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PROCEDE DE PREPARATION DE LA VITAMINE B 120
Cette invention concerne la production de vitamine B12 et plusspé- cialement la récupération de vitamine B12 avec des rendements plus grands à partir de matières brutes renfermant des substances étroitement apparentées à la vitamine B12 mais ayant une activité physiologique nettement moins marquée (c'est-à-dire activité anti-anémie pernicieuse et activité du facteur de pro- téine animale) que la vitamine B12. Plus particulièrement, l'invention concer- ne des procédés nouveaux par lesquels de telles subs.tances du genre de la vi- tamine B12 sont transformées en vitamine B12.
D'après l'invention, la matière du genre vitamine B12 est soumise à une réaction avec une substance fournissant des ions cyanogène pour transfor- mer la dite matière'en vitamine B12.
La littérature a révélé divers procédés pour obtenir la vitamine B12 à partir de foie et de bouillons de fermentation. Par exemple, il a été montré par Rickes et al. dans Science 108, 634-35 (3 déc. 1948) que la vitami- ne B12 peut être obtenue à partir de bouillons de fermentation produits par le streptomyces griseus.
Alors que les bouillons de fermentation fournissent une source pratique pour la production commerciale de vitamine B12, on a trou- 'vé que de tels bouillons renfermaient également des produits de fermentation, auxquels on se réfère ici sous le nom de substances genre vitamine B12, et qui sont étroitement apparentés à la vitamine B12 mais manifestent seulement une fraction de l'activité anti-anémie pernicieuse et de l'activité du facteur de protéine animale que manifeste la vitamine B12 elle-même. Dans la production de vitamine B12 de pureté uniforme, l'élimination de ces substances genre vi- tamine B12 à présenté un problème difficile.
A cause de l'étroite parenté exis- tant entre ces substances et la vitamine B12, la séparation de vitamine B12 pure cristallisée n'a été possible que par l'emploi de procédés compliqués et coûteux.
Nous avons maintenant découvert qu'il est possible de transformer ces substances genre vitamine B12 jusqu'ici indésirables en vitamine B12 pres-
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que quantitativement, réalisant de ce fait une simplification importante du procédé de récupération de 'vitamine B12 pure et en même temps un accroissement
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considérable du rendement .en -vitamine B12 obtenu' a partir de bouillons de fermentation..
Considéré sous certains de ses plus larges aspects, le nouveau pro- cède conformeà la présente invention comporte la mise en réaction des substances genre vitamine B12 avec une substance fournissant des ions cyanogène, ce qui entraîne la transformation des dites substances en vitamine B12. .Ainsi, par exemple, en traitant des bouillons,de fermentation, ou des concentrés convenables de ceux-ci, renfermant à la fois la -vitamine 12 et une substance genre vitamine B12, avec une source d'ions cyanogène, on constate que l'on obtient des rendements fortement accrus en vitamine B12 pure. En outre, comme signalé précédemment, l'isolement de la vitamine B12 est grandement facilité.
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Comme autre., :lément: de l'invention, on a trouvé que cette trans- formation peut être effectuée sous diverses conditions en utilisant différentes sources d'ion cyanogène. En général., la réaction est effectuée en réalisant un contact intime entre les substances genre vitamine B12 et les ions cyanogè- ne, réalisant ainsi la transformation des dites substances en vitamine B12.
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Par exemple des solutions de substances genre vitamine B32peuvent être traitées avec des composés fournissant des ions cyanogène (notamment des cyanures métal- liques, du cyanure d'ammonium ou de l'acide cyanhydrique). Les milieux solvants convenables comprennent l'eau, des mélanges d'eau et de solvant organique, ou- des solvants organiques renfermant des ions cyanogène et dans lesquels les sub- stances genre vitamine B12 sont solubles. Pour des fins pratiques, on a trou- vé que le mieux était de conduire la réaction en milieu aqueux.
On a aussi trouvé que la réaction de substances genre vitamine B12 particulières, qui ont été préparées, avec une substance fournissant des ions cyanogène de la façon décrite ci-dessus, conduit dans chaque cas à une trans- formation de la substance genre vitamine B12 en vitamine B12, laquelle peut être récupérée sous une forme très pure.
Les substances particulières que l'on a trouvées être transformables en vitamine B12 par réaction avec une substance fournissant des ions cyanogène comprennent des substances qui ont été identi- fiées comme étant la vitamine B12a, la vitamine B12b, la vitamine B12c et la vitamine B12d-
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La vitamine B12a qui à l'état pur existe sous forme de cristaux rouges orthorhombiques, peut être préparée à partir de vitamine B12 par réac- tion de la vitamine B12 avec l'hydrogène en présence d'un catalyseur d'hydro- génation, comme l'oxyde de platiné, l'oxyde de palladium ou le nickel de Raney.
La vitamine B12a montre un coéfficient de distribution caractéristique d'envi-
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ron 1,48 (conc.eau/conc.solva-nt) dans un système solvant organique-eau dans lequel le solvant organique est un mélange 2:5 d'o.crésol et de tétrachlorure de carbone.
La vitamine B 12b peut être préparée à partir de . concentrés bruts de vitamine B12 obtenus par un bouillon de fermentation de streptomyces griseus, par la distribution à contre-courant entre un mélange 2 :5 d'o.crésol et de té-
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trachlorure de carbone et de l'eau, système dans lequel la" vitamine Blub montre un coéfficient de distribution caractéristique d'environ 2,., (c.eau/c,solvant), tandis que la vitamine B12 montre un coefficient de distribution de presque zéro.
La vitamine B12c peut être préparée par réaction de la vitamine B12 avec un excès de sulfure ionisable comme les sulfures des métaux alcalins, le sulfure d'ammonium et l'hydrogène sulfuré, de préférence en solution aqueuse ou en solution aqueuse alcoolique. La réaction se produit à la température ambiante et est achevée en peu de temps, et la vitamine B12c peut être récupé- rée par l'évaporation du mélange réactionnel à siccité, la dissolution du ré- sidu dans l'eau et la cristallisation dans un mélange eau-acétone.
Les cris- taux peuvent être ensuite purifiés par une distribution à contre-courant entre un mélange 2 :5 d'o.crésol et de tétrachlorure de carbone et de l'eau, système
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dans lequel la vitamine B 12c montre un coefficient de distribution caractéris- tique d'environ 0,10, (c.eau/c.sol vaut).
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La vitamine B12d peut être préparée'par réaction de la vitamine B12 avec de l'anhydride sulfureux en solution aqueuse, alcoolique ou aqueuse- alcoolique de préférence en utilisant un excès considérable d'anhydride sulfu- reux et en chauffant légèrement le mélange réactionnel pour assurer une conver- sion maxima de vitamine B12 en vitamine B12d.
La vitamine B12d peut être récu- pérée par évaporation du mélange réactionnel à siccité, dissolution du résidu dans l'eau et cristallisation dans un mélange eau-acétone. Les cristaux peu- vent ensuite ,âtre purifiés par distribution à contre-courant entre un mélange 2:5 d'o.crésol et de tétrachlorure de carbone et de l'eau, système dans lequel la vitamine B12d montre un coefficient de distribution caractéristique d'envi- ron 1,63, (c.eau/c.solvant).
Bien que l'étude de la réaction montre qu'une môle d'ion cyanogène est nécessaire. par môle de substance genre vitamine B12, on préfère générale- ment utiliser un excès cyanogène pour assurer une conversion complète. En trai- tant une solution aqueuse de substances genre B12 avec un excès de cyanure mé- tallique, tel le cyanure de sodium, ou du cyanure d'ammonium formé en solution alcaline, il se forme un complexe intermédiaire de couleur pourpre. Ce complexe pourpre s'avère être la même substance que celle qui se forme lorsqu'on. ajoute- du cyanure de sodium à une solution aqueuse de vitamine B12. En acidifiant une solution renfermant ce complexe pourpre, la solution retrouve la couleur rouge caractéristique de la vitamine B12.
Cependant, en l'absence d'un excès de cyanure métallique ou d'un pH alcalin, ce processus d'acidification n'est pas nécessaire, puisque le complexe pourpre ne se forme pas. Quand on utilise l'acide cyanhydrique comme source d'ions cyanogène, le complexe pourpre ne se forme pas, même si on emploie un grand excès.
La.vitamine B12 obtenue par cette réaction est sous tous les aspects identique à la vitamine B12 obtenue directement à partir de bouillons de fermen- tation. Cette identité a été établie par comparaison des spectres d'adsorption ultra-violet, visible et infra-rouge, des rotations optiques, des analyses élé- mentaires, de la structure cristalline, des points de fusion ou de décomposi- tion, des phases de solubilité, du comportement polarographique, et des coéffi- cients de distribution, ainsi que par les activités microbiologiques et clini- ques.
En appliquant le procédé de la présente invention, des substances genre vitamine B12 à différents stades de récupération à partir de bouillons de fermentation peuventêtre mises en réaction avec une substance fournissant des ions cyanogène. Ainsi; par exemple, le bouillons, de fermentation peut ê- tre traité avec une petite quantité d'un cyanure convenable, tel le cyanure de potassium ou de sodium, ou en manière d'alternative, des concentrés de sub- stances genre vitamine B12, seuls ou en combinaison avec de la vitamine B12, peuvent être traités avec une substance fournissant des ions cyanogène.
Lorsqu'un bouillon de fermentation renfermant à la fois de la vi- tamine B12 et des substances genre B12 est traité suivant la présente invention, on ajoute au bouillon une certaine quantité de substance fournissant un excès d'ions cyanogène, pour réaliser la conversion des substances genre B12 en B12.
La vitamine B12 est alors extraite de ce bouillon par adsorption au moyen d'un absorbant convenable comme la terre à foulon, le charbon de bois, etc. Cet adsorbat peut être utilisé comme un supplément de B12 pour rendre plus forti- fientes les nourritures pour animaux, ou bien comme matière de départ pour l'i- solement de la vitamine B12 pure.
Il est préférable, dans l'application du procédé de la présente invention d'employer cependant un concentré des substances genre vitamine B12 car on réduit ainsi le volume de matière à manipuler et l'on minimise les dif- ficultés et les dangers résultant de la présence de cyanure n'ayant pas réagi.
Il est également préférable de traiter un concentré renfermant à la fois de la vitamine B12 et des substances genre vitamine B12 car, comme signalé plus haut, l'un des avantages pratiques du nouveau procédé réside dans l'élimination des processus difficiles et compliqués exigés pour la séparation de ces matiè- res.
La solution ou le concentré solide renfermant les substances genre
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@iramine B12 est traité avec une substance fournissant un excès d'ions cyano- gène de façon à assurer un contact intime des réactifs et une réaction complè- teo De préférence, le mélange est agité énergiquement, puis on le laisse repo- ser pendant un petit temps c.à.d. env. 15 à il.5 minutes.. Toute substance four- nissant un excès crions cyanogène peut être utilisée, comme par exemple l'aci- de cyanhydrique liquide ou gazeux, un sel métallique ou d'ammonium de l'acide cyanhydrique, ou des mélanges d'un cyanure métallique et d'un acide fournissant de l'acide cyanhydrique à l'état naissant.
Il suffit que le cyanure métallique utilisé, en milieu neutre ou alcalin, soit susceptible de fournir des ions cya- nogène dans les conditions de réaction utilisées. Les cyanures alcalins et alcalino-terreux remplissent cette condition. On a trouvé par exemple que les cyanures de sodium, potassium, barium et calcium et strontium peuvent être uti- lisés efficacement.
Lorsqu'un concentré solide est traité avec de l'acide cyanhydrique liquide ou gazeux, l'ionisation de l'acide cyanhydrique est suffisante pour permettre à la réaction de se poursuivre en l'absence de solvant, bien que l'on puisse cependant utiliser un solvant avantageusement. La réaction entre des substances genre vitamine B12 et des sels de l'acide cyanhydrique est conduite de préférence en présence d'un solvant qui favorisera l'ionisation du sel, com- me par exemple l'eau, des alcools de un à trois carbones, et des mélanges eau- solvant organique dans lesquels les substances genre vitamine B12 et les sub- stances fournissant les ions cyanogène sont solubles. Dans une opération à grande échelle, le plus commode et le plus économique est de conduire la réac- tion en solution aqueuse alcaline.
En précisant que l'on utilise un excès d'ions cyanogène, on veut entendre par là qu'il faut une quantité supérieure à celle en dessous de laquel- le le rendement en vitamine B12 pure commence à descendre. Le mieux est de déterminer cette quantité expérimentalement pour chaque matière brute de départ, car on constatera que la composition des différents bouillons et concentrés varie considérablement. On peut aussi déterminer approximativement la quanti- té nécessaire d'ions cyanogène par la mesure de la densité optique d'un échan- tillon de la matière à traiter, en utilisant une lumière d'une longueur d'onde de 5500 , l'une des pointes caractéristiques d'adsorption de la vitamine pure B12.
La valeur obtenue, qui représente la couleur due à la vitamine B12 éven- tuellement présente, plus celle due aux substances genre vitamine B12, est cal- culée comme potentiel en vitamine B12. Pour chaque mgr. de vitamine B12 poten- tielle ainsi calculée, on utilise de préférence environ 0,5 - 2 mg d'ions cya- nogène, ce qui s'avère être un excès considérable.
On comprendra qu'il y a habituellement de nombreuses impuretés non identifiées présentes dans les substances genre vitamine B12. Dans la mesure où ces impuretés peuvent elles aussi réagir avec l'ion cyanogène, il est néces- saire de fournir un excès suffisant d'ions pour satisfaire ces besoins et en même temps assurer une conversion complète des substances genre B12.
Lorsque la réaction est conduite en solution aqueuse en utilisant un cyanure métallique avec un pH alcalin, la=formation du complexe pourpre men- tionné plus haut est une indication visible commode de ce qu'un excès de cya- nure a été ajouté. Le complexe pourpre qui se forme est transformé en vitami- ne B12 par acidification du mélange réactionnel à un pH d'env. 5 ou moins.
On peut utiliser pour l'acidification des acides communs comme l'acide chlorhy- drique, sulfurique et acétique.
Il doit être entendu que la quantité d'ions cyanogène à utiliser pour transformer des substances genre vitamine B12 en vitamine B12 dépend en principe du type de produit désiré. Comme l'addition d'ions cyanogène en quan- tité inférieure à celle équivalent sur la base moléculaire à la quantité de substances genre vitamine B12 présentes, produit une transformation partielle et proportionnelle de substances genre vitamine B12 en vitamine B12; il est évi- dent que des quantités d'ions cyanogène aussi faibles que 10 % de la quantité nécessaire pour réagir avec la totalité des substances genre vitamine B12 pré- sentes produira un accroissement avantageux de la teneur en vitamine B12 du produit résultant.
Pour réaliser une transformation complète des substances
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genre B12 en vitamine B12, cependant, il est important d'utiliser au moins une quantité datons dyanogène équivalente sur base moléculaire à la quantité de substances genre vitamine B12 présentes. Comme souligné précédemment, les avan- tages de la présente invention appliquée à la production commerciale de vita- mine B12 sont doubles, comportant un net accroissement de la récupération de vitamine B12 à partir de concentrés'renfermant de la vitamine B12 associée à des substances genre vitamine B12, et aussi l'élimination des stades difficiles qui autrement seraient indispensables pour réaliser la separation pars de la la vitamine B12 des substances genre vitamine B12 associées.
Le der- nier de ces avantages ne peut évidemment être pleinement obtenu que si la quan- tité d'ions- cyanogène utilisée dans la réaction est suffisante pour réagir avec toutes les substances genre vitamine B12 présentes. En pratique vraie, la quantité exacte de substances genre vitamine B12 présentes dans un mélange ne peut être déterminée que par des processus compliqués et longs, aussi la façon proférée de conduire la réaction sur une échelle de production est d'utiliser un excès déterminé d'ions cyanogène pour assurer la transformation en vitamine B12 de toutes les substances genre vitamine B12.
Après achèvement de la réaction, le cyanure non transformé est éli- miné par évaporation sous un pH acide. L'évaporation peut être effectuée à une température pouvant aller jusque 50-60 , et de préférence sous pression réduite,. L'évaporation est effectuée jusqu'à ce que tout l'excès d'acide cyanhy- drique soit pratiquement-éliminé. Lorsqu'un concentré solide est mis en réac- tion avec de l'acide cyanhydrique liquide ou.gazeux, le cyanure non consommé peut être éliminé par évaporation sous vide ou à la pression atmosphérique.
Quand une solution est mi'se en réaction avec du cyanure,, d'autre part, il est parfois désirable d'utiliser un courant d'azote ou d'air pour accélérer l'éli- mination du cyanure non consommé.
Après traitement par le cyanure, acidification (si nécessaire) et élimination du cyanure nor consommé sous forme d'acide cyanhydrique., le mélan- ge réactionnel est ensuite traité pour en retirer là vitamine B12 pure. On connait différente procédés pour¯traiter des mélanges renfermant de la vitamine B12 et obtenir la vitamine B12 pure et la présente invention n'est pas limitée à l'emploi d'un procédé particulier de récupération.
Un tel procédé qui peut être employé pratiquement pour récupérer la vitamine B12 comporte la saturation d'une solution de vitamine B12 par un sel inorganique, (notamment le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, le sulfate de sodium ou le sulfate d'alumine) et l'extraction de la solution saturée par l'alcool benzylique, puis le séchage de l'extrait dans l'alcool benzylique, par exemple par un chauffage dans le vide jusque 75-80 C, puis on ajoute de l'éther à la solution anhydre d'alcool benzylique'pour précipiter la vitamine B12 brute.
Le précipité est alors dis- sous dans l'eau saturée d'alcool benzylique et renfermant env. 2-3 % d'acide acétique glacial. La solution et un volume approximativement équivalent d'eau saturée d'alcool benzylique sont introduits dans des récipients convenables et soumis à des extractions successives par des portions approximativement équi- valentes d'alcool benzylique saturé d'eau.
Ces extractions peuvent être effectuées de façon continue ou par extractions successives des deux solutions initialement-citées avec six à huit portions d'alcool benzyliqp.e saturé d'eau. Les extraits dans l'alcool benzy- lique réunis sont ensuite séchés et traités par l'éther pour précipiter la vi- tamine B12 purifiée Ce précipité peut être dissous dans l'eau et recristal- lisé pour obtenir la vitamine B12 d'env. 95 % de pureté, laquelle est préférée pour les emplois cliniques. On peut aussi réaliser une purification complémen- taire par une recristallisation dans l'eau.
Dans le cas où le précipité obtenu après extraction à l'alcool ben- zylique n'est pas suffisamment purifié pour donner une vitamine B12 de 95 % de pureté par cristallisation, on peut soumettre le précipité à une purifica- tion complémentaire par une dissolution dans le méthanol, l'adsorption de la vitamine B12 de la solution sur une colonne d'alumine activée et par le déve- loppement et le lessivage de la colonne par du méthanol. La liqueur riche du lessivage traitée par l'éther donne un nouveau précipité de vitamine B12 puri- fiée., On peut aussi réaliser la purification complémentaire en répétant le
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processus d'extraction par l'alcool benzylique.
Il faut noter, à. ce propos que les résidus aqueux de l'extraction à l'alcool benzylique, et les fractions de la liqueur de lessivage qui révèlent une faible teneur en vitamine B12 dans le processus de purification chromatographique, peuvent être à nouveau traités par l'ion cyanogène comme exposé ici et recyclés pour produire des quantités- additionnelles de vitamine B12.
Pour déterminer la quantité de vitamine B12 présente dans divers concentrés intermédiaires et pour déterminer la quantité de vitamine B12 pré- sente avant et après le traitement au. cyanure, il est nécessaire de disposer d'un moyen de dosage. On a trouvé avantageux d'employer une modification de l'extraction à contre-courant par l'eau-alcool benzylique comme moyen de dosa- ge. Ce procédé est basé sur un coefficient de distribution déterminé pour la vitamine B12 de 1,2, pour le système eau-alcool benzylique.
Pour effectuer le procédé de dosage, la matière ayant une teneur inconnue en vitamine B12 est soumise à une distribution à contre-courant en huit plateaux entre des portions égales en volume d'eau et d'alcool benzylique.,, On a trouvé que les substances genre vitamine B12 et autres substances inter- férentes ont des coefficients de distribution considérablement plus élevés et se retrouvent dans les trois premiers plateaux de la distribution. En outre, dans certains cas, on trouve des substances ayant des coéfficients de distri- bution plus faibles qui se retrouvent dans les trois derniers plateaux de la distribution. La courbe de distribution de la vitamine B12 pure montre une pointe pour le quatrième plateau.
La densité optique du contenu du quatrième (ou cinquième) plateau est mesurée à 5500 et la valeur obtenue représente la couleur due à la vitamine B12. Par comparaison avec la densité optique de la vitamine B12 pure (E1cm1% = 63), on peut calculer la teneur en vitamine B12 du plateau. Le quatrième plateau renferme 29,1 % (24,2% dans le cinquième plateau) de la quantité totale de vitamine B12 présente dans la matière exami- née. De cette manière;, on peut calculer la quantité totale de vitamine B12 présente. Cette méthode de dosage donne généralement une valeur absolue de la quantité de vitamine B12 lorsque la matière examinée renferme une teneur élevée en vitamine B12, c.a.d. supérieure à 75 %, suivant la nature des impure- tés.
Pour une pureté décroissante, la méthode est moins sûre pour déterminer des valeurs absolues, à cause des impuretés interférentes additionnelles; la méthode indique alors la quantité maxima de vitamine B12présente. Des matières brutes pauvres en vitamine B12 et renfermant une coloration d'interférence peu- vent être soumises à une distribution à contre-courant suivie de l'essai LLD du quatrième (ou cinquième) plateau, au lieu d'une mesure de coloration, et la quantité maxima de vitamine B12 est alors calculée sur la base de 11.000.000 unités LLD par mg. de vitamine B12. On donne ci-après une méthode pour appli- quer le procédé de dosage ci-dessus.
A chacun des huit tubes de 15 ml d'une centrifuge, on ajoute 5 ml d'eau, saturée d'alcool benzylique. Dans le premier tube, on ajoute la matière solide à examiner en quantité estimée renfermer env. 1-10 mg de -vitamine B12 On ajoute ensuite au premier tube 5 ml d'alcool benzylique saturé d'eau, le tube est agité, et on sépare les phases par centrifugation. La phase inférieu- re (alcool benzylique) est transférée dans le second tube, où on répète l'opé- ration., Ce processus est répété dans chaque tube successif jusqu'à ce que la phase alcool benzylique soit en équilibre avec l'eau du huitième tube. Une seconde portion de 5 ml d'alcool benzylique saturé d'eau est ensuite passée dans chaque tube successivement, de la même manière; jusqu'à équilibre avec l'eau du septième tube.
Ce processus est continué avec six autres portions d'alcool benzylique, après quoi les huit tubes renferment deux phases en équilibre.
Au contenu du quatrième (ou cinquième) tube, on ajoute 10 ml de chloroforme, pour faire passer la vitamine B12 dans la couche eau. La densité optique de la couche eau est alors déterminée à 5500 A dans une cellule de 1 cm. La quan- tité totale de vitamine B112 présente est alors calculée à partir de cette va- leur comme décrit plus haut.
Les exemples suivants montrent différents procédés pour traiter des matières genre vitamine B12 par l'ion cyanogène pour les transformer en vitamine B12, tout en signalant les rendements accrus de vitamine B12 obtenus
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en soumettant des mélanges renfermant à la fois de la vitamine B12 et dessub- stances genre vitamine B12 à la réaction avec l'ion. cyanogène.
Il doit toute- fois être entendu que ces exemples sont donnés à titre exemplatif et ne sont pas limitatifs.,
La vitamine B12 elle-même s'avère renfermer un groupe nitrile c a- ractéristique, et on propose pour la vitamine B12 la formule de structure par- tielle suivante :
CN- +++
Co
X-
000 dans laquelle cinq groupes sont coordonnés à l'atome de cobalt et représentés par (X-- ), deux de ces groupes étant de caractère négatif indiqué par -- et les trois autres de caractère neutre représenté par ooo; le sixième groupe coor- donné au cobalt étant le groupe nitrile CN .
Les atomes comprenant les cinq groupes représentés par (XOOO--) et coordonnés au cobalt sont aussi probablement liés entre eux de façon cependant inconnue jusqu'ici.,
La vitamine B12a peut être considérée comme étant l'analogue hydroxy- de la vitamine B12 dans laquelle un groupe hydroxyle remplacé le groupe ni- trile dans la molécule de vitamine B12@ Apparemment,la vitamine B12a existe dans les solutions aqueuses comme un mélange en équilibre de l'isomère hydroxy- et de l'isomère hydraté ionique comme les montre la réaction suivante :
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D'autres analogues de la vitamine B12 peuvent être représentés de façon similaire,-par exemple, l'analogue chloré (ou chlorure) de la vitamine B12.
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Les analogues de la vitamine B12 montrent un caractère ionique à des degrés divers. Ainsi, l'analogue chlorure a un caractère ionique pronon- céo Dans se cas, l'isomère représenté par la formule à droite peut être sup- posé prédominer. La vitamine B12 elle-même, cependant, montre un caractère ionique faible sinon nul. Elle se comporte comme une molécule neutre d'après les critères habituels.
Il doit évidemment être entendu que ces explications théoriques d'une structure possible des vitamines B12 et B12a sont basées sur notre con- naissance actuelle de ces produits et n'excluent pas la possibilité que des données expérimentales ultérieures établissent que les structures supposées sont en fait incorrectes. En conséquence, on ne désire pas être lié par ces considérations théoriques, quelque vraisemblables qu'elles puissent paraître à la lumière des connaissances actuelles. Ces explications sont données essen- tiellement pour permettre une meilleure compréhension de l'invention.
La vitamine B12a, qui à l'état pur se présente sous la forme de cristaux orthahombiques peut être préparée à partir de vitamine B12 par réac- tion de la vitamine B12 avec l'hydrogène en présence d'un catalyseur d'hydro- génation tel l'oxyde de platine, l'oxyde de palladium ou le nickel Rsney. La vitamine B12a peut aussi être obtenue à partir de concentrés de vitamine B12 et de vitamine B12a dérivés d'un bouillon de fermentation de streptomycine par l'extraction d'une solution aqueuse de tels concentrés par l'alcrool benzylique,
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pour enlever pratiquement toute la -vitamine B12, l'addition d'acétone à la solution aqueuse résultante, et la récupération de la vitamine B12a qui pré- cipite.
A partir de vitamine B12 ou de 'vitamine B12a, on peut préparer divers autres analogues de la vitamine B12 par réaction avec des composés four- nissant l'anion particulier désiré. Par exemple, lorsqu'une -solution de vita- mine B12 acidifiée par l'acide chlorhydrique est hydrogénée, on obtient l'ana- logue chloré de la vitamine B12; ou si on utilise un grand excès d'acide chlorhy- drique, il se forme un analogue dichloré de la vitamine B12. De même, en uti- lisant différents acides au lieu d'acide chlorhydrique, on obtient d'autres analogues de la vitamine B12 ayant l'anion caractéristique de l'acide employé.
On peut aussi transformer la vitamine B1a en un analogue chloré de la vitami- ne B12 par un contact avec des réactifs renfermant de l'acide chlorhydrique.
Quand on part de vitamine B12a, on peut obtenir d'autres' analogues de la vitamine B12 par réaction de la vitamine B12a avec un acide ou un sel renfermant l'anion désiré. Des analogues ainsi préparés comprennent les analo- gues nitrite, thiocyanate, cyanate, ïodite et sulfate de la vitamine B12
L'analogue sulfate de la vitamine B12 peut ainsi être préparé par dissolution de la vitamine B12 dans l'eau ou des solutions aqueuses d'alcools; et addition d'anhydride sulfureux ou d'acide sulfureux à la solution résultan- teo Pendant, la réaction, il se produit un changement de coloration du rouge au brun, mais la couleur rouge réapparaît par exposition à l'air.
L'analogue sulfate peut être récupéré d'une telle réaction en concentrant le mélange réac- tionnel à siccité, on dissout le résidu dans une petite quantité d'eau, on a- joute de 1' acétone % la solution aqueuse et on laisse cristalliser l'analogue sulfate.
Lorsque la vitamine B12 est mise en réaction avec un sulfure ioni- sable comme un sulfure alcalin, du sulfure d'ammonium., ou de l'hydrogène sul- furé, il se produit une réaction donnant un analogue de la vitamine B12 que l'on a désigné sous le nom de vitamine B12d Ce produit peut aussi être obte- nu par évaporation à siccité du mélange réactionnel, dissolution du résidu dans l'eau et cristallisation dans un mélange eau-acétone.
On a maintenant découvert conformément à la présente invention que des analogues de la vitamine B12 ayant un anion caractéristique autre que CN- peuvent être transformés en vitamine B12 par réaction avec un composé fournis- sant l'ion cyanogène. Dans la réaction résultante, le groupe nitrile c.aracté- ristique de la vitamine B12 est substitué à l'anion caractéristique¯de l'ana- logue de départ, et dans chaque cas, on obtient le même produit ayant toutes les propriétés physiques et chimiques caractéristiques de la vitamine B12.
Il faut noter à ce propos que la découverte de la convertibilité d'analogues de la vitamine B12 en vitamine B12 par réaction avec une substance fournissant l'ion cyanogène a été faite antérieurement à, et en réalité permit, des données importantes dont dérivent les hypothèses présentées ici au sujet de la nature chimique et de la structure apparentes de la vitamine B12 et de ses analogues.
Pour appliquer le procédé de la présente invention , on préfère trai- ter une solution de l'analogue particulier de la vitamine B12 avec un composé fournissant l'ion cyanogène comme, par exemple, un cyanure métallique, du cya- nure d'ammonium ou de l'acide cyanhydrique. Un milieu solvant convenable com- prend le milieu aqueux,,des mélanges d'eau et' de solvant organique, ou des sol- vants organiques renfermant des ions cyanogène dans lequels l'analogue parti- culier de la vitamine B12. est soluble Pour des fins pratiques, le plus com- mode est de conduire la réaction en milieu aqueux.
On préfère utiliser un excès d'ions cyanogène pour assurer une réac- tion complète. En traitant une solution aqueuse d'un analogue de la vitamine B12 avec un excès de cyanure métallique comme le cyanure de sodium ou de potas- sium, ou avec un excès de cyanure d'ammonium, c.à.d. sous des conditions qui sont nécessairement alcalines, il se forme un complexe intermédiaire de couleur pourpre Ce complexe pourpre s'avère être la même substance que celle qui se
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forme quand on aj oute du cyanure de sodium à une solution aqueuse de vitamine P12. Par acidification d'une solution renfermant ce complexe pourpre avec un acide commun comme l'acide chlorhydrique, sulfurique ou acétique, la solution retrouve la coloration rouge qui est caractéristique de la vitamine B12.
Ce- pendant, en l'absence d'un excès de cyanure métallique ou d'un pH alcalin, ce processus d'acidification n'est pas nécessaire puisque le complexe pourpre ne se forme pas. Quand on utilise de l'acide cyanhydrique comme source d'ions cyanogène, le complexe pourpre ne se forme pas même si l'on emploie un excès considérable.
Après achèvement de la réaction, on peut éliminer le cyanure non consommé par évaporation partielle à un pH acide. L'évaporation peut être conduite à une température allant jusqu'à 50-60 C et de préférence sous pres- sion réduite. L'évaporation est poursuivie jusqu'à élimination pratiquement totale de l'excès de cyanure sous forme d'acide cyanhydrique. Pour éliminer ainsi l'excès de cyanure de la solution, on peut accélérer l'opération en fai- sant passer un courant d'azote ou d'air à travers la solution pendant l'évapo- ration.
Il est aussi possible de transformer des analogues de la vitamine B12 en vitamine B12 par réaction d'un-. analogue anhydre de la vitamine B12 avec de l'acide cyanhydrique liquide ou gazeux lequel même en l'absence d'eau s'io- nise suffisamment que pour entretenir la réaction, et après achèvement de la réaction, on élimine le cyanure non consommé par évaporation sous vide ou à la pression atmosphérique
Après traitement par le cyanure, acidification (si nécessaire) et élimination du cyanure non consommé, le mélange réactionnel est ensuite traité pour obtenir la vitamine B12 pure.
On connait divers procédés pour traiter des mélanges renfermant la vitamine B12 et obtenir la vitamine B12 pure, et la présente invention n'est pas limitée à l'emploi d'un procédé particulier de récupération, Comme les mélanges réactionnels résultant du traitement d'a- nalogues de la vitamine B12 avec une substance fournissant l'ion cyanogène renferment principalement la vitamine B12 et relativement peu d'impuretés or- ganiques, la vitamine B12 peut facilement être isolée par équilibration du mé- lange réactionnel (en solution aqueuse) avec une solution d'o.crésol-tétrachlo- rure de carbone (2:5 en volume et saturée d'eau).
L'équilibration fait passer pratiquement toute la vitamine B12 dans la couche crésol-tétrachlorure de car- bone, et le produit organique. de la réaction et les impuretés organiques res- tent dans la couche eau. La solution crésol-tétrachlorure de carbone peut, si on le désire, être purifiée par extraction avec de l'eau saturée du mélange crésol-tétrachlorure de carbone. La solution dans le crésol-tétrachlorure de carbone de la vitamine B12 est alors diluée avec 10 à 12 volumes de tétrachlo- rure de carbone et extraite par l'eau, l'excès de tétrachlorure de carbone fai- sant passer la vitamine B12 dans la couche eau. La vitamine B12 peut, ensuite, être récupérée de la phase eau par évaporation à siccité et cristallisation dans une solution aqueuse d'acétone.
Il est aussi possible de récupérer la vitamine B12 à partir de mé- langes réactionnels formés dans le traitement au cyanure par la concentration directe de ces mélanges réactionnels à siccité, dilution avec env. dix volumes d'acétone et cristallisation de la vitamine B12 dans la solution aqueuse d'a- cétone. Le procédé combiné comportant d'abord l'équilibration avec l'o.crésol- tétrachlorure de carbone offre cependant l'avantage de séparer les analogues de la vitamine B12 qui n'ont pas réagi de la vitamine B12.
La vitamine B12 obtenue par le procédé ci-dessus est à tout point de vue identique à la vitamine B12 obtenue directement à partir de bouillons de fermentationo Cette identité a été établie par la comparaison des spectres d'adsorption ultra-violet, visible et infra-rouge, de la rotation optique, de l'analyse élémentaire, de la structure cristalline, des phases de solubilité et du comportement polarpgraphique, et aussi par les activités microbiologique et clinique.
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}?:{ P!S]5 la Ef:.:-5Je:tion rélinlinaire de concentré de vitamine B12. .
Environ 2200 gals. de bouillon de fermentation obtenu par l'élabo- ration d'un filtrat de S.griseus et titrant 4630 unités par ml d'activité LLD, furent acidifiés à un pH de 2,5 par l'acide phosphorique, soumis à une filtra- tion clarifiante préliminaire sur de la terre de diatomées, neutralisés à un
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plI' de 7-8 par l'hydroxyde de sodium, puis de nouveau filtrés sur de la terre de diatomées. Le filtrat fut ensuite' traité avec 88 lbs de charbon de bois activé pour adsorber les facteurs actifs. Après enlèvement par filtration,
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le charbon de bois fut agité avec 45 gals. de n. but an 01 pendant 15 minutes.
On ajouta au mélange 35 gals. d'eau et 25 lbs. d'adjuvant de filtration, et le mélange fut agité pendant 45 minutes.
Le solide fut séparé par filtration sur une centrifuge à panier puis lavé plusieurs fois sur la centrifuge avec un total d'env. 40 gals. d'eau
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préalablement saturée par du butanolo Le filtrat et les eaux de lavage furent réunis et les couches butanol 'et eau séparées. La couche eau qui renfermait pratiquement toute la matière à activité LLD fut filtrée pour éliminer les fi- nes particules de charbon.
Aux 85 gals. de la couche eau filtrée obtenus, on ajouta 13 gals. d'alcool benzylique et 425 lbs. de sulfate 'ammonique. Le mélange fut agité pendant 15 minutes puis abandonné au repos pendant 1 heure. La couche eau fut
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séparée et ré-extraite avec 8,5 gals. d'alcool benzylique. Les extraits dans l'alcool benzylique furent réunis et séchés sur du sulfate de sodium anhydre.
Le volume des extraits secs fut d'envo 28 gals. (l'augmentation de volume était due à la présence de butanol).
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La solution dans l'alcool benzylique fut ensuite cÍ1romatograpl1..iée sur 20 kg d'alumine activée. Quand la totalité de la solution eut passé sur la colonne, celle-ci fut lavée avec un mélange 1:2 de méthanol et d'acétone jusqu'à ce que l'effluent devint clair comme de l'eau. La colonne fut ensuite développée avec du méthanol, tout l'effluent montrant la coloration rouge étant recueilli comme portion riche. On obtint 52 litres de portion riche.
L'effluent riche fut concentré dans le vide en dessous de 35 C jus- qu'à env. 2 litres et précipité par l'addition d'un volume d'acétone et de 4 volumes d'éther.
Le précipité fut extrait par portions avec du méthanol jusqu'à ob- tention d'un résidu blanc. La densité optique de la solution dans le méthanol
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mesurée à 5500 i indiqua un maximum de 416 mg de vitamine Big et de substances genre vitamine B12. Une partie aliquote de la solution dans le méthanol fut traitée avec de l'éther pour produire la précipitation et le précipité fut sou- mis à une distribution à contre-courant à huit tubes dans le système alcool benzylique-eau. La quantité maxima de vitamine B12 présente déterminée par la méthode de dosage à contre--courant fut de 187 mg.
Conversion de substances genre vitamine B12 par le cyanure.
Le reste de la solution fut divisé en deux parties et une moitié fut traitée avec de l'éther pour produire la précipitation. Le précipité fut dissous dans env. 100 ml d'eau. On ajouta sous agitation 8 ml. d'une solution aqueuse de cyanure de potassium à 1 % et on laissa reposer la solution pendant env. 15 minutes. La solution fut ensuite traitée par l'acide chlorhydrique
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jusqu'à un pli d'env. 4' On ajouta 70 grammes de sulfate ammonique et le mélange fut extrait avec des portions de 20 ml, 10 ml et 10 ml d'alcool benzyliqaeo Les extraits dans l'alcool benzylique furent séchés par chauffage à 75-80oC dans le ..ride, la solution résultante étant ensuite filtrée et traitée par l'é- ther pour produire la précipitation.
Le précipité fut dissous dans 20 ml d'eau préalablement saturée par l'alcool benzylique et à laquelle on avait ajouté 0,5 ml d'acide acétique glacial. La solution fut placée dans un tube centrifuge de 40 ml. Dans un second tube centrifuge de 40 ml, on ajouta 20 ml d'eau saturée par l'alcool benzylique. Sept portions de 20 ml. d'alcool benzylique saturé d'eau furent
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ensuite passées a travers les deux. tubes à contre-courant, chaque portion d l-, cool benzylique étant utilisée pour extraire le premier tube :Ne 1 puis le tube
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N 2. Les solutions dans l'alcool benzylique furent ensuite réunies, séchées par chauffage sous vide et traitées par l'éther pour produire la précipitation.
(On notera. que ce processus d'extraction à contre-courant est en fait équivalent à la distribution à contre-courant pour la séparation de la vitamine B12 de
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tout résidu de substances genre vitamine 1312o Il n'est pas nécessaire de main- tenir les derniers tubes de la distribution à contre-courant séparés, puisque à ce stade ils renferment tous essentiellement de la vitamine B12 pure.
Le précipité obtenu fut dissous dans 1,1 ml. d'eau et abandonné à la cristallisation. Les cristaux furent enlevés par centrifugation et recris- tallisés par dissolution dans 10 ml d'eau, addition d'acétone (envo 120 ml.) jusqu'à aspect trouble et abandon de la solution au repos. Le poids de cris-
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taux obtenus fut de 127 mg. (séchés â 100 C'dans le vide) et révélèrent une pureté de 95 % dans l'essai de distribution à contre-courant. L'identité de ces cristaux avec la vitamine B12 authentique fut éprouvée par la comparaison des propriétés physiques et chimiques. Les résultats sont repris au tableau ci-dessous :
Comparaison du produit obtenu par le procédé au cyanure avec la
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vitamine Bi 3. authentique.
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Yroauit du vitamine B procède au cvanure.. 12
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<tb> Coefficient <SEP> de <SEP> distribution
<tb>
<tb> eau./alcool <SEP> benzylique <SEP> 1,2 <SEP> 1,2
<tb>
<tb> Spectre <SEP> d'adsorption
<tb>
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,\ Max. (1) 2780, 3615, 5500 2780, 3610 5500 Absorption infra-rouge Les deux matières correspondent en détail.
Indices de réfraction:
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1,618 " O 002 1,616 + 0,002 r 1î65o ¯+ 0,002 1,652 : 0,002 1,668 + 0,002 1,664 : 0,002 Rotation optique
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<tb> 23
<tb>
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[0(] 6563 1 -61 - 9 -59 = 9 Comparais on de la solubilité La détermination de la solubilité absolue en solution aqueuse comme de.la solubilité mixte dans une solution saturée de vitamine B12 authentique montre que les deux matières sont identiques.
La solution aqueuse restant après la distribution à contre courant modifiée décrite plus haut fut retraitée avec du cyanure de potassium en solu-
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t3¯on aqueuse, la solution fut de nouveau acidifiée et ensuite extraite avec une solution 2:1 de tétrachlorure de carbone-crésol et les extraits furent trai- tés par l'éther pour produire la précipitation.. Le précipité fut dissous dans une petite quantité de méthanol et de nouveau traité par l'éther pour produire la précipitation. Le précipité fut ensuite dissous dans 0,13 ml. d'eau et aban- donné à la cristallisation.. Les cristaux furent recristallisés dans un mélan-
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ge eeii-acétone. Le poids de cristaux obtenu fut de f7 mg.
(sèches à 100 C dans le vide) Les cristaux révélèrent une pureté de 73% en- vitamine pure B12 par le dosage par distribution à contre-courant.
Ainsi;, .on obtint l'équivalent de 153,3 mg. de vitamine B12 pure à partir de 1100 gais. de bouillon de fermentation en utilisant le nouveau pro-- cédé.
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La seconde moitié de la solution originale méthanolique fournit un rendement d'emr. 50 mg, de vitamine B12 par 'un traitement essentiellement analogue au précédent, sauf que le cyanure fut supprimé, ce qui montre que le
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traitement au cyanure donne un accroissement triple de la quantité de -vitamine isolée B12.
Quand on répète le procédé précédent en employant du cyanure d'am-
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minium., de barium, et de calcium au lieu de cyanure de potassium, les résultats montrent dons chaque cas un accroissement approximativement triple de la quan- tité de vitamine B12 récupérée dû au traitement par le cyanure.
EXEMPLE 2.
Un concentré intermédiaire obtenu par la propagation de S.griseus renfermant de la vitamine B12 et des substances genre vitamine B12 fut purifié par une distribution à contre-courant entre eau et alcool benzylique, en uti- lisant deux tubes d'eau et en faisant passer au travers de chacun d'eux- suc- cessivement un total de sept portions d'alcool benzylique, de la façon décrite dans l'exemple 1. Le concentré n'avait pas été traité précédemment par le cya- nure. Le produit purifié dans les extraits dans l'alcool benzylique fut ensuite soumis au processus pour obtenir la vitamine B12 pure.
Les couches eau, qui renfermaient les substances genre vitamine B12, une petite quantité de vitami- ne B12 et des impuretés inconnues furent réunies et traitées par l'éther, et le précipité amorphe formé fut séparé et séché. En travaillant suivant les méthodes antérieures, 'ce précipité était normalement retravaillé avec d'autres fractions pour atteindre une petite production complémentaire de vitamine B12 après de nombreuses étapes de purification et il y avait encore une perte con- sidérable des substances actives présentes.
Une portion du précipité amorphe fut traitée pour comparaison et plusieurs autres portions furent traitées avec du cyanure de la façon suivante : (a) Une portion du précipité fut dissoute dans l'eau et analysée
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spectrographiquement. Les pointes d'adsorption furent observées à 3610 B. et 5200 .
La solution fut ensuite soumise à une distribution à contre-courant entre eau et alcool benzylique de la façon décrite dans la méthode de dosage, Les mesures de densité optique sur le cinquième tube de la distribution à con-
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tre-courant indiqua qu'un maximum de 51 % du total de vitamine B12 et de sub- stances genre vitamine B12 présentes était en fait de la vitamine B12, repré- sentant 0,112 mg de vitamine par mg. de solide original, (b) 10,5 mg du précipité amorphe furent dissous dans 3 ml d'eau et on ajouta 0,2 ml d'acide cyanhydrique liquide. On laissa reposer la solu- tion pendant un temps court, puis on chauffa à 50-60 C, pour éliminer l'excès
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d'acide -cyanhydrique.
Des analyses spectrograpb-iques de la sol-utiorl résultante montrèrent des pointes d'adsorption à 3610 , et 5200 , et 5500 î. indi- quant un déplacement vers le spectre de la vitamine B12. La solution fut sou- mise à une distribution à contre-courant entre eau et alcool benzylique. La
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mesure de la densité optique de la solution dans le cinquième tube JJ1Ontre. que 88,3 1 du total de vitamine B12 et des substances genre vitamine B12 présen- tes étaient de la vitamine B, représentant 0,220 mg de vitamine Bl2 par mg de matière de départ, un accroissement de 96 %.
(c) 9,6 mg. du précipité amorphe furent dissous dans 2ml. de métha- nol et 0,2 ml. d'acide cyanhydrique anhydre furent ajoutés. On laissa reposer
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la solution dans un bain de glace pendant 15 minutes puis on chauffa à 50-600C jusqu'à siccité. Le résidu fut dissous dans l'eau et les analyses spectrogra- phiques montrèrent des pointes d'adsorption à 3610 î, 5200 1 et 5500 1, indi- quant un déplacement vers le spectre de la vitamine B12.
La solution aqueuse fut soumise à une distribution à contre-courant entre eau et alcool benzylique. La mesure de la densité optique de la matière dans le cinquième tube montra que 61 % du total de vitamine B12 et de substan- ces genre vitamine B12 présentes étaient de la vitamine B12; représentant 0,219mg
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de vitamine Bl2 par mg de matière de départ, un accroissement de 95,5 5 .
Trois portions additionnelles du précipité amorphe furent traitées avec de l'acide cyanhydrique en solution dans l'éthanol, l'alcool benzylique et le crésol, respectivement, an lieu de solution dans le méthanol. Dans tous les cas, on obtint un accroissement de la teneur en vitamine B12, les accrois- sements étant du même ordre de grandeur que ceux obtenus avec emploi de métha- n ol.
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(d) 10,8 mg du précipite amorphe furent intimement mélangés avec 2,2 ml d'acide cyanhydrique anhydre et abandonnés au repos jusqu'à évaporation de l'acide cyanhydrique. Le résidu fut dissous dans l'eau et les analyses spec- trographiques de la solution résultante montrèrent des pointes d'adsorption à 3610 1, 5200 A et 5500 A, indiquant un déplacement vers le spectre de la vi- tamine B12. La solution aqueuse fut soumise à une distribution à contre-courant entre eau et alcool benzylique. La mesure de la densité optique du cinquième tube montra que 81 % du total de vitamine B12 et des substances genre vitamine B12 était de la vitamine B12, Représentant 0,198 mg. de vitamine B12 par mg. de matière de départ, un accroissement de 77 %.
EXEMPLE 3.
3000 gals. de bouillon de fermentation provenant de plusieurs cu.-. vées obtenues par la propagation d'un filtrat de S. griseus furent -traités par l'adsorption au charbon de bois activé, lavage au butanol-eau, extraction, par l'alcool benzylique, chromatographie, et précipitation comme décrit dans l'exem- ple 1. Les solides précipités furent extraits avec du méthanol jusqu'à obten- tion d'un résidu blanc. La densité optique de la solution méthanolique obte- nue, lorsque mesurée à 5500 et comparée à la valeur obtenue pour la vitamine B12 pure, indiqua que 540 mg dé vitamine B12 et de substances genre vitamine B12 étaient présents.
On ajouta à la solution méthanolique de l'acétone et de l'éther pour produire la précipitation, jusqu'à obtention d'une liqueur sans coloration rose.
Le précipité fut dissous dans 300 ml d'eau et réglé à env. un pH de 8 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium. A cette solution, on ajouta 2,7 mg. de cyanure de sodium et on laissa reposer la solution, avec un peu d'a- gitation, pendant 45 minutes. (La solution avait une couleur pourpre indiquant qu'un excès déterminé de cyanure avait été ajouté. Le solution fut ensuite acidifiée à un pH d'enva 3 par de l'acide chlorhydrique, et on fit passer de l'azote à travers la solution pour éliminer l'acide cyanhydrique.210 gm. de sulfure ammonique furent ajoutés à la solution, et on fit l'extraction avec des portions de 50 ml., 25 ml., et 10 mlo d'alcool benzylique.
Les extraits furent séchés par chauffage à 75-80 C, dans le vide, et les .extraits secs fu- rent filtrés à travers un lit de verre fritté. On ajouta de l'éther au filtrat pour produire la précipitation.
Le précipité fut dissous dans 100 ml d'eau à laquelle on avait a- jouté 2 ml d'acide acétique glacial, et 100 ml. d'eau saturée d'alcool benzy- lique furent placés dans un second tube. On procéda à un processus de purifi- cation par distribution à contre-courant modifiée en faisant passer sept por- tions de 100 ml. d'alcool benzylique saturé d'eau à travers chaque tube succes- sivement, comme décrit dans l'exemple 1, et les extraits dans l'alcool benzy- lique furent réunis après leur enlèvement du second tube. Les extraits réunis furent séchés par chauffage à 75-80 C dans le vide. On ajouta de l'éther aux extraits secs pour produire la précipitation.
Le précipité fut dissous dans le méthanol et chromatographié sur de l'alumine activée, en développant la colonne .avec du méthanol. L'effluent riche fut traité avec- de l'éther pour produire la précipitation. Les portions de queue de la chromatographie, renfermant une coloration à 5500 1 qui lorsque calculée en vitamine B12 était l'équivalent d'envo 90 mg. de vitamine B12, fu- rent conservées pour retraitement. Le précipité fut dissous dans 1,9 ml d'eau et abandonné à la cristallisation. Les cristaux rouges furent dissous dans 20 ml d'eau, et la solution fut filtrée. Une quantité additionnelle de 20 ml d'eau fut utilisée .pour laver l'appareillage et ajoutée à la solution. On a- jouta 520 ml d'acétone et la cristallisation se produisit.
Les cristaux furent enlevés par centrifugation, lavés avecde l'acétone et séchés à 56 C dans le vide. On obtint 324,7 mg. de cristaux rouges. Un échantillon des cristaux perdit 5 % de poids par séchage à 100 C. L'échantillon séché révéla une teneur de 94% de vitamine B12 pure par la méthode de dosage par distribution à contre- courant, indiquant une récupération de 290 mg. de vitamine B12 pure,
On trouva que les mêmes résultats étaient obtenus pratiquement lors- que le traitement au cyanure était effectué en solution aqueuse de méthanol
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et d'éthanol.
EXEMPLE 4.
Le traitement au. cyanure pour la conversion de substances genre vitamine B12 fut appliqué à du bouillon de fermentation, et on fit une évalua- tion de la conversion en utilisant la méthode de dosage à contre-courant.
Trois litres de bouillon de fermentation obtenu par élaboration d'un filtrat de S.griseus furent traités avec 2,1 gm de cyanure de sodium dissous dans une petite quantité d'eau. La solution fut agitée pendant deux heures et portée à un pH 4 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. On mis sous vide de fa- çon que l'air barbota à travers la solution pendant une nuit. On ajouta à la solution 2150 gm de sulfate ammonique et 30 ml d'alcool benzylique. Le mélan- ge fut agité et laissé au repos et on enleva la couche d'alcool benzylique.
La couche aqueuse fut ensuite réextraite avec une portion de 20 ml et trois de 10ml d'alcool benzylique. La couche d'eau épuisée ne renfermant pas d'activité LLD fut éliminée. Les extraits réunis d'alcool benzylique fu- rent dilués avec 2 volumes de chloro- et extraits avec trois portions de 5ml d'eau. 10 ml de la solution aqueuse renfermant env. 300.000 unités LLD par ml. furent soumis à une distribution à contre-courant à huit plateaux avec de l' al- cool benzylique en utilisant des phases de 10 ml. Les résultats de la distri- bution à contre-courant sont donnés dans la table ci-après.
Un traitement identique fut appliqué sur 3 litres du même bouillon sauf que l'on n'ajouta pas de cyanure de sodium. La solution aqueuse originale obtenue par l'extraction à l'alcool benzylique fut de nouveau soumise à une distribution à contre-courant d'alcool benzylique. D'autres résultats sont donnés dans la table.
Effet du cyanure de sodium sur la conversion de l'activité LLD dans un bouillon en vitamine B12.
(Résultats du dosage par distribution à contre- courant dans le système alcool benzylique-eau.
Pourcentage de distribution.
Tube N Bouillon non traité Bouillon traité Vitamine B12 pure.
(voir chiffres p.31 texte anglais).
Le tableau ci-dessus montre un déplacement marqué dans le compor- tement de l'activité LLD dans-la distribution à contre-courant vers le compor- tement typique de la vitamine B12 après le traitement du bouillon par le cya- nure de sodium. D'après les données ci-dessus, il n'est pas possible de cal- culer exactement les quantités de vitamine B12 contenues dans les bouillons traité et non traité. Cependant on verra que la distribution du bouillon trai- té est différente de celle du bouillon non traité et très semblable à la dis- tribution de la vitamine B12 pure. En outre, il est évident que l'activité du bouillon traité dans le quatrième tube (tube montrant une teneur maxima en vitamine B12) est presque double de celle du bouillon non traité.
EXEMPLE 5.
Un bouillon de fermentation fut obtenu par propagation d'un filtrat de S. griseus. 100 litres du bouillon furent acidifiés à un pH de 2,5 par l'em- ploi d'acide chlorhydrique. Le bouillon fut ensuite traité avec 220 mg de cya- nure de sodium, et le bain fut agité pendant 10 minutes. 100 grammes de terre à foulon et 100 gm.de terre à diatomées furent ajoutés, la boue résultante fut agitée pendant 3C minutes, et l'adsorbat fut séparé par filtration et séché à 50 .C L'adsorbat révéla une activité de 843.000 unités par gm, lorsque essayé sur le L. Lactis Dorner par l'essai à l'éprouvette (cup assay) et s'avéra fa- voriser la croissance des poussins..
@
Toute la matière active du bouillon est pratiquement adsorbée par le traitement avec la terre à foulon sous les conditions décrites. Puisque la teneur en vitamine B12 du bouillon est nettement accrue par le traitement au cyanure, comme montré dans l'exemple 4, la teneur en vitamine de l'adsorbat
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ainsi préparé à partir de bouillon traité est augmentée proportionnellement.
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LyBIePLE 60 4 mg de vitamine B12 guai montrait des maxima dans le spectre d?ad-.- sorption à 2750 Ay 3520 Aj, et 5300 A et 42 mg de cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml deal1o La solution rouge changea immédiatement en une solu- tion colorée en pourpre par l'addition du cyanure de potassium. Le spectre d'adsorption de cette solution montrait des maxima à eniv. 2780 k, 3700 1, 5400 , et 5800 A, ce qui est identique sa spectre donné par une solution de vitamine B12 traitée par le cyanure de potassium. Apres env. une minute, la
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solution colorée en pourpre fut amenée à un pH de 4-5 avec 3-l. gouttes d'acide chlorhydrique dilué, après quoi la couleur de la solution passa au rouge.
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Cette solution fut équilibrée avec 1 ml d'une solution do.crêsol- tétrachlorure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau.
Après équilibration; toute la coloration sauf une trace se retrouva dans le crésol-tétrachlorure de carbone.. La solution crésol-tétrachlorure de carbone fut alors extraite neuf fois avec des portions d'l ml d'eau saturée par le o-crésol-tétrachlorure de carbone qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée. La so- lution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 volumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec trois portions d'un ml d'eau. Les extraits aqueux furent réunis et lavés quatre fois avec des portions d'un ml d'éther pour enlever les traces de solvant. La so- lution aqueuse résultante de vitamine B12 fut évaporée à siccité dans le vide
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à 25-300C.
Le résidu fut dissous dans envo 0,,25 ml d'eau et la solution fut ensuite diluée avec env. 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure, -de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se former dans la solution., On laissa reposer la solution pendant env. vingt heures et les cris- taux furent enlevés'par centrifugation, lavés 3-4 fois avec des portions d'l
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ml d'acétone et séchés; rendement P 2,lt. mg. Le spectr d'adsorption de ces cristaux de vitamine B12 montrèrent des maxima à 2780 A (Eli cm= 112), 3610 A (Etl% :: 193) et 5500 A (E 1 cm = 60), La matière était essentiellement de la Vl eI1lJ.ne B 12 püea PL' 70 IDCEMPLE 7 4 mg de vitamine B12b et .!;.2 mg de cyanure de potassium furent dis- sous dans 1 ml d'eau.
Après env. 1 minute, la solution de couleur pourpre fut amenée au pH 4-5 avec 3-4 gouttes d'acide chlorhydrique dilué. Cette solution
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fut équilibrée avec 1 ml d'une solution d'oocrêsol-têtrachlorure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau. Après équilibration, toute la coloration sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol-tétrachlorure de carbone. Cette solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite extraite neuf fois avec
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des portions d'un ml d'eau saturée par l'oocrésol-tétrachloI'u,re de carbone qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée.
La solution crésol- tétrac:borD.re de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 volumes de tétrachloru- re de carbone et le produit fut extrait par agitation avec trois portions d'eau d'un mlo Les extraits aqueux furent réunis et lavés quatre fois avec des por- tions d'éther d'un ml. La solution aqueuse de vitamine B12 fut évaporée à sic-
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cité dans le vide à ?5-30 C Le résidu fut dissous dans env. Oe25 ml d'eau et ensuite dilué avec envo 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrentà se former dans la solution.
On laissa reposer la solution pendant envo 20 heures et les cristaux furent ensuite enlevés par centrifugation, lavés 3-4 fois avec des portions d'acétone d'un ml et séchés; rendement : 3,3 mg. Le spectre d'adsorption des
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cristaux de vitamine B1 2 montrèrent des maxima à 2780 A (E!7 = 115 ) ? 3610 î ( cm= 188), et 550C (fcm 5 ) Le produit était essentiellement de la 'V'1 IT1112e B pure.
EXEMpLE. 80 . 3,4 mga de vitamine B12c et 38 mg de cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml d'eauo Après env. une minute, la solution de couleur pour--
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pré fut amenée à un pH 4-5 avec 3-4 gouttes d'acide chlorhydrique diluéo Cette solution fut équilibrée avec 1 ml d'une solution d'OClésol-t.étl'ach1o.!'lU"e
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de carbone (2:5 en volume) saturée d'eau. Après équilibration, toute la colo- ration sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol-tétrachlorure de car- boue Cette solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite extraite neuf
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fois avec des portions d'un ml d'eau saturée par l'o.crêsol-tétrachloxure de carbone qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée.
Cette so- lution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 volumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec trois portions d'eau de 1 ml. Les extraits aqueux furent réunis et lavés quatre fois avec des portions d'l ml d'éther. La solution-aqueuse résultante de vitamine B12 fut évaporée à siccité dans le vide à 25-30 C. Le résidu fut dissous dans env. 0,25 ml d'eau et dilué avec env. 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se for- mer dans la solution. La solution fut abandonnée au repos pendant env. vingt heures,et les cristaux furent enlevés par centrifugation, lavés 3-4 fois avec des portions d'l ml d'acétone et sèches : rendement : 2,3 mg.
Les spectres
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d'adsorption des cristaux de vitamine -B12 montrèrent des maxima à 2780 A (El %= 115), 3610 A (E-L% = 198) et 5500 (El% = 61). La matière était essen- cm I-bm lem tiellement de la vitamine B12 pure.
EXEMPLE 9.
2 mg de vitamine B12d et 18 mg de cyanure de potassium furent dis- sous dans 1 ml d'eau. Après env. une minute, la solution de couleur pourpre fut amenée au pH 4-5 avec 3-4 gouttes d'acide chlorhydrique dilué. La solution
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fut équilibrée avec 1 ml d'une solution d'o.crésol-tétrachlorure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau. Après équilibration, toute la coloration sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol-tétrachlorure de carbone. La solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite extraite neuf fois avec des portions d'l ml d'eau saturée d'o.crésol-tétrachlorure de carbone qui en- levèrent une très petite quantité de matière colorée.
La solution crésol-té- trachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 volumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec tr.ois portions d'l ml d'eau. Les extraits aqueux furent réunis et lavés quatre fois avec des portions
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de 1 ml d'éther. La solution aqueuse de vitamine B12 îut évaporée à siccité dans le vide à 25-30 C. Le résidu fut dissous dans env. 0,25 ml d'eau et en- suite dilué avec env. 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se former dans la solu- tion.
On laissa reposer la solution pendant env. vingt heures et ensuite les cristaux furent enlevés par centrifugation, lavés 3-4 fois avec des portions de 1 ml d'acétone et séchés; rendement : 1,1 mg. Les spectres d'adsorption
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des cristaux de vitamine Bl2 montrèrent des maxima à 2790 A (El If.' = 110),36lOA (E 1 cm = 196) et 5500 A (Eµ11,= 60). Le produit était essentiellement de la vitamine B12 pure.
EXEMPLE 10.
Une solution aqueuse d'acide cyanhydrique fut préparée par distilla- tion d'une solution de 50 mg de cyanure de sodium dans 20 ml d'acide sulfuri-
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que à 5 %0 Le distillat fut ajouté à une solution de 4,2 mg de vitanine-B!2a (à l'origine la matière montrait des maxima d'adsorption à 2750 A, 3540 A dans . 3 ml d'eau. Après quelques minutes à la température ambiante, le mélange réac- tionnel fut concentré à siccité. Le résidu après dissolution dans 0,5 ml dt'eau et traitement avec 5ml d'acétone laissa déposer 3,4 mg de cristaux rouges en aiguilles typiques de vitamine B12 qui montraient des maxima d'adsorption à
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2780 1, 3610 À et 5500 Î.
Lorsqu'on fit réagir les vitamines B12b,. B12c, B12d avec l'acide cyanhydrique de la façon décrite dans l'exemple 10, on obtint dans chaque cas un produit cristallin rouge qui révélait les spectres d'adsorption caractéristiques de la vitamine B12, c.à.d. des maxima à 2780 A, 3610 et 5500 .
EXEMPLE 11.
4 mg de l'analogue monochloré de la vitamine B12 montrant des maxima dans le spectre d'adsorption à env. 2750 A, 3520 et 5300 A, et 42 mg de
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cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml d'eau. La solution rouge changea immédiatement en une solution couleur pourpre par l'addition du cyanure de po-
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tassiblll. Le spectre d' 8dsorption de cette solution montra des maxima à env.
2780 A, 5400 A et 5$GO A, ce qui est identique au spectre donné par une solu- tion de vitamine B12 traitée par du cyanure de potassium. Après env. une mi-
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nute, la solution couleur pourpre fut amenée au pH L-5 par 3-li gouttes d'acide chlorhydrique diluée après quoi la couleur de la solution passa au rouge.
La solution fut équilibrée avec 1 ml de solution o-,créso1-tétrachlo- rure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau. Après équilibration, toute la coloration sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol-tétrachlorure de carbone. Cette solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite extrai-
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te neuf fois avec des portions de 1 ml d'eau saturée par le qyprésol-tétrachio- rure de carbone qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée.
La 'solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 vo- lumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec trois portions d'l ml d'eau. Les extraits aqueux furent réunis et lavés qua- tre fois avec des portions d'l ml d'éther pour enlever les traces de solvant.
La solution résultante aqueuse de vitamine B12 fut évaporée à siccité dans le
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vide à 25-300C. Le résidu fut dissous dans 0,25 ml d'eau et la solution fut ensuite diluée avec env. 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se former dans la solution., On laissa reposer la solution pendant env. 20 heures et les cris- taux furent enlevés par centrifugation, lavés 3-4 fois avec des portions
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d'1 ml d'acétone et séchés; rendement : 2,4 mg. Le spectre d'adsorptiôn de ces cristaux montrait des maxima à 2780 A (E'10 = 112)., 3610 . (El/ocm = 193) ic? lcm 1 cm et 5500 A (E" = 60). Cette matière, essentiellement pure vitamine B, mon- trait une activité de 10,5 x 10 U./mg pour la croissance du L. lactiso EXEMPLE 12.
3,7 mg de vitamine B12a furent dissous dans env. 1 ml d'eau. A cette solution, on ajouta env. 1 ml d'une solution de cyanure d'ammonium (pré- parée par réaction d'une solution de cyanure de potassium avec de l'acide sul- furique et en recueillant l'acide cyanhydrique- dans une solution diluée d'hy- droxyde d'ammonium). Après repos de cette solution pendant 12 heures, elle fut évaporée à siccité dans le video Le résidu fut dissous dans env. 0,5 ml d'eau et ensuite dilué avec envo 12 ml d'acétone. Après repos de la solution pendant un petit temps, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencè- rent à se former. Après 18 heures, les cristaux furent séparés par centrifu- gation, lavés à l'acétone et sèches.. Rendement 3,3 mg. Le spectre d'adsorption des cristaux était celui de la vitamine B12.
EXEMPLE 13.
3,7 mg de vitamine B12b furent dissous dans 2 ml-d'eau. A cette solution, on ajouta 0,5 ml de solution de cyanure de potassium (13,3 mg de cyanure de potassium/ml.). La solution passa à une couleur pourpre et fut ame- née à un pH 5-6 avec de l'acide chlorhydrique-dilué. Cettc solution fut ex- traite deux fois avec des portions d'1,5 ml d'une solution de phénol-tétrachlo- rure de carbone (1-7 en volume) saturée avec de l'eau, pour enlever la vitami- ne B12. Cette solution phénol-tétrachlorure de carbone fut extraite 4 fois avec des portions d'l ml d'eau qui au préalable avait été équilibrée avec la solution phénol-tétrachlorure de carbone. La solution phénol-tétrachlorure de carbone fut diluée avec envo 12 ml de tétrachlorure de carbone.
Cette solu- tion fut ensuite extraite 3 fois avec des portions d'eau de 1 ml, provoquant ainsi l'extraction de la vitamine B12 dans l'eau. L'extrait aqueux de vitami- ne B12 fut lavé avec de l'éther pour enlever le phénol et le tétrachlorure de carbone extraits. La solution aqueuse de vitamine B12 fut évaporée à siccité dans le -vide. Le résidu fut dissous dans env. 0,5 ml d'eau et dilué avec envo 12 ml d'acétone. Après repos de la solution pendant un petit temps, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à cristalliser. Les cristaux de vitamine B12 furent séparés par centrifugation, lavés avec de l'acétone et séchés.
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Rendement 2,3 mg.
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EXELTLE 1L,..
0,3 mg de vitamine B12b, (la substance décrite par Lichtman et al., dans Proc. Soc. 0 Exptl. Biol. & bleds 72, 64,3-4.5, 1949 et considérée comme i- dentique à l'analogue hydroxy- de la vitamine B12 et donnée ici comme vitamine
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Bl2a) et 10 mg de cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml d'eau, et le mélange réactionnel fut acidifié, équilibré avec 2-5 o-crésol-tétrachlorure de carbone, et traité comme décrit dans l'exemple 1 pour donner 0,2 mg de vita- mine B12 cristalline. Le spectred'adsorption de ces cristaux montrait des
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maxima principaux à 2780 1 (Eµ g" 118), 3615-3620 1 (Ello == 192), et 5500 A (Ell% cm == 6.3).
EXEMPLE 15.
4 mg du (mono,)chlorure analogue de vitamine B12 montrant des maxi-
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ma dans le spectre d'adsorption à 2750 1, 3520 Î et 5200-5300 1, et L2 mg de cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml d'eau. Après env. une minute, la solution couleur pourpre fut amenée au pH 4-5 avec 3-4 gouttes d'acide chlo- rhydrique dilué. Cette solution fut équilibrée avec 1 ml d'une solution d'o- crésol-tétrachlorure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau. Après équili- bration, toute la coloration sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol- tétrachlorure de carbone. La solution crésol-tétrachlorure de carbone fut en- suite extraite 9 fois avec des portions d'l ml d'eau saturée d'o-crésol-tétra- chlorure de carbone qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée.
La solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 vo- lumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec trois portions d'l ml d'eau. Les extraits aqueux furent réunis et lavés 4 fois avec des portions d'l ml d'éther. La solution aqueuse de vitamine B12 fut é- vaporée à siccité dans le vide à 25-30 C . Le résidu fut dissous dans env. 0,25 ml d'eau et ensuite dilué avec env. 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se for- mer dans la solution. On laissa reposer la solution pendant env. 20 heures et les cristaux furent ensuite enlevés par centrifugation, lavés 3-4 fois avec
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des portions d'1 ml d'acétone et séchés; rendement 3,3 mg.
Les speatres d'ad- sorption des cristaux de vitamine B12 montraient des maxima à 2780 1 (E1'cm --1% 1% 1 cm 115), 3610 A (E" =188) et 5500 A (E 1 cm 59). Le produit était essentiel- lement de la vitamine B12 pure.
EXEMPLE 16.
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3,1 mg de vitamine B. et 38 mg de cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml d'eau. Après env. une minute la solution couleur pourpre
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fut amenée à un pH 4-5 avec 3-1- gouttes d'acide chlorhydrique dilué. Cette solution fut équilibrée avec 1 ml d'une solution d'o-crésol-tétrachlorure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau. Après équilibration, toute la colora- tion sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol-tétrachlorure de car- bone. Cette solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite extraite 9
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fois avec des portions, d'l ml d'eau saturée d'o-crésoir-tétrachlorure de carbo- ne qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée.
La solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 volumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec "portions d'l ml d'eau. Les extraits aqueux furent réunis et lavés quatre fois avec des portions d'l ml d?éther. La solution aqueuse résultante de vitamine B12 fut évaporée à siccité dans le vide à 25-30 C. Le résidu fut dissous dans env. 0,25 ml d'eau et dilué avec env. 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se former dans la solution. La solution fut abandonnée au repos pendant env. 20 heures, et les cristaux furent enlevés par centrifugation, lavés 3-4 fois avec des portions d'l ml d'acétone et séchés; rendement 2,3 mg.
Les spectres d'adsorption des
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cristaux de vitamine B12 montraient des maxima à 2780 A (Ei70 = 115 ), 3610 A (3)" cl == 198) et 5500 A (31' cl :: 61). Cette matière était essentiellement de
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la. vitamine B12 pure.
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2 mg de sulfate analogue de vitamine B12 et 18 mg. de cyanure de potassium furent dissous dans 1 ml d'eau. ¯Après env. une minute, la solution couleur pourpre fut amenée au pH 4-5 avec 3-4 gouttes d'acide chlorhydrique dilué Cette solution fut équilibrée avec un ml d'une solution d'o-crésol-té- trachlorure de carbone (2-5 en volume) saturée d'eau. Après équilibration, toute la coloration sauf une trace se retrouvait dans la couche crésol-tétra- chlorure de carbone.' Cette solution crésol-tétrachlorure de- carbone fut ensuite extraite neuf fois avec des portions d'l ml d'eau saturée d'o-crésol-tétra- chlorure de carbone qui enlevèrent une très petite quantité de matière colorée.
La solution crésol-tétrachlorure de carbone fut ensuite diluée avec 10-12 volumes de tétrachlorure de carbone et le produit fut extrait par agitation avec 3 portions d'l ml d'eau. Les extraits aqueux furent réunis et lavés 4 fois avec des portions d'l ml d'éthero La solution aqueuse de vitamine B12 fut é-
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vaporée â siccité dans le vide à 25=30 Oa Le résidu fut dissous dans env.
0,25 ml d'eau et ensuite dilué avec envo 10 volumes d'acétone. Après moins d'une demi-heure, de minces aiguilles rouges de vitamine B12 commencèrent à se former dans la solution. On laissa reposer la solution pendant env. 20 heu- res et ensuite les cristaux furent enlevés- par centrifugation;lavés 3-4 fois avec des portions d'l ml d'acétone et séchés; rendement 1,1 mg. Les spectres
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d'adsorption des cristaux de vitamine Big montraient des maxima à 2780 -. (El% 110) 3610 A (E '0 = 196) et 5500 fla (3)% z.0) . Le produit était essentiel- lem 1 cm. lement de la vitamine B12 pure.
EXEMPLE 18.
Une solution aqueuse d'acide cyanhydrique fut préparée par distillation d'une solution de 50 mg de cyanure de sodium dans 20 ml d'acide sulfu-
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rique à 5 %. Le distillat fut ajouté à une solution dans 3 ml d'eau de 4,2 mg d'un analogue de vitamine B12 préparé comme suit : 400,8 mg de vitamine B12 furent dissous dans de l'acide acétique glacial. On ajouta de l'oxyde de platine réduit comme catalyseur, et le mélange fut agité
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sous une légère pression d'hydrogène pendant 20 heures à env. 250C. Le cataly- seur fut enlevé par centrifugation et la solution fut évaporée à siccité dans le vide. Le résidu fut dissous dans 30 ml d'eau et on ajouta de l'acétone jus- qu'à un volume de-300 ml.
Un précipité cristallin se forma par le repos et fut enlevé et sé- ché à env. 25-35 C dans le vide; rendement 295 mg. Une solution aqueuse du produit à son pH naturel montrai-- des maxima principaux d'adsorption à env.
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2750 A, 35ZO,Î et 5300 A. Ce produit, considéré à l'origine comme la "ritami- ne B12a s'avère sur la base des connaissances présentes être l'acétate analo- gue de la vitamine B12.
Après quelques minutes à la température ambiante, le mélange réac-
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tionnel fut concentré à siccité. Le résidu après dissolution dans 0,5 ml d'eau et traitement avec 5 ml d'acétone déposa 3,4 mg de cristaux en aiguilles rouges caractéristiques de vitamine B12 qui montrèrent des maxima d'adsorption à 2780
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.fil., 3610 à et 5500 A.
EXEMPLE 19.
5 mg du monochlorure analogue de vitamine B12 furent dissous dans enva 1 ml d'eau. A cette solution; on ajouta env. 10 mg de cyanure cuivreux vert jaunâtre.. On laissa reposer cette solution pendant 12 heures à env. 25- 30 C, puis on la chauffa à env. 75 C pendant une demi-heure. Le spectre d'ad- sorption de cette solution montra des maxima à 2780 A, 3610 1 et 5400-5500 , ce qui est caractéristique d'une solution de vitamine B12. Après séparation d'une petite quantité d'insolubles par centrifugation, la solution fut évaporée à siccité dans le vide. Le résidu fut dissous dans env. 0,5 ml d'eau et ensui- te dilué avec env. 12 ml d'acétone.
Après repos de la solution pendant un pe- tit temps, des cristaux rouges denses de vitamine B12 commencèrent à se former.
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Après 18 heures, les cristaux furent séparés par centrifugation>, lavés avec de
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l'acétone et sèches. Rendement 3,1 mg de vitamine B12.
EXEMPLE 20.
2,9 mg du thiocyanate analogue de vitamine B12 furent dissous dans 1 ml d'eau. A cette solution, on ajouta 0,5 ml de solution de cyanure de po- tassium (13,3 mg de cyanure de potassium/ml).
Par le même procédé que celui décrit dans l'exemple 3, on obtint 1,8 mg de minces aiguilles rouges de vitamine B12.
EXEMPLE 21.
Un mélange de 2,1 mg du monochlorure analogue de vitamine B12 et 2,0 mg du thiocyanate analogue de vitamine B12 furent dissous dans env. l ml d'eau. A cette solution, on ajouta 0,5 ml de cyanure de potassium (13,3 mg de cyanure de potassium/ml) . Par le même procédé que celui décrit dans l'exem- ple 3, on obtint 2,9 mg de vitamine B12 cristalline.
Les exemples ci-dessus de conversion de divers analogues de vita- mine B12 en vitamine B12 par réaction avec une substance fournissant l'ion cya- nogène semblent, lorsque considérés collectivement, indiquer que la vitamine B12 elle-même renferme un ion (ON) remplaçable qui est plus fermement fixé que tout autre ion. Cet ion semble aussi remplacer facilement tout autre ion qui caractérise les analogues B12.
A présent; la vitamine B12 est considérée comme le composé préféré pour usage thérapeutique, et de ce fait le procédé exposé ici pour la conversion des analogues de la vitamine B12 en vitamine B12 est re- marquablement important comme moyen pour fournir une vitamine B12 de composi- tion uniforme.
Même si quelqu'analogue particulier de vitamine B12, c.à.d. ayant un anion particulier substitué pour le groupe CN, devait être trouvé supérieur à la vitamine B12 dans certaines applications cliniques, le procédé découvert conserverait encore une réelle valeur et de l'importance puisque la préparation d'un analogue particulier de vitamine B12 peut être conduite plus efficacement (et tout en éliminant les analogues indésirables) par la préparation préalable de la vitamine B12 pure suivant le procédé ici exposé et ensuite par la conver- sion de la vitamine B12 pure en l'analogue particulier désiré.
Diverses variantes et des modifications dans les processus qui pré- cèdent apparaîtront à ceux spécialisés de ce domaine, et dans les limites où de tels changements et modificatipns rentrent dans le cadre des revendications en annexe, il doit être entendu qu'ils font partie intégrante de l'invention.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de préparation de la vitamine B12, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de matière genre vitamine B12 avec une substance fournissant des ions cyanogène pour ainsi convertir ladite substance en vita- mine B12.