolated from sources other than the species that will receive the product, from other geographic regions or from environmental sources. The use of autochthonous probiotics, isolated from the same region where it will be used and from the same species that will receive it, is favorable since the strain is already adapted to the animal's gastrointestinal tract, and its impact on the local/environmental microbiome will be smaller. In addition, the knowledge of the complete genome of the strain used as a probiotic allows the use of bioinformatics tools that help in the prediction of important characteristics for a good probiotic, such as metabolites, adhesins, virulence factors, and the presence or absence of antibacterial resistance genes.

[004] Estudos dos últimos anos mostraram o efeito benéfico (aumentando a imunidade e reduzindo a mortalidade frente a patógenos) de micro-organismos probióticos em tilápias do Nilo (STANDEN et al., 2016), surubim (PEREIRA et al., 2016), linguado (PARK et al., 2016) e juvenis de truta arco-íris (SAFARI et al., 2016). Os estudos com tilápia do Nilo e juvenis de esturjão (TA’ATI et al., 2011) relatam que os animais que receberam probióticos juntamente com a ração obtiveram maiores ganhos de peso em comparação com os grupos não tratados. Contudo, os dois estudos citados que avaliaram os efeitos em tilápias utilizaram produtos comerciais, sendo um deles derivado de levedura fermentadora de cerveja (TA’ATI et al., 2011) e o outro um mix de microrganismos sem descrição da fonte de isolamento (STANDEN et al, 2016). Estes dados demonstram o elevado potencial de probióticos e prebióticos para melhorar o desempenho zootécnico e reduzir a mortalidade causada por doenças em peixes.[004] Studies in recent years have shown the beneficial effect (increasing immunity and reducing mortality against pathogens) of probiotic microorganisms on Nile tilapia (STANDEN et al., 2016), surubim (PEREIRA et al., 2016) , sole (PARK et al., 2016) and juvenile rainbow trout (SAFARI et al., 2016). Studies with Nile tilapia and sturgeon juveniles (TA'ATI et al., 2011) report that animals that received probiotics along with the feed achieved greater weight gains compared to untreated groups. However, the two cited studies that evaluated the effects on tilapia used commercial products, one of them being derived from brewer's yeast (TA'ATI et al., 2011) and the other a mix of microorganisms without description of the isolation source (STANDEN et al, 2016). These data demonstrate the high potential of probiotics and prebiotics to improve zootechnical performance and reduce mortality caused by diseases in fish.

[005] Atualmente, no mercado, encontramos diferentes fórmulas comerciais de probióticos testadas e utilizadas em peixes. Porém, observa-se que probióticos isolados de outros animais ou espécies de peixes que não sejam o alvo, podem apresentar resultados controversos, sendo necessário o isolamento e desenvolvimento de probióticos espécie-específicos, ou seja, probióticos autóctones (MOURINO, 2010). Além disso, muitos dos probióticos foram isolados em outros países, o que pode influenciar negativamente a microflora aquática das bacias hidrográficas do Brasil, fazendo-se necessário, desta forma, o estudo de probiótico autóctones que sejam utilizados na mesma região que foram isolados.[005] Currently, on the market, we find different commercial formulas of probiotics tested and used in fish. However, it is observed that probiotics isolated from other animals or fish species that are not the target can present controversial results, requiring the isolation and development of species-specific probiotics, that is, autochthonous probiotics (MOURINO, 2010). In addition, many of the probiotics were isolated in other countries, which can negatively influence the aquatic microflora of Brazilian watersheds, making it necessary, therefore, to study autochthonous probiotics that are used in the same region that they were isolated.

[006] A linhagem Enterococcus faecium LAC7.2 foi capaz de aumentar o ganho de peso e o peso final de tilápias pelo método de fornecimento na ração. Os três métodos de fornecimento descritos aqui foram capazes de controlar a mortalidade da estreptococose. A mortalidade por franciselose foi menor quando o método de fornecimento associando ração e água foi utilizado. Quando o método de fornecimento via água foi utilizado, associado ou não à ração, a diversidade de gêneros bacterianos da microbiota fecal foi maior. No teste invasivo de segurança biológica foi possível observar a capacidade da referida linhagem em colonizar o fígado e manter-se viável. Mesmo assim, a linhagem mostrou-se segura ao não induzir alterações de comportamento ou manifestações clínicas nos peixes. Dos 27 genes codificantes de fatores de virulência identificados no genoma da Enterococcus faecium LAC7.2 no VFDB, 19 são de importância a um bom candidato a probiótico (adesão, cápsula, formação de biofilme e resistência a sais biliares). Esses quatro fatores, juntos, podem auxiliar que a linhagem sobreviva à digestão (resistência a sais biliares), não seja fagocitada pelo sistema imune (cápsula) e colonize a superfície dos enterócitos (adesão e formação de biofilme). Ainda, os outros genes identificados no VFDB não codificam fatores com ação deletéria direta ao hospedeiro, mas sim fatores de adaptação da bactéria ao ambiente (proteínas de estresse, enzimas, regulação de expressão gênica). Apesar de possuir genes de resistência a duas classes de antimicrobianos em um de seus plasmídeos, estes antimicrobianos não são de uso na piscicultura, assim não sofrem pressão de seleção que possa estimular a dispersão deste plasmídeo. Finalmente, a principal vantagem da linhagem Enterococcus faecium LAC 7.2 é ser um probiótco autóctone para tilápias brasileiras.[006] The Enterococcus faecium LAC7.2 strain was able to increase the weight gain and the final weight of tilapia by the method of supply in the diet. The three delivery methods described here were able to control streptococcosis mortality. Mortality from francisellosis was lower when the feed and water supply method was used. When the method of supply via water was used, associated or not with the ration, the diversity of bacterial genera of the fecal microbiota was greater. In the invasive biological safety test, it was possible to observe the ability of this strain to colonize the liver and remain viable. Even so, the strain proved to be safe as it did not induce changes in behavior or clinical manifestations in fish. Of the 27 virulence factor coding genes identified in the genome of Enterococcus faecium LAC7.2 in the VFDB, 19 are of importance for a good probiotic candidate (adhesion, capsule, biofilm formation and bile salt resistance). These four factors together may help the strain to survive digestion (bile salt resistance), not be phagocytosed by the immune system (capsule) and colonize the surface of enterocytes (adhesion and biofilm formation). Furthermore, the other genes identified in the VFDB do not encode factors with direct deleterious action on the host, but factors that adapt the bacteria to the environment (stress proteins, enzymes, regulation of gene expression). Despite having resistance genes to two classes of antimicrobials in one of its plasmids, these antimicrobials are not of use in fish farming, so they do not suffer selection pressure that could stimulate the dispersion of this plasmid. Finally, the main advantage of the Enterococcus faecium LAC 7.2 strain is that it is an autochthonous probiotic for Brazilian tilapia.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[007] A invenção BR 10 2016 014740-9, intitulada “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ALIMENTO PROBIÓTICO À BASE DE CHOCOLATE E PRODUTO OBTIDO”, cujo resumo descreve a composição de um chocolate acrescido de E. faecium, diferentemente da invenção proposta , a qual, apesar de também utilizar o E. faecium, trata do desenvolvimento de probiótico para tilápias.[007] The invention BR 10 2016 014740-9, entitled "PROBIOTIC FOOD OBTAINMENT PROCESS BASED ON CHOCOLATE AND PRODUCT OBTAINED", whose summary describes the composition of a chocolate plus E. faecium, unlike the proposed invention, which , despite also using E. faecium, deals with the development of probiotics for tilapia.

[008] A invenção PI 1100881-4, intitulada “PROBIÓTICO PARA BOVINO”, refere-se a uma linhagem de Enterococcus faecium que é parte em uma mistura líquida de microorganismos probióticos para fornecimento a bovinos, não fazendo referência alguma a probióticos para tilápias.[008] The invention PI 1100881-4, entitled "PROBIOTIC FOR BOVINE", refers to a strain of Enterococcus faecium that is part of a liquid mixture of probiotic microorganisms for supply to cattle, making no reference to probiotics for tilapia.

[009] A patente PI 1100908-0, intitulada “PROBIÓTICO EM PÓ DE ADMINISTRAÇÃO ORAL PARA BOVINO”, desenvolve uma linhagem de Enterococcus faecium que integra uma mistura de microrganismos probióticos em pó para fornecimento de bovinos, não havendo referência alguma a probióticos para tilápia.A invenção ES2657543 (T3), intitulada “COMPOSICIÓN DE ADITIVO ALIMENTÁRIO”, trata de um aditivo alimentar composto dos microrganismos Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e suas combinações. Esta patente e a invenção proposta possuem claras diferenças quanto aos organismos usados para a pesquisa, uma vez que a invenção proposta utiliza a linhagem Enterococcus faecium.[009] Patent PI 1100908-0, entitled "PROBIOTIC POWDER FOR ORAL ADMINISTRATION FOR BOVINE", develops a strain of Enterococcus faecium that integrates a mixture of probiotic microorganisms in powder for supply to cattle, with no reference to probiotics for tilapia The invention ES2657543 (T3), entitled “COMPOSICIÓN DE ADIDOTIVO ALIMENTÁRIO”, deals with a food additive composed of the microorganisms Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and their combinations. This patent and the proposed invention have clear differences regarding the organisms used for the research, since the proposed invention uses the Enterococcus faecium strain.

[010] A patente ES2655032 (T3), intitulada Polipéptidos que poseen actividad proteasa y polinucleótidos que los codifican, descreve proteases e as sequências de aminoácidos que os codificam para uso na alimentação animal, ou seja, a matéria de sua pesquisa é diferente da descrita Neste Relatório Descritivo, na medida em que esta última pleiteia como novo a invenção de um probiótico que diminui a mortalidade das tilápias-do-nilo que são criadas comercialmente no Brasil.[010] Patent ES2655032 (T3), entitled Polypeptides that poseen protease activity and polynucleotides that codify them, describes proteases and the amino acid sequences that encode them for use in animal nutrition, that is, the subject of their research is different from that described In this Descriptive Report, as the latter claims as new the invention of a probiotic that reduces the mortality of Nile tilapia that are commercially raised in Brazil.

[011] A invenção ES2650115 (T3), intitulada Polipéptidos que tienen actividad de alfa-xilosidasa y polinucleótidos que los codifican, descreve alfa-xilosidases e as sequências de aminoácidos que os codificam para uso na alimentação animal, tratando de matérias completamente distintas da invenção proposta, pelos exatos mesmos motivos indicados na patente analisada acima.[011] The invention ES2650115 (T3), entitled Polypeptides that have alpha-xylosidase activity and polynucleotides that encode them, describes alpha-xylosidases and the amino acid sequences that encode them for use in animal nutrition, dealing with completely different matters of the invention proposal, for the exact same reasons indicated in the patent analyzed above.

[012] A patente ES2649217 (T3) - Polipéptidos que tienen actividad de alfa-L-galactosidasa y polinucleótidos que los codifican, que, descreve alfa-L-galactosidases e as sequências de aminoácidos que os codificam para uso na alimentação animal. Ou seja, assim como a patente acima citada, trata de uma matéria distinta da discutida Neste Relatório Descritivo.[012] Patent ES2649217 (T3) - Polypeptides that have alpha-L-galactosidase activity and polynucleotides that encode them, which describes alpha-L-galactosidases and the amino acid sequences that encode them for use in animal feed. In other words, like the patent mentioned above, it deals with a different matter from the one discussed in this Descriptive Report.

[013] A patente ES2616630 (T3), intitulada “USO DE METILSULFINOLMETANO (MSM) PARA MODULAR LA ACTIVIDAD”, aplica um método para melhorar a fermentação de microrganismos de uso alimentar (bebidas alcólicas, produtos lácteos) ou uso em biocombustíveis, não havendo nenhuma referência a probióticos para tilápias.[013] Patent ES2616630 (T3), entitled “USE OF METHYLSULPHINOLMETHANE (MSM) TO MODULATE THE ACTIVIDAD”, applies a method to improve the fermentation of microorganisms for food use (alcoholic beverages, dairy products) or use in biofuels, there being no no reference to probiotics for tilapia.

[014] A patente ES2530858 (T3), intitulada “COMIDA PARA MASCOTAS, RECUBIERTA A VACÍO”, descrevendo um petisco para animais de companhia contendo microrganismos probióticos, trata de probióticos, mas apenas para animais de estimação, e não para a produção comercial de tilápias, como o faz a invenção aqui pleiteada[014] Patent ES2530858 (T3), entitled “FOOD FOR PETS, RECUBIERTA A VACÍO”, describing a pet treat containing probiotic microorganisms, deals with probiotics, but only for pets, and not for the commercial production of tilapia, as the invention claimed here does

[015] A invenção ES2349172 (T3), intitulada “POLIPEPTIDOS Y ACIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN”, trabalha com sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos para melhorar a conversão alimentar e microflora intestinal, coma intenção de beneficiar seres humanos, mas não a não de tilápias, como o faz a invenção pleiteada neste documento, sendo este o fator que diferencia esta invenção da pleiteada nesse pedido.[015] The invention ES2349172 (T3), entitled “POLIPEPTIDOS Y ACIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN”, works with nucleotide sequences that encode polypeptides to improve food conversion and intestinal microflora, with the intention of benefiting human beings, but not tilapia, as the invention claimed in this document does, which is the factor that differentiates this invention from the one claimed in this application.

[016] A invenção ES2279439 (T3), intitulada “UTILIZACION DE LOS BACILI PARA LA PREVENCION DEL SINDROME DE COMPRESION DE LAS VERTEBRAS”, utiliza-se de microrganismos da classe Bacilli para prevenir a compressão de vértebras em peixes salmonídeos. Esta patente, no entanto, trabalha com a classe Bacilli, e não com a linhagem Enterococcus faecium,[016] The invention ES2279439 (T3), entitled “UTILIZACION DE LOS BACILI PARA LA PREVENCION DEL SINDROME DE COMPRESION DE LAS VERTEBRAS”, uses microorganisms of the Bacilli class to prevent compression of vertebrae in salmonid fish. This patent, however, works with the Bacilli class, not the Enterococcus faecium lineage,

[017] A patente ES2269993 (T3), intitulada “PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE ALIMENTOS QUE COMPRENDEN UN SISTEMA DE SUMINISTRO PROBIOTICO”, é um processo de compactação de microrganismos viáveis a uma matriz para obtenção de alimento probiótico, mas que não necessariamente trata da obtenção deste alimento probiótico para tilápias, como é o caso da invenção pleiteada nesse pedido.[017] Patent ES2269993 (T3), entitled "PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE ALIMENTOS QUE COMPRENDEN UN SYSTEM DE SUMINISTRO PROBIOTICO", is a process of compaction of viable microorganisms to a matrix to obtain probiotic food, but which does not necessarily deal with the obtaining this probiotic food for tilapia, as is the case with the invention claimed in this application.

[018] A patente ES2261259 (T3), intitulada “PROCEDIMIENTO PARA INCREMENTAR LA ACTIVIDAD DE LOS ANIMALES DOMESTICOS”, descreve um aditivo nutricional para cães e gatos para promover o crescimento de bactérias bífido e lácteas no trato gastrintestinal. No entanto, não há menção nenhuma a tilápias, que é a matéria da invenção pleiteada neste documento.[018] Patent ES2261259 (T3), entitled “PROCEDIMIENTO PARA INCREMENTAR LA ACTIVIDAD DE LOS ANIMALES DOMESTICOS”, describes a nutritional additive for dogs and cats to promote the growth of bifid and lactic bacteria in the gastrointestinal tract. However, there is no mention of tilapia, which is the subject of the invention claimed in this document.

[019] A invenção US2016082053A1, intitulada “BACILLUS BACTERIA FOR USE IN TREATING AND PREVENTING INFECTION IN AQUATIC ANIMALS”, descreve formulações contendo esporos do gênero Bacillus para prevenir doenças de peixes ou crustáceos de criação. Apesar de esta patente tratar da criação de peixes, sua pesquisa foi executada utilizando a classe Bacillus, enquanto na pesquisa da Invenção aqui pleiteada, utiliza especificamente a linhagem Enterococcus faecium.[019] The invention US2016082053A1, entitled "BACILLUS BACTERIA FOR USE IN TREATING AND PREVENTING INFECTION IN AQUATIC ANIMALS", describes formulations containing spores of the genus Bacillus to prevent diseases of farmed fish or crustaceans. Although this patent deals with fish farming, its research was carried out using the Bacillus class, while in the research of the Invention claimed here, it specifically uses the Enterococcus faecium strain.

[020] A invenção BRPI9206505. intitulada “ENTEROCOCCUS MICROENCAPSULADO EM ÁCIDO GRAXO PARA USO COM AVES”, descreve duas cepas de E. faecium de uma coleção na Alemanha fornecidas microencapsuladas para aves com objetivo probiótico. Apesar de ambas as invenções, esta e a proposta nesse pedido, tratarem de temas semelhantes, esta direciona-se ao uso em aves e a proposta, ao uso em tilápias, desta forma, cada qual possui sua especificidade de acordo com a fisiologia e demais aspectos de seus respectivos animais.[020] The BRPI9206505 invention. entitled “ENTEROCOCCUS MICROENCAPSULATED IN FATTY ACID FOR USE WITH POULTRY”, describes two strains of E. faecium from a collection in Germany supplied microencapsulated to birds for probiotic purposes. Although both inventions, this one and the proposal in this application, deal with similar themes, this one is directed to the use in birds and the proposal, to the use in tilapia, in this way, each one has its specificity according to the physiology and others. aspects of their respective animals.

[021] A invenção BRPI0709852, intitulada “SUPLEMENTOS DIETÉTICOS CONTENDO PROBIÓTICOS”, descreve um suplemento alimentar, acrescido de várias cepas probióticas, entre elas E. faecium, para qualquer espécie animal (ser humano ou outro animal, incluindo animais aviários, bovinos, caninos, equinos, felinos, hicrinos, murinos, ovinos e suínos) que possa se beneficiar da administração de probióticos). Esta patente, além de não citar especificamente peixes, trata-se de uma pesquisa para suplemento alimentar, e não para produção de probióticos para evitar doenças (em peixes), como é o caso da invenção pleiteada neste documento.[021] The invention BRPI0709852, entitled "DIETARY SUPPLEMENTS CONTAINING PROBIOTICS", describes a food supplement, plus several probiotic strains, including E. faecium, for any animal species (human or other animal, including avian animals, cattle, dogs , equine, feline, hycrine, murine, ovine and swine) that may benefit from the administration of probiotics). This patent, in addition to not specifically mentioning fish, is a research for a food supplement, and not for the production of probiotics to prevent diseases (in fish), as is the case of the invention claimed in this document.

[022] A patente BRPI0614478, intitulada “COMPOSIÇÃO COSMÉTICA E/OU DERMATOLÓGICA PARA A PREVENÇÃO E/OU O TRATAMENTO DAS PELES SENSÍVEIS OU SECAS”, apresenta um produto que é uma composição tópica, cosmética, para pele seca de humanos, contendo pelo menos um microrganismo probiótico. Infere-se assim, pelo tema desta invenção, que a única semelhança entre ela e a proposta nesse pedido é a utilização de organismos probióticos, não havendo referência nenhuma à reprodução comercial de tilápias[022] Patent BRPI0614478, entitled “COSMETIC AND/OR DERMATOLOGICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF SENSITIVE OR DRY SKIN”, presents a product that is a topical, cosmetic composition for dry human skin, containing at least a probiotic microorganism. It is inferred, therefore, from the subject of this invention, that the only similarity between it and the proposal in this application is the use of probiotic organisms, with no reference to commercial reproduction of tilapia

[023] A invenção BRPI0608782, intitulada “FÓRMULA PARA BEBÊ COM PROBIÓTICOS”, cita que E. faecium pode ser parte de um formulado dietético para bebês humanos. Esta, entretanto, é a única referência a esta linhagem em toda a compleição da patente, ou seja, não há maiores semelhanças entre o tema desta e o da invenção proposta nesse pedido.[023] The invention BRPI0608782, entitled “BABY FORMULA WITH PROBIOTICS”, mentions that E. faecium can be part of a dietary formula for human babies. This, however, is the only reference to this lineage in the entirety of the patent, that is, there are no major similarities between the subject matter of this line and that of the invention proposed in this application.

[024] A patente BRPI0609456, intitulada “COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO COMPONENTE PROBIÓTICOS E ADOÇANTES”, origina um produto adoçante com probióticos podendo conter E. faecium para mamíferos, humanos ou animais de estimação, não direcionando-se à reprodução comercial de tilápias, como é o caso da invenção proposta.[024] Patent BRPI0609456, entitled "COMPOSITIONS INCLUDING PROBIOTIC COMPONENTS AND SWEETENERS", originates a sweetener product with probiotics that may contain E. faecium for mammals, humans or pets, not intended for commercial reproduction of tilapia, as is the case with case of the proposed invention.

[025] A patente PT3071235, intitulada “PRODUTOS TERAPÊUTICOS DE GLICANOS E RESPETIVOS MÉTODOS RELACIONADOS”, descreve uma composição de glicanos para modulação da microbiota humana. A invenção cuja patente é pleiteada neste Relatório Descritivo, no entanto, trabalha somente com a microbiota das tilápias do Nilo, criadas comercialmente no Brasil, desta forma, não há grandes semelhanças entre ambas as invenções.[025] Patent PT3071235, entitled “THERAPEUTIC GLYCAN PRODUCTS AND RELATED METHODS”, describes a glycan composition for modulating the human microbiota. The invention whose patent is claimed in this Descriptive Report, however, works only with the microbiota of Nile tilapia, commercially bred in Brazil, thus, there are no great similarities between both inventions.

[026] A invenção BRPI0412978, intitulada “CULTURA BIOLOGICAMENTE PURA DE GRUPO BACTERIANO, CO-CULTURA BACTERIANA, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA, ADITIVO OU SUPLEMENTO ALIMENTAR, GÊNERO ALIMENTÌCIO, MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR DESORDEM E ARTIGO DE MANUFATURA”, que métodos de utilização de cepas bacterianas do gênero Bacillus no tratamento de diarreia em humanos., assim, não há tratamento ao tema de probióticos para Tilápias, como é o proposto nesse pedido.[026] The invention BRPI0412978, entitled "BIOLOGICALLY PURE CULTURE OF BACTERIAL GROUP, BACTERIAL CO-CULTURE, THERAPEUTIC COMPOSITION, ADDITIVE OR FOOD SUPPLEMENT, FOOD, METHOD TO TREAT OR PREVENT DISORDER AND ARTICLE OF MANUFACTURE", which strains use methods bacteria of the genus Bacillus in the treatment of diarrhea in humans., thus, there is no treatment of probiotics for Tilapias, as proposed in this application.

[027] A invenção PT2306970, intitulada “USO COSMÉTICO DE LACTOBACILLUS PARACASEI PARA O TRATAMENTO DE PELE OLEOSA”, descreve um produto cosmético composto de Lactobacillus casei. Esta patente não apenas utiliza um organismo distinto do pesquisado na invenção proposta, como também visa outro público e mercado.[027] The invention PT2306970, entitled "COSMETIC USE OF LACTOBACILLUS PARACASEI FOR THE TREATMENT OF OIL SKIN", describes a cosmetic product composed of Lactobacillus casei. This patent not only uses a different organism from the one researched in the proposed invention, but also aims at another public and market.

[028] A patente BRPI0714227, intitulada “MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS”, descreve a utilização de nanopartículas coloidais metálicas para uso como antimicrobiano, não havendo referência alguma à produção de probióticos para tilápias.[028] Patent BRPI0714227, entitled "METHOD FOR PRODUCTION OF METALLIC NANOPARTICLES", describes the use of colloidal metallic nanoparticles for use as an antimicrobial, with no reference to the production of probiotics for tilapia.

[029] A invenção BRPI0615547, intitulada “PRODUTO ALIMENTÍCIO, PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO ALIMENTÍCIO, MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO PRODUTO ALIMENTÍCIO, USOS DA PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE FORNECIMENTO DE BENEFÍCIOS À SAÚDE DO INTESTINO E IMPLEMENTOS DE LIBERAÇÃO PARA USO COM PRODUTO ALIMENTÍCIO”, apresenta produtos alimentícios ou farmacêuticos contendo anticorpos e microrganismos probióticos para fornecimento a humanos. Desta forma, a expectativa é da sua utilização em humanos, e não em tilápias, como é com a invenção aqui pleiteada.[029] The invention BRPI0615547, entitled "FOOD PRODUCT, PHARMACEUTICAL PREPARATION, FOOD PRODUCT MANUFACTURING METHOD, PHARMACEUTICAL PREPARATION MANUFACTURING METHOD, FOOD PRODUCT USE, PHARMACEUTICAL PREPARATION USES, INTESTINE HEALTH BENEFITS METHOD AND IMPLEMENTATION RELEASE FOR USE WITH FOOD PRODUCT”, presents food or pharmaceutical products containing antibodies and probiotic microorganisms for supply to humans. Thus, the expectation is for its use in humans, and not in tilapia, as is the case with the invention claimed here.

[030] A invenção BRPI1003653, intitulada “PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO ALIMENTÍCIO, PRODUTO ALIMENTÍCIO, À BASE DE AMIDO E ISENTO DE LACTOSE CONTENDO CULTURAS PROBIÓTICAS E/OU INGREDIENTES PREBIÓTICOS E SEUS USOS”, são produtos alimentícios contendo microrganismos probióticos, preferencialmente Lactobacillus acidophilus ou Bifidobacterium animalis. Estes produtos alimentícios são para o benefício de seres humanos, e não de tilápias de criação comercial.[030] The invention BRPI1003653, entitled "PROCESS FOR MANUFACTURING FOOD PRODUCT, FOOD PRODUCT, STARCH-BASED AND LACTOSE-FREE CONTAINING PROBIOTIC CULTURES AND/OR PREBIOTIC INGREDIENTS AND THEIR USES", are food products containing probiotic microorganisms, preferably Lactobacillus acidophilus or Bifidobacterium animalis. These food products are for the benefit of humans, not commercially farmed tilapia.

[031] A invenção PT2149368, intitulada “UTILIZAÇÃO COSMÉTICA E DERMATOLÓGICA DE MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS LACTOBACILLUS PARACASEI PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS DO COURO CABELUDO OLEOSO”, apresenta um produto cosmético para humanos contendo Lactobacillus paracasei, não havendo nenhuma referência à sua utilização para benefícios de tilápias, como é o caso da Invenção pleiteada.[031] The invention PT2149368, entitled "COSMETIC AND DERMATOLOGICAL USE OF PROBIOTIC MICROORGANISMS LACTOBACILLUS PARACASEI FOR THE TREATMENT OF DISORDERS OF OIL SCALP", presents a cosmetic product for humans containing Lactobacillus paracasei, with no reference to its use for benefits of tilapia , as is the case with the claimed invention.

[032] A patente CN102757131B, intitulada “WATER QUALITY AMELIORANT FOR AQUACULTURE”, descreve um produto para melhorar a qualidade da água de aquicultura de alta densidade animal. Dentre os componentes, encontra-se uma cepa de Enterococcus faecalis, no entanto, esta pesquisa direciona-se à melhora da qualidade de água, e não à produção de probióticos para tilápias.[032] Patent CN102757131B, entitled “WATER QUALITY AMELIORANT FOR AQUACULTURE”, describes a product to improve the quality of high animal density aquaculture water. Among the components, there is a strain of Enterococcus faecalis, however, this research is aimed at improving water quality, not the production of probiotics for tilapia.

[033] A invenção US9603879B2, intitulada “BACILLUS BACTERIA FOR USE IN TRETATIN AND PREVENTING INFECTION IN AQUATIC ANIMALS”, estudou composições de esporos do gênero Bacillus para controle de doenças em animais aquáticos (peixes e crustáceos). No entanto, não há referências à linhagem Enterococcus faecalis, como é o caso da invenção aqui pleiteada, e tampouco menção exclusiva à tilápia-do-nilo e suas especificidades fisiológicas.[033] The invention US9603879B2, entitled “BACILLUS BACTERIA FOR USE IN TETATIN AND PREVENTING INFECTION IN AQUATIC ANIMALS”, studied spore compositions of the genus Bacillus to control diseases in aquatic animals (fish and crustaceans). However, there are no references to the Enterococcus faecalis strain, as is the case with the invention claimed here, and no exclusive mention of Nile tilapia and its physiological specificities.

[034] A patente KR20020013670A, intitulada “PROBIOTIC PREPARATIONS FOR AQUACULTURED FISH AND IS PRODUCTION METHOD”, descreve um produto contendo três cepas probióticas, sendo uma delas E. faecium, para fornecimento para peixes. Apesar disto, não há aprofundamento específico na cepa de Enterococcus faecalis, e tampouco direcionamento exclusivo às tilápias-do-nilo no Brasil, que possuem suas especificidades.[034] Patent KR20020013670A, entitled “PROBIOTIC PREPARATIONS FOR AQUACULTURED FISH AND IS PRODUCTION METHOD”, describes a product containing three probiotic strains, one of which is E. faecium, for supply to fish. Despite this, there is no specific in-depth study of the Enterococcus faecalis strain, nor is there an exclusive targeting of Nile tilapia in Brazil, which have their specificities.

SUMMARY OF THE INVENTION

[035] A presente invenção diz respeito a um probiótico autóctone composto por Enterococcus faecium LAC7.2 (SISGEN A4CF809) e aos métodos de sua identificação, sua validação, e de sua aplicação na alimentação de tilápias, na água de criação para tilápias, e na alimentação e água de criação de tilápias associadas. O uso desta invenção nos métodos descritos foi eficaz na redução da mortalidade por franciselose e estreptococose, aumento no ganho de peso e melhora de alguns parâmetros imunológicos de tilápias do Nilo. O uso de um probiótico autóctone isolado de peixes brasileiros, permite uma melhor adaptação e tempo de ação no trato digestório de tilápias do Nilo, resultando em risco mínimo/nulo dos animais terem alguma reação adversa ao tratamento e ainda um menor impacto no microbioma dos ambientes onde esses animais são criados. Adicionalmente, por análises genômicas, identificamos genes responsáveis por fatores favoráveis de resistência a sais biliares, formação de biofilme e aderência e validamos a baixa presença de genes de resistência a antibacterianos da cepa (com potencial de fácil dispersão para outras bactérias via plasmídeos), garantindo assim um menor risco de transmissão de genes de resistência para outras bactérias no ambiente aquático.[035] The present invention concerns an autochthonous probiotic composed of Enterococcus faecium LAC7.2 (SISGEN A4CF809) and the methods of its identification, validation, and application in tilapia feeding, in tilapia rearing water, and in the food and water of associated tilapia farming. The use of this invention in the methods described was effective in reducing mortality from francisellosis and streptococcosis, increasing weight gain and improving some immunological parameters of Nile tilapia. The use of an autochthonous probiotic isolated from Brazilian fish allows a better adaptation and action time in the digestive tract of Nile tilapia, resulting in a minimal/no risk of the animals having some adverse reaction to the treatment and even a smaller impact on the microbiome of the environments. where these animals are raised. Additionally, by genomic analyses, we identified genes responsible for favorable factors of resistance to bile salts, biofilm formation and adherence and validated the low presence of genes of resistance to antibacterials of the strain (with the potential for easy dispersion to other bacteria via plasmids), ensuring thus a lower risk of transmission of resistance genes to other bacteria in the aquatic environment.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 1) In vitro selection of a strain with potential inhibitory activity (Fig. 1 of the DRAWINGS document)

[036] Fezes e intestinos de tilápias saudáveis foram semeadas em caldo Man, Rogosa e Sharpe (MRS) e incubadas a 28°C por 48 horas. Então, o caldo foi diluído serialmente em salina 0,85% e semeado em ágar MRS e incubado por 48 horas a 28 °C.[036] Feces and intestines of healthy tilapia were seeded in Man, Rogosa and Sharpe (MRS) broth and incubated at 28°C for 48 hours. Then, the broth was serially diluted in 0.85% saline and seeded on MRS agar and incubated for 48 hours at 28 °C.

[037] As colônias obtidas isoladas foram submetidas ao teste de sobrecamada (spot-in-the-lawn) para avaliar sua capacidade de inibir o crescimento de bactérias patogênicas. Para isso, as colônias foram semeadas em placas contendo ágar MRS em pontos a uma distância de 2 cm da borda da placa e incubadas por 48 horas a 28 °C.[037] The isolated colonies were subjected to the spot-in-the-lawn test to assess their ability to inhibit the growth of pathogenic bacteria. For this, colonies were seeded on plates containing MRS agar in spots at a distance of 2 cm from the edge of the plate and incubated for 48 hours at 28 °C.

[038] Inóculos bacterianos de linhagens patogênicas de Escherichia coli, Staphylococcus spp e Streptococcus spp foram inoculados, separadamente, em ágar Mueller-Hinton (MH) semissólido a 45°C. Uma sobrecamada do ágar MH contendo as bactérias patogênicas foi distribuída sobre as placas de ágar MRS contendo as bactérias isoladas de fezes. As placas foram então incubadas a 28 °C por 24 horas. Após a incubação, foi verificada a presença de halos de inibição que foram mensurados em milímetros. A colônia com maiores halos de inibição foi selecionada para os testes seguintes (LAC7.2). Os halos de inibição obtidos foram: 16 mm, 15 mm e 10 mm, respectivamente.[038] Bacterial inocula of pathogenic strains of Escherichia coli, Staphylococcus spp and Streptococcus spp were inoculated separately on semi-solid Mueller-Hinton (MH) agar at 45°C. An overlay of MH agar containing the pathogenic bacteria was spread over the MRS agar plates containing the bacteria isolated from feces. The plates were then incubated at 28 °C for 24 hours. After incubation, the presence of inhibition halos was verified, which were measured in millimeters. The colony with the highest inhibition halos was selected for the following tests (LAC7.2). The inhibition halos obtained were: 16 mm, 15 mm and 10 mm, respectively.

[039] Então, os metabólitos da linhagem LAC7.2 foram submetidos a um teste de inibição da cepa F1 de Francisella orientalis e da cepa S13 de Steptococcus agalactiae. Para isso, uma colônia da linhagem 7.2 foi inoculada em caldo MRS e incubada a 28°C por 48 horas.[039] Then, the metabolites of the LAC7.2 strain were subjected to an inhibition test of the F1 strain of Francisella orientalis and the S13 strain of Steptococcus agalactiae. For this, a colony of strain 7.2 was inoculated in MRS broth and incubated at 28°C for 48 hours.

[040] Uma alíquota do caldo foi, então, centrifugada e o sobrenadante foi, ainda, filtrado em micromembrana (0,22 µm) para garantir a ausência de células. O sobrenadante filtrado e o caldo total foram adicionados em poços diferentes de placas de ágar cistina-coração suplementado com 5% de hemoglobina bovina previamente inoculado com cepa F1 e em placas de ágar Mueller-Hinton suplementado com 5% de sangue ovino desfibrinado previamente inoculado com cepa S13. As placas foram incubadas a 28 °C por 48 horas e então o diâmetro dos halos de inibição foram medidos em milímetros.[040] An aliquot of the broth was then centrifuged and the supernatant was further filtered through a micromembrane (0.22 µm) to ensure the absence of cells. The filtered supernatant and the total broth were added to different wells of cystine heart agar plates supplemented with 5% bovine hemoglobin previously inoculated with F1 strain and on Mueller-Hinton agar plates supplemented with 5% defibrinated sheep blood previously inoculated with strain S13. The plates were incubated at 28 °C for 48 hours and then the diameter of the inhibition halos was measured in millimeters.

[041] O halo de inibição da cepa F1 obtido pelo sobrenadante foi de 18 mm. O halo de inibição da cepa S13 pelo caldo total de Enterococcus faecium LAC 7.2 foi de 10 mm, o sobrenadante não inibiu a cepa S13.[041] The inhibition halo of the F1 strain obtained by the supernatant was 18 mm. The inhibition halo of the S13 strain by the total broth of Enterococcus faecium LAC 7.2 was 10 mm, the supernatant did not inhibit the S13 strain.

2) Genomic characterization and prediction of secondary metabolites, virulence factors and resistance genes (Figure 1)

[042] Após a extração do DNA genômico da linhagem 7.2, seu genoma foi sequenciado utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). As reads em formato FASTQ foram utilizadas para trimming e assembly utilizando o software CLC Genomics Workbench 12 (Qiagen). A anotação do genoma foi realizada pelo Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) do próprio NCBI. O genoma foi depositado no GenBank sob número de acesso CP045012.[042] After extracting the genomic DNA from the 7.2 lineage, its genome was sequenced using the MiSeq platform (Illumina). The reads in FASTQ format were used for trimming and assembly using the CLC Genomics Workbench 12 software (Qiagen). Genome annotation was performed by the NCBI's own Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP). The genome was deposited in GenBank under accession number CP045012.

[043] Análises filogenéticas foram realizadas utilizando os softwares Gegenees e SplitsTree4. Metabólitos secundários foram preditos utilizando os softwares antiSMASH 5.0 e RAST. Para verificar se havia algum fator de virulência, o genoma foi comparado por blastn com o banco de dados Virulence Factor Database (VFDB), disponível online. O software ResFinder 3.2, disponível online, foi utilizado para verificar a presença de genes de resistência no genoma. O genoma da linhagem Enterococcus faecium LAC 7.2 é composto por um cromossomo circular de 2625745 pb e dois plasmídeos de 206375 pb e 80816 pb.[043] Phylogenetic analyzes were performed using Gegenees and SplitsTree4 software. Secondary metabolites were predicted using antiSMASH 5.0 and RAST software. To check for any virulence factors, the genome was compared by blastn with the Virulence Factor Database (VFDB), available online. ResFinder 3.2 software, available online, was used to verify the presence of resistance genes in the genome. The genome of the Enterococcus faecium LAC 7.2 strain is composed of a circular chromosome of 2625745 bp and two plasmids of 206375 bp and 80816 bp.

[044] O conteúdo GC é de 37,96%, possui 18 rRNA operons, 68 genes de tRNA e 131 pseudogenes. Na análise filogenética é possível observar que a linhagem LAC 7.2 possui alta similaridade com outras E. faecium, porém não apresenta 100% de similaridade. Foram preditos 2 metabólitos secundários: enterocina A e um polissacarídeo.[044] The GC content is 37.96%, it has 18 rRNA operons, 68 tRNA genes and 131 pseudogenes. In the phylogenetic analysis, it is possible to observe that the LAC 7.2 lineage has high similarity with other E. faecium, but does not present 100% similarity. Two secondary metabolites were predicted: enterocin A and a polysaccharide.

[045] Na análise comparativa ao VFDB, foi possível identificar 9 classes/famílias de genes no genoma da LAC7.2 constantes na base de dados, sendo eles: cápsula/evasão ao sistema imune (9), adesão (8), proteínas de estresse (3), enzimas (2), formação de biofilme (1), pilus (1), regulação de expressão gênica (1), resistência a sais biliares (1) e 1 gene sem classificação do produto codificado. Como a conjugação é um dos mecanismos mais comuns de dispersão de genes de resistência aos antibacterianos, o software ResFinder foi utilizado para avaliação da presença de genes de resistência nos plasmídeos bacterianos. No plasmídeo I, foram identificados 3 genes de resistência a aminoglicosídeos (ant(6)-Ia, 100% ID; aph(2’’)-Id, 100% ID; e aph(3’)-III, 100% ID) e 3 genes de resistência a macrolídeos (erm(B), 100% ID; Inu(B), 100% ID; e Isa(E) 99,53% ID). No plasmídeo II não foram identificados genes de resistência a antimicrobianos.[045] In the comparative analysis to the VFDB, it was possible to identify 9 classes/families of genes in the genome of LAC7.2 constant in the database, namely: capsule/evasion to the immune system (9), adhesion (8), proteins of stress (3), enzymes (2), biofilm formation (1), pilus (1), gene expression regulation (1), bile salt resistance (1) and 1 unclassified encoded product gene. As conjugation is one of the most common mechanisms for spreading antibacterial resistance genes, the ResFinder software was used to assess the presence of resistance genes in bacterial plasmids. In plasmid I, 3 aminoglycoside resistance genes were identified (ant(6)-Ia, 100% ID; aph(2'')-Id, 100% ID; and aph(3')-III, 100% ID) and 3 macrolide resistance genes (erm(B), 100% ID; Inu(B), 100% ID; and Isa(E) 99.53% ID). In plasmid II, no antimicrobial resistance genes were identified.

3) Determination of biological safety

[046] Para verificar se a administração de Enterococcus faecium LAC7.2 era segura, um total de 20 juvenis de tilápias de aproximadamente 5 g foram distribuídos em quatro aquários e aclimatados por 10 dias. No final deste período, um inóculo contendo 8107 unidades formadoras de colônia por mL (UFC.mL-1) de Enterococcus faecium LAC7.2 foi preparado em salina tamponada com fosfato (PBS). Então, 100 µL do inóculo foi injetado via intraperitoneal (IP) nos peixes de dois dos aquários. Os peixes dos outros dois aquários foram injetados via IP apenas com PBS estéril, como controle.[046] To verify that the administration of Enterococcus faecium LAC7.2 was safe, a total of 20 juvenile tilapia of approximately 5 g were distributed in four aquariums and acclimated for 10 days. At the end of this period, an inoculum containing 8107 colony forming units per mL (CFU.mL-1) of Enterococcus faecium LAC7.2 was prepared in phosphate-buffered saline (PBS). Then, 100 µL of the inoculum was injected intraperitoneally (IP) into the fish in two of the aquariums. Fish from the other two aquariums were injected via IP with sterile PBS only, as a control.

[047] Os peixes foram observados por um período de 10 dias para observar seu comportamento e a manifestação de sinais clínicos. No final do período de observação, todos os peixes foram submetidos a eutanásia por benzocaína e os fígados foram coletados assepticamente e semeados em ágar MRS. Nenhum peixe, tanto dos injetados com Enterococcus faecium LAC7.2, quanto os controles, apresentou alterações de comportamento ou manifestações clínicas. Apesar de não ter sido observado mortalidade de nenhum peixe, de todos os 10 fígados de peixes inoculados com Enterococcus faecium LAC7.2 foi possível recuperar colônias puras da bactéria. Não houve crescimento bacteriano na cultura dos fígados dos controles.[047] The fish were observed for a period of 10 days to observe their behavior and the manifestation of clinical signs. At the end of the observation period, all fish were euthanized by benzocaine and the livers were aseptically collected and seeded on MRS agar. None of the fish, both injected with Enterococcus faecium LAC7.2 and the controls, showed behavioral changes or clinical manifestations. Although no fish mortality was observed, from all 10 fish livers inoculated with Enterococcus faecium LAC7.2 it was possible to recover pure colonies of the bacteria. There was no bacterial growth in the culture of the livers of the controls.

4) Methods of applying the LAC7.2 strain in feed and water (Fig. 2 of the DRAWING document)

[048] Aproximadamente 3 colônias da linhagem Enterococcus faecium LAC7.2 foram semeadas em 600 mL de caldo MRS e incubadas, sob rotação orbital contínua, por 48 horas a 28°C. A concentração média dos inóculos preparados foi de 2,3.109 UFC.mL-1.[048] Approximately 3 colonies of the Enterococcus faecium LAC7.2 strain were seeded in 600 mL of MRS broth and incubated under continuous orbital rotation for 48 hours at 28°C. The average concentration of the prepared inoculum was 2,3,109 CFU.mL-1.

[049] Para preparar 1 kg de ração, 100 mL do caldo contendo Enterococcus faecium LAC7.2 era aspergido gradativamente, em três frações. Para isso, a ração era distribuída em um recipiente plástico de modo que os pellets da ração formassem camada única. Então, uma fração de caldo contendo Enterococcus faecium LAC7.2 era aspergido sobre a camada de pellets de ração e cuidadosamente homogeneizada. Esse processo era realizado sequencialmente até que todo o volume de 100 mL fosse aspergido em todo o 1 kg de ração.[049] To prepare 1 kg of feed, 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2 was gradually sprinkled in three fractions. For this, the feed was distributed in a plastic container so that the feed pellets formed a single layer. Then, a fraction of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2 was sprinkled over the feed pellet layer and carefully homogenized. This process was carried out sequentially until the entire volume of 100 mL was sprinkled on the entire 1 kg of feed.

[050] Finalmente, 5 mL de veículo universal aglutinante (carboximetilcelulose) era aplicado sobre a ração já contendo Enterococcus faecium LAC7.2, e nova homogeneização era realizada. A ração preparada era estendida em camada fina para secagem por 12 horas a 28°C. A quantidade de Enterococcus faecium LAC7.2 por quilo de ração era pelo menos 2,3.1011 UFC. A ração pronta era mantida em refrigeração e utilizada por um período máximo de 10 dias.[050] Finally, 5 mL of universal binder vehicle (carboxymethylcellulose) was applied to the feed already containing Enterococcus faecium LAC7.2, and a new homogenization was performed. The prepared feed was spread out in a thin layer for drying for 12 hours at 28°C. The amount of Enterococcus faecium LAC7.2 per kg of feed was at least 2.3.1011 CFU. The ready-to-eat feed was kept refrigerated and used for a maximum period of 10 days.

[051] Para aplicação na água, o volume nos tanques foi reduzido para aproximadamente ¼ de seu volume total (25 L) e 100 mL do caldo contendo Enterococcus faecium LAC 7.2 foi adicionado diretamente na água e homogeneizado por agitação circular, totalizando 9,2.109 UFC por litro de água do tanque. Após 2 horas, o volume foi restabelecido.[051] For application in water, the volume in the tanks was reduced to approximately ¼ of its total volume (25 L) and 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC 7.2 was added directly to the water and homogenized by circular agitation, totaling 9,2,109 CFU per liter of tank water. After 2 hours, the volume was restored.

5) Evaluation and in vivo performance of the supply of the Enterococcus faecium LAC 7.2 strain for Nile tilapia

[052] Foram avaliados três métodos de fornecimento da linhagem Enterococcus faecium LAC 7.2: apenas na ração, diariamente (G1); apenas na água, a cada 10 dias (G2); e na ração diariamente associado à água a cada 10 dias (G3). Os três métodos foram realizados por um total de 38 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados em tilápias submetidas aos três métodos de fornecimento da linhagem Enterococcus faecium LAC7.2: peso final, ganho de peso, hematócrito, contagem de hemácias, contagem total indireta e diferencial de leucócitos e trombócitos, quantificação de hemoglobina, determinação do volume corpuscular médio e concentração média corpuscular de hemoglobina, lisozima sérica, atividade hemolítica da via alternativa do sistema complemento sérico e caracterização do microbioma fecal através de sequenciamento de próxima geração e análise metagenômica.[052] Three methods of supplying the Enterococcus faecium LAC 7.2 strain were evaluated: only in the feed, daily (G1); only in water, every 10 days (G2); and in the ration daily associated with water every 10 days (G3). The three methods were performed for a total of 38 days. The following parameters were evaluated in tilapia submitted to the three methods of supplying the Enterococcus faecium LAC7.2 strain: final weight, weight gain, hematocrit, erythrocyte count, total indirect and differential counts of leukocytes and thrombocytes, quantification of hemoglobin, determination of mean corpuscular volume and mean corpuscular concentration of hemoglobin, serum lysozyme, alternative pathway hemolytic activity of the serum complement system and characterization of the fecal microbiome through next generation sequencing and metagenomic analysis.

[053] Ainda, após receberem um dos métodos de fornecimento de Enterococcus faecium LAC 7.2, foi analisada a mortalidade das tilápias frente a infecção experimental com Francisella noatunensis subsp orientalis F1 (via banho de imersão) e Streptococcus agalactiae S13 (via intraperitoneal). Apesar de não haver diferença estatística, o fornecimento de Enterococcus faecium LAC 7.2 apenas na ração (G1) gerou peixes com maior peso final e ganho de peso médios. Além disso, a contagem de trombócitos foi significantemente maior no grupo G1. Os métodos de fornecimento de Enterococcus faecium LAC 7.2 na água (G2 e G3) foram capazes de promover uma maior diversidade de gêneros bacterianos na microbiota intestinal. Todos os métodos de fornecimento de Enterococcus faecium LAC 7.2 foram significantemente capazes de reduzir a mortalidade frente a estreptococose.[053] Also, after receiving one of the methods of supplying Enterococcus faecium LAC 7.2, the mortality of tilapia was analyzed against experimental infection with Francisella noatunensis subsp orientalis F1 (via immersion bath) and Streptococcus agalactiae S13 (intraperitoneal route). Although there was no statistical difference, the supply of Enterococcus faecium LAC 7.2 only in the diet (G1) generated fish with higher final weight and average weight gain. Furthermore, the thrombocyte count was significantly higher in the G1 group. The methods of supplying Enterococcus faecium LAC 7.2 in water (G2 and G3) were able to promote a greater diversity of bacterial genera in the intestinal microbiota. All methods of delivery of Enterococcus faecium LAC 7.2 were able to significantly reduce mortality from streptococcosis.

[054] Com relação à mortalidade por franciselose, não houve diferença estatística entre os métodos de fornecimento, porém o método de fornecimento associando ração e água (G3) foi mais eficaz em reduzir a mortalidade por essa doença.[054] Regarding mortality from francisellosis, there was no statistical difference between the methods of supply, however the method of supply combining feed and water (G3) was more effective in reducing mortality from this disease.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[055] FIGURA 1 - Esquema representativo do processo de seleção in vitro e caracterização genômica da linhagem probiótica Enterococcus faecium LAC7.2 a partir de intestino e fezes de tilápias sadias;[055] FIGURE 1 - Representative scheme of the in vitro selection process and genomic characterization of the probiotic strain Enterococcus faecium LAC7.2 from the intestine and feces of healthy tilapia;

[056] Onde:[056] Where:

[057] A: Coleta de intestinos e fezes de tilápias sadias[057] A: Collection of intestines and feces of healthy tilapia

[058] B: Semeadura em caldo MRS do material coletado por 48 horas a 28° C[058] B: Sowing in MRS broth of the material collected for 48 hours at 28° C

[059] C: Diluição seriada do caldo enriquecido[059] C: Serial dilution of enriched broth

[060] D: Plaqueamento das diluições em ágar MRS e seleção de colônias[060] D: Plating the dilutions on MRS agar and colony selection

[061] E: Seleção da colônia com melhor capacidade de inibição in vitro de patógenos. Corte transversal de placa de teste de inibição de sobrecamada (spot-on-the-lawn). A barra vermelha indica colônia que inibiu a bactéria patogênica na sobrecamada. O asterisco vermelho indica colônia que não inibiu a bactéria patogênica na sobrecamada.[061] E: Selection of the colony with the best ability to inhibit pathogens in vitro. Cross-section of spot-on-the-lawn test plate. The red bar indicates colony that inhibited the pathogenic bacteria in the overlay. The red asterisk indicates a colony that did not inhibit the pathogenic bacteria in the overlay.

[062] F: Extração do material genético da colônia selecionada e sequenciamento do genoma completo[062] F: Extraction of genetic material from the selected colony and sequencing of the complete genome

[063] G: Análises de bioinformática para predição de genes codificantes de fatores de virulência, metabólitos secundários e resistência a antimicrobianos.[063] G: Bioinformatics analysis to predict genes encoding virulence factors, secondary metabolites and antimicrobial resistance.

[064] FIGURA 2 - Esquema representativo dos métodos de aplicação da linhagem probiótica Enterococcus faecium LAC7.2 na ração e na água de tilápias[064] FIGURE 2 - Representative scheme of methods of application of the probiotic strain Enterococcus faecium LAC7.2 in the feed and water of tilapia

[065] Onde:[065] Where:

[066] A: Enterococcus faecium LAC7.2 em 600 mL de caldo MRS a 28°C por 48 horas[066] A: Enterococcus faecium LAC7.2 in 600 mL of MRS broth at 28°C for 48 hours

[067] B: Diluição seriada do caldo contendo Enterococcus faecium LAC7.2[067] B: Serial dilution of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2

[068] C: Plaqueamento das diluições para contagem de unidades formadoras de colônias por mL do caldo[068] C: Plating of dilutions to count colony forming units per mL of broth

[069] D: 100 mL de caldo contendo Enterococcus faecium LAC 7.2 em um borrifador[069] D: 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC 7.2 in a spray bottle

[070] E: 1 kg de ração distribuído em recipiente plástico em uma fina camada. Aspersão fracionada dos 100 mL de caldo contendo Enterococcus faecium LAC7.2 em três etapas/frações, com homogeneização entre elas[070] E: 1 kg of feed distributed in a plastic container in a thin layer. Fractional spraying of 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2 in three steps/fractions, with homogenization between them

[071] F: Adição de 5 mL de veículo universal aglutinante (carboximetilcelulose) seguida de homogeneização[071] F: Addition of 5 mL of universal binder vehicle (carboxymethyl cellulose) followed by homogenization

[072] G: Secagem da ração em fina camada a 28°C, por 12 horas[072] G: Drying of the feed in a thin layer at 28°C, for 12 hours

[073] H: Armazenamento sob refrigeração por até 10 dias[073] H: Refrigerated storage for up to 10 days

[074] I: 100 mL de caldo contendo Enterococcus faecium LAC7.2[074] I: 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2

[075] J: Aplicação do caldo no tanque com ¼ do volume de água (25L) e homogeneização por agitação circular[075] J: Application of the broth in the tank with ¼ of the volume of water (25L) and homogenization by circular agitation

[076] K: Restabelecimento do volume de água no tanque após 2 horas.[076] K: Restoration of the volume of water in the tank after 2 hours.

Claims

PROCESS OF IDENTIFICATION AND VALIDATION OF AUTOCTONE PROBIOTICS FROM THE SPECIES ENTEROCOCCUS FAECIUM AND USE AS ALTERNATIVE TREATMENT FOR THE PREVENTION/CONTROL OF TILAPIA BACTERIOSIS, characterized by using feces and intestines of healthy tilapia sown in Man, Rogosa and Sharpe broth (MRS) and incubated at 28 °C for 48 hours; Serial dilution of the broth in 0.85% saline and seeding on MRS agar and incubation for 48 hours at 28 °C; Isolate the colonies obtained and submit them to a spot-in-the-lawn test to assess their ability to inhibit the growth of pathogenic bacteria, the colonies are seeded on plates containing MRS agar at points at a distance of 2 cm from the edge of the plate and incubated for 48 hours at 28 °C; Bacterial inocula of pathogenic strains of Escherichia coli, Staphylococcus spp and Streptococcus spp were inoculated separately on semi-solid Mueller-Hinton (MH) agar at 45°C; An overlay of MH agar containing the pathogenic bacteria was spread over the MRS agar plates containing the bacteria isolated from feces; The plates were then incubated at 28 °C for 24 hours, after incubation, the presence of inhibition halos was verified which were measured in millimeters and the colony with the highest inhibition halos was selected for the following tests (LAC7.2); The inhibition halos obtained were: 16 mm, 15 mm and 10 mm, respectively; The metabolites of the LAC7.2 strain were submitted to an inhibition test of the F1 strain of Francisella orientalis and the S13 strain of Steptococcus agalactiae; A colony of strain 7.2 was inoculated into MRS broth and incubated at 28°C for 48 hours; An aliquot of the broth was centrifuged and the supernatant was micromembrane filtered (0.22 µm) to ensure the absence of cells; The filtered supernatant and the total broth were added to different wells of cystine heart agar plates supplemented with 5% bovine hemoglobin previously inoculated with F1 strain and on Mueller-Hinton agar plates supplemented with 5% defibrinated sheep blood previously inoculated with strain S13; The plates were incubated at 28 °C for 48 hours and the diameter of the inhibition zones was measured in millimeters; The inhibition halo of the F1 strain obtained by the supernatant was 18 mm; The inhibition halo of the S13 strain by the total broth of Enterococcus faecium LAC 7.2 was 10 mm, the supernatant did not inhibit the S13 strain

PROCESS OF IDENTIFICATION AND VALIDATION OF AUTOCTONE PROBIOTIC FROM THE SPECIES ENTEROCOCCUS FAECIUM AND USE AS ALTERNATIVE TREATMENT FOR PREVENTION/CONTROL OF TILAPIA BACTERIOSIS, characterized by sowing 3 colonies of the Enterococcus faecium LAC7.2 strain in 600 mL of MRS broth and incubated under orbital rotation continuous, for 48 hours at 28°C, the average concentration of the prepared inoculum was 2,3,109 CFU.mL-1; To prepare 1 kg of feed, 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2 was gradually sprinkled in three fractions; The feed was distributed in a plastic container so that the feed pellets formed a single layer; A fraction of broth containing Enterococcus faecium LAC7.2 was sprinkled on the feed pellet layer and homogenized; This process was carried out sequentially until the entire volume of 100 mL was sprinkled on the entire 1 kg of feed; Then, 5 mL of universal binder vehicle (carboxymethylcellulose) was applied to the feed already containing Enterococcus faecium LAC7.2, and a new homogenization was performed; The prepared feed was spread out in a thin layer for drying for 12 hours at 28°C; The amount of Enterococcus faecium LAC7.2 per kilogram of feed was at least 2,3,1011 CFU; The ready-to-eat feed was kept refrigerated and used for a maximum period of 10 days; For application in water, the volume in the tanks was reduced to approximately ¼ of its total volume (25 L) and 100 mL of broth containing Enterococcus faecium LAC 7.2 was added directly to the water and homogenized by circular agitation, totaling 9,2,109 CFU per liter. of water from the tank, after 2 hours, the volume was restored

PROCESS OF IDENTIFICATION AND VALIDATION OF AUTOCTONE PROBIOTICS FROM THE ENTEROCOCCUS FAECIUM SPECIES AND USE AS ALTERNATIVE TREATMENT FOR THE PREVENTION/CONTROL OF TILAPIA BACTERIOSIS, characterized by the application of three ways of supplying the Enterococcus faecium LAC 7.2 strain: only in the feed, daily (G1); only in water, every 10 days (G2); and in the ration daily associated with water every 10 days (G3)