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On sait qu'on peut introduire de l'oxygène dans des stéroides, en particulier des groupes hydroxy en position 11ss et 11[alpha], ainsi que des groupes oxo en position 11, par voie biochimique, par exemple, à l'aide de surrénales, de reins et de foies, en particulier avec leurs homogénéi- sats ou par passage à travers ces organes ou des tranches de ces organes, (voir parexemple F.W. Kahnt et A. Wettstein, Helv. Chim. Acta 34, 1791 [1951] ), ainsi que par voie microbiologique (voir par exemple Peterson & Murray, J. Am. Chem. Soc. 74, 1871 [1952]; F.W. Kahnt et autres, Experien- ta 8,422 [1952] ). Les substances de départ utilisées présentaient toujours le groupe 18-méthylique typique des stéroides.
La présente invention concerne un procédé permettant d'obtenir des produits particulièrement intéressants au point de vue physiologique, en partant de composés renfermant, en position 18, un groupe méthylique oxy- géné, libre ou fonctionnellement modifié. De tels composés peuvent être ob- tenus par exemple par synthèse totale, en opérant d'une manière analogue à celle décrite à la demande de brevet déposée en France au nom de Monsieur Tadeus Reichstein le 14 janvier 1955, ayant pour titre : de prépa- ration de stéroides oxygénés", ainsi qu'à partir de substances naturelles portant déjà un substituant en position 18.
Conformément à l'invention, on obtient des nouveaux produits d'o- xydation enzymatique, en soumettant des dérivés du prégnane 3,18,20-trioxy- génés, saturés ou non-saturés, ou leurs dérivés fonctionnels, à l'action aé- robienne d'enzymes permettant d'introduire de l'oxygène en position 11, et en isolant les substances oxygénés. En ce qui concerne les substances de départ et les produits finals du présent procédé, il y a lieu de comprendre également, par dérivés du prégnané, les composés de la série homo- et nor- prégnanique, par exemple ceux qui dérivent du 19-nor- et/ou du D-homo-pré- gnane, la chaine latérale de ce dernier étant, en particulier, située en po- sition 17a.
Les substances de départ peuvent être de n'importe quelle con- figuration stérique et peuvent aussi être des racémates; elles renferment sur les atomes de carbone 3, 18 et 20 des groupes hydroxy et/ou oxo libres on fonctionnellement modifiés, par exemple des groupes esters, éthers, thio-esters, thio-éthers, thiol-esters et thionesters, acétals, mercaptals, cétals, hydrazoniques ou semioarbazoniques, ainsi que des groupes énoliques, tels que ceux d'esters énoliques,d'éthers énoliques ou d'énamines et analo- gues. En outre, elles peuvent présenter d'autres substituants, sauf en posi- tion 11. Des doubles liaisons se trouvent, par exemple, en position 1, 4, 5, 6, 7, 14, 15 et/ou 16.
On utilise, en particulier, des dérivés du prégna- ne 3, 18, 20, 21-tétra-oxygénés, saturés ou non-saturés, qui peuvent en ou- tre aussi être oxygénés en position 16 et/ou 17, de préférence des dérivés du 3, 18, 20-trioxo-prégnane, du 3,20-dioxo-18-hydroxy-prégnane, du 3,18- dihydroxy-20-oxo-prégnane, du 3,18-dioxo-20-hydroxy-prégnane, du 3-hydroxy- 18,20-dioxo-prégnane, du 3,20-dihydroxy-18-oxo-prégnane, du 18,20-dihydroxy- 3-oxo-prégnane ou du 3,18,20-trihydroxy-prégnane, des composés correspondants comportant, en position 21, un groupe hydroxy ou oxo, ainsi que les dérivés fonctionnels de ces composés.
Les enzymes utilisées peuvent être de provenance microbiologique; on incube les substances de départ en présence d'air, par exemple avec des microorganismes vivants permettant d'introduire de l'oxygène en position 11.
On peut toutefois également séparer plus ou moins les enzymes du filtrat de culture ou des microorganismes et alors ne pas travailler en présence de mi- croorganismes vivants. Les microorganismes par exemple ceux des groupes des mucorales, des penicillium, des actinomycètes, tels que les streptomycètes l'aspergillus, le cunninghamella, le curvularia, ou des fungi imperfecti, sont cultivés d'une manière en elle-même connue, par exemple en cultures fi- xes ou en cultures mobiles, immergées, renfermant avantageusement du carbone
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:.SF'.iG:z..â i.t3n ex z,¯¯.X.'t i.:> ¯# f ..... .1 bydrc.t àe i3 i." LiiF'i=.
Un procédé simple au point de vu.6 pr-tiL's :'01:''':, lec-rit CW;i.S ,..,¯ ? ¯7. va. suivre, :sans que l'inven- %ion se tr:lt'î:re fez'.' S..-1 ##.-:î ? i<.<i%é:# ;>a=;- 1; 2 i1;iiatio:r}'8 fournies On culti- ve les C'Y"6';i-"::Ë:!Ii r.,.. :f.'- ;;>,a,a.r=>11 et .15.#:s -l-ai conditions CG#:.L.U''.$ à ceux qui sont vs'.::..aç, -:':'J""! L+ ,f,r...i:..- d.? P:;:0'::2d..3:; \:L( C.'t:":o",i...,:,5 1F'"txkT'.i'V'S.,"'y dans la fa- ura; a . z de :.:t-i"ci. '::;"i¯.'7.o' L:'r8';1.u.e les 0ú.l'':..rBs s às=; 'bien développées, on ajoute les s"s.i-n.3& 'le départ indiquées;, à l'état de fine dispersion eu d0 SiT..'eC3i..yp3.i 9L6LpJ0 ±-ce# le #ét"..,a:=;1, 190étvne ou. 1. é''13.31'..2YBel. col., et :poursu.i. t 1 \ incub'9.. tion ',"''t.? ti9F,=''E' ou sépare le fizrceîi=t#, extrait i e ,ç. '1" ... v, i v¯... lâ i:::z.: S .t"'. s; =..:6:i. en . f'.
E L '' t''2 manière en ella-même connue, les .'z'=:?'û.t.." re'T';icn3'..ola à i:.'",¯ ±s .i "'â'g par exemple par réparti1;i)r¯: er"r'e ¯¯¯¯ - ,. . r¯'.. : 3. mé2a.ngs de -d, iïû.T3'S non miscibles l'un é>vec l'autre, par =E''w rß i. T: c:¯:',V'?J-4J ,'.:':-:':1?l:';:O't ori:2'ta,11isa,ticm., transforma- tion en dérivée f-'3n,,:t:: :!::"{:Ës talz q"C..\ l<=i .:;:!Iq;..cé ,le Girard ou pa# d'a70e- tres pro0fé ... . ,-.r..: .... ' A ::'7 pif. ce :: q YiZy.a3d de Irr:-":1J.tlC :?a.".':JE:O..c3.C,j;7. on peut aus- si utiliser des (:)n2;{;?- s P:r01]'t';":LS!.'< T.; ù.. n o.r'S:;:';::> (P 8J.:.imaux, en particulier de surrénales. Le pro262.3 2. ?r:.::.:ttr'3 '3n -..;'1-r d ,.., út5 9 à savoir la perfu- sion des Erg., r at, e :'t.c..r l'utilia-tion d'homogénéisats. est FD-1.1 cosnu en 1" A:......ft t"(".....,4''Y'" ,i. -la.- .i> 1c= littérature citée).
Les T¯- a.'-¯9 . du prd;6:.-[; 'p2v0érl. r:(7':t\1tllt: aire 'utilises cosmie iT:2 dicaments e<;ce->z.e pysduitc. ine:mÉiir3 pco-cr a.G'!.1 pL'pr.rc'...''rit:y:"ge Sont, . en particulier, (}.' V..Il ir,4<; gr,'ü. :11Jt'2'r-t p!"6,1:;lq1J., l'aldostérone et les L1 - ¯ y L3",d'S n -> ç '= r ' f; 3 ry .'G-n'f;v :, -';C ?2?:.:, les L1 "'-3? 1 .1 , y 20-trioxo-l 1 8 , 2 1 -dih3r- drcxyprégnen8 et 129 L1 "'''-3,1'''i820-=-êtraox6-.21-hydro2y-prégnene .'} 20=-;ét>=zoeqxi=21 -nàrdoeoqr-p égn,èi= es ou leurs dérivés c";..-;.;ry¯oû dont le!. tru.3t''.c"e eat voisine de celle de l'aldostéro- neo La, r6s8úte invention concerne également à titre de produits in- dustriels -¯'?=f=::xYg 1?! pT'{)d.'cd 1;S (;;orfvrr'1GS à 0EH..X obtenus par le procédé défini s.3..=e.':-:.:
W 0:'{'¯'-:: t!.i': \l'c¯r!1::s ili!.t5 t,±"!l 1- p:r.5s:a#ike invention sans toute- fois la, l 1;ii.i P r- 11's"ae?i ?' G 1" A 1. U;:loir1- '1 Q -Wa- :2.'it i('- ;li!u\ ¯:, [!;"e.:r.}c:.5. de :1 CàiljUm, ±41 a,m.r.:.e à lll pµ5 de 66 .I!. i;,",,:3;:: =F9'w¯." .:;l,).ti.)/: ;":"t -.i"t'-'2 Ierf;:r..ll1.Yl-t /]Ô g de glucose bruts 240 u;1;3 1 (-:-'-'- .i'3 ., i.sé' ¯¯ ¯Ttâ 1;;1 rü&..:'::, ,': :'.':'':'..3t<3?'P li:f..LL0:r-), 20 g de NaCl 4 g de Oa00< et =;o l ' 4=;;.: i- 2::J1jin,. 3 is>; - ¯---,r: c'?tte solution en quantités égales de:F..?""2 1.iJl:#> >wr.i.,i->ez de litre ie caia.oibé chacinc, puis stérilise.
Apx45 #-a->-1:+ 8.:,,;:-=;.::r.k2oé flv.1-= "#.i:<.ùi<,a.#%3#is.Il* .'vi=:.i.GY: "e en agite t'ty''c.''1,'t.,."-..e mei,t lE:ci i ivLE:-1 - 26' o Au. 1,m.iJt c7L 60 'i¯L"é9 on ajoute aux cul tt1r bien ,j ,;.,= j;;- * .= de,..':.-: i.. cu,..-tii';.- ., - + c ,, ,, , ...,.. clutin yz d, 10 de fi \.lCV..1...0J.JJ!ç\:l, Lt:.:',...=.:. )-.':., tLu¯¯:;...L"'"i..:,; ;:p!.;-)¯-:ll...9, u"i!.e :...J..1...t0:r:. e .-,U g e.LJ, g L.'4.Sti.'''d Çl.-,' g î",,7.y.-'¯ is l: o..¯,:ß '± éSL d>, -== :]:1; um" de E'éthanol et agite encore pe(.,1.>:t :iAtJ t,'2'.--:-('.':' à 2.:i =- (1'=¯ <,>B--j;--!''-:;' l3c :,rr '..'?? et agite le filtrat de cul- ture (pE B,2) j ....-:. ;"t..1 --1. é:r;r'li5':J'::';
-¯v ¯ . de J ::.t'9.,-t$ d'éthyleo On lave l'ex- trait ^'',i±?' n., ^9ß,r "1 ' '" /.ér;1===.=+aR 1, Z:.' '-e solution à 2 % de bic'2r-boy,at<? d'i 'y-.ii.ic,'.'L et t 1 ?e?u, le SS:;L0 \.#- d". sulfate de sodium et lié- vaporé sous \-i";,.2, ;:, -::0'-' Oi!. ,ui;r,,;g<3¯ 1.-. 'tY=;¯ 198C 'fS! dans: du 'benzène chaud et chrom.>.bogl,np;xi# la. ::':;l.l-..:i -;-* ";! .:I;.i:r lf-7; 1.-; ... ,..¯ .r:.,3' par :p8.8SE!ge, l une co- lonne de 31 & i -ce;1' bzz milice- :;:rép'5...:-:":: :.,r:. r ¯s .i,rsn.::rl1eo Ori élue à plusieurs reprise&. *fl;.e;# cl.<:3,=;.,=< :roi-:;. 100 si=3 de tI8U2:'::.2; y ..t.
E ¯3É:i'S d'..al mélange d'é+1>s*; et d'aoêt-' ;l ' t ='él.., i z ( y # 1 riE ¯: ¯ mël.. -'';.'.. et 4 ? a oe é T # b e . '#; i.t< ( É g 2 ) , d'im zi 1 . ,g * 4 ' 1 .1 #;" =, :. i Ercr':.,. :s E -.-..-, 1 1 g i ) * ;1 : ô-,a é +: t; ,# d ' ± %lxj.."l o d'un
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mélange dqacétt9 d'éthyle et de méthanol (9el), d'un. mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol (8.2) et de méthanol, L'examen des diverses frac- tions, effectué par chromatographie sur papier, montre que les premières fractions contiennent la matière de départ et les fractions obtenues avec le mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol, ainsi que les fractions métha- noliques, renferment un mélange de produits hautement polaires.
A partir des fractions moyennes, par contre, on peut isoler un composé qui est d'une polarité plus élevée que celle de la matière de départ. Ce composé renferme le groupement il 4-3-cétonique (en ultra-violet À maximum 241 m#), la
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chaîne latérale lX=cêtclique (pouvoir de réduction), et un atome d'oxygène supplémentaire (é1::1a.l.1se) On peut purifier davantage le , 4-3,20-dioxo- 11 (3y 18,21= rihyiroXJrprégnène ainsi obtenu en le recristallisant dans des mélanges d'acétone, d'éther et d'éther de pétrole.
Exemple 2.
A l'aide d'une solution diluée d'hydroxyde de sodium, on amène
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à un pH de 6,5 4 litres d'une solution riatr4-tive renfermant 60 g de peptone, 25 cm3 d'eau -le gonflement du mais (cornsteep liquor), 200 mg de glucose
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brut et de l'eau du r.net on réparait cette solution en quantités égales dans 12 fioles coniques de 1 litre de c4.pn.: . é chacune, puis stérilise.
Après avoir ensemencé avec du 'iR'h.i2icp'¯lS nigrioans", on agite mécaniquement les fioles à 25 . Au tout de 48 heures, les cultures se sont bien dévelop- péesDans des conditions stériles, on répirtit en quantités égales dans
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les 12 fioles coniques une solution de 1,0 g de' Li °.3' 20-d.axa.1$hydror- prégnène dans 40 cm3 de méthanol et agite encore pendant 48 heures à 25 .
Après séparation du mycélium, on extrait et effectue le traitement chroma- tographique de l'extrait d'une manière enalogue à celle décrite à l'exem- ple 1. L'examen par chromatographie sur papier des diverses fractions
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chromatographiqwes montre que les fractions obtenues avec le mélange d'a- cétate d'éthyle et de méthanol et celles obtenues avec l'éoétate d'éthyle, renferment un mélange hautement polaire, tandis qu'on peut isoler à partir des fractions obtenues avec le mélange d'éther et d'acétate d'éthyle, ainsi qu'à partir des fractions obtenues avec 1 acétate d'éthyle, une substance qui est d'une polarité plus élevée que celle de la matière de départ.
La détermination analytique du carbone et de l'hydrogène permet de déceler l'introduction d'un atome d'oxygène, et le spectre en ultra-violet ( # ma-
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ximum 241 mj4) indiq'je la présence du groupement 4 4-3-cétoniqueo Par recristallisation dans des mélanges d acétc.e d'éther et d'éther de pétro- le, on obtient le 4=.3,20-dioxo-lla, 18-dihydroxy-prégnëne., Exemple 30 Com^.m décrit a. l'exemple 1, on prépare 12 cultures de "Cunning- hamella Blakesleenaiie On répartit également, dans des conditions stériles, une solution de 1,0 g de A °.--3' 1$9 20-r.oxo.2lhydroxy prégra.ène dans 40 cm3 d'acétone. Après avoir secoué pendant 48 heures à 26 , on sépare le mycélium et, tout en refroidissant, extrait le filtrat de culture (pH 8,0) avec de l'acétate d'éthyle.
On lave l'extrait avec de l'eau glacée, le sè- che, l'évapore à la température ambiante, dissout le résidu (950 mg) dans du chlorure de méthylène et chromatographie la solution sur 30 g de gel de silice suivant la méthode par passage On élue à plusieurs reprises avec chaque fois 100 cm3 de chlorure de méthylène, de chloroforme, d'un mélange de chloroforme et d'acétone (ltl) et d'acétone.
L'examen par chromatogra- phie sur papier permet de décaler la présence de la matière de départ dans
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les premières fractions chlorofcrmiques et de produits hautement polaires dans le& fractions acétoniqueso Les dernières fractions chloroformiques
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renferment iL.'1.
composé présentant UY.6 nolarité u-n peu plus forte que celle de la limdésoxy cor l cas-éro ne3 tar-dis dans les fractions obtenues avec le mélange de chloroforme et d'acétone, est présent un composé qui se com- porte, lors d'une- chro>atographic s7#r papier, d'une manière presque identi- que à celle de la cortisone., On isole ce dernier composé à partir des frac- tions unitaires et le purifie encore en le cristallisant dans un mélange
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d'acétone et d' é.t;!ll2r Le Il, - 8=oyclc=8erdacétal àw 4J 43 18 20-triogo llp-'21-di'hydr3xy-prégnène que l'on obtient ainsi, fond à 1651 $ .
Lorsqu'on part de 21-acétate, on obtient le même composé Son diaoétate -1-tyre peu nette, à 70-72 t son 1$-mor¯oaeétae obte- nu par hydrolyse partielle, à la température ambiante, avec du bicarbonate de sodium, fond à 200% et son obtenu par aoétylation partielle fond à 190-192 .
REVENDICATIONS.,
Io Un. procédé de préparation de nouveaux produits d'oxydation enzymatique, caractérisé par le fait qu'on soumet à l'action aérobienne d'enzymes permettait d'introduire de l'oxygène en position 11, des dérivés
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du prégnane 3918-20-ti-iczrygériésg saturéo ou. non-séltùrés, ou leurs dérivés fonctionnels, puis isole les stéroïdes oxygénés.
1On soumet à l'action sérobienne d'enzymes de provenance mi- crobiologique permettant d'introduire de l'oxygène en position lie des dé-
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rivés du prégnane 391 i20-rioxrgénés'sa.i==xés ou non-saturés, ou leurs dé- rivés fonctionnels, puis isole les stéroides oxygénés.
2.On incube d'une manière aérobienne, avec des microorganismes . vivants permettant d'introduire de l'oxygène ea position 11, des dérivés du prégnane 3,18,20-trioxygénés, saturés ou. non-saturés, puis isole les sté- roides oxygénés.
3. On utilise des cultures de microorganismes des groupes des mucorales, du. pénicillium, des actinomycètes tels que les streptomycètes,
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de l'aspergillus, du CU11!iiI'l..ghamella, du Curvularia ou des fungi imperfecti, ou leurs enzymes.
4. On soumet à 1 action aérobienne d'enzymes provenant d'organes animaux, en particulier de surrénales, qui permettent d'introduire de l'oxy- gène en position Il, des dérivés du prégnane 3,18,20-trioxygénés, saturés
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ou non=saturés, ou leurs dérivés fonctionnels, puis isole les stéroides oxy- génés 5 0 0-rx part de dérivés du prégnane 3,18,20,21-tétraoxygénéw, sa- turés ou. non-saturéa, ou de leurs dérivés fonctionnels z On part de dêrivê-s -w.xés ou on-saturés du 3,18,23-firioxo- prégnane, o-a de leurs dérivés f'J:r.!.ctio!311S1so 7. On part de dérivés saturés 0'1. non-sa.turés du 3,20-dicxo-l8- hydroxy-prégnane, cu de leurs dérivés fOTIctiormelso 8. On part de dérivés saturés 01;. non-sa-turés du 3,18-dihydroxy- 20-oxo-piégnane, ou de leurs dérivés fonctionnels.
9. On part de dérivés saturés ou TI:>:t:=sa.turés d.u 39 $adâ.oxom20 hydroxymprégnanes ou. de leurs dérivés fonctionnels.
10. On part de dérivés saturés ou nO.P4sa.t:xrés du 3=hydroxy=18920- dioxopr-égr=ne9 ou de leurs dérivés fOTIc'''ic.r.!.K'e2
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