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Nouveaux dérivés de la céphalosporine et procédé de préparation Faisant l'objet de deux premières demandes de brevet déposées en SUISSE, les
21 juin 1962 et
12 octobre 1962
La présente invention est relative à un procédé
EMI1.1
de propagation da nouveaux dérivés 4-,rapetitiquement actifs de la céphalofipor-Jft-s C de formula
EMI1.2
EMI1.3
dans laquelle R représente un: reste aminc-arylique dont un groupe f'm1n"t.onc peut être lié avec le groupe Ciirboxy- Hquc '?a la chaîne lat4lc en donnant lieu à la forma- tion d'un anneau .c ;:w et de composas dans lesquels le u3.::,,;a.tc;, en piGY) 3 est., cvcc le groupe oarbo- ::;y11que en position 4. fermé en un anneau ll1ctone ainsi que des celz de ce3 crmY'5ii$.
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Le reste arylique est un reste mono- ou poly- nucléaire, par exemple un reste naphtyle, mais en parti- culier un reste phényle.Le reste arylique est substitué par un ou plusieurs groupes aminogènes, de préférence par
2 ou 3 groupes aminogènes. L'anneau peut encore présenter d'autres substituants, par exemple des groupes NO2, des atomes d'halogène, des groupes alcoyles, alcoxy ou oarbal- ooxy inférieurs.
Les sels des nouveaux composés sont soit des sels d'addition acides, soit des sels métalliques, soit des sels avec des bases organiques tertiaires azotées, par exemple avec la triéthylamine ou la N-éthyl-pipéri- dine. Les sels d'addition acides sont, par exemple, ceux avec des acides inorganiques comme les hydracides halogè- nés, par exemple l'acide chlorhydrique ou l'acide bromhy- drique, avec les acides azotique, thiocyanique, sulfuri- que, phosphorique, ou avec des acides organiques comme les acides acétique, propionique, glycolique, lactique, pyruvique, oxalique, malonique, succinique, maléique, fumarique, tartrique, citrique, benzoïque, cinnamique,
EMI2.1
salicylique, 2-phénoxy-benzolque ou 2 acétoxy-benzoique, mandélique, méthane-sulfonique, é+;ha.ne-::mJ ron14ue;
droxy- éthane-sulfonique, benzène'-stilfonlque , éthane-sulfonique, benzene-sulfonique ou tolu:ne-sul. oni.. que.. Les sels métalliques sont surtout ceux de métaux al- calins ou alcalino-terreux thérapeutiquement utilisables, comme le sodium, le potassium ou le calcium.
EMI2.2
Les nouveaux composés de la formule (I), leurs laokones et leurs sels possèdent une activité ant1bact- -'. x-.i9 v1::>à-vin ,.If; tl'l\:t,"¯1 ''. G[\r!) positif, par'exem- cI" 'is-à-v1- du Ihc:U..lus wb' 1115, du Bacterium megathe-
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rium et du Staphylococcus aureus, en particulier aussi vis- à-vis des souche pénicilline-résistantes. Ils peuvent par suite être utilisés comme médicaments en médecine hu- ' maine et vétérinaire ainsi que comme adjuvants à la nour- riture des animaux ou pour la conservation d'alimenta.
EMI3.1
Sont particulièrement intéressantes la N-(2,-diaminoph5- nyl )-cphalo.3,vrln eC ou le lactame formé à partir de , celle-ci, l'acide 7['-(3'-oxo-6'-amino-l',2', ,' tétranydro-quinoxal.n-2'-yl)-butyryl]-amino-céphalo- sporanique, et la N¯(2,4,6-triaminophényl)-oéphalosporine C et son lactame, l'acide 7-[iY-(3'-oxo-6l,8'-diamino-> l',',3','..tétrahydro-quinoxalin-2' yl)-butyrylj-amino- céphalosporanique, et leurs lactones et leurs sels.
Les nouveaux composés sont préparés suivant des méthodes connues en elles-mêmes. C'est ainsi qu'on les obtient en traitant par des agents réducteurs des dé- rivés nitro-arylés de la cephalosporine C de formule
EMI3.2
dans laquelle R1 représente un reste nitro-arylique et R2 représente de l'hydrogène ou un benzyle, ou les laoto- nes correspondantes, puis, si on le désire, en transfor- mant les composés libres obtenus en leurs lactones et/ou en leurs sels.
Des agents réducteurs sont, par exemple, l'hydro - ' gène naissant ou l'hydrogène activé catalytiquement, de préférence de l'hydrogène activé avec du charbon au palladium.
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Les substances de départ sont connues ou peuvent être préparées suivant des méthodes connues en elles-mêmes .
C'est ainsi qu'on obtient par exemple les dérivés nitro- arylés de la céphalosporine C en faisant réagir de la ce phalosporine C sur des composés nitro-aryliques présen- tant un substituant échangeable, par exemple un atome
EMI4.1
d 'halogène ou un groupe ester de l'acide toluène-sultoni- que, en particulier sur le dinitrofluorobenzne ou le tr1nttrochlorobenzène.
Les nouveaux composés peuvent être utilisés com- @ me médicaments par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques les renfermant, eux ou leurs sels, en mé- lange avec une matière de support pharmaceutique, organi- que ou inorganique, solide ou liquide, appropriée pour une application entéi-ale, parentérale ou topique. Pour la formation de cette matière de support, on envisage des substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple l'eau, la gélatine, le lactose, l'ami- don, l'alcool stéarylique, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, le propylène-glycol, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus.
Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, d'onguents, de crèmes, de capsules, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires, telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsifiants, des solubilisants ou de. sels servant à faire varier la
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pression osmotique.
Elle peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thériqetiquement précieuses. Les préparations sont obtenues suivant les méthodes usuelles,
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composes obtenue par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non-limitatifs qui suivant, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades.
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EXEMPLE 1 Dans 20 om3 d'acide acétique glacial, on dissout
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100 mg (0,172 m.mole) de N-(2,4-dlnitrophényl)-oéphalospo- rine C et hydrogène à la température ambiante et sous la
EMI6.2
pression normale en présence des 200 mg d'un charbon à 10% de palladium.
Après absorption de 25,7 om3 (740 mm/25 ) d'hy drogène au cours de 2 heures (5,9 moles d'hydrogène par mole ae substance), on débarrasse la solution réactionnel- le du catalyseur par filtration, la lave ensuite avec 100 cm3 d'acide acétique glacial et l'évapore sous un vide poussé. Le produit obtenu sous la forme d'une masse solide (66 mg, rendement: 73,5%) est soluble dans l'acide
EMI6.3
acétique glacial, le diméthylformamide, l'acide ohlorhydri- que normal et une solution normale de bicarbonate de so- dium, moins bien soluble dans le méthanol et l'eau, et in- soluble dans l'éther de pétrole, le benzène, l'acétate d'éthyle, l'acétone et l'éthanol.
Le composé est constitué
EMI6.4
par l'acide 7[y-(3'-oxo-'-amino-l',2',3',+'-tétrahydro- quinoxalin-2'-yl)-butyryl.j-amino-céphalosporanique de
EMI6.5
EMI6.6
La caractérisation a lieu par chromatographle sur . ^..L #=r et par chromatographie sn couche mince dans u ays - tt1J11e de 100 parties en VOU1re de butanol normal et de 10
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parties en volume aa:e aotique glacial, système qui est saturé d'eau. Le chromatogramme sur papier est effectua sur du papier Whatman No. 1 et le chromatogramme en couche mince sur du gel de silice G suivant Stahl.
EMI7.2
<tb>
<tb>
<tb>
Dérivé <SEP> de <SEP> la <SEP> chroma- <SEP> chroma- <SEP> Détection
<tb>
<tb> céphalosporine <SEP> C <SEP> togramme <SEP> togramme
<tb>
<tb> sur <SEP> en <SEP> couche
<tb>
<tb> papier <SEP> mince
<tb>
EMI7.3
-(2, d.nitro- l a) couleur hényl) oéphalo- R. 0,73 Rr O,PO propre
EMI7.4
<tb> sporine <SEP> C <SEP> b) <SEP> bio-auto-
<tb>
<tb> gramme
<tb>
<tb> avec <SEP> du
<tb>
<tb> Bac <SEP> il <SEP> lus <SEP>
<tb>
<tb> subtilis
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acide <SEP> 7-[-(3'-oxo- <SEP> a) <SEP> fluores-
<tb>
EMI7.5
'-amtno-l',2',', oenoe d'un '-tétrahydro- vert-bleu ulnoxalin-21-Yl)- Rf 0, 50 Rf 0,12 lors d'une butyryl]-arn1no- et excitation céphalospor'an1que Ru 0,22 avec une
EMI7.6
<tb> radiation
<tb>
<tb> de <SEP> 357 <SEP> mu
<tb>
<tb> b) <SEP> p-diméthyl-
<tb>
<tb> amino-benzal-
<tb>
<tb> déhyde
<tb>
<tb> o)
<SEP> bio-auto-
<tb>
<tb> gramme <SEP> avec
<tb> du <SEP> Bacillus
<tb>
<tb> subilis
<tb>
La détection effectuée suivant b) avec du
EMI7.7
p-diméthylamino-benzaldéhyde est effectuée en arrosant la plaque avec une solution h un pour cent Clans l'acide acétique glacial. Il apparaît aussitôt des taches jaunes à rouges sur fond blanc.
Spectre d'absorption en ultra-violet (dans l'a-
EMI7.8
aide acétique glacial) de l'acide 7''['Y-'(3'"oxo-6'-amino- <1 ' 2 ' > 3 ' , 4 - tétrahydro-quinoxalin-2 ' -yl ) -butyryl ] -araino- céphalosporanique: A Max 368 m (E 1 1% c m m 173)
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EMI8.1
et "'max 253 mu r 1 '" 223 j .
Dans un test de dilution (effectué pendant 24 heures à "IQ dans du bouillon'4glucomé), on obtient les concentration suivantes qui son encore inhibanteat pour le Staphylococcus aureua 20701 2 'Y/on!' pour le Staphylococcus aureus. 2999 * à 12 Vem3 du nouveau composé. A titre comparatif, on a les valeurs suivantes pour la céphalosporine C:
EMI8.2
pour le Staphyloccfcus aureus 2070: 60 - 100 y/om3 pour le Staphyloeoocus aureus 2999s 100 - 125 'Y/cm3.
Le nouveau composé est également actif in vivo* Sur dix souris inreot6e avec du Staphylocoooue aureua 10 (sensible à la pénicilline), huit Survivent le dixième jour de l'essai lorsqu'elles reçoivent au cours de 30 heures après l'infection, par voie sous-cutanée, cinq fois 10 mg/kg du composé. Lors de la môme application, on observe trois survivantes pour une dose envisagée de
EMI8.3
5 mg/kg. S1:.1' 01, infecte 10 sauris avec la souche 2999 qui résista à la pénicilline, toute les dix survivant alors le dixième jour lorsqu'elles reçoivent à cinq reprises 50 mg/kg du nouveau composé et huit survivent pour une donc envisage!: de 25 mg/kg.
Dans les mêmes conditions,
EMI8.4
on obtient, danJ le uac de la céphalosporPne C, les valeur suivantes pour le Staphyloco:1cuS aureus 10s pour 100 mg/kg chaque fois, 10 survivantes pour 50 mg/kg chaque fois, 7 survivantes, pour 25 mg/kg chaque fois, 3 survivantes et pour 5 mg/kg chaque fois, 1 survivante;
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pour le Staphylococcus aureus 2999= pour chaque rois lOOmg par kg, 3 survivantes; les souris non-traitées meurent toutes au plus tard le quatrième jour.
EXEMPLE 2
Dans 20 cm3 d'acide acétique glacial, on dissout 100 mg (0,1314 mole) d'ester dibenzylique de la 2,4-di-
EMI9.1
nitrophenyl-oéphilosporlne C, puis hydrogène pendant une heure et demie à 25 sous une pression de 738 mm de mer- cure, en ajoutant 200 mg d'un charbon à 10 % de palladium.
Par mole de substance, 7,3 moles de H2 sont absorbées.
On sépare le catalyseur, le lave à l'acétate d'éthyle et évapore le filtrat à sec sous un vide poussé. On obtient 57 mg d'une matière amorphe, faiblement teintée en jaune.
Specture d'absorption ultra-violet dans l'acide
EMI9.2
acétique glaai.a.a max 368 mu- (E i cm " 224) et ?1 max 252 mu- (E1 * - 242). max 1 om
Le produit réactionnel est chromatographiquement identique au produit décrit dans l'exemple 1.
Pour purifier le produit d'hydrogénation brut, on le chromatographie sur une colonne de cellulose en utilisant comme éluant un mélange de butanol et d'eau.
La celLulosc est apportée sur la colonne par sédimentation et, préalablement à l'apport de la substance, on lave et équilibre pendant 6 jours avec un mélange de butanol et d'eau (95:5), à une vitesse de traversée de 3,8 à 4,4 om3
EMI9.3
par centimtre-arré et par heure.
On dissout 7,0 g du produit d'hydrogénation dans peu d'acide acétique glacial, lyophilise en ajoutant 10 g
EMI9.4
de célite 545. DU!... tzrc,:,E: à Hce en une colonne d'une
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hauteur de couche de 120 cm et d'une section de 34 cm2.
On commence la répartition à la température ambiante avec le syctème solvant utilisé pour l'équilibrage; lavitesse do traversée est de 130 cm3 par heure.
L'éluat est recueilli en fractions de 35 cm3 sur un collecteur automatique de fractions. Après une durée d'élution de 50 heures, on inverse, à la fraction No. 189, sur 1'caution gradient. Dans ce cas, le butanol qui pénètre dans la colonne et présente une teneur en eau de 5% est constamment modifié dans une chambre de mélange de 500 cm3 par un gros apport de butanol saturé d'eau, ce qui augmente de façon continue son effet d'élution. Les fractions du chromatogramme sont diluées avec du méthanol 1 :10 et l'on contrôle l'activité biologique à l'aide de la méthode de diffusion sur du Bacillus subtilia. Les fractions peuvent aussi être contrôlées par voie colori- métrique.
A cet effet, on mélange 0,2 cm3 de la solution- test et 0,2 cm3 d'une solution à un pour cent de p-di- méthylamlno-benzaldéhyde dans l'acide acétique glacial, laisse reposer pendant 15 minutes à la température ambiante rt dilue à 3, respectivement 6 onr avec de l'acide acétique glacial. La couleur jaune-rouge de la base de
EMI10.1
Schiff formée est mesurée au opectrophotomètre à 456 mg.
Le résultat du test colorimétrique concorde avec celui du test biologique.
Parmi les fractions rassemblées en groupes sur la base de cette estimation, le groupe comprenant les frétions 349 - 370 présente l'activité antibiotique spécifique la plus élevée.
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EMI11.1
Cette mâtine possède une haute activité anti- biotique vis-à-vis d1 différents organismes-tests. C'est ainsi que dans des essais effeotués in-vitro (dans du bouillon glucose), e e. est, par rapport à la céphalosporine C, 50 tôis plus active vis-à-vis du Streptoooccus pyogenes A B ',8iJt 5 fois plu active vis-à-vis du Staphylococcus ; aur+s 11977 poly-résistent.
EMI11.2
'' ' L'ester dienzyl1que de la N-(2e4-dinitrophényl)- céphalosporine C, utilise comme matière de départ et pouvant être obtenu sous forme bien cristallisée, peut être préparé comme suit:
Dans 125 cm3 de dioxanne, on dissout 11,63 g de
EMI11.3
N¯2,4-dinitrophényl-ééphalosporine C et ajoute à 22 , en agitant pendant 25 minutes, 250 cm3 d'une solution à 2%
EMI11.4
de phenyldiazoniëthanë dans de l'éther. Lorsque l'addition .est terminée, on laisse encore reposer pendant 20 minutes et concentre ehsultelargement sous vide. Le résidu re- pris dans du chloroforme est ensuite lavé chaque fois à trois reprises avec de l'acide chlorhydrique binormal, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et avec de l'eau.
En séchant la phase organique et en évaporant, on obtient 15,54 g d'un produit brut. En malax- ant avec de l'éther,;on élimine les fractions (2,42 g) qui sont solubles dans l'éther. Les fractions non-solubles dans l'éther (12,84 g) fournissent sous forme cristalline, dans un mélange d'acétone et d'éther, 9,98 g de l'éther dibenzylique de la N-2,4-dinitrophényl-céphalosporine C.
Après recristallisation, le composé fond à 109 - 111 et 25 présente un pouvoir rotatoire spécifique [Ó] 5 + 31,5 + 1 c 1 dans le chloroforme).
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EMI12.1
EXEMPLE 3 Dans 20 em3 d'acide acétique glacial, on dissout 100 mg (0,16 m.mole) de N- ( 2,", b-trinitrophënyl j -cbphelo- sporine C et hydrogène en pr *ence de 200 mg d'un, charbon à J.0;6 de palladium. Après absorption (745 mm/300) de 26,4 cn!3 d'hydrogène, on interrompt l'hydrogénation, sé- pare le catalyseur, lave ensile avec 100 em3 d'acide acétique glacial et lyophilise la solution. Le rendement est de 46 mg. La substance est facilement soluble dans une solution normale de bicarbonate de sodium, dans l'acide
EMI12.2
chlorhydrique normal, dans le diméthyltormamide, dans l'acide acétique glacial, moins bien soluble dans le méthanol et l'éthanol, et insoluble dans l'acétone, ainsi que dans les solvants non-polaires.
Le composé est con-
EMI12.3
stitué par l'acide 7-(-(3'-oxo-6t,$'-diamino-l',2',3',4' tétrahydro-quinoxalin-2'-yl)-butyryl]-amino-céphalosporanl'- que.
La caractérisation a lieu par chromatographie sur papier dans un système (saturé d'eau) constitué par @ 100 parties en volume de butanol normal et par 10 parties en volume d'acide acétique glacial (Rf 0,15; détection bio-autographique avec du Bacillus subtilis).
Spectre d'absorption ultra-violet dans un mélange d'acide acétique glacial et d'eau (1:1):
EMI12.4
max 246 m ( L -304) 273 m (E1 cm= 268) @
EMI12.5
340 m..(Ei Jm - 164 )#
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L'activité antibiotique dans du bouillon glucose
EMI13.1
vis-a-vis de trois souches différentes de Staphylooooou8 ressort du tableau suivant:
EMI13.2
<tb> Concentration <SEP> inhibant.
<tb>
EMI13.3
Staphylococcus ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯(tig/cm3)¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ aureus acide-7-[-(3'-oxo-6', souche No. 8'-diamina-1,2',3', céphalosporine C 4'-tétrahydro-quinoxa- lin-21-yl)7utyryll- am1no-oéphalo-spora-
EMI13.4
<tb> nique
<tb>
<tb>
<tb> 2070 <SEP> 100 <SEP> 8
<tb>
<tb> 2999
<tb> (pénicilion- <SEP> 100 <SEP> 16
<tb> résistant)
<tb>
<tb> 2977
<tb> (poly-résis- <SEP> 100 <SEP> 31
<tb> tant)
<tb>
EMI13.5
La N(2,4,6-.trinitrophényl)-abphaloapar3ne C utilisée oomne matière de départ peut être préparée comme suit;
Dans 80 om3 d'une solution normale de bicarbonate de sodium et 80 cm3 de dioxanne, on dissout 4 g de céphalo- sporine C. On refroidit la solution à 0 , puis, tout en
EMI13.6
agitant, ajoute goutts-.-outte 4,2 g de chlorure de picryle dans 80 om3 de dioxanne.
On agite encore ne mé- lange pendant une nuit à la température ambiante et évapore ensuite le solvant à 25 sous un vide poussé. On dissout le résidu dans 100 cm3 d'eau et, tout en refroidissant à la glace, ajusté à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique à 10%. On sépare par filtration, à l'aide de célite 545, le précipité qui se forme, le lave à l'eau, élue avec de
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l'acétone et évapore l'éluat sous vide jusqu'à siccité. Le rendement est de 4,38 g.
Dans un appareillage de répartition à contre- courant, on répartit en 100 stades, dans un système 2:2:1 de chlorure de méthylène, de méthanol et d'eau, 1,0 g du produit brut, avec des volumes de phase de 25 om3 chaque fois. Les solutions des éléments 21 à 40 qui ont une activité antibiotique sont réunies et évaporées à sec sous un vide poussé. Le rendement est de 262 mg.
La substance est facilement soluble dans l'étha- nol, l'acétone, une solution normale de bicarbonate de sodium, soluble dans l'acétate d'éthyle et insoluble dans l'eau, l'acide chlorhydrique normal, le chloroforme, ainsi que dans les solvants moins polaires comme le benzène, par exemple.
La caractérisation a lieu par ohromatographie sur papier dans le même système que celui décrit dans l'exemple l'en utilisant la méthode de détection bio-auto- graphique sur du Bacillus subtilis (Rf 0,68).
Spectre d'absorption ultra-violet dans un mé- lange (1:1) d'acide acétique glacial et d'eau:
EMI14.1
ax S56 (* ?m 290) 332 ( -190) . 332 mIJ. 190) . EXEMPt 4 Dans 40 cm3 d'acide acétique glaciale on dissout
EMI14.2
300 mg (0,50 m.mole) de N-(2-n1tro-4-oarbométhoxy-pHenyl)- céphalosporine C et hydrogène pendant 6 heures à 300 sous une pression de 742 mm de mercure, en ajoutant 600 mg d'un charbon à 105 de palladium. fl est absorbé 97% de la
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quantité théorique d'hydrogène. On sépare le catalyseur, le lave ensuite avec 200 on,3 d'acide acétique glacial et lyophilise la solution. Le rendement est de 217 mg d'acide
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7- [7- ( 3 ' -oxo-6 ' -carbométhoxy-1 ' , 2 ' , 3 ' , 4 ' -tétrahydro- quinoxalin-2'-yl)-butyryl]-amino-oéphalosporanique.
La substance est soluble dans une solution aqueuse normale de bicarbonate de sodium, dans l'acide acétique glacial, le diméthylformamide, peu soluble dans le méthanol, l'acé- tone, et insoluble dans les solvants plus lipophiles.
Spectre d'absorption ultra-violet dans l'acide acétique glacial :
EMI15.2
Amax 257 mg (Eî m 1& )46) 313 mu (El m '- 16+) .
L'activité antibiotique de la matière de départ et du produit d'hydrogénation dans du bouillon glucosé vis-à-vis de trois souches différentes de Staphylococcus ressort du tableau qui suit :
EMI15.3
<tb> Concentration <SEP> inhibante
<tb> Staphylococcus <SEP> ( g/cm3)
<tb>
EMI15.4
aureus M N-(2-nitro-4- acide 7-[<y-(3'-oxo-
EMI15.5
<tb> souche <SEP> No.
<SEP> carbométhoxy- <SEP> 6'-carbométhoxy-
<tb>
EMI15.6
phényl)-cépha- 1,2,3l,i-tétra-
EMI15.7
<tb> losporine <SEP> C <SEP> hydro-quinoxalin-2'-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> yl)-butyryl]-amino-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> céphalosporanique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2070 <SEP> 13 <SEP> 1,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2999
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (pénicillino- <SEP> 25 <SEP> 12,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> résistant)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2977
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (polyrésistant) <SEP> -- <SEP> 25
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
Tout comme la matière de départ,
le produit d'hy- drogénation peut être décelé Par voie bio-autographique dans un chromatogramme sur du'papier Whatman No. 1 (Bac. subtilis).
EMI16.1
<tb>
Valeurs <SEP> de <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> butanol <SEP> normal <SEP> Mélange <SEP> d'acétate
<tb>
<tb> saturé <SEP> d'eau <SEP> d'éthyle, <SEP> d'acide
<tb>
<tb> acétique <SEP> glacial
<tb>
<tb> et <SEP> d'eau
<tb>
<tb> (60:20:6:11)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N-(2-nitro-4-carbo-
<tb>
EMI16.2
éthoxy-phényl)- 0,00 z
EMI16.3
<tb> céphalosporine <SEP> C
<tb>
<tb> acide <SEP> 7-[r-(3'-oxo-
<tb>
EMI16.4
t-carbométhoxy- i,2f,3t,+'..tétra- 0,25 0,51 pydro-quinoxa11n-2'- yi)-butyryll-amino-
EMI16.5
<tb> céphalosporanique
<tb>
EMI16.6
L'acide 7-[-(3-oxo-6-earbométhoxy-1,2,3tr- tétrahydro-quinoxalin-2t-yl)-butyryll-amino-céphalosporanî- que présente également in vivo une activité antibactérienne élevée.
Si l'on traite dix souris infectées avec du Staphylococcus anreus 10, dans les 30 heures après l'in- fection, à 5 reprises avec chaque fois 5m/kg du nouveau composé, deux souris survivent alors le dixième jour après l'infection. Si l'on infecte les souris avec du Staphylococcus aureus 2999 et les traite dans les mêmes conditions avec 5
EMI16.7
fois 50 mg/kg ou 25 mg/kg d'acide 7-['Y-(3'-oxo-6'-carbométhoxy- 1t,2',i,4-tétrahydro-quinoxalin-2=-yl)-butyryl]-amlno- céphalosporanique, on observe alors respectivement six sur- vivante ou une.
Les souris infectuées qui ne sont pas traitées par le composé périssent au plus tard le quatrième jour après l'infection.
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
La N-(2-nitro-4-carbométhoxy-phényl)-o'phalo- sporine C utilisée comme matière de départ peut être préparée comme suit:
Dans 30 cm3 d'une solution normale de bicarbonate de sodium et dans 5 cm3 de dioxanne, on dissout un gramme (2,07 m.moles) du sel de baryum de la céphalosporine C.
EMI17.2
Tout en agitant, on ajoute lentement goutte-à-goutte# à la température ambiante, 0,8 g de 3-nitro-4-fluoro- benzoate de méthyle dans 5 cm3 de dioxanne, puis agite pendant 15 heures à 35 . Aveo 100 om3 d'acétate d'éthyle, on lave le mélange réactionnel à trois reprises chaque fois, à un pH de 8,5 et à un pH de 5,0 (en ajoutant 5 om3 d'acide chlorhydrique à 10%). On ajuste la solution aqueuse à un pH de 2,5 avec 1,5 cm3 d'acide chlorhydrique à 10%, puis extrait à quatre reprises avec 100 cm3 chaque fois d'acétate d'éthyle, lave la solution à trois re- prises avec 20 om3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, sèohe et évapore sous vide. Le rendement est de 640 mg, soit de 54%.
Dans un appareillage de répartition à contre- oourant, on répartit en 20 stades 400 mg du produit brut dans un système (1:1) d'acétate d'éthyle et d'une solution molaire d'un tampon à l'acétate de sodium (pu 4,0), avec des volumes de phase de 10 cm3 chaque fois. On réunit les solutions des éléments 3 à 9 qui sont actives du point de vue antibiotique, ajuste à un pH de 2,5 avec de l'acide chlorhydrique à 10% extrait à quatre reprises avec la même quantité d'acétate d'éthyle, lave avec une solution de chlorure de sodium, sèche sur du sulfate de sodium et
<Desc/Clms Page number 18>
évapore le solvant.
Le rendement est de 230 mg, Cette substance est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol. l'acétone, dans une solution aqueuse normele de bicar- bonate de sodium, moins bien soluble dans le ohloroforme, l'acétate d'éthyle, l'eau, et insoluble dans le chlorure de méthylène, le benzène, l'éther de pétrole et l'acide ohlorhydrique normal.
Spectre d'absorption ultra-violet dans l'acide acétique glacial :
EMI18.1
' max 260 mw (El . 450) 285 mu (El cm . 410) 398 mu. El % . 115).
<Desc / Clms Page number 1>
New cephalosporin derivatives and preparation process The subject of the first two patent applications filed in SWITZERLAND,
June 21, 1962 and
October 12, 1962
The present invention relates to a process
EMI1.1
propagation of new 4-, short-active derivatives of cephalofipor-Jft-s C of formula
EMI1.2
EMI1.3
in which R represents an: amino-aryl residue of which a f'm1n "t group can be linked with the Ciirboxy-Hquc 'group to the lat4lc chain, giving rise to the formation of a .c ring; : w and of composas in which the u3.::,,;a.tc ;, in piGY) 3 est., cvcc the group oarbo- ::; y11que in position 4. closed in an ll1ctone ring as well as celz of ce3 crmY'5ii $.
<Desc / Clms Page number 2>
The aryl residue is a mono- or polynuclear residue, for example a naphthyl residue, but in particular a phenyl residue. The aryl residue is substituted by one or more aminogenic groups, preferably by
2 or 3 amino groups. The ring may also have other substituents, for example NO 2 groups, halogen atoms, lower alkyl, alkoxy or arbalooxy groups.
The salts of the new compounds are either acid addition salts, or metal salts or salts with nitrogenous tertiary organic bases, for example with triethylamine or N-ethyl-piperidine. The acid addition salts are, for example, those with inorganic acids such as halogenated hydracids, for example hydrochloric acid or hydrobromic acid, with nitrogen, thiocyanic, sulfuric, phosphoric acids, or with organic acids such as acetic, propionic, glycolic, lactic, pyruvic, oxalic, malonic, succinic, maleic, fumaric, tartaric, citric, benzoic, cinnamic acids,
EMI2.1
salicylic, 2-phenoxy-benzoic or 2-acetoxy-benzoic, mandelic, methanesulfonic, é +; ha.ne - :: mJ ron14ue;
droxyethanesulphonic, benzene'-stilfonlque, ethanesulphonic, benzene-sulphonic or tolu: ne-sul. Metal salts are especially those of therapeutically usable alkali or alkaline earth metals, such as sodium, potassium or calcium.
EMI2.2
The novel compounds of the formula (I), their laokones and their salts possess ant1bact- 'activity. x-.i9 v1 ::> to-wine, .If; tl'l \: t, "¯1 ''. G [\ r!) positive, for example" 'is-to-v1- from Ihc: U..lus wb' 1115, from Bacterium megathe-
<Desc / Clms Page number 3>
rium and Staphylococcus aureus, in particular also against penicillin-resistant strains. They can therefore be used as medicaments in human and veterinary medicine as well as as adjuvants in animal feed or for food preservation.
EMI3.1
Of particular interest are N- (2, -diaminoph5-nyl) -cphalo.3, vrln eC or the lactam formed therefrom, the acid 7 ['- (3'-oxo-6'-amino -l ', 2',, 'tetranydro-quinoxal.n-2'-yl) -butyryl] -amino-cephalosporanic, and N¯ (2,4,6-triaminophenyl) -oephalosporin C and its lactam, 7- [iY- (3'-oxo-6l, 8'-diamino-> 1 ',', 3 ',' .. tetrahydro-quinoxalin-2 'yl) -butyrylj-aminocephalosporanic acid, and their lactones and their salts.
The new compounds are prepared according to methods known per se. Thus they are obtained by treating with reducing agents the nitro-aryl derivatives of cephalosporin C of formula
EMI3.2
in which R1 represents a nitro-aryl residue and R2 represents hydrogen or a benzyl, or the corresponding laotons, then, if desired, by converting the free compounds obtained into their lactones and / or their salts.
Reducing agents are, for example, nascent hydrogen or catalytically activated hydrogen, preferably hydrogen activated with charcoal to palladium.
<Desc / Clms Page number 4>
The starting materials are known or can be prepared according to methods known per se.
Thus, for example, nitro-aryl derivatives of cephalosporin C are obtained by reacting this phalosporin C with nitro-aryl compounds having an exchangeable substituent, for example an atom.
EMI4.1
halogen or an ester group of toluene-sultonic acid, in particular on dinitrofluorobenzene or tr1nttrochlorobenzene.
The novel compounds can be used as medicaments, for example in the form of pharmaceutical preparations containing them or their salts, in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, solid or liquid, suitable for an entéi-ale, parenteral or topical application. For the formation of this carrier material, substances which do not react with the new compounds, such as, for example, water, gelatin, lactose, starch, stearyl alcohol, magnesium stearate, etc. are envisaged. talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums, propylene glycol, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterin or other known excipients.
The pharmaceutical preparations can be presented, for example, in the form of tablets, dragees, ointments, creams, capsules, or in liquid form in the form of solutions, suspensions or emulsions. Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances, such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solubilizers or. salts used to vary the
<Desc / Clms Page number 5>
osmotic pressure.
They may also contain still other therapeutically valuable substances. The preparations are obtained according to the usual methods,
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by the implementation of the process defined above.
The invention is described in more detail in the following non-limiting examples, in which the temperatures are indicated in degrees centigrade.
<Desc / Clms Page number 6>
EXAMPLE 1 Dissolve in 20 om3 of glacial acetic acid
EMI6.1
100 mg (0.172 m.mole) of N- (2,4-dlnitrophenyl) -oephalosporin C and hydrogen at room temperature and below
EMI6.2
normal pressure in the presence of 200 mg of a carbon containing 10% palladium.
After absorption of 25.7 m 3 (740 mm / 25) of hydrogen over 2 hours (5.9 moles of hydrogen per mole of substance), the reaction solution is freed from the catalyst by filtration, washed. then with 100 cm3 of glacial acetic acid and evaporated under a high vacuum. The product obtained in the form of a solid mass (66 mg, yield: 73.5%) is soluble in acid
EMI6.3
glacial acetic, dimethylformamide, normal hydrochloric acid and a normal solution of sodium bicarbonate, less soluble in methanol and water, and insoluble in petroleum ether, benzene, l ethyl acetate, acetone and ethanol.
The compound is made up
EMI6.4
with 7 [y- (3'-oxo -'- amino-l ', 2', 3 ', +' - tetrahydro-quinoxalin-2'-yl) -butyryl.j-amino-cephalosporanic acid of
EMI6.5
EMI6.6
The characterization takes place by chromatography on. ^ .. L # = r and by thin layer chromatography in u ays - tt1J11e of 100 parts in VOU1re normal butanol and 10
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
parts by volume aa: glacial aotic e, a system that is saturated with water. The paper chromatogram is performed on Whatman No. 1 paper and the thin layer chromatogram on silica gel G according to Stahl.
EMI7.2
<tb>
<tb>
<tb>
Derived <SEP> from <SEP> the <SEP> chroma- <SEP> chroma- <SEP> Detection
<tb>
<tb> cephalosporin <SEP> C <SEP> togram <SEP> togram
<tb>
<tb> on <SEP> in <SEP> layer
<tb>
<tb> thin <SEP> paper
<tb>
EMI7.3
- (2, d.nitro- a) color henyl) oephalo- R. 0.73 Rr O, PO clean
EMI7.4
<tb> sporin <SEP> C <SEP> b) <SEP> bio-auto-
<tb>
<tb> gram
<tb>
<tb> with <SEP> from
<tb>
<tb> Tray <SEP> he <SEP> read <SEP>
<tb>
<tb> subtilis
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acid <SEP> 7 - [- (3'-oxo- <SEP> a) <SEP> fluores-
<tb>
EMI7.5
'-amtno-l', 2 ',', oenoe of a '-tetrahydro- green-blue ulnoxalin-21-Yl) - Rf 0, 50 Rf 0.12 during a butyryl] -arn1no- and cephalospor excitation 'an1que Ru 0.22 with a
EMI7.6
<tb> radiation
<tb>
<tb> of <SEP> 357 <SEP> mu
<tb>
<tb> b) <SEP> p-dimethyl-
<tb>
<tb> amino-benzal-
<tb>
<tb> dehyde
<tb>
<tb> o)
<SEP> bio-auto-
<tb>
<tb> gram <SEP> with
<tb> of <SEP> Bacillus
<tb>
<tb> subilis
<tb>
The detection carried out according to b) with
EMI7.7
p-Dimethylamino-benzaldehyde is carried out by spraying the plate with a one percent solution in glacial acetic acid. Yellow to red spots immediately appear on a white background.
Ultra-violet absorption spectrum (in a-
EMI7.8
glacial acetic aid) of 7 '' ['Y -' (3 '"oxo-6'-amino- <1' 2 '> 3', 4 - tetrahydro-quinoxalin-2 '-yl) -butyryl] acid -araino- cephalosporanic: A Max 368 m (E 1 1% cmm 173)
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
and "'max 253 mu r 1'" 223 d.
In a dilution test (carried out for 24 hours at "IQ in 4 glucomide broth), the following concentrations are obtained which are further inhibited for Staphylococcus aureua 20701 2 'Y / on!' for Staphylococcus aureus. 2999 * at 12 Vem3 of the new compound. By way of comparison, the following values are obtained for cephalosporin C:
EMI8.2
for Staphylococcus aureus 2070: 60 - 100 y / om3 for Staphyloeoocus aureus 2999s 100 - 125 'Y / cm3.
The new compound is also active in vivo * Out of ten mice tested with Staphylocoooue aureua 10 (penicillin-sensitive), eight survive on the tenth day of the test when they receive within 30 hours after infection, via the route subcutaneously, five times 10 mg / kg of the compound. During the same application, three survivors are observed for a planned dose of
EMI8.3
5 mg / kg. S1: .1 '01, infects 10 sauris with strain 2999 which was resistant to penicillin, all ten then surviving on the tenth day when they receive five times 50 mg / kg of the new compound and eight survive for one so consider! : 25 mg / kg.
Under the same conditions,
EMI8.4
in the cephalosporPne C uac, the following values are obtained for Staphyloco: 1cuS aureus 10s for 100 mg / kg each time, 10 survivors for 50 mg / kg each time, 7 survivors for 25 mg / kg each time, 3 survivors and for 5 mg / kg each time, 1 survivor;
<Desc / Clms Page number 9>
for Staphylococcus aureus 2999 = for each kings 100 mg per kg, 3 survivors; untreated mice all die by the fourth day at the latest.
EXAMPLE 2
In 20 cm3 of glacial acetic acid, 100 mg (0.1314 mol) of dibenzyl ester of 2,4-di- are dissolved.
EMI9.1
nitrophenyl-oephilosporlne C, then hydrogen for an hour and a half at 25 under a pressure of 738 mm of mercury, adding 200 mg of a carbon containing 10% palladium.
Per mole of substance, 7.3 moles of H2 are absorbed.
The catalyst is separated, washed with ethyl acetate and the filtrate evaporated to dryness under a high vacuum. 57 mg of an amorphous material, slightly yellow tinted, are obtained.
Ultraviolet absorption specture in acid
EMI9.2
acetic glaai.a.a max 368 mu- (E i cm "224) and? 1 max 252 mu- (E1 * - 242). max 1 om
The reaction product is chromatographically identical to the product described in Example 1.
To purify the crude hydrogenation product, it is chromatographed on a cellulose column using a mixture of butanol and water as eluent.
The celLulosc is brought onto the column by sedimentation and, prior to the addition of the substance, it is washed and equilibrated for 6 days with a mixture of butanol and water (95: 5), at a flow rate of 3, 8 to 4.4 om3
EMI9.3
per square inch and per hour.
7.0 g of the hydrogenation product are dissolved in little glacial acetic acid, lyophilized by adding 10 g
EMI9.4
of celite 545. DU! ... tzrc,:, E: to Hce in a column of
<Desc / Clms Page number 10>
layer height of 120 cm and a section of 34 cm2.
The distribution is started at room temperature with the solvent system used for the equilibration; the crossing speed is 130 cm3 per hour.
The eluate is collected in 35 cm3 fractions on an automatic fraction collector. After an elution time of 50 hours, the mixture is reversed, at fraction No. 189, on the gradient precaution. In this case, the butanol which enters the column and has a water content of 5% is constantly changed in a 500 cm3 mixing chamber by a large supply of water-saturated butanol, which continuously increases its effect. elution. The fractions of the chromatogram are diluted with methanol 1:10 and the biological activity is monitored using the diffusion method on Bacillus subtilia. The fractions can also be checked colorimetrically.
For this purpose, 0.2 cm3 of the test solution and 0.2 cm3 of a one percent solution of p-dimethylamlno-benzaldehyde in glacial acetic acid are mixed, left to stand for 15 minutes at room temperature rt diluted to 3, respectively 6 ounces with glacial acetic acid. The yellow-red color of the base
EMI10.1
Schiff formed is measured with an opectrophotometer at 456 mg.
The result of the colorimetric test agrees with that of the biological test.
Of the fractions pooled into groups based on this estimate, the group comprising fretions 349 - 370 exhibited the highest specific antibiotic activity.
<Desc / Clms Page number 11>
EMI11.1
This mastine possesses a high antibiotic activity towards different test organisms. Thus, in tests carried out in vitro (in glucose broth), e e. is, relative to cephalosporin C, 50 times more active vis-à-vis Streptoooccus pyogenes A B ', 8iJt 5 times more active vis-à-vis Staphylococcus; aur + s 11977 poly-resistant.
EMI11.2
'' 'N- (2e4-dinitrophenyl) cephalosporin C dienzyl ester, used as a starting material and obtainable in well crystallized form, can be prepared as follows:
In 125 cm3 of dioxane, 11.63 g of
EMI11.3
N¯2,4-dinitrophenyl-eephalosporin C and add to 22, stirring for 25 minutes, 250 cm3 of a 2% solution
EMI11.4
of phenyldiazonethane in ether. When the addition is complete, it is left to stand for another 20 minutes and then concentrated widely in vacuo. The residue taken up in chloroform is then washed three times each time with binormal hydrochloric acid, with normal sodium bicarbonate solution and with water.
By drying the organic phase and evaporating, 15.54 g of a crude product are obtained. By mixing with ether, the fractions (2.42 g) which are soluble in ether are removed. The non-soluble fractions in ether (12.84 g) give in crystalline form, in a mixture of acetone and ether, 9.98 g of the dibenzyl ether of N-2,4-dinitrophenyl- cephalosporin C.
After recrystallization, the compound melts at 109 - 111 and 25 exhibits a specific optical rotation [Ó] 5 + 31.5 + 1 c 1 in chloroform).
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
EXAMPLE 3 In 20 em3 of glacial acetic acid, 100 mg (0.16 mmol) of N- (2, ", b-trinitrophenyl j -bphelosporin C and hydrogen are dissolved in the presence of 200 mg of 'A carbon at J.0; 6 of palladium After absorption (745 mm / 300) of 26.4 cn! 3 of hydrogen, the hydrogenation is interrupted, the catalyst is separated, washed with 100 em3 d. glacial acetic acid and lyophilizes the solution. The yield is 46 mg. The substance is easily soluble in normal sodium bicarbonate solution, in acid
EMI12.2
normal hydrochloric acid, in dimethyltormamide, in glacial acetic acid, less soluble in methanol and ethanol, and insoluble in acetone, as well as in non-polar solvents.
The compound is con-
EMI12.3
stituted by 7 - (- (3'-oxo-6t, $ '- diamino-l', 2 ', 3', 4 'tetrahydro-quinoxalin-2'-yl) -butyryl] -amino-cephalosporanl' acid - than.
The characterization takes place by chromatography on paper in a system (saturated with water) consisting of @ 100 parts by volume of normal butanol and 10 parts by volume of glacial acetic acid (Rf 0.15; bio-autographic detection with Bacillus subtilis).
Ultraviolet absorption spectrum in a mixture of glacial acetic acid and water (1: 1):
EMI12.4
max 246 m (L -304) 273 m (E1 cm = 268) @
EMI12.5
340 m .. (Ei Jm - 164) #
<Desc / Clms Page number 13>
Antibiotic activity in glucose broth
EMI13.1
with respect to three different strains of Staphylooooou8 emerges from the following table:
EMI13.2
<tb> Concentration <SEP> inhibiting.
<tb>
EMI13.3
Staphylococcus ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ (tig / cm3) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ aureus acid-7 - [- (3'-oxo-6 ', strain No. 8'-diamina -1,2 ', 3', cephalosporin C 4'-tetrahydro-quinoxalin-21-yl) 7utyryll- am1no-oéphalo-spora-
EMI13.4
<tb> picnic
<tb>
<tb>
<tb> 2070 <SEP> 100 <SEP> 8
<tb>
<tb> 2999
<tb> (penicilion- <SEP> 100 <SEP> 16
<tb> resistant)
<tb>
<tb> 2977
<tb> (poly-resis- <SEP> 100 <SEP> 31
<tb> so much)
<tb>
EMI13.5
The N (2,4,6-.trinitrophenyl) -abphaloapar3ne C used as a starting material can be prepared as follows;
In 80 om3 of a normal solution of sodium bicarbonate and 80 cm3 of dioxane, 4 g of cephalosporin C are dissolved. The solution is cooled to 0, then, while
EMI13.6
while stirring, add drop-out 4.2 g of picryl chloride in 80 µm3 of dioxane.
The mixture is further stirred overnight at room temperature and the solvent then evaporated to a high vacuum. The residue is dissolved in 100 cm3 of water and, while cooling in ice, adjusted to pH 2 with 10% hydrochloric acid. The precipitate which forms is separated by filtration using Celite 545, washed with water and eluted with
<Desc / Clms Page number 14>
acetone and evaporate the eluate in vacuo to dryness. The yield is 4.38 g.
In a countercurrent distribution apparatus, 1.0 g of the crude product is distributed in 100 stages, in a 2: 2: 1 system of methylene chloride, methanol and water, with phase volumes of 25 om3 each time. The solutions of items 21 to 40 which have antibiotic activity are combined and evaporated to dryness under a high vacuum. The yield is 262 mg.
The substance is readily soluble in ethanol, acetone, normal sodium bicarbonate solution, soluble in ethyl acetate and insoluble in water, normal hydrochloric acid, chloroform, as well as in less polar solvents like benzene, for example.
The characterization takes place by ohromatography on paper in the same system as that described in the example using the bio-autographic detection method on Bacillus subtilis (Rf 0.68).
Ultraviolet absorption spectrum in a mixture (1: 1) of glacial acetic acid and water:
EMI14.1
ax S56 (*? m 290) 332 (-190). 332 mIJ. 190). EXEMPt 4 In 40 cm3 of glacial acetic acid is dissolved
EMI14.2
300 mg (0.50 m.mole) of N- (2-n1tro-4-oarbomethoxy-pHenyl) - cephalosporin C and hydrogen for 6 hours at 300 under a pressure of 742 mm of mercury, adding 600 mg of a 105 palladium charcoal. fl is absorbed 97% of the
<Desc / Clms Page number 15>
theoretical amount of hydrogen. The catalyst is separated, then washed with 200 ounces of glacial acetic acid and the solution freeze-dried. The yield is 217 mg of acid
EMI15.1
7- [7- (3 '-oxo-6' -carbomethoxy-1 ', 2', 3 ', 4' -tetrahydro-quinoxalin-2'-yl) -butyryl] -amino-oephalosporan.
The substance is soluble in normal aqueous sodium bicarbonate solution, in glacial acetic acid, dimethylformamide, sparingly soluble in methanol, acetone, and insoluble in more lipophilic solvents.
Ultraviolet absorption spectrum in glacial acetic acid:
EMI15.2
Amax 257 mg (Eî m 1 &) 46) 313 mu (El m '- 16+).
The antibiotic activity of the starting material and the hydrogenation product in glucose broth against three different strains of Staphylococcus can be seen from the following table:
EMI15.3
<tb> Inhibiting <SEP> concentration
<tb> Staphylococcus <SEP> (g / cm3)
<tb>
EMI15.4
aureus M N- (2-nitro-4- acid 7 - [<y- (3'-oxo-
EMI15.5
<tb> strain <SEP> No.
<SEP> carbomethoxy- <SEP> 6'-carbomethoxy-
<tb>
EMI15.6
phenyl) -cepha- 1,2,3l, i-tetra-
EMI15.7
<tb> losporin <SEP> C <SEP> hydro-quinoxalin-2'-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> yl) -butyryl] -amino-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cephalosporanic
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2070 <SEP> 13 <SEP> 1.6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2999
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (penicillino- <SEP> 25 <SEP> 12.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> resistant)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2977
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (polyresistant) <SEP> - <SEP> 25
<tb>
<Desc / Clms Page number 16>
Just like the starting material,
the hydrogenation product can be detected bioautographically in a chromatogram on Whatman No. 1 paper (Bac. subtilis).
EMI16.1
<tb>
<SEP> values of <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> butanol <SEP> normal <SEP> Mixture <SEP> of acetate
<tb>
<tb> saturated <SEP> with water <SEP> with ethyl, <SEP> with acid
<tb>
<tb> acetic <SEP> glacial
<tb>
<tb> and <SEP> of water
<tb>
<tb> (60: 20: 6: 11)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N- (2-nitro-4-carbo-
<tb>
EMI16.2
ethoxy-phenyl) - 0.00 z
EMI16.3
<tb> cephalosporin <SEP> C
<tb>
<tb> acid <SEP> 7- [r- (3'-oxo-
<tb>
EMI16.4
t-carbomethoxy- i, 2f, 3t, + '.. tetra- 0.25 0.51 pydro-quinoxa11n-2'- yi) -butyryll-amino-
EMI16.5
<tb> cephalosporanic
<tb>
EMI16.6
7 - [- (3-oxo-6-earbomethoxy-1,2,3tr-tetrahydro-quinoxalin-2t-yl) -butyryll-amino-cephalosporanic acid also exhibits high antibacterial activity in vivo.
If ten infected mice are treated with Staphylococcus anreus 10 within 30 hours of infection, 5 times each time with 5m / kg of the new compound, two mice then survive on the tenth day after infection. If the mice are infected with Staphylococcus aureus 2999 and treated under the same conditions with 5
EMI16.7
times 50 mg / kg or 25 mg / kg of 7 - ['Y- (3'-oxo-6'-carbomethoxy- 1t, 2', i, 4-tetrahydro-quinoxalin-2 = -yl) -butyryl ] -amlno- cephalosporanic, we then observe respectively six survivors or one.
Infected mice which are not treated with the compound perish no later than the fourth day after infection.
<Desc / Clms Page number 17>
EMI17.1
N- (2-nitro-4-carbomethoxy-phenyl) -o'phalosporin C used as starting material can be prepared as follows:
In 30 cm3 of a normal sodium bicarbonate solution and in 5 cm3 of dioxane, one gram (2.07 m.moles) of the barium salt of cephalosporin C.
EMI17.2
While stirring, 0.8 g of methyl 3-nitro-4-fluorobenzoate in 5 cm3 of dioxane is slowly added dropwise at room temperature, followed by stirring for 15 hours at 35. Aveo 100 µm3 of ethyl acetate, the reaction mixture is washed three times each time, at pH 8.5 and pH 5.0 (adding 5 µm3 of 10% hydrochloric acid). The aqueous solution is adjusted to a pH of 2.5 with 1.5 cm3 of 10% hydrochloric acid, then extracted four times with 100 cm3 each time of ethyl acetate, the solution washed three times. with 20 om3 of a saturated solution of sodium chloride, dry and evaporate in vacuo. The yield is 640 mg, or 54%.
In a counter-current distribution apparatus, 400 mg of the crude product is distributed in 20 stages in a system (1: 1) of ethyl acetate and a molar solution of a sodium acetate buffer. (pu 4.0), with phase volumes of 10 cm3 each time. The solutions of elements 3 to 9 which are antibiotically active are combined, adjusted to a pH of 2.5 with 10% hydrochloric acid extracted four times with the same amount of ethyl acetate, washed with sodium chloride solution, dried over sodium sulfate and
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the solvent evaporates.
The yield is 230 mg. This substance is easily soluble in methanol, ethanol. acetone, in a standard aqueous solution of sodium bicarbonate, less soluble in ohloroform, ethyl acetate, water, and insoluble in methylene chloride, benzene, petroleum ether and normal hydrochloric acid.
Ultraviolet absorption spectrum in glacial acetic acid:
EMI18.1
'max 260 mw (El. 450) 285 mu (El cm. 410) 398 mu. El%. 115).