BE561069A

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Publication number: BE561069A
Authority: BE

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



    L'invention concerne un nouvel antibiotique, plus particulièrement des procédés de préparation, de séparation, et de purification de   l'antibiotique ou de ses sels. 



   Dans le présent mémoire, le nouvel antibiotique est dénommé C- 159, aucune dénomination générale n'ayant encore été adoptée jusqu'à pré- sent, mais le C-159 est clairement identifié dans la description détaillée donnée ci-après. 



   L'antibiotique C-159 et ses sels sont caractérisés en ce qu'ils inhibent la croissance de micro-organiques à Gram-positif, contenant les aminoacides glycine, alanine, thréonine et acide aspartique, et aucun au- tre ; ils sont hautement solubles dans l'eau alcaline, et hautement insolu- bles dans des solutions aqueuses d'un pH inférieur à 4; ils sont solubles dans le méthanol et insolubles dans l'acétone,   l'éthèr   diéthylique et l'a-' cétate de butyle; à l'état pur, ils contiennent sensiblement   58,7%   de car- bone, 7,4 %   d'hydrogène,   9,9% d'azote et   24,0%   d'oxygène (dosé par diffé- rence); dissous dans   l'eau,   ils accusent une absorption maximum à la lu- mière ultraviolette à 345 millimicrons (E1%= 71) et un palier entre 260 
1cm   et 280 ;

   granulésdans du bromure de potassium, ils accusent des bandes   d'absorption caractéristiques dans la région infrarouge du spectre aux lon- gueurs   d'onde   suivantes, exprimées en microns   g 2,90,   3,38, 5,85   (palier),.   



  6,05 (palier marqué), 6,10, 6,55, 7,23,   79509   8,00 (bande large) et 9,40 (bande large); ainsi que les sels métalliqueso 
Le procédé de préparation de l'antibiotique   C-f59   comprend la culture d'une souche de Streptomyces canus producteur du C-159 dans une so- lution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un agent nutritif azoté, dans des conditions aérobies submergées, jusqu'à ce qu'une activité anti-    bactérienne notable soit conférée à la solution ; on le désire, on sépa-   re alors l'antibiotique ainsi produit du bouillon de fermentation. 



   Pour la fermentation, la solution d'hydrate de carbone renferme une source de carbone telle qu'un sucre existant dans le commerce, certains autres hydrates de carbone ou de l'huile de glycéride, et également une source d'azote telle qu'un sel inorganique, par exemple, du sulfate ammoni- que ou du nitrate de sodium, ou une substance organique, fréquemment à l'é- tat brut telle que de la liqueur de macération du maïs, des produits de distillerie solubles, de la levure, de la farine de soya. Le milieu de fermentation peut également contenir des sels minéraux, des agents tampons tels que du carbonate de calcium; ces milieux sont bien connus dans la technique de la préparation d'antibiotiques. 



   L'organisme producteur de l'antibiotique de la présente invention a été isolé d'échantillons de terre, et constitue une nouvelle souche de Streptomyces canus. 



   Des prélèvements de streptomyces canus (culture C-159) se déve- loppent convenablement à   28=30 C   sur l'asparagine-dextrose, des agars de Bennett et de farine d'avoine-tomates. Le mycélium végétatif qui se déve- loppe sur des substratums d'agar, est incolore à Flax (couleur lin)o Un mycélium aérien gris se développe le second ou le troisième jour, et donne naissance, dans certains milieux, à de nombreux sporophores enroulés de façon peu serrée. Dans certains milieux, il se forme des pigments ayant des teintes variant du jaune au vert jaunâtre. 



   Les hydrates de carbone cités ci-après sont aisément assimilés quand ils sont inclus dans de l'agar synthétique de Pridham et Gottlieb ne contenant aucune autre source de carbones dextrine, amidon, glycérine, arabinose, rhamnose, xylose, glucose, lévulose, maltose, lactose, cellobio- 

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 se, galactose, mannitol, inositol, sorbitol, acétate de sodium, citrate de   sodium,   succinate de sodium et malate de calciumo Le sucrose, le raffi- nose, l'inuline, le   dulcitol,   l'oxalate de sodium, le salicylate de sodium et le tartrate de sodium n'aident pas la croissance. 



   Une description plus détaillée de la croissance du Streptomyces canus (culture   C-159)   dans un certain nombre de milieux communément utili- sés à l'étude d'éléments du genre Streptomyces, est donnée au tableau I. 



  On y indique le type de croissance, la production de pigment et d'autres caractéristiques. Les milieux ont été ensemencés par traînées et toutes les cultures ont été soumises à une incubation à 28 = 30 C pendant une du- rée de 21 jours. Les noms de couleurs qui sont écrits avec une initiale majuscule dans le présent mémoire, correspondent à ceux décrits dans l'ou- vrage de Maerz et Paul, A Dictionary of Color, 2e édition, MacGraw-Hill, New York, 1950. 



   Le Streptomyces canus (culture C-159) donne une réaction alcali- ne au lait de tournesol, sans produire de coagulationo La peptonisation se produit lentemento La gélatine se liquéfie lentement, mais il ne se produit pas de pigment soluble. L'agar du sang n'est pas hémolyse. Il ne se produit pas de noircissement d'agar fer peptoneo   TABLEAU   I. 



   Caractéristiques de culture de Streptomyces canus (culture C-159) 
 EMI2.1 
 
<tb> Crois= <SEP> Couleur <SEP> Pig-
<tb> 
<tb> Milieux <SEP> Crois= <SEP> sance <SEP> du <SEP> mycé- <SEP> ment <SEP> Remarques
<tb> 
<tb> . <SEP> w.J. <SEP> J. <SEP> eux <SEP> sance <SEP> végé- <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> soluble
<tb> 
<tb> tative <SEP> et <SEP> des <SEP> spores <SEP> soluble
<tb> 
<tb> Agar-dextrose <SEP> franche <SEP> incolore <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> Flax
<tb> 
<tb> asparagine <SEP> gris <SEP> (lin)
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> de <SEP> Bennett <SEP> bonne <SEP> Flax <SEP> (lin)

   <SEP> gris <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> jau-
<tb> 
<tb> nâtre
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> franche <SEP> incolore <SEP> légèrement <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> inco-
<tb> 
<tb> blanc <SEP> lore
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> franche <SEP> Flax <SEP> (lin) <SEP> gris <SEP> franc <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> gris
<tb> 
<tb> mince
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> de <SEP> malate <SEP> franche <SEP> Amber <SEP> Whi-= <SEP> blanc <SEP> à <SEP> légère- <SEP> bien <SEP> dégagé
<tb> 
<tb> de <SEP> calcium <SEP> te <SEP> (blanc <SEP> gris <SEP> ment <SEP> jau- <SEP> de <SEP> l'agar
<tb> 
<tb> ambré) <SEP> nâtre
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> de <SEP> farine <SEP> bonne <SEP> Flax <SEP> (lin) <SEP> gris <SEP> vert <SEP> jau- <SEP> Verso <SEP> Bron-
<tb> 
<tb> d'avoine-=tomate <SEP> nâtre <SEP> ze-sheen <SEP> (é-
<tb> 
<tb> clat <SEP> bronzé)

  
<tb> 
<tb> 
<tb> Tampon <SEP> de <SEP> pom= <SEP> bonne <SEP> Cream <SEP> Woodash <SEP> Mauve=
<tb> 
<tb> me <SEP> de <SEP> terre <SEP> (crème) <SEP> (cendre <SEP> taupe
<tb> 
<tb> de <SEP> bois)
<tb> 
<tb> à <SEP> gris
<tb> 
 
Le spectre   antibactérien   in vitro de l'antibiotique   C-159   a été mesuré par la technique de dilution en tube9pour déterminer les concentra- tions minima de l'antibiotique produisant une inhibition complète de la croissance de bactéries pendant 24 heures. Un bouillon d'infusion de coeur a été utilisé comme milieu pour tous les organismes essayés, sauf indica- tions contraires.

   Les résultats obtenus sont les suivants g 

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 EMI3.1 
 
<tb> Organisme <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice
<tb> 
<tb> minimum
<tb> 
<tb> 
<tb> mcg/ml
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> varo <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> 125
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Microcossus <SEP> pyogenes <SEP> varo <SEP> aureus <SEP> 52 <SEP> = <SEP> 79 <SEP> 125
<tb> 
<tb> 
<tb> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> 125
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203M <SEP> 500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> 8
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 12,

  5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Lactobacillus <SEP> acidophilus <SEP> 250
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Aotobacillus <SEP> casei <SEP> @ <SEP> 500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 31
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> varo <SEP> mycoides <SEP> 250
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 3,

  1
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Neisseria <SEP> spo <SEP> 500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 500
<tb> 
 
Infusion de coeur + 10% de sérum   @   Bouillon de jus de tomates 
Le C-159 n'est pas léthal pour une souris à laquelle on l'injec- te par voie intraveineuse à raison de 750   mg/kg   dissous dans l'eau à une concentration de 2%;

   une dose de 1000 mg/kg est léthaleo 
Le   C=159   dissous dans une solution d'éthanol à 8% protège avec succès des souris infectées par inoculation intrapéritonale d'une dose lé- thale de Diplococcus pneumoniae9 à raison de 1,75   mg/Kg   quand on les traite par voie intrapéritonale, et à raison de 1395 mg/Kg quand on les traite par voie intramusculaire au moment de l'infectiono Le traitement par voie orale à raison de 500 mg/kg n'agit pas de façon effective sur l'infection expérimentale. 



   Il est bien entendu que pour la production de l'antibiotique, l'invention n'est pas limitée à ce micro-organisme particulier, mais com- prend particulièrement l'utilisation de   microorganismes   consistant en cul- tures isolées naturelles variants ou mutants produits en traitant   l'orga-   nisme décrit par des agents de mutation tels que des rayons X, radiations ultraviolettes et gaz moutardes azotés. 



   Les exemples qui suivent illustrent la préparation de bouillons de fermentation contenant l'antibiotique. 

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  EXEMPLE I.- 
 EMI4.1 
 On soumet du streptomyces canus (culture C509) à une fermentation aérobie pendant 72 heures à 27 C, sur un agitateur rotatif. On stérilise 100 ml de milieu dans un vase d'Erlenmeyer de 500 ml pendant 30 minutes à 
 EMI4.2 
 1905 atm., puis on lui inocule une croissance végétative de 42 heures à raison de 2%. Le milieu aqueux renferme   3%   de polysaccharide (Argo; dex- 
 EMI4.3 
 trine resynthétisée), 1% de liqueur de macération du mais, 0,5% de K2HP04y 0,5% de NaCl, 0,5% de Nana3 et 1% de farine de soyao La puissance finale du bouillon antibiotique, mesurée par l'essai biologique décrit plus haut, est de 20,2 mm, à l'état non dilué, et de 18,5 mm, dilué trois fois. 



     EXEMPLE   II.- 
 EMI4.4 
 On soumet à la fermentation une culture C509 de Stre tom ces ca- nus dans un appareil de fermentation de 1000 gallons (3785 litres), en uti- lisant le milieu de l'exemple I inoculé de semence végétative de 72 heures. 



  Après 60 heures, la puissance du bouillon est de 25 mm à l'état non dilué, et de 22 mm, dilué trois fois. 



   EXEMPLE   III.-   
 EMI4.5 
 On soumet du Streptomyoes oanus (culture C159) à une fermentation sans agitation et avec aération à raison de 74 pieds cubes (2095 litres) 
 EMI4.6 
 par minute à 2995 C pendant 120 heures, dans 600 gallons (2270 litres) d'un milieu contenant 190, de cérélose, 10% de farine de soya, 0,5% de chloru- re de sodium,   0,1%   de carbonate de calcium et   0,05%   d'une charge Curbay 
 EMI4.7 
 BoGo de produits solubles de distillerieo Le pH est de 7,4 au début de la fermentation; il descend à 6,0 puis monte jusqu'à 8,4 pour finir à 8,00 La-puissance finale du bouillon antibiotique est de 14,7   mm,   à l'état non dilué, et 12,5 mm dilué trois fois. 



     EXEMPLE   IV.- 
On fait fermenter du Streptomyces canus (culture C 159) sans agi- 
 EMI4.8 
 tation et avec aération de 74 pieds cubes (2095 litres) par minute à 2ge5OC pendant 100 heures dans 610 gallons (2309 litres) de milieu contenant 1,0% de cérélose, 190, de farine de soya, 0,5% de chlorure de sodium, 0,1% de carbonate de calcium et   0,05%   d'une charge Curbay B.G. de produits solubles de distillerie. Le pH est de 7,1 au début de la fermentation, et monte graduellement jusque 799 environ. La puissance du bouillon antibiotique après 70 heures, suivant l'essai biologique décrit plus haut, est de   14e9   mm à l'état non dilué, et 12 mm, dilué trois fois. 



   EXEMPLE V.- 
 EMI4.9 
 On fait fermenter du Streptomyces canus (culture C 159) en milieu aérobie pendant 72 heures à 27 C dans un agitateur rotatif. On stérilise 100 ml de milieu dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml, pendant 30 minutes sous 1,05 atmo puis on lui inocule une croissance végétative de 32 heures 
 EMI4.10 
 à 1a Le milieu aqueux renferme 1,0% de cérélose, 0,05% de charge Curbay de produits solubles de distillerie, 0,5% de chlorure de sodium, 0,1% de carbonate de calcium et 1,0% de farine de soya. La puissance finale du bouillon antibiotique est de 17,4 mm à l'état non dilué, et de 14,0, dilué trois   foiso   Le pH au moment de la récolte, est de 8,0. 



   On sépare l'antibiotique C 159 des bouillons de fermentation par 
 EMI4.11 
 filtration pour séparer le mycélium, réglage du pH du bouillon filtré'A 8,5 environ, et adsorption sur du silicate de magnésium de qualité chroma- tographique (par exemple 2,27 kg de Magnésol pour 453 litres de bouillon filtré). Après séparation des corps solides par filtration, on élue l'an- tibiotique du gâteau, par exemple, par un dixième de volume d'un mélange 

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 1:1 de méthanol et eauo On sépare ensuite l'antibiotique solide de l'élu- at, par exemple, par concentration par distillation dans le vide, suivie de lyophilisation ou de séchage par pulvérisation du concentré aqueux. On maintient le pH dans la gamme de 6,5 à 7,5 pendant cette concentration. 



   En variante, on effectue   l'élution   au moyen d'un mélange de 3 parties de n-butanol et une partie   d'eau,   en utilisant un dixième du   volu-   me du bouillon   filtréo   Après répétition de l'opération, on concentre les éluats réunis et on les sèche à fond par distillation dans le vide, en- maintenant le pH dans la gamme de 7 à 8, jusqu'à un dixième ou un vingtiè- me de leur volume originale Après filtration, on précipite l'antibiotique de sa solution concentrée, anhydre, limpide dans le butanol, par exemple, par addition de mélanges d'alcanes inférieurs tels que quatre ou cinq vo- lumes de Skellysolve Bo 
On peut également appliquer l'extraction par solvanto On extrait par exemple, l'antibiotique du bouillon filtré au pH 2,5, 6,0 ou   9,

  0   par du n-butanol mais pas par du chloroforme ni par de la méthylisobutyloéto- neo La gamme préférée de pH pour   l'extraction,   est d'environ 8,2 à 8,5 et on sépare l'antibiotique de l'extrait de butanol par concentration jus- qu'à ce qu'il cristallise ou par séchage azéotropique suivi de lyophilisa- tion, ou précipitation par addition de Skellysolve B. 



   On peut également séparer l'antibiotique C 159 par adsorption sur du charbon de bois activé (par exemple du Darco KB), à'partir de bouil- lon filtré, suivie   d'élution   par un mélange en parties égales de n-butanol et eau acidifiée au pH 390 par de l'acide chlorhydriqueo On sépare ensui- te les matières solides de l'éluat comme plus haut. 



   Les exemples ci-après illustrent l'invention sans la limiter, et décrivent la séparation de l'antibiotique d'un bouillon de fermentation sous ses deux formes, brute et purifiée. 



   EXEMPLE VI.- 
On filtre 570 gallons (2147 litres) de bouillon de fermentation obtenu suivant l'exemple III, en y mélangeant   2,4%   d'un agent auxiliaire de filtration. On règle le pH du filtrat à 8,5 par addition d'hydroxyde de sodium à   50%,   puis on remue pendant 30 minutes avec 5 livres (2,26 kg) de   Magnésol   par 100 gallons (379 litres) de filtrat. On recueille le gâteau de Magnésol et on l'élue par une solution de parties égales de méthanol et d'eau dont le volume est égal au dixième de celui du bouillon filtré. On concentre ensuite l'éluat par distillation dans le vide, pour obtenir 32 1 d'une solution aqueuse de l'antibiotique possédant une puissance de 19,7 mm à l'état non dilué, et 17,1 mm, dilué trois fois. 



   On lyophilise une portion de 1300 ml du concentré aqueux pour obtenir 26 g d'antibiotique C 159 ayant une puissance, à 1 mgm/ml, de 12,9 à l'état non dilué, et de 10,0, dilué trois fois. 



   On extrait une autre portion de 200 ml du concentré aqueux au pH 8,0, quatre fois par un quart de volume de n-butanol. On combine les ex- traits de butanol et on les concentre à un volume de 40 ml par distillation dans le video On ajoute vingt millilitres du concentré sec dans le butanol, à 80 ml de Skellysolve B, pour précipiter 170 mgm d'antibiotique C-159 so- lide, ayant une puissance à 1 mgm/ml de 1892 à   1 état   non dilué et de 1799 mm, dilué trois fois. On distille dans le vide les autres 20 ml de concen- tré de butanol en y ajoutant de l'eau, pour obtenir 15 ml de concentré   a-   queux qu'on lyophilise ensuite pour obtenir 329 mgm d'antibiotique soli- de, ayant une puissance, à 1 mgm/ml de 170 mm à   1 état   non dilué et de 1590 mm, dilué trois fois. 

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     EXEMPLE   VII.- 
On filtre 460 gallons (1741 litres) de bouillon de   fermentation   obtenu suivant l'exemple   IV   au pH de récolte de 7,1 environ, en y mélangeant 2,4% d'agent auxiliaire de filtration. On règle le pH du filtrat à 8,5 par addition d'hydroxyde de sodium à 50%. On remue ensuite le filtrat pendant environ 30 minutes avec du Magnésol, à raison de 2,26 kg pour 100 gallons (379 litres) de filtrat. On recueille le gâteau de Magnésol, et on l'élue en le remuant deux fois avec environ 40 gallons (151 litres) d'un mélange de trois parties de n-butanol avec une partie   d'eau.   On con- centre les éluats combinés par distillation dans le vide, à un volume   d'en-   viron 16 litres, ayant une puissance de 1790 mm, dilués dix fois.

   Il se précipite également 185 g d'antibiotique solide, humide, ayant une puissan- ce à 1 mgm/ml, de 12,9 mm à   l'état   non dilué, et de 10,0   mm,   dilué trois fois. 



   On concentre onze litres du concentré de butanol par distillation dans le vide jusqu'à un volume de 1350 ml, qu'on ajoute à quatre volumes de Skellysolve B pour précipiter l'antibiotique   C-159   solide, ayant une puissance, à 1 mgm/ml, de 1999 mm à l'état non dilué et de 17,2 mm, dilué trois fois, et pesant 26 g après séchage. 



   On augmente la puissance de ces produits solides en formant un brouet dans le méthanol (2 ml/g), puis on sépare les solides non dissous par filtration et on ajoute quatre volumes d'éther diéthylique pour préci- piter l'antibiotique. La liqueur-mère méthanol-éther ne contient que des impuretés inaotiveso 
EXEMPLE VIII.- 
On prépare un échantillon pur d'antibiotique   C=159   par réparti- tion à contre-courant dans six tubes en utilisant comme phase supérieure un mélange saturé d'eau d'une partie de n-butanol et 1,5 partie de méthyl-   isobutylcétone,   et comme phase inférieure, de l'eau tamponnée par une so- lution 0,02 molaire de phosphate au pH 6,0 et saturée à la fois de butanol et méthylisobutylcétoneo On avait déterminé d'avance que cette paire de systèmes de solvants, donne un rapport de répartition de 1.

   On dissout un gramme d'antibiotique C=159 solide dans 100 ml de la phase aqueuse, et on l'introduit dans un tube séparateur contenant 100 ml de la phase supérieu- re de solvant. Après mélange et séparation, on transfère la phase inférieu- re dans un second tube, et on la mélange à de la phase supérieure fraîche. 



  On ajoute de la phase aqueuse fraîche à la phase supérieure de solvant res- tant dans le tube de départ. On poursuit cet écoulement à contre-courant de la manière usuelle jusqu'à ce que cinq transferts aient encore été ef- fectuéso 
On combine les phases aqueuses provenant des tubes 2, 3 et   4,   et on les extrait par du butanol. On ajoute ce butanol aux phases de sol- vants combinées provenant des mêmes tubes, on sèche le mélange par azéotro- pie et on le lyophilise pour obtenir 140 mgm d'antibiotique   C-159   solide purifié, ayant une puissance, à 1 mgm/ml, de 23,0 mm à l'état non dilué, de 20,0 mm dilué trois fois, et de 17,5 mm dilué neuf   fois.   



   L'antibiotique C=159 accuse dans   l'eau,   un maximum d'absorption ultraviolette à 345 microns (Et% =71) et un palier à 260 - 280 microns. 



   1cm Granulé dans du bromure de potassium,   1 antibiotique   C-159 accuse des ban- des d'absorption caractéristiques dans la région infrarouge du spectre aux longueurs d'ondes suivantes, exprimées en microns   g 2,90,   3,38, 5,85 (palier), 6,05 (palier marqué), 6,10, 6,55, 7,23, 7,50, 8,00 (bande large) et 9,40 (bande large)o 

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L'antibiotique   C-159   titre à l'analyse environ   58,7%   de carbone, 7,4% d'hydrogène, 9,9% d'azote et, par différence,   2490%   d'oxygène.

   Par chromatographie sur papier suivant deux directions, après hydrolyse, par chauffage à 150 C en tube scellé en présence d'hydroxyde de baryum 0,38 N pendant 1,5 heure ou d'acide chlorhydrique à 20% pendant 5 heures, on trou- ve que l'antibiotique renferme les quatre acides aminés glycine,   ce-alanine,   thréonine, et acide aspartique, et aucun autre.   L'amphomycine   contient de l'histidine, de l'acide   aspartique,de   la glycine, de l'acide glutamique, de la proline, de la valine et un autre acide aminé, et ne contient ni Ó- alanine, ni thréonine. 



   L'antibiotique C-159 est insoluble dans l'acétone, l'éther et l'acétate de butyle; il est soluble dans le méthanol et est précipité de sa solution dans le méthanol par addition d'acétone ou d'éther. 



   L'antibiotique C-159 est très soluble dans une solution aqueuse légèrement alcaline, mais est considérablement moins soluble en solution aqueuse à réaction acide. C'est ainsi qu'en acidifiant graduellement une, solution de 1 g dans 20 ml d'eau ayant un pH initial de 8,8, quand on at- teint le pH 4,4, il se forme un précipité lourd et l'activité de la solu- tion est réduite à environ la moitié de sa valeur d'origine. Quand on at- teint le pH 3,7, l'activité de la solution n'est plus que d'environ un dixiè- me de l'activité initiale. 



     L'antibiotique     C=159   est un acide, et se transforme en sel d'am- monium, d'ammonium substitué et en sels métalliques, tels que ceux de so- dium, potassium, calcium, magnésium, aluminium,   etc... ,   par addition de la base appropriée, par exemple, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de so- dium, à une solution aqueuse de   l'antibiotique.   Si on le désire, on peut séparer les sels métalliques solides, par exemple par lyophilisation,   REVENDICATIONS.   



   1.- Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, le   C-159,   caractérisé en ce que l'on cultive une souche de Streptomyces canus produc- trice de C-159, dont les propriétés sont décrites dans la description, dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif convenable jusqu'à ce qu'une activité antibiotique notable soit impartie au milieu, et on sépare l'antibiotique du bouillon de fermentation.

Claims

20 - Procédé suivant la revendication 19 caractérisé en ce qu'on cultive la. souche de Streptomyces canas productrice de C=159 pendant envi- ron 42 à 70 heures.

3.- Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on cultive la souche de Streptomyces canus productrice de C-159 à une température comprise entre environ 27 et environ 30 C.

4.- Procédé suivant les revendications 1, 2 ou 39 caractérisé en ce que le milieu de fermentation contient de la farine de soya.

50 - Procédé suivant la revend.ication 4, caractérisé en ce que le milieu de fermentation contient 1% de farine de soyao 6. - Procédé suivant les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on sépare l'antibiotique du bouillon de fermentation par extraction au moyen de n=butanolo 7.- Procédé suivant les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on sépare l'antibiotique du bouillon de fermentation par filtration du bouillon et adsorption de l'antibiotique à partir du filtrat, à un pH de 8,5 environ, sur du silicate de magnésium, on élue l'antibiotique du sili- <Desc/Clms Page number 8> cate de magnésium par de l'alcool aqueux et on sépare l'antibiotique de l'éluato 8.- Substance antibiotique efficace pour l'inhibition de crois- sance de microorganismes à Gramm-positif,

caractérisée en ce qu'elle con- tient les acides aminés glycine, alanine, thréonine et acide aspartique, sans aucun autre, est hautement soluble dans l'eau alcaline et hautement insoluble dans des solutions aqueuses à un pH inférieur à 4, soluble dans le méthanol et insoluble dans l'acétone, l'éther diéthylique et l'acétate de butyle, contient sous sa forme purifiée, pratiquement 58,7% de carbone, 7,4% d'hydrogène, 9,9% d'azote et 24,0% d'oxygène par dosé par différence, accuse à l'état dissous dans l'eau une absorption maximum de lumière ultra- violette à 345 microns (E1% = 71), et un palier à 260 - 280 microns, et des bandes d'absorption 1cm caractéristiques dans la région infrarouge du spectre quand on la granule dans du bromure de potassium,

aux longueurs d'onde suivantes exprimées en microns g 2,90, 39389 5,85 (palier), 6,05 (pa- lier marqué), 6,10, 6,55, 79239 7,50, 8,00 mande large), et 9,40 (bande large), ou ses sels.

9.- Substance antibiotique suivant la revendication 8, caracté- risée en ce que le sel est un sel de sodium.

10.- Substance antibiotique suivant la revendication 8, caracté- risée en ce que le sel est un sel de calcium.

11.- Composition contenant au moins une partie pour mille d'une substance suivant la revendication 80 12.- Agent thérapeutique sous forme d'unité de dosage, caracté- risé en ce qu'il contient une substance suivant la revendication 8 en quan- tité non toxique, efficace contre les infections bactériennes.