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La présente invention a pour objet un procédé de préparation et d'obtention d'un antibiotique nouveau tiré des streptomycètes, doué de proprié- tés bactériostatiques et fongistatiques. Il se trouve dans le bouillon de cultu- re, ainsi qu'en petites quantités dans le mycélium d'un nouveau streptomycète , et la demanderesse l'a dénommé phyllomycine, en raison de son efficacité contre les moisissures pathogènes des végétaux.
Le streptomycète isolé de la vase des rivières, qui a reçu le nom de Streptomyces umbrosus et qui a été déposé sous cette dénomination au "Cen- tralbureau voor Schimmelkultures" à Baarn (Pays Bas), n'est identique à aucun des streptomycètes connus.
D'après l'ouvrage intitulé "Actynomycetes and their Antibiotics", de S.A. Waksman et H.A. Lechevalier, page 66, il est comme type chromogène, analogue au Streptomyces viridoflavus, un pigment soluble dans tous les mi- lieux organiques, mais s'en distingue cependant par des caractères distinctifs essentiels. D'après les méthodes de diagnose de W. Lindenbein (Archiv für Mikrobiologie, 17, 361-381 (1952 , les caractéristiques de cette nouvelle espè- ce sont celles réunies dans le Tableau 1 ci-après
Tableau 1.
Propriétés des cultures de Streptomyces umbrosus.
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Tableau 1.
(suite) Propriété des cultures de Streptomyces umbrosus
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On peut cultiver le Streptomyces umbrosus, avec formation du pro- duit actif, sur des solutions nutritives, par exemple avec de la glycérine ou de l'extrait de malt comme source de carbone, de la peptone, de l'eau de macéra- tion du mais, de la levure de brasserie, ou de l'hydrolysat de caséine comme source d'azote, avec addition de sels minéraux, comme par exemple de chlorure de sodium,
de phosphate acide dipotassique, de sulfate ferreux et de sulfate de magnésium. En outre, le milieu de culture doit renfermer les traces d'élé- ments essentiels, qui se trouvent habituellement dans l'eau de ville, ainsi que dans les additifs naturels des milieux de culture, par exemple la levure de bras- serie. Avant l'ensemencement, le pH de la solution nutritive doit être compris entre 6,5 et 7,5. La demanderesse a observé que dans presque tous les essais sur les cultures, le milieu devient au début lentement acide. Comparativement aux autres substances actives, la formation de l'antibiotique se fait très tôt, et atteint déjà son maximum au bout de trois jours de culture. De petites quan- tités de phyllomycine se forment dans le ballon à secousses; ou bien dans la culture superficielle.
Pour préparer des quantités plus importantes de l'anti- biotique, on donne la préférence à la culture aérobie agitée et immergée. Pour arriver à un accroissement aussi rapide que possible, et à une durée de fermen- tation de ce fait plus courte, on ensemence toujours abondamment avec une sus- pension de spores fraîchement préparée, ou bien avec une culture préalable sub- mergée correspondante. On cultive le Stceptomyces umbrosus à une température com- prise entre 26 et .32 , et de préférence à 29 .
La préparation des substances
<Desc/Clms Page number 3>
actives n'est cependant pas limitée à l'application du Streptomyces umbrosus, mais elle comprend aussi des mutations de cette souche, que l'on obtient par l'action d'agents de mutation, par exemple de rayons ultra-violets, de rayons de Roentgen et de substances chimiques. -
On détermine la concentration de l'antibiotique dans les filtrats et extraits de culture à l'aide de la Rhodotorula flava CBS 331 à titre..d'orga- nisme d'épreuve. Un filtrat de culture typique, sur un milieu'de culture conve- nant pour les levures ,enraye encore, la croissance à la dilution de 1:50, lors de l'essai à la plaquette trouée.
On peut extraire l'antibiotique des filtrats de culture, soit par extraction, soit par adsorption. L'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle con- viennent particulièrement pour l'extraction, mais les hydrocarbures chlorés, l'éther, les cétones et les alcools sont aussi applicables. On évapore dans le vide l'extrait du jus de culture, on sépare par précipitation les substances étrangères au moyen d'hydrocarbures, et après avoir chassé les hydrocarbures sous vide, on mélange le résidu huileux avec un alcool inférieur , de préféren- ce avec du méthanol. Après séparation des parties insolubles dans le méthanol, on obtient après concentration une huile brune (fraction insaponifiable de 1' huile = 20%; indice d'iode = 290), qui se montre encore active, à une dilution de 1:1.000.000, par l'essai à la plaquette trouée, envers la Rhodotorula flava.
Avec ce concentrat huileux de Phyllomycine, on a effectué les essais biologi- ques ci-dessous. Pour purifier plus 'à fond le fongistatique, on divise en dix fractions le concentrat de phyllomycine ayant une activité de 1:1.000.000 , en contre courant avec le système :13 parties en volume de ligroïne 6 parties en volume d'acétate de butyle, 2 parties en volume de di-n-butyléther, 14 par- ties en volume de N-diméthylformamide, et 7 parties en volume d'eau ; évapo- re à sec sous vide la fraction cinq et à partir du résidu solide subsistant, on obtient après cristallisation dans la méthyl propyl cétone, la phyllomycine en aiguilles disposées en rosaces, et ayant les caractéristiques suivantes :
Point de fusion :
177 - 178 C (non corrigé) [[alpha]] 21D = +75 (c = 0,834% dans du chloroforme)
C = 57,70%; h = 5,77 %; N = 5,88 %; 0 = 30,74 %. lambda max 322 m mu avec alpha = 9970 lambda max 225 m mu avec alpha = 60 (alpha = Coefficient d'extinction spécifique = Extinction pour c = 1 g/litre et d = 1 cm3)a
La phyllomycine possède des bandes d'absorption caractéristiques dans l'infra-rouge, pour les longueurs d'onde suivantes :
(Comprimé avec KBr; les valeurs entre parenthèses indiquent les transparences en %) : 2,97 (50,7%), 3937 (54,8%), 5,72 (7,1 %), 5,97 (27,7%) 6,10 (34,6%), 6,21 (37,0%), 6,29 (47,3%), 6,55 (17,1%) 6,87 (47,8%), 6,98 (48,4%), 7,36 (30,0%), 7,52 (43,2%) 7,64 (48,8%), 7,84 (36,3%), 7,98 (24,2%), 8,49 (17,0%) 8,66 (17,2%), 9,28 (36,9%), 9,30 (37,1%), 9,49 (49,0%) et 9,85 mu (44,6%).
On trouvera sur les Figures 1 et 2 l'allure exacte des cour- bes d'absorption, dans les domaines ultra-violet et infra-rouge du spectre. A la Fig. 1 le coefficient d'extinction spécifique a est porté en ordonnées et la longueur d'onde m mu en abscisses.
La phyllomycine résiste à l'action de la température dans des limi- tes définies; à 20 l'activité envers la Rhodotorula flava se conserve plus de 7 heures; à 50 ,et dans des conditions d'essai comparables, l'efficacité est de 100% après 3 heures, de 95% après 7 heures; à 100 , elle est de 100% après
<Desc/Clms Page number 4>
1/2 heure ; de 80% après 3 heures, de 18 % après 7 heures; à 150 elle est de 3 % après 1/2 heure, de 0% après 3 heures. La phyllomycine est sensible aux al- calis.
Sur le chromatogramme circulaire de partage, on trouve les valeurs ci-après de RF dans le milieu de partage suivant 0,13 avec : 1 partie en volume d'eau, 1 partie en volume d'éthylèneglycol, 4 parties en volume de N-diméthylformamide, 3 parties en volume de di-n-butyl-éther, 3 parties en vo- lume de ligroine, 0,31 avec : 1 partie en volume d'éthylène-glycol, 2 parties en volume de N-diméthylformamide, 1 partie en volume de di-n-butyléther, 2 par- ties en volume de ligroine; 0,68 avec : 1 partie en volume d'eau, 2 parties en volume de méthanol, 2 parties en volume de N-diméthylformamide, 2 parties en volume d'acétate de butyle, 3 parties en volume de ligroine, et 0,88 avec :
1 partie en volume d'eau, 3 parties en volume d'éthylène glycol, 2 parties en volume de N-diméthylformamide, 3 parties en volume d'acétate de butyle, 2 par- ties en volume de ligro ine. Pour réaliser le chromatogramme, on asperge des papiers filtres coupés en cercles (Schleicher et Schüll 2043 b) avec la phase hydrophile de chacun des milieux de partage, d'abord mise en équilibre par agi- tation prolongée, puis on les développe avec la phase hydrofuge. Après séchage du chromatogramme, on découpe suivant un rayon une bande de 0,5 mm de largeur, et on la pose sur une plaque d'agar ensemencée de rhodotorula flava.
A l'en- droit où se trouve la substance active, il se forme au cours de l'incubation une zone d'inhibition claire d'iù l'on peut calculer le RF qui est le rapport du parcours de l'antibiotique au parcours de la phase hydrofuge (=front du sol- vant).
A l'essai à la plaquette trouée, la phyllomycine cristallisée, à la dilution de 1:50.000.000 jusqu'à 1.100.000.000 enraye le développement de la Rhodotorula flava.
D'autre part, on peut extraire la phyllomycine du milieu de culture en mélangeant la solution de culture centrifugée ou filtrée avec un adsorbant, en particulier avec du charbon activé, en séparant l'adsorbat, et en désorbant l'agent actif à l'aide de solvants organiques, particulièrement à l'aide d'hy- drocarbures chlorés et d'alcools.
Outre la phyllomycine les filtrats de cultures renferment encore un autre antibiotique, qui est également actif contre les moisissures, par ex- emples contre la Rhodotorula flava et le Cladosporium cucumérinum. Lors de l'ex- traction par des solvants organiques, comice l'acétate de butyle ou l'acétate d'éthyle, il demeure dans la phase aqueuse.
La phyllomycine possède une activité prononcée contre des organis- mes pathogènes des végétaux, in vivo et in vitro. Pour les essais, on a utilisé un concentrat de phyllomycine (activité envers la Rhodotorula flava :1 : 1.000.000), dont l'efficacité in vitro, dans l'essai de dilution en petit tube, tout comme dans l'essai à la plaquette trouée, contre des moisissures et des bactéries est indiquée dans.le Tableau 2, et l'efficacité in vivo sur des végé- taux est indiquée dans le Tableau 3. Cependant , l'efficacité de l'antibiotique n'est pas limitée aux organismes indiqués dans les Tableaux 2 et 4. La phyllo- mycine peut trouver une utilisation comme agent de protection systémique des plantes.
Le coefficient, d'attaque de l'Omphalia flavida sur les plantes du $genre coléus, est de 52 après imprégnation de la terre avec une solution de phyl- lomycine à 1% ,et de 68 avec une solution à 0,1% (Témoin 100) (voir le Tableau 3).
Le concentrat de phyllomycine à 1 :1.000.000 ne possède qu'une phytotoxicité peu importante (voir Tableau 4). Sans aucune exception , on n'a observé aucun dommage avec une solution à 0,1%. Même les constatations effectuées avec une solution à 1% sont peu importantes.
Comme antibiotiques fongistatiques tirés des streptomycètes, on con- naissait un groupe de composés, comme par exemple la fongicidine (=nystatine)
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(J.D. Putcher, G. BOyack, S.Fox,Antibiotics Annual , 1953-1954, page 191), l' eurocidine (Y. Okami, R.Wahara, S.Nakomura, H.Umezawa, Journal of Antibiotics, Japon 7A, page 98, 1954), le flavacide (J.Takahachi, Journal of Antibiotics, Japon, 6A, page 117, 1953), la condicidine (H.A.Lechevalier, R.F.Acker, C.T.
Corke, C.M.Haenseler, S.A.Waksman, Mycologia, 45, page 155, 1953), qui se dis- tinguent chimiquement par une chaîne de doubles liaisons conjuguées, et possè- dent un spectre d'adsorption typique de cette constitution, avec trois maxima très voisins les uns des autres, par exemple la fongicidine (=nystatine) à 292, 304 et 318 m mu, l'urocidine à 318, 333 et 351 m mu, le falvacide à 341, 358 et 379 m mu et la candicidine à : 359,5, 3795 et 401,5 m mu. Le présent antibiotique, la phyllomycine, n'a pas, comme on peut le voir d'après le spec- tre ci-joint, de spectre d'absorption typique de ce genre, et doit être nette- ment différent des composés cités. Il existe pareillement une nette différence entre l'actidion (A.D.Whiffen, R.L.
Emmerson, N.H. Bohonos, brevet des Etats Unis D'Amérique N 205740519 du 13 Novembre 1951 ; UpjohnCompany) et la phyl- lomycine, car l'actidion, à l'essai de dilution en petit tube n'empêche la crois- sance du Cladosporium cumumerinum qu 'à la dilution de 1: 50.000, tandis que la phyllomycine est encore efficace à 1 s 10.000.000 . Il faut aussi noter des différences d'activité biologique marquées entre la phyllomycine et les antibio- tiques connus tirés des streptomycètes; la streptomycine, la tétracycline, la viomycine, l'érythromycine, le chloramphénicol et la novobiocine.
C'est ainsi qu'à l'essai à la plaquette trouée, le concentrat de phyllomycine donne, à la dillution de 1 200.000 une zone d'inhibition de 19 mm avec le Candida utilis CBS 840, alors que la streptomycine à la dilution de 1 : 400, la tétracycline à la dilution de 1 : 400, la viomycine à la dilution de 1 : 400, l'érythromyci- ne à la dilution de 1 :4.000, le chloramphénicol à la dilution de 1 : 4000, et la novobiocine à la dilution de 1 s 6000 sont inefficaces. Il existe égale- ment des différences entre la phyllomycine et l'antimycine A, un antibiotique découvert par C.
Leben et G.W. Keitt (Phytopathology, 37. 14, 1947, et 38. 899, 1948). Même le Strptomyces NRRL 'produisant l'antimycine" révèle vis à vis du Streptomyces umbrinus, qui donne naissance à de la phyllomycine, des diffé- rences de culture nettes, comme le montre le Tableau 5.
Une comparaison directe entre une préparation authentique d'antimycine A et de phyllomycine donne des différences de point de fusion (non corrigé); Antimyoine A : 136-137 ; Phyllo- mycine :: 177-178,5 , point de fusion en mélange : 129-130 , et comme le montre la Figure 3 (dans laquelle le demi-cercle supérieur est relatif à l'antimycine A et le demi-cercle inférieur à la phyllomycine), des différences des valeurs de RF sur le chromatogramme de partage circulaire, en utilisant un milieu de partage composé de :6 parties en volume de ligroine, 1 partie en volume de di-n-butyléther, 3 parties en volume d'acétate de butyle, 7 parties en volume de N-diméthylformamide, 3 parties en volume d'eau et en utilisant la technique décrite plus haut, (voir Fig. 3).
On a développé le chromatogramme avec de l'acide sulfanilique diazoté. Etant donné qu'il existe également des différen- ces qualitatives et quantitatives entre les activités biologiques des deux fongistatiques ,(voir Tableau 6), il faut sans aucun doute considérer la phyl- lomycine comme étant un nouvel antibiotique.
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TABLEAU 2.
Efficacité in vitro du concentrat de phyllomycine (Activité à la dilution de 1:1.000.000 sur la Rhodotorula flava) Nature Dilution limite d'efficacité Organisme de l' Diamètre de la zone d'inhibition essayé essai de l'essai à la plaquette trouée (#)
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P1= Essai à la plaquette trouée.
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Tableau 3
Efficacité in vivo du concentrat de phyllomycine (Activité à la dilution de 1:1.000.000 .sur la Rhodotorula flava)
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<tb> solani
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0005% <SEP> d <SEP> d <SEP> 78
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+) La terre a été imbibée de la solution à essayer.
(= Examen de l'efficacité systémique).
<Desc/Clms Page number 8>
Tableau 4 Phytotoxicité du concentrat de phyllomycine ----------- (Activité à la dilution de 1:1.000.000 sur la Rhodotorula flava)
EMI8.1
<tb> Plantes <SEP> d'essai <SEP> Concentration <SEP> Constatation
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<tb> Nouvelle <SEP> croissance <SEP> normale.
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" <SEP> 0,01 <SEP> % <SEP> Pas <SEP> de <SEP> dégàts
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<tb> Nouvelle <SEP> croissance <SEP> normale.
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<Desc/Clms Page number 9>
Tableau 5 Différenciation du Streptomyces "produisant de l'antimycine" et du Streptomyces umbrinus.
-----------
EMI9.1
<tb> Streptomyces <SEP> NRRL <SEP> 2288 <SEP> Streptomyces
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<tb> "produisant <SEP> de <SEP> l'anti- <SEP> umbrinus
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<tb> sur <SEP> glucose-asparagine- <SEP> De <SEP> blanc <SEP> à <SEP> crème <SEP> Gris
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<tb> agar,
<SEP> glucose-agar- <SEP> et
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<tb> agar <SEP> nutritif
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<tb> Image <SEP> microscopique <SEP> Pas <SEP> de <SEP> spirales <SEP> Spirales <SEP> avec
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<tb> du <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> spirales <SEP> de <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 5 <SEP> avec
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<tb> spires
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<tb> Couleur <SEP> du <SEP> substratum <SEP> sur
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<tb> milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> renfer- <SEP> D'incolore <SEP> à <SEP> légère- <SEP> Brun <SEP> foncé.
<tb>
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<tb> mant <SEP> du <SEP> peptone <SEP> (Agar <SEP> ment <SEP> jaunâtre
<tb>
<tb>
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<tb> nutritif <SEP> et <SEP> agar-gélatine)
<tb>
Tableau 6 Efficacité à l'essai à la plaque trouée,
de l'antimycine A et de la phyllomycine, sur trois levures différentes.
EMI9.2
<tb>
Levure <SEP> Antimycine <SEP> A <SEP> Phyllomycine
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<tb> Dilution <SEP> (- <SEP> # <SEP> mm <SEP> de <SEP> la <SEP> Dilution <SEP> (- <SEP> # <SEP> mm <SEP> de <SEP> la
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<tb> Candida <SEP> lypolytica <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10. <SEP> 000 <SEP> # <SEP> 21,8 <SEP> 1:640.000 <SEP> # <SEP> 27,0
<tb>
<tb>
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<tb> (Harrison) <SEP> Diddens <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 40.000# <SEP> 20,5 <SEP> 1 <SEP> :2.500.000 <SEP> # <SEP> 20,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> Lodder. <SEP> 1 <SEP> :160.000 <SEP> # <SEP> 18,0 <SEP> 1:10.000.000 <SEP> # <SEP> 12,5
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<tb> Sporolobomyces <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 10.000 <SEP> # <SEP> 22,2 <SEP> 1:640.000 <SEP> # <SEP> 25,5
<tb>
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<tb> holsaticus <SEP> 1: <SEP> 40.000 <SEP> # <SEP> 21,0 <SEP> 1:2.500.000 <SEP> # <SEP> 19,5
<tb>
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<tb> Windisch <SEP> 1:160.000 <SEP> # <SEP> 18,0 <SEP> 1:10.000.000 <SEP> # <SEP> 15,0
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<tb> Rhodotorula <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10.000# <SEP> 21,8 <SEP> 1 <SEP> :160.000 <SEP> # <SEP> 29,0
<tb>
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<tb>
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<tb> glutinis <SEP> 1:
<SEP> 40.000 <SEP> # <SEP> 20,6 <SEP> 1:640.000 <SEP> # <SEP> 21,0
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<tb>
<tb>
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<tb> (Fres.) <SEP> Harrison <SEP> 1 <SEP> :160.000 <SEP> # <SEP> 18,0 <SEP> 1:2.500.000 <SEP> # <SEP> 14,0
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<Desc/Clms Page number 10>
Exemple 1
Dans un erlenmeyer de 1 litre,on verse 150 cm3 d'une solution nutritive ayant la composition suivante :
2 % de glycérine 0,1 % de peptone 0,25% de glycocolle
0,1 % de NaCl 0,1 % de K2H PO4 0,02% de FeS04 . 7H20 0,02% de MgSO4 . 7H2O on stérilise à 120 C pendant 20 minutes;on ensemence après refroidissement avec une suspension de spores de Streptomyces umbrosus nov. spec., qui s'était développé sur un milieu nutritif de la même composition, avec 2 % d'agar, et on fait fermenter à 29 , sur une machine à secousses fonctionnant à 240 tours minute. Après une durée de culture de 72 heures le bouillon de fermentation, à la dilution ,de 1 : 50, inhibe la Rhodotorula flava.
Avec deux litres de cet- te culture préliminaire en croissance, on ensemence un fermenteur de 1.000 li- tres, garni de la solution nutritive suivante :
2 % de glycérine
1 % de levure de bière sèche 0,25 % de glycocolle 0,1 % de NaCl 0,1 % de K2H P04 0,02 % de FeS04 . 7H20 0,02 % de MgS04 , 7H2O 0,1 % d'huile de silicone (produit commercial) qui avait été stérilisé deux jours consécutifs pendant 20 minutes à 120 , puis on l'agite énergiquement pendant 72 heures, en faisant entrer de l'air à raison de 350 litres par minute. L'efficacité contre la Rhodotorula flava est alors de 1 : 50.
Immédiatement après, on débarrasse le jus de fermentation du mycélium par centrifugation, on extrait une fois le liquide de centrifugation avec 300 litres d'acétate de butyle, on concentre à 50 et sous vide l'extrait coloré en vert jaune à 4 litres, on ajoute 16 litres de ligroine, on sépare un précipité brun verdâtre, et on chasse le solvant à 50 sous vide. Le résidu visqueux restant, qui renferme encore l'huile de silicone ajoutée comme anti- mousse, est extrait deux fois avec chaque fois 3 litres de méthanol, on isole la phase huileuse qui se sépare, et on chasse le méthanol par distillation sous vide. On obtient 30 grammes environ d'huile brune, qui à la dilution de 1 :
1.000.000 arrête la croissance de la Rhodotorula flava, et que l'on utilise comme produit de départ pour des essais sur les plantes.
Pour continuer la purification de l'antibiotique, on verse dans huit ampoules à séparation de 10 litres chacune, chaque fois 4 litres de la phase organique du milieu de partage : 13 parties en volume de ligroine, 6 parties en volume d'acétate de butyle, 2 parties en volume de di-n-butyléther, 14 par- ties en volume de N-diméthylformamide, et 7 parties en volume d'eau; on dissout
400 grammes de concentrat précédent de phyllomycine (ayant une activité de 1 :
1.000.000) dans 4 litres de la phase aqueuse du milieu de partage indiqué, et on l'agite un certain temps, avec 4 litres de la phase organique de la première ampoule à séparation. On isole la phase aqueuse, on l'ajoute à la phase organi- que de la deuxième ampoule à séparation, et on verse ensuite dans la première ampoule 4 litres de phase aqueuse fraîche.
On agite un certain temps les deux ampoules à séparation. On recommence le processus sur huit stades dans le sens d'un partage, à contre-courant. On soutire les huit phases aqueuses, on ajoute aux phases organiques 2 litres d'acétate d'éthyle, et on agite une fois avec de l'eau. (on jette l'eau). On ajoute les huit phases aqueuses aux phases orga- niques correspondantes, on agite les huit fractions, et on isole les phases
<Desc/Clms Page number 11>
aqueuses. Celles-ci renferment encore de petites quantités de phyllomycine. On agite trois fois les phases organiques obtenues avec chaque fois 2 litres d'eau chacune, (on jette l'eau) ,et on distille à sec sous vide, sur un bain à 60 .
Les fractions quatre, cinq et six renferment la majeure partie du produit ac- tif. On obtient, en recristallisant trois fois la fraction cinq dans de la mé- thyl propyl cétone, 2 grammes de phyllomycine en aiguilles en forme de rosaces, qui arrêtent encore la croissance de la Rhodotorula flava, à la dilution de
1 : 50.000.000 à 1 : 100.000.000.
Point de fusion : 177-178,5 (non corrigé).
21 [a] D = +75 (C = 0,834 % dans du chloroforme)
C = 57,70 % H = 5,77 % N = 5,79 % et 0 = 30,74 %
Lambda max = 332 m mu avec alpha = 9,70
Lambda max = 225 m mu avec alpha = 60.
Exemple 2.
On centrifuge 10 litres de jus de culture dé Streptomyces umbrosus nov. spec. ayant une efficacité de 1 :50 contre la Rhodotorula flava; on agite le liquide centrifugé clair avec 50 grammes de charbon activé, et on sépare le charbon par centrifugation. Dans le milieu de culture débarrassé de l'agent ad- sorbant, subsistent 10 % environ de l'efficacité. On sèche le produit adsorbé, on l'agite pendant 30 minutes à 50 avec 1 litre de chloroforme, on le centri- fuge à nouveau, et on distille à sec la solution chloroformique surnageante.
Il reste comme résidu 1,7 gramme d'une huile , qui a la dilution de 1 : 200. 000 arrête encore la croissance de la Rhodotorula flava, et que l'on peut le cas échéant encore purifier comme indiqué plus haut.