BR102018004785A2

BR102018004785A2 - ?processo de peguilação n-terminal da l-asparaginase de e. coli, produto e uso?

Info

Publication number: BR102018004785A2
Application number: BR102018004785-0A
Authority: BR
Inventors: Giovanna Pastore Meneguetti; Carlota De Oliveira Rangel Yagui; Adalberto Pessoa; Adriano Marim De Oliveira
Original assignee: IPT Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Est.S.Paulo S/A
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2019-10-01

Abstract

?processo de peguilação n-terminal da l-asparaginase de e. coli, produto e uso? revela um produto constituído pela enzima l-asparaginase conjugada sítio especificamente na região n-terminal de cada monômero da enzima, através do protocolo de direcionamento do grupo reativo do polietilenoglicol à amina n-terminal, com aplicações da formulação no tratamento da leucemia linfóide aguda. ao qual a l-asparaginase, asnase, é capaz de depletar a l-asparagina circulante da corrente sanguínea ocasionando a morte de células tumorais. a conjugação com o mpeg promove o aumento de meia-vida plasmática, diminuição de efeitos imunogênicos, blindagem a proteases e diminuição da agregação proteica. o direcionamento da reação para a porção n-terminal mantém as propriedades do polietilenoglicol e também promove controle lote-a-lote nas preparações farmacêuticas. em particular, o conjugado da invenção mostrou propriedades superiores à l-asparaginase polipeguilada tais como termoestabilidade e manutenção de elevado nível de atividade in vitro. são também divulgados os métodos de peguilação sítio específico n-terminal e utilização do conjugado em células tumorais in vitro, em particular a doença cancer do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (lla), linfoma não hodgkin, linfoma nk e câncer pancreático.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO [001] A presente invenção, pertencente ao setor de preparações medicinais para aplicação na área da saúde, medicamentos e no tratamento de doenças, caracterizada pela conjugação de um polietilenoglicol (mPEG) a uma enzima (L-asparaginase) para utilização do conjugado principalmente no tratamento de câncer, particularmente leucemia linfoblástica aguda (LLA).

[002] A L-asparaginase, ASNase, possui atividade amino-hidrolase sendo capaz de depletar a L-asparagina circulante da corrente sanguínea ocasionando a morte de células tumorais. A conjugação com o mPEG promove o aumento de meia-vida plasmática, diminuição de efeitos imunogênicos, blindagem a proteases e diminuição da agregação proteica, sendo que o direcionamento da reação para a porção N-terminal mantém as propriedades do polietilenoglicol e também promove controle lote-a-lote nas preparações farmacêuticas.

ESTADO DA TÉCNICA [003] Uma das mais promissoras frentes de inovação tecnológica com grande potencial de impulsionar a produção industrial brasileira é o desenvolvimento de biobetters, ou seja, fármacos biológicos melhorados. Nesse sentido, uma das abordagens nanobiotecnológicas mais eficazes para resolver os problemas intrínsecos de várias proteínas terapêuticas como imunogenicidade e meia-vida curta refere-se à ligação covalente de cadeias de polietilenoglicol (PEG) na superfície da proteína, técnica conhecida como peguilação.

[004] A enzima L-asparaginase (ASNase) foi uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, resultando no fármaco pegaspargase (Oncaspar®), aprovado pelo FDA em 1994 para uso combinado no tratamento

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 10/36 / 15 quimioterápico de pacientes portadores de leucemia com hipersensibilidade à forma nativa da enzima, como mostrado no documento US4179337.

[005] O conceito de peguilação é definido pela modificação de proteínas, peptídeos, fosfolipídeos, fármacos e outras moléculas pela ligação covalente de uma ou mais cadeias de polietilenoglicol. Este polímero, altamente solúvel em água, não imunogênico e não antigênico é permitido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

[006] Os conjugados de PEG-proteína têm diversas vantagens e dentre elas podemos destacar o aumento de solubilidade, meia-vida prolongada no organismo, a diminuição da degradação por enzimas metabólicas e a redução da imunogenicidade da proteína. Esse fenômeno tornou-se uma tecnologia bem estabelecida no campo da formulação biofarmacêutica empregada para melhorar a estabilidade, a solubilidade, a biodisponibilidade e as propriedades imunológicas de compostos bioativos, aumentando o potencial de peptídeos e proteínas como agentes terapêuticos.

[007] O método utilizado na peguilação da Oncaspar® consiste na conjugação do mPEG-NHS (polietilenoglicol sucinimidil éster) de 5 kDa nas aminas livres da ASNase de E. coli. As proteínas contêm tipicamente diversas lisinas e, consequentemente, ocorre a peguilação aleatória de resíduos de lisina da enzima com várias cadeias de PEG, por isto este processo é considerado como peguilação aleatória. O documento CN102573917A, faz uso do mesmo PEG utilizado na terapêutica (mPEG-NHS) e também produz peguilação aleatória, porém em ASNase de outro microrganismo, a bactéria Erwinia chrysanthemi.

[008] Já o documento RU2441914C1 refere-se à ASNase recombinante de outro microrganismo, Erwinia carotovora, com peguilação aleatória utilizando outro PEG, o mPEG-suc-NHS (N-hidroxisucinimidil éster de monometoxi-hemisucinato). Uma importante limitação desta abordagem é que, somado ao alto grau de polidispersão, a enzima apresenta diminuição significativa de atividade nas preparações resultantes em relação à enzima

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 11/36 / 15 nativa, como mostrado no documento CN105802948A. Desta forma, as diferentes espécies peguiladas muitas vezes possuem diferentes perfis farmacocinéticos e atividades biológicas intrínsecas (SOARES, A. L. et al. Effects of polyethylene glycol attachment on physicochemical and biological stability of E. coli L-asparaginase. Int. J. Pharm., v.237, p.163-170, 2002).

[009] A estratégia de peguilação N-terminal apresenta-se como alternativa mais específica para solucionar a polidispersão e falta de controle lote a lote, além de manter os benefícios da peguilação. Esta estratégia consiste na conjugação de uma molécula de PEG à terminação amínica do resíduo de aminoácido da região N-terminal. No documento CN105802948A, a conjugação N-terminal da ASNase de E. coli é descrita com PEG propionaldeido ramificado (Y-PALD) de 40 kDa ou 30 kDa em uma ou duas subunidades da enzima tetramétrica. Todavia o PEG utilizado é diferente do qual já vem sendo utilizado na terapia para esta enzima, pois é um PEG ramificado e de massa molar até 4x maior à da presente invenção, dificultando a filtração glomerular do fármaco.

[0010] A presente invenção refere-se a um novo processo de peguilação N-terminal com o PEG usualmente já utilizado na terapêutica, porém com direcionamento para o resíduo N-terminal da ASNase. A reação de direcionamento do PEG ocorre sob condições de conjugação específicas e varia de proteína para proteína. Por exemplo o processo pode ser realizado por duas etapas de conjugação do PEG, como mostrado no documento CN 104926920A por adição de molécula orgânica para melhorar a eficiência de conjugação ao aminoácido N-terminal que apresenta impedimento estérico, descrito no documento CN102952067, ou também por diferença entre o pKa do α-amino da região N-terminal e o ε-amino das lisinas. Os resíduos de aminas primárias em proteínas têm diferentes valores de pKa: 7,6 a 8,0 para grupo αamino N-terminal e 9,3 a 10,5 para o grupo ε-amino em resíduos de lisina (YU, D. & GHOSH, R. Purification of PEGylated protein using membrane chromatography. J. Pharm. Sci., v.99, n.8, p.3326-33, 2010), portanto para o

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 12/36 / 15 direcionamento da reação de monopeguilação da ASNase, nos valores de pH entre 7 e 9, os resíduos amínicos de lisinas da ASNase encontram-se predominantemente protonados e, consequentemente, não reativos ao PEG.

[0011] Assim, considerando os avanços recentes em peguilação de proteínas e as exigências atuais para licenciamento de produtos farmacêuticos, é importante alternativas de peguilação da ASNase visando melhoria na terapêutica com preparações mais uniformes e menos polidispersas. A reação de peguilação sítio específica M-terminal mantém a estabilidade enzimática, apresenta proteção à clivagem pelas proteases séricas sem ser citotóxica às células saudáveis e, diferentemente da peguilação aleatória, proporciona controle lote a lote, mantendo constante o grau de peguilação, sendo a ASNase monopeguilada, monoPEG-ASNase, o efeito técnico novo deste processo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0012] Figura 1 - Desenho, sem escala, representativo do tetrâmero da L-asparaginase de E. coli (PDB código 3ECA), com região M-terminal destacada.

[0013] Figura 2 - (A) Fotografia, sem escala, de gel de eletroforese (poliacrilamida 10%) e (B) gráfico de porcentagem de peguilação baseada na intensidade de banda com L-asparaginase conjugada (PEG 2 kDa) em (a) diferentes molaridades do tampão PBS pH 7,6 (10, 100 e 200 mM) e diferentes razões PEG:ASNase (25:1 e 50:1), (b) diferentes pHs (6, 6,5, 7, 7,5 e 8), (c) diferentes tempos de reação (0 a 90 min, com alíquota a cada 15 min). Barras de erro representam o desvio-padrão.

[0014] Figura 3 - Cromatograma da purificação da L-asparaginase peguilada por coluna de troca aniônica, por gradiente linear de sal (NaCl) e gel de eletroforese nativo (poliacrilamida 6%).

[0015] Figura 4 - Cromatograma de purificação por exclusão molecular das frações eluídas em NaCl 78 mM obtidas na troca aniônica. Amostra

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 13/36 / 15 exemplo está destacada (70% da área) e amostra controle representada ao lado.

[0016] Figura 5 - Gráfico do estudo da estabilidade enzimática da amostra inventiva e da amostra controle frente ao tempo de armazenamento a 4 °C por 21 dias. As barras de erro representam o desvio padrão.

[0017] Figura 6 - Gráfico da cinética enzimática da amostra controle e da amostra inventada, em um intervalo de 0,005 a 1,476 mM do substrato Lasparagina. Análises estatísticas (teste F) e barras de erro representam o desvio-padrão.

[0018] Figura 7 - Fotografia, sem escala, de gel de eletroforese nativo (poliacrilamida 10%) do estudo da degradação proteolítica de duas proteases (asparagina endopeptidase, AEP e catepsina B, CTSB), nas amostras controle e exemplo por 84 h à 37 °C.

[0019] Figura 8 - Gráfico do estudo in vitro de citotoxicidade em células de cordão umbilical saudável e leucêmicas (provindas de linfócitos T e linfócitos B) com diferentes concentrações de atividade enzimática (0,01; 0,05; 0,1; 0,3 e 0,6 UI.mL^-1). Probabilidade de significância menor do que 0,05 (*), menor do que 0,01 (**) e menor do que 0,001 (***) em relação ao controle. Barras de erro representam desvio-padrão.

DETALHAMENTO DA INVENÇÃO [0020] “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA L-ASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO” constitui um sistema composto por polietilenoglicol conjugado à região N-terminal de enzima, como o aminoácido leucina presente na região N-terminal da L-asparaginase de E. coli.

[0021] A estratégia de peguilação N-terminal apresenta-se como alternativa mais específica e envolve a conjugação de uma molécula de PEG à terminação amínica, baseando-se nas diferenças entre os pKas dos diferentes grupamentos amínicos da proteína, sendo menor o pKa do grupo α-amino (região N-terminal com pKa de 7,6 a 8,0) do que os grupos ε-amino (pKa 10,5 a

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12,0). Portanto, para valores de pH entre 7,0 a 8,0, os resíduos amínicos de lisinas da ASNase encontram-se predominantemente protonados e, consequentemente, não reativos ao PEG. O grupo α-amino livre (N-terminal), por sua vez, apresenta-se predominantemente em sua forma não protonada estericamente disponível para conjugação com o PEG, como mostrado na Figura 1, de maneira a resultar na proteína monopeguilada, o que constitui a novidade e ativadade inventiva do método.

[0022] Inicialmente é realizada a reação química de conjugação do metoxipolietilenoglicol sucinimidil éster (mPEG-NHS) de 2 a 60 kDa, preferenciamente 10 kDa, à região N-terminal da L-asparaginase (ASNase). São solubilizados o PEG e a ASNase, na proporção molar de 1:1 a 100:1, em tampão fosfato salino (PBS) com força iônica de 80 a 150 mM, preferencialmente 10:1 e PBS 100mM em pH de 6,5 a 8,5, preferencialmente em pH 7,5, sob agitação magnética, de 400 a 900 rpm, preferencialmente 800 rpm, por 15 a 90 minutos, preferencialmente 30 minutos, seguida da adição de 5 a 20% (v/v), preferencialmente 10% (v/v) de hidroxilamina 2M ao meio reacional por mais 30 a 90 minutos, preferencialmente 60 minutos, de modo a clivar qualquer sítio instável de peguilação que tenha sido formado na proteína.

[0023] Para eliminar resíduos de reação da proteína presente no meio reacional (conjugada ao PEG e sem reagir, portanto livre) a fração clivada (NHS) e o PEG não conjugado são separados por ultrafiltração em membrana, preferencialmente usando frasco filtrante Amicon^®-Ultra, com corte superior a 20 kDa e inferior a 100 kDa, preferenciamente 50 kDa, em temperatura de 1 à 10 °C, preferencialmente à 4 °C, em rotação de 1500 à 3500 rpm, preferencialmente em 3000 rpm. Além disso, a ultrafiltração é utilizada para trocas de tampão entre as etapas de purificação cromatográfica (cromatografia de troca aniônica forte e cromatografia de exclusão molecular).

[0024] Duas etapas de purificação são empregadas para a obtenção da enzima de interesse (monoPEG-ASNase). A coluna cromatográfica de troca aniônica forte é equilibrada com tampão Bis-Tris-HCl de força iônica de 10 a

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 15/36 / 15 mM, preferencialmente 20 mM, e pH de 6,5 à 8,0, preferencialmente 7,0, e a proteína eluída com o mesmo tampão, porém com adição de NaCl de 300 mM a 2 M, preferencialmente 1 M.

[0025] A enzima é purificada em gradiente linear, 10 a 20 volumes de coluna, preferencialmente 12 volumes de coluna, de 150 até 500 mM de NaCl em fluxo de 0,5 a 3,0 mL^min^-1, preferencialmente eluição até 170 mM de NaCl em fluxo de 2,0 mL^min^-1. Nesta etapa, o último pico do gradiente linear, correspondente à enzima livre, pode ser utilizado para nova conjugação depois de realizada a troca do tampão reacional. O grau de pureza da enzima monopeguilada pode ser maior com a cromatografia de exclusão molecular. A purificação é realizada com as frações da etapa anterior correspondentes à monoPEG-ASNase (eluição do gradiente linear entre 70 e 80 mM NaCl, que equivale ao penúltimo pico). A purificação é realizada de maneira isocrática, com tampão Tris-HCl força iônica de 20 à 100 mM, preferencialmente 50 mM, pH de 6,0 à 9,0, preferencialmente pH 8,6, e fluxo de 0,2 à 1,0 mL^min^-1, preferencialmente 1,0 mL^min^-1. A ASNase monopeguilada representa 70% da área total, portando são descartadas as frações correspondentes ao início e ao final do pico, aproximadamente 15% em cada extremidade.

[0026] As frações coletadas podem ser avaliadas através de gel nativo de eletroforese que para alinhamento das amostras (empacotamento) pode ser de 3 à 6% (m/v) de poliacrilamida, preferencialmente 5%, e o gel de corrida (separação das amostras) variando de 6 à 12% (m/v), preferencialmente 10%, para gel desnaturado e 6% para gel nativo, e voltagem de 80 a 220 mV, preferencialmente 100 mV. A revelação da proteína pode ser feita em corante de Coomassie Brilliant Blue (CBB) ou prata, já conhecidas no estado da técnica.

[0027] O produto obtido, um conjugado, tem as seguintes características:

a) tem fórmula expressada por ASNase- [NH-CO- (CH₂) x-CO-NH-PEG] n, onde ASNase é a L-asparaginase, NH é um ou mais dos grupos NH dos resíduo N-terminal na ASNase, PEG monoPEG-ASNase é uma porção de

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 16/36 / 15 polietilenoglicol, especificamente monometoxi-polietilenoglicol, n é um número que representa de 25% a 100% dos grupos amino acessíveis na ASNase, e x um número inteiro que varia de 1 a 96; b) o PEG está ligado covalentemente a pelo menos 1, especificamente de 25% a 100% amino N-terminal da Lasparaginase e ou de 25% a 100%, dos grupos amino N-terminal, ou estar ligado covalentemente a um ou mais grupos amino N-terminal por ligação amida; c) a enzima utilizada em sua preparação é monoPEG-ASNase apresentando pelo menos 40% de identidade à SEQ ID NO: 1, como mostrado na Tabela 2; d) o conjugado tem uma atividade in vitro de pelo menos 60% em comparação com a L-asparaginase quando não conjugada com o PEG; e e) o conjugado proporciona a morte de pelo menos 50% das células cancerígenas em pelo menos 96 horas, sendo cancer do grupo que consiste em Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), linfoma não Hodgkin, linfoma NK e câncer pancreático.

[0028] Tabela 2 - Identidade da SEQ ID NO: 1

SEQUÊNCIA ID NO.1:

>3ECA:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE LPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVV NIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKT DGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNA VVTAADKASANRGVLVVM NDTVLDGRDV TKTNTTDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPK VGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDGIV SAGVGNGNLYKSVFDTLATAAKTGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFV ASGTLNPQKARVLLQLALTQTKDPQQIQ

QIFNQY >3ECA:B|PDBID|CHAIN|SEQUENCE LPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVV NIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKT

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DGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNA VVTAADKASANRGVLVVM NDTVLDGRDV

TKTNTTDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPK VGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDGIV

SAGVGNGNLYKSVFDTLATAAKTGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFV ASGTLNPQKARVLLQLALTQTKDPQQIQ

QIFNQY >3ECA:C|PDBID|CHAIN|SEQUENCE LPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVV NIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKT

DGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNA VVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDV

QIFNQY >3ECA:D|PDBID|CHAIN|SEQUENCE LPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVV NIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKT

QIFNQY

EXEMPLO DE CONCRETIZAÇÃO DA INVENÇÃO [0029] Primeiramente foram realizados diversos estudos para conquistar o melhor rendimento de produção da fração inventiva monoPEG-ASNase. Para

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 18/36 / 15 isso, foram realizados estudos de variação da força iônica do tampão (10, 100 e 200 mM tampão fostato salino pH 7,6) e razão PEG:proteina (25 e 50:1), depois de escolhido o tampão PBS 100 mM pH 7,6 com 25 vezes mais PEG que enzima, foi realizado o estudo do efeito do direcionamento do PEG à região N-terminal em diferentes pHs (6,0 a 8,0), e, após determinado o pH, o próximo estudo visou obter o melhor tempo para produção da enzima monopeguilada com menos polipeguilação. Como mostrado na Figura 2, a otimização do protocolo de peguilação N-terminal da ASNase para obtenção da maior fração, 41% m/m, de monoPEG-ASNase e menos contaminantes reacionais foi em 30 minutos de reação com tampão PBS 100 mM pH 7,5 (25:1).

[0030] O EXEMPLO foi realizado com o seguinte procedimento: foram adicionados 1,88 mg do PEG em balão de fundo redondo e posteriormente adicionados 1,0 mL de tampão fosfato salino pH 7,5 (100 mM), contendo 1,0 mg de ASNase pura (concentração final: 1 mg^mL’¹). A reação ocorreu sob agitação magnética por 30 minutos à 800 rpm. Após decorrido esse tempo, foi adicionado 100 pL de hidroxilamina 2 M ao meio reacional de modo a clivar qualquer sítio instável de peguilação que tenha sido formado, em agitação de 800 rpm por uma hora. Os resíduos da reação (PEG livre e grupo reativo clivado) foram purificados por ultrafiltração em membrana usando frasco filtrante Amicon^(R)-Ultra com corte de 50 kDa à 4 °C, 3000 rpm. A troca de tampão também foi realizada desta forma. As proteínas peguiladas e livres foram visualizadas em gel de eletroforese, onde as proteínas foram coradas com CBB ou prata. O gel utilizado para alinhamento das amostras (empacotamento) foi de 5% (m/v) de poliacrilamida e o gel de corrida (separação das amostras) variou de 12% a 10% (m/v), com corrente elétrica de 100 mV.

[0031] De modo a obter a fração inventiva, o meio reacional foi purificado por duas diferentes colunas de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) a primeira coluna foi de troca aniônica forte e a outra coluna foi de exclusão por

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 19/36 / 15 tamanho. Inicialmente a coluna cromatográfica de troca aniônica forte foi ativada com 5 volumes de coluna (VC) do tampão B (Bis-Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, adicionados de NaCl 1 M) em fluxo de 0,5 mL^min’¹. Posteriormente, foi equilibrada com tampão A (Bis-Tris-HCl 20 mM, pH 7,0) e então iniciou-se o processo de purificação. Foram injetados 1,0 mL do meio reacional, a proteína foi eluída em gradiente linear de 12 VC do tampão B até 170 mM de NaCl em fluxo de 2 mL^min’¹. O perfil de eluição da proteína foi monitorado por absorbância de ultravioleta a 280 nm, com coleta de frações de 1,5 mL. A fração contendo a enzima monopeguilada foi identificada em gel de eletroforese nativo, como mostrado na Figura 3. Posteriormente, para a segunda purificação, foi trocado o tampão da fração inventiva coletada para Tris-HCl 50 mM, pH 8,6. Foram injetados 500 pL da amostra, previamente filtrada em membrana de 22 pm e centrifugada por 5 minutos à 300 rpm, na coluna de exclusão molecular já equilibrada em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,6 (5 VC) com fluxo de 1 mL^min’¹. A purificação ocorreu de maneira isocrática, com fluxo de 1 mL^min’¹, monitoramento de absorbância a 280 nm e com coleta de frações de 0,5 mL. O produto inventivo foi identificado na região central do pico de eluição, isto é, sendo descartadas as frações correspondentes ao início e ao final do pico, aproximadamente 15% em cada extremidade.

[0032] A fração inventiva com 99% de pureza, representada em hachurado na Figura 4, foi coletada e avaliada através de gel nativo e também utilizada nos ensaios de caracterização enzimática, clivagem proteolítica e citotoxicidade.

[0033] A caracterização por cromatografia de exclusão por tamanho, mostrada na Figura 4, indicou enzima monopeguilada pura com massa molecular de aproximadamente 187 kDa ± 10, diferença de aproximadamente 41 kDa da enzima controle (146 kDa ± 6) devido às cadeias de PEG 10 kDa conjugadas em cada N-terminal da ASNase.

[0034] O estudo da estabilidade da enzima frente ao tempo identificou que a fração inventiva se comportou de forma estável por 21 dias à

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 20/36 / 15 temperatura de 4,0 °C, enquanto que as frações sem modificação obtiveram perda significativa na primeira semana, como mostrado na Figura 5. A atividade específica da enzima foi identificada pelo método de Nessler, em que consiste na liberação de amônia pela ação da enzima sobre a L-asparagina, com leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 436 nm.

[0035] A determinação dos parâmetros cinéticos da ASNase controle e monoPEG-ASNase, correspondente a fração inventada, permitiu elucidar o mecanismo catalítico, ou seja, seu papel no metabolismo. O controle do ensaio foi realizado com a ASNase sem peguilar, apenas dissolvida em tampão TrisHCL 20 mM pH 8,6. A cinética foi realizada pelo ensaio acoplado de oxidação de β-NADH com 1,8 U de ASNase (controle) e 1,6 U de monoPEG-ASNase e a concentração de L-asparagina variou de 5 a 1470 μΜ. As curvas de velocidade em função da concentração de substrato estão apresentadas na Figura 6.

[0036] Da mesma forma como descrito na literatura, tanto a ASNase controle quanto a inventiva apresentaram comportamento michaeliano com R² > 0,9164 e com k_M na mesma ordem de grandeza, em μΜ. A enzima pura apresentou k_M = 20 μM e a enzima monopeguilada apresentou menor afinidade à L-asparagina, k_M = 35 μM, como mostrado na Tabela 1, sendo que dados da literatura relatam valores de kM variando de 12 a 40 μΜ para a pegaspargase comercial (AVRAMIS V. I. et al. A randomized comparison of native Escherichia coli asparaginase and polyethyleneglycol conjugated asparaginase for treatment of children with newly diagnosed standard-risk acute lymphoblastic leukemia: a Children’s Cancer Group study. American Soc. of Hem., v.99, p.1986-1994, 2002; DOUER, D. et al. Pharmacodynamics and safety of intravenous pegaspargase during remission induction in adults aged 55 years or younger with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia. Blood Journal. v.109, p.2744-2750, 2007).

[0037] Tabela 1 - Determinação de parâmetros cinéticos da ASNase controle e monoPEG-ASNase

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Enzima	kM (μΜ)	^kCAT (^{S 1})	kCAT/kM (M^-1.s^-1)
1 ASNase	1 1 19,58 ± 0,003	22 ± 0,7	1 1 1,1.10⁶
monoPEG-ASNase	34,67 ± 0,005	35 ± 1,0	1,0.10⁶

[0038] A avaliação da resistência à clivagem proteolítica pela asparagina endopeptidase (AEP) e pela catepsina B (CTSB) foi com 4 pg de Lasparaginase e 2 pg de CTSB ou 1,8 pg de AEP (ambas humanas, recombinantes, produzidas em células HEK), em 20 pL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, à 37 °C em agitação de 80 rpm por 84 horas.

[0039] A atividade em gel de eletroforese nativo (Zimograma) permitiu detectar atividade da enzima de interesse, monoPEG-ASNase, pela adição do substrato L-asparagina na malha do gel após realizada a corrida e incubado por 30 minutos em 37 °C, sendo a atividade enzimática revelada com solução de hidroxilamina e cloreto férico. Mesmo após tratamento com duas proteases sanguíneas humanas que estão relacionadas com à diminuição da meia-vida plasmática da L-asparaginase, a fração inventada manteve atividade, como mostrado na Figura 7, enquanto que a ASNase controle demonstrou ser mais sensível ao tratamento.

[0040] O ensaio de citotoxicidade foi realizado a partir da viabilidade mitocondrial, consequentemente a viabilidade celular, e foi quantificado pela redução do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) pela enzima succinato desidrogenase presente na membrana mitocondrial, resultando na formação de cristais de formazan, cuja produção é proporcional ao número de células metabolicamente ativas. O ensaio foi realizado com linhagens celulares de leucemia linfoblástica aguda de células T (MOLT-4) descrita como uma linhagem sensível a ASNase e de células B (Reh) considerada resistente ao tratamento com ASNase, pois possui níveis consideráveis de expressão de asparagina sintetase (ASNS). Como controle,

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 22/36 / 15 foi utilizada a linhagem de células endoteliais saudáveis que cobrem a parede dos vasos sanguíneos (HUVEC).

[0041] As linhagens celulares foram mantidas em RPMI 1640 com 10% (v/v) de soro fetal bovino, L-glutamina e piruvato de sódio, incubadas à 37 °C com 5% CO2 (v/v) . O repique das células foi feito após atingirem uma alta densidade celular, confluência maior que 90%. A linhagem HUVEC teve suas células tripsinizadas com 0,05 mL^cm’2 de solução de Tripsina/EDTA, ressuspendidas em meio fresco. As três linhagens (MOLT-4, Reh e HUVEC) foram centrifugadas à 600 xg em 4 °C por 10 minutos e ressuspensas em meio fresco. A visualização da viabilidade celular foi feita com azul de Trypan (Sigma-Aldrich, Darmstadt/GER) e as células foram contadas em câmara de Neubauer. Em microplacas de 96 poços foram incubadas 20⁴ células leucêmicas e 10⁴ células saudáveis em diferentes concentrações de ASNase e monoPEG (0,01; 0,05; 0,1; 0,3 e 0,6 U^min’¹, em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4) por 48 e 72 horas, à 37 °C com 5 % CO₂ (v/v). Em seguida (48 ou 72 h), foi adicionada uma solução de MTT 0,25 mg^min’¹ e de SDS 1% e incubadas nas mesmas condições por mais 24 h. A leitura da densidade óptica foi realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm, sendo os resultados expressos em percentual de redução do MTT, tendo como parâmetro o grupo controle, para o qual foi atribuído 100% de redução.

[0042] A avaliação citotóxica da enzima controle e fração inventada demonstraram não apresentar citotoxicidade para células saudáveis HUVEC e sim para as células leucêmicas, como mostrado na Figura 8, haja vista que foi possível obter reduções de 48% e 62% de viabilidade celular para 48 e 72 h, respectivamente, para a linhagem MOLT-4 tratada com monoPEG-ASNase e não houve diferença estatística entre as duas enzimas testadas. A linhagem Reh que possui resistência ao tratamento com L-asparaginase, por ser capaz de sintetizar a L-asparagina, apresentou redução de 23% e 33% da viabilidade celular em 48 e 72 h, respectivamente, tanto para a ASNase controle quanto para a monoPEG-ASNase. Portanto, a peguilação manteve o perfil de atividade

Petição 870180019449, de 09/03/2018, pág. 23/36 / 15 citotóxica da ASNase frente às linhagens leucêmicas, sem perda significativa de atividade.

[0043] Tais resultados, indicam a capacidade da invenção monoPEGASNase em ser uma potêncial enzima terapêutica para leucemia linfoblástica aguda, pois a invenção proporcionou maior estabilidade e proteção proteolítica em relação à enzima controle, não apresentou citotoxicidade para as células saudáveis e manteve sua atividade citotóxica original em células leucêmicas MOLT-4 e Reh.

[0044] Embora não tenha sido realizado teste in vivo para se comprovar a eficácia da monoPEG-ASNase como agente citotóxico para as células leucêmicas, o seu perfil citotóxico semelhante ao da enzima nativa de controle indica que ela pode ser utilizada para o tratamento, uma vez que a ASNase com muitas cadeias de PEG (polipeguilada) é biofármaco aprovado pela ANVISA para o tratamento de leucemias.

Claims

1. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA LASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO” caracterizado por o produto obtido consistir em um conjugado compreendendo uma enzima e polietilenoglicol (PEG), em que o PEG tem um peso molecular de 2 a 60 kDa e a referida enzima apresenta pelo menos 40% de identidade à SEQ ID NO: 1 o PEG estar ligado covalentemente a pelo menos um amino N-terminal da referida L-asparaginase, tendo expressão na fórmula: ASNase- [NH-CO(CH2) x-CO-NH-PEG] n, onde ASNase é a L-asparaginase, NH é um ou mais dos grupos NH dos resíduo N-terminal na ASNase, PEG é uma porção de polietilenoglicol, n é um número que representa de 25% a 100% dos grupos amino acessíveis (região N-terminal) na ASNase, e x um número inteiro variando de 1 a 96; conjugado tem uma atividade in vitro de pelo menos 60% em comparação com a L-asparaginase quando não conjugada com o PEG; o conjugado proporciona a morte de pelo menos 50% das células cancerígenas em pelo menos 96 horas;

2. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA LASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido PEG ser monometoxipolietilenoglicol, a referida enzima ser uma L-asparaginase tendo 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1; o PEG estar ligado covalentemente de 25% a 100% a um ou mais grupos amino N-terminal por uma ligação amida; o PEG está ligado covalentemente a pelo menos 1, especificamente de 25% a 100% amino N-terminal da L-asparaginase e ou de 25% a 100%, dos grupos amino N-terminal, ou estar ligado covalentemente a um ou mais grupos amino Nterminal por ligação amida;

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3. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA L-

ASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO”, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por o processo de preparação do conjugado compreender a combinação de uma quantidade do PEG com uma quantidade da referida L-asparaginase em solução tamponada durante período de tempo suficiente para ligar covalentemente o PEG ao Lasparaginase na região N-terminal, onde a solução tamponada tem pH entre 6,0 e 8,0; L-asparaginase tem concentração de proteína entre 0,1 mg / mL e 25 mg / mL e a quantidade do PEG tem excesso molar de polímero sobre grupos amino na L-asparaginase inferior a 50: 1, conforme o procedimento: inicialmente é realizada a reação química de conjugação do metoxipolietilenoglicol sucinimidil éster (mPEG-NHS) de 2 a 60 kDa, à região N-terminal da ASNase sendo solubilizados o PEG e a ASNase na proporção molar de 1:1 a 100:1 em tampão fosfato salino (PBS) com força iônica de 80 a 150 mM e PBS 100mM em pH de 6,5 a 8,5 sob agitação magnética de 400 a 900 rpm, por 15 a 90 minutos, seguida da adição de 5 a 20% (v/v) de hidroxilamina 2M ao meio reacional por mais 30 a 90 minutos; para eliminar resíduos de reação da proteína presente no meio reacional (conjugada ao PEG e sem reagir, portanto livre) a fração clivada (NHS) e o PEG não conjugado são separados por ultrafiltração em membrana com corte superior a 20 kDa e inferior a 100 kDa em temperatura de 1 à 10 °C e em rotação de 1500 à 3500 rpm, sendo duas etapas de purificação empregadas para a obtenção da enzima de interesse (monoPEG-ASNase) em coluna cromatográfica de troca aniônica forte equilibrada com tampão Bis-Tris-HCl de força iônica de 10 a 50 mM e pH de 6,5 à 8,0, e a proteína eluída com o mesmo tampão, porém com adição de NaCl de 300 mM a 2 M; a enzima é purificada em gradiente linear, 10 a 20 volumes de coluna, e de 150 até 500 mM de NaCl em fluxo de 0,5 a 3,0 mL-min-1, e a outra purificação em coluna de exclusão por tamanho sendo a purificação realizada de maneira isocrática, em tampão Tris-HCl força iônica de 20 à 100 mM, pH de 6,0 à 9,0 e fluxo de 0,2 à 1,0 mL-min-1 com as frações do passo anterior correspondentes à

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3 / 4 monoPEG-ASNase, isto é, eluição do gradiente linear entre 70 e 80 mM NaCI equivalente ao penúltimo pico, sendo descartadas as frações correspondentes ao início e ao final do pico, aproximadamente 15% em cada extremidade.

4. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA L-

ASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO”, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por inicialmente ser realizada a reação química de conjugação do metoxipolietilenoglicol sucinimidil éster (mPEG-NHS) de 10 kDa, à região N-terminal da L-asparaginase (ASNase) sendo solubilizados o PEG e a ASNase na proporção molar de 10:1 em tampão fosfato salino (PBS) com força iônica de 80 a 150 mM, e PBS 100mM em pH 7,5, sob agitação magnética de 800 rpm, por 30 minutos, seguida da adição de 10% (v/v) de hidroxilamina 2M ao meio reacional por mais 60 minutos; para eliminar resíduos de reação da proteína presente no meio reacional (conjugada ao PEG e sem reagir, portanto livre) a fração clivada (NHS) e o PEG não conjugado são separados por ultrafiltração em membrana com corte de 50 kDa, em temperatura de 4 °C, em rotação de 3000 rpm, sendo duas etapas de purificação empregadas para a obtenção da enzima de interesse (monoPEG-ASNase) em coluna cromatográfica de troca aniônica forte e posteriormente coluna de exclusão por tamanho. A primeira coluna equilibrada com tampão Bis-Tris-HCl de força iônica de 20 mM, e pH de 7,0, e a proteína eluída com o mesmo tampão, porém com adição de NaCl de 1 M; a enzima é purificada em gradiente linear, 12 volumes de coluna, em eluição até 170 mM de NaCl em fluxo de 2,0 mL-min^-1; a segunda purificação sendo realizada de maneira isocrática, em tampão Tris-HCl força iônica de 50 mM, pH de 8,6, e fluxo de 1,0 mL-min^-1 com as frações do passo anterior correspondentes à monoPEG-ASNase, isto é, eluição do gradiente linear entre 70 e 80 mM NaCl equivalente ao penúltimo pico, sendo descartadas as frações correspondentes ao início e ao final do pico, aproximadamente 15% em cada extremidade.

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5. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA LASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO”, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por na fase de purificação em gradiente linear da enzima monoPEG-ASNase, o último pico do gradiente linear, correspondente à enzima livre, pode ser utilizado para nova conjugação depois de realizada a troca do tampão reacional.

6. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA LASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO”, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por uso de um sistema composto por polietilenoglicol conjugado à região N-terminal de enzima, de fórmula ASNase- [NH-CO- (CH2) x-CO-NH-PEG] n, onde ASNase é a L-asparaginase, NH é um ou mais dos grupos NH dos resíduo N-terminal na ASNase, PEG é uma porção de polietilenoglicol, n é um número que representa de 25% a 100% dos grupos amino acessíveis na ASNase, e x um número inteiro variando de 1 a 96, e ser para preparar um medicamento para tratar doenças tratáveis por depleção de L-asparagina.

7. “PROCESSO DE PEGUILAÇÃO N-TERMINAL DA LASPARAGINASE DE E. COLI, PRODUTO E USO”, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por o aminoácido leucina estar presente na região N-terminal da L-asparaginase de E. Coli para preparar um medicamento para tratar a doença cancer do grupo que consiste em Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), linfoma não Hodgkin, linfoma NK e câncer pancreático.