BG63167B1

BG63167B1 - Аналози на кератиноцитния растежен фактор

Info

Publication number: BG63167B1
Application number: BG101408A
Authority: BG
Inventors: Charles Morris; William Kenney; Bao-Lu Chen; Erik Hsu
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2001-05-31
Also published as: KR100278597B1; EP0785948A1; BR9509269A; CZ98197A3; PT785948E; NO971568L; NO318761B1; EE03975B1; HUT78050A; FI971420A0; SI0804479T1; FI971420A; ES2196082T3; SK284534B6; PT804479E; NO971568D0; EP0804479A1; ES2273338T3; DE69530403D1; NZ335109A

Abstract

Изобретението се отнася до аналози на силен митоген на растежа на нефибробластни епителни клетки, кератиноцитен растежен фактор (KGF), модифициран допървите 24 N-крайни аминокиселини, където цистеиновите остатъци, съответстващи на позициите на аминокиселини 1 и 15 на KGF [позиции 32 и 46 на аминокиселини от SEQ ID NO:2, (съответно Cys1 и Cys15)],са заличени или заместени с друга аминокиселина. Изобретението се отнася и до молекули на нуклеинови киселини, които кодират такива аналози, и до методи за използването на такива аналози за стимулиране пролиферацията на нефибробластни епителни клетки.

Description

Област на изоЬретението

Настоящото изобретение се отнася до една рекомбинантна ДНК технология и до една протеинова техника Синженерно структуриране на белтъчни съединения}. По-конкретно, рекомбинантните ДНК-методологии се прилагат за производство на полипептидни аналози на кератиноцитния Фактор на растежа С КФР2>, представляващ мощен митоген на растежа на нефибробластни епителни клетки, в които аналозите показват повишена стабилност, в сравнение с породилия ги КФР.

Ниво на техниката

Сложният процес на генериране и регенериране на тъкани се регулира от редица протеинови Фактори, понякога споменавани като фактори на растежа на меки тъкани. Тези молекули обикновено се освобождават от един тип клетка и дейстуват, като влияят на пролиферацията на други типове клетки.CRubin et al. (1989). Proc. Nat'l Acad. Sci. USA. 36:002-806). Някои меки тьканни фактори на растежа се получават в резултат на секреция от конкретни типове клетки и влияят върху пролиферацията Сразпространението}, диференциацията Сразделянето} и/или матурацията (съзряването) на клетките, реагиращи при развитието на многоклетъчните организми СFinch et al. (1989). Science. 245:752-755). В допълнение на тяхната роля в развиващите се организми. някои от тях имат значение за здравето и обслужването на по-зрелите системи. Например, при бозайниците има много системи, . при които се проявява бързо обновяване на клетките. Такива системи са кожата и гастроинтестиналнияттракт, като и двете системи са съставени от епителни клетки. Към тази група Фактори на растежа на меките тъкани спада и семейството протеини на фибробластните фактори на растежа С ФФР} .

Понастоящем са известни осем представители на семейството на ФФР, които са сродни по форми на първичен строеж: базичен Сс основен характер} фибробластен фактор на растежа, 6ФФР СAbraham et al. (1986). EMBO J 5:2523-2528): кисел фибробластен фактор на растежа, кффР.(Зауе et al. (1986). Science. 233:541-545: генен продукт int-2. int-2 (Dickson and Peters (19Θ7). Nature. 326:833): hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987). Cell. 450: 729-737) и Yoshida et al. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 64:7305-7309): ΦΦΡ FGF-5 (Zhan et al. (198Θ). Mol. cell. Bio 1..S:3487-3495): ФФР FGF-6 (Maries et al. (1989). Oncooene. 4:335-340): кератиноцитен фактор на растежа (Finch et al. (1989). Science. 24:752-755): и хисактофилин (Habazzettl et al. (1992). Nature: 855-858).

В семейството протеини на ФФР кератиноцитният фактор на растежа СКфР? представлява уникално средство за въздействие върху пролиферацията на нефибробластни епителни клетки Сособено кератиноцитните?, изведени от мезенхимални тъкани. Понятието природни КфР се отнася до естествен хуманен СхКфР? или рекомбинантен СрКФР? полипептид Сс или без сигнална последователност?, представен с аминокиселинния ред, означен като SEQ ID ND:2 или алеличен на него вариант. [В случай че не е указано друго, номерирането на аминокиселините от описаните тук молекули ще съответствува на номерацията, представяна по отношение на развитата форма на природната молекула Ст.е. минус сигналната последователност?, описана с аминокиселини 32 до 194 от SEQ ID N0:2.]

Природният КФР може да бъде изолиран от .природни човешки източници СхКФР? или да бъде произведен чрез рекомбинантни ДНК методи СрКФР? CFinch et al. (1989). supra: Rubin et al. (1989). supra: Ron et al. (1993). The Journal of Bioloaical Chemistry. 268 (4):2984-2988: и Yan et al (1991). In Vitro Cell. Dev. Biol. 27A:437-438).

Известно е, че във водна среда природниятКФР е относително нестабилен и че при преработка и съхранение той претърпява химическо и физическо разлагане, което води до загуба на биологична активност CChen et al.

Pharmaceutics1 (1994)

Research

1582- 1589). Природният КФР е склонен към агрегиране при повишени температури и се инактивира в условия на повишена киселинност

CRubin et al. 1989). Proc. Natl

Acad

Агрегирането на природния КФР във воден разтвор също води до инактивиране на протеина.

Това за съхранение на водни за удължени периоди от време или за администриране на протеина за удължени периоди.

Освен това е особено проблематично при подготвяне на Фармацевтични състави, тъй като агрегираните протеини са известни със своята имуногенност

CCleland et al

1993). Crit. Rev. Thersneutic Drua Carrier Systems

10:307-377

Robbins et al. (1987). Diabetes. 165:838-845: and

Pinckard et al. (19ό7). Clin. Exp

Immuno1

2:331-340)

Природният КФР е ьставен от пет цистеинови остатъка именно аминокиселини 1

102 и 106 С F i n с h et al. (1989)

Science 24:752-755) че съдържанието на цистеин природния КФР е известно не е оповестена която

Снапр.

биологичната активност) и терциерния строеж

Снапр.

склонност да ооразуват нежелани междумол екулни или вьтрешномолекщулни дисулфидни връзки?. Следователно липсва предварителен начин на обучение, съгласно който, ако съществува, цистеиновите остатъци са съществени или са ангажирани в образуването на нежелани дисулфидни връзки, което прави протеина възприемчив към агрегиране ихили нестабилност.

За да се направи опит за осьвьршенстване или да се променят една или повече характеристики на природния КФР, може да се приложи инженерен подход за проектиране на протеините. За модифициране на редовете на природния КфР се използува рекомбинантна ДНК технология.

Ron et al. (1993). J. Biol. Chem.

268 (4):

2984-2988 докладват за модифицирани полипептиди на

КфР с отцепени от азотните окончания 3, 8, 27, 38 или 49 аминокиселини. Тези полипептиди, при които отсъствуват N-крайни остатъци 3, 8, и 27, са описани като запазващи хепариновата си свързваща способност; останалите - не. Също така, полипептидите, на които липсват остатъци 3 и 8, са описани като запазващи активността си, докато формата, на която липсват остатъци 27, е докладана като 10-20 пъти по-малко митогенна, а Формите без аминокиселини 38 или 49 - като непсказваши митогенна активност. Стабилността на модифицираните полипептиди на КФР не е обсъждана или докладвана по друг начин.

Публикуваната съгласно РСТ заявка под номер 90x08771, suDra. също докладва производство на един химерен протеин, в който около първите 40 N-крайни аминокиселини на развитата Ферма природен КФР са комбинирани с С-крайни части Соколо 140 аминокиселини} на кффр. Докладвано е, че химеричният протеин е насочен към кератиноцити като КФР, но на него му липсва вьзприемчивост спрямо хепарин. който е характерен за кффР, не и на КФР. Стабилността на химера·, не е обсъждана или докладвана по друг начин.

Публикуваната заявка РСТ по. 90/08771, suDra. освен това докладва за химеричен протеин, в който около първите 40

N-крайни аминокиселини на зрялата ферма на природния КфР са съчетани с С-крайната част Соколо 140 аминокиселини} от кффР. Докладвано е, че химерната ферма е насочена срещу кератиноцити, като КФР, но й липсва вьзприемчивост спрямо хепарин, една характеристика на кФФР, не и на КФР. Стабилността на химерния тип не се обсъжда или докладва никъде.

И така, досега литературата не е съобщила за модифицирана молекула на КФР, притежаваща значително повишена стабилност по отношение на природния КфР. Освен това, литературата не съобщава достатъчно свидетелства или указания, осигуряващи основателни очаквания за успешно генериране на молекули на КФР с такива желани характеристики.

Въобще, влиянието върху биологичната активност на известна промяна на аминокиселините в един протеин, ще варира в зависимост от редица Фактори, включително от тридименсионалния строеж на протеина и в зависимост от това дали модификациите засягат или не областта на свръзване на рецептора към първичния ред на протеина. Тъй като нито тридименсионалния строеж на природния КФР, нито областта на свързване на рецептора към първичният строеж, не са публикувани, познанията в областта не позволяват да се направи обобщение на въздействията на модификациите на аминокиселини по отношение на природните КФР, основани върху въздействия на модификации на аминокиселини върху разпространени категоризирани протеини.

Цел на настоящото изобретение е да осигури полипептидни молекули, които да кодират такива аналози, които да проявяват повишена стабилност Снапр. при въздействие върху типични pH, термични и/или други условия на съхранение}, в сравнение с природни КфР.

Резюме на изобретението

Настоящето изобретение осигурява нови биологично активни полипептиди аналози на КФР. За целите на това изобретение понятието КфР включва природни КФР и протеини, характеризиращи се чрез пептиден ред, който е съществено същия, както пептидния ред на природния КФР, като се запазват цистеиновите остатъци,

155 32 съответни на Cys и Cys на природния КФР CCys и Cys на SEQ ID N0:2) и част или цялата биологична активност на природния КФР, особено пролиферацията на нефибробластни епителни клетки. Под Фразата характеризиращ се от пептиден ред, съществено същия, като пептидния ред на природния КФР се разбира пептиден ред, който е кодиран чрез ДНК последователност, способна да хибридизира с нуклеотиди 201 до 684 от SEQ ID N0:1, за предпочитане при строги условия на хибридизация.

Определянето на съответно място на аминокиселини между две последователности от аминокиселини може да стане чрез стиковане на две последователности с оглед максимизиране на съответствието на остатъците, включително преместване на амино и/или карбоксилни окончания, въвеждане според изискванията на празни места ихили заличаване на остатъци вградени структури в кандидата. Могат да бъдат провеждани справки в бази от данни, анализ на последователностите манипулации, като оъде приложена някоя от дооре известните текущо използувани алгоритмични програми за сканиране на хомоложни редове/представители Снапр.Pearson и Li Oman (1988)

Proc. Natl.Acad

Sci

USA. 85:2444-2448

А1tschu1 et al (1990). J. Mol. Biol. 215:403-410

Lipman и

Pearson (1985)

Science. 222:1435 или Devereux et al. (1984)

Nuc. Acids

P.es

12:387-395).

Строги условия, в контекста на хибридизацията, са строгите съчетания от условия - соли, температура, органични разтворители и други параметри, типично контролирани при реакциите на хибридизация. Примерни условия на хибридизация са тези на хибридизация в 4 пьти SSC при 62-67°С, последвана от промиване в 0.1 пьти SSC при S2-67°C в продължение на приблизително един час. Като алтернатива, примерни условия на хибридизация са хибридизация в 45-55% формамид, 4 пьти SSC при 4С-45°С. [Виж Т. Maniatis et al.. Molecular Cloninah (Лабораторно ръководство) Cold sDrina Harbor Laboratory (1982). p. 387 до 389].

Следователно протеините включват алелични вариации или заличаванеСия2), заместванеС ия2) или включванеС ия2) на аминокиселини _? включително Фрагменти, химерни или хибридни молекули на природния КФР. Един пример на

КФР включва полипептиди с променлив товар, в които един или повече аминокис ел инни остатъци

41-154 на природния

КФР

Сс йго η т ⁴³Gin

I ₽°

Ly s . 12Θ

Lys . 137 _. 1за

Asn , Gin , 13Р

Ly s

144 га , 147

Ly s

152

Gin , 153

Ly s или

154

Thr ) са заличени или заместени с неутрален или отрицателно натоварен остатък, избран с оглед въздействие върху протеина с намален положителен товар

С както е указано в разпространени?

USSN

08/332.337 регистриран на октомври

19942) , по-конкретно включващ

R(144)Q, един КфР, който има едно заместване на аргинин с глутамин в позициите на аминокиселини 144 в природния КФР. Друг пример на КфР включва протеини, които са генерирани чрез заместване на поне една аминокиселина, имаша по-висок потенциал за включване в цикъл, при поне една аминокиселина в рамките на

115 11<5 117 11Θ област на циклообразуване при Asn -His -Tyr -Asn

Thr на природния КфР Скакто инструктира разпространения IJSSN

08/323.473. регистриран на 13 окт. 19942), по-конкретно включващ

Н(116)Б, един КфР, имащ едно заместване на хистидин с глицин в позиция на аминокиселина 116 от природния КФР. Един друг пример включва протеини, които притежават едно или повече аминокиселинни замествания, заличавания или присъединявания в рамките на областта 123-133 Саминокиселини 154-164 от SEQ ID N0:2) на природния КфР, като тези протеини може да имат агонистична или антагонистична активност.

Изненадващо бе открито, че когато една молекула КФР Ст.е. молекула-родител}, съдържаща цистеинови остатъци, съответствуваши Скакто се установява чрез описаните по-горе методи} на Cys¹ и Cys¹⁵ от природния КфР Сцистеинови остатъци 32 и 46 от SEQ ID N0:2). бъде модифицирана чрез заместване на съответните цистеини, резултантният аналог на КФР показва подобрена стабилност в сравнение с молекулата родител. Като предпочитание, в допълнение на обстоятелството на повишена стабилност, изобретението е насочено към такива аналози, които в сравнение с природния КФР проявяват пълна биологична активност Ст.е. поне съществена подобна рецепторна връзка или афинитет^.

В друг аспект на изобретението са описани пречистени и изолирани молекули нуклеинови киселини, които кодират *

различните биологично-активни полипептидни аналози на КФР.

Съгласно едно конкретно изображение тези нуклеинови киселини са съставени от молекули

ДНК, клонирани биологично

Функционал ни плазмиди или вирални вектори.

Съгласно друго изпълнение, структурите от такива нуклеиновите киселини могат да бъдат използувани за осъществяване на устойчива трансформация на прокариотни или евкариотни донорни клетки. В още едно друго изпълнение изобретението засяга процес, при който дадена прокариотна С за предпочитане E.coli) или еукариотна клетка-донор, стабилно Трансформирана с молекула нуклеинова киселина, се отглежда при подходящи условия на хранене и по начин, който позволява експресия на аналог на КфР. След експресията резултантният рекомбинантен полипептид може да бьде изолиран и пречистен.

Друг аспект на изобретението засяга фармацевтични състави, съдържащи терапевтично ефективно количество от аналог на КФР и един приемлив фармацевтичен носител. Такива състави ще бъдат от полза при лечение на пациенти, страдащи от болести и увреждания на епитела.

Пак в този смисъл, друг аспект се отнася до методи на стимулиране на растежа на епителни клетки чрез въвеждане в пациент на терапевтично-ефективно количество от аналог на КфР. Съгласно едно описание, по този начин се стимулира разпространението на нефибробластните клетки. Такива епителни клетки са различните аднексални клетки, панкреатични клетки, клетки на черния дроб, както и мукозни епители от респираторния и гастроинтестиналния тракт.

Кратко описание на Фигурите

На фигура 1 са показани нуклеотидният CSEQ ID N0:1) и аминокиселинният CSEQ ID N0:2) ред на природния КфР Снуклеотидите,кодиращи зрялата, мадурна, Форма на природния КФР, са описани като бази 201 до 684 от SEQ ID N0:1, а развитата форма на КФР е изобразена чрез аминокиселинните остатъци 32 до 194 от SEQ ID N0:2).

фигури 2А, 2В и 2С показват плазмидните карти съответно на PCFM1156, DCFM1656 И DCFM3102.

фигура 3 илюстрира нуклеотидния ред CSEO ID N0:3) и аминокиселинния ред CSEQ ID N0:4) от структурата RSH-КФР.

На фигура 4 е показан нуклеотидниятред CSEQ ID N0:5) и аминокиселинниятред CSEQ ID N0:6) от структурата, която се съдържаща в плазмид КфР.

На фиг. 5 са показани получените чрез химически синтез OLIGO-съединения Ссъответно 0LIG0#6 до OLIGOttll: SEQ ID N0:12-173, използувани за заместване на последователността на ДНК между позиция Крп! и позиция EcoRI Сот позициите на аминокиселини 46 до 85 от SEQ ID N0:6} в структурата, която се съдържа в плазмида на КФР, произвеждащ структура на плазмид КфР Cdsd}.

На Фиг. 6 са показани получените чрез химически синтез OLIGO-съединения Ссъответно 0LIG0#12 до 0LIGD#24: SEQ ID

N0:18-30}, използувани за	с т рукт урира не	на КФР	С оптимизиран
кодон}.
фигура 7 илюстрира	нуклеотидните	CSEQ ID	N0:31)	и

аминокиселинни CSEQ ID N0:32) редове на CC1,15DS, представляващ аналог на КФР със заместен серин на мястото на цистеин в аминокиселинни позиции 1 и 15 от природния КФР.

Фигура 8 илюстрира нуклеотидните CSEQ ID N0:33) и аминокиселинни CSEQ ID N0:34) редове на AN3/CC15}S, представляващ аналог на КфР със заличаване на първите 3 аминокиселини в N-окончанието, както и заместен серин на мястото на цистеин в позиция на аминокиселина 15 от природния

КФР.

фигура 9 илюстрира нуклеотидните CSEQ ID

N0:35) аминокиселинни CSEQ ID N0:36) редове на

AN3/CC15}-, представляващ аналог на

КфР със заличени първите 3 аминокиселини на N-краища и заличен цистеин в аминокиселинна позиция 15 на природния КФР

На фигура са показани нуклеотидните CSEQ

ID N0:37) и аминокиселинни

CSEQ

ID N0:38) редове на aN8/CC152>S, представляваш, аналог на КфР със заличени пьрвите аминокиселини на N-край и заместен серин на мястото на цистеин

КФР.

са показани нуклеотидните CSEQ

На фигура

аминокиселинни	CSEQ	ID
представляващ	аналог	на
аминокиселини	на N-край	и
позиция 15 от	природния	КФР

N0:40) заличен цистеин в

КфР СЪС редове на заличени

AN8/CC152)-, първите 8 аминокиселинна

ID N0:41) и аминокиселинни CSEQ ID N0:42) редове на ΔΝ15, представляващ аналог на КфР със заличени първите 15 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 13 са казани нуклеотидните CSEQ

ID N0:43) и аминокиселинни CSEQ ID N0:44) редове на

ΔΝ16, представляващ аналог на КфР със заличени първите 16 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 14 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:45) и аминокиселинни CSEQ ID N0:46) редове на ΔΝ17, представляващ аналог на КФР със заличени пьрвите 17 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На Фигура 15 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:47) и аминокиселинни CSEQ ID N0:48) редове на ΔΝ18, представляващ аналог на КФР със заличени първите 18 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 16 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:497) и аминокиселинни CSEQ ID N0:50) редове на ΔΝ19, представляващ аналог на КФР със заличени първите 19 аминокиселини на N-край от природния КФР.

На фигура 17 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:51) и аминокиселинни CSEQ ID N0:52) редове на ΔΝ20, представляващ аналог на КфР със заличени първите 20 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 18 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:53) и аминокиселинни CSEQ ID N0:54) редове на ΔΝΞ1, представляващ аналог на КфР със заличени първите 21 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 19 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:55) и аминокиселинни CSEQ ID N0:56) редове на ΔΝ22, представляващ аналог на КфР със заличени първите 22 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 20 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:57) и аминокиселинни CSEQ ID N0:58) редове на ΔΝ23, представляващ аналог на КфР със заличени първите 23 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На Фигура 21 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:59) и аминокиселинни CSEQ ID N0:60) редове на ΔΝ24, представляващ аналог на КфР със заличени първите 24 аминокиселини на N-край от природния КфР.

На фигура 22 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:61) и аминокиселинни CSEQ ID N0:62) редове на С(1,15)S/R(144)Е, представляващ аналог на КфР със заместен серин на мястото на цистеин в аминокиселинни позиции 1 и 15 заместване на, аргинин с глутаминова киселина в позиция на аминокиселина 144 от природния КФР.

На фигура 23 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:63) и аминокиселинни CSEQ ID N0:64) редове на С(1.15)S/R(144)Q, представляващ аналог на КфР със замествания на серин на мястото на цистеин в аминокиселинни позиции 1 и 15 заместване аргинин с глутаминова киселина в положение на аминокиселина на

144 от природния КфР.

На фигура са показани нуклеотидните CSEQ

1D N0:65) аминокиселинни

CSEQ ID

N0:66) редове на

AN23/R (144)(3 представляващ аналог на

КФР със заместени първите аминокиселини на N-край и заместване на аргинин със глутаминова киселина в аминокиселинно положение 144 на природния КФР фигура 25 дава количеството на оставащия разтворим протеин, когато природен КФР и CC1.153S се съхраняват в тМ

Na фосфат, 0. 15М NaCI, pH 7.0 при 37°С в продължение на часа.

фигура 2© дава количеството на оставащия разтворим протеин, когато природен КФР и CC1.153S се съхраняват в тМ

Na фосфат, 0.15М NaCI. pH 7.0 при 37°С продължение на часа.

фигура 27 показва количеството на оставащия разтворим протеин, когато природен КФР, ΔΝ15 и CC1.153S се съхраняват в 50 mM Na фосфат, 0. 15М NaCI. pH 7.0 при 37°С в продължение на 27 часа.

На фигура 28 е показано количеството разтворим протеин, определено чрез изключваш» по размер високоскоростна течна хроматография, като функция на времето на инкубация при 37°С.

На фиг. 29 е показана определената температура на топене

СТ ). като функция на pH за природен КфР, CCI .153S/RC144DQ и т

С(1,153S/R(144)Е.

На фигура 30 ^е показан типичен профил на митогенна активност на СС1,15?определен чрез измерване на вграждане на [³Н]-тимидин по време на синтез на ДНК и чрез сравнението му сьс стандартна крива на природен КФР.

На Фигура 30 е показан типичен профил на митогенна активност на ΔΝ15, определен чрез измерване на въвеждането на [³Н]-тимидин по време на синтез на ДНК и чрез сравнението му със стандартна крива на природен КФР.

На фигура 31 е показан типичен профил на митогенна активност на ΔΝ23, определен чрез измерване на въвеждането на [³Н]-тимидин по време на синтез на ДНК и чрез сравнението му със стандартна крива на природен КФР.

На фигура 32 е показан типичен профил на митогенна активност на

ΔΝ 23/ R (144 ) Q, определен чрез измерване на въвеждането на сравнението му [³Н]-тимидин по време на синтез на ДНК и чрез със стандартна крива на природен КФР.

На фигура 33 е показан типичен профил на митогенна активност на С(1,15)S/R(144 )Q, определен чрез измерване на въвеждането на [³Н]-тимидин по време на синтез на ДНК и чрез сравнението му сьс стандартна крива на природен КфР.

На фигура 34 е показан типичен профил на митогенна активност на С(1.15)S/R(144)Е, определен чрез измерване на въвеждането на С Н]-тимидин по време на синтез на ДНК и чрез сравнението му сьс стандартна крива на природен КФР.

На Фигура 35 са показани въздействия на Природен КФР> КФР-а, Д N15.

На фигура 36 са показани нуклеотидните CSEQ ID 1x10:77) и аминокиселинни CSEQ ID N0:78) редове на C(1.15,4O)S, представляващ аналог на КФР сьс замествания на серин на мястото на цистеин в аминокиселинни позиции 1,15 и 40 от природния

КФР.

На фигура 37 са показани нуклеотидните

CSEQ

ID N0:79) и аминокиселинни С SEQ

ID

N0:80) редове на представляващ аналог на КФР сьс замествания на серин на мястото на цистеин в аминокиселинни позиции 1,15 и

102 от природния

КФР.

На фигура 38 са показани нуклеотидните

CSEQ

ID

N0: 81) и аминокиселинни CSEQ ID N0:82) редове на С(1,

15,

102,

1O6)S , представляващ аналог на КфР със замествания на серин на мястото на цистеин в аминокиселинни позиции 1, 15, 102 и 106 от природния КфР.

На фигура 39 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:83) и аминокиселинни CSEQ ID N0:84) редове на ΔΝ23/Ν(137)Е, представляващ аналог на КфР със заличаване на първите 23 аминокиселини към N-крайна верига и заместване на аспарагин с глутаминова киселина в място на аминокиселина номер 137 от природния КФР.

На фигура 40 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:-85) и аминокиселинни CSEQ ID N0:86) редове на ΔΝ23/Ν(139)Е. представляващ аналог на КФР със заличаване на първите 23 аминокиселини към N-крайна верига и заместване на лизин с глутаминова киселина в място на аминокиселина номер 139 от природния КФР.

На фигура 41 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:87) и аминокиселинни CSEQ ID N0:88) редове на AN23/N( 139)Q. представляващ аналог на КФР със заличаване на първите 23 аминокиселини към N-крайна верига и заместване на лизин с глутаминова киселина в място на аминокиселина номер 139 от природния КФР.

На фигура 42 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:89) и аминокиселинни С SEQ

ID

N0:90) редове на

AN23/R(144)А.

представляващ аналог на КфР сьс заличаване на пьрвите 23 аминокиселини кьм

N-крайна верига и заместване на аргинин с аланин в място на аминокиселина номер 144 от природния КФР.

На фигура са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:91) и аминокиселинни

CSEQ

ID

N0:92) редове на

ΔΝ23/Ν( 144)Е представляващ аналог на КфР сьс заличаване на пьрвите аминокиселини кьм N-крайна верига и заместване на аргинин с глутаминова киселина в място на аминокиселина номер 144 от природния КФР.

На фигура 44 са показани нуклеотидните CSEQ

ID N0:93) аминокиселинни CSEQ

ID

N0:94) редове на

ΔΝ23/Ν ( 1 44) L , представляващ аналог на КфР сьс заличаване на пьрвите аминокиселини кьм

N-крайна верига и заместване на аргинин левцин в място на аминокиселина номер 144 от природния КФР.

На фигура са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:95) аминокис ел инни

CSEQ

ID

N0:96) редове на

ΔΝ23/Κ( 144) Е.

представляващ аналог на КфР сьс заличаване на пьрвите аминокиселини кьм N-крайна верига и заместване на лизин глутаминова киселина в място на аминокиселина номер 147 от природния КФР.

На фигура 46 са показани нуклеотидните CSEQ

ID N0:97) аминокиселинни CSEQ

ID

N0:98) редове на

ΔΝ23/Κ( 147)0.

представляващ аналог на КФР сьс заличаване на пьрвите аминокиселини кьм N-крайна верига и заместване на лизина глутамин в място на аминокиселина номер 147 от природния КфР.

На фигура 47 са показани нуклеотидните

CSEQ

ID N0:99) аминокиселинни CSEQ ID N0:100) редове на

ΔΝ23/Κ( 153) Е, представляващ аналог на КФР със заличаване на първите 23 аминокиселини кьм N-крайна верига и заместване на лизин с глутаминова киселина в място на аминокиселина номер 153 от природния КфР.

На фигура 48 са показани нуклеотидните CSEQ

ID N0:101) аминокиселинни CSEQ

ID N0:102) редове на

ΔΝ23/Κ( 153)0 представляващ аналог на КФР със заличаване на първите аминокиселини кьм N-крайна верига и заместване на лизин глутамин в място на аминокиселина номер 153 от природния КФР.

На фигура 49 са показани нуклеотидните CSEQ ID N0:103) и аминокиселинни CSEQ ID N0:104) редове на ΔΝ23/Ό(152)Е/К(153)Е, представляващ аналог на КфР със заличаване на първите 23 аминокиселини към N-крайна верига и заместване на глутамин с глутаминова киселина в място на аминокиселина 152 от природния КФР и на лизин с глутаминова киселина в място 153 на аминокиселина на природния КФР.

На фигура 50 е показано влиянието на ΔΝ23 върху диабета предизвикан чрез стрептозотоцин върху плъхове тип Spraaue-Dawlеу.

Същност на изобретението

В съответствие с настоящото изобретение са осигурени нови аналози на КФР. С него се определя, че четири от цистеиновите остатъци на природния КФР CCys и Cys и Cys и Cys ? участвуват във образуване на два дисулфидни моста. Cys*⁰ не участвува в образуване на междумолекулярен дисулфид. Оттам, КФР съдържа два малки дисулфидни пръстена, разделени от почти 90 аминокиселини. Въз основа на основни положения, според определенията на които цистеиновите остатъци участвуват в дисулфидни мостове, се установява кои цистеини са свободни да образуват нежелателни междумолекулярни напречни връзки или междумолекулярни връзки, които предизвикват включване на протеина в нежелателни терциерни структури Снапр. конформация, която намалява активността на протеина?.

Изненадващо бе установено, че модифициране на КфР чрез заличаване или заместване на аминокиселинни остатъци на мястото на цистеинови остатъци, съответствуващи на места 1 и 15 на КФР Сместа 32 и 46 от SEQ ID N0:2), произвежда аналог на КфР, който има съществено подобрена стабилност Ст.е. намалени проблеми, предизвиквани при неправилно разгъване, образуване на междумолекулярни дисулфиди и/или агрегиране на протеини?. Например, аналозите на КФР обикновено следва да се пречистят при повишен добив на разтворим, правилно нагънат протеин. Освен това, след като бъде пречистен, материалът остава по-стабилен спрямо pH, температура и т.н. , в сравнение със стабилността на молекулата родител. Въпреки че не се очаква обвързване с

15 теория, вярваме, че Cys и Cys от КфР, освен че образуват един вътрешномолекулярен дисулфиден мост и един N-краен дисулфиден пръстен, при определени обстоятелства съществуват и като свободни цистеини, които могат да образуват вътрешномолекулярни дисулфидни мостове, водеши до нестабилност и агрегиране на протеина. Освен това е изяснено, че заличаването на N-крайния дисулфиден пръстен не е важен за рецепторно свързване или митогенна активност.

Според това изобретение, под “аналог на КФР“ или полипептиден аналог на КФР“ се разбира всеки от описаните присъствуваши или неприсъствуващи в природата полипептиди, които се различават в строежа си от от КФР по предизвиканите модификации в пептидния ред, съответствуващ на N-крайната верига с 24 аминокиселини при КфР С аминокиселини 32 до 55 на SEQ ID N0:2), в която Cys¹ и Cys¹³ от КФР Саминокиселини 32 до 46 от SEQ ID N0:2) са заместени или заличени. Начинът, по който се заместват или заличават цистеините, е без значение и включва, например, полипептидни аналози, които включват заличаване и/или заместване на една или повече аминокиселини. В съответствие с това, изобретението осигурява семейство нови протеини на кератиноцитния фактор на растежа. Това семейство е съставено от няколко групи протеини.

Една група аналози на КфР включва молекули, в които цистеините в положения 1 и 15 на КФР се заместват с аминокиселини, включително онези, които липсват естествено в протеините. Стратегиите за генериране на заместени аналози включват позиционно-ориентиран мутагенезис СНо et al. (1989), Gene 77:51-59; Innis et al. PRC Protocols. Academic Press, Inc., San Dieqo, CA) . [ Аналозите на КФР, получени възоснова на заместване на аминокиселини, се означават чрез остатъка, установен в мястото на развития протеин Сминус сигналната последователност}, означена в SEQ ID N0:2, последвана от това положение на аминокиселина в скоби и от новата аминокиселина. Например, даден аналог, който включва заместване на цистеин със серин в позиция на аминокиселина 15 от КфР С позиция 46 от SEQ ID N0:2) се означава като “CC15}S··. ] Предпочита се превръщане на цистеина в неутрална аминокиселина, като глицин, валин, аланин, левцин, изолевцин, тирозин, фенилаланин, хистидин, триптофан, серин, треонин и метионин, със серин, треонин и аланин, които се предпочитат най-много, поради химическото си сходство със цистеина. В пример 1 са дадени подробности по генерирането на CC1,15}S, като се използува частичен генен синтез Св комбинация с други рекомбинантни техники}, последвано от рекомбинантна експресия в един стабилно трансформиран бактериален организъм инкубатор.

Друга група аналози на КФР включват молекули, чиито цистеини в положения 1 и 15 са заличени от КФР.За целта могат да се ангажират различни стратегии, такива като отрязване на N-крайша и заличавания, специфични по отношение на място, или съчетание на двата метода.

Под отрязване на N-краища се разбира модификация на КФР, при което 1 до 24 N-крайни аминокиселинни остатъци на КФР Саминокиселини 32 до 55 от SEQ ID N0:2) , включително Cys¹ и

Cys у се заличават [аналози на КфР, съставени от отрязване на аминокиселини ще се означават чрез заличения остатък на това място във развития протеин Сминус сигналния ред}, обявен в SEQ ID N0:2, започвайки с мястото на заличаване и с номера на остатъка, който е заличен. Например, аналог на КфР, съставен в резултат на отрязване на N-край^включващ 24 остатъка на КФР

Состатъци 1-55 от SEQ ID N0:2), ще бъде означаван като аналог

В рамките на тази група по-конкретно са включени аналози ΔΝ23 от природен КфР, в който един или повече аминокиселинни остатъци 41-154 Саминокиселини 72-185 от SEQ ID N0:2), по-конкретно аминокиселинни остатъци 123-133 Саминокиселини 154-164 от SEQ ID N0:2) са заличени или заместени с един неутрален остатък или негативно натоварен остатък, избран за въздействие върху протеин с намален положителен товар. Предпочитани остатъци за провеждане на

модификация са	Λ ⁴¹ Arq ,	Gin⁴³.	Lys³³,	1 S>5 Lys ,	. 128 Lys	Λ ¹³⁷ , Asn
„, 138 . 13Р Gin , Lys ,	Arq ,	Lys¹⁴⁷,	Gin¹³²,	1 ¹⁼³ Lys	или	-r. 154 Thr c

_ . 13В . 13Р - 144

Gin , Lys , Arq

I 147

Lys

Г-1 ¹⁵²

Gin , или

I ¹⁵³

Lys като по-предпочитани и Ara¹⁴* като най-предпочитан. Освен това в тази група се включват и аналози ΔΝ23 на естествения КФР, които притежават пръстенообразуващи модификации в рамките на областта на пръстенообразуване л ^11:5 на Asn . , . 11<5 _ 117 _Λ 11Θ IIP

His -Tyr -Asn -Thr

С аминокис ел ини 146-150 от SEQ ID N0:2), за предпочитане включващи модификация с промяна на товара на аминокиселинен остатък 116, с още повече предпочитание заместване на G1у в положение 116. По-нататък в тази група включваме и аналози на

ΛΝ23 на естествения КфР, които притежават едно или повече замествания, заличавания или присъединявания на аминокиселини в рамките на областта 123-133 Саминокиселини

154-164 от SEQ

ID

Пример 1 разглегжда подробности по произвеждане на систематични отсичания на

N-крайни вериги, извършвано чрез парциален генен синтез комбинация с други рекомбинантни методи, последвани от рекомбинантни експресии в стабилно трансформирани бактериални инкубиращи клетки.Такива изолирани примери на отсичане на N-краища включват аналози ΔΝ15 и ΔΝ24.

Освен това, пример 3 дава подробности по експресията на културални клетки от бозайник на ДНК-кодировка на природен КФР хетерогенни N-крайни гликозилирани изоформи, като пречистването с предпочитание на една гликозилирана изоформа ангажира отсичане на N-край на аминокиселини 1-12 от развитата

Форма на природен КФР.

Напротив, методът на позиционно-ориентирано заличаване се отнася до модификация на КФР, при която се отстраняват една или повече аминокиселинни остатъци Снапр. Cys или Cys >. Когато

15 бъде заличен конкретно Cys или Cys на КФР, аналогът

представлява	една	аминокиселина,	която	е по-кьса	от
КфР.[Аналози	на	КфР, сьставени	чрез	заличаване	на
аминокиселини,	се означават чрез остатька,	установен в	това

положение в развития протеин Сминус сигналният ред}, представен чрез SEQ ID N0:2, последвано от мястото на заличената аминокиселина в скоби и отрицателен знак. Например, един аналог от тази група, който е получен след заличаване на цистеин в положение 15 на КфР Сположение 36 от SEQ ID N0:20, се означава като 0(15)-.] Позиционно-специфичните заличавания могат да се произведат, като се прилага насочена мутагенеза, както е описана по-горе.

В тази група се включват сьщр и аналози, в които Cys¹ и

Cys на КФР се отделят чрез отсичане и заличаване. Например, представителни аналози на КфР, които съставляват отсичане на пьрвите три аминокиселинни остатьци CCys-Asn-Asp) на КфР или отсичането на пьрвите осем аминокиселинни остатьци CCys-Asn-Asp-Met-Thr—Pro-Glu-Gln) на КФР, съчетани с заличаване на цистеина в положение 15 на КфР Стези аналози се означават съответно като AN3/CC15}- и AN8/CC152). Тьй като метиониновият остатьк се явява предимно естествено в положение на четвьртата и деветата аминокиселина на природния КфР, не е необходим допълнителен Met codon, за да се осигури правилно иницииране на транслация.

Една друга група включва молекули, в които цистеините в положения 1 и 15 на КфР се заместват чрез отсичане и заместване. Например, представителни аналози на КфР са AN3/C(15)S и ANB/C(15)S. Такива аналози са съставени чрез отсичане на пьрвите три аминокиселинни крайни остатьци на КФР или заличаване на пьрвите осем амино-крайни остатька на КфР, съчетани с заместване на цистеина при мястото на аминокиселина номер 15 с друга аминокиселина, напр. серин.

Когато аналозите на КфР са биологически производни,т. е.

са продукти на целударна експресия, което е противоположно на продуктите на синтеза на твърда база, протеолитна или ензимна дериватизация на природносрещаните продукти, и т. н. , нуклеиновите киселини, които кодират такива полипептиди, ще се различават по един или няколко неклуотида, в сравнение с нуклеотидния ред на природния кфР. Такива полинуклеотиди могат да ; бъдат експересирани, като резултантниятполипептид може да бъде пречистен по един от многото методи на рекомбинантна технология, известни на специалистите.

Кодирането на ДНК последователностите за целите или част от аналозите на КфР може да включва, между другите неща, въвеждане на кодони “предпочитани за «« експресия в избрани клетки-инкубатори Снапр.

“кодони за експресия на

Е. coli“} , осигуряване на места за разцепване чрезрестриктивни ензими и осигуряване на допълнителни начални, крайни или междинни нукл еотидни редове

Снапр.

първоначал ен метионинов аминокиселинен остатък за експресия в клетки на

Е. col i} , с оглед благ оприятствуване на конструирането на лесно експресирани вектори.

Настоящото изобретение осигурява също рекомбинантни молекули или вектори за работа по метода на експресия на полипептиди. Такива вектори могат да бъдат съставени от ДНК и РНК и могат да бъдат кръгли, линейни,просто разклонени или двойно· разклонени по природа и могат да бъдат налични в природата или сбор от разнообразни компоненти, било природно налични или синтетични.

Известни са много примери на такива вектори на експресия.

Компонентите на векторите, напр. реплики, избрани гени.

ускорители, промотори и други подобни, могат да бъдат получени от естествени източници или да бъдат процедури. Във всеки отделен случай синтезирани чрез известни векторите на експресия, прилагани това изобретение, ще съдържат поне един експресио-контролиран елемент, свързан

Функционално въведената молекула на нуклеинова киселина, кодиран» полипептидния аналог на

КФР. Този контролен елемент отговаря за регулирането на полипептидната експресия от молекулите на нуклеиновата киселина на това изобретение. Между полезните елементи за контрол се включват например, система lac. система trp, операторите и промоторите от фаг λ, промотор на гликолитични дрожди, промотор от ген на дрождева кисела фосфатаза, дриждев фактор на алфа съчетание и промотори, изведени от аденовирус, вирус на Epstein-Barr, полиома, симиан вирус, както и онези от различни ретровируси. И все пак в тази област са известни други многобройни вектори и контролни елементи, подходящи за прокариотна и еукариотна експресия, годни за прилагане в практиката на изобретението.

Примери на подходящи вектори за прокариотно клониране може да включват плазмиди от Е.coli Снапр. рВ322, col El, pUC и F-фактор?_? като предпочитаните плазмиди са pCFM1156 (АТСС 69702), pCFM1656(Atcc 69576) и pCFM3102 (описани в раздела ПРИМЕРИ по-долу?. За тези цели могат да бъдат прилагани и други подходящи вектори на експресия, от които са известни редица типове за експресия при бозайници, насекоми, дрожди, микроскопични гъби и бактерии. Трансфекцията на тези вектори в подходящи клетки инкубатори, може да доведе до експресия на полипептидни аналози на КФР.

Микроорганизмите инкубатори, полезни за това изобретение, могат да бьдат или прокариотни или еукариотни. Подходящи прокариотни инкубатори са Е. coli (напр. FM5, НВ1О1, DH5cx, DH1O и МС1061), щамове на Pseudomonas, Bacillus, щамове на стрептомицети, като се предпочита Е. coli. Подходящи еукариотни клетки инкубатори включват дрожди и други Фунги, клетки на насекоми, клетки на растения и животни, такива като CCS Снапр. COS-1 и COS-7? и редове от маймунски клетеки CV-1, редовете ЗТЗ, изведени от Швейцарски, Balb-c или NIH клетки, HeLa и L-929 миши клетки и СНО, ВНК или НаК хамстерни клетки. В зависимост от възпхриетия инкубатор, рекомбинантнтите полипептиди, които се произвеждат в съответствие с тези методи, гликозилирани с въглехидрати на бозайници или дряуги или могат да бъдат не^ликозилирани.

Предпочитаният метод на получаване ще варира в ще бъдат еукариоти зависимост от много фактори и съображения, като оптималната процедура за производство за дадена ситуация ще става явна за професионалистите след минимално експериментиране. След това полученият продукт на експресия може да бъде пречистен до близка хомогенност, като се използуват процедури, известни в областта. Типична процедура за пречистване в производството на прокариотни клетки включва разкъсване на клетъчните стени при високо налягане или чрез други средства, центрофугиране или Филтруване за отделяне на клетъчните стени, последвано от йонообменна хроматография на супернатантата или филтрата и накрая хидрофобна хроматография. Ако аналогът експресира в неразтворима форма, друга методика на пречистване включва първо солюбилизацияна включените тела, съдържащи аналозите, последвана от йонообменна хроматография, след това разгъване на протеина и накрая хидрофобна хроматография. Примерни методи на пречистване са описани в разпространените като собственост USSN 08/323,339, регистрирани на 13 окт. 1994. Обикновено USSN 08/323 339 препоръчва метод за пречистване на кератиноцитен фактор на растежа, който се състои от: Са? получаване на разтвор, съставен от КфР; Св) свързване на КфР от този разтвор, приготвен в Са) към катионообменна смола, Сс) елюиране на КФР в разтвора из катионобменната смола; Cd3 или прекарване на елюата от част CcD през подходяща матрица за отсяване по тегло или изпълнение на хидрофобна интерактивна хроматография върху елюата разтвор от част СcD, и Се) улавяне на КфР от матрицата на молекулното сито или хидрофобната интерактивна хроматография.

Разбира се, аналозите могат бързо да бъдат отсяти за оценка на техните физични свойства. Разделът ПРИМЕРИ описва; няколко известни проби за стабилност, въпреки че използуваните конкретни проби за изпитване на аналозите не са критични. Освен това нивото на биологична активност Снапр. рецепторно свързване и/или афинитет,митогенна активност, клетъчно пролиферативна и/или in vivo активност могат да бъдат също изпитвани, като се използуват разни биологични проби, някои от които се описват в раздела ПРИМЕРИ: Редица проби са добре известни и могат да бъдат прилагани за бърз скрининг на аналозите на КфР, с оглед определяне на това дали или не , те притежават приемлива биологична активност. Една такава биологична проба по конкретно изпитва аналозците на КфР за възможности да свързват рецептор на КФР СКфРРЗ при конкуриране с ъс свързване на КфР и I CBotaro et al (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:2984-2988). Алтернативен метод за тестване по биологичен пьт на взаимодействията на аналозите тип КФРР/КФР включва прилагането на методи като анализ на биоспецифично взаимодействие в реално време CBIA? СFelder et al. (1993), Molecular & Cellular Bioloqy, 13:1449-1445). Може да бъде приложена и митогенна биологична проба за изпитване на възможностите на аналозите на КФР да стимулират синтези на ДНК CRubin et al. (1989), supra). Най-накрая, могат да бъдат приложени биологично проби за пролиферация на клетки за изпитване на годността на аналозите на КФР да стимулират пролиферация на клетките CFalco et al, 1988). oncoqene 2: 573-58). Използувайки коя да е от споменатите системи за биологична проба, аналозите на КФР могат лесно да се подложат на отсяване по биологична активност.

В едно предпочитано изпълнение, настоящето изобретение е насочено към аналози на КФР, които запазват пълната Ст.е. поне съществено подобната? in vitro или in vivo биологична активност на естествения КФР. Примерни аналози на КФР с такива свойства.

както са определени чрез един или няколко от горните биологични проби, са С(1,15)S

AN3/C(15)S,

AN3/C(15)-,

AN8/C(15)S,

AN8/C(15)-, ΔΝ15, ΔΝ16. ΔΝ17, ΔΝ18,

AN19, AN20,

ΔΝ21, AN22,

ΔΝ23. N24 или XN23/R(144)Q

Аналозите на КФР могат да бъдат модифицирани и понататък,така че да съдържат допълнителни химичес ки г рупи, които нормално не са част от пептида.

Такива произ водни г рупи могат да подобрят разтворимостта, абсорбцията, биологичния полуживот, и живота на аналога на

КФР. Групите могат да елиминират или разсеят всяко нежелателно странично действие на протеина и подобните му. Групи, които са годни да регулират такива въздействия са разкрити например в......REMINGTON

PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed . , Mack

Publishing Co

Easton ,

РА (1990). В молекулата могат да бьдат вьведени и ковалентни модификации чрез реагиране насочено кьм аминокиселинни остатьци на пептида с органичен дериватизиращ агент, който може да реагира c избрана странична верига или краен остатьк

СТ.Е.Creiqhton (1983),

PROTEINS:STRUCTURE

AND

MOLECULE

PROPERTIES, W.H. Freeman & CO

San Francisco, рр

79-86)

Полиетиленгликольт CPEG?

е едно такова химично средство, което е използувано при получаване на терапевтични белтъчни продукти. При някои протеини, присъединяването на полие^тиленгликол, както е показано, може да защити организма срещу протеолиза, Sada et al. (1991), J. Fermentation Bioenqineerinq 71:137-139, а методи за присъединяване на различни групи от полиетиленгликол са известни. Виж US AT No. 4, 179,337, Davis et al

Non-Immunoqenic Polypeptides, издаден на 18 дек. 1979 г и US PAtent No. 4 002 531, Royer Modifyinq enzymes with

Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, издаден на 11 януари 1977. За обзор по вьпроса, виж Abuchowski et al. в enzymes and druqs. (Holcerberq and Roberts (eds.) pp. 367-383 (1981)). За полиетилен гликол са използувани разнообразни средства за присъединяване на молекули кьм протеин. Обикновено молекулите на полиетиленгликола се свьрзват кьм протеина чрез реактивни групи, установени вьрху протеина. Амино групите, като тези на лизиновите остатьци или кьм N-крайната верига са удобни за такова присъединяване. Например, Royer (US Pat. No. 4 002 531 по-горе? постановява, че редуктивното алкилиране е използувано за присъединяване на молекули на полиетилен гликола кьм ензим. ЕР 0 539 167» публикувано 28 април 1993, Wriqht

Pea Imidates and Protein Derivatives Thereof постановява, че пептиди и органични съединения със свободни аминогрупи се модифицират с едно междинно производно на PEG или сродни водоразтворими органични полимери. Един патент на САЩ US Pat. No. 4 904 584, Shaw, издаден 27 февруари 1990, се отнася до модификация на редица лизинови остатъци в протеини за присъединяване на молекула полиетиленгликол чрез реакционноспособна аминогрупа.

В едно друго изпълнение, настоящото изобретение е насочено кьм въвеждане на единична доза от медицинска рецептура, която да може безопасно да бъде администрирана парентерално или през устата, при лечение на болест при топлокръвните животни С какъвто е човека?. Такъв медицински състав може да бъде във форма на лиофилизиран или по друг начин дехидратиран терапевтик или диагностично средство, което може да бъде разложено при добавяне на физиологично приемлив разтвортел. Разтворителят може да бъде всяка среда, като стерилна вода, физиологичен разтвор, гликозен разтвор или други водни въглехидрати Снапр. полиоли като манитола, ксилитола или глицерина?, които са годни за разтваряне на твърди състави, съвместими с избрания път на въвеждане и които не се месят негативно с активното си вещество и включените в тях стабилизатори на разлагане. В едно конкретно изпълнение, настоящото изобретение е насочено към един набор за производство на единици за администриране на единица доза. Набора съдържа както първия контейнер със твърд протеин, така и втори контейнер с воден състав, състоящ се от стабилизатор на разлагане. Щр се отнася до концентрацията на протеина в разтвора, обемът на разтвора, който се зарежда във всеки контейнер, както и капацитета на контейнерите

Свзаимосвързани параметри, които могат да се модифицират по подходящ начин,в зависимост от желаната концентрация на активното вещество в единицата на крайно дозиране}, те могат да варират в рамките на широк обхват известен на професионалистите.

Аналозите на КФР съгласно изобретението могат да бъдат полезни като терапевтични и диагностични средства и като изследователски реагенти. Така аналозите на КфР могат да се използуват в in vitro и/или in vivo диагностични проби при даване на количествена оценка на величината на КФР в тъканта или примерния орган или при клетки, които експресират КфРР Chem. 265: 12767-12770, Ron et

2984-2988). В биологични проби по-ниска радиоактивност при свързване на сравнение със стандартизираната крива на определяне и/или изолиране на

CBottaro et	al	(1990)	, J-	Biol .
al. (1993).	J.	Biol .	Chem.	268:
на тъкани или	органи	се	явява

йод¹²³-КфР към КФРР, в свързване на I-КфР аналог, благодарение на небелязания природен КфР свързан с⁴

КфРРл.По съшия начин употребата на комплекса йод 125-КФР аналог може да бъде използуван за откриване на присъствието на КфРР в различни типове клетки.

Това изобретение също прокламира употребата на един аналог на КФР при генериране на антитела, изработвани срещу пептида, които антитела съшр свързват естествения КФР. В това изпълнение, антителата са моноклонални или поликлонални по произход и се генерират, като се използува един аналог на КфР. Получените в резултат на това антитела свързват преференциално природния КФР, с предпочитание , когато протеинът е в своята естествена Сбиологично активна} конформация. Тези антитела могат да бъдат използувани за откриване или пречистване на естествен КФР.

Освен това, изобретението прокламира употребата на аналози на КфР при откриване на високо афинни или ниско афинни КФР—свързващи молекули, които имат терапевтично приложение, например, като начин за ефикасно доставяне на КФР или като един инхибитор на активността на КФР. Термичната стабилност на аналозите на КФР е важна за идентифициране на такива свързващи молекули при физиологични условия Ст.е. при 37⁰ О , тъй като техният афинитет за КФР би могъл да бъде силно температурно зависим и може да бъде непредсказуем от афинитета наблюдаван при 4^С.

За употреба in vivo аналозите на КФР могат да бъдат съставени с адитиви. Такива добавки са буферите, носителите, стабилизаторите, неактивните пълнители, консервантите, средствата за регулиране на тонуса, антиокислителите и други подобни Снапр. средства за регулиране на вискозитета или средства за разширяване}. Подборът на специфични добавки ше зависи от Формата на съхранение Ст.е. течна или лиофилизирана} и от начина на администриране на аналога КФР. Подходящи рецептури, известни в професията, могат да бъдат намерени в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (последно издание}, Mack Publishinq Company, easton. PA.

Аналозите на КФР могат да бъдат приложени в терапевтично ефективни количества в тъкани, конкретно характеризирани като увредени, до клинично недостатъчен брой нефибробластни епителни клетки. Областите, в които могат да бъдат успешно приложени аналозите на КФР, включват, но не се ограничават до тях, стимулиране, пролиферация и диференциране на аднексални структури, като космени фоликули, потни жлези, мастни жлези при пациенти с обгаряния и други частични или пълни рани, ускорена реепителизация на поражения j предизвикани от epidermolysis bullosa. което е дефект в допир с епидермиса кьм лежащия под него дермис, което води до често отваряне, болезнени мехури, които предизвикват силна болезненост; предпазване от алопеция, предизвикана от хемотерапия и лечение на плешивост или прогресивна загуба на коса при мъже и жени, лечение на стомашна и дуоденална язва; лечение на възпалителни коремни болести, такива като болеста на Crohn Свъздействаща предимно на тънките черва, както и язвен колит Сувреждащ предимно дебелото черво}; предпазване или намаление на токсичност в червата при лъчева и хемотерапия чрез третирането им Снапр. предварителна обработка и/или следваш» обработка} за индуциране на цитопротективно въздействие или регенерация или и двете; стимулиране на производството на мукус през гастроинтестиналния тракт; предизвикване на пролиферация и диференциация от пневмоцити тип 11 , което може да помогне при лечение или предпазване от заболяване, като болест на хиалиновата мембрана Ст.е. детския синдром на респираторна нарушение и бронхопулмонарна дисплазия} при недоносени бебета; стимулиране пролиферация и диференциация на бронхиоларната и/или алвеоларна епителна тъкан, свързано с остро или хронично увреждане на дробовете или недостатъчност, дължаща се на увреждане от инхалация

Свключително от високо ниво на кислород}, емфизема, употреба на хемотерапевтици увреждащи белия дроб, вентилаторна травма или други обстоятелства, увреждащи белите дробове; разширяване функцията на черния дроб за лечение или предпазвнане от хепатична цироза, скоротечно поражение на черния дроб, поражение у предизвикано чрез остър вирусен хепатит и/или токсични инсулти към черния дроб; индуциране на регенерация на роговични клетки, например при лечение на абразия на роговицата; предизвикване на регенерация на епителни клетки при лечение на прогресивно заболяване на венците; индуциране регенариця на тимпанични епителни клетки при лечение на поражения на слуха от барабани и лечение или предпазване от възникване на захарен диабет или използуването му като спомагателно средство при трансплантация на островни клетки.

На даден пациент, който изпитва нужда от пролиферация на нефибробластни епителни клетки, се дава ефективно количество от аналог на КФР. Ефективно наричаме такова количество от аналога КфР, изискуемо за предизвикване на желаната реакция при пациента, който е подложен на лечение, и което ше бъде предписано обикновено от съответния лекар, факторите, влияещи в/у количеството на аналога на КфР, което следва да се въведе, включват възрастта и общото състояние на пациента, болестта, която трябва да се лекува и др. Типичните дози варират между 0.001 mg/kg и 500 mg/kg телесно тегло.

Аналогът на КфР може да се въведе безопасно парентерално Снапр. чрез IV, IT. IM. SC или IP пьтиша?, орално или повърхностно при топлокрьвни животни С като хората}.

Аналогът на КФР може да се използува веднаж или да се въвежда повторно, в зависимост от болеста и условията на пациента. В някои случаи КфР аналог може да се въведе като помощно средство по отношение на друга терапия, а съшр с други фармацевтични препарати.

За по-пълна Илюстрация на настоящето изобретение са описани следните примери.

ПРИМЕРИ

Стандартните методи,засягащи описаните процедури в следните примери, както и подходящи алтернативни процедури, могат да се вземат от някои широко признати наръчници по молекулярна биология, такива като например Molecular Cloninq. второ издание, Sanbrook et al.. Cold Sprinq Harbor Laboratory Press (19Θ7) и Current Protocols in Molecular Bioloqy, Ausabel et al. Green Publishinq associates/Wiley Interscience. New York (1990).

ПРИМЕР 1_: Получаване на ДНК кодиране за КфР и аналози на КФР.

Клонирането на гена на човешки кератиноцитен фактор на растежа СКФРЗв пълна дължина Скодиране на полипептид с последователността на природния КФР? бе проведено както чрез верижна реакция с полимераза СВРП? на РНК от животинска клетка, така и чрез верижна реакция с полимераза СВРГО на химически синтезирани Соптимизиран кодон на E.coliJ олигонуклеотиди СОЛИГО). По-долу са описани и двете процедури;

Бе проведено усилване на ВРП с РНК, изолирана от клетки, известни с производство на полипептида. Първоначално клетки от човешки фибробластни клетки - ред AG1523A (получени от Human Genetic Mutant Cell Culture Repository Institute for Medical Reserach, Camden, New Jersey) бяха разрушавани c гванидиум тиоцианат, последвано от екстракция Ссъгласно метода на Cho.yzinski et al. (19Θ7), Anal. Biochem., 172:156). Използувайки протокол на стандартна реверсивна транскриптаза за тотална РНК, бе генерирана сДНК на КФР. Усилването чрез ВРП СВРПЙ1) на гена на КфР бе проведено с сДНК на КФР, като шаблон и праймери ОЛИГО#1 и ОЛИГОИ2, които кодират ДНК последователности веднага 5' и 3' от гена на КфР [Термоциклиращо устройство Модел 9600 СPerkin-Elmer Cetus. Norwalk, СТ; 2Θ цикъла; всеки цикъл се състои от една минута при 94°С за денатуриране, две минути при 60° за каляване и три минути при 72°С за удължаване] След това като шаблон бе използувана малка аликвотна част от продукта на ВРП#1 и бе провеждано второ усилване с ВРП на КФР СВРП#23, идентично на условията на цикъла;описани по-горе, с изключение на това, че температурата за каляване бе 50°С. За клониране чрез експресия на гена на КФР бяха използувани вгнездени праймери на ВРП за създаване на подходящи места за рестрикция в двата края на гена на КФР. С помощта на ОЛИГОИЗ и ОЛИГО#4, ДНК-продукта на КФР бе модифициран от ВРП#2_?така че да влючва рестриктивните места Mlul и ВатНТ в краища S' и 3' на гена, съответно [ВРП#Зм 30 цикъла; всеки цикъл се състои от една минута при 94°С за денатурация, две минути при 6О°С за каляване и три минути при 72°С за удължаване]. Тази ДНК бе в последствие отрязана с Mlul и ВатНТ, екстрахирана с фенол и утаена с етанол. След това бе ресуспендирана и подложена на лигация Сс лигаза Т43 в плазмид PCFM1156 Сфиг. 2AJ , съдържаща една сигнална последователност RSH за конструиране на RSH-КФР Сфиг. 33 Продуктите на лигация бяха трансформирани Ссъгласно метода на Hanahan(19Θ3), J.Mol. Biol. 166:557) в Е coli шдм FM5 (ATCC:53911) и нанесена върху LB+канамицин при 28°С. Няколко трансформанта бяха избрани и култивирани в малки течни култури,съдържащи 20 цц/mL канамицин. Плазмидът RSH-КФР бе изолиран от клетките на всяка култура и бе преобразуван в последователност ДНК. Поради наличието в гена на КФР на едно вътрешно място Ndel , не бе възможно директно клониране на естествената последователност на гена в желания вектор на експресия с ограничителни места от двете страни като скоби, сьотв Ndel и BamHI. Това бе осъществено като трипътна лигация. Плазмид RSH-КФР бе отрязван с уникалните рестриктивни места BsmJ и SstlH след електрофореза през 1 % агароза гел, бе изолиран един ДНК-Фрагмент ~3 kbp (съдържащ края 3' на гена на КфР?. Бе провеждана ВРП СВРП#4?, както е описана при ВРП#3, с изключение на заместването с на ОЛИГО#3 с ОЛИГО#5 . След това ДНК-продукта на ВРП бе отрязван с Ndel и BsmI и , след електрофореза през 4 % гел на агароза, бе изолиран фрагмент на ДНК 311 Ьр. Третото парче на лигацията е фрагмент на ДНК 1.Θ kbp на PCFM1156, отрязан с Ndel и SstI, спец електрофореза през г1 % гел на агароза. След лигация Сс лигаза Т4?, трансформация, избиране на канамицин и генериране последователност на ДНК, както е описано по-горе, бе откъсван клон, съдържащ конструкцията от Фигура 4 и плазмида, означен с КфР. Поради наличие на едно вътрешно свързващо място на рибозом, което произвежда отсечени продукти, ДНК-последователността на КФР между уникалните места Крп! и EcoRI бе заместена с химически синтезирани олигонуклеотиди ОЛИГОИб до ОЛИГО#11? за минимизиране употребата на вътрешно стартово място Сфигура 5?.

OLIGO#1	(SEQ	ID	NO:7):	5'	-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'
0LIG0#2	(SEQ	ID	N0:8):	5'	-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA—3
0LIG0#3	(SEQ	ID	N0:9 ) :	5'	-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3
0LIG0#4	(SEQ	ID	N0:10):
	5'	-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'
OLIGO#5	(SEQ	ID	N0:11):
	5'	—ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'
0LIG0#6	(SEQ	ID	N0:12):

5'-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'

0LIG0#7	(SEQ ID N0:13): 5'-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-l'
OLIGOttS	(SEQ ID N0:14): 5'-GTCGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'
0LIG0#9	(SEQ ID N0:15): 5'-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3'

0LIG0#10 (SEQ ID N0:16):

5'-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3'

OLIGOttll (SEQ ID N0:17):

5'-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'

ОЛИГО-нуклеотидите бяха фосфорилирани c T4 полинуклеотид киназа и след това бяха денатурирани термично. Единично откъснатите Стип ss) ОЛИГО бяха оставяни да образуват фрагмент ДНК ds чрез оставяне на температурата да спадне бавно до стайна. След това бе използувана лигаза Т4 за ковалентно свързване на двете вещества, именно вътрешните ОЛИГО лепливи крайща и целия ds ОЛИГО фрагмент към плазмида на КфР, отсечен с ΚρηΙ и EcoRI. Новият плазмид бе означен като КФР Cdsdl·.

Един напълно оптимизиран с кодон ген на КфР чрез Е coli бе конструиран чрез усилване с ВРП на химически синтезирани ОЛИГО# 12 до 24.

0LIG0#12	(SEQ	ID	N0:18):	5 ·	-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3
0LIG0#13	(SEQ	ID	N0:19):	5'	-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3
0LIG0#14	(SEQ	ID	N0:20):

5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTACTGCTCCAAGCCCGGAACGT-3'

0LIG0#15 (SEQ ID N0:21):

5'-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT3Θ

GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3'

OLIGO#16 (SEQ ID N0:22):

5'-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3'

0LIGO817 (SEQ ID N0:23):

5‘-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

0LIG0#18(SEQ ID N0:24):

5'-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3’

0LIG0#19 (SEQ ID N0:25):

5'-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

0LIG0#20	(SEQ	ID	N0:26):5'	-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3'
0LIG0#21	(SEQ	ID	N0:27):5'	-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3'
0LIG0#22	(SEQ	ID	N0:28):5'	-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3'
0LIG0#23	(SEQ	ID	N0:29):5'	-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3'
0LIG0#24	(SEQ	ID	N0:30):5’	-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

ОЛИГО #12 до 24 бяха разчетени така, че цялата ДНК последователност, кодираща природния КфР, бе представена с ОЛИГОнуклеотиди с усукване тип Watson или тип Crick и след усилване с ВРП, би произвела желаната двойно усукана ДНК последователност Сфигура 6?. [ВРП#5, термоциклиращ прибор Модел 9600, Perkin-Elmer Cetus]; 21 цикъла, като всеки цикъл се състои от 31 секунди при 94°С за денатурация, 31 сек. при 50°С за каляване и 31 сек. при 73°С за удължаване; след завършване на 21 цикъла, ВРП завършваше с краен етап на удължаване 7 минути. След усилване с ВРП, фрагмента на ДНК бе отсичан с Xbal и BamHI, като фрагмента 521 Ьр бе лигатиран в експресиран плазмид pCFM1156, отсечен сьс съшите ензими.

ВРП#5 оползотворява външните праймери

С100 pmole/100 μΐ rxn) 0LIG0#12 и 0LIG0#13 и μ1/100 μΐ rxn на шаблон на КФР, получен като дериват чрез лигация Сс Т4 лигазаЗ на 0LIG0#14 до OLIGO#19 (OLIGO#15 до

OLIGO#1B бяха

Фосфорилирани с Т4 пол инукл еот ид киназаЗ чрез използуване на □LIGO#2O до 0LIG0#24 в качеството на помощни ол иг о -сьединения [Jayarama et al (1992) ,

Biotechniques. 12:392] за осъществяване на лигацията. Крайният продукт бе конструкция _f представляваща обозначен КфР Соптимизиран чрез йоден).

Всички аналози на КфР, описани тук, са сьставени частично от последователности на ДНК, установени в КфР Cdsd) или в КфР Соптимизиран с кодон? или в комбинация на тези двете.

Последователностите се модифицират по-нататьк чрез въвеждане в удобни рестриктивни сайтове, на ДНК последователности, които кодират конкретни аминокиселини на аналог на КФР, изпьлнявано чрез оползотворяване на една или повече от гореописаните методи за синтез на фрагменти на ДНК. Всеки от аналозите може да бьде генериран в тяхната цялост чрез гореописаните методи. И все пак, като част от общото проектиране с ОЛИГОнуклеотиди, там_?кьдето подхожда,бяха използувани оптимизирани кодони на Е. coli, вьпреки че присъствието на кодони^ оптимизирани чрез Е.coli, частично или вьобще за всеки от гените, кьдето това бе проучвано, не повишаваше значително добива на протеин, който би могъл да бьде получен от култивирани бактериални клетки, фигури 7 до 24 и 37 до 50 представят чрез удобни примери, практически конструкции от последователности на нуклеотиди и аминокиселини, характеризиращи конкретни аналози на КфР, а именно CC1.153S (Фигура 73; AN3/C(15)G( фигура 8?: AN3/C(15)S- фигура 93:

ΔΝ8/0(15)5 (Фигура 10?: ΔΝΘ/Ο 15)-(фигура 11}: ΔΝ15 (фигура 12}; ΔΝ16 (фигура 13}; ΔΝ17 (фигура 14}; ΔΝ18 (фигура 15};

ΔΝ19 (фигура 16}; ΔΝ20 (фигура 17}; ΔΝ21 (фигура 18} ΔΝ22 (фигура 19}; ΔΝ23 (фигура 20}; ΔΝ24 (фигура 21};

C(l, 15)S/R(144)E (фигура 22}; С(1.15)S/R(144 ) 0 (Фигура 36’^; С(1.15. 102) 5 (фигура 37

С(1,15.102. 106)5 (Фигура 38} ;

(Фигура 40 );

( Фигура 42);

( Фигура 44 } ;

(Фигура 46} ;

ΔΝ23/Ν(137)Е

ΔΝ23/Κ(139)0

AN23/R(144)Е

ΔΝ23/Κ(147)Е

ΔΝ23/Κ(153)Е (фигура 39):

(Фигура 41 ):

( Фигура 43 ) :

( фигура 45 ):

( Фигура 47 ) ·

ΔΝ23/Κ(139)Е

AN23/R(144)А

AN23/R(144)L

ΔΝ23/Κ(147)0

ΔΝ23/Μ153)0 (Фигура .48}; и ΔΝ23/0(152)Е/К(153)Е (фигура 49 Всички конструкции аналози на КФР, описани тук , бяха потвърдени последователности на ДОН.

ПРИМЕР 2: Производство в Е.coli

А. Експресия на КФР аналози.

При клониране на гените на аналози на КфР бяха използувани три различни експресни плазмида. Те бяха следните-. PCFM1156 (ATCC# 69702), pCFM1656 (ATCC# 69576). и PCFM3102 (съотв. фигури 2А, 2В и 20 . Плазмидът р3102 може да се получи като производно от плазмида pCFM1656 чрез получаване на редове от ориентираните към места изменения с ВРП с препокриващ се олигомутагенезис. Начиная с място BolII (pCFM1656 плазмид bp # 180) непосредствено 5' до промотора на плазмидна репликация. , РсорВ, и процедиране към гените на плазмидна репликация, измененията на базовата двойка са следните.

PCFM1656 bp # bp в pCFIH1656 bp променено в pCFM31O2

#	204	T/A	C/G
#	428	A/T	G/C
#	509	G/C	A/T
#	617	- -	въвеждане на два G/C bp
#	677	G/C	T/A
#	978	T/A	C/G
#	992	G/C	A/T
#	1002	A/T	C/G
#	1005	С/Б	T/A
#	1026	A/T	T/A
#	1045	C/G	T/A
#	1176	G/C	T/A
#	1464	G/C	T/A
#	2026	G/C	заличаване bp
#	2186	C/G	T/A
#	2479	A/T	T/A
#	2498-2501	AGTG	GTCA
		TCAC	CAGT
#	2641-2647	TCCGAGC	заличаване bp
		AGGCTCG
#	3441	G/C	A/T
#	3452	G/C	A/T
	3649	A/T	T/A
#	4556	—	въвеждане bps

(SEQ ID N0:67) 5'-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3' (SEQ ID N0:68) 3'-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5'

Както се вижда по-горе, pCFI*IH56 , .pCFI41656 и pCFM3102 са много сходни помежду си и съдържат до голяма степен еднакви рестриктивни места. Плазмидите бяха избрани по признака на удобство, а векторните ДНК компоненти могат лесно да бъдат разменени за целите на нови структури. Клетката инкубатор, използувана при всички клонирания, бе Е. coli щам FM5 (АТСС:53911), а трансформациите бяха проведени Ссъгласно метода на Hanahan (1983), supra) или чрез електроелюиране с Gene Pulser transfection апарат CBioRad Laboratories, Inc., Hercules, СА) съгласно указанията на производителя.

Първоначално малко количество прясно култивиран инокулум на желания клон на рекомбинантна Е. coll, дала убежище на желаната структура на един от трите вектора pCFM, бе стартирана чрез пренасяне на Ο.1 mL замразена в глицерин колония от подходящ щам в 2-литрова колба, съдържан® 500 мл хранителна среда Luria. Културата бе разклащана при 30°С в продължение на 16 часа, след което културата бе прехвърляна в 15 литров ферментатор, съдържащ 8 литра стерилна среда CTsai et al. (1987), J. Industrial Microbiol., 2:181-187).

Бе стартирана ферментация c периодично подхранване чрез въвеждане на среда Feed#l (Tsai et al. (1987), supra). Когато 0D600 достигаше 35, бе предизвиквана експресия на желания аналог на КфР чрез бързо повишаване на температурата на културата до 37°С в продължение на два часа, след това още веднаж до 42°С за денатуриране на репресора CI. Пускането на захранването Feed#l бе прекъсвано в полза на захранване Feed 2, като скоростта на пропускане бе първоначално 300 мл/час. Захранване Feed 2 бе съставено от 175 g/L триптицаза—пептон, 87.5 g/L дрождев екстракт и 260 g/L глюкоза. След един час при 42°С.. температурата на културата бе понижавана до 36°С, на което ниво температурата бе поддържана в продължение на оше 6 часа.

След това ферментацията бе преустановявана и клетъчната маса бе изолирана чрез центрофугиране в пластмасови торби, поставени в едно-литровите бутилки на цент рофуг ата.

Клетките бяха гранулирани чрез центрофугиране при

400 об/мин в продължение на 60 минути, след което бяха отделяни супернатантите и пастата от клетъчна маса бе замразявана при

-9О°С.

След експресията на различните аналози на

КФР

Е.coli , природния

КФР, природните протеини

СС1,15?S,

С(1,15)S/R(144)Е, С(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 и

AN23/R(144)Q бяха пречиствани съгласно следните процедури. Клетъчната паста, получена вследствие на ферментацията с висока плътност на биомаса, бе суспендирана при 4 °C в О. 2 М NaCI, 20 mN NaPQ^, pH 7.5, като 10-20 % разтвор Стегло в единица обем?, с помощта на подходящ миксер с висока степен на срязване. След това суспендираните клетки бяха подлагани на лизис чрез прекарване на разтвора три пъти през хомогенизатор CAPV Gaulin, Inc., Everett, МА). Изтичащият хомогенизат бе охлаждан до 4-8°С с помощта на подходящ топлообменник. Остатъците бяха отделяни

ТМ чрез центрофугиране на лизата в центрофуга J-6B (Beckman Instruments, Inc., Brea, СА), оборудвана с ротор JS 4.2 при 4,200 rpm в продължение на 30-60 min при 4°С. След това супернатантите бяха внимателно декантирани и заредени в предварително подготвена колона от 450 мл С5 cm х 23 cm) на йонообменна смола S-Sepharose Fas Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ) _? уравновесена c 0. 2 M NaCI, 20 mM NaPO*, pH 7.5 при 4°C. След това колоната бе промивана с обем, равностоен на пет обема на колоната С2250 мл? 0.2 М NaCI . 20 mM NaPO , pH 7.5 при 4°С. Желаният протеин бе елуиран чрез промиване на колоната с 5 литра 0.5 М NaCI , 20 mN NaPO*. pH 7.5. Бяха отбирани 50 мл-ови Фракции, като А от изтичащия обем бе подлаган непрекъснато

280 на текущ контрол. Фракции, идентифицирани чрез А като

280 съдържащи елуиран материал, бяха анализирани чрез SDS-PAGE с 14 % гелове за потвърждаване присъствието на желания· полипептид.

Онези фракции, съдържащи интересуващите ни протеини, бяха събирани, след това бе добавян равен обем дестилирана вода. След това разредената проба бе зареждана в предварително подготвена колона 450 мп С5 см х 23 cm? със S-Sepharose Fas F1 ow, уравновесени c Ο. 4 M NaCI. 20 mM NaPO*, pH 6.8 при 4°C. Колоната бе промивана c 2250 мл Ο. 4 M NaCI , 20 mM NaPO . pH

6. 8, а протеинът бе ел^-ipaH с помощта на обем_?равностоен на 20 колонни обема, с линеен градиент в интервала от О. 4 М NaCI, 20 mM NaPO , pH 6. В до 0.6 М NaCI . 20 тМ NaPO , pH 6.8. Отново бяха

4 събирани 50 мл-ови фракции при текущ контрол с постоянно А

280 на изтичащата течност. Онези фракции, които съдържаха протеина С определен чрез 14% SDS-PAGE). бяха улавяни и концентрирани през мембрана УМ-10 Сс молекулно тегло!0 000? в клетка с разбъркване 350 куб.см CAmicon. Inc. Mayberry, МА) до обем 30-40 мл.

След това концентратът бе зареждан в предварително заредена ТМ

1300 мл колона С4.4 см х 85 см? смола Superdex-75 (Pharmacist уравновесена в колонен буфер,съставен от IX PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline. D-PBS, освободен от калций и магнезий? или 0.15 М NaCI, 20 mM NaPO*. pH 7.0.След циркулиране на пробата през колоната, протеинът бе елуиран от матрицата за гел филтрация, използувайки буфер. След това 1О мл-ови фракции бяха събирани и онези, които съдържаха аналог Сопределен чрез 14% SDS-PAGE бяха отделяни. Типичната концентрация на протеин бе около 5-10 мг/мл в резултантния обем. Всички процедури, описани по-горе, бяха изпълнявани при 4-8°С, освен ако не е указано друго.

За пречистване на природния КфР, CC1,153S и ΔΝ23 бе прилагана алтернативна процедура за пречистване. Ако не са изложени други условия, материалите и разтворите бяха поддържани при 23+ 5°С, а процедурата включваше следните етапи.

При завършване на продуктивната фаза на бактериална ферментация клетъчната култура бе охлаждана до 4-8°С и клетките бяха изолирани чрез центрофугиране или друг подобен процес. На база на очаквания добив протеин на единица тегло от клетъчната паста и количеството на необходимия пречистен протеин бе определяно подходящо количество клетъчна паста, което бе суспендирано в мек буферен разтвор, състоящ се от 20 mM NaPO , 0.2 М NaCl . pH 7.5; разтворът тежеше около пет пъти повече от теглото на клетъчната паста, подлежаща на суспендиране. Клетките бяха диспергирани до получаване на хомогенен разтвор с помощта на високоскоростен миксер. По време на хомегенизацията температурата на дисперсията от клетъчна паста бе поддържана при 4-8°С.

След това клетките бяха подлагани на лизис под налягане, например чрез двукратно прекарване на дисперсията от клетъчна паста през подходящ по големина клетъчен хомогенизатор. Хомогенната система бе поддържана в охладено състояние при 5+3°С. За пречистване на клетъчния лизат бе използувана предварително подготвена филтърна камера CCutno, Inc., Meriden. СТ), оборудвана с филтър с достатъчна филтърна повърхност, обработена с подходящ обем 0. 2 М NaCl. 20 mM NaPO*. pH 7.5. Обработката и пречистването бяха изпълнени при б+3°С. Преди пречистването бе използувано подходящо количество филтърна маса за предварително покриване на филтъра, която маса бе предварително смесвана с клетъчния лизат, след което лизатът бе избистрян чрез прекарване разтвора през филтърен филтърът бе промиван с 0. 2 М NaCl. 20 mN NaPO .

Филтратът и всяка следваща промивка бяха събирани в апарат.

pH 7.5.

охлаждан контейнер с подходяща вместимост, през цялото време поддържани при температура по-ниска от 10°С.

След пречистването лизатът бе прекарван през предварително подготвена колона с пълнеж от SP-Sepharose Fast Flow, съдържаща поне 1 мл смола на 2 грама клетъчна каша. Колоната с пълнеж от SP-Sepharose Fast Flow бе обработвана със студен С5+3°С 0. 2 М NaCl. 20 mN NaPO , pH 7.5. Температурата на колоната бе поддържана при температура , по-ниска от 10 С. Пречистеният лизат С5+3 О бе зареждан в йонообменна колона с линия на поглъщане на светлина 280 nm СА > за елуираното 2ВО вещество под непрекъснат текущ контрол. След зареждане на пробата колоната бе промивана със студен разтвор 0.2 М NaCl. 20 mM NaPO*. pH 7.5, следвано от промиване с 0. 3 М NaCl, 20 ml*1 NaPO , pH 7.5 при 23+5°С.

За да се елуира желаният протеин, бе използуван материал с линеен градиент в интервал от 0.2-1 М NaCl, 20 ml*l NaPO . pH

7,5. Продуктът бе събиран в няколко фракции при база на поглъщане на светлина А от елюата. Следвайки елуирането, тези фракции бяха събирани на едно място и обемът им бе отбелязван.

За окисление на свободните сулфхидрилни групи, бе изпълнена една стъпка на окисление. При протеини с променен цистеинов състав, в сравнение с природния КфР, бе прибавян окислителен агент Снапр. цистамин дихидрохлорид или друг подходящ окислител, напр. цистин, окислен глутатион или двувалентна мед?, достигайки крайна концентрация от 1-20 тМ, като pH бе регулирано на 7-9.5 с pH от 9+0.3, с предпочитание, когато бе използуван цистамин дихидрохлорид. Окислението бе провеждано при 1О-ЗО°С за подходящ период от време. За протеин от природен КФР окислението бе извършвано чрез добавяне на подходящо количество амониев сулфат /NH, /₂ SO₄ като 1-2 Μ i разтвор, регулирано pH на 7.5+0.5, и задържане при температури 23+5°С за подходящ период от време.

След окисление pH на разтворабе регулирано между 6.5 и 9. 5. При необходимост към разтвора бе добавян амониев сулфат до крайна концентрация 2 М. За отстраняване на твърди частици разтворът бе прекарван през подходящи пречистващи филтри.

филтрираният окислен продукт след това бе подлаган на хроматография с хидрофилно взаимодействие СХХВ?. Матрицата ХХВ представляваше смола от Butyl-650N Toyopearl (Tosohaas, Inc. Montgomeryville, PA). Разтворът, съдържащ протеин, бе зареждан вколона, първоначално обработена с разтвор на 2 М амониев сулфат, 20 mN NaPO , pH 7.0. След зареждане на пробата колоната бе промивана с 2 М CNH ) (S0) , 0,15 N NaCl, 20 mN NaPO , pH

2 4 4

7.0. След това желаният протеин бе елуиран чрез използуване на материал с намаляващ линеен амониевосулфатен градиент от 2-ОМ,

развит в	разтвор	с 0.15 М	NaCl	, 20 mN NaPO	pH 7.0. 4	Когато
желаният	протеин	започва	да	се елуира,	както това	показва
повишаването на	абсорбцията на	светлина с	дължина на	вълната

280 nm, именно А на елюата, бяха събирани фракции. Аликвотни

280

4Θ части от всяка фракция бяха анализирани чрез SDS-РАБЕ. Тези Фракции, съдържащи желания протеин, бяха събирани, добре разбърквани, и обемът на продукта бе количествено определян, както и концентрацията на протеин в него.

Протеин-съдържащият елюат от сборния контейнер след ХХВ бе концентриран, като бе обменян елуиращият буфер. Типичната концентрация , до която бе концентриран продуктът, бе 3.0-10.0 mg/mL. Члтрафилтрацията бе проведена, като бе използувана ултрафилтрационна система, оборудвана с касетна система тип РТБС Pellicon (Millipore, Inc., Bedford, МА), c подходящо оразмерена мембрана.

След концентриране, пробата бе диафилтрирана с помощта на подходящ буфер. Задържаната маса от етапа на концентриране бе диафилтриран с помощта на 0.2 М NaCl. 20 mM NaPO^, pH 7.0, до постигане на проводимост на задържаната маса в рамките на 5% от проводимостта на разтвора 0.15 М NaCl , 20 mM NaPO^, pH 7.0.

Освен това , за да се отделят утайките и бактериалния ендотоксин, какъвто може и да присъствува, концентрираната диафилтрирана протеин-съдържаща проба бе прекарвана през филтър с параметри Ο. 1 μπ\ Posidyne (Pall. Inc. Cortland. NY). След определяне на концентрацията на протеин в разтвора и на база на желаната концентрация на крайния продукт, разтворът бе разреждан с 0.15 М NaCl, 20 mM NaPO^, pH 7.0 до желаната крайна концентрация. След това бе провеждана асептична филтрация през филтър 0.22 рп, като крайният обемист продукт бе прехвърлян в свободен от пирогени контейнер за съхранение Спри около 5°О за следващо обработване в състави.

В. Анализ

Анализът бе провеждан с произведени в Е coli природен КфР;

C(1,15)S; C(1,15)S/R(144)Q·, ΔΝ15; ΔΝ23 и AN23/R (144 ) Q.

КонФормаиионна стабилност

Полипептидите бяха сравнявани по устойчивост на съхранение, температури на преход към термично разгъване СТ ) и стабилност в широк интервал на условия на pH.

Устойчивост при съхранение фигура 26 сравнява природния КФР и CC1,153S при съхранение в 20 тМ NaP04 » 0.15 М NaCI при pH 7. О и 37°С в продължение на 27 часа. C(1.15)S показа значително повишено количество на разтворим протеин относително на природния КФР.

На фиг. 26 _е сравнена стабилността на естествения КфР с /не са посочени данни/ тази на ΔΝΐΈΥπ С(1,15)5 в PES и в 50mM Na РО , 0.15 М NaCI, pH 7.0 след съхранение при 37°С в продължение на 18 часа. При съхранение във фосфат добивът на разтворим протеин е много по-висок в сравнение с този при PBS . ΔΝ15, както и CC1.153S показват значително повишена устойчивост в сравнение с естествения КфР. ΛΝ15 и CC1.153S също така дават 1ОО % запазване на състава във висш фосфат, както се очаква от резултата за естествения КфР.

Все пак, бе проведен един единствен предварителен сравнителен пример на устойчивост при съхранение между С( 1.15)5 и C(40)S (който се кодира чрез основите 201 до 684 от SEQ ID N0:1, с изключение на това, че Ser бе кодиран чрез AGA); и между С(1,15,102) и C(102)S (което е закодирано чрез базите 201 до 684 на SEQ ID N0:1. с изключение на това, че Ser се кодира чрез AGA). Резултатите Снепоказани} показват намалена устойчивост Ст.е. по-малко разтворим протеин след съхранение при 37°О. Все пак количеството на разтворимия, правилно нагънат протеин CC1,15,4O}S , който бе пречистван от културалната среда, бе по-голямо·, отколкото това за CC403S, което означава, че CC1,15,4O3S може фактически да е по-стабилен и че резултатите от сравнителния пример са неубедителни. Настоящото изобретение с предпочитание включва един аналог на КфР, който има друг вид замествания при Cys*°£ys^±OZ, Cys^1O<s и с по-голямо предпочитание изключва CC1,15,4O}S , C(l,15,102)S и 0(1,15,40.102. 106). _D ,

Възможностите на природен КФР, C/1, 15/S, ΔΝ23, С/1, 15/S/R/144/E, C(1.15)S/R(144)Q и 6N23/R(144)Q да избягва агрегиране при повишени температури съшо бе проучена. Проби, съдържащи 0.5 mg/mL протеин, бяха приготвяни в D-PBS. 0.5 мл от всяка проба бе отделена като аликвотна част в 3 куб. см стъклени флакони тип-1. флаконите бяха затваряни с гумени запушалки и 13 мм алуминиеви фиксатори. Тези флакони бяха поставяни в инкубатор при 37°С. На предварително определени интервали от време, флаконите бяха изваждани и анализирани за загуба на разтворим протеин. Видимите утайки бяха отделяни чрез центрофугиране на 250 ц1_ от всяка проба, през филтруващо устройство 0.22 μπ\ SPin-X (Costar, Cambridge, МА). Разтворимият протеин във филтруваните разтвори бяха анализирани последователно чрез изключваща по размер високоскоростна течна хроматография CHPLC?. Количеството на разтворимия протеин бе определено чрез интергиране на пиковете от хроматографията и нанасяне на графика като резултат във функция от времето на инкубация при 37°С. Резултатите за природен КФР, C/1, 15/S, С/1, 15/S/R /144/Е и C/1, 15/S/R /144/Q /данните за Й N23 и Δ N 23/R /144/Q не са дадени/ са показани на фиг. 7.

От тези кинетични криви след това бе определян полуживота за загуба на разтворим мономерен протеин. Полуживотвг на останалия разтворим КФР след съхранение на тези протеини при 37°С е даден на Таблица 1.

Таблица 1.

Полудивот за загуг5а на разтворими, нононерни протеини

Протеин	t 1/2 C дни?
естествен КФР	0. 6
ΔΝ23	1.1
С(1.15)$	1.2
С( 1,15)S/R(144)Q	13.3
AN23/R(144)Q	22.3
C( 1,15)S/R(144)E	38.0

Както се вижда от Таблица 1 по-горе и на Фиг. .27 , естественият

КФР агрегира най-бързо , като има полуживот на разтворимост от

0.6 дни. С(1,15)S/R(144)Q, AN23/R(144)Q и С(1.15)S/R(144)Е показват съществено повишение на полуживота на разтворимост, съответно до 13.3, 22.3 и 38 дни

Термично разгъване

Термичното разгъване бе регистрирано чрез кръгов дихроизъм

СКД? при 230 пт с помощта на спектрополариметър J-720 (Jasco, Inc., Easton. MD), оборудван с температурна контролна система

РСТ-343 тип Peltier. За осъществяване на анализа на КД бяха приготвяни в D-PBS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)отделни проби, съдържащи 0.1 mg/ml от полипептида, подлежащ на анализ. За всяка проба около 2л5 мл бяха зареждани в 10 мм правоъгълна кварцова флуоресцентна кювета (Не11ma Cells, Inc. Jamaica, NY), кварц Suprasil (Hetaeus Quarzschmelze GmbH. Hanau, Germany). След това кюветата бе поставяна в температурната контролна система тип Peltier в спектрополарометъра. Термичното разгъване се провеждаше със скорост 50°С/час. За индикация на разгъването бяха регистрирани измененията на елиптичност при 230 пт. Величината Т на всяка проба бе определяна чрез определяне на

W температурата, при която 50 % от молекулите на протеина в разтвор са разгънати CBiophysical Chemistry, Cantor and Schimmel (eds), W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980). Оценката на T за всеки от трите протеина е описана в Таблица 2 т

Таблица 2.

Определени температури на топене

Протеин	Т (°C) m
естествен КфР	54. 0
ΔΝ15	55.0
C(1,15)S	55.0
ΔΝ23	55. 0
С(1,15)S/R(144)Q	62.5
AN23/R(144)Q	63.0
С(1,15)S/R(144)Е	63.5

Както показват тези резултати, CC1,15}S и ΔΝ15 показват повишение с 1°С на Т в сравнение с естествения КФР. Веществото m

ΔΝ23 показва една допълнителна степен на повишение на Т .

m обаче заместването на R144Q до С( 1.15)S/R(144)Q или ΔΝ23 добавя едно повишение, по-голямо от 6°С на Т и повече от 7°С, в m сравнение с естествения КФР. Освен това, за С (1.15)S/R(144)Е температурата е по-висока с 9°С при по-голяма устойчивост от естествения КфР.

рн

Киселинната устойчивост на С(1,15)S/R(144)Q и

С(1,15)S/R(144)Е сьщр бе сравнена с тази на естествения КфР чрез настройка на D-PBS на различни стойности на pH чрез добавяне на концентрирани солна киселина или натриева основа.

Приблизително 2.38 мл.от D-PBS при различни стойности на pH бяха смесвани с 1ОО микролитра от 2.45 mg/ml протеин на КфР в кварцова кювета. Тези проби бяха термично разгънати със скорост от 5О°С/час и бяха следени чрез КД при 230 nm. На фигура 29 е показана стойността на Т във функция на pH за естествения КфР.С/1, 15/S гп

СС1,153S/R(144)Q и С(1.15)S/R(144)Е. В измервания интервал от

C/1, 15/S, C/1, 15/S/R /144/Q и C/1, 15/S/R /144/Е. В измервания <_аинтервал от pH C/1, 15/S, C/1, 15/S/R /144/Q и C/1, 15/S/R /144/Е показваха винаги по-високи Тт от естествения КФР.

In vitro биологична активност

Бе определяна също и in vitro митогенна активност на C(1,15)S.

ΔΝ15, ΔΝ23, AN23/R(144)Q, СС1,150S/R(144)Q и C(1,15)S/R(144)Е във функция от концентрацията на протеин и полу-максималната концентрация чрез измерване на поемането на [Уи-тимидин в кювети Balb/Mk (съответно на методите на Rubin et al. (19Θ9)« supra). Обикновено концентрациите на всеки от аналозите на КфР относително на известния стандартен естествен КфР, бяха определяни чрез прилагане на in vitro биологична проба. Всеки аналог на КФР бе разреждан и подлаган на биологичната проба за биологична активност, като се използуваше митогенна проба Balb/Mk. Пробите бяха първо разреждани в биологичната среда на пробата, състояща се от 50% Eagle's MEM, произведен за клиента, 50% F12, произведен по поръчка, 5 цд/ml трансферни, 5ng/ml натриев селенит, 0.0005% HSA и 0.005% Tween 20. Пробите КФР бяха прибавяни вьрху предметни стъкла с по 96 дупки топ

Primeria » бяха посявани с клетки Balb/MK. Внасянето на [ Н]тимидин по време на синтеза на ДНК бе измервано и превръщано във входна концентрация на естествения КФР чрез сравнение със стандартна крива за естествен КФР. Резултатите са дадени на • фиг. 29 ДО 34 , Както се вижда на фигурите, изпитваните аналози .наКфР, описани на фиг. 28 ДО 33 имат сравнима активност с природния КФР.

Примери 3:Производство на клетъчни култури,присъщи на бозайници

Този пример описва експресията, изолирането и охарактеризирането на две биологично активни форми на рекомбинантен КФР СгКфРЗ,произведени в система на експресия присъша за бозайници.

Генът на човешкият КФР бе изолиран чрез усилване с PCR на сДНК, получена от нормални човешки Фибробластни клетки CClonetec, San Diego, СА). След етапа на произвеждане на сДНК чрез обратима транскриптаза, PCR бе използувана за усилване на гена на КФР. За усилване на гена извън сДНК бяха използувани 0LIG0#25 и OLIGO4I26. а за поставяне на рестриктивни места HindiII и Bglll към фрагментните краиша бе използувано друго усилване чрез ВРП Сверижна реакция с полимераза? с 0LIG0#27 и

0LIG0#2B, както е указано на фйГ. 1А И 1В:

0LIG0#25	(SEQ	ID	N0:69):5'	-CAATCTACAATTCACAGA-3
0LIG0#26	(SEQ	ID	N0:70):5'	-TTAAGTTATTGCCATAGG-3
0LIG0#27	(SEQ	ID	no :71):

5'-AACAAAGCTTCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3' □LIG0#28 (SEQ ID No .72):5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Следвайки клонирането и потвьржданието на последователността на ДНК, бе използувана ДНК на гена на КфР. Усилването бе реализирано чрез 0LIG0U29 и QLIG0#30.

0LIG0#29 (SEQ ID N0:73):

5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATGCTGACATGG-3'

0LIG0#30 (SEQ ID N0:74):

5-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'

Сензовиятпраймер 0LIG0#29 включваше едно място Xbal и транслационна последователност

Kozak (5'-ССАСС-3') в посока нагоре от стартовия кодон

ATG. Антисензовият праймер,

0LIG0#30 включваше клониращр място Sall и допълнителен стоп кодон. След 18 цикъла на усилване с ВРПСЗО секунди денатуриране при 94 С, 40 сек каляване при 55 С, издължаване при 72°СЗ, продуктът бе смилан от Xbal и Sall и лигатиран с подобно смляна ДНК от pDSRot2 Ссъответно на методите на Bourdrel et al. (1993), Protein Exp. & Purif. 4:130—140 и Lu et al. (1992). Arch.

Biochem. Biophys. 29:150-158). Това даде като резултат един плазмид на КФР/pDSRa2_ькойто постави гена на човешкия КФР между полимера SV40 и полиаденилационния ред α-FSH. Бяха отбрани два клона и анализвг на ДНК последователности потвърди конструкцията на желания вектор.

След това бяха линеаризирани две микрограми на ДНК на

K®P/pCDSRa2 с Pvul. Клетки от яйчник на китайски хамстер СКХЗ, посяти предишния ден на културално блюдо с 0.8 х 10^б клетки при диаметър на блюдото ©0 мм, бяха трансфектирани с обработена

ДНК, използувайки стандартен утаечен метод с калциев фосфат CBourdrel et al., supra). Две седмици по-късно отделни колонии бяха отбирани и прехвърляни в блюда с по 24 гнезда.

Кондиционираните среди бяха считани за свободни от серум, когато клетките достигаха конфлуенция и аликвоти от тях бяха анализирани чрез попиване тип Western, използувайки поликлонален антисерумен реактив от заек в контраст с човешкия КфР, експресиран на Е.coli.

Уестерни бяха	проведени	чрез	изпитване	на проби	с
полиакриламидни гелове 12. 5 %	(тегл.	/об. 5	SDS ,	следвани	от
електровсмукване в	продължение	на	1 час	при	400 mA	в

нитроцелулозни мембрани, използувайки полусух трансфериращ апарат CHoefer Scientific Instruments, San Francisco, СА). Като трансфериращ буфер бе глицин, 20 % метанол.

използуван разтвор на 20 mM Tris, 150 тМ

Нитроцелулозните листове бяха блокирани чрез инкубация с 10% нормален серум от коза в PBS. Като първично антитяло бе използуван антисерум от заек, издигнат срещу КфР, произведена от Е.coli.

За употреба той бе разреждан

1/10 000 в1% нормален серум от коза в PBS С фосфатно-буфериран

Физиологичен разтвор?и инкубиране с блокираните нитроцелулозни

Фолия в продължение на 12 часа при стайна температура, след което излишното антитяло бе отделяно чрез промиване в

PBS в продължение на 30 минути.

След това нитроцелулозните мембрани бяха инкубирани в ЮО мл

1% нормален кози серум в PBS, съдържащ кози серум в PBS, съдържащ Vectastain биотинилиран кози анти-заешки IgG (вторично антитяло, Vector Labs, Burlingame, СА) в продължение на 30 минути при стайна температура. След три 10-минутни промивки в PBS, една 30-минутна инкубация при стайна температура бе провеждана в ЮО-мл-ов разтвор в 1% нормален кози серум, съдържащ стрептавидин и биотинилирана пероксидаза, подготвена съгласно указанията на производителя СVector Labs). След три промивки в PBS материалът, реагиращ с КфР, бе визуализиран чрез инкубация в смес от 60 /J- от 30% Стегл/об? НО в 1ОО мл PBS и 50 та 4 хлоронафтол в 20 мл метанол.

2

Реакцията бе спирана чрез промиване във вода след 10 минути.

Анализът на попивателните разкри, че КфР-специфичното антитяло се свързва с три различни протеинови ивици, две от тях тясно свързани с молекулните тегла от около 25-29 kDa и единият-с определено молекулно тегло от около 17 kDa, в сравнение с очакваното молекулно тегло от приблизително 18.8 от 163 аминокиселини на зрелия протеин. Освен това,бяха избрани няколко високоекспресирани клонове, секретиращи повече от 2.0 mg от гКфР на литър, според анализа Western, като бяха експандирани в шишета Ссъгласно метода на Lu et al., supra) за генериране на големи обеми кондиционирана среда, свободна от серум, за пречистване на КФР чрез катионообменна хроматография и гел филтрация, както е указано по-долу.

КфР от 3 L кондиционирана среда , свободна от серум, бе пречистван,прилагайки серума директно кьм катионообменна колона С5х24 см) с пълнеж от 450 мл сулфоетил, колона на S—Sapharose Fast Flow (Pharmacia),предварително обработена с 2OmM натриев фосфат, при pH 7.5. След промиване с обем,равен на пет колонни обема, съдържащ 20 тМ натриев фосфат, 0. 2 М NaCI, при pH 7.5, гКфР бе елуиран,използувайки материал с линеен градиент от 0.2 до 1.0 М NaCl в 20 тМ натриев фосфат, pH 7.5. Чрез непрекъснат текущ контрол с абсорбция на светлина А бяха събрани 200

50-млови фракции. Протеинът на КфР бе определян чрез анализиране на аликвотни части от всяка фракция с помощта на метода SDS-PAGE. Методът SDS-PAGE бе изпълнен със система за електрофореза CNovex, San Diego,СА), използувайки предварително отлети телове 14 % Три-сглицин Ссъгласно метода Laemmli (1970) Nature 227:680-685). Проби бяха смесвани с нередуциращ буфер SDS без нагряване преди зареждане. Протеините бяха откривани чрез Комаси блу техника или чрез сребърен стейнинг. Два късно елуирани пика бяха установени да съдържат протеинови ивици, съответни на молекулни тегла 25-29 kDa и 17 kDa с помопгга на Western техника, фракциите, съдържащи тези пикове, бяха отделно концентрирани до обем _? по-малък от 1 мл . и бяха подложени на гел-филтрация.

За гел филтрация бяха използувани колони със смола Superdex-75 (HR 10/30, Pharmacia), предварително обработени с PBS, pH 7.2 и калибрирани със следните стандарти с известни молекулни тегла CBioRad, San Francisco, СА): тироглубин С670 kDa), g-глобулин (15Θ kDa), овалбумин (44 kDa), миоглобин С17 kDa) и витамин В-12 С1.4 kDa). Тези етапи на' пречистване доведоха до приблизително 2000-пьти пречистване на рекомбинантния КфР, рКфР, конкретно включващ материали от 17 kDa и 30 kDa, както се определя чрез сребърна стейнинг-техника.

В случая на материал с високо молекулно тегло рКфР елуира с основен симетричен пик С при А ?, който се нарича 280

КфР-a. При анализ SDS-PAGE на едно по-малко количество от този материал, 3 цд/лента срещу 6 рд/лента, бяха определени две ивици с разлика в молекулните тегла от 1-2 kDa. В случая на материал с по-ниско молекулно тегло, означаван като КФР-6, гел филтрацията доведе до получаване на протеин_? имащ очаквана подвижност. Както за КфР-a, така и за КфР-б, сумарният добив след пречистване бе приблизително 30-40%.

Бяха анализирани и аминокиселинни последователности от

КфР-a и КФР-б. Тези анализи бяха изпълнени анализатор на аминокиселини Смодел 4767А или на автоматичен

470А, Applied

Biosystems, Inc.,

Foster City, СА), оборудван с анализатор на аминокиселини РТН он-лайн модел 12ОА, както и система за събиране на данни модел 900А

Ссъгласно метода на Lu et al (1991) ,

J.Biol

Chem

266:8102-8107)

Анализът на последователности на Edman на КФР-а разкри една основна

N-крайна последователност

X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S-CSEQ ID

N0:75]

В 1.6 % от тоталния протеин, разглеждан във последователност, присъствуваше и една малка последователност, стартираща от третата N-крайна аминокиселина, аспарагиновата киселина. X , X ,

2

X бяха неозначените, поради отсъствие на фенилтиохидантоинил з

СРНТЗ аминокиселинни сигнали по време на анализ на последователностите. Една N-крайна аминокиселинна последователност на КфР, предсказана от последователност на сДНК, показва, че са Cys остатъци, аспарагин.

Отсъствието на X показва, че тези цистеини могат да образуват дисулфидни мостове.

На основата на консенсусна

N-свързана глюкозилирана последователност

Asn-X X-Ser, отсъствието на предсказания остатък Asn, съответствуващ на Х₂» показва че това е едно потенциално N-свързано глюкозилирано място.

Интересно е, че анализът на N-крайни последователности на КфР-б разкрива една N-крайна аминокиселинна последователност S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (SEQ ID N0:76), което показва,че това е една N-крайна отсечена форма на КфР, която е била

24 протеолитично разцепена при пептидната връзка Arg -Ser

За да бъдат охарактеризирани по-нататък пречистените КфР-а и КфР-б, протеинът бе подложен на глюкозидази Сневраминидаза, о-глюканаза и/или N-глюканазаЗ, прилагайки известни методи

CSasaki et al. (1987), J. Biol. Chem. 262:12059-12076; Takeuchi et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:3657-3663; Zsebo et al. (1990), Cell, 63:195-201). Тези данни показват, че КфР-a съдържа N- и О-свързани въглехидрати, въпреки че формата с по-ниско молекулно тегло на ΚΦΡ-а вероятно съдържа само

N-свързана захар.

Обработката с глюкозидаза не предизвика намаление на молекулно тегло по отношение на КФР-б, което показва, че молекулата е неглюкозилирана.

Глюкозилираният образец на КФР-а бе охарактеризиран по-нататък чрез масспектрометрия на Glu-С-пептиди^генерирани с ендопротеиназа, описани по-горе. Изясняването въглехидратния строеж на глюкопепетидите с помощта на метода на масспектрометричен анализ е успешно приложен на други протеини

CHuddleston et al. (1993), Anal. Chem. 65:877-884; Carr et al.

(1993), Prot.Sci. 2:183-196). Както се потвърждава чрез изолирането на неглюкозилирани пептиди, Thr изглежда да е частично глюкозилиран. Подобен масспектрометричен анализ на

Asn предположи микрохетерогенност при глюкозилирането, с bi-, tri- и tetra-разклонен строеж с варираща степен на сиалилация.

На Таблица З^{а са} обобщени концентрациите на КФР за стимулиране на вграждането кератиноцити с помощта на [³Н]-тимидин при половината от максималното ниво (съгласно метода на Рубин et al. (1989), Supra). Бе проучено взаимодействието с рецептор на КФГ с помощта на изолирани препарати на КФР - рецепторни мембрани, получени от епидермални кератиноцити от мишки Balb/MK (с помощта на процедурата на Massaque (19932) J. Biol. Chem. 258:13614 13620). По-конкретно, бяха разреждани различни форми на КФР с 50 mM Tris-HCL при pH 7.5, при съдържание на 0.2 % биволски серумен албумин, така че да се постигне концентрация от 0.8 ng до 100 ng на 50 μΣ . Те бяха поотделно инкубирани с мембранни препарати (75 ng/ml) и белязана с радиоактивен йод 125 КФР , като производна на E.coli (1.5 ng ). Бяха проведени свързване на рецептори и конкурентни опити при 4°С в продължение на 16 часа, след което време пробите бяха вземани, центрофугирани и промивани два пъти с горния разреждащ буфер за отделяне на несвързания и неспецифично-свързания белязан КФР. След това пробите бяха подлагани на брояч за определяне на остатъчната радиоактивност. Бяха построени конкурентни криви за рецепторното свързване между пробите КФР и белязан КФР чрез графично нанасяне на процента на несъстоятелния спрямо концентрациите на всяка проба КФР. На таблица ЗВ е обобщена концентрацията на КФР, необходима за постигане на 60% несъстоятелност спрямо белязания, произведен от E.coli КФР, изразена в единици ng/ml.

Както показва таблица ЗА, КФР-а и КФР-в стимулират сравнимо вграждане с [³Н] - тимидин, като половината от максималното ниво се стимулира приблизително от всеки аналог с 30 ng/ml. И така отразяването не намалява биологичната активност на молекулата. Обаче двата аналога имат прибилизително 30-кратно по-ниска активност, отколкото при пълноуразмерния КФР, произведен

Таблица ЗА.

з

Концентрацияна КФР за стимулиране на вграждане с С Н]-тимидин на кератиноцити при полу-максимална скорост

форми	ng/mL
КФР от Е. coli	10
КфР-а	30
КфР-б	30

Таблица ЗВ,
Концентрация на КФР за конкуриране на КфР,белязан с йод 125 при 60 % степен	рецепторно свързване с на несъстоятелност
форми	ng/mL
КфР от Е. coli	65. 8
КфР-а	93. 5
КфР-б	89. 1

от Е. coli. Както е показано на Таблица ЗВ, опитите по несъстоятелност при радиорецепторната биологична проба показва, че КфР, произведена от Е.coli, КфР-a и КфР-б , показват сходна активност за рецепторно свързване.

Пример 4; In Vivo биологична проба на полипептидите КФР, произведени в Е.coli и в клетъчни култури , присъщи на бозайниците

Показано е, че една единична подкожна доза КФР води до зависимо от дозата повишение на серумния холестерин при мишките в рамките на 24 часа. Бе направена оценка на природния КФР, на КфР-a, на C(1,15)S, ΔΝ23, за възможността да повишават серумния холестерин в зависимост от величината на дозата.

Всяка една от третираните

Balb/c С18-20 gms)., получени от физиологичен разтвор 0.Q% до

групи съдържа	пет	женски мишки
CRL. Протеинът	бе	разреждан	с
постигане на	краен обем	за

инжектиране от 1ОО /uL на мишка. Всяка мишка бе инжектирана подкожно със следните дози:

Група

Третиране

Доза Cmg/kg)

Природен КфР

0.1

0. 25

Природен КфР

	естествен	КФР	0. 5
	естествен	КФР	1
	естествен	КФР	5
2	C(1.15)S		0.1
	C(1,15)S		0.25
	С( 1.15)S		0.5
	C(1,15)S		1
	C(1,15)S		5
3	ΔΝ15		0.25
	ΔΝ15		0.5
	ΔΝ15		1
	ΔΝ15		5
4	ΔΝ23		0.01

ΔΝ23

КФР-а

0.5

Ο. 01

Ο. 05

Ο. 1

Ο. 5

Контрола от физиол. разтвор

Двадесет и четири часа след инжектиране, мишките бяха умъртвени и кръвта им бе източвана чрез кардинална пункция. Кръвните проби бяха обработвани за определяне на серумния холестерин.

Както е показано на фиг. 35, бе установено, че всеки един от аналозите на КФР повишава холестерина в кръвта по начин, зависим от дозата. Също така няма очевидна разлика в биоактивността на всеки един от изпитваните аналози на КФР.

In Vivo молели на диабет

За изследване на диабета и неговото лечение винаги са били използувани модели на различни животински видове с възбуждане на болеста по химически път. Стрептозотоцина предизвиква диабет при мишки, плъхове, хамстери, кучета и маймуни, въпреки че изследванията с плъхиве и мишки са най-чести. Junod et al. Proc. Soc. Exp. Pio.Med.126:210-205 (1967); Rerup, Pharm.Rev. 22:435-518 (1970); Rossini et al. P.N.AnS. 74:2485-2489 (1977) и Ar'Rajab and Ahren, Pancreas 8:50-57 (1993). При плъховете дозите срептозотоцин,възлизащи на 45 до 70 mg/kg като единична интревенозна доза, предизвикват стабилно заболяване. Дози под 45 mg/kg предизвикват преходно състояние на заболяване, което е обратимо. В рамките на един ден след инжектиране на срептозотоцин, хипергликемичното състояние е факт. Нивата на инсулин в кръвта остават съществено непроменени в сравнение с нормални плъхове; обаче, тоталното съдържание на инсулин и С-пептид в панкреаса е силно намалено. Плъховете показват класическите признаци и симптоми на диабет при хората: повишени нива на кръвна захар С хипергликемия?, глюкоза в урината Сглюкозуриа?, повишена жажда Сполидипсия?, повишено уриниране Сполиурия? повишен апетит Схиперффагиа?.

Изследванията, съгласно изобретението бяха проведени с модел на диабет, предизвикан със стрептозотоцин, основан на плъхове тип Sprague-Dawley. Бяха използувани мъжки плъхове с тегло 200—260 грама. Диабетът бе предизвикван с единична венозна инжекция на стрептозотоцин , съдържаща 50 mg стрептозотоцин в натриев цитратен буфер на кг телесно тегло. Недиабетичните контролни плъхове получаваха единична венозна инжекция от натриев цитрат буфер за контролни цели. КфР бе внасян ежедневно чрез подкожна инжекция. Дозата КФР бе 3 до 5 mg/kg/ден, в зависимост от опита. В първия опит терапията с КФР бе започвана два дена преди диабета, бе предизвиквана и продължавана след възбуждане на диабет в продължение на осем инжекции. Във втора и трета серия опити терапията с КфР, въведен подкожно, бе стартирана един ден след индуцирането на диабета със стрептозотоцин. В четвъртия експеримент бе провеждана 7-дневна терапия с КфР, стартирана 7 дни след обработка със стрептозотоцин и животните бяха проследявани след това в продължение на още 12 седмици. При всички експерименти, с изключение на четвъртия експеримент като крайни точки на анализа бяха използувани нивата на кръвната захар, нивата на захар в урината и обема на урината. Освен това в някои от експериментите бяха измервани също и обемвТ на поетата вода, нивата на С-пептид в урината или тоталния панкреатичен инсулин. В четвъртия експеримент единствената оценявана еквивалентна точка бе кръвната захар. Тъй като голяма част от инсулина се отделя при циркулацията в черния дроб, измерването на периферната концентрация на инсулин по-скоро отразява събития на пост-хепатичния метаболизъм, отколкото величината на инсулинова секреция от панкреаса. Ето зашр често се провеждат измервания на С-пептид в качеството на периферен маркер на инсулиновата секреция.

С-пептидът се произвежда в резултат на преобразуването на про-инсулин до инсулин.

Инсулинвт

С-пептидьт секретират от бета клетките във еквимол ярни количества и само малки количества С-пептид се извличат от черния дроб.

Това изследване проучва влиянието на рекомбинантен КФР

СрКфР върху диабет, предизвикан със стрептозотоцин на плъхове

Sprague-Dawley. В деня 0, групи плъхове бяха изложени на въздействието на стрептозотоцин в количества или или mg/kg. След това въздействие нивата на кръвна захар при негладували плъхове бяха отчитани ежедневно до оценка на степента на увреждане на островчетата. В ден

5-ти, животните, обработ вани със стрептозотоцин^ бяха поставяни в една от две групи CSO животни в група?, в зависимост от величината на хипергликемията. Разделителната линия бе зададена на ниво на кръвната захар от 300 mg/dl

Една група нетретирани със стрептозотоцин животни служеше за контрола. На седмия ден.

на животни от всяка хипергликемична група бе даван ΔΝ23 Спо 3 mg /kg /ден? или PBS чрез подкожна инжекция в продължение на 7 дни. След това нивата на кръвната захар бяха записвани ежедневно, на всеки втори ден или седмично и са нанесени на фигура 50, Забележете, че животните, които бяха третирани със стрептозотоцин и от двете групи, получавайки ΔΝ23, показваха значително понижение на кръвната захар по време на периода на дозиране на ΔΝ.23. И което е важно, средниятспад на глюкоза в кръвта, който бе изпитан при животнитетретирани със стрептозотоцин от групата,стартирала с кръвна захар <300mg/dl.

се стабилизираше при около 150 mg/dl, докато средният спад на кръвна захар при животните от групата,стартирала с > 30Qng/d 1, бе само преходен. Забележете, че скалата на дните е нелинейна.

Разбира се, настоящото изобретение, както е описано по-горе^най-общо и в частност по предпочитани изпълнения, не изчерпва всички варианти и модификации, които оиха възникнали за професионалистите в областта, в светлината на горното описание.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОСНОВНА ИНФОРМАЦИЯ (I) ЗАЯВИТЕЛ: Amgen Inc. /Амген ООД/ (ii) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: Аналози на Кератиноцитния Растежен фактор (iii) БРОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ: 104 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(А) ПОЛУЧАТЕЛ: Amgen Inc. /Амген ООД/ (Б) УЛИЦА: 1840 Dehavilland Drive /1840 Дехавиланд Драйв/ (Б) ГРАД: Thousand Oaks /Тоузанд Оъкс/ (Г) ЩАТ: California /Калифорния/ (Д) ДЪРЖАВА: САЩ (Е) ПОЩЕНСКИ КОД: 91320-1789 (ν) КОМПЮТЪРНО ЧИТАЕМА ФОРМА (A) ВИД: Флопи диск (Б) КОМПЮТЪР: IBM PC (B) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (Г) СОФТУЕЪР: Patentin Release #1.0, Версия #1.30 (vi) НАСТОЯЩИ ДАННИ НА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: PCT/IB95/00971 (Б) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 12 ОКТОМВРИ 1995 (B) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ПРЕДИШНИ ДАННИ НА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08,487,825 (Б) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 7 ЯНУАРИ 1995 (B) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ПРЕДИШНИ ДАННИ НА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/323,475 (Б) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 13 ОКТОМВРИ 1994 (B) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ПРЕДИШНИ ДАННИ НА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/323,340 (Б) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 13 ОКТОМВРИ 1994 (B) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(viii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА АДВОКАТА/АГЕНТА (A) ИМЕ: Zindrick, Thomas D. / Зиндрик, Томас Д./ (Б) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 32,185 (B) НОМЕР : А-315 С (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 1:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 862 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 1:

СААТСТАСАА	TTCACAGATA	GGAAGAGGTC	AATGACCTAG	GAGTAACAAT	CAACTCAAGA	6°
ТТСАТТТТСА	TTATGTTATT	CATGAACACC	CGGAGCACTA	CACTATAATG	CACAAATGGA	120
TACTGACATG	GATCCTGCCA	ACTTTGCTCT	ACAGATCATG	CTTTCACATT	ATCTGTCTAG	180
TGGGTACTAT	ATCTTTAGCT	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	240
ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	CATGGAAGGA	GGGGATATAA	300
GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	360
TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	420
TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	480
GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	540
ААААССАТТА	СААСАСАТАТ	GCATCAGCTA	AATGGACACA	CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	600
TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	660
CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATTGCATAT	GGTATATAAA	GAACCCAGTT	720
CCAGCAGGGA GATTTCTTTA	AGTGGACTGT	TTTCTTTCTT	CTCAAAATTT	TCTTTCCTTT	780
TATTTTTTAG TAATCAAGAA	AGGCTGGAAA	AACTACTGAA	AAACTGATCA	AGCTGGACTT	840'
GTGCATTTAT	GTTTGTTTTA	AG				862

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 2:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 194 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 2:

Met Н19 1

Lys

Trp

lie Leu Thr Trp lie Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg

5

10

15

Ser

Cys

Pho

His

lie

He

Cys

Leu

Vai

Gly

Thr

He

Ser

Leu

Ala

Cys

20

25

30

Аз η

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Cys

Ser

35

40

45

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly Gly

Asp

He

50

55

60

Arg

Vai

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

lie

Asp

65

70

75

80

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

85

90

95

lie

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

vai

Gly

lie

Val

Ala

He

Lys

Gly

100

105

110

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

115

120

125

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

He

Leu

130

,

135

140

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

145

150

155

160

Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Val

Arg Gly

165

170

175

Lys

LyS

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

180 · 185 190

He Thr (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 3:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 595 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 3:

ATCGATTTGA	TTCTAGAAGG	AGGAATAACA	TATGAAAAAG	CGCGCACGTG	CTATCGCCAT	60
TGCTGTGGCT	CTGGCAGGTT	TCGCAACTAG	TGCACACGCG	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	120
GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	180
CATGGAAGGA	GGGGATATAA	GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	240
GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	АСААТАТСАТ	300
GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	360
TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	420
CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	ААААССАТТА	СААСАСАТАТ	GCATCAGCTA	AATGGACACA	480
CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	540
AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATAG	595

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 4:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 186 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 4:

Met

Lys

Arg

Ala

Arg

Ala

He

Ala

lie

Ala

Vai

Ala

Leu

Ala

Gly

1

5

10

15

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

His

Ala

Cys

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

20

25

.

30

Ala

Thr

Asn

Vai

АЗП

Cys

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

40 45

Asp

Tyr 50

Met

Glu

Gly

Asp 55

He

Arg

Vai

Arg

Arg 60

Leu

Phe

Cys

Arg

Ths

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

65

70

75

80

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

lie

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

85

90

95

Vai

Gly

He

Vai

Ala

He

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

100

105

110

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

115

120

125

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

130

135

140

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

145

150

155

160

Gin

Lye

Gly

lie

Pro

Vai

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

165

170

175

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

180

185

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 5 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 499 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 5:

TATGTGCAAT

GACATGACTC

CAGAGCAAAT

GGCTACAAAT

GTGAACTGTT

CCAGCCCTGA

GCGACACACA

AGAAGTTATG

ATTACATGGA

AGGAGGGGAT

ATAAGAGTGA

GAAGACTCTT

120

CTGTCGAACA

CAGTGGTACC

TGAGGATCGA

TAAAAGAGGC

AAAGTAAAAG

GGACCCAAGA

180

GATGAAGAAT

AATTACAATA

TCATGGAAAT

CAGGACAGTG

GCAGTTGGAA

TTGTGGCAAT

240

CAAAGGGGTG

GAAAGTGAAT

TCTATCTTGC

AATGAACAAG

GAAGGAAAAC

TCTATGCAAA

300,

GAAAGAATGC AATGAAGaTT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC360 atatgcatca gctaaatgga CACACAACGG AGGGGAAATG TTTGTTGCCT ТАААТСАЛАА420

GGGGATTCCT GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC480 »

TATGGCAATA ACTTAATAG499 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 6:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 164 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 6:

Met Cys 1

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Cys

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

He

Arg

Vai

Arg

Lau

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

He

65

70

75

80

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu'

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ha

Pro

Vai

130

135

140

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala II· Thr (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 7:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 7:

CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 8:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:8:

ААААСАААСЛ TAAATGCACA AGTCCA 26 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 9:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 9:

ACAACGCGTG CAATGACATG АСТССА 26 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 10:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 31 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 10:

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA А (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 11:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 27 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 11:

ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 12:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

. (А) ДЪЛЖИНА: 37 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (В) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 12:

CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 13:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 44 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 13:

AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT 44 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 14:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 37 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 14:

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG 37 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 15:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 45 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 15:

TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 16:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 45 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 16:

ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT ТСАТС 45 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 17:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 36 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 17:

AATTCAGATT СААСАССТТТ GATTGCAACG АТАССА 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 18:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 18:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG ²⁰ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 19:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 19:

TCAAAACTGG АТССТАТТАА

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 20:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 91 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 20:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG ААТААСАТАТ GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC 60 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 21:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 90 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК . (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 21:

I

Г · · ..

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:21:

i

CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC60

CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA90 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 22:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 90 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г)ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 22:

CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG АААААСААСТ АСААСАТСАТ GGAAATCCGT 60

ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 23:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 90 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 23:

GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA 60

GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 24:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 90 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 24:

CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT 60 / GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 90 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 25:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 88 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 25:

ATCCCGGTTC GTGGTΑΛΑΛΑ ААССАААААЛ GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 60

GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA 08 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 26:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 26:

TACGGGTGTG ACGTTCCGGG 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 27:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 27:

CTTTACCACG TTTGTCGATA 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 28:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 28:

АТТСЛАСАСС TTTGATTGCA 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 29:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 29:

CCAGGATCAG TTCTTTGAAG 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 30:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ; неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 30:

GAACCGGGAT ACCTTTCTGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 31:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 495 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 31:

ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG ТТААСТССТС CTCCCCGGAA 60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 12(1 TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180 ATGAAAAACA АСТАСААТАТ TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240 AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 300 AAAGAATGCA ACGAAGACTG СААСТТСААА GAACTGATCC TGGAAAACCA СТАСААСАСС 360 TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420 GGTATCCCGG TTCGTGGTAA АААААССААА AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480 ATGGCAATCA СТТАЛ 495 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 32:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 164 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 32:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Ser

5 10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30

Азр Не

Arg Vai Arg Arg Leu Phe

Cys Arg

Thr Gin Trp 45

Tyr Leu

Arg

35

40

Не

Азр

Lys

Arg Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

•

55

60

Туг

Азп

He

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

He

65

70

75

80

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Не

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Азп

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ha

Pro

Vai

130

135

140

.

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ila The (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 33:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 483 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 33:

ATGACTCCGG	AACAGATGGC	TACCAACGTT	AACTCCTCCT	CCCCGGAACG	TCACACGCGT	60
TCCTACGACT	ACATGGAAGG	TGGTGACATC	CGCGTACGTC	GTCTGTTCTG	CCGTACCCAG	120
TGGTACCTGC	GTATCGACAA	ACGCGGCAAA	GTCAAGGGCA	CCCAAGAGAT	GAAAAACAAC	180
TACAATATTA	TGGAAATCCG	TACTGTTGCT	GTTGGTATCG	TTGCAATCAA	AGGTGTTGAA	240
TCTGAATTCT	ACCTGGCAAT	GAACAAAGAA	GGTAAACTGT	ACGCAAAAAA	AGAATGCAAC	300

GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGCATCTGCT 360

AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT420

CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT480

TAA483 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 34:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 160 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 34:

Met Thr 1

Pro

Glu Gin 5

Met

Ala Thr

Asn Vai Asn Ser ' 10

Ser

Pro 15

Glu

Ar?

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

He

Arg Val

20

25

30

Arg

Leu

Ph·

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys Arg

35

40

45

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

He

Met

50

55

60

Glu

II·

Arg

The

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

Ila

Lys

Gly

Val

Glu

65

70

75

80

Ser

Glu

Ph·

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

85

90

95

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ila

Leu

Glu

Asn

100

105

110

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

115

120

125

Met

Ph·

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

II·

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

130 135 140

Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala He Thr 145 150 155 160 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 35:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 480 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна

())) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 35:

ATGACTCCGG AACAGATGGC TACCAACGTT AACTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC60

TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG120

TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC180

AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT240

GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA300

GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA360

TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT420

GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA480 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 36:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 159 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 36:

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Ser Ser Pro Glu Arg 15 LO 15

Hia Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ila Arg Vai Arg

Arg Leu Phe 35

Cys

Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg He Asp Lys Arg Gly

40

45

Lys

Vai 50

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 55

Met

Lys

Asn

Tyr 60

Asn He

Met

Glu

lie 65

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai 70

Gly

He

Vai

Ala

lie 75

Lys

Gly Vai

Glu

Ser 80

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala. 85

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 90

Lys

Leu

Tyr Ala

Lys 95

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 100

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 105

Glu

Leu

He

Leu Glu 110

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 115

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 120

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 125

Glu

Met

Phe

Vai 130

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 135

Gly

He

Pro

Vai

Arg 140

Gly Lys

Lys

Thr

Lys 145

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 150

Ala

His

Phe

Leu

Pro 155

Met

Ala lie

Thr

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 37:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 468 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 37:

ATGGCTACTA ATGTTAACTC CTCTTCTCCT GAACGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG	60
GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC	120
GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA GAGATGAAAA АСААСТАСАЛ TATTATGGAA	180
ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG	240
GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC	300
AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC	360,
GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC	420
AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG CCGATGGCAA TCACTTAA	468

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 38:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА; 155 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 38:

Met 1

Ala

Thr

Asn

Val 5

Asn

Ser

Pro 10

Glu

Arg

His

Thr

Arg 15

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

lie

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

20

25

30

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

val

Lys

Gly

35

40

45

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

Thr

Val

50

55

60

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

lie

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

65

70

75

80

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

85

90

95

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

He

Leu

Glu

АЗП

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

100-

105

110

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

115

120

125

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

130

135

140

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

145

150

155

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 39;

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 465 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна

I »».· (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 39:

ATGGCTACTA ATGTTAACTC	TTCTCCTGAA CGTCATACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA	60
GGTGGTGACA TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC	120
AAACGCGGCA AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC	130
CGTACTGTTG CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA	240
ATGAACAAAG AAGGTAAACT	GTACGCAAAA AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA	300
GAACTGATCC TGGAAAACCA	CTACAACACC TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT	360
GGTGAAATGT TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA	420
AAAGAACAGA AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG ATGGCAATCA СТТАЛ	465

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 40:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 154 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 40:

Met

Ala

Thr

АЗП

Vai Asn

Ser

Pro

Glu

Arg

H1S

Thr

Arg

Ser

Tyr

1

5

10

15

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly Gly

Asp

lie

Arg

Vai

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

20

25

30

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu Arg

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

35

40

45

Gin

Glu

Met

Lys

Asn Asn

Tyr

Asn

Ila

Met

Glu

lie

Arg

Thr

Vai

Ala

50

55

60

Val 65

Gly

lie

Val

Ala

lie 70

Lys

Gly

Val

Glu

Ser 75

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 80

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 85

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 90

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 95

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 100

Glu

Leu

He

Leu

Glu 105

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 110

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 115

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 120

Glu

Met

Phe

Val 125

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 130

Gly

lie

Pro

Val

Arg 135

Gly Lys

Lys

Thr

Lys 140

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

145 150 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 41:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 450 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 41

ATGTCTTCTC

CTGAACGTCA TACGCGTTCC TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC

GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG

TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC

120

AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC

AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT

180

GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT

GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT

240

AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA GACTGCAACT

TCAAAGAACT GATCCTGGAA

300

AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT

360

GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT

GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC

420

GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA

450 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 42:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 149 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 42:

Met Ser 1

Ser Pro Glu 5

Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly

10

15

Gly

Asp

He

Arg

Vai

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

20

25

30

Arg

lie

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

35

40

45

Аз η

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

1

50

55

€0

!

He

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

i

65

70

75

80

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

85

90

95

Ϊ

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

H13

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

100

105

110

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

115

120

125

Vai

Arg Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

130

135

140

Pro

Met

Ala

He

Thr

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 43:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 447 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 43:

ATGTCTCCTG AACGTCATAC GCGTTCCTAC GACTACATGG AAGGTGGTGA CATCCGCGTA	60
CGTCGTCTGT TCTGCCGTAC CCAGTGGTAC CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG	120
GGCACCCAAG AGATGAAAAA CAACTACAAT ATTATGGAAA TCCGTACTGT TGCTGTTGGT	180
ATCGTTGCAA TCAAAGGTGT TGAATCTGAA TTCTACCTGG CAATGAACAA AGAAGGTAAA	240
CTGTACGCAA AAAAAGAATG CAACGAAGAC TGCAACTTCA AAGAACTGAT CCTGGAAAAC	300
САСТАСААСА CCTACGCATC TGCTAAATGG ACCCACAACG GTGGTGAAAT GTTCGTTGCT	360
CTGAACCAGA AAGGTATCCC GGTTCGTGGT AAAAAAACCA AAAAAGAACA GAAAACCGCT	420
CACTTCCTGC CGATGGCAAT САСТТАА	447

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 44:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 148 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 44:

Met 1

Ser

Pro

Glu

Ar? His 5

Thr

Arg

Ser

Tyr 10

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly 15

Gly

Asp

He

Ar?

Val 20

Ar? Ar?

Leu

Phe

Cys 25

Ar?

Thr

Gin

Trp

Tyr 30

Leu

Arg

lie

Asp

Lys 35

Ar?

Gly

Lys

Val

Lys 40

Gly

Thr

Gin

Glu

Met 45

Lys

Asn

Tyr

АЗП 50

lie

Met

Glu

He

Ar? 55

Thr

Val

Ala

Val

Gly 60

He

Val

Ala

He

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

70 75

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys 85

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp 90

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu 95

Leu

lie

Leu

Glu

Asn 100

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr 105

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp 110

Thr

His

Asn

Gly

Gly 115

Glu

Met

Phe

Val

Ala 120

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly 125

lie

Pro

Val

Arg

Gly 130

Lys

Thr

Lys

Lys 135

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala 140

His

Phe

Leu

Pro

Met Ala lie Thr

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 45:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 444 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 45:

ATGCCTGAAC GTCATACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGT60

CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA AGTCAAGGGC120,

ACCCAAGAGA TGAAAAACAA СТАСААТАТТ ATGGAAATCC GTACTGTTGC TGTTGGTATC190

GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCAA TGAACAAAGA AGGTAAACTG240

TACGCAAAAA AAGAATGCAA CGAAGACTGC AACTTCAAAG AACTGATCCT GGAAAACCAC300

ТАСАЛСЛССТ ACGCATCTGC TAAATGGACC CACAACGGTG GTGAAATGTT CGTTGCTCTG360

AACCAGAAAG GTATCCCGGT TCGTGGTAAA ААААССАААА AAGAACAGAA AACCGCTCAC420

TTCCTGCCGA TGGCAATCAC ТТАА444 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 46:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 147 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 46:

Met Pro Glu 1

Arg

His Thr Arg Ser 5

Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp

10

15

lie

Arg

Vai

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

20

25

30

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

35

40

45

Ash

lie

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

lie

Lys

50

55

60

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

65

70

75

80

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

’Glu

Leu

He

85

90

95

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

100

105

110

Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Vai

Arg

115

120

125

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

130

135

140

Ala Ila Thr

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 47:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 441 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 47:

ATGGAACGTC ATACGCGTTC CTACGACTAC ATGGAAGGTG GTGACATCCG CGTACGTCGT

CTGTTCTGCC GTACCCAGTG GTACCTGCGT ATCGACAAAC GCGGCAAAGT CAAGGGCACC

CAAGAGATGA	aaaacaacta CAATATTATG GAAATCCGTA CTGTTGCTGT tggtatcgtt	180
GCAATCAAAG	GTGTTGAATC TGAATTCTAC CTGGCAATGA ACAAAGAAGG TAAACTGTAC	240
GCAAAAAAAG	AATGCAACGA AGACTGCAAC ttcaaagaac tgatcctgga ааассастас	300
AACACCTACG	CATCTGCTAA ATGGACCCAC AACGGTGGTG AAATGTTCGT TGCTCTGAAC	360
CAGAAAGGTA	TCCCGGTTCG TGGTAAAAAA ACCAAAAAAG AACAGAAAAC CGCTCACTTC	420
CTGCCGATGG	CAATCACTTA A	441

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 48:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 146 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (Xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 48:

Met Glu Ахд His The As? Sec

Tyr

Asp Tyr 10

Met

Glu Gly

Gly

Asp 15

He

1

5

Ac?

Vai Ar?

Ar? 20

Leu

Phe

Cys

Ar?

Thr 25

Gin

Trp

Tyr

Leu

Ar? 30

lie

Asp

Lys

Ax? Gly 35

Lys

Val

Lys

Gly

Thr 40

Gin

Glu

Met

Lys

Asn 45

Asn

Tyr

Asn

lie

Met Glu 50

II·

Ar?

Thr

Val 55

Ala

Val

Gly

II·

Val 60

Ala

Ila

Lys

Gly

Vai 65

Glu Ser

G1U

Ph·

Tyr 70

Leu

Ala

Met

АЗП

Lys 75

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr 80

Ala

Lys Lys

Glu

Cys 85

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn 90

Ph·

Lys

Glu

Leu

lie 95

Leu

Glu

Asn His

Tyr 100

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 105

Ala

Lys

Trp

Thr

His 110

Asn

Gly

Glu Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Val

Ar?

Gly

115 120 125

-Lys Lys Thr.Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala ’ 130 135 140 lie Thr

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 49:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 438 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 49:

ATGCGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG 60 TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA 120 GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA 180 ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA 240 AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC 300 ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG 360 AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG 420 CCGATGGCAA TCACTTAA 438 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 50:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 145 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: белтък (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 50:

Met Arg 1

His

Thr

Arg 5

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met 10

Glu

Gly

Asp

lie 15

Arg

Val

Arg

Leu 20

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin 25

Trp

Tyr

Leu

Arg

lie 30

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys 35

Val

Lys

Gly

Thr

Gin 40

Glu

Met

Lys

Asn

Asn 45

Tyr

Asn

lie

Met

Glu 50

lie

Arg

Thr

Val

Ala 55

Val

Gly

He

Val

Ala 60

lie

Lys

Gly

Val

Glu 65

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu 70

Ala

Met

Asn

Lys

Glu 75

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala 80

Lys

Glu

Cys

Asn 85

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe 90

Lys

Glu

Leu

lie

Leu 95

Glu

Asn

His

Tyr

Asn 100

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala 105

Lys

Trp

Thr

His

Asn 110

Gly

Glu

Met

Phe 115

Val

Ala

Leu

Asn

Gin 120

Lys

Gly

Xie

Pro

Val 125

Arg Gly

Lys

Thr 130

Lys

Glu

Gin

Lys 135

Thr

Ala

His

Phe

Leu 140

Pro

Met

Ala

He

Thr

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 51:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 435 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 51:

ATGCATACTC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC60

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG120

ATGAAAAACA АСТАСЛАТАТ TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC180 aaaggtgttg aatctgaatt CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA

AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA ctacaacacc

TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA

GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG

ATGGCAATCA CTTAA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 52:

240

300

360

420

435 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 144 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 52

Met 1

His

Thr

Arg

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu. Gly Gly Asp lie Arg Vai

5

10

15

Arg

Leu

Ph· 20

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 25

Tyr Leu

Arg

lie

Asp Lys 30

Arg

Gly

Lys

Vai 35

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 40

Met

Lys Asn

Asn

Tyr 45

Asn lie

Met

Glu

Xie 50

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai 55

Gly

He

Vai. Ala

He 60

Lys

Gly Vai

Glu

Ser 65

Glu

Ph·

Tyr

Leu

Ala 70

Met

Asn

Lys

Glu Gly 75

Lys

Leu

Tyr Ala

Lys 80

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 85

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys Glu 90

Leu

lie

Leu Glu 95

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 100

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 105

Trp Thr

His

Asn

Gly Gly 110

Glu

Met

Ph·

Vai 115

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 120

Gly

lie Pro

Vai

Arg Gly Lys 125

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Ph· Leu

Pro

Met

Ala He

Thr

130 135 140 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 53:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 432 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 53:

IATGACTCGTT CCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GCGTACGTCG TCTGTTCTGC60

CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA CGCGGCAAAG TCAAGGGCAC CCAAGAGATG120

ААААЛСАЛСТ АСЛАТАТТАТ GGAAATCCGT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA180

GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA240

I GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA CTGATCCTGG ААААССАСТА СААСАССТАС 300

GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 3S0

ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA ААССЛЛАААЛ GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 420

GCAATCACTT АА432 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 54:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 143 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 54:

Met Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Vai Arg 15 10 15

Arg Leu Ph· Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg II· Asp Lys Arg Gly 20 25 30

Lys

Vai Lys Gly Thr Gin 35

Glu

Met Lys Asn Asn Tyr Asn lie Met Glu

40

⁴⁵

He

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

lie

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

50

55

60

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

65

70

75

80

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

He

Leu

Glu

Asn

His

85

90

95

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

100

105

HO

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Vai

Arg

Gly

Lys

Thr

115

120

125

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

He

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 55:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 429 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 55

ATGCGTTCCT ACGACTACAT GGAAGGTGGT GACATCCGCG TACGTCGTCT GTTCTGCCGT	60
ACCCAGTGGT ACCTGCGTAT CGACAAACGC GGCAAAGTCA AGGGCACCCA AGAGATGAAA	120
AACAACTACA. ATATTATGGA AATCCGTACT GTTGCTGTTG GTATCGTTGC AATCAAAGGT	180
GTTGAATCTG AATTCTACCT GGCAATGAAC AAAGAAGGTA AACTGTACGC AAAAAAAGAA	240
TGCAACGAAG ACTGCAACTT CAAAGAACTG ATCCTGGAAA АССАСТАСАЛ CACCTACGCA	300
TCTGCTAAAT GGACCCACAA CGGTGGTGAA ATGTTCGTTG CTCTGAACCA GAAAGGTATC	360
CCGGTTCGTG GTAAAAAAAC CAAAAAAGAA CAGAAAACCG CTCACTTCCT GCCGATGGCA	420
. ATCACTTAA	429

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 56:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 142 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 56:

Met Arg Ser Tyr 1

Asp 5

Tyr Met Glu

Gly Gly Asp lie Arg Vai Arg Arg

10

15

Leu

Phe

Cys Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

20

25

30

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

35

40

45

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

lie

Vai

Ala

lie

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

65

70

75

80

Cya

АЗП

Glu

Asp Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

85

90

95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

100

105

110

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Vai

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

He

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 57:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК

101 (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 57:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360 GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 58:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 58:

Met

Ser

Tyr Asp Tyr

Met

Glu Gly Gly Asp

lie

Arg

Val Arg

Arg

Leu

1

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr Leu

Arg

lie

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

АЗП

Tyr

Asn

He

Met

Glu

lie

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

He

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

He

Leu

Glu

Asn

H1S

Tyr

Asn

90 ' 95

102

The Tyr Ala Ser 100

Ala Lys

Trp Thr

His Asn 105

Gly Gly

Glu Met Phe 110

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 59:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 423 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 59:

ATGTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CCGTACCCAG 60 TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC 120 ТАСААТАТТА TGGAAATCCG TACTGTTGCT GTTGGTATCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA 180 TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAACTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC 240 GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGCATCTGCT 300 AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT 360 CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT 420 TAA 423 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 60:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 140 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък

103 (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 60

Met Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly
1	5
Cys	Arg	Thr	Gin 20	Trp	Tyr	Leu	Arg
Gly	Thr	Gin 35	Glu	Met	Lys	Asn	Asn 40
Vai	Ala 50	Vai	Gly	lie	Vai	Ala 55	lie
Leu 65	Ala	Met	Asn	Lys	Glu 70	Gly	Lys
Glu	Asp	Cys	Asn	Phe 85	Lys	Glu	Leu
Tyr	Ala	Ser	Ala 100	Lys	Trp	Thr	His
Leu	Asn	Gin 115	Lys	Gly	Ila	Pro	Vai 120
Gin	Lys 130	Thr	Ala	His	Phe	Leu 135	Pro

Asp	Ila 10	Arg	Vai	Arg	Arg	Leu 15	Pha
Tie 25	Asp	Lys	Arg	Gly	Lys 30	Vai	Lys
Tyr	Asn	Ila	Met	Glu 45	Ila	Arg	Thr
Lys	Gly	Vai	Glu 60	Ser	Glu	Phe	Tyr
Leu	Tyr	Al* 75	Lys	Lys	Glu	Cys	Asn 80
Tie	Leu 90	Glu	Asn	His	Tyr	Asn 95	Thr
Asn 105	Gly Gly	Glu	Met	Phe 110	Vai	Ala
Arg	Gly	Lys	Lys	Thr 125	Lys	Lys	Glu
Met	Ala	ria	Thr 140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 61:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 495 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 61:

ATGTCTAATG ATATGACTCC CGTCACACGC GTTCCTACGA TGCCGTACCC AGTGGTACCT ATGAAAAACA ACTACAATAT

GGAACAGATG GCTACCAACG

CTACATGGAA GGTGGTGACA

GCGTATCGAC AAACGCGGCA

TATGGAAATC CGTACTGTTG

TTAACTCCTC CTCCCCGGAA

TCCGCGTACG TCGTCTGTTC

AAGTCAAGGG CACCCAAGAG

CTGTTGGTAT CGTTGCAATC

120

180

240

104

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300

AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA

TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA

GGTATCCCTG TTGAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG

ATGGCAATCA CTTAA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 62:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 164 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък

3’60

420

480

495_ (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 62:

Met 1' ..

Ser

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Ser

5

10

15

Ser

Pro

Glu 20

Arg His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly Gly

Asp

Ila

Arg 35

Vai

Arg Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

He

Asp 50

Lys

Arg

Gly Lys

Vai 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Tyr 65

Asn

lie

Met

Glu He 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

II·

Val

Ala

He 80

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser Glu 85

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 100

Lys Glu

Cys

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Ph·

Lys 110

Glu

Leu

lie

Leu

Glu 115

Asn

His Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Xie

Pro

Val

130 135 140

105

Glu Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lya Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160

Met Ala lie Thr (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 63:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 495 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 63:

ATGTCTAATG ATATGACTCC CGTCACACGC GTTCCTACGA TGCCGTACCC AGTGGTACCT ATGAAAAACA· ACTACAATAT AAAGGTGTTG AATCTGAATT AAAGAATGCA ATGAAGATTG TATGCATCTG CTAAATGGAC GGTATCCCTG TTCAAGGTAA ATGGCAATCA CTTAA

GGAACAGATG GCTACCAACG CTACATGGAA GGTGGTGACA GCGTATCGAC AAACGCGGCA TATGGAAATC CGTACTGTTG CTATCTTGCA ATGAACAAGG TAACTTCAAA GAACTAATTC CCACAACGGT GGTGAAATGT GAAAACCAAG AAAGAACAGA

TTAACTCCTC CTCCCCGGAA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC AAGTCAAGGG CACCCAAGAG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC AAGGAAAACT CTATGCAAAG TGGAAAACCA TTACAACACA TCGTTGCTCT GAACCAGAAA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG

120

180

240

300

360

420

480

495 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 64:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

106 (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 64:

Met 1

Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn

Ser

5

10

15

Sec

Ser

Pro

Glu Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

lie

Arg

Vai

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

lie

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

lie

Met

Glu

He

Arg

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

lie

Vai

Ala

He

65

70

75

80

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Vai

130

135

140

Gin

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Ph·

Leu

Pro

145

150

155

160

Met

Ala

II·

Thr

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 65:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 65:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

107

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	1Θ0
GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	240
AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC АТТАСААСАС	ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

АСТТАА 42δ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 66:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 66:

Met Sec Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp lie Arg Vai Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

АЗП

Asn

Tyr

Asn

Xie

Met

Glu

He

Arg

35

40

45

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

lie

Vai

Ala

Xie

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

АЗП

Glu

Asp Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Xie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

95

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Val

Gin

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

LyS

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

130

135

140

108

I (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 67:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ВИД: нуклеинова киселина (В) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 67:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 68:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК <ix) .FEATURE:

(A) NAME/KEY: misc_feature (B) LOCATION: complement (1..24) (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 68:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No; 69:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 18 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г)ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 69:

I

СААТСТАСАА TTCACAGA 18

109 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 70:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 18 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 70:

TTAAGTTATT GCCATAGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 71:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 29 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 71:

AACAAAGCTT СТАСЛАТТСА CAGATAGGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 72:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 27 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 72:

AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG

110 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 73:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 38 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 73:

CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG 38 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 74:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 33 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 74:

GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG 33 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 75:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 75:

Xaa Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Xaa Xaa Ser 1 5 10 .- 15

111 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 76:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 12 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 76:

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Vai 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 77:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 517 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 77:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT60

TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT120

CCGCGTACGC CGTTTGTTCT CTCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA180

AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC240

TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TATCTTGCAA TGAACAAGGA300

AGGAAAACTC TATGCAAAGA AAGAATGCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAATTCT360

GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT420

TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA480

AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG517

112 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 78:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 164 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 78:

Met 1

Ser

Asn

Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly Gly

; 1 1 1

20

25

•

30

1 Asp

lie

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Ser

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

lie

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

lie

Met

Glu

lie

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ila

Val

Ala

lie

65

70

75

80

Lye

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

1

85

90

.

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Ph·

Lys

Glu

Leu

100

105

110

II·

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Ph·

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Val

i

130

135

140

Arg Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145	150	155	160
Met Ala II· Thr

113 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 79:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 517 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 79:

CTAGAAGGAG	GAATAACATA	TGTCTAATGA	TATGACTCCG	GAACAGATGG	CTACCAACGT	60
TAACTCCTCC	TCCCCGGAAC	GTCACACGCG	TTCCTACGAC	TACATGGAAG	GTGGTGACAT '	¹²⁰
CCGCGTACGT	CGTCTGTTCT	GCCGTACCCA	GTGGTACCTG	CGTATCGACA	AACGCGGCAA	180
AGTCAAGGGC	ACCCAAGAGA	TGAAAAACAA	CTACAATATT	ATGGAAATCC	GTACTGTTGC	2 4,0
TGTTGGTATC	GTTGCAATCA·	AAGGTGTTGA	ATCTGAATTC	TACCTGGCTA	TGAACAAAGA	300
AGGTAAACTG	TACGCTAAAA	AAGAATCCAA	TGAAGATTGT	AACTTCAAAG	AACTAATTCT	360
GGAAAACCAT	TACAACACAT	ATGCATCAGC	TAAATGGACA	CACAACGGAG	GGGAAATGTT	420
TGTTGCCTTA	AATCAAAAGG	GGATTCCTGT	AAGAGGAAAA	AAAACGAAGA	AAGAACAAAA	480
AACAGCCCAC	TTTCTTCCTA	TGGCAATAAC	TTAATAG			517

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 80:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 164 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 80:

net ear лзп лзр Mat ТПг Pro Glu Gin Met Аха xnr лзп vax лзп oar 15 10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 30

114

Asp

lie

Arg 35

Val

Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

lie

Asp 50

Lys

Arg

Gly

Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Tyr 65

Asn

He

Met

Glu

He 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

Xie

Val

Ala

He 80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser 85

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 100

Lys

Glu

Ser

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

He

Leu

Glu 115

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 130

Glu

Met

Phe

Val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

Xie

Pro

Val

Arg 145

Gly Lys

Lys

Thr

Lys 150

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 155

Ala

His

Phe

Leu

Pro 160

Met Ala lie Thr (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 81:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 517 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 81:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT60

TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT120

CCGCGTACGT CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA180 ♦

AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC240

TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA300

115

AGGTAAACTG TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTCT AACTTCAAAG AACTAATTCT360

GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT420

TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA480

AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG517 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 82:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 164 амино кисекини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 82:

Met 1

Ser Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

lie

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

lie

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

He

Val

Ala

Ila

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Ser

Asn

Glu

Asp

Ser

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

He

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Val

130

135

140

Arg Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met

Ala

He

Thr

116 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 83:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 83:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:83:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGGAACAGAA AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420
ACTTAA	426

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 84:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 84:

Met Set Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Ar? Val Ar? Ar? Leu

5 1015

Phe Cys Ar? Thr Gin Trp Tyr Leu Ar? lie Asp Lys Ar? Gly LysVal

25'30

117

Lys

Gly

Thr 35

Gin

Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn lie Met Glu

He

Arg

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

He

Val

Ala

He

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Glu

Gin

Lys

Gly

He

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

_e

115

120

125

/

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

He

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 85:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г)ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 85:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT	30.0
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGGA AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420
ACTTAA	426

i •1

118 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 86:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 анимо киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 86:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Vai Arg Arg Leu

5 1015

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg lie Aap Lya Arg Gly LyaVai

25.30

Lya

Gly

Thr 35

Gin

Glu

Met

Lya

Asn 40

Asn

Tyr

Asn

He

Met 45

Glu

He

Arg

Thr

Vai 50

Ala

Vai

Gly

He

Vai 55

Ala

He

Lya

Gly

Vai 60

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr 65

Leu

Ala

Met

Asn

Lys 70

Glu

Gly

Lya

Leu

Tyr 75

Ala

Lys

Glu

Cys 80

Asn

Glu

Asp

Cya

Asn as

Phe

Lya

Glu

Leu

He 90

Leu

Glu

Asn

His

Tyr 95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 100

Ala

Lys

Trp

Thr

Hia 105

Asn

Gly Gly

Glu

Met 110

Phe

Vai

Ala

Leu

Asn 115

Gin

Glu

Gly

He

Pro 120

Vai

Arg Gly Lys

Lys 125

Thr

Lys

Glu

Gin 130

Lya

Thr

Ala

His

Phe 135

Leu

Pro

Met

Ala

He 140

Thr

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 87:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

119 (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 87:

atgtcctacg actacatgga aggtggtgac CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG ACTTAA

ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

TTCGTTGCTC TGAACCAGCA AGGTATCCCT360

AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

426

ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 88:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 88:

Met Ser 1	Tyr	Asp Tyr 5	Met Glu Gly Gly Asp He Arg Vai Arg Arg Leu
10	15
Ph· Cys	Arg	Thr Gin ²⁰	Trp Tyr Leu Arg lie Asp 25	Lys Arg Gly Lys Vai 30
Lys Gly	Thr 35	Gin Glu	Met Lys Asn Asn Tyr Asn 40	He Met Glu He Arg 45
Thr Vai 50	Ala	Vai Gly	lie Vai Ala Ila Lys Gly 55	Vai Glu Ser Glu Phe 60
Tyr Leu 65	Ala	Met Asn	Lys Glu Gly Lys Leu Tyr 70 75	Ala Lys Lys Glu Cys 80

120

Лзп

Glu

Aap ‘Cys

Asn 85

Phe

Lya 4

Glu

Leu

lie 90

Leu

Glu

Asn

His

Tyr 95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 100

Ala

Lya

Trp

Thr

Hla 105

АЗП

Gly

Glu

Met 110

Phe

Vai

Ala

Leu

Aan 115

Gin

Gly

He

Pro 120

Vai

Arg

Gly

Lys

Lys 125

Thr

Lys

Lya

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

Hla

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

He

Thr

130 135 140 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 89:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 89:

ATGTCCTACG	ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT	360
GTTGCTGGTA	AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420

АСТТАА

426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 90:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г)ТОПОЛОГИЯ: неизвестна

121 (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 90:

(II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък

Met Ser 1

Tyr

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp

lie

Arg Val Arg

Arg 15

Leu

5

10

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

lie

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ila

Met

Glu

lie

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

lie

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

SO

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Val

Ala

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

He

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 91:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 91:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

122

ААСТАСААТА	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	2 40
AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATT AC AAC АС	ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTGAAGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

АСТТАА 426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 92:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 92:

Met 1	Ser	Tyr	Asp	Tyr 5
Phe	Cys	Arg	Thr 20	Gin
Lys	Gly	Thr 35	Gin	Glu
Thr .	Vai 50	Ala	Vai	Gly
Tyr 65	Leu	Ala	Met	Asn
1 Asn	Glu	Asp	Cys	АЗП 85
Thr 1	Tyr	Ala	Ser 100	Ala
1 , Ala	Leu	Asn 115	Gin	Lys
Glu	Gin 130	Lys	Thr	Ala

Met Glu	Gly	Gly Asp Ila Arg Vai Arg Arg Leu
10	15
Trp	Tyr	Leu	Arg	He	Asp	Lys	Arg	Gly	Lys	Vai
			25					30
Met	Lys	Asn	АЗП	Tyr	Asn	III	Met	Glu	He	Arg
		40					45
Не	Vai	Ala	He	Lys	Gly	Vai	Glu	Ser	Glu	Phe
	55					60
Lys	Glu	Gly	Lys	Leu	Tyr	Ala	Lys	Lys	Glu	Cys
70					75					80
Phe	Lys	Glu	Leu	He	Leu	Glu	Asn	His	Tyr	Asn
				90					95
Lys	Trp	Thr	His	Asn	Gly Gly	Glu	Met	Phe	Vai
			105					110
Gly	He	Pro	Vai	Glu	Gly Lys	Lys	Thr	Lys	Lys
		120					125
His	Phe	Leu	Pro	Met	Ala	He	Thr
	135				•	140

123 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 93:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 93:

atgtcctacg actacatgga aggtggtgac atccgcgtac GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCTGGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 94:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: анимо киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 94:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Vai Arg Arg Leu 15 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg lie Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30

124

Lys

Gly Thr Gin Glu Met 35

Lys

Asn Asn 40

Tyr Asn

lie

Met Glu 45

He

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

He

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

,

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Val

Leu

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 95:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 95:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC •	120
i ААСТАСААТЛ TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT j	180
GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 1	240
AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATTCCT	360
GTTCGTGGTA AGGAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420
i ¹ АСТТАЛ	426

i

125 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 96:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 96:

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:96:

Met

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

He

Arg

Val

Arg

Leu

1

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

lie

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

He

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

HO

Ala

Leu

Asn

Gin Lys

Gly

He

Pro

Val

Arg Gly Lys

Glu

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lie

Thr

130 . 135 140 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 97:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК

126 (xi) ОПИСАНИЕ HA СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 97:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGCAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:98:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (B) ВИД: амино киселина (В) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 98:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Val Arg Arg Leu

1

5

10

15

Phe

Cys Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

lie

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

lie

Met

Glu

lie Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

lie

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu Cys

65

70

75

80

127

Asn Glu Asp -Cys Asn Phe

Lys Glu Leu lie Leu Glu Asn His

Thr Tyr Ala Ser Ala Lys

100

Phe Val

Tyr Asn ’

Ala Leu Asn Gin Lys Gly

115 lie Pro Val Arg Gly Lys Gin Thr

120 125

Lys Lys

Glu Gin Lys Thr Ala His 130

Phe Leu Pro Met Ala II· Thr 135 140 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 99:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 99:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT360

GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

ACTTAA426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 100:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна

128 (II) ВИД МОЛЕКУЛА: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 100:

Met Sec Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp He Arg Vai Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Vai

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

35

40

45

Thr

Vai

Ala

Vai

Gly

He

Vai

Ala

He

Lys

Gly

Vai

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lie

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Vai

100

105

110

Ala

Leu

Asn.Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Vai

Arg Gly Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Glu

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ho

Thr

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 101:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА: к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 101:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

129

аастасаата	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	АСТАСААСАС	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	CAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
АСТТАА						426

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 102:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (Г) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 102:

Met 1

Ser

Tyr

Asp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Val Arg Arg Leu

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

He

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

He

Met

Glu

He

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lie

Val

Ala

He

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

He

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

•

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lie

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Thr

Ala

His

Phe

Leu

: РГО

Met

Ala

lie

Thr

130 135 140

130 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 103:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 426 двойки бази (Б) ВИД: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : к ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 103:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

ААСТАСААТЛ TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT100

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 3 60

GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAAGAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

АСТТАА426 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 104:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА СЕКВЕНЦИЯТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 141 амино киселини (Б) ВИД: амино киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: неизвестна (□ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ВИД МОЛЕКУЛА : белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: СЕКВЕНЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No: 104:

Claims

Патентни претенции

1. Аналог на природния кератиноциден фактор на растежа (KGF), характеризиращ се с това, че съдържа аминокиселинната последователност на KGF, съдържаща модификация на една или повече аминокиселини от 32 до 55, показана със SEQ ID N0:2, където цистеиновият остатък в позиция 32 на аминокиселината от SEQ ID N0:2 и цистеиновият остатък в позиция 46 на киселината от SEQ ID N0:2 се делетира или се замества с друга аминокиселина.
2. Аналог на KGF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че цистеиновият остатък в позиция 32 на аминокиселината от SEQ ID N0:2 и цистеиновият остатък в позиция 46 на киселината от SEQ ID N0:2 се заличават.
3. Аналог на KGF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че аминокиселините от 32 до 55 от SEQ ID N0:2 се заличават.
4. Аналог на KGF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че цистеиновият остатък в позиция 32 на аминокиселината от SEQ ID N0:2 се заличава и цистеиновият остатък в позиция 46 от аминокиселината от SEQ ID N0:2 се замества с друга аминокиселина.
5. Аналог на KGF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че до първите четиринадесет N-терминални аминокиселини се заличават и цистеиновият остатък в позиция 46 на аминокиселината от SEQ ID N0:2 се замества с друга аминокиселина.
6. Аналог на KGF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че цистеиновият остатък в позиция 32 на аминокиселината от SEQ ID N0:2 и цистеиновият остатък в позиция 46 на аминокиселината от SEQ ID N0:2 се заместват с друга аминокиселина.
7. Аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 4 до 6, характеризиращ се с това, че аминокиселинният остатък, избран от аланин, левцин или серин, се

187 заменя с цистеинов остатък.
8. Аналог на KGF съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че сериновият остатък се замества с цистеинов остатък.
9. Аналог на KGF съгласно вяска от претенциите от 1 до 8, характеризиращ се с това, че съдържа по-нататък заместване в позицията на аминокиселината, избрана от аргининовия остатък в позиция 72 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, лизиновия остатък в позиция 86 на аминокиселинната последователност SEQ ID N0:2, лизиновия остатък в позиция 126 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, аспаргиновия остатък в позиция 168 на аминокиселината от SEQ ID N0:2, остатъка на глутаминовата киселина в позиция 169 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, лизиновия остатък в позиция 170 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, аргининовия остатък в позиция 175 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, глутаминовия остатък в позиция 183 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, лизиновия остатък в позиция 184 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2 или треониновия остатък в позиция 185 на аминокиселинната последователност ат SEQ ID N0:2.
10. Аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 9, характеризиращ се с това, че съдържа по-нататък най-малко една аминокиселина в бримкообразу- , . 146 ™ 150 ващата последователност на аминокиселинните остатъци в позиция Asn - 1 nr на SEQ ID N0:2, заместени с остатък на различни аминокиселини, които имат повисок потенциал на бримкообразуване.
11. Аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 9 до 10, характеризиращ се с това, че аминокиселините от 32 до 54 от SEQ ID N0:2 са делетирани.
12. Аналог на KGF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че аналогът е С (1,15) S (който съответства на SEQ ID N0:32, с начален метионинов остатък, който се счита като остатък “0” и е по избор); С (1,15,40) S (който

188 съответства на SEQ ID N0:78, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и който е по избор); Q (l,15,102)S (който съответства на SEQ ID N0:80 с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); С (1, 15, 102, 106)S (който съответства на SEQ ID N0:82 с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 15 (SEQ ID N0:42, начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔN16 (който съответства на SEQ ID N0:44, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 17 (който съответства на SEQ ID N0:46, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 18 (който съответства на SEQ ID N0:48, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 19 (който съответства на SEQ ID N0:50, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 20 (който съответства на SEQ ID N0:52 с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 21 (който съответства на SEQ ID N0:54, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 22 (който съответства на SEQ ID N0:56, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 23 (който съответства на SEQ ID N0:58 с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 24 (който съответства на SEQ ID N0:60 с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N3/C(15)S (който съответства на SEQ ID N0:34, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 3/С(15) (който съответства на SEQ ID N0:36, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 8/С(15)S (който съответства на SEQ ID N0:38, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 8/С(15) - (който съответства на SEQ ID N0:40, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); C(1,15)S/R(144)E (който съответства на SEQ ID N0:62, с начален метионинов остатък, който се

189 счита за остатък “0” и е по избор); С(1,15)S/R(144)Q (който съответства на SEQ ID N0:64, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23 /H(116)G (който съответства на аминокиселини 54-194 на SEQ ID N0:2 с хистидинов остатък в позицията 147 на аминокиселината, който е заместен с глицин; Δ N 23/N(137)E (който съответства на SEQ ID N0:84, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23/К(139)Е (който съответства на SEQ ID N0:86, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 23/К/(139)Q (който съответства на SEQ ID N0:88, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 23/R( 144)А (който съответства на SEQ ID N0:90, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и по избор); Δ N 23/R(144)E (който съответства на SEQ ID N0:92, начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23/R(144)L (който съответства на SEQ ID N0:94, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 23/К(147)Е ), който съответства на SEQ ID N0:96, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23/K(147)Q (който съответства на SEQ ID N0:98, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23/N(153)E (който съответства на SEQ ID N0:100, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23/ NK(153)Q (който съответства на SEQ ID N0:102, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); ΔΝ 23/Q(153)E (който съответства на SEQ ID N0:104, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор); Δ N 23/R(144)Q (който съответства на SEQ ID N0:66, с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор).
13. Аналог на KGF съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че представлява ΔΝ 16, който съответства на SEQ ID N0:44 с начален метионинов остатък, който се счита за остатък “0” и е по избор.

190
14. Аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 13, характеризиращ се с това, че има сигнална последователност или аминотерминален метионинов остатък.
15. Аналог на KGF съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че сигналната последователност е представена от аминокиселини от 1 до 31 на SEQ ID N0:2.
16. Аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 15, характеризиращ се с това, че аналогът е ковалентно свързан към химична група.
17. Аналог на KGF съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че химичната група е полиетилен - гликол.
18. Аналог на природния KGF, характеризиращ се с това, че представлява Δ N 23, съответстващ на SEQ ID N0:58, с начален метионинов остатък, считан за остатък “0”, който е по избор, и е ковалентно свързана към химична група.
19. Аналог на KGF съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че химичната група е полиетилен-гликол.
20. Аналог на KGF съгласно всяка претенция от 1 до 19, характеризиращ се с това, че е лиофилизиран.
21. Фармацевтично средство съгласно претенциите от 1 до 20, характеризиращо се с това, че съдържа терапевтично ефективно количество на аналог на KGF и фармацевтично приемлив носител.
22. Рекомбинантна молекула на нуклеинова киселина, кодираща аналог на KGF съгласно всяка претенция от 1 до 15.
23. Биологически функционален вектор, съдържащ молекула на нуклеиновата киселина съгласно претенция 22.
24. Прокариотична или еукариотична клетка гостоприемник, съдържаща молекула на нуклеиновата киселина съгласно претенция 22 или биологически функционален вектор съгласно претенция 23.

191
25. Прокариотична клетка гостоприемник съгласно претенция 24, която е

E.coli.
26. Еукариотична клетка гостоприемник, която по същество е клетка от бозайник, за предпочитане яйцеклетка от китайски хамстер.
27. Метод за получаване на аналог на KGF, характеризиращ се с това, че се осъществява при хранителни условия, подходящи за растежа на клетката гостоприемник съгласно всяка претенция от 24 до 26, които позволяват експресия на закодирания аналог на KGF и изолирането му.
28. Приложение на ефективно количество от аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 20 за получаване на медикамент за стимулиране продуцирането на нефибробластни епителни клетки.
29. Приложение на аналог на KGF съгласно претенция 28, характеризиращо се с това, че нефибробластните епителни клетки са избрани от яйчникови структури, клетки от панкреаса, клетки от черния дроб, слизест епител от дихателния и храносмилателния тракт, клетки от корнея или епителни клетки на тъпанчето.
30. Приложение на аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 20 за получаването на медикамента за стимулиране на продуцирането на нефибробластни епителни клетки в пациент, за профилактика или лечение на изгаряния и други частични и дълбоки наранявания; епидермолизис булоза, хемотерапия индуцирана алопеция, мъжки тип косопад, прогресивна загуба на коса при мъже и жени; стомашна и дуоденална язва, възпалителни заболявания на червата като болестта на Крон и язвени колити, чревна токсичност при радиация и хемотерапевтични режими на лечение, заболяване на хиалиновата мембрана, остро или хронично заболяване на белия дроб, хепатична цироза; общо заболяване на черния дроб; остър вирусен хепатит; токсични инсулти в черния дроб; увреждане на корнеята; прогресиращо заболяване на венците; увреждане на тъпанчето или захарен диабет.

192
31. Метод за стимулиране продуцирането на нефибробластни епителни клетки, за приложението на аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 21.
32. Метод съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че нефибробластните епителни клетки са избрани от яйчникови структури, клетки от панкреаса, клетки от черния дроб, слизест епител в дихателния и храносмилателния тракт, клетки от корнея или епителни клетки на тъпанчето.
33. Метод за профилактика или лечение на състоянието на пациенти, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 20 или фармацевтичен състав съгласно претенция 21 на пациенти, страдащи от изгаряния и други частични и дълбоки наранявания; епидермолизис булоза, хемотерапия - индуцирана алопеция, мъжки тип косопад, прогресивна загуба на коса при мъже и жени; стомашна и дуоденална язва, възпалителни заболявания на червата, като болест на Крон и язвени колити, чревна токсичност при радиация и хемотерапевтични режими на лечение, заболяване на хиалиновата мембрана, остро или хронично заболяване на белия дроб, хепатична цироза; общо заболяване на черния дроб; остър вирусен хепатит; токсични инсулти в черния дроб, увреждане на корнеята; прогресиращо заболяване на венците; увреждане на тъпанчето или захарен диабет.
35. Метод съгласно всяка от претенциите от 31 до 34, характеризиращ се с това, че аналог на KGF се назначава интравенозно, интрамускулно, субкутанно или интраперитонеално.
36. Набор, съдържащ аналог на KGF съгласно всяка от претенциите от 1 до 20 или фармацевтичен състав съгласно претенция 21.