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MÉMOIRE DESCRIPTIF
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DÉPOSÉ A L'APPUI D'UNE DEMANDE DE BREVET D'INVENTION
FORMÉE PAR
GENEX CORPORATION. pour Chymosine de jeune bovin.
Demandes de brevets aux Etats-Unis d'Amérique n 394. 433 du 1 juillet 1982 et n 484. 539 du 13 avril 1983 en faveur de C. A. VASLET.
La présente invention concerne un gène cloné de bovin qui spécifie la biosynthèse de la chymosine de ce bovin. Elle se rapporte, en outre, à un plasmide contenant un gène cloné de chymosine de bovin, de même qu'à un micro-organisme transformé au moyen d'un tel plasmide.
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La chymosyne fiou présure (EC 3. 2. 23. 427 est La chymosyne e une enzyme protéolytique abondante dans le tube digestif des ruminants non sevrés. La chymosine est sécrétée sous forme de zymogène, ou prochymosine, qui est une chaîne polypeptidique simple contenant 365 aminoacides (37. 000 daltons). La prochymosine est convertie en chymosine par l'élimination spécifique de 42 aminoacides N-terminaux au cours d'une réaction autocatalytique dépendante du pH.
La chymosine de veau existe sous la forme de deux isoenzymes (dites A et B), qui peuvent être dédoublées par chromatographie sur DEAE-cellulose de l'enzyme cristalline. L'isoenzyme B, qui peut être catalytiquement moins efficace que l'isoenzyme A, est aussi la forme la plus abondante dans les extraits tissulaires. L'étude de la séquence des aminoacides a été exécutée pour l'isoenzyme B de chymosine de veau et partiellement pour l'isoenzyme A et a révélé uniquement une différence d'un acide aminé au résidu 290 (la glycine dans l'isoenzyme B et l'acide aspartique dans l'isoenzyme A) ±-voir Foltmann, B et al., J. Biol.
Chem., 254 : 8447-8456 (197617.
La chymosine de veau (mélange des isoenzymes) est utilisée depuis des siècles pour la fabrication des fromages. Toutefois, depuis la seconde guerre mondiale, une certaine disette de chymosine de veau est apparue, principalement en conséquence d'une baisse de la consommation de viande de veau. La chymosine extraite du tissu de l'abomasum (caillette) du veau non sevré a été remplacée progressivement par d'autres enzymes d'origine animale ou microbienne, mais dont aucune n'a les propriétés optimales de. l'enzyme de veau.
En conséquence de cette disette, on s'est beaucoup intéressé au clonage bactérien d'un gène de chymosine de veau et à l'isolement d'un micro-organisme
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produisant de la chymosine. Différents chercheurs ont décrit l'extraction du mRNA de chymosine du tissu de la caillette du veau ±-voir H. Uchiyama et al., Agric.
Biol. Chem., 44, 1373-1381 (198017 et le clonage d'un gène de chymosine ou cDNA en double chaîne (ds-cDNA) dans E. coli [voir Beppu T. et al., Recombinant DNA Industrial Applications (The Cetus Symposium) IFS Meeting, p. F-21. 5 (L) (1980) . ishimori K. et al./J.
Biochem., 90, 901-904 (1981) ont décrit des essais de clonage d'un gène de prochymosine dans E. coli et indiquent avoir obtenu un clone contenant une insertion de 1021 paires de bases qui semble avoir une homologie de séquence avec le gène de chymosine de veau (sur base d'observations de traduction arrêtée sur hybride). Cette insertion de 1021 paires de bases représente à peu près 80% de la longueur complète du gène de chymosine, dans l'hypothèse où le segment complet est issu du gène de chymosine. Néanmoins, les auteurs ne mentionnent aucune donnée caractérisante pour le gène, par exemple l'information relative à la séquence ou la carte de restriction, et le degré auquel le fragment cloné est issu du gène de chymosine de veau n'est donc pas connu.
De surcroît, ces auteurs n'indiquent pas avoir observé une expression de protéine par leurs clones bactériens.
Il reste donc nécessaire d'isoler un gène cloné de chymosine de veau de longueur complète et une souche microbienne capable de produire de la chymosine de veau.
La présente invention concerne un gène isolé intact de chymosine de veau, un gène isolé intact de prochymosine de veau, des plasmides contenant ces gènes et des micro-organismes transformés au moyen de ces plasmides. De plus, l'invention concerne un procédé pour produire de la chymosine de veau, suivant lequel
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on cultive un micro-organisme produisant de la chymosine de veau sur un milieu nutritif dans des conditions propres à la production de la chymosine.
Les procédés pour isoler et cloner un gène de chymosine de veau tels qu'ils sont décrits ici sont, sauf indication contraire, exécutés suivant les techniques habituelles de la biologie moléculaire. On peut se référer, par exemple, à Ullrich A. et al., Science, 196, 1313 (1977) et à Seeburg P. H. et al., Nature, 270, 486 (1977).
Les procédés conduisant à un micro-organisme producteur de chymosine de veau peuvent être divisés en les stades majeurs suivants, dont chacun est décrit plus en détail ci-après : (1) extraction du mRNA de prochymosine de la muqueuse garnissant la caillette de veaux nourris au lait, (2) synthèse in vitro de cDNA en double chaîne au moyen du mRNA de prochymosine de veau comme modèle, (3) insertion du cDNA en double chaîne dans un vecteur de clonage approprié et transformation de cellules au moyen de ce vecteur de clonage, et (4) sélection des clones microbiens contenant le gène de prochymosine de veau, sur base de leur aptitude à exprimer la prochymosine de veau.
Les détails expérimentaux relatifs à ces techniques sont discutés ciaprès dans les exemples, mais il convient de noter que ces techniques sont susceptibles de modifications notables tout en conduisant aux résultats désirés dans le cadre de l'invention.
Le mRNA de prochymosine de veau est avantageusement recueilli sous forme de mRNA polysomique après broyage de la muqueuse garnissant la caillette de veaux nourris au lait. Des ribonucléases existent dans ce tissu en concentrations relativement élevées, de sorte que le tissu est conservé par congélation peu après la mort de l'animal et que des substances sont utilisées
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pendant l'extraction pour atténuer l'activité des ribonucléases. De façon générale, le procédé de C. Vaslet et al., Nature, 285, 674-676 (1980) est applicable à l'extraction du mRNA polysomique.
Le tissu congelé peut être pulvérisé et homogénéisé et, après une centrifugation préliminaire éliminant les lipides et les débris cellulaires insolubles, le mRNA polysomique relativement dense est avantageusement séparé par centrifugation sur un gradient de saccharose. Du mRNA polyadénylé peut être isolé aisément de la préparation de mRNA polysomique par élution sur une colonne d'oligo d (T)-cellulose. Voir Green M. et al., Arch. Biochem.
Biophys., 172, 74 (1976).
Pour l'isolement d'une préparation enrichie de mRNA de prochymosine, l'éluat de la colonne d'oligo d (T)-cellulose peut être fractionné par centrifugation sur un gradient de saccharose, de la manière classique.
Les fractions de mRNA obtenues par centrifugation sur gradient de saccharose sont avec avantage sousmises à une vérification de leur teneur en mRNA de prochymosine en vue d'une détermination de leur activité de traduction dans un système de traduction exempt de cellules.
Un certain nombre de systèmes de traduction exempts de cellules ont été mis au point, par exemple l'extrait de germes de froment [Martial J. et collaborateur, Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA, 74, 1816 (1977S, un lysat de rétriculocytes dépendant du mRNA Pelham H. R. B. et al.,
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Eur. J. Biochem., 67, 247 zo et des oocytes de Xenopus laevis Lrsioma A. et al., Methods in Enzymology, volume 70 (1981li. Le système avec extrait de germes de froment est préféré pour la recherche du mRNA de prochymosine. Le système aux germes de froment exempt de cellules peut être additionné d'un aminoacide radioactif marqué, comme la S35-méthionine, de manière que les protéines résultantes contiennent un traceur.
La
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teneur en prochymosine des différents produits de germes de froment est alors avantageusement observée par électrophorèse sur gel, puis visualisation par fluorographie et la fraction de mRNA, qui s'est révélée contenir de la prochymosine dans ce système, est utilisée pour la synthèse du ds-cDNA.
La synthèse du cDNA est faite au moyen de la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire. Cette enzyme catalyse la synthèse d'une chaîne unique de DNA à partir des triphosphates de désoxynucléosides sur le mRNA modèle. Voir Kacian D. L. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 73, 2191 (1976). La queue poly r (A) du mRNA permet d'utiliser l'oligo (dT) (environ 12 à 18 nucléotides) comme amorce pour la synthèse du cDNA. L'utilisation d'un triphosphate de désoxynucléoside marqué radio-actif facilite la surveillance de la réaction de synthèse. De manière générale, un triphosphate de désoxynucléoside contenant du 32p, par exemple/-P/dCTP, peut être utilisé avec avantage à cette fin.
La synthèse du cDNA est généralement effectuée par incubation d'une solution du mRNA, des triphosphates de désoxynucléosides, de l'oligo (dT) et de la transcriptase inverse. La solution contient de
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préférence aussi de petites quantités d'actinomycine D éférence aus e p et de dithiothréitol favorisant la synthèse en longueur complète. Voir Kacian D. L. et al., supra. Après incubation, de l'acide éthylènediaminetétraacétique est ajouté à la solution et celle-ci est extraite avec du phénol/chloroforme. La phase aqueuse est avantageusement purifiée par chromatographie de filtration sur gel et le complexe cDNA-mRNA de l'éluat est précipité au moyen d'alcool.
Le mRNA peut être hydrolysé sélectivement en présence du cDNA au moyen d'hydroxyde de sodium dilué à une température élevée. La neutralisation de la solu-
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tion alcaline et la précipitation par l'alcool donnent la copie cDNA en chaîne simple.
La copie cDNA en chaîne simple s'est révélée comprendre une queue 5'-poly (dT) et avoir une structure en épingle à cheveux 3'terminale qui procure un segment court de DNA double. Voir Efstratiadis A et al., Cell, 7, 279 (1976). Cette structure en épingle à cheveux 3'peut servir d'amorce pour la synthèse d'une seconde chaîne de DNA. La synthèse de cette seconde chaîne est exécutée sensiblement dans les mêmes conditions que la synthèse de la copie cDNA, la transcriptase inverse étant toutefois remplacée par le fragment Klenow de la polymérase I de DNA de E. coli/Klenow H. et al., Eur. J. Biochem., 22, 371 (197l 7. Le cDNA double isolé de cette façon comprend une boucle 3' provenant de la structure en épingle à cheveux 3'de la copie cDNA en chaîne simple.
Cette boucle 3'peut être détachée par digestion avec une enzyme, à savoir la 81 nucléase, essentiellement suivant la technique de Ullrich A. et al., supra. Le produit de la digestion par la 81 nucléase peut être extrait au phénol/chloroforme et le ds-cDNA résultant peut être précipité de la phase aqueuse par addition d'alcool.
Pour la multiplication et la sélection, le gène de ds-cDNA préparé comme ci-dessus est généralement inséré dans un véhicule de clonage convenable qui est utilisé pour transformer des cellules hôtes appropriées. Des vecteurs de clonage convenables sont notamment différents plasmides et phages, mais la préférence va généralement aux plasmides. Les critères pour le choix d'un véhicule de clonage sont notamment sa dimension, son aptitude à la réplication dans les cellules hôtes, la présence de gènes pouvant être sélectionnés et la présence d'un site pour l'insertion du gène.
Pour ce qui est de la dimension, il est
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avantageux que le vecteur soit relativement petit pour
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permettre l'insertion d'un grand gène et pour ne pas e gaspiller d'importantes quantités d'éléments nutritifs, cellulaires et d'énergie dans la production de macromolécules inutiles. Le vecteur comprend également un réplicon intact qui reste fonctionnel après insertion du gène. Ce réplicon dirige de préférence le mode désiré de réplication du plasmide, c'est-à-dire des copies multiples ou une copie unique par cellule, ou bien un nombre contrôlable de copies par cellule. Les gènes spécifiants pour une ou plusieurs propriétés phénotypiques, de préférence de la résistance à des antibiotiques, facilitent la sélection des transformants.
Le site d'insertion est avantageusement un site de restriction unique pour une endonucléase de restriction. Un vecteur de clonage satisfaisant à tous ces critères est le plasmide pBR322. Voir Bolivar F. et al., Gene, 2, 95 (1977). Ce plasmide est petit (environ 2, 8 x 106 daltons), porte des gènes pour la résistance à l'ampicilline (amp) et à la tétracycline (tet) et est sujet à une réplication relâchée dans E. coli. Ce plasmide comprend également un site de restriction unique pour l'endonucléase PstI, qui existe dans le gène amp. Le ds-cDNA peut être inséré avec avantage dans ce plasmide suivant une technique de fixation en queue homopolymère. Voir Nelson T. et al., Methods of Enzymology, 68, 41 (1980).
Des queues homopolymères, par exemple de poly-dC, sont fixées sur les radicaux 3'-hydroxyle du ds-cDNA par réaction avec le triphosphate de désoxynucléoside approprié, par exemple dCTP, en présence d'une désoxynucléotidyl-transférase terminale [Chang L. M. S. et al., J. Biol. Chem., 246, 909 (1971) 7. Les ds-cDNA à queue de poly d (C) sont de préférence triés par dimension sur des gradients neutres de saccharose [voir Norgard et al., J. Biol.
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Chem., 255, 7665-7672 (198ou7. Les cDNA en double chaîne plus longs que 600 paires de bases sont utilisés aux stades ultérieurs.
Le plasmide est ouvert par digestion avec l'endonucléase appropriée et des queues homopolymères complémentaires, par exemple de poly-dG, sont fixées sur les radicaux 3'-hydroxyle du plasmide ouvert, suivant une technique de fixation de queue homopolymère identique, par exemple au moyen de dGTP. Si la chose est désirée, les réactions de fixation de queue peuvent être surveillées par mise en oeuvre de triphosphates de désoxynucléosides marqués radio-actifs, par exemple
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r /3H/dCTP et/3H/dGTP pour les réactions. En règle /3H7dCTP et Z3H e générale, ces réactions sont exécutées pour former des queues d'une longueur d'environ 10 à 20 nucléotides. Le cDNA augmenté de la queue et le plasmide sont recueillis, par exemple par extraction dans du phénol, puis précipitation par l'alcool.
Les deux espèces de DNA avec"queue"sont épurées par incubation dans une solution tamponnée de concentrations équimolaires des deux espèces de manière à donner un plasmide recombinant contenant le gène de prochymosine de bovin.
Une souche ampS, tetS appropriée de E. coli peut être transformée à l'aide du plasmide recombinant essentiellement suivant la technique de Lederberg, J.
Bacteriology, 119, 1072 (1974). Les transformants sont normalement cultivés sur du bouillon L ordinaire contenant de la tétracycline. Des échantillons de colonies croissant sur le milieu contenant de la tétracycline sont alors transférés dans un second milieu contenant de l'ampicilline. Du fait que le plasmide pBR322 confère aux cellules de la résistance à l'égard de la tétracycline, les colonies qui croissent sur le milieu contenant de la tétracycline doivent contenir le plasmide. D'autre part, la résistance à
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l'ampicilline du plasmide pBR322 est détruite par insertion du gène, de sorte que seules les colonies tetR, ampS sont retenues pour l'analyse ultérieure.
En règle générale, plusieurs centaines à quelques milliers de clones de prochymosine potentiels sont obtenus suivant ces modes opératoires. Pour identifier un groupe plus restreint de colonies qui contiennent le gène de prochymosine, un DNA marqué radio-actif peut être utilisé avec avantage comme indicateur. Voir Grunstein M. et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 72, 3961-3965 (1975). Un tel DNA indicateur peut être préparé avec avantage à partir d'une population fortement enrichie de mRNA de prochymosine au moyen de transcriptase inverse et par incorporation d'un nucléotide radio-actif marqué. De façon générale, le procédé de Grunstein et al. (supra) tel que modifié par Wahl et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 3683- 3687 (1979) constitue un procédé préféré pour analyser l'hybridation de la colonie.
Bien que l'hybridation de la colonie réduise généralement le nombre des clones de prochymosine potentiels, un nombre considérable de ces clones continue d'habitude d'exister. Un procédé qui a été appliqué avec succès pour sélectionner plus finement ces clones est le dosage par immunosorption avec liaison enzymatique (ELISA). Ce dosage permet de détecter la chymosine dans les clones où l'expression de la protéine se fait. L'opération consiste à appli- quer des étalons de chymosine et de produits de lyse de cellules sur la face intérieure des cuvettes de plaques de microtitrage en matière plastique et à réaliser une réaction immunologique entre la chymosine éventuellement présente et un anticorps antichymosine.
Le produit de conjugaison immobilisé est ensuite mis à réagir avec un second anticorps porteur d'enzyme qui
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est spécifique pour le premier anticorps. Après séparation de l'anticorps porteur non combiné, un substrat chromogène est introduit pour déterminer l'enzyme combinée en présence, ce qui constitue une mesure de la concentration en chymosine dans le produit de lyse cellulaire initial. Cette technique s'est révélée fort utile pour isoler un petit nombre de clones dans une grande population de clones identifiés comme positifs lors de l'analyse d'hybridation des colonies.
Les quelques clones identifiés par le système de dosage immunologique avec liaison enzymatique sont caractérisés avec avantage plus en détail par établissement de la carte de restriction et de la séquence des aminoacides. Un clone, dit pGx 1225, a donné des résultats positifs marqués et reproductibles à l'examen ELISA, et a été également confirmé comme contenant le gène de prochymosine par analyse de séquence et établissement de la carte de restriction. La carte de restriction de l'insertion du gène de prochymosine de pGx 1225 constitue la Fig. 1 des dessins. L'insertion consiste en 1289 paires de bases. Le zymogène est spécifié par la région depuis la paire de bases 43 jusqu'à la paire de bases 1137 et le gène de chymosine à maturité est spécifié depuis la paire de bases 169 jusqu'à la paire de bases 1137.
La séquence des nucléotides de ce gène de prochymosine inséré a été déterminée suivant le procédé de Sanger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 74, 5463- 5467 (1977) et cette séquence des nucléotides constitue la Fig. 2 subdivisée en Fig. 2A, Fig. 2B, Fig. 2C et Fig. 2D des dessins. La Fig. 2 montre la chaîne 5'-hua3' des régions non codantes et codantes, de même que la séquence des aminoacides spécifiés par le gène.
Aux fins de l'invention et pour la description de la Fig. 2, les abréviations ont les significations habi-
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tuelles suivantes :
A = désoxyadényle
T = thymidyle
G = désoxyguanyle C = désoxycytosyle
GLY = glycine
ALA = alanine
VAL = valine
LEU = leucine
ILE = isoleucine
SER = sérine
THR = thréonine
PHE = phénylalanine
TYR = tyrosine
TRP = tryptophane
CYS = cystéine
MET = méthionine
ASP = acide aspatique
GLU = acide glutamique
LYS = lysine
ARG arginin
HIS = histidine
PRO = proline
GLN = glutamine
ASN = asparagine Il convient de noter qu'en raison de la dégénérescence du code génétique, la séquence des nucléotides du gène peut varier sensiblement.
Par exemple, certaines parties ou l'ensemble du gène pourraient être synthétisés chimiquement pour produire du DNA ayant une séquence de nucléotides différente de celle indiquée à la Fig. 2, mais la séquence des aminoacides serait conservée à la condition que les attributions codonaminoacide appropriées soient respectées. Bien que la séquence des nucléotides du gène de prochymosine de
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veau et la séquence des aminoacides de la protéine aient été établies, le gène conforme à l'invention n'est pas limité à une séquence particulière des nucléotides et peut subir toutes les variations autorisées par le code génétique.
Une culture de cellules de E. coli, pGx 1225, contenant le gène de prochymosine inséré décrit cidessus a été déposée sous le numéro NRRL B-15061 au U. S. Department of Agriculture, Northern Régional Research Laboratory, Peoria, Illinois, E. U. A.
L'invention a été décrite avec référence à l'utilisation de E. coli comme bactérie hôte pour le DNA recombinant contenant le gène de prochymosine de veau, mais il est évident pour le spécialiste en biologie moléculaire que d'autres bactéries Gram-négatives, par exemple Pseudomonas, et des bactéries Gram-positives, par exemple Bacillus, outre des organismes unicellulaires supérieurs, par exemple des levures et champignons, peuvent être utilisés pour le clonage et/ou l'expression du gène de prochymosine ou de diverses parties de celui-ci.
L'invention est davantage illustrée par les exemples non limitatifs ci-après.
EXEMPLE 1. - Préparation du mRNA polysomique
On recueille les caillettes de veaux nourris au lait à l'abattoir local (Henry Stapf, Inc., Baltimore, Maryland) dans les 30 minutes après que les animaux ont été sacrifiés. On excise la muqueuse intérieure et on la congèle dans l'azote liquide pour la conserver. On prépare le mRNA polysomique suivant une variante du procédé décrit par Vaslet et al.
/' (Nature 285 : 6764-676 (1980L7. On homogénéise 50 g de tissu congelé pulvérisé dans 100 ml de tampon contenant du KCl 0, 25 M, du MgC12 0, 025 M, du Tris-HCl 0, 05 M de
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pH 7, 4, 0, 5% de NP40, 200/ug/ml de cyclohexamide et
250/ug/ml d'héparine. On centrifuge deux fois le produit d'homogénéisation à 10. 000 tours par minute pendant 10 minutes à 4 C pour clarifier une couche lipidique lourde et séparer les débris cellulaires. On recueille les polysomes sous la forme d'un culot en centrifugeant le liquide surnageant à basse vitesse dans une couche de 2, 5 ml de saccharose à 52% dans du tampon d'homogénéisation exempt de NP40, de cyclohexamide et d'héparine à 28. 000 tours par minute pendant 8 heures à 40C dans un rotor Beckman SW28.
On remet le culot de polysomes en suspension dans un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM de pH9, de l'EDTA 1 mM, du NaOAc 150 mM et 1% de SDS contenant de la protéinase (250/ug/ml). Après 60 minutes d'incubation à 37 C, on extrait la préparation à deux reprises avec du phénol/chloroforme et on précipite le RNA par l'alcool entre 0 et-80 C pendant 1 heure. On recueille le RNA sous forme de culot et on le lave trois fois avec de l'acétate de sodium 3 M pour solubiliser les petits RNA, la mucine et l'héparine. On remet le culot final de RNA polysomique en suspension dans de l'eau désionisée et on le conserve à-80 C.
On prépare du poly (A) + mRNa par hybridation du RNA polysomique avec une colonne d'oligo d (T)-cellulose. On met la colonne à l'équilibre avec du tampon de combinaison contenant du Tris-HCl 10 mM de pH 7, 6, de l'EDTA 1 mM, 0, 1% de SDS et du NaCl 400 mM, et on fait passer l'ensemble de la préparation de RNA polysomique cycliquement à cinq reprises sur la colonne. On élue le RNA non combiné avec plusieurs volumes de colonne de tampon de combinaison. Le tampon d'élution contient du Tris-HCl 10 mM de pH 7, 6, de l'EDTA 1 mM et 0, 1% de SDS et est utilisé pour éluer de la colonne le poly (A) + mRNA combiné. On précipite le poly (A) + mRNA
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par l'alcool et on le conserve à-80 C.
EXEMPLE 2.Fractionnement du poly (A) + mRNA sur un gradient de saccharose
On dépose en couche le poly (A) + mRNA sur un gradient de densité de saccharose continu de 5% à 20% préparé dans du tampon SDS contenant 0, 5% de SDS, du
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NaCl 0, 1 M, du Tris 0, 01 M de pH 7, 5 et de l'EDTA 0, 001 M. On chauffe le RNA à 80 C pendant 2 minutes et on le refroidit rapidement dans de la glace juste avant de former la couche sur le gradient. On introduit des rRNA de présure de veau dans des tubes distincts comme étalons de sédimentation. On centrifuge les gradients à 30. 000 tours par minute pendant 20 heures à 220C dans un rotor Beckman SW40 et on recueille des fractions de 0, 6 ml pour établir un profil A260, qui est illustré par la Fig. 3 des dessins.
On précipite par l'alcool le rMNA de chaque fraction et on la soumet ensuite à un essai de l'activité de traduction dans un système aux germes de froment préparé disponible dans le commerce (BRL) (voir exemple 3). La fraction hachurée indiquée à la Fig. 3 est enrichie en mRNA de prochymosine de veau et sert à la synthèse du ds-cDNA (exemple 4).
EXEMPLE 3.Traduction sur germes de blé des mRNA et électrophorèse sur gel de polyacrylamide
On traduit les échantillons de RNA dans un système aux germes de froment exempts de cellules additionné de S35-méthionine comme suggéré par le fabricant (Bethesda Research Laboratory, Rockville, Maryland). On soumet les produits de germes de froment à l'électrophorèse sur des plaques de gels de polyacrylamide SDS contenant 5% de gel d'accumulation et 12, 5% de gel de séparation LLaemmli, Nature 227 : 680-685 (197027. On visualise les protéines marquées radio-
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actives par fluorographie au moyen d'une pellicule Kodak XR-5/Bonner et Laskey, Eur. J. Biochem., 46 : 83-88 (19748.
EXEMPLE 4.Préparation de plasmides hybrides
On exécute une synthèse de cDNA en double chaîne et une fixation de queue homopolymère avec une modification très faible du procédé détaillé par McCandliss et al. (Methods of Enzymology, volume 70, 1981). On ajoute environ 10 à 20 résidus dG à l'extrémité 3'de pBR322 linéarisé par PstI. On ajoute le même nombre de résidus dC au ds-cDNA synthétisé. On trie par dimension le ds-cDNA à queue C sur des gradients neutres de saccharose comme décrit par Norgard et al.
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f'J (1980) 7LJBC 255 : 7665-7672 (1980) 7. On dissout le ds-cDNA dans de l'eau distillée et on l'applique en couche sur 12 ml d'un gradient de saccharose de 5% à 12% refroidi contenant du Tris-HCl 50 mM à pH 7, 5 et de l'EDTA 1 mM.
On centrifuge le gradient à 38. 000 tours par minute pendant 17, 5 heures à 5 C dans un rotor Beckman SW40. On traite simultanément un second gradient contenant 10/ug de plasmide pBR322 digéré par l'endonucléase TaqI afin d'obtenir des étalons de dimension. On fractionne les gradients et on les analyse de la manière suivante : a) gradient avec pBR322 digéré par TaqI. On précipite par l'alcool le DNA de chaque fraction de 0, 5 ml et on le remet en suspension dans du
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tampon contenant du Tris-HCl 0, 09 M de pH 8, 5, de l'acide borique 0, 09 M, de l'EDTA 40 mM, 5% de gly- cérol, 0, 025% de cyanol de xylène et 0, 025% de bleu de bromophénol. On soumet chaque échantillon à l'électrophorèse sur une plaque de gel d'acrylamide à 8%.
On photographie les gels colorés par le bromure d'éthidium et on note les bandes contenant du DNA d'une longueur supérieure à 600 paires de bases ; b) gradient avec ds-
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cDNA. On utilise 100/ul de chaque fraction de 1 ml pour le comptage par scintillation. On précipite par l'alcool de DNA de chaque fraction et on utilise pour les stades ultérieurs celles contenant du ds-cDNA d'une longueur supérieure à 600 paires de bases (comme indiqué par l'information apportée sur le gel par le pBR322 digéré par TaqI).
On dilue le DNA de pBR322 à queue oligo d (G) et le ds-cDNA à queue oligo d (C) de dimension calibrée jusqu'à des concentrations équimolaires dans un milieu contenant du Tris-HCl 10 mM à pH 7, 5, du NaCl 100 mM et du Na2EDTA 2, 5 mM. On chauffe les DNA à 700C pendant 10 minutes, puis on les refroidit lentement jusqu'à la température ambiante au cours de la nuit.
EXEMPLE 5.Transformation
On introduit des plasmides recombinants dans E. coli HB101 en substance suivant le procédé de Lederberg et Cohen SJ. Bacti., 119, 1072 (1974L7. On met les transformants en culture sur des plaques normalisées LB à la tétracycline (15/ug/ml) à 370C pendant 24 heures. On repique les colonies sur des plaques LB à l'ampicilline (50/ug/ml) pour déterminer le phénotype. On recueille uniquement les colonies sensibles à l'ampicilline pour la poursuite de l'analyse. On isole à peu près 750 clones.
EXEMPLE 6.Hybridation des colonies
On prépare des transformants pour l'hybridation des colonies suivant une variante du procédé décrit à l'origine par Grunstein et Hogness rPNAS, 72, 3961-3965 (1975. On procède à l'hybridation des filtres combinés au DNA en présence de sulfate de dextrane et de formamide comme suggéré par Wahl et al. /PNAS, 76, 3683-3687 (1979 L7. On soumet les filtres à
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la préhybridation dans 6 volumes de SSC (20X= NaCl 3 M et Na3citrate 0, 3 M), 1 volume de solution de Denhardt (10X-0, 2% BSA, 0, 2% PVP-40 et 0, 2% Ficoll) et 0, 1% de SDS dans un bocal en verre sous agitation modérée à 400C pendant 60 minutes.
On exécute une seconde préhybridation, à raison de 8 ml par filtre, dans 50% de diméthylformamide, 5 volumes SCS, 5 volumes de solution de Denhardt, NaP04 50 mM de pH 5, 6, 1% de glycine et 195/ug/ml d'ADNA de sperme de saumon dénaturé pendant
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2 heures à 45 C sous agitation modérée. On ajoute un témoin de 3P-cDNA (=O, 5xl06 coups par minute et par filtre) à un mélange d'hybridation contenant 50% de formamide, 5 volumes de SSC, 1 volume de solution de Denhardt, du NaP04 de pH 6, 5 20 mM, 10% de sulfate de dextrane, 10/ug/ml de DNA de sperme de saumon dénaturé et on effectue l'incubation avec les filtres à 42"C pendant 18 heures sous agitation modérée.
On prépare ce témoin à partir d'une fraction sur gradient de saccharose fortement enrichie en mRNA de prochymosine (exemple 2), qui est la première fraction supérieure adjacente à celle utilisée pour la synthèse du ds-cDNA. On lave les filtres trois fois pendant 10 minutes dans 2 volumes de SSC, 0, 1% de SDS à température ambiante et deux fois pendant 10 minutes dans 0, 1 volume de SSC, 0, 1% de SDS à 500C. On visualise les taches positives par exposition des filtres essorés sur du film Kodak XR-5 à-80 C pendant une nuit, avec filtre intensifiant.
EXEMPLE 7.Dosage par immunosorption avec liaison enzymatique
On applique le dosage par immunoabsorption avec liaison enzymatique (ELISA) établi par Engvall E. et Pearlman P./Immunochemistry, S (, 871-874 (1971 p pour examiner les 135 clones recombinants qui ont été préalablement identifiés comme positifs suivant le mode
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opératoire de l'exemple 6. Pour la préparation de l'anticorps, on repurifie la chymosine (Sigma) sur une colonne à focalisation isoélectrique et on utilise cette chymosine purifiée comme immunogène pour toutes les injections ultérieures. On immunise initialement des lapins blancs de Nouvelle-Zélande au moyen de 1 mg de chymosine dans de l'adjuvant complet de Freund en injection intramusculaire.
Les injections de rappel contiennent 0, 5 à 0, 75 mg de chymosine dans de l'adjuvant incomplet de Freund et sont faites de même à intervalles de 15 jours pendant 3 mois. On collecte ensuite du sang pour préparer le sérum antichymosine.
Dosage : on disperse des cultures âgées d'une nuit des colonies à examiner dans 5 ml de bouillon L contenant 25 mg de tétracycline par litre. On utilise comme témoins négatifs des cultures de HB101 contenant pBR322. On centrifuge les cultures dans un rotor Sorval SM-24 pendant 5 minutes à 40C à 8000 tours par minute. On lave les cellules une fois avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (PBS), on les transfère dans des tubes d'Eppendorf et on les, remet en suspension dans 300 ml de tampon au carbonate/bicarbonate 20 mM de pH 9, 5, puis on les conserve sur glace. On expose chaque tube à l'effet des ultrasons sur glace pendant 10 à 15 secondes à 200 watts. On sépare les débris par centrifugation et on transfère soigneusement le produit de lyse dans un tube d'Eppendorf propre.
On introduit 200/ul de produit de lyse des cellules dans chaque cuvette d'une plaque de microtitrage (Linbro, Flow Labs). Au moyen de chymosine repurifiée, on établit trois jeux de courbes étalons s'échelonnant de 1 à 0, 1/ug/ml par dilution du simple au double. On ajoute 200/ul de chaque étalon dans les cuvettes appropriées de la plaque de microtitrage qu'on met à incuber jusqu'au lendemain à 4"C.
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On aspire les produits de lyse des cellules et les étalons hors des plaques et on les lave trois fois avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate à 0, 05% de Tween 20.
On ajoute 200/ul d'albumine de sérum de lapin à 3% au contenu de chaque cuvette et on met le tout à incuber à 37 C pendant 1 heure pour bloquer les sites de combinaison encore actifs sur la matière plastique. On lave la plaque à trois reprises avec le système PBSTween et on introduit 200/ul d'anticorps antichymosine (dilué à 1/32) dans chaque cuvette, à l'exception d'une série de cuvettes étalons dans lesquelles on introduit du sérum préimmune dilué à 1/32. On met la plaque à incuber à 37 C pendant 1 heure et on la lave trois fois avec le système PBS-Tween.
On ajoute 200/ul d'anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort (Sigma) dilué à 1/500 dans chaque cuvette et on met le tout à incuber à 37 C. Après trois lavages
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avec le système PBS-Tween, on introduit 200/ul de substrat, à savoir de 2, 2'-azino-diL3-éthylbenzothiazoline-sulfonate7 (ABTS) dans chaque cuvette. On observe la plaque à 405 nm sur un appareil Flow Multi-Scanner 15 minutes après l'addition du substrat. On identifie ainsi deux clones donnant de manière reproductible des résultats positifs. L'un de ces clones, noté pGx1225, contient une insertion d'une longueur suffisante pour coder pour un gène de prochymosine de veau complet.
On caractérise le DNA de ce clone en établissant la carte de restriction et l'analyse de séquence, une culture de ces cellules étant ensuite déposée sous le n NRRL N- 15061 à l'U. S. Department of Agriculture, Northern Régional Research Laboratory, Peoria, Illinois.
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DESCRIPTIVE MEMORY
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FILED IN SUPPORT OF A PATENT INVENTION APPLICATION
FORMED BY
GENEX CORPORATION. for Young bovine chymosin.
Patent applications in the United States of America No. 394,433 of July 1, 1982 and No. 484,539 of April 13, 1983 in favor of C. A. VASLET.
The present invention relates to a cloned bovine gene which specifies the biosynthesis of chymosin in this bovine. It further relates to a plasmid containing a cloned bovine chymosin gene, as well as to a microorganism transformed by means of such a plasmid.
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Chymosyne rennet (EC 3.2.23.4277 is Chymosyne is an abundant proteolytic enzyme in the digestive tract of non-weaned ruminants. Chymosin is secreted as a zymogen, or prochymosin, which is a simple polypeptide chain containing 365 amino acids (37,000 daltons) Prochymosin is converted to chymosin by the specific elimination of 42 N-terminal amino acids during an autocatalytic pH-dependent reaction.
Calf chymosin exists in the form of two isoenzymes (called A and B), which can be split by chromatography on DEAE-cellulose of the crystalline enzyme. Isoenzyme B, which can be catalytically less effective than isoenzyme A, is also the most abundant form in tissue extracts. The amino acid sequence study was carried out for calf chymosin isoenzyme B and partially for isoenzyme A and revealed only a difference from one amino acid to residue 290 (the glycine in isoenzyme B and aspartic acid in isoenzyme A) ± - see Foltmann, B et al., J. Biol.
Chem., 254: 8447-8456 (197617.
Veal chymosin (mixture of isoenzymes) has been used for centuries in the production of cheeses. However, since the Second World War, a certain shortage of veal chymosin has appeared, mainly as a result of a decrease in the consumption of veal. The chymosin extracted from the tissue of the abomasum (abomasum) of the non-weaned calf has been gradually replaced by other enzymes of animal or microbial origin, but none of which has the optimal properties of. the calf enzyme.
As a result of this dearth, there has been much interest in the bacterial cloning of a calf chymosin gene and in the isolation of a microorganism
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producing chymosin. Different researchers have described the extraction of mRNA of chymosin from the calf abomasum tissue ± see H. Uchiyama et al., Agric.
Biol. Chem., 44, 1373-1381 (198017 and the cloning of a double-chain chymosin or cDNA gene (ds-cDNA) in E. coli [see Beppu T. et al., Recombinant DNA Industrial Applications (The Cetus Symposium ) IFS Meeting, p. F-21.5 (L) (1980). Ishimori K. et al./J.
Biochem., 90, 901-904 (1981) have described attempts to clone a prochymosin gene in E. coli and indicate that they have obtained a clone containing an insertion of 1021 base pairs which seems to have sequence homology with the calf chymosin gene (based on hybrid translation observations). This insertion of 1021 base pairs represents approximately 80% of the full length of the chymosin gene, assuming that the complete segment is derived from the chymosin gene. However, the authors do not mention any characterizing data for the gene, for example information relating to the sequence or the restriction map, and the degree to which the cloned fragment comes from the calf chymosin gene is therefore not known.
In addition, these authors do not indicate that they observed protein expression by their bacterial clones.
It therefore remains necessary to isolate a cloned calf chymosin gene of full length and a microbial strain capable of producing calf chymosin.
The present invention relates to an intact intact calf chymosin gene, an intact intact calf prochymosin gene, plasmids containing these genes, and microorganisms transformed with these plasmids. Furthermore, the invention relates to a process for producing calf chymosin, according to which
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a microorganism producing calf chymosin is cultivated on a nutritive medium under conditions suitable for the production of chymosin.
The methods for isolating and cloning a calf chymosin gene as described here are, unless otherwise indicated, carried out according to the usual techniques of molecular biology. Reference may be made, for example, to Ullrich A. et al., Science, 196, 1313 (1977) and to Seeburg P. H. et al., Nature, 270, 486 (1977).
The processes leading to a calf chymosin-producing microorganism can be divided into the following major stages, each of which is described in more detail below: (1) extraction of prochymosin mRNA from the mucosa lining the abomasum of fed calves milk, (2) in vitro synthesis of double chain cDNA using calf prochymosin mRNA as a model, (3) insertion of double chain cDNA into an appropriate cloning vector and transformation of cells using this vector cloning, and (4) selection of microbial clones containing the calf prochymosin gene, based on their ability to express calf prochymosin.
The experimental details relating to these techniques are discussed below in the examples, but it should be noted that these techniques are capable of significant modifications while leading to the desired results within the framework of the invention.
The calf prochymosin mRNA is advantageously collected in the form of polysomal mRNA after grinding of the mucosa lining the abomasum of calves fed with milk. Ribonucleases exist in this tissue in relatively high concentrations, so that the tissue is stored by freezing soon after the death of the animal and that substances are used
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during extraction to attenuate the activity of ribonucleases. In general, the method of C. Vaslet et al., Nature, 285, 674-676 (1980) is applicable to the extraction of polysomal mRNA.
The frozen tissue can be pulverized and homogenized and, after a preliminary centrifugation eliminating the lipids and insoluble cellular debris, the relatively dense polysomal mRNA is advantageously separated by centrifugation on a sucrose gradient. Polyadenylated mRNA can be easily isolated from the polysomal mRNA preparation by elution on an oligo d (T) -cellulose column. See Green M. et al., Arch. Biochem.
Biophys., 172, 74 (1976).
For the isolation of a preparation enriched with mRNA of prochymosin, the eluate from the oligo d (T) -cellulose column can be fractionated by centrifugation on a sucrose gradient, in the conventional manner.
The fractions of mRNA obtained by centrifugation on a sucrose gradient are advantageously subjected to a verification of their mRNA content of prochymosin with a view to determining their translation activity in a cell-free translation system.
A number of cell-free translation systems have been developed, for example wheat germ extract [Martial J. et al., Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA, 74, 1816 (1977S, a mRNA-dependent retriculocyte lysate Pelham H. R. B. et al.,
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Eur. J. Biochem., 67, 247 zo and oocytes of Xenopus laevis Lrsioma A. et al., Methods in Enzymology, volume 70 (1981li. The system with extract of wheat germ is preferred for the search for mRNA of prochymosin. cell-free wheat germ system can be supplemented with a labeled radioactive amino acid, such as S35-methionine, so that the resulting proteins contain a tracer.
The
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prochymosin content of the various wheat germ products is then advantageously observed by gel electrophoresis, then visualization by fluorography and the mRNA fraction, which has been found to contain prochymosin in this system, is used for the synthesis of ds- cDNA.
The synthesis of cDNA is carried out by means of the reverse transcriptase of the avian myeloblastosis virus. This enzyme catalyzes the synthesis of a unique chain of DNA from the deoxynucleoside triphosphates on the model mRNA. See Kacian D. L. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 73, 2191 (1976). The poly r (A) tail of the mRNA makes it possible to use the oligo (dT) (approximately 12 to 18 nucleotides) as a primer for the synthesis of cDNA. The use of a radioactive labeled deoxynucleoside triphosphate facilitates the monitoring of the synthesis reaction. In general, a deoxynucleoside triphosphate containing 32p, for example / -P / dCTP, can be used with advantage for this purpose.
The synthesis of cDNA is generally carried out by incubation of a solution of mRNA, dephynucleoside triphosphates, oligo (dT) and reverse transcriptase. The solution contains
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preferably also small quantities of actinomycin D eference aus e and dithiothreitol promoting synthesis in full length. See Kacian D. L. et al., Supra. After incubation, ethylenediaminetetraacetic acid is added to the solution and the solution is extracted with phenol / chloroform. The aqueous phase is advantageously purified by gel filtration chromatography and the cDNA-mRNA complex of the eluate is precipitated using alcohol.
MRNA can be selectively hydrolyzed in the presence of cDNA using dilute sodium hydroxide at an elevated temperature. Neutralization of the solu-
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alkaline tion and alcohol precipitation give the single chain cDNA copy.
The single chain cDNA copy has been shown to include a 5'-poly (dT) tail and to have a 3'terminal hairpin structure which provides a short segment of double DNA. See Efstratiadis A et al., Cell, 7, 279 (1976). This hairpin structure 3 ′ can serve as a primer for the synthesis of a second chain of DNA. The synthesis of this second chain is carried out substantially under the same conditions as the synthesis of the cDNA copy, the reverse transcriptase being however replaced by the Klenow fragment of DNA polymerase I of E. coli / Klenow H. et al., Eur . J. Biochem., 22, 371 (197l 7. The double cDNA isolated in this way comprises a 3 ′ loop originating from the hairpin structure 3 ′ of the cDNA copy in single chain.
This 3 ′ loop can be detached by digestion with an enzyme, namely 81 nuclease, essentially according to the technique of Ullrich A. et al., Supra. The 81 nuclease digestion product can be extracted with phenol / chloroform and the resulting ds-cDNA can be precipitated from the aqueous phase by addition of alcohol.
For multiplication and selection, the ds-cDNA gene prepared as above is generally inserted into a suitable cloning vehicle which is used to transform suitable host cells. Suitable cloning vectors include various plasmids and phages, but preference is generally given to plasmids. The criteria for choosing a cloning vehicle include its size, its ability to replicate in host cells, the presence of selectable genes and the presence of a site for gene insertion.
As for the dimension, it is
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advantageous that the vector is relatively small for
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allow the insertion of a large gene and not to waste large amounts of nutrients, cells and energy in the production of unnecessary macromolecules. The vector also includes an intact replicon which remains functional after insertion of the gene. This replicon preferably directs the desired mode of replication of the plasmid, i.e. multiple copies or a single copy per cell, or a controllable number of copies per cell. Genes specifying one or more phenotypic properties, preferably resistance to antibiotics, facilitate the selection of transformants.
The insertion site is advantageously a unique restriction site for a restriction endonuclease. A cloning vector satisfying all these criteria is the plasmid pBR322. See Bolivar F. et al., Gene, 2, 95 (1977). This plasmid is small (approximately 2.8 x 106 daltons), carries genes for resistance to ampicillin (amp) and tetracycline (tet) and is subject to loose replication in E. coli. This plasmid also includes a unique restriction site for the PstI endonuclease, which exists in the amp gene. Ds-cDNA can be advantageously inserted into this plasmid using a homopolymer tail fixation technique. See Nelson T. et al., Methods of Enzymology, 68, 41 (1980).
Homopolymer tails, for example of poly-dC, are attached to the 3'-hydroxyl radicals of ds-cDNA by reaction with the appropriate deoxynucleoside triphosphate, for example dCTP, in the presence of a terminal deoxynucleotidyl transferase [Chang LMS and al., J. Biol. Chem., 246, 909 (1971) 7. Poly d (C) tailed ds-cDNAs are preferably sorted by size on neutral sucrose gradients [see Norgard et al., J. Biol.
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Chem., 255, 7665-7672 (198ou7. Double chain cDNAs longer than 600 base pairs are used in later stages.
The plasmid is opened by digestion with the appropriate endonuclease and complementary homopolymer tails, for example of poly-dG, are fixed on the 3'-hydroxyl radicals of the open plasmid, according to an identical homopolymer tail fixing technique, for example the dGTP means. If desired, tail attachment reactions can be monitored by the use of radioactive labeled deoxynucleoside triphosphates, for example
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r / 3H / dCTP and / 3H / dGTP for reactions. As a rule / 3H7dCTP and Z3H e generally, these reactions are executed to form tails of a length of about 10 to 20 nucleotides. The cDNA increased from the tail and the plasmid are collected, for example by extraction in phenol, then precipitation by alcohol.
The two DNA species with "tail" are purified by incubation in a buffered solution of equimolar concentrations of the two species so as to give a recombinant plasmid containing the bovine prochymosin gene.
A suitable ampS, tetS strain of E. coli can be transformed using the recombinant plasmid essentially according to the technique of Lederberg, J.
Bacteriology, 119, 1072 (1974). Transformants are normally grown on ordinary L broth containing tetracycline. Colony samples growing on the medium containing tetracycline are then transferred to a second medium containing ampicillin. Because the plasmid pBR322 provides cells with resistance to tetracycline, colonies growing on the medium containing tetracycline must contain the plasmid. On the other hand, resistance to
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the ampicillin of the plasmid pBR322 is destroyed by insertion of the gene, so that only the tetR, ampS colonies are retained for subsequent analysis.
Typically, several hundred to a few thousand potential prochymosin clones are obtained according to these procedures. To identify a smaller group of colonies that contain the prochymosin gene, radioactive labeled DNA can be used with advantage as an indicator. See Grunstein M. et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 72, 3961-3965 (1975). Such an indicator DNA can be advantageously prepared from a highly enriched population of prochymosin mRNA by means of reverse transcriptase and by incorporation of a labeled radioactive nucleotide. In general, the method of Grunstein et al. (supra) as modified by Wahl et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 3683-3687 (1979) is a preferred method for analyzing colony hybridization.
Although colony hybridization generally reduces the number of potential prochymosin clones, a considerable number of these clones usually continue to exist. One method which has been successfully applied to more finely select these clones is the enzyme linked immunosorption assay (ELISA). This assay makes it possible to detect chymosin in the clones where the expression of the protein takes place. The operation consists in applying standards of chymosin and cell lysis products to the inside of the cuvettes of plastic microtiter plates and in carrying out an immunological reaction between the chymosin which may be present and an antichymosin antibody.
The immobilized conjugate is then reacted with a second enzyme-carrying antibody which
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is specific for the first antibody. After separation of the non-combined carrier antibody, a chromogenic substrate is introduced to determine the combined enzyme present, which constitutes a measure of the concentration of chymosin in the initial cell lysis product. This technique has proved to be very useful for isolating a small number of clones from a large population of clones identified as positive during the analysis of colony hybridization.
The few clones identified by the enzyme linked immunoassay system are further advantageously characterized by establishing the restriction map and the amino acid sequence. One clone, called pGx 1225, gave marked and reproducible positive results on the ELISA examination, and was also confirmed as containing the prochymosin gene by sequence analysis and establishment of the restriction map. The restriction map for the insertion of the prochymosin gene from pGx 1225 constitutes FIG. 1 of the drawings. The insertion consists of 1289 base pairs. The zymogen is specified by the region from base pair 43 to base pair 1137 and the mature chymosin gene is specified from base pair 169 to base pair 1137.
The nucleotide sequence of this inserted prochymosin gene was determined according to the method of Sanger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977) and this nucleotide sequence constitutes FIG. 2 subdivided in Fig. 2A, Fig. 2B, Fig. 2C and Fig. 2D drawings. Fig. 2 shows the 5'-hua3 'chain of the non-coding and coding regions, as well as the amino acid sequence specified by the gene.
For the purposes of the invention and for the description of FIG. 2, the abbreviations have the usual meanings
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following tiles:
A = deoxyadenyl
T = thymidyle
G = deoxyguanyl C = deoxycytosyl
GLY = glycine
ALA = alanine
VAL = valine
LEU = leucine
ILE = isoleucine
SER = serine
THR = threonine
PHE = phenylalanine
TYR = tyrosine
TRP = tryptophan
CYS = cysteine
MET = methionine
ASP = aspatic acid
GLU = glutamic acid
LYS = lysine
ARG arginine
HIS = histidine
PRO = proline
GLN = glutamine
ASN = asparagine It should be noted that due to the degeneracy of the genetic code, the nucleotide sequence of the gene can vary significantly.
For example, some or all of the gene could be chemically synthesized to produce DNA with a different nucleotide sequence than that shown in Fig. 2, but the amino acid sequence would be retained provided that the appropriate codonamino acid assignments are respected. Although the nucleotide sequence of the prochymosin gene from
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calf and the amino acid sequence of the protein have been established, the gene according to the invention is not limited to a particular nucleotide sequence and can undergo all the variations authorized by the genetic code.
A culture of E. coli cells, pGx 1225, containing the inserted prochymosin gene described above has been deposited under number NRRL B-15061 at the U.S. Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, U.S.A.
The invention has been described with reference to the use of E. coli as a host bacterium for the recombinant DNA containing the calf prochymosin gene, but it is obvious to the specialist in molecular biology that other Gram-negative bacteria, for example Pseudomonas, and Gram-positive bacteria, for example Bacillus, in addition to higher single-celled organisms, for example yeasts and fungi, can be used for cloning and / or expression of the prochymosin gene or various parts of it -this.
The invention is further illustrated by the following nonlimiting examples.
EXAMPLE 1 Preparation of the polysomal mRNA
The abomasum of milk-fed calves is collected at the local slaughterhouse (Henry Stapf, Inc., Baltimore, Maryland) within 30 minutes after the animals have been killed. The inner lining is excised and frozen in liquid nitrogen to preserve it. The polysomal mRNA is prepared according to a variant of the method described by Vaslet et al.
/ '(Nature 285: 6764-676 (1980L7. 50 g of frozen tissue pulverized are homogenized in 100 ml of buffer containing 0.25 M KCl, 0.025 M MgCl 2, 0.05 M Tris-HCl
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pH 7, 4, 0, 5% of NP40, 200 / ug / ml of cyclohexamide and
250 / ug / ml heparin. The homogenization product is centrifuged twice at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to clarify a heavy lipid layer and to separate the cellular debris. The polysomes are collected in the form of a pellet by centrifuging the supernatant liquid at low speed in a layer of 2.5 ml of 52% sucrose in homogenization buffer free of NP40, of cyclohexamide and of heparin at 28. 000 revolutions per minute for 8 hours at 40C in a Beckman SW28 rotor.
The polysome pellet is resuspended in a medium containing 50 mM Tris-HCl pH9, 1 mM EDTA, 150 mM NaOAc and 1% SDS containing proteinase (250 / ug / ml). After 60 minutes of incubation at 37 ° C., the preparation is extracted twice with phenol / chloroform and the RNA is precipitated with alcohol between 0 and -80 ° C. for 1 hour. The RNA is collected in the form of a pellet and washed three times with 3M sodium acetate to dissolve the small RNAs, the mucin and the heparin. The final pellet of polysomal RNA is resuspended in deionized water and stored at -80 C.
Poly (A) + mRNa is prepared by hybridization of the polysomal RNA with an oligo d (T) -cellulose column. The column is brought to equilibrium with combination buffer containing 10 mM Tris-HCl of pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.1% SDS and 400 mM NaCl, and the the entire polysomal RNA preparation cyclically five times on the column. Uncombined RNA is eluted with several column volumes of combination buffer. The elution buffer contains 10 mM Tris-HCl of pH 7.6, 1 mM EDTA and 0.1% SDS and is used to elute the combined poly (A) + mRNA from the column. Poly (A) + mRNA is precipitated
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by alcohol and it is stored at -80 C.
EXAMPLE 2 Fractionation of poly (A) + mRNA on a sucrose gradient
The poly (A) + mRNA is deposited in a layer on a continuous sucrose density gradient of 5% to 20% prepared in SDS buffer containing 0.5% SDS,
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0.1 M NaCl, 0.01 M Tris pH 7.5, and 0.001 M EDTA. RNA is heated to 80 C for 2 minutes and quickly cooled in ice just before forming the layer on the gradient. Calf rennet rRNAs are introduced into separate tubes as sedimentation standards. The gradients are centrifuged at 30,000 rpm for 20 hours at 220C in a Beckman SW40 rotor and 0.6 ml fractions are collected to establish an A260 profile, which is illustrated in FIG. 3 of the drawings.
The rMNA of each fraction is precipitated by alcohol and then subjected to a test for translation activity in a commercially available wheat germ system (BRL) (see Example 3). The hatched fraction shown in Fig. 3 is enriched in mRNA of calf prochymosin and is used for the synthesis of ds-cDNA (Example 4).
EXAMPLE 3 Translation on Wheat Germs of mRNA and Electrophoresis on Polyacrylamide Gel
The RNA samples are translated into a cell-free wheat germ system supplemented with S35-methionine as suggested by the manufacturer (Bethesda Research Laboratory, Rockville, Maryland). The wheat germ products are subjected to electrophoresis on SDS polyacrylamide gel plates containing 5% accumulation gel and 12.5% separation gel LLaemmli, Nature 227: 680-685 (197027. We visualize radio-labeled proteins
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active by fluorography using Kodak XR-5 / Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem., 46: 83-88 (19748.
EXAMPLE 4 Preparation of Hybrid Plasmids
A double chain cDNA synthesis and a homopolymer tail binding are carried out with very little modification of the process detailed by McCandliss et al. (Methods of Enzymology, volume 70, 1981). About 10 to 20 dG residues are added to the 3 ′ end of pBR322 linearized by PstI. The same number of dC residues is added to the synthesized ds-cDNA. The C-tailed ds-cDNA is sorted by size on neutral sucrose gradients as described by Norgard et al.
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f'J (1980) 7LJBC 255: 7665-7672 (1980) 7. Dissolve ds-cDNA in distilled water and apply it in a layer on 12 ml of a 5% to 12% sucrose gradient % cooled containing 50 mM Tris-HCl at pH 7.5, and 1 mM EDTA.
The gradient is centrifuged at 38,000 rpm for 17.5 hours at 5 ° C in a Beckman SW40 rotor. A second gradient containing 10 μg of plasmid pBR322 digested with the endonuclease TaqI is simultaneously treated in order to obtain size standards. The gradients are fractionated and analyzed as follows: a) gradient with pBR322 digested with TaqI. The DNA of each 0.5 ml fraction is precipitated by alcohol and resuspended in
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buffer containing 0.09 M Tris-HCl pH 8.5, 0.09 M boric acid, 40 mM EDTA, 5% glycerol, 0.025% xylene cyanol and 0 0.025% bromophenol blue. Each sample is subjected to electrophoresis on a plate of 8% acrylamide gel.
The gels stained with ethidium bromide are photographed and the bands containing DNA longer than 600 base pairs are noted; b) gradient with ds-
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cDNA. 100 µl of each 1 ml fraction is used for scintillation counting. The DNA is precipitated with alcohol from each fraction and those containing ds-cDNA with a length greater than 600 base pairs are used for the subsequent stages (as indicated by the information provided on the gel by the pBR322 digested with TaqI).
The DNA of pBR322 with oligo d (G) tail and the ds-cDNA with oligo d (C) of calibrated size are diluted to equimolar concentrations in a medium containing 10 mM Tris-HCl at pH 7.5, 100 mM NaCl and 2.5 mM Na2EDTA. The DNAs are heated at 700C for 10 minutes, then cooled slowly to room temperature overnight.
EXAMPLE 5 Transformation
Recombinant plasmids are introduced into E. coli HB101 in substance according to the method of Lederberg and Cohen SJ. Bacti., 119, 1072 (1974L7. The transformants are cultured on standard LB plates with tetracycline (15 μg / ml) at 370C for 24 hours. The colonies are subcultured on LB plates with ampicillin (50 / ug / ml) to determine the phenotype. Only colonies sensitive to ampicillin are collected for further analysis. Approximately 750 clones are isolated.
EXAMPLE 6 Hybridization of the Colonies
Transformants are prepared for the hybridization of the colonies according to a variant of the method originally described by Grunstein and Hogness rPNAS, 72, 3961-3965 (1975. The hybridization filters combined with DNA are carried out in the presence of sulfate of dextran and formamide as suggested by Wahl et al. / PNAS, 76, 3683-3687 (1979 L7. Filters are subjected to
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prehybridization in 6 volumes of SSC (20X = 3M NaCl and 0.3 M Na3citrate), 1 volume of Denhardt solution (10X-0.2% BSA, 0.2% PVP-40 and 0.2% Ficoll) and 0.1% SDS in a glass jar with moderate stirring at 400C for 60 minutes.
A second prehybridization is carried out, at the rate of 8 ml per filter, in 50% of dimethylformamide, 5 volumes of SCS, 5 volumes of Denhardt solution, 50 mM NaPO 4 of pH 5, 6, 1% of glycine and 195 μg / ml of DNA sperm from denatured salmon sperm during
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2 hours at 45 C with moderate stirring. A 3P-cDNA control (= 0.5 × 10 6 counts per minute and per filter) is added to a hybridization mixture containing 50% of formamide, 5 volumes of SSC, 1 volume of Denhardt solution, NaPO 4 of pH 6, 20 mM, 10% dextran sulfate, 10 µg / ml denatured salmon sperm DNA and the incubation is carried out with the filters at 42 ° C. for 18 hours with moderate agitation.
This control is prepared from a fraction on a sucrose gradient highly enriched in mRNA of prochymosin (Example 2), which is the first upper fraction adjacent to that used for the synthesis of ds-cDNA. The filters are washed three times for 10 minutes in 2 volumes of SSC, 0.1% of SDS at room temperature and twice for 10 minutes in 0.1 volumes of SSC, 0.1% of SDS at 500C. The positive spots are visualized by exposure of the filters wrung on Kodak XR-5 film at -80 ° C. overnight, with an intensifying filter.
EXAMPLE 7 Immunosorption Assay with Enzyme Binding
The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) established by Engvall E. and Pearlman P. / Immunochemistry, S (, 871-874 (1971 p) is applied to examine the 135 recombinant clones which have been previously identified as positive according to the mode.
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Example 6 for the preparation of the antibody, chymosin (Sigma) is repurified on an isoelectric focusing column and this purified chymosin is used as immunogen for all subsequent injections. New Zealand white rabbits are initially immunized with 1 mg of chymosin in complete Freund's adjuvant by intramuscular injection.
Booster injections contain 0.5 to 0.75 mg of chymosin in incomplete Freund's adjuvant and are given the same at 15-day intervals for 3 months. Blood is then collected to prepare the antichymosin serum.
Determination: colonies aged for one night are dispersed from the colonies to be examined in 5 ml of broth L containing 25 mg of tetracycline per liter. HB101 cultures containing pBR322 are used as negative controls. The cultures are centrifuged in a Sorval SM-24 rotor for 5 minutes at 40C at 8000 rpm. The cells are washed once with phosphate buffered saline (PBS), transferred to Eppendorf tubes and resuspended in 300 ml of 20 mM carbonate / bicarbonate buffer pH 9, 5, then store them on ice. Each tube is exposed to the effect of ultrasound on ice for 10 to 15 seconds at 200 watts. The debris is separated by centrifugation and the lysis product is carefully transferred to a clean Eppendorf tube.
200 μl of cell lysis product are introduced into each cuvette of a microtiter plate (Linbro, Flow Labs). Using repurified chymosin, three sets of standard curves are established ranging from 1 to 0, 1 / ug / ml by dilution of the simple to double. 200 µl of each standard is added to the appropriate cuvettes on the microtiter plate which is incubated overnight at 4 "C.
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The lysis products from the cells and the standards are aspirated from the plates and washed three times with physiological saline solution buffered with 0.05% Tween 20.
200 µl of 3% rabbit serum albumin is added to the contents of each cuvette and incubated at 37 ° C for 1 hour to block the combination sites still active on the plastic. The plate is washed three times with the PBSTween system and 200 μl of antichymosin antibody (diluted 1/32) are introduced into each cuvette, except for a series of standard cuvettes into which pre-immune serum is introduced. diluted to 1/32. The plate is incubated at 37 ° C. for 1 hour and washed three times with the PBS-Tween system.
200 µl of goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Sigma) diluted 1/500 is added to each bowl and the whole is incubated at 37 C. After three washes
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with the PBS-Tween system, 200 μl of substrate, namely 2, 2′-azino-diL3-ethylbenzothiazoline-sulfonate7 (ABTS) are introduced into each cuvette. The plate is observed at 405 nm on a Flow Multi-Scanner device 15 minutes after the addition of the substrate. Two clones are thus identified giving reproducible positive results. One of these clones, denoted pGx1225, contains an insertion of sufficient length to code for a complete calf prochymosin gene.
The DNA of this clone is characterized by establishing the restriction map and the sequence analysis, a culture of these cells then being deposited under the number NRRL N-15061 at U. S. Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois.