PROCEDE DE PREPARATION DE LA THYMOSINE-ALPHA OU 1)'UN DESDERIVES DE CE COMPOSE
La présente invention concerne un procédé de préparation de thymosine-alpha 1 et de certains dérivés particuliers de ce composé à partir de fragments peptidiques.
La thymosine-alpha 1 est un polypeptide acide particulier de la glande du thymus, qui présente la séquence d'amino-acides suivante :
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-
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et où l'amino-acide n[deg.] 1, la sérine se trouve acétylée.
Avec la thymosine-alpha 1, on a découvert d'intéressantes
propriétés biologiques qui permettent d'attendre son application ou la possibilité de son utilisation dans la lutte contre le cancer et dans le cadre de la régulation du système de défense immunologique (Cancer Treatment Reports, vol. 62, n[deg.] 11 (1978). C'est ainsi par exemple que l'on a trouvé
que l'on pouvait amoindrir par traitement avec la thymosinealpha 1 l'immuno-suppression qui résulte d'une irrad.iation au cours ou dans le cadre de la thérapie du cancer.
Il est par conséquent intéressant de disposer d'un procédé pour la préparation synthétique de la thymosinealpha 1.
La synthèse totale de la thymosine-alpha 1 est déjà connue à partir du J. A. C. S., 101, 1, 253-254 (1979).
Selon ce procédé, on effectue d'abord, conformément aux procédés habituels, la synthèse de plusieurs fragments peptidiques divers qui sont condensés par la suite les uns avec les autres selon diverses méthodes, mais surtout par la méthode utilisant un azide. Le procédé connu présente toutefois l'inconvénient d'être très coûteux et de ne permettre de fournir que de très faibles rendements.
La présente invention a pour objet de créer un procédé pour la synthèse de la thymosine-alpha 1, qui ne présente pas ces inconvénients et qui conduise, par une réaction plus simple, au produit désiré avec un bon rendement. Le procédé doit en outre être aussi approprié, sans modifications essentielles, pour la préparation de dérivés biologiquement intéressants ainsi que de composés analogues de la thymosine-alpha 1.
On y parvient conformément à la présente invention, par un procédé pour la préparation de thymosine-alpha 1 ou de l'un de ses dérivés, selon lequel l'un au moins des amino-acides 10, 15, 21, 25 et 28 se trouve à l'état d'amide ou d'alcoylamide et/ou le radical acétyle est remplacé par un autre radical acétyle, par la préparation d'une série de fragments peptidiques portant des groupes protecteurs, la condensation de ces fragments peptidiques et ensuite, la scission des groupes protecteurs, ce procédé étant caractérisé en ce que .
<EMI ID=2.1> trémité N-terminale n'est pas protégée et dont l'extrémité C-terminale est estérifiée ou fixée sur un support, en au moins 1,5 fois la quantité stoechiométrique par défaut avec
le fragment peptidique voisin dont l'extrémité C-terminale n'est pas protégée et dont l'extrémité N-terminale est protégée par le radical Ddz, dans un milieu solvant organique anhydre avec du dicyclohexylcarbodiimide et du 1-hydroxybenzotriazol (DCC/1-HOBt) ; b) on ajoute de l'acide trifluoro-acétique avec un léger excès stoechiométrique, pour scinder le groupe Ddz du fragment condensé ; c) on neutralise l'excès de l'acide avec une base organique et ;
d) on condense le fragment C-terminal allongé dont l'extrémité N-terminale est non protégée ainsi obtenu à chaque fois avec le fragment suivant protégé par un groupe Ddz sur le N-términal en répétant les étapes a), b) et c), jusqu'à ce que la chaîne peptidique soit complète et finalement, on sépare les groupes protecteurs subsistant de la façon habituelle, ce en quoi, les groupes protecteurs latéraux utilisés pour les groupes Asp et Glu sont des groupes ester t.-butylique, pour les groupes Ser et Thr, des groupes tert.-butyliques, pour le groupe Lys, des groupes benzyloxy- <EMI ID=3.1>
et que, le cas échéant, on effectue l'échange du groupe acétyle sur le N-terminal par un autre groupe acyle.
Les abréviations qui sont présentement utilisées correspondent aux recommandations IUPAG-IUB (J. Biol. Chem.
<EMI ID=4.1>
3,5-diméthoxybenzyloxy-carbonyle, Z signifie benzyloxycarbonyle, Ac signifie acétyle, OBut, signifie ester tert.butylique et Mbh signifie 4,4'-diméthyloxybenzhydryle. A titre de groupe alcoyle, on envisage des radicaux à chaîne
droite ou ramifiée, avec 1 à 6, de préférence 1 à 4 atomes de carbone. En tant que support, on utilise les matériaux de support qui sont connus du spécialiste de la question et qui sont appropriés peur l'immobilisation des peptides et des protéines.
Il est essentiel, dans le procédé selon la présente invention, que les fragments qui représentent la portion N-terminale de la molécule de thymosine-alpha 1, soient utilisées en au moins 1,5 fois par excès la quantité stoechiométriaue, de préférence de 2 à 2,5 fois. Etant donné que, lors de la condensation de deux fragments, il se forme un nouveau fragment dont le C-terminal est plus grand et dont le N-terminal porte un groupe protecteur Ddz et que ce
dernier peut être éliminé déjà pour l'étape de condensation suivante avec une très faible quantité d'acide, il est de même nécessaire de n'avoir pour la neutralisation qu'une faible quantité de base. De la sorte, les multiples étapes individuelles intervenant habituellement dans la mise en oeuvre des procédés connus jusqu'à présent , et les reprises intermédiaires se trouvent simplifiées, si bien que pour isoler le.produit de la réaction en question, on effectue une séparation chromatographique unique du mélange réactionnel dans une colonne. On utilise de préférence le produit connu sous la désignation de "Sephadex LH20" dans un solvant, le méthanol et le 2,2,2-trifluoroéthanol. Dans le cas d'une condensation de fragment fixé sur un support, il n'est pas non plus nécessaire d'isoler le produit intermédiaire de la chromatographie indiqué ci-dessus.
. Etanti donné que, selon la présente invention, on travaille dans un milieu organique anhydre, les étapes particulières de séchage ou d'élimination de l'eau sont superflues. De même, la purification appropriée effectuée par chromatographie du produit final qui est complètement protégé peut s'effectuer dans le même solvant organique anhydre.
En ce qui concerne l'étape a) on utilise de préférence du diméthylformamide, à titre de solvant. D'autres solvants qui sont appropriés sont la N-méthylpyrrolidone et des mélanges de ces deux corps indiqués ainsi que le diméthylacétamide.
On préfère à l'étape b), à titre de solvant pour l'acide, du diméthylformamide. D'autres solvants qui conviennent sont le chloroforme, le tétrahydrofuranne et le dioxanne.
On préfère en particulier utiliser une solution
de 1 à environ 5 X d'acide trifluoro-acétique dans le di-
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acétique réside dans le fait qu'il peut être utilisé également dans le cadre de l'élimination finale des groupes esters/ter.-butyliques et 4,4'-diméthoxybenzhydryle protec-
teurs, de sorte que seule sa concentration augmente.
Pour la neutralisation, il est possible d'utiliser fondamentalement toutes les amines organiques tertiaires fixées sur un support ou solubles dans des solvants organiques. On préfère particulièrement la N-méthylmorpholine, du fait qu'elle supprime la racémisation et de la sorte que l'on améliore la pureté optique du produit.
<EMI ID=6.1>
façon appropriée en appliquant un vide et l'on purifie le résidu par chromatographie, par exemple sur un matériau du genre tamis moléculaire, tel que le dextrane réticulé, le polystyrène ou composés similaires. La chromatographie s'effectue dans un solvant anhydre approprié tel qu'un alcanol, un hydrocarbure halogéné, etc. De préférence, on utilise le méthanol. Dans le cas des fragments condensés fixés sur des supports, on lave simplement le support polymère avec du diméthylformamide et du dichlorométhane.
Les fragments peptidiques que l'on utilise en tant que produits de départ pour le procédé selon la présente invention peuvent se préparer selon les procédés connus de la synthèse des peptides. De préférence, leur synthèse a lieu aussi en utilisant des groupes protecteurs Ddz. De la sorte, on élabore les anhydrides mixtes des amino-acides protégés avec Ddz avec le mélange de chlorure d'isobutyloxycarbonyle et de N-méthylmorpholine par allongement séquentiel par étape sur le groupe N-terminal.
On préfère utiliser particulièrement 1,5 à 2 équivalents des amino�acides Ddz, de N-méthylmorpholine et de chlorure de sec.-butyloxycarbonyle, dissous dans le dichlorométhane, et mélangé à environ - 10 à - 20[deg.]C, avec une solution que l'on obtient par la réaction d'un équivalent d'ester d'amino -acide avec Ddz et de tert.-butyle ou d'ester tert.-butylique et de Ddz-oligopeptide dans le dichlorométhane, qui contient 1 à 5 % d'acide trifluoroacétique et qu'on tient pendant environ un quart d'heure
à une demi-heure à la température ambiante et ensuite, on neutralise avec de la N-méthylmorpholine. Les solutions mélangées sont abandonnées pour réagir à la température ambiante pendant environ 30 minutes à deux heures. On évapore sous vide jusqu'à ce que le mélange réactionnel soit sec, et l'on chromatographie sur un matériau approprié pour la chromatographie, tel par exemple que du dextrane réticulé comme le "Sephadex LH20" dans un solvant comme le méthanol pour le purifier. Après avoir chassé ce solvant, on peut passer immédiatement à l'étape suivante de la condensation de la façon qui a été décrite, jusqu'à ce que le fragment peptidique soit achevé. Dans le cas d'une condensation de fragment fixé sur un support, on lave le support polymère après la réaction terminée avec du diméthylformamide et du dichlorométhane.
L'élaboration de la thymosine-alpha 1 à partir des fragments qui ont été ainsi obtenus sera encore mieux élucidée à l'aide du dessin annexé. On reconnaît que l'on prépare cinq fragments à partir desquels se composent les amino-acides 1 à 6 (fragment I), 7 à 12 (fragment II), 13 à 19 (fragment III) , 20 à 24 (fragment IV) , ainsi que de
25 à 28 (fragment V) . Le fragment V, en tant que fragment C-terminal est transformé conformément à la présente invention avec le fragment IV de sorte que l'on obtient le fragment VI C-terminal allongé. De la même façon, on transforme de nouveau le fragment VI avec le fragment III, de sorte que l'on obtient le fragment VII en tant que nouveau fragment C-terminal.
Enfin, on transforme ce dernier avec le fragment II avec formation du fragment VIII et celui-ci finalement avec le fragment I pour former la chaîne peptidique IX terminée, de laquelle il reste encore seulement
à éliminer des groupes protecteurs. Si, le cas échéant, on doit échanger le groupe acétyle contre un autre groupe acyle, ceci peut se faire lors de l'élaboration du fragment I. Les
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d'ester benzylique, le cas échéant pour le fragment V sur un support, les fragments II, III et IV sous la forme de
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terminaux de l'ester s'effectue de façon appropriée par saponification alcaline, dans le cas de l'ester méthylique, dans du dioxanne aqueux, dans le cas de l'ester benzylique, dans un mélange de tétrahydrofuranne et de méthanol.
La réaction de condensation proprement dite s'effectue de préférence dans le diméthylformamide en tant que solvant. Les rendements au cours des phases ou étapes particulières de la condensation sont excellents et atteignent
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vant approprié est un mélange de propanol et d'acide acétique cristallisable ainsi que le 2,2,2-trifluoroéthanol. Comme catalyseur, on utilise de façon appropriée du palladium sur charbon, de la mousse de platine ou de palladium.
Ainsi qu'il a été déjà indiqué, le procédé selon la présente invention permet aussi la synthèse de dérivés particuliers ou définis de la thymosine-alpha 1 et ceux en particuliers pour lesquels les andno-acides 10 (Glu), 15
(Asp), 21 (Glu), 25 (Glu) et 28 (Asn) présentent, à la place d'un groupe carboxyle, un groupe amide ou alcoylamide.
Dans ce cas, lors de l'étape correspondante de la synthèse
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trouvent présents dans la thymosine-alpha 1, naturelle, les dérivés déjà transformés de ces amino-acides en amide ou alcoylamide. Pour l'Asn, on utilise le diamide correspondant, puisque l'Asn représente déjà un amide.
Les dérivés qui ont été cités présentent un intérêt thérapeutique particulier et présentent, vis-à-vis de
la thymosine-alpha 1 une efficacité différente. En tant que composés nouveaux ces analogues constituent également l'un des objets de la présente invention.
De même, le groupe acyle N-terminal peut être utilisé pour la modification de l'effet ou de l'ampleur de l'action par échange contre un autre groupe acyle. On introduit par exemple de préférence au lieu du radical acétyle, un radical acylglycine.
L'exemple qui va suivre expliquera mieux la présente invention en regard du dessin annexé. EXEMPLE
Préparation de la thymosine-alpha 1 :
<EMI ID=11.1>
III (13 à 19), IV (20 à 24) et V (25 à 28) en solution, en utilisant des excès d'anhydrides mixtes d'acides aminés Ddz avec le mélange de chlorure d'isobutyloxycarbonyle et de Nméthylmorpholine, par la portion N-terminale par allongement séquentiel par étapes, avec protections de tous côtés. Après cela, les.fragments I et V se trouvent sous forme d'ester benzylique, les fragments II, III et IV sont sous forme d'ester méthylique avec des rendements pour toutes les étapes, calculés ainsi qu'il suit :
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Après la saponification alcaline dans du dioxanne aqueux, on condense le fragment IV dans du diméthylformamide avec le V, après quoi, à partir de ce dernier, on scinde le <EMI ID=13.1>
On obtient ainsi le fragment VI.
Après une saponification alcaline dans une solution aqueuse de tétrahydrofuranne et de méthanol, on effectue la liaison du fragment III avec le fragment IV dans les conditions qui ont été précédemment décrites, dans le diméthylformamide, à la température ambiante pendant 66 heures.
On obtient le fragment VII avec un rendement de 60 X.
Au cours de l'étape suivante, on effectue la liai-
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une saponification dans un mélange 8 : 2 de dioxanne et d'eau (v/v). On effectue la condensation pendant 18 heures à 0[deg.]C et pendant 10 heures à 20[deg.]C. Rendement : 67 X en fragment VIII.
Avant la dernière condensation, on élimine par
hydrogénolyse dans un mélange de propanol et d'acide acétique cristallisable le groupe ester benzylique du fragment I
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séparation préalable de Ddz avec VIII dans le mélange de Nméthylpyrrolidone/diméthylformamide (2 : 1) (v/v) en 24 heures. Rendement en produit IX : 52 %.
On purifie IX dans le 2,2,2-trifluoroéthanol sur "Sephadex LH20" par chromatographie. Analyse des aminoacides (valeurs calculées entre parenthèses : HCl 6 N,
110[deg.]C, 24 heures) : Asp, 4,11 (4) ; Thr, 2,64 (3) ; Ser, 2,38 (3) ; Glu, 6,80 (6) ; Lys, 4,59 (4) ; Ile, 1,13 (1) ; Leu, 1, 23 (1) ; Ala, 2,51 (3) ; Val, 2,41 (3) .
Au cours des trois étapes terminales de la réaction, IX est débarrassé ou libéré de tous ses groupes protecteurs. Par hydrogénolyse dans du 2,2,2-trifluoroéthanol, avec du Pd sur C, il est possible d'éliminer tous les groupes protecteurs benzyloxycarbonyle et l'ester benzylique <EMI ID=16.1>
dant 30 minutes d'un mélange d'acide trifluoroacétique et
de dichlorométhane (1 : 1 ) , v/v en présence de 10 vol. X d'anisol, il est possible d'éliminer les groupes esters tert.-butyliques. Après l'élimination des constituants volatils sous vide, à la température ambiante, on fait réagir le résidu de polypeptide et d'anisol avec de l'acide trifluoro-acétique pur, pour éliminer les groupes protecteurs 4,4'diméthoxybenzhydryle et les radicaux subsistants ter.butyliques, (120 minutes à 20[deg.]C environ). Après la précipitation et le lavage avec de l'éther, on purifie la thymosinealpha 1 synthétique par chromatographie. Pour ce faire, on effectue la chromatographie sur colonne (0,6 x 240 cm; qui
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sur trifluoroéthanol) pour déterminer d'abord le volume de rétention pour la chaîne B de l'insuline (poids moléculaire
<EMI ID=18.1>
synthétique. Elle sort de la colonne avec le volume d'élution correspondant à son poids moléculaire (3 107). (Ren-
dement 90 X calculé sur IX). Analyse des amino-acides
(valeurs calculées entre parenthèses HCl 6N/110[deg.]C/24, 48,
96 heures) : Asp, 4,11 (4) ; Thr, 2,86 (3) ; Ser, 2,70 (3) ; Glu, 5,89 (6) ; Lys, 3,98 (4) ; Ile, 0,97 (1) ; Leu, 1,00
(1) ; Ala, 3,05 (3) ; Val, 2,97 (3). Chromatogramme sur couche mince : (gel de silice Merck 60 F-254 ; 0,25 mm) ;
Rf = 0, 16 (mélange de n-butanol/pyridine/acide acétique cristallisable/eau 5 : 5 : 1 : 4 (v/v) produit unitaire.
<EMI ID=19.1>
-201,7[deg.] (435 nm) , -242, 5[deg.] (408 nm) ; -338,5[deg.] (365 nm) ;
-587,0[deg.] (313 nm) ; c = 0,083 dans l'eau.
La thymosine-alpha 1 synthétique s'avère être biologiquement active dans l'essai sur la stimulation lymphocytaire, dans l'essai E de Rosetten et dans l'essai de Mitogen.
PROCESS FOR THE PREPARATION OF THYMOSINE-ALPHA OR 1) 'A DESDERIVES OF THIS COMPOUND
The present invention relates to a process for the preparation of thymosin-alpha 1 and of certain specific derivatives of this compound from peptide fragments.
Thymosin-alpha 1 is a particular acidic polypeptide of the thymus gland, which has the following amino acid sequence:
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-
<EMI ID = 1.1>
and where the amino acid n [deg.] 1, the serine is acetylated.
With thymosin-alpha 1, we discovered some interesting
biological properties which allow to await its application or the possibility of its use in the fight against cancer and within the framework of the regulation of the immunological defense system (Cancer Treatment Reports, vol. 62, n [deg.] 11 (1978 This is how, for example, we found
that could be reduced by treatment with thymosinealpha 1 immunosuppression that results from irradiation during or as part of cancer therapy.
It is therefore interesting to have a process for the synthetic preparation of thymosinealpha 1.
The total synthesis of thymosin-alpha 1 is already known from J. A. C. S., 101, 1, 253-254 (1979).
According to this method, first of all, according to the usual methods, the synthesis of several diverse peptide fragments which are subsequently condensed with each other according to various methods, but especially by the method using an azide. The known method however has the disadvantage of being very expensive and of making it possible to provide only very low yields.
The object of the present invention is to create a process for the synthesis of thymosin-alpha 1, which does not have these drawbacks and which leads, by a simpler reaction, to the desired product with good yield. The process must furthermore also be suitable, without essential modifications, for the preparation of biologically interesting derivatives as well as of analogous compounds of thymosin-alpha 1.
This is achieved in accordance with the present invention, by a process for the preparation of thymosin-alpha 1 or one of its derivatives, according to which at least one of the amino acids 10, 15, 21, 25 and 28 is found in the state of amide or of alkylamide and / or the acetyl radical is replaced by another acetyl radical, by the preparation of a series of peptide fragments carrying protective groups, the condensation of these peptide fragments and then, the splitting of protecting groups, this process being characterized in that.
<EMI ID = 2.1> N-terminal end is not protected and whose C-terminal end is esterified or fixed on a support, in at least 1.5 times the default stoichiometric quantity with
the neighboring peptide fragment whose C-terminal end is not protected and whose N-terminal end is protected by the Ddz radical, in an anhydrous organic solvent medium with dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazol (DCC / 1- HOBt); b) trifluoroacetic acid is added with a slight stoichiometric excess, in order to split the Ddz group from the condensed fragment; c) neutralizing the excess acid with an organic base and;
d) the elongated C-terminal fragment whose N-terminal end is unprotected thus obtained is condensed each time with the following fragment protected by a Ddz group on the N-terminal by repeating steps a), b) and c ), until the peptide chain is complete and finally, the protecting groups remaining in the usual manner are separated, whereby the side protecting groups used for the Asp and Glu groups are t.-butyl ester groups, for the Ser and Thr groups, tert.-butyl groups, for the Lys group, benzyloxy groups - <EMI ID = 3.1>
and that, if necessary, the acetyl group is exchanged on the N-terminal with another acyl group.
The abbreviations that are currently used correspond to the IUPAG-IUB recommendations (J. Biol. Chem.
<EMI ID = 4.1>
3,5-dimethoxybenzyloxy-carbonyl, Z means benzyloxycarbonyl, Ac means acetyl, OBut, means tert.butyl ester and Mbh means 4,4'-dimethyloxybenzhydryl. As an alkyl group, chain radicals are contemplated
straight or branched, with 1 to 6, preferably 1 to 4 carbon atoms. As support, use is made of support materials which are known to the person skilled in the art and which are suitable for the immobilization of peptides and proteins.
It is essential, in the process according to the present invention, that the fragments which represent the N-terminal portion of the thymosin-alpha 1 molecule, be used in at least 1.5 times in excess of the stoichiometric amount, preferably 2 2.5 times. Since, during the condensation of two fragments, a new fragment is formed, the C-terminal of which is larger and the N-terminal of which carries a protective group Ddz and that this
the latter can be removed already for the next condensation step with a very small amount of acid, it is likewise necessary to have for neutralization only a small amount of base. In this way, the multiple individual steps usually involved in the implementation of the methods known until now, and the intermediate repeats are simplified, so that to isolate the product of the reaction in question, a chromatographic separation is carried out. single reaction mixture in a column. The product known under the designation "Sephadex LH20" in a solvent, methanol and 2,2,2-trifluoroethanol is preferably used. In the case of condensation of a fragment fixed on a support, it is also not necessary to isolate the intermediate product from the chromatography indicated above.
. Since, according to the present invention, one works in an anhydrous organic medium, the particular stages of drying or elimination of water are superfluous. Likewise, the appropriate purification carried out by chromatography of the final product which is completely protected can be carried out in the same anhydrous organic solvent.
As regards step a), dimethylformamide is preferably used as solvent. Other solvents which are suitable are N-methylpyrrolidone and mixtures of these two indicated bodies as well as dimethylacetamide.
In step b), dimethylformamide is preferred as the solvent for the acid. Other suitable solvents are chloroform, tetrahydrofuran and dioxane.
We particularly prefer to use a solution
from 1 to about 5 X of trifluoroacetic acid in the di-
<EMI ID = 5.1>
acetic resides in the fact that it can also be used in the context of the final elimination of the ester / ter.-butyl and 4,4'-dimethoxybenzhydryl protected groups.
so that only its concentration increases.
For neutralization, it is possible to use basically all tertiary organic amines fixed on a support or soluble in organic solvents. Particularly preferred is N-methylmorpholine, because it suppresses racemization and thus improves the optical purity of the product.
<EMI ID = 6.1>
suitably by applying a vacuum and the residue is purified by chromatography, for example on a material of the molecular sieve type, such as crosslinked dextran, polystyrene or similar compounds. The chromatography is carried out in a suitable anhydrous solvent such as an alkanol, a halogenated hydrocarbon, etc. Preferably, methanol is used. In the case of condensed fragments fixed on supports, the polymer support is simply washed with dimethylformamide and dichloromethane.
The peptide fragments which are used as starting materials for the process according to the present invention can be prepared according to known processes for the synthesis of peptides. Preferably, their synthesis also takes place using Ddz protecting groups. In this way, the mixed anhydrides of the amino acids protected with Ddz are prepared with the mixture of isobutyloxycarbonyl chloride and N-methylmorpholine by sequential elongation in stages on the N-terminal group.
It is particularly preferred to use 1.5 to 2 equivalents of amino acids Ddz, N-methylmorpholine and sec.-butyloxycarbonyl chloride, dissolved in dichloromethane, and mixed at about - 10 to - 20 [deg.] C , with a solution obtained by reacting an equivalent of amino acid ester with Ddz and tert.-butyl or tert.-butyl ester and Ddz-oligopeptide in dichloromethane, which contains 1 to 5% trifluoroacetic acid and is held for about a quarter of an hour
half an hour at room temperature and then neutralized with N-methylmorpholine. The mixed solutions are left to react at room temperature for about 30 minutes to two hours. Evaporated in vacuo until the reaction mixture is dry, and chromatographed on a material suitable for chromatography, such as for example crosslinked dextran such as "Sephadex LH20" in a solvent such as methanol to purify it . After removing this solvent, one can immediately proceed to the next stage of condensation as described, until the peptide fragment is completed. In the case of condensation of a fragment fixed on a support, the polymer support is washed after the reaction has ended with dimethylformamide and dichloromethane.
The elaboration of thymosin-alpha 1 from the fragments which have been thus obtained will be even better elucidated with the aid of the appended drawing. It is recognized that five fragments are prepared from which amino acids 1 to 6 (fragment I), 7 to 12 (fragment II), 13 to 19 (fragment III), 20 to 24 (fragment IV) are composed, as well as
25 to 28 (fragment V). The fragment V, as a C-terminal fragment is transformed in accordance with the present invention with the fragment IV so that the elongated C-terminal fragment VI is obtained. Similarly, fragment VI is again transformed with fragment III, so that fragment VII is obtained as a new C-terminal fragment.
Finally, the latter is transformed with fragment II with the formation of fragment VIII and the latter finally with fragment I to form the completed peptide chain IX, of which there is still only
to remove protective groups. If, if necessary, the acetyl group must be exchanged for another acyl group, this can be done during the preparation of fragment I.
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benzyl ester, where appropriate for fragment V on a support, fragments II, III and IV in the form of
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ester terminals is carried out in an appropriate manner by alkaline saponification, in the case of the methyl ester, in aqueous dioxane, in the case of the benzyl ester, in a mixture of tetrahydrofuran and methanol.
The actual condensation reaction is preferably carried out in dimethylformamide as a solvent. The yields during particular phases or stages of condensation are excellent and reach
<EMI ID = 9.1>
Vant suitable is a mixture of propanol and glacial acetic acid as well as 2,2,2-trifluoroethanol. As catalyst, palladium on charcoal, platinum or palladium foam is suitably used.
As already indicated, the process according to the present invention also allows the synthesis of specific or defined derivatives of thymosin-alpha 1 and those in particular for which andno-acids 10 (Glu), 15
(Asp), 21 (Glu), 25 (Glu) and 28 (Asn) have, in place of a carboxyl group, an amide or alkylamide group.
In this case, during the corresponding step of the synthesis
<EMI ID = 10.1>
found in thymosin-alpha 1, natural, the derivatives already transformed of these amino acids into amide or alkylamide. For Asn, the corresponding diamide is used, since Asn already represents an amide.
The derivatives which have been mentioned are of particular therapeutic interest and have, with respect to
thymosin-alpha 1 has a different efficacy. As new compounds, these analogs also constitute one of the objects of the present invention.
Likewise, the N-terminal acyl group can be used for modifying the effect or the extent of the action by exchange against another acyl group. For example, instead of the acetyl radical, an acylglycine radical is introduced.
The example which follows will explain the present invention better with reference to the appended drawing. EXAMPLE
Preparation of thymosin-alpha 1:
<EMI ID = 11.1>
III (13 to 19), IV (20 to 24) and V (25 to 28) in solution, using excess of mixed amino acid anhydrides Ddz with the mixture of isobutyloxycarbonyl chloride and Nmethylmorpholine, by N-terminal portion by sequential elongation in stages, with protections on all sides. After that, the elements I and V are in the form of a benzyl ester, the fragments II, III and IV are in the form of a methyl ester with yields for all the stages, calculated as follows:
<EMI ID = 12.1>
After the alkaline saponification in aqueous dioxane, the IV fragment is condensed in dimethylformamide with the V, after which, from the latter, the <EMI ID = 13.1> is split.
Fragment VI is thus obtained.
After an alkaline saponification in an aqueous solution of tetrahydrofuran and methanol, the fragment III is bonded with the fragment IV under the conditions which have been described previously, in dimethylformamide, at room temperature for 66 hours.
Fragment VII is obtained with a yield of 60 X.
In the next step, the connection is made
<EMI ID = 14.1>
saponification in an 8: 2 mixture of dioxane and water (v / v). Condensation is carried out for 18 hours at 0 [deg.] C and for 10 hours at 20 [deg.] C. Yield: 67 X in fragment VIII.
Before the last condensation, remove by
hydrogenolysis in a mixture of propanol and glacial acetic acid the benzyl ester group of fragment I
<EMI ID = 15.1>
preliminary separation of Ddz with VIII in the mixture of Nmethylpyrrolidone / dimethylformamide (2: 1) (v / v) in 24 hours. Yield of product IX: 52%.
IX is purified in 2,2,2-trifluoroethanol on "Sephadex LH20" by chromatography. Amino acid analysis (values calculated in parentheses: HCl 6 N,
110 [deg.] C, 24 hours): Asp, 4.11 (4); Thr, 2.64 (3); Ser, 2.38 (3); Glu, 6.80 (6); Lys, 4.59 (4); Ile, 1.13 (1); Leu, 1, 23 (1); Ala, 2.51 (3); Val, 2.41 (3).
During the final three stages of the reaction, IX is rid of or released from all of its protective groups. By hydrogenolysis in 2,2,2-trifluoroethanol, with Pd on C, it is possible to remove all the benzyloxycarbonyl protecting groups and the benzyl ester <EMI ID = 16.1>
for 30 minutes of a mixture of trifluoroacetic acid and
dichloromethane (1: 1), v / v in the presence of 10 vol. X of anisol, it is possible to eliminate the tert.-butyl ester groups. After the volatile constituents have been removed in vacuo, at room temperature, the residue of the polypeptide and of anisol is reacted with pure trifluoroacetic acid, in order to remove the protecting groups 4,4'dimethoxybenzhydryl and the remaining radicals ter.butyliques, (120 minutes at 20 [deg.] C approximately). After precipitation and washing with ether, the synthetic thymosinealpha 1 is purified by chromatography. To do this, column chromatography is carried out (0.6 x 240 cm; which
<EMI ID = 17.1>
on trifluoroethanol) to first determine the retention volume for the insulin B chain (molecular weight
<EMI ID = 18.1>
synthetic. It leaves the column with the elution volume corresponding to its molecular weight (3,107). (Ren-
dement 90 X calculated on IX). Amino acid analysis
(values calculated in brackets HCl 6N / 110 [deg.] C / 24, 48,
96 hours): Asp, 4.11 (4); Thr, 2.86 (3); Ser, 2.70 (3); Glu, 5.89 (6); Lys, 3.98 (4); Ile, 0.97 (1); Leu, 1.00
(1); Ala, 3.05 (3); Val, 2.97 (3). Thin layer chromatogram: (Merck 60 F-254 silica gel; 0.25 mm);
Rf = 0.16 (mixture of n-butanol / pyridine / crystallizable acetic acid / water 5: 5: 1: 4 (v / v) unit product.
<EMI ID = 19.1>
-201.7 [deg.] (435 nm), -242.5 [deg.] (408 nm); -338.5 [deg.] (365 nm);
-587.0 [deg.] (313 nm); c = 0.083 in water.
Synthetic thymosin-alpha 1 was found to be biologically active in the lymphocyte stimulation test, in Rosetten's E trial and in the Mitogen trial.