jointe à une demande de
Qualification proposée: BREVET D'INVENTION
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La présente invention est relative à la production de protéines à cellules uniques. Selon
une autre de ses caractéristiques, la présente invention concerne également une nouvelle culture mixte _ thermophile.
Lés efforts en vue de pallier le manque de protéines a conduit � la mise au point de procédés de biosynthèse permettant d'obtenir par la voie biologique des protéines à cellules uniques (PCU) par la croissance de microorganismes sur des substrats contenant du carbone.
Les sources de carbone et d'énergie employées comme substrats pour la mise en oeuvre de tels procédés
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marché, uniformes et sûres dans le sens où elles ne peuvent pas laisser subsister de résidus nuisibles dans le produit protéinique finalement obtenu par les conversions microbiennes. Dans le passé on a utilisé des hydrocarbures du pétrole comme source de carbone et d'énergie, mais on s'est heurté à des difficultés pratiques en raison du manque de solubilité dans l'eau de ces hydrocarbures, de leur consommation élevée d'oxygène et, prétendument, de traces de substances potentiellement carcinogènes provenant des charges d'hydrocarbures du pétrole et pénétrant ou adhérant au produit protéinique obtenu.
Selon d'autres procédés, on a également utilisé des dérivés hydrocarbonés oxygénés comme charges de départ, en raison de l'hydrosolubilité de tels dérivés et, par conséquent, de la facilité de leur manipulation, étant donné que les procédés de conversion microbienne sont essentiellement réalisés dans des conditions aqueuses. De telles charges de départ sont
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à partir du gaz naturel, de divers procédés de traitement d'immondices et/ou d'issues de boucherie et de
la conversion du méthane, à partir de la fermentation de divers grains et de la distillation destructrice du bois. De tels hydrocarbures oxygénés sont des charges de départ très répandues et relativement bon marché pour la mise en oeuvre de procédés de fermentation. Ces hydrocarbures oxygénés ont pour avantage supplémentaire de n'avoir que des besoins en oxygène sensiblement réduits.
Une autre difficulté et, par conséquent, un autre facteur limitant la commercialisation de procédés de production de protéines à cellules uniques, réside dans la nécessité de réaliser la fermentation à des
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non supérieures à environ 35[deg.]C. Les conversions microbiennes sont formées de réaction d'oxydation exothermiques qui engendrent d'importantes quantités de chaleur. La chaleur ainsi formée doit être évacuée de manière continue et importante du mélange de fermentation, car, autrement, on court le risque d'une surchauffe du système entraînant la mort des microorganismes ou une restriction de plus en plus importante de la croissance au fur et à mesure de l'élévation de la température et, par conséquent, une perte d'efficience.
De nombreuses recherches ont eu pour objet la découverte de procédés basés sur l'emploi de levures comme microorganismes. Les cellules des levures sontgénéralement un peu plus grandes que les cellules des bactéries et se prêtent quelquefois aune séparation plus aisée des milieux de. fermentation.
Cependant, les bactéries offrent des avantages, étant donné que l'on obtient, à partir de bactéries, des teneurs en protéines brutes de la cellule plus élevée
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de levures en général, étant donné que les cellules des levures comportent des proportions élevées de matière
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habituellement une teneur en protéines vraies nettement plus élevée et fréquemment plus élevée en composés importants du point de vue nutritions les
- aminoacides sulfurés et la lisine.
<EMI ID=7.1> moindre quantité de chaleur, d'un appareil de refroidissement moins important et, finalement, de permettre l'emploi de plus faibles quantités de chaleur pour la stérilisation, la coagulation et la séparation. Le danger de contamination par d'autres microorganismes est fortement réduit lorsque l'on peut utiliser une
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les bactéries thermophiles ou thermotolérantes sont manifestement nécessaires à la commercialisation ou
à l'industrialisation de procédés de production de protéines à cellules uniques*
La demanderesse a découvert à présent une remarquable culture de bactéries mixtes thermophile, contenant trois espèces de microorganismes. Ces microorganismes sont individuellement classés comme suit:
(1) gros bâtonnets courbes Gram-positifs, division:
bactéries, classe: Schizomycetes, ordre: Eubacteriales . famille: Bacillaceae, genre: Bacillus; (2) grands bâtonnets Gram-négatifs, division: bactéries, classe:
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genre: Bacillus; (3) courts bâtonnets Gram-négatifs, difision: bactéries, classe: Schizomycetes. La culture
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Cette culture est thermophile, elle croit efficacement avec une productivité élevée sur des charges hydrocarbonées oxygénées, en particulier des alcools inférieurs, plus avantageusement, le méthanol ou l'éthanol, à des températures auxquelles la plupart des autres espèces de bactéries connues sont relativement improductrices, ou ne peuvent simplement survivre, ou sont improductrices sur et intolérantes vis-à-vis d'une charge hydrocarbonée oxygénée.
La culture mixte remarquable conforme à la présente invention est désignée comme'suit..
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Le numéro de dépôt NRRL B-8158 reflète le fait que la culture mixte thermophile a été déposée au département de l'Agriculture officiel des EtatsUnis d'Amérique, Agricultural Research Service,
North Central Région, Northern Régional Reserach Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois
61604 en y déposant 30 préparations lyophilisées de la culture mixte en question, avant de prodéder au dé-
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numéro de dépôt NRRL B-8158.
Conformément à la présente-invention on a donc découvert une culture de bactéries mixtes thermophiles remarquablement efficace qui a reçu, le numéro de dépôt NRRL B-8158. Cette culture mixte qui-a reçu <EMI ID=13.1>
est extrêmement productive à des températures de fermentation relativement élevées, produisant des produits protéiniques à cellules uniques souhaitables et extrêmement intéressants à haute teneur protéinique, et, notamment à haute teneur et à bon équilibre en amino acides souhaitable. -
La culture mixte thermophile remarquable conforme à la présente invention est stable en composition. La culture mixte utilisée pour procéder à la lyophilisation a été isolée à partir d'un effet de fermentation et a été lyophilisée dans des conditions usuelles qui comprennent une congélation rapide des cellules microbiennes à une température très basse, suivie d'une déshydratation rapide sous vide poussé et d'une conservation à la température ambiante. Afin de déterminer la viabilité, on a subséquemment réactivé certains des échantillons lyophilisés et on a soumis la culture mixte lyophilisée à une croissance dans les mêmes conditions que celles antérieurement utilisées. Les fermentations
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ont donné sensiblement les mêmes résultats, en ce qui concerne le rendement élevé en cellules, la composition apparente de la culture de fermentation et analogues, que les essais antérieurs. L'examen au microscope de
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organiques existaient sous la même forme et dans les mêmes proportions dans la culture reconstituée que dans le milieu de fermentation servant de source.
La culture remarquable thermophile conforme
à la présente invention assure l'existence de vitesses de production de protéines à cellules uniques améliorées, n'exige que des besoins en refroidissement réduits, lorsqu'elle croit sur un substrat d'énergie et de carbone formé par un hydrocarbure oxygéné, en particulier un alcool inférieur , de préférence le méthanol ou l'éthanol et avantageusement le méthanol, ou un substrat contenant principalement du méthanol. Il existe de avantages
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comparaison de l'utilisation d'une culture thermophile pure pour la fermentation du méthanol ou de toute autre source de carbone et d'énergie similaire. En premier lieu, on obtient un rendement élevé en cellules en utilisant la culture mixte. Le rendement en cellules, auquel on se réfère dans le présent mémoire, est défini comme le nombre de grammes de cellules produits par
100 g employés de source de carbone et d'énergie, comme le méthanol. Le rendement élevé en cellules constitue un avantage économique et industriel important.
Un autre avantage de la culture mixte conforme à l'invention en comparaison d'une culture thermophile pure, réside dans le fait que la culture mixte engendre sensiblement moins de mousse en comparaison des cultures pures étudiées. Les cultures pures tendent généralement à produire d'importantes quantités de mousse au cours, du processus de fermentation. Bien que la mousse puissa être souhaitable dans un certain appareil comme moyen pour faciliter le transfert de chaleur lors de la mise en oeuvre du processus de fermentation et pour faciliter l'introduction des importantes quantités souhaitables d'oxygène moléculaire nécessaires à la mise en oeuvre du processus de fermentation aérobie, il n'en demeure néanmoins vrai que de nombreux types
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équipés pour permettre la manipulation des importantes quantités de mousse engendrées par des microorganismes de souche pure. Par conséquent, les quantités modérées de mousse engendrées par la culture remarquable conforme à l'invention constitue un net avantage.
Un autre avantage de la culture mixte conforme à l'invention réside dans le fait que cette culture produit, de manière inhérente, des protéines à cellules uniques qui sont constituées d'un mélange de plusieurs variétés de cellules. Par conséquent, l'équilibre des aminoacides dans les cellules microbiennes récupérées
à partir de la culture mixte est bien plus souhaitable que celui présenté par le produit de n'importe quelle culture pure engendrant des cellules uniques. Un meilleur équilibre des aminoacides signifie qu'il y a moins de possibilité d'existence d'une déficience en un aminoacide essentiel particulier.
La culture mixte thermophile conforme à l'invention a été découverte au cours de recherches en vue de découvrir et de développer toute une série de cultures convenant à la mise en oeuvre de procédés de conver-sion microbienne. On a prélavé un échantillon de terre
à 61 cm en-dessous de la surface de la terre recouvrant une conduite de vapeur d'eau à Bartlesville, Oklahoma, Research Center of Phillips Petroleum Company. Des techniques d'enrichissement classiques effectuées en présence de méthanol, ont été mises en oeuvre pour isoler diverses cultures séparées ou distinctes. Au cours du déroulement des recherches pendant lequel on a isolé plusieurs cultures thermophiles pures, il devint apparent que l'on avait obtenu une culture mixte d'une composition des plus inhabituellement stables d'organismes thermophiles.
La culture mixte thermophile est composée de trois microorganismes séparés. Les trois types de bactérie dans la culture mixte thermophile de composition stable sont décrits comme étant constitués de (1)
grands bâtonnets courbes gram-positifs, (2) grands bâtonnets gram-négatifs et (3) courts bâtonnets gramnégatifs.
Divers essais de séparation ont été réalisés sur cette culture afin d'isoler les microorganismes purs. Par exemple, des plaques à stries ont donné des colonies isolées des trois organismes sur un milieu constitué de gélose minérale contenant du méthanol. Cependant, lorsque l'on a transféré les colonies isolées sur des milieux aqueux en vue d'une croissance plus poussée avec du méthanol servant de source de carbone et d'énergie, on fut étonné et surpris de constater qu'aucune croissance ne se produisit. On a tenté, sans succès, de répéter des efforts de ce type.
La croissance coopérative de cette culture mixte indique qu'il existe une relation de symbiose entre les trois microorganismes. Il apparaît comme possible qu'un ou des produits métabolique s d'au moins l'un des mic roorganismes sert de substrat nécessaire à la croissance de l'un ou de l'autre des microorganismes résiduels. Bien que la nature exacte d'un tel métabolite ne soit pas connue à l'heure actuelle, il semble vraisemblable qu'un tel métabolite soit toxique vis-à-vis
du microorganisme qui le produit, en expliquant ainsi
la nécessité de la présence des microorganismes additionnels pour consommer ce métabolite toxique afin que le premier microorganisme puisse continuer à crottre de manière adéquate.
Une autre indication de cette relation de symbiose réside dans le fait que des fermentations
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dans des conditions de fermentation aérobie typiques, en comparaison des quantités de mousse normalement observées dans des conditions de fermentation aérobie typiques équivalentes mais réalisées en utilisant une bactérie thermophile pure du genre Bacillus. Ceci
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tités de mousse auxquelles on aurait pu autrement s'éttendre, parce que, lors de la fermentation de la
M , un produit extracellulaire, probablement protéinique, est consommé par au moins l'un des microorganismes vivant en symbiose, de façon à ainsi continuellement épuiser le mélange dé fermentation de ce produit constituant la matière formatrice de mousse.
Un hydrocarbure oxygéné sert de source de carbone et d'énergie ou de substrat. Les hydrocarbures
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sont sensiblement solubles dans l'eau et qui contiennent, de préférence, jusqu'à environ 10 atomes de carbone par molécule. :
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Des gaz de pétrole, comme le gaz naturel,
le méthane, ou d'autres gaz, tels que l'éthane, peuvent être oxydés de manière à engendrer des mélanges contenant de manière prédominante les alcools correspondants, comme aussi des quantités mineures de cétones, d'aldéhydes, d'éthers et d'acides.
Généralement, on préfère utiliser les alcools possédant de 1 à 7 atomes de carbone par molécule.
De tels alcools comprennent des alcools tant linéaires que ramifiés, qu'ils soient de nature primaire, secon-
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Comme exemples d'alcools, on peut citer les composés suivants: méthanol, éthanpl, propanol,
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deux ou de plus de ; deux de ces composés:
Les alcools les plus avantageux -sont ceux qui
<EMI ID=25.1> Un produit actuellement disponible dans le
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17 septembre 1973, page 23) illustre un mélange du commerce de méthanol et de pourcentages réglés en alcools supérieurs contenant jusqu'à environ 4 atomes de carbone par molécule et pouvant être utilisé comme substrat convenable.
Les procédés de fermentation aérobie sont bien connus des spécialistes de la technique, tout comme le sont des moyens pour fournir de l'oxygène à des mélanges de fermentation. En général, la fourniture d'oxygène moléculaire au mélange réactionnel aqueux de fermentation peut s'effectuer en faisant passer des volumes adéquats d'air ou d'air enrichi en oxygène ou d'air et d'une quantité supplémentaire d'oxygène pur introduite séparément, à travers le récipient de fermentation ou fermenteur. On peut récupérer les gaz d'échappement, les recycler si on le souhaite afin d'utiliser l'oxygène au maximum, comme en éliminant l'anhydride carbonique des gaz d'échappement et en procédant ensuite à.leur recyclage.
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de 0,1 à 10, plus habituellement de 0,7 à 2,5, volumes d'air par minute au mélange de fermentation, par volume de liquide aqueux présent dans le fermenteur, soit, exprimé en oxygène, les gammes respectives varient <EMI ID=28.1>
Les pressions utilisées peuvent varier entre
de larges limites. A titre d'exemple, on peut utiliser une pression de 10,13 à 10 132 kPa, plus habituellement de 101,3 à 3039 kPa, de préférence, de 101,3 à 506,5 kPa.
Des pressions supérieures à la pression atmosphérique sont avantageuses, étant donné qu'elles tendent à accroître la teneur en oxygène dissous du milieu de fermenta-= tion aqueux qui, à son tour, tend alors à promouvoir une croissance microbienne plus rapide. Les pression supé- rieures à la pression atmosphérique sont particulièrement intéressantes, étant donné que les températures élevées utilisées pour procéder à la fermentation ther-
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l'oxygène dans le milieu de fermentation aqueux.
La culture des bactéries mixtes avec la charge hydrocarbonée oxygénée peut avantageusement se réaliser à une température variant de 45 à 65[deg.]C, de préférence, pour l'obtention de vitesses de croissance optimales,
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Les températures inférieures tendent à inhiber la croissance.
Des concentrations élevées en certains des
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comme le méthanol, peuvent inhiber une croissance microbienne satisfaisante ou même se révéler toxiques vis-àvis des microorganismes utilisés pour procéder aux fermentations employant la culture mixte et doivent par Le procédé de fermentation peut se réaliser d'une manière discontinue ou d'une manière continue.
Un procédé continu est tout particulièrement convenable lorsque la source de carbone et d'énergie est constituée d'un alcool inférieur, tel que le méthanol ou l'éthanol, qui se prête aisément de lui-mtme au réglage du débit d'introduction. L'emploi de tels microorganismes et l'utilisation de telles charges de départ dans
un procédé de fermentation discontinu peuvent se considérer comme n'étant pas économiques. Cependant, de tels substrats sont commodément utilisés pour la mise
en oeuvre d'un procédé de fermentation continue avec
des avantages économiques et des efficiences globales élevées. Au cours de la fermentation, après avoir inoculé le fermenteur de manière appropriée de l'espèce de culture mixte, on peut introduire l'hydrocarbure oxygéné sous forme de courant séparé ou le mélanger à
de l'eau afin de stériliser cette dernière et de l'amener sous forme de courant aqueux ou bien on peut mélanger l'hydrocarbure oxygéné à des milieux minéraux afin de les stériliser et l'introduire avec ces derniers, ou bien on peut procéder à la mise en oeuvre de n'importe lequel ou de tous ces procédés en même temps. Habituellement, l'hydrocarbure oxygéné est introduit séparément pour des raisons de facilité de réglage, en une concentration dans le courant de charge introduit dans le
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tuellement et plus commodément 10 à 15 % en poids.
La culture s'effectue dans un milieu de croissance aqueux comprenant un milieu aqueux contenant un sel minéral, la source de carbone et d'énergie,
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la culture mixte conforme à l'invention.
Les vitesses de croissance au cours de la fermentation peuvent être ajustées en réglant le débit d'introduction de l'hydrocarbure oxygéné. La vitesse d'introduction de la source de carbone et d'énergie
doit être ajustée pour que les quantités de cette source d'énergie et de carbone introduites dans le fermenteur soient sensiblement les mêmes que la vitesse de consommation de cette source de carbone et d'énergie par l'organisme, afin d'en éviter une accumulation importante dans le fermenteur, en particulier-de toutes matières toxiques. Un ajustement satisfaisant peut également se <EMI ID=34.1>
non entrée en réaction dans l'effluent du fermenteur
à 0-0,2% en poids.
Généralement, la durée de séjour des cellules microbiennes dans le fermenteur, lors de la mise en oeuvre d'un procédé continu, varie de 2 à 4 heures dans les conditions précitées, bien que ceci ne soit pas critique.
La culture mixte conforme à l'invention exige .l'emploi de substances nutritives minérales et d'une source, d'azote assimilable, outre l'addition d'oxygène moléculaire et des sources de carbone et d'énergie déjà décrites. La source d'azote assimilable peut être constituée par n'importe quel composé contenant de l'azote susceptible de libérer de l'azote sous une
forme appropriée à l'utilisation métabolique par l'organisme en question. Bien que l'on puisse utiliser toute une série de composés azotés organiques comme source d'azote, tels que d'autres protéines, d'urées
et analogues, habituellement les matières azotées inorganiques sont plus économiques et plus pratiques à
cette fin. De manière typique, de tels composés azotés inorganiques servant de source d'azote assimilable comprennent, de préférence, l'ammoniac ou l'hydroxyde d'ammonium, comme aussi divers autres sels d'ammonium, comme le carbonate d'ammonium, le citrate d'ammonium,
le phosphate d'ammonium, le sulfate d'ammonium et le pyrophosphate d'ammonium. L'ammoniac gazeux est commode et peut s'utiliser en le faisant simplement barboter dans le milieu de fermentation aqueux en quantités convenables.
Le pH du mélange de fermentation microbien aqueux peut varier de 5,5 à 7,5, de préférence, de 6 à 7. L'introduction d'ammoniac facilite le réglage du pH souhaité, étant donné que le milieu aqueux tend autrement
à être légèrement acide. Bien évidemment, les pH préférés pour les microorganismes dépendent généralement dans une certaine mesure du milieu utilisé et, par conséquent, la plage préférée des pH peut chager au moins légèrement avec une modification du milieu minéral.
En plus de la source d'oxygène, d'azote et de carbone et d'énergie, il est nécessaire d'introduire des éléments nutritifs minéraux choisis en quantités et en proportions nécessaires dans les charges d'alimentation afin d'assurer une croissance appropriée du microorganisme et de maximiser l'assimilation de
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procédé de conversion microbienne.
Une source de phosphate ou de-tous autres ions phosphore, magnésium, calcium, sodium, manganèse, molybdène ou cuivre semble fournir les ingrédients minéraux essentiels. Un milieu nitritif minéral appelé
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oeuvre du procédé de fermentation conforme à l'invention et sa composition figure ci-dessous en même temps que celle d'une solution d'oligo-éléments qui fait partie
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On peut se servir d'instruments afin de mesurer la densité des cellules, le pH, la teneur en oxygène dissous, la concentration en hydrocarbure oxygéné dans le mélange présent dans le fermenteur, la température, les vitesses d'introduction et analogues. Il est actuellement préféré que les matières introduites dans le fermenteur soient stérilisées
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méthanol, il peut être commode d'ajouter ce composant aux autres constituants du mélange de fermentation, tels que le milieu minéral, en quantités stérilisantes
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de contact gaz/liquide. Par conséquent, la fermentation s'en trouve améliorée et le transfert de chaleur s'en trouve également amélioré, quant à son réglage,
son uniformité et la disparition des points chauds.
Evidemment, si on le souhaite, on peut utiliser une substance favorisant la production de mousse, comme certains détergents, de préférence non
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tion de mousse supplémentaire, bien que ceci ne soit normalement pas.nécessaire ni même souhaitable.
La récupération des cellules microbiennes peut s'effectuer par la mise en oeuvre des techniques usuelles, telles que 1'acidification de 1 'effluent de
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élevée pour né pas endommager le produit protéinique obtenu..On peut ensuite centrifuger l'effluent, le laver
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produit également un certain nombre de sous-produits <EMI ID=47.1> du rendement global du procédé, étant donné qu'ils comprennent des produits de valeur, comme des polysaccharides, des aminoacides, tels que l'acide glutamique, des enzymes, des vitamines et analogues*
Le produit obtenu à base de cellules uniques conformément à la présente invention constitue
une source intéressante de protéines pour les êtres humains comme aussi -pour les animaux. En vue de la consommation humaine, on peut traiter les cellules
afin de réduire leur teneur en acide-nucléique, si
on le souhaite, bien qu'un tel traitement ne semble
pas nécessaire dans le cas où le produit doit servir à la nourriture d'animaux.
EXEMPLE 1
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tinue en utilisant la culture mixte thermophile con- forme à la présente invention. Dans un fermenteur d'une contenance de 7 litres, équipé d'un aérateur, d'un agitateur, d'un dispositif de surveillance de l'oxygène dissous et de moyens pour mesurer et réglera la température et le pH du mélange de fermentation,
on a introduit environ 500 ml d'un mélange réactionnel de fermentation provenant d'un essai de fermentation
précédent utilisant la culture mixte thermophile et
10 ml de méthanol, cette charge servant d'inoculant.
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au cours du déroulement de la totalité de l'essai et
on a réglé le pH à 6,2-6,35 par l'addition, selon les besoins, d'une solution d'hydroxyde d'ammonium. On a introduit de l'air dans le fermenteur au débit de
2 litiges/ minute au cours de la totalité de l'essai. Après 6 heures, on a également introduit de l'oxygène sensiblement pur dans le fermenteur au débit de 6,5 litres par minute, puis on a élevé le débit d'introduction de l'oxygène sensiblement pur à 0,75 litres/minute après
118 heures, à 1,5 litre par minute après 174 heures et à deux litres par minute après 190 heures.
Au bout de 22 heures, on a changé le milieu
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méthanol, outre le milieu FM-12, + 0,75 g de chlorure
de potassium, deux fois la teneur normale en oligoéléments, trois fois la teneur normale en composant de manganèse (le tout sur la base du litre) et avec ommission de chlorure de sodium. Au bout de 166 heures, on a
changé la charge en une composition aqueuse à 10% en volume de méthanol, 2,5 ml d'acide phosphorique (85%) par litre, 2 g de chlorure de potassium par litre, 1,75 g
de sulfate de magnésium.7H20 par litre, 0,25 g de chlorure de calcium. 21^0 par litre, 20 ml d'une solution
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définie par litre.
Le débit d'introduction du milieu était
de 700 ml par heure au bout de 22 heures, de 817 ml par heure au bout de 118 heures, de 781 ml par heure au bout de 166 heures et de 763 ml par heure au bout
de 382 heures.
De temps en temps, on a prélevé des échantillons de l'effluent de fermentation afin d'en récu- pérer les cellules. Les valeurs obtenues quant à la teneur en cellules, exprimées sous forme de poids sec de cellules en grammes/litre et les rendements calculés sont présentés dans le tableau I. Le tableau I présente aussi les valeurs calculées pour la productivité, s'exprimant en grammes de cellules par litre et par heure.
Au bout d'environ 126 heures, on a prélevé des échantillons du mélange de fermentation et on les a préparés en vue de la lyophilisation des cellules microbiennes selon des procédés bien connus des spécialistes.
On a ensuite conservé ces échantillons lyophilisés pour l'utilisation subséquente dans un essai de fermentation ultérieur et pour fournir des échantillons de HTB-53 en vue de leur dépôt au département
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Des échantillons périodiques ont également été prélevés du mélange de fermentation en vue de
les soumettre à un examen microscopique afin d'examiner les cellules microbiennes quant à leur morphologie globale. Un tel examen microscopique a révélé que la culture mixte conforme à l'invention était composée de <EMI ID=54.1>
bâtonnets Gram-négatifs:et de petits bâtonnets Gram-négatifs. On a occacionnellement aussi observé l'existence de grands bâtonnets Gram-positifs (non courbés), mais la demanderesse suppose que ceux-ci étaient des variantes transitoires des grands bâtonnets courbes Gram-positifs.
TABLEAU I
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de l'effluent du fermenteur jusqu'au lendemain à
100[deg.]C et en soustrayant le poids des solides minéraux contenus dans 10 ml de milieu.
(b) Valeur obtenue en centrifugeant un échantillon de
100 ml d'effluent du fermenteur, en remettant les solides en suspension dans de l'eau distillée et en recentrifugeant afin de récupérer les solides que l'on sèche ensuite jusqu'au lendemain à 100[deg.]C.
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(g/l) par la durée de séjour (h). EXEMPLE 2
Après environ 1 mois, on a ouvert de manière aseptique par mise en oeuvre de procédés classiques, un tube unique de la culture microbienne HTB-53 lyophilisée obtenue au cours de l'essai de fermentation de l'exemple 1 susmentionné et on en a ajouté le contenu à
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On a incubé le flacon chargé de la culture
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24 heures, le flacon laissait apercevoir une bonne croissance de la culture et on a transféré 5 ml du mélange ainsi obtenu dans 100 ml du milieu IM2 conte-
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croissance se développa en l'espace de 24 heures et on a procédé à un troisième transfert dans le même milieu dans deux flacons, contenant chacun 500 ml du milieu 1142 et 1,5% en volume de méthanol. Ce troisième <EMI ID=62.1>
utilisée comme inoculant pour un essai de fermentation continuer dans l'appareil décrit plus haut à l'exemple 1.
<EMI ID=63.1> base du poids sec et en rendement comme aussi en productivité. Les données obtenues au cours de cet essai sont présentées dans le tableau II qui suit.
<EMI ID=64.1>
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. , '?/ Voir notes relatives au tableau I.
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la culture microbienne au cours de l'essai de fermentation à des fins d'examen microscopique, décrit
<EMI ID=67.1> pérées. Le tableau IV présente, également l'anlyse et
la teneur en aminoacides des cellules microbiennes récupérées à partir d'un autre essai de fermentation utilisant la culture thermophile mixte. A des fins de comparaison, l'analyse de la teneur en aminoacides des cellules obtenues par l'emploi d'un microorganisme ther-
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philes à partir de l'échantillon de terre initial pré- ' cédemment décrit, figure également dans le tableau IV.
TABLEAU III
Analyse chimique des cellules microbiennes obtenues au cours de l'es-
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TABLEAU IV
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thermophiles que l'on a fait croître
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attached to a request for
Proposed qualification: PATENT OF INVENTION
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The present invention relates to the production of single cell proteins. According to
another of its characteristics, the present invention also relates to a novel thermophilic mixed culture.
Efforts to make up for the lack of protein have led to the loss of protein. the development of biosynthetic processes making it possible to biologically obtain single-cell proteins (PCUs) by the growth of microorganisms on substrates containing carbon.
The carbon and energy sources used as substrates for the implementation of such processes
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market, uniform and safe in the sense that they cannot leave harmful residues in the protein product ultimately obtained by microbial conversions. In the past petroleum hydrocarbons have been used as a source of carbon and energy, but practical difficulties have been encountered due to the lack of water solubility of these hydrocarbons, their high oxygen consumption. and, allegedly, traces of potentially carcinogenic substances originating from petroleum hydrocarbon feedstocks and penetrating or adhering to the resulting protein product.
According to other methods, oxygenated hydrocarbon derivatives have also been used as feedstocks, due to the water solubility of such derivatives and, therefore, the ease of their handling, since microbial conversion processes are essentially carried out under aqueous conditions. Such starting loads are
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from natural gas, various refuse treatment processes and / or butchery and
the conversion of methane, from the fermentation of various grains and the destructive distillation of wood. Such oxygenated hydrocarbons are very widespread and relatively inexpensive starting charges for carrying out fermentation processes. These oxygenated hydrocarbons have the additional advantage of having only substantially reduced oxygen requirements.
Another difficulty, and therefore another factor limiting the commercialization of single cell protein production processes, is the need to perform fermentation at
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not greater than about 35 [deg.] C. Microbial conversions are formed by exothermic oxidation reactions which generate large amounts of heat. The heat thus formed must be continuously and extensively removed from the fermentation mixture, otherwise there is the risk of overheating the system resulting in the death of the microorganisms or an increasingly severe restriction of growth over time. as the temperature rises and consequently a loss of efficiency.
Much research has been aimed at the discovery of processes based on the use of yeasts as microorganisms. Yeast cells are generally a little larger than bacteria cells and sometimes lend themselves to easier separation from the media. fermentation.
However, bacteria offer advantages, since higher levels of crude cell protein are obtained from bacteria.
<EMI ID = 5.1>
yeasts in general, since yeast cells contain high proportions of material
<EMI ID = 6.1>
usually a significantly higher true protein content and frequently higher of nutrient important compounds
- sulfur amino acids and lisine.
<EMI ID = 7.1> less heat, less cooling apparatus, and ultimately less heat to be used for sterilization, coagulation and separation. The danger of contamination by other microorganisms is greatly reduced when one can use a
<EMI ID = 8.1>
thermophilic or thermotolerant bacteria are clearly necessary for marketing or
industrialization of single-cell protein production processes *
The Applicant has now discovered a remarkable culture of thermophilic mixed bacteria, containing three species of microorganisms. These microorganisms are individually classified as follows:
(1) Gram-positive large curved rods, division:
bacteria, class: Schizomycetes, order: Eubacteriales. family: Bacillaceae, genus: Bacillus; (2) large Gram-negative rods, division: bacteria, class:
<EMI ID = 9.1>
genus: Bacillus; (3) Gram-negative short rods, difision: bacteria, class: Schizomycetes. Culture
<EMI ID = 10.1>
This culture is thermophilic, it grows efficiently with high productivity on oxygenated hydrocarbon feedstocks, in particular lower alcohols, more preferably methanol or ethanol, at temperatures at which most of the other known bacteria species are relatively unproductive, or simply cannot survive, or are safe unproductive and intolerant of an oxygenated hydrocarbon feed.
The outstanding mixed culture according to the present invention is referred to as follows.
<EMI ID = 11.1>
The NRRL deposit number B-8158 reflects the fact that the thermophilic mixed culture has been deposited with the official United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service,
North Central Region, Northern Regional Reserach Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois
61604 by depositing therein 30 lyophilized preparations of the mixed culture in question, before producing the de-
<EMI ID = 12.1>
NRRL deposit number B-8158.
In accordance with the present invention, therefore, a remarkably efficient culture of mixed thermophilic bacteria has been discovered which has received the deposit number NRRL B-8158. This mixed culture which-received <EMI ID = 13.1>
is extremely productive at relatively high fermentation temperatures, producing desirable and extremely valuable single cell protein products with a high protein content, and especially a high content and good balance of desirable amino acids. -
The remarkable thermophilic mixed culture in accordance with the present invention is stable in composition. The mixed culture used to carry out the lyophilization was isolated from a fermentation effect and was lyophilized under usual conditions which include rapid freezing of the microbial cells at a very low temperature, followed by rapid dehydration under vacuum. pushed and stored at room temperature. In order to determine viability, some of the lyophilized samples were subsequently reactivated and the lyophilized mixed culture was grown under the same conditions as previously used. Fermentations
<EMI ID = 14.1>
gave substantially the same results, with regard to high cell yield, apparent composition of fermentation culture and the like, as previous tests. Microscopic examination of
<EMI ID = 15.1>
organic compounds existed in the same form and in the same proportions in the reconstituted culture as in the fermentation medium serving as the source.
The remarkable thermophilic culture conforms
to the present invention ensures the existence of improved single cell protein production rates, requires only reduced cooling requirements, when growing on an energy and carbon substrate formed by an oxygenated hydrocarbon, in particular a lower alcohol, preferably methanol or ethanol and advantageously methanol, or a substrate mainly containing methanol. There are advantages
<EMI ID = 16.1>
comparison of the use of a pure thermophilic culture for the fermentation of methanol or any other carbon and similar energy source. First, a high yield of cells is obtained by using the mixed culture. Cell yield, referred to herein, is defined as the number of grams of cells produced by
100 g of carbon and energy source, such as methanol. The high yield of cells constitutes an important economic and industrial advantage.
Another advantage of the mixed culture in accordance with the invention in comparison with a pure thermophilic culture lies in the fact that the mixed culture generates appreciably less foam compared to the pure cultures studied. Pure cultures generally tend to produce large amounts of foam during the fermentation process. Although foam may be desirable in some apparatus as a means of facilitating the transfer of heat during the operation of the fermentation process and of facilitating the introduction of the desirable large amounts of molecular oxygen necessary for the operation of the fermentation process. process of aerobic fermentation, however, it remains true that many types
<EMI ID = 17.1>
equipped to allow the handling of large quantities of foam generated by pure strain microorganisms. Consequently, the moderate amounts of foam generated by the remarkable culture according to the invention constitutes a clear advantage.
Another advantage of the mixed culture according to the invention lies in the fact that this culture inherently produces single-cell proteins which consist of a mixture of several varieties of cells. Therefore, the balance of amino acids in the recovered microbial cells
from the mixed culture is much more desirable than that exhibited by the product of any pure culture generating single cells. A better balance of amino acids means that there is less possibility of a deficiency in a particular essential amino acid.
The thermophilic mixed culture according to the invention was discovered during research with a view to discovering and developing a whole series of cultures suitable for the implementation of microbial conversion processes. We prewashed a soil sample
61 cm below the surface of the earth covering a water vapor pipe in Bartlesville, Oklahoma, Research Center of Phillips Petroleum Company. Conventional enrichment techniques carried out in the presence of methanol have been used to isolate various separate or distinct cultures. During the course of the research in which several pure thermophilic cultures were isolated, it became apparent that a mixed culture of the most unusually stable composition of thermophilic organisms had been obtained.
The thermophilic mixed culture is composed of three separate microorganisms. The three types of bacteria in the thermophilic mixed culture of stable composition are described as consisting of (1)
large gram-positive curved rods, (2) large gram-negative rods and (3) short gram-negative rods.
Various separation tests were carried out on this culture in order to isolate the pure microorganisms. For example, streak plates yielded isolated colonies of the three organisms on a medium consisting of mineral agar containing methanol. However, when the isolated colonies were transferred to aqueous media for further growth with methanol serving as the carbon and energy source, it was astonished and surprised to find that no growth occurred. . An attempt has been made, without success, to repeat such efforts.
The cooperative growth of this mixed culture indicates that there is a symbiotic relationship between the three microorganisms. It appears as possible that one or more metabolic products of at least one of the microorganisms serves as the substrate necessary for the growth of one or other of the residual microorganisms. Although the exact nature of such a metabolite is not known at the present time, it seems likely that such a metabolite is toxic to
of the microorganism that produces it, thus explaining
the need for the presence of additional microorganisms to consume this toxic metabolite so that the first microorganism can continue to grow adequately.
Another indication of this symbiotic relationship lies in the fact that fermentations
<EMI ID = 18.1>
under typical aerobic fermentation conditions, as compared to the amounts of foam normally observed under equivalent typical aerobic fermentation conditions but achieved using pure thermophilic bacteria of the genus Bacillus. This
<EMI ID = 19.1>
amounts of foam to which one could otherwise have spread, because, during the fermentation of the
M, an extracellular product, probably protein, is consumed by at least one of the microorganisms living in symbiosis, so as to continuously exhaust the fermentation mixture of this product constituting the foam-forming material.
An oxygenated hydrocarbon serves as a carbon and energy source or substrate. Hydrocarbons
<EMI ID = 20.1>
<EMI ID = 21.1>
are substantially water soluble and preferably contain up to about 10 carbon atoms per molecule. :
<EMI ID = 22.1>
Petroleum gases, such as natural gas,
methane, or other gases, such as ethane, can be oxidized so as to generate mixtures containing predominantly the corresponding alcohols, as also minor amounts of ketones, aldehydes, ethers and acids.
Generally, it is preferred to use alcohols having 1 to 7 carbon atoms per molecule.
Such alcohols include both linear and branched alcohols, whether primary, secondary in nature.
<EMI ID = 23.1>
As examples of alcohols, the following compounds may be mentioned: methanol, ethanol, propanol,
<EMI ID = 24.1>
two or more of; two of these compounds:
The most advantageous alcohols are those which
<EMI ID = 25.1> A product currently available in the
<EMI ID = 26.1>
September 17, 1973, page 23) illustrates a commercial mixture of methanol and controlled percentages of higher alcohols containing up to about 4 carbon atoms per molecule and which can be used as a suitable substrate.
Aerobic fermentation processes are well known to those skilled in the art, as are means for providing oxygen to fermentation mixtures. In general, the supply of molecular oxygen to the aqueous fermentation reaction mixture can be accomplished by passing adequate volumes of air or oxygen-enriched air or air and an additional amount of pure oxygen introduced. separately, through the fermentation vessel or fermenter. The exhaust gases can be recovered, recycled if desired in order to utilize the oxygen to the maximum, such as by removing carbon dioxide from the exhaust gases and then recycling them.
<EMI ID = 27.1>
0.1 to 10, more usually 0.7 to 2.5, air volumes per minute to the fermentation mixture, per volume of aqueous liquid present in the fermenter, i.e., expressed as oxygen, the respective ranges vary < EMI ID = 28.1>
The pressures used may vary between
wide limits. For example, a pressure of 10.13 to 10132 kPa, more usually 101.3 to 3039 kPa, preferably 101.3 to 506.5 kPa, can be used.
Pressures above atmospheric pressure are advantageous since they tend to increase the dissolved oxygen content of the aqueous fermentation medium which, in turn, then tends to promote faster microbial growth. Pressures above atmospheric pressure are of particular interest, since the high temperatures used to carry out the thermal fermentation.
<EMI ID = 29.1>
oxygen in the aqueous fermentation medium.
The culture of the mixed bacteria with the oxygenated hydrocarbon feed can advantageously be carried out at a temperature varying from 45 to 65 [deg.] C, preferably, in order to obtain optimum growth rates,
<EMI ID = 30.1>
Lower temperatures tend to inhibit growth.
High concentrations of some of the
<EMI ID = 31.1>
such as methanol, may inhibit satisfactory microbial growth or even be toxic to the microorganisms used to carry out the fermentations employing the mixed culture and must therefore be carried out in a batch or continuous manner. .
A continuous process is very particularly suitable when the source of carbon and energy consists of a lower alcohol, such as methanol or ethanol, which easily lends itself by itself to the regulation of the rate of introduction. The use of such microorganisms and the use of such starting charges in
a batch fermentation process may be considered uneconomical. However, such substrates are conveniently used for setting
implementation of a continuous fermentation process with
high economic benefits and overall efficiencies. During the fermentation, after having appropriately inoculated the fermenter with the mixed culture species, the oxygenated hydrocarbon can be introduced as a separate stream or mixed with
water in order to sterilize the latter and bring it in the form of an aqueous current or the oxygenated hydrocarbon can be mixed with mineral media in order to sterilize them and introduce it with the latter, or else it is possible to proceed to carrying out any or all of these methods at the same time. Usually, the oxygenated hydrocarbon is introduced separately for ease of control, at a concentration in the feed stream introduced into the feed.
<EMI ID = 32.1>
more preferably 10 to 15% by weight.
The culture is carried out in an aqueous growth medium comprising an aqueous medium containing an inorganic salt, the source of carbon and of energy,
<EMI ID = 33.1>
the mixed culture according to the invention.
Growth rates during fermentation can be adjusted by adjusting the rate of introduction of the oxygenated hydrocarbon. The rate of introduction of the carbon and energy source
must be adjusted so that the quantities of this energy and carbon source introduced into the fermenter are approximately the same as the rate of consumption of this carbon and energy source by the body, in order to avoid an accumulation of it important in the fermenter, in particular-of all toxic materials. A satisfactory fit can also be <EMI ID = 34.1>
not reacted in the effluent of the fermenter
at 0-0.2% by weight.
Generally, the residence time of the microbial cells in the fermenter, when carrying out a continuous process, varies from 2 to 4 hours under the aforementioned conditions, although this is not critical.
The mixed culture according to the invention requires the use of mineral nutrients and a source of assimilable nitrogen, in addition to the addition of molecular oxygen and carbon and energy sources already described. The source of assimilable nitrogen may be any nitrogen-containing compound capable of releasing nitrogen under a
form appropriate for metabolic use by the organism in question. Although a variety of organic nitrogen compounds can be used as a source of nitrogen, such as other proteins, ureas
and the like, usually inorganic nitrogenous materials are more economical and convenient to
this end. Typically, such inorganic nitrogenous compounds serving as an assimilable nitrogen source preferably include ammonia or ammonium hydroxide, as also various other ammonium salts, such as ammonium carbonate, citrate. ammonium,
ammonium phosphate, ammonium sulfate and ammonium pyrophosphate. Ammonia gas is convenient and can be used by simply bubbling it through the aqueous fermentation medium in suitable amounts.
The pH of the aqueous microbial fermentation mixture can vary from 5.5 to 7.5, preferably 6 to 7. The introduction of ammonia facilitates the adjustment of the desired pH, as the aqueous medium tends otherwise.
to be slightly acidic. Of course, preferred pHs for microorganisms generally depend to some extent on the medium used and therefore the preferred range of pHs may change at least slightly with modification of the mineral medium.
In addition to the source of oxygen, nitrogen and carbon and energy, it is necessary to introduce selected mineral nutrients in necessary quantities and proportions into feedstocks to ensure proper growth. of the microorganism and to maximize the assimilation of
<EMI ID = 35.1>
microbial conversion process.
A source of phosphate or all other phosphorus, magnesium, calcium, sodium, manganese, molybdenum or copper ions appears to provide the essential mineral ingredients. A mineral nitritic medium called
<EMI ID = 36.1>
implementation of the fermentation process according to the invention and its composition is shown below together with that of a solution of trace elements which is part
<EMI ID = 37.1>
<EMI ID = 38.1>
<EMI ID = 39.1>
<EMI ID = 40.1>
Instruments can be used to measure cell density, pH, dissolved oxygen content, oxygenated hydrocarbon concentration in the mixture present in the fermenter, temperature, feed rates and the like. It is presently preferred that the materials introduced into the fermenter are sterilized.
<EMI ID = 41.1>
methanol, it may be convenient to add this component to the other components of the fermentation mixture, such as the mineral medium, in sterilizing amounts
<EMI ID = 42.1> <EMI ID = 43.1>
gas / liquid contact. Consequently, the fermentation is improved and the heat transfer is also improved, as to its adjustment,
its uniformity and the disappearance of hot spots.
Obviously, if desired, one can use a foam promoting substance, such as certain detergents, preferably not.
<EMI ID = 44.1>
Additional foaming, although this is not normally necessary or even desirable.
The recovery of the microbial cells can be carried out by employing the usual techniques, such as the acidification of the effluent of
<EMI ID = 45.1>
high so as not to damage the protein product obtained. The effluent can then be centrifuged, washed
<EMI ID = 46.1>
also produces a number of <EMI ID = 47.1> by-products of the overall process efficiency, as they include valuable products, such as polysaccharides, amino acids, such as glutamic acid, enzymes, vitamins and analogues *
The product obtained based on single cells in accordance with the present invention constitutes
an interesting source of protein for humans as well as for animals. For human consumption, cells can be processed
in order to reduce their nucleic acid content, if
desired, although such treatment does not seem
not necessary if the product is to be used as animal feed.
EXAMPLE 1
<EMI ID = 48.1>
continued using the thermophilic mixed culture according to the present invention. In a fermenter with a capacity of 7 liters, equipped with an aerator, an agitator, a device for monitoring dissolved oxygen and means to measure and regulate the temperature and pH of the fermentation mixture,
about 500 ml of a fermentation reaction mixture from a fermentation test was introduced
previous using thermophilic mixed culture and
10 ml of methanol, this charge serving as inoculant.
<EMI ID = 49.1>
<EMI ID = 50.1>
during the course of the entire test and
the pH was adjusted to 6.2-6.35 by the addition, as needed, of an ammonium hydroxide solution. Air was introduced into the fermenter at the rate of
2 disputes / minute during the entire test. After 6 hours, substantially pure oxygen was also introduced into the fermenter at a rate of 6.5 liters per minute, then the rate of introduction of substantially pure oxygen was increased to 0.75 liters / minute afterwards.
118 hours, at 1.5 liters per minute after 174 hours and at two liters per minute after 190 hours.
After 22 hours, we changed the environment
<EMI ID = 51.1>
methanol, in addition to FM-12 medium, + 0.75 g of chloride
potassium, twice the normal micronutrient content, three times the normal manganese component content (all on a liter basis) and with sodium chloride omitted. After 166 hours, we have
changed the feed to an aqueous composition of 10% by volume of methanol, 2.5 ml of phosphoric acid (85%) per liter, 2 g of potassium chloride per liter, 1.75 g
of magnesium sulfate. 7H20 per liter, 0.25 g of calcium chloride. 21 ^ 0 per liter, 20 ml of a solution
<EMI ID = 52.1>
defined per liter.
The rate of introduction of the medium was
700 ml per hour after 22 hours, 817 ml per hour after 118 hours, 781 ml per hour after 166 hours and 763 ml per hour after
of 382 hours.
Occasionally, samples of the fermentation effluent were taken in order to recover the cells. The values obtained for cell content, expressed as dry weight of cells in grams / liter and the calculated yields are shown in Table I. Table I also shows the calculated values for productivity, expressed in grams. cells per liter per hour.
After about 126 hours, samples of the fermentation mixture were taken and prepared for lyophilization of microbial cells according to methods well known to those skilled in the art.
These lyophilized samples were then stored for subsequent use in a subsequent fermentation assay and to provide samples of HTB-53 for deposit in the department.
<EMI ID = 53.1>
Periodic samples were also taken from the fermentation mixture for the purpose of
subject them to microscopic examination in order to examine the microbial cells for their overall morphology. Such a microscopic examination revealed that the mixed culture according to the invention was composed of <EMI ID = 54.1>
Gram-negative rods: and small Gram-negative rods. The existence of large Gram-positive (non-curved) rods has also occasionally been observed, but the Applicant assumes that these were transient variants of the large Gram-positive curved rods.
TABLE I
<EMI ID = 55.1>
<EMI ID = 56.1>
of the fermenter effluent overnight at
100 [deg.] C and subtracting the weight of the mineral solids contained in 10 ml of medium.
(b) Value obtained by centrifuging a sample of
100 ml of effluent from the fermenter, resuspending the solids in distilled water and recentrifuging to collect the solids which are then dried overnight at 100 [deg.] C.
<EMI ID = 57.1>
(g / l) by the length of stay (h). EXAMPLE 2
After about 1 month, a single tube of the freeze-dried HTB-53 microbial culture obtained during the fermentation test of Example 1 mentioned above was aseptically opened by carrying out conventional methods and added thereto. content to
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
The culture flask was incubated
<EMI ID = 60.1>
24 hours, the flask showed good growth of the culture and 5 ml of the mixture thus obtained was transferred to 100 ml of the IM2 medium containing.
<EMI ID = 61.1>
Growth developed within 24 hours and a third transfer in the same medium was made to two vials, each containing 500 ml of the 1142 medium and 1.5 vol% methanol. This third <EMI ID = 62.1>
used as inoculant for a fermentation test continue in the apparatus described above in Example 1.
<EMI ID = 63.1> basis of dry weight and yield as well as productivity. The data obtained during this test are presented in Table II which follows.
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
. , '? / See notes to Table I.
<EMI ID = 66.1>
microbial culture during the fermentation test for microscopic examination, described
<EMI ID = 67.1> peries. Table IV also shows the analysis and
the amino acid content of the microbial cells recovered from another fermentation test using the mixed thermophilic culture. For comparison purposes, analysis of the amino acid content of cells obtained by the use of a thermoorganism
<EMI ID = 68.1>
philes from the initial soil sample previously described is also shown in Table IV.
TABLE III
Chemical analysis of microbial cells obtained during the
<EMI ID = 69.1>
<EMI ID = 70.1>
<EMI ID = 71.1>
TABLE IV
<EMI ID = 72.1>
thermophiles that have been grown
<EMI ID = 73.1>
<EMI ID = 74.1>