Област на техникатаTechnical field

Изобретението се отнася до средство за селективно потискане активността на патологични автореактивни В клетки при автоимунни заболявания.The invention relates to a means of selectively inhibiting the activity of pathologic autoreactive B cells in autoimmune diseases.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Известно е, че поради съчетание на недостатъчно изяснени генетични фактори и на въздействия от окръжаващата среда, при около 2 % от хората се развиват различни автоимунни заболявания. При тях имунната система започва да атакува собствените си органи и тъкани със специфични автоантитела или с автореактивни 'Tлимфоцити. В резултат на тази автоимунна атака се отключва възпалителен процес, който в повечето случаи води до унищожаване или до сериозно увреждане на прицелния орган или тъкан. В зависимост от броя на атакуваните органи, автоимунните заболявания се разделят на системни и органо-специфични. Съвременните противовъзпалителни и имуносупресивни средства само забавят развитието на тези болести, но не повлияват тяхната първопричина. Освен това тези лечебни препарати имат и вредни странични въздействия.It is known that due to a combination of poorly understood genetic factors and environmental influences, about 2% of people develop various autoimmune diseases. In them, the immune system begins to attack its own organs and tissues with specific autoantibodies or autoreactive 'Tymphocytes'. As a result of this autoimmune attack, the inflammatory process is unlocked, which in most cases leads to destruction or serious damage to the target organ or tissue. Depending on the number of organs attacked, autoimmune diseases are divided into systemic and organ-specific. Modern anti-inflammatory and immunosuppressive agents only delay the development of these diseases but do not affect their root cause. In addition, these medications have harmful side effects.

Логична мишена за терапевтична интервенция при автоимунни заболявания са патологичните автореактивни В клетки. Известно е, че при мишки линия (NZB х NZW)F1, които спонтанно развиват подобно на лупус заболяване, свързаните с него автоантитела се секретират от В-1 клетките. Продължителното и избирателно отстраняване на тези клетки от най-ранна възраст предотвратява развитието на гломерулонефрита и значително увеличава продължителността на живота при тези животни /1/. Този подход не е ефективен при пациенти с лупус и при мишки от линията MRL/Ipr, също развиващи спонтанно лупусоподобно заболяване, тъй като анти-ДНК специфичните В клетки при тях са от типа В-2.Pathologic autoreactive B cells are a logical target for therapeutic intervention in autoimmune diseases. In mouse (NZB x NZW) F1 mice that spontaneously develop lupus-like disease, autoantibodies associated with it are known to be secreted by B-1 cells. Prolonged and selective removal of these cells from an early age prevents the development of glomerulonephritis and significantly increases the life span of these animals (1). This approach is not effective in patients with lupus and MRL / Ipr mice also developing spontaneously lupus-like disease, since the anti-DNA specific B cells in them are of type B-2.

Изследванията на Courts, S. М. et al., 1996 и Furie, R., et al., 2001 показват, че за избирателното инактивиране на патологични В клетки може да се предизвика едносигнална анергия по антигенспецифичен начин. За тази цел повърхностният имуноглобулинов рецептор на В клетките се ангажира със структура, която съдържа олиговалентни В клетъчни епитопи, имобилизирани върху неимуногенен носител. Такава структура не трябва да съдържа Т клетъчни епитопи. Пример за такъв В клетъчен толероген е LJP394, който in vivo инактивира В клетките, специфични за нативната ДНК при BXSB мишки, развиващи спонтанна, наподобяваща лупус болест. Прилагането на този имуномодулатор удължава преживяемостга им и води до потискане на бъбречното увреждане. LJP394 вече е показал обещаващи резултати и при втората фаза от клиничните изпитания /2,3/.Studies by Courts, S. M. et al., 1996 and Furie, R., et al., 2001 show that selective inactivation of pathologic B cells can induce single-signal energy in an antigen-specific manner. For this purpose, the B cell surface immunoglobulin receptor engages a structure that contains oligovalent B cell epitopes immobilized on a non-immunogenic carrier. Such a structure should not contain T cell epitopes. An example of such a B cell tolerogen is LJP394, which in vivo inactivates B cells specific for native DNA in BXSB mice developing spontaneous, lupus-like disease. Administration of this immunomodulator prolongs their survival and suppresses renal impairment. LJP394 has already shown promising results in the second phase of clinical trials / 2,3 /.

BG 108155 описва средство за селективно потискане на патологични автореактивни В клетки, което представлява химерна антитялова молекула, свързваща се едновременно както към имуноглобулиновите рецептори на В-лимфоцитите със специфичност към ДНК, така и към потискащите рецептори от типа FcraMaRIIB. Действието на това средство се ограничава до В-клетките, експресиращи имуноглобулинови рецептори от IgG изотип. В нито един от цитираните документи, обаче, не се споменава за рецептора CD22, използван като прицелна молекула за имунотерапевтично въздействие.BG 108155 describes an agent for the selective inhibition of pathologic autoreactive B cells, which is a chimeric antibody molecule that binds both to B-lymphocyte immunoglobulin receptors with specificity for DNA and to FcraMaRIIB-type inhibitors. The action of this agent is limited to B cells expressing immunoglobulin receptors of the IgG isotype. However, none of the documents cited refers to the CD22 receptor used as a target molecule for immunotherapy.

От друга страна, добре известен е потискащият ефект на повърхностния рецептор CD22 върху функциите на В-лимфоцитите /4-6/. Все още не е ясно кой е физиологичният му лиганд, но е установено, че рецепторът се свързва с полизахариди с крайна 2,6 сиалова киселина. Когато В-лимфоцитът е в неактивирано състояние, CD22 е в неактивна (маскирана) форма /7/. Специфичните към ДНК В клетки са несъмнено активирани при автоимунно заболяване (лупус) и техният повърхностен рецептор CD22 е в състояние да взаимодейства със своите естествени или целенасочено синтезирани лиганди. Рецепторът е съставен от седем домена от имуноглобулинов тип, експресирани на клетъчната повърхност, а в цитоплазмената си опашка съдържа сигнални мотиви, отговорни за предаването на инхибиращ вътреклетъчен сигнал. Известно е, че когато се въздейства едновременOn the other hand, the suppressive effect of the CD22 surface receptor on B-lymphocyte function is well known (4-6). It is not yet clear what its physiological ligand is, but the receptor has been found to bind to polysaccharides with the final 2,6 sialic acid. When the B lymphocyte is in the inactive state, CD22 is in the inactive (masked) form (7). DNA-specific B cells are undoubtedly activated in autoimmune disease (lupus) and their surface receptor CD22 is able to interact with their natural or purposefully synthesized ligands. The receptor is composed of seven immunoglobulin-type domains expressed on the cell surface, and in the cytoplasmic tail contains signaling motifs responsible for the transmission of an inhibitory intracellular signal. It is known that when acting simultaneously

65954 Bl но върху CD22 посредством неговият лиганд или с моноклонално антитяло и с мембранния имуноглобулинов рецептор от изотип IgM на същата В клетка, нейната активност се потиска /8, 9/.65954 Bl but on CD22 by its ligand or monoclonal antibody and membrane immunoglobulin receptor of the IgM isotype of the same B cell, its activity is inhibited (8, 9).

Декапептидът с аминокиселинна последователност DWEYSVWLSN е известен с това, че наподобява в антигенно отношение нативната ДНК. Доказано е, че той се разпознава от патологичните миши IgG антитела срещу нативната ДНК и при имунизиране на мишки с пептида се индуцира синтезата на антитела със същата специфичност и се наблюдават типичните за лупуса бъбречни увреждания /10/.The decapeptide of the amino acid sequence DWEYSVWLSN is known to resemble native DNA in antigenic terms. It has been shown that it recognizes pathological mouse IgG antibodies against native DNA, and upon immunization of mice with the peptide induces the synthesis of antibodies of the same specificity and lupus-specific renal lesions are observed (10).

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

По своята същност изобретението представлява химерна молекула, която потиска селективно активността на патологични автореактивни клетки посредством въздействие върху техния инхибиращ рецептор CD22.In essence, the invention is a chimeric molecule that selectively inhibits the activity of pathologic autoreactive cells by acting on their CD22 receptor inhibitory activity.

За селективното потискане на патологичните ДНК-специфични клетки, съгласно изобретението, е създадено средство, представляващо химерна молекула от носител миши имуноглобулин G, състояща се от два отделни синтетични компонента, единият от които се свързва специфично с инхибиращия повърхностен рецептор CD22, а другият - с имуноглобулиновите рецептори на В клетките с анти-ДНК специфичност (фиг. 1).For the selective suppression of pathologic DNA-specific cells according to the invention, an agent is created that is a chimeric mouse immunoglobulin G molecule molecule consisting of two separate synthetic components, one of which binds specifically to the CD22 surface receptor inhibitor and the other to immunoglobulin receptors of B cells with anti-DNA specificity (Fig. 1).

Първият от тези два синтетични компонента представлява предварително модифициран синтетичен пептид от 10 аминокиселини, поспециално пегпвдьт DWEYSVWLSN (SEQ IDNO. 1) /10/, който в антигенно отношение наподобява нативна ДНК и към чийто С-край е добавен линкер, представляващ хексаметиленова група.The first of these two synthetic components is a pre-modified synthetic peptide of 10 amino acids, in particular DWEYSVWLSN (SEQ IDNO. 1) / 10 /, which antigenically resembles native DNA and to which a linker representing the hexamethylene group is added to the C-terminus.

Вторият синтетичен компонент, участващ в химерната молекула, съгласно изобретението представлява също предварително модифициран синтетичен пептид, по-специално пентапептидът GGPGG (SEQ ID NO. 2) с прибавен към неговия N-край олигозахариден SIN епитоп /11/, съдържащ свободен краен сиалов остатък. Към Скрая на този синтетичен пептид е добавен линкер, представляващ хексаметиленова група. От своя страна пентапептидът GGPGG е свързан ковалентно чрез хексаметиленов диаминен линкер към смола за твърдофазов синтез. За пентапеп тида се свързва епитопът SIN (търговски продукт на Calbiochem, Darmstadt, DE) посредством сериновия остатък на последния, като сиаловият остатък остава свободен. Новосинтезираният синтетичен пептид има следния схематичен вид (фигура 2).The second synthetic component involved in the chimeric molecule according to the invention is also a pre-modified synthetic peptide, in particular the pentapeptide GGPGG (SEQ ID NO. 2) with an oligosaccharide SIN epitope (11) added to its N-terminus containing a free terminal sial residue. To the end of this synthetic peptide was added a linker representing a hexamethylene group. For its part, the pentapeptide GGPGG is covalently linked via a hexamethylene diamine linker to a solid-phase synthesis resin. For the pentapepide, the epitope SIN (commercial product of Calbiochem, Darmstadt, DE) is bound via the serine residue of the latter, leaving the sial residue free. The newly synthesized synthetic peptide has the following schematic view (Figure 2).

Като молекули-носители са използвани мише моноклонално IgG2a антитяло, получено от хибридома IP 2-11-1, растяща върху синтетична безсерумна хранителна среда СНО или пул от миши имуноглобулини G, получени от смес на серуми на здрави мишки (получена от проф.As carrier molecules, a mouse monoclonal IgG2a antibody derived from hybridoma IP 2-11-1 grown on synthetic serum-free culture medium CHO or a pool of mouse immunoglobulins G, obtained from a mixture of sera from healthy mice (obtained by Prof.

G. Lazslo, Университет Otvos, Будапеща).G. Lazslo, Otvos University, Budapest).

Имуноглобулиновата фракция от синтетичната хранителна среда се пречиства чрез преципитация с амониев сулфат, а тази от смесения серум - чрез преципитация с амониев сулфат и последващо фракциониране върху имуноафинитетна колона, съдържаща имобилизиран протеин G (търговски продукт на фирмата Pharmacia).The immunoglobulin fraction of the synthetic culture medium was purified by precipitation with ammonium sulfate and that of the mixed serum by precipitation with ammonium sulfate and subsequent fractionation on an immunoaffinity column containing immobilized protein G (commercially available from Pharmacia).

Свързването на моноклоналните или поликлонални миши имуноглобулини G с модифицираните синтетични пептиди DWEYSVWLSN и STN-носещ пептид, се осъществява посредством познати методи със свързващ реактив 1етил-3(3'-диметиламинопропил) карбоимидин.НС1 (EDC)/12/.The binding of monoclonal or polyclonal mouse immunoglobulins G to the modified synthetic peptides DWEYSVWLSN and the STN-bearing peptide is accomplished by known methods using the binding reagent 1-ethyl-3 (3'-dimethylaminopropyl) carboimidine.CH1 (EDC) /.

За целта предварително се изготвя разтвор от всеки пептид в диметилформамид/ фосфатен буфер и на EDC във фосфатен буфер pH 6,0. Към разтвора на имуноглобулините се добавя разтвор на пептидите и EDC, реакционната смес се инкубира с постоянно разбъркване и се диализира срещу фосфат-буфериран физиологичен разтвор с pH 7.0. Полученият разтвор се концентрира, използвайки ултрафилтрация. Той съдържа химерната антитялова молекула, съставена от мишия имуноглобулинов носител, от епитопа STN, свързващ се с CD22 и от модифицирания пептид DWEYSVWLSN.To this end, prepare a solution of each peptide in dimethylformamide / phosphate buffer and EDC in phosphate buffer pH 6.0. A solution of peptides and EDC was added to the immunoglobulin solution, the reaction mixture was incubated with constant stirring and dialyzed against phosphate-buffered saline at pH 7.0. The resulting solution was concentrated using ultrafiltration. It contains a chimeric antibody molecule composed of the murine immunoglobulin carrier, the STN epitope binding to CD22, and the modified peptide DWEYSVWLSN.

Белтъчното съдържание на разтвора се определя спектрофотометрично при 280 nm. Чистотата на получената химера се анализира с използването на SDS-PAGE при нередуциращи условия.The protein content of the solution was determined spectrophotometrically at 280 nm. The purity of the resulting chimera was analyzed using SDS-PAGE under non-reducing conditions.

Възможността на полученото химерно моноклонално антитяло, съгласно изобретението, да се свързва специфично с рецептора CD22 и да потиска селективно патологични ДНК-специфични В клетки (фиг. 3), е изследвана в in vivo ексThe ability of the resulting chimeric monoclonal antibody of the invention to bind specifically to the CD22 receptor and to selectively inhibit pathologic DNA-specific B cells (Fig. 3) was tested in in vivo ex.

65954 Bl перименти върху животни, развиващи спонтанно автоимунно заболяване, по-специално системен лупус. Количеството на отделения с урината белтък (мярка за бъбречното увреждане при лупус) се определя със стандартни сухи тестове (Bayer, UK). Здравото животно не отделя белтък в урината си и неговото присъствие свидетелства за наличието на болестен процес на бъбреците. Проведените изследвания in vivo доказват, че химерната молекула, съгласно изобретението, се свързва специфично с рецептора CD22 и потиска патологичните ДНК-специфични В клетки, като по този начин отслабва активността на болестния автоимунен процес. Прилагането на химерата съгласно изобретението на животни със системен лупус води до по-късно начало на заболяването, до потискане развитието на бъбречното усложнение и до удължаване на живота им (фиг. 4 и 5).65954 Bl periments on animals developing spontaneous autoimmune disease, in particular systemic lupus. The amount of urine excreted protein (measure of renal impairment in lupus) was determined by standard dry tests (Bayer, UK). A healthy animal does not excrete a protein in its urine and its presence indicates the presence of a kidney disease process. In vivo studies have shown that the chimeric molecule of the invention specifically binds to the CD22 receptor and inhibits pathologic DNA-specific B cells, thereby weakening the activity of the disease autoimmune process. Administration of the chimera according to the invention to animals with systemic lupus leads to a later onset of the disease, suppression of the development of renal complication and prolongation of their life (Figs. 4 and 5).

Пояснение на приложените фигуриExplanation of the annexed figures

Фигура 1 представлява схематичен вид на конструираната химерна молекула.Figure 1 is a schematic view of the engineered chimeric molecule.

Фигура 2 представя схема на модифицирания STN епитоп.Figure 2 presents a schematic of the modified STN epitope.

Фигура 3 илюстрира инхибиращите клетъчната активност вътреклетъчни сигнали след едновременното свързване на имуноглобулиновия с CD22 рецептора на повърхността на прицелните В-лимфоцити.Figure 3 illustrates the cellular activity inhibiting intracellular signals after simultaneous binding of the immunoglobulin to the CD22 receptor at the surface of target B lymphocytes.

Фигура 4 показва нива на протеинурията при млади MRL/Ipr мишки, третирани с химерни молекули съгласно изобретението. С бели стълбчета са означени средните нива и стандартно отклонение на лекуваните с химерата мишки, а с черни - тези на контролните (** р<0.01; ♦ р<0.05, нечифтен t-тест).Figure 4 shows proteinuria levels in young MRL / Ipr mice treated with chimeric molecules according to the invention. The white bars indicate the mean levels and standard deviation of the chimera-treated mice and the black ones of the controls (** p <0.01; ♦ p <0.05, non-digit t-test).

Фигура 5 показва, че приложението на химерната молекула води до достоверно удължаване времето на преживяване при мишките MRL/ Ipr с автоимунно заболяване (спонтанен лупус). С квадрати е означено преживяването на животните от опитната група, а с триъгълници - това на контролите (* р<0.05, нечифтен t-тест).Figure 5 shows that administration of the chimeric molecule leads to a significant prolongation of the survival time in MRL / Ipr mice with autoimmune disease (spontaneous lupus). The squares denote the survival of the animals in the experimental group and the triangles indicate the survival of the controls (* p <0.05, non-digit t-test).

Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of carrying out the invention

Изобретението се характеризира със следните примерни изпълнения, без да го ограничават.The invention is characterized by the following non-limiting embodiments.

Пример 1. Получаване на модифицирани синтетични пептидиExample 1. Preparation of modified synthetic peptides

За получаването на средството за селективно потискане активността на патологични автореактивни В клетки, съгласно изобретението, се използва предварително модифициран синтетичен пептид GGPGG (SEQ ID NO. 2) със свързан към неговия N-край олигозахариден STN епитоп (закупен от Calbiochem, Darmstadt, DE) със свободен краен сиалов остатък. Към С-края на синтетичния пептид е включен линкер, представляващ хексаметиленова група. Синтезата се осъществява с използване на Fmoc-метод /13/.For the preparation of the selective inhibitor of the activity of pathologic autoreactive B cells according to the invention, a pre-modified synthetic peptide GGPGG (SEQ ID NO. 2) with an oligosaccharide STN epitope attached to its N-terminus (purchased from Calbiochem, Darmstadt, DE) with free terminal sial residue. A linker representing the hexamethylene group is attached to the C-terminus of the synthetic peptide. The synthesis was performed using the Fmoc method (13).

Използва се описан в литературата синтетичен пептид от 10 аминокиселини DWEYSVWLSN (SEQ ID NO. 1) /10/, който наподобява в антигенно отношение двойноверижна ДНК. Към неговия С-край също се добавя линкер, представляващ хексаметиленова група.The synthetic peptide of 10 amino acids DWEYSVWLSN (SEQ ID NO. 1) (10), which is antigenically similar to double stranded DNA, is used. A linker representing the hexamethylene group is also added to its C-terminus.

Пример 2. Конструиране на химерната имуноглобулинова молекулаExample 2. Construction of a chimeric immunoglobulin molecule

Двата модифицирани пептида се подлагат на пречистване чрез HPLC /14/, след което се осъществява свързването им към получените по описаните методи моноклонални или поликлонални миши имуноглобулини G. За целта предварително се изготвя разтвор на 0,4 mg от всеки пептид в диметилформамид/фосфатен буфер в съотношение 1:9 и на EDC във фосфатен буфер pH 6,0-0,3 mg/ml. Към разтвора на имуноглобулините се добавя разтвор на пептидите и EDC и обемът се довежда до 150 ml с фосфатен буфер pH 6,0. Реакционната смес се инкубира в продължение на 16 h при 4°С с постоянно разбъркване. След това тя се диализира при 4°С за 16 h срещу 200 обема фосфат-буфериран физиологичен разтвор с pH 7,0. Полученият разтвор се концентрира до краен обем 20 ml, използвайки ултрафилтрация през филтри с големина на порите 5 kDa (от Amicon, Millipore Corp.). Той съдържа химерната антитялова молекула, съставена от мишия имуноглобулинов носител, от епитопа STN, свързващ се с CD22 и от модифицирания пептид DWEYSVWLSN (фигура 1).The two modified peptides were purified by HPLC (14) and then coupled to the monoclonal or polyclonal mouse immunoglobulins obtained by the described methods. A solution of 0.4 mg of each peptide in dimethylformamide / phosphate buffer was prepared in advance. at a ratio of 1: 9 and EDC in phosphate buffer pH 6.0-0.3 mg / ml. A solution of peptides and EDC was added to the immunoglobulin solution and the volume was adjusted to 150 ml with phosphate buffer pH 6.0. The reaction mixture was incubated for 16 h at 4 ° C with constant stirring. It was then dialyzed at 4 ° C for 16 h against 200 volumes of pH 7.0 phosphate-buffered saline. The resulting solution was concentrated to a final volume of 20 ml using ultrafiltration through 5 kDa pore size filters (from Amicon, Millipore Corp.). It contains a chimeric antibody molecule composed of the murine immunoglobulin carrier, the STN epitope binding to CD22, and the modified peptide DWEYSVWLSN (Figure 1).

Белтъчното съдържание на разтвора се определя спектрофотометрично при 280 nm. Чистотата на получената химера се анализира с използването на SDS-PAGE при нередуциращи условия.The protein content of the solution was determined spectrophotometrically at 280 nm. The purity of the resulting chimera was analyzed using SDS-PAGE under non-reducing conditions.

Пример 3. Определяне на ефекта от приExample 3. Determining the effect of at

65954 Bl ложението нахимерната молекула върху мишки с развито автоимунно заболяване, по-специално със спонтанен лупус.65954 The administration of the chimeric molecule on mice with advanced autoimmune disease, in particular with spontaneous lupus.

С получената химерна молекула се третира група от женски MRL/Ipr мишки на 6-седмична възраст. Всяка мишка получава по 20 microg от химерата два пъти седмично по венозен път. Контролната група животни получава венозни инжекции с фосфат-буфериран физиологичен разтвор. Мишките от тази инбредна линия развиват спонтанно на около 7-9-седмична възраст заболяване, много близко до системната автоимунна болест лупус еритематозус при човека. Заболяването на животните завършва по правило с необратимо бъбречно увреждане, което причинява смъртта им.The resulting chimeric molecule was treated with a group of female MRL / Ipr mice at 6 weeks of age. Each mouse received 20 [mu] g of the chimera twice weekly by intravenous route. The control group received intravenous injections with phosphate-buffered saline. Mice in this inbred line develop spontaneously at about 7-9 weeks of age a disease very close to systemic autoimmune lupus erythematosus in humans. As a rule, animal disease ends with irreversible kidney damage that causes them to die.

Количеството на отделения с урината белтък (мярка за бъбречното увреждане при лупус) се определя със стандартни сухи тестове (Bayer, UK). Здравото животно не отделя белтък в урината си и неговото присъствие свидетелства за наличието на болестен процес на бъбреците. Приложението на химерната молекула, съгласно изобретението забавя момента на поява и отслабва нивото на албуминурията (фиг. 4). Приложението на същото средство показва също достоверно удължаване живота на лупусните мишки (фиг. 5).The amount of urine excreted protein (measure of renal impairment in lupus) was determined by standard dry tests (Bayer, UK). A healthy animal does not excrete a protein in its urine and its presence indicates the presence of a kidney disease process. The administration of the chimeric molecule according to the invention slows the onset and weakens the level of albuminuria (Fig. 4). Administration of the same agent also showed a significant lengthening of the lupus mice (Fig. 5).