BR102014014502A2

BR102014014502A2 - vetor de expressão t7 de escherichia coli, vetores para a co-expressão e co-purificação de polipeptídeos recombinantes em/com proteínas carregadoras, uso de vetores de expressão na obtenção de complexos com múltiplos antígenos r imunomoduladores

Info

Publication number: BR102014014502A2
Application number: BR102014014502A
Authority: BR
Inventors: Celso Raul Romero Ramos; Miryan Marroquin Quelopana
Original assignee: Ouro Fino Saúde Animal Ltda
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-03-15
Also published as: WO2015188240A1; UY36161A; BR102014014502B1; US20180135060A1; AR100705A1

Abstract

vetor de expressão t7 de escherichia coli, vetores para a co- expressão e co-purificação de polipeptídeos recombinantes em/com proteínas carregadoras, uso de vetores de expressão na obtenção de complexos com múltiplos antígenos e imunomoduladores. a presente invenção se refere a um vetor para expressão de proteínas recombinantes, antígenos, particulas semelhantes a patógeno, e complexos imunogênicos, dito vetor (aqui denominado pmrka) sendo produzidos por modificação de plasmídeos compreendendo a sequência gênica do promotor t7 de e. coli, sendo essa modificação caracterizada principalmente pela substituição do gene de resistência a ampicilina pelo gene de resistência à canamicina e pela inserção da sequência par (sequência de partição que determina a segregação eficiente dos plasmídeos nas células filhas durante a divisão celular). adicionalmente são providos vetores de expressão baseados no plasmídeo pmrka que compreendem adicionalmente pelo menos uma das sequências gênicas do exossomo de p. abyssi, vetores esses aqui denominados pmrka-exo, pmrka-ring e psumac. também estão previstos na presente invenção os vetores compreendendo adicionalmente sequências gênicas com atividade imunomoduladora/imunorreguladora, preferencialmente os vetores pmrka-z-z-exo e pmrka-z-z-ring. outros aspectos da invenção incluem o método para a produção de ditos vetores de expressão e usos dos vetores obtidos.

Description

“VETOR DE EXPRESSÃO T7 DE Escheríchia coli, VETORES PARA A CO-EXPRESSÃO E CO-PURIFICAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES EM/COM PROTEÍNAS CARREGADORAS, USO DE VETORES DE EXPRESSÃO NA OBTENÇÃO DE COMPLEXOS COM MÚLTIPLOS ANTÍGENOS E IMUNOMODULADORES” Campo da Invenção [0001] A presente invenção se refere a um vetor para expressão de proteínas recombinantes aqui denominado pMRKA, compreendendo a sequência do promotor T7 do bacteriófago T7 de E. coli, o gene de resistência à canamicina e a sequência par (sequência de partição que determina a segregação eficiente dos plasmídeos nas células filhas durante a divisão celular), para incrementar a estabilidade do plasmídeo. Adicionalmente são providos vetores de expressão baseados no plasmídeo pMRKA que compreendem adicionalmente pelo menos uma das sequências gênicas do exossomo de P. abyssi, vetores esses aqui denominados pMRKA-EXO, pMRKA-RING e pSUMAC, que permitem a co-expressão e co-purificação de proteínas recombinantes, especificamente para a obtenção de complexos contendo múltiplos antígenos vacinais e imunomoduladores. [0002] Outros aspectos da invenção incluem o método para a produção de ditos vetores de expressão e usos dos vetores obtidos.

Histórico da Invenção [0003] Inúmeros vetores de expressão de E. coli têm sido desenvolvidos usando promotores fortes, o primeiro dos quais foi o promotor T7 do bacteriófago T7. Os sistemas de expressão baseados em T7 são amplamente usados para super-expressão em larga escala de proteínas recombinantes em células procariotas e eucariotas. O sistema faz uso da RNA polimerase de T7 que é uma enzima altamente ativa, alongando cadeias de RNA oito vezes mais rápido do que a RNA polimerase de E. coli. [0004] Vetores T7 de E. coli são amplamente conhecidos, por exemplo, o vetor pAE que foi descrito por Ramos et al. (Ramos et al. 2004, A high-copy T7 Escherichia coli expression vector for the production of recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. Braz J Med Biol Res.37(8):1103-9), e tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1. O vetor pAE é um derivado do vetor comercial pRSETA (Life Technologies), do qual foram retiradas as sequências do Xpress Epitope, sitio de corte da enteroquinase, para permanecer no plasmídio modificado apenas uma fusão mínima de 6xHis não removível. O vetor pAE é usado com sucesso na escala de bancada, mas seu desempenho é reduzido em fermentadores com culturas de alta densidade celular, em razão de ser o pAE um plasmídeo instável nessas condições de fermentação. [0005] Assim, os sistemas de expressão de proteínas recombinantes precisam ser aperfeiçoados, para possibilitar, dentre outros fatores, a produção de proteínas recombinantes em escala industrial que requer fermentação com alta densidade celular; maior número de cópias do plasmídeo por célula para garantir a expressão da proteína desejada; estabilidade aperfeiçoada das proteínas produzidas; emprego de marcadores de seleção que não interfiram com os seres vivos, especialmente humanos e animais. [0006] Um dos marcadores de seleção que vêm sendo empregados é o de resistência à ampicilina, antibiótico com amplo emprego no tratamento de seres humanos e animais. Evidentemente que este marcador não é desejável devido às consequências que podem ocorrer. Consequentemente, esse marcador tem sido alvo de pesquisas para substituição por outro antibiótico não empregado em humanos e animais. Por exemplo, o documento EP1925670 descreve um vetor de expressão de E. coli no qual o gene de resistência à ampicilina foi substituído por um gene de resistência à canamicina. [0007] Apesar dos avanços já feitos no campo de vetores de expressão, ainda há necessidade de aperfeiçoamentos, tanto na abordagem de plasmídeos de multiuso como na de plasmídeos orientados para a expressão de proteínas específicas, visando alcançar condições melhoradas de produção em escala industrial de proteínas recombinantes. [0008] As vacinas baseadas em antígenos monoméricos possuem uma baixa imunogenicidade e não conseguem conferir proteção semelhante às vacinas convencionais, as quais usam organismos inteiros como bactérias e vírus atenuados ou inativados (Morein B, & Simons K (1985) “Subunit vaccines against enveloped viruses: virosomes, micelles and other protein complexes”, Vaccine. 3:83-93). Por este motivo, apesar do grande número de vacinas-candidatas e publicações sobre estas, não há no mercado vacinas baseadas neste tipo de antígenos. [0009] Estudos recentes mostraram que a formação de complexos de grande massa molecular, como as VLPs (Virus Like Particles), Virosomes e as ISCOM (vesículas de lipídeos contendo antígenos, as PLPs (Pathogen Like Particles, obtidas por nanotecnologia), são altamente imunogênicos. (Rosenthal J.A. et ai. (2014) Pathogen-like particles: biomimetic vaccine carriers engineered at the nanoscale. Current Opinion in Biotechnology (Nanobiotechnology · Systems biology) 28: 51-58). Não obstante, o uso deste tipo de antígenos está limitado pelo custo e complexidade de sua obtenção. [0010] Estruturas carregadoras de antígenos com menor complexidade foram obtidas usando sequências com tendência a formar fibras e usadas com sucesso em testes de laboratório: Rudra JS et al. (2010) “A self-assembling peptide acting as an immune adjuvant”. Proc Natl Acad Sei USA. 107(2):622-7; Rudra JS. et al. (2012) “Self-assembled peptide nanofibers raising durable antibody responses against a malaria epitope”. Biomaterials. 33(27):6476-84; Pepponi I. et al. (2013) Immune-complex mimies as a molecular platform for adjuvant-free vaccine delivery. PLoS One. 8(4):e60855; e Miyata T, et al. (2011) Tricomponent immunopotentiating system as a novel molecular design strategy for malaria vaccine development. Infect Immun. 79:4260-75. Por enquanto, os complexos conhecidos no estado da técnica conseguem carregar somente um antígeno e um modulador, sendo que para obter proteção efetiva contra bactérias e parasitas é necessário o uso de mais de um antígeno na formulação da vacina. [0011] Na presente patente tornou-se possível o uso do complexo do exossomo de arqueas, concretamente de Pyrococcus abyssi, como um sistema capaz de carregar mais de um antígeno e imunomoduladores, de forma tal que se consegue co-expressar e co-purificar os antígenos a partir de uma única cultura. Por ser o P. abyssi hipertermófilo, as proteínas de fusão contendo as proteínas do exossomo podem apresentar termoestabilidade.

Descrição Resumida da Invenção [0012] A presente invenção tem por objetivo prover plasmídeos estáveis que permitam a produção aumentada, em escala industrial, de proteínas recombinantes tanto em forma separada como formando complexos multiproteicos (estes podendo ser termoestáveis) com aplicação no desenvolvimento de vacinas multiantigênicas. [0013] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é provido um Vetor de expressão T7 de Escherichia coli caracterizado por: (a) ter alto número de cópias por célula; (b) ser altamente estável em condições de fermentação de alta densidade celular; (c) tamanho de cerca de 3 Kpb; (d) ter um marcador de resistência a antibiótico não empregado em humanos e animais. Mais preferivelmente, o vetor de expressão de T7 de E. coli da invenção é o plasmídeo pMRKA e compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 19. [0014] De acordo com um segundo aspecto da invenção, são providos vetores para expressão de polipeptídeos de fusão a proteínas carregadoras, tendo como características: (a) um vetor de acordo com o primeiro aspecto da invenção; e (b) pelo menos um gene do exossomo de P. abyssi codificante de pelo menos uma proteína carregadora de proteínas imunogênicas, antígenos ou moléculas imunorreguladoras. Mais preferivelmente, os ditos vetores são: o plasmídeo pMRKA-EXO compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 36, o plasmídeo pMRKA-RING compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 37, e o plasmídeo pSUMAC compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 40. [0015] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, são providos vetores para expressão de polipeptídeos de fusão a proteínas carregadoras, ditos vetores tendo, adicionalmente, atividade imunomoduladora e apresentando as seguintes características: (a) um vetor de acordo com o primeiro aspecto da invenção; (b) pelo menos um gene do exossomo de P. abyssi codificante de pelo menos uma proteína carregadora de proteínas imunogênicas, antígenos ou moléculas imunorreguladoras e (c) pelo menos um segmento de imunomodulação, tal como o domínio Z. Mais preferivelmente, os ditos vetores são: o plasmídeo pMRKA-ZZ-EXO compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 43, e o plasmídeo pMRKA-ZZ-RING compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 45. [0016] De acordo com um quarto aspecto da invenção, é provido um método de obtenção de um vetor de expressão de acordo com o primeiro aspecto da invenção, compreendendo as etapas de: (i) troca do gene de resistência à ampicilina no vetor de SEQ ID No: 1 pelo gene de resistência à canamicina; (ii) amplificação do fragmento do plasmídeo de SEQ ID No: 1 correspondente ao segmento localizado entre os nucleotídeos 804 a 1857; (iii) ligação dos segmentos amplificados da etapa (ii) com o gene de resistência à canamicina; (iv) amplificação do plasmídeo obtido na etapa (iii) para inserir sítios de restrição na base 2607 do plasmídeo pMK; (v) amplificação da sequência pare inserção da sequência amplificada resultante entre os sítios de restrição localizados na base 2607 do pMK para obtenção do plasmídeo pMRK; e (vi) eliminação dos sítios de restrição de Bglll e Ncol no gene de resistência à canamicina no vetor pMRK para obtenção do plasmídeo pMRKA. [0017] Em um quinto aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de obtenção de um vetor de expressão de acordo com o segundo aspecto da invenção, compreendendo as etapas de: (i) preparação do plasmídeo pMRKA de acordo com o método do quarto aspecto da invenção; (ii) preparação de pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi codificante de pelo menos uma proteína carregadora de proteínas imunogênicas, antígenos ou moléculas imunorreguladoras; (iii) síntese de um DNA de dupla fita contendo a dita pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi; e (iv) clonagem do dito DNA de dupla fita obtido na etapa (iii) no dito plasmídeo pMRKA. Este método possibilita a obtenção dos vetores de fusão pMRKA-EXO, pMRKA-RING e pSUMAC. [0018] Em um sexto aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de obtenção de um vetor de expressão de acordo com o terceiro aspecto da invenção, compreendendo as etapas de: (i) preparação do plasmídeo pMRKA de acordo com o método do quarto aspecto da invenção; (ii) preparação de pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P, abyssi codificante de pelo menos uma proteína carregadora de proteínas imunogênicas, antígenos ou moléculas imunorreguladoras; (iii) preparação de pelo menos uma sequência apresentando atividade imunomoduladora, preferencialmente pelo menos uma sequência do domínio Z; (iv) síntese de um DNA de dupla fita contendo a dita pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi e pelo menos uma sequência com atividade imunomoduladora; e (v) clonagem do dito DNA de dupla fita obtido na etapa (iv) no dito plasmídeo pMRKA. Este método possibilita a obtenção dos vetores de fusão pMRKA-ZZ-EXO e pMRKA-ZZ-RING. [0019] Em um sexto aspecto, a presente invenção diz respeito ao uso dos vetores de acordo com o primeiro, segundo e terceiro aspectos da invenção, obtidos de acordo com os métodos dos terceiro, quarto e quinto aspectos da invenção na preparação em larga escala de proteínas recombinantes termoestáveis e adicionalmente com atividade imunomoduladora.

Breve Descrição das Figuras [0020] A Figura 1 ilustra o fluxo da sequência de modificações para a obtenção dos vetores da presente invenção: pMRKA, pMRKA-EXO, pMRKA-RING e pSUMAC. [0021] A Figura 2 ilustra o mapa do vetor pAE e a sequência de fusão (6xHis) e sítios de clonagem, vetor esse que foi o plasmídeo base das modificações que resultaram nos vetores da invenção. [0022] A Figura 3 ilustra a estratégia usada para a troca do marcador de seleção (antibiótico) no vetor pAE visando à obtenção do vetor pMK. [0023] A Figura 4 ilustra a estratégia usada para a inserção da sequência par no vetor pMK para obtenção do vetor pMRK. [0024] A Figura 5 ilustra a análise de plasmídeos derivados do vetor pAE: pMK - vetor pAE com o marcador KanR em lugar de AmpR; e pMRK -vetor pAE com as duas modificações, sequência de resistência à canamicina e sequência par, KAN - correspondente aos produtos de amplificação do gene da canamicina, par - produtos de amplificação da sequência par do plasmídeo pSC1010. [0025] A Figura 6 ilustra o esquema das modificações realizadas por mutagênese para obtenção do plasmídeo pMRKA. [0026] A Figura 7 ilustra o esquema do lócus contendo os genes PAB0419, PAB0420 e PAB0421 que codificam as proteínas do exossomo Rrp4, Rrp41 e Rrp42, respectivamente. [0027] A Figura 8 apresenta o diagrama de superfície da estrutura do exossomo de Pyrococcus abyssi; em magenta, o diagrama de superfície do RNA ligado ao exossomo. [0028] A Figura 9 ilustra o esquema do gene sintético para a clonagem em fusão na extremidade N- e C-terminal das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42 do exossomo de P. abyssi. [0029] A Figura 10 ilustra a estratégia de clonagem do gene sintético contendo os genes das proteínas de P. abyssi no vetor pMRKA. [0030] A Figura 11 ilustra o gel de co-purificação das proteínas do complexo exossômico de P. abyssi, co-expressadas pelo plasmídeo pMRKA-EXO em E. coli. [0031] A Figura 12 ilustra o diagrama de superfície do núcleo do exossomo de Pyrococcus abyssi, formado pelas proteínas Rrp41 e Rrp42; em magenta pode ser visualizado o diagrama de superfície do RNA ligado ao complexo “RING”. [0032] A Figura 13 ilustra a estratégia de clonagem dos genes correspondentes ao núcleo do exossomo de P. abyssi no vetor pMRKA para obtenção do pMRKA-RING. [0033] A Figura 14 ilustra a co-purificação das proteínas Rrp41 e Rrp42, co-expressadas no plasmídeo pMRKA-RING, por cromatografia de troca-iônica. 80°C - input, material tratado a 80°C por 30 minutos seguido de centrifugação; 1 - 5 - frações correspondentes ao pico de eluição. [0034] A Figura 15 ilustra o diagrama de superfície do complexo formado pela proteína Rrp42. [0035] A Figura 16 ilustra a estratégia de clonagem da proteína Rrp42 no vetor pMRKA para obtenção do vetor pSUMAC, [0036] A Figura 17 ilustra o gel de proteína Rrp42 purificada numa etapa de lise celular a 80°C por 30 minutos, seguido de centrifugação. [0037] A Figura 18 ilustra a estratégia de clonagem dos domínios Z-Z no plasmídeo pMRKA-EXO. [0038] A Figura 19 ilustra a estratégia de clonagem dos domínios Z-Z no plasmídeo pMRKA-RING. [0039] A Figura 20 ilustra a análise por SDS-PAGE do complexo co-purificado contendo as proteínas do exossomo de P. abyssi com a fusão dos domínios Z-Z na proteína Rrp42. M denota o Marcador de Massa Molecular. [0040] A Figura 21 ilustra a análise por SDS-PAGE do complexo co-purificado contendo as proteínas do anel (RING) do exossomo de P. abyssi com a fusão dos -domínios Z-Z na proteína Rrp42. M - denota o Marcador de Massa Molecular. 1 - denota o complexo ZZ-RING purificado.

[0041] A Figura 22 ilustra a estratégia de clonagem dos genes sintéticos de antígenos vacinais de Mycoplasma hyopneumoniaeno no plasmídeo pMRKA-EXO para obtenção do vetor pMRKA-EXOMYC [0042] A Figura 23 ilustra a análise por SDS-PAGE da expressão das poliproteínas dos complexos de antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae com as proteínas do exossomo de P. abyssi. M - denota o Marcador de Massa Molecular; 1- denota a cepa Rosetta (DE3)/pMRKA-EXOMYC; 2 - denota a cepa Rosetta (DE3)/pMRKA-RINGMYC; 3 - denota a cepa Rosetta (DE3)/pSUMAC-MYC; Não induzido - denota a cultura sem a presença do indutor; Induzido - denota a cultura induzida com 1mM ITPG. [0043] A Figura 24 ilustra o resultado da purificação do complexo EXOMYX expresso em Escherichia coli, por filtração tangencial. M - denota o marcador de massa molecular; 1_- denota a análise de 2 μΙ_ da proteína purificada; 2 - denota a análise de 4 pl_ da proteína purificada. [0044] A Figura 25 ilustra a estratégia de clonagem dos genes sintéticos do antígeno Inibina, como descrito e reivindicado no pedido de patente copendente P1102014005376-0, no vetor pSUMAC. [0045] A Figura 26 ilustra a análise por SDS-PAGE da expressão da proteína de fusão Rrp42-lniOF durante a formação (indução) e do produto purificado por tratamento térmico (retido 100 kDa).

Descrição Detalhada da Invenção [0046] A presente invenção trata da obtenção de vetores de expressão para produção de proteínas recombinantes termoestáveis, incluindo os vetores compreendendo plasmídeos para a expressão de proteínas recombinantes de fusão com proteínas carregadoras oriundas do exossomo de P. abyssi. Mais particularmente, a invenção diz respeito aos vetores obtidos a partir do plasmídeo pAE (Ramos et al., 2004), o qual foi obtido por modificação do plasmídeo comercial pRSETA (Life Technologies), principalmente por modificação do gene de resistência a antibiótico (marcador de seleção) e pela inserção da sequência par do plasmídeo pSC101. O fluxograma das modificações introduzidas no plasmídeo pAE e nos plasmídeos subsequentes resultantes de cada passo de modificação está representado na Figura 1. [0047] O termo “vetor de expressão” tem a intenção de significar, nesta descrição, os plasmídeos, em sua forma final, resultantes das modificações introduzidas no plasmídeo inicial pAE e nos plasmídeos intermediários subsequentes. [0048] Os termos “sequência imunomoduladora” e “sequência imunorreguladora” são aqui usados de modo intercambiável e significam as sequências que conferem atividade de imunorregulação às proteínas/polipeptídeos contendo sequências gênicas com essa característica, por exemplo, o domínio Z da proteína A de S. aureus. [0049] Os termos “polipeptídeo” e “proteína recombinante” são aqui usados de modo intercambiável e significam as sequências de aminoácidos codificadas a partir dos plasmídeos da invenção, ditas sequências correspondendo às proteínas recombinantes com termoestabilidade aperfeiçoada. [0050] Como mencionado anteriormente, o vetor pAE é adequado para expressão de proteínas em escala de bancada, mas, devido à sua instabilidade em fermentadores com culturas de alta densidade, seu desempenho torna-se inaceitável para a produção de proteínas recombinantes em escala industrial. [0051] Para suplantar essa deficiência do vetor pAE, foram realizadas de acordo com a invenção, as seguintes modificações: (a) substituição do gene de resistência a antibiótico, dando origem ao plasmídeo aqui denominado de pMK; (b) introdução da sequência de partição “par"’ do plasmídeo pSC101, resultando no plasmídeo aqui denominado pMRK; e (c) eliminação dos sítios de restrição Bglll e Ncol no gene de resistência à canamicina no vetor pMRK.

Vetor pMK [0052] O vetor pMK resulta da substituição do gene de resistência à ampicilina pelo gene de resistência à canamicina no vetor pAE, que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 1, tendo seu mapa representado na Figura 2. [0053] A necessidade de modificação do plasmídeo pAE foi devida às seguintes razões: (a) como o gene de resistência à ampicilina codifica uma beta-lactamase que se localiza no espaço periplasmático da E. coli, nas culturas de alta densidade essa enzima tem a possibilidade de migrar para o meio de cultura e, consequentemente, degradar o antibiótico, diminuindo a pressão seletiva do meio e propiciando o acúmulo de células sem o plasmídeo; e (b) na produção de vetores de expressão em escala industrial não se recomenda o uso de antibióticos semelhantes aos que são usados nos campos de medicina e veterinária, como é o caso da ampicilina. Como a canamicina não tem aplicação médica, o gene de resistência à ampicilina no vetor pAE foi substituído pelo gene de resistência à canamicina. [0054] Para efetuar esta substituição de gene de resistência a antibiótico, foi realizada a modificação no esqueleto do vetor pAE usando a técnica “whole plasmid PCR”, que permite operar os trocas com exatidão, como representado esquema mostrado na Figura 3. [0055] De acordo com a invenção, foi usado o gene de resistência à canamicina do plasmídeo pK18 (No. de acesso No GenBank M17626.1, [Pridmore RD. 1987. New and versatile cloning vectors with kanamycin-resistance marker. Gene. 56(2-3):309-12]). Este plasmídeo contém o gene do transposon Tn5 que codifica a enzima Neomicina Fosfotransferase (NPT), a qual confere resistência tanto à neomicina (neo) como à canamicina (kan). Para a amplificação, por PCR, da região que codifica a NPT juntamente com seu promotor (do nucleotídeo 208 até o nucleotídeo 1182, na sequência do plasmídeo pK18 (M17626.1 No GenBank) foram desenhados os seguintes primers: Kan-For - SEQ ID No: 2 5’ ATCTCGAGTTATGGACAGCAAGCGAACC 3’ Kan-Rev - SEQ ID No: 3 5’ CATCTAGAATTTCGAACCCCAGAGTCC 3’ [0056] O primer Kan-For contém o sítio de restrição Xhol e o primer Kan-Rev o sítio de Xbal (ambos sublinhados nas sequências dos primers). O PCR foi realizado com a enzima de alta fidelidade KOD DNA polimerase (Novagen) e usando como molde o plasmídeo pK18. Como resultado, a sequência contendo o gene de resistência à canamicina (SEQ ID No: 4) foi amplificada, sendo que o gene resultante codifica a enzima NPT (SEQ ID No: 5). [0057] Adicionalmente, foi amplificado, por PCR, um fragmento do plasmídeo pAE, desde do nucleotídeo 804 até o nucleotídeo 1857, o qual não contém o gene de resistência à ampicilina. Esta amplificação foi realizada usando os primers: VecMar-For - SEQ ID No: 6 5’ CGACTAGTGCATTGGTAACTGTCAGACC 3’ VecMar-Rev - SEQ ID No: 7 5’ AT GT CGACGT GCCACCTAAATT GT AAGCG 3’ [0058] O primer VecMar-For contém o sítio de restrição Spel, e o primer VecMar-Ver o sítio de restrição Sall (ambos sublinhados nas sequências dos primers) para possibilitar a ação de enzimas que não possuem sítios de corte na sequência do pAE. A amplificação foi realizada usando a enzima de alta fidelidade KOD XL DNA polimerase (Novagen), indicada para amplificação de fragmentos extensos de DNA, como plasmídeos íntegros. [0059] Os cortes com as enzimas Sall, no DNA amplificado do vetor pAE, e Xhol no DNA amplificado do gene de resistência à canamicina, geram extremos compatíveis. Este fato permite a junção destes DNAs, ao mesmo tempo em que, na eventualidade de serem perdidos os sítios de corte originais, não é necessária a introdução de sítios de corte no novo vetor durante sua construção. O mesmo acontece com as enzimas Spel (no segmento amplificado do vetor) e Xbal (no segmento amplificado de KanR) que geram extremos compatíveis após o corte (ver Figura 3). A ligação dos segmentos amplificados do vetor (cortado com as enzimas Sall e Spel) e de KanR (cortado com Xhol e Xbal), resulta no plasmídeo denominado pMK, selecionado pela sua resistência à canamicina (ver Figura 3) (SEQ ID No: 8).

Vetor pMRK [0060] Apesar de aperfeiçoado pela substituição do gene de resistência a antibiótico, o vetor pMK ainda apresenta estabilidade insatisfatória, o que foi superado, de acordo com a presente invenção, através da inserção de uma sequência, conhecida como “par1’, que possuí a propriedade de melhorar a estabilidade de plasmídeos. [0061] Para aumentar a estabilidade dos plasmídeos da invenção, foi empregada a estratégia de introduzir a sequência de partição “par1’ (que determina a segregação eficiente dos plasmídeos nas células filhas durante a divisão celular) do plasmídeo pSC101 no vetor pAE. A utilização da sequência par na melhoria da estabilidade de plasmídeos foi descrita anteriormente por Meacock et al. (Meacock PA and Cohen SN (1980) Partitioning of bacterial plasmids during cell division: a cis-acting locus that accomplishes stable plasmid inheritance. Cell. 20(2):529-42; WO 1984001172 A1). Vale observar que, apesar de essa estratégia ser muito interessante sob o ponto de vista de estabilização dos plasmídeos obtidos, atualmente, os sistemas amplamente difundidos na pesquisa (por exemplo, os vetores pET) e na produção em escala industrial não incluem o uso da sequência “par*’. [0062] Assim, para aumentar a estabilidade dos plasmídeos baseados no vetor pAE, a sequência de partição “par" foi inserida no plasmídeo pMK usando, mais uma vez, a técnica “whole plasmid PCR”, como mostrada no esquema da Figura 4. [0063] No diagrama do plasmídeo pMRK, mostrado na Figura 4, é evidenciada a posição dos sítios de corte para as enzimas de restrição Bglll e Ncol, tanto no marcador de seleção KanR, como no sítio múltiplo de clonagem. [0064] Como fonte da sequência “par1' foi usado o próprio plasmídeo pSC101 (N de acesso No GenBank NC_002056, [Yamaguchi &Masamune Y. 1985. Autogenous regulation of synthesis of the replication protein in plasmid pSC101. Mol Gen Genet. 200(3):362-7]). Para a amplificação da sequência par (do nucleotídeo 4605 até o nucleotídeo 4876, da sequência NC_002056 do GenBank) e subsequente inserção desta sequência no vetor pMK, foram desenhados os seguintes primers: ParFor - SEQ ID No: 9 3’ ATCTCGAGTTTGTCTCCGACCATCAGG 3’ ParRev- SEQ ID No: 10 5’ GTTCTAGACGGGATAATCCGAAGTGG 3’ [0065] O primer ParFor contém o sítio de restrição Xbal, e o primer ParRev contém o sítio para Xhol (ambos sublinhados nas sequências dos primers). O PCR foi realizado usando a enzima de alta fidelidade KOD DNA polimerase (Novagen) e usando como molde o plasmídeo pSC101, Como resultado da amplificação, foi obtida a sequência “par1’ (SEQ ID NO: 11). [0066] Adicionalmente, o plasmídeo pMK foi amplificado por PCR para inserir sítios de restrição na posição da base 2607 deste plasmídeo, possibilitando, assim, a inserção do segmento amplificado da sequência “par1’, por meio do uso dos seguintes primers: VecPar-For - SEQ ID No: 12 5’ ATACTAGTACGCGGCCTTTTTACGGTTCC 3’ VecPar-Rev - SEQ ID No: 13 5’ ATGTCGACTGCTGGCGTTTTTCCATAGG 3’ [0067] O primer VecPar-For contém o sítio de restrição Spel e o primer VecPar-Ver contém o sítio de Sall (sublinhados nas sequências dos primers) para possibilitar a ação de enzimas que não possuem sítios de corte na sequência do pMK. A amplificação foi realizada usando a enzima de alta fidelidade KOD XL DNA polimerase (Novagen), que é indicada para amplificação de plasmídeos inteiros, [0068] Como foi descrito anteriormente, os cortes com as enzimas Sall e Xhol geram extremos compatíveis no DNA digerido, do mesmo modo que os cortes com as enzimas Spel e Xbal. A ligação dos segmentos amplificados no vetor (cortado com as enzimas Sall e Spel) e da sequência “par” (cortado com Xhol e Xbal), resultou no plasmídeo de expressão denominado pMRK (SEQ ID NO: 14) (ver Figura 4), selecionado por sua resistência à canamicina. [0069] A Figura 5 mostra a análise por PCR dos plasmídeos pMK e pMRK, com relação à presença do marcador de resistência à canamicina e da sequência par.

Vetor pMRKA [0070] Finalmente, para eliminar os sítios de restrição Bglll e Ncol no gene de resistência à canamicina, ou seja, no marcador KanR do vetor pMRK, foram realizadas duas mutagêneses sítio dirigidas, empregando a técnica de PCR e usando o kit “QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagene), como mostrado na Figura 6. [0071] Primeiramente foi realizada a mutagênese No sítio Bglll. Este sítio se localiza após a região promotora do gene que codifica a enzima Neomicina Fosfotransferase (NPT), que confere resistência à canamicina (kan). Para efetuar a mutação C976T, que corresponde a Citosina do sitio (AGATÇT), foram desenhados os primers BglFor e BgIRev, cujas sequências são mostradas a seguir: BglFor (SEQ ID No: 15) GATG G C GCAGGGGAT CAAGATTT GAT CAAGAGACAG G ATG AG BgIRev (SEQ ID No: 16) CT CATCCT GT CT CTT GAT CAAAT CTT GAT CCCCTGCGCCAT C [0072] A posição dos nucleotídeos que integram o sítio Bglll está sublinhado e no quadrado está ressaltado o nucleotídeo mutagênico. Após o ciclo de mutagênese por PCR usando o kit “QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagene), os plasmídeos resultantes foram caracterizados por análise de restrição com a enzima Bglll e por sequenciamento com o primer Kan-For (SEQ ID No: 2) para verificar se a mutagênese foi bem sucedida, [0073] Em seguida foi realizada a mutagênese no sítio Ncol. Esse sítio se localiza na região codificante de resistência à canamicina (kanR). Para a realização da mutação neutra T1571C na Timina do sítio (CCATGG), que corresponde à terceira posição no códon CAT codificante da His188 na enzima Neomicina Fosfotransferase, foram desenhados os primers NcoFor e NcoRev, A mudança de CAT para CAC não altera esse resíduo aminoácido já que o códon CAC continua codificando a Histidina.

NcoFor - SEQ ID No: 17 ATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGC NcoRev - SEQ ID No: 18 GCAAGCAGGCATCGCCGTGGGTCACGACGAGAT [0074] A posição dos nucleotídeos que integravam o sítio Ncol está sublinhada, sendo ressaltado, no quadrado, o nucleotídeo mutagênico. Após o ciclo de mutagênese por PCR usando o kit “QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagene), os plasmídeos resultantes foram caracterizados por análise de restrição com a enzima Ncol e por sequenciamento com o primer Kan-Rev (SEQ ID No: 3) para verificar se a mutagênese foi bem sucedida. [0075] Após os dois ciclos de mutagênese, os sítios Bglll e Ncol, no sítio múltiplo de clonagem, passaram a ser sítios únicos na sequência do plasmídeo, e assim podem ser usados para as clonagens desejadas. O plasmídeo sem os sítios de divagem Bglll e Ncol no gene de resistência à canamicina foi denominado pMRKA (SEQ ID No: 19) e corresponde ao primeiro aspecto da presente invenção. Este vetor codifica a proteína de fusão 6xHis (SEQ ID No: 20) e a enzima NPT, com a mutação neutra T1571C (SEQ ID No: 21). [0076] A estabilidade do pMRKA em cultura de fermentação em escala industrial (elevada densidade celular) foi testada com sucesso. [0077] O plasmídeo pMRKA corresponde ao vetor do primeiro aspecto da invenção e representa uma opção vantajosa em relação ao vetor pET, o qual é o vetor comercial usado na grande maioria dos processos para a produção de proteínas recombinantes. As vantagens do pMRKA são as seguintes: [0078] Tamanho menor: 2,8 Kpb contra 5,4 Kpb do pET; assim, o pMRKA pode carregar sequências de maior tamanho. [0079] Maior número de cópias por célula: o vetor pMRKA tem 300-500 cópias por célula contra 20-50 cópias do pET por célula; com isso o pMRKA tem maior carga gênica e, em alguns casos, maior expressão em comparação com o vetor pET. O pMRKA também facilita os experimentos de clonagem e sequenciamento. [0080] Maior estabilidade: a presença da sequência “par1’ torna o pMRKA mais estável em relação ao plasmídeo pET.

Vetor pMRKA-EXO [0081] As vantagens do vetor pMRKA acima mencionadas possibilitaram a utilização desse plasmídeo na construção de um vetor derivado de expressão de proteínas de fusão com proteínas carregadoras, vetor esse que compreende as sequências codificantes das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42 de P. abyssi comprovadamente importantes como proteínas carregadoras de antígenos ou complexos imunogênicos. [0082] A bactéria Pyrococcus abyssi é uma arqueobactéria hipertermófila, que vive perto de aberturas hidrotermais no solo do oceano.

Esta arquea suporta temperaturas acima de 100 Ce pressão de até 200 atmosferas, não representando, entretanto, perigo para a saúde de seres humanos, plantas ou animais. Para suportar temperaturas e pressões tão elevadas, a evolução fez com que a P. abyssi possuísse proteínas extremamente estáveis, resistentes à desnaturação por temperatura ou por pressão. [0083] Os genes que codificam as proteínas que compõem o complexo do exossomo de Pyrococcus abyssi estão localizados em um único lócus no genoma desta arqueobactéria (Koonin EV et al. (2001) Prediction of the archaeal exosome and its connections with the proteasome and the translation and transcription machineries by a comparative-genomic approach. Genome Res. 11:240-252) (ver Figura 7). [0084] No processo da presente invenção, o complexo do exossomo de P. abyssi foi montado in vivo e in vitro usando proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli. Este complexo foi anteriormente caracterizado funcional e estruturalmente (Ramos CR, et al. (2006) The Pyrococcus exosome complex: structural and functional characterization. J Biol Chem. 281:6751-6759; e Navarro MV et al. 2008. Insights into the mechanism of Progressive RNA degradation by the archaeal exosome. J Biol Chem. 283:14120-14131). [0085] Na Figura 8, são mostrados os modelos de superfície da estrutura do exossomo de P. abyssi. A estrutura do complexo denominado “RNases PH ring” formado por Rrp41 e Rrp42 foi determinado por cristalografia (Navarro et al., 2008), enquanto que a estrutura e posição da Rrp4 foi modelada usando como molde as estruturas de exossomos das arqueas Archaeoglobus fulgidus (Büttner K et al (2005) Structural framework for the mechanism of archaeal exosomes in RNA processing. Mol Cell. 20:461-471) e Sulfolobus solfataricus (Lorentzen E, & Conti E. Crystal structure of a 9-subunit archaeal exosome in pre-catalytic States of the phosphorolytic reaction. Archaea. 2012:721869). [0086] Na base da estrutura do exossomo pode ser visualizado um anel (“RING”) hexamérico formado por três cópias das proteínas Rrp41 (em vermelho) e Rrp42 (em azul). Este anel possui atividade de ligação ao RNA e atividade catalítica (RNase). Acima do anel se localizam três cópias da proteína Rrp4 (em amarelo), que contém domínios de ligação ao RNA. [0087] Esta estrutura compacta é altamente solúvel e estável, e pode ser expressada em alto nível em Escherichia coli, características estas que facilitam sua obtenção.

Exossomo como carregador de antíqenos vacinais [0088] O complexo do exossomo de arqueas possui características únicas que podem ser exploradas no desenvolvimento de vacinas de nova geração denominadas “partículas parecidas a patógenos”, as quais usam o biomimetismo para melhorar a resposta imunológica, tais como: [0089] Capacidade para auto-associação especifica (self-assembly) quando dito complexo é expresso em células de Escherichia coli, [0090] Alta expressão, solubilidade e termoestabilidade do complexo, o que facilita a purificação e formulação das proteínas recombinantes. [0091] Este complexo também confere maior estabilidade à proteína imunogênica durante a formulação e o armazenamento de produtos acabados, aspecto importante no desenvolvimento de produtos biológicos. [0092] Capacidade de carregar mais de uma proteína antigênica e imuno-moduladora porque, segundo estrutura determinada por cristalografia, os extremos amino e carboxila terminal das três proteínas estão expostos ao solvente, [0093] A técnica da presente invenção, utilizando sequências gênicas do exossomo de P. abyssi, representa um grande avanço em relação ao uso de antígenos recombinantes sozinhos na formulação de vacinas, antígenos esses que não conseguem conferir grau de proteção suficiente como aquele que é alcançado com organismos inteiros como bactérias e vírus inativados (Rosenthal J.A. et al. (2014) Pathogen-líke partícles: biomimetic vaccine carríers engineered at the nanoscale. Current Opinion in Biotechnology (Nanobiotechnology · Systems biology) 28: 51-58). [0094] A possibilidade de juntar num complexo mais de um antígeno e imuno-moduladores, faz com que o sistema proposto na presente invenção seja superior as estratégias reportadas usando sequências com tendência a formar fibras como Rudra JS et al. (2010) “A self-assembling peptide acting as an immune adjuvant”. Proc Natl Acad Sei USA. 107(2):622-7; Rudra JS. et al. (2012) “Self-assembled peptide nanofibers raising durable antibody responses against a malaria epitope”. Biomaterials. 33(27):6476-84; Pepponi I. et al. (2013) Immune-complex mimies as a molecular platform for adjuvant-free vaccine delivery. PLoS One. 8(4):e60855; e, Miyata T, et al. (2011) Tricomponent immunopotentiating system as a novel molecular design strategy for malaria vaccine development. Infect Immun. 79:4260-75.

Gene sintético para expressão do exossomo de P. abvssi [0095] Para explorar a possibilidade do uso do exossomo como complexo carregador de múltiplas moléculas, de acordo com a invenção, foi desenhada uma sequência de DNA contendo os genes para as proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42 de Pyrococcus abyssi (nessa ordem, como são encontrados no genoma do P. abyssi, ver Figura 7), com sítios de restrição que permitam clonar proteínas recombinantes em fusão na extremidade N- ou C-terminal dos componentes do exossomo. [0096] A Figura 9 mostra o esquema da sequência projetada de acordo com a invenção. [0097] A construção mostrada na Figura 9 está planejada para a clonagem no vetor pMRKA entre os sítios Xbal e Hindlll. Assim, apenas o primeiro gene (Rrp4) fica sob o controle do promotor T7 do vetor. Para os genes Rrp41 e Rrp42 foram desenhadas sequências contendo o promotor T7, de forma semelhante ao desenho dos vetores de co-expressão pETDuet-1 e pACYCDuet-1 (EMD Millipore), porém sem a sequência operadora do operon lac, presente nestes vectores comerciais.

Sequências entre as regiões codificantes das proteínas do exossomo [0098] O primeiro fragmento desenhado contém, a partir do extremo 5’, o sítio de corte para a enzima Xbal, a sequência transcrita a partir do promotor T7 do vector pMRKA, o sítio de ligação ao ribossomo (Ribosome Binding Site (RBS)), o códon de início de tradução (ressaltado no quadrado) e os sítios de restrição Clal e EcoRV para a clonagem em fusão N-terminal com a proteína Rrp4, como mostrado a seguir.

Rrp4 RBS - SEQ ID NO: 22 Xbal RBS Clal EcoRV

TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATATATGGCTATCGATGCGGATATCGCC M A I DADIA [0099] O segundo fragmento desenhado contém o sitio de corte para a enzima Bglll, visando à clonagem em fusão C-terminal da proteína Rrp4, o códon stop, e os sítios Kpnl e Pstl para a clonagem unidirecional. Seguem-se as seguintes sequências: uma sequência que contém o promotor T7 para a proteína Rrp41, o sítio de ligação ao ribossomo, o códon de início de tradução (ressaltado no quadrado) e os sítios de restrição Ndel e Mlul para a clonagem em fusão N-terminal com a proteína Rrp41, como mostrado a seguir.

Rrp4 end e Promotor de Rrp41 e start - SEQ ID NO: 23 Bglll Kpnl Pstl AGATCTTAAGGTACCCTGCAGGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCAACT RS* Rrp4 Promotor T7 TCGAAATCAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCATCTTAGTATATTAGTTTAAC RBS Ndel Mlul TTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTACGCGTGCA M A T R A Rrp41 [0100] O terceiro fragmento desenhado contém o sítio de corte para a enzima BamHI para a clonagem em fusão C-terminal com a proteína Rrp41, o códon stop, e os sítios Spel e EcoRI, para a clonagem unidirecional. Em continuação seguem-se as sequências: uma sequência que contém o promotor T7 para a proteína Rrp42, o sítio de ligação ao ribossomo, o códon de início de tradução (ressaltado no quadrado) e os sítios de restrição Ncol e Sall para a clonagem em fusão N-terminal com a proteína Rrp42: Rrp41 end e Promotor para Rrp42 e start - SEQ ID NO: 24 BamHI Spel EcoRI GGATCCTAAACTAGTGAATTCGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATA G S * Rrp41 Promotor T7 ATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCATCTTAGTATATTAGTTAA RBS Ncol SalI GTATAAGAAGGAGATATACCATGGGTGTCGAC M G V D Rrp4 2 [0101] Finalmente o quarto fragmento desenhado contém o sítio de corte para a enzima Xhol para a clonagem em fusão C-terminal com a proteína Rrp42, o códon stop, e os sítios Notl e Hindlll (no extremo 3’), para a clonagem unidirecional.

Rrp42 end(SEQ ID NO: 25) Xhol Notl Hindlll CTCGAGTAAGCGGCCGCAAGCTT L E * Rrp42 Desenho dos genes sintéticos para as proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42: [0102] Para o desenho dos genes sintéticos, foi empregada a estratégia baseada na teoria conhecida como “Codon Harmonization” (harmonização de códons) (Angov E, et al. (2011) Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods Mol Biol, 705:1-13). Pela teoria de harmonização de códons, os códons denominados raros (que se usam menos que os outros códons num dado organismo) têm menor quantidade de tRNAs e desempenham um papel importante no enovelamento das proteínas. Eles estão localizados nos “loops” das proteínas, entre os segmentos de estrutura secundária definida. Estes códons podem diminuir a velocidade de síntese da proteína pelo ribossomo, permitindo que a sequência sintetizada se enovele antes do início da síntese de outro fragmento proteico.

[0103] Os códons raros nos genes PAB0419, PAB0420 e PAB0421, que codificam as proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42, respectivamente, foram identificados por meio do emprego do programa ANACONDA (http://bioinformatics.ua.pt/software/anaconda) alimentado com a tabela de uso de códons de P. abyssi, obtido na base de dados “Codort Usage Database” (http://www.kazusa.or.jp/codon/). [0104] A localização dos aminoácidos codificados pelos “códons raros” nas estruturas tridimensionais obtidas para cada uma das proteínas foi realizada usando o programa Swiss-Pdb-Viewe 4.0.1 (http://spdbv.vital-it.ch/). Na “harmonização” do gene sintético foram considerados os códons raros que codificam aminoácidos localizados nas regiões de “loops” entre as sequências de estrutura secundária, alfa-hélice ou folha-beta. [0105] Para o desenho do gene sintético foi usado o programa Gene Designer 2.0 (DNA2.0), escolhendo manualmente códons “raros” de E. coli para cada um dos aminoácidos identificados com o programa ANACONDA e localizados na estrutura com Swiss-Pdb-Viewe 4.0.1, no intuito de melhorar o enovelamento das proteínas. O programa Gene Designer 2.0 foi alimentado com a tabela de uso de códons para proteínas altamente expressas em E. coli (Villalobos et al. (2006) GeneDesigner: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. BMC Bioinformatics. 7:285). [0106] As sequências de aminoácidos usadas para o desenho dos genes sintéticos correspondem àquelas relatadas no GenBank para Pyrococcus abyssi cepa GE5: Tabela 1: Sequências gênicas de P. abyssi empregadas na presente invenção. [0107] No desenho não foram consideradas as metioninas iniciais das proteínas (por exemplo, Rrp41 tem duas metioninas no inicio da tradução). [0108] A proteína Rrp41 contém o sítio catalítico responsável pela atividade de RNase do exossomo. Como esta atividade não é desejada para o desenvolvimento de vacinas, os aminoácidos presentes no sítio ativo foram trocados, tomando por base resultados publicados (Navarro MV et al. 2008. Insights into the mechanism of Progressive RNA degradation by the archaeal exosome. J Biol Chem. 283:14120-14131). Nesse trabalho é mencionado que a dupla mutação R89E e K91E em Rrp41, aboliu a atividade de RNase do exossomo. No gene sintético foram feitas as trocas com R89T e K91S que resultaram em uma mudança menor na carga da molécula em comparação com as mutações relatadas na literatura. [0109] Assim, a atividade de ligação da proteína Rrp4 (que contém os domínios de ligação ao RNA S1 e KH) ao ssRNA foi mantida, assim como a estrutura de anel (RING) formada pelas proteínas Rrp41-Rrp42. Sem querer ficar limitado a uma teoria específica, acredita-se que o ssRNA de E. coli, o qual é co-purificado com o exossomo, pode ativar o receptor TLR7 e, assim, atuar como um adjuvante nas vacinas baseadas no exossomo. [0110] Finalmente, as sequências foram unidas na seguinte ordem: SEQ ID No: 22-SEQ ID No: 26-SEQ ID No: 23-SEQ ID No: 28-SEQ ÍD No: 24-SEQ ID No: 30-SEQ ID No: 25, para obter uma sequência completa correspondente ao diagrama da Figura 10 - SEQ ID No: 32. [0111] As sequências das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42, com as modificações nos extremos amino e carboxila terminal contidas na sequência SEQ ID No: 32 estão apresentadas nas sequências SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 34 e SEQ ID No: 35, respectivamente. [0112] Adicionalmente, um DNA de dupla fita contendo a sequência SEQ ID No: 32 foi sintetizado e clonado pelos sítios Xbal e Hindlll no vetor pMRKA, como mostrado no diagrama da Figura 10, resultando no vetor pMRKA-EXO da presente invenção. [0113] De acordo com o método do quarto aspecto da presente invenção, para a construção do vetor pMRKA-EXO, o vetor pMRKA é o preferido por ser estável, com maior número de cópias por célula, quando comparado com os vetores da série pET e, além disso, por ter tamanho menor, o que facilita a clonagem de outros genes em fusão com as proteínas do exossomo de P. abyssi. O plasmídeo pMRKA-EXO compreende a SEQ ID No: 36. [0114] A Figura 11 mostra o resultado da co-purificação das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42, expressas em Escherichia coli pelo plasmídeo pMRKA-EXO.

Vetor pMRKA-RING

Anel de RNases PH do exossomo de P. abyssi [0115] O núcleo (“core") do exossomo é constituído pelo hexâmero formado pelas proteínas Rrp41 e Rrp42. Esta estrutura em forma de anel é conhecida como “RNases PH ring” e é aqui denominada de “RING” (ver Figura 12). [0116] Esta estrutura, mais simples do que a do exossomo inteiro da Figura 8, também pode ser usada para fusionar antígenos e moléculas imunorreguladoras no conceito de “partículas parecidas a patógenos” como anteriormente descritas. A atividade de RNase foi abolida mediante as mutações R89T e K91S na proteína Rrp41, enquanto foi mantida a atividade de ligação ao RNA de fita única (ssRNA). Acredita-se que o ssRNA de E. coli, que é co-purificado juntamente com o “RING” (já anteriormente detectado na estrutura cristalina deste complexo (Navarro et al., 2008)), pode ativar o receptor TLR e, assim, atuar como adjuvante, melhorando a resposta imunológica das vacinas baseadas neste complexo. [0117] A Figura 13 mostra a estratégia de clonagem para a obtenção do vetor de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, o qual contém as proteínas Rrp41 e Rrp42 de P. abyssi e é aqui denominado pMRKA-RING, o qual compreende a sequência SEQ ID No: 37. A Figura 14 mostra o resultado da co-purificação das proteínas Rrp41 e Rrp42, expressas em E. coli transformada com o plasmídeo pMRKA-RING da presente invenção.

Vetor pSUMAC [0118] Durante a caracterização individual das proteínas do exossomo de P. abyssi, foi verificado que a Rrp42 se mostrou mais solúvel e termoestável em comparação com as proteínas Rrp4 e Rrp41. A análise desta proteína por gel-filtração mostra um raio de giro correspondente a uma estrutura trimérica, como pode ser visualizado no modelo estrutural da Figura 15. [0119] Da mesma forma que os vetores comerciais, tais como MBP, GST e SUMO, para fusão de proteínas recombinantes, essas características da proteína Rrp42 (alta expressão, solubilidade, termoestabilidade e multimerização) são extremamente úteis na produção de uma proteína, por exemplo, imunogênica, de fusão para incrementar a solubilidade de proteínas recombinantes. [0120] A proteína Rrp42 foi testada, por meio do programa BepiPred 1.0 (www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred), durante o desenvolvimento de vacinas recombinantes, tendo sido comprovada a sua maior imunogenicidade em comparação com outras moléculas usadas como carregadores de peptídeos e de proteínas, tais como ovoalbumina, BSA, cloranfenicol acetil transferase (CAT), entre outros. Em outras palavras, além de facilitar a purificação deste tipo de fusões, a Rrp42 proporciona uma maior imunogenicidade que os carregadores de proteínas recombinantes disponíveis no mercado. [0121] Assim, de acordo com um aspecto da invenção, foi construído um vetor para expressão em fusão com a proteína Rrp42. A Figura 16 mostra a estratégia da clonagem usada para atingir essa finalidade. [0122] A sequência correspondente à proteína Rrp42 foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pMRKA-EXO, usando os seguintes oligonucleotídeos: P42-For- SEQ ID No: 38 Ndel ACCATATGGGTTCTGATAATGAAATCGTG P42-Rev (SEQ ID No: 39) PstI BamHI Xhol AACTGCAGGGATCCCTCGAGACCACCCTGTTTGGCCTTCTCAACAGC [0123] Foram sublinhadas as sequências dos sítios de corte para as enzimas de restrição Ndel, Pstl, BamHI e Xhol. O fragmento de DNA amplificado foi digerido com as enzimas Ndel e Pstl e clonado nos sítios correspondentes no vetor pMRKA, como mostrado na Figura 16. Desta forma, foi obtido, de acordo com o segundo aspecto da invenção, o vetor pSUMAC para expressão de proteínas recombinantes em fusão com a proteína Rrp42, vetor esse que compreende a SEQ ID No: 40. [0124] A Figura 17 mostra o resultado da lise térmica das células de E. coli transformadas com o plasmídeo pSUMAC. [0125] Como pode ser verificado a partir da descrição precedente, o pMRKA é um vetor de expressão T7 de E. coli, com alto número de cópias por célula e é altamente estável em condições de fermentação com alta densidade celular. Esse vetor, que corresponde ao primeiro aspecto da invenção, pode ser usado para expressão de proteínas recombinantes com ou sem a fusão N-terminal da cauda 6xHis. [0126] Adicionalmente, de acordo com o segundo aspecto da invenção, os vectores pMRKA-EXO, pMRKA-RING e pSUMAC são vetores derivados do pMRKA para expressão de proteínas de fusão C- ou N-terminal com os componentes do exossomo de Pyrococcus abyssi. [0127] Em resumo, o vetor pMRKA-EXO compreende o vetor pMRKA e as sequências gênicas codificantes das proteínas Rrp4-Rrp41-Rp42 do exossomo de Pyrococcus abyssi] o vetor pMRKA-RING compreende o vetor pMRKA e as sequências gênicas codificantes das proteínas Rrp41-Rp42 do exossomo de Pyrococcus abyssr, e o vetor pSUMAC compreende o vetor pMRKA e a sequência gênica codificante da proteína Rp42 do exossomo de Pyrococcus abyssi. [0128] De acordo com o segundo aspecto da invenção, o pMRKA-EXO e o pMRKA-RING podem ser usados para a co-expressão e purificação de vários antígenos ao mesmo tempo, fusionados aos componentes do exossomo, com o intuito de formar partículas semelhantes a patógenos. [0129] Ainda de acordo com o segundo aspecto da invenção, o plasmídeo pSUMAC pode ser usado como carregador de vacinas peptídicas, conferindo maior solubilidade, termoestabilidade a tais vacinas e facilitando a purificação por desnaturação térmica das proteínas do hospedeiro (E. coli). Esta característica é única entre as proteínas de fusão e carregadores usadas atualmente, facilitando enormemente a produção de proteínas recombinantes em escala industrial com baixo custo. [0130] Adicionalmente, os plasmídeos de fusão com as proteínas do exossomo de arquea, ou seja, pMRKA-EXO, pMRKA-RING e pSUMAC, conferem maior estabilidade às proteínas recombinantes produzidas, tanto na formulação como no armazenamento do produto acabado contendo as mesmas. [0131] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, são providos vetores derivados do plasmídeo pMRKA que além de compreenderem a fusão deste plasmídeo a proteínas carregadoras de P. abyssi, eles também incluem pelo menos uma sequência com atividade imunomoduladora, particularmente pelo menos uma sequência do domínio Z, o que confere, aos complexos de polípeptídeos resultantes, características de inunomodulação da atividade antigênica de ditos complexos. O domínio Z é um derivado do domínio de ligação de imunoglobulinas da proteína A de Staphylococcus aureus (Ljungberg, et al. (1993) “The interaction between different domains of staphylococcal protein A and human polyclonal IgG, IgA, IgM and F(ab)2: separation of affinity from specificity”. Mol. Immunol. 30:1279-1285). Este domínio tem capacidade de estimular a resposta imune (Bekeredjian-Ding et al. (2007) “Staphylococcus aureus Protein A Triggers T Cell-lndependent B Cell Proliferation bySensítizing B Cells for TLR2 Ligands”. J Immunol.178:2803-2812), característica esta que pode ser usada para dirigir a interação dos antígenos quiméricos com as células apresentadoras de antígenos, com a finalidade de incrementar a resposta imunológica de vacinas. Recentemente, Miyata et al. (Miyata et al., 2011, “Tricomponent immunopotentiating system as a novel molecular design strategy for malaria vaccine development”. Infect Immun. 79:4260-75) mostraram a eficácia de um complexo contendo um antígeno de malária, o domínio-Z e uma sequência de polimerização, onde o domínio-Z teve um papel essencial para indução de uma resposta imuno-protetora, [0132] Miyata et al. (2011) relatam a dificuldade de produção do complexo obtido por eles devido à formação de corpúsculos de inclusão que precisam passar por desnaturação e re-enovelamento para obter o complexo em forma solúvel. Ao contrário dos resultados obtidos por esses pesquisadores, os complexos obtidos na presente invenção são solúveis e facilmente purificados. [0133] Além do domínio-Z, há outros domínios imunogênicos que podem ser utilizados na presente invenção para conferir atividade imunomoduladora aos complexos de poliproteínas obtidas a partir dos vetores da presente invenção. [0134] A seguir são providos exemplos que ilustram e representam concretizações específicas da invenção. Os exemplos a seguir não devem ser interpretados como limitativos da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: - Preparo do inóculo: [0135] Descongelamento de alíquota da cepa produtora e inoculação em meio LB-kanamicina. [0136] Em seguida a mistura é cultivada e agitada em Shaker, em erlemmeyer de 1L com 200 ml de LB-KAN (25 pg/ml). Cultura a 37°C, 200 rpm por 14-16 horas (DOeoonmde 1 a 2). - Fermentação: [0137] A cultura obtida na etapa anterior é transferida para dorna com 5 Litros do meio complexo para cultura em alta densidade (MCHD). Após atingir DOeoonm de 20) se inicia a indução por alimentação com Lactose, ate completar por 22 horas de cultura. - Coleta das células. [0138] As células são coletadas por centrifugação a 6000 rpm por 30 minutos, na temperatura de 8°C em garrafas de 1 litro. - Lise celular. [0139] As células são ressuspendidas no tampão (5ml por grama de pellet): [0140] 30mM Tris-HCI pH 9,0; 0,1% Triton X-100; 5mM 2- mercaptoetanol. [0141] Em seguida as células são tratadas por 1 hora a 90°C, em banho Maria, homogeneizando cada 10 minutos em homogeneizador Turrax (5000 rpm). - Clarificação do lisado. [0142] As células lisadas e homogeneizadas são submetidas à filtração através de membrana de 0,2 pm em temperatura ambiente. - Tratamento com a enzima benzonase. [0143] O material filtrado é tratado com a enzima benzonase por 8 horas à temperatura de 37°C, para eliminar os ácidos nucléicos contaminantes. - Filtração na membrana de 100 kDa. [0144] A retirada dos restos de ácidos nucléicos digeridos e da benzonase e condicionamento final da proteína recombinante no tampão de armazenamento feita por diafiltração no sistema de filtração de fluxo tangencial, através de membrana oca de 100 kDa. - Filtração estéril na membrana de 0,2 pm. [0145] Finalmente, é realizada uma filtração em ambiente estéril através de membrana de 0,2 pm. O lote produzido é armazenado em forma estéril até seu uso a 4°C. [0146] O processo fermentativo descrito neste Exemplo 1 corresponde a uma metodologia geral que pode ser empregada na preparação e purificação de poliproteínas e complexos de poliproteínas obtidas a partir dos vetores da presente invenção.

Exemplo 2: Fusão dos domínios Z-Z da proteína A de Staphvlococcus aureus na proteína Rrp42 do exossomo de Pvrococcus abvssi [0147] A atividade imunomoduladora do domínio-Z junto ao complexo de proteínas do exossomo, que na presente invenção é usado como carregador de antígenos, foi verificada por meio da síntese de um gene (SEQ ID No: 41), que codifica uma sequência de aminoácidos através da expressão, em tandem, de duas cópias do domínio-Z, aqui denominados de domínios Z-Z (SEQ ID No: 42). A sequência de nucleotídeos (SEQ ID No: 41) foi clonada em fusão na região correspondente à extremidade N-terminal da proteína Rrp42, usando os sítios Ncol e Sall nos plasmídeos pMRKA-EXO e pMRKA-RING. As Figuras 18 e 19 apresentam os diagramas representativos desta estratégia, resultando nos plasmídeos pMRKA-ZZ-EXO (SEQ ID No: 43) e pMRKA-ZZ-RING (SEQ ID No: 45) ), respectivamente, e consequentemente na expressão da proteína Rrp42 com a fusão do domínio Z-Z na sua extremidade N-terminal (SEQ ID No: 44). [0148] Para verificar se a fusão dos domínios Z-Z interfere na termoestabilidade e purificação dos complexos relacionados ao exossomo de Pyrococcus abyssi, células competentes de Rosetta (DE3) foram transformadas com os plasmídeos pMRKA-ZZ-EXO e pMRKA-ZZ-RING. Após a transformação foi realizado um experimento de indução da proteína recombinante. Ao final da indução, as células foram recuperadas, ressuspendidas em tampão 30mM Tris-HCI pH 8,0 e lisadas por homogeneização em alta pressão (105 kPa (1000 Bar)). O homogeneizado foi incubado a 80°C por 30 minutos e resfriado em gelo por 5 minutos antes de centrifugar por 30 minutos a 15000xg. O lisado tratado termicamente e clarificado foi carregado em uma coluna cromatográfica empacotada com a resina Q-sepharose XL e equilibrado com o tampão de lise (30mM Tris-HCI pH 8,0). Após lavagem da coluna com o mesmo tampão, a proteína ligada foi eluída com gradiente de NaCI (0-500 mM) no mesmo tampão. As Figuras 20 e 21 mostram o resultado da purificação dos complexos ZZ-EXOSSOMO e ZZ-RING, respectivamente. [0149] Os resultados mostrados nas Figuras 20 e 21 indicam que a fusão com os domínios Z-Z não interfere nem na solubilidade nem na estabilidade dos complexos do exossomo inteiro e do anel (RING) do exossomo, e que é possível obtê-los com alto grau de pureza em apenas uma etapa cromatográfica. [0150] Em cada complexo há três cópias da proteína Rrp42 (ver Figura 8 e Figura 12), portanto, também há três cópias dos domínios Z-Z, resultando num total de 6 domínios-Z por complexo, o que pode facilitar a interação destes complexos com as células apresentadoras de antígenos. Ainda ficam livres os extremos C-terminal das proteínas do exossomo para fusionar antígenos, o que representa maior capacidade do que o complexo descrito no trabalho de Miyata et al. Portanto, os plasmídeos pMRKA-ZZ-EXO (SEQ ID No: 43) e pMRKA-ZZ_RING (SEQ ID No: 45), também podem ser usados para carregar antígenos na parte do Exossomo e do anel do núcleo do exossomo, respectivamente, em conjunto com os domínios Z-Z.

Exemplo 3: Obtenção de complexos de proteínas contendo antígenos de Mvcoplasma hyopneumoniae [0151] O Mycoplasma hypneumoniae é um dos principais agentes patogênicos que afetam a suinocultura. Diversos candidatos vacinais já foram identificados, porém nenhum deles, separadamente, consegue induzir proteção contra esta doença no mesmo nível que as bacterinas comerciais. Com o intuito de usar o complexo exossômico para carregar vários antígenos do Mycoplasma hypneumoniae, foram sintetizados três genes codificando as proteínas quiméricas: P36-MHP271; P46-P97R1R2 e HSP70-NrdF, correspondentes aos pares de antígenos vacinais. Os genes sintéticos foram clonados no vetor pMRKA-EXO pelos sítios Bglll-Kpnl; BamHI-EcoRI e Xhol-Hindlll, respectivamente. [0152] O plasmídeo resultante pMRKA-EXOMYC consegue expressar as seguintes poliproteínas: - Rrp4- P36 - MHP271 (80,5 kDa) - Rrp41 - P46 - P97R1R2 (82,7 kDa) - Rrp42 - HSP - NrdF (72,6 kDa). [0153] De forma semelhante, os genes das proteínas quiméricas P46-P97R1R2 e HSP70-NrdF, foram clonados no vetor pMRKA-RING pelos sítios BamHI-EcoRI e Xhol-Hind111, respectivamente, obtendo-se o plasmídeo pMRKA-RINGMYC que expressa as poliproteínas: - Rrp41 - P46 - P97R1R2 (82,7 kDa) - Rrp42 - HSP - NrdF (72,6 kDa) [0154] Finalmente o gene da proteína quimérica HSP70-NrdF foi clonado no vetor pSUMAC pelos sítios Xhol-Hind111, obtendo-se o plasmídeo pSUMAC-MYC que expressa a poliproteína: (a) Rrp42 - HSP - NrdF (72,6 kDa). [0155] As células competentes de Rosetta (DE3) foram transformadas com os plasmídeos pMRKA-EXOMYC, pMRKA-RINGMYC pSUMAC-MYC. Após a transformação, foi realizado um experimento de indução para visualizar as bandas induzidas em cada cepa transformante. A Figura 23 mostra o resultado deste experimento. [0156] O resultado da Figura 23 confirma a expressão de poliproteínas através dos vetores da presente invenção, incluindo a co-expressão de 3 poliproteínas num único vetor, fato inédito no estado da técnica. A banda induzida que migra entre os marcadores de 66 e 97 kDa corresponde à poliproteína Rrp42-P216A-HSP-NrdF (expressa pelo plasmídeos pMRK-Rrp42-EXO, comparar as canaletas 3 da Figura 23). Também é possível concluir, pela comparação das proteínas induzidas pelo pMRK-EXOMYC (canaletas 1 de Figura 23) e pelo pMRK-RING-MYC (canaletas 2 de Figura 23), que existe a sobreposição na migração das bandas correspondentes às poliproteínas Rrp4-P216B-P36-MΗP271 (80,5 kDa) e Rrp41-P46-P97R1 R2 (82,7 kDa) no gel de SDS-PAGE.

Exemplo 4: Purificação do complexos de proteínas contendo antíqenos de Mycoplasma hyopneumoniae [0157] A cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) transformada com o plasmídeo pMRK-EXOMYC foi crescida em 200 ml de meio LB contendo canamicina (25 pg/ml). A cultura foi incubada a 37°C, a 200 rpm, por 16 horas. [0158] Os 200 ml de cultura foram inoculados em 5 Litros do meio MCHD (Meio Complexo de Alta Densidade) em fermentador de 15 litros. A fermentação foi realizada em regime constante de batelada alimentada, a 37°C, 30% de oxigênio dissolvido, tendo glicerol como fonte de carbono. Na DOeoonm = 15, a alimentação por glicerol foi trocada por lactose (indução) e a fermentação continuou por mais 12 horas a 28°C. [0159] As células foram coletadas por centrifugação a 6000 rpm por 30 minutos e ressuspendidas no tampão de lise (50 mM Tris-HCI, pH 8,0; 0,1% Triton X-100; 0,25% Sarcozyl) e lisadas no homogeneizador de alta pressão. [0160] As células lisadas e homogeneizadas foram submetidas a filtração através de membrana de 0,2 pm (sistema “end-filtration” millipore) à temperatura ambiente. [0161] MgCL foi adicionado até a concentração final de 5mM e Benzonase 90 pg/mL (concentração final), e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 6 horas. [0162] O material tratado com Benzonase foi concentrado e diafiltrado no sistema de filtração tangencial usando uma membrana de fibra oca de 500 kDa de MWCO, no tampão 20 mM Tris-HCI, pH 8,0; 100mM NaCI e 0,1 mM EDTA. A proteína retida é esterilizada por microfiltração com membrana de 0,2 pm e armazenada a 4°C. A Figura 24 mostra o resultado da co-purificação das poliproteínas que compõem o complexo Exomyc. A indução de formação de anticorpos contra cada um dos antígenos de M. hyopneumoniae incluídos no complexo (dados não mostrados) corrobora a utilidade do complexo do exossomo de P. abyssi como carregador de antígenos de grande complexidade.

Exemplo 5: Purificação da proteína de fusão Rrp42-inibina [0163] A vacinação com a inbina é uma técnica promissora no campo da fertilização de animais, assim como para incrementar a produção de ovos em aves. No estado da técnica podem ser encontrados numerosos estudos sobre esta aplicação. Esta vacina evitaria o uso de hormônios que são mais difíceis e caros de produzir e formular (ver Findlay et al. (1993) “Inhibin as a fecundity vaccine”. Animal Reproduction Science. 33: 325-343. [0164] O antígeno mais usado para este tipo de vacina é um peptídeo contendo os primeiros 29 aminoácidos da subunidade alfa da inibina conjugado com proteínas carregadoras para estimular a resposta imunológica. Mesmo assim, a resposta imune é baixa. Para melhorar a resposta são usadas grandes quantidades do antígeno de fusão, chegando a quantidades de 1 até 5 mg por dose, e aplicação de até 5 doses (ver Wang et al. (2009) “The long-term effect of activeimmunization against inhibin in goats”. Theriogenology. 71: 318-22). [0165] A presente invenção tornou possível o desenho e síntese de um gene que codifica uma proteína de 49 aminoácidos que contém as regiões mais imunogênicas da alfa-inibina. Esta sequência foi clonada pelos sítios Xhol e Hindlll no vetor pSUMAC, como mostrado na Figura 25. A proteína contendo regiões mais imunogênicas da inibina e sua obtenção são detalhadas no pedido copendente PI102014005376-0. [0166] A cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) transformada com o plasmídeo pSUMAC-IniOF foi crescida em 200 ml de meio LB canamicina (25 ug/ml). A cultura foi incubada a 37°C, a 200 rpm, por 16 horas. A cultura foi usada para inocular 5 Litros do meio MCHD (Meio Complexo de Alta Densidade) para realizar uma fermentação do mesmo modo que no exemplo anterior. [0167] Após a fermentação, as células foram coletadas por centrifugação a 6000 rpm por 30 minutos, na temperatura de 8°C em garrafas de 1 litro e ressuspendidas no tampão 30mM Tris-HCI pH 8,0; 0,1% Triton X-100. As células foram incubadas por 1 hora a 90°C, em banho-maria, homogeneizando a cada 10 minutos em homogeneizador Turrax (5000 rpm). [0168] As células lisadas termicamente foram submetidas à filtração através de membrana de 0,2 pm em temperatura ambiente, para clarificar o lisado. O material filtrado é tratado com a enzima benzonase por 8 horas à temperatura de 37°C, para eliminar os ácidos nucléicos contaminantes. A retirada dos restos de ácidos nucléicos digeridos e da benzonase, para acondicionamento final da proteína recombinante no tampão de armazenamento, foi feita por diafiltração no sistema de filtração de fluxo tangencial, através de membrana oca de 100 kDa. [0169] A Figura 26 ilustra o resultado da fermentação e do produto final purificado empregando apenas filtração tangencial. [0170] Os resultados mostrados indicam que a fusão com as proteínas do exossomo de Pyrococcus abyssi, não obstante sua complexidade, resulta na expressão de proteínas solúveis no citoplasma de Escherichia coli. Em alguns casos, estas proteínas de fusão também são termo-resistentes, fato que pode ser aproveitado para a purificação das proteínas recombinantes de uma forma simples, por tratamento térmico para remover as proteínas contaminantes provenientes de E. coli, um microrganismo que é mesotérmico.

Claims

1. VETOR DE EXPRESSÃO T7 de Escherichia coli, caracterizado por: (a) ter alto número de cópias por célula; (b) ser altamente estável em condições de fermentação de alta densidade celular; (c) ter tamanho de cerca de 2Kpb a 4Kpb ; e (d) ter um marcador de resistência a antibiótico,

2. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter de 300 a 500 cópias por célula.

3. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estabilidade em condições de fermentação de alta densidade celular é conferida pela presença da sequência pardo plasmídeo pSC101.

4. VETOR, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência par compreende a SEQ ID No: 11.

5. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito marcador de resistência a antibiótico é o gene de resistência a canamicina.

6. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser o plasmídeo pMRKA e compreender a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 19.

7. VETOR PARA EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE FUSÃO A PROTEÍNAS CARREGADORAS, caracterizado pelo fato de compreender: (a) um vetor como definido em qualquer das reivindicações 1 a 6; e (b) pelo menos um gene do exossomo de P. abyssi codificante de pelo menos uma proteína carregadora de proteínas imunogênicas, antígenos ou moléculas imunorreguladoras.

8. VETOR, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender o gene do exossomo de P. abyssi codificantes de pelo menos uma das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42,

9. VETOR, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender os genes do exossomo de P. abyssi codificantes de pelo menos duas das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42.

10. VETOR, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender os genes do exossomo de P. abyssi codificantes das três proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42.

11. VETOR, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser o plasmídeo pMRKA-EXO e compreender a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 36.

12. VETOR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender os genes do exossomo de P. abyssi codificantes das proteínas Rrp41 e Rrp42,

13. VETOR, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser o plasmídeo pMRKA-RING e compreender a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 37.

14. VETOR, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender o gene do exossomo de P. abyssi codificante da proteína Rrp42.

15. VETOR, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser o plasmídeo pSUMAC e compreender a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 40.

16. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender pelo menos uma sequência gênica de imunorregulação.

17. VETOR, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma sequência gênica de imunorregulação é a sequência do domínio Z da proteína A de S. aureus.

18. VETOR, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que dita sequência do domínio Z da proteína A de S. aureus é uma sequência de nucleotídeos Z-Z que compreende a SEQ ID No: 41 codificante da proteína de SEQ ID No: 42.

19. VETOR, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucleotídeos Z-Z compreendendo a SEQ ID No: 41 é clonada em fusão na região codificante da extremidade N-terminal de dita Rrp42 compreendida no plasmídeo pMRKA-EXO, resultando no vetor pMRKA-ZZ-EXO que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 43.

20. VETOR, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucleotídeos Z-Z compreendendo a SEQ ID No: 41 é clonada em fusão na região codificante da extremidade N-terminal de dita Rrp42 compreendida no plasmídeo pMRKA-RING, resultando no vetor pMRKA-ZZ-RING que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID No: 45.

21. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO, como definido nas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) troca do gene de resistência à ampicilina no vetor de SEQ ID No: 1 pelo gene de resistência à canamicina; (ii) amplificação do fragmento do plasmídeo de SEQ ID No: 1 correspondente ao segmento localizado entre os nucleotídeos 804 a 1857; (iii) ligação dos segmentos amplificados da etapa (ii) com o gene de resistência à canamicina; (iv) amplificação do plasmídeo obtido na etapa (iii) para inserir sítios de restrição na base 2607 do plasmídeo pMK; (v) amplificação da sequência par e inserção da sequência amplificada resultante entre os sítios de restrição localizados na base 2607 do pMK para obtenção do plasmídeo pMRK; e (vi) eliminação dos sítios de restrição de Bglll e Ncol no gene de resistência à canamicina no vetor pMRK para obtenção do plasmídeo pMRKA.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que dita troca do gene de resistência da etapa (i) é realizada por amplificação do segmento obtido a partir dos primers de SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 3, sendo que o segmento amplificado compreende a SEQ ID No: 4.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que dita amplificação da etapa (ii) é realizada a partir dos primers de SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que dita ligação da etapa (iii) resulta no plasmídeo pMK que compreende a SEQ ID No: 8.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que dita amplificação da sequência par da etapa (v) é realizada a partir dos primers de SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10, resultando na sequência amplificada SEQ ID No: 11.

26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que dito plasmídeo pMRK é obtido por ampliação do plasmídeo pMK, a partir dos primers de SEQ ID No: 12 e SEQ ID No: 13, e inserção da SEQ ID No: 11, resultando no plasmídeo de SEQ ID No; 14.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que dita eliminação dos sítios de restrição de Bglll e Ncol no gene de resistência à canamicina da etapa (vi) é feita por mutagênese sítio dirigida, sendo que a eliminação do dito sítio de restrição de Bglll é feita utilizando os primers de SEQ ID No: 15 e SEQ ID No: 16; e a eliminação do dito sítio de restrição de Ncol é feita utilizando os primers de SEQ ID No: 17 e SEQ ID No: 18.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de que dito plasmídeo pMRKA compreender a SEQ ID No: 19.

29. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO, como definido nas reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) preparação do plasmídeo pMRKA de acordo com o método definido nas reivindicações -21 a 28; (ii) preparação de pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi codificante de pelo menos uma proteína carregadora de proteínas imunogênicas, antígenos ou moléculas imunorreguladoras; (iii) síntese de um DNA de dupla fita contendo a dita pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi; e (iv) clonagem do dito DNA de dupla fita obtido na etapa (iii) no dito plasmídeo pMRKA.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita clonagem da etapa (iv) é feita entre os sítios Xbal e Hindlll do plasmídeo pMRKA.

31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 e 30, caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi da etapa (ii) compreende as sequências gênicas codificantes das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42 do exossomo de P. abyssi.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que adicionalmente serem providas sequências SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25 para permitir a clonagem por fusão ditas sequências gênicas codificantes das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42 do exossomo de P. abyssi.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências gênicas compreendem as sequências SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 28 e SEQ ID No: 30, codificantes das proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42, respectivamente, do exossomo de P. abyssi.

34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que as sequências gênicas do exossomo de P. abyssi são unidas na ordem SEQ ID No: 22-SEQ ID No: 26-SEQ ID No: 23-SEQ ID No: 28-SEQ ID No: 24-SEQ ID No: 30-SEQ ID No: 25.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a união das ditas sequências gênicas forma a SEQ ID No: 32.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de adicionalmente ser sintetizado um DNA de dupla fita compreendendo a SEQ ID No: 32 que é clonado no plasmídeo pMRKA, entre os sítios Xbal e Hindlll, para formar a SEQ ID No: 36 que está compreendida no plasmídeo pMRKA-EXO.

37. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 e 30, caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi da etapa (ii) compreende as sequências gênicas codificantes das proteínas Rrp41 e Rrp42 do exossomo de P. abyssi.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências gênicas compreendem as sequências SEQ ID No: 28 e SEQ ID No: 30, codificantes das proteínas Rrp41 e Rrp42, respectivamente, do exossomo de P. abyssi.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que ditas sequências gênicas do exossomo de P. abyssi foram amplificadas a partir do plasmídeo pMRKA-EXO para formar a SEQ ID No: 37 que está compreendida no plasmídeo pMRKA-RING.

40. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 e 30, caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma sequência gênica do exossomo de P. abyssi da etapa (ii) compreende a sequência gênica codificante da proteína Rrp42 do exossomo de P. abyssi.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a dita sequência codificante da proteína Rrp42 do exossomo de P. abyssi foi amplificada a partir do plasmídeo pMRKA-EXO, empregando os oligonucleotídeos de SEQ ID No: 38 e SEQ ID No: 39.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o fragmento de DNA resultante da amplificação das sequências SEQ ID No: 38 e SEQ ID No: 39 foi clonado no vetor pMRKA para formar a SEQ ID No: 40 que está compreendida no plasmídeo pSUMAC.

43. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 42, caracterizado pelo fato de adicionalmente incluir nos plasmídeos pMRKA-EXO e pMRKA-RING pelo menos uma sequência gênica de imunorregulação.

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma sequência gênica de imunorregulação é a sequência do domínio Z da proteína A de S. aureus para a expressão em tandem de duas cópias do domínio-Z, domínios Z-Z, que é clonada em fusão com a região codificante da extremidade N-terminal da proteína Rrp42 compreendida nos vetores pMRKA-EXO e pMRKA-RING.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que dita sequência gênica codificante dos domínios Z-Z é clonada em fusão com a região codificante da extremidade N-terminal da proteína Rrp42 entre os sítios Ncol e Sall nos plasmídeos pMRKA-EXO e pMRKA-RING.

46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de ser produzido o vetor pMRKA-ZZ-EXO que compreende a SEQ ID No: 43.

47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de ser produzido o vetor pMRKA-ZZ-RING que compreende a SEQ ID No: 45.

48. USO DOS VETORES DE EXPRESSÃO, definidos nas reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser na expressão de proteínas recombinantes, antígenos e complexos imunogênicos.

49. USO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de o vetor ser o plasmídeo pMRKA.

50. USO DOS VETORES DE EXPRESSÃO, definidos nas reivindicações 7 a 15, caracterizado por ser na expressão de proteínas recombinantes, antígenos e complexos imunogênicos fusionados a proteínas carregadoras.

51. USO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de ditas proteínas carregadoras são proteínas do exossomo de P. abyssi, preferencialmente as proteínas Rrp4, Rrp41 e Rrp42.

52. USO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de o vetor ser o plasmídeo selecionado de pMRKA-EXO e pMRKA-RING, sendo dito vetor especialmente utilizável na expressão e co-purificação de proteínas recombinantes para formar partículas semelhantes a patógeno.

53. USO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de o vetor ser o plasmídeo pSUMAC que é especialmente utilizável na obtenção de proteínas carregadoras de vacinas peptídicas.

54. USO DOS VETORES DE EXPRESSÃO definidos nas reivindicações 16 a 20, caracterizado por ser na expressão de proteínas recombinantes, antígenos e complexos imunogênicos fusionados a proteínas carregadoras e tendo adicionalmente atividade imonomodularora