<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention est relative à de nouveaux antibiotiques utiles et à des procédés pour leur production.
Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux antibioti- ques sous diverses formes, ainsi que des procédés pour les produire par fermentation, de même que pour les concentrer, les purifier, les isoler et produire leurs sels. Sous sa for- me libre, le nouvel antibiotique est appelé "thiostrepton".
L'antibiotique suivant la présente invention est formé par la culture, dans des conditions contrôlées, d'une espèce non décrite jusqu'ici de Streptomyces.
Le microorganisme.-
Le microorganisme utilisé pour la préparation du thiostrepton est une souche de Streptomyces, isolée d'un é- chantillon de terre désertique obtenue dans le New-Mexico aux Etats-Unis d'Amérique, une culture du microorganisme vivant a été déposée et fait partie de la collection de cultures du Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey) où elle est disponible et où le numéro 3705 lui a été assigné dans la collection Waksman. Cette souche est désignée ci-après comme Streptomyces sp. 3705.
Il est évident que l'invention n'est pas limitée à l'utilisation de l'organisme particulier ici décrit, mais englobe entre autres les mutantes produites à partir des orga- nismes décrits par des agents de mutation, tels que rayons X, rayons ultra-violets, actinophages et moutardes azotées.
Pour isoler et caractériser le microorganisme, une partie de l'échantillon de terre est agitée dans de t'eau distillée stérile et étalée sur un milieu d'agar écran. Ce milieu contient :
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EMI2.1
<tb> Sucrose <SEP> 10,0 <SEP> grs.
<tb>
Avide <SEP> citrique <SEP> 1,2 <SEP> grs.
<tb>
<tb>
(NH4)2HP04 <SEP> 0,4 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
KC1 <SEP> 0,08 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.2
MgCl2.H20 0,41$ gr.
EMI2.3
<tb> MnC12.4H2o <SEP> 0,036 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.4
FeCl3.bHZ0 0,023 gr.
EMI2.5
<tb> ZnC12 <SEP> 0,021 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.6
COC1206H20 0,004 gr.
EMI2.7
<tb> Agar <SEP> 15,0 <SEP> grs.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Les cultures sont alors testées par le procédé d'étalement sur plaque d'agar de boeuf et levure, en vue de déterminer leur activité antibiotique vis-à-vis des bactéries et des fongi. La culture n'inhibe aucun des fongi d'essai,
EMI2.8
mais inhibe les bactéries d'essai suivantes : lViicrococcus pyo- enes var. aureus, Aerroobbacillus po a. Streptococcus faeca- lis, Bacillus subtil, Lactobacillus aCido!,:..Llus, Clostridium septicum, Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium diphteriae, et lycobaéterium tuberculosis.
On décrira ci-après des colonies du microorganisme incubé pendant 10 jours à 24 C sur divers milieru (description des couleurs selon l'ouvrage de Ridgway "Color Standars and Color Nomenclature , Washington; D. C. , 1912).
EMI2.9
Agar Czepek-Dox : NaN 3' gr-; 2 4 gr KC1, 0,5 gr.; MgS04.
7H20 0,5 gr.; FeSO .7H 2 , , 0 0 0 1 gr.; glucose, 40 gr.; agar 15 gr.; eau distillée ad 1000 ml. La croissance est bonne et les colonies ont des bords entiers. La sporulation est blanche avec des zones gris-fumée et des taches bleu de médici clair. La croissance par transparence est olive pâle avec des
EMI2.10
taches gris glauque foncé. Pas dfexopigment produit.
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Agar de Sabouraud. cultures inclinées:
Glucose, 40 grs.; néopeptone, 10 grs.; agar, 15 grs.; eau distillée ad 1000 ml. La croissance est bonne et les colonies ont des bords ondulés. Les spores sont blancs et la croissance par transparence Est ocre-tan à brun Mars.
Un exopigment brun est produit..
Agar d'infusion de graines de soja :
Une suspension à 2% de farine de graines de soja est bouillie pendant 30 minutes et filtrée à chaud. Le pH est alors ajusté à 7 à l'aide d'hydroxyde de sodium et 0,2% de glucose, 0,5% de NaCl et 2% d'agar ou gélose sont ajoutés.
La croissance est bonne, les colonies ont des bords entiers, les spores sont blancs à gris Payne olive, la croissance par transparence est olive pâle. Pas d'exopigment.
Agar d'Henrici :
Caséïnate ou case N.Z, 5 grs.; glycérol, 5 ml. ; K2HOP4, 2 grs.; MgSO4.7H2O, trace ; agar, 15 grs.; eau distil- lée ad 1000 ml.; pH 7,0. La croissance est bonne, les colo- nies ont des bords entiers, les spores sont blancs avec des zones gris foncé mat, la croissance par transparence est brun noirâtre. Pas d'exopigment.
Agar boeuf-levure :
Extrait de boeuf, 1± grs.; extrait de levure, 3 grs.; peptone, 6 grs.; dextrose, 1 gr.; agar, 15 grs.; eau distillée ad 1000 ce. Croissance légère; colonies avec bords entiers, spores blancs; croissance par transparence avellanée.
Pas d!exopigment.
La culture liquéfie la gélatine et produit une coa- gulation acide dans le lait, mais ne produit pas dtindol ou de réduction de nitrate ea nitrite.
L'organisme est capable d'utiliser les sources de
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EMI4.1
carbone suivantes dans un milieu ae 1. oun-.ant du (';;Jl); S04 comme source d'azote : arabinose, I'lf!tnttc3. xyloue, gluco- se, galactose, fructose mannose, ZUCtU.3C, Cr imulino dextrine , {raf1ïnose , amidon, glyc,!rol, inosttol et remuai 1;01.
La croissance est médiocrement supoorte par la salicino le sorbitol, le citrate de sodium et l'acétate de sodium.
La croissance n'est pas supportée par le dulcitol,
EMI4.2
le fonniate d'aumonium, l' oxalate d'ammonium et le tartrate d 1 ;:;m:!oni um. Dans un milieu de base contenant de l'amidon G :-..: ;12 source de carbone, les sources d'azote suivantes suppor- teront la croissance : sulfate d'ammonium, nitrate de sodium nitrite de sodium et asparagine. La croissance est médiocre-
EMI4.3
.#,xï.t supportée par la 1-tyrosine et le d,l-tryptophane. La croissance n'est pas supportée par l'acétamide.
Lfantibiotiaue.- On a constaté que le ttor.yces s. 3705 produit #en :1.,?,;:'lfSe d'antibiotiques. Lorsque la croissance s'opère dane un milieu approprié, au moins trois antibiotiques diffé- rées sont produits. Lorsque le mycélium est séparé du bouil- lon par filtration, un des antibiotiques est présent principa- lement dans la matte de mycelium, tandis que les deux autres antibiotiques sont présents principalement dans le filtrat.
-antibiotique auquel l'invention se rapporte principalement est celui qui est extrait de latte de mycélium et auquel a été donné le nom de "thiostrepton".
-Pour former du thiostrepton, on fait pousser du
EMI4.4
5tom ees ss. 3705 à une température appropriée de 20 à 35 y de préférence à environ 25-27 C, dans des conditions aé- robies submergées, dans un milieu nutritif aqueux contenant une source d'encre et de carbone fermentescible assimilable et une source d'azote assimilable. Des sources appropriées
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. de carbone,., \.Comme indiqué plus haut, comportent des hydrates de carbone, tels que amidon, dextrine ,et des sucres, tels que maltose, lactose et glucose; du glycérol; -des li ides; des graisses, etc...
Comme sources d'azote appropriées, on peut citer les sources d'azote organiques, telles que l'aspa- ragine et la farine de graines de soja$ de même que les sour- ces d'azote inorganiques, telles que le sulfate d'ammonium ou le nitrate de sodium. La fermentation est exécutée pendant environ 72 à l6ô heures à un pH situé entre environ 6 et 8.
A la fin de cette période, une quantité substantielle de thio- strepton a été formée (comme montré par des bioessais), comme décrit plus en détails dans les exemples.
Après la fin de la croissance, le thiostrepton est isolé du bouillon en séparant le gâteau de mycelium du bouil- lon par filtration ou centrifugation. Le thiostrepton est alors extrait du gâteau de mycelium à l'aide d'un solvant organi- que approprié, tel que le chloroforme, le dioxane, une amide d'acide N,N-di-(alcoyl inféreiur)alcanoïque inférieur (par ex- emple, N,N-diméthylformamide ou N,N-diméthylacétamide) ou l'alcool benzylique.
Le thiostrepton est une base faible, qui forme des sels avec les acides, en particulier avec des acides minéraux (par exemple, l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique) par réaction avec ceux-ci dans un solvant organique,tel qu'un alcool, comme l'éthanol. L'antibiotique forme également des complexes avec les sels des métaux alcalino-terreux (par exem- ple, le chlorure de calcium ou le chlorure de magnésium) par réaction avec ceux-ci dans un solvant organique, tel qu'un alcool, comme le méthanol. Les sels d'addition avec les acides 'et les complexes de métaux alcalino-terreux sont hydrolysés, lorsqu'ils sont mis en contact avec de l'eau.
Les exemples suivants illustrent des procédés pour,
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réparer, purifier et former des dérivés des antibiotiques suivant la présente invention.
EXEMPLE 1.-
Fermentation de Streptomyces sp.3705 en flacons à agiter.- Stade de germination
Une cuillerée d'une culture de Streptomyce.s sp.
3705 est transféréedans un flacon de 50 ce contenant le mi- lieu suivant:
EMI6.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 15 <SEP> g.
<tb>
Dextrose <SEP> 30
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 2,5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
NaC1 <SEP> 1,0 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Le flacon est incubé pendant 2 jours à 25 C dans un agitateur à mouvement alternatif (140 courses par minute, longueur : 13/4 pouce).
Stade de fermentation
Un inoculum de 10 cc préparé dans le stade de germination est transfère du flacon de germination dans cha- cun de cinq flacons d'un litre contenant le milieu suivant:
EMI6.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 20 <SEP> g.
<tb>
EMI6.3
CoC1.6HO ,005 g. CaC03 1,0g.
EMI6.4
<tb> Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
.Les flacons sont incubés pendant 7 jours à 25 C dans un agitateur à mouvement de va-et-vient. Au bout de sept jours, des échantillons de bouillon neutre centrifugé sont soumis à des essais en vue de déterminer leur activité vis-à-:
EMI6.5
vis du Wçsçoçïusjvosenes var. aureus et Mycobacterium tuberculosis BCG. Les résultats obtenus sont les suivants :
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EMI7.1
<tb> Activité <SEP> en <SEP> unités'de <SEP> dilution <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var <SEP> aureus <SEP> M. <SEP> tuberculosis <SEP> BCG
<tb>
<tb> 250-305 <SEP> 100 <SEP> ¯¯¯¯
<tb>
EXEMPLE 2.-
Fermentation en tank de Streptomyces sp. 3705.-
I-.
Source d'inoculum .-
Des cultures de stock de Streptomyces sp. 3705 .: sont transférées hebdomadairement à des milieux inclinés frais d'agar de Gould ( 2o g. agar, 10 g.glucose, 2,5 g. ex- trait de levure, 1,0 g.K2HOP4 et 1000 cc eau distillée). Les cultures inclinées inoculées sont utilisées après 3 à 5 jours d'inoculation à 25 C.
II.- Préparation d'inoculum.-
Dans un flacon de 500 ce contenant 100 ce du milieu aqueux suivant :
EMI7.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 15 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 20 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CaCO3 <SEP> 5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
NaCl <SEP> 1 <SEP> g. <SEP>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
qui a été stérilisé pendant 30 minutes à 121 C après ajuste- ment du pH à 7,0-7,2 avec de l'hydroxyde de sodium, on place une cuillerée du produit obtenu sous I. La culture est incu- bée pendant 72 heures à 25 C. Au bout de cette période, 10 cc de la culture sont transférés dans un second flacon contenant 100 cc de milieu. Cette seconde culture est incubée pendant 48 heures à 25 C. Au bout de cette période, le contenu du se- cond flacon est transféré dans un flacon d'une capacité de 4 litres contenant 1000 ce du milieu.
Cette troisième culture est incubée pendant 48 heures à 25 C, puis transférée dans un germinateur d'une capacité de 10 gallons contenant 25 litres
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d'un milieu préalablement stérilisé pendant 15 minutes à 121 C . et présentant la composition suivante:
EMI8.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 750 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 1000 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CaC03 <SEP> 25 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 25 <SEP> litres
<tb>
(pH ajusté à 7,0 @ du NaCH avant et après stérilisation)
Le germinateur est aéré et agité pendant 30 à 36 heures à 25 C sous une pressi.. 10 livres par pouce carré.
Un agent anti-mousse est également ajouté au milieu pour em- pêcher un moussage excessif.
III.- Fermentation .-
Dans un fermentateur de 100 gallons contenant 50 gallons d'un milieu, qui a été précédemment stérilisé pendant
15 minutes et contient :
EMI8.2
<tb> 3,0% <SEP> de <SEP> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> soja
<tb>
<tb> 3,0% <SEP> glucose
<tb>
<tb>
<tb> 0,5% <SEP> CaCO3
<tb>
<tb>
<tb> 0,2% <SEP> Na2SO4
<tb>
<tb>
<tb> 0,25% <SEP> Foamrex <SEP> S <SEP> (Socony <SEP> Vacuum <SEP> Oil <SEP> Company, <SEP> Inc.), <SEP> ou
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> autre <SEP> agent <SEP> anti-mousse <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> pH <SEP> 7,0 <SEP> avec
<tb>
NaOH avant stérilisation, on introduit le con- tenu du germinateur. Le fermerlt ateur est aéré et agité pendant 56 à 108 heures à 25 C sous une pression de 10 livres par pouce carré.
Au bout de 50 à 80 heures, l'activité atteint un maximum de 10.000 à 16.000 unités de dilution/ce vis-à-vis du Micrococcus pyogenes var. aureuset reste ensuite sensiblement constante. Le pH du bouillon de fermentation reste sensible- nt constant dans la gamme de 7,0 à 7,4 pendant la période de fermentation .
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Le thiostreptonbeut alors être séparé de tout le bouillon par les procédé,,, illustrés dans :.en exemples sui-
EMI9.1
vant.. Exe!'npj.e¯3. - EXTRACTION.du cHZOSxREo; dtun ifY'CELIUTd.
Le bouillon entier neutre est filtré et le gâteau est séché autant que possible dans une presse. Le gâteau do filtre humide est alors placé dans un volume de chloroforme juste assez grand pour donner une bonne pâte (12-15 gallons par 100 livres de gâteau humide) et qui est agitée vigoureu- sement pendant une =- heure.
Le mélange est filtré, le chloro- forme est séparé de l'eau présente et conserva Le gâteau
EMI9.2
est alors extrait avec un second voilume de chloroforme (F3 à 10 gallons par 100 livres anglaises de gâteau humide), après quoi on filtre et on sépare le chloroforme, qui est combiné
EMI9.3
au premier extrait Les extraits chloroformiques combinés sont alors distillés sous vide( température maximum de l'a- lambic : 25 C) jusqu'à 1/50ème du volume originel. A ce con- centrât, on ajoute 10 volumes d'hexaneAprès repos pendant
EMI9.4
1 heure, le précipité est séparé par :"¯¯traction, lavé à l'acé- tone et séché.
Le précipité (A) contient 70 à 90% de thiostrepton pur et peut être davantage purifié et cristallisé par disso- lution dans du dioxane (1 gramme/10 cc), en ajoutant du car- bone (2% poids/volume), en chauffant le mélange tout en agi- tant à 50 C, puis en filtrant et en ajoutant lentement 5 vo- lumes d'eau au filtrat. Le précipité cristallin ainsi obtenu est assez pur, mais il est encore quelque peu coloré. Il peut être purifié davantage et un produit pus blanc peut être ob- tenu en redissolvant le précipité dans du dioxane (1 gramme/ 15 ce), en filtrant et en ajoutant lentenant au filtrat 5 vo-
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lum@@ @@@e solution aqueuse a 50% de méthanol.
Le mélange est laissé au repos à température ambiante jusqu'au lendemain et le précipité cristallin de thiostrepton est alors séparé lavé à l'acétone et séché. Le produit obtenu est une matière uniformément cristalline blanche ou jaune pâle, qui titre
100. 000-110.000 unités de dilution par mgr (Micrococcus pyo- genes var. aureus).
Les rendements de chacun des stades de cristallisation et de recristallisation sont compris entre environ 75 et 80%. actives
Les matières/additionnelles sont également présen- tes en petites quantités dans le'bouillon, @ne de ces matières peut être obtenue à partir du premier précipité brat (A), en empâtant ce précipité avec de l'acétone. Cette matière parti- culière est soluble dans l'acétone et peur 3n être isolée par précipitation à l'eau ou évaporation de l'acétone jusqu'à sic- cité .
L'activité de cette matière partiellement purifiée est de l'ordre de 6.000 à 8.000 unités de dilation par mgr (Mi- crococous pyogenes var. aureus. )
Une autre matière présente peut être récupérée par cristallisation des liqueurs-mères de la seconde précipitation du thiostrepton. Cette autre matière présente une solubilité Plus grande que le thiostrpton et ne peut être récupérée des liqueurs-mères organiques de comstallisation qu'après addition de beaucoup d'eau. L'activité in vitro de la matière brute-est de l'ordre de 15.000 à 20. 000 unités de dilution par milligram. me (Micrococcus pyogenes var. aureus).
EXEMPLE 4.-
Préparation du chlorhydrate de thiostrepton.-
Le chlorhydrate de thiostrepton est formé en empâ- tant le thiostrepton cristallin ou brut dans un alcool, tel que le méthanol, puis en ajoutant un équivalent d'acide chlor- hy rique sous forme d'une solution aqueuse concentrée. Le thic-
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strepton se dissou' ce qui indique la formation d'un sel.
Le chlorhydrate peut être précipité de cette solution par ad- dition d'éther ou d'acétate d'éthyle. Le chlorhydrate est in- stable sous forme de solide ou dans la solution méthanolique originelle, son activité diminuant rapidement . Si l'on ajou- te de l'eau à la matière solide ou à la solution alcoolique, le sel est immédiatement hydrolysé et la base libre est obte- nue.
D'autres sels d'addition avec des acides , tels, que le sulfate, peuvent être préparés de la même manière que le chlorhydrate et ont les mêmes propriétés générales.
EXEMPLE 5. -
EMI11.1
Préparation du complexe de c.orure ca3;.:i:que - dE thlo-gr on-- Le complexe do chlor'.'re calcique est formé en empâ- tant du thiostrepton dans une @@@@ution méthanolique à 0,5% de chlorure de calcium à une concentration de 4-5 milligrammes par cc. La base se dissout lentement ce qui indique la forma- tion d'un complexe, étant donné qu'en l'absence de chlorure de calcium elle ne se dissout pas. Lorsque la dissolution est complète ,le complexe est précipité par addition d'éther ou d'acétate d' éthyle. L'addition d'eau à la matière solide ou à la solution méthanolique originelle provoque une hydrolyse immédiate du complexe en sorte qu'on obtient la base libre.
Propriétés physiques et chimiques du thiostrepton.-
Le thiostrepton cristallisé a les caractéristiques physiques et chimiques suivantes: Point de fusion : Fo@ce à environ 235 C et fond avec décomposition à envi-
EMI11.2
ron tr5-56 C
<Desc/Clms Page number 12>
Analyse élémentaire (approximatif):
C= 51,75 %
H = 5,30
S = 9,22 %
N = 15,84 %
0 = 17,89% (par différence)
Pas d'autres éléments présents .
Acétyl = 8,70 % .
Pas de groupes méthoxy . Ne forme pas d'esters avec les anhydrides succinique et phtalique .
Poids équivalent = 380
Solubilité :
Bonne solubilité dans dioxane, chloroforme, N,N-dimé- thylformamide, N;N-dimérthylacétamide et alcool benzylique.
Soluble à raison de 100-200 mcg/ml dans alkanols, tels que méthanol, éthanol, isopropanol et butanol, et dans trichloro- éthylène et propylène glycol. Presque insoluble dans l'eau (10-20 mcg/ml). Insoluble dans éther, acétone, benzène, hexa- ne, acétate déthyle , acétate d'amyle, éther dibutylique, glycol, diéthylène glycol, glycérol, huile de maïs, huile de sésame et oléate d'éthyle.
Stabilité :
Stable jusqu'à 1 semaine dans une solution 50%- dioxane-505 eau à pH 7 à 30 C. Très instable dans le même système de solvants à pH 2 et 11. Stable dans la diméthyl- acétamide pendant au moins deux mois à une température infé- rieure à la température ambiante (faible perte d'activité seulement après 2 mois à température ambiante).
Spectre ultraviolet :
Les ressauts d'absorption d'ultraviolet du thio- strepton cristallin dans le méthanol se présentent aux lon-
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gueurs d'ondes suivantes:
EMI13.1
<tb> # <SEP> (m )/240
<tb>
<tb> 280
<tb>
<tb> 305
<tb>
. Spectre infra-rouge :
Les pointes et ressauts (r) d'absorption d'infra- rouge se présentent aux fréquences et longueurs d'ondes sui- vantes :
EMI13.2
1(cm-1) À yi) 7 ) /\'
EMI13.3
<tb> 3289 <SEP> 3,04 <SEP> 1116 <SEP> 8,96
<tb>
<tb> 1733 <SEP> 5,77 <SEP> 1094 <SEP> 9,14
<tb> 1658 <SEP> 6,03 <SEP> 1060 <SEP> 9,43
<tb>
<tb> 1631 <SEP> 6,13 <SEP> 1033 <SEP> 9,68 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1580 <SEP> 6,33 <SEP> 1020 <SEP> 9,60
<tb>
<tb> 1534 <SEP> 6,52 <SEP> (r) <SEP> 984 <SEP> 10,16
<tb>
<tb> 1511 <SEP> 6,62 <SEP> 971 <SEP> 10,30
<tb>
<tb>
<tb> 1486 <SEP> 6,73 <SEP> 951.
<SEP> 10,52
<tb>
<tb> 1420 <SEP> 7,04 <SEP> (r) <SEP> 935 <SEP> 10,70
<tb> 1376 <SEP> 7,27 <SEP> 9 <SEP> 21 <SEP> 10,86 <SEP> (r)
<tb>
<tb>
<tb> 1366 <SEP> 7,32 <SEP> (r) <SEP> 893 <SEP> 11,20
<tb> 1348 <SEP> 7,42 <SEP> (r) <SEP> 856 <SEP> 11,68
<tb>
<tb> 1309 <SEP> 7,64 <SEP> (r) <SEP> 808 <SEP> 12,38
<tb>
<tb> 1282 <SEP> 7,80 <SEP> 780 <SEP> 12,82
<tb>
<tb> 1269 <SEP> 7,88 <SEP> 769 <SEP> 13,00 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1244 <SEP> 8,04 <SEP> (r) <SEP> 760 <SEP> 13,15
<tb>
<tb> 1203 <SEP> 8,31 <SEP> 740 <SEP> 13,52
<tb>
<tb> 1166 <SEP> 8,58 <SEP> (r) <SEP> 730 <SEP> 13,70
<tb>
<tb> 1152 <SEP> 8,68 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1138 <SEP> 8,79
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
Propriétés biologiques du thiostrepton.-
Le thiostrepton possède un large spectre antibac- térien vis-à-vis de nombreuses bactéries (et virus),
comme indiqué par la liste partielle suante:
EMI14.2
Microor'anisme Concentration d'inhibi- tion minimum en -;Y/ml.
Micrococcus !?yogeues var. aureus 209P o 01-0 02
EMI14.3
<tb> Cahill <SEP> 0,03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N 5 <SEP> 1,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N 376 <SEP> 1,67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203 <SEP> 0,003
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,03
<tb>
EMI14.4
Streptococcus faecalis ,06 ϱ *2àìïÏH˯aoidoilus 0,06 Clostridium septicwn 0,15 Dr5lococcus pneumoniae type 3 0,3 Xnebacterum¯dijohteriae 2cobactérimn tuberculors var. bovis (BCG) 3,0 Aerobaéter aeroge.es 50 Escherichia coli
EMI14.5
<tb> 50
<tb>
EMI14.6
Pseudomonas aftrSl2!l.
Salmonella schettmulleri Shigella sonnai
EMI14.7
<tb> -### <SEP> 50
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris
<tb>
<tb> 50
<tb>
EMI14.8
Salmonellatyphosa
EMI14.9
<tb> 30
<tb>
EMI14.10
Shigella dysenteriae
EMI14.11
<tb> ######30
<tb>
des D'autres essais ont été exécutés avec des oeufs des souris, des des lapins et des chats pour déterminer la toxicité .l'efficacité du thiostrepton.
EMI14.12
Pour déterminer l'activité :Ll1V:LVO du thiostrepton vis- e-vis du virus méningo-plleumonitis dans des eoufs des
<Desc/Clms Page number 15>
oeufs embryonnés vieux de 7 jours ont été infectés à l'aide de doses de 100 LD50 d'un inoculum standardisé de virus méningo-pneumonitis par la membrane vitelline.
Les oeufs ont ensuite été traités, un jour après l'infection, par la mem- brane vitelline à l'aide de thiostrepton dissous dans de la diméthylacétamide ( rapport antibiotique: diméthylacétamide 1 :10) aux doses indiquées dans le tableau suivant:
TABLEAU 1.-
EMI15.1
<tb> Doses <SEP> Temps <SEP> moyen <SEP> Différence <SEP> Rapport <SEP> PD50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (mgr/oeuf <SEP> ) <SEP> de <SEP> survivance <SEP> dans <SEP> le <SEP> temps <SEP> survivan- <SEP> (mar/oeuû
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (heures) <SEP> de <SEP> survivance <SEP> de/total <SEP> (mgr/oeu)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (heures) <SEP> (après <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ' <SEP> ours <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Contrôle <SEP> (diméthylacétamide) <SEP> 158 <SEP> 0/18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 219 <SEP> +61 <SEP> 8/16 <SEP> 0,
72
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> 213 <SEP> +55 <SEP> 7/17
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,25 <SEP> 189 <SEP> +31 <SEP> 1/17
<tb>
* -aux embryons vivants, 10 jours après l'infection, on a assigné des temps de survivance de 240 heures pour les besoins du calcul.
** -méthode de Reeds et Muench .
Pour déterminer l'activité in vivo du thiostrepton vis-à-vis du Streptococcus pyogenes C203 chez la souris, des souris ont été infectées avec un inoculum standardisé de Streptococcus pyogens C203 par injection intrapéritonale. Les souris ont ensuite été traitées par injection sous-cutanée avec du thio- strepton dissous dans de la N,N-diméthylacétamide et dilué à l'eau jusqu'à la concentration finale indiquée dans le ta- bleau 2 .
<Desc/Clms Page number 16>
TABLEAU 2.-
EMI16.1
<tb> Dose <SEP> Pourcentage
<tb>
<tb>
<tb> (mcg/souris <SEP> dans <SEP> de <SEP> survivance
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> ml. <SEP> de <SEP> solu- <SEP> (%)
<tb>
<tb>
<tb> tion)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Contrôle <SEP> (solu-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> saline) <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 40 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 20
<tb>
Des essais ont également été exécutés pour déter- miner l'activité du thiostrepton vis-à-vis du Micrococcus pyogenes var. aureus n 5 (souche sensible à la pénicilline) et vis-à-vis du Micrococcus pyogenes var. aureus n 376 (sou- che résistant à la pénicilline) chez la souris.
Pour ces dé- terminations, des souris pesant 18 à 20 grammes ont été infec- tées, par la voie intrapéritonéale, à l'aide d'un inoculum standardisé des souches respectives dans 5% de mucine.-Les souris infectées ont été ensuite traitées par injection intra- veineuse avec une seule dose de thiostrepton de la manière in- diquée dans le tableau 3. A des fins comparatives, des essais ont également été faits avec le sel potassique de pénicilline G au lieu de l'antibiotique suivant la présente invention .
<Desc/Clms Page number 17>
TABLEAU 3
EMI17.1
ANTIBIOTIQUE MODE D* ADMINISTRATION Activité -vis-à-vis du 1cgenE.; ;'&.:.:'. arEH.1.S Souche sensible à la Souche résistent à 1 pénicilline n' 5 pénicilline n 3?o r.DST2f S/r Dota Si
EMI17.2
<tb> Solution <SEP> saline <SEP> (con- <SEP> Temps <SEP> de <SEP> survivance <SEP> moyen <SEP> - <SEP> 20 <SEP> heures;
Survivants/Total <SEP> (S/T) <SEP> 0/10
<tb> trôle)
<tb>
EMI17.3
Thiostrepton 100 meizo antibiotique + 1000 mcgQNtNdiéthylncétaide 220 (DMA) dans 0,5 ce solution saline physiologique 222 10 10 220 jazz
EMI17.4
<tb> 50 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> + <SEP> 500 <SEP> mcg. <SEP> DMA <SEP> dans <SEP> 0,25 <SEP> cc <SEP> solution <SEP> saline <SEP> physiologique <SEP> 200 <SEP> 9/10 <SEP> 109
<tb> 25 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> + <SEP> 250 <SEP> mog. <SEP> DMA <SEP> dans <SEP> 0,125 <SEP> ce
<tb>
EMI17.5
solution saline physiologique "9 .10 42 2rJ..
100 mcg. antibiotique + 1000 mcg. dioxam '....::..ns 0,5 cc solution saline physiologique 190 8/10 1 3 //#
EMI17.6
<tb> 50 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> '- <SEP> 500 <SEP> mcg. <SEP> dioxane <SEP> dans <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb> solution <SEP> saline <SEP> physiologique <SEP> 44 <SEP> 2/10 <SEP> 0 <SEP> ci')
<tb> 25 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> + <SEP> 250 <SEP> mcg. <SEP> dioxane <SEP> dans <SEP> 0125 <SEP> 0/10
<tb>
EMI17.7
ce solution saline physiologique 32 1/10 0 cIL':
EMI17.8
<tb> Pénicilline <SEP> G <SEP> potas'- <SEP> 60 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> dans <SEP> 0,5 <SEP> ce <SEP> solution <SEP> saline
<tb> sique <SEP> physiologique <SEP> 155 <SEP> 7/10 <SEP> 0 <SEP> 0/10
<tb> 30 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> dans <SEP> 0,25 <SEP> ce <SEP> solution <SEP> saline <SEP> l) <SEP> 3
<tb> physiologique <SEP> 123 <SEP> 5/10 <SEP> 0 <SEP> 0/9
<tb> 15 <SEP> mcg.
<SEP> antibiotique <SEP> dans <SEP> 0,125 <SEP> ce <SEP> solution <SEP> saline <SEP> 133 <SEP> bzz10
<tb> pysiologique <SEP> 133 <SEP> 6/10 <SEP> 0 <SEP> 0/10
<tb>
* DST - Différence (en heures) dans le temps de survivance par rapport aux contrôles ** Souche résistant à 100 unités de pénicilline in vitro
<Desc/Clms Page number 18>
Les essais précédents démontrent l'efficacité par- ticulière du thiostrepton in vivo contre les infections mi- crococciques et streptococciques.
Pour déterminer la toxicité aiguë du thiostrepton chez la souris, une solution à 10% de l'antibiotique dans de la N,N-diméthylacétamide a été diluée de 1 & 2C dans de l'eau distillée et administrée par la voie intraveinesse (0,lcc/5sec à des souris. La dose léthale LD50 s'est avéré;: d'environ 41,7 mgr/Kg et la dose LD2 estimée à 23,1 mgr/kg.
On a également constaté qu'une seule injection intraveineuse da 5 mg de thio- strepton par kg. n'a pas d'effet fâcheu: sur des animaux d'es- sai , tels que chats, rats et lapins
En thérapie humeine, le thi@ostrepton possède le même spectre antibiotique général que la pénicilline et peut ainsi être utilisé pour combattre les infections dues à des -les coques à gram positif, tel/que les infections dues aux strepto. coques, staphylocoques et pneumocoques. Le thiontrepton. peut être administré entre autres par la voie buccale et par la voie intraveineuse.
Pour l'administration par la bouche, dans le traitement des infections staphylococciques du tractus gastro- intestinal, l'antibiotique est administré en capsules en deux parties à une dose d'environ 1 à 2 gr. par jour. Pour l'ad- ministration par voie intraveineuse, l'antibiotique est d'a- bord dissous dans de la N,N-diméthylacétamide à 100%, la solu- tion obtenue étant mélangée avant l'injection à de l'eau, de façon à donner une composition finale contenant environ 10% de N,N-diméthylacétamide et environ 90% d'eau. Cette composi- tion est alors administrée par voie intraveineuse à raison d'environ 300 à 400 mgr de thiostrepton par j our.
Des modifications peuvent évidemment être apportées aux détails décrits ci-dessus sans sortir du cadre de l'inven- tion tel qu'il est défini dans les revendications suivantes.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to novel useful antibiotics and to methods for their production.
More particularly, it relates to novel antibiotics in various forms, as well as to processes for producing them by fermentation, as well as for concentrating, purifying, isolating and producing their salts. In its free form, the new antibiotic is called "thiostrepton".
The antibiotic according to the present invention is formed by culturing, under controlled conditions, a hitherto undescribed species of Streptomyces.
The microorganism.-
The microorganism used for the preparation of thiostrepton is a strain of Streptomyces, isolated from a sample of desert soil obtained in New Mexico in the United States of America, a culture of the living microorganism has been deposited and is part of the culture collection of the Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey) where it is available and where the number 3705 has been assigned to it in the Waksman collection. This strain is hereinafter referred to as Streptomyces sp. 3705.
It is evident that the invention is not limited to the use of the particular organism described here, but encompasses inter alia mutants produced from the organisms described by mutating agents, such as x-rays, rays. ultraviolet, actinophagous and nitrogen mustards.
To isolate and characterize the microorganism, part of the soil sample is stirred in sterile distilled water and spread on a screen agar medium. This medium contains:
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
<tb> Sucrose <SEP> 10.0 <SEP> grs.
<tb>
Greedy <SEP> citric <SEP> 1,2 <SEP> grs.
<tb>
<tb>
(NH4) 2HP04 <SEP> 0.4 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
KC1 <SEP> 0.08 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.2
MgCl2.H20 $ 0.41 gr.
EMI2.3
<tb> MnC12.4H2o <SEP> 0.036 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.4
FeCl3.bHZ0 0.023 gr.
EMI2.5
<tb> ZnC12 <SEP> 0.021 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.6
COC1206H20 0.004 gr.
EMI2.7
<tb> Agar <SEP> 15.0 <SEP> grs.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
The cultures are then tested by the method of plating on a beef and yeast agar plate, with a view to determining their antibiotic activity against bacteria and fungi. The culture does not inhibit any of the test fungi,
EMI2.8
but inhibits the following test bacteria: lViicrococcus pyoenes var. aureus, Aerroobbacillus po a. Streptococcus faecalis, Bacillus subtile, Lactobacillus aCido !,: .. Llus, Clostridium septicum, Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium diphteriae, and lycobaeterium tuberculosis.
Colonies of the microorganism incubated for 10 days at 24 ° C. on various media will be described below (description of the colors according to the work by Ridgway "Color Standars and Color Nomenclature, Washington; D. C., 1912).
EMI2.9
Czepek-Dox Agar: NaN 3 'gr-; 2 4 gr KCl, 0.5 gr .; MgS04.
7H20 0.5 gr .; FeSO 7H 2, 0 0 0 1 gr .; glucose, 40 gr .; agar 15 gr .; distilled water ad 1000 ml. Growth is good and the colonies have entire margins. Sporulation is white with smoky gray areas and light medici blue spots. The growth by transparency is pale olive with
EMI2.10
dark sea-gray spots. No dexopigment produced.
<Desc / Clms Page number 3>
Agar of Sabouraud. tilted crops:
Glucose, 40 grs .; neopeptone, 10 grs .; agar, 15 grs .; distilled water ad 1000 ml. Growth is good and the colonies have wavy edges. The spores are white and the growth by transparency is ocher-tan to March brown.
A brown exopigment is produced.
Soybean infusion agar:
A 2% suspension of soybean flour is boiled for 30 minutes and filtered while hot. The pH is then adjusted to 7 using sodium hydroxide and 0.2% glucose, 0.5% NaCl and 2% agar or agar are added.
The growth is good, the colonies have entire margins, the spores are white to gray Payne olive, the growth by transparency is pale olive. No exopigment.
Henrici's Agar:
Caseinate or box N.Z, 5 grs .; glycerol, 5 ml. ; K2HOP4, 2 grs .; MgSO4.7H2O, trace; agar, 15 grs .; distilled water ad 1000 ml .; pH 7.0. Growth is good, the colonies have entire margins, the spores are white with dull dark gray areas, the growth by transparency is blackish brown. No exopigment.
Beef-yeast agar:
Beef extract, 1 ± grs .; yeast extract, 3 grs .; peptone, 6 grs .; dextrose, 1 gr .; agar, 15 grs .; distilled water ad 1000 cc. Light growth; colonies with entire margins, white spores; growth by avellane transparency.
No exopigment.
The culture liquefies the gelatin and produces an acid coagulation in the milk, but does not produce indol or nitrate / nitrite reduction.
The body is able to use the sources of
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
following carbon in ae medium 1. oun-.ant du (';; Jl); S04 as nitrogen source: arabinose, I'lf! Tnttc3. xyloue, glucose, galactose, fructose mannose, ZUCtU.3C, Cr imulino dextrin, {raf1inose, starch, glyc,! rol, inosttol and remuai 1.01.
Growth is poorly supported by salicino, sorbitol, sodium citrate, and sodium acetate.
Growth is not supported by dulcitol,
EMI4.2
ammonium formate, ammonium oxalate and 1;:; m:! oni um tartrate. In a base medium containing starch G: - ..:; 12 carbon source, the following nitrogen sources will support growth: ammonium sulfate, sodium nitrate sodium nitrite and asparagine. Growth is poor-
EMI4.3
. #, xï.t supported by 1-tyrosine and d, l-tryptophan. Growth is not supported by acetamide.
Lfantibiotiaue.- It was found that the ttor.yces s. 3705 produces # in: 1.,?,;: 'LfSe of antibiotics. When growth takes place in a suitable medium, at least three different antibiotics are produced. When the mycelium is separated from the broth by filtration, one of the antibiotics is present mainly in the mycelium matte, while the other two antibiotics are present mainly in the filtrate.
-antibiotic to which the invention relates mainly is that which is extracted from lath of mycelium and to which the name "thiostrepton" has been given.
-To form thiostrepton, we grow
EMI4.4
5tom ees ss. 3705 at a suitable temperature of 20 to 35%, preferably about 25-27 C, under submerged aerobic conditions, in an aqueous nutrient medium containing a source of ink and assimilable fermentable carbon and a source of assimilable nitrogen . Appropriate sources
<Desc / Clms Page number 5>
. As indicated above, include carbohydrates, such as starch, dextrin, and sugars, such as maltose, lactose and glucose; glycerol; - li ides; fats, etc ...
Suitable sources of nitrogen include organic nitrogen sources, such as asparagine and soybean meal, as well as inorganic nitrogen sources, such as sodium sulfate. ammonium or sodium nitrate. Fermentation is carried out for about 72 to 16 hours at a pH between about 6 and 8.
At the end of this period, a substantial amount of thiostrepton had been formed (as shown by bioassays), as described in more detail in the Examples.
After growth has ceased, thiostrepton is isolated from the broth by separating the mycelium cake from the broth by filtration or centrifugation. The thiostrepton is then extracted from the mycelium cake using an appropriate organic solvent, such as chloroform, dioxane, an N, N-di- (lower alkyl) lower alkanoic acid amide (eg. - Example, N, N-dimethylformamide or N, N-dimethylacetamide) or benzyl alcohol.
Thiostrepton is a weak base, which forms salts with acids, especially with mineral acids (e.g. hydrochloric acid or sulfuric acid) by reaction with them in an organic solvent, such as alcohol, such as ethanol. The antibiotic also forms complexes with the salts of alkaline earth metals (eg, calcium chloride or magnesium chloride) by reaction with them in an organic solvent, such as an alcohol, such as methanol. Addition salts with acids and alkaline earth metal complexes are hydrolyzed when contacted with water.
The following examples illustrate methods for,
<Desc / Clms Page number 6>
repair, purify and form derivatives of the antibiotics according to the present invention.
EXAMPLE 1.-
Fermentation of Streptomyces sp. 3705 in shake flasks - Germination stage
A spoonful of a culture of Streptomyce.s sp.
3705 is transferred to a 50 cc vial containing the following medium:
EMI6.1
<tb> Flour <SEP> of <SEP> seeds <SEP> of <SEP> soybeans <SEP> 15 <SEP> g.
<tb>
Dextrose <SEP> 30
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 2.5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
NaC1 <SEP> 1.0 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Water <SEP> from <SEP> tap <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
The flask is incubated for 2 days at 25 ° C on a reciprocating shaker (140 strokes per minute, length: 13/4 inch).
Fermentation stage
A 10 cc inoculum prepared in the germination stage is transferred from the germination vial into each of five 1 liter vials containing the following medium:
EMI6.2
<tb> Flour <SEP> from <SEP> soybean <SEP> <SEP> <SEP> 30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 20 <SEP> g.
<tb>
EMI6.3
CoC1.6HO, 005 g. CaCO3 1.0g.
EMI6.4
<tb> Water <SEP> from <SEP> tap <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
The vials are incubated for 7 days at 25 ° C. in a reciprocating shaker. After seven days, samples of centrifuged neutral broth are tested to determine their activity towards:
EMI6.5
screw of Wçsçoçïusjvosenes var. aureus and Mycobacterium tuberculosis BCG. The results obtained are as follows:
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> Activity <SEP> in <SEP> units'of <SEP> dilution <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var <SEP> aureus <SEP> M. <SEP> tuberculosis <SEP> BCG
<tb>
<tb> 250-305 <SEP> 100 <SEP> ¯¯¯¯
<tb>
EXAMPLE 2.-
Tank fermentation of Streptomyces sp. 3705.-
I-.
Source of inoculum .-
Stock cultures of Streptomyces sp. 3705 .: are transferred weekly to fresh Gould's agar slant media (20 g. Agar, 10 g. Glucose, 2.5 g. Yeast extract, 1.0 g. K2HOP4 and 1000 cc of distilled water) . Inoculated slant cultures are used after 3-5 days inoculation at 25 C.
II.- Preparation of inoculum.-
In a 500 cc flask containing 100 cc of the following aqueous medium:
EMI7.2
<tb> Flour <SEP> of <SEP> seeds <SEP> of <SEP> soybeans <SEP> 15 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 20 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CaCO3 <SEP> 5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
NaCl <SEP> 1 <SEP> g. <SEP>
<tb>
<tb> Water <SEP> from <SEP> tap <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
which was sterilized for 30 minutes at 121 ° C. after adjusting the pH to 7.0-7.2 with sodium hydroxide, a spoonful of the product obtained is placed under I. The culture is incubated for 72 hours at 25 ° C. At the end of this period, 10 cc of the culture are transferred to a second flask containing 100 cc of medium. This second culture is incubated for 48 hours at 25 ° C. At the end of this period, the contents of the second flask are transferred to a flask with a capacity of 4 liters containing 1000 cc of the medium.
This third culture is incubated for 48 hours at 25 C, then transferred to a germinator with a capacity of 10 gallons containing 25 liters.
<Desc / Clms Page number 8>
a medium sterilized beforehand for 15 minutes at 121 C. and having the following composition:
EMI8.1
<tb> Flour <SEP> of <SEP> seeds <SEP> of <SEP> soybean <SEP> 750 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 1000 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CaC03 <SEP> 25 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Water <SEP> from <SEP> tap <SEP> 25 <SEP> liters
<tb>
(pH adjusted to 7.0 @ NaCH before and after sterilization)
The germinator is aerated and agitated for 30 to 36 hours at 25 ° C. under a pressure of 10 pounds per square inch.
An anti-foaming agent is also added to the medium to prevent excessive foaming.
III.- Fermentation .-
In a 100 gallon fermenter containing 50 gallons of a medium, which has been previously sterilized for
15 minutes and contains:
EMI8.2
<tb> 3.0% <SEP> of <SEP> flour <SEP> of <SEP> soybean <SEP> <SEP>
<tb>
<tb> 3.0% <SEP> glucose
<tb>
<tb>
<tb> 0.5% <SEP> CaCO3
<tb>
<tb>
<tb> 0.2% <SEP> Na2SO4
<tb>
<tb>
<tb> 0.25% <SEP> Foamrex <SEP> S <SEP> (Socony <SEP> Vacuum <SEP> Oil <SEP> Company, <SEP> Inc.), <SEP> or
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> other <SEP> anti-foaming agent <SEP> <SEP> adjusted <SEP> to <SEP> pH <SEP> 7.0 <SEP> with
<tb>
NaOH before sterilization, the contents of the germinator are introduced. The shutter is aerated and agitated for 56 to 108 hours at 25 ° C under 10 pounds per square inch pressure.
After 50 to 80 hours, the activity reaches a maximum of 10,000 to 16,000 dilution units / cc against Micrococcus pyogenes var. aureuset then remains substantially constant. The pH of the fermentation broth remains substantially constant in the range of 7.0 to 7.4 during the fermentation period.
<Desc / Clms Page number 9>
The thiostrepton can then be separated from all the broth by the methods,, illustrated in:. In the following examples.
EMI9.1
before .. Exe! 'npj.ē3. - EXTRACTION.du cHZOSxREo; dtun ifY'CELIUTd.
The whole neutral broth is filtered, and the cake is dried as much as possible in a press. The wet filter cake is then placed in a volume of chloroform just large enough to make a good paste (12-15 gallons per 100 pounds of wet cake) and which is stirred vigorously for one hour.
The mixture is filtered, the chloroform is separated from the water present and the cake
EMI9.2
is then extracted with a second volume of chloroform (F3 at 10 gallons per 100 UK pounds of wet cake), after which the chloroform is filtered and separated, which is combined
EMI9.3
to the first extract The combined chloroform extracts are then distilled under vacuum (maximum temperature of the lambic: 25 ° C.) down to 1 / 50th of the original volume. 10 volumes of hexane are added to this concentrate. After standing for
EMI9.4
1 hour, the precipitate is separated by: "¯¯traction, washed with acetone and dried.
The precipitate (A) contains 70-90% pure thiostrepton and can be further purified and crystallized by dissolving in dioxane (1 gram / 10 cc), adding carbon (2% w / v), heating the mixture while stirring to 50 ° C., then filtering and slowly adding 5 volumes of water to the filtrate. The crystalline precipitate thus obtained is quite pure, but it is still somewhat colored. It can be further purified and a pus white product can be obtained by redissolving the precipitate in dioxane (1 gram / 15 cc), filtering and adding slowly to the filtrate 5 vol-
<Desc / Clms Page number 10>
lum @@ @@@ e 50% aqueous solution of methanol.
The mixture is left to stand at room temperature overnight and the crystalline precipitate of thiostrepton is then separated, washed with acetone and dried. The product obtained is a uniformly crystalline white or pale yellow material which has a
100,000-110,000 dilution units per mgr (Micrococcus pyo- genes var. Aureus).
The yields of each of the crystallization and recrystallization stages are between about 75 and 80%. active
The additional materials are also present in small amounts in the broth, one of these materials can be obtained from the first brate precipitate (A), by pasting this precipitate with acetone. This particular material is soluble in acetone and can be isolated by precipitation with water or evaporating the acetone to dryness.
The activity of this partially purified material is of the order of 6,000 to 8,000 dilation units per mgr (Micrococous pyogenes var. Aureus.)
Other material present can be recovered by crystallizing the mother liquors from the second precipitation of thiostrepton. This other material exhibits a greater solubility than thiostrpton and can only be recovered from the organic mother liquors of composition after the addition of a great deal of water. The in vitro activity of the crude material is of the order of 15,000 to 20,000 dilution units per milligram. me (Micrococcus pyogenes var. aureus).
EXAMPLE 4.-
Preparation of thiostrepton hydrochloride.
Thiostrepton hydrochloride is formed by impassing crystalline or crude thiostrepton in an alcohol, such as methanol, and then adding one equivalent of hydrochloric acid as a concentrated aqueous solution. The thic-
<Desc / Clms Page number 11>
strepton dissolves indicating the formation of a salt.
The hydrochloride can be precipitated from this solution by adding ether or ethyl acetate. The hydrochloride is unstable as a solid or in the original methanolic solution, its activity decreasing rapidly. If water is added to the solid or the alcoholic solution, the salt is immediately hydrolyzed and the free base is obtained.
Other addition salts with acids, such as sulfate, can be prepared in the same way as hydrochloride and have the same general properties.
EXAMPLE 5. -
EMI11.1
Preparation of the chloride complex ca3;.: I: que - dE thlo-gr on-- The chlorine complex of calcium is formed by impasting thiostrepton in a methanolic use at 0, 5% calcium chloride at a concentration of 4-5 milligrams per cc. The base dissolves slowly indicating the formation of a complex, since in the absence of calcium chloride it does not dissolve. When the dissolution is complete, the complex is precipitated by adding ether or ethyl acetate. The addition of water to the solid material or to the original methanolic solution causes immediate hydrolysis of the complex so that the free base is obtained.
Physical and chemical properties of thiostrepton.
Crystallized thiostrepton has the following physical and chemical characteristics: Melting point: Fo @ ce at about 235 C and melts with decomposition at approx.
EMI11.2
ron tr5-56 C
<Desc / Clms Page number 12>
Elemental analysis (approximate):
C = 51.75%
H = 5.30
S = 9.22%
N = 15.84%
0 = 17.89% (by difference)
No other elements present.
Acetyl = 8.70%.
No methoxy groups. Does not form esters with succinic and phthalic anhydrides.
Equivalent weight = 380
Solubility:
Good solubility in dioxane, chloroform, N, N-dimethylformamide, N; N-dimethylacetamide and benzyl alcohol.
Soluble at 100-200 mcg / ml in alkanols, such as methanol, ethanol, isopropanol and butanol, and in trichlorethylene and propylene glycol. Almost insoluble in water (10-20 mcg / ml). Insoluble in ether, acetone, benzene, hexane, ethyl acetate, amyl acetate, dibutyl ether, glycol, diethylene glycol, glycerol, corn oil, sesame oil and ethyl oleate.
Stability:
Stable up to 1 week in 50% solution - dioxane-505 water at pH 7 at 30 C. Very unstable in the same solvent system at pH 2 and 11. Stable in dimethylacetamide for at least two months at a temperature below room temperature (slight loss of activity only after 2 months at room temperature).
Ultraviolet spectrum:
The ultraviolet absorption jumps of crystalline thio-strepton in methanol occur in the longest range.
<Desc / Clms Page number 13>
following waveforms:
EMI13.1
<tb> # <SEP> (m) / 240
<tb>
<tb> 280
<tb>
<tb> 305
<tb>
. Infra-red spectrum:
Infra-red absorption peaks and jumps (r) occur at the following frequencies and wavelengths:
EMI13.2
1 (cm-1) To yi) 7) / \ '
EMI13.3
<tb> 3289 <SEP> 3.04 <SEP> 1116 <SEP> 8.96
<tb>
<tb> 1733 <SEP> 5.77 <SEP> 1094 <SEP> 9.14
<tb> 1658 <SEP> 6.03 <SEP> 1060 <SEP> 9.43
<tb>
<tb> 1631 <SEP> 6.13 <SEP> 1033 <SEP> 9.68 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1580 <SEP> 6.33 <SEP> 1020 <SEP> 9.60
<tb>
<tb> 1534 <SEP> 6.52 <SEP> (r) <SEP> 984 <SEP> 10.16
<tb>
<tb> 1511 <SEP> 6.62 <SEP> 971 <SEP> 10.30
<tb>
<tb>
<tb> 1486 <SEP> 6.73 <SEP> 951.
<SEP> 10.52
<tb>
<tb> 1420 <SEP> 7.04 <SEP> (r) <SEP> 935 <SEP> 10.70
<tb> 1376 <SEP> 7.27 <SEP> 9 <SEP> 21 <SEP> 10.86 <SEP> (r)
<tb>
<tb>
<tb> 1366 <SEP> 7.32 <SEP> (r) <SEP> 893 <SEP> 11.20
<tb> 1348 <SEP> 7.42 <SEP> (r) <SEP> 856 <SEP> 11.68
<tb>
<tb> 1309 <SEP> 7.64 <SEP> (r) <SEP> 808 <SEP> 12.38
<tb>
<tb> 1282 <SEP> 7.80 <SEP> 780 <SEP> 12.82
<tb>
<tb> 1269 <SEP> 7.88 <SEP> 769 <SEP> 13.00 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1244 <SEP> 8.04 <SEP> (r) <SEP> 760 <SEP> 13.15
<tb>
<tb> 1203 <SEP> 8.31 <SEP> 740 <SEP> 13.52
<tb>
<tb> 1166 <SEP> 8.58 <SEP> (r) <SEP> 730 <SEP> 13.70
<tb>
<tb> 1152 <SEP> 8.68 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1138 <SEP> 8.79
<tb>
<Desc / Clms Page number 14>
EMI14.1
Biological properties of thiostrepton.
Thiostrepton has a broad antibacterial spectrum against many bacteria (and viruses),
as indicated by the partial sweating list:
EMI14.2
Microoranism Minimum inhibition concentration in -; Y / ml.
Micrococcus !? yogeues var. aureus 209P o 01-0 02
EMI14.3
<tb> Cahill <SEP> 0.03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N 5 <SEP> 1.25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N 376 <SEP> 1.67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203 <SEP> 0.003
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0.03
<tb>
EMI14.4
Streptococcus faecalis, 06 Ï ± * 2àìïÏH˯aoidoilus 0.06 Clostridium septicwn 0.15 Dr5lococcus pneumoniae type 3 0.3 Xnebacterum¯dijohteriae 2cobactérimn tuberculors var. bovis (BCG) 3.0 Aerobaéter aeroge.es 50 Escherichia coli
EMI14.5
<tb> 50
<tb>
EMI14.6
Pseudomonas aftrSl2! L.
Salmonella schettmulleri Shigella sonnai
EMI14.7
<tb> - ### <SEP> 50
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris
<tb>
<tb> 50
<tb>
EMI14.8
Salmonellatyphosa
EMI14.9
<tb> 30
<tb>
EMI14.10
Shigella dysenteriae
EMI14.11
<tb> ###### 30
<tb>
Other tests were performed with eggs from mice, rabbits and cats to determine the toxicity and effectiveness of thiostrepton.
EMI14.12
To determine the activity: L1V: LVO of thiostrepton against meningo-plleumonitis virus in eggs of
<Desc / Clms Page number 15>
7 day old embryonated eggs were infected with 100 LD50 doses of a standardized meningo-pneumonitis virus inoculum through the vitelline membrane.
The eggs were then treated, one day after infection, with the vitelline membrane using thiostrepton dissolved in dimethylacetamide (antibiotic: dimethylacetamide ratio 1:10) at the doses indicated in the following table:
TABLE 1.-
EMI15.1
<tb> Doses <SEP> Average <SEP> time <SEP> Difference <SEP> Report <SEP> PD50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (mgr / egg <SEP>) <SEP> of <SEP> survival <SEP> in <SEP> the <SEP> time <SEP> survivan- <SEP> (tue / egg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (hours) <SEP> of <SEP> survival <SEP> of / total <SEP> (mgr / oe)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (hours) <SEP> (after <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> '<SEP> bear <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Control <SEP> (dimethylacetamide) <SEP> 158 <SEP> 0/18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1.0 <SEP> 219 <SEP> +61 <SEP> 8/16 <SEP> 0,
72
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.5 <SEP> 213 <SEP> +55 <SEP> 7/17
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.25 <SEP> 189 <SEP> +31 <SEP> 1/17
<tb>
* -for live embryos, 10 days after infection, survival times of 240 hours were assigned for calculation purposes.
** - Reeds and Muench method.
To determine the in vivo activity of thiostrepton against Streptococcus pyogenes C203 in mice, mice were infected with a standardized inoculum of Streptococcus pyogens C203 by intraperitoneal injection. The mice were then treated by subcutaneous injection with thio-strepton dissolved in N, N-dimethylacetamide and diluted with water to the final concentration shown in Table 2.
<Desc / Clms Page number 16>
TABLE 2.-
EMI16.1
<tb> Dose <SEP> Percentage
<tb>
<tb>
<tb> (mcg / mouse <SEP> in <SEP> of <SEP> survival
<tb>
<tb>
<tb> 0.5 <SEP> ml. <SEP> of <SEP> solu- <SEP> (%)
<tb>
<tb>
<tb> tion)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Control <SEP> (solution
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> saline) <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 40 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 20
<tb>
Tests were also carried out to determine the activity of thiostrepton against Micrococcus pyogenes var. aureus n 5 (penicillin sensitive strain) and against Micrococcus pyogenes var. aureus n 376 (penicillin resistant strain) in mice.
For these determinations, mice weighing 18 to 20 grams were infected, intraperitoneally, with a standardized inoculum of the respective strains in 5% mucin. The infected mice were then treated. by intravenous injection with a single dose of thiostrepton as shown in Table 3. For comparative purposes, tests were also made with the potassium salt of penicillin G instead of the antibiotic according to the present invention. .
<Desc / Clms Page number 17>
TABLE 3
EMI17.1
ANTIBIOTIC METHOD OF ADMINISTRATION Activity against 1cgenE .; ; '&.:.:'. arEH.1.S Strain sensitive to the Strain resistant to 1 penicillin n '5 penicillin n 3? o r.DST2f S / r Dota Si
EMI17.2
<tb> Saline <SEP> solution <SEP> (con- <SEP> Time <SEP> of <SEP> survival <SEP> average <SEP> - <SEP> 20 <SEP> hours;
Survivors / Total <SEP> (S / T) <SEP> 0/10
<tb> control)
<tb>
EMI17.3
Thiostrepton 100 meizo antibiotic + 1000 mcgQNtNdiethylncetaid 220 (DMA) in 0.5 cc physiological saline solution 222 10 10 220 jazz
EMI17.4
<tb> 50 <SEP> mcg. <SEP> antibiotic <SEP> + <SEP> 500 <SEP> mcg. <SEP> DMA <SEP> in <SEP> 0.25 <SEP> cc <SEP> physiological <SEP> saline <SEP> <SEP> 200 <SEP> 9/10 <SEP> 109
<tb> 25 <SEP> mcg. <SEP> antibiotic <SEP> + <SEP> 250 <SEP> mog. <SEP> DMA <SEP> in <SEP> 0.125 <SEP> ce
<tb>
EMI17.5
physiological saline solution "9 .10 42 2rJ ..
100 mcg. antibiotic + 1000 mcg. dioxam '.... :: .. ns 0.5 cc physiological saline solution 190 8/10 1 3 // #
EMI17.6
<tb> 50 <SEP> mcg. <SEP> antibiotic <SEP> '- <SEP> 500 <SEP> mcg. <SEP> dioxane <SEP> in <SEP> 0.25 <SEP> ce
<tb> physiological <SEP> saline <SEP> <SEP> 44 <SEP> 2/10 <SEP> 0 <SEP> ci ')
<tb> 25 <SEP> mcg. <SEP> antibiotic <SEP> + <SEP> 250 <SEP> mcg. <SEP> dioxane <SEP> in <SEP> 0125 <SEP> 0/10
<tb>
EMI17.7
this physiological saline solution 32 1/10 0 cIL ':
EMI17.8
<tb> Penicillin <SEP> G <SEP> potas'- <SEP> 60 <SEP> mcg. <SEP> antibiotic <SEP> in <SEP> 0.5 <SEP> this <SEP> saline <SEP> solution
<tb> sic <SEP> physiological <SEP> 155 <SEP> 7/10 <SEP> 0 <SEP> 0/10
<tb> 30 <SEP> mcg. <SEP> antibiotic <SEP> in <SEP> 0.25 <SEP> this <SEP> solution <SEP> saline <SEP> l) <SEP> 3
<tb> physiological <SEP> 123 <SEP> 5/10 <SEP> 0 <SEP> 0/9
<tb> 15 <SEP> mcg.
<SEP> antibiotic <SEP> in <SEP> 0.125 <SEP> this <SEP> solution <SEP> saline <SEP> 133 <SEP> bzz10
<tb> pysiological <SEP> 133 <SEP> 6/10 <SEP> 0 <SEP> 0/10
<tb>
* DST - Difference (in hours) in survival time compared to controls ** Strain resistant to 100 units of penicillin in vitro
<Desc / Clms Page number 18>
The previous tests demonstrate the particular efficacy of thiostrepton in vivo against micrococcal and streptococcal infections.
To determine the acute toxicity of thiostrepton in mice, a 10% solution of the antibiotic in N, N-dimethylacetamide was diluted 1 & 2C in distilled water and administered intravenously (0, lcc / 5sec in mice The lethal LD50 dose was found to be approximately 41.7 mgr / Kg and the LD2 dose estimated at 23.1 mgr / kg.
It was also found that a single intravenous injection of 5 mg of thiostrepton per kg. has no adverse effect: on test animals, such as cats, rats and rabbits
In humeine therapy, thi @ ostrepton has the same general antibiotic spectrum as penicillin and can thus be used to combat infections due to gram-positive cocci, such as infections due to strepto. cockles, staphylococci and pneumococci. Thiontrepton. can be administered inter alia by the oral route and by the intravenous route.
For administration by mouth, in the treatment of staphylococcal infections of the gastrointestinal tract, the antibiotic is administered in two-part capsules at a dose of about 1 to 2 g. per day. For intravenous administration, the antibiotic is first dissolved in 100% N, N-dimethylacetamide, the resulting solution being mixed before injection with water, so as to give a final composition containing about 10% N, N-dimethylacetamide and about 90% water. This composition is then administered intravenously at a rate of approximately 300 to 400 mg of thiostrepton per day.
Modifications can of course be made to the details described above without departing from the scope of the invention as defined in the following claims.