<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne la préparation de la 1-lysine, un amino acide essentiel.
Un certain nombre d'aliments, en particulier ceux contenant des grai- nes de céréales, ou des produits en dérivant, manquent de l'amino-acide essen- tiel, la 1-lysine. Les amino-acides essentiels sont ceux qui sont nécessaires aux animaux pour leur maintien et leur croissance. Le corps animal n'est pas capable de synthétiser les amino-acides nécessaires à la formation de la proté- ine animale. Il y a un grand nombre d'amino-acides essentiels, et, par chance, la plus grande partie de la matière protéinique est faite d'un équilibre de ceux-ci de sorte que quand cette protéine est consommée, on dispose d'une alimen- tation suffisante en amino-acides appropriés après la digestion pour reconstitu- er la matière protéinique nécessaire pour la croissance des animaux.
Bien que la plus grande partie de la matière protéinique d'origine animale contienne un équilibre adéquat d'amino-acides essentiels, et bien que certaines matières protéiniques d'origine végétale conviennent à la croissance appropriée des ani- maux, un grand nombre de produits alimentaires manquent de la protéine qui don- nerait tous les amino-acides essentiels. Ceci est particulièrement le cas des protéines dérivés des graines de céréales telles que le riz, l'avoine, et le mais. Récemment, il est apparu que de nombreux aliments consommés par les ani- maux, y compris l'homme, ont besoin d'être complétés par la 1-lysine en vue de donner un équilibre approprié des amino-acides essentiels pour que ces aliments soient plus efficaces pour l'entretien et la croissance du corps animal.
Bien que l'on puisse préparer synthétiquement et par des processus de fermentation de bactéries la 1-lysine, ces procédés sont très coûteux et tendent à limiter l'emploi de la lysine comme complément alimentaire. Il était donc désirable de mettre au point un procédé bon marché de préparation de la 1- lysine sous une forme convenant à l'addition à la nourriture des animaux. La présente invention fournit un tel procédé.
Le procédé selon l'invention de préparation de la 1-lysine
EMI1.1
consiste à soumettre à l'action des enzymes de la levure un acide organique choisi dans le groupe constitué par
EMI1.2
0 0 (I) acide 5-formYl-2-oxovalérique CHOH2GH2CH2COOOH NE2 (Il) acide alpha-aminoadipique OOOHCH2CHCOOH 0 Il (III) acide alpha-cétoadipique 000HOH2CH2cH20COOH
Bien que 1 on sache que l'on peut préparer la 1-lysine par certains micro-organismes en utilisant certains précurseurs particuliers tels que l'acide diaminopimélique, on pense que l'on n'avait encore jamais découvert que les enzymes de la levure ont la propriété de transformer les acides organiques pré- cités en 1-lysine en quantités de loin supérieures à celles nécessaires à la cellule de la levure pour sa teneur en protéine.
En d'autres termes, on peut extraire la 1-lysine du milieu aqueux nutritif dans lequel croissent les cellu- les aussi bien que des cellules de levure sans qu'il soit nécessaire d'hydrolyser la protéine de la levure pour libérer la 1-lysine. La quantité de 1-lysine pro- duite peut être très élevée et comme les acides organiques précités peuvent être facilement synthétisés en quantités illimités et à bas prix, ce nouveau procédé donne un moyen d'obtention de la 1-lysine à bon marché et en quantités illimitées.
<Desc/Clms Page number 2>
Un des très importants avantages de l'invention découle du fait que l'on a fait croître de la levure à l'échelle industrielle depuis de nombreuses années comme source de nourriture animale. Il n'est donc pas nécessaire de mettre au point aucune nouvelle technique ou appareillage pour obtenir la 1-lysine sous une forme comestible. Si on le désire, on peut simplement ajouter la totalité de la liqueur de fermentation résultant du développement de cellules de levure dans un milieu contenant de l'acide 5-formyl -2-oxovalérique à des aliments pour animaux, sans.aucun traitement quel qu'il soit pour accroître la valeur nutritive de ces nourritures grâce aux quantités relativement grandes de lysine contenues dans toute la masse de fermentation.
Cette masse de fermentation peut être séchée et emballée et envoyée n'importe où, où elle est nécessaire. Selon une variante, on peut séparer de la masse les cellules de levure, les laver et les sécher et les utiliser partout où des cellules de levure seront utilisées comme complément alimentaire. La nouvelle levure obtenue par le procédé de l'invention est particulièrement efficace de ce point de vue car au lieu de ne contenir que 3 à 4 % de 1-lysine dont la plus grande partie est liée sous forme protéinique, les nouvelles cellules de levure préparées par le procédé qui sera décrit ci-après, peuvent contenir jusqu'à 20 % de 1-lysine, dont la plus grande partie sous forme de lysine libre.
Naturellement, si on le désire, on peut traiter les cellules de levure de la présente invention pour en libérer la teneur en lysine et en récupérer la 1-lysine libre sous forme pratiquement pure dans.les cas où l'on a besoin de lysine essentiellement pure.
Bien qu'un mode de mise en pratique préféré de l'invention consiste à ajouter un des acides organiques précités à une fermentation de levure et à lui permettre de se transformer en 1-lysine par les enzymes de la levure simul- tanément à la production de nouvelles cellules de levure, ces enzymes contenues dans les cellules de levure au repos peuvent également transformer ce précur- seur en 1-lysine. Tout ce qui est nécessaire dans cette réalisation de l'inven- tion est de mélanger cet acide organique avec des cellules de levure dans une suspension aqueuse et laisser les enzymes contenues dans les cellules de levure effectuer la conversion, de préférence en agitant et en aérant le mélange.
Cette conversion par les cellules au repos de levure intervient sur un inter- valle de pH de 2,5 à 8,5, de préférence de 3,0 à 5,0 et sur un large interval- le de température, par exemple de 5 à 50 . Une conversion notable est obtenue en 24 h à température ambiante bien que la période de temps puisse aller d'aussi peu qu'une heure à 48 h ou plus selon le pH, la température, le taux d'aération, l'agitation et autres facteurs.
Un autre mode de réalisation de l'invention, qui ne serait normale- mentpas utilisé dans la fabrication industrielle de la lysine consiste à rompre les cellules de la levure par des moyens physiques ou chimiques pour libérer les enzymes qu'elles contiennent et à ajouter l'un des acides organiques précités, ,de telle sorte qu'il soit converti en la 1-lysine désirée par les enzymes en solution.
Bien qu'il ait été indiqué ci-dessus que les acides organiques préci- tés sont convertis en 1-lysine par l'action des enzymes de la levure, on notera que le mécanisme de la conversion n'est pas connu avec certitude. En fait, il est possible qu'un mécanisme autre que l'action enzymatique intervienne. Sur la base de l'expérience cependant, il apparaît que la conversion résulte des enzy- mes, mais par plus d'une étape et probablement plusieurs. Il est bien entendu par conséquent que la présente invention n'est liée à aucune théorie. Le fait est que les acides organiques précités sont convertis en 1-lysine par biosyn- thèse avec un excellent rendement sous l'action des cellules de levure.
On com- prendra mieux l'invention grâce à la description suivante se référant aux exem- ples suivants.
<Desc/Clms Page number 3>
EXEMPLE 1 On prépare un milieu synthétique avec les composants suivants :
EMI3.1
<tb> Ingrédient <SEP> Milieu <SEP> synthétique
<tb>
<tb> puissance <SEP> finale <SEP> du <SEP> milieu <SEP> en <SEP> g/1
<tb> dextrose <SEP> 50
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,3
<tb> MgSO4 <SEP> 0,1
<tb> acide <SEP> aspartique <SEP> 0,2
<tb> acide <SEP> glutamique <SEP> 0,2
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 3,8
<tb> tampon <SEP> au <SEP> citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> * <SEP> 50 <SEP> cc
<tb> solution <SEP> vitaminée <SEP> ** <SEP> 10 <SEP> cc
<tb> eau <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
* tampon au citrate de sodium 100 g citrate de sodium
20 g acide citrique eau pour 1 litre
EMI3.2
<tb> ** <SEP> solution <SEP> vitaminée <SEP> Thiamine <SEP> 20,
0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> biotine <SEP> 0,2 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pyridoxine <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> inositol <SEP> 200,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acide <SEP> nicotinique <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> pour <SEP> 40 <SEP> cc
<tb>
On place dans des récipients de fermentation des portions du milieu synthétique cités et on les stérilise. A certaines,, on ajoute en conditions aseptiques des proportions variables d'acide 5-formyl-2-oxovalérique comme in- diqué au tableau ci-dessous. D'autres servent de contrôle.
On inocule les réci- pients de fermentation au moyen de cultures de 24 à 28 h de cellules de levure en cours de croissance. Les souches de levure Y-80 et Y-416 du tableau sont du Saccharomyces cereviseae. Les souches Y-3 et Y-4 sont des espèces non modifiées de Saccharomyces. On fait incuber les récipients de fermentation pendant 72 h à environ 24 dans une secoueuse à va-et-vient. Au bout de la période de fermen- tation, on passe à la vapeur le contenu des récipients pour rompre les cellules de levure et libérer la 1-lysine libre qu'elles contiennent.
On centrifuge la liqueur fermentée et on analyse la teneur de la liqueur surnageante en 1-lysine par une méthode microbiologique décrite par Steel et al. dans Journal of Biolo- gical Chemistry, 177, page 533, (1949)e Les résultats de cette série de fermen- tation sont indiqués au tableau ci-dessous.
TABLEAU I
EMI3.3
<tb> SOUCHE <SEP> DE <SEP> LEVURE
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> organique <SEP> Y-80 <SEP> Y-3 <SEP> Y-4 <SEP> Y-146
<tb>
<tb>
<tb> [gamma]/cc <SEP> 1-lysine <SEP> [gamma]/cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aucun <SEP> 42 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> -- <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> 68- <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 250 <SEP> -- <SEP> 29 <SEP> 22 <SEP> 62
<tb>
<tb>
<tb> 500 <SEP> 190 <SEP> 40 <SEP> 34 <SEP> 80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1500 <SEP> 136 <SEP> - <SEP> -- <SEP> --
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
Les résultats ci-dessus montrent que les enzymes de la levure sont capables de transformer l'acide 5-formyl-2-oxovalérique en 1-lysine.
On a utilisé un milieu synthétique pour illustrer cette propriété en raison du fait que les milieux contenant des substances naturelles contiennent un grand nombre de composants différents, dont plusieurs servent de précurseurs de lysine. Quand on prépare la 1-lysine sur une base commerciale avec l'acide 5-formyl-2-oxovalérique comme précurseur, la pratique préférée serait d'ajouter à une certaine quantité du milieu de fermentation une quantité de précurseur allant jusqu'à 2 % environ en poids et à laisser la fermentation se dérouler de manière normale. Toute fer- mentation de levure convenable utilisée pour la production de cellules de levu- re sur une base commerciale peut être utilisée.
Un des procédés les plus désira- bles emploie la levure Torulopsis utilis avec un milieu de fermentation carac- térisé par l'emploi de liqueur sulfitée résiduelle. Ce procédé a été décrit dans de nombreuses publications et des détails n'en sont pas nécessaires. La seule modification nécessaire pour accroître la teneur en 1-lysine libre des cellules de levure résultantes consiste à ajouter l'acide 5-formyl-2-oxovalérique au moins 1 heure avant la récolte des cellules. Il est bien entendu naturellement que les cellules de levure des familles Endomycetaceae et Cryptococcaceae et celles qui leur sont apparentées contiennent également des enzymes capables de convertir l'acide 5-formyl-2-oxovalérique en 1-lysine.
Ces cellules de levure, au moment de leur récolte, peuvent être mélangées avec des nourritures pour ani- maux de diverses sortes pour en accroître la teneur en lysine et rendre ces nourritures plus efficaces nutritivement pour l'homme et les animaux.
EXEMPLE 2
On place des portions du milieu synthétique décrit à l'exemple 1 dans des récipients en verre, certains contenant de plus diverses quantités d'aci- de alpha-amino-adipique (désigné également ici par AAA). Ces récipients de fermentation sont bouchés avec du coton et stérilisés à l'autoclave pendant 15 mm sous 1,05 kg/cm2 de pression de vapeur. On met en suspension des cultures en tube oblique sur malt-agar-agar, apportant des cultures de 24 à 28 h de cellules de levure en cours de croissance, dans 10 cc de solution saline physiologique stérile. On utilise cette suspension pour inoculer les récipients stériles que l'on fait alors incuber pendant 72 h à environ 24 sur un secoueur à va-et-vient.
Au bout de la période de fermentation, on passe à la vapeur la liqueur fermentée pendant 10 mm dans un autoclave ouvert pour interrompre la fermentation et li- bérer la 1-lysine libre des cellules. On centrifuge le liquide, on recueille la liqueur qui surnage et on analyse sa teneur en 1-lysine par la méthode indiquée à l'exemple 1,.Le résultat de cette série de fermentation est indiqué au tableau ci-dessous.
On prépare une autre série de récipients de fermentation contenant un milieu composé de 50 g de dextrose, 3,8 g de sulfate d'ammonium et 50 cc de liqueur de macération de mais (50 % de solides à sec) par litre et ajusté à pH 5,3 par l'acide phosphorique et on conduit des fermentations de la même manière.
Les résultats sont également indiqués au tableau suivant. La désignation CSL désigne le milieu liquide de macération de mais décrit ci-dessus et SYN désigne le milieu synthétique.
<Desc/Clms Page number 5>
TABLEAU'.11
EMI5.1
rrr¯rry""yr--rwwr-r¯¯¯-------------------..wrrn-----------y-----------
EMI5.2
<tb> Levure <SEP> milieu <SEP> dl-AAA <SEP> 1-lysine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> mg/cc
<tb>
EMI5.3
----------------------------------------------- r-------------
EMI5.4
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
EMI5.5
firme "Red Star Bakers" CSL aucun 0,20
EMI5.6
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5,0 <SEP> 1,15
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
EMI5.7
firme "Fleischmann's Bakers" CSL aucun oe22
EMI5.8
<tb> CSL <SEP> 5,0 <SEP> 1,3
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> Y-17 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,14
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 2,0 <SEP> 0,50
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 10,0 <SEP> 2,
71
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> Y-87 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,19
<tb>
EMI5.9
"" CSL- 2, 0 . 0, 75
EMI5.10
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 10,0 <SEP> 2,66
<tb>
EMI5.11
Saccharomyces tour-n3ér CSL aucun 0,06 Ti CSL leo 0,15
EMI5.12
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 3,0 <SEP> 0,30
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> Y-9 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,22
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 2,0 <SEP> 0,58
<tb> '" <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 10,0 <SEP> 3,12
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> ellipsoideus <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,010
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1,0 <SEP> 0,027
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> thermantitonium <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,004
<tb>
EMI5.13
SYN leo 03014
EMI5.14
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Y-900 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,48
<tb>
EMI5.15
" " " CSL 5,0 1,
75
EMI5.16
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Y-1082 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,39
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5,0 <SEP> 1,26
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> cremoris <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,07
<tb>
EMI5.17
" " 0 SYN 2, 0 0,49
EMI5.18
<tb> Torulopsis <SEP> s <SEP> haerica <SEP> SYN <SEP> ,aucun <SEP> 0,04
<tb> SYN <SEP> 2,0 <SEP> 0,19
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> pulcherrima <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,06
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 2,0 <SEP> 0,35
<tb>
<tb> Candida <SEP> tenius <SEP> SYN <SEP> aucun, <SEP> 0,04
<tb> " <SEP> SYN <SEP> 1,0 <SEP> 0,11
<tb>
<tb> Kloeckeria <SEP> brevis <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,009
<tb>
EMI5.19
-' SYN 1,0 ' 0, 021
<Desc/Clms Page number 6>
EXEMPLE 3
On prépare et on stérilise un milieu de fermentation contenant 0,4 % d'extrait de levure, 0,4 % de glucose,
1,0 % d'extrait de malt et de l'eau. A un groupe de ballons de fermentation, on ajoute suffisamment d'acide alpha-amino- adipique pour représenter 5 mg ce de milieu. On inocule alors les ballons par des cultures de cellules de levure en croissance et on laisse croître dans le milieu pendant 72 h avec agitation constante à 24 . Au bout de ce temps, on chauffe le contenu du ballon pour interrompre la fermentation et rompre les cel- lules de levure et en libérer la lysine libre.
On examine ensuite la liqueur surnageante pour en évaluer la teneur en 1-lysine avec les résultats suivants :
TABLEAU III A
EMI6.1
<tb> Levure <SEP> pas <SEP> de <SEP> AAA
<tb> précurseur <SEP> 5 <SEP> mg/cc
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> (non <SEP> identifiée) <SEP> 119 <SEP> 190
<tb>
EMI6.2
Eremasca.s fertilis 180 279 Nematospora pehaseo3,.
70 214 Endomycopsis fibulier 63 356 Saocharonorcodes ludmi 11 52 278 Eanseniospora valbyensis 199 220 8chiosaccharamyc.es pombe 143 463
EMI6.3
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidemtalis <SEP> 57 <SEP> 542
<tb>
<tb> Debaryomyces <SEP> menbranefaciens <SEP> 210 <SEP> 278
<tb>
<tb> Lipomyces <SEP> starkeii <SEP> 204 <SEP> 254
<tb>
Dans une démonstration semblable de l'aptitude des cellules de levure à convertir l'acide alpha-amino-adipique en 1-lysine , on prépare un milieu à 2 % de mélasses, 3 % d'extrait de malt, et de l'eau. A une série de ballons de fermentation, on ajoute de l'acide alpha-amino-adipique à raison de 5 mg par litre de milieu.
On conduit la fermentation comme ci-dessus, on analyse la liqueur surnageante pour sa teneur en 1-lysine, avec les résultats suivants :
TABLEAU III B.
EMI6.4
<tb>
Levure <SEP> Pas <SEP> de <SEP> AAA
<tb> précurseur <SEP> mg/cc
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> 58- <SEP> 74
<tb>
EMI6.5
Endomycopsis fibrzliger 43 253 Saccharomycodes 1 . ii 62 292 Hanse1!liospora valbyenses 145 292 Schizosacchar6e pombe 58 414 Schwaai.omyces occ;Í}d.entalis 60 369 Debaryomyces membruefacie1!lB 67 76
En plus des espèces précédentes, on a trouvé qualitativement que l'acide alpha-amiao-adipique peut être transformé en lysine par les levures suivantes.
Saccharomyces pastorianus ,Saccharomyces exigius
Saccharomyces ilicis
Saccharomyces monacensis
Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces albus
<Desc/Clms Page number 7>
Saccharomyces sake
Saccharomyces turbidans
Saccharomyces fragilis
Saccharomyces chodati
Saccharomyces aromaticus
Saccharomyces lactis
Saccharomyces behrensianus
Saccharomyces spiritus-vini
Torulopsis lactis
Zygosaccharomyces fragilis
Candida rugosa
Candida flareri
Candida lipolytica
Candida pulcherrima
Candida reukaufi
Candida tenuis Nematospora phaseoli
Sporobolomyces sp.
Dematium sp.
En plus de ces levures particulières, un grand nombre de levures non identifiées sont également capables de convertir l'acide alpha-amino-adipique en 1-lysine. De ces résultats, il apparaît que pratiquement toutes les levures ont cette capacité d'effectuer cette conversion dans des conditions favorables.
EXEMPLE 4
Les exemples précédents 2 et 3 illustrent la conversion de l'acide alpha-amino-adipique en 1-lysine par un grand nombre d'espèces différentes de cellules de levure des familles Endomycetaceae et Cryptococcaceae, tandis qu' elles sont en cours de croissance dans un milieu nutritif. Des études supplé- mentaires montrent que l'acide alpha-amino-adipique peut être transformé en 1-lysine par des cellules au repos sans qu'il soit nécessaire d'ajouter l'acide d'alpha-amino-adipique aux cellules en cours de fermentation.
Dans une telle expérience, on a fait croître une espèce de Saccharo- myces Y-9 dans un milieu nutritif convenable, on a recueilli les cellules de levure par centrifugation, on les a lavé deux fois à l'eau distillée et finalement, on les a mis en suspension dans un tampon au citrate 0,1 M à un pH de 5,2, la suspension contenant 5 % en poids (à sec) de cellules de levure. A chacun d'une série de béchers, on a ajouté 10 mg de sulfate d'ammonium, 50 mg de glucose, 0,3 mg de pyridoxal et une quantité de cellules de levure en suspension comme préparées ci-dessus. A certains des béchers, on a également ajouté 5 mg d'acide dl-alpha-amino-adipique et on a complété le volume à 3 cc avec de l'eau et on a ajusté le pH à 5,2 avec le tampon au citrate.
On a alors placé les béchers sur une secoueuse, et on a incubé à 30 en secouant. On a prélevé les échantil- lons au bout de 30 mn et de 3 h, on les a dilué à 3 cc avec de l'eau et on les a passé à la vapeur pendant 10 mn pour interrompre la fermentation et rompre les cellules de levure pour libérer la 1-lysine libre. On a alors centrifugé le liquide et déterminé la teneur en 1-lysine par essai micro biologique.
Les résul- tats de cette série de démonstrations sont indiqués au tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 8>
TABLEAU IV
EMI8.1
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> dl-AAA <SEP> Temps <SEP> d'in- <SEP> lysine
<tb> Ballon <SEP> levure <SEP> (poids <SEP> mg/ballon <SEP> cubation <SEP> Y/ballon
<tb> à <SEP> sec) <SEP> (h)
<tb>
<tb> 1 <SEP> 16,8 <SEP> - <SEP> 0,5 <SEP> 85
<tb> 2 <SEP> 16,8 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 260
<tb> 3 <SEP> 50,4 <SEP> - <SEP> 0,5 <SEP> 285
<tb> 4 <SEP> 50,4 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 820
<tb> 5 <SEP> 16,8 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 865
<tb> 6 <SEP> 50,4 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 1005
<tb>
EXEMPLE 5
Dans d'autres expériences ,
on a montré que l'addition du précurseur n'augmente pas notablement le nombre ou le poids des cellules de levure qui se forment dans une fermentation donnée pas plus que la présence du précurseur n'accroît notablement la teneur en 1-lysine de la protéine de la cellule de levure. D'autre part, le précurseur augmente considérablement la présence de lysine libre dans la cellule de levure ainsi que dans le milieu de fermentation en dehors des cellulesde levure.
Dans une telle expérience, on fait fermenter 15 ce du milieu de fer- mentation à la liqueur de macération de mais décrit à l'exemple 1, avec une culture de Saccharomyces Y-9 comme utilisée précédemment. Certains des ballons contiennent 2 mg/cc d'acide dl-amino-adipique, d'autres contiennent 10 mg/cc d'acide amino-adipique et d'autres ne contiennent aucun précurseur. On laisse les cellules de levure provoquer la fermentation aérobie de ce milieu à tempéra- ture ambiante sur une secoueuse à va-et-vient. On prélève des échantillons des ballons après des périodes de 24,48 et 72 h. On examine la teneur en 1-lysine de la liqueur surnageante. On passe la liqueur de fermentation et les cellules de levure à la vapeur pour libérer la lysine libre des cellules, et on analyse la teneur en 1-lysine libre de la liqueur surnageante.
Les résultats de cette série d'expériences sont donnés au tableau ci-dessous.
TABLEAU V
EMI8.2
<tb> Lysine <SEP> [gamma]/Ml.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Temps <SEP> d'incubation, <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dl-AAA <SEP> 24 <SEP> extra- <SEP> 48 <SEP> extra- <SEP> 72 <SEP> extra-
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> Total <SEP> Cellulaire <SEP> Total <SEP> Cellulaire <SEP> Total <SEP> Cellulaire
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aucun <SEP> 96 <SEP> 48 <SEP> 118 <SEP> 58 <SEP> 216 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 320 <SEP> 84 <SEP> 552 <SEP> 106 <SEP> 580 <SEP> 118
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 1260 <SEP> 403 <SEP> 2580 <SEP> 140 <SEP> 3120 <SEP> 160
<tb>
Ainsi qu'on le voit d'après ce qui précède, une quantité notable de 1-lysine libre est à l'extérieur des cellules de levure dans le milieu de fermentation et naturellement une quantité plus grande encore est dans la cellule elle-même.
EXEMPLE 6
On place dans des fioles Erlenmeyer de 125 cc des portions de 15 ce du milieu synthétique décrit à l'exemple 1. On prépare un certain nombre de ces fioles, certaines contement de plus des quantités variables d'acide alpha-céto-
<Desc/Clms Page number 9>
adipique (désigné également par KAA). On bouche ces flacons avec du.coton et on les stérilise à l'autoclave pendant 15 mn à 1,05 kg/cm2 de pression de vapeur.
On met en suspension des cultures en tube oblique sur malt-agar-agar véhiculant des cultures de 24 à 28 h de cellules de levure en cours de croissance (Saccha- romyces cereviseae) dans 10 cc de solution saline physiologique stérile. On utilise 0,3 cc de cette suspension pour inoculer les fioles Erlenmeyer stériles.
On incube alors les fioles bouchées avec du coton pendant 72 h à 24 environ sur une secoueuse à va-et-vient. Au bout de cette période de fermentation, on passe les fioles à la vapeur pendant 10 mn dans un autoclave ouvert pour inter- rompre la fermentation. On centrifuge le contenu des fioles, on recueille la liqueur surnageante et on analyse sa teneur en 1-lysine par la méthode micro- biologique indiquée à l'exemple 1. Les résultats de cette série de fermentations sont indiqués au tableau ci-dessous.
On conduit de la même manière une autre série de fermentations en utilisant un milieu composé de 50 g de dextrose, 3,8 g de sulfate d'ammonium et 50 cc de liqueur de macération de mais (à 50 % de solides à sec) et ajusté à pH 5,3 par l'acide phosphorique. Les résultats de cette série de fermentations sont également indiqués au tableau suivant.
TABLEAU VI
EMI9.1
<tb> Production <SEP> de <SEP> lysine <SEP> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> KAA <SEP> par <SEP> croissance <SEP> de <SEP> levures <SEP> en <SEP> milieu
<tb>
<tb>
<tb> synthétique <SEP> ou <SEP> en <SEP> milieu <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> milieu <SEP> liqueur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KAA <SEP> ajouté <SEP> milieu <SEP> synthétique <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> [gamma]/cc <SEP> % <SEP> conversion <SEP> [gamma]/cc <SEP> % <SEP> conversion
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aucun <SEP> 45 <SEP> -- <SEP> 200 <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,3 <SEP> 265 <SEP> 88 <SEP> -- <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb> 0,6 <SEP> 500 <SEP> 83--
<tb>
<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 558 <SEP> 56 <SEP> -- <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb> 3,
0 <SEP> 833 <SEP> 27-- <SEP> --
<tb>
<tb>
<tb> 5,0 <SEP> 324 <SEP> 5,4 <SEP> 4210 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb> 10, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> -- <SEP> 4210 <SEP> 42
<tb>
Ainsi qu'on le voit d'après ces résultats, l'acide alpha-céto-adipi- que est converti à raison de 88 % dans le milieu synthétique quand le taux d'a- cide est de 0,3 mg/cc de fermentation et à raison de 84 % dans le milieu de li- queur de macération de mais quand le taux d'acide est de 5 mg/cc. Comme on le verra également, la production de lysine est considérablement accrue par rapport à ce qu'on obtient sans l'emploi de l'acide céto-adipique comme précurseur, ce qui montre la conversion de l'acide alpha-céto-adipique en lysine comme résultat de la fermentation.
EXEMPLE 7
On conduit une série de fermentations en utilisant les mêmes milieux de fermentation que dans l'exemple précédent, et dans les mêmes conditions, la seule différence étant dans les espèces de cellules de levure utilisées pour inoculer les milieux de fermentation. Les résultats de ces fermentations sont indiqués au tableau suivant. La désignation CSL indique que le milieu est le milieu à la liqueur de macération de mais comme décrit à l'exemple'1. Le terme SYN désigne l'emploi du milieu synthétique comme décrit à l'exemple 1.
<Desc/Clms Page number 10>
TABLEAU VII
EMI10.1
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> milieu <SEP> KAA <SEP> Rendement
<tb>
<tb>
<tb> mg/cc <SEP> en <SEP> lysine <SEP> mg/cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> firme <SEP> "Red <SEP> Star <SEP> Bakers" <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,20
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 1,56
<tb>
<tb>
<tb> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 2,98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cereviseae <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> firme <SEP> "Fleischmann's <SEP> Bakers" <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,22
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> l <SEP> mg <SEP> 1,95
<tb>
<tb>
<tb> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,92
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> ellipsoideus <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,
010
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,103
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> thermantitonium <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,004
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,121
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces- <SEP> turbidans <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,008
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,185
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,008
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,165
<tb>
Dans une autre série de fermentationsconduites de la même manière, d'autres espèces de Saccharomyces à savoir le Saccharomyces aromaticus, le Saccharomyces spiritus, et le Saccharomyces logos, convertissent également l'acide alpha-céto-adipique en lysine en quantités notables.
EXEMPLE 8
On démontre l'aptitude des cellules de levure d'une famille différente à convertir l'acide alpha-céto-adipique en lysine dans des fermentations dans lesquelles on emploie plusieurs espèces de Torulopsis. On démontre cette aptitude à la fois dams le milieu synthétique et dans le milieu de liqueur de macération de mais comme décrit à l'exemple 1. Le milieu de fermentation contient différen- tes quantités d'acide alpha-oéto-adipique. Les résultats de cette étude sont indiqués dans le tableau suivant.
TABLEAU VIII
EMI10.2
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Milieu <SEP> Précurseur <SEP> mg/cc <SEP> Lysine <SEP> mg/cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> utilis
<tb>
<tb>
<tb> souche <SEP> NRRL <SEP> Y-900 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,48
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> utilis
<tb>
<tb>
<tb> souche <SEP> NRRL <SEP> 1082 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,39
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> utilis
<tb>
<tb>
<tb> souche <SEP> NRRL <SEP> 1084 <SEP> CSL <SEP> aucun <SEP> 0,46
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> CSL <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 3,18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> cramoris <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,07
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,
37
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> sphaerica <SEP> SYN <SEP> aucun <SEP> 0,04
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> SYN <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 0,68
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Dans des expériences supplémentaires utilisant des cellules de levures de la même famille Cryptococcacae on a trouvé que les levures d'autres souches, comprenant les espèces Rhodoturola glutinis et Candida lipolytica ont également l'aptitude de convertir l'acide alpha-céto-adipique en lysine dans le même type de fermentation et dans les mêmes conditions de fermentation que décrit ci- dessus. D'autres expériences encore indiquent que d'autres souches telles que la Kloeckeria peuvent convertir l'acide alpha-céto-adipique en lysine dans un processus de fermentation tel que décrit ci-dessus en quantité notable.
EXEMPLE 9
On a également examiné de nombreuses espèces de souches de la famille Endomycetaceae pour leur aptitude à produire de la lysine à partir d'acide alpha- céto-adipique comme précurseur.. Ces expériences ont été conduites avec divers substrats nutritifs différents mais étaient par ailleurs similaires aux fermen- tations décrites précédemment.
Dans une de ces séries d'expériences, le milieu de fermentation con- tenait comme éléments nutritifs 2 % de mélasses et 3 % d'extrait de malt. Après 72 heures de fermentation, on chauffe la masse de fermentation à la vapeur à 1000 pendant 10 minutes pour interrompre la fermentation et rompre les cellules de levure.
On analyse alors la liqueur surnageante pour la lysine avec les résul- tats suivants :
TABLEAU IX A
EMI11.1
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Lysine <SEP> pas <SEP> de <SEP> [gamma]/Ml <SEP> 5 <SEP> mg/cc <SEP> KAA
<tb>
<tb>
<tb> précurseur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> sp. <SEP> 58 <SEP> 426
<tb>
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 78 <SEP> 505
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomycopsis <SEP> fibuliger <SEP> 43 <SEP> 557
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomycodes <SEP> ludwigii <SEP> 62 <SEP> 385
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 58 <SEP> 958
<tb>
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 60 <SEP> 565
<tb>
Dans une autre série de fermentations, le milieu de fermentation contenait 0,4 % d'extrait de levure, 0,4 % de glucose et 1,0 % d'extrait de malt.
Les résultats sont indiqués ci-dessous.
TABLEAU IX B
EMI11.2
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Lysine <SEP> pas <SEP> de <SEP> [gamma]/Ml
<tb>
<tb> précurseur <SEP> 5 <SEP> mg/cc <SEP> KAA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 70 <SEP> 853
<tb>
<tb> Endomycopsis <SEP> fibuliger <SEP> 63 <SEP> 284
<tb>
<tb> Saccharomycodes <SEP> ludwigii <SEP> 52 <SEP> 310
<tb>
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 143 <SEP> 758
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 57 <SEP> 185
<tb>
Dans une autre série de fermentations, le milieu contenait 5 % de cérélose (qualité technique de dextrose), 5 % de liqueur de macération de mais et 0,5 % de sulfate d'ammonium.
Les résultats sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 12>
TABLEAU IX C
EMI12.1
<tb> Culture <SEP> de <SEP> levure <SEP> Lysine <SEP> pas <SEP> de <SEP> [gamma]/Ml
<tb> précurseur <SEP> 5 <SEP> mg/cc <SEP> KAA
<tb>
<tb> Nematospora <SEP> phaseoli <SEP> 108 <SEP> 351
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 44 <SEP> 116
<tb> Lipomyces <SEP> starkeii <SEP> 155 <SEP> 314
<tb>
Comme on le voit par ce qui précède, la conversion de l'acide alpha- céto-adipique en lysine varie considérablement suivant la nature du milieu nutri- tif.
EXEMPLE 10
On met en suspension environ 200 g de cellules de levure au repos (Saccharomyces cereviseae), vendue dans une épicerie sous la marque "Levure de Fleischmann's Baker" dans 1 litre d'eau et on mélange avec 1 litre d'une solu- tion aqueuse à 1,0 % d'acide alpha-céto-adipique. On tamponne le mélange à pH 4,5 avec de l'acide citrique 0,1 M et de la soude. On examine la teneur en ly- sine libre de la liqueur surnageante et d'un échantillon de cellules de levure rompues. On ne trouve pas de lysine. On place alors la suspension conte- nant les cellules au repos dams un récipient et on fait passer de l'air à tra- vers la solution à raison de 15 litres/mn pendant 23 heures à température am- biante. Au bout de ce temps, on trouve que les cellules de levure contiennent 2,4 g/l de lysine libre.
EXEMPLE 11
On répète le processus de l'exemple 10 ci-dessus, en ajustant le pH de la suspension aqueuse, initialement, à des valeurs de 3,0 à 8,5. Un peu de l'acide alpha-céto-adipique est converti en lysine dans tous les cas, mais on obtient les résultats optimum dans l'intervalle de pH de 3,0 à 5,0.
Bien quel'un des principaux avantages de la présente invention réside dans le fait que la totalité de la masse fermentée provenant de la fer- mentation puisse être ajoutée directement, avec séchage si on le désire, aux ali- ments pour animaux pour porter leur teneur en lysine à l'équilibre, ou que les cellules de levure séparées peuvent être utilisées pour complémenter les nour- ritures déficientesen lysine pour l'homme et les animaux, il peut être désira- ' ble de récupérer la lysine essentiellement pure du produit fermenté. On peut récupérer la teneur en 1-lysine de la liqueur fermentée de toute manière connue.
Un moyen efficace consiste à utiliser des résines d'échange d'ions ayant une affinité pour les amino-acides. Les liqueurs aqueuses contenant la 1-lysine, qu'elle provienne de la liqueur surnageante du fermentateur ou des cellules de levure hydrolysées contenant la lysine libre, est adsorbée sur une résine d'é- change d'ions appropriés puis soumise à l'élution, et l'éluat est raffiné pour obtenir la 1-lysine essentiellement pure.
Les cellules de levure qui ont été en contact avec l'acide 5-formyl- 2-oxovalérique ou avec l'acide alpha-céto-adipique sont caractérisées par une teneur extrêmement élevée en 1-lysine, de 10 % et plus, et semblent être une nouvelle forme de levure en raison de cette teneur élevée en 1-lysine libre. Cet- te propriété rend ces cellules de levures particulièrement précieuses pour com- plémenter les aliments pauvres en lysine provenant des céréales telles que le mais, l'avoine et le riz. Par exemple, la farine d'avoine est pauvre en 1-lysine et l'addition de quantités de lysine allant jusqu'à 0,4 % environ en poids a été recommandée.
Ceci est facilement réalisable après l'addition d'environ 4 % en poids, à sec, de cellules de levure contenant 10 % de lysine libre. Naturelle- ment, quand les cellules de levure contiennent de plus grandes quantités qu'il
<Desc/Clms Page number 13>
n'a été indiqué ci-dessus, la quantité de levure qu'il est nécessaire d'ajouter peut être considérablement réduite.
La quantité de lysine libre dans les cellules de levure peut être déterminée par la quantité d'acide organique qui est ajoutée à la fermentation qui produit les cellules de levure. De plus grandes quantités de 1-lysine ajou- tées à la fermentation, à savoir des quantités allant jusqu'à 2 %, conduisent à de des teneurs plus élevées en 1-lysine libre dans la levure et dans le milieu de fermentation où on peut l'isoler indépendamment de la 1-lysine libre et de la lysine liée aux protéines dans les cellules de levure. L'invention couvre donc l'emploi de quantités de précurseur aussi élevées que 2% en poids dans ce procédé.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de la 1-lysine, caractérisé en ce qu'on soumet à l'action des enzymes de la levure un acide organique choisi entre l'- acide 5-formyl-2-oxovalérique, l'acide alpha-amino-adipique et l'acide alpha- céto-adipique.